JPWO2014046178A1

JPWO2014046178A1 - 遺伝子、微生物、変換方法及び製造方法

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Publication number: JPWO2014046178A1
Application number: JP2014536903A
Authority: JP
Inventors: 青木　裕史; 裕史青木; 謙小木戸; 米田　正; 正米田
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Showa Denko KK
Priority date: 2012-09-24
Filing date: 2013-09-19
Publication date: 2016-08-18
Also published as: CN104640982A; WO2014046178A1; EP2899273A4; US20150232830A1; EP2899273A1

Abstract

下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子であって、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子との組み合わせにより、微生物又は該微生物の培養物に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する能力を付与できる、遺伝子。（ａ）配列番号１の塩基配列を有する遺伝子（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子

Description

本発明は遺伝子、微生物、変換方法及び製造方法に関する。

近年、化石資源の枯渇や地球温暖化対策などの観点から、再生可能資源を原料とした化合物製造プロセスが注目されている。特に、バイオマスを原料として、生物化学的プロセスで種々のポリマー原料化合物や化学品原料化合物を製造する、所謂バイオリファイナリーが広く検討されている。

バイオマスの原料転換が期待されている化合物として、ブタンジオール類（１，３−ブタンジオール及び１，４−ブタンジオールを指す。）が挙げられる。例えば、１，４−ブタンジオールは、精密有機化学品の合成原料、ポリエステル及びエンジニアリングプラスチックのモノマー単位などで使用され、１，３−ブタンジオールは、有機溶媒や化粧品基材などで使用される。１，４−ブタンジオール及び１，３−ブタンジオールのいずれの場合においても、バイオマスなどの再生可能資源を原料とした、生物化学的プロセスに対する要求が大きくなっている。

生物化学的プロセスを用いたブタンジオール類の製造方法としては、例えば、特許文献１乃至３及び非特許文献１に記載された方法が挙げられる。

特許第４３８０７０４号明細書国際公開２００８／１１５８４０号公報国際公開２０１０／１２７３１９号公報

ＨａｒｒｙＹｉｍｅｔａｌ．，ＭｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｆｏｒｄｉｒｅｃｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ，ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ，７，４４５−４５２（２０１１）．

しかしながら、特許文献１乃至３及び非特許文献１に記載された方法は、プロセスが複雑である。

上記課題に対して、経済的に１，４−ブタンジオールを得ることができる、新たな１，４−ブタンジオールの製造方法を提供する。また、当該製造方法に関連する変換方法、並びに当該製造方法及び当該変換方法に適用可能な遺伝子、微生物を提供する。

本発明者らは、上記のような課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の遺伝子が有効であることを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は以下のものを含む。
［１］下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子であって、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子との組み合わせにより、微生物又は該微生物の培養物に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する能力を付与できる、遺伝子。
（ａ）配列番号１の塩基配列を有する遺伝子
（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子

［２］前記微生物が、大腸菌、酵母、コリネバクテリウム又はクロストリジウムである［１］に記載の遺伝子。

［３］［１］に記載の遺伝子と、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子と、を含む微生物。

［４］アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を更に含む［３］に記載の微生物。

［５］［３］に記載の微生物又は該微生物の培養物を用いて、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する、変換方法。

［６］［４］に記載の微生物又は該微生物の培養物を用いて、１，４−ブタンジオールを製造する、製造方法。

［７］前記微生物が、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素又はアセトアセチルＣｏＡ還元酵素の少なくとも一方をコードする遺伝子を含む、［６］に記載の製造方法。

［８］アセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを経由して１，４−ブタンジオールを製造する、［６］に記載の製造方法。

経済的な１，４−ブタンジオールの製造方法を提供できる。また、当該製造方法に関連する変換方法、並びに当該製造方法及び当該変換方法に適用可能な遺伝子、微生物を提供できる。

本実施形態に係る３−ヒドロキシブチリルと４−ヒドロキシブチリルとの間での変換方法を説明するための概略図である。

以下、図１を用いて、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、「ＣｏＡ」とは、コエンザイムＡを意味する。

（遺伝子）
先ず、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子との組み合わせにより、微生物又は該微生物の培養物に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する能力を付与できる、本実施形態の遺伝子について説明する。

本実施形態の遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子とそのホモログである。本実施形態の遺伝子は、エノイルＣｏＡヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子と組み合わせて形質転換などにより微生物体内で発現させることで、例えば、３−ヒドロキシブチリルと４−ヒドロキシブチリルとの間での変換方法や、１，４−ブタンジオールの製造方法に適用することができる。

本実施形態におけるホモログは、オーソログ及びパラログを含む。オーソログとは、共通祖先の遺伝子から種分化により生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素の組を指す。パラログとは、同種内において、種分化でなく遺伝子重複によって生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素の組を指す。ホモログとは、オーソログ、パラログに関係なく配列に同一性を有する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素を指す。

より具体的には、配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子のホモログ遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子、より好ましくは、その遺伝子の塩基の１個若しくは数個が欠失、置換又は付加された遺伝子を含む。

また、前記ホモログ遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を含む。具体的には、公知のデータベースに対するホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）を適用して、又は、同定遺伝子の少なくとも一部から成るプローブ（当該遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）を用いたストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション若しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの常法に基づいて、遺伝子（又はその遺伝子による形質転換で得られる酵素）として取得することができる。また、当業者であれば、塩基配列を置換等することによって、自ら設計することが可能である。なお、ここで言うストリンジェントな条件としては、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ −ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬＴＨＩＲＤＥＤＩＴＩＯＮ（ＪｏｓｅｐｈＳａｍｂｒｏｏｋ，ＤａｖｉｄＷ．Ｒｕｓｓｅｌｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）の非特許文献に記載されたハイブリダイズさせる条件が挙げられる。具体的には、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムで、ｐＨ：７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート溶液及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液に、プローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温保持し、ハイブリダイズさせる条件である。

（微生物）
本実施形態の遺伝子及びエノイルＣｏＡヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子を導入することができる形質転換宿主微生物の例としては、遺伝子組み換え技術を適用することができる微生物であれば、特に限定されない。産業上の利用の観点から、具体例としては、大腸菌、酵母、コリネ型細菌、クロストリジウム属細菌が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、クリベロマイセス・ラクティス、クリベロマイセス・マルキシアヌス等が挙げられる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・エフィシエンス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・インマリオフィルム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・ロゼウム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・リリウム、コリネバクテリウム・メラセコーラ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等が挙げられる。クロストリジウム属細菌としては、クロストリジウム・クリベリ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・アミノブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムなどが挙げられる。これらの中でも、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、コリネバクテリウム・グルタミカムを使用することが、形質転換が容易であるため、好ましく、大腸菌を使用することが、より好ましい。

また、本実施形態における形質転換微生物は、微生物培養菌体そのもの又はその培養物の各種形態で使用されても良い。具体的には、本実施形態における微生物の培養物は、微生物培養菌体の培地・緩衝液等媒体による懸濁物、微生物培養菌体からの無細胞抽出液、さらにこの無細胞抽出液から当該反応を触媒する成分を濃縮・精製・抽出したもの等の処理物を含む。本実施形態における微生物の培養物は更に、前記の微生物の処理物を難溶性の担体に固定化したものを含む。このような固定化担体としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ−Ｎ−ビニルホルムアミド、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、メチルセルロース、グルコマンナン、アルギン酸塩、カラギーナン等、更にこれらの共重合、架橋化物など、前述の微生物菌体もしくはその処理物を包合した水難溶性の固形分を形成するような化合物が挙げられる。これらは１種類を単独で使用しても良く、２種類以上を混合して使用しても良い。また、活性炭、多孔質セラミックス、グラスファイバー、多孔質ポリマー成形体、ニトロセルロース膜など、予め固形物として形成された物体上に微生物もしくはその抽出液・抽出成分を保持させたものも、微生物の培養物として用いることもできる。

（変換方法）
本実施形態の遺伝子は、前述したように、エノイルＣｏＡヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子と組み合わせて形質転換などにより微生物体内で発現させることで、３−ヒドロキシブチリルと４−ヒドロキシブチリルとの間での変換方法に適用することができる。

図１に、本実施形態に係る３−ヒドロキシブチリルと４−ヒドロキシブチリルとの間での変換方法を説明するための概略図を示す。後述する微生物体内に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが供給されると、前記の遺伝子の作用により、ヒドロキシル基（ＯＨ基）が転位反応し、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換される（Ｓ１０５及びＳ１０７）。また、この微生物体内に４−ヒドロキシブチリルＣｏＡが供給されると、前記の遺伝子の作用により、ＯＨ基が転位反応し、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡが３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換される。

配列番号１で示す遺伝子の、アミノ酸配列への翻訳結果は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＡＪ２５０２６７で参照することができるクロストリジウムアミノブチリカム由来ａｂｆＤ遺伝子の翻訳結果と相同である。ａｂｆＤ遺伝子がコードする酵素の詳細は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆ４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅｂｙＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ：ｃｌｏｎｉｎｇｏｆｔｗｏｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｏｆ４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ，ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７４（３）１８９−１９９（２０００）．などの非特許文献に記載されている。配列番号１で示す遺伝子は、翻訳配列及び前記遺伝子が提供する反応から、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒトラターゼ活性を有する酵素をコードすると考えられる。しかしながら、比較例として後述するように、ａｂｆＤ遺伝子配列を含む組換え体を用いた場合では、３−ヒドロキシブチリルと４−ヒドロキシブチリルとの間での変換機能が作用しない。即ち、本実施形態においては、組換え体において、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子と他の遺伝子との共発現によって、３−ヒドロキシブチリルと４−ヒドロキシブチリルとの間での変換機能が発現すると考えられる。なお、本実施形態の配列番号１で示す遺伝子と前述のａｂｆＤ遺伝子とは、コードするアミノ酸配列は相同であるが、遺伝子情報処理ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ；ＧＥＮＥＴＹＸＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）を用いた塩基配列の相同性は７５％と大きく異なる。塩基配列が大きく異なる遺伝子を適用した本実施形態では、３−ヒドロキシブチリルと４−ヒドロキシブチリルとの間での高い変換効率を有する変換方法を提供することができる。

（１，４−ブタンジオールの製造方法）
前述の変換方法で得られる３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び／又は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、そのアシルＣｏＡ部位を反応点として更に他の反応を組み合わせることで、ブタンジオール類を製造するための前駆体とすることができる。したがって、本実施形態の遺伝子は、効率の良いブタンジオール類（例えば、１，４−ブタンジオール）の製造方法に適用することができる。

図１には、本実施形態に係る１，４−ブタンジオールの製造方法を説明するための概略図も示した。本実施形態においては、配列番号１で示される遺伝子、エノイルＣｏＡヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子、更にアシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を、微生物体内で発現させる。これらの遺伝子が発現した状態で、この微生物体内に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが供給されると、先ず、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換される（Ｓ１０５及びＳ１０７）。その後、アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子の作用により１，４−ブタンジオールに変換される（Ｓ１０９）。また、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子の作用により、図示しない１，３−ブタンジオールに変換される。

なお、本実施形態では、下記で説明する酵素又は一連の酵素群を、遺伝子組み換えにより形質転換された微生物体内で共発現させることで、反応を進行させる。各酵素をコードする遺伝子を個別に、或いは、一連のクラスターとして、任意のベクターに挿入して宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体を、適当な炭素源、例えばグルコースを炭素源とする培地により培養することで、各遺伝子を発現させる。宿主で構成発現し得る遺伝子の場合には、培地中で形質転換体を培養することで、遺伝子が発現する。一方、各遺伝子をベクター上に配されたレギュレーターの制御下で構成した場合には、誘導基質を添加し、誘導的環境へ移行することにより、各々のコードする遺伝子が発現する。なお、本実施形態における培養とは、通常の微生物培養の培養条件を全て含み、また、培養するステップとは、微生物がブタンジオール類を製造するための十分な時間及び条件で培養することを意味する。

本実施形態のブタンジオール類の製造方法の基質となる３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ又は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの製造方法について説明する。先ず、アセチルＣｏＡの供給下で、２分子のアセチルＣｏＡから１分子のＣｏＡが脱離し、アセトアセチルＣｏＡを与える、チオラーゼ（ＥＣ番号２．３．１．９）をコードする遺伝子又はそのホモログを用いた酵素反応（Ｓ１０１）を利用する。なお、アセチルＣｏＡは、解糖系などの既知のルートにより得られる。次に、得られたアセトアセチルＣｏＡを還元して３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを与える活性を有するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３６）、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．３５）、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１５７）又はこれらのホモログを用いた酵素反応により、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。なお、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）を使用した場合、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）又は３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）を使用した場合、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。

また、３−ヒドロキシブタン酸に直接ＣｏＡを転移する酵素として、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＥＣ番号２．８．３．１）が知られている。プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子又はそのホモログの発現下、かつ、ＣｏＡ転移反応のドナーとなるアセチルＣｏＡの供給下で、微生物又は該微生物を含む培養物に３−ヒドロキシブタン酸を供給することにより、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成することができる。また、４−ヒドロキシブタン酸にＣｏＡを転移する酵素としては、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅａｎａｅｒｏｂｉｃｓｕｃｃｉｎａｔｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｉｎＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７８（３），８７１−８８０（１９９６）．などの非特許文献に記載された４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素が知られている。この酵素をコードする遺伝子又はそのホモログの発現下、かつ、ＣｏＡ転移反応のドナーとなるアセチルＣｏＡ供給下で、微生物又は該微生物の培養物に４−ヒドロキシブタン酸を供給することにより、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。

（その他の酵素及び該酵素をコードする遺伝子）
次に、上述した各々の酵素と、該酵素をコードする遺伝子の具体例について、説明する。

［エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子］
本実施形態で用いられるエノイルＣｏＡヒドラターゼは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを脱水してクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。

（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の具体例としては、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子又はそのホモログが挙げられる。エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子の詳細については、Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｏｆ４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡｔｏｃｒｏｔｏｎｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅ．Ａ．，ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＰ，ＤａｒｌｅｙＤＪ，ＧｏｌｄｉｎｇＢＴ，ＢｕｃｋｅｌＷ．，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ，２００８４７（１７）３２５４−３２５７（２００８）．の非特許文献などを参照することができる。また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子としては、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１１９）をコードする遺伝子又はそのホモログなどが挙げられる。エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１１９）をコードする遺伝子の詳細については、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｐｏｌｙ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ．ＩＩ．ＥｎｚｙｍａｔｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＤ−（−）−ｂｅｔａｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡｂｙａｎｅｎｏｙｌｈｙｄｒａｓｅｆｒｏｍＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ．，ＭｏｓｋｏｗｉｔｚＧＪ，ＭｅｒｒｉｃｋＪＭ．ＪｏｕｒｎａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，８２７４８−２７５５（１９６９）．の非特許文献などを参照することができる。

前述した通り、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼは、適用する酵素の種類によって、（Ｒ）体及び／又は（Ｓ）体の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成することができる。また、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒するエノイルＣｏＡヒドラターゼも、同様の光学異性体の選択性を有する。即ち、本実施形態に係るブタンジオール類の製造方法では、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼとエノイルＣｏＡヒドラターゼの光学選択性を適切に組み合わせることができるため、アセトアセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成するまでの反応の収率などの観点から有利である。

［アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子］
本発明で用いられるアシルＣｏＡ還元酵素遺伝子は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡのＣｏＡ位を還元して１，４−ブタンジオールを生成する反応を触媒する酵素をコードするものであれば任意に選択することができる。具体的には、ＥＣ番号：１．２．１の一群に含まれる、アルデヒド体に作用する酸化還元酵素（例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．１０））をコードする遺伝子又はそのホモログを用いることができる。前述の酵素の詳細については、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄｋｉｎｅｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｏｅｎｚｙｍｅＡ−ｌｉｎｋｅｄａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｆｒｏｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ．，ＪｏｕｒｎａｌＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０３６６３−７５（１９８０）．等の非特許文献を参照することができる。

得られるアルデヒド体は、宿主のアルコールデヒドロゲナーゼによりアルコールに導かれるため、１、４−ブタンジオールを得ることができる。本実施形態の変形例として、４−ヒドロキシブタナール還元活性を持つアルコールデヒドロゲナーゼを合わせて共発現させた場合においても、１、４−ブタンジオールを得ることができる。また、本実施形態の他の変形例として、複合機能を有するアルデヒド／アルコール還元酵素をコードする遺伝子又はそのホモログを用いて、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから１，４−ブタンジオールを得ることも可能である。このような複合機能を有する酵素の詳細については、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆａｄｈＥ２，ｔｈｅＧｅｎｅＥｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅＮＡＤＨ−ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＡｌｄｅｈｙｄｅ／ＡｌｃｏｈｏｌＤｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＲｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒＢｕｔａｎｏｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＡｌｃｏｈｏｌｏｇｅｎｉｃＣｕｌｔｕｒｅｓｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＡＴＣＣ８２４．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８４（３）８２１−８３０（２００２）．などの非特許文献を参照することができる。
（培養条件）
本発明の反応は、もっとも簡便には、例えば形質転換体をLB培地などの栄養培地で15℃〜40℃、望ましくは18℃〜37℃の温度で24時間程度培養したのち、通常の炭素源、例えば0.01〜50%、望ましくは0.1〜30%のグルコースを炭素源とする培地に移殖し、引き続き同様の温度で1時間〜200時間程度培養し、その過程で培養液中にブタンジオール類を蓄積させることにより達せられる。また菌の増殖・反応の進行による炭素源の消費に応じて、連続的あるいは間欠的に炭素源を添加してもよく、この場合の炭素源の反応液中濃度は前記の限りではない。

微生物を培養するための培地炭素源としては、グルコースやシュークロース、フルクトース等の糖類、グリセロール等のポリオール、エタノールや酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、安息香酸、脂肪酸などの有機物またはこれらのアルカリ金属塩、n-パラフィンなどの脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、または例えばペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉、ふすま等の天然有機物を、単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常0.01％〜30％、望ましくは0.1％〜20％程度の濃度で用いることができる。

微生物を培養するための培地窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素化合物、また尿素、尿酸などの含窒素有機物、ペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉等の天然有機物を単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常0.01％〜20％、望ましくは0.1％〜10％程度の濃度で用いることができる。

さらに必要に応じて、リン酸2水素カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、硫酸ニッケルなどの金属塩を菌の生育、酵素活性の改善のために添加することができる。添加濃度は培養条件により異なるが、通常、リン酸塩に関しては0.01％〜5％、マグネシウム塩においては10ppm〜1％、他の化合物では0.1ppm〜1,000ppm程度である。また選択する培地により、ビタミン類、アミノ酸、核酸などの供給源として例えば酵母エキス、カザミノ酸、酵母核酸を1ppm〜100ppm程度、菌の生育、酵素活性を改善のために添加することができる。

培地のpHは、4.5〜9、望ましくは5〜8に調整することが望ましい。また前記のような培地であらかじめ培養された微生物菌体を、遠心分離、膜ろ過などの方法により培養液から分取し、反応原料を含む水、生理食塩水、または培養のpHと同等のpHに調整されたリン酸、酢酸、ホウ酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどとこれらの塩よりなる緩衝液などに再度懸濁し、反応させることは、反応液中の夾雑物を低減し、後の生成物の分取を簡便にするために有用である。反応中のpHは、充分な濃度の緩衝液を用いる場合においては通常維持されうるが、反応の進行により上記pHを逸脱する場合においては、同様のpHとなるよう水酸化ナトリウム、アンモニアなどを用いて適宜調整することが望ましい。

反応液中に生成したブタンジオール類の分離回収および精製は、ブタンジオール類の生成量が実質的な量に達した時点で、反応液から菌体を遠心分離により除去してから、あるいはそのままの反応液に、一般の有機化合物の分離回収および精製の手段を用いることで行うことができる。例えば、培養液から菌体その他を除去したろ液より、適当な有機溶媒を用いて抽出する。この抽出物をそのまま留去するほか、更に適当な溶媒で再抽出する、あるいはシリカゲル等のクロマトグラフィーを用いて精製する、もしくは多段蒸留等に供することにより、高純度のブタンジオール類が得られる。

反応液中にブタンジオール類が蓄積することにより、反応速度が低下する場合、生成物の濃度に応じて反応液中に、水、生理食塩水、反応緩衝液等を追加し連続的に希釈してゆく方法は好適である。また反応速度が低下した時点で菌を分取し、上清を生産物溶液として回収し、分取した菌は再度反応原料を含む溶液あるいは懸濁液に戻すことにより、反応速度を回復することができる。この操作は、遠心分離器や分離膜等を用いて連続的に、あるいは回分的にも実施することができる。

以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

（実施例１）
配列番号３で示される塩基配列（４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素に対応）の、５'末端にＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩサイト相当）、３'末端にＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩサイト相当）を付加した平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドを制限酵素処理して、配列３の領域を含むＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。得られた遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト中、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに常法により挿入して、プラスミドｐＥＴＳＤ３を得た。

配列番号１で示される塩基配列の、５'末端にＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩサイト相当）、３'末端にＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩサイト相当）を付加した平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドを制限酵素処理し、配列１の領域を含むＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得た。得られた遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト中、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに常法により挿入しプラスミドｐＥＴＳＤ１を得た。得られたｐＥＴＳＤ１をテンプレートとして、ｐＥＴＳＤ１のｐＥＴ１７ｂベクター由来Ｔ７プロモーター上流にアニールし、更にＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩサイト相当）を５'側に追加したプライマーと、ｐＥＴＳＤ１の配列１の３'末端を相補し、更にＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩサイト相当）を５'側に追加したプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅物をＳａｃＩ処理して、断片１を得た。

配列番号２で示される塩基配列（エノイルＣｏＡヒドラターゼに対応）の、５'末端にＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩサイト相当）、３'末端にＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩサイト相当）を付加した平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドを制限酵素処理し、配列２の領域を含むＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。得られた遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト２中、ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトに常法により挿入して、プラスミドｐＥＤＳＤ０２を得た。得られたプラスミドｐＥＤＳＤ０２をテンプレートとして、ｐＥＤＳＤ０２のｐＥＴＤｕｅｔベクター由来Ｔ７Ｌａｃプロモーター上流にアニールし、さらに、ＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩサイト相当）を５'側に追加したプライマーと、ｐＥＤＳＤ０１の配列１の３'末端を相補し、更にＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩサイト相当）の相補配列を５'側に追加したプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅物をＳａｃＩ処理して断片２を得た。

断片１及び断片２を常法によりＳａｃＩサイト同士でライゲーションし、配列１及び配列２を含む断片３を得た。次に、断片３と、断片３の外側にｐＥＴＳＤ３のＢａｍＨＩサイトの上・下流側１５ｂｐ（断片３のＢａｍＨＩサイト含む）が各々両端に付加されるよう予め設計されたプライマーとを用いて、ＰＣＲを行った。得られた増幅物と、ｐＥＴＳＤ３のＢａｍＨＩ処理断片とを、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ社製）で結合し、配列３、配列１及び配列２を含むプラスミドｐＥＴＳＤ１２３を得た。

得られたプラスミドｐＥＴＳＤ１２３を用いて、常法により大腸菌ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。

形質転換体ｐＥＴＳＤ１２３／ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭ、更に０．３％４−ヒドロキシブタン酸ナトリウムを含む５ｍＬの評価培地１に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。

評価培地１の組成は、
２％グルコース、
１％ペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、
０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、
２．４％Ｋ_２ＨＰＯ_４、
０．６％ＫＨ_２ＰＯ_４、
６００ｐｐｍクエン酸鉄、
１００ｐｐｍリボフラビン／蒸留水（ｐＨ７．２）、
とした。

なお、評価培地１としては、上述の組成物を全て混和し、常温下で２時間撹拌した後、φ０．４５μｍのフィルターを用いてろ過滅菌したものを供した。

本実施形態において、４−ヒドロキシブタン酸ナトリウムは、国際公開２０１０／０６８９５３号公報に記載された合成方法に基づいて下記の方法で合成したものを使用した。０．１ＭのＮａＯＨを溶解した５０ｍＬのメタノールを撹拌しながら、０．１Ｍのγ−ブチロラクトンを滴下した。１時間撹拌した後、溶液を６０℃で３時間乾燥することで、無色の結晶を得た。得られた結晶に純水を加えて水溶液にし、得られた水溶液をＨＰＬＣ（カラム：ＳｈｏｄｅｘＣ１８Ｐ−４Ｅ（昭和電工製）、カラム温度：４０℃、溶離液：メタノール／１０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ３）＝１０／９０、検出：ＵＶ２１０ｎｍ）に供した。γ−ブチロラクトン由来のピークが完全に消失して、４−ヒドロキシブタン酸ナトリウム由来の単一のピークが得られたことを確認した。

培養液の上清を、ＨＰＬＣ（カラム：ＳｈｏｄｅｘＳＨ−１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供した。培養液中には、３５０ｍｇ／Ｌの３−ヒドロキシブタン酸が検出された。

本実施形態においては、培養液中に添加した４−ヒドロキシブタン酸骨格を有する化合物が、配列３で示される４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素をコードする遺伝子の作用により４−ヒドロキシブチリルＣｏＡとなる。また、配列１の遺伝子及び配列２の遺伝子の作用により３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換される。変換された３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは更に、宿主である大腸菌が有するチオエステラーゼの作用により、３−ヒドロキシブタン酸として培養液中に排出されたと考えられる。

（比較例１）
実施例１で得られたプラスミドｐＥＴＳＤ３を用いて、常法により大腸菌ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換して、形質転換体ｐＥＴＳＤ３／ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）を得た。得られた形質転換体を、実施例１と同様の方法により培養した。培養後の培養液を、実施例１と同様のＨＰＬＣに供したが、３−ヒドロキシブタン酸は検出されなかった。

比較例１の方法では、配列１及び配列２の遺伝子を有さないため、これらの遺伝子の作用がなく、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換されなかったと考えられる。

（比較例２）
実施例１で得られたプラスミドｐＥＴＳＤ１２３を、ｐＥＴＳＤ１２３上の配列１のコード領域前後より外向きにアニール・増幅を行うプライマーを用いて、インバースＰＣＲし、ｐＥＴＳＤ１２３から配列１を除去した直鎖平滑末端断片を得た。

配列番号５で示される、クロストリジウム・アミノブチリカム野生株由来ａｂｆＤ（４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼに対応）遺伝子配列の平滑末端断片を常法により全合成した。得られた平滑末端断片と前述の直鎖平滑末端断片のリン酸化物をライゲーションして形質転換し、ＰＣＲ及び制限酵素処理によるマッピングから、配列１と同方向に配列５が単一置換挿入されたプラスミドｐＥＴＳＤ５２３を得た。

得られたプラスミドｐＥＴＳＤ５２３を用いて、常法により大腸菌ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した、形質転換体ｐＥＴＳＤ５２３／ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）を得た。得られた形質転換体ｐＥＴＳＤ５２３／ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）は、実施例１と同様の方法で培養評価した。培養液中には、３−ヒドロキシブタン酸が検出されなかった。

本実施形態では、配列５の遺伝子が作用しなかったため、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換が生じなかったと考えられる。

（実施例２）
配列番号４で示される塩基配列の平滑末端断片を常法により全合成し、クローニングベクターｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドをテンプレートとし、配列４の５'末端、３'末端に対応する各１５ｂｐに加え、実施例１で得られたｐＥＴＳＤ１２３のマルチクローニングサイト中のＮｄｅＩサイトＣＡＴＡＴＧの「ＣＡＴ」を含む上流側１５ｂｐ分、「ＡＴＧ」を含む下流側１５ｂｐ分に対応する配列を外側に付加した両端各３０ｂｐのプライマーを調製して増幅反応を行い、配列４を含む平滑末端断片を得た。得られた断片と、ｐＥＴＳＤ１２３を制限酵素サイトＮｄｅＩの中央からのインバースＰＣＲによって得た直鎖断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングによりライゲーションし、配列１乃至４を含むプラスミドｐＥＴＳＤ４１２３を得た。

得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４１２３を用いて、常法により大腸菌ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）株を形質転換した。

得られた形質転換体ｐＥＴＳＤ４１２３／ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭ、更に０．３％４−ヒドロキシブタン酸ナトリウムを含む５ｍＬの前記評価培地１に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。培養液上清を、ＨＰＬＣ（カラム：ＳｈｏｄｅｘＳＨ−１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供した。培養液中には、３２０ｍｇ／Ｌの３−ヒドロキシブタン酸、２４０ｍｇ／Ｌの１，３−ブタンジオール、２２０ｍｇ／Ｌの１，４−ブタンジオールが検出された。

本実施形態においては、培養液中に添加した４−ヒドロキシブタン酸骨格を有する化合物が、配列３で示される４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素をコードする遺伝子の作用により４−ヒドロキシブチリルＣｏＡとなる。また、配列１の遺伝子及び配列２の遺伝子の作用により３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換される。変換された３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、配列４のアルデヒド還元酵素をコードする遺伝子の作用により、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ又は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから、各々、１，３−ブタンジオール又は１，４−ブタンジオールが生成し、更に、宿主である大腸菌が有するチオエステラーゼの作用により、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタン酸が生成し、これらが培養液中に排出されたと考えられる。

（比較例３）
実施例２で得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４１２３を、制限酵素ＢａｍＨＩで処理した。得られた２つの断片の長鎖側を切り出し、ライゲーションすることで、配列１及び２の遺伝子配列が除去されたプラスミドｐＥＴＳＤ４３を得た。

得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４３を用いて、常法により大腸菌ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体を、実施例２と同様の方法により、培養した。培養後の培養液中には、２９０ｍｇ／Ｌの１，４−ブタンジオールが検出され、３−ヒドロキシブタン酸、１，３−ブタンジオールは検出されなかった。

本実施形態においては、培養液中に添加した４−ヒドロキシブタン酸骨格を有する化合物が、配列３で示される４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素をコードする遺伝子の作用により４−ヒドロキシブチリルＣｏＡとなる。しかしながら、配列１及び配列２の塩基配列を有する遺伝子の作用がないため、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換されない。そのため、培養後の培養液中には、３−ヒドロキシブタン酸、１，３−ブタンジオールが検出されなかったと考えられる。

（実施例３）
実施例１及び実施例２と同様の方法により、ベクターｐＥＴ１７ｂのマルチクローニングサイトに個別に上流にＴ７プロモーターを配置し、配列４、配列１及び配列２をこの順序で挿入して、プラスミドｐＥＴＳＤ４１２を得た。

また同様に、ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト１に配列番号６で示される塩基配列を、マルチクローニングサイト２に配列番号７で示される塩基配列を挿入したプラスミドｐＣＤＳＤ６−７を得た。

得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４１２及びｐＣＤＳＤ６−７を用いて、常法により大腸菌ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）株を形質転換した。

得られた形質転換体ｐＥＴＳＤ４１２＋ｐＣＤＳＤ６−７／ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含む５ｍＬの前記評価培地１に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。培養液上清を、ＨＰＬＣ（カラム：ＳｈｏｄｅｘＳＨ−１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供した。培養液中には、４１０ｍｇ／Ｌの３−ヒドロキシブタン酸、２２０ｍｇ／Ｌの１，３−ブタンジオール、４０ｍｇ／Ｌの１，４−ブタンジオールが検出された。

本実施形態では、配列６及び配列７を有する遺伝子の作用により、解糖系から供給されるアセチルＣｏＡを基質として３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが生成する。また、配列１の遺伝子及び配列２の遺伝子の作用により、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの一部が４−ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換される。配列４のアルデヒド還元酵素をコードする遺伝子の作用により、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ又は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから、各々、１，３−ブタンジオール又は１，４−ブタンジオールが生成し、更に、宿主である大腸菌が有するチオエステラーゼの作用により、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタン酸が生成し、これらが培養液中に排出されたと考えられる。

（比較例４）
実施例１乃至実施例３と同様の方法により、ベクターｐＥＴ１７ｂのマルチクローニングサイトに、個別に上流にＴ７プロモーターを配置した配列４、配列５及び配列２をこの順序で挿入したプラスミドｐＥＴＳＤ４５２を得た。

得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４５２及びｐＣＤＳＤ６−７を用いて、常法により大腸菌ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）株を形質転換した。

形質転換体ｐＥＴＳＤ４５２＋ｐＣＤＳＤ６−７／ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含む５ｍＬの前記評価培地１に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。培養液上清を、ＨＰＬＣ（カラム：ＳｈｏｄｅｘＳＨ−１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供試した。培養液中には、５３０ｍｇ／Ｌの３−ヒドロキシブタン酸、２７０ｍｇ／Ｌの１，３−ブタンジオールが検出された。

本実施形態では、配列５の遺伝子が作用しなかったため、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換が生じず、結果として１，４‐ブタンジオールが生成しなかったと考えられる。

本出願は、２０１２年９月２４日に日本国特許庁に出願された特願２０１２−２０９９８２号に基づく優先権を主張するものであり、特願２０１２−２０９９８２号の全内容を本出願に援用する。

Claims

下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子であって、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子との組み合わせにより、微生物又は該微生物の培養物に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する能力を付与できる、遺伝子。
（ａ）配列番号１の塩基配列を有する遺伝子
（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
前記微生物が、大腸菌、酵母、コリネバクテリウム又はクロストリジウムである請求項１に記載の遺伝子。
請求項１に記載の遺伝子と、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子と、を含む微生物。
アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を更に含む請求項３に記載の微生物。
請求項３に記載の微生物又は該微生物の培養物を用いて、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを４−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する、変換方法。
請求項４に記載の微生物又は該微生物の培養物を用いて、１，４−ブタンジオールを製造する、製造方法。
前記微生物が、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素又はアセトアセチルＣｏＡ還元酵素の少なくとも一方をコードする遺伝子を含む、請求項６に記載の製造方法。
アセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを経由して１，４−ブタンジオールを製造する、請求項６に記載の製造方法。