BR112017025554B1 - Composição, e, método para produzir um polímero, resina ou artigo de fabricação - Google Patents

Composição, e, método para produzir um polímero, resina ou artigo de fabricação Download PDF

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Abstract

ácido nucleico, cassete de expressão, um vetor ou um veículo de clonagem, célula transformada ou transduzida, planta transgênica, célula vegetal ou semente, polipeptídeo, composição, anticorpo, hibridoma, método para isolar ou identificar um polipeptídeo, produzir um polipeptídeo recombinante, produzir um composto, produzir ou fabricar um butadieno, um dialqueno ou um composto, produzir um polímero, resina ou artigo de fabricação, catalisar enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico a um 3-buten-2-ol, catalisar enzimaticamente a conversão de um 3-buten-2-ol a um butadieno, catalisar enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico a um butadieno, peptídeo ou polipeptídeo, e, uso de ou um método para uso de um polipeptídeo. em modalidades alternativas, são providas enzimas de vinilisomerase-desidratase não natural ou geneticamente engenheiradas, incluindo desidratases de alquenol, desidratases de linalool e desidratases de álcool crotílico. em modalidades alternativas, são providos polipeptídeos não naturais ou geneticamente engenheirados tendo uma atividade que compreende, por exemplo, uma vinilisomerase-desidratase, uma desidratase de alquenol, uma desidratase de linalool e/ou uma atividade de desidratase de álcool crotílico ou uma combinação dos mesmos. em modalidades alternativas, também são providos ácidos nucleicos não naturais ou geneticamente engenheirados (polinucleotídeos) que codificam polipeptídeos descritos aqui, veículos de expressão ou clonagem que compreendem ou têm ácidos nucleicos contidos aqui como descritos aqui e células não naturais ou geneticamente engenheiradas que compreendem ou têm ácidos nucleicos contidos aqui como descritos aqui. em modalidades alternativas, também são providos métodos para fabricar vários compostos orgânicos, incluindo metil vinil carbinol e butadieno.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício da prioridade do Pedido de Patente Condicional U.S. N° de série (USSN) 62/168,787, depositado em 30 de maio de 2015; USSN 62/236,662, depositado em 2 de outubro de 2015 e USSN 62/314,531 depositado em 29 de março de 2016. Os pedidos já mencionados são expressamente incorporados neste por referência em sua totalidade e para todos os propósitos.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA PROVIDA ELETRONICAMENTE
[002] Uma versão eletrônica (forma legível por computador) de uma Listagem de Sequência de acordo com 37 C.F.R. §1.821 até 1.825, é depositada com este em formato ASCII por intermédio de EFS-Web de acordo com MPEP §502.05(IX), cujos conteúdos são incorporados por referência em sua totalidade na especificação para todos os propósitos. Este arquivo eletrônico foi criado em 27/08/2018, é de 236 kilobytes de tamanho e intitulado 2018-08-27 5843.121255_ST25.txt.
CAMPO TÉCNICO
[003] Esta invenção geralmente refere-se à enzimologia e a processos biossintéticos para a produção de produtos químicos orgânicos. São providas enzimas de vinilisomerase-desidratase não naturais ou geneticamente engenheiradas, incluindo desidratases de alquenol, desidratases de linalool e desidratases de álcool crotílico, que podem ser bifuncionais em que uma enzima como provida neste tem tanto atividade de isomerase quanto de desidratase, mas não necessária ao mesmo nível. Também são providos micróbios geneticamente engenheirados contendo tais enzimas e seu uso na produção sustentável de alquenóis e alquenos.
FUNDAMENTOS
[004] Mais de 25 bilhões de libras (11.339.810 de toneladas) de butadieno (BD, BDE), incluindo 1,3-butadieno, são produzidos anualmente e são aplicadas na fabricação de polímeros, tais como borrachas sintéticas e resinas ABS e produtos químicos, tais como hexametilenodiamina e 1,4- butanodiol. O butadieno é tipicamente produzido como um subproduto do processo de craqueamento de corrente para a conversão de matérias-primas de petróleo, tais como nafta, gás de petróleo liquefeito, etano ou gás natural a etileno e outras olefinas. A capacidade de fabricar butadieno a partir de matérias primas alternativas e/ou renováveis representa um avanço maior na busca para de processos de produção química mais sustentável. O butadieno pode ser produzido de maneira renovável por fermentação de açúcares ou outras matérias-primas para produzir dióis, tais como 1,4-butanodiol ou 1,3- butanodiol, são separados, purificados e então desidratados a butadieno em uma segunda etapa envolvendo a catálise com base em metal.
[005] Entretanto, o produto de fermentação direto de butadieno (ou outro dialqueno) a partir de estoques de alimentação renováveis evita a necessidade de etapas de desidratação de produtos químicos visto que o gás butadieno (ponto de ebulição ou é de -4,4°C) pode ser emitido continuamente a partir do fermentador e facilmente coletado, por exemplo, por condensação. O processo de produção fermentativo direto elimina a necessidade de butadieno com base fóssil (ou outro dialqueno) e deve permitir economias substanciais em custo, energia e resíduo e emissões nocivas com relação ao butadieno petroquimicamente derivado.
[006] As enzimas, organismos microbianos e métodos melhorados para produzir efetivamente butadieno ou um dialqueno a partir de matérias- primas renováveis baratas, tais como dextrose, melados, suco de cana de açúcar e açúcares derivados de biomassa, incluindo resíduo agrícola e de madeira, bem como matérias-primas de C1, tais como syngas, metanol e dióxido de carbono são necessários.
SUMÁRIO
[007] Em modalidades alternativas, são providos ácidos nucleicos isolados, sintéticos ou recombinantes (polinucleotídeos) que compreendem (a) uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97% 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de ácido nucleico que consiste em SEQ ID NO: 11, 13, 14, 21, 36, 42, 48, 54, 60, 63, 65, 71, 73, 79, 85, 91 ou 97 (que codifica enzima de comprimento total) ou SEQ ID NO: 15, 17, 18, 40, 46, 52, 58, 69, 77, 83, 89, 95 ou 101 (que codifica enzima madura processada) ou sua sequência complementar, com a condição de que a sequência de ácido nucleico não codifica um “LDRV” ou uma proteína “cdLD-Botes” com ou sem seu peptídeo sinalizador ou qualquer sequência periplásmica ou um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10 com ou sem seu peptídeo sinalizador ou uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de ácido nucleico que consiste em SEQ ID NO: 11, 13, 14, 21, 36, 42, 48, 54, 60, 63, 65, 71, 73, 79, 85, 91 ou 97 (que codifica enzima de comprimento total) ou SEQ ID NO: 15, 17, 18, 40, 46, 52, 58, 69, 77, 83, 89, 95 ou 101 (que codifica enzima madura processada), ou sua sequência complementar; (b) uma sequência de ácido nucleico (polinucleotídeo) que hibridiza sob condições estringentes a um ácido nucleico que compreende SEQ ID NO: 11, 13, 14, 21, 36, 42, 48, 54, 60, 63, 65, 71, 73, 79, 85, 91 ou 97 (que codifica enzima de comprimento total) ou SEQ ID NO: 15, 17, 18, 40, 46, 52, 58, 69, 77, 83, 89, 95 ou 101 (que codifica enzima madura processada), e as condições estringentes compreendem uma etapa de lavagem que compreende uma lavagem em 0,2X SSC em uma temperatura de cerca de 65°C por cerca de 15 minutos, ou sua sequência complementar, com a condição de que a sequência de ácido nucleico não codifica um “LDRV” ou um proteína “cdLD-Botes” ou um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10 com ou sem seu peptídeo sinalizador; (c) um nucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 (enzima de comprimento total) ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102 (enzima madura processada) ou um fragmento enzimaticamente ativo dos mesmos ou uma sequência complementar do ácido nucleico codificador; (d) o ácido nucleico de (c), que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa ou uma sequência complementar do ácido nucleico codificador; (e) um nucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102 ou um fragmento enzimaticamente ativo dos mesmos, tendo pelo menos um, dois, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácido selecionado do grupo que consiste em: V19I, L21L, Y71F, G74S, G133M, R171K, I182L, V196F, D200N, F325S, G365S e L368F (numeração com referência à SEQ ID NO: 12) ou a mesma substituição em uma posição correspondente identificada pelo alinhamento à SEQ ID NO: 12; (f) o ácido nucleico de (e), que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa ou uma sequência complementar do ácido nucleico codificador; (g) um nucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102 ou um fragmento enzimaticamente ativo dos mesmos, tendo pelo menos um, dois, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em: uma substituição de aminoácido feita na SEQ ID NO: 2 como observado em uma proteína “LDRV” (numeração com referência à SEQ ID NO: 2) ou a mesma substituição em uma posição correspondente identificada pelo alinhamento à SEQ ID NO: 2, (h) o ácido nucleico de (g), que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa ou uma sequência complementar do ácido nucleico codificador ou (i) um nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de gerar um anticorpo que liga-se especificamente a um polipeptídeo tendo a sequência da SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102, ou sua sequência complementar; em que o ácido nucleico de qualquer um de (a) a (i) codifica um polipeptídeo: (1) tendo uma atividade de desidratase de linalool-isomerase (LinD), (2) tendo uma atividade de vinilisomerase, (3) tendo uma atividade de desidratase, opcionalmente uma atividade de desidratase de alquenol, (4) capaz de catalisar enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico (but-2-en-1-ol) a um 3-buten-2-ol, (5) capaz de catalisar enzimaticamente a conversão de um 3 - buten-2-ol a um butadieno ou um 1,3 butadieno, (6) capaz de catalisar enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico (but-2-en-1-ol) a um butadieno ou um 1,3 butadieno, (7) capaz de catalisar enzimaticamente a conversão de um 2,3- dimetilbut-2-en-1-ol em dimetil-butadieno, (8) catalisar a conversão de um composto correspondente à fórmula geral CnH2nO em CnH2n-2 + H2O com 3<n<7, em que opcionalmente o composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é um álcool crotílico, um but-3-en-2-ol ou um but- 3-en-1-ol e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um 1,3 butadieno; e opcionalmente o composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é um 2,3- dimetil-but-2-en-1-ol, um 2,3-dimetil-but-3-en- 2-ol ou um 2,3-dimetil-but-3-en-1-ol e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um dimetilbutadieno ou (9) qualquer combinação de (1) a (8).
[008] Em modalidades alternativas, ácidos nucleicos providos neste (a) compreende adicionalmentem uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou peptídeo que compreende (ou tendo) ou que consiste em: uma sequência sinalizadora, uma sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS) ou um polipeptídeo ou peptídeo tendo uma atividade PTS ou PSS ou uma sequência sinalizadora eucariótica ou (b) compreende sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 11, 13, 14, 21, 36, 42, 48, 54, 60, 63, 65, 71, 73, 79, 85, 91 ou 97 ou SEQ ID NO: 15, 17, 18, 40, 46, 52, 58, 69, 77, 83, 89, 95 ou 101.
[009] Em modalidades alternativas, ácidos nucleicos providos neste compreende adicionalmentem uma sequência codificadora (ou um códon) que codifica uma metionina de terminal N.
[0010] Em modalidades alternativas, para ácidos nucleicos providos neste: (b) a sequência de ácido nucleico tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de ácido nucleico que consiste em SEQ ID NO: 11, 13, 14, 21, 36, 42, 48, 54, 60, 63, 65, 71, 73, 79, 85, 91 ou 97, ou sua sequência complementar, com a condição de que a sequência de ácido nucleico não codifica um “LDRV” ou uma proteína “cdLD-Botes”' ou um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10 com ou sem seu peptídeo sinalizador ou uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de ácido nucleico que consiste em SEQ ID NO: 11, 13, 14, 21, 36, 42, 48, 54, 60, 63, 65, 71, 73, 79, 85, 91 ou 97; ou sua sequência complementar; (c) uma sequência de ácido nucleico (polinucleotídeo) que hibridiza sob condições estringentes a um ácido nucleico que compreende SEQ ID NO: 11, 13, 14, 21, 36, 42, 48, 54, 60, 63, 65, 71, 73, 79, 85, 91 ou 97, e as condições estringentes compreendem uma etapa de lavagem que compreende uma lavagem em 0,2X SSC em uma temperatura de cerca de 65°C por cerca de 15 minutos, ou sua sequência complementar, com a condição de que a sequência de ácido nucleico não codifica um “LDRV” ou uma proteína “cdLD-Botes” ou um polipeptídeo, incluindo uma proteína tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10 com ou sem seu peptídeo sinalizador.
[0011] Em modalidades alternativas, a sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS) é: um trajeto de alvejamento de SecB pós-tradução PTS ou PSS; um trajeto de alvejamento (SRP) de partícula de reconhecimento de sinal de co-tradução PTS ou PSS ou um sistema independente e Sec de translocação de arginina duplo PTS ou PSS. Em modalidades alternativas, a sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS) compreende ou consiste em: (a) uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 8; (b) uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 20, 39, 45, 51, 57, 68, 76, 82, 88, 94 ou 100; (c) SEQ ID NO: 25 [Lam B sequência sinalizadora ou LamBss], e opcionalmente o polipeptídeo codificado compreende SEQ ID NO: 24; (d) SEQ ID NO: 26 [MalE sequência sinalizadora ou MalEss]; (e) SEQ ID NO: 36 [FhuD sequência sinalizadora ou FhuDss]; (f) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO: 34; (g) um LamB ss, um MalE ss, um Mg1B ss, um OmpA ss, um Pe1B ss, um PhoA ss, um DsbA ss, um SfmC ss, um To1B ss, um TorT ss, um FhuD ss, um Pe1B ss, um YcdO ss, um MdoD ss, um Tor Ass ou um YcdO ss ou (h) um peptídeo codificado por um ácido nucleico tendo cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 19, 38, 44, 50, 56, 67, 75, 81, 87, 93 ou 99; e opcionalmente o polipeptídeo ou peptídeo compreendendo ou tendo a sequência de alvejamento periplásmica (PTS), sequência sinalizadora periplásmica (PSS) ou tendo uma atividade PTS ou PSS é operacionalmente ligada no terminal amino do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico isolado, sintético ou recombinante (polinucleotídeo) de acordo com a reivindicação 1, e opcionalmente uma metionina de terminal amino é colocada terminal amino ao polipeptídeo ou peptídeo compreendendo ou tendo a sequência de alvejamento periplásmica (PTS), sequência sinalizadora periplásmica (PSS) ou tendo uma atividade PTS ou PSS. A sequência sinalizadora eucariótica pode ser uma levedura ou uma sequência sinalizadora fúngica.
[0012] Em modalidades alternativas, um ácido nucleico como provido neste compreende adicionalmente: um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido heteróloga ou uma sequência de nucleotídeo heteróloga, e opcionalmente a sequência de aminoácido heteróloga compreende ou funciona como uma etiqueta ou um epítopo, e opcionalmente a sequência de aminoácido heteróloga compreende ou funciona como uma extensão de terminal N e/ou terminal C para alvejar a um retículo endoplasmático (ER) ou endomembrana ou que atua como uma sequência de alvejamento periplásmica sequência sinalizadora periplásmica ou tendo uma atividade PTS ou PSS.
[0013] Em modalidades alternativas, providos neste são cassetes de expressão, vetores ou veículos de clonagem que compreendem ou têm contido neste: (a) uma sequência de ácido nucleico como provido neste; (b) o cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem de (a) que compreende, ou inserido em, um vetor viral, um plasmídeo, um fago, um fagomídeo, um cosmídeo, um fosmídeo, um bacteriofago ou um cromossomo artificial; (c) o cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem de (b), em que o vetor viral compreende ou é um vetor de adenovírus, um vetor retroviral ou um vetor viral adeno-associado ou (d) o cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem de (a), (b) ou (c), que compreende, ou inserido em, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um plasmídeo, um vetor derivado de bacteriofago P1 (PAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC) ou um cromossomo artificial mamífero (MAC).
[0014] Em modalidades alternativas, são providas nestas células transformadas ou transduzidas (por exemplo, células não naturais ou engenheiradas): (a) que compreende um ácido nucleico como provido neste; (b) que compreende o cassete de expressão, um vetor ou um veículo de clonagem como provido neste; (c) a célula transformada ou transduzida de (a) ou (b), em que a célula é uma célula bacteriana, uma célula de mamífero, uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de inseto ou uma célula vegetal; (d) a célula transformada ou transduzida de (c), em que em que a célula é um metilótrofo ou um metanótrofo, e opcionalmente quaisquer espécies dentro do gênero Bacillus, Methylobacterium, Methyloversatilis, Methylococcus, Methil ocystis ou Hyphomicrobium, opcionalmente um Bacillus metanolicus, um Methylobacterium extorquens ou um Methylococcus capsulatis; (e) a célula transformada ou transduzida de (c), em que a célula bacteriana ou célula fúngica é qualquer espécie dentro do gênero Aspergillus, Saccharomyces, Escherichia, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas, Castellaniella, Bacillus, Cornyebacteria ou Staphylococcus; (f) a célula transformada ou transduzida de (c), em que a célula bacteriana ou célula fúngica é um Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus clausii, Castellaniella Defragrans, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, um Pseudomonas putida, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans ou um Saccharomyces cerevisiae; (g) a célula transformada ou transduzida de (c), em que a célula de levedura ou célula fúngica é qualquer espécie selecionada de ou dentro de: gênero Saccharomycetales ou a família Saccaromycetaceae ou o gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Schizochytrium, Rhodotorula, Thraustochytrium, Aspergillus, Kluyveromyces, Issatchenkia, Yarrowia, Ogataea, Kuraishia, Hansenula, Candida, Ogataea, Kuraishia ou Komagataella; ordem Saccharomycetales ou a família Dipodascaceae, ou o gênero Yarrowia; ordem Schizosaccharomycetales ou a família Schizosaccaromycetaceae ou o gênero Schizosaccharomyces; ordem Eurotiales ou a família Trichocomaceae, ou o gênero Aspergillus; ordem Mucorales ou a família Mucoraceae, ou o gênero Rhizopus; (h) a célula transformada ou transduzida de (c), em que a célula de levedura ou célula fúngica é qualquer espécie de selecionada de: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Rhizopus arrhizus, Rhizobus oryzae, Yarrowia lipolytica, Issatchenkia orientalis, Hansenula polymorpha, Candida boidinii ou Pichia metanolica ou (i) a célula transformada ou transduzida de (c), em que a célula bacteriana ou célula fúngica é qualquer espécie selecionada de ou dentro de: ordem Enterobacteriales ou a família Enterobacteriaceae ou o gênero Escherichia e Klebsiella; ordem Aeromonadales ou a família Succinivibrionaceae, ou o gênero Anaerobiospirillum; ordem Pasteurellales ou a família Pasteurellaceae ou o gênero Actinobacillus e Mannheimia; ordem Rhizobiales ou a família Bradyrhizobiaceae, ou o gênero Rhizobium; ordem Bacillales ou a família Bacillaceae, ou o gênero Bacillus; ordem Actinomycetales ou as famílias Corynebacteriaceae e Streptomycetaceae, ou o gênero Corynebacterium e o gênero Streptomyces, respectivamente; ordem Rhodospirillales ou a família Acetobacteraceae, ou o gênero Gluconobacter; ordem Sphingomonadales ou a família Sphingomonadaceae, ou o gênero Zymomonas; ordem Lactobacillales ou as famílias Lactobacillaceae e Streptococcaceae, ou o gênero Lactobacillus e o gênero Lactococcus, respectivamente; ordem Clostridiales ou a família Clostridiaceae, ou o gênero Clostridium ou ordem Pseudomonadales ou a família Pseudomonadaceae, ou o gênero Pseudomonas.
[0015] Em modalidades alternativas das células transformadas ou transduzidas não naturais, engenheiradas providas neste: (a) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente uma desidratase de álcool crotílico heteróloga (CAD); (b) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente um CAD heterólogo e uma redutase de crotonaldesídeo (CAR) e/ou um formador de redutase de crotonil-CoA - álcool (CCR-OH); (c) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente um CAD heterólogo, CAR e/ou um formador de crotonil-CoA redutase - aldesídeo (CCR-ALD) e/ou uma a crotonato redutase (CTR); (d) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente um CAD heterólogo, CAR, CCR e/ou CTR e uma hidrolase de crotonil-CoA (CCH), transferase de crotonil-CoA (CCT) ou sintetase de crotonil-CoA (CCS); (e) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente um CCROH heterólogo e um CAD; (f) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente uma desidratase 3-hidroxibutiril-CoA heteróloga (HCD) ou hidratase de enoil-CoA (ECH) e qualquer combinação de (a) a (e); (g) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente um redutor de cetona de redutase de acetoacetil-CoA heterólogo (ACR-KET) e qualquer combinação de (a) a (f); (h) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente uma carboxilase de acetil-CoA heteróloga (AC-CAR), uma sintase de acetoacetil-CoA (ACS) (opcionalmente um ACS FhsA) e/ou uma acetiltransferase de acetil-CoA:acetil-CoA (ACAC-AT) (ou uma tiolase de acetoacetil-CoA ou acetiltransferase de acetil-CoA), e qualquer combinação de (a) a (g); (i) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente uma sintase de 3-oxoacil-CoA heteróloga (OCS), e qualquer combinação de (a) a (h); (j) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente uma enzima para catalisar a conversão de um 3-hidroxibutiril- CoA a um crotonil-CoA ou uma desidratase de 3-hidroxibutiril, uma hidrolase ou uma hidratase de enoil-CoA; (k) a célula compreende um homólogo ou compreende adicionalmente uma oxidorredutase heteróloga, uma redutase de acil-CoA ou uma desidrogenase de aldesídeo de acilação para reduzir um acil-CoA a seu aldeído correspondente ou uma redutase de acil-CoA graxa, uma redutase de succinil-CoA, uma redutase de butiril-CoA ou uma redutase de propionil-CoA ou (l) a célula compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais enzimas da FIG. 1 ou FIG. 6; (m) opcionalmente produz um di-alqueno, onde opcionalmente o di-alqueno é butadieno.
[0016] Em modalidades alternativas, são providas plantas transgênicas, células vegetais ou sementes: (a) que compreende uma sequência como provida neste ou o cassete de expressão, um vetor ou um veículo de clonagem como provido neste, ou uma célula transformada como provido neste, em que opcionalmente a planta é uma planta de milho, uma planta de sorgo, uma planta de batata, uma planta de tomate, uma planta de trigo, uma planta de semente oleosa, uma planta de semente de colza, uma planta de soja, uma planta de arroz, uma planta de cevada, uma grama, uma planta de tabaco ou uma planta de forragem e/ou alimentação para um animal ou um ruminante, e opcionalmente uma planta de forragem ou alimentação é feno, milho, painço, soja, trigo, trigo sarraceno, cevada, alfafa, centeio, uma grama anual, sorgo, sorgo do Sudão, grama veldt ou grama buffel, em que opcionalmente a célula vegetal ou semente é uma semente de milho, um grão de trigo, uma semente oleosa, uma semente de colza, uma semente de soja, uma semente de palma, uma semente de girassol, uma semente de gergelim, uma semente de arroz, uma de cevada, uma de amendoim ou de uma planta de tabaco ou uma semente de qualquer planta de forragem e/ou alimentação para um animal ou um ruminante, e opcionalmente uma planta de forragem ou alimentação é feno, milho, painço, soja, trigo, trigo sarraceno, cevada, alfafa, centeio, uma grama anual, sorgo, sorgo do Sudão, grama veldt ou grama buffel.
[0017] Em modalidades alternativas, são providos polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes codificado por um ácido nucleico como provido neste.
[0018] Em modalidades alternativas, são providos polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes: (a) tendo uma sequência de aminoácido pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102 , com a condição de que o polipeptídeo não é um “LDRV” ou uma proteína “cdLD-Botes” ou um polipeptídeo ou uma proteína tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10 com ou sem seu peptídeo sinalizador ou tendo uma sequência de aminoácido pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a um polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102; (b) um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102 ou um fragmento enzimaticamente ativo dos mesmos; (c) o polipeptídeo de (b), tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa; (d) um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102 ou um fragmento enzimaticamente ativo dos mesmos, tendo pelo menos um, dois, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em: V19I, L21L, Y71F, G74S, G133M, R171K, 1182L, V196F, D200N, F325S, G365S e L368F (numeração com referência à SEQ ID NO: 12) ou a mesma substituição em uma posição correspondente identificada pelo alinhamento à SEQ ID NO: 12; (e) o polipeptídeo de (d), tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa ou (f) um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102 ou um fragmento enzimaticamente ativo dos mesmos, tendo pelo menos um, dois, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em: uma substituição de aminoácido feita na SEQ ID NO: 2 como observado em uma proteína “LDRV” (numeração com referência à SEQ ID NO: 2) ou a mesma substituição em uma posição correspondente identificada pelo alinhamento à SEQ ID NO: 2; (g) o polipeptídeo de (f), tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa; (h) um polipeptídeo capaz de gerar um anticorpo que liga-se especificamente a um polipeptídeo tendo a sequência da SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102; em que o polipeptídeo de qualquer um de (a) a (h) compreende uma atividade: (1) tendo uma atividade de desidratase de linalool-isomerase (LinD), (2) tendo uma atividade de vinilisomerase, (3) tendo uma atividade de desidratase, opcionalmente uma atividade de desidratase de alquenol, (4) capaz de catalisar enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico (but-2-en-1-ol) a um 3-buten-2-ol, (5) capaz de catalisar enzimaticamente a conversão de um 3- buten-2-ol a um butadieno ou um 1,3 butadieno, (6) capaz de catalisar enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico (but-2-en-1-ol) a um butadieno ou um 1,3 butadieno, (7) capaz de catalisar enzimaticamente a conversão de um 2,3- dimetilbut-2-en-1-ol em dimetil-butadieno, (8) catalisar a conversão de um composto correspondente à fórmula geral CnH2nO em CnH2n-2 + H2O com 3<n<7, em que opcionalmente o composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é um álcool crotílico, um but-3-en-2-ol ou um but- 3-en-1-ol e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um 1,3 butadieno; e opcionalmente o composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é um 2,3-dimetil-but-2-en-1-ol, um 2,3-dimetil-but-3-en- 2-ol ou um 2,3-dimetil-but-3-en-1-ol, e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um dimetilbutadieno ou (9) qualquer combinação de (1) a (8).
[0019] Em modalidades alternativas, um polipeptídeo provido neste: (a) compreende adicionalmente ou consiste em: um peptídeo sinalizador, uma sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS) ou um polipeptídeo ou peptídeo tendo uma atividade PTS ou PSS ou uma sequência sinalizadora eucariótica ou (b) compreende ou consiste em SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102.
[0020] Em modalidades alternativas, um polipeptídeo provido neste compreende adicionalmente ou consiste em uma metionina de terminal N.
[0021] Em modalidades alternativas, para um polipeptídeo provido neste: (a) o polipeptídeo tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a um polipeptídeo tendo uma sequência que consiste em SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98, com a condição de que um polipeptídeo não é uma proteína “LDRV” ou um polipeptídeo tendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10 com ou sem seu peptídeo sinalizador ou um polipeptídeo tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a um polipeptídeo tendo uma sequência que consiste em SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98.
[0022] Em modalidades alternativas, a sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS) é: um trajeto de alvejamento de SecB pós-tradução PTS ou PSS; um trajeto de alvejamento (SRP) de partícula de reconhecimento de sinal de co-tradução PTS ou PSS ou um sistema independente e Sec de translocação de arginina duplo PTS ou PSS. Em modalidades alternativas, a sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS) compreende ou consiste em: (a) uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 8; (b) SEQ ID NO: 20, 39, 45, 51, 57, 68, 76, 82, 88, 94 ou 100; (c) SEQ ID NO: 25 [Lam B sequência sinalizadora ou LamBss], e opcionalmente o polipeptídeo codificado compreende SEQ ID NO: 24; (d) SEQ ID NO: 26 [MalE sequência sinalizadora ou MalEss]; (e) SEQ ID NO: 36 [FhuD sequência sinalizadora ou FhuDss]; (f) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO: 34; (g) um LamB ss, um MalE ss, um Mg1B ss, um OmpA ss, um Pe1B ss, um PhoA ss, um DsbA ss, um SfmC ss, um To1B ss, um TorT ss, um FhuD ss, um Pe1B ss, um YcdO ss, um MdoD ss, um Tor Ass ou um YcdO ss ou (h) um peptídeo codificado por um ácido nucleico tendo cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 19, 44, 38, 50, 56, 67, 75, 81, 87, 93 ou 99; e opcionalmente o polipeptídeo ou peptídeo compreendendo ou tendo a sequência de alvejamento periplásmica (PTS), sequência sinalizadora periplásmica (PSS) ou tendo uma atividade PTS ou PSS é operacionalmente ligada no terminal amino do polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14, e opcionalmente uma metionina de terminal amino é colocada terminal amino ao polipeptídeo ou peptídeo compreendendo ou tendo a sequência de alvejamento periplásmica (PTS), sequência sinalizadora periplásmica (PSS) ou tendo uma atividade PTS ou PSS. Em modalidades alternativas, a sequência sinalizadora eucariótica é uma levedura ou sequência sinalizadora fúngica.
[0023] Em modalidades alternativas, para um polipeptídeo provido neste: o polipeptídeo compreende adicionalmente: uma sequência de aminoácido heteróloga, e opcionalmente a sequência de aminoácido heteróloga compreende ou funciona como uma etiqueta ou um epítopo, e opcionalmente a sequência de aminoácido heteróloga compreende ou funciona como uma extensão de terminal N e/ou terminal C para alvejar a um retículo endoplasmático (ER) ou endomembrana ou que atua como uma sequência de alvejamento periplásmica ou sequência sinalizadora periplásmica ou tendo uma atividade PTS ou PSS.
[0024] Em modalidades alternativas, para um polipeptídeo provido neste: (a) a substituição de aminoácido conservativa compreende a substituição de um aminoácido alifático com um outro aminoácido alifático; substituição de uma Serina por uma Treonina ou vice versa; a substituição de um resíduo ácido com um outro resíduo ácido; substituição de um resíduo que carrega um grupo amido com um outro resíduo que carrega um grupo amido; troca de um resíduo básico por um outro resíduo básico ou, a substituição de um resíduo aromático com um outro resíduo aromático ou uma combinação dos mesmos ou, (b) o polipeptídeo isolado, sintético ou recombinante de (a), em que o resíduo alifático compreende Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina ou um sintético equivalente dos mesmos ou o resíduo ácido compreende Ácido aspártico, Ácido glutâmico ou um sintético equivalente dos mesmos ou o resíduo compreendendo um grupo amida compreende Ácido aspártico, Ácido glutâmico ou um sintético equivalente dos mesmos ou o resíduo básico compreende Lisina, Arginina ou um sintético equivalente dos mesmos ou o resíduo aromático compreende Fenilalanina, Tirosina ou um sintético equivalente dos mesmos.
[0025] Em modalidades alternativas, são providas composições que compreende um polipeptídeo como provido neste, em que opcionalmente a composição compreende adicionalmente um substrato para o polipeptídeo, e opcionalmente o substrato compreende um alquenol, um álcool crotílico, um but-3-en-2-ol ou um but-3-en-1-ol, um composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 ou uma combinação dos mesmos, em que opcionalmente a composição compreende ou é formulada como um líquido, um sólido ou um gel.
[0026] Em modalidades alternativas, um polipeptídeo como provido neste compreende adicionalmente um epítopo ou uma etiqueta, e opcionalmente a etiqueta é uma etiqueta de afinidade.
[0027] Em modalidades alternativas, são providos anticorpos isolados, sintéticos ou recombinantes: (a) que ligam-se especificamente a um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 22 ou (b) o anticorpo de (a), em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou policlonal.
[0028] Em modalidades alternativas, são providos hibridomas que compreendem um anticorpo que liga-se especificamente ao polipeptídeo como provido neste, ou um hibridoma que produz um anticorpo como provido neste.
[0029] Em modalidades alternativas, são providos métodos de isolar ou identificar um polipeptídeo com uma atividade enzimática que compreende as etapas de: (a) prover um anticorpo como provido neste; (b) prover uma amostra que compreende um ou uma pluralidade de polipeptídeos e (c) contatar a amostra da etapa (b) com o anticorpo da etapa (a) sob condições em que o anticorpo pode ligar-se especificamente ao polipeptídeo, em que opcionalmente a atividade enzimática compreende uma atividade de desidratase de linalool-isomerase (LinD), uma atividade de vinilisomerase, ou uma atividade de desidratase, desse modo isolando ou identificando um polipeptídeo tendo a atividade enzimática.
[0030] Em modalidades alternativas, são providos métodos de produzir um polipeptídeo recombinante que compreende (i) (a) prover um ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor, em que o ácido nucleico compreende um ácido nucleico como provido neste e (b) que expressa o ácido nucleico da etapa (a) sob condições que permite a expressão do polipeptídeo, desse modo, produzindo um polipeptídeo recombinante ou (ii) o método de (i), que compreende adicionalmente transformar uma célula hospedeira com o ácido nucleico da etapa (i) (a) seguido pela expressão do ácido nucleico da etapa (a), desse modo, produzindo um polipeptídeo recombinante em uma célula transformada.
[0031] Em modalidades alternativas, são métodos providos para produzir um composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 de um composto correspondente a, ou que compreende, a fórmula geral CnH2nO, com 3<n<7, que compreende: (a) cultivar a célula transformada ou transduzida, engenheirada, não natural como provido neste, ou uma célula vegetal como provido neste, em um meio adequado que compreende uma fonte de carbono ou um substrato para um polipeptídeo como provido neste e cultivar a célula sob condições adequadas para produzir um produto enzimático que compreende o composto ou (b) expressar um ácido nucleico como provido neste, sob condições em que um polipeptídeo como provido neste é produzido e contatar o polipeptídeo com um substrato para um polipeptídeo como provido neste, sob condições adequadas para produzir um produto enzimático que compreende o composto, em que, opcionalmente, o método compreende adicionalmente recuperar o composto produzido correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 , e/ou opcionalmente o composto é um butadieno (BD), ou um 1,3-butadieno, e/ou opcionalmente o composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é um álcool crotílico, um but-3-en-2-ol ou um but- 3-en-1-ol e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um 1,3-butadieno, e/ou opcionalmente o composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é um 2,3-dimetil-but-2-en-1-ol, um 2,3-dimetil-but- 3-en-2-ol ou um 2,3-dimetil-but-3-en-1-ol e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um dimetilbutadieno e/ou opcionalmente as condições compreendem expressão in vitro do ácido nucleico.
[0032] Em modalidades alternativas, são providos métodos de catalisar enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico a um 3-buten-2- ol, que compreende contatar um polipeptídeo como provido neste com o álcool crotílico sob condições em que o álcool crotílico é enzimaticamente convertido ao 3-buten-2-ol.
[0033] Em modalidades alternativas, são providos métodos de catalisar enzimaticamente a conversão de um 3-buten-2-ol a um butadieno, que compreende contatar um polipeptídeo como provido neste com o 3-buten- 2-ol sob condições em que o 3-buten-2-ol é enzimaticamente convertido ao butadieno.
[0034] Em modalidades alternativas, são providos métodos de catalisar enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico a um butadieno, que compreende contatar um polipeptídeo como provido neste com o álcool crotílico sob condições em que o álcool crotílico é enzimaticamente convertido ao butadieno.
[0035] Em modalidades alternativas, são providos peptídeos ou polipeptídeos tendo uma atividade de alvejamento periplásmico bacteriano que compreende ou que consiste em uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 20, 39, 45, 51, 57, 68, 76, 82, 88, 94 ou 100, ou uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 20, 39, 45, 51, 57, 68, 76, 82, 88, 94 ou 100 e tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa, ou tendo não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido.
[0036] Em modalidades alternativas, são providos polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes: (a) tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência to uma sequência de aminoácido como apresentada na: (i) SEQ ID NO: 2,; (ii) SEQ ID NO: 6 ou (iii) SEQ ID NO: 10 ou (b) que compreende um fragmento enzimaticamente ativo de (a) e que compreende adicionalmente ou que consiste em uma sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS) ou um polipeptídeo ou peptídeo tendo uma atividade PTS ou PSS ou uma sequência sinalizadora eucariótica. O polipeptídeo ainda pode compreender uma metionina de terminal N. O polipeptídeo ainda pode compreender uma sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou a sequência sinalizadora periplásmica (PSS), que pode ser: um trajeto de alvejamento de SecB pós-tradução PTS ou PSS; um trajeto de alvejamento (SRP) de partícula de reconhecimento de sinal de co-tradução PTS ou PSS ou um sistema independente e Sec de translocação de arginina duplo PTS ou PSS. Em modalidades alternativas, a sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS) compreende ou consiste em: (a) uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 8; (b) SEQ ID NO: 20, 39, 45, 51, 57, 68, 76, 82, 88, 94 ou 100; (c) SEQ ID NO: 25 [Lam B sequência sinalizadora ou LamBss], e opcionalmente o polipeptídeo codificado compreende SEQ ID NO: 24; (d) SEQ ID NO: 26 [MalE sequência sinalizadora ou MalEss]; (e) SEQ ID NO: 36 [FhuD sequência sinalizadora ou FhuDss]; (f) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO: 34; (g) um LamB ss, um MalE ss, um Mg1B ss, um OmpA ss, um Pe1B ss, um PhoA ss, um DsbA ss, um SfmC ss, um To1B ss, um TorT ss, um FhuD ss, um Pe1B ss, um YcdO ss, um MdoD ss, um Tor Ass ou um YcdO ss ou (h) um peptídeo codificado por um ácido nucleico tendo cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 19, 44, 38, 50, 56, 67, 75, 81, 87, 93 ou 99; e opcionalmente o polipeptídeo ou peptídeo compreendendo ou tendo a sequência de alvejamento periplásmica (PTS), sequência sinalizadora periplásmica (ss) ou tendo uma atividade de PTS é operacionalmente ligada no terminal amino do polipeptídeo de acordo com a reivindicação 34, e opcionalmente uma metionina de terminal amino é colocada terminal amino ao polipeptídeo ou peptídeo compreendendo ou tendo a sequência de alvejamento periplásmica (PTS), sequência sinalizadora periplásmica (ss) ou tendo uma atividade PTS ou PSS. Em modalidades alternativas, a sequência sinalizadora eucariótica é uma levedura ou sequência sinalizadora fúngica.
[0037] Em modalidades alternativas, são providos usos de ou um método de usar um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico como provido neste ou um polipeptídeo como provido neste, ou uma célula transformada ou transduzida como provido neste, ou uma célula vegetal como provido neste, for uma conversão de um composto correspondente à fórmula geral CnH2nO em CnH2n-2 + H2O, com 3<n<7. Em modalidades alternativas dos usos ou métodos: (a) o composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é um álcool crotílico, um but-3-en-2-ol ou um but-3-en-1-ol e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um 1,3 butadieno ou (b) o composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é um 2,3- dimetil-but-2-en-1-ol, um 2,3-dimetil-but-3-en-2-ol ou um 2,3-dimetil-but-3-en-1-ol e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um dimetilbutadieno.
[0038] Em modalidades alternativas, a conversão ou produção do CnH2n-2 com 3<n<7, acontece em uma célula in vivo ou in vitro.
[0039] Em modalidades alternativas, são providos métodos de produzir ou fabricar um dialqueno, um butadieno, um dimetil-butadieno, um 3-buten-2-ol, ou um composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 de um composto correspondente a, ou que compreende, a fórmula geral CnH2nO, com 3<n<7, tal como um álcool crotílico ou 2,3-dimetil-but-2- en-1-ol, que compreende: (a) cultivar uma célula transformada ou transduzida como provido neste, ou uma célula vegetal como provido neste, em um meio adequado que compreende uma fonte de carbono ou um substrato para um polipeptídeo como provido neste e cultivar a célula sob condições adequadas para produzir (para catalisar a geração de) um produto enzimático que compreende o composto ou (b) expressar um ácido nucleico como provido neste ou expressar um ácido nucleico a partir de uma construção ou vetor como provido neste, sob condições em que um polipeptídeo como provido neste é produzido e contatar o polipeptídeo com um substrato para o polipeptídeo sob condições adequadas para produzir um produto enzimático que compreende o composto, em que opcionalmente o substrato de (a) ou (b) compreende: um composto correspondente à fórmula geral CnH2nO em CnH2n-2 + H2O com 3<n<7, um álcool crotílico (but-2-en-1-ol), um 3-buten-2-ol, um 2,3-dimetil- but-2-en-1-ol ou qualquer combinação dos mesmos, em que, opcionalmente, o método compreende adicionalmente recuperar ou isolar o composto produzido, que compreende opcionalmente ou corresponde à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 , e/ou opcionalmente o composto produzido compreende ou é: um 3-buten-2-ol, um dimetil-butadieno, um butadieno (BD), ou um 1,3- butadieno, e/ou opcionalmente o substrato composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7, compreende ou é: um álcool crotílico, um but-3-en-2-ol ou um but-3-en-1-ol e/ou o composto de produto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7, compreende ou é um 1,3- butadieno, e/ou opcionalmente o substrato composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é ou compreende um 2,3-dimetil-but-2-en- 1-ol, um 2,3-dimetil-but-3-en-2-ol ou um 2,3-dimetil-but-3-en-1-ol e/ou o composto de produto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é ou compreende um dimetilbutadieno e/ou opcionalmente as condições compreendem expressão in vitro do ácido nucleico.
[0040] Em modalidades alternativas, o método compreende adicionalmente uma, diversas ou todas as seguintes etapas: (a) obter um gás residual fermentador que compreende a diolefina conjugada, por exemplo, butadieno, uma impureza volátil, uma impureza de bio-subproduto e vapor de água; (b) comprimir o gás residual fermentador em um sistema de compressão multi-estágios para produzir uma corrente comprimida; (c) alimentar a corrente comprimida em uma primeira zona de destilação para a remoção de impureza de bio-subproduto e vapor de água, a primeira zona de destilação tendo estágio de refluxo superior, estágios de destilação médios e um estágio re-ebulidor inferior; (d) contatar uma corrente de vapor superior produzida a partir da impureza de bio-subproduto e zona de destilação de remoção de água com um adsorvente para produzir uma corrente superior secada; (e) alimentar a corrente superior secada em uma segunda zona de destilação para a remoção de impureza volátil pelo topo, com a segunda zona de destilação tendo estágio de refluxo superior, estágios de destilação médios e um estágio re-ebulidor inferior e (f) coletar no fundo da zona de destilação para a remoção da impureza volátil a olefina conjugada líquida purificada resultante, por exemplo, butadieno.
[0041] Em modalidades alternativas, são providos métodos de produzir um polímero, resina ou artigo de fabricação que compreende reagir o di-alqueno, opcionalmente butadieno, para criar um polímero ou resina e ainda formar opcionalmente o polímero ou resina no artigo de fabricação, onde o di-alqueno, opcionalmente butadieno, é produzido por um método como provido neste, ou um use como provido neste ou opcionalmente, produzido usando-se uma composição como provido neste. Em modalidades alternativas, o polímero, resina ou artigo de fabricação compreende ou é um polímero contendo butadieno, polibutadieno, adiponitrila, um copolímero, acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS), borracha de acrilonitrila-butadieno (ABR), copolímeros de borracha de estireno-butadieno (SBR), látex de estireno-1,3-butadieno ou o artigo de fabricação é um pneu, um cano, uma peça automotiva, uma peça de barco, um recipiente alimentício ou um forro de tapete.
[0042] Em modalidades alternativas, são providos variações da SEQ ID NO: 12 Exemplar com base em diferenças de resíduo de aminoácido correspondentes particulares na SEQ ID NO: 2; onde em modalidades alternativas, um ou mais aminoácidos da SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo de comprimento total WT C. defragrans 65Phen LinD, são importados na posição correspondente da SEQ ID NO: 12 exemplar, como indicado na tabela de comparação abaixo. Em modalidades alternativas, as mudanças de posição podem modificar a atividade da SEQ ID NO: 12 ou uma variante desta como provido neste, para a conversão catalítica de álcool crotílico a butadieno ou but-3-en-2-ol a butadieno, como indicado abaixo.
[0043] Em modalidades alternativas, a invenção provê uma composição ou método de acordo com qualquer modalidade da invenção, substancialmente como descrito anteriormente ou descritos neste, com referência a qualquer um dos exemplos.
[0044] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da descrição e desenhos e a partir das reivindicações.
[0045] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados neste são, desse modo, expressamente incorporados por referência para todos os propósitos.
[0046] As modalidades da descrição descritas neste não são pretendidas serem exaustivas ou para limitar a descrição às formas precisas descritas nos seguintes desenhos ou descrição detalhada. Em vez disso, as modalidades são escolhidas e descritas de modo que outras pessoas versadas na técnica podem estimar e entender os princípios e práticas da descrição.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0047] Os desenhos apresentados neste são ilustrativos de modalidades da invenção e não são entendidos limitar o escopo da invenção como abrangido pelas reivindicações.
[0048] A FIG. 1 ilustra esquematicamente trajetos metabólicos exemplares alternativos para produzir álcool crotílico e butadieno, como debatido em detalhes, abaixo.
[0049] A FIG. 2 ilustra as sequências de alvejamento periplásmicas (PTSs) que podem ser usadas para praticar esta invenção, como descrito abaixo; também como descrito por Steiner et al. (2006) Nature Biotechnology 24:823-831.
[0050] A FIG. 3A e a FIG. 3B ilustram o efeito de peptídeos de sinal heterólogo fundidos a LinD maduro de C. defragrans 65 Phen (SEQ ID NO: 6). O PTS do tipo selvagem (WT) (SEQ ID NO: 8) de LinD tipo WT da C. defragrans 65 Phen (SEQ ID NO: 2) foi substituído com PTSs de proteínas periplásmicas de E. coli como indicado, expressado em E. coli e estimado para a atividade de butadieno como descrito abaixo.
[0051] A FIG. 4 ilustra um alinhamento de sequência (SEQ ID NO: 108): SEQ ID NO: 2 (tipo selvagem) vs SEQ ID NO: 12 (tipo selvagem); as diferenças são destacadas.
[0052] A FIG. 5 ilustra um alinhamento de sequência (SEQ ID NO: 109): Alinhamento SEQ ID NO: 12 (tipo selvagem) vs SEQ ID NO: 22 (variante tendo 11 substituições) Substituições na SEQ ID NO: 12: V19I, Y71F, G74S, G133M, R171K, I182L, V196F, D200N, F325S, G365S, L368F. SEQ ID NO: 12 não teve atividade detectável em álcool crotílico.
[0053] A FIG. 6 ilustra esquematicamente trajetos alternativos para a produção de álcool crotílico, um substrato para polipeptídeos enzimaticamente ativos exemplares providos neste e também ilustra trajetos exemplares para a produção de butadieno a partir de acetil-CoA, glutaconil- CoA, glutaril-CoA, 3-aminobutiril-CoA ou 4-hidroxibutiril-CoA por intermédio de álcool crotílico (em que em modalidades alternativas, um, diversos ou todos estes compostos podem ser adicionados a uma célula, um sistema de cultura celular ou um biorreator como provido neste); também são ilustradas enzimas exemplares para a transformação dos substratos identificados aos produtos e as enzimas incluem: A. acetiltransferase de acetil-CoA:acetil-CoA, B. acetoacetil-CoA redutase, C. 3-hidroxibutiril-CoA desidratase, D. crotonil-CoA redutase (formação de aldesídeo), E. crotonaldesídeo redutase (formação de álcool), I. crotonil-CoA hidrolase, sintetase, transferase, J. crotonato redutase, K. crotonil-CoA redutase (formação de álcool), L. glutaconil-CoA descarboxilase, M., glutaril-CoA desidrogenase, N. 3-aminobutiril-CoA desaminase, O. 4-hidroxibutiril-CoA desidratase e VD) um desidratase de álcool crotílico (CAD) (em que em modalidades alternativas, uma, diversas ou todas as enzimas de A até O são expressadas, por exemplo, recombinantemente expressadas, em uma célula engenheirada como provido neste). Uma desidratase de álcool crotílico (CAD) é um nome alternativo para as enzimas da presente invenção que reconhece álcool crotílico como o substrato para a conversão a butadieno.
[0054] A FIG. 7, ilustra reações exemplares para a detecção de butadieno, por exemplo, em avaliação de rendimento alto (HTS), como descrito neste.
[0055] As FIGS. 8A, 8B e 8C: ilustram reações exemplares para a detecção de butadieno, por exemplo, como descrito neste.
[0056] A FIG. 9 ilustra reações exemplares para a detecção de butadieno, por exemplo, como descrito neste.
[0057] A FIG. 10 ilustra trajetos enzimáticos exemplares para o uso na detecção de butadieno, por exemplo, como descrito neste. As reações enzimáticas exemplares para converter butadieno a 3-buteno-1,2-diol ou 1- hidróxi-2-butanona como mostrado. As enzimas são: A. monooxigenase de butadieno, B. hidrolase de monóxido de butadieno, C. desidrogenase de 3- buteno-1,2-diol, D. Monooxigenase de monóxido de butadieno.
[0058] A FIG. 11 descreve um alinhamento (SEQ ID NO: 108) de sequências de aminoácido de comprimento total de proteína do tipo selvagem conhecida (2753) (SEQ ID NO: 2) e um polipeptídeo primeiro identificado neste (9819) (SEQ ID NO: 12), para mostrar posições correspondentes; o peptídeo sinalizador é sublinhado.
[0059] A FIG. 12 descreve um alinhamento de sequências de aminoácido de comprimento total de proteína do tipo selvagem conhecida (2753) e um polipeptídeo identificado primeiro neste (9873), para mostrar posições correspondentes; o peptídeo sinalizador é sublinhado.
[0060] A FIG. 13 descreve um alinhamento (SEQ ID NO: 111) de sequências de aminoácido de comprimento total de proteína do tipo selvagem conhecida (2753) (SEQ ID NO: 2) e um polipeptídeo identificado primeiro neste (9874) (SEQ ID NO: 37), para mostrar posições correspondentes; o peptídeo sinalizador é sublinhado.
[0061] A FIG. 14 descreve um alinhamento (SEQ ID NO: 112) de sequências de aminoácido de comprimento total de proteína do tipo selvagem conhecida (2753) (SEQ ID NO: 2) e um polipeptídeo identificado primeiro neste (9875) (SEQ ID NO: 49), para mostrar posições correspondentes; o peptídeo sinalizador é sublinhado.
[0062] A FIG. 15 descreve um alinhamento (SEQ ID NO: 113) de sequências de aminoácido de comprimento total de proteína do tipo selvagem conhecida (2753) (SEQ ID NO: 2) e um polipeptídeo identificado primeiro neste (9894) (SEQ ID NO: 55), para mostrar posições correspondentes; o peptídeo sinalizador é sublinhado.
[0063] A FIG. 16 descreve um alinhamento de sequências de aminoácido de comprimento total de proteína do tipo selvagem conhecida (2753) e um polipeptídeo identificado primeiro neste (9895), para mostrar posições correspondentes; o peptídeo sinalizador é sublinhado.
[0064] A FIG. 17 apresenta atividade enzimática demonstrada de enzimas exemplares da invenção. “CrOH” é álcool crotílico; “MVC” é metil vinil carbinol ou 3-buten-2-ol; “Prenol” é prenol ou 3-metil-2-buten-1-ol.
[0065] A FIG. 18A e FIG. 18B proveem identidade percentual em pares (“% ID”) entre os novos polipeptídeos providos neste e enzima tipo selvagem conhecida bem como entre os novos polipeptídeos providos neste. A FIG. 18A provê identidade percentual de sequência de aminoácido em pares para a proteína de comprimento total (não processada) e FIG. 18B para a proteína “madura” ou processada.
[0066] Símbolos de referência semelhantes nos vários desenhos indicam elementos semelhantes, a não ser que estabelecido de outra maneira.
[0067] Referência será feita agora em detalhes a várias modalidades exemplares da invenção, cujos exemplos são ilustrados no desenhos anexos. A seguinte descrição detalhada é provida para dar ao leitor um melhor entendimento de certos detalhes de aspectos e modalidades da invenção e não devem ser interpretada como uma limitação no escopo da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0068] Em modalidades alternativas, são providas enzimas de vinilisomerase-desidratase não naturais ou geneticamente engenheiradas, incluindo desidratases de alquenol, desidratases de linalool e desidratases de álcool crotílico. Em modalidades alternativas, são providos polipeptídeos tendo uma atividade que compreende, por exemplo, uma vinilisomerase-desidratase, uma desidratase de alquenol, uma atividade de desidratase de linalool e/ou de um álcool crotílico desidratase ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades alternativas, são providas enzimas não naturais ou geneticamente engenheiradas que podem catalisar a isomerização de um álcool crotílico a um metil vinil carbinol, e opcionalmente, também são capazes de desidratar um metil vinil carbinol a um butadieno, por exemplo, a 1,3-butadieno. Em modalidades alternativas, são providas enzimas não naturais ou geneticamente engenheiradas que podem catalisar a desidratação de um metil vinil carbinol a um butadieno, por exemplo, um 1,3-butadieno.
[0069] Em modalidades alternativas, são providos peptídeos não naturais ou geneticamente engenheirados tendo uma atividade de sequência sinalizadora (SS), uma atividade de sequência de alvejamento periplásmica (PTS) e/ou uma atividade de sequência sinalizadora periplásmica (PSS). Em uma modalidade, peptídeos tendo atividade de SS, PTS ou PSS são operacionalmente ligados a polipeptídeo como provido neste ou a qualquer polipeptídeo, por exemplo, enzima, para a dobra e/ou inserção apropriadas do polipeptídeo em um periplasma bacteriano ou espaço periplásmico ou para direcionar o polipeptídeo em periplasma ou translocar o polipeptídeo através de uma membrana interna bacteriana em um periplasma.
[0070] Em modalidades alternativas, também são providos ácidos nucleicos não naturais ou geneticamente engenheirados que codificam um polipeptídeo (por exemplo, enzima) ou peptídeo (por exemplo, tendo Atividade de SS, PTS ou PSS) como descritos neste. Em modalidades alternativas, são providos sistemas de expressão ou veículos, por exemplo, vetores ou vírus recombinantes, vetores de clonagem e outros compreendendo ou tendo contido neste ácido nucleico como descritos neste.
[0071] Em modalidades alternativas, também são providas células não naturais ou geneticamente engenheiradas, por exemplo, células transfectadas ou transduzidas, compreendendo ou tendo contido neste um ácido nucleico como descritos neste e/ou um sistema de expressão ou veículo, por exemplo, um vetor recombinante ou um vírus, vetor de clonagem e semelhante como provido neste. Em modalidades alternativas, as células são células bacterianas, Archaeal, levedura, fúngicas, eucarióticas ou vegetais.
[0072] Em modalidades alternativas, são providos organismos ou plantas não naturais ou geneticamente engenheirados, compreendendo ou tendo contido neste um ácido nucleico como descritos neste e/ou um sistema de expressão ou veículo, por exemplo, um vetor recombinante ou um vírus, vetor de clonagem e semelhante como provido neste.
[0073] Em modalidades alternativas, células ou organismos não naturais ou geneticamente engenheirados como provido neste compreende adicionalmentem enzimas adicionais em um trajeto metabólico para produzir um produto desejado, por exemplo, butadieno ou 1,3-butadieno. Em modalidades alternativas, as enzimas adicionais podem envolver-se na produção de um substrato de uma enzima como provido neste (por exemplo, um álcool crotílico, um but-3-en-2-ol ou um but-3-en-1-ol, um 2-metil-but-3- en-1-ol, um 2-metil-but-2-en-1-ol, um 3-metil-but-3-en-2-ol ou um 2-metil- but-3-en-2-ol) ou as enzimas adicionais podem envolver-se na modificação de um produto de uma enzima como provido neste a um produto adicional.
[0074] Em modalidades alternativas, são providos sistemas de cultura celular, incluindo biorreatores, que compreendem células ou organismos não naturais ou geneticamente engenheirados como provido para a produção de um produto desejado, por exemplo, para metil vinil carbinol e/ou butadieno. Sequências de Proteína LDRV
[0075] Em modalidades alternativas, é provido um gênero de ácidos nucleicos tendo pelo menos entre 50% e 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de ácido nucleico que consiste em SEQ ID NO: 11, 13, 14, 21, 36, 42, 48, 54, 60, 63, 65, 71, 73, 79, 85, 91 ou 97 ou SEQ ID NO: 15, 17, 18, 40, 46, 52, 58, 69, 77, 83, 89, 95 ou 101, com a condição que nenhum ácido nucleico neste gênero codifica uma denominada proteína “LDRV”. Em modalidades alternativas, é provido um gênero de polipeptídeos tendo pelo menos entre 50% e 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de ácido nucleico que consiste em SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102, com a condição que nenhum polipeptídeo neste gênero é uma denominada proteína “LDRV”.
[0076] As proteínas “LDRV” providas ou excluídas compreendem variantes relatadas específicas da desidratase de linalool do tipo selvagem SEQ ID NO: 2, por exemplo, como expressamente listado em Pedido de patente internacional publicado como WO2014184345A1, incluindo aquelas sequências resumidas abaixo. cada uma das variantes específicas descritas neste são coletiva e individualmente referidas como proteínas “LDRV” (ou sequências).
[0077] Por exemplo, as proteínas providas ou excluídas incluem cada uma das variantes listadas nas páginas 17 a 45 do WO2014184345A1, por exemplo, variante “V195F A18I F20L G73S G132M R170K I181L D199N W269A L367F” na página 17 à variante “V195F G73S Y70F E77I G132A” na página 45 e também incluindo a sequência na página (do WO2014184345A1), por exemplo, variante “V195F T84I G132R”, até a página 99, por exemplo, variante “V195F G132A W269A”.
[0078] As proteínas “LDRV” providas ou excluídas também incluem cada uma das variantes expressamente listadas na FIG. 2 a FIG. 28 do WO2014184345A1. As proteínas LDRV também incluem cada variante expressamente listada nas tabelas neste, incluindo aquelas variantes nas seguintes tabelas extraídas da WO2014184345A1. As variantes exemplares incluem “V195F G73S R170K I181L F324S” e “V195F G132A G73S E771” que são variantes de 5 e de 4 substituições de sequência de aminoácido na desidratase de linalool do tipo selvagem desidratase SEQ ID NO: 2, respectivamente.
[0079] As proteínas “LDRV” providas ou excluídas também incluem cada uma das sequências de proteína maduras das sequências expressamente listadas no WO2014184345A1, visto que a desidratase de linalool do tipo selvagem SEQ ID NO: 2 tem um peptídeo sinalizador que garante o transporte no espaço periplásmico, quando este é removido.
[0080] As proteínas “LDRV” providas ou excluídas também incluem as variantes descritas no pedido de patente internacional WO2014033129A1, onde o peptídeo sinalizador é interrompido pela inserção de um his-tag (6 histidinas) após o início de metionina.
[0081] Também são providas ou excluídas as sequências de ácido nucleico LDRV que abrangem aquelas sequências sequência de ácido nucleico que codificam uma proteína LDRV provida ou excluída e inclui suas variantes de sequência de ácido nucleico degeneradas.
[0082] Por exemplo, as seguintes tabelas extraídas do WO2014184345A1 indicam as variantes de substituição específicas providas ou excluídas, como proteínas e ácidos nucleicos providos neste. As atividades enzimáticas expressadas são aquelas como relatadas no WO2014184345A1 usando-se ensaios específicos e substratos relatados neste.
[0083] Também são providas ou excluídas as sequências listadas na Tabela 1 do WO2014184345A1, que lista variantes de mudança de aminoácido simples de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirada aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, V195F na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que V em 195 é substituída por F.
[0084] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 2 do WO2014184345A1, que lista variantes de mudança de dois aminoácidos de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado neste como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, G132R V195F na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que G na posição 132 é substituída por R e V na posição 195 é substituída por F.
[0085] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 3 do WO2014184345A1, que lista variantes de mudança de variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, V195F significa que V na posição 195 na Sequência 1 do tipo selvagem do WO2014184345A1 é substituída por F.
[0086] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 4 do WO2014184345A1, que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2. Por exemplo, G132R V195F na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que G na posição 132 é substituída por R e V na posição 195 é substituída por F.
[0087] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 5 do WO2014184345A1, que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, G132R V195F na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que G na posição 132 é substituída por R e V na posição 195 é substituída por F.
[0088] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 10 do WO2014184345A1 que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, na posição 18 de sequência do tipo selvagem o A é substituído por I ou V, criando suas variantes.
[0089] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 13 do WO2014184345A1 que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, G132R V195F na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que G na posição 132 é substituída por R e V na posição 195 é substituída por F.
[0090] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 14 do WO2014184345A1 que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, G132R V195F na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que G na posição 132 é substituída por R e V na posição 195 é substituída por F.
[0091] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 16 do WO2014184345A1 que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem da C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas denominada aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, G132R V195F na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que G na posição 132 é substituída por R e V na posição 195 é substituída por F.
[0092] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 17 do WO2014184345A1 que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, G132A V195F na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que G na posição 132 é substituída por A e V na posição 195 é substituída por F.
[0093] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 19 do WO2014184345A1 que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, F20T na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que F na posição 20 é substituída por T.
[0094] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 20 do WO2014184345A1 que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, S75V na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que S na posição 75 é substituída por V.
[0095] Também são providas ou excluídas as sequências como listadas na Tabela 21 do WO2014184345A1 que lista variantes de mudança de aminoácido de desidratase de linalool do tipo selvagem de C. defragrans (referida como Sequência 1 no WO2014184345A1 mas engenheirado aqui como SEQ ID NO: 2). Por exemplo, A18I na seguinte tabela significa a variante daquela sequência específica em que A na posição 18 é substituída por I.
Sequência de proteína “cdLD-Botes”
[0096] Em modalidades alternativas, é provido um gênero de ácidos nucleicos tendo pelo menos entre 50% e 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de ácido nucleico que consiste em SEQ ID NO: 11, 13, 14, 21, 36, 42, 48, 54, 60, 63, 65, 71, 73, 79, 85, 91 ou 97 ou SEQ ID NO: 15, 17, 18, 40, 46, 52, 58, 69, 77, 83, 89, 95 ou 101, com a condição que nenhum ácido nucleico neste gênero codifica uma denominada proteína “cdLD-Botes”. Em modalidades alternativas, é provido um gênero de polipeptídeos tendo pelo menos entre 50% e 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de ácido nucleico que consiste em SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 61, 62, 64, 66, 72, 74, 80, 86, 92 ou 98 ou SEQ ID NO: 16, 41, 47, 53, 59, 70, 78, 84, 90, 96 ou 102, com a condição que nenhum polipeptídeo neste gênero é uma denominada proteína “cdLD-Botes”.
[0097] As proteínas “cdLD-Botes” providas ou excluídas compreendem variantes relatadas específicas da linalool desidratase SEQ ID NO: 103, por exemplo, como expressamente listado em USPN 9,220,742, incluindo aquelas sequências resumidas abaixo. Cada uma das variantes específicas descritas neste são coletiva e individualmente referidas como “cdLD-Botes” (ou sequências).
[0098] Em modalidades alternativas, as sequências providas ou excluídas incluem as denominadas sequências de ácido nucleico “cdLD- Botes” que abrangem as sequências de ácido nucleico que codificam a proteína “cdLD-Botes” e inclui suas variantes de sequência de ácido nucleico degeneradas.
[0099] As proteínas “cdLD-Botes” providas ou excluídas compreendem um polipeptídeo (ou um polinucleotídeo que as codificam) que compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90% ou entre 90% e 100%, homologia de sequência de aminoácido à SEQ ID NO: 103, em que a sequência de aminoácido compreende pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 mutações nas seguintes posições X da SEQ ID NO: 103 (onde cada R é o mesmo como o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 103) R1-95X96R97-98X99R100-122X123R124-185X187R188-203X204R205- 211X212R213-272X273X274X275R276-323X324R325-327X328R329-R359X360R361-365X366R367- 381X382R383-398, em que: X96 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de L e aminoácidos equivalentes; X99 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de L e aminoácidos equivalentes; X123 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de I e aminoácidos equivalentes; X187 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de M e aminoácidos equivalentes; X204 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de I e aminoácidos equivalentes; X212 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de F, Y, e aminoácidos equivalentes; X273 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de C e aminoácidos equivalentes; X274 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de F e aminoácidos equivalentes; X275 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de I e aminoácidos equivalentes; X324 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de L, E, e aminoácidos equivalentes; X328 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de V e aminoácidos equivalentes; X360 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de Y e aminoácidos equivalentes; X356 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de V, C, G e aminoácidos equivalentes; X382 é mutado a um aminoácido diferente selecionado de W e aminoácidos equivalentes.
[00100] As proteínas “cdLD-Botes” providas ou excluídas compreendem um polipeptídeo (ou um polinucleotídeo que as codificam) que compreende ou que consiste (tendo apenas) as seguintes combinações de mutações (mudanças) a SEQ ID NO: 103: V204I, M274F, V275I; V1231, M274F, V275I; V1231, V204I, V275I; V1231, V204I, M274F; M274F, V275I; M274F, A324L; M274F, R360Y; M274F, V275I, A324L; M274F, V275I, F382W; M274F, A324L, F382W; M274F, V275I, R360Y; F382W; V275I, A324L; V2751, F382W; V275I, A324L, R360Y; V2751, A324, F382W; R360Y, F382W; M274F; V275I; A324L; R360Y; F382W; V123I e/ou V204I e qualquer combinação destas; V123I/V204I/M274F; M274F/V2751/F382W; V275I/A324L; V275I; V123I e V204I; A324L, M274F, S366V, V275I e/ou F382W e qualquer combinação destas; V123I, V204I, M274F, V275I e F382W; V275I e F382W; A324L, V275I, V123I, e V204I; A324L e S366G; M274F e F96L; M274F e Y99L; F382W e L212Y; F382W e A273C; F382W e L328V; F382W, L328V, e 1187M; V204I, M274F, e V275I; V1231, M274F, e V275I; V1231, V204I, e V275I; V 123I, V204I, e M274F; M274F, V275I, e A324L; M274F, V275I; M274F, V275I, R360Y, e F382W; V275I e A324L; R360Y e F382W.
[00101] Adicionalmente, as proteínas “cdLD-Botes” (e os ácidos nucleicos que as codificam) também incluem, isto é, que também são providas ou excluídas, compreendem ou consistem de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107.
[00102] Também são providas ou excluídas proteínas “cdLD-Botes” (e os ácidos nucleicos que as codifica) tendo ou não tendo: uma ou mais metioninas de terminal N, uma etiqueta periplásmico, uma etiqueta de terminal C tal como um His-tag de terminal C ou qualquer combinação dos mesmos.
Métodos computacionais para alinhamento de sequência e geração de identidade de sequência
[00103] Em modalidades alternativas, quaisquer métodos computacionais para o alinhamento de sequência e geração de identidade de sequência podem ser usados, por exemplo, incluindo alinhamentos globais e alinhamentos locais. O alinhamento global usa a otimização global para forçar o alinhamento a abranger o comprimento total das sequências em questão. Os alinhamentos locais, em contraste, identificam regiões de similaridade dentro de sequências longas que são, frequentemente, amplamente divergentes em geral. Para o entendimento, a identidade de uma sequência alvo a um padrão, um alinhamento global pode ser usado. Opcionalmente, as sequências de terminal amino e/ou terminal carbóxi da sequência alvo que dividem pouca ou nenhuma identidade com a sequência padrão podem ser excluídas com um alinhamento global e geração de um registro de identidade.
[00104] Em modalidades alternativas, qualquer algoritmo bem conhecido por aqueles versados na técnica pode ser usado, tais como Align, BLAST, Clustal W e outros, para comparar e determinar uma similaridade ou identidade de sequência múltiplos e também determinar a presença ou significância de fendas na sequência à qual pode ser atribuída um peso ou registro. Tais algoritmos também são conhecidos na técnica e são similarmente aplicáveis para determinar a similaridade ou identidade de sequência de nucleotídeo. Os parâmetros para similaridade suficiente para determinar relação são computados com base em métodos bem conhecidos para calcular a similaridade estatística ou a chance de encontrar uma correspondência similar em um polipeptídeo aleatório e a significância da correspondência determinada. Uma comparação de computador de duas u mais sequência, se desejado, também pode ser otimizada visualmente por aqueles habilitados na técnica. Os produtos genéticos ou proteínas relacionados podem ser esperados ter uma similaridade alta, por exemplo, de 45% a 100% de identidade de sequência.
[00105] As proteínas que não são relacionadas podem ter uma identidade que é essencialmente a mesma como deve ser esperado ocorrer por mudança, se um banco de dados de tamanho suficiente for submetido à varredura digitalizado (cerca de 5%).
[00106] Por exemplo, um alinhamento pode ser realizado usando-se o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman, S. & Wunsch, C). Alternativamente, um método geral aplicável à pesquisa quanto a similaridades na sequência de aminoácido de duas proteínas J. Mol. Biol, 1970, 48, 443-453, implementadas através da ferramenta BALIGN pode ser usado. Parâmetros padrão podem ser usados para o alinhamento e BLOSUM62 pode ser usado como a matriz de registro.
[00107] Em modalidades alternativas, o algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) é usado para determinar a identidade de sequência entre as sequências de polipeptídeo ou entre um motivo de aminoácido e uma sequência padrão e uma sequência alvo. Em modalidades alternativas, BLAST é usado para identificar ou entender a identidade de um estiramento mais curto dos aminoácidos (por exemplo, um motivo de sequência) entre uma proteína padrão e um alvo. Em modalidades alternativas BLAST encontra sequências similares usando-se um método heurístico que aproxima o algoritmo de Smith-Waterman por localização de correspondências curtas entre as duas sequências. O algoritmo (BLAST) pode identificar sequências de biblioteca que assemelham-se com a sequência em questão acima de um certo limiar. Os parâmetros exemplares para determinar a relação de duas sou mais sequências usando-se o algoritmo BLAST, por exemplo, como pode ser apresentado abaixo. Em modalidades alternativas, os alinhamentos de sequência de aminoácido podem ser realizados usando-se a versão BLASTP 2.0.8 (Jan-05-1999) e os seguintes parâmetros: Matriz: 0 BLOSUM62; abertura de intervalo: 11; extensão de intervalo: 1; x_dropoff: 50; expect: 10.0; tamanho da palavra: 3; filtro: ligado. Os alinhamentos de sequência de ácido nucleico podem ser realizados usando-se a versão BLASTN 2.0.6 (Set-16-1998) e os seguintes parâmetros: correspondência: 1; desacordo: -2; abertura de intervalo: 5; extensão de intervalo: 2; x_dropoff: 50; expect: 10.0; tamanho de palavra: 11; filtro: desligado. Aqueles versados na técnica conhecerão quais modificações podem ser feitas aos parâmetros acima para aumentar ou diminuir a estringência da comparação, por exemplo, e determinar a relação de duas sou mais sequências.
Sistemas de Expressão, Células Engenheiradas
[00108] Em modalidades alternativas, as construções de expressão, veículos ou vetores são providos para incluir ou contendo, dentro de um ou mais ácidos nucleicos como exemplificado neste, opcionalmente, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão, por exemplo, um promotor, funcional em um organismo hospedeiro. Em modalidades alternativas, construções de expressão, veículos ou vetores aplicáveis para o uso nos organismos hospedeiros microbianos providos incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores de fago, vetores virais ou vírus recombinantes, epissomas e cromossomos artificiais, incluindo vetores e sequências de seleção ou marcadores operáveis para a integração estável em um cromossomo hospedeiro. Em modalidades alternativas, os vetores de expressão também incluem um ou mais genes marcadores selecionáveis e sequências de controle de expressão apropriados. Os genes marcadores selecionáveis também podem ser incluídos, por exemplo, proveem resistência a antibióticos ou toxinas, complementam deficiência auxotróficas ou fornecem nutrientes críticos que não nos meios de cultura. As sequências de controle de expressão podem incluir promotores constitutivos ou indutíveis, intensificadores de transcrição, terminadores de transcrição e outros que são bem conhecidos na técnica. quando dois ou mais exógenos que codificam ácidos nucleicos devem ser co-expressados, ambos os ácidos nucleicos podem ser inseridos, por exemplo, em um vetor de expressão simples ou em vetores de expressão separados. Para a expressão de vetor simples, os ácidos nucleicos codificadores podem ser opcionalmente ligados a uma sequência de controle de expressão comum ou ligados às sequências de controle de expressão diferentes, tal como um promotor indutível e um promotor constitutivo.
[00109] Em modalidades alternativas, a transformação ou transdução de um ácido nucleico como provido neste em uma célula, incluindo transformação ou transdução de uma sequência de ácido nucleico exógena envolvida em um trajeto metabólico ou sintético, pode ser confirmada usando-se métodos bem conhecidos na técnica. tais métodos incluem, por exemplo, análise de ácido nucleico, tais como Northern blots ou amplificação de reação de cadeia de polimerase (PCR) ou imunoblotting para a expressão de produtos genéticos gene ou outros métodos analíticos adequados para testar a expressão de uma sequência de ácido nucleico introduzida ou seu produto genético correspondente. É entendido por aqueles versados na técnica que o ácido nucleico exógeno é expressado em uma quantidade suficiente para a produção do produto desejado ainda é entendido que os níveis de expressão podem ser otimizados para obter a expressão suficiente usando-se métodos bem conhecidos na técnica e como descrito neste.
[00110] Em modalidades alternativas, o termo “exógeno” é pretendido significar que a molécula preferida (por exemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico como provido neste) ou a atividade referida (por exemplo, enzima) são introduzidas no organismo microbiano hospedeiro. A molécula pode ser introduzida, por exemplo, epissomalmente ou por introdução de um ácido nucleico (por exemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico como provido neste) em um material genético hospedeiro, tal como por integração em um cromossomo hospedeiro ou como material genético não cromossômico, tal como um plasmídeo. Em modalidades alternativas, o termo “exógeno” é usado em referência à expressão de um ácido nucleico codificador em uma forma expressável em uma célula, por exemplo, um organismo microbiano. Quando usado em referência a uma atividade biossintética, o termo “exógeno” pode referir-se a uma atividade que é introduzida no organismo hospedeiro de referência. A fonte pode ser, por exemplo, um homólogo ou heterólogo (por exemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico como provido neste) que codifica ácido nucleico que expressa a atividade referida seguindo a introdução no organismo microbiano hospedeiro. Em modalidades alternativas, o termo “endógeno” refere-se a uma molécula referida ou atividade que está presente no hospedeiro. Em modalidades alternativas, o termo quando usado em referência à expressão de um ácido nucleico codificador pode referir-se à expressão de um ácido nucleico codificador contido dentro do organismo microbiano. Em modalidades alternativas, o termo “heterólogo” pode referir-se a uma molécula ou atividade derivada de uma outra fonte que não a espécie referida visto que “homólogo” refere-se a uma molécula ou atividade derivada do organismo microbiano hospedeiro. Em modalidades alternativas, a expressão exógena de um ácido nucleico codificador pode utilizar cada um ou tanto um ácido nucleico heterólogo quanto homólogo.
[00111] Em modalidades alternativas mais do que um heterólogo de ácido nucleico exógeno (por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos como provido neste) podem ser introduzidos no organismo microbiano hospedeiro em moléculas de ácido nucleico separadas, em moléculas de ácido nucleico policistrônicas ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades alternativas, um organismo microbiano pode ser engenheirado para expressar dois ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam uma enzima ou proteína de trajeto desejado. No caso onde dois ácidos nucleicos exógenos (por exemplo, onde pelo menos um é um ácido nucleico como provido neste) que codifica uma atividade desejada são introduzidos em um organismo microbiano hospedeiro, em modalidades alternativas os dois ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos como um ácido nucleico simples, por exemplo, em um plasmídeo simples, em plasmídeos separados ou podem ser integrados no cromossomo hospedeiro em um local simples ou locais múltiplos. Em modalidades alternativas, mais do que dois ácidos nucleicos exógenos (por exemplo, onde pelo menos um é um ácido nucleico como provido neste) podem ser introduzidos em um organismo hospedeiro em qualquer combinação desejada, por exemplo, em um plasmídeo simples, em plasmídeos separados, podem ser integrados no cromossomo hospedeiro em um local simples ou locais múltiplos.
[00112] Em modalidades alternativas, os ácidos nucleicos providos neste podem ser introduzidos de maneira estável ou transitória na célula hospedeira usando-se técnicas bem conhecida na técnica incluindo, mas não limitado à, conjugação, eletroporação, transformação química, transdução, transfecção e transformação por ultrassom. Opcionalmente, para expressão exógena em E. coli ou outras células procarióticas, algumas sequências de ácido nucleico nos genes ou cDNAs de ácidos nucleicos eucarióticos podem codificar os sinais de alvejamento, tais como um sinal mitocondrial de terminal N ou outro sinal de alvejamento, que pode ser removido antes da transformação em células hospedeiras procarióticas, se desejado. Em modalidades alternativas, a remoção de uma sequência líder mitocondrial é realizada para a expressão aumentada em E. coli (Hoffmeister et al., 1 Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)). Em modalidades alternativas para a expressão exógena em levedura ou outras células eucarióticas, os genes podem ser expressados no citosol sem a adição de sequência líder ou pode ser alvejada à mitocôndria ou outras organelas ou alvejados para a secreção, pela adição de uma sequência de alvejamento adequada, tal como um alvejamento mitocondrial ou sinal de secreção adequada para as células hospedeiras. Em modalidades alternativas, as modificações apropriadas a um ácido nucleico como provido neste são feitos, por exemplo, para remover ou induzir uma sequência de alvejamento ou para comunicar quaisquer propriedades desejáveis. Em modalidades alternativas, os genes devem ser submetidos à otimização de códon com técnicas bem conhecidas na técnica para atingir a expressão otimizada das proteínas.
[00113] Em modalidades alternativas providas neste são “células microbianas,” “organismos microbianos” ou “microorganismos” (por exemplo, contendo nestes um ácido nucleico como provido neste para expressar um polipeptídeo como provido neste, incluem qualquer organismo que existe como uma célula microscópica que está incluída dentro dos domínios de archaea, bactérias ou eukarya. Em modalidades alternativas, são providas neste as células procarióticas ou eucarióticas ou organismos tendo um tamanho microscópio e inclui bactérias, archaea e eubactérias de todas as espécies bem como os microorganismos eucarióticos, tais como levedura e fungos. Em modalidades alternativas providas neste são culturas celulares de quaisquer espécies que podem ser cultivadas para a produção de um produto bioquímico.
[00114] Em modalidades alternativas providas neste são microorganismos contendo nestes um ácido nucleico ou polipeptídeo como provido neste; incluindo tanto organismos procarióticos quanto procarióticos incluindo, mas não limitado a, bactérias, incluindo Archaea e eubactérias e eucariotas, incluindo levedura, planta, inseto, animal e mamífero incluindo in vitro células humanas. As espécies exemplares usadas para praticar esta invenção incluem, por exemplo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Candida boidinii, Clostridium kluyveri, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium tetanomorphum, Clostridium tetani, Clostridium propionicum, Clostridium aminobutyricum, Clostridium subterminale, Clostridium sticklandii, Ralstonia eutropha, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Porphyromonas gingivalis, Arabidopsis thaliana, Thermus thermophilus, espécies Pseudomonas, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus, Rhodobacter spaeroides, Thermoanaerobacter brockii, Metallosphaera sedula, Leuconostoc mesenteroides, Chloroflexus aurantiacus, Roseiflexus castenholzii, Eritrobacter, Simmondsia chinensis, Espécies Acinetobacter, incluindo Acinetobacter calcoaceticus e Acinetobacter baylyi, Porphyromonas gingivalis, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus acidocaldarius, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus brevis, Bacillus pumilus, Rattus norvegicus, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Euglena gracilis, Treponema denticola, Moorella thermoacetica, Thermotoga maritima, Halobacterium salinarum, Geobacillus stearothermophilus, Aeropyrum pernix, Sus scrofa, Caenorhabditis elegans, Corynebacterium glutamicum, Acidaminococcus fermentans, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus, Enterobacter aerogenes, Candida, Aspergillus terreus, Pedicoccus pentosaceus, Zymomonas mobilus, Acetobacter pasteurians, Kluyveromyces lactis, Eubacterium barkeri, Bacteroides capillosus, Anaerotruncus colihominis, Natranaerobius thermophilusm, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Serratia marcescens, Citrobacter amalonaticus, Myxococcus xanthus, Fusobacterium nuleatum, Penicillium chrysogenum, marine gamma proteobacterium, butirato produzir bacterium, Nocardia iowensis, Nocardia farcinica, Streptomyces griseus, Schizosaccharomyces pombe, Geobacillus thermoglucosidasius, Salmonella typhimurium, Vibrio cholera, Heliobacter pylori, Nicotiana tabacum, Oryza sativa, Haloferax mediterranei, Agrobacterium tumefaciens, Achromobacter denitrificans, Fusobacterium nucleatum, Streptomyces clavuligenus, Acinetobacter baumanii, Mus musculus, Lachancea kluyveri, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma brucei, Pseudomonas stutzeri, Bradyrhizobium japonicum, Mesorhizobium loti, Bos taurus, Nicotiana glutinosa, Vibrio vulnificus, Selenomonas ruminantium, Vibrio parahaemolyticus, Archaeoglobus fulgidus, Haloarcula marismortui, Pyrobaculum aerophilum, Mycobacterium smegmatis MC2 155, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10, Mycobacterium marinum M, Tsukamurella paurometabola DSM 20162, Cyanobium PCC 7001, Dictyostelium discoideum AX4, bem como outras espécies exemplares descritas neste ou disponíveis como organismos de fonte para genes correspondentes.
[00115] As espécies exemplares usadas para praticar esta invenção incluem, por exemplo Acinetobacter baumannii Naval-82, Acinetobacter sp. ADP], Acinetobacter sp. strain M-1, Actinobacillus succinogenes 130Z, Allochromatium vinosum DSM 180, Amycolatopsis metanolica, Arabidopsis thaliana, Atopobium parvulum DSM 20469, Azotobacter vinelandii DJ, Bacillus alcalophilus ATCC 27647, Bacillus azotoformans LMG 9581, Bacillus coagulans 36D1, Bacillus megaterium, Bacillus metanolicus MGA3, Bacillus metanolicus PB1, Bacillus metanolicus PB-1, Bacillus selenitireducens MLS1 0 , Bacillus smithii, Bacillus subtilis , Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia multivorans, Burkholderia pyrrocinia, Burkholderia stabilis, Burkholderia thailandensis E264, Burkholderiales bacterium Josh/ 001, bactéria produtora de butirato L2-50, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida boidinii, Candida metilica, Carboxydothermus hydrogenoformans, Carboxydothermushydrogenoformans Z-2901, Caulobacter sp. AP07, Chloroflexus aggregans DSM 9485, Chloroflexus aurantiacus J-10 fZ, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri ATCC BAA-895, Citrobacter youngae , Clostridium, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Clostridium acidurici, Clostridium aminobutyricum, Clostridium asparagiforme DSM 15981, Clostridium beijerinckii , Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, Clostridium bolteae ATCC BAA-613, Clostridium carboxidivorans P7, Clostridium cellulovorans 743B, Clostridium difficile, Clostridium hiranonis DSM 13275, Clostridium hylemonae DSM 15053, Clostridium kluyveri, Clostridium kluyveri DSM 555, Clostridium ljungdahli, Clostridium ljungdahlii DSM 13528, Clostridium metilpentosum DSM 5476, Clostridium pasteurianum, Clostridium pasteurianum DSM 525, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens ATCC 13124, Clostridium perfringens str. 13, Clostridium phytofermentans ISDg, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum NI-4, Clostridium tetani, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium glutamicum R, Corynebacterium sp. U-96, Corynebacterium variabile, Cupriavidus necator N-1, Cyanobium PCC7001, Desulfatibacillum alkenivorans AK-01, Desulfitobacterium hafniense, Desulfitobacterium metallireducens DSM 15288, Desulfotomaculum reducens MI-1, Desulfovibrio africanus str. Walvis Bay, Desulfovibrio fructosovorans JJ, Desulfovibrio vulgaris str. Hildenborough, Desulfovibrio vulgaris str. Miyazaki F', Dictyostelium discoideum AX4, Escherichia coli, Escherichia coli K-12 , Escherichia coli K-12 MG1655, Eubacterium hallii DSM 3353 , Flavobacterium frigoris, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 , Geobacillus sp. Y4.1MC1, Geobacillus themodenitrificans NG80-2, Geobacter bemidjiensis Bern, Geobacter sulfurreducens, Geobacter sulfurreducens PCA, Geobacillus stearothermophilus DSM 2334, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Homo sapiens, Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobacter thermophilus TK-6, Hyphomicrobium denitrificans ATCC 51888, Hyphomicrobium zavarzinii, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578, Lactobacillus brevis ATCC 367, Leuconostoc mesenteroides, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus sphaericus, Mesorhizobium loti MAFF303099, Metallosphaera sedula, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina acetivorans C2A, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei Tuc01, Methylobacter marinus, Methylobacterium extorquens, Methylobacterium extorquens AM1, Methylococcus capsulatas, Methylomonas aminofaciens, Moorella thermoacetica, Mycobacter sp. strain JC1 DSM 3803, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium gastri, Mycobacterium marinum M, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium smegmatis MC2 155, Mycobacterium tuberculosis, Nitrosopumilus salaria BD31, Nitrososphaera gargensis Ga9.2, Nocardia farcinica IFM 10152, Nocardia iowensis (sp. NRRL 5646), Nostoc sp. PCC 7120, Ogataea angusta, Ogataea parapolymorpha DL-1 (Hansenula polymorpha DL-1), Paenibacillus peoniae KCTC 3763, Paracoccus denitrificans, Penicillium chrysogenum, Photobacterium profundum 3TCK, Phytofermentans ISDg, Pichia pastoris, Picrophilus tornidus DSM9790, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas gingivalis W83, Pseudomonas aeruginosa PA01, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas knackmussii, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, Pyrobaculum islandicum DSM 4184, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii OT3, Ralstonia eutropha, Ralstonia eutropha H16, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sphaeroides ATCC 17025, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas palustris CGA009, Rhodopseudomonas palustris DX-1, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum rubrum ATCC 11170, Ruminococcus obeum ATCC 29174, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae S288c, Salmonella enterica, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2, Salmonella enterica typhimurium, Salmonella typhimurium, Schizosaccharomyces pombe, Sebaldella termitidis ATCC 33386 , Shewanella oneidensis MR-1, Sinorhizobium meliloti 1021, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350, Sulfolobus acidocalarius, Sulfolobus solfataricus P-2, Synechocystis str. PCC 6803, Syntrophobacter fumaroxidans, Thauera aromatica, Thermoanaerobacter sp. X514, Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus litoralis, Thermoplasma acidophilum, Thermoproteus neutrophilus, Thermotoga maritima, Thiocapsa roseopersicina, Tolumonas auensis DSM 9187, Trichomonas vaginalis G3, Trypanosoma brucei, Tsukamurella paurometabola DSM 20162, Vibrio cholera, Vibrio harveyi ATCC BAA-1116, Xanthobacter autotrophicus Py2, Yersinia intermedia ou Zea mays.
Sistemas de cultura celular, biorreatores
[00116] Em modalidades alternativas, são providos sistemas de cultura celular, incluindo biorreatores, que compreende células ou organismos não naturais ou geneticamente engenheirados como provido neste para a produção de um produto desejado, por exemplo, a metil vinil carbinol, butadieno. Os métodos para produzir os produtos desejados usando-se células engenheiradas como provido neste incluem fermentação anaeróbica ou aeróbica, métodos contínuos ou de batelada e semelhantes. Qualquer sistema de cultura, reator, biorreator e semelhantes conhecidos na técnica podem ser usados para a prática dos mesmos métodos ou usando-se células ou organismos não naturais ou geneticamente engenheirados como provido neste para a produção de um produto desejado, por exemplo, como descrito na patente U.S. ou pedido de patente N° 9,023,642; 9,012,205; 9,005,550; 8,980,624; 8,980,623; 8,778,647; 8,709,793; 8,518,691; 8,835,159; 5,954,858; 20150104835; 20140377822; 20140187826; 20150017683; 20130005011; 20120070888.
[00117] Em modalidades alternativas, para usar sistemas de cultura celular, qualquer fonte de carbono adequada pode ser usada. Por exemplo, em uma modalidade, a fonte de carbono é metanol ou formiato e cada um ou ambos podem ser usados como uma fonte de carbono nos organismos providos neste, sozinhos ou em combinação com os trajetos de produto providos neste.
[00118] Em modalidades alternativas, a fonte de carbono compreende um açúcar (por exemplo, uma glicose) ou uma biomassa contendo açúcar. Por exemplo, a fonte de carbono pode compreender metanol e/ou formiato e um açúcar (por exemplo, glicose) ou uma biomassa contendo açúcar. Em modalidades específicas, o metanol ou formiato ou ambos, na alimentação por fermentação é provido como uma mistura com açúcar (por exemplo, glicose) ou biomassa compreendendo açúcar (contendo açúcar). Em certas modalidades, o açúcar é provido para o desenvolvimento de cepa suficiente.
[00119] Em modalidades alternativas, células não naturais ou geneticamente engenheiradas providas neste (por exemplo, quando usado para a produção de um butadieno) são cultivadas em um meio com fonte de carbono e outros nutrientes essenciais. Em modalidades alternativas, pode ser desejável manter as condições anaeróbicas no fermentador para reduzir o custo do processo total. Tais condições podem ser obtidas, por exemplo, pulverizando-se primeiro o meio com nitrogênio e então vedando os reservatórios ou fermentadores. Para cepas onde o crescimento não é observado anaerobicamente, então as condições microaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas podem ser aplicadas. As condições anaeróbicas exemplares foram descritas previamente e são bem conhecidas na técnica. as condições aeróbicas e anaeróbicas são descritas, por exemplo, na publicação dos Estados Unidos 2009/0047719, depositada em 10 de agosto de 2007. Em modalidades alternativas, as fermentações podem ser realizadas de uma maneira de bateladas, alimentação-batelada ou contínua.
[00120] Se desejado, o pH do sistema de cultura pode ser mantido em um pH desejado, em particular pH neutro, tal como um pH de cerca de 7 pela adição de uma base, tal como NaOH ou outras bases, ou ácido, como necessário para manter o meio de cultura em um pH desejável. A taxa de desenvolvimento pode ser determinada pela medição da densidade ótica usando-se um espectrofotômetro (600 nm) e a taxa de absorção de glicose pelo monitoramento da depleção da fonte de carbono durante o tempo.
[00121] O meio de desenvolvimento pode incluir, por exemplo, qualquer fonte de carboidrato que pode fornecer uma fonte de carbono microorganismo de ocorrência natural. Tais fontes incluem, por exemplo, açúcares, tais como glicose, xilose, arabinose, galactose, manose, frutose, sacarose e amido. Outras fontes de carboidrato incluem, por exemplo, matérias primas e biomassa renováveis. Os tipos exemplares de biomassas que podem ser usados como matérias primas nos métodos de avaliação incluem biomassa celulósica e matéria-prima celulósica ou porções de matéria-prima. Tais matérias primas de biomassa contêm, por exemplo, substratos de carboidrato úteis como fontes de carbono, tais como glicose, xilose, arabinose, galactose, manose, frutose e amido. Dadas as explicações e instruções providas neste, aqueles habilitados na técnica entenderão que outras matérias-primas e biomassas renováveis que não aquelas exemplificadas acima também podem ser usadas para cultivar os organismos microbianos providos nestes, por exemplo, para a produção do composto desejado, por exemplo, um butadieno.
[00122] Além das matérias-primas renováveis, tais como aquelas exemplificadas acima, as células não naturais ou geneticamente engenheiradas providas neste também podem ser modificadas para o desenvolvimento em gás de síntese como sua fonte de carbono. Nesta modalidade específica, uma ou mais proteínas ou enzimas são expressadas nos organismos para prover um trajeto metabólico para a utilização de syngas ou outra fonte de carbono gasosa. O gás de síntese, também conhecido como syngas ou gás produtor, é o produto maior da gaseificação de carvão e de materiais carbonáceos, tais como materiais de biomassa, incluindo lavouras agrícolas e resíduos. O syngas é uma mistura primária de H2 e CO e pode ser obtida a partir da gaseificação de qualquer matéria-prima orgânica, incluindo mas não limitado a carvão, óleo de carvão, gás natural, biomassa e matéria orgânica residual. A gaseificação é geralmente realizada sob uma razão de combustível para oxigênio alta. Embora em grande parte H2 e CO, o syngas também pode incluir CO2 e outros gases em quantidades menores. Desta maneira, o gás de síntese provê uma fonte efetiva quanto ao custo de carbono gasoso, tais como CO e, adicionalmente, CO2.
[00123] Em modalidades alternativas, as células não naturais ou geneticamente engenheiradas providas neste podem usar o ciclo de ácido tricarboxílico redutivo (reverso) ligado com a desidrogenase de monóxido de carbono e/ou atividades de hidrogenase para a conversão de CO, CO2 e/ou H2 a acetil-CoA e outros produtos, tais como acetato. Os organismos capazes de fixar carbono por intermédio do trajeto de TCA redutivo pode utilizar uma ou mais das seguintes enzimas: ATP citrato - liase, liase de citrato, aconitase, desidrogenase de isocitrato, alfa-cetoglutarato: oxidorredutase de ferredoxina, sintetase de succinil-CoA, transferase de succinil-CoA, redutase de fumarato, fumarase, desidrogenase de malato, NAD(P)H: oxidorredutase de ferredoxina, desidrogenase e hidrogenase de monóxido de carbono. Especificamente, os equivalentes de redução extraídos de CO e/ou H2 por desidrogenase e hidrogenase de monóxido de carbono são utilizados para fixar CO2 por intermédio do ciclo de TCA redutivo TCA em acetil-CoA ou acetato. O acetato pode ser convertido a acetil-CoA por enzimas, tais como acetil-CoA transferase, cinase/fosfotransacetilase de acetato e sintase de acetil-CoA. Acetil-CoA pode ser convertido ao butadieno, gliceraldesídeo-3-fosfato, fosfoenolpiruvato e piruvato, por piruvato: oxidorredutase de ferredoxina e as enzimas de gluconeogênese. Seguindo as explicações e instruções providas neste para introduzir um número suficiente de codificadores de ácido nucleico para gerar um trajeto metabólico desejado, aqueles habilitados na técnica entenderão que o mesmo projeto de engenharia também pode ser realizado em relação à introdução pelo menos dos ácidos nucleicos que codificam as enzimas ou proteínas de trajeto de TCA redutivo ausentes no organismo hospedeiro. Portanto, a introdução de um ou mais codificadores de ácido nucleico nos organismos microbianos, tal que o organismo modificado contenha o trajeto TCA redutivo completo conferirá a capacidade de utilização de syngas e bibliotecas de tais micróbios modificados pode ser avaliado usando-se os mecanismos e métodos descritos neste.
[00124] Em modalidades alternativas, células não naturais ou geneticamente engenheiradas providas neste podem iniciar a síntese de um produto desejado, por exemplo, um butadieno, a partir de um intermediário e este intermediário pode ser adicionado ao meio de cultura (ou biorreactor) ou as enzimas podem ser adicionadas a uma célula para complementar a quantidade de ou adicionar (de novo) à célula a produção de, por exemplo, acetoacetil-CoA, 3-hidroxibutiril-CoA, crotonil-CoA, crotonaldesídeo, álcool crotílico, 2- betenil-fosfato, 2-butenil-4-difosfato, eritritol-4-fosfato, 4- (citidina 5'-difosfo)-eritritol, 2-fosfo-4-(citidina 5'-difosfo)-eritritol, eritritol- 2,4-ciclodifosfato, 1- hidróxi-2-butenil 4-difosfato, butenil 4-difosfato, 2- butenil 4-difosfato, 3-oxoglutaril-CoA, 3-hidroxiglutaril-CoA, 3-hidróxi-5- oxopentanoato, 3,5-di-hidróxi pentanoato, 3-hidróxi-5- fosfonatooxipentanoato, 3-hidróxi-5- [hidróxi (fosfonooxi) fosforil]óxi pentanoato, crotonato, eritrose, eritritol, 3,5-dioxopentanoato ou 5-hidróxi-3- oxopentanoato.
[00125] Em modalidades alternativas, células não naturais ou geneticamente engenheiradas providos neste são cultivadas sob condições que podem ser classificadas e/ou desenvolvidas continuamente para a fabricação de um produto desejado, por exemplo, um butadieno. Os procedimentos de desenvolvimento exemplares incluem, por exemplo, fermentação alimentada- batelada e separação por batelada; fermentação alimentada-batelada e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua. Todos estes processos são bem conhecidos na técnica. os procedimentos de fermentação podem ser úteis para a produção biossintética de quantidades comerciais de um produto desejado, por exemplo, um butadieno.
[00126] Em modalidades alternativas, como com os procedimentos de cultura não contínuos, a produção contínua e/ou quase contínua de um produto desejado, por exemplo, um butadieno, pode incluir cultivar uma célula não natural ou geneticamente engenheirada como provido neste em nutrientes suficientes e meio para sustentar e/ou quase sustentar o desenvolvimento em uma fase exponencial. A cultura contínua sob tais condições pode incluir, por exemplo, desenvolvimento por 1 dia, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou mais. Em modalidades alternativas, a cultura contínua pode incluir períodos de tempo mais longos de 1 semana, 2, 3, 4 ou 5 ou mais semanas e até vários meses. Alternativamente, os organismos microbianos podem ser cultivados por horas, se adequado para uma aplicação particular. Deve ser entendido que as condições de cultura contínuas e/ou quase contínuas também podem incluir todos os intervalos de tempo entre estes períodos exemplares. Em modalidades alternativas, o tempo de cultivar o organismo microbiano é para um período suficiente de tempo para produzir uma quantidade suficiente de produto para um propósito desejado.
[00127] Consequentemente, são providos neste in vitro ou in vivo, por exemplo, com base celular, métodos de produzir ou fabricar butadieno, um dialqueno ou um composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 de um composto correspondente a, ou que compreende, a fórmula geral CnH2O, com 3<n<7, que compreende: (a) cultivar a célula transformada ou transduzidas ou células vegetais da invenção descritos neste em um meio adequado que compreende uma fonte de carbono ou um substrato para um polipeptídeo da invenção como descritos neste e cultivar a célula sob condições adequadas para produzir um produto enzimático que compreende o composto ou (b) expressar um ácido nucleico da invenção sob condições em que um polipeptídeo da invenção é produzido e contatar o polipeptídeo com um substrato para o polipeptídeo sob condições adequadas para produzir um produto enzimático que compreende o composto, em que, opcionalmente, o método compreende adicionalmente recuperar o composto produzido correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7, (c) u opcionalmente o composto é um butadieno (BD), a 1,3- butadieno, e/ou opcionalmente o composto correspondente à fórmula geral CnH2 O com 3<n<7 é um álcool crotílico, um but-3-en-2-ol ou um but- 3-en-1-ol e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um 1,3-butadieno, e/ou opcionalmente o composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 é um 2,3-dimetil-but-2-en-1-ol, um 2,3-dimetil-but- 3-en-2-ol ou um 2,3-dimetil-but-3-en-1-ol e/ou o composto correspondente à fórmula geral CnH2n-2 com 3<n<7 é um dimetilbutadieno e/ou opcionalmente as condições compreendem expressão in vitro do ácido nucleico.
[00128] A fermentação pode acontecer sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas, preferivelmente anaeróbicas onde o composto, por exemplo, butadieno, é reativo com oxigênio. Também é provido um método de produzir um polímero, resina ou artigo de fabricação que compreende reagir o composto, di-alqueno, opcionalmente butadieno, para criar um polímero ou resina e ainda formar opcionalmente o polímero ou resina em um artigo de fabricação, onde o composto, di-alqueno, opcionalmente butadieno, é produzido por um método ou uso da invenção ou produzido usando-se uma composição, por exemplo, polinucleotídeo, enzima, micróbio engenheirado, composição de produto de alqueno, da invenção. Além disso, o polímero, resina ou artigo de fabricação pode compreender ou é um polímero contendo butadieno, polibutadieno, adiponitrila, um copolímero, acrilonitrilabutadieno-estireno (ABS), borracha de acrilonitrila-butadieno (ABR), copolímeros de borracha de estireno-butadieno (SBR), látex de estireno-1,3-butadieno ou o artigo de fabricação é um pneu, um cano, uma peça automotiva, uma peça de barco, um recipiente alimentício ou um forro de tapete.
Métodos para Avaliar a Atividade Enzimática e Produtos de Recuperação
[00129] Em modalidades alternativas, qualquer método para avaliar a atividade enzimática, por exemplo, produção de um produto desejado, por exemplo, tais como butadieno e qualquer método para isolar os produtos enzimáticos ou produtos finais pode ser usado, por exemplo, como descrito no: WO2011071682A1 publicado em 16 de junho de 2011 intitulado Methods and Organisms for Converting Synthesis Gas or Other Gaseous Carbon Sources and Methanol to 1,3-Butanediol; WO2011031897A publicado em 17 de março de 2011 intitulado Microorganisms and Methods for the CoProduction of Isopropanol with Primary Alcohols, Diols and Acids; WO20101273 19A2 publicado em 4 de novembro de 2010 intitulado Organisms for the Production of 1,3-Butanediol; WO2013071226A1 publicado em 16 de maio de 2013 intitulado Eukaryotic Organismsand Methods for Increasing the Availability of Cytosolic Acetyl-CoA, and for Producing 1,3-Butanediol; WO2013028519A1 publicado em 28 de fevereiro de 2013 intitulado Microorganisms and Methods for Producing 2,4- Pentadienoate, Butadiene, Propylene, 1,3-Butanediol and Related Alcohols; WO2013036764A1 publicado em 14 de março de 2013 intitulado Eukaryotic Organisms and Methods for Producing 1,3-Butanediol; WO2013012975A1 publicado em 24 de janeiro de 2013 intitulado Methods for Increasing Product Yields; WO2012177619A2 publicado em 27 December 2012 intitulado Microorganisms for Producing 1,3-Butanediol and methods Related Thereto e, WO/2014/106122, publicado em de julho de 2014, intitulado Compositions and Methods for Bio-Butadience Production Screening.
[00130] Os intermediários de butadieno, tais como 1,4-butanodiol, 1,3- butanodiol, álcool crotílico, 3-buten-2-ol (metil vinil carbinol) e 3-buten-1-ol, podem ser feitos pela co-expressão de desidrogenases de álcool descritas neste com um trajeto de produto como conhecido na técnica, por exemplo, como descrito neste. Os trajetos de produto e enzimas adequados, métodos para avaliação e métodos para o isolamento são encontrados em: WO2011140171A2 publicado em 10 de novembro de 2011 intitulado Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene; WO2012018624A2 publicado em 9 de fevereiro de 2012 intitulado Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Aromatics, 2,4- Pentadienoate e 1,3-Butadiene; WO2011140171A2 publicado em 10 de novembro de 2011 intitulado Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene; WO2013040383A1 publicado em 21 de março de 2013 intitulado Microorganisms and Methods for Producing Alkenes; WO2012177710A1 publicado em 27 de dezembro de 2012 intitulado Microorganisms for Producing Butadiene and Methods Related thereto; WO2012106516A1 publicado em 9 de agosto de 2012 intitulado Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene; WO2013028519A1 publicado em 28 de fevereiro de 2013 intitulado Microorganisms and Methods for Producing 2,4-Pentadienoate, Butadiene, Propylene, 1,3-Butanediol and Related Alcohols e United States Série N° 61/799255 depositado em 15 de março de 2013.
[00131] O butadieno e outros dialquenos feitos usando-se as enzimas descritas neste podem ser separados e/ou isolados dos outros componentes na cultura usando-se uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. No caso de um dialqueno volátil, tal como butadieno, isto pode ser obtido e isolado a partir do gás residual de fermentação. Tais métodos de separação incluem, por exemplo, procedimentos de extração, bem como métodos que incluem extração de líquido-líquido contínua, pervaporação, filtração por membrana, separação de membrana, osmose reversa, eletrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de adsorção, ultrafiltração, compressão de gás, destilação extrativa usando-se um solvente, remoção de solvente via destilação e destilação final. Além disso, quando o dialqueno, por exemplo, butadieno, é nocivo na presença de oxigênio suficiente, fermentação anaeróbica pode ser usada. Todos os métodos acima são bem conhecidos na técnica.
[00132] Por exemplo, a publicação de pedido de patente internacional WO2014121357 intitulado “Method Of Separating and Purifying a Conjugated Diolefin Produced by Fermentation under Anaerobic Conditions” provê um método para separar e purificar uma fermentação sob condições anaeróbicas a partir de um gás residual fermentador que inclui a) obter um gás residual fermentador que compreende a diolefina conjugada, por exemplo, butadieno, uma impureza volátil, uma impureza de bio-subproduto e vapor de água; b) comprimir o gás residual fermentador em um sistema de compressão multi-estágios para produzir uma corrente comprimida; c) alimentar a corrente comprimida em uma primeira zona de destilação para a remoção de impureza de bio-subproduto e vapor de água, a primeira zona de destilação tendo estágio de refluxo superior, estágios de destilação médios e um estágio re-ebulidor inferior; d) contatar uma corrente de vapor superior produzida a partir da impureza de bio-subproduto e zona de destilação de remoção de água com um adsorvente para produzir uma corrente superior secada; e) alimentar a corrente superior secada em uma segunda zona de destilação para a remoção de impureza volátil pelo topo, com a segunda zona de destilação tendo estágio de refluxo superior, estágios de destilação médios e um estágio re-ebulidor inferior e f) coletar no fundo da zona de destilação para a remoção da impureza volátil a olefina conjugada líquida purificada resultante, por exemplo, butadieno.
[00133] O composto produzido pode ser recuperado separando-o dos outros componentes na cultura e purificando-o usando-se uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. No caso de um dialqueno volátil, tal como butadieno, pode ser obtido e isolado do gás residual de fermentação. Tais métodos de separação incluem, por exemplo, procedimentos de extração bem como métodos que incluem extração de líquido-líquido contínua, pervaporação, filtração de membrana, separação de membrana, osmose reversa, eletrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de adsorção, ultrafiltração, compressão de gás, destilação extrativa usando-se um solvente, remoção de solvente via destilação e destilação final. A recuperação pode compreender separar o composto dos outros componentes na cultura e purificação do composto e ainda a separação ou purificação pode compreender coletar o gás residual de fermentação contendo o composto e ainda a separação e a purificação podem compreender uma ou mais de compressão do gás residual, destilação extrativa usando-se um solvente, remoção de solvente por intermédio de destilação e destilação. Em uma modalidade o método para produzir os compostos, por exemplo, butadieno, compreende adicionalmente a) obter um gás residual fermentador que compreende a diolefina conjugada, por exemplo, butadieno, uma impureza volátil, uma impureza de bio-subproduto e vapor de água; b) comprimir o gás residual fermentador em um sistema de compressão multi- estágios para produzir uma corrente comprimida; c) alimentar a corrente comprimida em uma primeira zona de destilação para a remoção de impureza de bio-subproduto e vapor de água, a primeira zona de destilação tendo estágio de refluxo superior, estágios de destilação médios e um estágio re- ebulidor inferior; d) contatar uma corrente de vapor superior produzida a partir da impureza de bio-subproduto e zona de destilação de remoção de água com um adsorvente para produzir uma corrente superior secada; e) alimentar a corrente superior secada em uma segunda zona de destilação para a remoção de impureza volátil pelo topo, com a segunda zona de destilação tendo estágio de refluxo superior, estágios de destilação médios e um estágio re-ebulidor inferior e f) coletar no fundo da zona de destilação para a remoção da impureza volátil a olefina conjugada líquida purificada resultante, por exemplo, butadieno.
[00134] Em modalidades alternativas, são providos organismos microbianos, por exemplo, bactérias, para produzir os compostos orgânicos, por exemplo, um butadieno, incluindo produzir compostos desejados de estoques de alimentação renováveis, por exemplo, matérias-primas renováveis baratas, tais como melados, caldo de cana de açúcar, açúcares derivados de fontes de biomassa, incluindo resíduos agrícolas e de madeira, bem como matérias-primas de C1 (um composto de carbono), tais como syngas e dióxido de carbono. Em modalidades alternativas, os polipeptídeos providos neste que catalisam a conversão de um álcool crotílico (but-2-en-1-ol) a um butadieno ou um 1,3 butadieno e para avaliar quanto a polipeptídeos com esta atividade, qualquer método para avaliar quanto à atividade de enzima, incluindo avaliação de rendimento alto (HTS) de uma população grande de células para a produção de butadieno levando vantagem da reatividade alta de butadieno podem ser usados.
[00135] Em modalidades alternativas, qualquer método para detectar e/ou isolar um butadieno (por exemplo, 1,3-butadieno), incluindo um gás butadieno, produzido em uma célula como um produto de um processo biossintético, por exemplo, como um produto de um processo biossintético de organismo microbiano usando-se uma enzima como provido neste. Em modalidades alternativas, são providas composições e métodos para fabricar e detectar butadieno, incluindo gás butadieno.
[00136] Em modalidades alternativas, as composições e métodos da invenção compreendem o uso de qualquer método ou mecanismo para detectar um volátil orgânico, por exemplo, BD ou gás BD ou um volátil orgânico microbianamente produzido (por exemplo, gás BD), por exemplo, utilizando a amostragem invasiva de meio de fermentação ou espaço superior seguido pela submissão da amostra à cromatografia a gás ou cromatografia líquida frequentemente ligada com a espectroscopia de massa. Em modalidades alternativas, qualquer mecanismo “de ponta” pode ser usado, por exemplo, para a avaliação de alto rendimento, por exemplo, um Agilent 7697A HEADSPACE SAMPLERTM (Agilent Technologies, Santa Clara CA, USA) tendo uma capacidade de 111frascos (frascos de 10 ml, 20 ml ou 22 ml) e três suportes de 36 frascos que podem ser substituídos enquanto o amostrador superior está operando ou equivalente podem ser usados. Além das configurações e números de amostra limitados, o mecanismo quando acoplado com GC ou GC/MS deve requerer tipicamente de 10 a 30 para analisar cada amostra.
[00137] Em modalidades alternativas, os mecanismos são engenheirados ou configurados para HTS de célula, por exemplo, microbiano, por exemplo, bacteriano, produção de butadieno por detecção e/ou medição de BDE direta ou indiretamente, por exemplo, por reação química ou enzimática, por exemplo, em sua forma solúvel em um meio de cultura celular, em sua forma de gás em um espaço superior de cultura celular, em sua forma solúvel em um líquido que aprisionou o gás BDE produzido por uma cultura celular e/ou em sua forma gasosa no espaço superior daquele líquido.
[00138] Em modalidades alternativas, os métodos são automatizáveis e adequados para o uso com sistemas robóticos laboratoriais, eliminando ou reduzindo o envolvimento do operador, enquanto provê-se a avaliação de rendimento alto. Em algumas modalidades, o mecanismo explora a natureza volátil de BDE por sua detecção direta no espaço superior de cultura celular ou pelo aprisionamento do gás residual BD seguido por sua detecção no estado aprisionado.
[00139] Qualquer um dos mesmos métodos descritos, ou qualquer método conhecido na técnica para detectar a geração de um produto de uma enzima como provido neste, pode ser usado para determinar se um polipeptídeo tem atividade requerida para estar dentro do escopo da invenção reivindicada.
Trajetos metabólicos de Engenharia
[00140] Em modalidades alternativas, as enzimas ou ácidos nucleicos adicionais que as codificam (além do uso de uma enzima como provido neste) são usadas (por exemplo, inseridas na mesma célula) para produzir ou para aumentar a quantidade de um substrato de uma enzima como provido neste ou um substrato de um trajeto metabólico que leva à produção de um substrato de uma enzima como provido neste; por exemplo, como descrito na FIG. 1, que ilustra um trajeto exemplar que permite a produção de um álcool crotílico (um substrato de uma enzima como provido neste) e um butadieno (um produto de uma enzima como provido neste) a partir de acetil-CoA (um substrato de um trajeto metabólico que leva à produção de um substrato de uma enzima como provido neste). Como ilustrado na FIG. 1, a produção de álcool crotílico e butadieno pode ser realizada pelas seguintes enzimas: A) acetil-CoA carboxilase, B) uma sintase de acetoacetil-CoA, C) uma acetiltransferase de acetil-CoA:acetil-CoA, D) uma redutase de acetoacetil- CoA (redutor de cetona), J) uma desidratase de 3-hidroxibutiril-CoA (HCD), K) uma redutase de crotonil-CoA (formação de aldesídeo) (CCR-ALD), L) uma hidrolase de crotonil-CoA (CCH), transferase (CCT) ou sintetase (CCS), M) uma redutase de crotonato (CTR), N) uma redutase de crotonaldesídeo (CAR), U) uma redutase de crotonil-CoA (formação de álcool) (CCR-OH), e S) desidratação química ou VD) uma desidratase de álcool crotílico (CAD) como descritos neste.
[00141] Qualquer micróbio para produzir um substrato ou engenheirado para produzir um substrato para as enzimas descritas neste são hospedeiros adequados e podem ser usados para praticar esta invenção. Por exemplo, micróbios exemplares podem ser engenheirados para produzir álcool crotílico, por exemplo, como descrito nas Publicações de pedido de patente internacionais WO2011140171, WO2012106516 e WO2013090915A1, depois também descrevendo o uso de uma desidratase de linalool para a conversão enzimática de álcool crotílico a butadieno. A FIG. 1 também ilustra etapas enzimáticas exemplares para álcool crotílico a partir de acetil-CoA (como descrito, por exemplo, no WO2011140171 e WO2012106516) e sua conversão a butadieno por intermédio de uma vinilisomerase-desidratase (FIG. 1, etapa VD), que são as enzimas descritas neste.
[00142] A FIG. 6 provê trajetos alternativos ilustrativos para a produção de álcool crotílico e em modalidades alternativas, as enzimas providas neste podem: catalisar enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico (but-2-en-1-ol) a um 3-buten-2-ol; catalisa enzimaticamente a conversão de um 3-buten-2-ol a um butadieno ou um 1,3 butadieno e/ou catalisa enzimaticamente a conversão de um álcool crotílico (but-2-en-1-ol) a um butadieno ou um 1,3 butadieno e qualquer um, diversos ou todos os compostos intermediários ou precursores e/ou as enzimas que os formam podem ser adicionados a uma célula engenheirada. O seguinte provê detalhes de micróbios hospedeiros exemplares e enzimas úteis para produzir álcool crotílico para o uso como enzimas descritas neste
Enzimas de Síntese de Álcool Crotílico e Butadieno Exemplares
[00143] São providos genes e enzimas exemplares que podem ser usados para a conversão de acetil-CoA a álcool crotílico e butadieno como descrito nos trajetos da FIG. 1 e FIG. 6; por exemplo, em modalidades alternativas, as células engenheiradas como providas neste compreendem um ou diversos dos mesmos genes e/ou enzimas exemplares adicionalmente a um ácido nucleico ou enzima como provido neste.
FIG. 1 Etapa A. Carboxilase de Acetil-CoA
[00144] A carboxilase de Acetil-CoA (EC 6.4.1.2) catalisa a carboxilação dependente de ATP de acetil-CoA a malonil-CoA. Esta enzima é dependente de biotina e é a primeira reação de início de biossíntese de ácido graxo em diversos organismos. As enzimas exemplares são codificadas por accABCD de E. coli (Davis et al, J Biol Chem 275:28593-8 (2000)), ACC1 de Saccharomyces cerevisiae e homólogos (Sumper et al, Methods Enzym 71:347 (1981)).
FIG. 1: Etapa B: Sintetase de Acetoacetil-CoA
[00145] A conversão de substratos de malonil-CoA e acetil-CoA a acetoacetil-CoA pode ser catalisada por uma sintetase de CoA na família 2.3.1 de enzimas. Diversas enzimas catalisam as atividades de sintetase de CoA foram descritas na literatura e representam os candidatos adequados.
[00146] Os produtos de 3-Oxoacil-CoA tais como acetoacetil-CoA, 3- oxopentanoil-CoA, 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA podem ser sintetizados a partir de substratos de acil-CoA e malonil-CoA por sintases de 3-oxoacil- CoA. As enzimas neste classe catalisam uma reação essencialmente irreversível, estes são particularmente úteis para aplicações de engenharia metabólica para super-produzir metabólitos, combustíveis ou produtos químicos derivados de intermediários de 3-oxoacil-CoA, tais como acetoacetil-CoA. A sintase de Acetoacetil-CoA, por exemplo, foi heterologamente expressada em organismos que biossintetizam butanol (Lan et al, PNAS USA (2012)) e poli-(3-hidroxibutirato) (Matsumoto et al, Biosci Biotech Biochem, 75:364-366 (2011). Uma enzima de sintase de acetoacetil- CoA (EC 2.3.1.194) (FhsA) foi caracterizada na bactéria do solo Streptomyces sp. CL190 quando participa na biossíntese de mevalonato (Okamura et al, PNAS USA 107:11265-70 (2010)). Outros genes de sintase de acetoacetil-CoA podem ser identificados pela homologia de sequência à fhsA.
FIG. 1: Etapa C: Aciltransferase Acetil-CoA:acetil-CoA (tiolase de Acetoacetil-CoA)
[00147] A tiolase de Acetoacetil-CoA (também conhecida como acetiltransferase de acetil-CoA) converte duas moléculas de acetil-CoA em uma molécula cada um de acetoacetil-CoA e CoA. As enzimas de tiolase de acetoacetil-CoA exemplares incluem os produtos de gene de atoB de E. coli (Martin et al., Nat.Biotechnol 21:796-802 (2003)), thiA e thlB de C. acetobutylicum (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Winzer et al., J. Mol. Microbiol Biotechnol 2:531-541 (2000) e ERGJO de S. cerevisiae Hiser et al., J. Biol. Chem. 269:31383-31389 (1994)). A tiolase de acetoacetil-CoA de Zoogloea ramigera é irreversível na direção biossintética e uma estrutura cristalina está disponível (Merilainen et al, Biochem 48: 1101125 (2009)). Estes genes/proteínas são identificados na Tabela abaixo.
FIG. 1: Etapa D: Redutase de Acetoacetil-CoA
[00148] Uma atividade de enzima adequada é 1.1.1.a Oxidorredutase (oxo a álcool). Ver aqui. Além disso, a redutase de Acetoacetil-CoA (EC 1.1.1.36) catalisa a redução de acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA. Esta enzima participa do trajeto de fermentação de acetil-CoA a butirato em diversas espécies de Clostridia e foi estudada em detalhes (Jones et al., Microbiol Rev. 50:484-524 (1986)). A redutase de Acetoacetil-CoA também participa da biossíntese de poli-hidroxibutirato em muitos organismos e foi usado em aplicações de engenharia metabólica para super-produzir PHB e 3- hidroxi-isobutirato (Liu et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 76:811-818 (2007); Qui et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 69:537-542 (2006)). A enzima de Clostridium acetobutylicum, codificado por hbd, foi clonado e funcionalmente expressado em E. coli (Youngleson et al., J Bacteriol. 171:6800-6807 (1989)). Os genes candidatos adicionais incluem phbB de Zoogloea ramigera (Ploux et al., Eur.J Biochem. 174:177-182 (1988)) e phaB de Rhodobacter sphaeroides (Alber et al., Mol.Microbiol 61:297-309 (2006)). O gene de Z. ramigera é dependente de NADPH e o gene foi expressado em E. coli (Peoples et al., Mol. Microbiol 3:349-357 (1989)). Os estudos de especificidade de substrato no gene levaram à conclusão que pode-se aceitar - oxopropionil-CoA como um substrato além de acetoacetil-CoA (Ploux et al., Eur. J. Biochem. 174:177-182 (1988)). Os genes adicionais incluem phaB em Paracoccus denitrificans, Hbdl (domínio de terminal C) e Hbd2 (domínio de terminal N) em Clostridium kluyveri (Hillmer and Gottschalk, Biochim. Biophys. Acta 3334:12-23 (1974)) e HSD17B10 em Bos taurus (Wakil et al., J Biol. Chem. 207:631-638 (1954)). A enzima de Paracoccus denitrificans foi funcionalmente expressado e caracterizado em E. coli (Yabutani et al., FEMS Microbiol Lett. 133:85-90 (1995)). Diversas enzimas similares foram observadas em outras espécies de Clostridia e em Metallosphaera sedula (Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007)). A enzima de Candida tropicalis é um componente da enzima multifuncional de beta-oxidação de ácido graxo peroxissomal tipo 2 (MFE-2). O domínio de desidrogenase B desta proteína é cataliticamente ativa em acetoacetil-CoA. O domínio foi funcionalmente expressado em E. coli, uma estrutura cristalina está disponível e o mecanismo catalítico é bem entendido (Ylianttila et al., Biochem Biophys Res Commun 324:25-30 (2004); Ylianttila et al., J Mol Blot 358:1286-1295 (2006)).
FIG. 1: Etapa J: Desidratase de 3-Hidroxibutiril-CoA
[00149] Uma hidro-liase EC 4.2.1. provê atividade de enzima adequada e são descritos abaixo e aqui. A hidratase de enoil-CoA de Pseudomonas putida, codificada por ech, catalisa a conversão de 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA (Roberts et al., Arch. Microbiol 117:99-108 (1978)). Esta transformação também é catalisada pelo produto de gene de crt de Clostridium acetobutylicum, o produto de gene crtl de C. kluyveri e outros organismos de clostridial Atsumi et al., Metab Eng 10:305-311 (2008); Boynton et al., J Bacteriol. 178:3015-3024 (1996); Hillmer et al., FEBSLett. 21:351-354 (1972)). Os candidatos de hidratase de enoil-CoA adicionais são phaA e phaB, de P. Putida e paaA e paaB de P. fluorescens (Olivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 95:6419-6424 (1998)). O produto genético de pimF em Rhodopseudomonas palustris é predito codificar uma hidratase de enoil-CoA que participa na degradação de pimeloil-CoA (Harrison et al., Microbiology 151:727-736 (2005)). Em último lugar, diversos genes de Escherichia coli foram mostrados demonstrar funcionalidade de hidratase de enoil-CoA incluindo maoC (Park et al., J. Bacteriol. 185:5391-5397 (2003)), paaF (Ismail et al., Eur.J Biochem. 270:3047-3054 (2003); Park et al., Appl .Biochem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004); Park et al., Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)) e paaG (Ismail et al., Eur. J. Biochem. 270:3047-3054 (2003); Park and Lee, Appl .Biochem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004); Park and Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)).
FIG. 1: Etapa K: Redutase de Crotonil-CoA (formação de aldesídeo)
[00150] Uma EC 1.2.1.b Oxidorredutase (acil-CoA a aldesídeo) provê atividade de enzima adequada. As redutases de Acil-CoA na família 1.2.1 reduzem uma acil-CoA a seu aldeído correspondente. Diversas enzimas de redutase de acil-CoA foram descritas na literatura aberta e representam candidatos adequados para esta etapa. As redutases de Acil-CoA ou acilação de aldesídeo desidrogenases reduzem uma acil-CoA a seu aldeído correspondente. As enzimas exemplares incluem redutase de acil-CoA graxa, redutase de succinil-CoA (EC 1.2.1.76), redutase de acetil-CoA redutase, redutase de butiril-CoA, redutase de propionil-CoA (EC 1.2.1.3) e outros mostrados na tabela abaixo.
[00151] As enzimas de redutases de acil-CoA graxas exemplares são codificadas por acrl de Acinetobacter calcoaceticus (Reiser, Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (1997)) e Acinetobacter sp. M-1 (Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol. 68:1192-1195 (2002)). As enzimas com a atividade de redutase de succinil-CoA são codificadas por sucD de Clostridium kluyveri (Sohling, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996)) e sucD de P. gingivalis (Takahashi, J. Bacteriol 182:4704-4710 (2000)). As enzimas de redutase de succinil-CoA adicionais participam do ciclo de 3-hidroxipropionato/4- hidroxibutirato de archaea termofílico incluindo Metallosphaera sedula (Berg et al., Science 318:1782-1786 (2007)) e Thermoproteus neutrophilus (Ramos- Vera et al., J Bacteriol., 191:4286-4297 (2009)). A enzima M. sedula, codificado por Msed 0709, é estritamente dependente de NADPH e também tem atividade de redutase de malonil-CoA. A enzima T. neutrophilus é ativa tanto com NADPH quanto NADH. A enzima que acila a desidrogenase de acetaldesídeo em Pseudomonas sp, codificado por bphG, ainda é um outro como foi demonstrado oxidar e acilar acetaldesídeo, propionaldesídeo, butiraldesídeo, isobutiraldesídeo e formaldesídeo (Powlowski, J. Bacteriol. 175:377-385 (1993)). Além de reduzir acetil-CoA a etanol, a enzima codificada por adhE em Leuconostoc mesenteroides foi mostrado oxidar o composto de cadeia ramificada isobutiraldesídeo a isobutiril-CoA (Kazahaya, J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972) e Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)). A desidrogenase de butiraldesídeo catalisa na reação similar, a conversão de butiril-CoA a butiraldesídeo, em organismos solventogênicos, tais como Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Kosaka et al., Biosci Biotechnol Biochem., 71:58-68 (2007)). As enzimas de redutase de propionil-CoA exemplar inclui pduP de Salmonella typhimurium LT2 (Leal, Arch. Microbiol. 180:353-361 (2003)) e eutE de E. coli (Skraly, Patente WO N° 2004/024876). A redutase de propionil-CoA de Salmonella typhimurium LT2, que converte naturalmente propionil-CoA a propionaldesídeo, também catalisa a redução de 5-hidroxivaleril-CoA a 5- hidroxipentanal (WO 2010/068953A2).
[00152] Uma enzima adicional que converte um acil-CoA a seu aldeído correspondente é redutase de malonil-CoA que transforma malonil-CoA a semialdesídeo malônico. A redutase de Malonil-CoA é uma enzima chave na fixação de carbono autotrófica por intermédio do ciclo de 3-hidroxipropionato em bactérias archaeal termoacidofílicas (Berg, Science 318:1782-1786 (2007) e Thauer, Science 318:1732-1733 (2007)). A enzima utiliza NADPH como um cofator e foi caracterizado em Metallosphaera e Sulfolobus sp. (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006) e Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)). A enzima é codificada por Msed 0709 em Metallosphaera sedula (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006) e Berg, Science 318:17821786 (2007)). Um gene que codifica uma redutase de malonil-CoA de Sulfolobus tokodaii foi clonada e heterologamente expressado em E. coli (Alber et al., J. Bacteriol 188:8551-8559 (2006). Esta enzima também foi mostrada catalisar a conversão de metilmalonil-CoA a seu aldeído correspondente (WO2007141208 (2007)). Embora a funcionalidade de desidrogenase de aldesídeo destas enzimas é similar à desidrogenase bifuncional de Chloroflexus aurantiacus, existe pouca similaridade de sequência. Ambos os candidatos a enzima de redutase de malonil-CoA têm similaridade de sequência alta a desidrogenase de aspartato-semialdesídeo desidrogenase, uma enzima catalisa a redução e desfosforilação concorrente de aspartil-4-fosfato a aspartato semialdesídeo. Os candidatos de gene adicionais podem ser observados por homologia de sequência a proteínas em outros organismos incluindo Sulfolobus solfataricus e Sulfolobus acidocaldarius e foram listados abaixo. Ainda, um outro candidato para desidrogenase de aldesídeo de acilação de é o gene ald de Clostridium beijerinckii (Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999). Esta enzima foi relatada para reduzir acetil-CoA e butiril-CoA a seus aldesídeos correspondentes. Este gene é muito similar a eutE que codifica desidrogenase de acetaldesídeo de Salmonella typhimurium e E. coli (Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999).
[00153] A redutase de 4-hidroxibutiril-CoA catalisa a redução de 4- hidroxibutiril-CoA a seu aldeído correspondente. Diversas desidrogenases de acil-CoA são capazes de catalisar esta atividade. As desidrogenases de succinato semialdesídeo (SucD) de Clostridium kluyveri e P. gingivalis foram mostradas na ref. (WO/2008/115840) para converter 4-hidroxibutiril-CoA a 4-hidroxibutanal como parte de um trajeto para produzir 1,4-butanodiol. Muitas desidrogenases de butiraldesídeo também são ativos em 4- hidroxibutiraldesídeo, incluindo bld de Clostridium saccharoperbutylacetonicum e bphG de Pseudomonas sp (Powlowski et al., 1 Bacterial. 175:377-385 (1993)). Ainda, um outro candidato é o gene ald de Clostridium beijerinckii (Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999). Este gene é muito similar a eutE que codifica a desidrogenase de acetaldesídeo de Salmonella typhimurium e E. coli (Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999). Estas proteínas e adicionais com atividade de redutase de 4-hidroxibutiril-CoA são identificados abaixo.
FIG. 1: Etapa L: Hidrolase, Transferase ou Sintetase de Crotonil-CoA
[00154] Uma hidrolase de CoA EC 3.1.2.a, transferase de CoA EC 2.8.3.a CoA e/ou uma sintetase de CoA EC 6.2.1.a provê atividade de enzima adequada e são descritos neste e nas seguintes seções.
[00155] Hidrolase de CoA EC 3.1.2.a CoA. As enzimas na família 3.1.2 hidrolizam as moléculas de acil-CoA a seus ácidos correspondentes. Diversas tais enzimas foram descritas na literatura e representam candidatos adequados para esta estas etapas.
[00156] Por exemplo, a enzima codificada por acotl2 de cérebro de Rattus norvegicus (Robinson et al., Biochem. Biophys. Res .Commun. 71:959965 (1976)) pode reagir com butiril-CoA, hexanoil-CoA e malonil-CoA. A tioesterase de ácido dicarboxílico humano, codificado por acot8, apresenta atividade em glutaril-CoA, adipil-CoA, suberil-CoA, sebacil-CoA e dodecanedioil-CoA (Westin et al., J. Biol .Chem. 280:38125-38132 (2005)). O homólogo de E. coli mais próximo a esta enzima, tesB, também pode hidrolizar uma faixa de tiolésteres de CoA (Naggert et al., J. Blot. Chem. 266:11044-11050 (1991)). Uma enzima similar também foi caracterizada no fígado de rato (Deana R., Biochem Mt 26:767-773 (1992)). As enzimas adicionais com atividade de hidrolase em E. coli incluem ybgC, paal e ybdB (Kuznetsova, et al., FEMS Microbiol Rev, 2005, 29(2):263-279; Song et al., J Biol Chem, 2006, 281(16):11028-38). Embora sua sequência não seja relatada, a enzima da mitocôndria da folha de ervilha tem uma especificidade de substrato amplo, com atividade demonstrada em acetil-CoA, propionil- CoA, butiril-CoA, palmitoil-CoA, oleoil-CoA, succinil-CoA e crotonil-CoA (Zeiher et al., Plant. Physiol. 94:20-27 (1990)). A hidrolase de acetil-CoA, ACH1, de S. cerevisiae representa uma outra hidrolase de candidato (Buu et al., J. Biol. Chem. 278:17203-17209 (2003)) .
[00157] As enzimas de hidrolase adicionais incluem hidrolase de 3- hidroxi-isobutiril-CoA hidrolase que foram descritas para catalisar eficientemente a conversão de 3-hidroxi-isobutiril-CoA a 3-hidroxi- isobutirato durante a degradação de valina (Shimomura et al., J Blot Chem. 269:14248-14253 (1994)). Os genes que codificam esta enzima incluem hibch de Rattus norvegicus (Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000)) e Homo sapiens (Shimomura et al., supra). Os candidatos de gene similares também podem ser identificados por homologia de sequência, incluindo hibch de Saccharomyces cerevisiae e BC 2292 de Bacillus cereus.
[00158] EC 2.8.3.a Transferase de CoA. As enzimas na família 2.8.3 catalisam a transferência reversível de uma porção de CoA de uma molécula para outra. Diversas enzimas de transferase de CoA foram descritas na literatura aberta e representam candidatos adequados para estas etapas. Estas são descritas abaixo.
[00159] Muitas transferases têm especificidade ampla e, desta maneira, podem utilizar receptores de CoA tão diversos quando acetato, succinato, propionato, butirato, 2-metilacetoacetato, 3-ceto-hexanoato, 3-cetopentanoato, valerato, crotonato, 3-mercaptopropionato, propionato, vinilacetato, butirato, entre outros. Por exemplo, uma enzima de Roseburia sp. A2-183 foi mostrado ter transferase de butiril-CoA:acetato:CoA transferase e atividade de transferase de propionil-CoA:acetato:CoA (Charrier et al., Microbiology 152, 179-185 (2006)). Os homólogos próximos podem ser encontrados em, por exemplo, Roseburia intestinalis L1-82, Roseburia inulinivorans DSM 16841, Eubacterium rectale ATCC 33656. Uma outra enzima com atividade de transferase de propionil-CoA pode ser observada em Clostridium propionicum (Selmer et al., Eur J Biochem 269, 372-380 (2002)). Esta enzima também pode usar acetato, (R)-lactato, (S)-lactato, acrilato e butirato como o receptor de CoA (Selmer et al., Eur J Biochem 269, 372-380 (2002); Schweiger e Buckel, FEBS Letters, 171(1) 79-84 (1984)). Os homólogos próximos podem ser observados em, por exemplo, Clostridium novyi NT, Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 e Clostridium botulinum C str. Eklund. YgfH
[00160] codifica uma transferase de propionil CoA:succinato CoA em E. coli (Haller et al., Biochemistry, 39(16) 4622-4629). Os homólogos próximos podem ser observados em, por exemplo, Citrobacter youngae ATCC 29220, Salmonella enterica subsp. arizonae serovar e Yersinia intermedia ATCC 29909.
[00161] Uma enzima candidata adicional é a enzima de duas unidades codificada por pcal e pcal em Pseudomonas, que foi mostrado ter atividade de transferase de 3-oxoadipil-CoA:succinato (Kaschabek et al., supra). As enzimas similares com base em homologia existe em Acinetobacter sp. ADP1 (Kowalchuk et al., Gene 146:23-30 (1994)) e Streptomyces coelicolor. As transferases de succinil-CoA:3:oxoácido-CoA exemplares adicionais estão presentes em Helicobacter pylori (Corthesy-Theulaz et al., J. Biol .Chem. 272:25659-25667 (1997)) e Bacillus subtilis (Stols et al., Proteína. Expr.Purif. 53:396-403 (2007)). Estas proteínas são identificadas abaixo.
[00162] A transferase de CoA que pode utilizar acetato como o receptor de CoA é transferase de acetoacetil-CoA, codificado por genes de E. coli atoA (subunidade alfa) e atoD (subunidade beta) (Vanderwinkel et al.,Biochem. Biophys. Res Commun. 33:902-908 (1968); Korolev et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58:2116-2121 (2002)). Esta enzima também foi mostrada transferir a porção CoA para acetato a partir de uma variedade de substratos de acil-CoA ramificados e lineares, incluindo isobutirato (Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992)), valerato (Vanderwinkel et al., supra) e butanoato (Vanderwinkel et al., supra). As enzimas similares existem em Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Duncan et al., Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002)), Clostridium acetobutylicum (Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990)), e Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Kosaka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 71:58-68 (2007)). Estas proteínas são identificadas abaixo.
[00163] Os candidatos de transferase exemplares adicionais são catalisados pelos produtos genéticos de cat1, cat2, e cat3 de Clostridium kluyveri que3 foram mostrados apresentar atividade de transferência de succinil-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA e butiril-CoA, respectivamente (Seedorf et al., supra; Sohling et al., Eur. J. Biochem. 212:121-127 (1993); Sohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996)). As atividades de transferase de CoA similares também estão presentes em Trichomonas vaginalis (van Grinsven et al., J. Biol. Chem. 283:1411-1418 (2008)) e Trypanosoma brucei (Riviere et al., J. Biol .Chem. 279:45337-45346 (2004)). Estas proteínas são identificadas abaixo.
[00164] A enzima glutaconato-CoA-transferase (EC 2.8.3.12) de bactéria anaeróbica Acidaminococcus fermentans reage com diácido glutaconil-CoA e 3-butenoil-CoA (Mack et al., FEBSLett. 405:209-212 (1997)). Os genes que codificam esta enzima são gctA e gctB. Esta enzima tem atividade reduzida mas detectável com outros derivados de CoA incluindo glutaril-CoA, 2-hidroxiglutaril-CoA, adipil-CoA e acrilil-CoA (Buckel et al., Eur. J. Biochem. 118:315-321 (1981)). A enzima foi clonada e expressada em E. coli (Mack et al., Eur. J. Biochem. 226:41-51 (1994)). Estas proteínas são identificadas abaixo.
[00165] EC 6.2.1.a Sintase de CoA (ligase de ácido-tiol ligase). A conversão de substratos de acil-CoA a seus produtos ácidos pode ser catalisada por uma ligase de ácido-tiol de CoA ou sintetase de CoA na família 6.2.1 de enzimas, diversas das quais são reversíveis. Diversas enzimas catalisam ligase de ácido-tiol de CoA ou atividades de sintetase de CoA foram descritas na literatura e representam candidatos adequados para estas etapas.
[00166] Por exemplo, a sintetase de acetil-CoA formador de ADP (ACD, EC 6.2.1.13) é uma enzima que liga a conversão de ésteres de acil- CoA a seus ácidos correspondentes com a síntese concomitante de ATP. ACD I de Archaeoglobus fulgidus, codificado por AF1211, foi mostrado operar em uma variedade de substratos de cadeia linear e ramificada incluindo isobutirato, isopentanoato e fumarato (Musfeldt et al., J Bacteriol. 184:636- 644 (2002)). Um segundo ACD reversível em Archaeoglobus fulgidus, codificado por AF1983, também foi mostrado ter uma faixa de substrato ampla com atividade alta em compostos cíclicos fenilacetato e indoleacetato (Musfeldt and Schonheit, J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). A enzima de Haloarcula marismortui (anotado como uma sintetase de succinil-CoA) aceita propionato, butirato e ácidos de cadeia ramificada (isovalerato e isobutirato) como substratos e foi mostrado operar nas direções avançadas e reversas (Brasen et al., Arch Microbiol 182:277-287 (2004)). O ACD codificado por PAE3250 de crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum hipertermofílico mostrou a faixa de substrato mais ampla de todos os ACDs caracterizados, reagindo com acetil-CoA, isobutiril-CoA (substrato preferido) e fenilacetil-CoA (Brasen et al, supra). Evolução ou engenharia direcionada podem ser usadas para modificar esta enzima para operar na temperatura fisiológica do organismo hospedeiro. As enzimas de A. fulgidus, H. marismortui e P. aerophilum foram clonadas, funcionalmente expressadas e caracterizadas em E. coli (Brasen and Schonheit, supra; Musfeldt and Schonheit, J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). Um candidato adicional é sintetase de succinil-CoA, codificado por sucCD de E. coli e genes de LSC1 e LSC2 de Saccharomyces cerevisiae. Estas enzimas catalisam a formação de succinil-CoA a partir de succinato com o consumo concomitante de um ATP em uma reação que é reversível in vivo (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)). A ligase de acil CoA ligase de Pseudomonas putida foi demonstrada trabalhar para trabalhar em diversos substratos alifáticos incluindo ácidos acéticos, propiônico, butíricos, valéricos, hexanoicos, heptanoicos e octanoicos e em compostos aromáticos, tais como ácidos fenilacéticos e fenoxiacéticos (Fernandez-Valverde et al., Appl.Environ.Microbiol. 59:1149-1154 (1993)). Uma enzima relacionada, sintetase de malonil CoA (6.3.4.9) de Rhizobium leguminosarum pode converter diversos diácidos, isto é, etil-, propil-, alil-, isopropil-, dimetil-, ciclopropil-, ciclopropilmetileno-, ciclobutil- e benzil-malonato em seus monotioésteres correspondentes (Pohl et al., 1Am. Chem.Soc. 123:5822-5823 (2001)).
[00167] Uma outra enzima candidata para esta etapa é 6-carboxi- hexanoato-CoA ligase, também conhecida como pimeloil-CoA ligase (EC 6.2.1.14), que ativa naturalmente pimelato a pimeloil-CoA durante a biossíntese de biotina em bactérias gram-positivas. A enzima de Pseudomonas mendocina, clonada em E. coli, foi mostrada aceitar os substratos alternados hexanedioato e nonanodioato (Binieda et al., Biochem. J 340 (Pt 3):793-801 (1999)). Outros candidatos são encontrados em Bacillus subtilis (Bower et al., J Bacteriol. 178:4122-4130 (1996)) e Lysinibacillus sphaericus (anteriormente Bacillus sphaericus) (Ploux et al., Biochem.J 287 (Pt 3):685-690 (1992)).
[00168] As ligases de CoA adicionais incluem a ligase de dicarboxilato-CoA de rato para a qual a sequência ainda é não caracterizada (Vamecq et al., Biochem. J 230:683-693 (1985)), cada uma das duas ligases de fenilacetato-CoA ligases caracterizadas de P. chrysogenum (Lamas- Maceiras et al., Biochem. J 395:147-155 (2006); Wang et al., 360:453-458 (2007)), a ligase de fenilacetato-CoA de Pseudomonas putida (Martinez- Blanco et al., J Blot Chem 265:7084-7090 (1990)) e a ligase de 6-carboxi- hexanoato-CoA de Bacillus subtilis (Bower et al. J Bacteriol 178(14):4122- 4130 (1996)). As sintetases de Acetoacetil-CoA de Mus musculus (Hasegawa et al., Biochim Biophys Acta 1779:414-419 (2008)) e Homo sapiens (Ohgami et al., Biochem. Pharmacol. 65:989-994 (2003)) catalisa naturalmente a conversão dependente de ATP de acetoacetato em acetoacetil-CoA.
[00169] Como enzimas em outras classes, certas enzimas na classe EC 6.2.1 foi determinada ter a especificidade de substrato ampla. A ligase de acil CoA de Pseudomonas putida foi demonstrada trabalhar em diversos substratos alifáticos incluindo ácidos acético, propiônico, butírico, valérico, hexanoico, heptanoico e octanoico e em compostos aromáticos, tais como ácidos fenilacético e fenoxiacético (Fernandez-Valverde et al., Applied and Environmental Microbiology 59:1149-1154 (1993)). Uma enzima relacionada, sintetase de malonil CoA (6.3.4.9) de Rhizobium trifolii pode converter diversos diácidos, isto é, etil-, propil-, alil-, isopropil-, dimetil-, ciclopropil-, ciclopropilmetileno-, ciclobutil- e benzil-malonato em seus monotioésteres correspondentes (Pohl et al., J. Am. Chem. Soc. 123:58225823 (2001)).
FIG. 1: Etapa M: Redutase de Crotonato:
[00170] Uma atividade de enzima adequada é uma 1.2.1.e Oxidorredutase (ácido a aldesídeo), incluindo o seguinte.
[00171] A conversão de um ácido a um aldesídeo é termodinamicamente desfavorável e requer tipicamente cofatores ricos em energia e etapas enzimáticas múltiplas. A conversão direta do ácido a aldesídeo por uma enzima simples é catalisada por uma enzima de redutase de ácido na família 1.2.1. As enzimas de redutase de ácido exemplar incluem redutase de ácido carboxílico, alfa-aminoadipato redutase e redutase de ácido retinoico. A redutase de ácido carboxílico (CAR), encontrado em Nocardia iowensis, catalisa o magnésio, ATP e redução dependente de NADPH de ácidos carboxílicos a seus aldesídeos correspondentes (Venkitasubramanian et al., J. Biol. Chem. 282:478-485 (2007)). O substrato natural deste enzima é benzoato e a enzima apresenta aceitação alta de substratos aromáticos incluindo p-toluato (Venkitasubramanian et al., Biocatalysis in Pharmaceutical and Biotechnology Industries. CRC press (2006)). A enzima de Nocardia iowensis, codificada por car, foi clonada e funcionalmente expressada em E. coli (Venkitasubramanian et al., J. Biol. Chem. 282:478-485 (2007)). CAR requer ativação pós-tradução por uma transferase de fosfopanteteina (PPTase) que converte a apo-enzima inativa para a holo- enzima ativa (Hansen et al., Appl. Environ. Microbiol 75:2765-2774 (2009)). A expressão do gene npt, que codifica uma PPTase específica, atividade melhorada do produto da enzima. Uma enzima adicional candidata encontrada em Streptomyces griseus é codificada pelos genes griC e griD. Acredita-se que esta enzima converta ácido 3-amino-4-hidroxibenzoico a 3-amino-4- hidroxibenzaldesídeo como anulação de griC ou griD levaram ao acúmulo de ácido 3-acetilamino-4-hidroxibenzoico extracelular, um produto de desvio de metabolismo de ácido 3-amino-4-hidroxibenzoico (Suzuki, et al., J. Antiblot. 60(6):380-387 (2007)). Co-expressão de griC e griD com SGR 665, um enzima similar em sequência a Nocardia iowensis npt, pode ser benéfica.
[00172] Os genes car e npt adicionais podem ser identificados com base em homologia de sequência.
[00173] Uma enzima com características similares, a redutase de alfa- aminoadipato redutase (AAR, EC 1.2.1.31), participa dos trajetos de biossíntese de lisina em algumas espécies fúngicas. Esta enzima reduz naturalmente alfa-aminoadipato para alfa-aminoadipato semi aldesídeo. O grupo carboxila é primeiro ativado através da formação dependente de ATP de um adenilato que é então reduzido por NAD(P)H para produzir o aldesídeo e AMP. Como CAR, esta enzima utiliza magnésio e requer ativação por uma PPTase. Os candidatos de enzima para AAR e sua PPTase correspondente são observados em Saccharomyces cerevisiae (Morris et al., Gene 98:141-145 (1991)), Candida albicans (Guo et al., Mol.Genet.Genomics 269:271-279 (2003)) e Schizosaccharomyces pombe (Ford et al., Curr.Genet. 28:131-137 (1995)). O AAR de S. pombe apresentou atividade significante quando expressado em E. coli (Guo et al., Yeast 21:1279-1288 (2004)). O AAR de Penicillium chrysogenum aceita S-carboximetil-L-cisteina como um substrato alternativo, mas não reage com adipato, L-glutamato ou diaminopimelato (Hijarrubia et al., J Biol.Chem. 278:8250-8256 (2003)). O gene que codifica a PPTase de P. chrysogenum não foi identificado até hoje e nenhum acerto de confiança alta foi identificado pela pesquisa de homologia de comparação de sequência.
[00174] FIG. 1: Etapa N: Redutase de Crotonaldesídeo.
[00175] Uma atividade de enzima adequada é provida por uma EC 1.1.1.a Oxidorredutase (oxo a álcool). EC 1.1.1.a Oxidorredutase (oxo a álcool) inclui o seguinte:
[00176] A redução de glutarato semialdesídeo a 5-hidroxivalerato por redutase de glutarato semialdesídeo implica a redução de um aldesídeo a este álcool correspondente. As enzimas com atividade de redutase de glutarato semialdesídeo incluem o produto genético de ATEG 00539 de Aspergillus terreus e desidrogenase de 4-hidroxibutirato de Arabidopsis thaliana, codificado por 4hbd (WO 2010/068953A2). A enzima de A. thaliana foi clonada e caracterizada em levedura (Breitkreuz et al., J. Biol. Chem.278:41552-41556 (2003)).
[00177] Os genes adicionais que codificam enzimas que catalisam a redução de um aldesídeo a álcool (isto é, desidrogenase de álcool ou equivalentemente redutase de aldesídeo) incluem alrA que codifica a desidrogenase de álcool de cadeia média para C2-C14 (Tani et al., Appl. Environ. Microbiol. 66:5231-5235 (2000)), yqhD e fucO de E. coli (Sulzenbacher et al., 342:489-502 (2004)) e bdh I e bdh II de C. acetobutylicum que converte butiraldesídeo em butanol (Walter et al., 174:7149-7158 (1992)). YqhD catalisa a redução de uma faixa ampla de aldesídeos usando-se NADPH como o cofator, com uma preferência para comprimentos de cadeia maiores do que C(3) (Sulzenbacher et al., 342:489502 (2004); Perez et al., J. Biol .Chem. 283:7346-7353 (2008)). O produto genético de adhA de Zymomonas mobilisE foi demonstrado ter atividade em diversos aldesídeos incluindo formaldesídeo, acetaldesídeo, propionaldesídeo, butiraldesídeo e acroleina (Kinoshita et al., Appl Microbiol Biotechnol 22:249-254 (1985)). Os candidatos de redutase de aldeídeo adicionais são codificados por bdh em C. saccharoperbutylacetonicum e Cbei_1722, Cbei_2181 e Cbei_2421 em C. Beijerinckii. Os candidatos de gene de redutase de aldesídeo adicionais em Saccharomyces cerevisiae incluem as redutases de aldesídeo GRE3, ALD2-6 e HFD1, redutases de glioxilato GOR1 e YPL113C e desidrogenase de glicerol GCY1 (WO 2011/022651A1; Atsumi et al., Nature 451:86-89 (2008)). Os candidatos de enzima descritos previamente para catalisar a redução de metilglioxal para acetol ou lactaldesídeo também são candidatos de enzima de redutase de lactaldesídeo adequados.
[00178] As enzimas que apresentam atividade de desidrogenase de 4- hidroxibutirato (EC 1.1.1.61) também estão nesta categoria. Tais enzimas foram caracterizadas em Ralstonia eutropha (Bravo et al., J Forens Sci, 49:379-387 (2004)) e Clostridium kluyveri (Wolff et al., Proteína Expr.Purif. 6:206-212 (1995)). Ainda, um outro gene é a desidrogenase de álcool adhl de Geobacillus thermoglucosidasius (Jeon et al., J Biotechnol 135:127-133 (2008)).
[00179] Existem diversas desidrogenases de álcool exemplares que convertem uma cetona a um grupo funcional hidroxila. Duas tais enzimas de E. coli são codificadas por desidrogenase de malato (mdh) e desidrogenase de lactato (ldhA). Além disso, a desidrogenase de lactato de Ralstonia eutropha foi mostrada demonstrar atividades altas em 2-cetoácidos de vários comprimentos de cadeia incluindo lactato, 2-oxobutirato, 2-oxopentanoato e 2-oxoglutarato (Steinbuchel et al., Eur. J. Biochem. 130:329-334 (1983)). A conversão de alfa-cetoadipato em alfa-hidroxiadipato pode ser catalisada por redutase de 2-cetoadipato, uma enzima relatada ser observada em placenta de rato e humana (Suda et al., Arch. Biochem. Biophys.176:610-620 (1976); Suda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:586-591 (1977)). Uma oxidorredutase adicional é a desidrogenase de 3-hidroxibutirato mitocondrial (bdh) do coração humano que foi clonada e caracterizada (Marks et al., J. Biol. Chem. 267:15459-15463 (1992)). As enzimas de desidrogenase de álcool de C. beijerinckii (Ismaiel et al., J. Bacteriol. 175:5097-5105 (1993)) e T. brockii (Lamed et al., Biochemi 195:183-190 (1981); Peretz et al., Biochemistry. 28:6549-6555 (1989)) converte acetona a isopropanol. A redutase de metil etil cetona catalisa a redução de MEK a 2-butanol. As enzimas de redutase de MEK exemplares podem ser observadas em Rhodococcus Tuber (Kosjek et al., Biotechnol Bioeng. 86:55-62 (2004)) e Pyrococcus furiosus (van der Oost et al., Eur. J. Biochem. 268:3062-3068 (2001)).
[00180] Diversos organismos codificam genes que catalisam a redução de 3-oxobutanol a 1,3-butanodiol, incluindo aqueles que pertencem ao gênero Bacillus, Brevibacterium, Candida e Klebsiella entre outros, como descrito por Matsuyama et al. J Mol Cat B Enz, 11:513-521 (2001). Uma destas enzimas, SADH de Candida parapsilosis, foi clonada e caracterizada em E. coli. Uma redutase de fenilacetaldesídeo de Rhodococcus mutada (Sar268) e uma desidrogenase de álcool de Leifonia também foi mostrada caracterizar esta transformação em rendimentos altos (Itoh et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 75:1249-1256 (2007)).
FIG. 1: Etapa U: redutase de Crotonil-CoA (formação de álcool):
[00181] A conversão direta de substrato de crotonil-CoA a este álcool correspondente é catalisado por enzimas bifuncionais com atividade de redutase de acil-CoA (formação de aldesídeo) e redutase de aldesídeo ou atividades de desidrogenase de álcool. As oxidorredutases bifuncionais exemplares convertem uma acil-CoA a álcool são descritas neste. São adequadas as enzimas de crotonaldesídeo redutase (formação de álcool) que catalisam as 2 etapas de redução requeridas para a formação de álcool crotílico de crotonil-CoA. As oxidorredutases de 2 etapas exemplares que convertem uma acil-CoA a um álcool são providas abaixo. Tais enzimas podem converter naturalmente crotonil-CoA a álcool crotílico ou podem ser engenheiradas para realizar isto. Estas enzimas incluem aquelas que transformam substratos, tais como acetil-CoA a etanol (por exemplo, adhE de E. coli (Kessler et al, FEBS.Lett. 281 :59-63 (1991))) e butiril-CoA a butanol (por exemplo, adhE2 de C. acetobutylicum (Fontaine et al., J. Bacteriol. 184:821-830 (2002))). A enzima adhE2 de C. acetobutylicum foi especificamente mostrada em ref. (Burk et al, supra, (2008)) para produzir BDO a partir de 4-hidroxibutiril-CoA. Além de reduzir acetil-CoA a etanol, a enzima codificada por adhE em Leuconostoc mesenteroides foi mostrada oxidar o composto de cadeia ramificada isobutiraldesídeo a isobutiril-CoA (Kazahaya et al, J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972); Koo et al, Biotechnol. Lett. 27:505-510 (2005)).
[00182] Uma outra enzima exemplar é uma que converte malonil-CoA a 3-HP. Uma enzima dependente de NADPH com esta atividade foi caracterizada em Chloroflexus aurantiacus quando participa do ciclo 3- hidroxipropionato (Hugler et al, supra, (2002); Strauss et al, 215:633-643 (1993)). Esta enzima, com uma massa de 300 kDa, é altamente específica de substrato e mostra pouca similaridade de sequência a outras oxidorredutases conhecidas (Hugler et al, supra, (2002)). Nenhuma enzima em outros organismos foi mostrada catalisar esta região específica; entretanto existe evidência bioinformática que outros organismos podem ter trajetos de similaridade (Klatt et al., Environ Microbiol. 9:2067-2078 (2007)). Os candidatos de enzima em outros organismos incluindo Roseiflexus castenholzii, Eritrobacter sp. NAP1 e gama proteobactéria marinha HTCC2080 pode ser implicados por similaridade de sequência.
[00183] FIG. 1: Etapa VD: Desidratase de álcool Crotílico:
[00184] Conversão de álcool crotílico para butadieno usand-se uma desidratase de álcool crotílico inclui as variantes de enzima de linalool desidratase descritos neste. Embora não seja ligado por teoria, a enzima de desidratase de linalool tem duas atividades, a isomerização enzimática de álcool crotílico [ara 3-buten-2-ol e desidratação de 3-buten-2-ol a butadieno. Ver Brodkorb et al, J Blot Chem 285:30436-42 (2010) para clonagem, expressão e estudo de uma desidratase de linalool do tipo selvagem.
Sequências de alvejamento periplásmico, peptídeos sinalizadores
[00185] Em modalidades alternativas, os polipeptídeos como providos neste compreende adicionalmentem (ou consistem de) um homólogo ou a sequência sinalizadora heteróloga ou peptídeo sinalizador (os termos “peptídeo sinalizador” e “sequência sinalizadora” são usados de maneira intercambiável e ambos incluem as várias classes de peptídeos de alvejamento e sinalizadores), por exemplo, uma sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS) ou um polipeptídeo ou peptídeo tendo uma atividade PTS ou PSS ou uma sequência sinalizadora eucariótica. Em modalidades alternativas, polipeptídeos como provido neste ainda podem compreender (tendo no lugar de sua sequência sinalizadora natural) qualquer sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS), por exemplo, qualquer trajeto de alvejamento de SecB pós-tradução PTS ou PSS; qualquer trajeto de alvejamento de partícula de reconhecimento de sinal (SRP) de co-tradução PTS ou PSS ou, qualquer sistema independente e Sec de translocação de arginina duplo PTS ou PSS.
[00186] Por exemplo, a FIG. 2 ilustra sequências sinalizadoras heterólogas exemplares que podem ser usadas para a prática desta, por exemplo, (operacionalmente ligado a) uma enzima madura ou processada como provido neste, por exemplo, o polipeptídeo LinD exemplar SEQ ID NO: 16, que é a forma madura de polipeptídeo de comprimento total SEQ ID NO: 12 sem sua sequência sinalizadora natural, que é o peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 20. Por exemplo, qualquer uma das sequências sinalizadoras da FIG. 2 ou outras sequências sinalizadoras, são usadas no lugar da sequência sinalizadora natural das enzimas LinD exemplares de comprimento total SEQ ID NO: 12. O polipeptídeo LinD exemplar SEQ ID NO: 12 contém uma sequência dependente de sec de alvejamento periplásmica (PTS) como descritos neste (o peptídeo SEQ ID NO: 20). Em modalidades alternativas, o PTS do polipeptídeo LinD exemplar é substituído por cada um dos PTSs dependentes de sec e dependentes de SRP, como ilustrado na FIG. 2, bem como sequências com base em TAT (não mostradas). Similarmente, em modalidades alternativas, são providos neste os polipeptídeos de LinD de comprimento total SEQ ID NO: 12, 22, 37, 43, 49, 55, 64, 66, 74, 80, 86, 92 ou 98 com suas sequências sinalizadoras naturais (incluindo SEQ ID NO: 20, 20, 39, 45, 51, 57, 20, 68, 76, 82, 88, 94 ou 100, respectivamente) substituído por uma sequência sinalizadora da FIG. 2 ou uma outra sequência sinalizadora.
[00187] Em modalidades alternativas, são providas neste novas sequências sinalizadoras SEQ ID NO: 20, 39, 45, 51, 57, 68, 76, 82, 88, 94 ou 100, operacionalmente ligado a um outro polipeptídeo, por exemplo, um outro polipeptídeo LinD, tal como SEQ ID NO: 2 (onde uma sequência sinalizadora como provido neste é substituída por sequência sinalizadora natural da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8).
[00188] As sequências sinalizadoras heterólogas são funcionais, isto é, uma sequência sinalizadora é funcional quando operacionalmente ligada a um polipeptídeo diferente a partir do qual esta é derivada.
[00189] Por exemplo, como ilustrado na FIG. 3A e FIG. 3B, PTS do tipo selvagem (WT) PTS (SEQ ID NO: 8) de LinD tipo WT da C. defragrans 65 Phen (SEQ ID NO: 2) foi substituído por PTSs de proteínas periplásmicas de E. coli, expressadas em E. coli e estimadas para a atividade de butadieno. A FIG. 3A: PTSs dependentes de Sec e TAT-SEC PTSs parecem ter atividade similar àquela da sequência de alvejamento do tipo selvagem; FIG. 3B: peptídeos sinalizadores comparáveis com PTSs do tipo selvagem são destacados em amarelo (LamB ss, MalE ss, Pe1B ss, FhuD) e aqueles que reduzem significantemente a atividade são destacados em vermelho (MalE e YcdO).
[00190] A % de alinhamentos ID computada MUSCLE (MUSCLE: alinhamento de sequência múltiplo com precisão alta e rendimento alto) realizada em Geneious; Edgar (2004) Nucleic Acids Research 32(5):1792-7 Sumário de sequências exemplares: Desidratase de linalool (LinD) de C. defragrans 65Phen (GMN 2753 engenheirado) SEQ ID NO: 1 Sequência de ácido nucleico natural que codifica tipo selvagem (WT) polipeptídeo de desidratase de linalool SEQ ID NO: 2; incluindo peptídeo sinalizador que codifica a Sequência SEQ ID NO: 2 polipeptídeo de desidratase de linalool tipo selvagem de comprimento total natural SEQ ID NO: 3 Ácido nucleico otimizado por códon que codifica a SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4 Ácido nucleico otimizado por códon que codifica a SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 5 Ácido nucleico otimizado por códon que codifica a SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 6 Forma madura (processada) de SEQ ID NO: 2 desidratase de linalool tipo selvagem SEQ ID NO: 7 Ácido nucleico natural que codifica sequência sinalizadora SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 8 Peptídeo de sequência sinalizadora de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 9 Ácido nucleico que codifica a SEQ ID NO: 10; difere de SEQ ID NO: 4 por ter 12 substituições de códon. SEQ ID NO: 10 Variante de polipeptídeo de comprimento total de SEQ ID NO: 2; tendo 12 substituições Desidratase de linalool (LinD) de Castellaniella defragrans 62Car; engenheirado GNM 9819 SEQ ID NO: 11 Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 12; incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 12 Tipo selvagem LinD de comprimento total de C. defragrans 62Car, com peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 13 (1° ácido nucleico otimizado por códon que codifica SEQ ID NO: 12 de comprimento total; engenheirado GNM 9819A) SEQ ID NO: 14 (2° ácido nucleico otimizado por códon que codifica SEQ ID NO: 12 de comprimento total; engenheirado GNM 9819B) SEQ ID NO: 15 (Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 16; forma processada (madura) de SEQ ID NO: 11 ácido nucleico, GNM 9819) SEQ ID NO: 16 (forma madura de polipeptídeo LinD SEQ ID NO: 12 (GNM 9819)) SEQ ID NO: 17: (Ácido nucleico otimizado por códon que codifica a SEQ ID NO: 16 (encurtado da SEQ ID NO: 13 GNM 9819A) SEQ ID NO: 18: (Ácido nucleico otimizado por códon que codifica a SEQ ID NO: 16 (encurtado da SEQ ID NO: 14 GNM 9819B) SEQ ID NO: 19 (Ácido nucleico natural que codifica sequência sinalizadora SEQ ID NO: 20; da SEQ ID NO: 11) SEQ ID NO: 20 (Peptídeo sinalizador da SEQ ID NO: 12 (GNM 9819)) SEQ ID NO: 21 (Ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 22 variante de comprimento total, engenheirado 9819C; difere de tipo selvagem SEQ ID NO: 13 GNM 9819A por ter 11 substituições de códon) SEQ ID NO: 22 (variante de comprimento total SEQ ID NO: 12 (GNM 9819) com 11 substituições de aminoácido V19I, Y71F, G74S, G133M, R171K, I182L, V196F, D200N, F325S, G365S, L368F; engenheirado 9819C) SEQ ID NO: 23 (enzima variante: SEQ ID NO: 25 (sequência sinalizadora heteróloga LamB ss) fundido a LinD do tipo selvagem forma madura de C. defragrans 65Phen, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 24 (enzima variante: SEQ ID NO: 25 (sequência sinalizadora heteróloga LamB ss) fundida a enzima tipo selvagem forma madura de Castellaniella defragrans 62Car, SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 25 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga (ss) LamBss (ou LamB ss)) SEQ ID NO: 26 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga MalE ss) SEQ ID NO: 27 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga MglBss) SEQ ID NO: 28 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga OmpAss) SEQ ID NO: 29 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga PelBss) SEQ ID NO: 30 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga PhoAss) SEQ ID NO: 31 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga DsbAss) SEQ ID NO: 32 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga SfmCss) SEQ ID NO: 33 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga TolBss) SEQ ID NO: 34 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga TorTss) SEQ ID NO: 35 (peptídeo: sequência sinalizadora heteróloga FhuD ss) Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em lama ativada de Padre Dam enriquecida em Myrcene; engenheirado GNM 9874 SEQ ID NO: 36 Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 37, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 37: Enzima LinD natural ou não processada, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 38: Ácido nucleico que codifica peptídeo sinalizador GNM 9874 SEQ ID NO: 39: peptídeo sinalizador GNM 9874 SEQ ID NO: 40: Ácido nucleico que codifica enzima LinD GNM 9874 processada, sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 41: Enzima LinD GNM 9874 LinD processada, sem peptídeo sinalizador (polipeptídeo GNM 9874 de comprimento total tem 99% de identidade de sequência a GNM 2753 de comprimento total e o polipeptídeo GNM 9874 maduro ou processado tem 99% de identidade de sequência a GNM 2753 processado). (polipeptídeo GNM 9874 de comprimento total tem 94% de identidade de sequência a GNM 9819 de comprimento total e o polipeptídeo GNM 9874 maduro ou processado tem 96% de identidade de sequência a GNM 9819 processado). Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em lama ativada de Camp Pendleton enriquecida em Myrcene (enriquecimento secundário); engenheirado GNM 9873 SEQ ID NO: 42 Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 43, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 43: Enzima LinD natural ou não processada, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 44: Ácido nucleico que codifica GNM 9873 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 45: GNM 9873 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 46: Ácido nucleico que codifica enzima LinD GNM 9873 processada, sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 47: enzima de LinD GNM 9873 processada, sem peptídeo sinalizador (polipeptídeo GNM 9873 de comprimento total tem 75% de identidade de sequência a GNM 2753 de comprimento total e o polipeptídeo GNM 9873 maduro ou processado tem 79% de identidade de sequência a GNM 2753 processado). (polipeptídeo GNM 9873 de comprimento total tem 75% de identidade de sequência a GNM 9819 de comprimento total e o polipeptídeo GNM 9873 maduro ou processado tem 79% de identidade de sequência a GNM 9819 processado). Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em lama ativada de Camp Pendleton enriquecida em Myrcene (Enriquecimento primário); engenheirado GNM 9875 SEQ ID NO: 48: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 49, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 49: Enzima LinD natural ou não processada, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 50: Ácido nucleico que codifica GNM 9875 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 51: GNM 9875 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 52: Ácido nucleico que codifica enzima LinD GNM 9875 processada, sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 53: Enzima LinD GNM 9875 processada, sem peptídeo sinalizador (Polipeptídeo GNM 9875 de comprimento total tem 78% de identidade de sequência a GNM 2753 de comprimento total e o polipeptídeo GNM 9875 maduro ou processado tem 82% de identidade de sequência a GNM 2753 processado). (Polipeptídeo GNM 9875 de comprimento total tem 78% de identidade de sequência a GNM 9819 de comprimento total e o polipeptídeo GNM 9875 maduro ou processado tem 81% de identidade de sequência a GNM 9819 processado). Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em lama ativada (Camp Pendleton); engenheirado GNM 9894 SEQ ID NO: 54: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 55, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 55: Enzima LinD natural ou não processada, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 56: Ácido nucleico que codifica GNM 9894 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 57: GNM 9894 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 58: Ácido nucleico que codifica enzima LinD GNM 9894 processada, sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 59: Enzima LinD GNM 9894 processada, sem peptídeo sinalizador (Polipeptídeo GNM 9894 de comprimento total tem 78% de identidade de sequência a GNM 2753 de comprimento total e o polipeptídeo GNM 9894 maduro ou processado tem 81% de identidade de sequência a GNM 2753 processado). (Polipeptídeo GNM 9894 de comprimento total tem 78% de identidade de sequência a GNM 9819 de comprimento total e o polipeptídeo GNM 9894 maduro ou processado tem 81% de identidade de sequência a GNM 9819 processado). Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em lama ativada (Camp Pendleton); engenheirado GNM 9895 SEQ ID NO: 60: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 61, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador sem local de clivagem de sinalizador de peptídeo identificado. SEQ ID NO: 61: Enzima LinD natural ou não processada, incluindo peptídeo sinalizador sem local de clivagem de sinalizador de peptídeo identificado. SEQ ID NO: 62: Enzima LinD SEQ ID NO: 61 tendo uma modificação A196F; engenheirado 9895B. (Polipeptídeo GNM 9895 de comprimento total tem 66% de identidade de sequência a GNM 2753 de comprimento total. (Polipeptídeo GNM 9895 de comprimento total tem 65% de identidade de sequência a GNM 9819 de comprimento total. Desidratase de linalool (LinD) (uma variante engenheirada de GNM 9819 com as 7 mutações (mudanças de aminoácido): G74S, G133Q, R171K, I182K,V196F,D200G, G365S); GNM 9819T engenheirado SEQ ID NO: 63: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 64, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 64: Enzima LinD engenheirada natural ou não processada, incluindo peptídeo sinalizador. Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em lama ativada (Camp Pendleton); GNM 10038 engenheirado. SEQ ID NO: 65: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 66, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 66: Enzima LinD natural ou não processada GNM 10038, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 67: Ácido nucleico que codifica GNM 10038 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 68: GNM 10038 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 69: Ácido nucleico que codifica enzima LinD GNM 10038 (madura) processada, sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 70: Enzima LinD GNM 10038 (madura) processada, sem peptídeo sinalizador Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em lama ativada (Camp Pendleton); engenheirado GNM 10039. SEQ ID NO: 71: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 72, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador que não identificou local de clivagem de peptídeo sinalizador. SEQ ID NO: 72: Enzima LinD natural ou não processada GNM 10039, incluindo peptídeo sinalizador que não identificou local de clivagem de peptídeo sinalizador. Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos de amostra de solo (rio Cottonwood); engenheirado GNM 10058. SEQ ID NO: 73: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 74, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 74: Enzima LinD natural ou não processada GNM 10058, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 75: Ácido nucleico que codifica GNM 10058 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 76: GNM 10058 peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 77: Ácido nucleico que codifica enzima LinD GNM 10058 processada (madura), sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 78: enzima LinD GNM 10058 processada (madura), sem peptídeo sinalizador. Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em amostra de solo; engenheirado GNM 10092. SEQ ID NO: 79: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 80, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 80: Enzima LinD natural ou não processada GNM 10092, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 81: Ácido nucleico que codifica peptídeo sinalizador GNM 10092 SEQ ID NO: 82: peptídeo sinalizador GNM 10092 SEQ ID NO: 83: Ácido nucleico que codifica enzima LinD GNM 10092 processada (madura), sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 84: Enzima LinD GNM 10092 processada (madura), sem peptídeo sinalizador. Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em amostra de solo (rio Cottonwood); engenheirado GNM 10093. SEQ ID NO: 85: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 86, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 86: Enzima LinD natural ou não processada GNM 10093, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 87: Ácido nucleico que codifica peptídeo sinalizador GNM 10093 SEQ ID NO: 88: peptídeo sinalizador GNM 10093 SEQ ID NO: 89: Ácido nucleico que codifica enzima LinD GNM 10093 processada (madura), sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 90: enzima LinD GNM 10093 processada (madura), sem peptídeo sinalizador. Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em lama ativada (Sierra Nevada); engenheirado GNM 10094. SEQ ID NO: 91: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 92, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 92: Enzima LinD natural ou não processada GNM 10094, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 93: Ácido nucleico que codifica peptídeo sinalizador GNM 10094 SEQ ID NO: 94: peptídeo sinalizador GNM 10094 SEQ ID NO: 95: Ácido nucleico que codifica enzima LinD GNM 10094 processada (madura), sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 96: enzima LinD GNM 10094 processada (madura), sem peptídeo sinalizador. Desidratase de linalool (LinD) de Metagenômicos em amostra de solo (rio Cottonwood); engenheirado GNM 10097. SEQ ID NO: 97: Ácido nucleico natural que codifica a SEQ ID NO: 98, que é não processado e inclui seu peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 98: Enzima LinD natural ou não processada GNM 10097, incluindo peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 99: Ácido nucleico que codifica peptídeo sinalizador GNM 10097 SEQ ID NO: 100: peptídeo sinalizador GNM 10097 SEQ ID NO: 101: Ácido nucleico que codifica enzima LinD natural ou não processada GNM 10097, sem peptídeo sinalizador SEQ ID NO: 102: Enzima LinD GNM 10097 LinD processada (madura), sem peptídeo sinalizador.
Sequências exemplares adicionais da invenção:
[00191] As sequências exemplares adicionais da invenção podem ser encontradas em comparações de sequência de resíduos de aminoácido LinD, incluindo as comparações de FIG. 11 a FIG. 16, como explicado abaixo:
[00192] Por exemplo, as sequências exemplares adicionais da invenção podem ser encontradas nas comparações de sequência de FIG. 12 até a FIG. 16, que compara novas sequências da invenção GNM 9873 (SEQ ID NO: 43) (FIG. 12); GNM 9874 (SEQ ID NO: 37) (FIG. 13); GNM 9875, (SEQ ID NO: 49) (FIG. 14); GNM 9894, (SEQ ID NO: 55) (FIG. 15) e GNM 9895 (SEQ ID NO: 61) (FIG. 16), com polipeptídeo LinD conhecido GNM 2753 (SEQ ID NO: 2). As sequências exemplares adicionais podem ser observadas na comparação de sequência da FIG. 11, que compara a enzima LinD exemplar GNM 9819 (SEQ ID NO: 12) com o GNM 2753 (SEQ ID NO: 2) conhecido.
[00193] As sequências exemplares adicionais da invenção são identificadas pelos resíduos que diferem na comparação de sequência, onde cada diferença de resíduo de aminoácido é transferida ou incorporada a um resíduo equivalente de polipeptídeo LinD como descrito neste, incluindo as sequências LinD conhecidas e novas como descritos neste.
[00194] Por exemplo, o alinhamento de FIG. 12 mostra uma diferença no primeiro resíduo de aminoácido (aa) após o peptídeo sinalizador, onde o primeiro resíduo aa na forma “madura” de GNM 9873 (SEQ ID NO: 43) de comprimento total é “E” e o primeiro resíduo aa na forma “madura” de GNM 2753 (SEQ ID NO: 2) de comprimento total é de “A”. Desta maneira, as sequências exemplares adicionais da invenção incluem polipeptídeos LinD onde o primeiro resíduo aa “maduro” é um “A” ou um “E”. Além disso, as sequências exemplares adicionais da invenção incluem variantes do polipeptídeo LinD exemplar (por exemplo, GNM 9819 (SEQ ID NO: 12) e o GNM 2753 (SEQ ID NO: 2) conhecido onde o primeiro resíduo aa “maduro” é um “A” ou um “E”.
[00195] Um outro exemplo de sequências exemplares adicionais da invenção da FIG. 12 pode ser encontrado no quarto resíduo aa do polipeptídeo LinD “maduro”, onde o 4° resíduo aa na forma “madura” de GNM 9873 de comprimento total (SEQ ID NO: 43) é “F” e o 4° resíduo aa na forma “madura” de GNM 2753 de comprimento total (SEQ ID NO: 2) é “P”. desta maneira, sequências exemplares adicionais da invenção incluem polipeptídeos LinD onde o 4° resíduo aa “maduro” (ou resíduo equivalente) é um “F” ou um “P”. As sequências exemplares adicionais da invenção incluem variantes dos polipeptídeos LinD exemplares (por exemplo, GNM 9819 (SEQ ID NO: 12) e o GNM 2753 (SEQ ID NO: 2) conhecido, onde o 4° resíduo aa “maduro” é um “F” ou um “P”.
[00196] As sequências exemplares adicionais da invenção podem ser observadas na comparação das variantes do polipeptídeo LinD exemplar GNM 9819 (SEQ ID NO: 12) e o GNM 2753 (SEQ ID NO: 2) conhecido, como na FIG. 11 e que incorpora estas diferenças de resíduos de aminoácido (aa) em outros novos polipeptídeos LinD como provido neste. Por exemplo, o 2° resíduo aa na forma “madura” de GNM 9819 (SEQ ID NO: 12) de comprimento total é “P” e o 2° resíduo aa na forma “madura” de GNM 2753 (SEQ ID NO: 2) de comprimento total é “E”. Desta maneira, as sequências exemplares adicionais da invenção incluem polipeptídeos LinD onde o 2° resíduo aa “maduro” (ou resíduo equivalente) é um “E” ou um “P” e este inclui incorporar estas diferenças de resíduo de aminoácido (aa) nos novos polipetídeos LinD como provido neste e outros polipeptídeos LinD conhecidos, (desta maneira criando uma nova variante, isto é, uma nova sequência LinD exemplar provida neste).
[00197] As sequências exemplares adicionais da invenção são combinações de dois, três, quatro, cinco, seis ou mais destas mudanças de resíduo aa como observado pelas comparações de sequência, por exemplo, como provido neste. Por exemplo, um polipeptídeo LinD exemplar provido neste compreende dois ou mais de: uma mudança em seu primeiro resíduo aa “maduro” a um “A” ou um “E”; uma mudança neste 2° resíduo aa “maduro” (ou resíduo equivalente) um “E” ou um “P”; uma mudança em seu 4° resíduo aa “maduro” (ou equivalente) um “F” ou um “P”; etc.
[00198] Em modalidades alternativas, a prática da invenção compreende o uso de qualquer técnica convencional comumente usada em biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são conhecidas por aqueles versados na técnica e são descritos em numerosos textos e trabalhos de referência (Ver, por exemplo, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Segunda Edição, Cold Spring Harbor, 1989 e Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology,” 1987). A não ser que definido de outra maneira neste, todos os termos técnicos e científicos usados neste têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Por exemplo, Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a Ed., John Wiley and Sons, NY (1994) e Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) abastece aqueles habilitados na técnica com dicionários gerais de muitos dos termos usados na invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes para aqueles descritos neste encontram uso na prática da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos nestes. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais totalmente descritos por referência à Especificação como um todo.
[00199] A não ser que de outra maneira neste, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste encontram uso na prática da invenção presente, os métodos e materiais preferidos são descritos neste. Consequentemente, os termos imediatamente definidos abaixo são mais totalmente escritos por referência à Especificação como um total.
[00200] Como usado aqui, os termos singulares "um", "uma" e "o" incluem a referência plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. a não ser que indicado ao contrário, os ácidos nucleicos são escritos de esquerda para a direita em orientação de 5' a 3'; as seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi, respectivamente. Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos e reagentes descritos, como estes podem variar, dependendo do contexto que estes são utilizados pelas pessoas versadas na técnica.
[00201] Os seguintes exemplos e as figuras visam esclarecer a invenção e demonstrar e ainda ilustrar certas modalidades e aspectos preferidos sem restringir o objetivo da invenção aos exemplos e figuras.
EXEMPLOS Exemplo 1. Demonstração da atividade de desidratase de linalool
[00202] Abaixo está uma tabela de atividade para a produção de butadieno (no espaço superior) de desidratase de linalool tipo selvagem conhecida (expressada a partir do ácido nucleico engenheirado 2753I) e sua variantes de substituição de 12-aminoácido engenheirada 2753N expressada em E. coli com álcool crotílico exogenamente adicionado; tempo de reação de 48 horas como descritos neste. Na reação de enzima, álcool crotílico é isomerizado a MVC que é desidratado a butadieno. O butadieno é suficientemente volátil coletando-o e medindo-o no espaço superior. Como relatado na literatura e mostrado neste as enzimas tipo selvagem e variantes são ativas in vivo em álcool crotílico.
[00203] Abaixo está uma tabela de atividade para a produção de butadieno (no espaço superior) da nova desidratase de alquenol provida neste, a partir de C. defragrans 62 Car, (SEQ ID NO: 12), expressada de ácido nucleico SEQ ID NO: 11, como expressada em E. coli com álcool crotílico exogenamente adicionado ou seu isômero metil vinil carbinol (MVC); tempo de reação de 48 horas como descritos neste. Na reação de enzima, álcool crotílico é isomerizado a MVC que é desidratado a butadieno. O butadieno é suficientemente volátil coletando-o e medindo-o no espaço superior. A forma madura da nova enzima é feita pelo E. coli engenheirado e é ativo in vivo tanto em álcool crotílico quanto em MVC como mostrado na tabela abaixo. A nova enzima também foi ativa em dois alquenóis C5 dentro da fórmula CnH2nO onde 3<n<7. Quando as substituições usadas em 2753N foram colocadas simultaneamente na nova enzima 9819, a variante de subestação de 11-aminoácido específica engenheirada 9819I, não melhora a atividade em álcool crotílico mas em vez disso inativou a proteína no álcool crotílico. Outras variantes de substituição, incluindo aquelas com peptídeos de sinal heterólogo ou com poucos números de substituição como descrito neste, foram demonstradas como ativas ou melhorando a atividade (dados não mostrados).
Ensaios de Produção de 1,3-Butadieno In Vivo
[00204] E. coli (variantes ATCC 8739 C) são transformados com a expressão de plasmídeos e selecionados e mantidos usando-se a seleção antibiótica. No dia anterior ao experimento, 1 mL de culturas durante a noite em antibióticos LB foram inoculados e desenvolvidos com uma selo respirável em placa de 24 reservatórios a 37°C. As culturas durante a noite foram semeadas em OD600=0,05 em 2 ml de M9 + 4% de glicose + antibiótico + IPTG + 10 mM de álcool crotílico em garrafas com tampa de rosca de 10 ml. As garrafas foram incubadas por 48 horas a 37°C e produção de 1,3- butadieno foi validada por análise de espaço superior por GC-MS.
Sequenciamento Metagenômico
[00205] As amostras de água de esgoto foram obtidas a partir de um local de tratamento de água residual na Califórnia e foram usados como o inóculo para culturas de enriquecimento. O sequenciamento metagenômico foi realizado nas amostras de DNA extraídas das culturas de enriquecimento usando a plataforma Illumina MiSeq. A montagem de novo foi realizada usando o montador SPAdes para gerar contíguos representando o metagenoma. Uma pesquisa TBLASTN foi conduzida contra este banco de dados de contíguos usando-se um polipeptídeo de comprimento total de WT C. defragrans 65Phen para identificar homólogos na montagem metagenômica; usando-se protocolos como descrito, por exemplo, em Bankevich, et al., SPAdes: A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing. Journal of Computational Biology 19(5) (2012), 455-477. doi:10.1089/cmb.2012.0021.
[00206] A tabela como ilustrada na FIG. 18 e tabela seguinte, relatam identidade percentual em pares entre os novos polipeptídeos providos neste e enzima tipo selvagem conhecida (formas de comprimento total e maduras) descritos neste, onde a identidade percentual (% ID) foi computada usando-se o algoritmo de alinhamento MUSCLE usando-se o software Geneious (Edgar, MUSCLE: multiple sequence alinhamento with high accuracy and high throughput, Nucleic acids research 32 (5):1792-7 (2004)). As tabelas da figura 18 descrevem tanto % ID em pares para proteína de comprimento total (não processado) (FIG. 18A) quando % ID em pares para proteína “madura” ou processada (FIG. 18B). As tabelas demonstram que os inventores identificaram enzimas nativas com função enzimática similar que dividem comprimento de aminoácido idêntico ou quase idêntico e identidade de aminoácido (e desta maneira estrutural) tão baixa quanto pelo menos cerca de 75% e ainda tão baixo quanto cerca de 63% em comparação entre as sequências de aminoácido de comprimento total e 67% entre as sequências de aminoácido de proteína madura.
Exemplo 2. Demonstração de Atividade de Desidratase de Linalool
[00207] Este exemplo provê dados que demonstram a atividade de enzima de desidratase e atividade de enzima isomerase-desidratase bifuncional de enzimas exemplares como provido neste.
Objetivos/Hipótese e Fundamentos
[00208] Para testar um painel RBS para a nova LinD 9895A (SEQ ID NO: 61, que é não processada e inclui seu peptídeo sinalizador) para a atividade em 10 mM de CrOH, MVC e prenol. O experimento também incluir um teste de repetição de construções originais de 9895A (SEQ ID NO: 61) e 9895B (que é SEQ ID NO: 62 tendo uma modificação A196F).
[00209] (um local de ligação ribossômico (RBS) é uma sequência em mRNA que é ligado pelo ribossomo quando inicia a tradução da proteína) Projeto do Experimento Cepa(s) Hospedeira(s) 8157 Plasmids (rpt: pG8227, pG_8228), pG_8285, pG_8286, pG_8287, pG_8288 Genes (rpt: 9895A, 9895B, canônico RBS), 13k-9895A, 34k-9895A, 104k- 9895A, 290k-9895A Variável força de RBS Protocol de Exp. Cultura celular em frasco com tampa de rosca em SMM5 + 10 mM de CrOH ou 10 mM de MVC ou 10 mM de prenol Pontos de tampo da Amostra Medição de espaço superior de cultura de 72 horas para BDE Tipos de dados coletados BDE de CrOH e MVC por GCMS Condições Experimentais
[00210] 2 ml de pré-cultura de LB+glicose+Kan em placa de 24 reservatórios, desenvolvidos durante a noite em incubadora umidificada. Amostras em duplicata biológica.
[00211] Usado para inocular 2 ml de SMM5+Trace+Kan+IPTG + 10 mM de CrOH ou 10 mM de MVC ou 10 mM de prenol em frascos de vidro selados de 10 ml. Início OD 0,1. Desenvolvido 72 horas a 35°C. As amostras receberam 60°C, morte por calor 30 minutos, então submetido à análise de espaço superior para BDE por GCMS.
[00212] Para SDS-PAGE, desenvolvido 24 horas em frasco de agitação, SMM5+IPTG. Dados (1) polipeptídeo LinD 9895 (SEQ ID NO: 61) foi demonstrado converter metil vinil carbinol (MVC) em 10 mM aBDE, com tanto quanto 0,27, 0,25 e 0,17 ppm foi detectado com 13, 34 e 104K sequências RBS, respeitosamente. A Conversão de MVC a butadieno (BD, BDE) demonstra atividade de desidratase. (2) polipeptídeo LinD 9895 (SEQ ID NO: 61) foi demonstrado converter prenol em 10 mM a isopreno, com tanto quanto 6, 4 a 8 e 3 ppm foi detectado com 13, 34 e 104K sequências RBS, respeitosamente. Conversão de prenol a isopreno demonstra tanto atividade de isomerase quanto de desidratase (em que a atividade de isomerase converte o prenol a seu isômero isoprenol e a atividade de desidratase converte o isoprenol a isopreno). (3) Introdução da mutação A196F em polipeptídeo LinD 9895 (engenheirado GNM 9895B, SEQ ID NO: 62) pode resultar em uma intensificação de 2 vezes no ensaio MVC (para produzir BDE). Em um ensaio, usando-se um RBS “canônico” RBS, o polipeptídeo LinD 9895 (SEQ ID NO: 61) converteu prenol a isopreno em um rendimento de 0,13 ppm, enquanto a mutação 9895B A196F LinD (SEQ ID NO: 62) converteu prenol a isopreno em um rendimento de 0,17 ppm.(4) polipeptídeo LinD 9819T (SEQ ID NO: 64, que é variante engenheirada não processada e inclui seu peptídeo sinalizador; codificado por SEQ ID NO: 63) em séries separadas deste ensaio foi demonstrado converter metil vinil carbinol (MVC) em 10 mM de aBDE: tendo uma média de 132 uM, as séries separadas geraram 7,36 ppm (ou 136 uM), 7,32 ppm (135 uM) e 6,68 ppm (123 uM).
[00213] A FIG. 17 na forma de tabela resumo a atividade enzimática demonstrada de enzimas exemplares da invenção.
[00214] Diversas modalidades da invenção foram descritas. Entretanto, deve ser entendido que várias modificações podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da invenção. Consequentemente, outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações seguintes.

Claims (7)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo compreendendo uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 62, que tem um, dois, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em: V19I, L21L, Y71F, G74S, G133M, R171K, I182L, V196F, D200N, F325S, G365S e L368F (numeração com referência à SEQ ID NO: 12) ou a mesma substituição em uma posição correspondente identificada pelo alinhamento à SEQ ID NO: 12, e um substrato para o polipeptídeo compreendendo um alquenol, um álcool crotílico, um but-3-en-2-ol ou um but-3-en-1-ol, um composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 ou uma combinação dos mesmos.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende adicionalmente um peptídeo sinal.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende adicionalmente uma sequência de alvejamento periplásmica (PTS) ou sequência sinalizadora periplásmica (PSS).
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições conservativas de aminoácido na SEQ ID NO: 62.
5. Método para produzir um polímero, resina ou artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende reagir um composto correspondente à fórmula geral CnH2nO com 3<n<7 com uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polímero, resina ou artigo de fabricação compreende um polímero contendo butadieno, polibutadieno, adiponitrila, um copolímero, acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS), borracha de acrilonitrila-butadieno (ABR), copolímeros de borracha de estireno-butadieno (SBR), látex de estireno-1,3-butadieno.
7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o artigo de fabricação é um pneu, um cano, uma peça automotiva, uma peça de barco, um recipiente alimentício ou um forro de tapete.
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