CN103540558B

CN103540558B - 一种生物法合成异戊烯醇的方法

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Publication number: CN103540558B
Application number: CN201210243034.4A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 郑艳宁; 刘炜
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2032-07-12
Also published as: CN103540558A

Abstract

本发明提供了一种重组大肠杆菌菌株、该菌株的制备方法以及利用该重组大肠杆菌菌株通过生物法合成异戊烯醇的方法。本发明通过在大肠杆菌体内构建并改造甲羟戊酸途径(MVA途径)，通过表达大肠杆菌自身的焦磷酸酶，使工程大肠杆菌菌株可以高特异性合成产物组成超过80％的异戊烯醇。

Description

一种生物法合成异戊烯醇的方法

技术领域

本发明涉及异戊烯醇化合物的生物合成，具体地涉及一种重组大肠杆菌工程菌株、该菌株的制备方法以及利用该重组大肠杆菌工程菌株合成异戊烯醇化合物的方法。

背景技术

异戊烯醇又名3-甲基-2-丁烯-1-醇(3-Methyl-2-butene-1-ol)，相对分子质量为86.13，密度0.848g/CB，沸点140℃，闪点43℃，为无色透明液体，在水中的溶解度为170g/L(20℃)。异戊烯醇主要用于合成高效低毒农药拟除虫菊酯类杀虫剂的中间体贲亭酸酯(以甲酯、乙酯为主)，以及其下游产品二氯菊酸酯、DV菊酰氯(二氯菊氯)等，另外还可作为合成香料的中间体。目前的三种合成路线各有优缺点：(1)以异丁烯为原料的方法，反应在高温高压下进行，条件苛刻，且设备投资较大；(2)以异戊二烯为原料的方法，氯化氢参与反应，反应相对较为容易，但对设备腐蚀性较大，而且存在反应物醋酸钠分离困难的问题；(3)以丙酮为原料的方法源于乙炔化工，原料成本高于石油化工，由于我国是乙炔大国，故本法较适合国情。但此法须在贵金属催化剂存在的情况下进行催化加氢，使得反应操作复杂，成本升高。

为异戊烯醇的生产提供更有效更绿色的方法将是本技术领域的进步。一种有可能的解决方法是利用生物合成途径来生产异戊烯。工程大肠杆菌具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此工程大肠杆菌作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而再利用MVA途径的终产物二甲基丙烯基焦磷酸作为直接前体来转化生产异戊二烯(美国专利公开，2009/0203102)。MVA途径首先在甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的作用下利用糖来合成甲羟戊酸，然后甲羟戊酸再在甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的作用下转化为异戊烯基焦磷酸(IPP)，IPP再在异戊烯基焦磷酸异构酶的作用下转化为二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。

高特异性生产异戊烯醇可以简化产物分离，从而有效节约生产成本和生产周期，无疑将会产生重要的经济效益。为了高特异性生产异戊烯醇，需要找到一种能够高特异性水解DMAPP的焦磷酸酶，但是目前尚没有关于焦磷酸酶底物特异性研究的报道，缺少一种能够高特异性水解DMAPP的焦磷酸酶。Wither等鉴定了一种来源于枯草芽孢杆菌的焦磷酸酶基因，并通过体内和体外反应进行了其功能，发现其能够水解IPP和DMAPP生成异戊烯醇和异戊二烯醇(Witheretal，2007)，但没有对其底物特异性进行研究，也没有对异戊烯醇和异戊二烯醇生产途径进行优化。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明主要通过代谢工程改造甲羟戊酸途径(MVA途径)，特别是过量表达来源于大肠杆菌的焦磷酸酶，从而在工程大肠杆菌中实现了高特异性生产产物组成超过80％以上的异戊烯醇。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌菌株，其包含：

(1)编码羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因片段和编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段或分别与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性的核酸分子；

(2)编码甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶的基因片段或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶基因具有70％以上同源性的核酸分子；

(3)编码焦磷酸酶的基因片段，或与焦磷酸酶基因具有70％以上同源性的核酸分子，或与焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且对二甲基丙烯基焦磷酸具有明显底物偏爱性的核酸分子。

在第二个方面，本发明提供了一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备包含羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因具有70％以上同源性的核酸序列的重组质粒A；

(2)将重组质粒A与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性的核酸序列连接成重组质粒B；

(3)制备包含甲羟戊酸激酶基因片段、磷酸甲羟戊酸激酶基因片段、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因片段和异戊烯基焦磷酸异构酶基因片段或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶基因具有70％以上同源性的核酸分子的重组质粒C；

(4)制备包含焦磷酸酶基因片段，或与焦磷酸酶基因具有70％以上同源性的核酸分子，或与焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且对二甲基丙烯基焦磷酸具有明显底物偏爱性的核酸分子的重组质粒D；

(5)将重组质粒B、C和D共同转化大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得含有三种重组质粒的工程重组大肠杆菌菌株。

在第三个方面，本发明提供了一种合成异戊烯的方法，该方法包括将本发明的工程重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含合适的碳源和诱导剂的培养基中进行培养，在培养过程中不断通入空气，从尾气中分离包含异戊烯醇的产物。

本发明的有益效果如下：

1.本发明的方法可以以可再生糖类为原料。

2.根据本发明的方法制备的异戊烯醇的摇瓶总产量超过200mg/L，而且异戊烯醇在产物中的比例占80％以上。

3.本发明经济、绿色，从根本上解决了目前异戊烯醇生产中存在的原料不可持续、污染严重、成本高等瓶颈问题。

附图说明

图1图示了本发明的大肠杆菌体内合成异戊烯醇的途径。

图2图示了通过本发明的方法生产的异戊烯醇的气相色谱图，其中图2A为异戊烯醇和异戊二烯醇标准品的峰，图2B为通过本发明生产的异戊烯醇等产物的峰。

图3是pISP213重组质粒的构建流程图。

图4是pISP214重组质粒的构建流程图。

图5是pTtrc-lower重组质粒的构建流程图。

图6是pYY16重组质粒的构建流程图。

具体实施方式

本发明通过基因工程在大肠杆菌细胞中引入HMG-CoA合成酶基因，HMG-CoA还原酶基因，甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因和异戊烯基焦磷酸异构酶基因来重建甲羟戊酸途径(MVA途径)，同时通过过量表达来源于大肠杆菌的焦磷酸酶，从而在工程大肠杆菌中实现了高特异性生产产物组成超过80％的异戊烯醇。

在一个优选实施方案中，提供了一种重组大肠杆菌菌株，其包含以下几种核酸分子：

(1)编码羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因片段和编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段，所述基因片段任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接；

(2)编码甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶的基因片段，上述基因片段以上述次序连接并任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接；

(3)编码焦磷酸酶的基因片段，该基因片段任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接。

优选地，所述羟甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶分别由来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的HMG-CoA合成酶基因mvaS和HMG-CoA还原酶基因mvaE编码；所述甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶分别由来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因ERG12，甲羟戊酸磷酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVD1和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1编码；所述焦磷酸酶由来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的焦磷酸酶基因EcNudF编码，或由来源于其它生物体的与所述大肠杆菌焦磷酸酶基因同源性超过70％的核酸分子编码，或由与大肠杆菌焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且对二甲基丙烯基焦磷酸具有明显底物偏爱性的核酸分子编码。优选地，所述焦磷酸酶或不同于焦磷酸酶的能够水解异戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且对二甲基丙烯基焦磷酸具有明显底物偏爱性的表达产物在本发明的重组大肠杆菌中是过量表达的。

在另一个优选的实施方案中，提供了一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备包含任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接的羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因片段的重组质粒A；

(2)将重组质粒A与任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因片段连接成重组质粒B；

(3)制备包含任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接的甲羟戊酸激酶基因片段、磷酸甲羟戊酸激酶基因片段、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因片段和异戊烯基焦磷酸异构酶基因片段的重组质粒C，其中所述基因片段以上述次序连接；

(4)制备包含任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接的焦磷酸酶基因片段的重组质粒D；

优选地，所述羟甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因分别是来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的HMG-CoA合成酶基因mvaS和HMG-CoA还原酶基因mvaE；所述甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶基因分别是来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因ERG12，甲羟戊酸磷酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVD1和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1；所述焦磷酸酶基因是来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的焦磷酸酶基因EcNudF，或来源于其它生物体的与所述大肠杆菌焦磷酸酶基因同源性超过70％的核酸分子，或与大肠杆菌焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且对二甲基丙烯基焦磷酸具有明显底物偏爱性的核酸分子。优选地，所述焦磷酸酶基因，或其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且对二甲基丙烯基焦磷酸具有明显底物偏爱性的核酸分子在本发明的重组大肠杆菌中被过量表达。

在本发明的制备重组大肠杆菌菌株的方法中，质粒或载体的构建以及转化感受态细胞的方法不受限制，可以采用本领域中已知的常规方法。

上述重组质粒A、B、C和D中的抗生素抗性基因可以是相同的或不同的。所述抗生素抗性基因可以选自本领域中公知的抗生素抗性基因，例如，氯霉素、氨苄霉素、卡那霉素、四环素等等。通过不同的抗生素抗性基因组合可以更高效和准确地筛选出包含上述三个重组质粒或表达载体的工程大肠杆菌。

在本发明的制备重组大肠杆菌菌株的方法中，筛选利用各种重组质粒所具有的抗生素抗性来进行，即根据不同的筛选阶段可以在平板培养基中添加与相应重组质粒所具有的抗生素抗性对应的抗生素或抗生素组合。

在另一个优选的实施方案中，提供了一种合成异戊烯醇的方法，该方法包括将本发明的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含合适的碳源和诱导剂的培养基中进行培养，在培养过程中不断通入空气，从尾气中分离包含异戊烯醇和异戊二烯醇的产物。

优选地，所述碳源可以是糖类、甘油(例如，生物柴油或制皂工艺的副产物)、油类(例如，植物油诸如棉籽油、棕榈油或大豆油)、动物脂肪、脂肪酸(例如不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸)、脂质、磷脂、甘油酯(例如，甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯等)、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)，可再生碳源(例如，生物质碳源诸如可水解的生物质碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸酯、乙酸酯等。在本发明中，碳源优选是可再生糖类，如水解生物质，包括甘蔗渣、玉米秸秆、木浆、转化糖、光合作用产物(包括，但不限于葡萄糖)，以及其它单糖(例如，果糖、甘露糖、半乳糖、木糖或阿拉伯糖等)、二糖、多糖等。

在本发明的生物合成异戊烯醇的方法中，可使用适合于工程大肠杆菌的中等至大规模培养的任何液体培养基，例如M9液体培养基，在所述液体培养基中可以添加与所述工程大肠杆菌的抗生素抗性相对应的抗生素或组合以提高生长选择性，例如，如果在工程大肠杆菌的筛选过程中分别使用了氯霉素、氨苄霉素和卡那霉素三种抗生素，则在生物合成过程(例如摇瓶培养或发酵罐培养)中，在培养基中可以添加上述三种抗生素。此外，在本发明的生物合成过程中，可以在培养基中添加常规的诱导剂例如IPTG以进行诱导培养。

根据本发明的方法制备的异戊烯醇的摇瓶总产量可以超过200mg/L，其中异戊烯醇占80％以上。

定义和缩写

在本文中使用下列的缩写或简称：

甲羟戊酸途径：MVA途径

羟甲基戊二酰辅酶A：HMG-CoA

大肠杆菌(Escherichiacoli)：E.coli

“基因片段”在本文中根据具体的使用场合应理解为是与体内特定基因序列相对应的分离的核酸分子或核酸序列，而非存在于生物体体内的基因组内的基因片段。

“可操作地连接”指在表达调控元件和受调控序列(例如基因)的多核苷酸之间的功能连接，使得受调控序列在适于表达该受调控序列的条件下表达，从而产生所期望的肽或多肽。例如，表达调控元件可以是转录调控元件如启动子、增强子序列和其他顺式作用元件等。

“过量表达”或“过表达”是指特定基因在生物体中的表达超过正常水平(即，野生型表达水平)，例如，通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

保藏说明：

根据本发明的制备方法制备的一株工程重组大肠杆菌菌株于2012年02月08日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5745，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。

以下将以实施例方式，以根据本发明的菌株制备方法制备的工程大肠杆菌生产异戊烯醇为例，详细描述本发明：

实施例1

通过在大肠杆菌(E.coli)中共同过量表达来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的HMG-CoA合成酶基因(mvaS)(SEQIDNO：1)和HMG-CoA还原酶基因(mvaE)(SEQIDNO：2)，来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸磷酸激酶(ERG8)，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(MVD1)和大肠杆菌(Escherichiacoli)焦磷酸酶基因(EcNudF)(SEQIDNO：3)，所得到的工程大肠杆菌可以利用糖来生物合成异戊烯醇。

1.1外源基因的克隆和表达载体的构建

1.1.1外源基因的克隆

1.1.1.1粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)HMG-CoA合成酶基因的克隆

按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取Enterococcusfaecalis(购自ATCC，No.29212)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增HMG-CoA合成酶基因mvaS，GI：9937382。PCR扩增采用的引物序列如下：

mvaS-F：5’-CCAGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAAATTA(SEQIDNO：5)

mvaS-R：5’-CAACTGCAG-TTAGTTTCGATAAGAGCGAACG(SEQIDNO：6)

PCR反应条件如下：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒，48-58℃退火30秒，72℃延伸1-4分钟，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，最后72℃延伸10分钟。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。

1.1.1.2粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)HMG-CoA还原酶基因的克隆

按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取Enterococcusfaecalis的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增烯酰-CoA水解酶基因mvaE，GI：9937382。PCR扩增采用的引物序列如下：

mvaE-F：5’-CATGCCATGGGCATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQIDNO：7)

mvaE-R：5’-CGCGGATCC-TTAGTTTCGATAAGAGCGAACGGT(SEQIDNO：8)

PCR反应条件如1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.No.K0692)回收目的基因片段。

1.1.1.3酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVD1，异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1的克隆

将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甲羟戊酸激酶基因ERG12(GeneID：855248)，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8(GeneID：855260)，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVD1(GeneID：855779)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1(GeneID：855986)等四个基因的序列依次排列在一起，通过化学合成制备。化学合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。总序列见序列表ERG12-ERG8-MVD1-IDI1(SEQIDNO：4)。

1.1.1.4大肠杆菌(Escherichiacoli)焦磷酸酶基因EcNudF的克隆

按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D3350-01)提供的操作步骤，提取E.coliK-12(ATCCNo.10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增来源于E.coli的焦磷酸酶基因EcNudF，GeneID：947519。PCR扩增采用的引物序列如下：

EcNudF-F：5’-CTAGCCATGGGCATGCTTAAGCCAGACAACCTG(SEQIDNO：9)

EcNudF-R：5’-CAGGGATCCTTATGCCCACTCATTTTTTAACG(SEQIDNO：10)

1.1.2表达载体的构建

1.1.2.1pISP213载体的构建(构建过程参见图3)

将胶回收后的mvaE基因与pACYCDuet-1载体(购自Novagen)分别用NcoI和BamHI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物42℃热激转化E.coliDH5α感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRaCodeD9057)，然后涂布加有34μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为mvaE-F和mvaE-R(见上)，反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pISP213后，再通过限制性酶切和测序验证。

1.1.2.2pISP214载体的构建(构建过程参见图4)

将胶回收后的mvaS基因与pISP213载体用SacI和PstI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物42℃热激转化E.coliDH5α感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRaCodeD9057)，然后涂布加有34μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为mvaS-F和mvaS-R(见上)，反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pISP214后，再通过限制性酶切和测序验证。

1.1.2.3pTrc-lower载体的构建(构建过程参见图5)

将化学法合成的ERG12-ERG8-ERG19-IDI用Xhol和PstI进行双酶切。pTrcHis2B载体用的Xhol和PstI进行双酶切。酶切后的载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物42℃热激转化E.coliDH5α感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRaCodeD9057)，然后涂布加有50μg·mL^-1氨苄霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为low-F(5’-TTTGCCAGATATTGGAAGTG-3’)(SEQIDNO：11)和low-R(5’-CGTGCAGTAAAGTTAGATGA-3’)(SEQIDNO：12)，反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pTrc-lower后，再通过限制性酶切和测序验证。

1.1.2.4pYY16载体的构建(构建过程参见图6)

将胶回收后的EcNudF基因与pCOLADuet-1载体(购自Novagen)用NcoI和BamHI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物42℃热激转化E.coliDH5α感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRaCodeD9057)，然后涂布加有50μg·mL^-1卡那霉素素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物序列如下：

DuetUP1：5’-GGATCTCGACGCTCTCCCT(SEQIDNO：13)

DuetDOWN1：5’-GATTATGCGGCCGTGTACAA(SEQIDNO：14)

PCR反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.No.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pYY16后，再通过限制性酶切和测序验证。

1.2E.coliYY168重组菌株的构建

pISP214，pTrc-lower和pYY16三个重组质粒共同42℃热激转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞(购自Invitrogen，SKU#C6000-03)，涂布加有氯霉素，氨苄霉素和卡那霉素三种抗生素的LB固体平板，平板上长出的单菌落即为含有三个表达载体的工程大肠杆菌E.coliYY168(已保藏为CGMCCNo.5745)。

1.3工程大肠杆菌E.coliYY168的摇瓶培养

将E.coliYY159按1∶100的比例接种到装有M9液体培养基(0.6％磷酸氢二钠，0.3％磷酸二氢钾，0.1％氯化铵，0.05％氯化钠，0.025％硫酸镁，3％葡萄糖)的摇瓶中，培养基中含有50μg·mL^-1的卡那霉素，100μg·mL^-1的氨苄霉素和34μg·mL^-1氯霉素，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD_600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L^-1～1.0mmol·L^-1，然后在25～30℃，180～225rpm条件下，继续诱导培养24-72h。

1.4工程大肠杆菌E.coliYY168的发酵罐培养

将E.coliYY168按1∶100的比例接种到装有M9液体培养基的发酵罐中，培养基中含有50μg·mL^-1的卡那霉素和34μg·mL^-1氯霉素，在温度为37℃，溶氧为10％-30％，pH为6.0-8.0条件下培养，当OD_600nm为2～20时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L^-1～1.0mmol·L^-1，然后在温度为25℃-37℃，溶氧为10％-30％，pH为6.0-8.0条件下，继续诱导培养24-72h，期间不断补加葡萄糖，并控制残糖量在0.1％-0.3％。

实施例2异戊烯醇的合成

2.1异戊烯醇产物分离(以下的测定结果以CGMCCNo.5745菌株为例)

在发酵过程中不断通入空气，尾气会将发酵液中的异戊烯醇不断带出，将尾气进行低温冷却，尾气中的水、异戊烯醇将被冷凝下来，从而得到浓缩的异戊烯醇产物，最后得到的异戊烯醇通过蒸馏进行进一步分离纯化。

2.2异戊烯醇产物测定

将在2.1中得到的异戊烯醇通过气相色谱(GC)和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对其进行分析测定。GC采用CP-FFAPCB毛细管色谱柱(25m×0.25mm；0.2μm)，方法为50℃维持1分钟，5℃/分钟程序升温至100℃，然后25℃/分钟升温至250℃。GC-MS采用AgilentHP-INNOWax毛细管色谱柱(30m×0.32mm，0.25μm.)，方法为50℃维持2分钟，然后10℃/分钟程序升温至240℃，240℃维持3分钟。实验结果显示，样品峰的保留时间(图2A)异戊烯醇标准品(购自阿拉丁，货号：1102927)峰的保留时间(图2B)一致，证明工程大肠杆菌E.coliYY168可以生产异戊烯醇，摇瓶产量超过200mg/L。

Claims

1.保藏号为CGMCCNo.5745的重组大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株，其包含：

(1)SEQIDNO：1所示的编码来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因片段和SEQIDNO：2所示的编码来源于粪肠球菌的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段；

(2)SEQIDNO：4所示的依次编码来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶的基因片段；

(3)SEQIDNO：3所示的编码来源于大肠杆菌的焦磷酸酶基因EcNudF的基因片段。

2.一种合成异戊烯醇的方法，该方法包括将权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含合适的碳源和诱导剂的培养基中进行培养，在培养过程中不断通入空气，从尾气中分离包含异戊烯醇的产物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述碳源是可再生糖类。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述可再生糖类是水解生物质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述水解生物质选自甘蔗渣、玉米秸秆、木浆、转化糖、单糖、二糖或多糖。