JP2021524262A - コリネ型細菌由来のD−キシロースデヒドロゲナーゼおよびD−キシロネートの生産(Herstellung)方法 - Google Patents
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Abstract
Description
b)相同D−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の発現が増強している、および/または相同D−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している本発明によるコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップa)による溶液中で、C5炭素源をD−キシロネートへ微生物変換するステップ、および
c)任意選択的に、該溶液からD−キシロネートを単離および/または調製するステップ
を含む方法である。
a)D−キシロース単位を含有するオリゴ糖類または多糖類、
b)好ましくは少なくとも10gL−1の濃度の、D−キシロース、
c)リグノセルロース、セルロース、もしくはヘミセルロースを含有するバイオマス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、D−キシロース単位を含有する抽出物、および
d)a)〜c)の組合せ
を含む群から選択されるC5炭素源を含有する溶液中でD−キシロネートへの微生物変換を行う方法でもある。
b)相同D−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の発現が増強している、および/または相同D−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している本発明によるコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップa)による溶液中で、C5炭素源をD−キシロネートへ微生物変換するステップ、および
c)任意選択的に該溶液からD−キシロネートを単離および/または調製するステップ
を含む、D−キシロネートの生産方法である。
a)D−キシロース単位を含有するオリゴ糖類または多糖類、
b)好ましくは少なくとも10gL−1の濃度のD−キシロース、
c)リグノセルロース、セルロースもしくはヘミセルロースを含有するバイオマス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、D−キシロース単位を含有する抽出物、
d)a)〜c)の組合せ
を含む群から選択されるC5炭素源を含有する溶液中でD−キシロネートへの微生物変換を行う方法である。
表1 本発明の細菌株およびプラスミドの一覧を示す。異なる株C.glutamicum ATCC13032 iolG1、C.glutamicum ATCC13032 iolG2およびC.glutamicum ATCC13032 iolG3は、異なるiolGコピー数を有する、C.glutamicum ATCC13032の3つの挿入株を表す。C.glutamicum ATCC13032 iolG1は、染色体中に、相同iolG遺伝子の挿入を有し、詳細にはcg1121とcg1122との間の遺伝子間領域内に有する。iolG2は、iolG1に基づき、付加的に、cg0901とcg0902との間の遺伝子間領域内に相同iolG遺伝子の第2の挿入を含有する。iolG3は、iolG2に基づき、付加的に、cg3327とcg3328との間の遺伝子間領域内に相同iolG遺伝子の第3の挿入を含有する。
C.glutamicum ATCC13032 PO6iolT1を、NiebischおよびBott(2001年)(https://doi.org/10.1007/s002030100262)に基づきベクターpk19mobsacBを用いて、二重相同組換え(Schaeferら、1994年)(https://doi.org/10.1016/0378〜1119(94)90324〜7)を介して構築した。そのために、第1のステップでは、2つの交換対象のヌクレオチドを有する、iolT1遺伝子前方の5’領域(プライマー:PromiolT1_fw_fw/PromiolT1fw_rev)または遺伝子の3’領域(プライマー:Piolt1_rev_fw/Piolt1_rev_rev)を含有する2つのPCR産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の500塩基対を増幅した。第2のステップでは、DNA断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼxBaIおよびEcoRIで切断してあるpk19mobsacBベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した(Gibsonら、2009年)(https://doi.org/10.1038/NMETH.1318)。そのようにして得られた該プラスミドpk19mobsacB_PO6iolT1を、ヒートショックを利用してE.coli DH5αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーPCRおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのDNA配列を特定した。プラスミドを単離後、C.glutamicumエレクトロコンピテントセルのアリコート150μlを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド1〜4.5μgを混合し、氷上で予冷した0.2cmのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、4℃の冷10%(v/v)グリセロール800μLを覆い重ね、エレクトロポレーター(2500V、25μF、200Ω、2mm)中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、46℃に予熱したBHIS培地4mL中に移して、6分間46℃でインキュベーションした。続いて、細胞を2時間、30℃において、170rpmでインキュベーションし、懸濁液をBHIS−Kan15寒天上にまいた。続いて、クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI−Kan25寒天上とに移すことによりsacB遺伝子の機能を試験した。第2の組換え現象における成功した除去を選択するために、BHI−Kan25上で培養した細胞を、およそ5h、BHI培地5ml中で培養し、培養物100μlおよび1:10希釈物を、10%スクロースを含むBHI寒天上にまいた。クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーPCR(プライマー:checkPromiolT1fw/checkPromiolT1rev)に続きDNAシークエンシングを行い、ヌクレオチド置換の成功を確認した。
PromiolT1_fw_fw:TGCATGCCTGCAGGTCGACTGAAAAATTGATCAGCAAACACC
PromiolT1fw_rev:GGCAGACACGATATCCCCCGTCAATCGTACATAGGGAA
Piolt1_rev_fw:CGGGGGATATCGTGTCTGCCACGATTAAAG
piolt1_rev_rev:TTGTAAAACGACGGCCAGTGGAGTCCAAGAAGCACACG
checkPromiolT1fw:TACGAATGCCCACTTCGCACCCTT
checkPromiolT1rew:CAACTCATTACGGCCAGCCAGTGAGC
C.glutamicum ATCC13032 PO6iolT1PO13iolCを、NiebischおよびBott(2001年)(https://doi.org/10.1007/s002030100262)に基づきベクターpk19mobsacBを用いて、二重相同組換え(Schaeferら、1994年)(https://doi.org/10.1016/0378〜1119(94)90324〜7)を介して構築した。そのために、第1のステップでは、2つの交換対象のヌクレオチドを有する、iolC遺伝子前方の5’領域(プライマー:PO13 iolC fw/PO13 iolC rev)または遺伝子の3’領域(プライマー:PO13 iolC rev_fw/PO13 iolC rev_rev)を含有する2つのPCR産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の500塩基対を増幅した。第2のステップでは、DNA断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼxBaIおよびEcoRIで切断してあるpk19mobsacBベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した(Gibsonら、2009年)(https://doi.org/10.1038/NMETH.1318)。そのようにして得られた該プラスミドpk19mobsacB_PO13iolCを、ヒートショックを利用してE.coli DH5αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーPCRおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのDNA配列を特定した。プラスミドを単離後、C.glutamicum ATCC13032 PO6iolT1エレクトロコンピテントセルのアリコート150μlを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド1〜4.5μgを混合し、氷上で予冷した0.2cmのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、4℃の冷10%(v/v)グリセロール800μLを覆い重ね、エレクトロポレーター(2500V、25μF、200Ω、2mm)中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、46℃に予熱したBHIS培地4mL中に移して、6分間46℃でインキュベーションした。続いて、細胞を2時間、30℃において、170rpmでインキュベーションし、懸濁液をBHIS−Kan15寒天上にまいた。続いて、クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI−Kan25寒天上とに移すことによりsacB遺伝子の機能を試験した。第2の組換え現象における成功した除去を選択するために、BHI−Kan25上で培養した細胞を、およそ5h、BHI培地5ml中で培養し、培養物100μlおよび1:10希釈物を、10%スクロースを含むBHI寒天上にまいた。クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーPCR(プライマー:Check Prom iolC fw/Check Prom iolC_rev)に続きDNAシークエンシングを行い、ヌクレオチド置換の成功を確認した。
PO13 iolC fw:TGCATGCCTGCAGGTCGACTGGATGCCGTCTTCGAGGC
PO13 iolC rev:GACCCTCACGATCGCATCCCATGACAATAACAC
PO13 iolC rev_fw:GGGATGCGATCGTGAGGGTCGCCACATTC
PO13 iolc rev_rev:TTGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGGCTCTTCACTGAAACCAG
Check Prom iolC fw:TCTCGTTTTCTAGGCGTGCTCCGGG
Check Prom iolC_rev:CGACGGTTCGCACGAGTAGTCA
C.glutamicum ATCC13032 PO6iolT1PO5〜O9iolCを、NiebischおよびBott(2001年)(DOI 10.1007/s002030100262)に基づきベクターpk19mobsacBを用いて、二重相同組換え(Schaeferら、1994年)(https://doi.org/10.1016/0378〜1119(94)90324〜7)を介して構築した。そのために、第1のステップでは、4つの交換対象のヌクレオチドを有する、iolC遺伝子のコード領域前方の5’領域(プライマー:PO5〜PO9 iolC_fw_fw/PO5〜PO9 iolC_fw_rev)またはiolC遺伝子の3’末端(プライマー:PO5〜PO9iolC_rev_fw/PO5〜PO9iolC_rev_rev)を含有する2つのPCR産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の500塩基対を増幅した。第2のステップでは、DNA断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびEcoRIで切断してあるpk19mobsacBベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した(Gibsonら、2009年)(DOI:10.1038/NMETH.1318)。そのようにして得られた該プラスミドを、ヒートショックを利用してE.coli DH5αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーPCRおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのDNA配列を特定した。プラスミドを単離後、C.glutamicum ATCC13032 PO6iolT1エレクトロコンピテントセルのアリコート150μlを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド1〜4.5μgを混合し、氷上で予冷した0.2cmのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、4℃の冷10%(v/v)グリセロール800μLを覆い重ね、エレクトロポレーター(2500V、25μF、200Ω、2mm)中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、46℃に予熱したBHIS培地4mL中に移して、6分間46℃でインキュベーションした。続いて、細胞を2時間、30℃において、170rpmでインキュベーションし、懸濁液をBHIS−Kan15寒天上にまいた。続いて、クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI−Kan25寒天上とに移すことによりsacB遺伝子の機能を試験した。第2の組換え現象における成功した除去を選択するために、BHI−Kan25上で培養した細胞を、およそ5h、BHI培地5ml中で培養し、培養物100μlおよび1:10希釈物を、10%スクロースを含むBHI寒天上にまいた。クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーPCR(プライマー:PO5〜PO9iolC_check_fw/PO5〜PO9iolC_check_rev)に続きDNAシークエンシングを行い、ヌクレオチド置換の成功を確認した。
PO5〜PO9 iolC_fw_fw:TGCATGCCTGCAGGTCGACTGGTTGGCGTTTTTGAGGTC
PO5〜PO9 iolC_fw_rev:TAAGTTTCGCTACTCATTCCCTAATGCAAGTGATAATCCCAGATCAATAAA
PO5〜PO9iolC_rev_fw:GGAATGAGTAGCGAAACTTAGTGAAAAGGGCAGAGTTTGCAGGTCATAGGGTGCAA
PO5〜PO9iolC_rev_rev:TTGTAAAACGACGGCCAGTGTCCAGCTCAGCAAGCAGG
PO5〜PO9iolC_check_fw:GAGTTTTTCTGCGATGGCGGAACTT
PO5〜PO9iolC_check_rev:GGGGTCTTAAAAGTCTGATCGGTGG
C.glutamicum ATCC13032 ΔPO6iolT1を、NiebischおよびBott(2001年)(https://doi.org/10.1007/s002030100262)に基づきベクターpk19mobsacBを用いて、二重相同組換え(Schaeferら、1994年)(https://doi.org/10.1016/0378〜1119(94)90324〜7)を介して構築した。そのために、第1のステップでは、2つのヌクレオチドが欠失した、iolT1遺伝子前方の5’領域(プライマー:DPO6iolT1_Fw_fw/DPO6iolT1_Fw_rev)または遺伝子の3’領域(プライマー:DPO6iolT1_rev_fw/DPO6iolT1_rev_rev)を含有する2つのPCR産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の500塩基対を増幅した。第2のステップでは、DNA断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼxBaIおよびEcoRIで切断してあるpk19mobsacBベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した(Gibsonら、2009年)(https://doi.org/10.1038/NMETH.1318)。そのようにして得られた該プラスミドpk19mobsacB_ΔPO6iolT1を、ヒートショックを利用してE.coli DH5αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーPCRおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのDNA配列を特定した。プラスミドを単離後、C.glutamicumエレクトロコンピテントセルのアリコート150μlを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド1〜4.5μgを混合し、氷上で予冷した0.2cmのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、4℃の冷10%(v/v)グリセロール800μLを覆い重ね、エレクトロポレーター(2500V、25μF、200Ω、2mm)中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、46℃に予熱したBHIS培地4mL中に移して、6分間46℃でインキュベーションした。続いて、細胞を2時間、30℃において、170rpmでインキュベーションし、懸濁液をBHIS−Kan15寒天上にまいた。続いて、クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI−Kan25寒天上とに移すことによりsacB遺伝子の機能を試験した。第2の組換え現象における成功した除去を選択するために、BHI−Kan25上で培養した細胞を、およそ5h、BHI培地5ml中で培養し、培養物100μlおよび1:10希釈物を、10%スクロースを含むBHI寒天上にまいた。クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーPCR(プライマー:checkPromiolT1fw/checkPromiolT1rev)に続きDNAシークエンシングを行い、欠失の成功を確認した。
DPO6iolT1_Fw_fw:TGCATGCCTGCAGGTCGACTAATTGATCAGCAAACACC
DPO6iolT1_Fw_rev:ATCGTGGCAGACACGATATCCCGTCAATC
DPO6iolT1_rev_fw:GATATCGTGTCTGCCACGATTAAAGACATTG
DPO6iolT1_rev_rev:TTGTAAAACGACGGCCAGTGACTGCGAGTCCAAGAAGC
checkPromiolT1fw:TACGAATGCCCACTTCGCACCCTT
checkPromiolT1rev:CAACTCATTACGGCCAGCCAGTGAGC
C.glutamicum ATCC13032 PO6iolT1 ΔPO13iolCを、NiebischおよびBott(2001年)(https://doi.org/10.1007/s002030100262)に基づきベクターpk19mobsacBを用いて、二重相同組換え(Schaeferら、1994年)(https://doi.org/10.1016/0378〜1119(94)90324〜7)を介して構築した。そのために、第1のステップでは、2つのヌクレオチドが欠失した、iolC遺伝子前方の5’領域(プライマー:DPO13iolC_fw_fw/DPO13iolC_fw_rev)または遺伝子の3’領域(プライマー:DPO13iolC_rev_fw/DPO13iolC_rev_rev)を含有する2つのPCR産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の500塩基対を増幅した。第2のステップでは、DNA断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼxBaIおよびEcoRIで切断してあるpk19mobsacBベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した(Gibsonら、2009年)(https://doi.org/10.1038/NMETH.1318)。そのようにして得られた該プラスミドpk19mobsacB_ΔPO13iolCを、ヒートショックを利用してE.coli DH5αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーPCRおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのDNA配列を特定した。プラスミドを単離後、C.glutamicum ATCC13032 PO6iolT1エレクトロコンピテントセルのアリコート150μlを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド1〜4.5μgを混合し、氷上で予冷した0.2cmのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、4℃の冷10%(v/v)グリセロール800μLを覆い重ね、エレクトロポレーター(2500V、25μF、200Ω、2mm)中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、46℃に予熱したBHIS培地4mL中に移して、6分間46℃でインキュベーションした。続いて、細胞を2時間、30℃において、170rpmでインキュベーションし、懸濁液をBHIS−Kan15寒天上にまいた。続いて、クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI−Kan25寒天上とに移すことによりsacB遺伝子の機能を試験した。第2の組換え現象における成功した除去を選択するために、BHI−Kan25上で培養した細胞を、およそ5h、BHI培地5ml中で培養し、培養物100μlおよび1:10希釈物を、10%スクロースを含むBHI寒天上にまいた。クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーPCR(プライマー:Check Prom iolC fw/Check Prom iolC rev)に続きDNAシークエンシングを行い、欠失の成功を確認した。
DPO13iolC_fw_fw:TGCATGCCTGCAGGTCGACTCCGTCTTCGAGGCGTTGG
DPO13iolC_fw_rev:GTGGCGACCCTCACGATCGCATCCCATG
DPO13iolC_rev_fw:GCGATCGTGAGGGTCGCCACATTCCATC
DPO13iolC_rev_rev:TTGTAAAACGACGGCCAGTGCGCGGCTTGGCTCTTCAC
Check Prom iolC fw:TCTCGTTTTCTAGGCGTGCTCCGGG
Check Prom iolC_rev:CGACGGTTCGCACGAGTAGTCA
C.glutamicum ATCC13032 PO6iolT1 ΔPO5〜O9iolCを、NiebischおよびBott(2001年)(https://doi.org/10.1007/s002030100262)に基づきベクターpk19mobsacBを用いて、二重相同組換え(Schaeferら、1994年)(https://doi.org/10.1016/0378〜1119(94)90324〜7)を介して構築した。そのために、第1のステップでは、2つのヌクレオチドが欠失した、iolC遺伝子前方の5’領域(プライマー:ΔPO5〜PO9iolC_fw_fw/ΔPO5〜PO9iolC_fw_rev)または遺伝子の3’領域(プライマー:ΔPO5〜PO9iolC_rev_fw/ΔPO5〜PO9iolC_rev_rev)を含有する2つのPCR産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の500塩基対を増幅した。第2のステップでは、DNA断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼxBaIおよびEcoRIで切断してあるpk19mobsacBベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した(Gibsonら、2009年)(https://doi.org/10.1038/NMETH.1318)。そのようにして得られた該プラスミドpk19mobsacB_ΔPO5〜O9iolCを、ヒートショックを利用してE.coli DH5αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーPCRおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのDNA配列を特定した。プラスミドを単離後、C.glutamicum ATCC13032 PO6iolT1エレクトロコンピテントセルのアリコート150μlを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド1〜4.5μgを混合し、氷上で予冷した0.2cmのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、4℃の冷10%(v/v)グリセロール800μLを覆い重ね、エレクトロポレーター(2500V、25μF、200Ω、2mm)中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、46℃に予熱したBHIS培地4mL中に移して、6分間46℃でインキュベーションした。続いて、細胞を2時間、30℃において、170rpmでインキュベーションし、懸濁液をBHIS−Kan15寒天上にまいた。続いて、クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI−Kan25寒天上とに移すことによりsacB遺伝子の機能を試験した。第2の組換え現象における成功した除去を選択するために、BHI−Kan25上で培養した細胞を、およそ5h、BHI培地5ml中で培養し、培養物100μlおよび1:10希釈物を、10%スクロースを含むBHI寒天上にまいた。クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーPCR(プライマー:Check ΔPO5〜PO9iolC_fw/Check ΔPO5〜PO9iolC_rev)に続きDNAシークエンシングを行い、欠失の成功を確認した。
ΔPO5〜PO9iolC_fw_rev:TAAGTTTCGCTACTCATTCCCTAATGCAAGTGATAATCAGATCAATAAAAGCCCTGGAT
ΔPO5〜PO9iolC_rev_fw:GGAATGAGTAGCGAAACTTAGTGAAAAGGGCAGAGTTTGCAGGTCATAGTGCAACTTTGTTAACCC
ΔPO5〜PO9iolC_rev_rev:TTGTAAAACGACGGCCAGTGTCCAGCTCAGCAAGCAGG
Check ΔPO5〜PO9iolC_fw:GAGTTTTTCTGCGATGGCGGAACTT
Check ΔPO5〜PO9iolC_rev:GGGGTCTTAAAAGTCTGATCGGTGG
C.glutamicum ATCC13032 ΔiolGを、NiebischおよびBott(2001年)(https://doi.org/10.1007/s002030100262)に基づきベクターpk19mobsacBを用いて、二重相同組換え(Schaeferら、1994年)(https://doi.org/10.1016/0378〜1119(94)90324〜7)を介して構築した。そのために、第1のステップでは、最初の3コドンを有する、iolG遺伝子の5’領域(プライマー:iolG前方fw/iolG前方rev)または最後の6コドンを有する、iolG遺伝子の3’領域(プライマー:iolG後方fw/iolG後方rev)を含有する2つのPCR産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の500塩基対を増幅した。第2のステップでは、DNA断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼxBaIおよびEcoRIで切断してあるpk19mobsacBベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した(Gibsonら、2009年)(https://doi.org/10.1038/NMETH.1318)。そのようにして得られた該プラスミドpk19mobsacB_ΔiolGを、ヒートショックを利用してE.coli DH5αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーPCRおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのDNA配列を特定した。プラスミドを単離後、C.glutamicumエレクトロコンピテントセルのアリコート150μlを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド1〜4.5μgを混合し、氷上で予冷した0.2cmのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、4℃の冷10%(v/v)グリセロール800μLを覆い重ね、エレクトロポレーター(2500V、25μF、200Ω、2mm)中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、46℃に予熱したBHIS培地4mL中に移して、6分間46℃でインキュベーションした。続いて、細胞を2時間、30℃において、170rpmでインキュベーションし、懸濁液をBHIS−Kan15寒天上にまいた。続いて、クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI−Kan25寒天上とに移すことによりsacB遺伝子の機能を試験した。第2の組換え現象における成功した除去を選択するために、BHI−Kan25上で培養した細胞を、およそ5h、BHI培地5ml中で培養し、培養物100μlおよび1:10希釈物を、10%スクロースを含むBHI寒天上にまいた。クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーPCR(プライマー:check iolG fw/check iolG rev)に続き電気泳動を行い、欠失の成功を確認した。
iolG前方fw:TGCATGCCTGCAGGTCGACTGAAGAGTTCGGCATGAAGC
iolG前方rev:TACTCCCGGGCATATGGCGAAGGCTCTTGCTCAT
iolG後方fw:GAGCCTTCGCCATATGCCCGGGAGTACTGGATCCGTTGATGCGGCACCTCGC
iolG後方rev:TTGTAAAACGACGGCCAGTGATGACTCGCCATGCTTCAATACC
check iolG fw:CGACGTTGCTGGTCTTGCTTCCAAG
check iolG rev:GGTTAGTGATGTAGCGCAGGCCGTG
様々なC.glutamicum挿入突然変異体C.glutamicum ATCC13032 iolG1、C.glutamicum ATCC13032 iolG2、C.glutamicum ATCC13032 iolG3を、NiebischおよびBott(2001年)(https://doi.org/10.1007/s002030100262)に基づき、それぞれpk19mobsacBベースのベクターを用いて、二重相同組換え(Schaeferら、1994年)(https://doi.org/10.1016/0378〜1119(94)90324〜7)を介して構築した。そのために、第1のステップでは、様々な挿入部位のフランキング領域、構成的プロモーターTuf、および遺伝子iolGを含有するPCR産物を生成した(プライマー:NCS_PTuf_fw/NCS_PTuf_rev/NCS_Ptuf_iolG_fw/NCS_Ptuf_iolG_rev/CgLP4_fw_fw/CgLP4_fw_rev/CgLP4_PTuf_fw/CgLP4_PTuf_rev/CgLP4_iolG_fw/CgLP4_iolG_rev/CgLP4_rev_fw/CgLP4_rev_rev/CgLP12_fw_fw/CgLP12_fw_rev/CgLP12_PTuf_fw/CgLP12_PTuf_rev/CgLP12_iolG_fw/CgLP12_iolG_rev/CgLP12_rev_fw/CgLP12_rev_rev)。第2のステップでは、DNA断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼxBaIおよびEcoRIで切断してあるpk19mobsacBベクターと共に、それぞれ、ギブソン・アセンブリを利用して融合した(Gibsonら、2009年)(https://doi.org/10.1038/NMETH.1318)。そのようにして得られたプラスミドpk19mobsacB ncr cons PTufiolG、pk19mobsacB CgLP4 PTufiolG、およびpk19mobsacB CgLP12 PTufiolGを、ヒートショックを利用してE.coli DH5αに形質転換した。構築されたプラスミド上に存在する各カナマイシン耐性遺伝子により、それぞれ、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーPCRおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのDNA配列を特定した。プラスミドを単離後、C.glutamicumエレクトロコンピテントセルのアリコート150μlを氷上で溶かし、そのアリコートに形質転換すべき各プラスミド1〜4.5μgを混合し、氷上で予冷した0.2cmのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、4℃の冷10%(v/v)グリセロール800μLを覆い重ね、エレクトロポレーター(2500V、25μF、200Ω、2mm)中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、46℃に予熱したBHIS培地4mL中に移して、6分間46℃でインキュベーションした。続いて、細胞を2時間、30℃において、170rpmでインキュベーションし、懸濁液をBHIS−Kan15寒天上にまいた。続いて、クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI−Kan25寒天上とに移すことによりsacB遺伝子の機能をそれぞれ試験した。第2の組換え現象における成功した除去を選択するために、BHI−Kan25上で培養した細胞を、およそ5h、BHI培地5ml中で培養し、培養物100μlおよび1:10希釈物を、10%スクロースを含むBHI寒天上にまいた。クローンを、BHI−Kan25寒天上と10%スクロースを含むBHI寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーPCR(プライマー:NCS check fw/NCS check rev/CgLP4_Check_fw/CgLP4_Check_rev/CgLP12_Check_fw/CgLP12_Check_rev)に続きDNAシークエンシングを行い、それぞれ挿入の成功を確認した。
NCS_PTuf_fw:TTTAAATTGTGTCCATGAGGCACAGGGTAGCTGGTAGTTTG
NCS_PTuf_rev:TCTTGCTCATACGCGTTCCTCCTGGACTTC
NCS_Ptuf_iolG_fw:AGGAACGCGTATGAGCAAGAGCCTTCGC
NCS_Ptuf_iolG_rev:CGAAGCATATGCCCGGGAGTTTAAGCGTAGAAATCTGGGC
NCS check fw:CGGAATGATCTTGACCCTTGTTGGTG
NCS check rev:ATCAAGCAGATCTCTGAGCTGCTGGC
CgLP4_fw_fw:TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTTCTGGGTCGGCGATAC
CgLP4_fw_rev:CTACCCTGTGCATCAAAAAATCCGCCGTTC
CgLP4_PTuf_fw:TTTTTTGATGCACAGGGTAGCTGGTAGTTTG
CgLP4_PTuf_rev:TCTTGCTCATACGCGTTCCTCCTGGACTTC
CgLP4_iolG_fw:AGGAACGCGTATGAGCAAGAGCCTTCGC
CgLP4_iolG_rev:CTCACTTAGTTTAAGCGTAGAAATCTGGGC
CgLP4_rev_fw:CTACGCTTAAACTAAGTGAGTTTGGATG
CgLP4_rev_rev:TTGTAAAACGACGGCCAGTGTAGTACGCGGATAAATGATC
CgLP4_Check_fw:TGCAGGTCACTGTGGAAAATCG
CgLP4_Check_rev:AATCAGCATCACCCATCCCTTCAC
CgLP12_fw_fw:TGCATGCCTGCAGGTCGACTCGTTGAAGACTCCGTCAAAC
CgLP12_fw_rev:CTACCCTGTGATATGCCGATTGCAAGAAAC
CgLP12_PTuf_fw:ATCGGCATATCACAGGGTAGCTGGTAGTTTG
CgLP12_PTuf_rev:TCTTGCTCATACGCGTTCCTCCTGGACTTC
CgLP12_iolG_fw:AGGAACGCGTATGAGCAAGAGCCTTCGC
CgLP12_iolG_rev:ATTTTTTGACTGATTAAGCGTAGAAATCTGGGC
CgLP12_rev_fw:CTACGCTTAATCAGTCAAAAAATGTTGAAATCAG
CgLP12_rev_rev:TTGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCGCTTCTTTGAAGAG
CgLP12_Check_Fw:CTCAAGGTCATCCGTGAAATGTGGC
CgLP12_Check_Rev:TTGGCTTTCCATGCTTTGAGGACT
ゲノムDNAを単離するための第1のステップでは、C.glutamicum細胞を、2%DMSO50μl中での懸濁に続く95℃における5分間のインキュベーションにより破砕した。細胞片を11,000rpmで1分間、遠心分離し、上清の3μLを、テンプレートとしてiolGの増幅に使用した(プライマー:p3_iolG_fw/p3_iolG_rev)。その増幅物を、すでに制限エンドヌクレアーゼpstIおよびEcoRIで切断してあるpEKEx3ベクターと共に、ギブソン・アセンブリで融合した(Gibsonら、2009年)(https://doi.org/10.1038/NMETH.1318)。そのようにして得られた該プラスミドpEKEx3iolGを、ヒートショックを利用してE.coli DH5αに形質転換した。プラスミドが仲介するスペクチノマイシン耐性により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーPCRおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのDNA配列を特定した。プラスミドを単離後、C.glutamicumエレクトロコンピテントセルのアリコート150μlを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド1〜4.5μgを混合し、氷上で予冷した0.2cmのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、4℃の冷10%(v/v)グリセロール800μLを覆い重ね、エレクトロポレーター(2500V、25μF、200Ω、2mm)中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、46℃に予熱したBHIS培地4mL中に移して、6分間46℃でインキュベーションした。続いて、細胞を2時間、30℃において、170rpmでインキュベーションした。続いて懸濁液をBHIS−Spc100寒天上にまいた。
p3_iolG_fw:GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGCTAGTATAAGGAGATATAGATATGAGCAAGAGCCTTCGC
p3_iolG_rev:CTGTAAAACGACGGCCAGTGTTAAGCGTAGAAATCTGGGC
C.glutamicum株の培養には、Brain Heart Infusion複合培地(BHI、Difco Laboratories、デトロイト、米国)およびCGXII合成培地を使用した。CGXII培地は、脱イオン水1リットルにつき、次の組成物:K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、尿素5g、CaCl2・2H2O 13.25mg、MgSO4・7H2O 0.25g、FeSO4・7H2O 10mg、MnSO4・H2O 10mg、NiCl2・6H2O 0.02mg、CuSO4・5H2O 0.313mg、ZnSO4・7H2O 1mg、ビオチン0.2mg、3,4−ジヒドロキシベンゾエート、0.02%(vv−1)消泡剤AF204を含有した。発現ベクターpEKEx3を有する株の培養には、スペクチノマイシンおよびイソプロピルβ−D−チオガラクトシド(IPTG)を、100μgmL−1または1mmolL−1の最終濃度で添加した。すべての化学製品はSigma−Aldrich(シュタインハイム、ドイツ)から入手した。まず、試験管中のBHI培地上での前培養を、単一コロニーから植え付け、30℃において8h、回転式振とう培養機上、170rpmでインキュベートした。次いで、その培養から、第2の前培養を、CGXII合成培地50mLならびに炭素源およびエネルギー源としてのD−グルコース10gL−1およびD−キシロース30gL−1を含む500mL振とうフラスコ中に植え付けて、30℃において15h、回転式振とう培養機上、130rpmでインキュベートした。続いて、本培養を、炭素源およびエネルギー源としてのD−グルコース10gL−1およびD−キシロース30gL−1を含むCGXII合成培地50mL中に、1のOD600で植え付けて、30℃において56h、回転式振とう培養機上、130rpmでインキュベートした。本培養から、バイオマス、D−キシロースおよびD−キシロネートの濃度を測定するための試料を採取した。
バッチ法および流加法を利用したD−キシロネート生産には、CGXII合成培地および前処理したバガス加水分解物を使用した。粉砕バガス(0.25〜1cm)の前処理は、0.1molL−1のH2SO4中、121℃でのインキュベーションにより行った。続く加水分解は、600mLの作業体積および前処理済みバガス180g、50mM C2H3NaO2および酵素ミックスCellic CTec2(Novomzymes、バウスヴェア、デンマーク)10.4mLからなる溶液を含む並列バイオリアクターシステム(Eppendorf/DASGIP、ユーリッヒ、ドイツ)中で行った。KOHを利用してpHをpH5に調整し、50℃において72h、一定のスターラ回転数(400rpm)で加水分解を行った。続いて、NH4Cl 8gおよびK2HPO4 2gを脱イオン水200mL中に溶解して、加水分解物に添加した。次いで、培養目的用の培地を、5M NH4OHによりpH7に調整した。いくつかの培地成分(D−グルコース、D−キシロース、PCA、微量元素、AF204)を、オートクレーブ後に無菌添加した。流加プロセスの場合、脱イオン水中の100gL−1D−グルコース溶液を使用した。培養中、pH値を、5M H3PO4または5M NH4OHの供給により双方からpH7に調節した。温度およびガス供給速度は、30℃または0.5vvmに固定した。好気性プロセス条件(>30%の溶存酸素濃度)は、スターラ回転数(400〜1,200rpm)の調節によって保証した。オンライン測定は、pH(405−DPAS−SC−K80/225、Mettler Toledo)、DO(Visiferm DO 225、Hamilton)および排気組成(GA4、DASGIP AG)に関して行った。植え付けは、指数増殖中のCGXII培地(20gL−1D−グルコース)上の前培養から、最終OD2へと行った。本培養から、バイオマス、D−キシロースおよびD−キシロネートの濃度を測定するための試料を採取した。
iolGを異種遺伝子発現させるために、プラスミドpET−28b−iolGを、大腸菌BL21に形質転換し、続いて、カナマイシン50mg/Lを含むTerrificBroth(TB)培地2x50mL中で、30℃および250rpmにおいて16時間、培養した。初期炭素源としての20g/Lのグリセロールおよび選択圧を維持するための50mg/Lのカナマイシンを含む4つのバイオリアクター培養を植え付けるために、それらの培養の各10mLを利用した。バイオリアクター培養を30℃に調温し、アンモニア水を用いてpH値をpH7に滴定した。培養開始からおよそ5h後ならびにおよそ32h後に改めて、250μMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により遺伝子発現を誘導した。初期グリセロール量が完全に代謝された後、700g/Lグリセロールおよび20g/L MgSO4・7H2Oを含む濃縮基質溶液を、オンオフ制御装置(オン:DO>30%、オフ:DO<10%)に基づいて、20mL/hの速度で自動的に計量添加した。およそ10hの補給段階後、培養を回収し、20分間の遠心分離(8000rpm)により培養培地から細胞を分離した。細胞塊を−20℃において保管した。
細胞塊およそ60gを、氷上の平衡化緩衝液(50mM Tris−HCl、2mM MgSO4、300mM NaCl、pH7.0)150mL中で30分間、再懸濁した。循環式冷却室(Umlaufkuehlzelle)内で、超音波プローブ(超音波プロセッサーUP 200S Dr. Hielscher S14D−Sonotrode、サイクル0.5振幅70)を利用して、細胞懸濁液を30分間破砕した。破砕上清を遠心分離(23000rpm、4℃、35分間)後、Ni−NTAカラム(カラム体積70mL、流量6mL/分)上に載せた(洗浄バッファー:50mM Tris pH7.5、300mM NaCl、2mM MgSO4 25mMイミダゾール;溶出バッファー:50mM Tris pH8.0、300mM NaCl、2mM MgSO4、250mMイミダゾール)。溶出液を全体として60mLの画分で捕集し、Sephadex−G25カラムを介して脱塩し(カラム体積960mL、流量10mL/分、脱塩バッファー:10mM Tris pH7.6、2mM MgSO4)、そのうちの全体で150mLをタンパク質含有画分として収集し、凍結乾燥させた。結果として生じる凍結乾燥物は、Bradfordのタンパク質定量によると60%のタンパク質含有量を有した。
IolG凍結乾燥物の活性測定をするための酵素テストを200μLの全体積で行った。酵素反応は、入れておいた基質溶液(0〜250mM[反応体積当たり最終0〜25mM]のD−キシロースまたはミオイノシトール)20μLに反応混合物(250mM Tris−HCl、22mM NAD+、5mM MgCl2および2.5mg/LのIolG凍結乾燥物溶液125μL/ml、pH7.5、30℃へと>30分予熱)180μLを素早く添加して行った。340nmにおける吸光度上昇の測定を、(30℃へと>30分予熱した)マイクロタイタープレートリーダー中、およそ20分間追跡した。全測定シグナルの短い過渡振動挙動の後、初期反応速度を2分間の測定時間にわたって、線形回帰を利用して算定した。得られた、単位[1分当たりの吸光度単位]での傾きを、基質溶液の代わりに公知のNADH濃度を有する標準溶液による吸光度シグナルの検量線を利用して、較正パラメーター共分散行列を考慮しつつガウスの誤差伝搬を適用し、単位[1分当たりのmM NADH]でのNADH結合速度に算定した。酵素は、基質ミオイノシトールに対しては活性を示さない。
コリネ型細菌株の様々な変形形態の、野生型と比べた増殖、D−キシロース摂取およびD−キシロネート形成に関する実験を、振とうフラスコ内の、10gL−1D−グルコースおよび30gL−1D−キシロースを含むCGXII合成培地中で行った。以下の例は、本発明によるD−キシロースデヒドロゲナーゼ活性がコリネ型細菌中でのD−キシロネート形成を担うことを明確に示す。図14および15。
1.D−キシロースデヒドロゲナーゼの上昇した発現が、
a)遺伝子発現に関する調節またはシグナル構造の改変、
b)コードする核酸配列の転写活性の改変、
c)コードする核酸配列の遺伝子コピー数の上昇、および
d)a)〜c)からの組合せ
を含む群から選択される改変に基づくことを特徴とするコリネ型細菌細胞。
a)コードする核酸配列の発現の上昇、
b)高まった触媒活性および/または基質特異性を有するD−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の発現、
c)コードする核酸配列から導かれるmRNAの安定性の上昇、
d)D−キシロースを変換するための相同D−キシロースデヒドロゲナーゼの触媒活性および/または基質特異性の改変、および
e)a)〜d)からの組合せ
を含む群から選択される改変に基づくことを特徴とする、主題1に記載のコリネ型細菌細胞。
a)本発明によるD−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している、
b)本発明による核酸配列の発現が増強している、
c)配列番号3によるミオイノシトール/プロトン共輸送体(IolT1)またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、
d)配列番号4によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール/プロトン共輸送体IolT1の活性が上昇している、
e)好ましくは、配列番号9および配列番号10の核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、iolT1遺伝子の作動可能に連結されたIolR結合部位内の1つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有するミオイノシトール/プロトン共輸送体(IolT1)をコードする核酸配列を有する、
f)配列番号5によるミオイノシトール/プロトン共輸送体(IolT2)またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、
g)配列番号6によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール/プロトン共輸送体IolT2の活性が上昇している、
h)c)およびf)によるミオイノシトール/プロトン共輸送体IolT1/2をコードする両核酸配列の発現が上昇している、
i)d)およびg)による両ミオイノシトール/プロトン共輸送体IolT1/2の活性が上昇している、
j)本発明によるD−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするiolGを含有するiolC遺伝子クラスターの非コード調節領域内にある作動可能に連結された1つもしくは複数のIolR結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または1つもしくは複数のIolR結合部位が部分的もしくは完全に欠失している核酸配列を有する、
k)好ましくは、配列番号7、配列番号8、配列番号63、および配列番号64による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、iolC遺伝子クラスターの作動可能に連結されたIolR結合部位内の1つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有する、D−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を有する、
l)ミオイノシトール調節因子IolRまたはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列が、完全または部分的に欠失している、
m)iolR遺伝子の発現が低下または欠如している、
n)ミオイノシトール調節因子IolRの活性が低下もしくは完全にスイッチオフされている、または
o)a)〜n)からの組合せであるコリネ型細菌細胞。
a)水およびC5炭素源を含有する溶液を準備するステップ、
b)相同D−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の発現が増強している、および/または相同D−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇しているコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップa)による溶液中で、C5炭素源をD−キシロネートへ微生物変換するステップ、および
c)任意選択的に該溶液からD−キシロネートを単離および/または調製するステップ
を含む、D−キシロネートの生産方法。
Claims (37)
- アミノ酸配列が、配列番号2によるアミノ酸配列またはその断片に対して少なくとも70%の同一性を有することを特徴とする、コリネ型細菌から単離されたD−キシロースデヒドロゲナーゼ。
- 配列番号2によるアミノ酸配列またはその断片を含有する、請求項1に記載のD−キシロースデヒドロゲナーゼ。
- 配列番号1による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも70%の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項1に記載のD−キシロースデヒドロゲナーゼ。
- 配列番号1による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子によってコードされる、請求項1または2に記載のD−キシロースデヒドロゲナーゼ。
- 好ましくはコリネ型細菌中で、D−キシロネートを生産するための、
a)配列番号1による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも70%の同一性を有する核酸配列、
b)ストリンジェントな条件下に配列番号1による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列、
c)配列番号1による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子、および
d)a)〜c)による核酸の各々に応じて、D−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列であって、遺伝暗号の縮重または機能的中立突然変異により、a)〜c)によるそれらの核酸配列とは異なる核酸配列、
を含む群から選択される、請求項1〜4のいずれか一つに記載のD−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする、コリネ型細菌から単離された核酸配列。 - 請求項1〜4のいずれか一つに記載のD−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするiolGを含有するiolC遺伝子クラスターの非コード調節領域内にある作動可能に連結された1つもしくは複数のIolR結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または1つもしくは複数のIolR結合部位が部分的もしくは完全に欠失していることを特徴とする、請求項5に記載の核酸配列。
- 好ましくは配列番号7および配列番号8による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、iolC遺伝子クラスターの作動可能に連結されたIolR結合部位に1つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有することを特徴とする、請求項5または6に記載の核酸配列。
- 好ましくは配列番号63および配列番号64による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、iolC遺伝子クラスターの作動可能に連結されたIolR結合部位に1つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有することを特徴とする、請求項5または6に記載の核酸配列。
- コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、特にコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)またはブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum)を含む群から選択されるコリネ型細菌から単離された、請求項1〜4のいずれか一つに記載のタンパク質または請求項5〜8のいずれか一つに記載の核酸配列。
- コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870
コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP−1539
ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum) ATCC14067
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020
を含む群から選択されるコリネ型細菌から単離された、請求項1〜4のいずれか一つに記載のタンパク質または請求項5〜8のいずれか一つに記載の核酸配列。 - 請求項1〜4のいずれか一つに記載の相同D−キシロースデヒドロゲナーゼまたはその断片の上昇した発現および/または高まった活性を有することを特徴とする、D−キシロネート生産のためのコリネ型細菌細胞。
- iolC遺伝子クラスター中の、D−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の非コード調節領域内にある作動可能に連結された1つもしくは複数のIolR結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または1つもしくは複数のIolR結合部位が部分的もしくは完全に欠失している、請求項5〜8のいずれか一つに記載の核酸配列を有することを特徴とする、請求項11に記載のコリネ型細菌細胞。
- 好ましくは配列番号7および配列番号8による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、iolC遺伝子クラスターの作動可能に連結されたIolR結合部位に1つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含む核酸配列を有することを特徴とする、請求項11または12に記載のコリネ型細菌細胞。
- 好ましくは配列番号63および配列番号64による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、iolC遺伝子クラスターの作動可能に連結されたIolR結合部位に1つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含む核酸配列を有することを特徴とする、請求項11または12に記載のコリネ型細菌細胞。
- 好ましくは配列番号9および配列番号10の核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、iolT1遺伝子の作動可能に連結されたIolR結合部位に1つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含む核酸配列を有することを特徴とする、請求項11〜14のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、特にコリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムまたはブレビバクテリウム・ディバリカタムを含む群から選択される、請求項11〜15のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15806
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス FERM BP−1539
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ATCC13869
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
を含む群から選択される細菌細胞であることを特徴とする、請求項11〜16のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。 - 本発明によるD−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の増加したコピー数が、染色体上にコードされて存在する、請求項11〜17のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- 非組換え的に改変されていることを特徴とする、請求項11〜18のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- 本発明によるD−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の増加したコピー数が、染色体外にコードされて、好ましくはプラスミドにコードされて、またはベクターにコードされて存在する、請求項11〜19のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- a)請求項1〜4、9または10のいずれか一つに記載のD−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している、
b)請求項5〜10のいずれか一つに記載の核酸配列の発現が増強している、
c)配列番号3によるミオイノシトール/プロトン共輸送体(IolT1)またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、
d)配列番号4によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール/プロトン共輸送体IolT1の活性が上昇している、
e)好ましくは配列番号9および配列番号10の核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、iolT1遺伝子の作動可能に連結されたIolR結合部位に1つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有するミオイノシトール/プロトン共輸送体(IolT1)をコードする核酸配列を有する、
f)配列番号5によるミオイノシトール/プロトン共輸送体(IolT2)またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、
g)配列番号6によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール/プロトン共輸送体IolT2の活性が上昇している、
h)c)およびf)によるミオイノシトール/プロトン共輸送体IolT1/2をコードする両核酸配列の発現が上昇している、
i)d)およびg)による両ミオイノシトール/プロトン共輸送体IolT1/2の活性が上昇している、
j)請求項1〜4または5〜10のいずれか一つに記載のD−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするiolGを含有するiolC遺伝子クラスターの非コード調節領域内にある作動可能に連結された1つもしくは複数のIolR結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または1つもしくは複数のIolR結合部位が部分的もしくは完全に欠失している、請求項5〜10のいずれか一つに記載の核酸配列を有する、
k)好ましくは配列番号7、配列番号8、配列番号63および配列番号64による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、iolC遺伝子クラスターの作動可能に連結されたIolR結合部位に1つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有する、D−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を有する、または
l)a)〜k)の組合せである、
請求項11〜20のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。 - a)水およびC5炭素源を含有する溶液を準備するステップ、
b)相同D−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の発現が増強している、および/または相同D−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇しているコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップa)による溶液中で、C5炭素源をD−キシロネートへ微生物変換するステップ、および
c)任意選択的に、前記溶液からD−キシロネートを単離および/または調製するステップ
を含む、D−キシロネートを生産するための方法。 - 請求項11〜21のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞を使用する、請求項22に記載の方法。
- ステップb)でのD−キシロースデヒドロゲナーゼが、配列番号2によるアミノ酸配列またはその断片に対して少なくとも70%の同一性のアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号1による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも70%の同一性を有する核酸配列によってコードされている、請求項22または23に記載の方法。
- 水、ならびに
a)D−キシロース単位を含有するオリゴ糖類または多糖類、
b)好ましくは少なくとも10gL−1の濃度の、D−キシロース、
c)リグノセルロース、セルロースもしくはヘミセルロースを含有するバイオマス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、D−キシロース単位を含有する抽出物、および
d)a)〜c)の組合せ
を含む群から選択されるC5炭素源を含有する溶液中で微生物変換を行うことを特徴とする、請求項22〜24のいずれか一つに記載の方法。 - C5炭素源が、バガス、好ましくはスクロースバガス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、D−キシロース単位を含有する抽出物である、請求項22〜24のいずれか一つに記載の方法。
- 培養を断続的または連続的、好ましくはバッチモード、流加モード、反復流加モードで、またはワンポット加水分解・発酵プロセスとして行うことを特徴とする、請求項22〜26のいずれか一つに記載の方法。
- 前記溶液が、炭素源およびエネルギー源として、培養開始時に、D−キシロースの他に好ましくは少なくとも8〜10gL−1の、D−グルコースを含有することを特徴とする、請求項22〜27のいずれか一つに記載の方法。
- 培養を流加モードで、好ましくはD−キシロースの補給により、行うことを特徴とする、請求項22〜28のいずれか一つに記載の方法。
- 非組換え的に改変されている(non−GMO)コリネ型細菌細胞を使用することを特徴とする、請求項22〜29のいずれか一つに記載の方法。
- D−キシロネートを生産するための、請求項1〜4、9もしくは10のいずれか一つに記載のD−キシロースデヒドロゲナーゼ、または請求項5〜10のいずれか一つに記載の核酸配列、または請求項11〜21のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞の使用。
- コリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム、酵母、好ましくはサッカロミセス、および真菌、好ましくはアスペルギルスの群から選択される宿主系を製造するための、請求項1〜4、9もしくは10のいずれか一つに記載のD−キシロースデヒドロゲナーゼ、または請求項5〜10のいずれか一つに記載の核酸配列の使用。
- コリネバクテリウム・グルタミクムを用いてD−キシロネートを微生物生産するための、請求項31に記載の使用。
- D−キシロネート生産のためのコリネ型細菌を製造するための、請求項5〜10のいずれか一つに記載の核酸配列または配列番号7、配列番号8、配列番号9もしくは配列番号10を含む群から選択されるヌクレオチド配列の使用。
- D−キシロネート生産のためのコリネ型細菌を製造するための、請求項5〜10のいずれか一つに記載の核酸配列または配列番号63および配列番号64を含む群から選択されるヌクレオチド配列の使用。
- 請求項1〜4、9もしくは10のいずれか一つに記載の酵素、請求項5〜10のいずれか一つに記載の核酸配列によりコードされる酵素、請求項11〜21のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞、または請求項22〜30のいずれか一つに記載の方法を用いて生産されたD−キシロネートを含有する組成物。
- 医薬品、食品、飼料、溶媒、着色剤および/または建設資材産業の構成要素、好ましくはセメントまたはコンクリートを製造するための、請求項1〜4、9もしくは10のいずれか一つに記載の酵素、請求項5〜10のいずれか一つに記載の核酸配列によりコードされる酵素、請求項11〜21のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞、もしくは請求項22〜30のいずれか一つに記載の方法を用いて生産されたD−キシロネートの使用、または請求項36に記載の組成物の使用。
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