CN102533870B - 一种生物法合成异戊二烯的方法、酶系统和重组细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括通过生物法由简单碳源合成二醇或烯醇和对合成的二醇或烯醇进行脱水以获得异戊二烯的步骤，其中所述二醇可以选自2-甲基-1，4-丁二醇、3-甲基-1，3-丁二醇，所述烯醇可以是3-甲基-3-丁烯-1-醇。本发明还涉及在本发明所述合成异戊二烯化合物方法中使用的酶系统和重组细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生产异戊二烯化合物的领域，具体涉及一种利用生物法合成异戊二烯化合物的领域。
背景技术
异戊二烯又名2-甲基-1，3-丁二烯，是一种共轭二烯烃，分子式C5H8。作为一种萜类化合物，异戊二烯为不溶于水的无色液体，但能与乙醇、乙醚、丙酮和苯等溶剂混溶。自身易聚合，也易与别的不饱和化合物共聚合。若在齐格勒-纳塔催化剂下聚合，则会产生聚异戊二烯，即天然橡胶成分，具有优秀的弹性、张力等。少量异戊二烯与异丁烯共聚，会产生丁基橡胶。
异戊二烯作为一种非常重要的合成单体，主要用于生产性能接近天然橡胶的聚异戊二烯橡胶，其用量占异戊二烯总产量的95％。其次，还可以用作合成丁基橡胶的一种共聚单体，以改进丁基橡胶的硫化性能，异戊二烯还用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶等。此外，还用于制造农药、医药、香料及黏结剂等。
目前异戊二烯的生产主要通过化学法来进行，主要的合成路线有异戊烷，异戊烯脱氢法，异丁烯-甲醛法，乙炔-丙酮法，丙稀二聚法以及裂解C5馏分萃取蒸馏法等(岳鹏，2006)。化学法生产异戊二烯的原料主要来源于石油基产品，具有不可再生性，且对环境具有较大的污染性。
因此，为这种有价值的化合物的生产提供更有效更绿色的方法将是本技术领域的进步。一种有可能的解决方法是利用生物合成途径来生产异戊二烯。目前已报道的异戊二烯生物合成途径都是通过生物体中存在的两种天然代谢途径，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径进行合成的，如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了50微克/克干细胞/天的产率(Pia Lindberg等，2009)；Genencor和Goodyear公司利用MVA途径在工程大肠杆菌中进行异戊二烯的生产，取得了最高60g/L的产量(美国专利公开，2009/0203102)。
目前通过MEP途径在工程蓝藻中进行异戊二烯的生物合成只能取得很低的产量，而在工程大肠杆菌中通过MVA途径进行异戊二烯的生产虽然取得了较高的产物浓度，但是该方法已经申请了专利保护，技术引进需要大量的资金，会使得生产企业产品成本过高，且缺乏核心竞争力，不利于企业长期的健康可持续发展。因此开发不同于以上两种代谢途径，具有我国自主知识产权的异戊二烯合成新方法，对于我们打破国外技术垄断，摆脱在异戊二烯生物合成领域的被动局面，提高我们在该领域的核心竞争力，促进我国异戊二烯生物合成工业走到健康的可持续的发展道路上来，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供一种制备异戊二烯的新型方法，即从简单碳源，诸如葡萄糖的简单起始材料开始，在生物体内直接合成2-甲基-1，4-丁二醇，3-甲基-1，3-丁二醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇，再将上述三种醇经过脱水后最终制备成异戊二烯的方法、酶和重组细胞。本发明利用亮氨酸的生物合成途径、亮氨酸降解途径以及甲羟戊酸脱羧途径，构建重组细胞并表达相应酶系统，进行2-甲基-1，4-丁二醇，3-甲基-1，3-丁二醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇的生物合成。所述的酶系统、重组细胞和方法在制备异戊二烯中的应用；以及所制备的异戊二烯。所述的酶系统、重组细胞和方法在制备异戊二烯衍生物的应用。所述的酶系统、重组细胞、方法、异戊二烯、或者衍生物在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物例如：异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯—异戊二烯—苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂等。
一种合成3-甲基-1，3-丁二醇的酶系统或重组细胞，所述酶系统包括氨基转移酶，烯酰-CoA水解酶和醇醛脱氢酶；所述重组细胞是通过代谢工程野生型细胞获得的，可表达上述酶的重组细胞，这些野生型细胞为微生物细胞，包括细菌、真菌或酵母菌，例如埃希氏杆菌，芽孢杆菌，酵母，假单胞菌，链霉菌，曲霉菌等。
一种合成3-甲基-3-丁烯-1-醇的酶系统或重组细胞，所述酶系统包括HMG-CoA合成酶，HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸脱羧酶，所述重组细胞是通过代谢工程野生型细胞获得的，可表达上述酶的重组细胞，这些野生型细胞为微生物细胞，包括细菌、真菌或酵母菌，例如埃希氏杆菌，芽孢杆菌，酵母，假单胞菌，链霉菌，曲霉菌等。
一种同时合成2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基-1，3-丁二醇的酶系统或重组细胞，所述酶系统包括乙酰乳酸合成酶，酮酸还原异构酶，二羟酸脱水酶，2-异丙基苹果酸合成酶，3-异丙基苹果酸异构酶，3-异丙基苹果酸脱氢酶，酮异戊酸脱羧酶，醇脱氢酶和P450单加氧酶，所述重组细胞是通过代谢工程野生型细胞获得的，可表达上述酶的重组细胞，这些野生型细胞为微生物细胞，包括细菌、真菌或酵母菌，例如埃希氏杆菌，芽孢杆菌，酵母，假单胞菌，链霉菌，曲霉菌等。
本发明是在野生菌中过量表达了控制2-甲基-1，4-丁二醇，3-甲基-1，3-丁二醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇生物合成的一系列关键酶基因，得到的2-甲基-1，4-丁二醇，3-甲基-1，3-丁二醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇经脱水后得到异戊二烯。本发明提供的方法，突破了传统采用MEP和MVA途径进行异戊二烯生产的束缚，另辟蹊径，巧妙地利用了宿主细胞产生的代谢中间物进行异戊二烯的生产，是具有开创性的异戊二烯生产新方法。具体的合成途径示意图参见附图1-4。
具体内容如下：
1、一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括通过生物法合成二醇或烯醇和对合成的二醇或烯醇进行脱水以获得异戊二烯的步骤。
2、根据以上1所述的方法，其中所述二醇选自2-甲基-1，4-丁二醇、3-甲基-1，3-丁二醇，所述烯醇是3-甲基-3-丁烯-1-醇。
3、根据以上1所述的方法，其中所述二醇或烯醇是通过酶系统或通过培养重组细胞生物合成的。
4、根据以上1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇，且所述3-甲基-1，3-丁二醇是使用包括氨基转移酶、烯酰-CoA水解酶和醇醛脱氢酶的酶系统合成的。
5、根据以上1所述的方法，其中所述烯醇是3-甲基-3-丁烯-1-醇，且所述3-甲基-3-丁烯-1-醇是使用包括HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸脱羧酶的酶系统合成的。
6、根据以上1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇，且所述3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇是使用包括乙酰乳酸合成酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、2-异丙基苹果酸合成酶、3-异丙基苹果酸异构酶、3-异丙基苹果酸脱氢酶、酮异戊酸脱羧酶、醇脱氢酶和P450单加氧酶的酶系统合成的。
7、根据以上1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇，且通过培养具有生产3-甲基-1，3-丁二醇的能力的重组细胞来合成所述3-甲基-1，3-丁二醇，所述具有生产3-甲基-1，3-丁二醇的能力的重组细胞表达氨基转移酶基因、烯酰-CoA水解酶基因和醇醛脱氢酶基因，优选地，其中
所述氨基转移酶基因是来源于大肠杆菌的ilvE基因，或和ilvE基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和ilvE基因没有明显的同源性，但和ilvE基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述烯酰-CoA水解酶基因是来源于Pseudomonas aeruginosa的phaJ1基因，或和phaJ1基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和phaJ1基因没有明显的同源性，但和phaJ1基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述醇醛脱氢酶基因是来源于Clostridium acetobutylicum的adhE基因，或和adhE基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和adhE基因没有明显的同源性，但和adhE基因具有相同或相似功能的核酸序列。
8、根据以上1所述的方法，其中所述烯醇是3-甲基-3-丁烯-1-醇，且通过培养具有生产3-甲基-3-丁烯-1-醇的能力的重组细胞来合成所述3-甲基-3-丁烯-1-醇，所述具有生产3-甲基-3-丁烯-1-醇的能力的重组细胞表达HMG-CoA合成酶基因、HMG-CoA还原酶基因和甲羟戊酸脱羧酶基因，优选地，其中
所述HMG-CoA合成酶基因是来源于Saccharomyces cerevisiae的HMGS基因，或和HMGS基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和HMGS基因没有明显的同源性，但和HMGS基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述HMG-CoA还原酶基因是来源于S.cerevisiae的tHMGR基因，或和tHMGR基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和tHMGR基因没有明显的同源性，但和tHMGR基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述甲羟戊酸脱羧酶基因是来源于S.cerevisiae的mvd1基因，或和mvd1基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和mvd1基因没有明显的同源性，但具有甲羟戊酸脱羧功能的核酸序列。
9、根据以上1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇，且使用具有生产3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇的能力的重组细胞来合成所述3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇，所述具有生产3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇的能力的重组细胞表达乙酰乳酸合成酶基因、酮酸还原异构酶基因、二羟酸脱水酶基因、2-异丙基苹果酸合成酶基因、3-异丙基苹果酸异构酶基因、3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、酮异戊酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因和P450单加氧酶基因，优选地，其中
所述乙酰乳酸合成酶基因是来源于Bacillus subtilis的alsS基因，或和alsS基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和alsS基因没有明显的同源性，但和alsS基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述酮酸还原异构酶基因是来源于E.coli的ilvC基因，或和ilvC基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和ilvC基因没有明显的同源性，但和ilvC基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述二羟酸脱水酶基因是来源于E.coli的ilvD基因，或和ilvD基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和ilvD基因没有明显的同源性，但和ilvD基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述2-异丙基苹果酸合成酶基因是来源于E.coli的leuA基因，或和leuA基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和leuA基因没有明显的同源性，但和leuA基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述3-异丙基苹果酸异构酶基因是来源于E.coli的leuCD基因，或和leuCD基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和leuCD基因没有明显的同源性，但和leuCD基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述3-异丙基苹果酸脱氢酶基因是来源于E.coli的leuB基因，或和leuB基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和leuB基因没有明显的同源性，但和leuB基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述酮异戊酸脱羧酶基因是来源于Lactococcus lactis的kivd基因，或和kivd基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和kivd基因没有明显的同源性，但和kivd基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述醇脱氢酶基因是来源于S.cerevisiae的ADH2基因，或和ADH2基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和ADH2基因没有明显的同源性，但和ADH2基因具有相同或相似功能的核酸序列，
所述P450单加氧酶基因是来源于化学合成的P450-BM3-J基因(序列见SEQ ID NO.1)，或和P450-BM3-J基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和P450-BM3-J基因没有明显的同源性，但和P450-BM3-J基因具有相同或相似功能的核酸序列。
10、根据以上1-6中任一项所述的方法，其中所述简单碳源包括生物质碳源，如糖类、木质素、纤维素、半纤维素、淀粉或其组合。
11、根据以上7-9中任一项所述的方法，其中所述培养利用简单碳源，优选生物质碳源，如糖类、木质素、纤维素、半纤维素、淀粉或其组合；和/或所述培养优选利用摇瓶或萃取发酵方法来实施；和/或所述重组细胞优选是由微生物，包括酵母菌、真菌和细菌，如埃希氏菌属大肠杆菌(E.coli)、埃希氏杆菌、芽孢杆菌、酵母、假单胞菌、链霉菌、曲霉菌通过基因工程技术构建而成的。
12、根据前述以上任一项所述的方法，其中所述脱水包括生物法脱水或化学法脱水，所述化学法脱水优选以Al2O3作为催化剂，在加热的情况下进行。
13、一种由简单碳源合成二元醇或烯醇的酶系统，所述酶系统为在根据以上4-6中任一项所述的方法中使用的酶系统。
14、一种由简单碳源合成二元醇或烯醇的重组细胞，所述重组细胞为在根据以上7-12中任一项所述的方法中使用的重组细胞。
15、根据以上1-12中任一项所述的方法、根据以上13所述的酶系统和根据以上14所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物包括：异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯—异戊二烯—苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
附图说明
图1是利用亮氨酸降解途径生产3-甲基-1，3-丁二醇的代谢途径示意图。
图2是利用甲羟戊酸脱羧途径生产3-甲基-3-丁烯-1-醇的代谢途径示意图。
图3是利用亮氨酸生物合成途径生产2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基-1，3-丁二醇的代谢途径示意图。
图4是3-甲基-1，3-丁二醇，3-甲基-3-丁烯-1-醇和2-甲基-1，4-丁二醇脱水生成异戊二烯过程示意图。
图5是pISP01重组质粒的构建流程图。
图6是pISP012重组质粒的构建流程图。
图7是pISP03重组质粒的构建流程图。
图8是pISP21重组质粒的构建流程图。
图9是pISP212重组质粒的构建流程图。
图10是pISP24重组质粒的构建流程图。
图11是pISP11重组质粒的构建流程图。
图12是pISP112重组质粒的构建流程图。
图13是pISP13重组质粒的构建流程图。
图14A和图14B分别是3-甲基-1，3-丁二醇标准品通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
图15A和图15B分别是3-甲基-3-丁烯-1-醇标准品通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
图16A和图16B分别是2-甲基-1，4-丁二醇标准品通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
图17A和图17B分别是异戊二烯标准品通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
图18A和图18B分别是E.coli ISP0123工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
图19A和图19B分别是E.coli ISP2124工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
图20A和图20B/图20C分别是E.coli ISP1123工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
图21A和图21B分别是E.coli ISP0123工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的中间产物3-甲基-1，3-丁二醇在氧化铝的催化下加热反应生成的终产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
图22A和图22B分别是E.coli ISP2124工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的中间产物3-甲基-3-丁烯-1-醇在氧化铝的催化下加热反应生成的终产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
图23A和图23B分别是E.coli ISP1123工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的中间产物2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基-1，3-丁二醇在氧化铝的催化下加热反应生成的终产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
序列表说明
SEQ ID NO.1是P450-BM3-J基因的核苷酸序列。
具体实施方式
以下将以实施例方式，以工程大肠杆菌生产异戊二烯为例，详细描述本发明：
实施例1
通过在大肠杆菌(E.coli)中共同过量表达来源于E.coli的氨基转移酶基因(ilvE)，P.aeruginosa的烯酰-CoA水解酶基因(phaJ1)和C.acetobutylicum的醇醛脱氢酶基因(adhE)，以利用亮氨酸降解途径来生物合成中间产物3-甲基-1，3-丁二醇，生成的3-甲基-1，3-丁二醇再在Al2O3的催化下加热脱水生成终产物异戊二烯。
1.1 外源基因的克隆和表达载体的构建
1.1.1 外源基因的克隆
1.1.1.1 E.coli氨基转移酶基因的克隆
按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取E.coli K-12(购自ATCC，ATCC No.10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增氨基转移酶基因ilvE，Gene ID：6058370。PCR扩增采用的引物序列如下：
ilvE-F：5’-CATGCCATGGGCATGACCACGAAGAAAGCTG
ilvE-R：5’-CGGGATCCTTATTGATTAACTTGATCTAAC
PCR反应条件如下：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒，48-58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，最后72℃延伸10分钟。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
1.1.1.2 P.aeruginosa的烯酰-CoA水解酶基因的克隆
按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取P.aeruginosa(Schroeter)Migula(购自ATCC，ATCC No.10197)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增烯酰-CoA水解酶基因phaJ1，GeneID：7176431。PCR扩增采用的引物序列如下：
phaJ1-F：5’-GGAATTCCATATGAGCCAGGTCCAGAACATTC
phaJ1-R：5’-CACGATATCTTATCAGCCGATGCTGATCGGCG
PCR反应条件如1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
1.1.1.3 C.acetobutylicum的醇醛脱氢酶基因的克隆
按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取C.acetobutylicum ATCC 824(ATCC No.824TM)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增醇醛脱氢酶基因adhE，GeneID：1116040。PCR扩增采用的引物序列如下：
adhE-F：5’-CATGCCATGGGCATGAAAGTTACAAATCAAAAAG
adhE-R：5’-CGGGATCCTTAAAATGATTTTATATAGATATC
PCR反应条件如1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
1.1.2 表达载体的构建
1.1.2.1 pISP01载体的构建
将胶回收后的phaJ1基因与pACYCDuet-1载体(购自Novagen)分别用NdeⅠ和EcoRⅤ进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物42℃热激转化E.coli DH5α感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRaCode D9057)，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为phaJ1-F和phaJ1-R(见上)，反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pISP01(图5)后，再通过限制性酶切和测序验证。
1.1.2.2 pISP012载体的构建
将胶回收后的ilvE基因与pISP01载体用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物42℃热激转化E.coli DH5α感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRa Code D9057)，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增采用的引物序列如下：
DuetUP1：5’-GGATCTCGACGCTCTCCCT
DuetDOWN1：5’-GATTATGCGGCCGTGTACAA
PCR反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pISP012(图6)后，再通过限制性酶切和测序验证。
1.1.2.3 pISP03载体的构建
将胶回收后的adhE基因与pET-28a(+)载体(购自Novagen)用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物42℃热激转化E.coli DH5α感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRa Code D9057)，然后涂布加有50μg·mL-1卡那霉素素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为adhE-F和adhE-R(见上)，PCR反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pISP03(图7)后，再通过限制性酶切和测序验证。
1.2 E.coli ISP0123重组菌株的构建
pISP012和pISP03两个重组质粒共同42℃热激转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(购自Invitrogen，SKU#C6000-03)，涂布加有氯霉素和卡那霉素两种抗生素的LB固体平板，通过PCR分别对E.coli ISP0123中的phaJ1，ilvE和adhE等三个基因进行验证，PCR反应所采用的引物和反应条件同实施例1.1.2.1，1.1.2.2和1.1.2.3中所采用的引物和反应条件。三个PCR反应均为阳性的克隆即为含有pISP012和pISP03两个表达载体的工程大肠杆菌E.coli ISP0123。
1.3 工程大肠杆菌E.coli ISP0123的摇瓶培养
将E.coli ISP0123按1∶100的比例接种到装有M9液体培养基(0.6％磷酸氢二钠，0.3％磷酸二氢钾，0.1％氯化铵，0.05％氯化钠，0.025％硫酸镁，2％葡萄糖)的摇瓶中，培养基中含有50μg·mL-1的卡那霉素和34μg·mL-1氯霉素，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1～1.0mmol·L-1，然后在25～30℃，180～225rpm条件下，继续诱导培养24-72h。
1.4 工程大肠杆菌E.coli ISP0123的发酵罐培养
将E.coli ISP0123按1∶100的比例接种到装有M9液体培养基的发酵罐中，培养基中含有50μg·mL-1的卡那霉素和34μg·mL-1氯霉素，在温度为37℃，溶氧为10％-30％，pH为6.0-8.0条件下培养，当OD600nm为1.0～3.0时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1～1.0mmol·L-1，然后在温度为25℃-37℃，溶氧为10％-30％，pH为6.0-8.0条件下，继续诱导培养24-72h，期间不断补加葡萄糖，并控制残糖量在0.1％-0.3％。
1.5 3-甲基-1，3-丁二醇产物分离
在发酵液中加入50～400ppm的非离子型絮凝剂丙烯酰胺-甲基丙烯酸-2-羟基丙酯基三甲基氯化铵共聚物(也可以使用聚α-氰基丙烯酸甲酯或聚烷基酚-环氧乙烷等)，除去菌体固形物和蛋白质，用酸调节发酵液的pH为1～3。发酵液用15％～40％的丙醛、丁醛、异丁醛或异戊醛进行反应萃取，醇与醛发生缩醛反应形成缩醛，并被萃取到有机相。萃取相中加入5％～15％的水，通过填有固体酸的精馏塔进行反应精馏，醛类分离出后使得缩醛水解反应得以正向进行，得到3-甲基-1，3-丁二醇，同时回收醛类。
1.6 3-甲基-1，3-丁二醇产物测定
得到的3-甲基-1，3-丁二醇通过Agilent 5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对其进行分析测定。采用毛细管色谱柱(Agilent HP-INNO Wax 30m，0.32mm，0.25μm.)，方法为50℃维持2分钟，然后10℃/分钟程序升温至240℃，240℃维持3分钟。实验结果显示，样品峰的保留时间(图18A)和3-甲基-1，3-丁二醇标准品(购自阿拉丁，货号：1105718)峰的保留时间(图14A)一致，而且样品峰的质谱图(图18B)和3-甲基-1，3-丁二醇标准品的质谱图(图14B)一致，证明工程大肠杆菌E.coli ISP0123可以生产3-甲基-1，3-丁二醇。
1.7 异戊二烯的生产
以Al2O3作为催化剂，将3-甲基-1，3-丁二醇在300℃以上的温度下进行加热脱水，即可以获得异戊二烯。得到的异戊二烯通过Agilent 5975C GC-MS系统对其进行分析。采用Agilent DB-5毛细管色谱柱(50m，0.25mm，0.25μm)，方法为40℃维持1分钟，然后5℃/分钟程序升温至80℃，继续25℃/分钟升温至300℃，300℃维持5分钟。实验结果显示，样品峰的保留时间(图21A)和异戊二烯标准品(购自TCI，产品编码：I0160)峰的保留时间(图17A)一致，而且样品峰的质谱图(图21B)和标准谱图库中异戊二烯标准品的质谱图(图17B)一致，因此证明了异戊二烯的产生，同时也说明了该方法确实能够利用糖类原料来合成异戊二烯。
实施例2
通过在大肠杆菌(E.coli)中共同过量表达来源于Saccharomyces cerevisiae的HMG-CoA合成酶基因(HMGS)，来源于S.cerevisiae的HMG-CoA还原酶基因(tHMGR)和来源于S.cerevisiae的甲羟戊酸脱羧酶基因(mvd1)，以利用甲羟戊酸脱羧途径来生物合成中间产物3-甲基-3-丁烯-1-醇，生成的3-甲基-3-丁烯-1-醇再在Al2O3的催化下加热脱水生成终产物异戊二烯。
2.1 外源基因的克隆和表达载体的构建
2.1.1 外源基因的克隆
2.1.1.1 S.cerevisiae HMG-CoA合成酶基因的克隆
按照酵母基因组提取试剂盒(OMEGA，Cat.No.D3370-01)提供的操作步骤，提取S.cerevisiae M4054(购自ATCC，ATCC No.200528)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增HMG-CoA合成酶基因HMGS，Gene ID：854913。PCR扩增采用的引物序列如下：
HMGS-F：5’-GGAATTCCATATGAAACTCTCAACTAAACTTTG
HMGS-R：5’-CACCTCGAGTTATTTTTTAACATCGTAAGATC
PCR反应条件如1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
2.1.1.2 S.cerevisiae HMG-CoA还原酶基因的克隆
按照酵母基因组提取试剂盒(OMEGA，Cat.No.D3370-01)提供的操作步骤，提取S.cerevisiae M4054(购自ATCC，ATCC No.200528)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增HMG-CoA还原酶基因tHMGR，Gene ID：854900。PCR扩增采用的引物序列如下：
tHMGR-F：5’-CATGCCATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAG
tHMGR-R：5’-CGGGATCCTTAGGATTTAATGCAGGTGACG
PCR反应条件如1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
2.1.1.3 S.cerevisiae甲羟戊酸脱羧酶基因的克隆
按照酵母基因组提取试剂盒(OMEGA，Cat.No.D3370-01)提供的操作步骤，提取S.cerevisiae M4054(购自ATCC，ATCC No.200528)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增甲羟戊酸脱羧酶基因mvd1，Gene ID：855779。PCR扩增采用的引物序列如下：
mvd1-F：5’-GGAATTCCATATGACCGTTTACACAGCATCC
mvd1-R：5’-CGGAATTCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTC
PCR反应条件如1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
2.1.2 表达载体的构建
2.1.2.1 pISP21载体的构建(图8)
将胶回收后的HMGS基因与pACYCDuet-1载体(购自Novagen)分别用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，连接、转化、提取及验证过程参见1.1.2.1，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为HMGS-F和HMGS-R(见上)。获得的重组质粒称为pISP21。
2.1.2.2 pISP212载体的构建(图9)
将胶回收后的tHMGR基因与pISP21载体用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，连接、转化、提取及验证过程参见1.1.2.2，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为tHMGR-F和tHMGR-R(见上)。获得的重组质粒称为pISP212。
2.1.2.3 pISP24载体的构建(图10)
将胶回收后的mvd1基因与pET-30a(+)载体(购自Novagen)用Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，连接、、提取转化及验证过程参见1.1.2.3，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为mvd1-F和mvd1-R(见上)。获得的重组质粒称为pISP24。
2.2 E.coli ISP2124重组菌株的构建
pISP212和pISP24两个重组质粒共同42℃热激转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen，SKU #C6000-03)，涂布加有氯霉素和卡那霉素两种抗生素的LB固体平板，通过PCR分别对E.coli ISP2124中的HMGS，tHMGR和mvd1等三个基因进行验证，PCR反应所采用的引物和反应条件同实施例2.1.1.1，2.1.1.2和2.1.1.3中所采用的引物和反应条件。三个PCR反应均为阳性的克隆即为含有pISP212和pISP24两个表达载体的工程大肠杆菌E.coli ISP2124。
2.3 工程大肠杆菌E.coli ISP2124的摇瓶培养，方法参见1.3。
2.4 工程大肠杆菌E.coli ISP2124的发酵罐培养，方法参见1.4。
2.5 3-甲基-3-丁烯-1-醇产物分离，方法参见1.5。
2.6 3-甲基-3-丁烯-1-醇产物测定
检测方法参见1.6。实验结果显示，样品峰的保留时间(图19A)和3-甲基-3-丁烯-1-醇标准品(购自TCI，产品编码：M0726)峰的保留时间(图15A)一致，而且样品峰的质谱图(图19B)和标准谱库中3-甲基-3-丁烯-1-醇标准品的质谱图(图15B)一致，证明工程大肠杆菌E.coli ISP2124确实可以生产3-甲基-3-丁烯-1-醇。
2.7 异戊二烯的生产
方法参见1.7。实验结果显示，样品峰的保留时间(图22A)和异戊二烯标准品(购自TCI，产品编码：I0160)峰的保留时间(图17A)一致，而且样品峰的质谱图(图22B)和标准谱图库中异戊二烯标准品的质谱图(图17B)一致，因此证明了异戊二烯的产生，同时也说明了该方法确实能够利用糖类原料来合成异戊二烯。
实施例3
通过在大肠杆菌(E.coli)中共同过量表达相关基因，生物合成中间产物3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇，产生的3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇再在Al2O3的催化下加热脱水生成终产物异戊二烯。
3.1 外源基因的克隆和表达载体的构建
3.1.1 外源基因的克隆
3.1.1.1 B.subtilis乙酰乳酸合成酶基因alsS的克隆
按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取B.subtilis BU169(购自ATCC，ATCC No.10774)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增来源于B.subtilis的乙酰乳酸合成酶基因alsS，Gene ID：936852。PCR扩增采用的引物序列如下：
alsS-F：5’-CTCAGATCTATGACAAAAGCAACAAAAGAAC
alsS-R：5’-AGCCATGGTATATCTCCTTATTAAACTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAGT
反应条件同1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
3.1.1.2 E.coli酮酸还原异构酶基因ilvC的克隆
按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取E.coli K-12(购自ATCC，ATCC No.10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增酮酸还原异构酶基因ilvC，GeneID：948286。PCR扩增采用的引物序列如下：
ilvC-F：5’-ACTCATGAAAACGAAAGCTCTCTAGTTTAATAAGGAGATATACCATGGCTAACTACTTCAATACACTG
ilvC-R：5’-CACCTCGAGTTAACCCGCAACAGCAATACGTTTC
PCR反应条件同1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
3.1.1.3 E.coli的二羟酸脱水酶基因ilvD的克隆
按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取E.coli K-12(购自ATCC，ATCC No.10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增二羟酸脱水酶基因ilvD，GeneID：948277。PCR扩增采用的引物序列如下：
ilvD-F：5’-CAAAACAACCTGCGTTTATGAATTAATTTAATAAGGAGATATACCATGCCTAAGTACCGTTCCGCCACCA
ilvD-R：5’-CATCGTCGACTTAACCCCCCAGTTTCGATTTATCG
PCR反应条件同1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
3.1.1.4 E.coli的2-异丙基苹果酸合成酶基因leuA，3-异丙基苹果酸异构酶大亚基基因leuC，3-异丙基苹果酸异构酶小亚基基因leuD，3-异丙基苹果酸脱氢酶基因leuB的克隆
按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取E.coli K-12(购自ATCC，ATCC No.10798)的基因组DNA。leuA，leuB，leuC和leuD共同位于一个基因簇leuABCD，因此将四个基因作为一个整体进行克隆，leuA，leuB，leuC和leuD四个基因的GeneID依次分别为947465，944798，945076，945642。根据GenBank序列设计引物，PCR扩增leuABCD。PCR扩增采用的引物序列如下：
leuABCD-F：5’-CAGAGCTCATGAGCCAGCAAGTCATTATTTTCG
leuABCD-R：5’-AGGCATGGTATATCTCCTTATTAAATTAATTCATAAACGCAGGTTGTTTTG
PCR反应条件同1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
3.1.1.5 L.lactis酮异戊酸脱羧酶基因kivd的克隆
按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取L.lactis subsp.Lactis(购自ATCC，ATCC No.11007)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增酮异戊酸脱羧酶基因kivd，GeneID：8678808。PCR扩增采用的引物序列如下：
kivD-F：5’-CATGCCATGGATGTATACAGTAGGAGATTACCTAT
kivD-R：5’-AGACATGGTATATCTCCTTATTAAATTATGATTTATTTTGTTCAGCAAAT
PCR反应条件同1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
3.1.1.6 S.cerevisiae醇脱氢酶基因ADH2的克隆
按照酵母基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3370-01)提供的操作步骤，提取S.cerevisiae M4054(购自ATCC，ATCC No.200528)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增醇脱氢酶基因ADH2，GeneID：855349。PCR扩增采用的引物序列如下：
ADH2-F：5’-ATTTGCTGAACAAAATAAATCATAATTTAATAAGGAGATATACCATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAG
ADH2-R 1：5’-TTATTTAGAAGTGTCAACAACGTAT
PCR反应条件同1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。
3.1.1.7 P450单加氧酶基因P450-BM3-J的克隆
P450-BM3-J基因通过化学合成(合成自上海捷瑞生物工程有限公司)获得，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.1.2 融合基因的构建
3.1.2.1 alsS-ilvC融合基因的构建
将切胶回收后的alsS基因和ilvC基因等摩尔混合后互为引物进行PCR反应条件同1.1.1.1。扩增得到的产物作为模板，以alsS-F和ilvC-R作为引物扩增全长的alsS-ilvC融合基因，PCR反应条件同1.1.1.1。
3.1.2.2 leuABCD-ilvD融合基因的构建
将切胶回收后的leuABCD基因和ilvD基因等摩尔混合后互为引物进行PCR扩增，PCR反应条件同1.1.1.1。扩增得到的产物作为模板，以leuABCD-F和ilvD-R作为引物扩增全长的leuABCD-ilvD融合基因，PCR反应条件同1.1.1.1。
3.1.2.3 kivD-ADH2-P450-BM3-J融合基因的构建
将切胶回收后的kivD基因和ADH2基因等摩尔混合后互为引物进行PCR扩增，反应条件同1.1.1.1。扩增得到的产物作为模板，以kivD-F和ADH2-R1作为引物扩增全长的kivD-ADH2-1融合基因，PCR反应条件同1.1.1.1。
以kivD-ADH2-1为模板，kivD-F和ADH2-R2作为引物扩增获得kivD-ADH2-2，以全基因合成产物为模板，BM3-J-F和BM3-J-R为引物扩增获得P450-BM3-J基因。引物序列如下：
ADH2-R2：5’-TGTCATGGTATATCTCCTTATTAAATTATTTAGAAGTGTCAACAACGTAT
BM3-J-F：5’-ATACGTTGTTGACACTTTCAAATAATTTAATAAGGAGATATACCATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGC，
BM3-J-R：CACCTCGAGTTACCCAGCCCACACGTCTTTTGCG
将得到的kivD-ADH2-2基因与P450-BM3-J基因等摩尔混合后互为引物进行PCR扩增，PCR反应条件同1.1.1.1。扩增得到的产物作为模板，以kivD-F和BM3-J-R作为引物扩增全长的kivD-ADH2-P450-BM3-J融合基因，PCR反应条件同1.1.1.1。
3.1.3 表达载体的构建
3.1.3.1 pISP11载体的构建(图11)
将alsS-ilvC与pACYCDuet-1载体(购自Novagen)分别用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ进行双酶切，连接、转化、提取及验证参见1.1.2.1，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为alsS-F和ilvC-R(见上)。获得的重组质粒称为pISP11。
3.1.3.2 pISP112载体的构建(图12)
将leuACDB-ilvD融合基因与pISP11载体分别用Sac Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切，连接、转化、提取及验证同1.1.2.1，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为leuABCD-F和ilvD-R(见上)。获得的重组质粒称为pISP112。
3.1.3.3 pISP13载体的构建(图13)
将kivD-ADH2-P450-BM3-J融合基因与pTrcHis2B载体(购自Invitrogen)分别用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，连接、转化、提取及验证同1.1.2.3，仅筛选用抗生素变为50μg·mL-1氨苄青霉素。并且PCR筛选阳性克隆时使用的引物为kivD-F和BM3-J-R(见上。获得的重组质粒称为pISP13。
3.2 E.cloi ISP1123重组菌株的构建
pISP112和pISP13两个重组质粒共同42℃热激转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen，SKU #C6000-03)，涂布加有氯霉素和氨苄青霉素两种抗生素的LB固体平板，通过PCR分别对E.coli ISP1123中的alsS-ilvC，leuACDB-ilvD和kivd-ADH2-P450-BM3-J等三个基因进行验证，PCR反应所采用的引物和反应条件同实施例3.1.2.1，3.1.2.2和3.1.2.3中所采用的引物和反应条件。三个PCR反应均为阳性的克隆即为含有pISP112和pISP13两个表达载体的工程大肠杆菌E.coli ISP1123。
3.3 工程大肠杆菌E.coli ISP1123的摇瓶培养，参见1.3。
3.4 工程大肠杆菌E.coli ISP1123的发酵罐培养，参见1.4。
3.5 2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基-1，3-丁二醇产物分离，参见1.5。
3.6 2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基-1，3-丁二醇产物测定
参见1.6。实验结果显示，样品峰的保留时间(图20A)分别和3-甲基-1，3-丁二醇标准品(购自阿拉丁，货号：1105718)峰(图14A)和2-甲基-1，4-丁二醇标准品(购自TCI，产品编码：M1234)峰(图16A)的保留时间一致，而且样品峰的质谱图(图20B和图20C)分别和3-甲基-1，3-丁二醇标准品的质谱图(图14B)和2-甲基-1，4-丁二醇标准品的质谱图(图16B)一致，证明工程大肠杆菌E.coli ISP1123确实可以生物合成3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇。
3.7 异戊二烯的生产
参见1.7。实验结果显示，样品峰的保留时间(图23A)和异戊二烯标准品(购自TCI，产品编码：I0160)峰的保留时间(图17A)一致，而且样品峰的质谱图(图23B)和标准谱图库中异戊二烯标准品的质谱图(图17B)一致，因此证明了异戊二烯的产生，同时也说明了该方法确实能够利用糖类原料来合成异戊二烯。
Claims (4)
1.一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括以葡萄糖为原料，通过培养重组细胞生物合成2-甲基-1，4-丁二醇、3-甲基-1，3-丁二醇或3-甲基-3-丁烯-1-醇和进一步脱水以获得异戊二烯的步骤，其中
所述3-甲基-1，3-丁二醇是通过培养具有生产3-甲基-1，3-丁二醇的能力的重组细胞合成的，所述具有生产3-甲基-1，3-丁二醇的能力的重组细胞表达氨基转移酶基因、烯酰-CoA水解酶基因和醇醛脱氢酶基因，其中
所述氨基转移酶基因是来源于大肠杆菌的ilvE基因，
所述烯酰-CoA水解酶基因是来源于Pseudomonas aeruginosa的phaJ1基因，
所述醇醛脱氢酶基因是来源于Clostridium acetobutylicum的adhE基因；
所述3-甲基-3-丁烯-1-醇是通过培养具有生产3-甲基-3-丁烯-1-醇的能力的重组细胞合成的，所述具有生产3-甲基-3-丁烯-1-醇的能力的重组细胞表达HMG-CoA合成酶基因、HMG-CoA还原酶基因和甲羟戊酸脱羧酶基因，其中
所述HMG-CoA合成酶基因是来源于Saccharomyces cerevisiae的HMGS基因，
所述HMG-CoA还原酶基因是来源于S.cerevisiae的tHMGR基因，
所述甲羟戊酸脱羧酶基因是来源于S.cerevisiae的mvdl基因；并且
所述3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇是使用具有生产3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇的能力的重组细胞合成的，所述具有生产3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇的能力的重组细胞表达乙酰乳酸合成酶基因、酮酸还原异构酶基因、二羟酸脱水酶基因、2-异丙基苹果酸合成酶基因、3-异丙基苹果酸异构酶基因、3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、酮异戊酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因和P450单加氧酶基因，其中
所述乙酰乳酸合成酶基因是来源于Bacillus subtilis的alsS基因，
所述酮酸还原异构酶基因是来源于E.coli的ilvC基因，
所述二羟酸脱水酶基因是来源于E.coli的ilvD基因，
所述2-异丙基苹果酸合成酶基因是来源于E.coli的leuA基因，
所述3-异丙基苹果酸异构酶基因是来源于E.coli的leuCD基因，
所述3-异丙基苹果酸脱氢酶基因是来源于E.coli的leuB基因，
所述酮异戊酸脱羧酶基因是来源于Lactococcus lactis的kivd基因，
所述醇脱氢酶基因是来源于S. cerevisiae的ADH2基因，
所述P450单加氧酶基因是来源于化学合成的P450-BM3-J基因，其中所述P450-BM3-J基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱水选自生物法脱水或化学法脱水，其中所述化学法脱水以Al2O3作为催化剂，在加热的情况下进行。
3.一种由葡萄糖合成二元醇或烯醇的重组细胞，所述重组细胞为在根据权利要求1所述的方法中使用的重组细胞。
4.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求3所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物选自：异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂或催化剂。
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