CN102559716A - 一种源于冰叶午时花芒的肌醇甲基转移酶基因及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种源于冰叶午时花芒的肌醇甲基转移酶基因及其制备方法和应用。所述肌醇甲基转移酶(IMTI)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2。所述IMTI基因是利用基因合成方法制备而成，并利用蘸花法将所述IMTI基因转化到拟南芥中。经抗冻实验后，转入了IMTI基因的转基因拟南芥的存活率高达70％以上，表明所述IMTI基因的转入大大提高了拟南芥植株的抗低温能力，本发明的IMTI基因对于培育植物抗低温的植物品种具有重要意义。

Description

一种源于冰叶午时花芒的肌醇甲基转移酶基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种源于冰叶午时花芒的肌醇甲基转移酶(IMTI)基因及其制备方法和应用。

背景技术

自然界中，植物生长在开放的系统中，经常遇到恶劣环境的影响，主要有强光、高温、干旱、水涝和高盐等逆境的胁迫。为了适应这些环境，植物在生理、生化水平以及分子细胞水平都有相应的反应。其中，温度作为重要的环境因子之一，限制植物的分布、生长和产量。并且在研究中，人们发现植物在长期的进化中发展了许多对温度逆境的适应能力。例如，许多温带植物在遭受短期的低温后，会提高自身对低温的耐受性，这种现象称为冷驯化。但，人们目前对植物这种冷适应的机理还不是十分清楚，因此探索植物抗寒性的遗传机理不仅在基础理论上具有重要意义，在解决生产实际问题上也具有广泛的应用价值。

植物在长期的进化过程中，形成了一定的胁迫应答机制来适应环境并满足各种生理需求。通常在逆境条件下，植物能感知、传递逆境胁迫信号，诱导相关功能基因的表达，在生理生化上作出适应性响应。干旱、低温、高盐是影响植物生长和农作物产量的主要非生物环境因子。长期以来，人们都非常关注对这些非生物胁迫的研究。因此，改良作物的抗逆性，选育抗逆品种已经成为作物育种学的一个重要任务。

抗寒性是植物对低温长期适应的一种遗传特性，可诱导且受多基因控制，并且只有在一定条件(低温或短日照)下才能表达为抗寒力。在抗寒基因未表达之前抗寒性强的植物也是不耐寒的，所以抗寒的遗传性仅是一种潜能，只有经一定时间的冷驯化后才能发展为抗寒力。温度是影响植物生长及分布的重要环境因子之一。低温影响植物的生长代谢，引起植物相关生理生化变化，导致植物受到伤害、减产，严重时还会造成植物死亡。低温冻害使许多植物生存受到严重危害，全球每年因低温冻害造成的农作物损失高达数千亿元，研究并提高植物抗寒力具有重要理论和现实意义。

编码肌醇甲基转移酶基因(IMTI)是从松叶菊属盐土植物冰叶午时花芒(Mesembryanthemum crystallinum)中得来的。国内外对编码肌醇甲基转移酶基因也有很多的报道，但主要是集中在耐盐方面的研究，该基因受盐胁迫诱导，有关该基因的分子和生理方面的功能由Vernon等和Rammesmayer等研究报道【Vernon et al.，The EMBO J，1992，11：2077-2085；Rammesmayer et al.，Arch.Biochem Biophys，1995，322：183-188】。Sheveleva等以及国内的董云洲等都研究报道过该基因转化烟草后提高了耐盐能力【Sheveleva et al.，Plant Physiol，1997，115：1211-1219；董云洲等，农业生物技术学报，2000，8(1)：53-55】。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种源于冰叶午时花芒的肌醇甲基转移酶基因及其制备方法和应用。利用基因合成法制备IMTI基因，并将该IMTI基因转化拟南芥，以提高转基因拟南芥的抗冻能力，该基因对于培育抗低温的植物品种具有重要意义。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种源于冰叶午时花芒的IMTI基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2。

所述IMTI基因是将冰叶午时花芒中的IMTI基因利用基因合成法【Xiong et al.，NuclAcids Res，2004，32：e98】制备而成。首先设计Imt1-1-Imt1-27共27个引物，并以Imt1-1-Imt1-27为引物，利用PTDS法进行扩增。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连。4℃连接过夜，高效转化于DH5α感受态细胞中，即获得长度为1512bp的阳性克隆，即为本发明的IMTI基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。

将制得的冰叶午时花芒IMTI基因直接与真核表达载体pYM8249相连，经过DH5α克隆过的环形质粒单酶切使其线性化。

利用电击法将上述线性化DNA导入农杆菌GV3101中，即取50μL农杆菌GV3101感受态细胞，加入1μL线性化DNA转入0.2cm电击杯转化(400Ω，2.5KV，25μf)。加入1mL含有1wt％甘露醇的LB培养基恢复培养2小时(28℃，250rpm)。取10μL涂LB平板(利福平50μg/mL，庆大霉素50μg/mL，氯霉素100μg/mL)。

通过蘸花法转化将IMTI基因转化到拟南芥中【Clough et al.，The plant journal，1998，16(6)：735-743】，并验证了该转基因拟南芥对低温的抗性，结果表明：转入了IMTI基因的转基因拟南芥经过抗冻胁迫实验后的存活率高达70％以上，即所述源于冰叶午时花芒IMTI基因可应用于提高植物的抗冻性中。所述源于冰叶午时花芒IMTI基因还可应用于培育提高植物抗逆性中。

本发明的有益效果：

本发明采用基因合成法合成了来源于冰叶午时花芒的肌醇甲基转移酶基因，即IMTI基因，比较了转IMTI基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对低温胁迫的耐受性，进一步分析该基因在低温逆境中的作用与功能。结果显示：野生型和转IMTI基因拟南芥植株在存活率上有很大的差异，其中，转入了IMTI基因的转基因拟南芥经过抗冻胁迫实验后的存活率高达70％以上，表明IMTI基因的转入大大提高了拟南芥植株的抗低温的能力。

附图说明

图1为基因合成法合成本发明的源于冰叶午时花芒的IMTI基因的策略图。

图2为基因合成法合成本发明的源于冰叶午时花芒的IMTI基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为2000marker。

图3为本发明经过转化后约2个月的转基因拟南芥和野生型拟南芥生长情况图，其中，WT为野生型拟南芥，AT8249为转基因拟南芥。

图4为本发明转基因拟南芥和野生型拟南芥的抗冻表型图，其中，WT为野生型拟南芥，8249-1、8249-2、8249-3为转基因拟南芥的三个株系。

具体实施方式

以下结合具体实施方式详细描述本发明的技术方案。

本发明所用的试验材料及其来源包括：

野生型拟南芥种子(Arabidopsis thaliana)，大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，农杆菌菌株GV3101由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。T/A克隆载体、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、T4DNA连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。

PNS培养液配方：A母液：KNO₃             101.1g/L；

               B母液：Ca(NO₃)₂          2236.15g/L；

               C母液：MgSO₄            246.48g/L；

               D母液：FeSO₄            5.57g/L；

               EDTA钠盐                7.45g/L；

               E母液：KH₂PO₄           130.4g/L；

               K₂HPO₄                  9.12g/L。

本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989】。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。

实施例1基因合成法合成源于冰叶午时花芒的IMTI基因

利用PTDS法合成冰叶午时花芒IMTI基因。IMTI基因的合成引物如下：

Imt1-1：

GAA

ATGACCACCTATACTAATGGTAACTACACTCAACCTAAGACTCTGGACAAG

Imt1-2：

CATTTGCCAGAGTGACAGCCAATCCAGCAAGCTGCTCGTCCTTGTCCAGAGTCTTAGGTT

Imt1-3：

GGCTGTCACTCTGGCAAATGCAGCTGCATTCCCAATGATCTTGAAGAGTGCATTCGAGCT

Imt1-4：

GACACCTTCACCAGCCTTGGAGAAGATGTCCAGGATCTTCAGCTCGAATGCACTCTTCAA

Imt1-5：

CCAAGGCTGGTGAAGGTGTCTTCGTCAGTACCAGCGAGATCGCTTCTCAGATTGGTGCTA

Imt1-6：

CGAAGCATACGGTCCAGCAGGACTGGTGCATTTGGATTCTTAGCACCAATCTGAGAAGCG

Imt1-7：

CTGCTGGACCGTATGCTTCGTCTTCTGGCATCTCACAGCGTCCTGACCTGTAAACTTCAG

Imt1-8：

GAGCTGGACCATAGACCCTCTGACTACCACCTTCACCCTTCTGAAGTTTACAGGTCAGGA

Imt1-9：

GAGGGTCTATGGTCCAGCTCCACTGTGTAACTACCTGGCATCCAACGACGGTCAAGGAAG

Imt1-10：

CATGACCTTGTCATGGTGCAGGACGAGCAGTGGTCCAAGGCTTCCTTGACCGTCGTTGGA

Imt1-11：

TGCACCATGACAAGGTCATGATGGAGTCCTGGTTCCACCTGAACGACTACATCCTGGAAG

Imt1-12：

AACTGGATCATTCCATGTGCTCTCTTGAATGGAACACCTCCTTCCAGGATGTAGTCGTTC

Imt1-13：

GCACATGGAATGATCCAGTTTGACTACACTGGTACTGACGAGAGGTTCAACCACGTCTTC

Imt1-14：

TCTTCATGACCAAGATGGTATGATGAGCCATACCTTGGTTGAAGACGTGGTTGAACCTCT

Imt1-15：

TACCATCTTGGTCATGAAGAAGCTCCTTGACAACTACAATGGTTTCAACGACGTCAAGGT

Imt1-16：

AGAGACGTTGACACCAATGTTACCACCAACATCGACCAGGACCTTGACGTCGTTGAAACC

Imt1-17：

ACATTGGTGTCAACGTCTCTATGATCGTTGCTAAGCACACCCATATCAAGGGTATCAACT

Imt1-18：

GGATAGCTTGGAGCGTCTGCGATGACGTGTGGAAGGTCGTAGTTGATACCCTTGATATGG

Imt1-19：

GCAGACGCTCCAAGCTATCCTGGTGTTGAGCATGTTGGTGGTAACATGTTCGAGTCTATC

Imt1-20：

CATGCAAGACCCACTTCATGAAGATTGCATCTGCTTGTGGGATAGACTCGAACATGTTAC

Imt1-21：

CATGAAGTGGGTCTTGCATGACTGGTCTGACGAACACTGCGTCAAGATCCTGAACAAATG

Imt1-22：

AACCAGGATGATCTTACCTCCCTTAGCCAAGGACTCGTAGCATTTGTTCAGGATCTTGAC

Imt1-23：

GAGGTAAGATCATCCTGGTTGAGTCTCTGATCCCAGTCATTCCAGAAGACAACCTTGAGT

Imt1-24：

TGAACAAGAGTATGACAGTCAAGAGAGAAGACCATGTGAGACTCAAGGTTGTCTTCTGGA

Imt1-25：

GACTGTCATACTCTTGTTCACAACCAAGGTGGTAAGGAGAGATCCAAGGAGGACTTCGAA

Imt1-26：

TGACGTCAACAGTGCTGAATCCAGTCTTACTTGCCAGTGCTTCGAAGTCCTCCTTGGATC

Imt1-27：

AAG

TTACTTCTTATACAACTCCATAACCCAGGTATCGTAGCGCAACAGATGACGTCAACAGTGCTGAAT

基因合成设计原则包括：避免基因中出现ATTTA等PolyA加尾信号，避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40～60％，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins，避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸(CG在植物中易造成甲基化)。采用基因合成法合成的本发明的源于冰叶午时花芒IMTI基因的策略参看图1。

以Imt1-1-Imt1-27为引物，利用PTDS法进行扩增IMTI片段，在50μl反应体系中，内侧的25个引物为1.5ng、外侧的两个引物浓度为30ng，1μl KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，5μl 10×PCR buffer，4μl dNTP，加无菌水定容至50μl。扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，1min。共25个循环。PCR结束后，用1％琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连，4℃连接过夜，高效转化于DH5α感受态中。取5μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到的目的条带为1098bp左右的目的片段，其结果参见图2。

PCR反应得到了一个1098bp左右的片段，即为本发明的冰叶午时花芒IMTI基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。

序列经BLAST比对分析表明PTDS法合成的IMTI基因与冰叶午时花芒IMTI基因的氨基酸序列完全一致。

将上述制得的冰叶午时花芒基因直接与真核表达载体pYM8249(上海市农科院生物所实验室提供)相连，经过DH5α克隆过的环形质粒单酶切使其线性化。

实施例2拟南芥转化

1.电击法转化农杆菌

1)制备农杆菌GV3101感受态细胞，方法参照MicroPulser^TM Electroporation ApparatusOperating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司)。

2)取50μL农杆菌GV3101感受态细胞，加入1μL实施例1中的线性化DNA转入0.2cm电击杯转化(400Ω，2.5KV，25μf)。加入1mL含有1wt％甘露醇的LB培养基恢复培养2小时(28℃，250rpm)。取10μL涂LB平板(利福平50μg/mL，庆大霉素50μg/mL，氯霉素100μg/mL)。

2.野生型拟南芥的培养

1)野生型拟南芥种子在4℃进行2-3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花期的提前。

2)将蛭石、黑土、珍珠岩按质量比：9∶3∶0.5拌匀，经高温灭菌后装于10cm的塑料小盆，以营养液PNS浸湿待用。

3)以牙签将上述处理过的野生型拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22℃暗培养2-3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22℃培养室中进行16小时光照培养。

4)野生型拟南芥抽苔后及抽苔后两周需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当拟南芥次生苔长至2-10cm(少数已经开花)可用于转化。

3.拟南芥蘸花法转化

1)含目的质粒的农杆菌菌株单菌落接菌在5mL含对应抗生素的LB培养基中28℃培养2天。将5mL菌液转到500mL的液体LB培养基中28℃培养16-24小时(OD＝1.5-2.0)。液体可以在4℃保存30天。室温下离心收集菌体，4000g离心10分钟。用等体积5％的新鲜蔗糖溶液悬浮。加入0.02％的Silwet-77混匀后转移到烧杯中，即得转化菌液。将上述培养的野生型拟南芥倒置后浸入转化菌液中10秒钟。莲座和花序都要侵染。侵染后将转基因拟南芥植株菌液空干3-5秒。用保鲜膜将转基因拟南芥植株圈好，平放16-24小时。

2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，共转化三次，这样可以在花发育的不同时期进行转化，提高转化效率。

3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。

经过蘸花法转化后的转基因拟南芥植株生长约两个月后，可以正常开花结子，具体参见图3。

4.拟南芥转化植株种子的筛选

1)称25-30mg上述收集的种子放入1.5mL离心管。

2)1mL 75wt％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5秒，去上清。

3)加入1mL过滤后的漂白粉消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000rpm离心5秒，去上清。

4)无菌水洗涤3-4次。

5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(Hyg 50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16小时光照培养6天，得到抗性植株。

6)将上述抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T₁)继续培养，并收集种子进行T₂代和T₃代筛选，得到转基因拟南芥。

实施例3冰叶午时花芒IMTI基因转化植物后的抗冻分析

在22℃生长三个星期的野生型拟南芥和转基因拟南芥用于低温抗性实验，其中野生型拟南芥标记为WT，三组转基因拟南芥分别标记为8249-1、8249-2和8249-3。具体是将野生型拟南芥和转基因拟南芥在4℃冰箱下培养48小时，放到-22℃冷冻20min，然后再放回4℃冰箱放置过夜恢复，第二天再放回培养室恢复培养，实验结果表型参见图4。野生型拟南芥和转基因拟南芥的存活率如表1所示。

表1经过抗冻胁迫后的野生型拟南芥和转基因拟南芥的存活率

由表1可见，野生型拟南芥和转基因拟南芥的存活率有很大的差异，转入了IMTI基因的转基因拟南芥经过抗冻胁迫实验后的存活率高达70％以上，表明IMTI基因的转入大大提高了拟南芥植株的抗低温的能力。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (6)

1.一种源于冰叶午时花芒的肌醇甲基转移酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。

2.根据权利要求1所述的肌醇甲基转移酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2所示。

3.权利要求1或2所述的肌醇甲基转移酶基因的制备方法，其特征在于，利用基因合成法合成肌醇甲基转移酶基因。

4.根据权利要求3的肌醇甲基转移酶基因的制备方法，其特征在于，所述基因合成法所用引物如下：

Imt1-1：

GAAATGACCACCTATACTAATGGTAACTACACTCAACCTAAGACTCTGGACAAG

Imt1-2：

CATTTGCCAGAGTGACAGCCAATCCAGCAAGCTGCTCGTCCTTGTCCAGAGTCTTAGGTT

Imt1-3：

GGCTGTCACTCTGGCAAATGCAGCTGCATTCCCAATGATCTTGAAGAGTGCATTCGAGCT

Imt1-4：

GACACCTTCACCAGCCTTGGAGAAGATGTCCAGGATCTTCAGCTCGAATGCACTCTTCAA

Imt1-5：

CCAAGGCTGGTGAAGGTGTCTTCGTCAGTACCAGCGAGATCGCTTCTCAGATTGGTGCTA

Imt1-6：

CGAAGCATACGGTCCAGCAGGACTGGTGCATTTGGATTCTTAGCACCAATCTGAGAAGCG

Imt1-7：

CTGCTGGACCGTATGCTTCGTCTTCTGGCATCTCACAGCGTCCTGACCTGTAAACTTCAG

Imt1-8：

GAGCTGGACCATAGACCCTCTGACTACCACCTTCACCCTTCTGAAGTTTACAGGTCAGGA

Imt1-9：

GAGGGTCTATGGTCCAGCTCCACTGTGTAACTACCTGGCATCCAACGACGGTCAAGGAAG

Imt1-10：

CATGACCTTGTCATGGTGCAGGACGAGCAGTGGTCCAAGGCTTCCTTGACCGTCGTTGGA

Imt1-11：

TGCACCATGACAAGGTCATGATGGAGTCCTGGTTCCACCTGAACGACTACATCCTGGAAG

Imt1-12：

AACTGGATCATTCCATGTGCTCTCTTGAATGGAACACCTCCTTCCAGGATGTAGTCGTTC

Imt1-13：

GCACATGGAATGATCCAGTTTGACTACACTGGTACTGACGAGAGGTTCAACCACGTCTTC

Imt1-14：

TCTTCATGACCAAGATGGTATGATGAGCCATACCTTGGTTGAAGACGTGGTTGAACCTCT

Imt1-15：

TACCATCTTGGTCATGAAGAAGCTCCTTGACAACTACAATGGTTTCAACGACGTCAAGGT

Imt1-16：

AGAGACGTTGACACCAATGTTACCACCAACATCGACCAGGACCTTGACGTCGTTGAAACC

Imt1-17：

ACATTGGTGTCAACGTCTCTATGATCGTTGCTAAGCACACCCATATCAAGGGTATCAACT

Imt1-18：

GGATAGCTTGGAGCGTCTGCGATGACGTGTGGAAGGTCGTAGTTGATACCCTTGATATGG

Imt1-19：

GCAGACGCTCCAAGCTATCCTGGTGTTGAGCATGTTGGTGGTAACATGTTCGAGTCTATC

Imt1-20：

CATGCAAGACCCACTTCATGAAGATTGCATCTGCTTGTGGGATAGACTCGAACATGTTAC

Imt1-21：

CATGAAGTGGGTCTTGCATGACTGGTCTGACGAACACTGCGTCAAGATCCTGAACAAATG

Imt1-22：

AACCAGGATGATCTTACCTCCCTTAGCCAAGGACTCGTAGCATTTGTTCAGGATCTTGAC

Imt1-23：

GAGGTAAGATCATCCTGGTTGAGTCTCTGATCCCAGTCATTCCAGAAGACAACCTTGAGT

Imt1-24：

TGAACAAGAGTATGACAGTCAAGAGAGAAGACCATGTGAGACTCAAGGTTGTCTTCTGGA

Imt1-25：

GACTGTCATACTCTTGTTCACAACCAAGGTGGTAAGGAGAGATCCAAGGAGGACTTCGAA

Imt1-26：

TGACGTCAACAGTGCTGAATCCAGTCTTACTTGCCAGTGCTTCGAAGTCCTCCTTGGATC

Imt1-27：

AAG

TTACTTCTTATACAACTCCATAACCCAGGTATCGTAGCGCAACAGATGACGTCAACAGTGCTGAAT。

5.权利要求1或2所述的肌醇甲基转移酶基因在培育提高植物抗逆性中的应用。

6.权利要求1或2所述的肌醇甲基转移酶基因在提高植物的抗冻性中的应用。

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