CN1292822A - 修饰植物中次级代谢化合物水平的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种获得具有至少一种次级代谢途径的产物改变了含量的遗传转化植物的方法。这种方法包括将DNA表达盒引入到能够被转化并再生成完整植物的植物细胞中。表达盒包括在植物细胞中转化和筛选所需要的DNA序列,它还包括在植物细胞中有活性的启动子控制之下,编码能够改变次级代谢途径中底物可用性的蛋白质的DNA序列。这个底物不是选自葡萄糖、氨基酸、普通脂肪酸和核苷酸的初级代谢物。然后,可以重获具有至少一种次级代谢途径的产物改变了含量的植物或植物组织(包括种子)。本发明还提供了根据此方法所得到的植物和种子衍生的饲料产品。

Description

修饰植物中次级代谢化合物水平的方法和组合物

此申请书是美国系列申请No．09／012，453的部分继续申请，并且要求临时申请60／072，156中的优先权。

发明领域

本发明提供改变植物中由次级代谢途径产生的化合物的方法和组合物。本发明还提供次级代谢物含量有所改变的植物细胞和改变了次级代谢物含量的植物种子。在一个实施方案中，在根据本发明的植物、植物细胞以及植物种子中，损营养性的次级代谢产物的含量有所变化。在另一个实施方案中，在根据本发明的植物、植物细胞和植物种子中，改变了类苯丙酸(phenylpropanoid)以及糖醇次级代谢途径中所发现产物的含量。本发明进一步提供对改变植物细胞和种子中次级代谢物含量有用的遗传构建体和载体。本发明还涉及修饰的种子粉，含有修饰的种子粉的动物饲料，特别是次级代谢物含量减少或改变了的种子粉。

发明背景

植物通过次级代谢途径产生大量的化合物。尽管不认为次级代谢途径是植物代谢所必须的，但它常常产生独特的生化产物，其中一些被认为是损营养性甚至是毒性的。次级代谢途径和由这些途径产生的化合物对于个别的种或属是特异的。因此次级代谢途径的操作能够产生新的生化产物的组合物或产生具有变化的次级代谢含量的植物组织。尤其，为改变本质上损营养性或毒性的次级代谢化合物的次级代谢操作，能够在食品和饲料领域中提供独特的应用。

希望在不干扰被认为是植物细胞生长和生存所必需的生化过程的情况下进行次级代谢操作。植物生长和生存所必须的生化过程和化合物的总合被认为是初级代谢途径以及它们的产物。一般认为，初级代谢包括那些可形成基本糖类(如葡萄糖)、氨基酸、普通脂肪酸、核苷酸和由它们所衍生的多聚体(多糖，例如淀粉、蛋白质、脂质、RNA和DNA等)的生化过程。(Yeoman和Yeoman，Tansley综述No．90，培养的植物细胞中的次级代谢操作，新植物学者(New Phytologist)，134：553-569，1996)。

由此，本领域人员认为初级代谢可以定义为那些对所有植物细胞的生存和生长都必需的代谢过程，而次级代谢则可定义为那些不是对所有植物细胞都必需的生化过程。例如，次级代谢途径决定这样的植物特性如色、味、形态学等。次级代谢还产生昆虫可识别的或参与病原体应答的多种化合物。一些这种化合物可以提供一些植物种类在野生条件下的优越性，但是在栽培时，这些化合物对所收获产物的质量可能是有害的，或者限制了这种作物对于某种应用的实用性。一些次级代谢物是独特的化合物，在某一物种中，它们已进化成为特化的生化途径。次级代谢的特征不在于生化机制中的丰余性，而这恰是初级代谢的典型特征，那么，特征上，次级代谢的产物不是由植物中的多个途径产生的。一般地，次级代谢物比参与初级途径的普遍存在的生化产物更具有植物特异性。

多种操作初级代谢途径的尝试已经使得植物细胞具有变化的淀粉或油脂(脂质)含量。然而，预计初级代谢的总操作可能会引起有害的结果。例如，可以改变脂质的组成，但是显而易见，脂质的消除对于细胞存活将是有害的。因为丰余的生化机制可以在操作中抵消一些尝试，初级代谢的操作并不常常是完全成功的。因此，按照可以预料的并且提供栽培条件下有用的和实实在在结果的方式进行植物中初级代谢途径的操作往往是比较困难的。

在一些实例中，已经成功地改变初级代谢，产生了一种新型表型，它代表一种组成上的变化而不是某种特异物质的减少和消除。一般地，已经通过植物基因的异位表达完成了这些操作，例如，在某种组织中或者以组成型方式而不是以可调控型方式过量表达一个基因，或者通过反义RNA、核酶或协同抑制来抑制一个特定基因的活性。但是，要事前预料这些操作的结果是困难的。

植物酶的表达可以在多种水平上修饰。这包括在基因表达水平、翻译、蛋白质加工和蛋白质功能的别构调节上加以控制。因此，参与初级代谢的植物基因异位表达不可能压倒初级代谢调控上的复杂的生化调节。而且，因为初级代谢途径对植物的生长和生存是必需的，初级代谢的丰余度还在这些操作中设置了难以克服的障碍。因此，试图改变初级代谢的尝试经常不能达到预期的表型。然而，这些被修饰植物在田野水平或在不同的极端环境下的评估常常发现，没有观察到预期的结果，或者植物的性能是综合平衡的。那么，初级代谢的修饰就要求仔细考虑初级代谢途径或者途径中的关键步骤以便得到特定的表型。

由于对所涉及的生物化学了解的太少，几乎没有任何在次级代谢途径中表达的基因之信息以及一般情况下，生化途径之间的复杂相互关联信息，使得次级代谢途径的操作复杂化。

然而，改变次级代谢的方法可以提供产生新表型的一种有价值的手段，包括那些具有变化水平的次级代谢化合物的表型，例如，本质上被认为具有损营养性化合物。因此，次级代谢途径代表植物遗传操作的一个重要的靶点。

两条认为是植物中次级代谢途径的生化途径已经被作为旨在改变终产物水平的研究主题。用于操作这些途径的方法不能产生所要求的结果。例如，类苯丙酸途径参与木质素的形成，被认为是次级代谢途径。木质素生物合成是普通类苯丙酸生物合成途径的一部分，这条途径至少产生三种基本酚类前体，对羟基桂皮酸、阿魏酸、芥子酸，它们的产物聚合成木质素和其它的酚类化合物(参见图2)。

在改变次级代谢的类苯丙酸途径的尝试中，最近，将参与木质素单体形成的多种酶之基因鉴定为采用反义或共抑制技术降低木质素的靶点(例如，US5，451，514、US5，633，439、WO93／05160、WO94／08036)。这些靶基因包括那些编码肉桂醇脱氢酶、咖啡酸O-甲基转移酶和苯丙氨酸氨裂合酶的基因。这些技术针对降低木质素含量，因为设想这将对植物的加工或可消化性具有全面、有益的影响。

采用以类苯丙酸途径中的一个基因为靶点，通过反义或共抑制技术降低木质素，可能会产生一些不希望的结果。这些可能包括增强的疾病易感性、变化的生长速率或植物纤维的物理强度降低，以及因此而产生的农学行为表现变劣。已显示抑制苯丙氨酸氨裂合酶可引起许多有害的表型(Elkind等人，含有异源的苯丙氨酸氨裂合酶基因的异常植物发育和转基因烟草中类苯丙酸生物合成减量调节，美国国家科学院院报(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)87：9057-9061，1990)。苯丙氨酸氨裂合酶作用于初级代谢物苯丙氨酸，它是一种氨基酸。这些实验的结果证明通过参与特定次级代谢途径中的一个初级代谢物的修饰而改变次级代谢，可能会产生预想不到和有害的表型。因此，选择一个次级代谢途径中的生化步骤，对于能否产生正常表型而又显示出某种特定次级代谢物的降低是致关重要的。此外，使用反义RNA或共抑制策略也可能不提供商业上可接受的次级代谢物降低的水平或特异性。另外，编码关键酶活性基因的抑制可能还会影响相关基因的表达。因此，几乎没有取得有关引起据信损营养性的酚类化合物的减少，或者通过反义RNA或共抑制减少木质素的含量而又不伴随有害副作用方面的任何进展。

第二个不能成功地产生所要求结果的改变代谢途径的努力是修饰canola中芥子油苷生物合成。已经报道了通过芥子油苷途径的操作来改变canola粉中芥子油苷含量的尝试。一种已经建议用来改变芥子油苷生物合成的方法是，产生一个竞争芥子油苷形成中所使用的硫的新途径，或者通过将色氨酸转化为色氨来降低芥子油苷形成中所要使用的色氨酸水平(“通过两种可选择的策略工程改变芥子油苷生物合成”，Ibrahim、Chavadej&De Luca撰写，发表于植物次级代谢的遗传工程(Genetic engineering of plants secondary metabolism)1994，Plenum出版公司；纽约；美国)。

然而，在降低canola种子粉中芥子油苷含量时，这种方法没有成功。这种方法不能降低canola粉中芥子油苷的损营养性含量。芥子油苷是在植物的叶中制造，然后运输到种子。那么，这种方法是建立在这一信条的基础之上，即其中一种形成芥子油苷时使用的初级代谢物(硫、氨基酸色氨酸)可用性的简单变化将能够减少芥子油苷的产生。然而，种子中的初级芥子油苷是不利用氨基酸色氨酸产生侧链的脂肪族芥子油苷。而且，这些实验的结果(例如，Chavade等人，美国国家科学院院报(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)91：2166-2170，1994)证明在携带能够改变基本氨基酸色氨酸的酶的转基因植物种子中不含有减少的芥子油苷，种子中的脂肪族芥子油苷的含量等于或可能甚至会大于非转基因植物。因此，种子中的总芥子油苷的产量没有减低，即使一种较小的组分(吲哚芥子油苷)似乎是减少了。遗传研究清楚地表明，可通过传统的育种获得低芥子油苷的植物，以及在十字花科植物中有许多控制低芥子油苷的位点。在芥子油苷生物合成中发生着大量的生物化学转化，这些步骤为全部的或大部分芥子油苷的合成之共用的，如果需要一种降低总的芥子油苷的方法，那些步骤就应该作为靶点。因此，如果要设计通用的改变十字花科植物中芥子油苷产量的普适方法，就必须考虑芥子油苷生物合成中所用的不同的酶和底物。

但是，似乎用来获得这种修饰的酶还会作用于初级代谢物上(氨基酸色氨酸和矿物硫)，因而，植物细胞中这些化合物的任何显著的变化都预计会有有害作用。因此，所建议的方法不能特异地以次级代谢途径为靶点。确实可以预想，色氨酸的变化可能引起多种有害的作用。低估修饰初级代谢的困难，那么初级代谢物水平的改变不会产生低芥子油苷canola粉的预期结果。

因此，改变次级代谢的通用方法对于改变植物组织中的生化组分将是有价值的。这可能包括，例如，损营养性化合物的减少、次级代谢物分布型的改变、提供具有改变的加工特性的植物组织、具有工业实用性或药学重要性的化合物水平的改变、具有变化的口味、质地或外观的植物的生产、具有参与引诱昆虫、疾病耐受或其它受次级代谢物影响的生物过程发生了变化的次级代谢物植物的产生，或者有着通过变更次级代谢物而正向改变了生长特性的植物。

发明简述

本发明提供以次级代谢物形成为靶点的方法。这种方法包括改变对次级代谢途径特异的以及对最终的次级代谢产物，尤其是终产物形成时1到5个生化步骤中那些化合物的形成致关重要的底物的可用性。以接近终产物形成的底物为靶点可以避免随还参与基础途径的代谢物的变化而伴随产生的问题，因为终产物是在底物进入初级代谢途径的进入位点后才出现的。因此本方法提供了通过确定不包含初级代谢途径中的底物的次级代谢途径中所使用的前体，而特异性定位于次级代谢物的减少或变化的一种新型手段。

这种方法还包括用组织特异的方式改变底物的可用性，以便只改变某种组织，例如，种子组织。

因此，本方法提供了通过确定不包括初级代谢化合物的次级代谢途径中所使用的前体，而特异性定位于次级代谢物的减少或变化的一种新型手段。

在一个实施方案中，本发明提供了一种获得遗传转化的植物的方法，包括：

A)将除植物细胞中转化和选择所需要的DNA序列之外，

还包括在植物细胞中活性启动子控制之下，编码能够改变次级代

谢途径中底物利用的蛋白质之DNA序列的DNA表达盒，引入

能够被转化以及再生成一个完整植物的植物细胞，条件是底物不

是选自葡萄糖、氨基酸、普通脂肪酸和核苷酸这一类的初级代谢

物，以及

B)重获具有至少一种改变了含量的次级代谢途径产物的

植物。

在另一个实施方案中，本发明提供了制备遗传转化的种子的方法，包括在允许种子形成的条件下，培育根据以上所描述的方法中的步骤A和B所获得的植物。

重组DNA以染色体的形式整合到可育植物的基因组中，以便它可以传给随后的世代。

在下一实施方案中，本发明提供转化植物的载体、根据以上所描述的方法转化的植物和种子，以及含有由此而衍生的种子或粉的饲料产品。

附图简述

图1：改变任何次级代谢途径方法的一般方案的示意图。

图2：总的类苯丙酸代谢和芥子碱产生的示意图。

图3：发育的种子中芥子碱合成的起始与进展。Brassica napus cvWestar种子的薄层层析分析。

图4：HPLC分析得到的发育中的种子中芥子碱积累的定量分析。

图5：经过切割的长角果的柄施用放射性胆碱，通过传粉后7到43天掺入芥子碱的标记，来测定发育中的种子合成芥子碱的能力。

图6：将分离的种子浸入含有放射性胆碱的溶液中，通过传粉后43到64天掺入芥子碱的标记，来测定发育中的种子合成芥子碱的能力。

图7：发育中的种子中的子叶、胚轴和种皮部分新合成的芥子碱的累积作为种子中总的标记的芥子碱中的一部分。

图8：每单位质量组织样品中，发育中的种子子叶和胚轴成分中芥子碱的含量。

图9：根据每一个种子(即轴或一对子叶)测定发育中的种子的子叶和胚轴成分中芥子碱的含量。

图10A和10B：胆碱氧化酶开放阅读框的核苷酸序列(SEQ IDNO：3)。

图11：推出的胆碱氧化酶开放阅读框的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图12：含有组织选择性启动子控制下的COX基因的pHS731植物转化载体的示意图。

图13：通过COX基因的表达，芸苔属的种中种子中芥子碱含量的减少。

图14：含有组织选择性启动子控制下的BADH基因的pHS981植物转化载体的图表。

图15：通过COX和BADH基因的表达，芸苔属的种之种子中芥子碱含量的减少。

图16：通过COX和BADH基因的表达，芸苔属的种之种子中酚含量的变化。

图17：最适于植物细胞中表达的、合成的短小芽孢杆菌(B．pumulis)阿魏酸脱羧酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

图18：推定的由合成的短小芽孢杆菌阿魏酸脱羧酶开放阅读框编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图19：含有组成型35S启动子控制下的阿魏酸脱羧酶基因的植物转化载体的限制性酶切图。

图20：含有种子选择性napin启动子控制下的阿魏酸脱羧酶基因的植物转化载体的限制性酶切图。

图21：种子发育期间肌醇六磷酸的累积。

图22：发育的种子中肌醇六磷酸沉积的组织特异性。

图23：肌醇六磷酸、脂质、TFA可溶性细胞壁和细胞残渣部分中所发现的代谢标记的肌醇的百分比。

图24：肌醇O-甲基转移酶基因的扩增DNA片段的序列(SEQ IDNO：5)。

图25：含有pRD400 5中35S启动子-IMT-GUS-Nos-终止子盒的pSIMT载体的限制性酶切图。

图26：含有pRD400中种子选择性启动子-IMT-GUS-Nos-终止子的pNIMT载体的限制性酶切图。

图27：含有IMT基因的转基因植物的PCR分析。

图28：表达IMT基因的植物的Northern印迹分析。

图29：阐明转基因植物中观察到的肌醇六磷酸减少的条形图。

图30：阐明含有pNIMT载体的田地中生长的F1、F2和F3植物中肌醇六磷酸减少的表。

图31：阐明含有pNIMT载体的田地中生长的F1、F2植物中肌醇六磷酸减少的表。

发明详述

本发明依据的是与初级代谢物截然不同的次级代谢产物的前体之特异性减少和改变。用这种方式，可以消除改变初级代谢途径来获得类似结果而引起的潜在有害作用。因此，本发明避免了可能被认为是初级代谢物的化合物的操作。

在优选的应用中，通过使用一种酶来改变底物的可用性，例如，与所述的植物细胞异源的，能够作用于所述底物的，以及能除去底物或在可用的底物库中改变底物可用性的酶。一般性总的综述方法和初级与次级代谢的关系如图1中所示。使用异源酶活性来改变次级代谢途径中的产物流程可引起所要求的靶次级代谢物的修饰。这改变了次级代谢途径中的产物流程，引起所要求的靶次级代谢物的修饰。这样的话，次级代谢途径中的某种酶促步骤的终产物的水平就会降低，然而，相反地，途径中其它步骤的产物累积到一个高的水平，就会抑制负责所述产物产生的酶。这种反馈抑制反过来影响整个次级代谢途径中最终的终产物的产生。通过引入可改变途径中生化产物(例如，其中的底物和产物)的新型的酶，可获得特异的次级代谢途径中产物水平的变化。异源的酶已在植物的组织中得到了表达，将这些途径中的前体代谢转换成在植物细胞中积累但又无有害作用的底物。

在一些实施方案中，形成对植物细胞有价值的产物或具有有益作用的产物是此方法的结果。

在一个实施方案中，然后，将靶定的前体用加入的新型的酶活性加以修饰。本发明的一个优选方面构思了选择一种具有与植物细胞异源的并在其中表达活性的酶。例如这是植物细胞中不与所讨论的次级代谢途径正常相关的一种酶。使用的酶可以是植物的、动物的或微生物来源的，它可以被修饰以便在植物细胞中正确表达。所选择的异源酶能够修饰前体来改变它用以形成次级代谢物的可用性。通过使用一种在植物细胞中表达的与该细胞异源的酶活性，可绕过正常的生化调控机制并按照预想的方式改变次级代谢。本发明领域中一个特殊的目的是修饰与糖醇以及类苯丙酸次级代谢途径相关的次级代谢途径的产物。

利用本方法的另一个实施例是改变修饰的糖化合物(如半乳糖)和损营养性的蔗糖糖苷(如水苏糖以及棉子糖)的水平。半乳糖转化成半乳糖醇，它是形成这些损营养性的蔗糖糖苷的前体之一。半乳糖的前体形式是称为UDP-半乳糖的接合形式。作为本发明中构思的一种方法，可利用与植物细胞异源的酶活性，即所述的能够改变UDP-半乳糖水平的酶来阻止UDP-半乳糖(随后转变成半乳糖醇)的形成和累积。UDP-半乳糖4-差向异构酶(galE)参与生物系统中半乳糖代谢的主要步骤之一。它催化UDP-半乳糖到UDP-葡萄糖的转换。可采用人、酵母和细菌中这个酶的基因。在本发明中，考虑使用细菌编码的酶。

作为在植物细胞中表达这个异源酶的结果，将会降低UDP-半乳糖的可用性，而产生有益的化合物UDP-葡萄糖。完全相信UDP-半乳糖4-差向异构酶的表达将可引起半乳糖醇生物合成的减少，它是损营养性的蔗糖糖苷的前体之一。除降低不希望的蔗糖糖苷的积累速率之外，这种新引入的酶活性会导致UDP-葡萄糖可用性增强以及后续的蔗糖的形成。后者预期将参与或增强其它的代谢途径，其中蔗糖是增强植物生产力的碳源(例如，蛋白质、脂质、总产量)或直接作为蔗糖积累都是必需的。

还可预期，在本发明范围之内此方法还具有其它应用。它可能会通过利用葡糖磷酸变位酶(pgm)来改变多种糖衍生物如葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸的水平。这种酶在蔗糖的合成与消耗中催化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸(G-1-P，G-6-P)的相互转化。这种酶在蔗糖、淀粉和糖原的合成与利用中起着关键的作用，并存在与所有的生物。多种真核生物来源的以及细菌来源(例如，土壤杆菌属(Agrobacterium))的酶的基因都是可以使用的。

G-6-P是许多糖相互转化的重要的起始材料，其中之一是肌醇-1-磷酸的合成。后者分别是肌醇六磷酸和损营养性蔗糖糖苷合成的重要底物和辅因子。可以预想，酶的表达将降低G-6-P的水平，其将转变为以上提及的损营养性因子较低的水平。因此，本发明范围之内可构思的多种代谢的改变。

此方法不局限于任何特殊的次级代谢途径。此方法也从不仅限于任何特殊的植物物种。当然，此方法可应用于改变许多有商业价值的作物物种中普遍存在的次级代谢途径，包括单子叶植物和双子叶植物，或针对一个对特定作物具有独特意义的次级代谢物。

本发明的方法的生化基础是建立在通过底物可用性调节酶促活性的观念之上的。一般，酶速率受底物可用性的影响。换句话说，酶可以与可用的底物量成比例的速率来生产产物。底物浓度的降低会引起产物水平的减少。而且，许多酶都是受终产物抑制的，也就意味着，在终产物大量过剩的情况下，酶促速率就会降低。因此，通过改变可用的底物或酶促产品的水平，可使生化途径产生的化合物的总量得到改变。

可通过本发明改变的次级代谢途径的实例包括类异戊二烯生物合成、生物碱生物合成、类萜生物合成、酚的生物合成、糖醇的生物合成，或任何产生损营养性或具商业价值性化合物的其它次级代谢途径。能够被本发明调节的特定次级代谢物包括损营养性的酚类化合物，如十字花科植物中的芥子碱或芥子油苷、糖醇产物如肌醇六磷酸或水苏糖和棉子糖、棉花中的棉酚、烟碱、绿原酸、缩合鞣质或其它的损营养性次级代谢物。化合物绿原酸在大豆、棉花、向日葵中普遍存在，它是由咖啡酸，一种类苯丙酸途径中产生的化合物衍生而来的。其它的损营养性化合物还包括皂苷类化合物，许多植物包括苜蓿中发现的损营养性化合物。皂苷类化合物是高分子量的糖苷，它是由连接于三萜或类固醇糖苷配基的糖部分所组成。至少有三种已知的皂苷类化合物，三萜糖苷、类固醇糖苷以及类固醇生物碱糖苷。植物中皂苷类化合物的生物合成包括起始材料鲨烯。其它重要的次级代谢物的种类，例如，植物甾醇、强心苷、葫芦素、苦木素醇和limonides也是由鲨烯衍生的。动物饮食中过剩的皂苷类化合物与已知为气胀病的情况相关。

通过在一些无相互关系的次级代谢途径中使用此方法的实证可例证本发明。然而，将此方法应用于修饰任何植物次级代谢途径，对熟练的技术人员来说是显然的，且规定了施行本发明的常规方法。

在一个实施方案中，本发明提供了用于改变植物中芥子碱成分和相关的酚类化合物的方法和DNA组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了改变了酚类含量的植物细胞以及具有减少了酚类含量的植物种子，特别是具有减少了芥子碱含量的十字花科植物。在另一个实施方案中，本发明提供了用于改变植物细胞中糖醇次级代谢途径中的一种产物肌醇六磷酸含量的方法和DNA组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了改变了肌醇六磷酸含量的植物细胞以及具有减少了肌醇六磷酸的植物种子。在另一个实施方案中，本发明提供了适用于饲料应用的具有减少了肌醇六磷酸含量的植物种子，适用于制备改性粉的具有减少了肌醇六磷酸含量的植物种子以及具有修饰的糖醇(肌醇)代谢的植物细胞。

植物中的每一个次级代谢途径都是与一定量的酶以及对这些酶特异的或以特异的方式使用的底物相关联的。次级代谢途径可以产生在整个植物中使用或存在的多种化合物。那么，作为改变次级代谢的手段，可将独特的酶活性用于特异性改变特定途径中的化合物流程。为了提供应用此方法的例证，根据本发明中的方法修饰两条截然不同的次级代谢途径。以下将提供有助于完全理解此方法性质的这些途径方面的资料。(A)类苯丙酸代谢的次级代谢途径

植物通过类苯丙酸这一次级代谢途径产生多种酚类化合物。类苯丙酸途径与植物中的多种生理过程相牵连，包括疾病抵抗力、UV光保护和植物生长调节。这个途径的产物是木栓质和木质素生物合成所需求的，木栓质和木质素是植物组织的组成成分，并参与植物纤维的形成，这是涉及种子或种子粉中代谢不足(under-metabolized)的碳水化合物的普通术语。认为木质素参与不可溶性纤维的形成，因此，种子或粉中高水平的木质素与粉或种子的低效利用相关，尤其在单胃动物中。因此，可以认为植物酚，尤其是木质素的酚前体是动物饲养的损营养性因子；植物酚，尤其是木质素形成中所使用的酚的减少或适量的变化，可以提供一种优质的粉。

植物酚还参与多种其它化合物的形成，其中的一些本质上也是损营养性的。

本发明提供了一种减少用作饲料的植物细胞、种子或粉中被认为是损营养性的特异酚类化合物的手段。特别地，本发明构思了在产生芥子碱(或芥子酸胆碱)的细胞中降低这种苦味的损营养性化合物。还认为在粉中，芥子碱与蛋白质形成复合体，降低了动物消化和利用蛋白质的可用性。苦味也影响进食水平。另外，当喂养一些产棕色壳鸡蛋的母鸡品系时，芥子碱将导致鸡蛋中的一种不受欢迎的腥臭气味。在这些情形下，含有芥子碱的粉比例必须保持低于约10％。这限制了含芥子碱粉在这些饲料配制中的使用。因此，降低十字花科植物的种子或种子粉中的芥子碱是一个重要的商业目标。

芥子碱的产生作为类苯丙酸途径的延伸反应出现。本发明范围之内详细说明的途径包括导致芥子酸形成的生化途径以及从多个步骤分支来的生化途径，例如，导致木质素单体和其它的由类苯丙酸途径的产物衍生的生化产物形成的分支途径。

在类苯丙酸途径中，L-苯丙氨酸，一种芳香族氨基酸是苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)的底物。PAL酶促活性导致肉桂酸-4-羟化酶(C4H)的底物肉桂酸的合成。C4H的产物是p-肉桂酸，它是多种类黄酮化合物的前体，其中一些也可在酪氨酸氨裂合酶(TAL)的作用下，由L-酪氨酸形成的。肉桂酸也可作为木质素生物合成的前体。P-肉桂酸-3-羟化酶(C3H)作用于p-肉桂酸产生咖啡酸。咖啡酸通过咖啡酸／5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶(OMT)代谢生成阿魏酸。阿魏酸是三种已知的用于木质素生物合成的初级酚单体中的一种。阿魏酸还是生成5-羟基阿魏酸的阿魏酸-5-羟化酶(F5H)的底物，它可被OMT酶进一步修饰成芥子酸。芥子酸是另一个主要的酚类木质素单体。芥子酸也可通过UDP-葡萄糖芥子酰(sinapoyl)转移酶(SGT)的作用结合形成芥子酰葡萄糖。芥子酰葡萄糖是芥子酰葡萄糖：胆碱芥子酰转移酶(SCT)的底物，这种酶可导致芥子酰胆碱或芥子碱的形成。这后来的两步在十字花科植物中是普遍存在的，在芸苔属中，种子中的芥子碱的积累代表着成熟种子里主要的非聚合酚类化合物。图2表示类苯丙酸代谢的一般途径。应该注意的是另外的酶促活性可能是某些植物物种中类苯丙酸途径的一部分。

芥子碱或芥子酰胆碱是十字花科植物种子中最为丰富的酚类化合物，在B．napus中，它能占到粉中的4％(Blair和Reichert，1984，科学食物农业杂志(J．Sci．Food Agric．)35：29．)。芥子碱的合成发生在外表看来还是淡绿色的非成熟的种子中，并且似乎当种子成熟时也没有净降解(Vogt等人，1993．，生物化学生物物理学文献(Arch．Biochem．Biophys．)300：622．)。发育中的种子(即，萌发的种子)可通过产生芥子酸和胆碱的酯酶反应降解芥子碱。已经假定，但是还没有证实，芥子碱的降解可以提供种子萌发期间类苯丙酸合成所使用的胆碱(Strack等人，1981．，Z．Naturforsch．36c：215)。然而，大多数非十字花科植物的种子中不含有芥子碱，芥子碱就不象是一种普遍存在的、种子发育和萌发所必需的化合物。

已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离得到常规类苯丙酸途径中缺损的突变型(Chapple等人，1992．，植物细胞(The Plant Cell)4：1413-1424)。这些突变体提供了用于生理的、生化的和遗传研究的优秀框架，因为突变的负结果，它们没有任何农艺学价值，因为整个植物中尤其是在叶片中，突变表型的表现会引起植物对紫外线超敏感。这些称为SIN1的突变体(芥子酰苹果酸生物合成突变体)阻碍芥子酸酯的合成，降低芥子碱(芥子酰-胆碱酯)的含量，并且进一步改变植物木质素的单体成分。木质素含量的改变可产生具有独特木质素成分，并因此而改变了植物纤维的植物。

Chapple等人进一步讨论使用如SIN1这些突变型来降低木质素含量或改变重要的十字花科植物种子(如canola种子)中木质素组成的可能性，但是没有如何能够实现的指导性方法。进一步预期canola种子中芥子碱的降低是一个主要的目标，但是在如何用SIN1突变实现这一目标方面没有任何指导方向。假如SIN1突变型具有明显的UV敏感性，这个突变在农业条件下就几乎没有任何使用价值。尽管本领域中还没有描述降低种子中芥子碱含量的方法，SIN1突变提供了芥子碱不是植物生长和发育所必需的组合物，并且具有减少了芥子碱的种子能够生长和发育这一重要的、科学的证据。但是，SIN1突变没有提供不与有害的UV敏感性相关的、商业上可生产具有降低的芥子碱含量的十字花科植物种子的方法。

除损营养性的酚类化合物如芥子碱之外，还有许多类苯丙酸途径中的产物参与木质素的形成。木质素的生物合成是常规的类苯丙酸途径的一部分，这个途径至少产生三种酚类前体，对羟基桂皮酸、阿魏酸、芥子酸，它们的产物聚合成木质素和其它的酚类化合物。

由这些前体形成木质素的生物化学是非常复杂的，有许多其它的酶参与，例如，咖啡酸-5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶(COMT)、咖啡酰-CoA-还原酶(CCoAOMT)、肉桂基醇脱氢酶(CAD)、肉桂酰-CoA-还原酶(CCR)、过氧化物酶、4-香豆酸：CoA连接酶(4CL)以及松柏苷特异的β-葡糖醛酸糖苷酶(CBG)。其它可能参与的酶以及木质素形成的完整的生物化学还不是完全清楚。

木质素是一种复合多聚体，主要由这些单体的酚单元以不同的比例相互连接而成的，在不同的细胞型以及在不同的物种还具有不同的连接方式。木质素是植物细胞壁中重要的组成成分，那里的组织要求机械强度或参与水的传导。另外，还认为木质素参与抵抗病原体的机制。双子叶植物中普遍存在的是邻甲氧苯基-丁香基木质素，它是由阿魏酸衍生的邻甲氧苯基单位与芥子酸衍生的丁香基残基所组成的。因此，芥子酸和阿魏酸都是野生型木质素形成所必需的。认为木材的降解性和加工性能，例如，在制成纸浆的时候，高度依赖于木质素的单体组成成分，而这主要根据特定木质素单体的可用性。可以认为芥子酰-衍生的丁香基木质素中5-O-甲基基团的存在可降低交联，从而使得主要由丁香基单元组成的木质素比主要由阿魏酸衍生的邻甲氧苯基单元组成的木质素易于加工。因此，增加丁香基木质素含量的方法可使得粉更易消化，因为木质素交联的减少。

饲料作物的可消化性受纤维量的影响，因为交联的木质素可抵抗降解并将细胞壁组分整体物理连接在一起。

从上述内容明显看出，任何想通过降低或消除芥子碱和改变总酚类含量的改进种子粉的尝试都应该靶定于发育中的种子。对于在种子中特异性改变芥子碱合成的适宜的生化途径，最为合适的是分子遗传学的方法，因为生殖质的缺乏可自然地造成低芥子碱的特性。

在一个实施方案中，本发明陈述了一种改变种子中酚类化合物水平并进一步改变芥子酸与相关酚类化合物水平的方法。此方法依据的是新的酶促活性的引入，它们影响那些用作类苯丙酸途径中酶的前体和底物的化合物的可用性。这些化合物丰度的减少和变化会导致正常途径中的生化转变以及产生具有变化水平的多种类苯丙酸产物。

作为此方法的一个实施例，采用一种新型的酶促活性，胆碱氧化酶(COX)来减少植物细胞中，尤其是植物种子中的胆碱库。在除了其它情况之外，胆碱用于由芥子酰葡萄糖产生芥子碱。胆碱库的减少将引起芥子碱前体(胆碱和芥子酰葡萄糖)库水平的改变，因此改变类苯丙酸途径的前期酶促步骤中形成的前体(包括芥子酸)的组成。结果是种子中的芥子碱含量大量减少，酚类含量也有所改变。已知胆碱氧化酶可将胆碱氧化产生过氧化氢。植物细胞中产生过氧化氢被认为是有益的，并因此对植物中表达胆碱氧化酶也具有另外的益处。作为此方法另一个方面的例证，又一个酶活性甜菜醛脱氢酶(BADH)被用于增强胆碱氧化酶的产物甜菜醛转换成甜菜碱，它具有应激保护物的功能。化合物甜菜碱是对食品工业中多种应用有价值的化合物，并且可作为增强植物生长的一种添加剂。

因此，通过降低类苯丙酸途径中单一的前体可显示出改变了植物细胞中酚类含量的有利结果，以及芥子碱的特异性降低。对于本领域的技术人员，很显然使用此方法范围之内的其它酶可改变类苯丙酸途径中的多种其它终产物。

本发明范围之内的另一个实施例是用新型酶活性降解也是在类苯丙酸途径中形成的阿魏酸。作为三种主要的木质素单体，认为阿魏酸通过交联戊糖链、阿拉伯木聚糖、半纤维素赋予细胞壁结构构造上的刚性和强度，使得细胞壁更加坚硬，以及使之对酶促降解不甚敏感。因此，作为木质素的组分，阿魏酸在植物组织的机械强度方面具有重要的作用。以一种特异的方式改变阿魏酸的水平将会导致一些有益的的结果。

如上所述，阿魏酸在总类苯丙酸途径中合成，它是这个途径中多种产物的前体(在JPN Rosazza等人，工业微生物杂志(Journal ofIndustrial Microbiology)15：457-471，1995；R Whetten和RSederoff，植物细胞(Plant Cell)7：1001-1013，1995；RD Dixon和NL Paiva，植物细胞7：1085-1097，1995中有综述)。

此方法提供一种通过改变阿魏酸的水平来调整类苯丙酸途径中的多种其它化合物，尤其是芥子碱的产生的方法。本发明的一个方面陈述改变植物细胞中阿魏酸水平的方法。此方法依据的是代谢阿魏酸的异源酶促活性的引入。一些这种酶还可产生商业上可用的化合物。例如，使用阿魏酸脱羧酶，生产化合物乙烯愈创木酚，它是一种可用作工业原料的化合物，并可在植物细胞中积累而无有害的结果。阿魏酸丰度的减少或变化会导致正常类苯丙酸途径中的生化转变以及产生具有变化水平的多种类苯丙酸产物。

根据本发明的方法不局限于类苯丙酸途径。作为本发明实用性的一个实施例，将例示产生糖醇的次级代谢途径的修饰。(B)糖醇代谢的次级代谢途径

本发明提供改变植物细胞中糖醇含量的方法和DNA组合物。作为本发明中此方法的应用结果，提供了改进的由糖醇衍生的化合物，例如，肌醇六磷酸、水苏糖、棉子糖、蔗糖糖苷、uronides和戊糖、磷酸肌醇和糖基磷酸神经酰胺(glycophosphoceramides)的植物细胞。结果，在本发明的一些实施例中获得了具有降低的肌醇六磷酸的植物种子。本发明还提供适用于饲料应用的具有降低的肌醇六磷酸含量的植物种子、适于制备改进粉的具有降低的肌醇六磷酸含量的植物种子以及修饰的肌醇代谢的植物细胞。本发明还改变了其它的由糖醇代谢衍生的化合物，包括损营养性的糖醇衍生化合物，例如，水苏糖和棉子糖。特别适用于饲料应用的是肌醇六磷酸含量有修饰的种子。

肌醇六磷酸是一般占2-4％种子质量的许多种子的重要成分，但在一些物种中也可达到10％。饲料配给中存在高水平的肌醇六磷酸与食欲的降低、胎仔数降低和其它负面性能因素有关。这些结果很可能是由于肌醇六磷酸的锌结合能力。肌醇六磷酸与其它种子成分的复合物一般称为肌醇六磷酸钙镁。高水平的肌醇六磷酸钙镁与负面作用也有着相似的联系。

除了饲料性能的破坏作用，饲料配方中存在肌醇六磷酸也会导致一些不受欢迎的环境后果。在单胃动物中，与肌醇六磷酸结合的磷通常是不能利用的，那么在通常的食物中必须添加磷，这就意味着增加成本。与肌醇六磷酸结合的磷被单胃动物排泄，后来通过微生物使粪便降解会导致将肌醇六磷酸中含有的磷释放到环境中。许多种子粉中高水平的肌醇六磷酸造成大量的排泄磷。不断增加的家畜产量也会导致水源的富营养化以及其它的与磷污染相关的环境问题。预料这些问题将会增加，并可能成为将来限制家畜产量的重要原因。那么降低排泄的肌醇六磷酸水平的方法将大大有益于改善这些环境问题。

尽管与在配料中添加磷相关的实际花费不占饲料费用的很大比例，但排泄磷的环境后果将产生很大的花费，而这些花费可通过生产低肌醇六磷酸粉加以避免。

在反刍动物中，瘤胃中微生物群的存在能够将肌醇六磷酸中含有的磷释放出来，因此，磷就变得更加可用。结果，瘤胃动物配给中所加入磷的量与单胃动物相比大大降低。但是，大多数植物种子中肌醇六磷酸的量超过实际所要求的，那么即使是在反刍动物中，磷污染也是一个主要问题。

迄今为止，构思的用以减少肌醇六磷酸的主要方法都是利用粉中含有的肌醇六磷酸酶的作用降解肌醇六磷酸。尽管这种方法可产生较高的磷可用性，但它没有虑及生产具有降低肌醇六磷酸含量的植物种子和粉，只有肌醇六磷酸含有磷的粉才是一般情况下更为可用的。因此，只有在使得肌醇六磷酸中的磷更为可用时，肌醇六磷酸酶的使用才有实用性。

肌醇六磷酸酶在微生物中是普遍存在的，例如霉菌(曲霉属(Aspergillis))、细菌(芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas))以及酵母(酵母属(Saccharomyces))。用含有微生物肌醇六磷酸酶的酶混合物处理植物材料来去除肌醇六磷酸在美国专利No．5，554，399的实施例中有描述。大多数微生物合成一些肌醇六磷酸酶活性，其中除进一步降解肌醇六磷酸的多种磷酸酶外，可能还包括本身的肌醇六磷酸酶活性。从肌醇六磷酸完全释放可用的磷可能依赖于一些不同的酶活性。

也已经描述了转化植物产生微生物肌醇六磷酸酶的可供选择的方法。US5，593，963描述了在包括那些既能够指挥组成型表达又可命令在一定时期或以组织特异的方式表达的调控序列控制之下，转基因植物中的肌醇六磷酸酶的表达。可以产生含有能够释放包含在肌醇六磷酸中的一部分磷的具有肌醇六磷酸酶活性的植物细胞，或更特别的，植物种子细胞。

但是，仅仅是从肌醇六磷酸简单地释放磷还不能完全解决降低磷浪费以及肌醇六磷酸的潜在损营养性作用的问题。更为重要的是复合的肌醇六磷酸或肌醇六磷酸根的存在没有减少。本领域已公布的技术提供了从肌醇六磷酸释放磷的手段，但是没有提供控制产生的肌醇六磷酸水平的方法。

任何能够用来便利地操作肌醇六磷酸水平的方法都将在饲料应用上有很大的用途。例如，具有降低肌醇六磷酸水平的植物种子能够提供一种有着更大矿物可用性的粉。具有降低的肌醇六磷酸的植物种子也将提供具有减少的肌醇六磷酸钙镁的种子粉，因而由于肌醇六磷酸复合物的减少而变得更有营养、更易消化。

除了在粉的营养上有所改进以外，降低了肌醇六磷酸的粉将会降低释放到环境中的磷，减轻了污染。尽管从肌醇六磷酸释放磷的方法可以降低添加和排泄的磷水平，但是肌醇六磷酸的实际水平以及由此而来的潜在的可利用的磷在大多数动物中仍是超过了对磷营养的要求。

因此，操作肌醇六磷酸水平的方法在所有的饲料应用中会发现用处，并进一步提供新的和有价值的粉和饲料组合物。

考虑到这些，很明显在种子发育期间可以通过它而调节肌醇六磷酸产量的方法将会是有用的，并且提供解决与磷污染和与肌醇六磷酸损营养性效果相关的问题办法。另外，在大范围的植物物种中起作用的遗传机制也将是特别有价值的。本发明提供了这样的解决方案。

要理解本发明的范围需要掌握负责肌醇六磷酸形成的生化机理。尽管肌醇六磷酸的生物合成不是完全清楚，但是有一些已知的关键步骤。肌醇六磷酸是肌醇的六磷酸衍生物；合成肌醇六磷酸的生化途径中利用了肌醇，它是一种广泛用作起始底物的糖醇。这种化合物(肌醇，也普遍称为肌醇)对产生其它肌醇衍生物和差向异构体也是很重要的。一些这种衍生物，例如，蔗糖糖苷也是损营养性的化合物，因此也要求降低这些化合物。

肌醇是一种植物细胞中普遍存在的糖醇。但是任何一个糖醇羟基基团的简单保护都会使之不适用于肌醇六磷酸和其它途径的生物合成。通过多种甲基转移酶在特定位点的甲基化可以体内实现肌醇保护。例如，通过6位上的单甲基化作用可将肌醇转换为芒柄花醇(ononitol)。5位上的甲基化产生红杉醇，它是松醇的差向异构体。松醇不能用于肌醇六磷酸的生物合成。已知肌醇的甲基化衍生物可赋予植物有益的特征，例如协迫抗性，它们还参与溶质运输和稳定膜蛋白。因此，本发明的范围之内还构思了利用不与正常糖醇代谢途径相联系的异源酶活性来修饰肌醇。

肌醇六磷酸形成的生物化学不是完全了解的，但是，至少已知两个关于形成的潜在途径，似乎有一些不同的酶活性参与肌醇六磷酸的生物合成。在大多数植物组织中发现了肌醇六磷酸，然而在种子与花粉中，它特别普遍，这支持了在磷贮存中的预期作用。因此，通过传统手段设计一种修饰肌醇六磷酸生物合成的方法，尤其是因为没有完全了解它的形成的生物化学，已知是非常困难的。

为了将肌醇六磷酸的产量减到最少，本发明描述了方法和编码修饰肌醇并阻止肌醇六磷酸生物合成中肌醇利用的酶之DNA组合物。本发明构思了使用异源的甲基转移酶基因来特异性甲基化种子中的，尤其是种子中负责肌醇六磷酸生物合成的组织中的肌醇。(所谓异源是指不与所述的植物细胞中肌醇六磷酸生物合成正常相关的酶。)本发明利用盐生植物中获得的异源酶活性，这种酶活性在传统的作物例如玉米、大豆、棉花、苜蓿、小麦、大麦、黑麦、高粱、向日葵、芸苔属、油籽以及传统耕种的作物中没有发现。

由肌醇而来的甲基肌醇的生产还提供了更多的产生对植物细胞没有有害作用的无害化合物的益处。因此，通过降低可用的肌醇库，可降低肌醇六磷酸的产量。

肌醇六磷酸是种子粉中主要的损营养性因子之一。肌醇六磷酸的损营养性作用包括矿物结合、与蛋白质形成复合物以及其它负面的作用，尤其是那些与以肌醇六磷酸形式过量排泄磷相关的作用，它们在环境中代谢会产生磷污染。因此，降低植物细胞中肌醇六磷酸的方法在饲料应用中是有用的。水产养殖中，高肌醇六磷酸水平也是采用植物衍生的蛋白质代替青鱼粉使用中的一个问题。因此，降低植物细胞中，尤其是用作动物饲料的植物组织的细胞中肌醇六磷酸含量的方法，将是有价值的，并具有广泛的用途。降低大范围的用作动物饲料的植物物种的种子中肌醇六磷酸含量的方法，在饲料工业中是非常有价值的。

已经从Mesembryanthemum crystallinum(冰植物)分离到编码肌醇-O-甲基转移酶(IMT)的植物基因，这种酶能够在异源的转基因植物中将肌醇转化为松醇(美国专利No．5，563，324)。这个植物基因已经置于组成型启动子的控制下，其目的是通过肌醇、甲基化衍生物芒柄花醇(其随后会差向异构成松醇)的生产过剩来增加植物中的协迫耐受。本发明中，这种植物基因置于种子选择性启动子的控制下，以改变种子中的肌醇代谢。

美国专利No．5，563，324中描述的松醇的产生，当在整个转基因烟草中组成型表达时，表现出赋予了对盐的耐受。相似地，细菌甘露醇1-磷酸脱氢酶的表达，当在植物细胞中组成型表达时，催化了甘露醇(这是一种糖醇或多元醇)的产生，可以使得植物细胞对盐逆境产生抵抗。因此，美国专利No．5，563，324描述了利用能够由植物细胞所固有的糖来产生糖醇的一种酶产生糖醇，作为一种使得植物细胞呈现出盐耐受的手段。

然而，美国专利No．5，563，324没有提供关于利用能够修饰肌醇以阻止肌醇作为合成包括天然衍生物的其它化合物的基因的任何指导。但是美国专利No．5，563，324提供了明确的证据，肌醇的修饰不引起任何对植物负面的结果，因此肌醇水平的操作将不会产生有害的结果。

因此，用甲基转移酶基因修饰肌醇的可能性预期对植物细胞无害，已知这种酶促反应的甲基化产物对植物细胞是无害的。

但是，肌醇对植物生长和发育的许多不同的方面是重要的。除了它作为肌醇六磷酸生物合成的前体之外，肌醇还用于uronide和戊糖生物合成，它还存在于植物细胞壁膜的磷酸肌醇中，以及包括糖基磷酸神经酰胺的其它的复合植物脂质。而且，它还是其它的自然产生的肌醇异构体的前体，其中许多以及肌醇在整个植物界中都是以物种特异的模式以甲基酯的形式分布的。

在一般植物代谢中，肌醇具有重要的作用，肌醇库的修饰将具有无法预料的结果，尤其是在农艺学的生长条件下。尽管美国专利No．5，563，324描述了甲基转移酶基因的组成型表达，但没有提供任何生成的植物具有实用性的证据。在美国专利No．5，563，324中指出，“即使刚刚插入的基因不产生在农业条件下具有更好性能的植物，携带这些基因的转基因植物对于调查植物内部的过程(如渗透调节)是如何影响植物的田间性能方面是有用的。”2栏，60-65行)。因此，美国专利No．5，563，324未预见用于降低肌醇六磷酸的肌醇水平的操作，或者充分预期具有有用的农艺学特性的植物，所以效用由此处所包括的教导产生。于是，美国专利No．5，563，324描述了在整个植物中表达肌醇修饰基因，其目的是用于协迫耐受或进一步的科学研究。

因此，完全可以认为，本发明讲授了降低肌醇六磷酸的一种新的方法。甲基转移酶基因的使用对肌醇六磷酸的降低是特异的。本发明不依赖于本领域中已有的方法，例如，不能用来对付种子和／或种子粉中过量的肌醇六磷酸问题的肌醇六磷酸酶的表达。在此处进行的工作期间，发现通过改变能够用于肌醇六磷酸生物合成的肌醇水平，可以控制肌醇六磷酸的水平。发现在种子组织中表达甲基转移酶基因将导致种子中肌醇六磷酸的降低，而植物的其它特性则没有可见的改变。显而易见，限定在负责肌醇六磷酸生物合成的种子组织中表达甲基转移酶基因，可大大降低成熟种子中的肌醇六磷酸，甚至是在环境极端的田间条件下，同时对植物也没有其它的影响。使用组织选择性启动子对本领域技术大有好处，其中包括将酶活性限定在种子组织而保证其它的组织中的肌醇代谢不受影响。

本发明的目的是转变肌醇作为肌醇六磷酸生物合成的起始材料的利用，是将之转移到它被转变为对植物无害的化合物的代谢库中。此方法依据新型酶活性的引入，包括实施方案中的消耗或改变用来产生肌醇六磷酸的肌醇库的甲基转移酶基因。消耗或改变这种前体的水平将导致正常肌醇六磷酸生物合成途径中的生化转变，以及引起所产生的肌醇六磷酸水平的降低。

本发明的生化原理是以底物的可用性可调节酶活性这一概念为基础的。一般地，酶促速率由底物的可用性控制。一般情况下，酶将以与可利用的底物量成比例的速率来生产某种产物。底物浓度的减少导致终产物水平的降低。

因此，本发明利用这种方法，使用新型的甲基转移酶酶活性来消耗用于形成肌醇六磷酸的肌醇的可用性。在本发明范围中许多能够作用于植物种子中肌醇库的酶都将得到利用。此方法依据一种引入的酶促活性，它能够以多种不同的方式，改变用于肌醇六磷酸生物合成的肌醇库。

与美国专利No．5，563，324相反，本发明追求通过表达能够修饰肌醇以致使它们不能用于肌醇六磷酸产生的基因，以种子选择性的方式来改变肌醇六磷酸的产生。令人惊讶地，甚至是肌醇修饰基因的组成型表达也会导致种子中的肌醇六磷酸水平降低。然而，在本发明的大多数优选的实施方案中，将采用种子选择性启动子以确保植物的农艺学性能不是某种妥协，而最终的植物在各种方式中(除种子中的肌醇六磷酸水平降低之外)都是正常的。因此，与美国专利No．5，563，324相反，本发明不期望产生协迫耐受的植物，也不将植物用作研究目的。

所描述的方法对涉及通过表达肌醇六磷酸酶降低肌醇六磷酸的本领域技术赋予诸多好处。这些包括在特定组织中改变了肌醇六磷酸水平的植物、具有降低的肌醇六磷酸水平的种子的植物以及具有降低的肌醇六磷酸种子粉。这种植物、种子和粉的益处包括较好的饲料利用以及粉性能、降低了磷水平的粉和饲料制备以及由此而来的较好的环境特性，和在以前受粉和种子中损营养性肌醇六磷酸量限制的饲料工业应用中使用所述的粉的能力。

所描述的方法在许多植物物种中都是有用的。这些植物物种包括单子叶植物和双子叶植物，以及谷类和油料种子作物。此方法在油籽油菜和十字花科植物中特别有用。

这种遗传修饰的结果是植物细胞中发生糖醇代谢的改变，尤其是肌醇代谢，以及植物细胞具有降低的肌醇六磷酸含量，尤其是在植物种子中的肌醇六磷酸含量降低。因此，本发明的此方法提供了改变与糖醇有关的次级代谢的一种有价值的手段。

尽管涉及糖醇代谢的改变，例如具有降低的肌醇六磷酸含量的植物细胞的本发明的实施方案已经在canola植物细胞中得到了证实，但玉米植物也具有高浓度的肌醇六磷酸，在玉米细胞中肌醇六磷酸含量的降低也同样做得到。

本发明提供了用于改变植物细胞和种子中肌醇六磷酸含量，尤其是降低植物细胞中肌醇六磷酸水平的方法、遗传构建体和载体。本发明进一步提供了用于降低植物种子中肌醇六磷酸的方法和DNA组合物。本发明进一步涉及修饰的种子粉以及含有修饰的种子粉的动物饲料，尤其是具有降低的肌醇六磷酸含量的种子粉。

利用刚刚描述的方法和DNA组合物可将肌醇六磷酸降低。此方法包括“代谢支路”或新的生化途径的形成，其能够将肌醇六磷酸生物合成途径中的前体转移到一种新的或新引入的降低肌醇六磷酸产生的“盲端途径”。作为此方法的一个特定实施方案的结果，“盲端途径”的产物是公知的对所述的植物细胞无害的化合物。因此，完全可以认为前体肌醇化合物转向成这些化合物将不以任何方式调和植物的性能。

依照本发明的另一个方面，提供了载体和重组的DNA构建体，用来生产具有改变的肌醇六磷酸含量的植物种子，尤其是具有降低的肌醇六磷酸含量的植物种子。另外，本发明的另一方面提供了用于生产具有降低的肌醇六磷酸含量的种子粉的植物种子。所述的种子粉具有降低的肌醇六磷酸水平，因此可用于动物饲料，尤其是用于在那些肌醇六磷酸与环境污染相联系的或肌醇六磷酸已被鉴定为损营养性因子的应用中。本发明还提供由遗传改造的种子衍生的修饰的粉，它能够用于多种动物的日常饮食中，包括家禽、猪、牛以及鱼。

此方法包括能够改变种子中肌醇含量并能够直接应用于所有植物物种和品种的新型酶促活性的添加。因为肌醇的变化在任何植物物种中以同样的方式发生，所以相同的基因可在任何植物物种中使用。此方法不依赖于基因抑制技术的使用，这些技术由DNA序列决定，因此需要特异地为每个特定基因或作物物种特制基因。由此，本发明在所有作物中的实用性是显而易见的。此方法范围之内可以使用微生物、植物或动物来源的多种适合的酶。相同的遗传构建体可在多种不同的植物物种中使用。

与本发明的方面广泛相一致，提供了降低植物种子中肌醇六磷酸含量的方法，包括植物转基因载体的构建，其中除了含有允许鉴定植物细胞是否被所述的载体转化的可选择标记外，还含有一种能够代谢肌醇，使得肌醇不适用于肌醇六磷酸产生的酶。

本发明的上下文中，肌醇的代谢作用包括羟基化、异构化、甲基化、切割，或其它的生化修饰，使得肌醇不再能被正常情况下作用于肌醇使之变成肌醇六磷酸的相应的酶促活性作用。于是，代谢作用包括任何有效地将用于肌醇六磷酸生物合成的可利用的底物库中肌醇的可用性降低的修饰。

作为本发明的一个实施例，使用编码肌醇甲基转移酶的基因例证本发明的一个方面。所述的受启动子控制、在植物种子细胞中选择性表达的酶能够消耗可用于所述的植物细胞中肌醇六磷酸产生的肌醇库。与本发明的另一个方面相一致，所述的甲基转移酶能够将肌醇转化为无害的物质。

根据本发明的方法产生的植物细胞具有不曾改变的初级代谢，除了如预期中的特定次级代谢途径中某种产物或某些产物得到改变以外，具有与未经修饰的植物无区别的表型。

为了确保初级代谢不受影响，本发明描述了一种以组织特异的方式，通过改变对次级代谢途径特异的且对该途径的终产物形成致关重要的底物，尤其是终产物形成的第一到第五个生化步骤中的那些底物的可用性的、靶定于次级代谢物形成的方法。这样，就可实现降低次级代谢途径中的特定产物。

本发明的上下文中，用作类苯丙酸次级代谢途径的产物前体的化合物包括但又不只限于：肉桂酸、对羟基桂皮酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羟基阿魏酸、芥子酸、胆碱、多种芥子基化合物，包括但不限于芥子酰葡萄糖、芥子酰苹果酸和芥子碱。本发明的上下文中，类苯丙酸次级代谢途径的产物包括但又不只限于：类黄酮化合物、木质素、多种单体的和聚合的酚类化合物和芥子碱。通过选择特异的酶可实现许多类苯丙酸途径中的产物水平的改变。用来修饰或靶定用作前体的化合物的酶可以是微生物来源的、动物来源的或植物来源的。酶可以是自然产生的或是由公知的酶突变衍生而来的，改变了酶的底物特异性，因此产生了新的酶活性。

在本发明范围之内使用的酶是那些能够通过异构化、接合作用、磷酸化、羟基化、氧化、脱氢化、甲基化或其它类似的生化活性(包括结合和鳌合)来修饰用作类苯丙酸途径中发现的产物之前体化合物的酶，或者还可包括能够破坏用作类苯丙酸途径中的前体化合物的酶，诸如水解酶、脱羧酶、氧化酶、酯酶或任何其它能降解L-苯丙氨酸、桂皮酸、对羟基桂皮酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羟基阿魏酸、芥子酸、芥子酰葡萄糖、芥子酰苹果酸或胆碱(用来由芥子酰葡萄糖产生芥子碱)的酶。此方法的一个方面，使用的是通过用作类苯丙酸途径中正常形成的产物前体的化合物来产生协迫抗性物质的酶。同样地，利用特定酶促活性降低另外的底物，可用来降低所述的产物水平，这种底物不是作为类苯丙酸途径的一部分而产生的，但它是类苯丙酸途径的产物形成所必需的。因此，两种用作类苯丙酸途径中前体的化合物以及任何其它的类苯丙酸途径所产生的产物所要求的化合物都可在本发明范围之内作为靶点。

本发明的上下文中，用作糖醇次级代谢途径产物的前体化合物包括但又不只限于：肌醇、半乳糖醇和糖的UDP衍生物。糖醇代谢的产物包括但又不只限于：肌醇六磷酸、水苏糖、棉子糖、蔗糖糖苷类、uronides和戊糖、磷酸肌醇类和糖基磷酸神经酰胺类。本发明的上下文中，用作改变糖醇代谢的化合物的酶包括那些具有羟基化、异构化、甲基化、切割或其它的生化修饰(包括结合和鳌合)能力的酶，使得糖醇不再能被正常情况下作用所述糖醇的相应的酶促活性作用。在本发明例证中的糖醇次级代谢途径内，将作为肌醇六磷酸前体的肌醇甲基化，可降低用于肌醇六磷酸生物合成的肌醇的可用性。

因此，对本领域的技术人员来说，很明显在一个次级代谢途径中终产物的前体是那些能够直接用于次级代谢物形成的生化产物，或那些在导致形成特异的次级代谢物的生化反应中使用的生化产物，所述的生化产物不是初级代谢物。

用来作用于或定位作为次级代谢途径中的产物前体的，优选由所述的化合物物质产生的那些化合物的酶，对植物细胞是无害的，因此，能积累到一个高的水平但不会改变植物细胞的性质。这种酶也可能产生对植物细胞具有有益作用的物质，例如，由用作次级代谢途径中产物前体的所述化合物而来的应激保护的产生。所使用的酶还可能产生有用的物质，例如，工业化学药品、药用的或营养用(nutraceutical)物质。可在本发明的范围之内使用一种或多种酶，可以使用不止一种的不同活性来降低用作次级代谢途径中产物前体的特定化合物的水平。

本发明上下文中所使用的酶可以由广泛的来源衍生，或通过多种手段获得。例如，熟练的技术人员能够，确定一个在本发明的范围之内用作次级代谢途径中前体的化合物的定位。这些化合物的化学结构是众所周知的，或可以确定的，因为酶的文献可以用来分析鉴定一个对化学上相似的底物具有已知活性的酶。因此，可以确定一个合适的酶以及本发明上下文中分离和使用的基因。另外，组合化学或探索人工产生的具有所要求活性蛋白质的类似的方案也可作为获得合成基因的依据。本发明范围内所使用的酶可用本领域公知的普通方法加以修饰。

作为酶修饰的一个实施例，可以通过使用位点特异性修饰、突变和在异源系统中(如细菌或真菌的细胞中)选择改变的特异性等技术，修饰和／或选择增加活性的编码能够作用于与次级代谢途径中用作前体的化学上相关的化合物的酶基因。这可包括在原来不能代谢所述的化合物的细菌细胞中，表达编码所述的改变的酶之基因，选择表达这种酶的以及能够以所述的化合物作为唯一营养或碳源生长的细菌细胞，回收能够作用于用作次级代谢途径前体的特异化合物的酶促活性。这样，有可能产生对用作次级代谢途径中前体的特异化合物具有特异性的酶。作为选择，细菌可以选择在用作次级代谢途径中前体的多种化合物上生长。熟练的技术人员可以容易地知晓突变的细菌或其它对在用作次级代谢途径中前体特异的化合物上生长的细胞的筛选，这将提供一种鉴定具有可将所述化合物转变为无害物质的特定酶促活性的方法。这种方法可包括特定酶促活性的直接选择或逐步的修饰，以及所要求的酶促活性的选择。

同样，商业上普遍使用的公知的酶促活性，例如，纸浆制造中使用能降解木质素的木霉属(Trichoderma)的真菌提取物制成的酶制剂，可以提供一个合适的酶活性的来源，如分离参与降解酚类化合物的酶。对于本领域熟练的技术人员来说，很显然编码在纸浆工业中用于木质素加工的酶的基因可以在此方法的范围中应用，或直接或是经过修饰，以便特异地作用于一个用作类苯丙酸途径中前体的化合物。因此，构思了许多不同的酶促活性可以在此方法的范围之内使用。所以，此方法不受所使用酶的来源或特异性限制。

例如，在此方法的一个方面中，植物细胞中表达的酶作用于一个用作类苯丙酸途径中产物的前体或底物的化合物，产生一种不再被这个正常情况下可利用所述的化合物作为类苯丙酸途径的前体的酶作用的物质。因此，可通过所述产物形成所需要的前体的减少来降低类苯丙酸途径的特定产物的水平。所得植物细胞可以直接使用或者这个细胞可被诱导再生成一个其中类苯丙酸途径的产物水平已经改变的完整植物，该植物在许多工业过程中有用，而不只局限于饲料应用、纸浆应用或具有新型酚类化合物组分，包括类苯丙酸途径中某种产物过量产生的植物生产。具有改变的类苯丙酸产物水平的树木在纸浆和造纸工业中大有用途。具有改变的类苯丙酸产物水平的植物在饲料工业中也是有用的。

此方法还依赖于具有改变特性的植物细胞或组织，尤其是依赖用于饲料应用或其它工业加工中的植物组织的回收和使用。很可能，本发明范围之内构思的类苯丙酸途径的变化会在由所述方法衍生的植物农艺学性能上引起积极的改变，尤其是本发明中由所加入的酶促活性而导致的应激保护能力的产生那些方面。预期其它有益的结果还包括增强的疾病和UV抵抗力，机械强度增强等等。

在本发明的进一步实施方案中，此方法包括培育所述的植物细胞，以及回收其中类苯丙酸途径的产物已经被改变的植物的步骤。

在本发明的又一实施方案中，本发明包括将所述的植物用于工业加工如有用化合物的生产、动物饲料制备或纸浆制造中。

编码能够作用于用作类苯丙酸途径中产物前体的化合物之酶基因可以是天然的、合成的或是二者的结合。熟练的技术人员将容易地知晓基因的编码序列可以被修饰，从而允许在植物细胞中高水平表达。这可通过改变密码子的序列，使之与基因被表达的植物细胞中所见的正常密码子用法更加相似这样的方法加以实现。而且，很显然，可将特定限制性酶切位点加以改造使之允许编码序列的便利操作。还构思了，多种序列的添加，如翻译增强子、内含子等可以用来确保编码序列的适当表达。还可以通过改变底物结合位点或其它对增强酶促活性的一级氨基酸序列的修饰来改造酶。所有这些操作在本领域中都是常见的，并为熟练的技术人员容易地掌握。

在本发明的另一个方面，酶是在组织选择性启动子控制之下的，更为特殊的是种子选择性启动子。种子选择性启动子是一种功能特定的或有优势偏好的启动子，使得在它控制下的序列表达局限在植物种子的组织中。因此，类苯丙酸途径的特定产物水平将以组织选择性的方式加以改变，而植物的其它组织中将具有正常水平的类苯丙酸途径产物。其中酶选择性表达的组织可用于饲料的制备或任何其它的工业过程。

对于熟练技术人员来说，很显然任何组织选择性启动子可在本发明范围之内使用。特别地，种子选择性启动子被用于改变种子或种子粉将用作饲料的作物中的类苯丙酸途径的产物。在其它作物中，可依据其中要求改变酚类含量的植物所占的比例，使用多种组织选择性启动子。例如，根或块茎选择性启动子可用来改变根或块茎作物如(马铃薯、芜菁、木薯等)的酚类或木质素含量。在那些叶和茎被用作饲料的情况中，可使用叶或茎选择性启动子来限制能够作用于用作类苯丙酸途径中前体化合物的酶的表达。其它组织选择性启动子也可在植物中使用，例如那些收获用来造纸浆的树木。因此，将酶活性限定到树木的木材部分中的启动子在本发明的范围之内也有用途。

在本发明的一个特定方面，构思了在植物细胞中表达胆碱代谢酶的编码序列。所述胆碱代谢酶的表达将消耗用于由芥子酰葡萄糖形成芥子碱的可用胆碱库。一些植物物种，特别是那些十字花科(Cruciferae)的那些植物产生称作芥子碱的损营养性化合物。据信芥子碱是通过与胆碱交换芥子酰葡萄糖(sin-glu)的葡萄糖部分来合成的。损营养性化合物芥子碱的减少增强种子以及由它们衍生的最终的粉的价值。胆碱修饰酶如胆碱氧化酶的使用在本发明中具有用途。

众所周知，胆碱在食物植物如小麦、菠菜、甜菜、大麦中被氧化成甜菜碱(Rhodes和Hanson，1993，植物生理学和植物分子生物学年鉴综述(Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology)，44：357-384)。这个氧化途径是由两种酶催化的(一般专有名词称作“胆碱氧化系统”)，这条途径的产物如下面所示：

胆碱→甜菜醛→甜菜碱(甜菜碱)

第一步在细菌或动物中是由胆碱脱氢酶(CDH)或胆碱氧化酶(COX)催化的(Rozwadowski，Khachatourians和Selvaraj，1991，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，173：472-478)，而在植物中是由胆碱单加氧酶(CMO)催化的(Rhodes和Hanson，1993)。第二步是由甜菜醛脱氢酶(BADH)催化的(Rhodes和Hanson，1993)。因此，使用胆碱代谢酶，通过使用组成型、可诱导的或组织特异的启动子，以一般的或特异的方式可消耗可用的胆碱库。胆碱可用性的降低减少了芥子碱的产生。另外，芥子碱的减少可引起类苯丙酸途径其它产物的水平变化，从而产生具有改变的酚类含量的植物组织。

本发明的另一个特定实施方案中，将微生物胆碱氧化酶(COX)基因置于种子选择性启动子控制之下(Rozwadowski，Khachatourians和Selvaraj，1991，细菌学杂志，173：472-478)。种子中胆碱氧化酶的表达将canola种子中芥子碱生物合成的前体之一的胆碱，通过在COX酶的活性作用下可缓慢转变成甜菜碱的甜菜醛形成，转化为一种无害的物质甜菜碱。包含重组DNA的植物种子具有降低的芥子碱的水平，和改变了的类苯丙酸途径其它产物水平。由所述种子衍生的粉在饲料应用中是有用的。

本发明的另一个特定实施方案中，COX基因在种子选择性启动子控制下使用，另一个酶BADH用来增加由甜菜醛而来的甜菜碱的合成。在这个实施方案中，BADH(Boyd，L．A．、L．Adam、L．E．Pelcher、A．Mchughen、R．Hirji和G．Selvaraji，1990，基因(Gene)103：45-52。)在种子选择性启动子控制下表达。甜菜碱是许多食物和饲料植物的可食部分中发现的一种化合物，在一些情况中，它可用作食物和饲料添加剂。甜菜碱还提供应激保护剂功能。

本发明的另一个特定实施方案中，COX基因在种子选择性启动子控制下，在十字花科植物细胞(芸苔属)中使用，也在种子选择性启动子控制下表达的另一种酶BADH用来确保由甜菜醛而来的甜菜碱的形成。

十字花科植物种子中胆碱的改变提供了芥子碱含量的减少以及类苯丙酸途径中多种产物的变化。完全可以相信，种子中胆碱水平的改变会导致较高水平的芥子酰葡萄糖或其它芥子酰基化合物如芥子酰基苹果酸，这将反过来改变木质素前体芥子酸的水平。因此实行一般称为终产物抑制的生化调节机制，这可导致类苯丙酸途径中多种产物水平的变化。因此，阻止芥子碱的形成可引起类苯丙酸途径中在芥子碱形成的最终步骤之前的多个步骤中形成的许多产物的水平发生变化。

次级代谢类苯丙酸途径也可通过在植物细胞中表达作用于阿魏酸的酶进行靶定。阿魏酸是类苯丙酸途径中的另一个前体。因此，阿魏酸的水平被降低。阿魏酸可用性的降低引起酚类化合物水平的变化，包括十字花科植物中芥子碱的降低。

编码能够作用于阿魏酸的酶的基因可以是天然的、合成的或是二者的结合。熟练的技术人员将容易地完全了解基因的编码序列可以被修饰从而允许在植物细胞中高水平表达。

根据本发明的另一个方面，将编码能够作用于阿魏酸的酶之基因置于组织选择性启动子的控制之下。因此，阿魏酸的水平以组织选择性的方式改变，但在植物的其它组织中维持正常的阿魏酸水平。酶选择性表达的组织可用在饲料的配制、食品配制及其它的工业过程中。

预计在本发明的这些实施方案中使用的酶包括那些能修饰阿魏酸的酶，尤其是那些公知的能由阿魏酸产生有用化合物的酶。对本领域熟练的技术人员，很显然可以使用此方法范围之内的其它的酶代谢阿魏酸。在以下微生物中发现已知的阿魏酸代谢活性：产气杆菌(Aerobacter sp．)属的种、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、肠杆菌属的种(Enterobacter sp．)、假单胞菌属的种、链霉(Streptomyces sp．)属的种、曲霉属的种(Aspergillis sp．)、假丝酵母属(Candida sp．)、镰胞霉属的种(Fusarium sp．)、(Hansenula sp．)、青霉属的种(Penicillumsp．)、(Rhodotorula sp．)、酵母属的种(Saccharomyces sp．)。这个清单不是没有遗漏的，而是用作例举本领域所发现的阿魏酸代谢酶的一些来源之用。那么，此方法不受用来代谢阿魏酸的酶的来源限制。在本发明范围之内，构思了改变微生物编码基因以确保植物细胞中的最佳表达。所述的方法在本领域是众所周知的。

作为这些酶的一个例子，使用短小芽孢杆菌(B．pumulis)中的阿魏酸脱羧酶。分离并测序这个酶的基因(Zago等人，应用环境微生物(Aoplied and Environment Microbiology)61：4484-4486，1995)。可以将基因序列修饰的更加类似植物基因，但是还保持着预期的氨基酸序列。这种酶可通过脱羧作用由阿魏酸产生乙烯基愈创木酚。于是，在此方法的一个实施例中，通过能够作用于阿魏酸的引入基因的活性，产生一个有价值的化合物(乙烯基愈创木酚，VG)。这种酶不要求另外的辅因子，具有一个约22千道尔顿(Kda)的表观分子量。

在本发明的另一个特定实施方案中，将阿魏酸脱羧酶置于组织选择性启动子的控制之下，产生一种含有在阿魏酸代谢中具有特异改变的组织的植物。

阿魏酸的改变使得阿魏酸含量降低，从而进一步改变类苯丙酸途径中的多种产物。

本发明还构思了植物组织的产生，尤其是在饲料或食品应用中有用的植物种子。不论是种子，还是使用加工的种子制成的修饰的粉的直接饲喂，都属于本发明的范围之内。植物种子酚类含量的降低在饲料应用中是希望的，酚类含量已改变，尤其是降低了损营养性酚类含量的经遗传修饰的种子在饲料工业将大有用途。

除了直接用完整的种子或部分破裂的种子饲养外，还有许多用于生产种子粉的方法。在十字花科植物种子中，最为重要的是在从十字花科植物的油料种子提取油时，粉的生产。一般地，使用溶剂或非溶剂的方法从油料种子中提取油。加工中产生的块状物或挤出的固体用来配制粉，通常含有十字花科植物种子中大多数的酚类含量。一种产生具有较低酚类含量的粉的方法提供一种新型组分，它没有在当前由十字花科植物种子衍生的粉中发现。

本发明预期利用依据此方法产生的经遗传修饰的种子，获得具有改变的酚类含量的粉产品。

所描述的方法对植物表型的改变大有益处。另外，此方法允许产生具有已知工业实用性的多种化合物。所描述的方法在任何植物物种或植物组织中都有用。

所描述的方法与涉及类苯丙酸途径的操作的已公布的技术相比具有许多优势。此方法不依赖于突变，例如，在整个植物中显现的SIN1突变且与UV敏感性有关。此方法不利用用来封闭基因表达的遗传机理，例如反义RNA或是类苯丙酸途径的植物基因的克隆所要求的共抑制。此方法不特异地修饰任何植物的天然基因。因此，此途径的多种功能如黄酮类化合物的产生、UV保护剂的产生、疾病反应的参与以及其它的此途径生化功能都没有有害的改变。利用组织选择性启动子，可在任意的组织中改变酚类含量，而植物的其它组织保持不变。

在许多植物物种中发现了所描述的方法的用途，但在十字花科植物中还发现了特殊的用途。作为此方法的结果，通过应激保护剂的产生或引入的酶活性所产生的有价值的工业化合物，提供了另外的好处。显而易见，类苯丙酸途径中许多步骤的任一个可以作为此方法的靶点，其它的生化途径也可用类似的方法修饰。

本发明在修饰其它的次级代谢途径中也有用。例如，在本发明的一个实施方案中，提供了产生具有改变的糖醇代谢的植物，尤其是改变种子细胞中的肌醇六磷酸含量的方法和DNA组合物。肌醇六磷酸是由糖醇肌醇衍生而来的，肌醇也是其它化合物包括水苏糖、棉子糖、蔗糖糖苷类、uronides和戊糖、磷酸肌醇类、糖基磷酸神经酰胺类形成的前体或中间物。本发明进一步提供降低十字花科植物种子中肌醇六磷酸含量的方法和DNA组合物。本发明还提供适用于饲料应用的具有降低的肌醇六磷酸含量的植物种子、适于制备改进的粉的具有降低的肌醇六磷酸含量的植物种子以及修饰的肌醇代谢的植物细胞。

本发明提供产生种子细胞中具有改变的肌醇六磷酸含量的植物的方法和DNA构建体。本发明进一步提供降低单子叶植物、双子叶植物、油料种子和十字花科植物种子中肌醇六磷酸含量的方法和DNA组合物。本发明还提供适用于饲料应用的具有降低的肌醇六磷酸含量的植物种子、适于制备改进的粉的具有降低的肌醇六磷酸含量的植物种子以及修饰的肌醇代谢的植物细胞。

本发明构思了编码作用于肌醇六磷酸生物合成的糖醇前体肌醇的酶基因的表达，这种酶能够引起这个前体转变为在植物细胞中可无害地积累的“盲端”或代谢不佳的化合物。这样，就实现了肌醇六磷酸生物合成的降低。其它的糖醇也可通过本发明中所描述的方法靶定。用来靶定肌醇的酶可以是微生物、动物或植物来源的。这种酶可以是天然发生的或是由已知的酶通过改变它的底物特异性而产生的新酶活性的方法衍生而来的。

用以作用于肌醇的酶优选地产生对植物细胞无害的化合物，因而可在细胞中积累到高的水平，但对植物细胞没有有害作用。在本发明的范围之内可以使用一种或多种酶，且可使用一种以上的不同活性来降低肌醇的水平。

在本发明范围之内使用的酶是那些能够通过异构化作用、接合作用、磷酸化、羟基化、甲基化或其它类似的生化活性来修饰肌醇的那些酶，或者可包括能够除去肌醇或其它糖醇的酶。

在本发明上下文中使用的酶可以由一些来源或通过多种方法衍生而来。例如，熟练的技术人员可用已知的对化学上类似底物的活性来鉴定一个酶。因此，可在本发明的上下文中，进行酶的鉴定、基因的分离和使用。可通过使用本领域公知的技术修饰本发明范围之内所用的酶。

此方法不依赖于使用转化以将编码酶的基因引入到植物细胞中。可采用多种方法来完成植物细胞的转化。常用的方法包括使用根癌土壤杆菌(A．tumifaciens)和发根土壤杆菌(A．rhyzogenes)的二元质粒或共合体质粒的基于土壤杆菌属的系统(例如，US4，940，838，US5，464，763)、biolistic方法(例如，US4，945，050，US 5，015，580，US5，149，655)、显微注射(例如，US4，743，548)、原生质体的直接DNA摄取(例如，US5，231，019，US5，453，367)或针状颈须法(例如，US5，302，523)。可在本发明的上下文中使用任何遗传转化植物细胞的方法。

此方法还依赖于具有改变的特性的植物细胞或者组织的回收和使用，尤其是用于饲料的植物种子组织。

由此，获得了具有改变的糖醇代谢的植物细胞。由糖醇衍生了许多化合物，但最重要的是化合物肌醇六磷酸或肌醇六磷酸酯(盐)。在某种植物细胞中降低肌醇六磷酸酯(盐)的方法在饲料应用中大有用途。

编码能够作用于肌醇的酶的基因可以是天然的、合成的或二者的结合。熟练的技术人员将容易地完全了解基因的编码序列可以被修饰，从而允许在植物细胞中高水平表达。这可通过改变密码子的序列，使之与基因被表达的植物细胞中所发现的正常密码子用法更加相似这种方法加以实现。而且，很显然，可将特异的限制性酶切位点加以改造使之允许编码序列的便利操作。还构思了多种序列的添加如翻译增强子、内含子等可以用来确保编码序列的适当表达。所有这些操作在本领域中都是常见的，并为熟练的技术人员容易掌握。

很明显，可以使用组织选择性启动子来将能够修饰肌醇的酶之表达限制于那些其中合成肌醇六磷酸的组织，例如，种子组织。适当的种子选择性启动子包括Brassica napus的napin启动子、由菜豆属(Phaseolis)的菜豆蛋白启动子，或者其它种子选择性启动子。

尤其构思了在本发明的范围之内使用例如Mesembryanthemumcrystallinum中的可用的肌醇O-甲基转移酶。

本发明构思了由能够作用于肌醇的酶表达而产生经遗传修饰的种子的用途，所述的酶在种子选择性启动子的控制之下。因此，降低了肌醇六磷酸的水平。在种子加工时，产生了具有降低的肌醇六磷酸含量的粉产品。因此，作为此方法的结果，获得了一种肌醇六磷酸含量降低的饲料制品。

本发明提供产生降低的肌醇六磷酸含量的十字花科植物种子的方法。尤其是在本发明范围之内构思了，利用例如Mesembryanthemumcrystallinum产生的肌醇O-甲基转移酶来降低十字花科植物作物中的肌醇六磷酸水平。熟练的技术人员可以容易地知晓，作为本发明的结果，能够实现来自十字花科植物种子的具有降低的肌醇六磷酸含量的粉的生产。

公知的，饲料粉中肌醇六磷酸的存在对水产业中养殖的鱼是有害的。但是，一些种子粉，例如canola种子粉含有适合于鱼类营养的一种蛋白质成分。canola种子粉中高浓度的肌醇六磷酸限制了它用在鱼类日常饮食中的量。因此，降低了肌醇六磷酸含量的十字花科植物种子的粉在水产业中将大有用途。

因此，本发明发现了生产具有修饰的肌醇六磷酸含量的种子以及具有降低的肌醇六磷酸含量的种子粉的用途。这种修饰的种子和粉可用在许多饲料应用中，包括例如在家禽、猪、水产业、反刍动物和非反刍动物中都有用。由前面的描述可以进一步知晓在本发明范围之内可以使用多种不同的酶中的任一种来修饰肌醇。还可知晓利用种子选择性启动子的这些酶的多种组合也可用于实现肌醇六磷酸的特异性降低。

本发明在糖醇次级途径中的应用不局限于这些作为例子的植物物种。实际上，任何产生肌醇六磷酸的植物物种都可用本发明的此方法加以修饰。因为所使用的酶，O-甲基转移酶对所有商业上重要的主要作物物种来说都是异源的，所以此方法对任何作物物种都有用。那么，可以采用本方法修饰用作动物饲料或产生部分地或全部用作动物饲料的种子之任何作物物种，以产生具有降低的肌醇六磷酸酯(盐)含量的植物。因此，此方法可用于任何作物，包括单子叶植物(例如，玉米、稻、小麦、大麦、黑麦)和双子叶植物(例如，大豆、棉花、苜蓿、芸苔属、亚麻、向日葵等)。

通过本方法可实现类苯丙酸和糖醇代谢的修饰，提供关于如何根据本发明的方法，以一种可信的以及可预料的方式实现特定代谢化合物，尤其是损营养性化合物降低的特定实施例。

对于本领域的熟练的技术人员很显然，在本发明范围之内，任何次级代谢途径都是可以改变的。本发明已经在两种不相关的次级代谢途径中得到证实，并且提供了可预言的及明确的结果。在本发明的广泛指导下可实现例如，在canola植物细胞、玉米植物细胞、稻植物细胞和棉花植物细胞中损营养性剂的降低。

作为本发明方法的一部分，将指导熟练的技术人员评估特定次级代谢物的产生。因此，熟练的技术人员将很容易知晓，需对这样的组织有基本的了解，其中所述组织在制造用作前体的次级代谢物或化合物的发育时间框架之外，合成这些次级代谢物或化合物。这样的资料对于选择控制作用于次级代谢物或那些转化成它们的前体的酶表达的启动子的选择可提供指导。这样，熟练的技术人员就会很容易了解次级代谢物的靶定将要求一种在组织中能作用于形成所述的次级代谢物的前体的酶，其中在组织形成的发育时间框架中也制造次级代谢物。因此，这种能作用于前体成为所述的次级代谢物的酶应该在或大约在所述前体合成的时间表达。

进一步指导熟练的技术人员进行在待实施本发明的组织中的生化分析。所述的分析可包括整个发育中组织内多种化合物水平的测定、生物合成的任何区室化与亚细胞定位、化合物第一次合成或不再合成的发育期间的时间周期和其它的任何相关生化信息。通过进行这些分析，熟练的技术人员能够选择可提供适当的表达水平的启动子，从而引入植物组织中次级代谢物含量的所要求的变化。完全理解，即使是用作前体的化合物水平有小的变化，也可得到所要求的结果。

例如，作为本发明的肌醇六磷酸实施方案的一部分，熟练的技术人员将很容易知晓组织的基本理解，其中一种在形成肌醇六磷酸的发育时间框架之外，合成肌醇六磷的组织，这样会对控制作用于肌醇的酶表达之启动子的选择提供指导。这样，熟练的读者就会很容易完全了解肌醇的靶定要求一种能作用于组织中肌醇的酶，在其中合成肌醇六磷酸的组织中，在发育时间框架中也形成肌醇六磷酸。因此，这种能作用于肌醇的酶应该在或大约在所述肌醇六磷酸合成的时间表达。可以修饰酶的表达水平以达到一个肌醇六磷酸降低的特定水平。降低的水平可从一个小的百分比变化到肌醇六磷酸几乎完全消除。熟练的技术人员将很容易理解，肌醇六磷酸的降低，尤其是在肌醇六磷酸含量高的某些作物物种中的降低，可能要求比在那些肌醇六磷酸以低水平存在的作物物种中，修饰肌醇的基因水平有更高的表达。多种操作表达水平的方法是本领域中众所周知的。这可能包括加入增强翻译的DNA序列、提供高水平转录的强启动子或加入诸如似乎是提供转基因之可信之高转录水平的基质附着或支架附着区的DNA序列。

本发明的这个实施方案还构思了产生植物组织，尤其是在饲料应用上有用的植物种子。种子的直接饲喂以及加工的种子之修饰粉的使用都属于本发明的范围之内。植物种子中肌醇六磷酸含量的减少在饲料应用中是希望的，具有变化的肌醇六磷酸含量的、经遗传修饰的种子在饲料应用中大有用途。

在一些应用中，可用整个的谷粒饲养动物，或谷粒经过最低限度地加工，而不是使之分级分离。例如颗粒玉米常经过最低限度地加工后就用作饲料。然而，某种玉米颗粒经过加工，最终的加工产物例如，玉米麸粉也用来饲养动物。降低的肌醇六磷酸含量将有益于这两种玉米饲料，尤其是当它与由于动物排泄过量的磷而涉及环境降解时。用作饲料的其它的谷类如小麦、大麦和燕麦也将从本发明中受益。因此，本发明对宽范围的经济上重要的作物物种都是有用的。在本发明中证明的改变肌醇水平的基因可在任一作物物种中都发挥作用，因为在所有的作物种类中都发现了肌醇，并且它是已知唯一的肌醇六磷酸生物合成的前体。由此，已经清楚地证明了甲基转移酶基因的使用可用来改变肌醇的水平。熟练的技术人员将很容易理解，编码区域的编码序列或启动子(或非翻译引导序列、终止子等)的特异DNA序列都可被修饰，用来确保在特定植物物种的植物细胞中的最佳表达。所有这些都属于普通技术人员的技能。因此，完全可以预计本发明可以在任何能够被遗传转化的植物物种中应用，包括其谷粒可直接用于饲料应用的那些植物物种或者其谷粒在用于饲料应用之前被加工的那些植物物种。

因此，作为本方法的结果，产生了降低的肌醇六磷酸含量的整个种子的饲料制品。

除了完全或部分破碎的种子的直接饲喂外，还有许多方法用于生产种子粉。玉米的湿法制粉用来生产玉米麸质粉。除了加工的玉米饲料产品以外，根据本发明的方法还可产生具有降低的肌醇六磷酸的完整玉米颗粒。本发明在生产具有降低的肌醇六磷酸的玉米麸质粉中也有用。

除了主要的饲料作物如玉米之外，油料种子作物提供用作饲料的大量的植物粉。在油料种子中，最为重要的是在提取油时产生的粉。一般地，采用溶剂或非溶剂的方法从油料种子中提取油。这个加工中产生的“饼”或排出的固体用来配制粉，通常含有种子中大多数的肌醇六磷酸含量。

油料种子最普通的加工包括油的提取以及油提取后回收饼或种子的残余组分。本发明在这个方法中是有用的，由于降低了肌醇六磷酸的含量，最终的粉产物比传统生产的粉更有价值。

因此，生产具有较低肌醇六磷酸含量的粉的方法提供了一种目前还没有在油料种子衍生的粉中发现的新的组合物。从本发明中受益的大多数油料作物包括十字花科植物的油料种子作物，例如，Brassicanapus、芜菁(Brussica rapa)、芥菜(Brassica juncea)、Brassica nigra、欧白芥(Sinapis alba)、两节荠属(Crambe)、芝麻菜(Eruca sativa)、以及其它的在商业上重要的并可用作饲料的十字花科植物种子。经常在粉应用中使用的非十字花科植物的油料种子包括大豆、棉花、玉米、红花、向日葵和花生。

本发明构思了由能够作用于肌醇的酶的表达而产生的经遗传修饰的油料种子的用途，所述的酶在种子选择性启动子的控制之下。因此，降低了肌醇六磷酸的水平。在加工油料种子时，衍生了具有降低的肌醇六磷酸含量的粉产品。

下面的实施例用来例证此方法，但决不限制本发明的范围。实施例1：用来鉴定类苯丙酸途径产物的总方法：十字花科植物种子中类苯丙酸途径的终产物芥子碱含量的测定

显而易见，熟练的技术人员可以参考分析化学中许多出版物，来改编所有所例证的方法用以测定类苯丙酸途径中的产物。在作为例子的第一个方法中，从已公布的方法改编了一种简单的、用于鉴定植物组织，也就是十字花科植物种子组织中芥子碱的试验(ChappleC．C．S．、T．Vogt、B．E．Eills和C．R．Somerville，1992，植物细胞4：1413-1424)。薄层层析(TLC)方案经标准化用于评估类苯丙酸途径中的产物芥子碱。此方法使用了植物提取液的分离并将已知量的芥子碱点到硅胶板上(例如，Whatman 60A SilicaG)。可以用公布的方法纯化芥子碱(例如，D．Strack1977，Z．Pflanzenphysiol．84：139-145)。通过比例分别为10∶2∶3的正丁醇、乙酸和水的溶剂混合物移动到距离原点大约10厘米来分离。将预称重的样品在一个紧密封闭的、含有100-500μl甲醇溶液(98％甲醇、2％乙酸)试管中浸泡过夜，制备种子提取物，然后在研磨前及研磨中加入等体积的甲醇。大约12，000×g离心后，获得上清液。将上清液用氯仿：水(CW；400μl：100μl)混合物抽提，如上所述离心，移去脂相，将水相空气干燥或真空干燥。将样品溶于水中并点样在TLC板上。在接触上行的溶剂之前，将完全根据经验的尝试而决定的确定量的样品点到TLC板上。通过干燥，然后称出一个已知新鲜样品的重量的量，实现所使用的干重的测量。

然后，在UV灯下观察TLC板，芥子碱显形成一个光亮的点。将以前纯化的芥子碱样品用作标准，单独或作为一个与种子提取液的人工混合物使用，以确保当与种子提取液的组分显现时，提纯的芥子碱随种子提取液中的芥子碱移动。在定量反映放射性发射的Ambis4000(Scanalytics)扫描中扫描TLC板，监测放射性标记的芥子碱。

随后，用高压液相色谱(HPLC)来检验芥子碱的含量。将上述但没有经氯仿-水抽提的植物材料之甲醇提取物在装有NucleosilC18AB柱的Varian HPLC仪器中进行HPLC分析。加样体积一般为10μl，移动相是溶剂A(2％乙酸水溶液)和溶剂B(2％乙酸乙腈溶液)的混合物。一般过柱条件包括移动相：溶剂A经过17分钟由90％变化到80％，然后经过1分钟进一步降到10％。将柱用10％溶剂A维持4分钟，然后用90％溶剂A冲洗并平衡。这些条件可以改变以便更好地分离洗脱的物质。例如，溶剂A可经过15分钟由起始时间的90％变化到80％，再经15分钟变到70％，然后经2分钟降到10％，接下来在10％维持2分钟，再用90％的溶液平衡。用二极管阵列检测器监测UV吸收。设定在330纳米的UV吸收用于样品的分析。用纯化的芥子碱构建一个标准曲线，用于植物提取物中芥子碱的定量。对一个熟练的技术人员来说显而易见，HPLC条件(例如，溶剂的比例与梯度、不同的溶剂类型)是可以改变的。有必要确定与装置以及所使用的样品复杂性相适应的条件。所公布的文献教导了用来分析酚类化合物(包括芥子碱)的许多HPLC方法。

采用放射性示踪物研究来获得芥子碱生物合成起始的更精确的体现以及用于测定在种子的多个部分中新合成的芥子碱的比例。放射性示踪物方法还可用来测定个别种子成分(例如，子叶、胚芽、种皮)由外源供应的胆碱合成芥子碱的能力。然后，可以分析放射性标记的产物中的芥子碱，例如，通过TLC方案后的Ambis4000扫描。

采用HPLC方案定量分析种子和种子成分中总芥子碱的含量。TLC用来定量分析种子发育的多个阶段中的芥子碱含量，放射性示踪物和TLC一起，随后再通过放射性点的计数，可用于确定种子和种子组织(如子叶、胚轴、种皮)中芥子碱的起始和分布。

用来确定由胆碱从头合成芥子碱的放射性示踪物方法使用的是完整荚果(长角果)，而不是分离的种子，以便提供尽可能代表体内条件的实验条件。从一般白天的温度为20℃，夜晚的温度为15℃，白天／黑夜的循环为16／8小时的受控条件下培育的植物，采摘不同发育阶段的长角果。将长角果的梗节部分浸泡在含有购于New England Nuclear(原液的比活性为2．0GBq／mmol；浓度，7．4MBq／ml相当于0．2mCi／ml；胆碱，3．7微摩／ml)的¹⁴C标记的胆碱的溶液中。将具有梗节的长角果浸泡在含有1．8毫升水性培养基例如，半浓度的Murashige-Skoog培养基以及1mM非放射性胆碱和1．8到9μl的放射性胆碱原液的试管中，按照在20℃的温度下，16小时光照／8小时黑暗的白天／夜晚的循环，在植物培养箱中孵育24到72小时。光照条件是51微量子摩尔每平方米每秒，将从这些豆荚移出的种子用来进行TLC分析。将这些样品用甲醇溶液提取，然后再如上所述，用氯仿-水(CW)抽提。

分析较老的种子时，除以上的方法外，从长角果剥离的种子还要进行浸润。将20粒种子在500μl如上所述的放射性胆碱培养基在有光的真空下浸泡15分钟，室温大约23℃。然后，去除放射性培养基并用500μl含有上述成分，但减去¹⁴C-胆碱的非放射性培养基代替，在23℃孵育24小时。然后，如上所述抽提种子。

植物材料还可用分别为5∶12∶3比例的氯仿：甲醇：甲酸(CMF)混合物抽提。一般，1毫克的样品中加入2μl CMF，将样品碾碎，放于室温(21-23℃)过夜(16小时)，然后大约12，000×g离心5分钟。收集上清液，沉淀与另一个体积的如前所加入的CMF充分混合，放置20分钟，如上离心。将上清液混合，如前所述用氯仿-水(CW)抽提，同上，分析水相部分。实施例2：特定植物组织中，类苯丙酸途径的产物合成定位的鉴定。

在这个实施例中，测定了类苯丙酸途径的产物合成的发育性时间选择。这个特定实施例例证在十字花科植物种子组织内芥子碱合成和积累。在这个实施例中，使用的是发育中的Brassica napus种子。对由人工传粉的花而得到的长角果提取物进行TLC分析，从而建立芥子碱积累的起始时间。在传粉后(DAP)或种子成熟后7、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32和34天采集样品。根据实施例1中所描述的方法制备种子提取物，并用TLC分析使芥子碱的含量可见。从18DAP到种子成熟，芥子碱都是明显的，显示成熟的种子中含有最大量的芥子碱，这表明在发育的种子中有一个净积累。

种子从其上剥离的豆荚壁部分不含有芥子碱，在从7-、14-和16-DAP的样品上的较幼嫩的种子中没有芥子碱。这个分析表明芥子碱积累的起始是在大约18DAP，然而，因为这个方法使用的是UV荧光检测，即便是在较幼嫩的种子中存在有很小量，是检测不出来的。图3表示到28DAP的样品之TLC分析的实例，第二个板表明到种子成熟时的实例。因为，以上的结果不是定量的，如实施例1中所述，将用甲醇溶液得到的整个种子的提取物用HPLC分析。图4所列出的结果证实了从20DAP芥子碱合成开始，快速连续增长一直到成熟。成熟种子中芥子碱的量，依种子干重大约为0．8％，因为油将占种子的大约45％，这将可转换成大约1．5％的脱脂种子粉。实施例3：类苯丙酸途径中产物合成的时间和空间方面的测定-关于种子发育的芥子碱合成。

基于实施例2所获得的资料，进一步证实了芥子碱是由发育中的种子合成的。也很明显，芥子碱的降解在种子发育期间也是最小的。为了确证这个分析，将发育中的种子与用于由芥子酰葡萄糖合成芥子碱这一植物中类苯丙酸途径的终步骤的前体¹⁴C-胆碱孵育。放射性前体的存在导致了标记的芥子碱的产生。那么，有可能通过这种方法定量芥子碱的生物合成。如图5中所示，芥子碱的合成(¹⁴C-胆碱掺入到芥子碱)在10DAP时是无法检测的，第一次出现在14DAP。那么，芥子碱的合成(即，由前体芥子酰葡萄糖和胆碱到最终产物芥子碱的产生)发生在14DAP到种子接近成熟时。因此芥子碱在种子中积累的起始发生在14DAP后，发育中的种子不断合成并积累芥子碱一直到成熟。

尽管18DAP似乎是芥子碱的积累到了在非放射性分析中已经可见的时候，但放射性分析更为敏感，可以检测到甚至更少量的待测生物合成。因此，如放射性检验所示，芥子碱的合成首先以一个低的速率开始于14DAP。渗透实验表明芥子碱的合成能力在较老的、接近成熟的种子中也是存在的(图6)。

为了确定类苯丙酸途径的产物积累的发育时间框架，熟练的技术人员进一步确定定类苯丙酸途径产物的生物合成的组织特异性。在实施例的这个部分，测定了芥子碱在子叶、胚轴、种皮中的积累。用18DAP到42DAP的完整长角果进行放射性示踪物分析。将切除的长角果梗节浸泡在含有¹⁴C-胆碱的溶液中24到72小时，将种子的三个组成切成碎片，进行芥子碱分析。总结在图7中的结果表明，子叶含有最大量的芥子碱(以每一个种子为依据)，其次是胚轴和种皮。从25DAP到成熟的种子的子叶与胚轴中抽提的芥子碱表明，根据干重，胚轴中含有子叶中芥子碱的约50％(图8)。但是，因为子叶和胚轴相比，具有相对较大的质量(成熟时，大约是胚轴的6倍)，所以它们的芥子碱的含量要占到种子中所发现的总芥子碱的90％。实施例4：采用一个编码能够作用于类苯丙酸途径之前体的酶基因的植物遗传转化

在这个实施例中，在植物细胞中表达一种能够作用于用作芥子碱合成前体的胆碱氧化酶(COX)。将这种胆碱氧化酶插入到植物转化载体中受种子选择性启动子控制。胆碱是由芥子酰葡萄糖产生芥子碱的前体，因此胆碱库的降低可减少芥子碱的产生。

用种子选择性胆碱氧化酶(COX)构建体进行十字花科植物物种Brassica napus的遗传转化。胆碱氧化酶基因的DNA序列如图10中所示，而预期的氨基酸序列则在图11中列出。为了提供种子特异的表达，使用了napin启动子序列(Kohno-Murase，J．、M．Murase、H．Ichikawa和J．Imamura，1994，植物分子生物学(Plant MolecularBiology)，26：115-1124)。最终的质粒pHS731是根据如Maniatis，T．、Frittsch，E．F．和Sambrook，J．(1982；分子克隆：实验室操作指南(Molecular Cloning：A Laboratory Mamural)，冷泉港，纽约)的那些操作指南中所描述的标准方法，通过一系列的克隆和亚克隆来构建的。载体的骨架来自RD400(Datla，R．S．S．、Hammerlindl，J．K．、Panchck，B．、Pelcher，L．E．和Keller，W．，1992，基因211：383-384)，但是其已经经过修饰，包括了在gus和npt(Gus::npt)之间的一个融合基因而不是RD400的NosP-NptⅡ植物选择标记。以前已经描述了Gus-npt(Datla，R．S．S．、Hammerlindl，J．K．、Pelcher，L．E．、Crosby，W．L．和G．Selvaraj，1991，基因101：239-246)。将一个在npt序列末端含有Nos终止子(PolyA信号)2．6Kb的片段，由pGKK14(Datla等人，1991)克隆到一个已经丢失了RD400的整个T-DNA的中间质粒中。一个部分重复的CaMV35S启动子与pBⅠ525苜蓿花叶病毒前导区(Datla，R．S．S．、F．Bekkaoui、J．K．Hammerlindl、G．Pilate、D．I．Dunstan和W．L．Crosby，1993，植物科学(Plant Science)94：139-149)一起在Gus::npt序列的5’-端被克隆为一个HindⅢ-BamHⅠ片段。用聚合酶Ⅰ的Klenow片段通过填补末端去除了HindⅢ、BamHⅠ的位点以及相邻的XbaⅠ位点，产生了pHS722。通过聚合酶链反应得到了一个0．26kb的含有pTZ19R(Mead，D．A．、E．Szczesna-Skorupa和B．Kemper，蛋白质工程(Protein Engineering)1：67-74)中多克隆位点的功能性Lac-α区的片段。将这个片段用MunⅠ和EcoRⅠ消化，并引入到pHS722的EcoRⅠ位点，产生pHS723。测定了载体的T-DNA部分的核苷酸序列，多克隆位点中的独特位点也通过限制性酶切分析进行了鉴定。pHS725是由pHS723衍生而来的，含有源于pKR11(参见Rozwadowski等人，1991)，并经过一系列提供了方便位点或如花椰菜花叶病毒PolyA信号这样的特征的中间载体而来的胆碱氧化酶开放阅读框。pHS725载体为pHS723背景COX开放阅读框在3’端提供了CaMV的PolyA信号。用来自于一个中间载体的napin启动子取代含有CaMV35S启动子的开放阅读框的5’部分，产生pHS731。中间载体包括含有1．1kb napin启动子的pUC19衍生物的HindⅢ-NapinP-BamHⅠ盒，这是由J．Kohno-Murase(Kohno-Murase等人，1994)通过将HindⅢ-BamHⅠ插入到质粒RD400的HindⅢ-BamHⅠ窗(Datla等人，1992)中连接而得到的。最终的质粒为pHS974。由pRKJ6A中分离出2．1kb的BamHⅠ-BADH开放阅读框-PolyA-KpnⅠ盒(pRKJ6A详细描述在R．K．Jain，1995，植物中osmolyte生物合成的遗传工程：烟草中甜菜醛脱氢酶基因表达的操作，博士论文，Saskatchewan大学，Saskatoon，加拿大)，并连接到pHS974中的BamHⅠ-KpnⅠ窗中产生pHS981。pHS981用在pHS731的衍生中。图12表明含有具有左右边界napin启动子-COX开放阅读框-CaMVPolyA信号的最终的质粒pHS731。已经通过成分检测了napin启动子-COX开放阅读框-CaMV PolyA信号片段的核苷酸序列。因为pHS723的原型包括所有含有左右边界及它以外的所有区域的pBIN19(Bevan，M．，1984，核酸研究(NucleicAcids Research)12：8711-8721)，也有可能确定另外的序列。已经公布了pBIN19的完整的核苷酸序列。可以很容易地获得以上所描述的COX基因构建体用于其它载体的克隆。大肠杆菌DHS中的质粒载体pHS731已经于1997年1月22日被保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville MD，美国20852，保藏编号为ATCC 98300。

依据有关napin启动子的已公布的资料(Delisle，A．J．和Crouch，M．L．，1989，植物生理学(Plant Physiology)91：617-623；Hoglund，A．-S．、T．Rodin、E．Larsson和L．Rask，植物生理学98：509-515)和我们的研究结果，预期napin基因表达跨越在B．napus种子的时间上发育的中间时段。

通过标准的三亲交配将载体pHS731插入到土壤杆菌菌株MP90中去，然后再通过土壤杆菌介导转化芸苔属。转化基本上按照Moloney等人于1989年在植物细胞报道8：238-242中所描述的进行操作。

用含有二元载体pHS731的根癌土壤杆菌菌株GV3101／pMP90(Koncz C．&Schell，J．，1986，分子普通遗传学，204：383-396)来进行转化的研究。通过离心收集LB肉汤(Difco，美国)(100ml)中稳定期的细胞培养物，并重新悬浮于10毫升含有1％DMSO(二甲基亚砜)(Sigma，美国)用作冷冻保护剂的新鲜LB肉汤中。200μl的等份试样贮存在-20℃直到用于转化，其中的细菌等份试样加入含有2％蔗糖、50μM乙酰丁香酮，pH5．6的2毫升脑心浸液肉汤(Difco，美国)，在28℃，孵育过夜。细菌细胞浓度为大约1x10⁹细胞／毫升。

根据Moloney等人，1989，植物细胞报道8：238-242中的方法，将子叶外植体接触含有植物转化载体的土壤杆菌。将外植体叶柄的切开的表面短暂地在细菌培养物中浸没一下。将外植体插入到共培养培养基中以便切开的表面能与培养基接触。每一个100X15毫米Petri平板中放置10个外植体。用Stretch’n Seal^TM塑料包装纸密封共培养平板。平板在提供如以上所提到的种子萌发步骤的温度和光周期条件的培养箱中孵育3天。然后，将外植体转移到选择培养基中。

在选择培养基中3到4周后，将再生的绿色幼苗(推定的转化体)切开，并转移到新鲜的选择培养基中继续生长。当幼苗达到1．5-2．0厘米长，将它们转移到生根培养基中。基本上按照Jefferson，R．A．，1987，植物分子生物学报道(Plant Mol．Biol．Rep．)5：387-405中所描述的，筛选表达gus基因的推定的转基因幼苗。兰色染色的出现被认为是转化的证据。

通过NPTⅡ和PAT检验、Southern印迹、PCR(聚合酶链反应)和子代分析来建立证实转化的方法。称作202622的含有载体pHS731的Brassica napus cv．Westar的转基因种子已经于1997年1月22日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville MD，美国20852，保藏编号为ATCC97854。

然后，测定了Brassica napus种子中胆碱氧化酶基因的表达。再生了几个不同的转基因系。采用一种偶联的酶促反应来证明COX的活性。COX可由胆碱产生甜菜醛，这种甜菜醛可以通过BADH的NAD依赖的氧化来进行方便地检定。通过340nm下吸收值的变化来监测NAD还原。为了使这个检定标准化，用可变量的商业上可得的COX(例如，Sigma)和一定量的由过量表达BADH的细菌菌株制备的大肠杆菌BADH(50单位；1单位=每分钟每毫克蛋白质还原的1纳摩尔NAD)来使得反应条件标准化，并建立COX而不是BADH为有限的一个标准曲线。然后，用转基因系和对照的植物提取物进行检定。BADH可以根据已公布的方法进行富集或纯化(例如，Falkengerg，P．和Strom，A．R．，1990，生物化学生物物理学通报(Biochemica Biophysica Acta)1034：253-259)。

如下获得植物提取物。将大约100mg的植物叶片在液氮中冷冻，用相当于样品重量2倍体积的冰冻的抽提缓冲液碾碎。大约10．000x g下将样品离心，再将上清液重新离心。重复离心直到看不见粒状的物质。将每个样品大约20粒的种子中，在第一次离心后加入20mg活性碳，再进行流程中的剩余步骤。用KOH调整抽提缓冲液到pH8．0，每100毫升中含有1．92克HEPES、0．2ml的0．5M EDTA、10ml甘油以及将体积调到100ml的去离子水。在检定之前，加入1M的DTT贮存液，使得最终浓度为25mM，还加入了在HEPES缓冲液中的10X贮存的完全蛋白酶抑制剂混合物(Boehringer-Mannheim，目录：1697-498)。酶检定缓冲液(BADH缓冲液)含有50mM HEPES-KOH，pH8．0、1mM EDTA和新鲜加入的1mM终浓度的DTT。可在含有50μl BADH缓冲液、50μl 10mM的NAD贮存液、50μl植物样品、30μl或相当于50U的BADH，及去离子水的最终体积为450μl的反应体系中进行偶联实验。将反应混合物混匀，并监测20分钟。对于340nm处吸收值的背景变化，加入了50μl氯化胆碱，分光光度仪读数持续10到20分钟。对于标准曲线，不加入植物样品，而是用各种量的纯化COX来代替。采用可程序化的记录型Beckman DU65分光光度计计算单位。熟练的技术人员可使用文献中有关NAD消光系数的可用的生化资料来修改操作方法，以适应仪器的可用性。NAD还原本身是测定脱氢酶的标准实验。实施例5：转基因种子降低的酚类含量的分析

在这个实施例中，分析了种子的芥子碱的含量。培育实施例4中重获的转基因植物种子直到获得自交子代，用这些子代系来分析其中编码转基因β葡糖醛酸糖苷酶(Gus)活性的分离或其缺失。这个基因(参见，Datla，R．S．S．、Hammerlindl，J．K．、Pelcher，L．E．、Crosby，W．L．和G．Selvaraj，1991，基因101：239-246)存在于载体pHS731的T-DNA的左右边界之内，因此，可作为分离的遗传分析的方便标记。遗传分离的缺乏表明产生子代的植物具有纯合的性质。那些表现为分离的植物系是半合子的，缺乏GUS活性的分离子被作为不含有COX基因的对照。因此，有许多含有COX的纯合系以及不含有转基因的相对应的植物系。用HPLC方法来分析这些植物系的芥子碱含量。图13中所表示的结果清楚地表明，与那些非转基因的相对应的植物系相反转基因分离子的芥子碱水平大大降低。非转基因分离子是最好的对照，因为它们来源于相同的原代转基因植物。这些结果证明了所述方法的实用性。对一个熟练的技术人员来说，很显然，可以通过改变基因表达的水平、时间和位置来实现多种水平的降低，并且还可在个别的转基因系中寻找由于包括位置效应和拷贝数等许多原因而显示所希望的结果之有益变体。实施例6：通过类苯丙酸途径内前体的转移产生应激保护剂产物

在这个实施例中，通过在种子选择性启动子的控制之下的COX和BADH的联合活性产生应激保护剂甜菜碱。在这个实施例开始的部分，制备了携带有种子选择性启动子控制之下的BADH基因的转基因Brassica napus。进行了这些植物关于BADH表达的分析。

甜菜醛脱氢酶基因在Brassica napus种子中表达。分离一个大肠杆菌BADH(betB)基因，并通过与B．napus的napin启动子连接而改造成种子特异性表达(Boyd等人，基因103：45-52(1990))。RD400(Patla，R．S．S．，Hammerlindl，J．K．，Panchuk，B．，Pelcher，L．E．，和Keller，W．，1992，基因211：383-384)用作载体，由此获得的在左右T-DNA边界内含有betB开放阅读框的最终的衍生物pHS974，自betB开放阅读框的ATG位点是在napin启动子和花椰菜花叶病毒PoluA信号的表达控制下。Napin-betB-PoluA盒(大约3．3kbp)按照所指示的顺序，包括HindⅢ位点、Napin启动子、BamHⅠ位点、betB开放阅读框、EcoRⅠ位点-花椰菜花叶病毒DNA的PolyA信号、KpnⅠ位点以及EcoRⅠ位点。Napin启动子是Kohno-Murase等人构建的(植物分子生物学，26：115-1124，1994)，PolyA信号来源于质粒pJIT117(Guerineau，F．、Woolston，S．、Brooks，L．和Mullineaux，1988，核酸研究16：11380)。图14表示了大约15kbp的最终质粒pHS981。将它引入根癌土壤杆菌GV3101[pMP90]中(Koncz，C．和Schell，J．，分子和普通遗传学(Molecular and General Genetics)204：383-396)，所获得的菌株用于Brassica napus的遗传转化。

获得几个转基因系，不同发育阶段的种子用于进行BADH活性的检定。在约35DAP发现BADH活性达到峰值，成熟种子中保留着残留活性。作为发育阶段的函数之比活性证明BADH活性的起始与芥子碱的合成是共同发生的。

将表达BADH基因的植物系与实施例4中所描述的携带COX基因的植物系杂交。用含有COX基因的植物以及同时含有BADH和COX基因的植物来分析芥子碱含量和总酚类含量。这些结果如图15(芥子碱含量)和图16(总酚类含量)中所示。所分析的种子从在1999年夏季田间条件下养殖的植物中收获。如图15所示，COX和BADH的联合活性与仅有COX活性相比，造成芥子碱积累更进一步的降低。如图16所示，相对于对照，在转基因植物中总酚类含量也降低。实施例7：合成的阿魏酸脱羧酶基因的核苷酸序列

在这个实施例中，已经公布的短小芽孢杆菌的阿魏酸脱羧酶的序列(Zago等人，应用环境微生物61：4484-4486，1995)被用于构建最适合于在植物细胞中表达的基因。通过连接以已经公布的序列为基础而合成的寡核苷酸合成了阿魏酸脱羧酶的开放阅读框。很大程度上基于在Brassica napus中高度表达的基因之密码子偏好来合成寡核苷酸。

合成的寡核苷酸大约60个核苷酸长。寡核苷酸双链的设计包括5’末端的BamHI-粘性末端(5’GATC-)和3’末端的EcoRⅠ-粘性末端(3’TTAA-5’)。装配这个单独双链，形成具有5’BamHⅠ和3’EcoRⅠ-位点的全长的开放阅读框。连接反应依据标准方案进行。将连接的产物顺次连接到克隆载体中。

在将以上合成的基因连接到BamHⅠ和EcoRⅠ切割的pBluescriptSK-(Statagene)中去以后，通过小量制备大肠杆菌克隆的质粒DNA来鉴定含有0．5kb插入的克隆。筛选潜在的候选者，并测定两个克隆的核苷酸序列。在每一个克隆中都发现了一个点突变。在所选择的两个克隆中，这两个点突变是间隔的。突变的间隔使得允许由这些克隆中基因的非突变部分而组合得到完整基因的重新构建。这个克隆被称作pGS97b1。图17中列出了这个合成基因的核苷酸序列。图18表示了预期的氨基酸序列。

通过简单的测试可以确定合成基因的功能性。阿魏酸脱羧酶将阿魏酸转化为4-对乙烯基愈疮木酚(4-VG)。4-VG具有特有的丁香气味，认为4-VG是赋予丁香自然芳香的唯一最重要的化合物。具有pGS97b1的大肠杆菌菌株，当在含有1mM阿魏酸的生长培养基中生长时，可产生独特的芳香气味，而无阿魏酸的培养物或仅仅是含有载体的菌株培养物都不产生气味。添加了阿魏酸的培养物的HPLC分析证实阿魏酸的消失。依据以上的结果，可以得出功能性基因被克隆在pGS97b1中的结论。实施例8：用在组成型启动子控制下的编码阿魏酸脱羧酶的基因进行植物遗传转化。

在这个实施例中，将克隆在pGS97b1中的酶阿魏酸脱羧酶插入到植物转化载体RD400中，其已经被改造以包括在gus和npt(Gus::npt)之间的一个融合基因，而不是RD400的NosP-NptⅡ植物选择标记(Datla，R．S．S．、Hammerlindl，J．K．、Panchck，B．、Pelcher，L．E．和Keller，W．，1992，基因211：383-384)。以前已经描述了Gus-npt(Datla，R．S．S．、Hammerlindl，J．K．、Pelcher，L．E．、Crosby，W．L．和G．Selvaraj，1991，基因101：239-246)。将阿魏酸脱羧酶放置于35S启动子控制之下，根据标准方案，使用这个质粒来转化烟草植物。

图19表明了此载体的限制性酶切图谱。图19中表明的载体pGS97b3，除了以下所列出的以外，和pHS731是相似的。在pHS731相同的载体骨架上，HindⅢ-napin p-BamHⅠ盒已经被花椰菜花叶病毒35S启动子-苜蓿花叶病毒前导盒所取代(在R．S．S．Datla、F．Bekkaoui、J．K．Hammerlindl、G．Pilate、D．I．Dunstan和W．L．Crosby，使用AMV·RNA4非翻译前导区序列提高植物中高水平组成型外源基因表达，植物科学(Plant Science)94：139-149，1993中有描述)。启动子部分在图19中缩写为35S。35S后面是5’末端连有BamHⅠ和3’末端为EcoRⅠ的阿魏酸脱羧酶的开放阅读框，而不是pHS731中的COX开放阅读框。

回收表达阿魏酸脱羧酶基因的转基因植物。分析植物酚类含量以及乙烯基愈疮木酚的产生。

使用抗阿魏酸脱羧酶的多克隆抗体在Western印迹分析中，发现携带有阿魏酸脱羧酶基因的独立的转基因烟草植物中含有预期大小的免疫反应性多肽。非转化的植物则不含有免疫反应性肽类。这提供了在这些转基因植物中有着阿魏酸脱羧酶的转基因表达的证据。实施例9：使用在组织选择性启动子控制下编码阿魏酸脱羧酶基因进行植物的遗传转化。

在这个实施例中，将克隆在pGS97b1中的酶阿魏酸脱羧酶插入到植物转化载体RD400中。将阿魏酸脱羧酶置于种子特异的、来自B．napus的napin启动子控制之下，并根据标准方案，使用这个质粒来转化烟草植物。图20表明了此载体的限制性酶切图谱。图20中表明的载体pGS97b2与pGS97b3是相似的，除了在相同的载体骨架上用图12中表示的pHS731中的HindⅢ-napin启动子-BamHⅠ盒来代替HindⅢ-35S-BamHⅠ盒。回收表达阿魏酸脱羧酶基因的转基因植物。分析植物种子酚类含量以及乙烯基愈疮木酚的产生。实施例10：十字花科植物Brassica napus发育的种子中肌醇六磷酸积累的组织特异性以及发育模式的测定。肌醇六磷酸的生物合成。

在这个实施例中，关于肌醇六磷酸生物合成途径的资料在Brassicanapus种子中加以测定。因为肌醇六磷酸是肌醇的六磷酸衍生物(肌醇六磷酸被称为IP₆)，测定了总的磷酸化肌醇衍生物的肌醇组分的单个磷酸化衍生物的比例(例如，IP₁、IP₂、IP₃、IP₄和IP₅)。使用通过高压灭菌能部分降解产生多种磷酸化衍生物的纯化肌醇六磷酸作为HPLC分析的标准，HPLC分析是根据Vernon和Bohnert(1992，欧洲分子生物学杂志(The EMBO Journal)11：2077-2085)和VernonDM，、Tarczynski MC、Jensen RG和Bohnert HJ(1993．植物杂志(The Plant Journal)4：199-205)的方法来进行。

通过这种分析，可以很容易地区别磷酸化肌醇的多种形式(例如，IP₁、IP₂、IP₃、IP₄和IP₅)以及肌醇六磷酸。分析从芸苔属发育中的种子中抽提的肌醇磷酸样品时，只发现了对应于IP₆(即，肌醇六磷酸)的一个峰。这个结果表明IP₆是发育中的种子中占主导地位的肌醇磷酸，其它的磷酸化肌醇中间体形成不能通过所描述的方法用HPLC进行检测。因此，由肌醇合成肌醇六磷酸被认为是以快速的并且主要是定量的方式发生的。肌醇六磷酸的发育的生物合成。

在实施例的这一部分，测定肌醇六磷酸积累的发育计时。以下是测定种子中肌醇六磷酸含量的方法：种子在液氮存在下于研体中碾碎，将粉末转移到含有5毫升的0．5MHCl的15毫升无菌试管中。用己烷抽提去除脂质，将剩余的相(含有组织残余物的水相)用超声流体加工机(XL2020型，Heat Systems，Inc．，Farmingdale，NY，美国)在水平3超声处理90秒钟。将离心后的液体转移到一支新的试管中，用于HPLC的肌醇六磷酸的分析。这种方法可用于多个发育阶段的种子。

图21表明了种子发育阶段肌醇六磷酸的积累。尽管在非常早的阶段(例如，传粉后12天)肌醇六磷酸首次被检测出来，但是它的含量直到传粉后22天都没有特别大的增长。在它第一次出现后的10天这一时期内，肌醇六磷酸达到了约240微克／种子的最大水平。以成熟种子的干重表示，所表达的肌醇六磷酸含量大约占3．2％。这些结果表明通过干扰肌醇六磷酸生物合成的肌醇六磷酸的减少要求一种能够在大约12DAP到接近种子成熟的时期表达的启动子。

进一步的分析表明肌醇六磷酸主要贮存在胚组织中而不是种皮中(图22)。子叶中含有几乎90％的种子肌醇六磷酸，10％存在于胚轴中。这些发现进一步提示多种胚组织是通过肌醇六磷酸生物合成的遗传修饰来降低肌醇六磷酸的最优选的靶位组织。实施例11：发育的种子组织中肌醇代谢的测定。

这个实施例例证了用于肌醇六磷酸生物合成的肌醇库的比例。尽管肌醇是植物中肌醇六磷酸合成的前体，它还应用于磷脂酰肌醇产生和细胞壁成分的其它合成代谢的途径。这个实施例例证了在发育的种子中用于肌醇六磷酸生物合成的总的肌醇库的比例。使用³H-肌醇体内标记的芸苔属种子来跟踪用不同溶剂抽提的不同部分中肌醇的分配。用于体内使用³H-肌醇脉冲标记发育的种子的技术如下所述。采摘不同发育阶段的长角果，并将切割的一端立即放入在50毫升管中，其中含有5μCi³H-肌醇灭菌的培养基10毫升，在标准条件下培养(在光照下，20℃度培养16小时，黑暗中，15℃培养8小时)2天。收获种子用于脂质、肌醇六磷酸、可溶于三氟乙酸(TFA)的细胞壁组分以及细胞壁残片的抽提。每一级分的放射性用液体闪烁计数法测定。

从脉冲标记的种子中采用4种类型的抽提来进行水溶性细胞组分(用于肌醇六磷酸分析)、溶于己烷的(用于脂质分析)、溶于三氟乙酸(TFA)的细胞壁组分以及细胞残片的分离。图23列出了种子发育的不同阶段每一部分的平均放射性。资料表明超过20％的种子中的总标记是传粉后25-30天(DAP)在脂质部分发现的。细胞壁部分的放射性(溶于三氟乙酸的细胞壁以及细胞残片)占到种子发育期间所掺入的总标记的大约5％。进一步通过HPLC分析水溶性部分中的放射性来鉴定肌醇六磷酸的比例。发现水溶性提取物中，大约10％的标记可在肌醇六磷酸峰处回收，约30％的标记在样品注射峰中，这是游离的肌醇。存在于水溶性提取物中的其它标记材料在先于或迟于肌醇六磷酸峰处回收，代表未鉴定的化合物。

在肌醇六磷酸、脂质、溶于三氟乙酸的细胞壁以及细胞残片中发现的代谢标记的百分比如图3中所示。来自³H-肌醇衍生代谢物的大约30％的标记见于20到30DAP的肌醇六磷酸中。相伴地，大约60％的标记存在于脂质中(含有肌醇的磷脂)，不足10％的存在于细胞壁部分。

因此，用于肌醇六磷酸生物合成的总的肌醇库的分配是大约30％在种子发育的时期内，此时肌醇六磷酸生物合成似乎是最大值。实施例12：编码能够作用于肌醇的酶的基因克隆。

在这个实施例中，分离了能够作用于肌醇的基因。这个基因是在普通冰植物(ice plant)中存在的肌醇-O-甲基转移酶基因。按照以下所描述的方法，使用逆转录酶克隆来分离此基因。根据Maniatis，T．等人，分子克隆，实验室操作指南，冷泉港实验室，冷泉港，纽约中的那些方法进行标准的DNA操作。

从500mM NaCl处理的冰植物叶片组织中提取总RNA，再进一步纯化poly(A)+RNA。这种mRNA可通过Superscript Ⅱ逆转录酶(Promega，Madison，WI．)，按照以下的条件用于逆转录。将溶于20μl水中的3微克mRNA用作模板。将RNA加热到65℃5分钟变性，然后在冰中冷却。在混合物中加入3μl oligo-T(500微克／毫升)、8μl5X逆转录酶缓冲液、4μl 0．1M DTT、2μl 10mM dNTPs。将混合物加热到42℃，然后加入3μl(60单位)Superscript Ⅱ逆转录酶。反应在42℃持续1小时。这段时间以后，加入1μl RnaseH(1单位／μl)，反应在37℃持续30分钟。所得到的cDNA用作PCR的模板，反应采用Vent聚合酶在以下的条件下进行：PCR反应在100μl体积中进行，使用包括如下循环94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟的、每一个循环都有2秒钟的延长，共30个循环。这个反应中所使用的引物是根据已经公布的IMT DNA序列(GenBank保存号M87340)。所使用的正向引物是Seq I．D．No．6：5’TTTTTGGATCCATGACTACTTACA CAATGGCAACTACA3’

其中包括一个5’末端的BamHⅠ位点(下划线)。

所使用的反向引物是SeqⅠ．D．No．7：5’TTTTTTTTGCGGCCGCATAAAGGCAAATCATACACTG3’

这里包括一个5’末端的NotⅠ位点(下划线)。

扩增的DNA片段用BamHⅠ和NotⅠ消化，然后，亚克隆到pSPORT 1(BRL，Bethesda，MD．)中。BamHⅠ和NotⅠ消化的片段克隆到pSPORT载体的相应位点，衍生出pSportIMT。图24(SequenceI．D．No．5)表示扩增的DNA片段的序列，这与公布的IMT DNA序列是一致的，除了在3’非翻译区两个碱基的不同。预期的蛋白质序列与公布的GeneBank中可用的资料是一致的。实施例13：含有编码能够作用于肌醇的酶的基因之植物转化载体的构建：使用冰植物的肌醇O-甲基转移酶基因。

本实施例例证了含有能够在植物细胞中具有活性的启动子控制之下作用于肌醇的基因的植物转化载体的构建。作为例子的植物转化载体包括一个在种子细胞中具有活性的启动子控制之下的肌醇O-甲基转移酶基因、35S启动子。按照以下的方法构建载体：用BamHⅠ和Eco RⅠ消化pSportIMT以释放IMT基因。将IMT基因片段克隆到pBluescriptSK(-)的相应位点中(Strategene，La Jolla，CA．)，最终的质粒称为pBlueIMT。用SpeⅠ来消化pBlueIMT，并克隆到事先用XbaⅠ消化的载体pBⅠ221(CloneTech)中。选择相对于pBⅠ221中的35S启动子来说含有正确方向的IMT基因的质粒，并用HindⅢ和Eco RⅠ消化。将35S-IMT-Nos终止子片段转移到pRD400中，产生植物转化载体p35SIMT。

所得构建体p35SIMT含有pRD400中的35S启动子-IMT-GUS-Nos终止子盒，如图25所示。实施例14：含有编码在种子选择性启动子控制之下可作用于肌醇的酶的基因的植物转化载体的构建。

在这个实施例中，将编码在种子选择性启动子控制之下的能够作用于肌醇的酶的基因构建在植物转化载体中。所使用的基因是肌醇O-甲基转移酶基因，启动子是种子选择性napin启动子。载体被称为pNIMT。

按照以下方法构建载体pNIMT：将SpeⅠ消化的IMT DNA片段(实施例4)连接到pDH1中的XbaⅠ位点，产生了napin启动子-IMT-Nos终止子盒。将这个表达盒进一步转移到pRD400中，所得载体如图26所示。实施例15：用p35SIMT转化Brassica napus(Westar)。

通过标准的三亲交配将载体p35SIMT插入到土壤杆菌菌株MP90中去，然后再通过土壤杆菌介导转化芸苔属。按照实施例4中所描述的进行转化。获得了含有p35SIMT的转化的植物，并用于分析肌醇六磷酸的含量。实施例16：转基因植物的分子分析。

通过PCR、Southern和Northern印迹以及IMT酶学检定来分析含有CaMV35S-IMT表达盒的F₀转基因植物。初步的PCR分析表明所有的转基因植物都含有IMT基因(图27)。Southern杂交表明IMT基因被以多种拷贝数整合到芸苔属基因组中。从发育的种子中抽提的总RNA的Northern杂交分析如图28所示。实施例17：转基因植物中肌醇六磷酸的分析。

分析从F₀转基因植物收获的成熟种子中的肌醇六磷酸含量。如实施例10中所描述的进行种子的抽提。收集的资料表明在转基因植物中发现了平均超过15％的肌醇六磷酸的减少。图29和图30表示的是资料的总结。所收集的资料表明在含有pSIMT载体的转基因植物中发现了平均超过15％的肌醇六磷酸的减少。由于分离，F₁种子是转基因种子和非转基因种子的混合体，因此，就每一个转化的种子来说，实际的肌醇六磷酸减少明显较高。F₂和F₃种子是含有pSIMT载体的纯合系。显然，在田间条件下，含有pSIMT载体的纯合系在种子中的肌醇六磷酸水平上表现为平均30％的减少。除了肌醇六磷酸分析以外，进行了Southern杂交分析来测定所插入基因的拷贝数。甚至在仅插入单拷贝基因的植物(例如，植物编号TP#11)中，也可发现肌醇六磷酸的大大降低(34％)。在负责肌醇六磷酸生物合成的组织中能够修饰肌醇的酶活性的表达明确导致种子中肌醇六磷酸的减少。也很显然，因为它是可遗传的，低肌醇六磷酸的品质可经有性转移，那么低肌醇六磷酸品质一经确立，所使用的方法也包括通过传统育种技术转移这种品质。实施例18：用pNIMT转化Brassica napus．

通过标准的三亲交配将载体p35SNIMT插入到土壤杆菌菌株MP90中去，然后再通过土壤杆菌介导转化芸苔属。转化按照实施例4中所描述的进行。

获得了含有p35NIMT的转化的植物，并按照实施例17中所描述的方法分析降低的肌醇六磷酸含量。图31表示的是从在田间条件下生长的携带pNIMT载体的F₁和F₂转基因种子收集的资料表。在F₁植物中，pNIMT插入是分离的，那么所分析的种子是转基因与非转基因分离子的混合体。在F₂代中，大多数植物系是纯合的或近乎纯合的群体。在F₂分析中，从在田间条件下培植的植物中观察到种子中肌醇六磷酸含量的降低接近40％。那么，能够以种子选择性方式，降低用于肌醇六磷酸生物合成的肌醇的可用性酶的表达可导致肌醇六磷酸水平的大大降低。实施例19：利用一种与植物细胞异源的酶活性来阻止UDP-半乳糖的形成和积累。

UDP-半乳糖4-差向异构酶(galE)参与生物系统中半乳糖代谢的主要步骤之一。它催化UDP-半乳糖到UDP-葡萄糖的转换。可从人、酵母和细菌获取中这个酶的基因。

这个实施例的目的是在靶植物的特定组织中过量表达这种酶，以随着增加UDP-半乳糖，增加UDP-葡萄糖库为目标。预期的结果将是降低了肌醇半乳糖苷的生物合成，肌醇半乳糖苷是损营养性的蔗糖糖苷(RFO糖苷，例如，棉子糖、水苏糖等)的前体。除了降低不受欢迎的RFO糖苷的积累速率以外，实现这个目标还可同时实现UDP-葡萄糖和蔗糖的可用性的增强。预计后者将参与或增强其它代谢途径，即需要蔗糖产生其它植物必需代谢物或用蔗糖作为增强植物生产力(例如，蛋白质、脂质、总产量等)的碳源所需要的其它代谢途径。

这是一个例证在较高等的植物中使用细菌酶以引起一种必要的底物代谢转变为另一种底物的实施例，由此最终的新底物将被植物在多种重要的代谢相互转化中方便地利用。实施例20：通过使用葡糖磷酸变位酶(pgm)改变糖的衍生物水平。

葡糖磷酸变位酶(pgm)催化蔗糖的合成和消耗过程中葡萄糖(Glc)-1-磷酸和Glc-6-磷酸相互转化。这种酶在蔗糖、淀粉和糖原的合成和利用中起着关键的作用，并存在于所有的生物。可从多种真核生物以及细菌来源(例如，土壤杆菌属)获得酶的基因。

G-1-P、G-6-P是所有生命系统中许多初级碳水化合物代谢途径的必要的底物。具体地，G-1-P是产生蔗糖生物合成中主要底物UDP-葡萄糖的初级底物。另一方面，G-6-P是许多糖相互转化的重要起始材料，其中之一是肌醇-1-磷酸的合成。后者分别是肌醇六磷酸和RFO合成中的重要底物和辅因子。

此实施例的目的是表明，通过细菌PGM基因在靶植物中的过量表达，可以改变G-1-P与G-6-P的相对比例，有利于两种(组织依赖的)葡萄糖的磷酸化形式中的一个或另一个。通过正确靶定这个活性，例如，以发育中的种子为例(sink组织)，期望增加G-1-P水平，这是UDP-或ADP-葡萄糖产生，以及接下来的蔗糖或其它储存物质(如蛋白质、脂质或淀粉)产生所要求的。另一方面，降低G-6-P的水平的结果将转化为降低以上提及的损营养性因子的水平。实施例21：转基因玉米细胞的产生与再生。

Ⅱ型愈伤组织培养开始于基因型Hi-Ⅱ的未成熟合子胚(Armstrong等人，(1991)Maize Genet．Coop．Newslett．，65：92-93)。未成熟的胚是从温室培育的Hi-Ⅱ亲本A与Hi-Ⅱ亲本B杂交产生的谷穗在传粉后约14天分离的，或者由Hi-Ⅱ植物的自花或近缘传粉衍生的F2胚。在含有N6盐和维生素(Chu等人，(1978)N6培养基和它对谷类作物的花药培养的应用Proc．Symp．Plant TissueCulture，北京出版社(Peking Press)，43-56)、1．0mg／L2，4-D、25mML-脯氨酸、100mg／L酪蛋白水解物、10mg／L硝酸银、2．5g／L脱乙酰吉兰糖胶(Schweizerhall，South Plainfield，NJ)、和20g／l蔗糖pH5．8的起始培养基上培养未成熟的胚(1．5到3．5mm)。4到6个星期以后，将愈伤组织在维持培养基(起始培养基中不加入硝酸银，并且L-脯氨酸降低到6mM)上传代培养。大约12-16星期，进行Ⅱ型愈伤组织的选择。

为了轰击或将外来的DNA引入到植物细胞(通过微粒轰击转化)中，通过在300μL质粒DNA和水中，加入74μL的2．5M CaCl₂、H₂O和30μL亚精胺(游离碱)，将140μg的质粒DNA(例如，35S-PAT／玉米球蛋白启动子／IMT)沉淀到60毫克醇洗的、球形金微粒(直径1．5-3．0μm，Aldrich Chemical Co．，Inc．，Milwaukee，WI)上。立即将溶液涡旋，使得DNA包被的金微粒沉降。去除所得清澈的上清，金微粒重新悬浮于1毫升的无水乙醇中。用无水乙醇稀释悬浮液到15mg DNA-包被金／ml的浓度。

优选所用的质粒含有可选择的标记，例如bar或pat基因，其赋予对膦丝菌素或除草剂草铵膦的抗性以及能够改变次级代谢的遗传构建体，例如在合适的种子选择性启动子(如玉米球蛋白1启动子或玉米醇溶蛋白启动子)的控制之下的图24中所描述的IMT基因的编码区，或图17中所描述的阿魏酸脱羧酶基因的编码区。此外，组成型启动子如玉米的泛素启动子或稻肌动蛋白启动子可以用来表达IMT或阿魏酸脱羧酶。

将大约600毫克的胚发生愈伤组织涂布在缺少酪蛋白水解物和L-脯氨酸，但补加了0．2M山梨醇和0．2M甘露醇作为渗压剂的Ⅱ型愈伤组织维持培养基的表面上。作为预处理将愈伤组织保持4小时，然后转移到含有轰击培养基(用25克／升TC琼脂(PhytotecnologyLaboratories，LLC，Shawnee Mission，KS)固化的渗透介质取代7克／升的脱乙酰吉兰糖胶)的培养皿中。用氦气(轰击)来加速悬浮的DNA包被金微粒朝向或进入已准备好的组织靶点。所使用的装置在此处引用作为参考的美国专利No．5，141，131中有描述。用不锈钢筛网(104微米开孔)将组织盖上，并放入25英寸汞柱的部分真空的装置槽中。在轰击以前，将DNA包被的金微粒进一步用无水乙醇1∶1稀释，并使用1500psi的氦压在愈伤组织靶加速4次，每一次轰击输送20μl的DNA／金悬浮液。轰击后，立即将组织转移到渗透培养基进行16-24小时的恢复。然后，将组织切成小片并转移到选择培养基(缺少酪蛋白水解物和L-脯氨酸，但含有30毫克／升BASTA^*(AgrEvo，Berlin，德国)的维持培养基)。三个月中每4个星期将组织薄片非选择地转移到新鲜的选择培养基中。7至22个星期后，将发现在生长被抑制的组织背景上增殖的愈伤组织部分切除并分离。将最终的BASTA^*抗性组织每两个星期传代培养到新鲜的选择培养基上。适当的分析后鉴定阳性转基因系，并转移到再生培养基。

通过将愈伤组织转移到以细胞分裂素为基础的、含有Murashige和Skoog盐(下文中的MS盐)以及维生素(Murashige和Skoog，(1962)植物生理学(Physiol．Plant．)15：473-497)、30克／升蔗糖、100毫克／升肌醇、30克／升甘露醇、5毫克／升6-苄基氨基嘌呤(下文中的BAP)、0．025毫克／升2，4-D、30毫克／升BASTA^_和2．5克／升脱乙酰吉兰糖胶，pH5．7的诱导培养基中来开始它的再生。将培养物放在低亮度(125英尺烛光)下一个星期，然后再在高亮度下(325英尺烛光)一个星期。两个星期的诱导阶段后，再将组织非选择性地转移到无激素的再生培养基上，该培养基与诱导培养基是一致的，只是不含有2，4-D和BAP，将它置于高亮度下。摘除小的(1．5-3cm)胚，放于含有SH培养基(SH盐和维生素(Schenk和Hildebrandt，(1972)Can．J．Bot．50：199-204)、10克／升蔗糖、100毫克／升肌醇、5毫升／升FeEDTA、2．5克／升脱乙酰吉兰糖胶，pH5．8)的150X25毫米的培养管中。

一旦胚呈现出生长并发育了足够的根系统，就将较大的植株转移到含有大约0．25kg的METRO-MIX360(The Scotts Co．Marysville，OH)的放置于温室的12厘米的花盆中。联合使用高压钠和金属氯化物灯，采用16小时的光周期培育植株，需要时联合使用三种独立的Peters Excel化学肥料配方(Grace-Sierra园艺产品公司，Milpitas，CA)来浇灌。在6-8叶期，将植物转植到含有大约4千克METRO-MIX360的5加仑的花盆中，培育成成熟的可育转基因玉米。这些植物结的种子含有插入到未成熟的胚中基因，当长成植物时将表达由插入基因编码的蛋白质。实施例22：转基因水稻的产生。

为了引发胚发生愈伤组织，将日本栽培品种，Taipei309成熟种子脱皮，并在70％的乙醇中表面杀菌2-5分钟。然后在加入几滴‘Liquinox’皂的50％的商品漂白剂(2．6％次氯酸钠)中浸泡30-45分钟。将种子在无菌蒸馏水中冲洗三次，在转移到‘愈伤组织诱导’培养基(即，NB)之前，放于滤纸上。NB培养基含有N6微量元素(Chu等人，(1978)N6培养基和它对谷类作物的花药培养的应用(Proc．Symp．Plant Tissue Culture，北京出版社(Peking Press)，p43-56)、B5微量元素和维生素(Gamborg等人，1968，大豆根细胞的悬浮培养的营养要求，实验细胞研究(Exp．Cell Res．)50：151-158)、300毫克／升酪蛋白水解物、30克／升蔗糖、2毫克／升2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、和2．5克／升脱乙酰吉兰糖胶(Schweiezerhall，NJ)，并将pH调整到5．8。将在愈伤组织‘诱导’培养基上培养的成熟种子在黑暗中，28℃孵育。培养3星期后，将从成熟胚的盾片区诱导出现的初级愈伤组织转移到新鲜的NB培养基中进一步培养。

用植物组织的Biolistic转化来引入外源DNA。如实施例21中所描述的，将大约140μg的质粒DNA沉积到60毫克的1．0微米(Bio-Rad)的金微粒上。质粒含有驱动hpt(潮霉素磷酸转移酶)的玉米泛素启动子和玉米泛素1、玉米球蛋白，或驱动所使用的IMT基因的玉米醇溶蛋白启动子。按照此处所描述的，将大约140μg的质粒DNA沉积到60毫克的1．0微米(Bio-Rad)的金微粒上。

为了进行氦轰击，将大小为2-4毫米的、活跃生长的胚发生愈伤组织培养物经高渗压剂处理。这种处理包括在氦轰击前4小时将愈伤组织放于含有0．2M甘露醇、0．2M山梨醇(Vain等人，1993，渗压剂处理增强微粒轰击-介导的玉米的瞬时和稳定转化，植物细胞报道(Plant Cell Rep．)12：84-88)的NB培养基上。渗压剂处理后，将愈伤组织培养物转移到‘轰击’培养基(NB+2％琼脂)上，用不锈钢筛网盖住(230微米)。在每一个靶点2，000psi氦压下轰击愈伤组织两次。轰击后，将愈伤组织转移回到含有高渗压剂的培养基中过夜，然后再放到含有30毫克／升潮霉素之NB培养液的选择培养基上。两个星期后，将培养物转移到新鲜的含有高浓度选择剂，即，NB+50毫克／升潮霉素的选择培养基上(Li等人，1993，一种使用biolistic方法的改进的水稻转化系统植物细胞报道12：250-255)。

通过转移到‘预再生’(PR)培养基+50毫克／升潮霉素中，将在NB+50毫克／升潮霉素上恢复的、密实、黄白色胚发生愈伤组织培养物再生。PR培养基包括含有2毫克／升苄基氨基嘌呤(BAP)、1毫克／升萘乙酸(NAA)、和5毫克／升脱落酸(ABA)的NB培养基。在黑暗中培养2个星期后，将愈伤组织转移到‘再生’(RN)培养基中。RN培养基的组成是含有3毫克／升BAP、0．5毫克／升NAA的NB培养基。将RN培养基上的愈伤组织培养物在高荧光灯(325英尺烛光)下，28℃孵育2周。在小植株开始形成后，将2厘米长的植株转移到含有1／2MS培养基(Murashige和Skoog，1962，用于烟草组织培养的快速生长和生物测定的修正的培养基，植物生理学15：473-497)、1／2 B5维生素、10克／升蔗糖、0．05毫克／升NAA、50毫克／升潮霉素、2．5克／升脱乙酰吉兰糖胶，调至pH5．8的品红盒中。具有发育良好的根系统的8-15厘米大的植物转移到土壤中(1份metromix：1份顶层土)并在温室中培养(29／24℃白天／黑夜循环，50-60％潮湿度，12小时光周期)。水稻植物长成可育转基因作物。这些植物结的种子含有插入到水稻愈伤组织中的基因，当长成植物时，将表达插入的基因所编码的蛋白质。

序列表<110>GEORGES，FAWZY

           DONG，JIN-ZHUO

           KELLER，WILF

           HUSSAIN，ATTA A．K．

           SELVARAJ，GOPALAN

           DATLA，RAJU<120>用于调节次级植物代谢物的方法和组合物<130>PCT<140><141><150>US60／072156<151>1998-01-22<150>US09／012453<151>1998-01-23<160>7<170>PatentIn Ver． 2．0<210> 1<211>483<212>DNA<213>滋养节杆菌<400> 1atggaccaat tcgtgggtct ccacatgatc tacacatacg agaacggttg ggagtacgaa 60atctacatca agaacgacca cacaatcgac taccgtatcc acagtggtat ggtgggtggt 120aggtgggtga gggaccaaga ggtgaacatc gtgaagctca caaagggtgt gtacaaggtg 180agctggacag agccaacagg tacagacgtg agcctcaact tcatgccaga ggagaagagg 240atgcacggtg tgatcttctt cccaaagtgg gtgcacgaga ggccagacat cacagtgtgc 300taccaaaacg actacatcga cctcatgaag gagagcaggg agaagtacga gacataccca 360aagtacgtgg tgccagagtt cgctgacatc acatacatcc accacgctgg agtgaacgac 420gagacaatca tcgctgaggc tccatacgag ggtatgacag acgagatcag ggctggtagg 480aag                                                                483<210>2<211>161<212>PRT<213>短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)<400>2Met Asp Gln Phe Val Gly Leu His Met Ile Tyr Thr Tyr Glu Asn Gly1           5             10             15Trp Glu Tyr Glu Ile Tyr Ile Lys Asn Asp His Thr Ile Asp Tyr Arg

         20                25                    30Ile His Ser Gly Met Val Gly Gly Arg Trp Val Arg Asp Gln Glu Val

         35                   40                   45Asn Ile Val Lys Leu Thr Lys Gly Val Tyr Lys Val Ser Trp Thr Glu

   50                    55                   60Pro Thr Gly Thr Asp Val Ser Leu Asn Phe Met Pro Glu Glu Lys Arg65                   70                   75                   80Met His Gly Val Ile Phe Phe Pro Lys Trp Val His Glu Arg Pro Asp

                     85                   90                   95Ile Thr Val Cys Tyr Gln Asn Asp Tyr Ile Asp Leu Met Lys Glu Ser

              100            105            110Arg Glu Lys Tyr Glu Thr Tyr Pro Lys Tyr Val Val Pro Glu Phe Ala

        115            120            125Asp Ile Thr Tyr Ile His His Ala Gly Val Asn Asp Glu Thr Ile Ile

  130                  135                   140Ala Glu Ala Pro Tyr Glu Gly Met Thr Asp Glu Ile Arg Ala Gly Arg

                                                    68145                   150                  155                   160Lys<210>3<211>546<212>PRT<213>滋养节杆菌<400>3Met His Ile Asp Asn Val Glu Asn Leu Asn Asp Arg Glu Phe Asp Tyr

1             5                  10                  15Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Arg Leu

         20                   25                  30Ser Glu Glu Pro Thr Val Ser Val Ala Leu Val Glu Ala Gly Pro Asp

     35                  40                  45Asp Arg Gly Val Pro Glu Val Leu Gln Leu Asp Arg Trp Met Glu Leu

 50                  55                  60eu Glu Ser Gly Tyr Asp Trp Asp Tyr Pro Ile Glu Pro Gln Glu Asn65                 70                   75                    80Gly Asn Ser Phe Met Arg His Ala Arg Ala Lys Ile Met Gly Gly Cys

            85                   90                 95Ser Ser His Asn Ser Cys Ile Ala Phe Trp Ala Pro Arg Glu Asp Leu

        100                 105                110Asp Glu Trp Glu Ser Lys Tyr Gly Ala Thr Gly Trp Asn Ala Glu Ser

    115                 120                125Ala Trp Pro Leu Tyr Gln Arg Leu Glu Thr Asn Glu Asp Ala Gly Pro

130                135                  140Asp Ala Pro His His Gly Asp Ser Gly Pro Val His Leu Met Asn Val

                                69145            150            155            160Pro Pro Ala Asp Pro Ala Gly Val Ala Leu Leu Asp Ala Cys Glu Gln

            165                  170               175Ala Gly Ile Pro Arg Ala Lys Phe Asn Thr Gly Thr Thr Val Ile Asn

       180                  185                 190Gly Ala Asn Phe Phe Gln Ile Thr Arg Arg Ala Asp Gly Thr Arg Ser

   195                  200                  205Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Pro Ile Ile Glu Arg Gly Asn Phe

210                215                  220Thr Leu Leu Thr Gly Leu Arg Ala Arg Gln Leu Val Phe Asp Ala Asp225                 230                  235                240Lys Arg Cys Thr Gly Val Asp Val Val Asp Ser Ala Phe Gly Arg Thr

           245                  250                255His Arg Leu Ser Ala Arg Cys Glu Val Ile Leu Ser Thr Gly Ala Ile

       260                  265                  270Asp Ser Pro Lys Leu Leu Met Leu Ser Gly Ile Gly Pro Ala Ala His

   275                  280                  285Leu Ala Glu His Gly Val Glu Val Leu Val Asp Ser Pro Gly Val Gly

290                 295                 300Glu His Leu Gln Asp His Pro Glu Gly Val Val Gln Phe Glu Ala Lys305                 310                 315                 320Gln Gln Met Val Gln Thr Ser Thr Gln Trp Trp Glu Ile Gly Ile Phe

            325                330                335Thr Pro Thr Glu Asn Gly Leu Asp Arg Pro Asp Leu Met Met His Tyr

       340                  345                   350Gly Ser Val Pro Phe Asp Met Asn Thr Leu Arg Tyr Gly Tyr Pro Thr

   355                  360                 365Thr Glu Asn Gly Phe Ser Leu Thr Pro Asn Val Thr His Ala Arg Ser

370                 375                380Arg Gly Thr Val Arg Leu Arg Ser Arg Asp Phe Arg Asp Lys Pro Ala385                 390                 395                 400Val Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Asp Pro Glu Gly His Asp Met Arg Val

            405                 410                 415Met Val Ala Gly Ile Arg Lys Ala Arg Glu Ile Ala Ala Gln Pro Ala

       420                  425                 430Met Ala Glu Trp Thr Gly Arg Glu Leu Ser Pro Gly Thr Glu Ala Gln

   435                 440                 445Thr Asp Glu Glu Leu Gln Asp Tyr Ile Arg Lys Thr His Asn Thr Val450                  455                460Tyr His Pro Val Gly Thr Val Arg Met Gly Pro Ala Asp Asp Asp Met465                 470                 475                 480Ser Pro Leu Asp Pro Glu Leu Arg Val Lys Gly Val Thr Gly Leu Arg

            485                  490                495Val Ala Asp Ala Ser Val Met Pro Glu His Val Thr Val Asn Pro Asn

        500                 505                 510Ile Thr Val Met Met Ile Gly Glu Arg Cys Ala Asp Leu Ile Arg Ala

    515                  520               525Ser Arg Thr Gly Glu Thr Thr Thr Ala Glu Ala Glu Leu Ser Ala Ser

530                 535                 540Leu Ala545<210>4<211>1641<212>DNA<213>滋养节杆菌<400>4atgcacatcg acaacgtcga aaacctcaac gaccgcgagt tcgactacat catcatcggc 60ggcggttccg ccggagcggc agtcgccgcc cgcctgagcg aggagcccac cgtgtccgtg 120gcgctggtgg aggccggccc ggacgaccgc ggcgttcccg aggtactgca gctcgaccgc 180tggatggagc tgctggaatc cggctacgac tgggactacc cgatcgaacc gcaggagaac 240ggcaactcct tcatgcgcca cgcccgcgcg aagatcatgg gtggctgctc cagccacaac 300tcctgcatcg ccttctgggc cccgcgcgaa gacctggacg agtgggagtc caagtacggc 360gccaccggct ggaacgctga gtccgcctgg ccgctgtacc agcggctgga gaccaacgag 420gacgccggcc cggacgcgcc gcaccacggc gactcaggcc cggtgcacct gatgaacgtg 480cccccggcgg accccgccgg cgtcgcactc ctggacgcct gcgaacaggc aggcattccg 540cgcgcgaagt tcaacaccgg caccaccgtg atcaatggcg ccaacttttt ccagatcaca 600cgccgcgcgg acggcacccg ttcctccagc tcggtctcct acatccaccc gatcatcgag 660cgcgggaact tcaccctgct gaccgggttg cgcgcccggc aactggtgtt cgacgcggac 720aagcgctgca ccggcgtcga cgttgtggac tcggcgttcg gccggactca ccggctctcc 780gcgcgttgcg aggtcatcct gtccaccggc gccattgact cgcctaagct gctcatgctc 840tccggcatcg gccccgccgc gcacctcgcc gagcacggcg tcgaggtcct ggtcgactcc 900cccggtgtcg gcgagcacct gcaggaccac cccgaaggcg tcgtccagtt cgaggccaag 960cagcagatgg tgcagacttc gacgcagtgg tgggagatcg gcatcttcac ccccaccgag 1020aacggcctgg accgcccgga cctgatgatg cactacggct ccgtcccgtt cgacatgaac 1080accctgcggt acggctaccc caccacggag aacggcttca gcctcacgcc gaacgtcacg 1140cacgcccgct cccgcggcac cgtccggctg cgcagccgcg acttccgcga caagcccgcc 1200gtcgacccgc ggtacttcac tgatccggag ggccacgaca tgcgcgtcat ggtggccggc 1260atccgcaagg cccgtgaaat cgccgcccag cctgccatgg ccgaatggac cggccgcgag 1320ctctcgcccg gcaccgaggc gcagaccgac gaggaactgc aggactacat ccgcaagacg 1380cacaacaccg tttaccaccc cgtcggcacc gtccgcatgg gaccagccga cgacgacatg 1440tcgccgctcg accccgagct gcgggtgaag ggcgtgaccg gcctgcgcgt cgccgatgcc 1500tctgtcatgc ctgaacacgt cacggtcaat cccaacatca ccgtcatgat gatcggcgaa 1560cgctgcgccg acctcatccg cgccagccgg accggcgaaa caacgacggc ggaggcggag 1620ctcagcgcgt ccctcgcctg a                                           1641<210>5<211>1494<212>DNA<213>Mesembryanthemum crystallinum<400>5aaaaaaaaaa ttttacttct ctgttttacc aaaaagagaa aaaaaaatga ctacttacac 60caatggcaac tacacacaac caaaaaccct agacaaagat gaacaattag ctggtttggc 120agtgacatta gcaaatgcag ctgcttttcc aatgatcctg aaatcagcct ttgagctaaa 180aatccttgac atattctcaa aagcagggga aggcgtgttt gtatcgactt ctgagatcgc 240tagccaaatc ggggcaaaga accctaatgc cccggtgttg ttggaccgga tgctccggct 300cctggctagc cactctgtgt taacatgcaa gctccaaaag ggtgagggtg gttctcaaag 360ggtgtatggt ccagctcccc tttgcaacta tcttgctagt aatgatggtc aaggctctct 420tggccctttg cttgttttgc atcatgacaa ggtcatgatg gagagttggt ttcacttgaa 480tgattacata ctagaaggag gtgttccatt caagcgcgct catgggatga tccaattcga 540ctacactggg actgatgaaa ggttcaatca tgtgttcaac caagggatgg cacaccacac 600tatcctggtc atgaagaagc tccttgacaa ctacaatggg tttaatgatg tcaaggtcct 660agttgatgtg ggtggtaaca ttggtgtcaa tgtgagcatg atcgtcgcta agcatactca 720cattaagggc atcaactatg acttgcctca tgtcattgct gatgctcctt cttaccccgg 780tgtggagcat gttggtggta acatgtttga gagcatacca caagcagatg ccattttcat 840gaagtgggtg ttgcatgatt ggagcgacga gcattgcgtg aagatactca acaagtgcta 900tgagagcctg gcaaagggag ggaagatcat ccttgtggaa tcgcttatac cagtaatccc 960agaagacaac ctcgaatcac acatggtgtt tagccttgat tgccacactt tggtgcacaa 1020ccaaggtgga aaagagagat caaaggagga ttttgaagcc ttagcttcca agactggctt 1080ctctacagtt gatgtcattt gctgtgccta tgacacttgg gtcatggagc tctacaagaa 1140gtgattcaag ctctaaatgc tgtgttgttg tcattgttgc tagcccaagt agctagctag 1200ctggttaaaa tttctcctac ctagcatttg ttttatggct aagttgagga gattcatgta 1260ttgtaaatgt tgtgtttggg tttgggtttg tatttgtatt tgtgttttgt tgttgtgtct 1320ttgtagctaa gttgatatcc tgctcatcta ggctggctgc attttttttg tggctgcctg 1380acaatgtagc atttgtggtt ttctttcaat aaagcatcta ttgtacctct gttatcagtg 1440tatgatttgc ctttattttt aataacttaa tttttttttt cttgtttata tcca        1494<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>6tttttggatc catgactact tacacaatgg caactaca                           38<210>7<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>7ttttttttgc ggccgcataa aggcaaatca tacactg                            37

Claims (32)

1．一种制备经遗传转化的植物的方法，包括

A)将一种DNA表达盒导入能被转化并再生为完整植物的植

物细胞，所述DNA表达盒除植物细胞中转化和选择所要求的

DNA序列之外，还包括在植物细胞中有活性的启动子控制之下

的DNA序列，该DNA序列编码一种能够修饰次级代谢途径中

底物可用性的蛋白质，前提是底物不是选自葡萄糖、氨基酸、普

通脂肪酸和核苷酸的初级代谢物，以及

B)重获具有至少一种次级代谢途径的产物含量已经被改变的

植物。

2．一种制备经遗传转化的种子的方法，包括在允许种子形成的条件下培植根据权利要求1的方法中步骤A和B所得到的植物。

3．根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中启动子是组织选择性的。

4．根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中启动子是种子选择性的。

5．根据权利要求4所述的方法，其中种子选择性启动子选自菜豆蛋白启动子和napin启动子。

6．根据权利要求1到5中任何一个所述的方法，其中次级代谢途径的产物是损营养性的。

7．根据权利要求1到6中任何一个所述的方法，其中蛋白质是一种异源酶。

8．根据权利要求1到7中任何一个所述的方法，其中所编码的蛋白质是能够改变类苯丙酸途径中的底物的酶，由此引起类苯丙酸途径中至少一种产物的改变。

9．根据权利要求8中所述的方法，其中所编码的蛋白质是能够作用于胆碱以改变类苯丙酸途径中其它酶对胆碱使用的胆碱代谢酶。

10．根据权利要求2到9中任何一个所述的方法，其中胆碱代谢酶是胆碱氧化酶，其中编码胆碱氧化酶的DNA序列在植物细胞中有活性的种子选择性启动子的控制之下。

11．根据权利要求8中所述的方法，其中所编码的蛋白质是能够作用于甜菜醛将它转变为甜菜碱的甜菜醛脱氢酶，所述的甜菜醛脱氢酶编码DNA序列在植物细胞中有活性的种子选择性启动子的控制之下。

12．根据权利要求7中所述的方法，其中所编码的蛋白质是阿魏酸脱羧酶。

13．根据权利要求1到7中任何一个所述的方法，其中所编码的蛋白质是能够作用于糖醇的酶。

14．根据权利要求13中所述的方法，其中所编码的蛋白质是能够作用于肌醇的酶。

15．根据权利要求1到8中任何一个所述的方法制备的具有降低的芥子碱含量的经遗传修饰的植物种子。

16．根据权利要求13所述的方法制备的具有改变的酚含量的经遗传修饰的植物种子。

17．根据权利要求1到8中任何一个所述的方法制备的具有改变的木质素含量的经遗传修饰的植物。

18．根据权利要求13所述的方法制备的具有改变的糖醇含量的经遗传修饰的植物种子。

19．根据权利要求13所述的方法制备的具有降低的肌醇六磷酸含量的经遗传修饰的植物种子。

20．DNA载体pHS731。

21．DNA载体pHS981。

22．DNA载体pGS97b1。

23．DNA载体pSIMT。

24．DNA载体pNIMT。

25．一种DNA载体，其含有在菜豆蛋白启动子控制之下的选自COX基因、BADH基因、IMT基因和阿魏酸脱羧酶基因的基因。

26．一种通过权利要求1到14中任何一个所述的方法制备的植物，其中植物选自双子叶植物纲和单子叶植物纲。

27．一种通过权利要求1到14中任何一个所述的方法制备的植物，其中所述的植物选自锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linaceae)、菊科(Compositae)、Fabaceae、大戟科(Euphorbiaceae)、禾本科(Gramineae)和木犀科(Oleaceae)中的成员。

28．一种通过权利要求1到14中任何一个所述的方法制备的植物，其中所述的植物是十字花科中的成员。

29．一种通过权利要求1到14中任何一个所述的方法制备的植物，其中所述的植物选自亚麻属(Linum)、棉属(Gossypium)、大豆属(Glycine)、落花生属(Arachis)、红蓝菊属(Carthamus)、向日葵属(Helianthus)、苜蓿属(Medicago)、欧白芥属(Sinapis)、萝卜属(Raphanus)、蓖蔴属(Ricinus)、樨榄属(Olea)、玉蜀黍属(Zea)、大麦属(Hordium)、小麦属(Triticale)和稻属(Oryza)中的成员。

30．通过根据权利要求1到14中任何一个所述的方法制备的植物，其中所述的植物是芸苔属的成员。

31．通过根据权利要求1到14中任何一个所述的方法制备的植物，其中所述的植物是Brassica napus或芜菁。

32．一种饲料产品，包括种子或从其衍生的粉，其中种子是根据权利要求2到14中任何一个所述的方法制备的。

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