CN104640982A - 基因、微生物、转换方法及制造方法 - Google Patents

基因、微生物、转换方法及制造方法 Download PDF

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Abstract

一种基因，为下述(a)～(c)中任一项所述的基因：(a)具有序列号1的碱基序列的基因；(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入一个或多个碱基的碱基序列的基因，其中该基因具有相对于序列号1的碱基序列的90％以上的同一性的碱基序列；(c)在严格条件下将具有序列号1记载的碱基序列的基因与具有互补的碱基序列的基因杂交的基因，其中，所述基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因组合，从而能够对微生物或该微生物的培养物赋予将3-羟基丁酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA、或将4-羟基丁酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的能力。

Description

基因、微生物、转换方法及制造方法
技术领域
本发明涉及一种基因、微生物、转换方法及制造方法。
背景技术
近些年，从化石资源枯竭或全球变暖对策等观点来看，以可再生资源为原料的化合物制造工艺受到了关注。特别是，以生物质作为原料的、利用生物化学工艺来制造各种聚合物原料化合物或化学品原料化合物的、所谓的生物炼制被广泛研究。
作为被期待进行生物质的原料转化的化合物，可举出丁二醇(指1,3-丁二醇及1,4-丁二醇)。例如，1,4-丁二醇被用作精密有机化学品的合成原料、聚酯及工程塑料的单体单位等，1,3-丁二醇被用作有机溶剂或化妆品基质等。无论1,4-丁二醇还是1,3-丁二醇的情况，均对于以生物质等可再生资源为原料的生物化学工艺的要求变大。
作为利用生物化学工艺的丁二醇的制造方法，例如可举出专利文献1～3及非专利文献1记载的方法。
专利文献1：(日本)专利第4380704号公报
专利文献2：国际公布2008/115840号公报
专利文献3：国际公布2010/127319号公报
非专利文献1：Harry Yim et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli for directproduction of 1,4-butanediol,Nature Chemical Biology,7,445-452(2011).
发明内容
<本发明所要解决的技术问题>
然而，专利文献1～3及非专利文献1记载的方法的工艺复杂。
针对上述问题，要提供一种新的1,4-丁二醇的制造方法，其能够经济地获得丁二醇。另外，提供与该制造方法关联的转换方法、以及能够适用于该制造方法及该转换方法的基因、微生物。
<用于解决技术问题的方案>
作为本发明人为解决上述问题而进行积极研究的结果，发现了特定的基因较有效，并得到本发明。换言之，本发明包括以下内容。
[1]一种基因，其为下述(a)～(c)中任一项所述的基因：
(a)具有序列号1的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入一个或多个碱基的碱基序列的基因，其中该基因具有相对于序列号1的碱基序列的90％以上的同一性的碱基序列；
(c)在严格条件下将具有序列号1记载的碱基序列的基因与具有互补的碱基序列的基因杂交的基因，
其中，所述基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因组合，从而能够对微生物或该微生物的培养物赋予将3-羟基丁酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA、或将4-羟基丁酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的能力。
[2]根据[1]所述的基因，其中，所述微生物是大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌。
[3]一种微生物，其包括根据[1]所述的基因、以及编码烯酰CoA水合酶的基因。
[4]根据[3]所述的微生物，其中，所述微生物还包括编码酰基CoA还原酶的基因。
[5]一种转换方法，其利用根据[3]所述的微生物或该微生物的培养物，将3-羟基丁酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA、或将4-羟基丁酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA。
[6]一种制造方法，其利用根据[4]所述的微生物或该微生物的培养物来制造1,4-丁二醇。
[7]根据[6]所述的制造方法，其中，所述微生物包含编码乙酰乙酰CoA合酶或乙酰乙酰CoA还原酶中的至少一者的基因。
[8]根据[6]所述的制造方法，其中，从乙酰CoA经由3-羟基丁酰CoA来制造1,4-丁二醇。
<发明的效果>
能够提供一种经济的1,4-丁二醇的制造方法。另外，能够提供与该制造方法关联的转换方法、以及能够适用于该制造方法及该转换方法的基因、微生物。
附图说明
图1是用于对本实施方式的3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换方法进行说明的概要图。
具体实施方式
以下，使用图1对本发明进行详细说明。需要说明的是，在本说明书中，“CoA”意味着辅酶A。
(基因)
首先，对本实施方式的基因进行说明，该基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因组合，从而能够对微生物或该微生物的培养物赋予将3-羟基丁酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA、或将4-羟基丁酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的能力。
本实施方式的基因是具有序列号1的碱基序列的基因和其同源物。本实施方式的基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因组合并通过转化而在微生物体内表达，从而能够应用到例如3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换方法、或1,4-丁二醇的制造方法。
本实施方式中的同源物(homolog)包括直系同源物和旁系同源物。直系同源物是指在从共同祖先的基因分化而生成的种类之间对应的基因及由该基因得到的酶的组合。旁系同源物是指在同种内，在不是通过分化而是通过基因重复而生成的种类之间对应的基因及由该基因得到的酶的组合。同源物是指与直系同源物、旁系同源物无关地、在序列上具有同一性的基因及由该基因得到的酶。
具体来说，具有序列号1记载的碱基序列的基因的同源物基因包括含有与序列号1记载的碱基序列具有90％以上的同一性、优选95％以上的同一性的碱基序列的基因，更优选是缺失、取代或插入了一个或多个该基因的碱基的基因。
另外，该同源物基因包括在严格条件下将具有序列号1记载的碱基序列的基因与具有互补的碱基序列的基因杂交的基因。具体来说，通过应用针对公知的数据库的同源性检索程序(例如BLAST、FASTA)、或基于在利用由认定基因的至少一部分构成的探针(由该基因的碱基序列构成的DNA和由互补的碱基序列构成的DNA)的严格条件下的杂交或聚合酶链反应(PCR)等常规方法，能够取得基因(或由该基因的转化得到的酶)。另外，只要是本领域的技术人员，就能够通过对碱基序列进行取代，来亲自进行设计。需要说明的是，作为在此所说的严格条件，例如可以举出非专利文献Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION(Joseph Sambrook,David W.Russell.,Cold Spring Harbor Laboratory Press)中记载的进行杂交的条件。具体来说，是在包含6×SSC(1×SSC的组成：为0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠，pH：7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt溶液及100mg/mL鲱鱼精子DNA的溶液中，与探针一起在65℃下保持恒温8～16小时，进行杂交的条件。
(微生物)
作为能够导入本实施方式的基因及编码烯酰CoA水合酶的基因的转化宿主微生物的例子，只要是能够使用基因重组技术的微生物，便无特别限定。从产业利用的观点来看，作为具体例子，可以举出大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌属细菌。作为酵母，可举出酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母等。作为棒状杆菌，可举出谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、糖短杆菌、immariophilum短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)、乳发酵短杆菌、玫瑰色短杆菌、黄色短杆菌、生硫短杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、帚石南棒杆菌、百合棒状杆菌、mellassecola棒状杆菌(Corynebacterium mellassecola)、嗜氨微杆菌等。作为梭菌，可举出克氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、氨基酪酸梭菌、拜氏梭菌、saccharoperbutylacetonicum梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)等。其中，由于使用大肠杆菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母，或谷氨酸棒杆菌容易进行转化，因此优选使用，更优选使用大肠杆菌。
另外，本实施方式的转化微生物可以用于微生物培养菌体本身或其培养物的各种形态。具体来说，本实施方式中的微生物的培养物包含微生物培养菌体的培养基或由缓冲液等介质构成的悬浊物、来自微生物培养菌体的无细胞抽出液、以及从该无细胞抽出液浓缩、精炼或提取对该反应进行催化的成分的处理物等处理物。本实施方式中的微生物的培养物还包含将该微生物的处理物固定在难溶性的载体上的物质。作为该类固定载体，可以举出聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚-N-乙烯基甲酰胺、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、甲基纤维素、葡甘露聚糖、藻酸盐、角叉菜胶等、以及其共聚物或交联化物等、形成封装了该微生物菌体或其处理物的水难溶性的固体含量的化合物。其可以单独使用一种，也可以混合使用两种以上。另外，活性炭、多孔陶瓷、玻璃纤维、多孔聚合物成型体、硝化纤维素膜等、在预先作为固形物形成的物体上保持微生物或者其提取液或提取成分的物体也可以被用作微生物的培养物。
(转换方法)
如上所述，本实施方式的基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因组合并通过转化而在微生物体内表达，从而能够应用到3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换方法。
图1表示出用于对本实施方式的3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换方法进行说明的概要图。如果向下述微生物体内供给3-羟基丁酰CoA，则通过该基因的作用，羟基(OH基)发生重排反应，3-羟基丁酰CoA被转换成4-羟基丁酰CoA(S105及S107)。另外，如果向该微生物体内供给4-羟基丁酰CoA，则通过该基因的作用，OH基发生重排反应，4-羟基丁酰CoA被转换成3-羟基丁酰CoA。
序列号1所示的基因的针对氨基酸序列的翻译结果、与可参见GenBank的登记号AJ250267的源于氨基酪酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)的abfD基因的翻译结果相同。abfD基因所编码的酶的详细内容记载在Fermentation of 4-aminobutyrate byClostridium aminobutyricum:cloning of two genes involved in the formation anddehydration of 4-hydroxybutyryl-CoA,Archives of Microbiology,174(3)189-199(2000)等非专利文献中。可以认为，使序列号1所示的基因根据翻译序列及该基因所提供的反应，来编码具有4-羟基丁酰CoA脱水酶活性的酶。然而，作为比较例，当使用包含abfD基因序列的重组体时，3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换功能不产生作用。换言之，在本实施方式中，可以认为，在重组体中，通过具有序列号1的碱基序列的基因和其他基因的共表达，从而表达3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换功能。需要说明的是，对于本实施方式的序列号1所示的基因与上述abfD基因，其编码的氨基酸序列相同，但利用基因信息处理软件(GENETYX；GENETYX CORPORATION制造)的碱基序列的相同性为75％有较大不同。在使用碱基序列较大不同的基因的本实施方式中，能够提供具有3-羟基丁酰和4-羟基丁酰之间的转换效率较高的转换方法。
(1,4-丁二醇的制造方法)
对于利用上述转换方法得到的3-羟基丁酰CoA和/或4-羟基丁酰CoA，通过以其酰基CoA部位为反应点而进一步组合其他反应，从而能够使其成为用于制造丁二醇的前体。因此，本实施方式的基因能够用于高效的丁二醇(例如1,4-丁二醇)的制造方法。
图1中还表示出了用于对本实施方式的1,4-丁二醇的制造方法进行说明的概要图。在本实施方式中，使由序列号1所示的基因、编码烯酰CoA水合酶的基因、以及编码酰基CoA还原酶的基因在微生物体内表达。在这些基因表达的状态下，如果向该微生物体内供给3-羟基丁酰CoA，则首先被转换成4-羟基丁酰CoA(S105及S107)。之后，通过编码酰基CoA还原酶的基因的作用，被转换成1,4-丁二醇(S109)。另外，通过编码酰基CoA还原酶的基因的作用，3-羟基丁酰CoA被转换成未示出的1,3-丁二醇。
需要说明的是，在本实施方式中，通过使下述说明的酶或一系列的酶组在利用基因重组而转化的微生物体内共表达，从而进行反应。将编码各个酶个别地、或作为一系列簇插入到任意的载体中，对宿主微生物进行转化。通过对所得到的转化体，利用适当的碳源、例如利用以葡萄糖为碳源的培养基进行培养，从而表达各基因。当基因在宿主中能够表达时，通过在培养基中培养转化体，从而使基因表达。另一方面，当在设在载体上的调节器的控制下对各基因进行配置时，通过添加诱导基质并使其转移到诱导环境，从而使各个编码的基因表达。需要说明的是，本实施方式中的培养包括所有通常的微生物培养的培养条件，另外培养步骤意味着以用于制造丁二醇的充分的时间及条件来培养微生物。
对作为本实施方式的丁二醇的制造方法的基质的3-羟基丁酰CoA或4-羟基丁酰CoA的制造方法进行说明。首先，利用使用了在乙酰CoA的供给下，1个分子的CoA从2个分子的乙酰CoA中脱离、编码硫解酶(EC号2.3.1.9)的基因或其同源物的酶反应(S101)。需要说明的是，乙酰CoA通过糖酵解系统等已知的途径获得。接着，通过利用具有还原所得到的乙酰乙酰CoA并给予3-羟基丁酰CoA的活性的乙酰乙酰CoA还原酶(EC号：1.1.1.36)、3-羟基丁酰CoA脱氢酶(EC号：1.1.1.35)、3-羟酰CoA脱氢酶(EC号：1.1.1.157)或其同源物的酶反应，能够得到3-羟基丁酰CoA。需要说明的是，当使用乙酰乙酰CoA还原酶(EC号：1.1.1.36)时，能够获得(R)-3-羟基丁酰CoA，当使用3-羟基丁酰CoA脱氢酶(EC号：1.1.1.35)或3-羟酰CoA脱氢酶(EC号：1.1.1.157)时，能够获得(S)-3-羟基丁酰CoA。
另外，作为将CoA直接转移为3-羟基丁酸的酶，已知丙酰CoA转移酶(EC号2.8.3.1)。通过在编码丙酰CoA转移酶的基因或其同源物的表达下、且作为CoA转移反应的供体的乙酰CoA的供给下，向微生物或包含该微生物的培养物供给3-羟基丁酸，从而能够生成3-羟基丁酰CoA。另外，作为将CoA转移为4-羟基丁酸的酶，已知在Molecular analysis of the anaerobic succinate degradation pathway in Clostridiumkluyveri,Journal of Bacteriology,178(3),871-880(1996).等非专利文献中记载的4-羟基丁酰CoA；CoA变位酶。通过在编码该酶的基因或其同源物的表达下、且作为CoA转移反应的供体的乙酰CoA的供给下，向微生物或包含该微生物的培养物供给4-羟基丁酸，从而能够得到4-羟基丁酰CoA。
(其他酶及编码该酶的基因)
接着，对上述各个酶、和编码该酶的基因的具体例子进行说明。
(编码烯酰CoA水合酶的基因)
对于在本实施方式中所使用的烯酰CoA水合酶，只要是对使3-羟基丁酰CoA脱水并生成巴豆酰CoA的反应进行催化的酶，便无特别限定。
作为编码对由(S)-3-羟基丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的酶的基因的具体例子，可举出编码烯酰CoA水合酶(EC号：4.2.1.17)的基因或其同源物等。对于编码烯酰CoA水合酶(EC号：4.2.1.17)的基因的详细内容，可参见The completestereochemistry of the enzymatic dehydration of 4-hydroxybutyryl coenzyme A to crotonylcoenzyme.A.,Friedrich P,Darley DJ,Golding BT,Buckel W.,Angewandte ChemieInternational Edition,200847(17)3254-3257(2008).等非专利文献。另外，作为编码对由(R)-3-羟基丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的酶的基因，可举出编码烯酰CoA水合酶(EC号：4.2.1.119)的基因或其同源物等。对于编码烯酰CoA水合酶(EC号：4.2.1.119)的基因的详细内容，可参见Metabolism ofpoly-beta-hydroxybutyrate.II.Enzymatic synthesis of D-(-)-beta hydroxybutyrylcoenzyme A by an enoyl hydrase from Rhodospirillum rubrum.,Moskowitz GJ,MerrickJM.Journal Biochemistry.,82748-2755(1969).等非专利文献。
如上所述，对由乙酰乙酰CoA生成3-羟基丁酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA还原酶，根据所使用的酶的种类，能够生成(R)体和/或(S)体的3-羟基丁酰CoA。另外，对由3-羟基丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的烯酰CoA水合酶也具有同样的光学异构体的选择性。也即，在本实施方式的丁二醇的制造方法中，由于能够适当地组合乙酰乙酰CoA还原酶和烯酰CoA水合酶的光学选择性，因此从由乙酰乙酰CoA生成巴豆酰CoA为止的反应的收率等观点来看有利。
(编码酰基CoA还原酶的基因)
对于在本发明中使用的酰基CoA还原酶基因，只要是编码对还原4-羟基丁酰CoA的CoA位并生成1,4-丁二醇的反应进行催化的酶的基因，便可以任意地选择。具体来说，可以使用编码包含在EC号：1.2.1的一组中的、作用于醛体的氧化还原酶(例如醛脱氢酶(EC号1.2.1.10))的基因或其同源物。关于该酶的具体内容，可以参见Purification,properties,and kinetic mechanism of coenzyme A-linked aldehydedehydrogenase from Clostridium kluyveri.,Journal Arch.Biochem.Biophys.203663-75(1980).等非专利文献。
由于所得到的醛体通过宿主的醇脱氢酶而被导入醇，因此能够得到1,4-丁二醇。作为本实施方式的变形例，即使是在使具有4-羟基丁醛还原活性的醇脱氢酶一起表达的情况下，也能够得到1,4-丁二醇。另外，作为本实施方式的其他变形例，也可以使用编码具有复合功能的醛/醇还原酶的基因或其同源物，从4-羟基丁酰CoA得到1,4-丁二醇。对于该具有复合功能的酶的具体内容，可以参见Molecular Characterizationand Transcriptional Analysis of adhE2,the Gene Encoding the NADH-DependentAldehyde/Alcohol Dehydrogenase Responsible for Butanol Production in AlcohologenicCultures of Clostridium acetobutylicum ATCC 824.,Journal of Bacteriology,184(3)821-830(2002).等非专利文献。
(培养条件)
本发明的反应的最方便的实现方式例如是，将转化体在LB培养基等营养培养基中以15℃～40℃、优选18℃～37℃的温度培养24小时左右，之后移植到以通常的碳源、例如0.01～50％、优选0.1～30％的葡萄糖为碳源的培养基中，接着以同样的温度培养1小时～200小时左右，在该过程中使丁二醇积存在培养液中。另外，可以根据菌的增值或反应的进行引起的碳源的消耗，连续地或间断地添加碳源，此时的反应液中的碳源的浓度不限于上述浓度。
作为用于培养微生物的培养基碳源，可单独地或组合地利用葡萄糖、蔗糖、果糖等糖类、甘油等多元醇、乙醇、乙酸、柠檬酸、琥珀酸酸、乳酸、苯甲酸、脂肪酸等有机物质或其碱金属盐、正链烷烃等
脂肪族烃、芳香烃、或者例如蛋白胨、肉提取物、鱼肉提取物、大豆粉、麸皮等天然有机物，从而能够以通常0.01％～30％、优选0.1％～20％左右的浓度来使用。
作为用于培养微生物的培养基氮源，例如可单独地或组合地利用硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机氮化合物、尿素、尿酸等含氮有机物、或蛋白胨、肉提取物、鱼肉提取物、大豆粉等天然有机物，从而能够以通常0.01％～20％、优选0.1％～10％左右的浓度来使用。
进一步根据需要，为了改善菌的生长、酶活性，可以添加磷酸二氢钾等磷酸盐、硫酸镁、硫酸亚铁、醋酸钙、氯化锰、硫酸铜、硫酸锌、硫酸钴、硫酸镍等金属盐。添加浓度根据培养条件而不同，但通常磷酸盐为0.01％～5％，镁盐中为10ppm～1％，其他化合物中为0.1ppm～1,000ppm左右。另外，根据所选择的培养基，作为维生素、氨基酸、核酸等供给源，为了改善菌的生长、酶活性可以添加1ppm～100ppm左右的酶提取物、酪蛋白氨基酸、酵母核酸。
培养基的pH值，优选调整为4.5～9，更优选调整为5～8。另外可以利用离心分离或膜过滤等方法将在上述培养基中预先培养的微生物菌体从培养液中分离、并使其再次悬浊、反应为包含反应原料的水、生理食盐水、或与培养的pH值同等的pH值的磷酸、乙酸、硼酸、三(羟甲基)氨基甲烷等和该盐组成的缓冲液等有助于降低反应液中的杂质、简化后续生成物的分流。对于反应中的pH值，当使用足够浓度的缓冲液时通常可被维持，但当由于反应而脱离上述pH值时，优选使用氢氧化钠、氨等将其适当调整为同样的pH值。
对于在反应液中生成的丁二醇的分离回收及提纯，可在丁二醇的生成量到达实质量的时点，利用离心分离将菌体从反应液中除去后，或直接在反应液中，利用一般的有机化合物的分离回收及提纯的手段来进行。例如，从将菌体和其他从培养液中除去的滤液中，利用适当的有机溶剂进行萃取。除了将该提取物直接蒸馏除去，还进一步用适当的溶剂进行再提取、或使用硅胶等色谱仪进行提纯、或利用多极蒸馏等，来得到高纯度的丁二醇。
优选通过在反应液中积蓄丁二醇，而在反应速度降低时，根据生成物的浓度而在反应液中增加水、生理食盐水、反应缓冲液等而连续进行稀释的方法。另外在反应速度降低时，通过对菌进行分馏、将上清作为生产物溶液进行回收，并将所分馏的菌再次回收到包含反应原料的溶液或悬浊液中，从而能够恢复反应速度。该操作可使用离心分离器或分离膜等连续地或分批地实施。
(实施例)
以下，通过实施例对本发明更详细地进行说明，本发明不限定于下述实施例。
(实施例1)
在序列号3所示的基因序列(对应于4-羟基丁酰CoA；CoA变位酶)的5’末端利用通常方法完全合成GGATCC(相当于BamHl位点)，在3’末端利用通常方法完全合成附加CTCGAG(相当于Xhol位点)的平滑末端片段，得到在pUC18的多克隆位点中的Smal位点中插入的质粒。对所得到的质粒进行限制酶处理，得到包含序列3的区域的BamHl-Xhol片段。利用通常方法将该基因片段插入表达载体pET17b(Novagen公司制)的多克隆位点中的BamHl-Xhol位点中，得到pETSD3。
在序列号1所示的基因序列的5’末端利用通常方法完全合成CATATG(相当于Ndel位点)，在3’末端利用通常方法完全合成附加AAGCTT(相当于Hindlll位点)的平滑末端片段，得到在pUC18的多克隆位点中的Smal位点中插入的质粒。对所得到的质粒进行限制酶处理，得到包含序列1的区域的Ndel-Hindlll片段。利用通常方法将该基因片段插入表达载体pET17b(Novagen公司制)的多克隆位点中的Ndel-Hindlll位点中，得到pETSD1。以所得到的pETSD1为模板，使其退火为源于pETSD1的pET17b载体的T7启动子上游，并进一步对将GGATCC(相当于BamHI位点)添加在5’侧的引物及pETSD1的序列1的3’末端进行互补，并进一步利用将GAGCTC(相当于Sacl位点)添加在5’侧的引物来进行PCR，并对所得到的扩增产物进行Sacl处理，得到片段1。
利用通常方法完全合成在序列号2所示的基因序列(对应于烯酰CoA水合酶)的5’末端附加了CATATG(相当于Ndel位点)、在3’末端附加了CTCGAG(相当于Xhol位点)的平滑末端片段，得到在pUC18的多克隆位点中的Smal位点插入的质粒。对所得到的质粒进行限制酶处理，得到包含序列2的区域的Ndel-Xhol片段。利用通常方法将所得到的基因片段插入表达载体pETDuet(Novagen公司制)的多克隆位点2中的Ndel-Xhol位点中，得到pEDSD02。以该pEDSD02为模板，将其退火至源于pEDSD02的pETDuet载体的T7启动子上游，进一步对将GAGCTC(相当于Sacl位点)增加至5’侧的引物及pEDSD01的序列7的3’末端进行互补，进一步使用将GGATCC(相当于BamHl位点)的互补序列添加至5’侧的引物来进行PCR，并对所得到的扩增产物进行Sacl处理而得到片段2。
利用通常方法在Sacl位点将片段1和片段2连接(ligation)，得到包含序列1及序列2的片段3。接着，利用片段3、和以在片段3的外侧分别在两端附加pETSD3的BamHl位点的上、下游侧15bp(包括片段3的BamHl位点)的方式预先设计的引物，进行PCR。用In-Fusion HD Cloning Kit(TAKARA BIO公司制)将所得到的扩增物和pETSD3的BamHl处理片段结合，得到包含序列3、序列1及序列2的质粒pETSD123。
使用所得到的pETSD123，利用常用方法对大肠杆菌Rosetta Blue(DE3)菌株(Novagen公司制)进行转化。
将转化体pETSD123/Rosetta Blue(DE3)，用包含100mg/L的氨苄青霉素、32mg/L的氯霉素的5mL的LB培养基，以需氧条件培养12小时。将0.1mL的培养液移植到含有100mg/L的氨苄青霉素、32mg/L的氯霉素、0.2mM的IPTG、以及0.3％的4-羟基丁酸钠的5mL的评价培养基1中，在30℃下以需氧条件培养48小时。
评价培养基1的组成为：
2％  葡萄糖；
1％  蛋白胨(Difco公司制)；
0.5％  酵母提取物(Difco公司制)；
2.4％  K2HPO4；
0.6％  KH2P04；
600ppm  柠檬酸铁；
100ppm  核黄素/蒸馏水(pH7.2)。
需要说明的是，作为评价培养基1，完全混合上述组成物，在常温下搅拌2小时后，使用Φ0.45μm的过滤器进行过滤灭菌。
在本实施方式中，对于4-羟基丁酸钠，使用了基于国际公布2010/068953号公报中记载的合成方法利用下述方法来合成的4-羟基丁酸钠。一边对溶液有0.1M的NaOH的50mL的甲醇进行搅拌，一边滴下0.1M的γ-丁内酯。搅拌1小时后，通过将溶液在60℃下干燥3小时，从而得到无色的结晶。在所得到的结晶中加入纯水使其成为水溶液，将所得到的水溶液提供至HPLC(色谱柱：Shodex C18P-4E(昭和电工制)、柱温度：40℃、洗脱液：甲醇/10mM磷酸钾溶液(pH3)＝10/90、检测：UV 210nm)。确认了源于γ-丁内酯的峰值完全消失，得到了源于4-羟基丁酸钠的单一峰值。
将培养液上清供应至HPLC(色谱柱：Shodex SH-1011(昭和电工制)、柱温度：60℃、洗脱液：25mM硫酸水溶液、流速0.6mL/min、检测：差分折射检测器)。在培养液中检测到350mg/L的3-羟基丁酸。
在本实施方式中，由于编码序列3所示的4-羟基丁酰CoA；CoA变位酶的基因的作用，在培养液中添加的具有4-羟基丁酸骨架的化合物变成了4-羟基丁酰CoA。另外，由于序列1的基因及序列2的基因的作用，被转换成3-羟基丁酰CoA。可以认为，由于作为宿主的大肠杆菌所具有的硫酯酶的作用，所转换的3-羟基丁酰CoA进一步作为3-羟基丁酸被排出到培养液中。
(比较例1)
使用在实施例1中得到的质粒pETSD3，利用常规方法对大肠杆菌RosettaBlue(DE3)菌株(Novagen公司制)进行转化，得到转化体pETSD3/Rosetta Blue(DE3)。利用与实施例1同样的方法对所得到的转化体进行培养。将培养后的培养液提供至与实施例1同样的HPLC，未检测出3-羟基丁酸。
可以认为，在比较例1的方法中，由于不具有序列1及序列2的基因，因此没有这些基因的作用，未从4-羟基丁酰CoA转换到3-羟基丁酰CoA。
(比较例2)
利用进行从pETSD123上的序列1的编码区域前后向外向退火、扩增的引物，对在实施例1中得到的质粒pETSD123进行反向PCR，得到将序列1从pETSD123除去的直链平滑末端片段。
利用常规方法来完全合成序列号5所示的、源于氨基酪酸梭菌野生菌株的abfD(对应于4-羟基丁酰CoA脱水酶)基因序列的平滑末端片段。将得到的平滑末端片段和上述的直链平滑末端片段的磷酸化物连接并转化，通过利用PCR及限制酶处理的映射，得到在与序列1的同方向上单一取代插入有序列5的质粒pETSD523。
使用所得到的质粒pETSD523，得到利用常规方法转化大肠杆菌Rosetta Blue(DE3)菌株(Novagen公司制)的、转化体pETSD523/Rosetta Blue(DE3)。用与实施例1同样的方法对所得到的转化体pETSD523/Rosetta Blue(DE3)进行培养评价。在培养液中未检测出3-羟基丁酸。
可以认为，在本实施方式中，由于序列5的基因未起作用，因此未产生从4-羟基丁酰CoA到3-羟基丁酰CoA的转换。
(实施例2)
利用通常方法完全合成序列号4所示的基因序列的平滑末端片段，得到在克隆载体pUC18的多克隆位点中的Smal位点插入的质粒。以所得到的质粒为模板，对与序列4的5’末端、3’末端对应的各个15bp、以及将与包括在实施例1中所得到的pETSD123的多克隆位点中的Ndel位点CATATG的“CAT”的上游侧15bp及包括“ATG”的下游侧15bp对应的序列附加到外侧的两端各个30bp的引物进行调制并进行扩增反应，得到包含序列4的平滑末端片段。利用In-Fusion Cloning将所得到的片段、与对pETSD123进行来自限制酶位点Ndel的中央的反向PCR而得到的直链片段连接，得到包含序列1至序列4的质粒pETSD4123。
使用所得到的pETSD4123，利用常用方法对大肠杆菌Rosetta Blue(DE3)菌株(Novagen公司制)进行转化。
利用包含100mg/L的氨苄青霉素、32mg/L氯霉素的LB培养基5mL，在37℃下以需氧条件将所得到的转化体pETSD4123/Rosetta Blue(DE3)培养12小时。将0.1mL的培养液移植到包含100mg/L的氨苄青霉素、32mg/L的氯霉素、0.2mM的IPTG、以及0.3％的4-羟基丁酸钠的5mL的上述培养基1中，在30℃下以需氧条件培养48小时。将培养液上清供应至HPLC(色谱柱：Shodex SH-1011(昭和电工制)、柱温度：60℃、洗脱液：25mM硫酸水溶液、流速0.6mL/min、检测：差分折射检测器)。在培养液中检测出320mg/L的3-羟基丁酸、240mg/L的1,3-丁二醇、220mg/L的1,4-丁二醇。
在本实施方式中，由于编码序列3所示的4-羟基丁酰CoA；CoA变位酶的基因的作用，在培养液中添加的具有4-羟基丁酸骨架的化合物变成了4-羟基丁酰CoA。另外，由于序列1的基因及序列2的基因的作用，被转换成3-羟基丁酰CoA。可以认为，对于所转换的3-羟基丁酰CoA，由于编码序列4的醛还原酶的基因的作用，分别由3-羟基丁酰CoA或4-羟基丁酰CoA生成1,3-丁二醇或1,4-丁二醇，进一步由于作为宿主的大肠杆菌所具有的硫酯酶的作用，由3-羟基丁酰CoA生成3-羟基丁酸，其被排出到培养液中。
(比较例3)
对在实施例2中得到的质粒pETSD4123，用限制酶BamHl进行了处理。通过将得到的2个片段的长链侧切掉，并进行连接，从而得到除去了序列1及2的基因序列的质粒pETSD43。
利用所得到的质粒pETSD43，利用常规方法对大肠杆菌Rosetta Blue(DE3)菌株进行转化。利用与实施例2同样的方法，对所得到的转化体进行培养。在培养后的培养液中，检测出290mg/L的1,4-丁二醇，未检测出3-羟基丁酸、1,3-丁二醇。
在本实施方式中，由于编码序列3所示的4-羟基丁酰CoA；CoA变位酶的基因的作用，在培养液中添加的具有4-羟基丁酸骨架的化合物变成了4-羟基丁酰CoA。然而，由于具有序列1及序列2的碱基序列的基因未起作用，因此未从4-羟基丁酰CoA转换到3-羟基丁酰CoA。因此，可以认为，在培养后的培养液中，未检测出3-羟基丁酸、1,3-丁二醇。
(实施例3)
利用与实施例1及实施例2同样的方法，在载体pET17b的多克隆位点上个别地在上游配置T7启动子，将序列4、序列1及序列2以该顺序插入，得到质粒pETSD412。
另外，同样地，得到在载体pCDFDuet(Novagen公司制)的多克隆位点1上插入序列号6所示的碱基序列、在多克隆位点2上插入序列号7所示的碱基序列的质粒pCDSD6-7。
使用所得到的pETSD412及pCDSD6-7，利用常用方法对大肠杆菌RosettaBlue(DE3)菌株进行转化。
利用包含100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的链霉素、32mg/L氯霉素的LB培养基5mL，在37℃下以需氧条件将所得到的转化体pETSD412+pCDSD6-7/RosettaBlue(DE3)培养12小时。将0.1mL的培养液移植到包含100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的链霉素、32mg/L的氯霉素、0.2mM的IPTG的5mL的上述培养基1中，在30℃下以需氧条件培养48小时。将培养液上清供应至HPLC(色谱柱：Shodex SH-1011(昭和电工制)、柱温度：60℃、洗脱液：25mM硫酸水溶液、流速0.6mL/min、检测：差分折射检测器)。在培养液中检测出410mg/L的3-羟基丁酸、220mg/L的1,3-丁二醇、40mg/L的1,4-丁二醇。
在本实施方式中，由于具有序列6及序列7的基因的作用，以从糖酵解系统所供给的乙酰CoA为基质生成3-羟基丁酰CoA。另外，由于序列1的基因及序列2的基因的作用，一部分3-羟基丁酰CoA被转换成4-羟基丁酰CoA。可以认为，由于编码序列4的醛还原酶的基因的作用，分别由3-羟基丁酰CoA或4-羟基丁酰CoA生成1,3-丁二醇或1,4-丁二醇，进一步由于作为宿主的大肠杆菌所具有的硫酯酶的作用，由3-羟基丁酰CoA生成3-羟基丁酸，其被排出到培养液中。
(比较例4)
利用与实施例1至实施例3同样的方法，在载体pET17b的多克隆位点上个别地在上游配置T7启动子，将序列4、序列5及序列2以该顺序插入，得到质粒pETSD452。
另外，同样地，得到在载体pCDFDuet(Novagen公司制)的多克隆位点1上插入序列号6所示的碱基序列、在多克隆位点2上插入序列号7所示的碱基序列的质粒pCDSD6-7。
使用所得到的pETSD452及pCDSD6-7，利用常用方法对大肠杆菌RosettaBlue(DE3)菌株进行转化。
利用包含100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的链霉素、32mg/L氯霉素的LB培养基5mL，在37℃下以需氧条件将所得到的转化体pETSD452+pCDSD6-7/RosettaBlue(DE3)培养12小时。将0.1mL的培养液移植到包含100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的链霉素、32mg/L的氯霉素、0.2mM的IPTG的5mL的上述培养基1中，在30℃下以需氧条件培养48小时。将培养液上清供应至HPLC(色谱柱：Shodex SH-1011(昭和电工制)、柱温度：60℃、洗脱液：25mM硫酸水溶液、流速0.6mL/min、检测：差分折射检测器)。在培养液中检测出530mg/L的3-羟基丁酸、270mg/L的1,3-丁二醇。
在本实施方式中，可以认为，由于序列5的基因未起作用，因此未产生由4-羟基丁酰CoA到3-羟基丁酰CoA的转换，作为结果为生成1,4-丁二醇。
本申请以2012年9月24日申请的日本专利申请第2012-209982号作为要求优先权的基础，本申请援引该日本专利申请第2012-209982号的全部内容。

Claims (8)

1.一种基因，其为下述(a)～(c)中任一项所述的基因：
(a)具有序列号1的碱基序列的基因；
(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、取代或插入一个或多个碱基的碱基序列的基因，其中该基因具有相对于序列号1的碱基序列的90％以上的同一性的碱基序列；
(c)在严格条件下将具有序列号1记载的碱基序列的基因与具有互补的碱基序列的基因杂交的基因，
其中，所述基因通过与编码烯酰CoA水合酶的基因组合，从而能够对微生物或该微生物的培养物赋予将3-羟基丁酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA、或将4-羟基丁酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA的能力。
2.根据权利要求1所述的基因，其中，所述微生物是大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌。
3.一种微生物，其包括根据权利要求1所述的基因、以及编码烯酰CoA水合酶的基因。
4.根据权利要求3所述的微生物，其中，所述微生物还包括编码酰基CoA还原酶的基因。
5.一种转换方法，其利用根据权利要求3所述的微生物或该微生物的培养物，将3-羟基丁酰CoA转换成4-羟基丁酰CoA、或将4-羟基丁酰CoA转换成3-羟基丁酰CoA。
6.一种制造方法，其利用根据权利要求4所述的微生物或该微生物的培养物来制造1,4-丁二醇。
7.根据权利要求6所述的制造方法，其中，所述微生物包含编码乙酰乙酰CoA合酶或乙酰乙酰CoA还原酶中的至少一者的基因。
8.根据权利要求6所述的制造方法，其中，从乙酰CoA经由3-羟基丁酰CoA来制造1,4-丁二醇。
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Application publication date: 20150520

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