JP2002502587A - 植物において二次代謝化合物のレベルを改変する方法および組成物 - Google Patents

植物において二次代謝化合物のレベルを改変する方法および組成物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、二次代謝経路の少なくとも１種の産物の含量を変更した遺伝的形質転換植物を作出する方法を提供する。この方法は、形質転換可能で、かつ、完全な植物体へと再分化可能な植物細胞へＤＮＡ発現カセットを導入することからなる。この発現カセットは、植物細胞における形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列を含む。それはまた、植物細胞中で活性なプロモーターの下で二次代謝経路における基質の利用を改変することができるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。この基質は、グルコース、アミノ酸、一般脂肪酸およびヌクレオチドから選択される群の一次代謝産物ではない。次いで、二次代謝経路の少なくとも１種の産物の含量が変更された植物または種子をはじめとする植物組織を再生することができる。本発明はまた、本方法に従って得られた植物および種子に由来する飼料製品を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本願は米国出願出願番号第０９／０１２，４５３号の一部継続出願であり、仮
出願６０／０７２，１５６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、植物における二次代謝経路によって産生される化合物を変更する方
法および組成物を提供する。本発明はまた、二次代謝産物の含量を改変した植物
細胞および二次代謝産物含量の変化した植物種子を提供する。１つの具体例では
、本発明に従い、植物、植物細胞および植物種子において、抗栄養二次代謝産物
の含量が変更される。もう１つの具体例では、本発明に従い、植物、植物細胞、
植物種子において、フェニルプロパノイドおよび糖アルコール二次代謝経路内で
見られる産物が変更される。本発明はさらに、植物細胞および種子の二次代謝産
物含量を改変するのに有用な遺伝子構築体およびベクターを提供する。本発明は
さらに、改良種子粉餌、および改良種子粉餌を含有する動物飼料、特に二次代謝
産物を減少または変更させた種子粉餌に関する。
【０００３】
【発明の背景】
植物は二次代謝によって種々の化合物を産生する。植物の代謝に必須であると
は考えられないものの、二次代謝経路は時に独特の生化学物質を産生し、その中
には抗栄養的または有毒さえ考えられるものまである。二次代謝経路およびこれ
らの経路により産生される化合物は、それぞれの種または属に特異的である。従
って二次代謝経路を操作すると、新規な生化学物質の組成物の産生または二次代
謝含量を変更した植物組織の作出が可能となる。特に、本来抗栄養的または有毒
な二次代謝化合物の変更を目的とする二次代謝の操作は、食物および飼料の領域
で独自の用途を提供することができる。
【０００４】 望ましいのは、植物細胞の増殖と生存に必須であると考えられる生化学的過程
を妨害することなく二次代謝を操作することである。生化学的過程の集合体と植
物の生育と生存に必須である関連化合物とは、一次代謝経路とそれらの産物と考
えられる。一次代謝は一般に、一次糖（グルコースなど）、アミノ酸、一般脂肪
酸、ヌクレオチドおよびそれらに由来する重合体（デンプンなどの多糖類、タン
パク質、脂質、ＲＮＡおよびＤＮＡなど）の形成をもたらす生化学的過程を包含
すると考えられている。Yeoman and Yeoman, Tansley Review No. 90, Manipula tiong Secondary Metabolism in Cultured Plant Cells , New Phytologist, 134
;553-569, 1996.
【０００５】 従って、当該技術分野では、一次代謝を総ての植物細胞の生存と増殖に必須な
代謝過程と定義できる一方、二次代謝は総ての植物細胞に必須でない生化学的過
程と定義できるものと認められる。例えば、二次代謝経路はかかる植物の色、風
味、形態などの特徴を決定する。また、二次代謝は昆虫に認識される、あるいは
病原応答に関する種々の化合物を産出する。これらの化合物の中には野生条件下
で、ある植物種に利益を与えるものがあるが、栽培下ではこれらの化合物は収穫
物の品質に不利となるかもしれず、あるいはある用途に関しては作物の有用性を
限られたものにする可能性がある。二次代謝産物の中には、分化した生化学的経
路の結果、種内で進化した独自の化合物がある。二次代謝は、一次代謝に典型的
な生化学的メカニズムにおける重複性という特徴をもっていないので、特質上、
二次代謝産物は植物において多重経路により産生されるものではない。二次代謝
産物は典型的には、一次経路に関与する偏在性の生化学物質よりも植物特異的で
ある。
【０００６】 一次代謝経路の操作に対する多くの試みの結果、デンプンまたは油（脂質）含
量が変更された植物細胞が得られた。しかし、一次代謝を著しく操作することは
有害な影響を招くおそれがある。例えば、脂質の組成は変えられても、脂質の消
失は明らかに細胞の生存に有害であろう。重複する生化学的メカニズムは操作に
おけるいつくかの試みを克服できるので、一次代謝の操作は必ずしも完全に好結
果を生むものではない。従って植物における一次代謝経路は、予測可能で、かつ
、栽培条件下で有用かつ有形の結果を与える方法では操作し難いことがしばしば
である。
【０００７】 いくつかの例では、一次代謝を変更して、特異的物質の減少または消失ではな
く、組成変化を示す新規な表現型を作出することに成功している。典型的には、
特定の組織内または調節型ではなく構成型での遺伝子の過剰発現といった植物遺
伝子の異所発現により、あるいはアンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたは共同抑
制による特異的遺伝子の阻害によって、これらの操作が達成された。しかし、こ
うした操作の結果を仮定において予測することは困難であった。
【０００８】 植物の酵素の発現は多くのレベルで改変され得る。これには遺伝子発現レベル
での制御、翻訳、タンパク質のプロセシングおよびタンパク質機能のアロステリ
ック制御が含まれる。従って、一次代謝に関与する植物遺伝子の異所発現は、一
次代謝の調節における複雑な生化学的制御を克服できないであろう。さらに、一
次代謝経路は植物の生育と生存にとって必須であるので、一次代謝における重複
性はまた、これらの操作において克服困難な障害を有している。それゆえに一次
代謝を変更しようとする試みは、意図した表現型を得ることができないことが多
い。さらに、現場（field）レベルにおいて、または種々の極端な環境下におい て、改変されたこれら植物の評価が、予測した結果が観察されない、または植物
生産性が損なわれたという発見をもたらすことしばしばであった。従って、一次
代謝の改変には一次代謝経路に対する注意深い考察、あるいは特異的な表現型を
得るための経路での慎重な工程が要求される。
【０００９】 二次代謝経路の操作は、関連する生化学に関する理解が不十分であること、二
次代謝経路で発現される遺伝子についての情報が少ないこと、また一般的には生
化学的経路間に複雑な相互関係があることにより理解し難かった。
【００１０】 しかしながら、二次代謝を変更する方法は、例えば本来抗栄養的と考えられて
きたような二次代謝化合物のレベルを変更されたものをを含む、新規な表現型を
作出する価値ある手段が提供できる。従って、二次代謝経路は植物の遺伝子操作
の重要な標的となるものである。
【００１１】 二次代謝経路と考えられる、植物における２つの生化学的経路が最終産物のレ
ベルの変更を目的とする研究の対象であった。これらの経路の操作に用いられた
方法は所望される結果を生んでいない。例えば、フェニルプロパノイド経路はリ
グニンの形成に関与していて、二次代謝経路と考えられている。リグニンの生合
成は、一般のフェニルプロパノイド生合成経路の一部であり、この経路は少なく
とも３種の主要なフェノール前駆体であるクマル酸、フェルラ酸、およびシナピ
ン酸を産生し、その産物は重合してリグニンや他のフェノール化合物となる（図
２参照）。
【００１２】 二次代謝フェニルプロパノイド経路を変更する試みでは、現在、リグニン単量
体の形成に関わる多くの酵素の遺伝子が、アンチセンスまたは共同抑制技術でリ
グニンを減少させる標的として同定されている （例えば、米国特許第５，４５ １，５１４号、米国特許第５，６３３，４３９号、ＷＯ９３／０５１６０、ＷＯ
９４／０８０３６）。これらの標的遺伝子にはシンナミルアルコールデヒドロゲ
ナーゼ、カフェイン酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼおよびフェニルアラニンア
ンモニアリアーゼをコードするものが含まれる。リグニン含量の減少は植物の加
工または消化性に対して総合的に有益な効果を有するとされているので、これら
の技術は、リグニン含量の減少に向けられている。
【００１３】 しかしながら、フェニルプロパノイド経路内の遺伝子の１つを標的とする、ア
ンチセンスまたは共同抑制技術によるリグニンの減少は、いくつかの望ましくな
い効果を有する可能性がある。それには罹病率の上昇、成長速度または植物繊維
の物理的強度の低下、またそれゆえに農業経済効率の低下が含まれるであろう。
酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼの阻害は多くの有害な表現型をもたら
すことがわかっている(Elkind et al., Abnomal Plant Development and Down-R
egulation of Phenylpropanoid Biosynthesis in Transgenic Tobacco Containi
ng a Heterologous Phenylalanine Ammonia Lyase Gene, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87: 9057-9061, 1990)。酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼは一 次代謝物であるアミノ酸のフェニルアラニンに作用する。これらの実験結果は、
特定の二次代謝経路に関与する一次代謝物の１つを改変して二次代謝を変更する
と、予期しない有害な表現型を作出する可能性があるということを証明するもの
である。従って、二次代謝経路内での生化学的段階を選択することは、表現型の
上では正常であるが特定の二次代謝産物の減少を示す植物を作出するのに非常に
重要である。さらに、アンチセンスＲＮＡまたは共同抑制戦略を用いると、二次
代謝産物の減少の、商業上許容されるレベルまたは特異性を得ることはできない
であろう。さらには、鍵となる酵素活性をコードする遺伝子の阻害は、関連遺伝
子の発現に作用するであろう。従って、抗栄養的と考えられるフェノール化合物
の減少、または有害な副作用を伴わないアンチセンスＲＮＡまたは共同抑制によ
るリグニン含量の減少を用いた場合には進展はほとんどなかった。
【００１４】 所望の結果が得られなかった代謝経路を変更する努力の２つめの例は、カノー
ラにおけるグルコシノレート生合成の改変である。グルコシノレート経路の操作
によりカノーラ粉餌のグルコシノレート含量を改変しようとする試みが報告され
ている。グルコシノレートの生合成を変更する目的で提案された方法の１つは、
グルコシノレートの形成に用いられる硫黄に関して競合する新しい経路を作り出
すことか、あるいはトリプトファンからトリプタミンへの変換によるグルコシノ
レートの形成に用いられるトリプトファンのレベルを減少させることである。("
Engineering Altered Glucosinolate Biosynthesis by Two Alternative Strate
gies", by Ibrahim, Chavadej & De Luca, published in: Genetic engineering of plant secondary metabolism 1994, Plenum Publishing Corporation; New
York; USA).
【００１５】 しかしながら、この方法はカノーラ種子粉餌のグルコシノレート含量を首尾よ
く減らすことはできなかった。この方法はカノーラ粉餌におけるグルコシノレー
トの抗栄養含量を減らすことができなかった。グルコシノレートは植物の葉で作
られ、種子へと輸送される。従ってこの方法は、グルコシノレートの形成に用い
られる一次代謝物（硫黄、アミノ酸トリプトファン）のうちの１つの利用能の単
純な変更がグルコシノレートの産生を減らすであろうとの確信に基づくものであ
る。しかしながら、種子内の一次グルコシノレートは、側鎖の形成のためのアミ
ノ酸トリプトファンを利用しない脂肪族グルコシノレートである。さらに、これ
らの実験結果(例えば、Chavadej et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91: 216
6-2170, 1994)は、一次アミノ酸トリプトファンを変更し得る酵素を有するトラ ンスジェニック植物の種子ではグルコシノレート含量が減少していないことを証
明しており、この種子中の脂肪族グルコシノレート含量は非トランスジェニック
植物と等しいかまたは多い可能性さえある。従って、たとえ微量な成分（インド
ールグルコシノレート）の減少が見られたとしても、種子内の総グルコシノレー
ト生産は減少していなかった。従来の育種によって低グルコシノレート植物を得
ることが可能であること、また、アブラナ科では低グルコシノレートを制御する
多くの遺伝子座が存在することは、遺伝学的研究から明らかである。グルコシノ
レートの生合成で起こる生化学的形質転換は数多くあり、グルコシノレートの合
成の総てまたはほとんどに共通するこれらの工程は、総グルコシノレートを減少
させる方法が必要とされる場合に標的となるべき工程である。従って、もし全般
的に有用な方法を考案するとすれば、アブラナ科におけるグルコシノレート生産
を変更する一般法としては、別の酵素とグルコシノレート生合成で用いられる基
質を考慮に入れなければならない。
【００１６】 しかしながら、この改変を得るために用いられる酵素はまた、一次代謝物（ア
ミノ酸トリプトファンおよび無機硫黄）に作用することが明らかであり、ゆえに
植物細胞におけるこれらの化合物のいずれの有意な変更も有害な作用を有するも
のと思われる。従って、提案された方法は二次代謝経路を特異的に標的とするこ
とができなかった。実際、トリプトファンの変更は多くの有害な作用をもたらす
ものと予想できる。従って、一次代謝物のレベルの変更は低グルコシノレートカ
ノーラ粉餌について意図した効果を生み出さず、このことは一次代謝を改変する
難しさを強調するものである。
【００１７】 従って、二次代謝を変更する一般法は、植物組織の生化学的組成を変更するこ
とに価値があるだろう。これには例えば、抗栄養化合物の減少、二次代謝プロフ
ィールの変更、加工特性が変更された植物組織の提供、産業上有用なまたは医薬
上注目される化合物のレベルの変更、風味、質感または外観を改変した植物の作
出、昆虫の誘引に関与する二次代謝産物を変更した植物の作出、病害耐性または
二次代謝産物の影響を受ける他の生物学的過程、または二次代謝産物の変更によ
り生育特性を積極的に改良した植物などが含まれる。
【００１８】
【発明の概要】
本発明は二次代謝産物の形成を標的とする方法を提供する。この方法は、二次
代謝経路に特異的であり、かつ、最終の二次代謝産物の形成に不可欠な基質、特
に最終産物の形成の１〜５つの生化学的段階の範囲内にある化合物の利用能を変
更することを含んでなる。最終産物の形成に近い段階にある標的基質は、一次代
謝経路への基質の流入点の後に生じるので、一次経路にも関与する代謝産物の選
択に伴う問題を防げる。従ってこの方法は、一次代謝経路の基質を含まない二次
代謝経路内で用いられる前駆体を同定することにより、二次代謝産物を減少させ
るまたは変更することを特に標的とする新規な手段を提供する。
【００１９】 またこの方法は、組織特異的に基質の利用能を変更することを含んでなり、そ
の結果、特定の組織、例えば種子のみが変更される。 従ってこの方法は、一次代謝化合物を含まない二次代謝経路内で用いられる前
駆体を同定することにより、二次代謝産物を減少させるまたは変更することを特
に標的とする新規な手段を提供する。
【００２０】 １つの具体例では、本発明は、遺伝的に形質転換された植物を作出する方法で
あって、 Ａ）形質転換可能であり、かつ完全な植物体へと再分化可能な植物細胞へ、植
物細胞における形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他、植物細胞中で活性
なプロモーターの制御の下、二次代謝経路の基質の利用を改変することができる
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ発現カセットを導入し（
ただし、この基質はグルコース、アミノ酸、一般脂肪酸およびヌクレオチドから
選択される群の一次代謝産物ではない）、さらに Ｂ）二次代謝経路の少なくとも１種の産物の含量が変化した植物を再生させる
、ことを含んでなる方法を提供する。
【００２１】 もう１つの具体例では、本発明は、遺伝的に形質転換された種子を作出する方
法であって、種子の形成が可能な条件の下で、前記の方法の段階ＡおよびＢに従
って得られた植物を生育させることを含んでなる方法を提供する。
【００２２】 この組換えＤＮＡは稔性植物のゲノム中に染色体レベルで組み込まれ、従って
次代に受け渡される。 さらなる具体例では、本発明は、植物を形質転換するためのベクター、前記の
方法に従って形質転換された植物および種子、ならびにその種子またはそれに由
来する粉餌を含有する飼料製品を提供する。
【００２３】
【発明の詳しい説明】
本発明は、一次代謝産物とは異なる二次代謝産物の前駆体の特異的減少または
変更に関する。このようにすれば、同様の結果を達成するために一次代謝経路を
変更する有害な作用の可能性が避けられる。従って本発明は、一次代謝産物とみ
なし得る化合物の操作を避けるものである。
【００２４】 好ましい適用では、例えば基質に作用することができ、かつ、利用できる基質
プールからその基質を除去する、または利用できる基質プールの基質の利用能を
改変し、植物細胞とは異種のものである酵素を使用することによって、基質の利
用能を変化させる。この方法の概要および一次代謝と二次代謝の関係は図１に示
されている。二次代謝経路の産物の流れを変更するために異種の酵素活性を使用
することで、所望の標的二次代謝産物が改変される。これにより二次代謝経路の
産物の流れが変化し、所望の標的二次代謝産物が変化する。このようにすること
により、二次代謝経路内の特定の酵素的段階の最終産物のレベルが低くなり、一
方これに対し、この経路の他の段階では産物が高レベルに集積し、その産物の産
生を担う酵素を阻害する。このフィードバック阻害は次ぎに、全二次代謝経路か
らの最終産物の産生に影響を及ぼす。このように特異的な二次代謝経路の産物の
レベルの変化は、この経路による生化学物質（例えば、その基質および産物）の
流れを変える新規な酵素活性を導入することによって達成される。異種の酵素は
植物組織で発現され、これらの経路内の前駆体の、植物細胞に有害な作用を持た
ず集積する基質への代謝転換が起こる。
【００２５】 いくつかの具体例では、この方法の結果として価値ある産物または植物細胞に
有益な作用を有する産物が形成される。
【００２６】 １つの具体例では、標的とされる前駆体は次いで、新規な酵素活性の付加によ
り改変される。本発明の１つの好ましい態様は、それが発現する植物細胞とは異
種の活性を有する酵素の選択を意図したものである。例えば、この酵素は植物細
胞の問題とされる二次代謝経路と通常関連しないものである。使用される酵素は
植物または微生物起源であってもよく、植物細胞中で好ましく発現するよう改変
することができる。選択される異種の酵素は前駆体を改変して、二次代謝産物の
形成に関するその利用能を変更することができる。それが発現される細胞に対し
て異種の酵素活性を用いることにより、正常な生化学的制御機構が迂回され、予
測できる様式で二次代謝を変化させる。本発明の範囲内で特に注目されるのは、
糖アルコールおよびフェニルプロパノイド二次代謝経路に関する二次代謝経路の
産物の改変である。
【００２７】 本方法の有用性のさらなる例は、ガラクトースなどの修飾糖化合物およびスタ
キオースおよびラフィノースなどの抗栄養スクロシルグリコシドのレベルの変更
に見出せる。ガラクトースは、これらの抗栄養スクロシルグリコシドの形成のた
めの前駆体の１つであるガラクチノールへ変換する。ガラクトースの前駆形態は
ＵＤＰ−ガラクトースと呼ばれる複合形態である。本発明の範囲内で意図される
方法として、ＵＤＰ−ガラクトースの形成および集積（ならびにこれに次ぐガラ
クチノールへの変換）は植物細胞に対して異種の酵素活性を利用することにより
防げ、この酵素はＵＤＰ−ガラクトースのレベルを変更することができるもので
ある。酵素ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ｇａｌＥ）は生体系におけ
るガラクトース代謝の主要な段階の１つに関与している。それはＵＤＰ−ガラク
トースのＵＤＰ−グルコースへの変換を触媒する。この酵素の遺伝子はヒト、酵
母および細菌から得られる。本発明では、細菌にコードされる酵素の使用を意図
している。
【００２８】 植物細胞でのこの異種の酵素の発現の結果、ＵＤＰ−ガラクトースの利用能は
低下し、有用な化合物ＵＤＰ−グルコースが生産される。酵素ＵＤＰ−ガラクト
ース４−エピメラーゼの発現により、抗栄養スクロースグルコシドの前駆体の１
つであるガラクチノールの生合成は減少するということが十分確信される。望ま
しくないスクロースグリコシドの集積率が低下することに加え、新たに導入され
た酵素の活性がＵＤＰ−グルコースの利用能を高め、次いでスクロースの形成を
高めることになる。後者は、植物の生産性（例えば、タンパク質、脂質、全体の
収量など）を高めるための炭素源としてか、あるいは直接的には集積された糖ス
クロースとしてスクロースが必要とされる他の代謝経路の活性に関与してそれを
高めるものと考えられる。
【００２９】 この方法のなおその他の適用は、本発明の範囲内にあるものと考えることがで
きる。酵素ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）を用いることにより、グルコース−
１−リン酸およびグルコース−６−リン酸などの種々の糖誘導体のレベルを変更
することができる。この酵素はスクロースの合成と消費においてグルコース−１
−リン酸とグルコース−６−リン酸（Ｇ−１−Ｐ、Ｇ−６−Ｐ）の相互変換を触
媒する。この酵素はスクロース、デンプンおよびグリコーゲンの合成および利用
において中枢的役割を果たし、これはあらゆる生物に存在する。この酵素の遺伝
子は種々の真核生物ならびに細菌源（例えば、アグロバクテリウム(Agrobacteri um )）から得られる。
【００３０】 Ｇ−６−Ｐはいくつかの糖の相互変換の主要な出発物質であり、その１つにミ
オイノシトール−１−Ｐの合成がある。後者はそれぞれフィチン酸および抗栄養
スクロシルグリコシドの合成の主要基質および補因子である。この酵素の発現は
前記の抗栄養因子のレベルがより低くなるよう翻訳されるＧ−６−Ｐのレベルを
低くするものと考えられる。従って、種々の代謝変更は本発明の範囲内にあると
考えられる。
【００３１】 この方法は特定の二次代謝経路のいずれをも制限するものではない。Ｎｏｒは
特定の植物種のいずれもを制限する方法である。むしろこの方法は、単子葉類お
よび双子葉類を含む商業的に価値ある多くの作物種に共通する二次代謝経路を変
更するため、あるいは特定の作物に対して独自の重要性を有する二次代謝産物を
標的とするために適用できる。
【００３２】 本発明の方法の生化学的基礎は、基質の利用能による酵素活性の調節の概念に
見出せる。一般に、酵素作用速度は基質の利用能により影響を受ける。言い換え
れば、酵素は利用できる基質の量に比例する速度で産物を産生する。基質濃度が
低下すると、産物レベルは低くなる。さらに多くの酵素は最終産物による阻害を
受けるが、このことは酵素作用速度が大過剰の最終産物の存在下では低下するこ
とを意味する。従って、利用できる基質または酵素産物のレベルを変更すること
により、生化学的経路によって産生される化合物の全体の産生を変化させること
ができる。
【００３３】 本発明によって変更され得る二次代謝経路の例としては、イソプレノイド生合
成、アルカノイド生合成、テルペノイド生合成、フェノール生合成、糖アルコー
ル生合成、または抗栄養物もしくは商業的に価値ある性質を有する化合物を産生
する他のいずれかの二次代謝経路が挙げられる。本発明によって改変され得る特
異的な二次代謝産物としては、アブラナ科のシナピンまたはグルコシノレートな
どの抗栄養フェノール化合物、フィチン酸またはスタキノースおよびラフィノー
スなどの糖アルコール産物、ワタのゴシポール、ニコチン、クロロゲン酸、濃縮
タンニンまたは他のいずれかの抗栄養二次代謝産物が挙げられる。化合物クロロ
ゲン酸はダイズ、ワタ、ヒマワリに共通するものであり、フェニルプロパノイド
経路で産生される化合物であるカフェイン酸から誘導される。なおその他の抗栄
養化合物としては、アルファルファをはじめとする多くの植物に見られる抗栄養
化合物であるサポニンが挙げられる。サポニンはトリテルペンまたはステロイド
アグリコンと結びついた糖部分からなる高分子量グリコシドである。少なくとも
このようなクラスのサポニンとして知られているものには、トリテルペングリコ
シド、ステロイドグリコシドおよびステロイドアルカノイドグリコシドがある。
植物におけるサポニンの生合成には出発物質のスクワレンが含まれる。また、フ
ィトステノール、カルデノリド、ククルビタシン、クワシノイドおよびリモナイ
ドなど、重要な二次代謝産物クラスもスクワレンから誘導される。動物の食餌中
の過剰なサポニンは鼓脹症として知られる症状に関与している。
【００３４】 本発明は、多くの関連のない二次代謝経路における本方法の有用性の証明によ
って実証される。しかしながら、いずれかの植物二次代謝経路を改変するための
本方法の有用性は当業者には明らかであり、本発明を行う一般法を提供する。
【００３５】 １つの具体例では、本発明は、植物のシナピン含量および関連のフェノール化
合物を変更する方法ならびにＤＮＡ組成物を提供する。もう１つの具体例では、
本発明はフェノール含量が改変された植物細胞、フェノール含量が減少した植物
種子、特にシナピン含量が減少したアブラナ科植物を提供する。もう１つの具体
例では、本発明は、植物細胞において、糖アルコール二次代謝経路の産物である
フィチン酸含量を変更するための方法およびＤＮＡ組成物を提供する。もう１つ
の具体例では、本発明は、フィチン酸含量が改変された植物細胞およびフィチン
酸が減少した植物種子を提供する。もう１つの具体例では、本発明は、飼料の施
用に好適な、フィチン酸含量が減少した植物種子、改良粉餌の製造に好適な フィチン酸含量が減少した植物種子、および糖アルコール（イノシトール）代謝
が改変された植物細胞を提供する。
【００３６】 植物における各々の二次代謝経路は、それと関連した限られた数の酵素および
独自のまたは独自の様式で用いられるこれら酵素の基質を有する。二次代謝経路
は植物中で使用されるまたは植物中に存在する種々の化合物を産生する。従って
、二次代謝を変更する手段として、独自の酵素活性を用いて特異的経路による化
合物の流れを特異的に変更する。この方法の有用性を示すために、２つの異なる
二次代謝経路が本発明の方法に従い改変された。本方法の特徴を十分に理解する
助けとなるこれらの経路に関する情報は以下に示される。
【００３７】 （Ａ）フェニルプロパノイド代謝の二次代謝経路 植物は、二次代謝経路であるフェニルプロパノイド経路によって種々のフェノ
ール化合物を産生する。フェニルプロパノイド代謝はなかでも、病害抵抗性、紫
外線防護および植物生長調節をはじめとする植物における多くの生理学的プロセ
スに関与している。この経路の産物は、植物組織の成分であり、植物繊維（種子
または種子粉餌中の代謝を受けにくい炭水化物に対する一般名称）の形成に関与
するスベリンおよびリグニン生合成に必要である。リグニンは不溶性繊維の形成
に関与するものと考えられ、ゆえに種子または粉餌中の高レベルのリグニンは、
特に単胃動物における粉餌または種子が十分に利用されないことに関係している
。従って、植物フェノール、特にリグニンのフェノール前駆体は動物飼料の抗栄
養因子と考えられ、植物フェノール、特にリグニン形成に使用されるフェノール
の減少または適当な変更は優れた粉餌を提供できる。
【００３８】 また植物フェノールは、種々のその他の化合物の形成にも関与しており、その
いくつかもまた本来抗栄養的なものである。
【００３９】 本発明は、植物細胞、種子または飼料の使用される粉餌において、抗栄養的で
あるとみなされる特異なフェノール化合物を減少させる手段を提供する。特に本
発明は、それを産生する植物細胞において苦味のある抗栄養化合物シナピン（ま
たはシナポイルコリン）の減少を意図するものである。シナピンはまた、粉餌中
のタンパク質と複合体を形成して、動物による消化および利用に対するタンパク
質の利用能を低下させると考えられる。また苦味は食餌レベルにも影響を及ぼし
得る。さらに、茶色の殻の卵を産むニワトリの数系統に与えた場合、シナピンは
卵が魚臭くなる。このような場合、シナピン含有粉餌の割合は約１０％以下に留
める必要があり、このためこのような飼料配合物におけるシナピン含有粉餌の使
用は限られたものとなる。従ってアブラナ科由来の種子および種子粉餌中のシナ
ピンを減らすことが商業目的上重要である。
【００４０】 シナピンの産生はフェニルプロパノイド経路の拡大として起こる。本発明の範
囲内で定義される経路には、シナピン酸の形成をもたらす生化学的段階、ならび
にリグニン単量体やフェニルプロパノイド経路の産物に由来するその他の生化学
物質の形成をもたらす分岐経路が含まれる。
【００４１】 フェニルプロパノイド経路では、芳香族アミノ酸であるＬ−フェニルアラニン
が酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）の基質となる。ＰＡＬの
酵素活性により桂皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）の基質となる桂皮酸が
形成される。Ｃ４Ｈの産物は多くのフラボノイド化合物の前駆体となるｐ−クマ
ル酸であり、そのいくつかはまた酵素チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）の
作用によりＬ−チロシンからも形成され得る。クマル酸はリグニン生合成の前駆
体としても働く。酵素ｐ−クマル酸−３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）はｐ−ク
マル酸に作用してカフェイン酸を生じる。カフェイン酸はカフェイン酸／５−ヒ
ドロキシフェルレート−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）により代謝さ
れてフェルラ酸が形成する。フェルラ酸はリグニン生合成に用いられる主要なフ
ェノール単量体として知られる３種のうちの１種である。フェルラ酸は５−ヒド
ロキシフェルラ酸を生じる酵素フェルラ酸−５−ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）の
基質ともなり得、５−ヒドロキシフェルラ酸は酵素ＯＭＴによってさらに修飾さ
れてシナピン酸が生じる。シナピン酸はその他の主要なフェノールリグニン単量
体である。シナピン酸はまた、酵素ＵＤＰ−グルコースシナポイルトランスフェ
ラーゼ（ＳＧＴ）の作用により、結合してシナポイルグルコースとなる。シナポ
イルグルコースはシナポイルグルコース：コリンシナポイルトランスフェラーゼ
（ＳＣＴ）の基質として働き、シナポイルコリンまたはシナピンが形成される。
これら後者の２つの段階はアブラナ科において有力であり、種子中のシナピンの
集積は、成熟種子に見られる主な非重合フェノール化合物に相当する。フェニル
プロパノイド代謝の一般経路は図２に示されている。ある植物種では、付加的な
酵素活性としてフェニルプロパノイド経路部分があり得ることに留意すべきであ
る。
【００４２】 シナピンまたはシナポイルコリンはアブラナ科の種子において最も豊富なフェ
ノール化合物であり、アブラナ（B. napus）では粉餌の４％という高さを占める
(Blair and Reichert, 1984., J. Sci. Food Agric, 35:29)。シナピン合成は、
外観上まだ薄緑である成熟種子で起こり、種子の成熟とともに正味分解されずに
現れる(Vogt et al., 1993., Arch. Biochem. Biophys. 300: 622)。発達中の種
子（すなわち発芽中の種子）は、シナピン酸およびコリンを生じるエステラーゼ
反応によってシナピンを分解する。明らかではないまでも、シナピンの分解は種
子の発芽中リン脂質の合成に対するコリン供給を果たすと仮定されている(Strac
k et al., 1981., Z. Naturforsch. 36c: 215)。しかしながら、アブラナ科以外
のほとんどものはその種子中にシナピンを含んでないので、シナピンは通常の種
子発達または発芽にとって不可欠な化合物であるとは考えにくい。
【００４３】 アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)において、一般フェニルプ
ロパノイド経路に欠損がある突然変異が単離された(Chapple et al., 1992., Th
e Plant Cell 4: 1413-1424)。これらの変異体は生理学的、生化学的、および遺
伝的研究に優れた枠組みをもたらしたが、植物、特に葉の変異表現型の発現によ
る紫外線に対する過敏性を含む突然変異の負の結果のために農業経済的価値がな
いものである。ＳＩＮ１（シナポイルマレエート生合成突然変異）で表されるこ
れらの変異体はシナピン酸エステルの合成を遮断し、シナピン（シナポイル−コ
リンエステル）含量が減少し、さらには植物のリグニンの単量体組成を変更する
。リグニン含量の変化により、独自の組成のリグニンを有する植物、従って植物
繊維が変化した植物が得られる。
【００４４】 Chapple et alはさらに、ＳＩＮ１などの変異体を用いてカノーラ種子などの 重要なアブラナ科の種子におけるリグニン含量を低下させるまたはリグニン含量
を変更できる可能性を議論しているが、これがどのようにして達成され得るのか
については方向づけがない。さらに、カノーラ種子におけるシナピンの減少は重
要な目的であると考えられてはいるが、ＳＩＮ１突然変異を用い、これがどのよ
うにして達成され得るのかについては方向性は示されていない。ＳＩＮ１変異体
の明らかな紫外線感受性を与えると、突然変異は農業条件下での使用には価値が
低くなる。種子のシナピン含量を低下させる方法は当技術分野で記載されている
が、ＳＩＮ１突然変異は、シナピンが植物の生育や発達の必須化合物ではないこ
と、およびシナピンが減少した種子が生育および発達可能であることの重要な科
学的証明を与える。しかしながらＳＩＮ１突然変異は、付随する有害な紫外線感
受性を示さない、商業的に生産されたアブラナ科種子におけるシナピン含量を減
少させる方法を提供していない。
【００４５】 シナピンなどの抗栄養フェノール化合物の他、フェニルプロパノイド経路の多
くの産物がリグニンの形成に関与している。リグニンの生合成は、少なくタンパ
ク質も３種の主要なフェノール前駆体、クマル酸、フェルラ酸およびシナピン酸
を産生する一般のフェニルプロパノイド生合成経路の一部であり、これらの産物
は重合してリグニンおよび他のフェノール化合物となる。
【００４６】 これらの前駆体からのリグニンの形成の生化学は複雑であり、カフェイン酸／
５−ヒドロキシフェルラ酸−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、カフ
ェオイル−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）、シンナミルアルコールデ
ヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナモイル−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＣＣＲ）、
ペルオキシダーゼ、４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）およびコニフェリ
ン特異的β−グルクロニダーゼ（ＣＢＧ）などのその他いくつかの酵素が含まれ
る。その他の酵素を含む可能性もあり、リグニン形成の完全な生化学は未だ十分
理解されていない。
【００４７】 リグニンは、種々の割合で相互連結した主にこれら単量体フェノールからなる
複合ポリマーであり、異なる細胞種や多用な植物種では結合のタイプが異なって
いる。リグニンは、組織が機械的強度を要求する植物細胞壁の必須成分であり、
水の伝導に関与している。さらにリグニンは、病原体に対する抵抗性のメカニズ
ムにも関与していると考えられる。双子葉類に共通しているのはグアヤシル−シ
リンジルリグニンであり、これはフェルラ酸由来グアヤシル単位とシナピン酸由
来シリンジル残基の双方からなる。従って、シナピン酸およびフェルラ酸は双方
とも野生型リグニンの形成に必要とされる。例えばパルプ形成中の木材の分解性
または加工性は、主として特異なリグニン単量体の利用能に基づくリグニン単量
体組成に高く依存すると考えられる。シナポイル由来シリンジルリグニンに５−
Ｏ−メチル基が存在すると架橋が減り、ゆえに主にシリンジル単位からなるリグ
ニンは、主にフェルラ酸由来のグアヤシル単位からなるリグニンよりも加工が容
易となる。従って、シリンジルリグニン含量を高める方法は、リグニンの架橋が
低いためにより消化されやすい粉餌をもたらし得る。
【００４８】 架橋リグニンは分解に耐性があり、細胞壁成分と物理的に結合する作用を有す
るので、飼料作物の消化性は繊維量にによって影響を受ける。
【００４９】 前記のことから、シナピンを低下または消失させ、全般的なフェノール含量を
変更することによる種子粉餌の改良の試みはいずれも発達中の種子に標的を向け
るべきであるということが明らかである。本来生殖質を含まなければシナピンの
特性が少なくなるという点からすれば、種子においてシナピン合成の生化学的経
路を特異的に変化させるには、分子遺伝学的アプローチが最も適当である。
【００５０】 １つの具体例では、本発明は、種子におけるフェノール化合物のレベルを変更
し、さらにはシナピン酸および関連のフェノール化合物のレベルを変更する方法
が挙げる。この方法はフェニルプロパノイド経路の酵素の前駆体および基質とし
て用いられる化合物の利用能に作用する新規な酵素活性の導入にある。これらの
化合物の涸渇および存在量の変化は、正常な経路に生化学的シフトをもたらし、
種々のフェニルプロパノイド産物のレベルが変化した生産をもたらす。
【００５１】 この方法の一例として、新規な酵素活性、コリンオキシダーゼ（ＣＯＸ）を利
用して植物細胞、特に植物種子のコリンプールを低下させる。シナポイルグルコ
ースからのシナピンの産生のためには、他のもの中でとりわけコリンが用いられ
る。コリンプールの減少はシナピン前駆体（コリンおよびシナポイル−グルコー
ス）のプールレベルに変化をひき起こし、ゆえにシナピン酸を含むフェニルプロ
パノイド経路の初期の酵素作用段階で形成される前駆体の組成を変化させる。そ
の結果、シナピン含量が著しく低下し、フェノール含量が変更された種子が得ら
れる。コリンオキシダーゼによるコリンの酸化は過酸化水素を産生することが知
られている。植物細胞における過酸化水素の産生は有益であるとみなされるので
、植物におけるコリンオキシダーゼの発現には付加的な利点が存在する。この方
法のさらなる態様の例示としては、第二の酵素活性、ベタインアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）を利用してコリンオキシダーゼの産物であるベタインア
ルデヒドのグリシンベタインへの変換を高め、これはストレス保護物質として機
能する。この化合物ベタインは食品産業における種々の適用に、また植物の生育
を高める添加物として価値ある化合物である。
【００５２】 従って、植物細胞のフェノール含量を変更する、またシナピンの特異的減少の
有益な効果は、フェニルプロパノイド経路の単一の前駆体の減少により示される
。フェニルプロパノイド経路の他の種々の最終産物を変更するために本方法の範
囲内で他の酵素を利用することができることは当業者には明らかである。
【００５３】 本発明の範囲内にあるもう１つの例としては、フェニルプロパノイド経路でも
形成されるフェルラ酸を分解する新規な酵素活性の使用がある。３種の主要なリ
グニン単量体のうちフェルラ酸は、架橋ペントース鎖、アラビノキシランおよび
ヘミセルロースにより細胞壁構造に構造的剛性や強度を付与し、細胞壁をより堅
くし酵素的分解に対する感受性が低くなる。従って、リグニンの成分としてのフ
ェルラ酸は植物組織の機械強度に重要な役割を果たす。特異的な様式でのフェル
ラ酸のレベルの変更は多くの有益な効果をもたらし得る。
【００５４】 フェルラ酸は前記のように一般フェニルプロパノイド経路内で合成され、この
経路の種々の産物の前駆体として働く（JPN Rosazza et al., Journal of Indus
trial Microbiology 15: 457-471, 1995; R Whetten and R Sederoff, Plant Ce
ll 7: 1001-1013, 1995; RA Dixon and NL Paiva, 1995, Plant Cell 7: 1085-1
097, 1995）。
【００５５】 本方法はフェルラ酸のレベルを調整し、それによりフェニルプロパノイド経路
の他の種々の化合物、特にシナピンの産生を変更する手段を提供する。本発明の
１つの態様では、植物細胞におけるフェルラ酸のレベルを変更する方法を挙げる
。この方法はフェルラ酸を代謝する異種の酵素活性の導入にある。この数種の酵
素もまた商業用途の化合物を産生することができる。例えば、工業供給原料とし
て使用され、有害な作用なく植物細胞に蓄積され得る化合物、ビニルグアヤコー
ル化合物を産生する酵素フェルラ酸デカルボキシラーゼが使用される。フェルラ
酸の涸渇または存在量の変化は、正常なフェニルプロパノイド経路に生化学的シ
フトをもたらし、種々のフェニルプロパノイド産物のレベルが変化した生産をも
たらす。
【００５６】 本発明の方法はフェニルプロパノイド経路を制限するものではない。本発明の
有用性の例として、糖アルコールを産生する二次代謝経路の改変が例示される。
【００５７】 （Ｂ）糖アルコール代謝の二次代謝経路 本発明はまた、植物細胞における糖アルコール含量を変更する方法およびＤＮ
Ａ組成物を提供する。本発明の方法の適用の結果として、フィチン酸、スタキオ
ース、ラフィノース、スクロシルグリコシド、ウロニドおよびペントースなどの
糖アルコール、ホスホイノシチドならびにグリコホスホセラミド由来の化合物に
おいて改変された植物細胞が提供される。その結果、本発明のいくつかの具体例
では、フィチン酸が減少した植物種子が得られる。本発明はまた、飼料用途に適
したフィチン酸含量が減少した植物種子、改良粉餌の製造に適したフィチン酸含
量が減少した植物種子、およびイノシトール代謝が改変された植物細胞を提供す
る。糖アルコール代謝から誘導されるその他の化合物もまた本発明により変更さ
れ、これにはスタキオースおよびラフィノースなどの抗栄養糖アルコール由来の
化合物が含まれる。飼料用途に特に適したものは、フィチン酸塩含量が改変され
た植物種子である。
【００５８】 フィチン酸塩は多くの種子の重要な成分であり、典型的には種子質量の２〜４
％を占めるが、ある種では１０％のレベルに達することもある。飼料中に高レベ
ルのフィチン酸塩が存在することは、食欲の減退、厩肥の大きさの縮小およびそ
の他の負の性能因子につながるものであった。これらの作用はフィチン酸塩の亜
鉛結合力によるものであると思われる。フィチン酸塩と他の種子成分の複合体は
一般にフィチンと呼ばれている。高レベルのフィチンは同様に負の作用と関係し
ている。
【００５９】 飼料性能に対する破壊的な作用の他、飼料配合物中にフィチン酸が存在すると
、いくつかの望ましくない環境的結果ももたらされる。単胃動物では、フィチン
酸と会合したリンは一般に入手できないので、リン付加コストを示すものとして
食餌中にリンを加えなければならない。フィチン酸と会合したリンは単胃動物に
より排泄され、次いで微生物により糞尿が分解され、フィチン酸内に含まれてい
たリンが環境中へ放出されることになる。多くの種子粉餌の高レベルのフィチン
酸は相当量の排泄リンになる。畜産が継続的に増すと、しばしば、給水の富栄養
化やリン汚染に関するその他の環境問題がもたらされる。これらの問題は増え、
将来、畜産の主要な問題となる可能性がある。排出されるフィチン酸のレベルを
減少させるこうした方法は、これらの環境問題を改善するのに極めて有利となろ
う。
【００６０】 リンを配合物に加えることに伴う実際のコストは飼料コストの重大な部分では
ないが、排出されるリンの環境的重要性はフィチン酸塩粉餌の製造により回避で
きると考えられる無視できない付随コストを産む。
【００６１】 反芻動物では、第一胃中の微生物相の存在がフィチン酸内に含まれるリンの遊
離を引き起こすので、リンはさらに利用できるようになる。その結果、第一胃の
割当中の添加リンの量は単胃動物に比べて非常に少なくなる。しかしながら、ほ
とんどの植物の種子中のフィチン酸の量は、実際に必要とされる量より過剰とな
るので、反芻動物でも、リン汚染は主要な留意点となる。
【００６２】 これまでのところ、フィチン酸の減少を意図した有力な方法は、大抵、粉餌内
に含まれるフィターゼ酵素の作用によるフィチン酸塩の分解に向けられてきた。
この方法の結果としてリンの利用能が高くなるが、これはフィチン酸含量が減少
した種子または粉餌の製造を考慮したものではなく、単にフィチン酸内に含まれ
るリンが一般により利用しやすいという粉餌に過ぎない。従って、フィターゼ酵
素の使用は、単にフィチン酸中のリンをより利用しやすくする際に有用性を見出
せるに過ぎない。
【００６３】 フィターゼ活性は一般に、カビ（アスペルギリス(Aspergilis)）、細菌（バチ
ルス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)）および酵母菌（サッカロミセ ス(Saccharomyces)）などの微生物のおいて対抗する。植物材料を微生物のフィ ターゼを含有する酵素混合物で処理することによるフィチン酸塩の除去は、例え
ば、米国特許第５，５５４，３９９号に記載されている。ほとんどの細菌はいく
つかのフィターゼ活性を合成し、これにはフィチン酸をさらに分解する種々のホ
スファターゼの他、フィターゼ活性自身が含まれる。フィチン酸からの利用可能
なリンの完全な遊離はいくつかの異なる酵素活性によるものであると考えられる
。
【００６４】 また、微生物のフィターゼを製造するための植物の形質転換の別のアプローチ
も記載されている。米国特許第５，５９３，９６３号では、構成的発現、または
段階もしくは組織特異的発現を指示できるものを含む調節配列の制御下でのトラ
ンスジェニック植物中でのフィターゼの発現が記載されている。フィチン酸内に
含まれるリンの一部を遊離できるフィターゼ活性を含む植物細胞またはより具体
的には植物種子細胞が製造可能である。
【００６５】 しかしながら、フィチン酸からの単純なリンの遊離は、リンの消耗の減少やフ
ィチン酸の抗栄養作用の可能性の問題に十分近づくものではない。さらに重要な
ことは、複合化したフィチン酸またはフィチン酸塩の存在が減らないということ
である。公開された技術はフィチン酸からリンを遊離させる手段を提供するが、
生成されるフィチン酸のレベルを制御する手段を提供するものではない。
【００６６】 フィチン酸レベルが便宜に操作できると考えられる手段はいずれも、飼料用途
における多大な有用性を見出すであろう。例えば、フィチン酸レベルが低下した
植物種子は、ミネラルの利用能がより高い粉餌を提供するであろう。また、フィ
チン酸が減少下した植物種子はフィチンが減少した種子粉餌をも提供し、従って
、フィチン酸複合体の減少により栄養性や消化性がより高くなるであろう。
【００６７】 栄養的に改良された粉餌に加え、フィチン酸が減少した粉餌は、環境へのリン
放出を少なくして汚染を少なくする。フィチン酸からリンを遊離させる手段はリ
ンの添加および排泄レベルを低くすることができるが、ほとんどの動物において
フィチン酸の実際のレベル、従って潜在的に利用できるリンのレベルはリン栄養
として要求されるものより過剰である。
【００６８】 従って、フィチン酸レベルを操作する方法は、あらゆる飼料用途において有用
性を見出すであろうし、さらには新規かつ価値ある粉餌および飼料組成物を提供
するであろう。
【００６９】 これらの観点から、種子発達中のフィチン酸塩の産生が調節され得る手段が有
用であり、リン汚染やフィチン酸の抗栄養作用に関連した問題への解決策をもた
らすことが明らかである。さらに、広範な植物種にわたって有用性が認められる
遺伝的メカニズムも特に価値があると考えられる。本発明はかかる解決策を提供
するものである。
【００７０】 本発明の範囲を理解するには、フィチン酸の形成を担う生化学的メカニズムを
表すことが必要である。フィチン酸の生合成は完全にはわかっていないが、いく
つかの鍵となる段階が知られている。フィチン酸はミオイノシトールの５リン酸
誘導体であり、フィチン酸をを合成する生化学経路は、最初の基質としてもっぱ
ら糖アルコールであるミオイノシトールを利用する。この化合物（ミオイノシト
ール、一般にイノシトールとも呼ばれる）はまた、他のミオイノシトール誘導体
およびエピマーの産生も制御する。スクロシルグリコシドなど、これらの誘導体
のいくつかはまた抗栄養化合物であり、従ってこれらの化合物を減少させること
も望ましい。
【００７１】 ミオイノシトールは植物細胞に偏在する糖アルコールである。しかしながら、
ミオイノシトールヒドロキシル基のいずれか１つの単純な保護は、フィチン酸の
生合成および他の経路に不適切なものとなる。ミオイノシトールの保護は、in v
ivoにおいて種々のメチルトランスフェラーゼによる特異的部位でのメチル化に よって達成され得る。例えば、ミオイノシトールは６位における一メチル化によ
りオノニトールに変換される。５位におけるメチル化はセコイイトールを生じ、
これはエピマー化されてピニトールとなる。ピニトールはフィチン酸生合成に使
用できない。ミオイノシトールのメチル化誘導体はストレス耐性などの有用な特
性を植物に与えることが知られており、それらは溶質輸送や膜タンパク質の安定
化が関与している。通常糖アルコール代謝とは関係のない異種の酵素活性の使用
によるイノシトールのこのような修飾は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００７２】 フィチン酸形成の生化学は十分わかっていないが、少なくとも２つの可能性あ
る生成経路が知られており、フィチン酸生合成に関与するいくつかの異なる酵素
活性があると考えられる。フィチン酸塩はほとんどの植物組織に見られるが、特
に種子や花粉に優勢であり、このことはリン貯蔵において推定される役割を支持
するものである。 このように、特にその形成の生化学が十分わかっていないので、従来の手段に
よってフィチン酸塩の生合成を改変する手段を考案するのは困難であることがわ
かっいる。
【００７３】 フィチン酸の産生を最小にするため、本発明はミオイノシトールを修飾して、
フィチン酸の生合成におけるミオイノシトールの利用を妨げる方法および酵素を
コードするＤＮＡ組成物を記載する。本発明は異種のメチルトランスフェラーゼ
位を使用して種子、特にフィチン酸の生合成を担う種子の組織中のミオイノシト
ールを特異的にメチル化することを意図するものである（異種とは、その植物細
胞におけるフィチン酸塩の生合成とは通常無関係な酵素を意味する）。本発明は
塩生植物から得られる異種の酵素活性を利用する。なお、この酵素活性はトウモ
ロコシ、ダイズ、ワタ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ソルガ
ム、ヒマワリ、アブラナ科の脂肪種子およびその他通常栽培される作物などの通
常の作物には見られない。
【００７４】 ミオイノシトールからのメチルイノシトールの産生はまた、植物細胞に有害な
作用のない無害な化合物を産生するという付加的な利点をもたらす。従って、利
用できるミオイノシトールのプールを減らすことにより、フィチン酸の産生は減
少する。
【００７５】 フィチン酸塩は種子粉餌中の主要な抗栄養因子の１つである。フィチン酸の抗
栄養作用には、無機質の結合、タンパク質との複合体の形成およびその他の負の
作用、特にリン汚染をつくり出す環境中で代謝されるフィチン酸の形態にある過
剰なリンの排泄に関連するものが含まれる。従って、植物細胞中のフィチン酸を
減少させる方法は飼料用途に有用性を有する。水産養殖においても、高いフィチ
ン酸レベルは、ニシン粉餌の代替物としての植物由来タンパク質の使用にとって
の主要な問題である。植物細胞、特に動物飼料に用いられる植物組織の細胞のフ
ィチン酸含量を減少させるこのような方法は価値があり、多大な有用性を有する
。動物飼料に用いられる広範な植物種にわたって植物種子のフィチン酸含量を減
少させる方法は、飼料産業によって特に価値あるものである。
【００７６】 ミオイノシトール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＩＭＴ）をコードする植
物遺伝子は、メセムブリアンテマム・クリスタリナム(Mesembryanthemum crysta
llinum)（メセンブリアンテマ）から単離されており、この酵素は異種のトラン スジェニック植物中でミオイノシトールをピニトールへ変換することがわかって
いる（米国特許第５，５６３，３２４号）。この植物遺伝子は、次いでエピマー
化されてピニトールとなるミオイノシトールのメチル化誘導体、オノニトールの
過剰生産により植物のストレス耐性を増強する目的で、構成的プロモーターの制
御下に置かれていた。本発明では、この植物遺伝子は、種子のイノシトール代謝
を変更するため、種子選択性プロモーターの制御下に置かれる。
【００７７】 米国特許第５，５６３，３２４号に記載されているピニトールの産生は、トラ
ンスジェニックタバコ植物体中で構成的に発現される場合、耐塩性を与えること
がわかっている。同様に、細菌マンニトール１−Ｐデヒドロゲナーゼの発現は、
植物細胞で構成的に発現される場合、マンニトール、糖アルコール、またはポリ
オールの産生を触媒し、植物細胞を塩ストレスに対して耐性とする。従って、米
国特許第５，５６３，３２４号は、植物細胞に耐塩性を付与する手段として、植
物細胞に生得的な糖から糖アルコールを産生することができる酵素の使用による
、糖アルコールの産生を記載している。
【００７８】 しかしながら、米国特許第５，５６３，３２４号は、前駆体としてミオイノシ
トールの使用を避けるため、ミオイノシトールを修飾して、天然の誘導体を含ん
でなる他の化合物とすることができる遺伝子を用いるための方向付けを提供する
ものではない。しなしながら、米国特許第５，５６３，３２４号は、ミオイノシ
トールの修飾が植物に対するいずれの負の作用ももたらすものではないという明
確な証拠を与え、ゆえにミオイノシトールレベルの操作が有害な作用をもたらす
とは考えられない。
【００７９】 従って、メチルトランスフェラーゼ遺伝子によりミオイノシトールの修飾が可
能であることは、植物細胞に対して有害であるとは考えられず、この酵素反応の
メチル化産物は、植物細胞に対し無害であることが知られている。
【００８０】 しかしながら、ミオイノシトールは、植物の生育と発達に関する多くの異なる
面の基礎となるものである。フィチン酸の生合成のための前駆体としてのその役
割に加え、ミオイノシトールはウロニドおよびペントースの生合成にも使用され
、また植物細胞膜のホスホイノシチド中、ならびにグリコホスホセラミドを含む
他の植物の複合脂質中にも存在する。さらに、それは他の天然に存在するイノシ
トール異性体の前駆体でもあり、これらの多くはミオイノシトールと同様、植物
界に種特異的なパターンでメチルエステルとして分布している。
【００８１】 一般の植物代謝におけるミオイノシトールの役割は広く、特に農業生育条件下
においては、ミオイノシトールプールの改変は予想外の結果を生じ得る。米国特
許第５，５６３，３２４号にはメチルトランスフェラーゼ遺伝子の構成的発現が
記載されているが、得られた植物が有用であるという証拠は示されていない。米
国特許第５，５６３，３２４号には以下のことが述べられている：「農業条件下
において新しく挿入された遺伝子が植物の生産力をより良くできなかったとして
も、かかる遺伝子を有するトランスジェニック植物は、植物の内部プロセスの変
化（例えば浸透圧調節）が植物の圃場能力にいかに影響するかを検討するための
研究目的に有用である」（２段落目、６０−６５行）。米国特許第５，５６３，
３２４号では、フィチン酸を減少させるためのミオイノシトールレベルの操作は
予想しておらず、すなわち有用な農業特性を有する植物をそれほど期待していな
いので、そこに包含される教示から有用性が生ずるであろう。従って、米国特許
第５，５６３，３２４号には、ストレス耐性またはさらなる科学的研究のための
、植物全体におけるミオイノシトール修飾遺伝子の発現について記載されている
。
【００８２】 従って、フィチン酸を減少させる新しいアプローチが本発明により教示される
ものと十分考えられる。メチルトランスフェラーゼ遺伝子の使用は、フィチン酸
の減少に対して特異的なものである。本発明は、種子または種子粉餌中の過剰な
フィチン酸の問題に近づくものではないが、フィターゼ酵素の発現といった当技
術分野に既存の方法によるものではない。本明細書において行われた研究の過程
では、フィチン酸の生合成に利用可能なミオイノシトールレベルを変化させるこ
とにより、フィチン酸のレベルが制御できることが見出された。種子組織中での
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が、植物の他の特徴には証明できるよう
な変化を起こさずに、種子中のフィチン酸の減少をもたらすことが見出された。
フィチン酸塩の生合成を担う、種子組織に対するメチルトランスフェラーゼ遺伝
子の発現の制限により、成熟種子中のフィチン酸が有意に減少したが、植物にそ
れ以外の付加的な作用を及ぼすことなく、環境学的に極端な圃場条件下において
さえも生育した。組織選択性プロモーターの使用により、他の組織におけるミオ
イノシトール代謝を完全に残しながら、種子組織に対しては酵素活性を制限する
ことを含む、当技術分野における多くの利点が提供される。
【００８３】 本発明の目的は、ミオイノシトールが植物にとって無害な化合物に変換される
代謝プールへと転換することにより、フィチン酸生合成の出発物質としてのミオ
イノシトールの利用率を変化させることにある。その方法は、１つの具体例にお
いて、フィチン酸の産生に使用されるミオイノシトールプールを涸渇または変更
するメチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなる新規な酵素活性の導入に基づ
く。この前駆体レベルの涸渇または変更が、フィチン酸生合成の正常経路におい
て生化学的シフトをもたらし、産生されるフィチン酸のレベルの減少を引き起こ
す。
【００８４】 本発明の生化学的基礎は、基質利用能による酵素活性の調節という概念に基づ
いている。一般に、酵素作用速度は基質の利用能により制御される。酵素は、一
般に利用可能な基質の量に比例する速度で産物が産生される。基質濃度の減少に
より最終産物のレベルは低下する。
【００８５】 従って、本発明は、フィチン酸の形成に使用されるイノシトール基質の利用能
を涸渇させる新規な酵素活性である、メチルトランスフェラーゼを用いることに
より、この試みを利用する。植物種子中のミオイノシトールプールに作用できる
多くの酵素のいずれもが、本発明の範囲内で使用できる。本方法は、いずれの数
の異なる様式であっても、フィチン酸生合成に使用されるミオイノシトールプー
ルを変更する、導入酵素活性によるものである。
【００８６】 米国特許第５，５６３，３２４号とは対照的に、本発明はミオイノシトールを
修飾することによりフィチン酸の産生に利用できなくすることのできる遺伝子の
発現により、種子選択的な方法でフィチン酸塩の産生を改変しようとするもので
ある。驚くべきことに、ミオイノシトール修飾遺伝子の構成的発現でさえも種子
中のフィチン酸塩の減少を引き起こす。しかしながら、本発明の最も好ましい具
体例では、植物の農業生産力に悪影響を及ぼさず、得られた植物が種子中のフィ
チン酸塩レベルの減少以外はすべての形態において正常であることを保証するた
めに種子選択性プロモーターが利用される。従って、米国特許第５，５６３，３
２４号とは対照的に、本発明はストレス耐性植物の作出を期待するものでも、研
究目的のために有用な植物を研究するものでもない。
【００８７】 記載の方法は、フィターゼ酵素の発現によるフィチン酸の減少に関する当技術
分野にわたって多くの利点を提供する。これらは、特異的な組織中のフィチン酸
レベルを変更した植物、フィチン酸レベルが減少した種子を有する植物、フィチ
ン酸の減少した種子粉餌を含む。このような植物、種子、および粉餌の利点とし
ては、より良い飼料利用率および粉餌生産力、リンレベルを減少させた粉餌およ
び飼料の製造、従って粉餌または飼料中の抗栄養フィチン酸の量によりこれまで
制限されていた飼料産業における用途にかかる粉餌類を使用するためのより良い
環境特性および能力が挙げられる。
【００８８】 記載の方法は、多くの植物種において有用性を見出すものである。これらの植
物種には、単子葉や双子葉植物、ならびに穀物や脂肪種子作物が含まれる。本法
は特に脂肪種子およびアブラナ科の植物に有用性を見出すものである。
【００８９】 この遺伝学的改変の結果、植物細胞の糖アルコール代謝、特にイノシトール代
謝は改変され、植物細胞のフィチン酸含量は減少し、特に植物の種子中のフィチ
ン酸塩含量が減少する。このようにして、本発明の方法は、糖アルコールに関す
る二次代謝を変更させる価値ある手段を提供する。
【００９０】 本発明の具体例は糖アルコール代謝の変更を包含するが、例えば、フィチン含
量が減少した植物細胞はカノーラ植物細胞中に認められ、トウモロコシ植物もま
たフィチン酸濃度が高く、トウモロコシ細胞中のフィチン酸含量の減少も同様に
達成可能である。
【００９１】 本発明は、植物細胞および種子のフィチン酸含量の改変、特に植物細胞におけ
るフィチン酸塩レベルを減少させるのに有用な方法、遺伝子構築体およびベクタ
ーを提供する。本発明はさらに、植物種子中のフィチン酸塩を減少させるのに有
用な方法およびＤＮＡ組成物を提供する。本発明はさらに、改良種子粉餌および
改良種子粉餌、特にフィチン酸塩の含量が減少した種子粉餌を含有する動物飼料
に関する。
【００９２】 フィチン酸の減少は、新しく記載された方法およびＤＮＡ組成物を用いて達成
される。その方法は、「代謝切り替え(metabolic shunt)」の開発、またはフィ チン酸生合成経路の前駆体を、フィチン酸の産生を減少させる新しく、新規に導
入された「行き止まり経路(dead end pathway)」に転じることのできる新しい生
化学的経路の開発を含んでなる。この方法の１つの特定の具体例の結果として、
「行き止まり経路」の産物は、その植物細胞に対して無害であることが知られてい
る化合物である。従って、前駆体であるミオイノシトール化合物のこれらの化合
物への切り替えは、植物の生産力に何ら影響を及ぼすものではないということは
十分考えられることである。
【００９３】 本発明のもう１つの態様によれば、フィチン酸含量が変更された植物種子、特
にフィチン酸含量が減少した植物種子の製造のための、ベクターおよび組換えＤ
ＮＡ構築体が提供される。さらに、本発明のもう１つの態様では、フィチン酸塩
含量が減少した種子粉餌の製造に有用な植物種子を提供する。この粉餌のフィチ
ン酸塩レベルは減少しており、それゆえに、特にフィチン酸が環境汚染に結びつ
き、または抗非栄養因子であると同定された動物用飼料としての適用に有用であ
る。本発明はまた、食用鳥類、豚、牛および魚類などを含む種々の動物用食餌に
使用できる、遺伝的に変更された種子由来の改良粉餌を提供する。
【００９４】 この方法は、種子中のミオイノシトール含量を変え、あらゆる種および品種の
植物に直接適用できる新規な酵素活性の添加を含んでなる。いずれの植物種にお
いてもミオイノシトールの変化は同じ様式で起こるため、同遺伝子はいずれの植
物種にも使用できる。本法は、ＤＮＡ配列に依存し、そのため特定の遺伝子また
は作物種のそれぞれに対して適合させた特定の遺伝子が必要となる、遺伝子抑制
技術の使用によるものではない。このように、あらゆる作物に対する本発明の有
用性は明白である。本発明の方法の範囲内で、微生物、植物または動物由来の、
多くの好適な酵素を使用できる。同遺伝子構築体は種々の異なる植物種に使用で
きる。
【００９５】 このように、本発明の広範な態様によれば、植物の種子中のフィチン酸塩含量
を減少させる方法であって、このベクターで形質転換された植物細胞の同定を可
能にする選択マーカーの他、ミオイノシトールをフィチン酸の産生に不適な形に
代謝できる酵素を包含する、植物形質転換ベクターの構築を含んでなる方法が提
供される。
【００９６】 本発明の範囲内では、イノシトールの代謝とは、通常はミオイノシトールに作
用してフィチン酸を産生する相当する酵素活性によりミオイノシトールが作用さ
れないようにさせる、水酸化、異性化、メチル化、切断またはその他のいずれか
の生化学的改変を包含する。それゆえ、代謝には、フィチン酸生合成に利用可能
な基質プールからのミオイノシトールの利用能を効果的に低下させるいずれの改
変もが包含される。
【００９７】 本発明の実施例として、本発明の１つの態様を例示するために、ミオイノシト
ールメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が使用される。この酵素は、
植物の種子細胞での発現のために選択されるプロモーターの制御下で、その植物
の種子中でのフィチン酸塩産生に利用できるミオイノシトールプールを涸渇させ
ることができる。本発明のもう１つの態様によれば、このメチルトランスフェラ
ーゼはミオイノシトールを無害の物質に変換できる。
【００９８】 本発明の方法により作出された植物細胞は一次代謝は変更されておらず、特定
の二次代謝経路の産物に関する変更を除けば、非改変植物と区別できない表現型
を有する。
【００９９】 一次代謝が影響を受けないことを保証するために、本発明は、二次代謝経路に
特異的であり、その経路の最終産物の形成に必要な基質、特に最終産物形成まで
が１〜５つの生化学的段階以内の基質の利用能を変更することにより、二次代謝
物の形成を組織特異的に標的化する方法を記載する。この方法で、二次代謝経路
の特定の産物を減少させることが達成される。
【０１００】 本発明の範囲内で、フェニルプロパノイド二次代謝経路の産物の前駆体として
使用される化合物としては、限定されるものではないが、桂皮酸、ｐ−クマル酸
、カフェイン酸、フェルラ酸、５−ヒドロキシフェルラ酸、シナピン酸、コリン
、限定されるものではないが、シナポイル−グルコースおよびシナポイル−リン
ゴ酸塩およびシナポイルコリンなどのシナポイル化合物が挙げられる。本発明の
範囲内で、フェニルプロパノイド経路の産物としては、限定されるものではない
が：フラボノイド、リグニン、種々の単一または重合化フェノール化合物および
シナピンが挙げられる。特定の酵素を選択することにより、フェニルプロパノイ
ド経路中の多くの産物のレベルを変更することができる。前駆体として使用され
る化合物を改変または標的化するのに使用される酵素は、微生物、動物または植
物起源のものであり得る。その酵素は、天然のもの、または既知の酵素の基質特
異性を変更させ、新規な酵素活性を生み出す突然変異により得られたものであっ
てもよい。
【０１０１】 本発明の範囲内で使用される酵素は、フェニルプロパノイド経路中に見出され
る産物の前駆体として使用される化合物を、異性化、抱合、リン酸化、水酸化、
酸化、脱水素化、メチル化、またはその他のいずれかの類似する生化学的活性（
結合または分離を含む）により改変でき、またはフェニルプロパノイド経路中の
前駆体として使用される化合物をも破壊できる、例えばヒドロラーゼ、デカルボ
キシラーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、またはＬ−フェニルアラニン、桂皮
酸、ｐ−クマル酸、カフェイン酸、フェルラ酸、５−ヒドロキフェルラ酸、シナ
ピン酸、シナポイル−グルコース、シナポイル−リンゴ酸もしくはコリン（シナ
ポイルーグルコースからシナピンを産生するのに使用）を分解できる他のいずれ
の酵素を含んでなってもよい。本方法の１つの態様では、通常、フェニルプロパ
ノイド経路で形成される産物の前駆体として使用される化合物から、ストレス保
護物質を産生する酵素が使用される。同様に、フェニルプロパノイド経路の一部
として産生されるのではなく、フェニルプロパノイド経路の産物の形成に必要と
される付加的な基質を特異的に減少させるための酵素活性が、この産物のレベル
を減少させるのに用いることができる。従って、フェニルプロパノイド経路で前
駆体として使用される化合物、およびフェニルプロパノイド経路において産物を
産生するために必要とされるその他の化合物の双方が、本方法の範囲内で標的と
なり得る。
【０１０２】 本発明の範囲内で、糖アルコール二次代謝経路の産物の前駆体として使用され
る化合物としては、限定されるものではないが：ミオイノシトール、ガラクチノ
ールおよび糖のＵＤＰ−誘導体が挙げられる。糖アルコール代謝の産物としては
、限定されるものではないが、フィチン酸、スタキオース、ラフィノース、スク
ロシルグリコシド、ウロニドおよびペントース、ホスホイノシチド、ならびにグ
リコホスホセラミドが挙げられる。本発明の範囲内では、糖アルコール代謝の化
合物を変更する酵素活性には、通常、その糖アルコールに作用する相当する酵素
活性により、糖アルコールが作用されないようにする、水酸化、異性化、メチル
化、切断またはその他の生化学的改変（例えば結合または分離）を可能にする酵
素活性が挙げられる。本発明の糖アルコール二次代謝経路の例示では、フィチン
酸の前駆体であるイノシトールのメチル化により、フィチン酸生合成のためのイ
ノシトールの利用能が減少することが示された。
【０１０３】 従って、二次代謝経路の最終産物の前駆体は、二次代謝物の形成に直接使用さ
れる生化学物質、または特定の二次代謝物の形成を導く生化学的反応に使用され
る生化学物質であり、この生化学物質は一次代謝物ではないことは当業者には明
らかである。
【０１０４】 二次代謝経路において産物の前駆体として機能するこの化合物に作用するよう
に、またはこの化合物を標的とするよう用いられた酵素は、植物細胞に対し無害
であるがゆえに植物細胞の特性を変化させずに高レベルまで蓄積できる物質を、
その化合物から産生することが好ましい。この酵素はまた、二次代謝経路の産物
の前駆体として使用されるその化合物からストレス保護物質を産生するように、
植物細胞に有益な効果を与える物質を産生することができる。使用される酵素は
また、工業用化学物質、薬学または栄養学的物質のような有用な物質を産生する
。本発明の範囲内で１種またはそれ以上の酵素を使用してよく、二次代謝経路の
産物の前駆体として使用される特定の化合物のレベルを減少させるために、１種
以上の別個の活性を用いてもよい。
【０１０５】 本発明の範囲内で使用される酵素は、いくつかの起源または種々の方法により
得られたものであってよい。例えば、当業者ならば本方法の範囲内で標的とされ
るべき、二次代謝経路における前駆体として使用される化合物を同定できる。こ
れらの化合物の化学構造は十分公知であるか、または同定が可能であるので、酵
素文献を分析して、化学的に類似した基質に対して既知の活性を有する酵素を同
定できる。従って、好適な酵素を同定し、遺伝子を単離して本発明の範囲内にお
いて用いることができる。さらに、所望の活性のために人為的に製造したタンパ
ク質を検索する化合化学または類似のシステムも、合成遺伝子を得るための基礎
として用いてよい。本発明の範囲内で使用される酵素は、当技術分野で一般に知
られている方法により改変してもよい。
【０１０６】 酵素改変の一例としては、二次代謝経路で前駆体として用いられる化学的に関
連した化合物に作用することができる酵素をコードする遺伝子を改変することが
でき、かつ／または部位特異的改変、突然変異、および細菌もしくは真菌細胞の
ような異種の系での、変更された特異性の選択といった技術を用いることにより
増強させた活性を選択できる。これには、細菌細胞中でこの化合物の代謝が不能
となるよう変更された酵素をコードする遺伝子の発現、酵素を発現してこの化合
物を唯一の栄養または炭素源として増殖できる細菌の選択、および二次代謝経路
で前駆体として用いられる特定の化合物に作用する酵素活性の回復が含まれてよ
い。この方法により、特定の二次代謝経路で前駆体として用いられる特定の化合
物に対して、特異的な酵素を産生することが可能である。あるいは、二次代謝経
路で前駆体として用いられる種々の化合物上での増殖に関して細菌を選択できる
。当業者ならば、二次代謝経路で前駆体として用いられる特定の化合物上での変
異型細菌または他の細胞の選択が、この化合物を無害な物質に変換できる特定の
酵素活性を同定する方法となり得ることが容易にわかる。この試みには、特異的
酵素活性の直接的な選択、または所望の酵素活性の段階的な改変および選択が含
まれてよい。
【０１０７】 同様に、パルプ化操作中にリグニンを分解できるトリコデルマ属(Trichoderma )真菌抽出物を用いる酵素調製物など、現在商業的に用いられている公知の酵素 活性の使用は、例えばフェノール化合物の分解に関与する酵素を単離するための
、好適な酵素活性の供給源となり得る。当業者には、パルプ産業においてリグニ
ンを加工に用いられる酵素をコードする遺伝子を、本方法の範囲内で、直接的ま
たは改変して、フェニルプロパノイド経路における前駆体として用いられる化合
物の１つに特異的に作用させるために使用できることが明らかである。従って、
本発明の方法の範囲内で、いくつかの異なる酵素活性が使用できると考えられる
。従って本方法は、使用される酵素の供給源または特異性により制限されるもの
ではない。
【０１０８】 例えば、本方法の１つの態様では、植物細胞中で発現される酵素は、フェニル
プロパノイド経路中の産物に対する前駆体または基質として用いられる化合物に
作用し、ある物質を産生するが、その物質はもはやフェニルプロパノイド経路で
前駆体としてこの化合物を通常利用するその酵素により作用されることはない。
従って、この産物の形成に必要な前駆体濃度の減少を通じて、フェニルプロパノ
イド経路の特定の産物のレベルが減少する。得られた植物細胞は、直接使用する
こともできるし、あるいはその細胞はフェニルプロパノイド経路の産物のレベル
が変更された完全な植物体を再生するよう誘導でき、この植物細胞は飼料用途、
パルプ用途またはフェニルプロパノイド経路中のある産物の過剰生産を含む新規
なフェノール化合物組成物を有する植物の生産に限らず、多くの工業加工におい
て有用である。フェニルプロパノイド産物のレベルが変更された木は、パルプお
よび製紙産業において有用であろう。フェニルプロパノイド産物のレベルが変更
された植物は、飼料産業において有用であろう。
【０１０９】 本方法はまた、特性が変更された植物細胞または組織、特に飼料用途または他
の工業加工に使用される植物組織の再生および使用に関する。本発明の範囲内で
意図されたフェニルプロパノイド経路に対する変更は、この方法、特に付加され
た酵素活性の結果としてストレス保護物質が産生されるという本発明の態様に基
づく植物の、農業生産力にも明白な変化をもたらすであろう。期待されるその他
の有益な作用としては、病害抵抗性およびＵＶ耐性の増強、機械的強度の増強な
どが挙げられる。
【０１１０】 本発明のさらなる具体例では、この方法は、その植物細胞を増殖させる工程、
フェニルプロパノイド経路の産物が変更されている植物の再分化を包含する。
【０１１１】 さらなる具体例では、本発明は、有用な化合物の生産、動物飼料の製造または
パルプ化といった工業加工のためのその植物の利用を包含する。
【０１１２】 フェニルプロパノイド経路の産物の前駆体として用いられる化合物に作用でき
る酵素をコードする遺伝子は、天然物、合成物またはそれらの組合せであっても
い。当業者ならば、植物細胞中で高レベルに発現するように遺伝子のコード配列
が改変されてよいことが容易にわかるだろう。これはその遺伝子が発現される植
物細胞中に通常認められるそのコドン用法に、より正確に類似するように、その
コドンの配列を変更することにより達成される。さらに、コード配列の便宜な操
作のために特異的な制限部位を操作してもよいことは明らかである。また、翻訳
エンハンサー、イントロンなどのような、コード配列の適切な発現を保証するた
めに使用し得る種々の配列の付加も意図される。基質結合部位の変更、または酵
素活性を増強させる一次アミノ酸配列に対する他の変更により酵素を改変しても
よい。これらの総ての操作は当技術分野において一般的なものであり、当業者な
らば容易にわかるであろう。
【０１１３】 本発明のもう１つの態様では、酵素は組織選択性プロモーター、より詳細には
種子選択性プロモーターの制御下にある。種子選択性プロモーターは植物の種子
内の組織に限定されるその制御の下、独占的にまたは優先的に機能して配列の発
現を引き起こすプロモーターである。従って、フェニルプロパノイド経路の特定
の産物のレベルは組織選択的に変化し、植物の他の組織ではフェニルプロパノイ
ド経路の産物のレベルは正常のままである。酵素が選択的に発現する組織は飼料
の製造または他の工業過程に使用される。
【０１１４】 当業者には、本発明の範囲内でいずれの数の組織選択性プロモーターを使用し
てもよいということが明らかである。特に、種子選択性プロモーターを使用して
種子または飼料粉餌が飼料に使用される作物においてフェニルプロパノイド経路
の産物を変更する。他の作物では、フェノール含量の変更が必要とされる植物の
部位に応じて種々の組織選択性プロモーターを使用してよい。例えば、根または
塊茎選択性プロモーターを使用して、ジャガイモ、カブ、カッサバなどの根また
は塊茎作物のフェノールまたはリグニン含量を変化させてもよい。葉または茎が
飼料として使用される場合には、葉または茎選択性プロモーターを使用してフェ
ニルプロパノイド経路内の前駆体として用いられる化合物に作用することができ
る酵素の発現を制限してもよい。パルプ化用に伐採される木などの植物において
は、他の組織選択性プロモーターを使用してもよい。従って、木の木部に対する
酵素の活性を制限するプロモーターは、本方法の範囲内で有用性を見出すもので
ある。
【０１１５】 本発明の１つの特定の態様では、植物細胞中のコリン代謝酵素のコード配列の
発現が意図される。コリン代謝酵素の発現によりシナポイル−グルコースからシ
ナピンを形成するのに用いられる利用可能なコリンの貯蔵が減少する。ある植物
種、特にアブラナ科のものはシナピンと呼ばれる抗栄養化合物を産生する。シナ
ピンはシナポイルグルコース（ｓｉｎ−ｇｌｕ）のグルコース部分をコリンと交
換することによって合成されると考えられている。抗栄養化合物シナピンの減少
は種子およびそれらから得られた粉餌の価値を高める。コリン酸化酵素などのコ
リン修飾酵素の使用は本発明において有用性がある。
【０１１６】 コムギ、ホウレンソウ、テンサイおよびオオムギなどの食用植物中では、コリ
ンは酸化されてベタインとなることが知られている(Rhodes and Hanson, 1993,
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 44: 357-3
84)。この酸化経路は２種の酵素によって触媒され（総称として「コリン酸化系 」として知られている）、この経路の産物を以下に示す： コリン→ベタインアルデヒド→グリシンベタイン（ベタイン）。
【０１１７】 第１段階は、細菌および動物においてはコリンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）ま
たはコリンオキシダーゼ（ＣＯＸ）によって(Rozwadowski, Khachatourians and
Selvaraj, 1991, Journal of Bacteriology, 173: 472-478)、また植物におい てはコリンモノオキシゲナーゼ（ＣＭＯ）によって(Rhodes and Hanson, 1993) 触媒される。第２段階は、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）に
よって触媒される(Rhodes and Hanson, 1993)。従って、コリン代謝酵素の使用 によって、構成的、誘導的、または組織特異的なプロモーターの使用により、全
般的または特異的に、利用可能なコリンの貯蔵を減少させることができる。コリ
ンの利利用能の低下はシナピンの産生を低下させる。従って、シナピンの減少は
フェニルプロパノイド経路の他の産物のレベルに変化を引き起こすことができ、
フェノール含量が変化した植物組織が得られる。
【０１１８】 本発明のもう１つの特定の具体例では、細菌のコリンオキシダーゼ（ＣＯＸ）
遺伝子(Rozwadowski, Khachatourians and Selvaraj, 1991, Journal of Bacter
iology, 173: 472-478)が種子選択性プロモーターの制御下に置かれている。種 子におけるコリンオキシダーゼの発現は、カノーラ種子におけるシナピン生合成
の前駆体の１つであるコリンを、ＣＯＸ酵素の活性によって徐々にベタインに変
換されるベタインアルデヒドの形成を介して、無害の物質ベタインに変換する。
組換えＤＮＡを含んでなる種子はシナピンレベルが低下し、またフェニルプロパ
ノイド経路の他の産物のレベルが変化する。この種子に由来する粉餌は飼料用途
に有用である。
【０１１９】 本発明のもう１つの特定の具体例では、種子選択性プロモーターの制御下でＣ
ＯＸ遺伝子を使用し、さらに第２の酵素ＢＡＤＨを使用して、ベタインアルデヒ
ドからのベタイン形成を促進する。この具体例では、ＢＡＤＨ(Boyd, L.A. L. A
dam, L.E. Pelcher, A. McHughen, R. Hirji. and G. Selvaraj, 1990, Gene 10
3: 45-52)は種子選択性プロモーターの制御下で発現される。ベタインは多くの 食物および飼料植物の可食部分に見られる化合物であり、また食物および飼料添
加物として使用される場合もある。ベタインはまた、ストレス保護機能も提供す
る。
【０１２０】 本発明のもう１つの特定の具体例では、種子選択性プロモーターの制御下、ア
ブラナ科の植物細胞（ブラシカ種）においてＣＯＸ遺伝子を使用し、さらに同じ
く種子選択性プロモーターの制御下で発現される第２の酵素ＢＡＤＨを使用して
、ベタインアルデヒドからのベタインの形成を確実なものとする。
【０１２１】 アブラナ科の種子におけるコリンの変更はシナピン含量の低下およびフェニル
プロパノイド経路の種々の産物におけるさらなる変更をもたらす。種子における
コリンレベルの変化は高レベルのシナポイルグルコースまたはシナポイルマレー
トなどの他のシナポイル化合物をもたらし、これは順にシナピン酸、リグニン前
駆体のレベルを変更するということが十分考えられる。従って、一般に最終産物
阻害と呼ばれる生化学的調節機構が働き、フェニルプロパノイド経路内の種々の
産物のレベルの変化をもたらす。従って、シナピン形成の阻害はシナピン形成と
いう最終工程に先立って、フェニルプロパノイド経路内の工程によって形成され
るいくつかの産物のレベルの変化をもたらす。
【０１２２】 二次代謝フェニルプロパノイド経路もまた、植物細胞において発現され、フェ
ルラ酸に作用する酵素による標的となり得る。フェルラ酸はフェニルプロパノイ
ド経路中のもう１つの前駆体である。よって、フェルラ酸のレベルは低下する。
フェルラ酸の利用能の低下はアブラナ科植物におけるシナピンの減少をはじめと
するフェノール化合物のレベルの変化をもたらす。
【０１２３】 フェルラ酸に作用することができる酵素をコードする遺伝子は天然物、合成物
またはそれらの組合せであってもよい。当業者ならば、遺伝子のコード配列を改
変して植物細胞において高レベルの発現を可能にすることができることが容易に
わかるであろう。
【０１２４】 本発明のもう１つの態様によれば、フェルラ酸に作用することができる酵素を
コードする遺伝子は組織選択性プロモーターの制御下に置かれている。従って、
フェルラ酸のレベルは組織選択的に変化し、植物の他の組織は正常なレベルのフ
ェルラ酸を有したままである。酵素が選択的に発現する組織は飼料の製造、食品
の製造または他のいずれかの工業過程で使用される。
【０１２５】 本発明のこれらの具体例で使用が意図される酵素には、フェルラ酸を改変する
ことができるものおよび特にフェルラ酸から価値ある化合物を産生することが知
られているそれらの酵素が挙げられる。当業者には、フェルラ酸を代謝する方法
の範囲内で他の酵素を使用してもよいとことが明らかである。フェルラ酸代謝活
性の公知の供給源は以下の微生物中に見出されている：アエロバクター種(Aerob acter sp.)、巨大菌(Bacillus megaterium)、枯草菌(B. subtilis)、コリネバク
テリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、エンテロバクター種(E nterobactor sp.)、シュードモナス種(Psuedomonas sp.)、ストレプトミセス種( Streptomyces sp.)、アスペルギリス種(Aspergillis sp.)、カンジダ種(Candida sp.)、フザリウム種(Fusarium sp.)、ハンセニューラ種(Hansenula sp.)、ペニ
シラム種(Penicillum sp.)、ロドトルラ種(Rhodotorula sp.)、サッカロミセス 種(Saccharomyces sp.)。この一覧は網羅的なものではないが、当技術分野で見 出されているフェルラ酸塩代謝酵素の多くの供給源を例示するものである。従っ
て、この方法はフェルラ酸を代謝するのに用いられる酵素の供給源によって制限
されるものではない。本発明の範囲内で、微生物のコードされた遺伝子を変更し
て、植物細胞での最適な発現を確実なものにするということが意図される。この
方法は当技術分野で十分に公知である。
【０１２６】 これらの酵素の例としては、Ｂ．プムリス(B. pumulis)由来のフェルラ酸デカ
ルボキシラーゼが使用される。この酵素の遺伝子は単離され配列決定されている
(Zago et al, Applied and Environmental Microbiology 61:4484-4486, 1995) 。この遺伝子配列は、推定アミノ酸配列を維持しつつ、植物遺伝子に厳密に相似
するよう改変することができる。この酵素は脱炭酸よってフェルラ酸からビニル
グアヤコールを産生することができる。従って、本方法の１つの例では、フェル
ラ酸に作用することができる、導入遺伝子の活性によって価値ある化合物（ビニ
ルグアヤコール、ＶＧ）が産生される。酵素はさらなる補助要因を必要とせず、
約２２Ｋｄａの見かけの分子量を有する。
【０１２７】 本発明のもう１つの特定の具体例では、フェルラ酸デカルボキシラーゼを組織
選択性プロモーターの制御下に置き、フェルラ酸代謝が特異的に変更された組織
を含んでなる植物をもたらす。
【０１２８】 フェルラ酸の変更はフェルラ酸含量の低下およびフェニルプロパノイド経路の
種々の産物にさらなる変更をもたらす。
【０１２９】 また、本発明は植物組織、特に植物種子の作出を意図したものであり、それは
飼料または食品用途に有用性がある。種子の直接給餌および加工された種子由来
の改良粉餌の使用は双方とも本発明の範囲内にある。植物種子におけるフェノー
ル含量の低下は飼料用途において望ましいものであり、フェノール含量が変化し
た、特に抗栄養フェノール含量が低下した遺伝的に改変された種子は飼料産業に
おいて大きな有用性がある。
【０１３０】 完全にまたは部分的に粉砕された種子の直接給餌に加え、種子粉餌を製造する
のに使用される多くの方法がある。アブラナ科の種子において特に重要なものは
アブラナ科の脂肪種子から油を抽出する際の粉餌の製造である。一般に、溶媒ま
たは非溶媒法のいずれかを用いて脂肪種子から油を抽出する。この方法によって
産生されたケーキまたは排除された固体は粉餌配合物に使用され、通常アブラナ
科の種子のフェノール含量の大部分を含む。フェノール含量が低い粉餌を製造す
る方法はアブラナ科の種子に由来する粉餌には目下のところ見出されていない新
規な組成を提供する。
【０１３１】 本発明はフェノール含量が変化した粉餌製品を得る方法に従って製造された、
遺伝的に改変された種子を利用することを意図するものである。
【０１３２】 記載の方法は植物の表現型の変更に関して多くの利点を提供する。従って、こ
の方法により公知の工業的有用性を有する種々の化合物の製造が可能となる。記
載の方法はいずれの植物種または植物組織においても有用性がある。
【０１３３】 記載の方法はフェニルプロパノイド経路の操作に関する公開技術に関して多く
の利点を提供する。この方法は植物全体に表れ、ＵＶ感受性に関与するＳＩＮＩ
変異などの変異によるものではない。この方法はアンチセンスＲＮＡなどの遺伝
子発現を妨げるようデザインされた遺伝的機構またはフェニルプロパノイド経路
からの植物遺伝子のクローニングを必要とする共同抑制効果を利用するものでは
ない。この方法は植物本来のいずれの遺伝子も特異的に改変しない。従って、フ
ラボノイドの産生、ＵＶ保護剤の産生、病害応答における関与および経路の他の
生化学的機能といった経路の種々の機能が有害に変更されるものではない。組織
選択性プロモーターの使用により、植物の他の組織は変化しないまま、いずれの
組織においてもフェノール含量を変更することができる。
【０１３４】 記載の方法は多くの植物種に有用性があるが、特にアブラナ科の植物に有用性
がある。この方法の結果として、ストレス保護剤または導入酵素活性の結果とし
ての価値ある工業的化合物の産生によって、さらなる利益が提供される。この方
法によってフェニルプロパノイド経路内のどんな数の工程も標的とすることがで
き、また同様のアプローチを用いて他の生化学的経路も改変することができるこ
とは明らかである。
【０１３５】 また、本発明は他の二次謝経路を改変することにも有用性がある。例えば、本
発明の１つの具体例では、糖アルコール代謝が変化した植物の作出、特に種子細
胞におけるフィチン酸塩含量の変更のために提供された方法およびＤＮＡ構築体
がある。フィチン酸塩はスタキオース、ラフィノース、スクロシルグリコシド、
ウロニド、ペントース、ホスホイノシチドおよびグリコホスホセラミドをはじめ
とする他の化合物形成の前駆体または中間体としての役割も果たす糖アルコール
であるミオイノシロールに由来する。本発明はアブラナ科の種子においてフィチ
ン酸塩含量を低下させる方法およびＤＮＡ構成体をさらに提供する。また、本発
明は飼料用途に好適なフィチン酸含量が低下した植物種子、改良粉餌の製造に好
適なフィチン酸含量が減少した植物種子、イノシトール代謝が改変された植物細
胞を提供する。
【０１３６】 本発明は種子細胞においてフィチン酸塩含量が変化した植物を作出するための
方法およびＤＮＡ構築体を提供する。本発明は単子葉植物、双子葉植物、脂肪種
子およびアブラナ科の種子においてフィチン酸塩含量を低下させる方法およびＤ
ＮＡ構成体さらに提供する。また、本発明は飼料用途に好適なフィチン酸含量が
低下した植物種子、改良粉餌の製造に好適なフィチン酸含量が低下した植物種子
、イノシトール代謝が改変された植物細胞を提供する。
【０１３７】 本発明ではフィチン酸生合成に関する糖アルコール前駆体、すなわちミオイノ
シトールに作用する酵素をコードする遺伝子の発現を意図しており、これはこの
前駆体の植物細胞内に無害に蓄積し得る、「行き止まりの」または十分に代謝さ
れない化合物への代謝変更を引き起こす。この方法で、フィチン酸生合成の減少
が達成される。本発明に記載の方法によって他の糖アルコールを標的とすること
ができる。ミオイノシトールを標的とするのに使用される酵素は細菌、動物また
は植物起源のものであってもよい。酵素は天然のものであってもまたは公知の酵
素の突然変異由来のものであって、その基質特異性が変化して新規な酵素活性を
示すものであってもよい。
【０１３８】 ミオイノシトールに作用させるのに使用される酵素は植物細胞に無害であって
、それゆえ植物細胞に対して有害な作用をともわずに高レベルに蓄積し得る化合
物を産生することが好ましい。本発明の範囲内で、１種以上の酵素を使用しても
よく、１種以上の異なる活性を使用してミオイノシトールのレベルを低下させて
もよい。
【０１３９】 本発明の範囲内で使用される酵素は異性化、抱合、リン酸化、ヒドロキシル化
、、メチル化または他の同様の生化学的活性のいずれかによってミオイノシトー
ルを修飾できるものであるか、またはミオイノシトールまたは他の糖アルコール
を排除できる酵素を含んでなってよい。
【０１４０】 本発明の範囲内で使用される酵素はいくつかの起源由来のものであってよく、
または種々の方法によるものであってよい。例えば、当業者は化学的に類似する
物質に対する公知の活性を用いて酵素を同定し得る。従って、本発明の範囲内で
酵素を同定し、遺伝子を単離して使用することができる。本発明の範囲内で使用
される酵素は当技術分野で一般に知られている方法を用いて改変してもよい。
【０１４１】 さらに、この方法は形質転換を使用して植物細胞内に酵素をコードする遺伝子
を導入することにさらに依存するものである。植物細胞の形質転換は種々の手段
によって達成し得る。一般的に有用な方法としてはバイナリーおよびＡ．ツミフ
ァシエンス(A. tumifaciens)およびＡ．リゾゲネス(A. rhyzogenes)双方の融合 体プラスミドのいずれかを用いるアグロバクテリウムを基にした系（例えば、米
国特許第４，９４０，８３８号、米国特許第５，４６４，７６３号）、生物学的
アプローチ（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号、米国特許第５，０１５
，５８０号、米国特許第５，１４９，６５５号）、マイクロインジェクション法
（例えば、米国特許第４，７４３，５４８号）、プロトプラストによるＤＮＡの
直接取り込み（例えば、米国特許第５，２３１，０１９号、米国特許第５，４５
３，３６７号）または針状電極法（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号）
が挙げられる。植物細胞を遺伝的に形質転換させるいずれの方法を本発明の範囲
内で使用してよい。
【０１４２】 また、この方法は特性が変化した植物細胞または組織、特に飼料に使用される
植物種子組織の再生と使用に依存するものである。
【０１４３】 このように糖アルコール代謝が変化した植物細胞が得られる。多数の化合物が
糖アルコールに由来しているが、最も重要なものはフィチン酸またはフィチン酸
塩化合物である。ある植物細胞においてフィチン酸塩を減少させる方法は飼料用
途に大きな有用性がある。
【０１４４】 ミオイノシトールに作用することができる酵素をコードする遺伝子は天然物、
合成物またはそれらの組合せであってもよい。当業者ならば、遺伝子のコード配
列を改変して植物細胞において高レベルの発現を可能にすることができることが
容易にわかるであろう。これは遺伝子が発現される植物細胞に通常見られるコド
ン用法に、より正確に類似するようにコドンの配列を変更することによって達成
し得る。さらに、特定の制限部位を作出してコード配列の便宜な操作を可能にす
ることができることは明らかである。また翻訳エンハンサー、イントロンなどの
種々の配列の付加を用いてコード配列の十分な発現を確実なものにできるという
ことも意図される。これらの操作の総ては当技術分野では一般的なものであり、
当業者ならば容易にわかるであろう。
【０１４５】 また、組織選択性プロモーターを使用して、種子組織などのフィチン酸が作ら
れる組織への、ミオイノシトールを修飾することができる酵素の発現を制限する
ことができることも明らかである。好適な種子選択性プロモーターとしては、ア
ブラナ由来のナピンプロモーター、ファゼオリス由来のファゼオリンプロモータ
ーまたは種子選択的である他のプロモーターいずれもが挙げられる。
【０１４６】 特に、本発明の範囲内では、メセンブリアンテマから入手できるものなどのミ
オイノシトールＯ−メチルトランスフェラーゼの使用が考えられる。
【０１４７】 本発明はミオイノシトールに作用することができる酵素の発現により生じる遺
伝的に改変された種子の使用を考えており、この酵素は種子選択性プロモーター
の制御下にある。従って、フィチン酸のレベルは低下する。種子を加工するとフ
ィチン酸含量が低下した粉餌製品が得られる。従って、この方法の結果としてフ
ィチン酸含量が減少した飼料製品も得られる。
【０１４８】 本発明はフィチン酸含量が減少したアブラナ科の種子を作出する手段を提供す
る。特に本発明の範囲内では、アブラナ科の作物においてメセンブリアンテマト
由来のものなどのミオイノシトールＯ−メチルトランスフェラーゼを使用してフ
ィチン酸のレベルを低下させることが考えられる。当業者ならば、本発明の結果
としてアブラナ科の種子からフィチン酸含量が低下した粉餌の製造を達成するこ
とができることが容易にわかるであろう。
【０１４９】 種子粉餌中のフィチン酸の存在が水産養殖で飼育される魚に有害であるという
ことが知られている。しかしながら、カノーラ種子粉餌などのいくつかの種子粉
餌は魚の栄養素に好適なタンパク質組成を有している。カノーラ粉餌中の高濃度
のフィチンによって、魚の食餌に使用され得る量が制限される。従って、アブラ
ナ科の種子から製造されるフィチン酸が減少した粉餌は水産養殖において大きな
有用性がある。
【０１５０】 従って、本発明はフィチン酸含量が改変された種子およびフィチン酸含量が低
下した種子粉餌の生産に有用性がある。改変された種子および粉餌は飼鳥類、豚
、水産養殖、反芻動物および非反芻動物をはじめとするいくつかの飼料用途にお
いて有用性を有する。さらに、前記の記載により本発明の範囲内で、いずれの数
の種々の酵素を使用してミオイノシトールを修飾してもよいということが明らか
である。また、種子選択性プロモーターを用いるこれらの酵素の種々の組合せを
使用してフィチン酸の特異的減少を達成し得ることも明らかである。
【０１５１】 糖アルコール二次経路への本発明の適用は例示された植物種に限定されるもの
ではない。実際、本発明の方法によりフィチン酸を産生するいずれの植物種も改
変し得る。この方法は、商業上重要な総ての主要作物種に対し、使用される酵素
、Ｏ−メチルトランスフェラーゼが異種であるのでいずれの作物種においても有
用性を提供する。従って、本方法によって動物の飼料に使用される、または一部
もしくは全体が動物の飼料に使用される種子を生産するいずれの作物種も改変し
て、フィチン酸塩含量が低下した植物を作出することができる。従って、この方
法を単子葉植物（例えばトウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ）お
よび双子葉植物（例えばダイズ、ワタ、アルファルファ、アブラナ属の各種蔬菜
、アマ、ヒマワリなど）をはじめとする総ての作物において適用し得る。
【０１５２】 本方法によってフェニルプロパノイドおよび糖アルコール代謝双方の改変が達
成され、本発明の方法に従う信頼性のある、予測可能な方法で、どのように特定
の代謝化合物、特に非栄養素化合物の減少が達成されるかに関する特定の実施例
を提供する。
【０１５３】 当業者には、本発明の範囲内でいずれの二次代謝経路も変更することができる
ということが明らかである。本発明は２種の関連のない二次代謝経路において実
証されており、予測し得り、かつ確実な結果を提供する。本発明の広範囲の教え
のもと、例えばカノーラ植物細胞、トウモロコシ植物細胞、イネ植物細胞および
ワタ植物細胞における抗栄養物質の減少が達成される。
【０１５４】 本発明の方法の一部として、当業者は特定の二次代謝産物の産生を評価しなけ
ればならない。よって、当業者ならば、二次代謝産物またはその前駆体として使
用される化合物が合成される組織、ならびにそれが作られる発達の時間枠につい
ての基礎的な理解が必要なことが容易にわかるであろう。かかる情報は二次代謝
産物またはその前駆体に作用する酵素の発現を制御するプロモーターの選択のた
めの指標を提供するであろう。この方法では、当業者ならば、二次代謝産物を標
的とするには二次代謝産物が作られる組織において、ならびにそれが作られる発
達の時間枠において、その二次代謝産物の前駆体に作用することができる酵素が
必要となるであろうことが容易にわかる。よって、二次代謝産物の前駆体に作用
する酵素は前駆体の合成時点またはその付近に発現されるべきである。
【０１５５】 さらに、当業者は、本発明が実施される組織の生化学的分析を行わなければな
らない。この分析としては、発達中の組織内の種々の化合物のレベル、生合成の
いずれかの区画化または細胞下の限局化、化合物が最初に合成されるかまたはも
はや合成されない発達期間およびいずれかの他の関連ある生化学的情報の測定を
挙げることができる。この分析を行うことによって、当業者は植物組織において
好適なレベルの発現を提供して二次代謝産物含量に所望の変化をもたらすプロモ
ーターを選択できるであろう。前駆体として使用される化合物のレベルにおいて
は小さな変更であっても所望の効果を提供し得るということがわかる。
【０１５６】 例えば、本発明のフィチン酸例の一部として、当業者ならば、はフィチン酸が
合成される組織、ならびにフィチン酸が作られる発達の時間枠についての基礎的
な理解が、ミオイノシトールに作用する酵素の発現を制御するプロモーターの選
択のための指針を提供するであろうことが容易にわかるであろう。この方法にお
いて、当業者ならば、ミオイノシトールを標的とするにはフィチン酸が作られる
組織においてミオイノシトールに作用することができる酵素、ならびにフィチン
酸が作られる発達の時間枠が必要となるであろうことが容易にわかる。従って、
ミオイノシトールに作用する酵素はフィチン酸の合成の時点またはその付近に発
現されるべきである。酵素の発現レベルを改変してフィチン酸の特定のレベルの
低下を達成することができる。この減少レベルはわずかなパーセントからフィチ
ン酸のほぼ完全な消失までの範囲に及び得る。当業者ならば、フィチン酸の減少
は、とりわけフィチン酸が多いある一定の作物種においては、フィチン酸が低レ
ベルで存在している作物種よりもミオイノシトールを修飾する遺伝子のより高い
発現レベルを必要とすることが容易にわかるであろう。種々の手段による発現レ
ベルの操作は当業界では十分に公知である。これには翻訳を増強するＤＮＡ配列
、高レベルの転写をもたらす強力なプロモーターの付加、または導入遺伝子に対
する確かなレベルの高い転写をもたらすことが明らかなマトリックス付着もしく
は足場付着領域といったＤＮＡ配列の付加を挙げることができる。
【０１５７】 また本発明のこの具体例は、植物組織、特に飼料用途に有用な植物種子の作出
を意図する。種子の直接給餌および加工種子由来の改良粉餌の使用は双方とも、
本発明の範囲内にある。植物種子におけるフィチン酸含量の減少は飼料用途にお
いて望ましいものであり、フィチン酸含量が変化した遺伝的に改変された種子は
飼料産業において大きな有用性を有する。
【０１５８】 ある適用においては、全粒を動物に給餌することもできるし、あるいは穀粒を
分別せずに最小限に加工する。例えば、トウモロコシ粒は最小の加工をして飼料
に使用されることが多い。しかしながら、加工されるトウモロコシ粒もあり、ト
ウモロコシグルテン粉餌などの最終加工品もまた動物に給餌される。両形態のト
ウモロコシ飼料とも、低下したフィチン酸レベルによって、特にそれが動物から
排泄される過剰なリンによる環境悪化に関連するので、利益を得ることができる
。コムギ、オオムギ、エンバクなどの飼料に使用される他の穀類も本発明から利
益を得ることができる。従って、本発明は商業的に重要な広範な作物種において
有用である。ミオイノシトールはいずれの作物種にも見出され、またフィチン酸
生合成の唯一の公知の前駆体であるので、本発明においてミオイノシトールレベ
ルを変更することが証明される遺伝子は、いずれの作物種においても働くことと
がわかるであろう。このように、ミオイノシトールを改変するのに使用されるメ
チルトランスフェラーゼ遺伝子の有用性は明確に実証されている。当業者ならば
、コード領域のコード配列またはプロモーターの特定のＤＮＡ配列、あるいは非
翻訳リーダー配列、ターミネーターなどを改変して植物細胞または特定の植物種
における最適な発現を確実なものとすることができることが容易にわかる。これ
は総て、当業者の技術の範囲内である。従って、穀粒が直接飼料用途に使用され
る植物種、または飼料用途に使用される前に穀粒が加工される植物種を含む、遺
伝的に形質転換可能であるいずれの植物種においても本発明を実施できるという
ことが十分に意図できる。
【０１５９】 従って、この方法の結果としてフィチン酸含量が減少した全種子飼料製品が製
造される。
【０１６０】 全部または部分的に粉砕された種子の直接給餌の他、種子粉餌を製造するのに
使用される方法には多くがある。トウモロコシの湿式製粉は数ある製品の中でも
トウモロコシグルテン粉餌を製造するのに使用される。本発明の方法に従い、加
工トウモロコシ粉餌製品の他、フィチン酸が減少した全粒トウモロコシも作出で
きる。本発明はまたフィチン酸が減少したトウモロコシグルテン粉餌の製造にお
いても有用である。
【０１６１】 トウモロコシなどの主要飼料作物に加え、脂肪種子作物は飼料に使用される多
量の植物粉餌を提供する。脂肪種子において特に重要なことは油の抽出の際の粉
餌の製造である。一般に、油は溶媒または非溶媒処理のいずれかを用いて脂肪種
子から抽出する。この処理によって製造される「ケーキ」または搾油かす固形分
が飼料配合物に使用され、通常種子のフィチン酸含量の大部分を含む。
【０１６２】 最も一般的な脂肪種子の加工は、油の抽出および油の抽出に続く種子のケーキ
または残りの構成要素の回収を含む。本発明はこの処理に有用であり、また減少
したフィチン酸により、得られる粉餌製品は従来法で製造された粉餌よりも価値
あるものである。
【０１６３】 従って、フィチン酸含量が低い粉餌を製造する方法は、脂肪種子由来の粉餌に
はこれまでには見られない新規な組成を提供する。本発明から利益を得るであろ
う主要な脂肪種子作物としてはアブラナ(Brassica napas)、カブ(Brassica rapa )、カラシナ(Brassica juncea)、ブラシカ・ニグラ(Brassica nigra)、シナピス
・アルバ(Sinapis alba)、ハマナ(Crambe)、エルカ・サティバ(Eruca sativa)な
どのアブラナ科の脂肪種子作物および他の商業的に重要であって、かつ粉餌に使
用され得るアブラナ科の脂肪種子が挙げられる。粉餌用途に使用されることが多
いアブラナ科以外の脂肪種子としてはダイズ、ワタ、トウモロコシ、ベニバナ、
ヒマワリ、およびラッカセイが挙げられる。
【０１６４】 本発明はミオイノシトールに作用することができる酵素の発現によって作出さ
れる遺伝的に改変された脂肪種子の使用を意図するものであり、この酵素は種子
選択性プロモーターの制御下にある。よって、フィチン酸のレベルが低下する。
脂肪種子を加工するとフィチン酸含量が低下した粉餌製品が得られる。
【０１６５】 以下、実施例により本方法を具体的に示すが、これらは本発明の範囲を限定す
るものではない。
【０１６６】
【実施例】
実施例１：フェニルプロパノイド経路の産物の同定に使用される一般法：アブラ ナ科の種子におけるフェニルプロパノイド経路の最終産物である、シナピン含量 の測定 当業者ならば、分析化学における多数の出版物を参照することによって例示さ
れた方法の総てをフェニルプロパノイド経路の産物の測定に適合させることがで
きることは明らかである。例示された第１の方法では、公開された方法(Chapple
, C.C.S., T. Vogt, B.E. Ellis and C.R. Somerville, 1992, Plant Cell 4:14
13-1424)から植物組織、すなわちアブラナ科の植物からの種子組織におけるシナ
ピンの同定のための簡単なアッセイを適用した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）プロトコールをフェニルプロパノイド経路産物シナピンの評価用に標準化し
た。この方法ではシリカプレート（例えば、Whatman ６０Ａ ＳｉｌｉｃａＧ）
上にスポットされた植物抽出物と既知量のシナピンの分離を利用した。公開され
た方法（例えば、D. Strack, 1977, Z. Pflanzenphydiol, 84:139-145)によって
シナピンを精製することができる。分離は起点から約１０ｃｍまでで、各々１０
：２：３の割合のｎ−ブタノール、酢酸および水の溶媒混合物の移動によるもの
とした。予め秤量したサンプルを１００〜５００マイクロリットルのメタノール
溶液（９８％メタノール、２％酢酸）を含有する、厳重に密閉した試験管内に一
晩浸漬し、次いで先に加えたものと同じ等量のメタノールを加えて粉砕すること
によって種子抽出物を調製した。約１２，０００×ｇの遠心分離後、上清を得た
。クロロホルム：水（ＣＷ；４００マイクロリットル：１００マイクロリットル
）混合物で上清を抽出し、それを前記のように遠心分離し、脂質相を除去して水
相を風乾または真空乾燥した。サンプルを水に溶解してＴＬＣプレートにスポッ
トした。上昇性溶媒に曝す前に、経験的試験から決定される所定量のサンプルを
ＴＬＣプレートにスポットした。既知量の新しいサンプルを乾燥させ、次いで秤
量することによって、使用した乾燥重の測定値を得た。
【０１６７】 次いで、紫外線照射下でＴＬＣプレートを観察すると、輝くスポットとしてシ
ナピンが可視化された。これまでに精製したシナピンのサンプルを単独で標準と
して、また種子抽出物との人工的混合物としても使用して、種子抽出物の構成要
素とともに存在する場合に、精製されたシナピンが種子抽出物中のシナピンとと
もに移動するということを確認した。放射活性標識したシナピンの放射量を測定
する場合には、放射活性放出を定量的に描くＡｍｂｉｓ４０００(Scanalytics) スキャナーでＴＬＣプレートをスキャンした。
【０１６８】 次いで、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してシナピン含量を
確認した。前記のような植物材料のメタノール抽出物でクロロホルム−水抽出物
を含まないものをＮｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８ＡＢカラムを取り付けたＶａｒｉ ａｎ ＨＰＬＣ機によるＨＰＬＣ分析に付した。注入容量は典型的には１０マイ
クロリットルであり、また移動層は溶媒Ａ（水中の２％酢酸）および溶媒Ｂ（ア
セトニトリル中の２％酢酸）の混合物であった。典型的な操作条件は溶媒Ａが１
７分にわたって９０％〜８０％に変化し、次いで１分にわたって１０％までのさ
らに低下する移動層を必要とする。カラムを４分間の間１０％溶媒Ａを保持させ
、次いで流して９０％溶媒Ａで平衡化する。これらの条件を変化させて溶出され
る物質の分離を高めることができる。例えば、溶媒Ａを最初の時点の９０％から
１５分にわたって８０％へ、１５分にわたって７０％へ、次いで２分にわたって
１０％へ、さらにもう２分１０％として９０％で平衡化に変更できる。ダイオー
ドアレイ検出器を使用して紫外線吸光度をモニターした。サンプル分析のために
は、３３０ナノメーター設定での紫外線吸光度を使用した。精製シナピンを用い
て標準曲線を求め、植物抽出物中のシナピンの定量に使用した。ＨＰＬＣ条件（
例えば溶媒の割合および勾配、種々の種類の溶媒）は変化させてもよいことは、
当業者には明らかである。装置および適用されるサンプルの複雑性に適した条件
を決定することが望ましい。公開された文献で、シナピンをはじめとするフェノ
ール化合物を分析する多様なＨＰＬＣ法は教示されている。
【０１６９】 放射活性トレーサー研究を用い、シナピン合成開始の、また種子の種々の部分
において新規に合成されたシナピンの割合を決定するためのより正確な像を得た
。また、放射活性トレーサー法を使用して、個々の種子構成要素（例えば、子葉
、胚、種皮）の外来のコリン供給からシナピンを合成する能力を決定することも
できる。次いで、例えばＴＬＣプロトコールとそれに続くＡｍｂｉｓ４０００に
よるスキャニングによって放射活性産物をシナピンに関して分析してもよい。
【０１７０】 種子および種子構成要素における総シナピン含量の定量分析には、ＨＰＬＣプ
ロトコールを使用した。種子生育の種々の段階でのシナピン含量の定量分析には
ＴＬＣを使用し、また種子および子葉、胚軸、種皮などの種子組織におけるシナ
ピンの開始および分布の測定には、ＴＬＣを用いる放射活性トレーサーとそれに
次ぐ放射活性スポットの測定を使用した。
【０１７１】 in vivo条件をできる限り代表する実験条件を提供するために、コリンからのd
e novoシナピン合成を確立するための放射活性トレーサー法には単離種子ではな
く莢全体（長角）を使用した。制御された条件下、典型的には１６／８時間の明
／暗サイクルで明期温度２０℃、暗期温度１５℃で生育させた植物体から種々の
生育段階からの長角果を得た。長角果の小花柄部分をNew England Nuclearから 購入した１４Ｃ標識したコリン（２．０ＧＢｑ／ｍｍｏｌの原液固有活性；濃度
、７．４ＭＢｑ／ｍｌ（これは０．２ｍＣｉ／ｍｌと同等である）；コリン、３
．７マイクロモル／ｍｌ）を含有する溶液に浸漬した。小花柄を１．８ｍｌの１
／２強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地などの水性培地および１ｍＭの
非放射活性コリンおよび１．８〜９マイクロリットルの放射活性コリン原液を含
有する試験管内に浸漬した長角果を植物生育チャンバー内で、１６時間明／８時
間暗の明／暗サイクルで２４〜７２時間、２０℃の温度でインキュベートした。
光条件は１秒当たり５１マイクロアインシュタイン／ｓｑ．ｍであり、これらの
莢から摘出した種子をＴＬＣ分析に使用した。メタノール溶液で、次いで前記の
ようなクロロホルム−水（ＣＷ）抽出によってこれらのサンプルを抽出した。
【０１７２】 古い種子を分析する場合には、前記の方法に加え、長角果から取り出した種子
の浸潤を行った。２０個の種子を軽い減圧下で１５分間、約２３℃の室温で５０
０マイクロリットルの前記の放射活性コリン培地で浸潤させた。次いで、放射活
性培地を除去して５００マイクロリットルの１４Ｃ−コリンを欠く前記組成の非
放射活性培地に置換し、２３℃で２４時間インキュベートした。その後、前記の
ようにして種子を抽出した。
【０１７３】 また、各々５：１２：３：の割合のクロロホルム：メタノール：蟻酸の混合物
（ＣＭＦ）によって植物材料を抽出することもできる。典型的には、サンプル１
ｍｇあたり２マイクロリットルのＣＭＦを加え、サンプルを磨砕して室温（２１
〜２３℃）に一晩（１６時間）放置し、次いで約１２，０００×ｇで５分間遠心
分離した。上清を回収し、また前に加えたような新たな量のＣＭＦでペレットを
完全に混合し、２０分放置して前記のように遠心分離した。上清をプールし、前
記のようにクロロホルム−水（ＣＷ）抽出を行って水性画分を前期のように分析
した。
【０１７４】 実施例２：特定の組織におけるフェニルプロパノイド経路の産物の合成の位置決 定 この実施例では、フェニルプロパノイド経路産物合成の発生のタイミングを測
定した。この特定の実施例によりシナピン合成およびアブラナ科の種子組織内で
の蓄積を示す。この実施例では、アブラナの発達中の種子を使用した。人口受粉
された花から得た長角果の抽出物のＴＬＣ分析を行い、シナピン蓄積の開始の時
間を立証した。受粉後日数（ＤＡＰ）７、１４、１６、１８、２０、２２、２４
、２６、２８、３０、３２および３４および種子成熟後にサンプルを採取した。
実施例１に記載の方法に従って種子抽出物を調製し、ＴＬＣ分析によってシナピ
ン含量を可視化した。シナピンは１８ＤＡＰ〜種子成熟まで確認され、成熟種子
は多量のシナピンを含んでいることが示され、このことは発達中の種子において
正味の蓄積があるということを示唆するものである。
【０１７５】 種子を取り出した莢壁画分はシナピンを含んでおらず、また７−１４−および
１６−ＤＡＰのサンプルからの若い種子中にはシナピンはなかった。この分析は
シナピン蓄積の開始は約１８ＤＡＰであると示したが、しかしながらこの方法は
紫外線蛍光検出を用いるので、若い種子中に極めて少量の存在が、たとえあった
としても検出不可能であろう。図３は２８ＤＡＰまでのサンプルのＴＬＣ分析の
実施例を示し、第２のプレートは種子成熟までの実施例を示す。前記の結果は定
量的ではないが、実施例１に記載のようにメタノール溶液を用いて得た、全種子
抽出物のＨＰＬＣ分析を行った。図４に示される結果から、２０ＤＡＰから急速
に増加し成熟まで継続するシナピン合成の開始が確認された。成熟種子における
シナピンの量は種子の乾燥重に対して約０．８％であり、種子の約４５％が油で
あると考えられるので、このことから油を除いた種子粉餌の約１．５％と言い換
えられよう。
【０１７６】 実施例３：フェニルプロパノイド経路における生産物合成についての時間的およ び空間的態様の決定−種子発達に関連したシナピン合成 さらに実施例２で得られた情報に基づき、発達中の種子によりシナピンが合成
されることが示された。また種子発達中には、シナピンの分解が最小限であるこ
とが明らかとなった。この分析についての確証を得るため、発達中の種子を、植
物のフェニルプロパノイド経路の最終段階であるシナポイルグルコースからのシ
ナピン合成に使用される前駆体、１４Ｃ−コリンとともにインキュベートした。
放射性前駆体の存在により標識されたシナピンが生産された。このように、この
方法によりシナピン生合成の定量化が可能である。図５で示されるように、シナ
ピン合成（１４Ｃ−コリンのシナピンへの取り込み）は１０ＤＡＰでは検出され
ず、１４ＤＡＰで初めて確認された。シナピン合成（すなわち、前駆体シナポイ
ルグルコースとコリンからの最終産物シナピンの生産）は１４ＤＡＰから成熟間
近の種子までに起こる。よって、種子内でのシナピンの蓄積は１４ＤＡＰ後に開
始され、発生中の種子は成熟するまでシナピンを合成して蓄積し続ける。
【０１７７】 １８ＤＡＰは非放射性分析でシナピンの蓄積が認識できるようになる時点であ
ると考えられるが、放射性アッセイはより感度がよく、検出しようとする生合成
が少量であったとしても検出できる。よって、放射性アッセイにより示されるよ
うに、シナピン合成はまず１４ＤＡＰにおいて低速で開始される。浸潤調査では
、シナピン合成能が、さらに生育した成熟間近の種子にも存在することが示され
ている（図６）。
【０１７８】 当業者は、フェニルプロパノイド経路の産物の蓄積についての発生時間枠の決
定に加え、さらにフェニルプロパノイド経路の産物の生合成についての組織特異
性を決定しなければならない。実施例のこの部分では子葉、胚軸および種皮にお
けるシナピンの蓄積を測定した。１８〜４２ＤＡＰの長角果全体を用いて放射性
トレーサー分析を行った。摘出した長角果の小花柄を１４Ｃ−コリンを含む溶液
に２４〜７２時間浸し、３つの種子構成部分を切開してシナピンについて分析し
た。この結果は図７で概略が示されているが、子葉で最大量のシナピン（種子当
たり）が含まれ、次いで胚軸および種皮に含まれることがわかった。子葉および
２５ＤＡＰ〜成熟種子の胚軸からのシナピン抽出物から、胚軸には子葉のシナピ
ンの約５０％（乾燥重量）が含まれていたことがわかった（図８）。しかしなが
ら、子葉は胚軸に比べ、質量が比較的大きい（成熟した胚軸の重量の約６倍）の
で、そのシナピン含量は種子に見られる全シナピンの９０％を占めるまでになる
（図９）。
【０１７９】 実施例４：フェニルプロパノイド経路の前駆体に作用することができる酵素をコ ードする遺伝子による植物の遺伝的形質転換 本実施例では、シナピン合成に使用される前駆体に作用する酵素、コリンオキ
シダーゼ（ＣＯＸ）を植物細胞で発現させる。酵素、コリンオキシダーゼを種子
選択性プロモーターの制御下、植物形質転換ベクターに挿入する。コリンはシナ
ポイルグルコースからシナピンを生産するための前駆体であり、このためコリン
プールが縮小することによりシナピンの生産が減少する。
【０１８０】 種子選択性コリンオキシダーゼ（ＣＯＸ）構築体による、アブラナ科植物種の
アブラナ(Brassica napas)の遺伝的形質転換。コリンオキシダーゼ遺伝子のＤＮ
Ａ配列を図１０に示し、推定アミノ酸配列を図１１に示している。種子特異的な
発現をもたらすため、ｎａｐｉｎプロモーター配列(Kohno-Murase, J., M. Mura
se, H. Ichikawa, and J. Imamura, 1994, Plant Molecular Biology, 26: 115-
1124) を用いた。この最終プラスミドｐＨＳ７３１は、Maniatis, T., Frittsch
, E.F., and Sambrook, J. (1982; Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Habor, New York)のようなマニュアルに記載される標準プロトコー
ルに従い、一連のクローニングおよびサブクローニングにより構築した。ベクタ
ー主鎖は、ＲＤ４００のＮｏｓＰ−ＮｐｔＩＩ植物選択マーカーの代わりにｇｕ
ｓとｎｐｔとの融合遺伝子（Ｇｕｓ：：ｎｐｔ）を含むように改変されたＲＤ４
００(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuｋ, B., Pelcher, L.E., andK
eller, W., 1992, Gene 211: 383-384)由来のものである。Ｇｕｓ−ｎｐｔにつ いてはこれまでに既に記載されている(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pel
cher, L.E., Crosby, W.L., and G. Selvaraj, 1991, Gene 101: 239-246)。こ れをｎｐｔ配列の末端にＮｏｓターミネーター（ポリＡシグナル）を含む２．６
Ｋｂ断片として、ｐＧＫＫ１４(Datlaら, 1991)からＲＤ４００の全Ｔ−ＤＮＡ を欠失させた中間プラスミドへクローン化した。ｐＢＩ５２５(Datla, R.S.S.,
F. Bekkaoui, J.K. Hammerlindl, G. Pilate, D.I. Dunstan and W.L. Crosby,
1993, Plant Science 94: 139-149)由来のアルファルファモザイクウイルスリー
ダーとともに、部分的に複製されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、Ｇｕｓ：：
ｎｐｔ配列の５’末端のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローン化した
。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩに対する部位および隣接するＸｂａＩ部位を、ポ
リメラーゼＩのクレノウ断片で末端を埋めることにより除去してｐＨＳ７２２を
得た。ポリメラーゼ鎖反応により、ｐＴＺ１９Ｒ(Mead, D.A., E.Szczesna-Skor
upa, and B. Kemper, 1986, Protein Engineering 1: 67-74)由来の多重クロー ニング部位を含むラクトース−α機能領域が０．２６Ｋｂ断片として得られた。
この断片をＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＨＳ７２２のＥｃｏＲＩ部位
に導入してｐＨＳ７２３を得た。ベクターのＴ−ＤＮＡ部分のヌクレオチド配列
を決定し、多重クローニング部位の特定部位を制限解析によって確認した。ｐＨ
Ｓ７２５はｐＨＳ７２３を起源とした誘導体であり、本来カリフラワーモザイク
ウイルスポリＡシグナルとして適切な部位またはかかる特徴を提供する一連の中
間ベクターを経由するｐＫＲ１１（Rozwadowskiら, 1991 参照）由来のコリンオ
キシダーゼのオープンリーディングフレームを含んでいる。ｐＨＳ７２５ベクタ
ーはｐＨＳ７２３バックグラウンド内に３’末端にＣＡＭＶのポリＡシグナルを
有するＣＯＸオープンリーディングフレームを与えてある。ＣＡＭＶ３５Ｓプロ
モーターを含むオープンリーディングフレームの５’部分を中間プラスミド由来
のｎａｐｉｎプロモーターと置き換えてｐＨＳ７３１を得た。中間プラスミドは
、プラスミドＲＤ４００(Datlaら, 1992)のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩウイン ドウへの ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ挿入配列として連結されているＪ．Ｋｏ ｈｎｏ−Ｍｕｒａｓｅ(Kohno-Muraseら, 1994)から受け取るＨｉｎｄＩＩＩ−Ｎ
ａｐｉｎＰ−ＢａｍＨＩカセットとして１．１Ｋｂ ｎａｐｉｎプロモーターを
含むｐＵＣ１９誘導体を含んでいた。得られたプラスミドはｐＨＳ９７４であっ
た。ＢａｍＨＩ−ＢＡＤＨオープンリーディングフレーム−ポリＡ−ＫｐｎＩカ
セットをｐＲＫＪ６Ａ（ｐＲＫＪ６Ａについては、R.K. Jain, 1995, Genetic E
nginering of Osmolyte Biosynthesis in Plants: Manipulation of Betaine Al
dehyde Dehydrogenase Gene Expression Tabacoo, Ph.D. Thesis, University o
f Saskatchewan, Saskatoon, Canadaで詳細に記載）由来の２．１Ｋｂ断片とし て単離し、ｐＨＳ９７４のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩウインドウに連結してｐＨＳ９
８１とした。ｐＨＳ９８１はｐＨＳ７３１の誘導に用いた。図１２では、得られ
たプラスミドｐＨＳ７３１が左右ボーダーｎａｐｉｎプロモーター−Ｃｏｘオー
プンリーディングフレーム−ＣａＭＶポリＡシグナルを含んでいることを示して
いる。ｎａｐｉｎプロモーター−Ｃｏｘオープンリーディングフレーム−ＣａＭ
ＶポリＡシグナルセグメントのヌクレオチド配列をその構成要素から決定した。
ｐＨＳ７２３の起源には左右の境界部およびその外側にある領域の総てを含んだ
ｐＢＩＮ１９の総てが含まれる(Bevan, M., 1984, Nucleic Acids Research 12:
8711-8721)ので、さらなる配列の確認も可能である。ｐＢＩＮ１９の完全なヌ クレオチド配列は公開されている。よって、前記ＣＯＸ遺伝子構築体は他のベク
ターへのクローニング用に容易に修正できる。大腸菌ＤＨ５のプラスミドベクタ
ーｐＨＳ７３１については、１９９７年１月２２日に受託番号ＡＴＣＣ ９８３
００としてAmerican Type Culture Collection(ATCC)、12301 Parklawn Drive, R
ockville MD, USA 20852に寄託された。
【０１８１】 公開された情報(DeLisle, A.J., and Crouch, M.L., 1989, Plant Physiology
91: 617-623; Hoglund, A. -S., T. Rodin, E. Larsson and L. Rask, 1992, P
lant Physiology 98: 509-515)とｎａｐｉｎプロモーターに関する本発明者の結
果に基づけば、ｎａｐｉｎ遺伝子発現がアブラナ種子の時間的発達の中間部分に
及んでいると考えられた。
【０１８２】 ベクターｐＨＳ７３１を標準的な３親交配によりアグロバクテリウム株ＭＰ９
０に挿入し、次いでアグロバクテリウムを媒介としてアブラナ科を形質転換させ
る。実質的にはMoloneyら, 1989, Plant Cell Reports 8: 238-242に記載される
ように形質転換を行った。
【０１８３】 バイナリーベクターｐＨＳ７３１を有するアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス株 ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０(Koncz C. & Schell, J., 1986, Mol. Gen.
genet. 204: 383-396)を形質転換の研究に用いた。ＬＢ液体培地（Ｄｉｆｃｏ，
ＵＳＡ）（１００ｍｌ）中の定常期細菌培養物を遠心分離により回収し、凍結防
止剤として１％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を加
えた新鮮なＬＢ液体培地１０ｍｌに再懸濁した。２００μｌアリコートを形質転
換に使用するまで−２０℃で保存し、形質転換では細菌アリコートを２％スクロ
ース、５０μＭアセトシリンゴンを含有するＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕ
ｓｉｏｎ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ） 、ｐＨ５．６ ２ｍｌに加え、 ２８℃で一晩インキュベートした。菌体密度はｍｌ当たり約１ｘ１０９細胞であ
った。
【０１８４】 Moloneyら, 1989, Plant Cell Rep. 8: 238-242の方法に従い、子葉外植片を 植物形質転換ベクターを含有するアグロバクテリウムに曝した。外植片の葉柄切
断面を一時的に細菌培地に浸漬した。この外植片を共存培養培地に挿入し、断面
が培地に接触するようにした。１０の外植片をそれぞれ１０ｘ１５ｍｍペトリプ
レートに入れた。共存培養プレートをＳｔｒｅｔｃｈ’ｎ Ｓｅａｌ（商標）ラ
ップで密閉した。プレートを、前記のような種子発芽段階に関する温度および光
周期条件にした生育キャビネットで３日間インキュベートした。次いでこの外植
片を選択培地に移した。
【０１８５】 選択培地に入れて３〜４週間後、再分化した緑の幼芽（推定形質転換体）を切
り取り、生育継続のための新鮮な選択培地に移した。幼芽が１．５〜２．０ｃｍ
の長さに達したときに、これを発根培地に移した。推定されるトランスジェニッ
ク幼芽は、実質的にはJefferson, R.A., 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-
405により記載されるようにして、ｇｕｓ遺伝子の発現に関してスクリーニング した。青色染色の存在が形質転換の結果とみなされた。
【０１８６】 形質転換の確認については、ＮＰＴＩＩおよびＰＡＴアッセイ、サザンブロッ
ト、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）および後代解析により確立された。２０２
６２２と称されるベクターｐＨＳ７３１を含有するＷｅｓｔａｒ品種、アブラナ
のトランスジェニック種子については、１９９７年１月２２日に受託番号ＡＴＣ
Ｃ指定９７８５４としてAmerican Type Culture Collection(ATCC)、12301 Parkl
awn Drive, Rockville MD, USA 20852に寄託した。
【０１８７】 次いでアブラナ（Brassica napus）種子のコリンオキシダーゼ遺伝子の発現を
測定した。いくつかの独立したトランスジェニック系統を再分化させた。ＣＯＸ
活性については共役酵素反応を用いて証明した。ＣＯＸはコリンからベタインア
ルデヒドを生成するが、このベタインアルデヒドをＢＡＤＨによるそのＮＡＤ依
存性酸化によって容易にアッセイすることができる。ＮＡＤ還元は３４０ｎｍに
おける吸光度の変化によってモニターする。アッセイを標準化するため、種々の
量の市販のＣＯＸ（例えばＳｉｇｍａ）と一定量のＢＡＤＨ過剰発現細菌株から
の大腸菌ＢＡＤＨ調製物（ｍｇタンパク質当たり５０単位；１Ｕ＝１分間当たり
１ｎｍｏｌのＮＡＤが還元される）を用いて反応条件を標準化し、ＢＡＤＨでな
く、ＣＯＸを制限する標準曲線を確立する。次いでトランスジェニック系統およ
び対照からの植物抽出物を用いてアッセイを行う。公開された方法（例えばFalk
enberg, P. and Strom, A.R., 1990, Biochemica Biophysica Acta 1034: 253-2
59）により、ＢＡＤＨ量を高め、精製することができる。
【０１８８】 植物抽出物は次のようにして得た。約１００ｍｇの植物の葉を液体窒素で凍結
させ、サンプル重量に対し２容量の氷冷抽出緩衝液で磨砕する。サンプルを約１
０，０００ｘｇで遠心分離し、その上清を再度遠心分離した。粒状物質が見られ
なくなるまで遠心分離を繰り返した。種子に関しては、サンプル当たり約２０の
種子について最初の遠心分離の後に活性炭２０ｍｇを加え、後の手順に従った。
ＫＯＨでｐＨ８．０に調節した抽出緩衝液は、１００ｍｌ当たりＨＥＰＥＳ１．
９２ｇ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ０．２ｍｌ、グリセロール１０ｍｌを含み、脱イ
オン水で１００ｍｌにしたものである。アッセイに先立ち、１Ｍ原液のＤＴＴを
最終濃度２５ｍＭまで加え、ＨＥＰＥＳ緩衝液中の１０Ｘ原液の完全プロテアー
ゼ阻害剤混合物（Boehringer-Mannheim，カタログ：１６９７−４９８）を加え た。酵素アッセイ緩衝液（ＢＡＤＨ緩衝液）には５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ
、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡが含まれ、さらに新たに最終濃度１ｍＭま
でＤＴＴを加えた。共役アッセイは、ＢＡＤＨ緩衝液５０μｌ、１０ｍＭ ＮＡ
Ｄ原液５０μｌ、植物サンプル５０μｌ、３０μｌまたは５０Ｕを与えるに等し
いＢＡＤＨを含み、脱イオン水で容量を４５０ｍｌにした反応液中で行った。反
応混合物を混合し、後２０分間モニターした。３４０ｎｍにおける吸光度のバッ
クグラウンド変化として、塩化コリン５０μｌを加え、分光光度の記録を１０〜
２０分間続けた。標準曲線については、植物サンプルを除き、代わりに種々の量
の精製ＣＯＸを加えた。Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６５型のプログラム可能な記録式
分光光度計を使用して単位を算出した。当業者ならば、ＮＡＤの吸光係数に関す
る文献から入手できる生化学的データを用いて、利用できる装置に適するように
プロトコールを改良することができる。ＮＡＤ還元自体はデヒドロゲナーゼに関
して行われる標準アッセイである。
【０１８９】 実施例５：トランスジェニック種子のフェノール含量低下に関する分析 本実施例では、シナピン含量について種子を分析した。実施例４で再分化した
トランスジェニック植物由来の種子を生育させ、自家受粉後代を得、これらの後
代系統をβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性をコードする導入遺伝子の分離また
はその欠損について解析した。この遺伝子（Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K.
, Pelcher, L.E. Crosby, W.L., and G. Selvaraj, 1991 Gene 101: 239-246参 照）はベクターｐＨＳ７３１のＴ−ＤＮＡの左右境界部内に存在しており、よっ
て分離についての遺伝的解析における便宜なマーカーとして機能する。遺伝的分
離のないことで、後代の起源となる植物のホモ接合性が示された。分離が示され
た系統は半接合であり、ＧＵＳ活性のない分離体はＣＯＸ遺伝子を含まない対照
として保持した。このように、ＣＯＸを含むホモ接合系統のプールおよび導入遺
伝子を含まないそれらの対応物があった。これらの系統をＨＰＬＣプロトコール
によってシナピン含量について分析した。図１３に示された結果により、トラン
スジェニック分離体ではその非トランスジェニック対応物に比べ、シナピンレベ
ルが有意に低下したことが明白に示された。それらは本来同一のトランスジェニ
ック植物から生じているため、非トランスジェニック分離体は最良の対照として
提供される。これらの結果より、記載の方法の有用性が示される。遺伝子発現の
レベル、タイミングおよび位置を変え、かつ、位置効果およびコピー数をはじめ
とする種々の理由により望ましい結果を示す個々のトランスジェニック系統の中
で有益な変異体を探すことにより、種々のレベルの低下が達成され得ることは当
業者には明らかである。
【０１９０】 実施例６：フェニルプロパノイド経路内での前駆体の転換によるストレス保護産 物の生成 本実施例ではＣＯＸおよびＢＡＤＨ活性を組み合わせることにより、双方とも
種子選択性プロモーターの制御下で、ストレス保護剤ベタインが産生された。こ
の実施例の最初の部分として、種子選択性プロモーターの制御下でＢＡＤＨ遺伝
子を有するトランスジェニックアブラナを生成する。これらの植物のＢＡＤＨ発
現についての分析を行った。
【０１９１】 アブラナ種子のベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現。大腸菌Ｂ
ＡＤＨ遺伝子（ｂｅｔＢ）を単離し、アブラナｎａｐｉｎプロモーターと連結す
ることにより、種子特異的発現のために操作した(Boydら, Gene 103: 45-52(199
0))。プラスミドＲＤ４００(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuｋ, B.
, Pelcher, L.E., and Keller, W., 1992, Gene 211: 383-384)をベクターとし て用いたが、このベクターから、ｎａｐｉｎプロモーターの発現制御下で、左右
Ｔ−ＤＮＡ境界内にそのＡＴＧ部位からのｂｅｔＢのオープンリーディングフレ
ームを含んでいる最終誘導体ｐＨＳ９７４およびカリフラワーモザイクウイルス
ポリＡシグナルが得られる。Ｎａｐｉｎ−ｂｅｔＢ−ポリＡカセット（約３．３
Ｋｂｐ）は、表示のオーダーで：ＨｉｎｄＩＩＩ部位、Ｎａｐｉｎプロモーター
、ＢａｍＨＩ部位、ｂｅｔＢ ＯＲＦ、ＥｃｏＲＩ部位−カリフラワーモザイク
ウイルスＤＮＡのポリＡシグナル、ＫｐｎＩ部位、およびＥｃｏＲＩ部位を含ん
でなった。ｎａｐｉｎプロモーターはＫｏｆｎｏ−Ｍｕｒａｓｅら(Plant Molec
ular Biology, 26: 115-1124, 1994)由来のものであり、ポリＡシグナルは本来 プラスミドｐＪＩＴ１１７(Guerineau, F., Woolston, S., Brooks, L., and Mu
llineaux, 1988, Nucleic Acids Research 16: 11380)由来であった。最終的な プラスミドｐＨＳ９８１、約１５Ｋｂｐを図１４に示している。これをアグロバ
クテリウム・ツメファシエンス ＧＶ３１０１［ｐＭＰ９０］に導入し(Koncz,
C., and Schell, J., 1986, Molecular and General Genetics 204: 383-396)、
得られた株をアブラナの遺伝的形質転換に用いた。
【０１９２】 数種のトランスジェニック系統が得られ、種々の発達段階の種子をＢＡＤＨ活
性に関してアッセイした。ＢＡＤＨ活性は３５ＤＡＰ辺りでピークとなることが
わかり、成熟種子は残りの活性を維持していた。発達段階の関数としての比活性
により、ＢＡＤＨ活性の開始がシナピン合成と同時に起こっていることが示され
た。
【０１９３】 ＢＡＤＨ遺伝子を発現している系統を、実施例４に記載されたＣＯＸ遺伝子を
有する系統と交雑した。ＣＯＸ遺伝子を含む植物とＢＡＤＨおよびＣＯＸ遺伝子
双方を含む植物をシナピン含量および全フェノール含量に関して分析した。これ
らの結果を図１５（シナピン含量）および図１６（全フェノール含量）に示して
いる。分析した種子は１９９９年夏に野外条件下で栽培した植物から採種した。
図１５に示されるように、ＣＯＸおよびＢＡＤＨを組み合わせた活性ではとＣＯ
Ｘ活性単独よりもさらにシナピンの蓄積が低下することとなる。図１６に示され
るように、トランスジェニック植物では対照に比べ、全フェノール含量の低下が
見られる。
【０１９４】 実施例７：合成フェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列 本実施例では、バチルス・プミラス由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼの公
開配列(Zagoら, Applied and Environmental Microbiology 61: 4484-4486, 199
5)を植物細胞中での発現について最適化した遺伝子の構築に用いた。フェルラ酸
デカルボキシラーゼオープンリーディングフレームを公開配列に基づいて合成オ
リゴヌクレオチドを連結して合成した。オリゴヌクレオチドを主としてアブラナ
の高度に発現した遺伝子のコドン選択を基に合成した。
【０１９５】 合成オリゴヌクレオチドは約６０ヌクレオチドの長さであった。オリゴヌクレ
オチド二本鎖ＤＮＡの設計には５’末端にＢａｍＨＩ付着端（５’ＧＡＴＣ−）
３’末端にＥｃｏＲＩ付着端（３’−ＴＴＡＡ−５’）が含まれていた。個々の
二本鎖ＤＮＡを集成し、５’ＢａｍＨＩおよび３’ＥｃｏＲＩ部位を有する全長
オープンリーディングフレームを形成した。連結反応は標準プロトコールに従っ
た。連結産物は次ぎにクローニングベクターへ連結した。
【０１９６】 前記の合成遺伝子とＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ切断ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ−（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ）とを連結する際、０．５ｋｂ挿入配列を有したクロ
ーンを大腸菌クローン由来のプラスミドＤＮＡの簡易使用スクリーニングにより
確認した。可能性ある候補物をスクリーニングし、クローンの２つのヌクレオチ
ド配列を決定した。各々のクローンが点突然変異を有しており、これらの２つの
点突然変異が選択された２つのクローンに別個に位置していることがわかった。
この突然変異の間隔はこれらのクローン由来の遺伝子の２つの非変異部分を組み
合わせての完全な遺伝子の再構築を考慮するものであった。このクローンをｐＧ
Ｓ９７ｂ１と称する。この合成遺伝子のヌクレオチド配列を図１７に示し、その
推定アミノ酸配列は図１８に示されている。
【０１９７】 合成遺伝子の機能性は簡便な試験により確かめられた。フェルラ酸デカルボキ
シラーゼはフェルラ酸を４−ビニルグアヤコール（４−ＶＧ）へと変換する。４
−ＶＧはチョウジの独特な臭気を有しており、４−ＶＧがチョウジの天然の芳香
を付与する単一の最も重要な化合物であると考えられている。増殖培地中、フェ
ルラ酸１ｍｌの存在下で増殖させたｐＧＳ９７ｂ１を有する大腸菌株は独特のチ
ョウジ臭を発するが、フェルラ酸を含まない培地またはベクター単独を含む株の
培地では臭気がなかった。フェルラ酸を与えた培地のＨＰＬＣ分析では、フェル
ラ酸が消滅したことが確認された。前記の結果に基づけば、機能的遺伝子がｐＧ
Ｓ９７ｂ１にクローン化されているものと推断された。
【０１９８】 実施例８：フェルラ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を有する植物の構 成プロモーターの制御下での遺伝的形質転換 本実施例では、酵素、ｐＧＳ９７ｂ１中でクローン化されたフェルラ酸デカル
ボキシラーゼを、ＲＤ４００のＮｏｓＰ−ＮｐｔＩＩ植物選択マーカーの代わり
にｇｕｓとｎｐｔとの融合遺伝子（Ｇｕｓ：ｎｐｔ）を含むように改変した植物
形質転換ベクターＲＤ４００(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuｋ, B
., Pelcher, L.E., and Keller, W., 1992, Gene 211: 383-384)へ挿入した。Ｇ
ｕｓ−ｎｐｔについてはこれまで既に記載されている(Datla, R.S.S., Hammerli
ndl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L., and G. Selvaraj, 1991, Gene 101:
239-246)。フェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を３５Ｓプロモーターの制御 下に置き、標準的なプロトコールに従って、プラスミドを用いてタバコ植物を形
質転換した。
【０１９９】 ベクターの制限地図を図１９に示している。図１９に示されたベクターｐＧＳ
９７ｂ３は、ｐＨＳ７３１と同一のベクター主鎖上で、ＨｉｎｄＩＩＩ−ｎａｐ
ｉｎ Ｐ−ＢａｍＨＩカセットをカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモー
ター−アルファルファモザイクウイルスリーダーカセット(R.S.S. Datla, F. Be
kkaoui, J.K. Hammerlindl, G. Pilate, D.I. Dunstan and W.L. Crosby. Impro
ved high-level constitutive foreign gene expression in plants using an A
MV RNA4 untranslated leader sequence, Plant Science 94: 139-149, 1993に 記載)で置き換えたこと以外は、ｐＨＳ７３１と同様である。図１９ではこのプ ロモーター部分を３５Ｓと略記している。３５Ｓのあと、ｐＨＳ７３１のＣＯＸ
オープンリーディングフレームの代わりに、フェルラ酸デカルボキシラーゼのオ
ープンリーディングフレームを、５’末端でＢａｍＨＩおよび３’末端でＥｃｏ
ＲＩにより連結した。
【０２００】 フェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を発現するトランスジェニック植物を再
生した。植物はフェノール含量およびビニルグアヤコールの産生に関して分析し
た。
【０２０１】 フェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有するタバコの個々のトランスジェニ
ック植物には、フェルラ酸デカルボキシラーゼに対して作製されたポリクロナー
ル抗体によるウエスタンブロット解析で推定されるサイズの免疫反応性ポリペプ
チドが含まれていることがわかった。非形質転換植物は免疫反応性ポリペプチド
を含んでいなかった。このことは、これらのトランスジェニック植物におけるフ
ェルラ酸デカルボキシラーゼタンパク質のトランスジェニック発現に関する証明
となるものである。
【０２０２】 実施例９：フェルラ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を有する植物の組 織選択性プロモーターの制御下での遺伝的形質転換 本実施例では、酵素、ｐＧＳ９７ｂ１中にクローン化されたフェルラ酸デカル
ボキシラーゼを植物形質転換ベクターＲＤ４００へ挿入した。フェルラ酸デカル
ボキシラーゼ遺伝子をアブラナ由来の種子特異的ｎａｐｉｎプロモーターの制御
下に置き、標準的なプロトコールに従って、プラスミドを用いてタバコ植物を形
質転換した。ベクターの制限地図は図２０に示されている。図２０に示されたベ
クターｐＧＳ９７ｂ２は、同一のベクター主鎖上で、ＨｉｎｄＩＩＩ−３５Ｓ−
ＢａｍＨＩカセットを図１２で示されたｐＨＳ７３１のＨｉｎｄＩＩＩ−ｎａｐ
ｉｎプロモーター−ＢａｍＨＩカセットと置き換えたことを除き、ｐＧＳ９７ｂ
３と同様である。フェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を発現するトランスジェ
ニック植物を再生した。植物の種子をフェノール類含量およびビニルグアヤコー
ルの産生に関して分析した。
【０２０３】 実施例１０：アブラナ科植物、アブラナの発達中の種子におけるフィチン酸集積 の組織特異性および発達パターンの決定 フィチン酸の生合成 本実施例では、アブラナ科種子において、フィチン酸の生合成経路に関する情
報を求めた。フィチン酸はミオイノシトールの六リン酸誘導体であるので（フィ
チン酸をＩＰ６と称する）、全リン酸化イノシトール誘導体のうちミオイノシト
ール成分の個々のリン酸化誘導体（例えばＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３、ＩＰ４およ
びＩＰ５）の割合を求めた。種々のリン酸化誘導体を得るためにオートクレーブ
で処理して部分的に分解した純粋なフィチン酸を、Vernon and Bohnert (1992.
The EMBO Journal 11: 2077-2085)、ならびにVernon DM, Tarczynski MC, Jense
n RG, and Bohnert HJ (1993. The Plant Journal 4: 199-205)に従って行われ るＨＰＬＣ分析用の標準として用いた。
【０２０４】 種々の形態のリン酸化イノシトール（例えばＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３、ＩＰ４ およびＩＰ５）とフィチン酸はこの分析により容易に識別することができた。発
達中のアブラナ科種子から抽出されたリン酸イノシトールサンプルを分析した際
、ＩＰ６（すなわちフィチン酸）に一致する唯一のピークが見つかった。この結
果により、発生中の種子においてはＩＰ６が有力なリン酸イノシトールの形態で
あり、他のリン酸化イノシトール中間体の形態は記載の方法によるＨＰＬＣでは
検出できなかったことが示された。よってミオイノシトールからのフィチン酸の
生合成は速やかに、かつ実質的に定量的に起こると考えられる。
【０２０５】 フィチン酸の発達的生合成 実施例のこの部分では、フィチン酸の集積の発達上のタイミングを求めた。種
子のフィチン酸含量の定量法は次のようである：種子を液体窒素の存在下、乳鉢
ですりつぶし、その粉末を０．５Ｍ ＨＣｌ ５ｍｌの入った１５ｍｌ滅菌試験
管に移す。ヘキサン抽出により脂質を除去した後、残った相（組織残渣を含む水
相）を超音波液体処理装置（ＸＬ２０２０型、Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎ
ｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いてレベル３で９０秒間音
波処理する。遠心分離の後、液体をフィチン酸のＨＰＬＣ分析用の新しい試験管
に移す。種々の発達段階の種子にこの方法を用いた。
【０２０６】 種子発達中のフィチン酸の集積を図２１に示している。フィチン酸はまず非常
に早期の段階（すなわち受粉後１２日）の種子で検出できるが、受粉後２２日ま
でこの含量の有意な増加はなかった。その最初の出現後１０日間にフィチン酸は
最高レベルの約２４０μｇ／種子に達する。成熟種子の乾燥重量の点から見ると
、発現されたフィチン酸含量は約３．２％である。これらの結果により、フィチ
ン酸の生合成による干渉でフィチン酸を減少させるには、約１２ＤＡＰ〜種子成
熟間近の発現能力を有するプロモーターを必要とすることが示される。
【０２０７】 さらなる分析では、フィチン酸が種皮よりも主に胚組織に堆積することが示さ
れた（図２２）。種子のフィチン酸のほぼ９０％が子葉に含まれており、１０％
が胚軸に存在する。これらの発見は種々の胚組織がフィチン酸の生合成の遺伝的
改変によるフィチン酸の減少についての最も好ましい標的組織であることを示唆
している。
【０２０８】 実施例１１：発達中の種子組織におけるミオイノシトール代謝の測定 本実施例では、フィチン酸の生合成に使用されるミオイノシトールプール部分
を示す。ミオイノシトールは植物のフィチン酸の生合成のための前駆体であるが
、ホスファチジルイノシトールおよび細胞壁成分を生産する他の同化経路におい
ても使用される。本実施例では、発達中の種子におけるフィチン酸の生合成に使
用される全ミオイノシトールプール部分を示す。アブラナ科種子の３Ｈ−ミオイ
ノシトールを使用したin vivo標識を用いて、種々の溶媒で抽出された異なる画 分中のイノシトール分布を追跡した。発達中の種子の３Ｈ−ミオイノシトールで
のin vivoパルス標識に使用した技術は次のようであった。異なる発達段階の長 角果を取り出し、直ちに切断末端を５０ｍｌ試験管中の５μＣｉ３Ｈ−ミオイノ
シトール含有滅菌培地１０ｍｌに入れ、標準的な増殖条件（光下で２０℃で１６
時間、光無しで１５℃で８時間）で２日間培養した。種子を脂質、フィチン酸、
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）可溶性細胞壁成分および細胞壁有機堆積物の抽出の
ために回収した。各画分の放射能を液体シンチレーションにより測定した。
【０２０９】 パルス標識した種子から４種類の抽出を行い、水溶性細胞成分（フィチン酸分
析用）、ヘキサン溶性（脂質分析用）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）可溶性細胞
壁成分および細胞有機堆積物に分離した。図２３に種子発達の異なる段階におい
ての各画分の平均放射能を記載している。データは受粉後２５〜３０日（ＤＡＰ
）の脂質画分で種子中の全標識の２０％を超えるものが見つかったことを示して
いる。細胞壁画分（ＴＦＡ可溶性細胞壁および細胞有機堆積物）の放射能は種子
発達中に取り込まれた全標識の約５％を占めている。フィチン酸分の同定のため
、水溶性画分の放射能をさらにＨＰＬＣにより分析した。水溶性抽出物の標識の
約１０％がフィチン酸のピークで回収され、標識の約３０％がサンプル注入ピー
クにあり、それが遊離ミオイノシトールであることがわかった。水溶性抽出物に
ある他の標識物質についてはフィチン酸ピークの前後で回収され、それが未確認
の化合物であることが示された。
【０２１０】 フィチン酸、脂質、ＴＦＡ可溶性細胞壁および細胞有機堆積物画分に見られる
代謝標識の割合を図３に示している。３Ｈ−ミオイノシトール誘導代謝産物に由
来する標識の約３０％が２０〜３０ＤＡＰのフィチン酸に見られる。同時に、標
識の約５０％は脂質（リン脂質を含有するイノシトール）に存在し、細胞壁画分
には１０％未満であった。
【０２１１】 よって、フィチン酸の生合成に使用される全ミオイノシトールプール部分は、
フィチン酸の生合成が最大になると思われる種子発達の段階において約３０％で
ある。
【０２１２】 実施例１２：ミオイノシトールに作用することができる酵素をコードする遺伝子 のクローニング 本実施例では、ミオイノシトールに作用することができる遺伝子を単離した。
この遺伝子は一般的なメセンブリアンテマ由来のイノシトールＯ−メチルトラン
スフェラーゼ遺伝子であった。逆転写酵素クローニングを用いて、下記のように
遺伝子を単離した。Maniatisら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Co
ld Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYに従い、標準ＤＮＡ操 作を行った。
【０２１３】 メセンブリアンテマの葉組織を処理した５００ｍＭ ＮａＣｌから全ＲＮＡを
抽出し、さらにポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。このｍＲＮＡを次の条件下でＳ
ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ．）による逆転写に用いた：水２０μｌに溶解したｍＲＮＡ３μｇを鋳型とし
て用いた。ＲＮＡを６５℃で５分間加熱し、次いで氷上でチルドして変性させた
。混合物にオリゴ−ｄＴ（５００μｇ／ｍｌ）３μｌ、５Ｘ逆転写酵素緩衝液８
μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ４μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ２μｌを加えた。この混
合物を４２℃まで温め、次いでＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素３μｌ
（５０単位）を加えた。４２℃で１時間反応を行った。この時間の後、ＲＮアー
ゼ Ｈ １μｌ（１．５単位／μｌ）を加え、３７℃で３０分間反応を行った。
得られたｃＤＮＡを次の条件下でＶｅｎｔポリメラーゼによるＰＣＲの鋳型とし
て用いた：ＰＣＲ反応は９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を含
むサイクルで、総計３０サイクルの各サイクルに２秒の延長を加え、１００μｌ
容量で行った。この反応で用いたプライマーは公開されたＩＭＴ ＤＮＡ配列（
ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ８７３４０）に基づいた。用いた正方向のプライマ
ーは５’末端にＢａｍＨＩ部位（下線）を含んでなる配列番号６： ５’TTTTTGGATCCATGACTACTTACA CAATGGCAACTACA３’ であった。
【０２１４】 用いた逆方向のプライマーは５’末端にＮｏｔＩ部位（下線）を含んでなる配
列番号７： ５’TTTTTTTTGCGGCCGCATAAAGGCAAATCATACACTG３’ であった。
【０２１５】 増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、次いでｐＳＰＯ
ＲＴ １（BRL, Bethesda, MD.）へサブクローン化した。ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ
により消化されたＰＣＲ断片をｐＳＰＯＲＴベクターの相当する部位へクローン
化してｐＳｐｏｒｔＩＭＴを誘導した。図２４（配列番号５）は増幅されたＤＮ
Ａ断片の配列であり、これが３’非翻訳領域の２つの塩基の相違を除き、公開さ
れたＩＭＴ ＤＮＡ配列と一致していることを示している。推定タンパク質配列
はＧｅｎｅＢａｎｋから入手可能な公開情報と一致している。
【０２１６】 実施例１３：ミオイノシトールに作用することができる酵素をコードする遺伝子 による植物形質転換ベクターの構築 メセンブリアンテマ ミオイノシトールＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の 利用 本実施例では、植物細胞に有効なプロモーターの制御下でミオイノシトールに
作用することができる遺伝子を含む植物形質転換ベクターの構築を示す。例示さ
れる植物形質転換ベクターは種子細胞に有効なプロモーター、３５Ｓプロモータ
ーの制御下でミオイノシトールＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでな
る。ベクターの構築は次の通りであった：ｐＳｐｏｒｔＩＭＴをＢａｍＨＩおよ
びＥｃｏＲＩで消化し、ＩＭＴ遺伝子を遊離させた。ＩＭＴ遺伝子断片をｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）、（Strategene, La Jolla, CA.）の相当する部 位へクローン化し、得られたプラスミドはｐＢｌｕｅＩＭＴと称する。ｐＢｌｕ
ｅＩＭＴをＳｐｅＩで消化し、予めＸｂａＩで切断したベクターｐＢＩ２２１（
Clone Tech）へクローン化した。ｐＢＩ２２１の３５Ｓプロモーターに関して正
しい方向でＩＭＴ遺伝子を含むプラスミドを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃ
ｏＲＩで消化した。３５Ｓ−ＩＭＴ−Ｎｏｓターミネーター断片をｐＲＤ４００
へ転移させ、植物形質転換ベクターｐ３５ＳＩＭＴとした。
【０２１７】 得られた構築体、ｐ３５ＳＩＭＴはｐＲＤ４００に３５ＳプロモーターＩＭＴ
−ＧＵＳ−Ｎｏｓターミネーターカセットを含んでおり、これは図２５に示され
ている。
【０２１８】 実施例１４：種子選択性プロモーターの制御下でミオイノシトールに作用するこ とができる酵素をコードする遺伝子による植物形質転換ベクターの構築 本実施例では、種子選択性プロモーターの制御下でミオイノシトールに作用す
ることができる酵素をコードする遺伝子を植物形質転換ベクターにて構築する。
用いられた遺伝子はミオイノシトールＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子であ
り、プロモーターは種子選択性ｎａｐｉｎプロモーターであった。このベクター
をｐＮＩＭＴと称する。
【０２１９】 ベクターｐＮＩＭＴを次の通り構築した：ＳｐｅＩで消化したＩＭＴ ＤＮＡ
断片（実施例４）をＸｂａＩ部位でｐＤＨＩに連結し、ｎａｐｉｎプロモーター
−ＩＭＴ−Ｎｏｓターミネーターカセットとした。この発現カセットをさらにｐ
ＲＤ４００へ導入した。得られたベクターは図２６に示されている。
【０２２０】 実施例１５：アブラナ（Ｗｅｓｔａｒ）のｐ３５ＳＩＭＴによる形質転換 ベクターｐ３５ＳＩＭＴを標準的な３親交配によりアグロバクテリウム株ＭＰ
９０に挿入し、次いでアグロバクテリウムを媒介としてアブラナ科を形質転換さ
せる。形質転換は実施例４に記載されるように行った。ｐ３５ＳＩＭＴで形質転
換した植物が得られ、フィチン酸塩含量に関して分析した。
【０２２１】 実施例１６：トランスジェニック植物の分子解析 ＣａＭＶ ３５Ｓ−ＩＭＴ発現カセットを含んでなるＦ０トランスジェニック
植物をＩＭＴ酵素アッセイとともにＰＣＲ、サザンおよびノーザンブロットによ
り解析した。予備ＰＣＲ解析では、全てのトランスジェニック植物にＩＭＴ遺伝
子が含まれていることが示された（図２７）。サザンハイブリダイゼーションで
はＩＭＴ遺伝子が多くのコピー数を有するアブラナ科ゲノムに組み込まれること
が示された。全ＲＮＡは発達中の種子から図２８に示されるノーザンハイブリダ
イゼーション解析のために抽出された。
【０２２２】 実施例１７：トランスジェニック植物におけるフィチン酸分析 Ｆ０トランスジェニック植物から採種した成熟種子のフィチン酸含量を分析し
た。種子の抽出は実施例１０に記載されるように行った。採集したデータは、ト
ランスジェニック植物に平均して１５％を超えるフィチン酸の減少が見られるこ
とを示している。図２９および図３０はデータの概要を示している。採集したデ
ータは、ｐＳＩＭＴベクターにより作出されたトランスジェニック植物に平均し
て１５％を超えるフィチン酸の減少が見られることを示している。Ｆ１種子は分
離によるため、トランスジェニック種子と非トランスジェニック種子との混合物
であり、このため実際に起こるフィチン酸の減少は形質転換種子を基準とした場
合、実質上より大きい。Ｆ２およびＦ３種子はｐＳＩＭＴベクターを含むホモ接
合系である。圃場条件下では、ｐＳＩＭＴベクターを有するホモ接合系が現れ、
種子のフィチン酸レベルが平均して３０％の減少に達することは明白である。フ
ィチン酸の分析に加え、サザンブロット解析を行い、挿入された遺伝子のコピー
数を求めた。挿入された遺伝子のコピーが１つであるという植物でも、フィチン
酸の有意な減少（３４％）が見られる（例えば植物番号 ＴＰ ＃１１）。よっ
て、フィチン酸の生合成を担う組織においてミオイノシトールを改変し得る酵素
活性の発現により、種子内のフィチン酸が減少していることがわかる。またフィ
チン酸レベルが低いという形質は遺伝性であるため、これを生殖により伝えるこ
とが可能である。よって、一度、低フィチン酸形質が確立された場合、利用法と
して通常の育種技術によるその形質の伝達も含み得ることは明白である。
【０２２３】 実施例１８：ｐＮＩＭＴを有するアブラナの形質転換 ベクターｐ３５ＳＮＩＭＴを標準的な３親交配によりアグロバクテリウム株Ｍ
Ｐ９０に挿入し、次いでアグロバクテリウムを媒介としてアブラナ科を形質転換
する。形質転換は実施例４に記載されるように行った。
【０２２４】 ｐ３５ＳＮＩＭＴにより形質転換した植物が得られ、低下したフィチン酸含量
に関して実施例１７のように分析した。図３１では圃場条件下で生育させた、ｐ
ＮＩＭＴベクターを有するＦ１およびＦ２トランスジェニック種子から採集した
データに関する表を示している。Ｆ１植物ではｐＮＩＭＴ挿入配列は分離してお
り、よって分析した種子はトランスジェニックと非トランスジェニック分離物と
の混合物であった。Ｆ２世代ではほとんどの系がホモ接合か、またはほぼホモ接
合に近い個体群であった。Ｆ２解析では圃場条件下で生育させた植物から種子中
のフィチン酸含量に４０％に近い減少が観察された。よって、種子選択性物質に
おけるフィチン酸の生合成のためのミオイノシトールの利用能を低下させ得る酵
素の発現により、フィチン酸レベルの有意な低下がもたらされる。
【０２２５】 実施例１９：植物細胞と異種の酵素活性を利用するＵＤＰ−ガラクトースの形成 および集積の抑制 酵素ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ｇａｌＥ）は生体系のガラクト
ース代謝の主要な段階の１つに関与している。これはＵＤＰ−ガラクトースのＵ
ＤＰ−グルコースへの変換を触媒する。この酵素の遺伝子はヒト、酵母および細
菌から得られる。
【０２２６】 本実施例での目的は、ＵＤＰ−ガラクトースプールを費やしてＵＤＰ−グルコ
ースプールを増加させるため、この酵素を標的植物の特定の組織で過剰発現させ
ることである。推定される結果は、抗栄養スクロースグリコシド（ＲＦＯ グリ
コシド、例えばラフィノース、スタキオースなど）の前駆体であるガラクチノー
ルの生合成の低下であった。この目標を達成することで、望ましくないＲＦＯ
グリコシドの集積速度の低下に加え、ＵＤＰ−グルコースおよびスクロースの利
用の可能性が同時に高められよう。後者は植物に必須である他の代謝産物の生産
のため、または植物生産力を高める炭素源として（例えばタンパク質、脂質、全
産物等）のいずれかにスクロースを必要とする他の代謝経路に関連し、かつそれ
を促進すると考えられている。
【０２２７】 これはある必須物質を別のものへ代謝変換させる高等植物における細菌酵素の
利用例であり、それによって得られた新しい物質は直ちに種々の重要な代謝相互
変換で植物に利用されるであろう。
【０２２８】 実施例２０：酵素ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）を用いた糖誘導体レベルの変 更 酵素ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）は、スクロースの合成および消費におい
てグルコース（Ｇｌｃ）−１−とＧｌｃ−６−ホスフェートの相互変換を触媒す
る。この酵素はスクロース、デンプンおよびグリコーゲンの合成および利用にお
いて中枢的役割を果たし、あらゆる生物に存在している。この酵素の遺伝子は細
菌源（アグロバクテリウム）ならびに種々の真核生物から得られる。
【０２２９】 Ｇ−１−ＰおよびＧ−６−Ｐはあらゆる生体系の主要な炭水化物代謝経路の多
くで必須物質である。特に、Ｇ−１−Ｐはスクロース生合成の主要な物質である
ＵＤＰ−グルコースの生産での主要物質である。他方、Ｇ−６−Ｐはミオイノシ
トール−１−Ｐの合成の１つである糖相互変換の多くで主要な出発物質となって
いる。後者はフィチン酸およびＲＦＯそれぞれの合成における主要な物質であり
、補因子である。
【０２３０】 本実施例での目的は、標的植物の細菌ＰＧＭ遺伝子を過剰発現させることによ
り、グルコースの２つのリン酸化型のどちらか一方を選んで（組織依存）Ｇ−１
−ＰとＧ−６−Ｐの相対比を操作し得ることを示すことである。 例えば発達中の種子（例えば、シンク組織）のこの活性を適当に標的化すること
により、Ｇ−１−Ｐレベルの向上が考えられ、これはＵＤＰ−またはＡＤＰ−グ
ルコース、続いてスクロースならびにタンパク質、脂質、またはデンプンなどの
他の貯蔵物質の生産に要求されよう。他方Ｇ−６−Ｐレベルの低下による影響で
前記の抗栄養因子が低レベルへと転じるであろう。
【０２３１】 実施例２１：トランスジェニックトウモロコシ細胞の産生および再分化 ＩＩ型カルス培養を遺伝子型Ｈｉ−ＩＩの未熟接合胚から始める(Armstrongら
, (1991) Maize Genet. Coop. Newslett., 65: 92-93)。未熟胚は、Ｈｉ−ＩＩ 親ＡとＨｉ−ＩＩ親ＢまたはＨｉ−ＩＩ植物の自己または近親受粉から誘導され
たＦ２胚との交雑から温室で生育させた雌穂より受粉後約１４日に単離する。未
熟胚（１．５〜３．５ｍｍ）をＮ６塩およびビタミン(Chuら, (1978) The N6 me
dium and its application to anther culture of cereal crops. Proc. Symp.
Plant Tissue Culture, Peking Press, 43-56)、２，４−Ｄ１．０ｍｇ／Ｌ、Ｌ
−プロリン２５ｍＭ、カゼイン加水分解物１００ｍｇ／Ｌ、ＡｇＮＯ３１０ｍｇ
／Ｌ、ＧＥＬＲＩＴＥ(Schweizerhall, South Plainfield, NJ)２．５ｇ／Ｌお よびスクロース ２０ｇ／Ｌからなる開始培地、ｐＨ５．８に入れる。４〜６時
間後、カルスを維持培地（ＡｇＮＯ３を含まず、Ｌ−プロリンを６ｍＭまで下げ
た開始培地）へサブクローン化する。ＩＩ型カルスの選択は約１２〜１６週間行
われる。
【０２３２】 幼芽形成または外来ＤＮＡの植物細胞への導入（マイクロパーティクル衝撃に
よる形質転換）のために、２．５Ｍ ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ ７４μＬおよび０．
１Ｍスペルミジン（遊離塩基）３０μＬをプラスミドＤＮＡ３００μＬおよびＨ ２ Ｏに加えて、プラスミドＤＮＡ（例えば３５Ｓ−ＰＡＴ／トウモロコシグロブ
リンプロモーター／ＩＭＴ）をアルコール洗浄した球状金粒子（直径１．５〜３
．０μｍ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａ
ｕｋｅｅ，ＷＩ）６０ｍｇ上に沈着させる。溶液を直ちにかき混ぜてＤＮＡ被覆
した金粒子を沈殿させる。得られた清澄な上清を除去し、金粒子を無水エタノー
ル１ｍｌ中に再懸濁する。この懸濁液を無水エタノールで希釈するとＤＮＡ被覆
した金１５ｍｇ／ｍＬが得られる。
【０２３３】 用いるプラスミドＤＮＡには、ホスフィノトリシンまたは除草剤グルフォシネ
ートアンモニウム耐性を与えるｂａｒまたはｐａｔ遺伝子のような選択マーカー
、およびトウモロコシグロブリン１プロモーターまたはトウモロコシゼインプロ
モーターなどの好適な種子選択性プロモーターの制御下で、図２４に記載される
ＩＭＴ遺伝子のコード領域、または図１７に記載されるフェルラ酸デカルボキシ
ラーゼ遺伝子のコード領域などの二次代謝産物を変換し得る遺伝子構築体が含ま
れていることが好ましい。あるいは、トウモロコシ由来のユビキチンプロモータ
ーまたはイネアクチンプロモーターなどの構成プロモーターを使用してＩＭＴま
たはフェルラ酸デカルボキシラーゼを発現させてもよい。
【０２３４】 胚形成的カルス組織約６００ｍｇを浸透圧調節剤として０．２Ｍソルビトール
および０．２Ｍマンニトールを添加した、カゼイン加水分解物およびＬ−プロリ
ンを含まないＩＩ型カルス維持培地に広げる。前処理としてカルスを４時間維持
し、次いで幼芽形成培地（ ＧＥＬＲＩＴＥ７ｇ／Ｌの代わりに、ＴＣ寒天２０ ｇ／Ｌ（Phyto Technology Laboratories, LLC, Shawnee Mission, KS）により 凝固させた浸透性培地）の入った培養皿に移す。ヘリウムガス（幼芽形成）を用
いて、懸濁したＤＮＡ被覆金粒子を調製した組織標的に向けて加速させる。使用
する装置は、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，１４１
，１３１号に記載されている。組織をステンレス綱スクリーン（開口部１０４μ
ｍ）で覆い、装置室内 Ｈｇ２５インチの部分真空下に置く。幼芽形成の前に、 ＤＮＡ被覆金粒子をさらに無水エタノールで１：１希釈し、ヘリウム圧１５００
ｐｓｉを用いて４回カルス標的に加速させ、各幼芽にはＤＮＡ／金懸濁液２０μ
Ｌが送り込まれる。幼芽形成直後、１６〜２４時間の再生期間に、組織を浸透性
培地に移す。その後、組織を小片に分割し、選択培地（カゼイン加水分解物およ
びＬ−プロリンを含まないが、ＢＡＳＴＡ（商標）（AgrEvo, Berlin, Germany ）を含んだ維持培地）に移す。３ヶ月の間、４週間ごとに組織片を選択せずに新
鮮な選択培地に移す。７週間後２２週まで、増殖阻害された組織の背景に対して
増殖が見られたカルス片を取り出し、単離する。得られたＢＡＳＴＡ（商標）耐
性組織を週２回新鮮な選択培地にサブクローン化する。適当な分析の後、陽性ト
ランスジェニック系統を同定し、再分化培地に移す。
【０２３５】 再分化はカルス組織をMurashige and Skoog塩（以後ＭＳ塩）ならびにビタミ ン(Murashige and Skoog, (1962) Physiol, Plant. 15: 473-497)、スクロース ３０ｇ／Ｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、マンニトール３０ｇ／Ｌ、６−
ベンジルアミノプリン（以後ＢＡＰ）５ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ０．０２５ｍｇ／
Ｌ、ＢＡＳＴＡ（商標）３０ｍｇ／ＬおよびＧＥＬＲＩＴＥ２．５ｇ／Ｌ、ｐＨ
５．７からなるサイトカイニンを基礎とする誘導培地に移すことで開始する。培
養基を低光量（１２５ｆｔ−ｃａｎｄｌｅｓ）で１週間、次いで高光量（３２５
ｆｔ−ｃａｎｄｌｅｓ）で１週間置く。２週間の誘導期間の後、組織を選択せず
に、２，４−ＤおよびＢＡＰが含まれないことを除き、誘導培地と同じであるホ
ルモンフリー再分化培地に移し、高光量で維持する。小さな幼植物（１．５〜３
ｃｍ）を取り出し、ＳＨ培地（ＳＨ塩およびビタミン(Schenk and Hildebrandt,
(1972) Can. J. Bot. 50: 199-204)、スクロース １０ｇ／Ｌ、ミオイノシト ール １００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＥＤＴＡ ５ｍＬ／Ｌ、およびＧＥＬＲＩＴＥ ２
．５ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）の入った培養試験管１５０ｘ２５ｍｍに入れる。
【０２３６】 大きな幼植物が生育を表し、十分な根系が発達すると直ちにそれらを温室でＭ
ＥＴＲＯ−ＭＩＸ ３６０(The Scotts Co.Marysville,OH)約０．２５ｋｇの入 った１２ｃｍポットに移す。これらの幼植物は高圧ナトリウムランプおよびハロ
ゲン化金属ランプの併用によって補う１６時間の光周期で生育させ、３つの独立
したＰｅｔｅｒｓ Ｅｘｃｅｌ肥料配合物(Grace-Sierra Horticultural Produc
ts Company,Milpitas,CA)の組合せとともに必要に応じて水を入れる。６〜８葉 段階で植物をＭＥＴＲＯ−ＭＩＸ ３６０ 約４ｋｇの入った５つのガロンポッ
トに移植し、成熟した繁殖能力のあるトランスジェニックトウモロコシになるま
で生育させる。これらの植物がもたらした種子には未熟胚に挿入した遺伝子が含
まれ、植物体へと生育した際には挿入されたＤＮＡによってコードされるタンパ
ク質を発現する。
【０２３７】 実施例２２：イネトランスジェニックの作出 胚形成的カルスを起こすために、ジャポニカ品種の成熟種子、Ｔａｉｐｅｉ
３０９を脱穀し、７０％エタノールで２〜５分間表面殺菌し、次いで ’Ｌｉｑ
ｕｉｎｏｘ’ソープを数滴加えた５０％工業用漂白剤（２．６％塩酸ナトリウム
）中で３５〜４５分間浸漬する。さらに「カルス誘導」培地（すなわちＮＢ）に
移す前に、この種子を滅菌蒸留水で３回すすいで濾紙上に置く。ＮＢ培地はＮ６
多量元素(Chu, 1978, The N6 medium and its application to anther culture
of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, P43-56)
、Ｂ５微量元素およびビタミン(Gamborgら, 1968, Nutrient requirement of su
spension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158)、カ
ゼイン加水分解物３００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン５００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミ
ン５００ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、２，４−ジクロロ−フェノキシ酢酸
（２，４−Ｄ）２ｍｇ／Ｌ、および ＧＥＬＲＩＴＥ(Schweizerhall, NJ)２．５
ｇ／Ｌからなる、ｐＨが５．８に調整された培地である。カルス「誘導」培地で
培養した成熟種子を暗室で２８℃でインキュベートする。培養３週間後、成熟胚
の胚盤領域から誘導され、現れた一次カルスをさらに維持するため、新鮮なＮＢ
培地に移す。
【０２３８】 生物的形質転換を用いて外来ＤＮＡを導入する。プラスミドＤＮＡ約１４０μ
ｇを、実施例２１に記載されるように１ミクロン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）金粒子６０
ｍｇ上に沈着させる。ｈｐｔ（ハイグロマイシンホスホトランシフェラーゼ）を
機能させるトウモロコシユビキチンプロモーター、およびトウモロコシユビキチ
ン１、トウモロコシグロブリン１、またはＩＭＴ遺伝子を機能させるゼインプロ
モーターを含むプラスミドを用いる。プラスミドＤＮＡ約１４０μｇを、本明細
書に記載されるように１ミクロン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）金粒子６０ｍｇ上に沈着さ
せる。
【０２３９】 ヘリウム幼芽形成については、活発に増殖している胚形成的カルス培養物２〜
４ｍｍサイズを高浸透圧処理に付す。この処理にはヘリウム幼芽形成前に、０．
２Ｍマンニトールおよび０．２Ｍソルビトールを含むＮＢ培地（Vainら, 1993,
Osmoticum treatment enhances particle bombardment-mediated transient and
stable transformation of maize. Plant Cell Rep. 12: 84-88）上にカルスを
４時間置いておくことが含まれる。浸透圧処理の後、カルス培養物を「幼芽形成
」培地（ＮＢ＋２％寒天）に移し、ステンレス綱スクリーン（２３０ミクロン）
で覆う。カルス培養物を標的当たりヘリウム圧２，０００ｐｓｉで２回幼芽形成
させる。幼芽形成した後、カルスをハイグロマイシン３０ｍｇ／Ｌを含むＮＢ培
地を構成する選択培地に置く前に、高浸透圧培地に一晩移し戻しておく。２週間
後、培地を高濃度の選択剤、すなわちＮＢ＋ハイグロマイシン５０ｍｇ／Ｌ(Li
et al, 1993, An improved rice transformation system using the biolistic
method. Plant Cell Rep. 12: 250-255)を含む新鮮な選択培地に移す。
【０２４０】 ＮＢ＋ハイグロマイシン５０ｍｇ／Ｌ上を覆う、密集した白黄色の胚形成的カ
ルス培養物を「再分化準備」（ＰＲ）培地＋ハイグロマイシン５０ｍｇ／Ｌに移
して再分化させる。ＰＲ培地はベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）２ｍｇ／Ｌ、ナ
フタレン酢酸（ＮＡＡ）１ｍｇ／Ｌ、およびアブシジン酸（ＡＢＡ）５ｍｇ／Ｌ
を含むＮＢ培地で構成されている。暗室での培養２週間後、カルスを「再分化」
（ＲＮ）培地へ移す。ＲＮ培地の組成はＢＡＰ３ｍｇ／ＬおよびＮＡＡ０．５ｍ
ｇ／Ｌを含むＮＢ培地である。ＲＮ培地上のカルス培養物を高蛍光下（３２５−
ｆｔ−ｃａｎｄｌｅｓ）、２８℃で２週間インキュベートする。胚の形成開始後
、２ｃｍの幼芽を有する胚を１／２Ｂ５ビタミン、スクロース１０ｇ／Ｌ、ＮＡ
Ａ０．０５ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン５０ｍｇ／ＬおよびＧＥＬＲＩＴＥ２．
５ｇ／Ｌを含む、ｐＨ５．８に調整した１／２ＭＳ培地(Murashige andSkoog, 1
962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue
cultures. Physiol, Plant. 15: 473-497)の入ったマゼンタボックスに移す。 十分に発達した根系を有する大きな植物体８〜１５ｃｍを土壌（ｍｅｔｒｏｍｉ
ｘ：表土 １：１）に移し、温室で栽培する（昼／夜 ２９／２４℃周期、湿度
５０〜６０％、光周期１２時間）。イネ植物は繁殖力のあるイネトランスジェニ
ック作物となる。これらの植物がもたらした種子にはイネカルスへ挿入した遺伝
子が含まれ、植物体へと生育した際には挿入されたＤＮＡによってコードされる
タンパク質を発現する。
【０２４１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 二次代謝経路のいずれかを変更する方法の概略的なスキームの模式図である。
【図２】 概略的なフェニルプロパノイド代謝およびシナピン産生の模式図である。
【図３】 発達中の種子のシナピン合成の開始と進行。アブラナ品種ウェスターの種子の
薄層クロマトグラフィー分析。
【図４】 ＨＰＬＣ分析による発達中の種子のシナピンの集積の定量分析。
【図５】 摘出した長角果の小花柄を介して放射性コリンを供給することによる、発達中
の種子のシナピン合成能の測定、受粉７〜４３日後のシナピンへの組み込みレベ
ル。
【図６】 単離種子に放射性コリン含有溶液を浸潤させることによる、発達中の種子のシ
ナピン合成能の測定、受粉４３〜６４日後のシナピンへの組み込みレベル。
【図７】 発達中の種子の子葉、胚軸および種皮画分において、種子中の標識された総シ
ナピン画分としての新たに合成されたシナピンの集積。
【図８】 組織サンプルの単位量当たりの発達中の種子の子葉および胚軸成分のシナピン
含量。
【図９】 種子当たり、すなわち胚軸または子葉対当たりの、発達中の種子の子葉および
胚軸成分のシナピン含量の測定。
【図１０】 コリンオキシダーゼオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列
番号３）。
【図１１】 コリンオキシダーゼオープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列（配列
番号４）。
【図１２】 組織選択性プロモーターの制御下にある、ＣＯＸ遺伝子を含む植物形質転換ベ
クターｐＨＳ７３１の図解。
【図１３】 ＣＯＸ遺伝子の発現による、ブラシカ種の種子のシナピン含量の減少。
【図１４】 組織選択性プロモーターの制御下にある、ＢＡＤＨ遺伝子を含む植物形質転換
ベクターｐＨＳ９８１の図解。
【図１５】 ＣＯＸおよびＢＡＤＨ遺伝子の発現による、ブラシカ種の種子のシナピン含量
の減少。
【図１６】 ＣＯＸおよびＢＡＤＨ遺伝子の発現による、ブラシカ種の種子のフェノール含
量の変化。
【図１７】 植物細胞中での発現のために最適化したＢ．パムリスの合成フェルラ酸デカル
ボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図１８】 Ｂ．パムリスの合成フェルラ酸デカルボキシラーゼオープンリーディングフレ
ームによりコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）。
【図１９】 ３５Ｓ構成プロモーターの制御下にある、フェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝
子を含んでなる植物形質転換ベクターの制限地図。
【図２０】 種子選択性ナピンプロモーターの制御下にある、フェルラ酸デカルボキシラー
ゼ遺伝子を含んでなる植物形質転換ベクターの制限地図。
【図２１】 種子発達中のフィチン酸の集積。
【図２２】 発達中の種におけるフィチン酸の堆積の組織特異性。
【図２３】 フィチン酸、脂質、ＴＦＡ可溶細胞壁および細胞残渣画分に見られる代謝標識
されたミオイノシトールのパーセンテージ。
【図２４】 ミオイノシトールＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅ＤＮＡ断片の配
列（配列番号５）。
【図２５】 ｐＲＤ４００ ５において３５Ｓプロモーター−ＩＭＴ−ＧＵＳ−Ｎｏｓター
ミネーターカセットを含んでなるベクターｐＳＩＭＴの制限地図。
【図２６】 ｐＲＤ４００において種子選択性プロモーター−ＩＭＴ−ＧＵＳ−Ｎｏｓ−タ
ーミネーターを含んでなるベクターｐＮＩＭＴの制限地図。
【図２７】 ＩＭＴ遺伝子を含むトランスジェニック植物のＰＣＲ解析。
【図２８】 ＩＭＴ遺伝子を発現する植物のノーザンブロット解析。
【図２９】 トランスジェニック植物で認められるフィチン酸の減少を示す棒グラフ。
【図３０】 ベクターｐＳＩＭＴを含むＦ１、Ｆ２およびＦ３圃場生育植物におけるフィチ
ン酸の減少を示す表。
【図３１】 ベクターｐＮＩＭＴを含むＦ１およびＦ２圃場生育植物におけるフィチン酸の
減少を示す表。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月２７日（２０００．４．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】
【発明の背景】 植物は二次代謝によって種々の化合物を産生する。植物の代謝に必須であると
は考えられないものの、二次代謝経路は時に独特の生化学物質を産生し、その中
には抗栄養的または有毒さえ考えられるものまである。二次代謝経路およびこれ
らの経路により産生される化合物は、それぞれの種または属に特異的であること
が多い。従って二次代謝経路を操作すると、新規な生化学物質の組成物の産生ま
たは二次代謝含量を変更した植物組織の作出が可能となる。特に、本来抗栄養的
または有毒な二次代謝化合物の変更を目的とする二次代謝の操作は、食物および
飼料の領域で独自の用途を提供することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】 しかしながら、二次代謝を変更する方法は、例えば本来抗栄養的と考えられて
きたような二次代謝化合物のレベルを変更されたものをを含む、新規な表現型を
作出する価値ある手段が提供できる。従って、二次代謝経路は植物の遺伝子操作
の重要な標的となるものである。 浸透圧保護剤ベタインの合成ができない植物へベタイン生合成経路を移入する
ために努力がなされてきた。Holmstrom, K.O. et al., production of the Esch
erichia coli betaine-aldehyde dehydrogenase, an enzyme required for the
synthesis of the osmoproytectant glysine betaine, in transgenic plants,
The Plant Journal, (1994) 6(5): 749-58は、浸透圧保護的代謝産物であるグリ
シンベタインを合成するためにベタイン−アルデヒドデヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子を使用することを開示している。 ＤｅｒｗｅｎｔアブストラクトＡＮ９６−５１２５７８，１９９６年１０月１
５日トヨタ自動車株式会社は、浸透圧保護剤であるベタインを産生するためにコ
リンデヒドロゲナーゼ遺伝子およびベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子
を使用することを開示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】 しかしながら、この改変を得るために用いられる酵素はまた、一次代謝物（ア
ミノ酸トリプトファンおよび無機硫黄）に作用することが明らかであり、ゆえに
植物細胞におけるこれらの化合物のいずれの有意な変更も有害な作用を有するも
のと思われる。従って、提案された方法は二次代謝経路を特異的に標的とするこ
とができなかった。実際、トリプトファンの変更は多くの有害な作用をもたらす
ものと予想できる。従って、一次代謝物のレベルの変更は低グルコシノレートカ
ノーラ粉餌について意図した効果を生み出さず、このことは一次代謝を改変する
難しさを強調するものである。 ＷＯ９７／２３５９９ A Method for Regulation of Plant Composition, (E.
I. DuPont and Purdue Research Foundation, July 3, 1997)は、植物において リグニン組成を調節するために、アブラナ科植物由来のフェルラ酸−５−ヒドロ
キシラーゼ（Ｆ５Ｈ）を使用することを開示している。ＷＯ９７／２３５９９に
開示されているＦ５Ｈ酵素は、植物細胞、例えばそれが由来するアブラナ科植物
においてフェニルプロパノイド経路部分と通常考えられる酵素である。ＷＯ９７
／２３５９９に開示されているＦ５Ｈ酵素は、それが由来する細胞のＦ５Ｈ酵素
の活性を示さない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】 この方法のなおその他の適用は、本発明の範囲内にあるものと考えることがで
きる。酵素ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）を用いることにより、グルコース−
１−リン酸およびグルコース−６−リン酸などの種々の糖誘導体のレベルを変更
することができる。この酵素はスクロースの合成と消費においてグルコース−１
−リン酸とグルコース−６−リン酸（Ｇｌｕ−１−Ｐ、Ｇｌｕ−６−Ｐ）の相互
変換を触媒する。この酵素はスクロース、デンプンおよびグリコーゲンの合成お
よび利用において中枢的役割を果たし、これはあらゆる生物に存在する。この酵
素の遺伝子は種々の真核生物ならびに細菌源（例えば、アグロバクテリウム(Agr obacterium )）から得られる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】 Ｇｌｕ−６−Ｐはいくつかの糖の相互変換の主要な出発物質であり、その１つ
にミオイノシトール−１−Ｐの合成がある。後者はそれぞれフィチン酸および抗
栄養スクロシルグリコシドの合成の主要基質および補因子である。この酵素の発
現は前記の抗栄養因子のレベルがより低くなるよう翻訳されるＧｌｕ−６−Ｐの
レベルを低くするものと考えられる。従って、種々の代謝変更は本発明の範囲内
にあると考えられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７７】 米国特許第５，５６３，３２４号に記載されているピニトールの産生は、トラ
ンスジェニックタバコ植物体で構成的に発現される場合、耐塩性を与えることが
わかっている。同様に、細菌マンニトール１−Ｐデヒドロゲナーゼの発現は、植
物細胞で構成的に発現される場合、マンニトール、糖アルコール、またはポリオ
ールの産生を触媒し、植物細胞を塩ストレスに対して耐性とする。従って、米国
特許第５，５６３，３２４号は、植物細胞に耐塩性を付与する手段として、植物
細胞に生得的な糖から糖アルコールを産生することができる酵素の使用による、
糖アルコールの産生を記載している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８７】 記載の方法は、フィターゼ酵素の発現によるフィチン酸の減少に関する当技術
分野にわたって多くの利点を提供する。これらは、特異的な組織中のフィチン酸
レベルを変更した植物、フィチン酸レベルが減少した種子を有する植物、フィチ
ン酸の減少した種子粉餌を含む。このような植物、種子、および粉餌の利点とし
ては、より良い飼料利用率および粉餌生産力、リンレベルを減少させた粉餌およ
び飼料の製造、従って飼料産業における用途、すなわち粉餌または飼料中の抗栄
養フィチン酸の量によりこれまで制限されていた使用にかかる粉餌類を使用する
ためのより良い環境特性および能力が挙げられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９８】 従って一般に、本発明の方法により作出された植物細胞は一次代謝は変更され
ておらず、特定の二次代謝経路の産物に関する変更を除けば、非改変植物と区別
できない表現型を有する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０１】 本発明の範囲内で使用される酵素は、フェニルプロパノイド経路中に見出され
る産物の前駆体として使用される化合物を、異性化、抱合、リン酸化、水酸化、
酸化、脱水素化、メチル化、またはその他のいずれかの類似する生化学的活性（
結合または分離を含む）により改変でき、またはフェニルプロパノイド経路中の
前駆体として使用される化合物をも破壊できる、例えばヒドロラーゼ、デカルボ
キシラーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、または桂皮酸、ｐ−クマリン酸、カ
フェイン酸、フェルラ酸、５−ヒドロキフェルラ酸、シナピン酸、シナポイル−
グルコース、シナポイル−リンゴ酸もしくはコリン（シナポイルーグルコースか
らシナピンを産生するのに使用）を分解できる他のいずれの酵素を含んでなって
もよい。本方法の１つの態様では、通常、フェニルプロパノイド経路で形成され
る産物の前駆体として使用される化合物から、ストレス保護物質を産生する酵素
が使用される。同様に、フェニルプロパノイド経路の一部として産生されるので
はなく、フェニルプロパノイド経路の産物の形成に必要とされる付加的な基質を
特異的に減少させるための酵素活性が、この産物のレベルを減少させるのに用い
ることができる。従って、フェニルプロパノイド経路で前駆体として使用される
化合物、およびフェニルプロパノイド経路において産物を産生するために必要と
されるその他の化合物の双方が、本方法の範囲内で標的となり得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８０】 種子選択性コリンオキシダーゼ（ＣＯＸ）構築体による、アブラナ科植物種の
アブラナ(Brassica napas)の遺伝的形質転換。コリンオキシダーゼ遺伝子のＤＮ
Ａ配列を図１０に示し、推定アミノ酸配列を図１１に示している。種子特異的な
発現をもたらすため、ｎａｐｉｎプロモーター配列(Kohno-Murase, J., M. Mura
se, H. Ichikawa, and J. Imamura, 1994, Plant Molecular Biology, 26: 1115
-1124) を用いた。この最終プラスミドｐＨＳ７３１は、Maniatis, T., Frittsc
h, E.F., and Sambrook, J. (1982; Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Habor, New York)のようなマニュアルに記載される標準プロトコ ールに従い、一連のクローニングおよびサブクローニングにより構築した。ベク
ター主鎖は、ＲＤ４００のＮｏｓＰ−ＮｐｔＩＩ植物選択マーカーの代わりにｇ
ｕｓとｎｐｔとの融合遺伝子（Ｇｕｓ：：ｎｐｔ）を含むように改変されたＲＤ
４００(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuｋ, B., Pelcher, L.E., an
dKeller, W., 1992, Gene 211: 383-384)由来のものである。Ｇｕｓ−ｎｐｔに ついてはこれまでに既に記載されている(Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., P
elcher, L.E., Crosby, W.L., and G. Selvaraj, 1991, Gene 101: 239-246)。 これをｎｐｔ配列の末端にＮｏｓターミネーター（ポリＡシグナル）を含む２．
６Ｋｂ断片として、ｐＧＫＫ１４(Datlaら, 1991)からＲＤ４００の全Ｔ−ＤＮ Ａを欠失させた中間プラスミドへクローン化した。ｐＢＩ５２５(Datla, R.S.S.
, F. Bekkaoui, J.K. Hammerlindl, G. Pilate, D.I. Dunstan and W.L. Crosby
, 1993, Plant Science 94: 139-149)由来のアルファルファモザイクウイルスリ
ーダーとともに、部分的に複製されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、Ｇｕｓ：
：ｎｐｔ配列の５’末端のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローン化し
た。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩに対する部位および隣接するＸｂａＩ部位を、
ポリメラーゼＩのクレノウ断片で末端を埋めることにより除去してｐＨＳ７２２
を得た。ポリメラーゼ鎖反応により、ｐＴＺ１９Ｒ(Mead, D.A., E.Szczesna-Sk
orupa, and B. Kemper, 1986, Protein Engineering 1: 67-74)由来の多重クロ ーニング部位を含むラクトース−α機能領域が０．２６Ｋｂ断片として得られた
。この断片をＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＨＳ７２２のＥｃｏＲＩ部
位に導入してｐＨＳ７２３を得た。ベクターのＴ−ＤＮＡ部分のヌクレオチド配
列を決定し、多重クローニング部位の特定部位を制限解析によって確認した。ｐ
ＨＳ７２５はｐＨＳ７２３を起源とした誘導体であり、本来カリフラワーモザイ
クウイルスポリＡシグナルとして適切な部位またはかかる特徴を提供する一連の
中間ベクターを経由するｐＫＲ１１（Rozwadowskiら, 1991 参照）由来のコリン
オキシダーゼのオープンリーディングフレームを含んでいる。ｐＨＳ７２５ベク
ターはｐＨＳ７２３バックグラウンド内に３’末端にＣＡＭＶのポリＡシグナル
を有するＣＯＸオープンリーディングフレームを与えてある。ＣＡＭＶ３ ５Ｓプロモーターを含むオープンリーディングフレームの５’部分を中間プラス
ミド由来のｎａｐｉｎプロモーターと置き換えてｐＨＳ７３１を得た。中間プラ
スミドは、プラスミドＲＤ４００(Datlaら, 1992)のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ Ｉウインドウへの ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ挿入配列として連結されている Ｊ．Ｋｏｈｎｏ−Ｍｕｒａｓｅ(Kohno-Muraseら, 1994)から受け取るＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＮａｐｉｎＰ−ＢａｍＨＩカセットとして１．１Ｋｂ ｎａｐｉｎプロモ
ーターを含むｐＵＣ１９誘導体を含んでいた。得られたプラスミドはｐＨＳ９７
４であった。ＢａｍＨＩ−ＢＡＤＨオープンリーディングフレーム−ポリＡ−Ｋ
ｐｎＩカセットをｐＲＫＪ６Ａ（ｐＲＫＪ６Ａについては、R.K. Jain, 1995, G
enetic Enginering of Osmolyte Biosynthesis in Plants: Manipulation of Be
taine Aldehyde Dehydrogenase Gene Expression Tabacoo, Ph.D. Thesis, Univ
ersity of Saskatchewan, Saskatoon, Canadaで詳細に記載）由来の２．１Ｋｂ 断片として単離し、ｐＨＳ９７４のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩウインドウに連結して
ｐＨＳ９８１とした。ｐＨＳ９８１はｐＨＳ７３１の誘導に用いた。図１２では
、得られたプラスミドｐＨＳ７３１が左右ボーダーｎａｐｉｎプロモーター−Ｃ
ｏｘオープンリーディングフレーム−ＣａＭＶポリＡシグナルを含んでいること
を示している。ｎａｐｉｎプロモーター−Ｃｏｘオープンリーディングフレーム
−ＣａＭＶポリＡシグナルセグメントのヌクレオチド配列をその構成要素から決
定した。ｐＨＳ７２３の起源には左右の境界部およびその外側にある領域の総て
を含んだｐＢＩＮ１９の総てが含まれる(Bevan, M., 1984, Nucleic Acids Rese
arch 12: 8711-8721)ので、さらなる配列の確認も可能である。ｐＢＩＮ１９の 完全なヌクレオチド配列は公開されている。よって、前記ＣＯＸ遺伝子構築体は
他のベクターへのクローニング用に容易に修正できる。大腸菌ＤＨ５のプラスミ
ドベクターｐＨＳ７３１については、１９９７年１月２２日に受託番号ＡＴＣＣ
９８３００としてAmerican Type Culture Collection(ATCC)、12301 Parklawn
Drive, Rockville MD, USA 20852に寄託された。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８１】 公開された情報(DeLisle, A.J., and Crouch, M.L., 1989, Plant Physiology
91: 617-623; Hoglund, A. -S., T. Rodin, E. Larsson and L. Rask, 1992, P
lant Physiology 98: 509-515)とｎａｐｉｎプロモーターに関する本発明者らの
結果に基づけば、活性はアブラナ種子の時間的発達の中間部分に及んでいること
がわかった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８６】 形質転換の確認については、カナマイシン上での選択、サザンブロット、ＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ連鎖反応）および後代解析により確立された。２０２６２２と
称されるベクターｐＨＳ７３１を含有するＷｅｓｔａｒ品種、アブラナのトラン
スジェニック種子については、１９９７年１月２２日に受託番号ＡＴＣＣ指定９
７８５４としてAmerican Type Culture Collection(ATCC)、12301 Parklawn Driv
e, Rockville MD, USA 20852に寄託した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８８】 植物抽出物は次のようにして得た。約１００ｍｇの植物の葉を液体窒素で凍結
させ、サンプル重量に対し２容量の氷冷抽出緩衝液で磨砕する。サンプルを約１
０，０００ｘｇで遠心分離し、その上清を再度遠心分離した。粒状物質が見られ
なくなるまで遠心分離を繰り返した。種子に関しては、サンプル当たり約２０の
種子について最初の遠心分離の後に活性炭２０ｍｇを加え、後の手順に従った。
ＫＯＨでｐＨ８．０に調節した抽出緩衝液は、１００ｍｌ当たりＨＥＰＥＳ１．
９２ｇ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ０．２ｍｌ、グリセロール１０ｍｌを含み、脱イ
オン水で１００ｍｌにしたものである。アッセイに先立ち、１Ｍ原液のＤＴＴを
最終濃度２５ｍＭまで加え、ＨＥＰＥＳ緩衝液中の１０Ｘ原液の完全プロテアー
ゼ阻害剤混合物（Boehringer-Mannheim，カタログ：１６９７−４９８）を加え た。酵素アッセイ緩衝液（ＢＡＤＨ緩衝液）には５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ
、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡが含まれ、さらに新たに最終濃度１ｍＭま
でＤＴＴを加えた。共役アッセイは、ＢＡＤＨ緩衝液５０μｌ、１０ｍＭ ＮＡ
Ｄ原液５０μｌ、植物サンプル５０μｌ、３０μｌまたは５０Ｕを与えるに等し
いＢＡＤＨを含み、脱イオン水で容量を４５０ｍｌにした反応液中で行った。吸
光度を３４０ｎｍにて２０分間モニターし、次いで、塩化コリン５０μｌを加え
、分光光度の記録を１０〜２０分間続けた。標準曲線については、植物サンプル
を除き、代わりに種々の量の精製ＣＯＸを加えた。Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６５型
のプログラム可能な記録式分光光度計を使用して単位を算出した。当業者ならば
、ＮＡＤの吸光係数に関する文献から入手できる生化学的データを用いて、利用
できる装置に適するようにプロトコールを改良することができる。ＮＡＤ還元自
体はデヒドロゲナーゼに関して行われる標準アッセイである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２１９】 ベクターｐＮＩＭＴを次の通り構築した：ＳｐｅＩで消化したＩＭＴ ＤＮＡ
断片（実施例４）をＸｂａＩ部位でｐＤＨＩ（Kohno-Murase et al 1994, Plant
Molecular Biology, 26:1115-1124に記載のｎａｐｉｎプロモーター）に連結し
、ｎａｐｉｎプロモーター−ＩＭＴ−Ｎｏｓターミネーターカセットとした。こ
の発現カセットをさらにｐＲＤ４００へ導入した。得られたベクターは図２６に
示されている。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２６】 本実施例での目的は、ＵＤＰ−ガラクトースプールを費やしてＵＤＰ−グルコ
ースプールを増加させるため、この酵素を標的植物の特定の組織で過剰発現させ
ることである。推定される結果は、抗栄養スクロースグリコシド（ＲＦＯ グリ
コシド（オリゴ糖のラフィノース族）、例えばラフィノース、スタキオースなど
）の前駆体であるガラクチノールの生合成の低下であった。この目標を達成する
ことで、望ましくないＲＦＯ グリコシドの集積速度の低下に加え、ＵＤＰ−グ
ルコースおよびスクロースの利用の可能性が同時に高められよう。後者は植物に
必須である他の代謝産物の生産のため、または植物生産力を高める炭素源として
（例えばタンパク質、脂質、全産物等）のいずれかにスクロースを必要とする他
の代謝経路に関連し、かつそれを促進すると考えられている。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２２９】 Ｇｌｕ−１−ＰおよびＧｌｕ−６−Ｐはあらゆる生体系の主要な炭水化物代謝
経路の多くで必須物質である。特に、Ｇｌｕ−１−Ｐはスクロース生合成の主要
な物質であるＵＤＰ−グルコースの生産での主要物質である。他方、Ｇｌｕ−６
−Ｐはミオイノシトール−１−Ｐの合成の１つである糖相互変換の多くで主要な
出発物質となっている。後者はフィチン酸およびＲＦＯそれぞれの合成における
主要な物質であり、補因子である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２３０】 本実施例での目的は、標的植物の細菌ＰＧＭ遺伝子を過剰発現させることによ
り、グルコースの２つのリン酸化型のどちらか一方を選んで（組織依存）Ｇｌｕ
−１−ＰとＧｌｕ−６−Ｐの相対比を操作し得ることを示すことである。 例えば発達中の種子（例えば、シンク組織）のこの活性を適当に標的化すること
により、Ｇｌｕ−１−Ｐレベルの向上が考えられ、これはＵＤＰ−またはＡＤＰ
−グルコース、続いてスクロースならびにタンパク質、脂質、またはデンプンな
どの他の貯蔵物質の生産に要求されよう。他方Ｇｌｕ−６−Ｐレベルの低下によ
る影響で前記の抗栄養因子が低レベルへと転じるであろう。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２３２】 幼芽形成または外来ＤＮＡの植物細胞への導入（マイクロパーティクル衝撃に
よる形質転換）のために、２．５Ｍ ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ ７４μＬおよび０．
１Ｍスペルミジン（遊離塩基）３０μＬをプラスミドＤＮＡ３００μＬおよびＨ ２ Ｏに加えて、プラスミドＤＮＡ（例えば３５Ｓ−ＰＡＴ／トウモロコシグロブ
リンプロモーター／ＩＭＴを含むベクター）をアルコール洗浄した球状金粒子（
直径１．５〜３．０μｍ、Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI）６０ ｍｇ上に沈着させる。溶液を直ちにかき混ぜてＤＮＡ被覆した金粒子を沈殿させ
る。得られた清澄な上清を除去し、金粒子を無水エタノール１ｍｌ中に再懸濁す
る。この懸濁液を無水エタノールで希釈するとＤＮＡ被覆した金１５ｍｇ／ｍＬ
が得られる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２３９】 ヘリウム幼芽形成については、活発に増殖している胚形成的カルス培養物２〜
４ｍｍサイズを高浸透圧処理に付す。この処理にはヘリウム幼芽形成前に、０．
２Ｍマンニトールおよび０．２Ｍソルビトールを含むＮＢ培地（Vainら, 1993,
Osmoticum treatment enhances particle bombardment-mediated transient and
stable transformation of rice. Plant Cell Rep. 12: 84-88）上にカルスを ４時間置いておくことが含まれる。浸透圧処理の後、カルス培養物を「幼芽形成
」培地（ＮＢ＋２％寒天）に移し、ステンレス綱スクリーン（２３０ミクロン）
で覆う。カルス培養物を標的当たりヘリウム圧２，０００ｐｓｉで２回幼芽形成
させる。幼芽形成した後、カルスをハイグロマイシン３０ｍｇ／Ｌを含むＮＢ培
地を構成する選択培地に置く前に、高浸透圧培地に一晩移し戻しておく。２週間
後、培地を高濃度の選択剤、すなわちＮＢ＋ハイグロマイシン５０ｍｇ／Ｌ(Li
et al, 1993, An improved rice transformation system using the biolistic
method. Plant Cell Rep. 12: 250-255)を含む新鮮な選択培地に移す。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２４０】 ＮＢ＋ハイグロマイシン５０ｍｇ／Ｌ上を覆う、密集した白黄色の胚形成的カ
ルス培養物を「再分化準備」（ＰＲ）培地＋ハイグロマイシン５０ｍｇ／Ｌに移
して再分化させる。ＰＲ培地はベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）２ｍｇ／Ｌ、ナ
フタレン酢酸（ＮＡＡ）１ｍｇ／Ｌ、およびアブシジン酸（ＡＢＡ）５ｍｇ／Ｌ
を含むＮＢ培地で構成されている。暗室での培養２週間後、カルスを「再分化」
（ＲＮ）培地へ移す。ＲＮ培地の組成はＢＡＰ３ｍｇ／ＬおよびＮＡＡ０．５ｍ
ｇ／Ｌを含むＮＢ培地である。ＲＮ培地上のカルス培養物を高蛍光下（３２５−
ｆｔ−ｃａｎｄｌｅｓ）、２８℃で２週間インキュベートする。胚の形成開始後
、２ｃｍの幼芽を有する胚を１／２Ｂ５ビタミン、スクロース１０ｇ／Ｌ、ＮＡ
Ａ０．０５ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン５０ｍｇ／ＬおよびＧＥＬＲＩＴＥ２．
５ｇ／Ｌを含む、ｐＨ５．８に調整した１／２ＭＳ培地(Murashige andSkoog, 1
962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue
cultures. Physiol, Plant. 15: 473-497)の入ったマゼンタボックスに移す。 十分に発達した根系を有する大きな植物体８〜１５ｃｍを土壌（ＭＥＴＲＯ−Ｍ
ＩＸ：表土 １：１）に移し、温室で栽培する（昼／夜 ２９／２４℃周期、湿
度５０〜６０％、光周期１２時間）。イネ植物は繁殖力のあるイネトランスジェ
ニック作物となる。これらの植物がもたらした種子にはイネカルスへ挿入した遺
伝子が含まれ、植物体へと生育した際には挿入されたＤＮＡによってコードされ
るタンパク質を発現する。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 二次代謝経路のいずれかを変更する方法の概略的なスキームの模式図である。
【図２】 アブラナ科における概略的なフェニルプロパノイド代謝およびシナピン産生の
模式図である。
【図３】 発達中の種子のシナピン合成の開始と進行。アブラナ品種ウェスターの種子の
薄層クロマトグラフィー分析。
【図４】 ＨＰＬＣ分析による発達中の種子のシナピンの集積の定量分析。
【図５】 摘出した長角果の小花柄を介して放射性コリンを供給することによる、発達中
の種子のシナピン合成能の測定、受粉７〜４３日後のシナピンへの組み込みレベ
ル。
【図６】 単離種子に放射性コリン含有溶液を浸潤させることによる、発達中の種子のシ
ナピン合成能の測定、受粉４３〜６４日後のシナピンへの組み込みレベル。
【図７】 発達中の種子の子葉、胚軸および種皮画分において、種子中の標識された総シ
ナピン画分としての新たに合成されたシナピンの集積。
【図８】 組織サンプルの単位量当たりの発達中の種子の子葉および胚軸成分のシナピン
含量。
【図９】 種子当たり、すなわち胚軸または子葉対当たりの、発達中の種子の子葉および
胚軸成分のシナピン含量の測定。
【図１０】 コリンオキシダーゼオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列
番号３）。
【図１１】 コリンオキシダーゼオープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列（配列
番号４）。
【図１２】 組織選択性プロモーターの制御下にある、ＣＯＸ遺伝子を含む植物形質転換ベ
クターｐＨＳ７３１の図解。
【図１３】 ＣＯＸ遺伝子の発現による、ブラシカ種の種子のシナピン含量の減少。
【図１４】 組織選択性プロモーターの制御下にある、ＢＡＤＨ遺伝子を含む植物形質転換
ベクターｐＨＳ９８１の図解。
【図１５】 ＣＯＸおよびＢＡＤＨ遺伝子の発現による、ブラシカ種の種子のシナピン含量
の減少。
【図１６】 ＣＯＸおよびＢＡＤＨ遺伝子の発現による、ブラシカ種の種子のフェノール含
量の変化。
【図１７】 植物細胞中での発現のために最適化したＢ．パムリスの合成フェルラ酸デカル
ボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図１８】 Ｂ．パムリスの合成フェルラ酸デカルボキシラーゼオープンリーディングフレ
ームによりコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）。
【図１９】 ３５Ｓ構成プロモーターの制御下にある、フェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝
子を含んでなる植物形質転換ベクターの制限地図。
【図２０】 種子選択性ナピンプロモーターの制御下にある、フェルラ酸デカルボキシラー
ゼ遺伝子を含んでなる植物形質転換ベクターの制限地図。
【図２１】 種子発達中のフィチン酸の集積。
【図２２】 発達中の種におけるフィチン酸の堆積の組織特異性。
【図２３】 フィチン酸、脂質、ＴＦＡ可溶細胞壁および細胞残渣画分に見られる代謝標識
されたミオイノシトールのパーセンテージ。
【図２４】 ミオイノシトールＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅ＤＮＡ断片の配
列（配列番号５）。
【図２５】 ｐＲＤ４００ ５において３５Ｓプロモーター−ＩＭＴ−ＧＵＳ−Ｎｏｓター
ミネーターカセットを含んでなるベクターｐＳＩＭＴの制限地図。
【図２６】 ｐＲＤ４００において種子選択性プロモーター−ＩＭＴ−Ｎｏｓ−ターミネー
ターを含んでなるベクターｐＮＩＭＴの制限地図。
【図２７】 ＩＭＴ遺伝子を含むトランスジェニック植物のＰＣＲ解析。
【図２８】 ＩＭＴ遺伝子を発現する植物のノーザンブロット解析。
【図２９】 トランスジェニック植物で認められるフィチン酸の減少を示す棒グラフ。
【図３０】 ベクターｐＳＩＭＴを含むＦ１、Ｆ２およびＦ３圃場生育植物におけるフィチ
ン酸の減少を示す表。
【図３１】 ベクターｐＮＩＭＴを含むＦ１およびＦ２圃場生育植物におけるフィチン酸の
減少を示す表。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジン‐ツォ、ドング カナダ国サスカチェワン州、サスカトゥー ン、ブルーデル、ロード、110 (72)発明者 ファウジィ、ジョージズ カナダ国サスカチェワン州、サスカトゥー ン、エグナトフ、ウェイ、134 (72)発明者 アタ、エイ．ケイ．フッサイン カナダ国サスカチェワン州、サスカトゥー ン、ネメイベン、ロード、426 (72)発明者 ゴパラン、セルバライ カナダ国サスカチェワン州、サスカトゥー ン、ネスリン、クレセント、540 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AB03 AD09 4B024 AA08 BA07 BA08 CA02 DA01 EA04 FA02 GA11 GA17 4B065 AA15Y AA89X AA89Y AB01 AC14 BA02 CA27 CA28 CA43 CA53

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝的に形質転換された植物を作出する方法であって、 Ａ）形質転換可能であり、かつ完全な植物体へと再分化可能な植物細胞へ、植
    物細胞における形質転換および選択に必要なＤＮＡ配列の他、植物細胞中で活性
    なプロモーターの制御の下、二次代謝経路の基質の利用を改変することができる
    タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ発現カセットを導入し（
    ただし、この基質はグルコース、アミノ酸、一般脂肪酸およびヌクレオチドから
    選択される群の一次代謝物ではない）、さらに Ｂ）二次代謝経路の少なくとも１種の産物の含量が変化した植物を再生させる
    、 ことを含んでなる、前記方法。
  2. 【請求項２】 遺伝的に形質転換された種子を作出する方法であって、種子の形成が可能な条
    件の下で、請求項１記載の方法の段階ＡおよびＢに従って得られた植物を生育さ
    せることを含んでなる、方法。
  3. 【請求項３】 プロモーターが組織選択的である、請求項１または請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 プロモーターが種子選択的である、請求項２または請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 種子選択的プロモーターがファゼオリンプロモーターおよびナピンプロモータ
    ーから選択される、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 二次代謝経路の産物が抗栄養物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 タンパク質が異種酵素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 コードされるタンパク質がフェニルプロパノイド経路の基質を変更することが
    できる酵素であり、それによりフェニルプロパノイド経路の少なくとも１種の産
    物が変更される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 コードされるタンパク質が、コリンに作用してフェニルプロパノイド経路のそ
    の他の酵素によるコリンの使用を改変することができるコリン代謝酵素である、
    請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 コリン代謝酵素がコリンオキシダーゼであり、かつ、コリンオキシダーゼをコ
    ードするＤＮＡ配列が植物細胞中で活性な種子選択性プロモーターの制御下にあ
    る、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 コードされるタンパク質が、それをベタインに変換するベタインアルデヒドに
    作用することができるベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、このベタイ
    ンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列が植物細胞中で活性な種
    子選択性プロモーターの制御下にある、請求項８記載の方法。
  12. 【請求項１２】 コードされるタンパク質がフェルラ酸デカルボキシラーゼである、請求項７記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】 コードされるタンパク質が糖アルコールに作用することができる酵素である、
    請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 コードされるタンパク質がミオイノシトールに作用することができる酵素であ
    る、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に従って作出され、シナピン含量が
    低下した、遺伝的に改変された植物種子。
  16. 【請求項１６】 請求項１３の方法に従って作出され、フェノール含量が変化した、遺伝的に改
    変された植物種子。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に従って作出され、リグニン含量が
    変化した、遺伝的に改変された植物。
  18. 【請求項１８】 請求項１３の方法に従って作出され、糖アルコール含量が変化した、遺伝的に
    改変された植物種子。
  19. 【請求項１９】 請求項１３の方法に従って作出され、フィチン酸塩含量が低下した、遺伝的に
    改変された植物種子。
  20. 【請求項２０】 ＤＮＡベクターｐＨＳ７３１。
  21. 【請求項２１】 ＤＮＡベクターｐＨＳ９８１。
  22. 【請求項２２】 ＤＮＡベクターｐＧＳ９７ｂ１。
  23. 【請求項２３】 ＤＮＡベクターｐＳＩＭＴ。
  24. 【請求項２４】 ＤＮＡベクターｐＮＩＭＴ。
  25. 【請求項２５】 ファゼオリンプロモーターの制御下にある、ＣＯＸ遺伝子、ＢＡＤＨ遺伝子、
    ＩＭＴ遺伝子およびフェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝子から選択される遺伝子
    を含有するＤＮＡベクター。
  26. 【請求項２６】 双子葉類および単子葉類から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記
    載の方法によって作出された植物。
  27. 【請求項２７】 アオイ科、アマ科、キク科、マメ科、トウダイグサ科、イネ科およびモクセイ
    科に属するものから選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に
    よって作出された植物。
  28. 【請求項２８】 アブラナ科に属するものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法
    によって作出された植物。
  29. 【請求項２９】 アマ属、ワタ属、ダイズ属、ラッカセイ属、ベニバナ属、ヒマワリ属、ウマゴ
    ヤシ属、カラシ属、ダイコン属、トウゴマ属、オリーブ属、トウモロコシ属、オ
    オムギ属、ライコムギ属およびイネ属に属するものから選択される、請求項１〜
    １４のいずれか一項に記載の方法によって作出された植物。
  30. 【請求項３０】 アブラナ属に属するものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法
    によって作出された植物。
  31. 【請求項３１】 アブラナ(Brassica napus)またはカブ(Brassica rapa)である、請求項１〜１ ４のいずれか一項に記載の方法によって作出された植物。
  32. 【請求項３２】 請求項２〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って作出された種子または該
    種子に由来する粉餌を含んでなる、飼料製品。
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