CN102108357B - 源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和应用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2；所述基因为CFAFP3I基因，它是将昆虫抗冻肽中的CFAFP3I基因按照植物偏爱密码进行改造，利用基因合成方法制备而成。将该基因转化拟南芥，进而提高了转基因拟南芥的抗冻能力。本发明的基因对于培育植物抗低温的植物品种非常重要，具有重要的理论意义和现实意义。

Description

源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明属作物遗传育种领域，具体涉及一种来源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和应用。

背景技术

植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进化的遗传基因型所控制，又受系统发育中生理生态因素所制约。逆境会诱导植物表达大量的特异蛋白，不同的逆境诱导表达的蛋白不完全相同，既有交叉又有差别，而同一种逆境在同一种植物的不同部位所诱导表达的蛋白也不完全相同，在不同的植物物种中这些蛋白的合成差别就更大【Kasuga et al.，NatureBiotechnol.，1999，17：287-291】。因此有很多的蛋白参与了植物对非生物逆境的反应，它们协同作用来调整植物生理代谢的变化，从而提高植物对非生物逆境的适应性，可见植物对非生物逆境的抵抗是体内的系统反应，并不是由一个两个功能基因就能完成的【Urrutia et al.，Biochem.Biophy.Acta.，1992，1121：199-206】。逆境胁迫导致植物体内产生多方面的变化：如抗逆基因的表达，新蛋白质的合成，代谢的转变，抗逆境物质的积累，气孔的关闭，光合作用的降低等【Smirnoff，Curr.Opin.Biotech.，1998，9：214-219】。

人们就逆境对植物影响的认识和研究，首先是从表观生理指标一般性描述开始，其次研究植物在各种逆境下产生的生理生化、生态变化和生理调节机制，最后发展到分子水平，进一步探讨植物对不同逆境的感应、信号传导、基因表达与调控、蛋白质组装和细胞膜功能获得。为更深入了解植物对不同逆境响应的分子机理和研究人工调控的生物技术等方面展示出良好前景。

温度作为重要的环境因子之一，限制植物的分布、生长和产量【Viswanathanet al.，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol Sci.，2002，357(1423)：877-886】。在研究中人们发现植物在长期的进化中发展了许多对温度逆境的适应能力。但目前对植物这种冷适应的机理还不是十分清楚，因此探索植物抗寒性的遗传机理不仅在基础理论上具有重要意义，在解决生产实际问题上也具有广泛的应用价值。

抗冻蛋白(Antifreeze protein，AFP)在鱼类、昆虫及植物中均有发现，鱼类AFP包括含糖基的AFPs(Antifreeze glycoproteins，AFGPs)和不含糖基的AFP I-IV。就目前的研究结果看来，其抗冻活性没有昆虫的高【费云标等，昆虫学报，2000，43(1)：98-102】。对于AFPs的研究可以追溯到本世纪60年代，Ramsay(1964)在黄粉甲(Tenebrio molitor)幼虫中发现一种导致冰点低于熔点的物质【Ramsay，Phil.Trans.R.Soc.London B.，1964，248：279-314】，Grimstone等(1968)证明这种物质是蛋白质【Grimstone，Phil.Trans.R.Soc.London B.，1968，253：343-382】。由它导致的熔点与冰点之差称为热滞温度或热滞活(Therm hysteresisactivity，THA)，这种蛋白质就被称为热滞蛋白(Therm hysteresis proteins，THPs)。在鱼类和一些植物研究中习惯地称其为抗冻蛋白即AFPs。它的研究对象扩展到极区鱼、无脊椎动物、脊椎动物、最后又扩展到非维管植物和维管植物【Barrett，Int J.Biochem.Cell Biol.，2001，33(2)：105-117】，甚至细菌、真菌、微生物。科学家发现，原来AFP在生物界广泛存在，是生物抵抗低温、抵御冻害的一种机制。

鱼类的抗冻蛋白根据其抗冻蛋白含糖与否，人们将其分为抗冻糖蛋白(Antifreeze glycoprotein，AFGP)和抗冻蛋白；在抗冻蛋白中又由结构的不同而分为I型、II型、III型和IV型抗冻蛋白【李树峰等，东北农业大学学报，2003，34，(1)：90-94】。有关鱼类抗冻蛋白抗冻机制已经提出多种假说，就目前研究来看，吸附抑制机制比较合理，得到大多数学者赞同【Kaye等，Plant Physiol.，1998，116：1367-1377】。其机制的模型为：一般晶体生长垂直于晶体表面，假如杂质分子吸附于冰晶生长通途的表面，那么需要外加推动力促使冰在杂质间生长。抗冻蛋白的吸附使曲率增大，促使边缘的表面积也增加。由于表面张力的影响，增加表面积将使体系的平衡状态发生改变，从而冰点下降。有关植物AFPs的研究90年代初才开始报道。植物中许多冷诱导蛋白中有一小部分也类似于鱼类和昆虫中的抗冻蛋白。人们从冷驯化的冬黑麦等叶片细胞间隙中抽提出一类蛋白，它们与植物抗冻性有关，统称为抗冻蛋白(AFPs)【唐艳梅等，山东林业科技，2005，4：76-78】。

昆虫抗冻蛋白(AFPs)的分子量为14～20kD，无糖基，与鱼类I型AFPs相似，含有较多的亲水性氨基酸(例如Thr，Ser，Asx，Glx，Lys，Arg)，有40％～59％的氨基酸残基能形成氢键，其中长椿(Oncopeltus)AFPs含Ser达30％；有些昆虫AFPs类似于鱼类II型AFPs，含有一定数量的半胱氨酸。一种甲虫(DendroidesCanadensis)AFPs H1组分含有较多的半胱氨酸(15.9％)，几乎有1/2的半胱氨酸残基涉及到二硫键的生成，用DTT处理，降低了这些二硫键，或使游离巯基烷基化，AFPs随之失去活性。T.molitor幼虫既有含半胱氨酸的AFPs(T3)，又有无半胱氨酸的AFPs(T4)【费云标等，昆虫学报，2000，43(1)：98-102】。云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)AFPs与鱼类(如美洲绒杜文鱼Hemitripterus americanue)II型AFPs有免疫交叉反应【Hew et al.，Can.J.Zool.，1983，61：2324-2328】，说明这些鱼类和昆虫的AFPs有共同的抗原决定簇。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和应用。将该基因转化拟南芥，进而提高转基因拟南芥的抗冻能力，该类基因对于培育植物抗低温的植物品种非常重要，具有重要的理论意义和现实意义。

本发明的技术方案如下：

一种源于昆虫抗冻肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2。

所述源于昆虫抗冻肽基因是CFAFP3I基因。

所述源于昆虫抗冻肽基因是将昆虫抗冻肽中的CFAFP3I基因按照植物偏爱密码进行改造，利用基因合成法【Xiong et al.，NuclAcids Res，2004，32：e98】制备而成。其引物如下：

CFAFP3I-1Z：

GAA，GGA，TCC，ATG，AAA，TGC，CTG，ATG，CTC，ATC，ATG，GCT，CTT，GCT，ATC，ATT，AAC，ACC，GTC，AGC

CFAFP3I-1F：

CAG，ACA，GTT，GGC，TGT，TAG，TGT，TAG，TGC，AAG，TAC，CGT，CAC，TGC，TGA，CGG，TGT，TAA，TGA，TAG

CFAFP3I-2Z：

CAC，TAA，CAG，CCA，ACT，GTC，TGC，CAA，CAG，TAA，GTG，TGA，CAA，GAG，TAC，TCT，GAC，TAA，CTG，TTA

CFAFP3I-2F：

ACC，AGT，GCA，GGT，GGT，GCC，ATA，GAC，TTC，AGA，CTT，GTC，AAC，ATA，ACA，GTT，AGT，CAG，AGT，ACT

CFAFP3I-3Z：

ATG，GCA，CCA，CCT，GCA，CTG，GTT，CTC，GTT，TCG，ATG，GTG，TCA，CCA，TCA，CCA，GCA，GCA，CCA，GCA

CFAFP3I-3F：

CTG，CTG，ATC，TTA，CAG，CCT，GGA，CCA，AGG，ATA，CGA，CTG，CCA，GTG，CTG，GTG，CTG，CTG，GTG，ATG

CFAFP3I-4Z：

CCA，GGC，TGT，AAG，ATC，AGC，AGC，TGT，ATC，ATC，ACT，GGT，GGT，GTT，CCA，GCT，CCT，AGT，GCT，GCC

CFAFP3I-4F：

AAG，GAG，CTC，TTA，GTT，GGC，AGA，GAA，GGT，GCA，GCC，ACT，GAT，CTT，ACA，GGC，AGC，ACT，AGG，AGC，TGG，AA

利用BamHI和SacI进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将该基因与含有双35S启动子的植物表达载体连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因CFAFP3I的重组质粒AH84，该表达载体还带内含子卡那霉素抗性标记基因。

利用电击法将上述重组质粒AH84导入根癌农杆菌LBA4404中，农杆菌粘花法转化将CFAFP3I基因转化到拟南芥中【Clough et al.，The plant journal，1998，16(6)：735-743】，验证了该转基因植物对低温的抗性，即该源于昆虫抗冻肽基因可应用于提高植物的抗冻性中。

所述源于昆虫抗冻肽基因还可应用于培育提高植物抗逆性中。

有益效果：

本发明采用基因合成法合成了来源于昆虫抗冻肽基因，即CFAFP3I基因。为了进一步分析该基因在低温逆境中的作用与功能，比较了转CFAFP3I基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对低温胁迫的耐受性。结果表明：野生型和转CFAFP3I基因拟南芥植株在存活率上有很大的差异，转基因植株比野生型拟南芥有明显的抗冻能力。这也表明CFAFP3I的转入提高了拟南芥植株的抗低温的能力。

附图说明

图1为基因合成法合成本发明的源于昆虫抗冻肽CFAFP3I基因的策略图。

图2为基因合成法合成本发明的源于昆虫抗冻肽CFAFP3I基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为2000marker。

图3为拟南芥经过转化后约两个月的生长情况图。

图4为转基因与野生型拟南芥的抗冻表型图，其中：WT为野生型拟南芥，84-1为转基因拟南芥AH84的一个株系。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。应当说明的是，所述实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试验材料及其来源包括：

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型拟南芥Columbia，23℃人工气候室培养，16h光照培养。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。

本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989】。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。

实施例1

基因合成法合成源于昆虫抗冻肽CFAFP3I基因

(一)试验方法：

按照植物偏爱密码重新合成昆虫抗冻肽CFAFP3I基因。

CFAFP3I基因的合成引物如下：

CFAFP3I-1Z：

GAA，GGA，TCC，ATG，AAA，TGC，CTG，ATG，CTC，ATC，ATG，GCT，CTT，GCT，ATC，ATT，AAC，ACC，GTC，AGC

CFAFP3I-1F：

CAG，ACA，GTT，GGC，TGT，TAG，TGT，TAG，TGC，AAG，TAC，CGT，CAC，TGC，TGA，CGG，TGT，TAA，TGA，TAG

CFAFP3I-2Z：

CAC，TAA，CAG，CCA，ACT，GTC，TGC，CAA，CAG，TAA，GTG，TGA，CAA，GAG，TAC，TCT，GAC，TAA，CTG，TTA

CFAFP3I-2F：

ACC，AGT，GCA，GGT，GGT，GCC，ATA，GAC，TTC，AGA，CTT，GTC，AAC，ATA，ACA，GTT，AGT，CAG，AGT，ACT

CFAFP3I-3Z：

ATG，GCA，CCA，CCT，GCA，CTG，GTT，CTC，GTT，TCG，ATG，GTG，TCA，CCA，TCA，CCA，GCA，GCA，CCA，GCA

CFAFP3I-3F：

CTG，CTG，ATC，TTA，CAG，CCT，GGA，CCA，AGG，ATA，CGA，CTG，CCA，GTG，CTG，GTG，CTG，CTG，GTG，ATG

CFAFP3I-4Z：

CCA，GGC，TGT，AAG，ATC，AGC，AGC，TGT，ATC，ATC，ACT，GGT，GGT，GTT，CCA，GCT，CCT，AGT，GCT，GCC

CFAFP3I-4F：

AAG，GAG，CTC，TTA，GTT，GGC，AGA，GAA，GGT，GCA，GCC，ACT，GAT，CTT，ACA，GGC，AGC，ACT，AGG，AGC，TGG，AA

以CFAFP3I-1Z-CFAFP3I-4F为引物，利用PCR进行扩增CFAFP3I片段，在50μl反应体系中，内侧的六个引物浓度为1.5pmol，外侧的两个引物浓度为30pmol。

基因合成设计原则包括：按植物偏爱密码子，避免基因中出现ATTTA等PolyA加尾信号，避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40～60％，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins，避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸(CG在植物中易造成甲基化)。PCR反应得到了一个327bp左右的片段，产物经回收，克隆和测序。序列经BLAST比对分析表明PCR法合成的CFAFP3I基因与昆虫的抗冻肽基因的氨基酸序列完全一致，其核苷酸序列如下：

ATGAAATGCC  TGATGCTCAT  CATGGCTCTT  GCTATCATTA

ACACCGTCAG  CAGTGACGGT  ACTTGCACTA  ACACTAACAG

CCAACTGTCT  GCCAACAGTA  AGTGTGACAA  GAGTACTCTG

ACTAACTGTT  ATGTTGACAA  GTCTGAAGTC  TATGGCACCA

CCTGCACTGG  TTCTCGTTTC  GATGGTGTCA  CCATCACCAG

CAGCACCAGC  ACTGGCAGTC  GTATCCTTGG  TCCAGGCTGT

AAGATCAGCA  GCTGTATCAT  CACTGGTGGT  GTTCCAGCTC

CTAGTGCTGC  CTGTAAGATC  AGTGGCTGCA  CCTTCTCTGC

CAACTAA

上述CFAFP3I基因编码的氨基酸序列，以单字母表示如下：

MKCLMLIMAL    AIINTVSSDG    TCTNTNSQLS    ANSKCDKSTLTNCYVDKSEV  YGTTCTGSRFDGVTITSSTS  TGSRILGPGC  KISSCIITGGVPAPSAACKI SGCTFSAN*

(二)试验结果：

采用基因合成法合成的本发明的源于昆虫抗冻肽CFAFP3I基因的策略参看图1，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定该合成基因的产物，其结果参考图2。

实施例2

拟南芥转化

(一)试验方法：

1.电击法转化农杆菌

1)制备农杆菌GV3101感受态，方法参照MicroPulserTM ElectroporationApparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司)【Raineri et al.，Bio.Tech.，1990，8：33-38】。

2)取50μL GV3101感受态细胞，加入1μL DNA，转入0.2cm电击杯转化(400Ω，2.5KV，25μf)。加入1mL含有1wt％甘露醇的LB培养基恢复培养2小时(28℃，250rpm)。分别取10μL、100μL涂LB平板(利福平50μg/mL，庆大霉素50μg/mL，氯霉素100μg/mL)。

2.植物材料

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型拟南芥Columbia。

3.拟南芥的培养

1)拟南芥种子在4℃进行2-3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花期的提前。

2)将蛭石、黑土、珍珠岩按9∶3∶0.5的比例拌匀，经高温灭菌后装于10cm的塑料小盆，以营养液PNS浸湿待用。

3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22℃暗培养2-3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22℃培养室中进行16小时光照培养。

4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2-10cm(少数已经开花)可用于转化【何玉科，巩振辉，细跑生物学杂志，1991，13(3)：97-101】。

4.拟南芥蘸花法转化

1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约5～10秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22℃培养室低光强度下生长24小时，即可正常培养。

2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花发育的不同时期进行转化，提高转化效率。

3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。

5.拟南芥转化植株种子的筛选

1)称25-30mg种子放入1.5mL离心管。

2)1mL 75wt％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5秒，去上清。

3)加入1mL过滤后的漂白粉消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000rpm离心5秒，去上清。

4)无菌水洗涤3-4次。

5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(Hyg 50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16小时光照培养6天。

6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T1)继续培养，并收集种子进行T2代和T3代筛选。

(二)试验结果：

拟南芥经过蘸花法转化后生长约两个月后，可以正常开花结子，参见图3。

实施例3

本发明的昆虫抗冻肽CFAFP3I基因转化植物后的抗冻分析

(一)试验方法：

将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22℃生长两个星期。然后将野生型和转基因培养皿小苗用于低温抗性实验。将野生型和转基因培养皿小苗在4℃冰箱下培养48小时，然后放到-20℃冷冻30min，然后再放回4℃冰箱放置过夜恢复，第二天再放回培养室恢复培养。结果表明：野生型和转基因拟南芥培养皿小苗的存活率有很大的差异。

(二)试验结果：

经过抗冻处理的转基因与野生型拟南芥的表型差异如图4所示。

附：本发明所涉及的核苷酸/氨基酸序列表：

<110>上海市农业科学院

<120>源于昆虫抗冻肽基因及其制备方法和应用

<160>1

<210>SEQ ID NO 1

<211>327

<212>DNA

<213>昆虫(Choristoneura fumiferana)

<400>1

atgaaatgcc tgatgctcat catggctctt gctatcatta acaccgtcag cagtgacggt  60

acttgcacta acactaacag ccaactgtct gccaacagta agtgtgacaa gagtactctg 120

actaactgtt atgttgacaa gtctgaagtc tatggcacca cctgcactgg ttctcgtttc 180

gatggtgtca ccatcaccag cagcaccagc actggcagtc gtatccttgg tccaggctgt 240

aagatcagca gctgtatcat cactggtggt gttccagctc ctagtgctgc ctgtaagatc 300

agtggctgca ccttctctgc caactaa                                     327

<210>2

<211>108

<212>PRT

<213>昆虫(Choristoneura fumiferana)

<400>2

Met Lys Cys Leu Met Leu Ile Met Ala Leu Ala Ile Ile Asn Thr Val

1               5                   10                  15

Ser Ser Asp Gly Thr Cys Thr Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn

            20                  25                  30

Ser Lys Cys Asp Lys Ser Thr Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser

        35                  40                  45

Glu Val Tyr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ser Arg Phe Asp Gly Val Thr

    50                  55                  60

Ile Thr Ser Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg Ile Leu Gly Pro Gly Cys

65                  70                  75                  80

Lys Ile Ser Ser Cys Ile Ile Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala

                85                  90                  95

Ala Cys Lys Ile Ser Gly Cys Thr Phe Ser Ala Asn

            100                 105

Claims (3)

1.一种源于昆虫抗冻肽基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

2.权利要求1所述的源于昆虫抗冻肽基因的制备方法，其特征在于，是将昆虫抗冻肽中的CFAFP3I基因按照植物偏爱密码进行改造，利用基因合成方法制备而成。

3.权利要求1所述的源于昆虫抗冻肽基因在提高植物的抗冻性中的应用。

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