CN102234319B

CN102234319B - 植物耐逆性相关蛋白GmTPRPK1及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102234319B
Application number: CN 201010161630
Authority: CN
Inventors: 徐兆师; 马有志; 李连城; 陈明
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2030-04-27
Also published as: CN102234319A

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmTPRPK1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。GmTPRPK1在干旱、高盐、ABA、高盐、乙烯等诱导下表达，在低温胁迫下表达受抑制。GmTPRPK1能够提高植物对高盐、干旱的抗性，促进根系的发育。GmTPRPK1能够自磷酸化，定位在细胞核和细胞膜上，分布范围较大。本发明的GmTPRPK1为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白GmTPRPK1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白GmTPRPK1及其编码基因和应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，蛋白激酶在植物胁迫信号的感知、传递的调控中起着重要作用。

到目前为止，已发现的蛋白激酶约有300种左右，分子内都存在一个同源的由约270氨基酸残基构成的催化结构区。在细胞信号传导、细胞周期调控等系统中，蛋白激酶形成了纵横交错的网络。这类酶催化从ATP转移出磷酸并共价结合到特定蛋白质分子中某些丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上，从而改变蛋白质、酶的构象和活性。

目前，在植物中已知的与胁迫相关的蛋白激酶主要有：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶如MAPK(mitogen-activated protein kinase)，CDPK(calcium-dependent proteinkinase)；酪氨酸蛋白激酶如Src家族、Tec家族、ZAP70、家族、JAK家族；还有一种丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸双特异性蛋白激酶，如DYRK相关的蛋白激酶，CDC25等。这三类蛋白激酶均有文献报道参与植物相应外界环境胁迫的信号传导过程，提高植物对外界逆境的适应能力。

根据蛋白激酶的磷酸化氨基酸残基的种类，蛋白激酶可以分为Ser/Thr蛋白激酶，Tyr蛋白激酶以及双特异性Ser/Thr/Tyr蛋白激酶。Ser/Thr蛋白激酶主要包括MAPK，CDPK，JNK等。这种类型的蛋白激酶目前研究的较多，并且在信号传导途径中起重要作用。而酪氨酸蛋白激酶分为两类，一类是非受体型酪氨酸蛋白激酶，以src基因产物为代表，此外还有Yes、Fyn、Lck、Fgr、Lyn、Fps/Fes及Ab1等；另一类是受体型酪氨酸蛋白激酶，根据它们的结构不同，受体型酪氨酸激酶可以分为9种类型。在动物细胞中，酪氨酸蛋白激酶往往参与程序性细胞死亡、癌变等重要细胞行为。

植物中酪氨酸蛋白激酶研究较晚。Maya Mayrose等人的工作表明，西红柿中的双特异性激酶LeMPK3能够提高植物对病原体的抵抗。文献提出，在受到病原体的侵害后，LeMPK3激酶的活性首先提高，然后LeMPK3的mRNA的表达量也短暂的提高。2002年，Parvathi Rudrabhatla等人从花生cDNA文库中得到一个双特异性蛋白激酶，具有丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性。并且发现，该激酶的mRNA表达水平以及激酶活性受到低温和高盐胁迫的诱导。但是其蛋白表达水平却没有明显的变化。在250mM浓度的NaCl处理24h下，STY的mRNA表达水平提高了20倍，在4℃条件下处理24h，其mRNA表达水平提高了50倍左右。在100mMABA处理下，STY表达量没有变化。

目前，在许多植物中都发现蛋白激酶参与抗病，抗逆境等信号传递过程(ParvathiRudrabhatla，2002；Lizhong Xiong，2003)。Parvathi Rudrabhatla等认为，花生中的一种STY激酶参与了花生对非生物胁迫的起始相应，证明了一种非MAPK途径的蛋白激酶级联信号传递过程在非生物胁迫中起重要作用。Lizhong Xiong等人认为，水稻蛋白激酶OsMAPK5能够提高水稻对低温，干旱，高盐以及病害等的抗性。而Jen Sheen认为，钙离子依赖的蛋白激酶CDPK(CDPK1 and CDPK1a)能够激活与植物抗逆境相关基因的启动子，参与植物逆境信号传导过程。Riichiro Yoshida等报道，在拟南芥中ABA诱导的蛋白激酶SnRK2在植物响应脱水胁迫的信号传导过程中起到重要的作用。由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

综合目前的研究结果，蛋白激酶在植物响应逆境胁迫的信号传导途径中占有重要的地位。蛋白激酶通过自身的磷酸化提高或者降低自身的激酶活性，通过磷酸化底物提高或者降低底物蛋白的酶活性，然后底物蛋白又调控下游基因的酶活，形成一个级联调控途径。如RAS信号调控途径，在细胞受体酪氨酸蛋白激酶感受到配体的信号后，形成二聚体并发生自身磷酸化，激活RAS，然后由活化的RAS激活引起蛋白激酶的级联反应。这种级联调控是一种很精密很复杂的调控网络，蛋白激酶可能在上游作为一种开关在行使其功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白GmTPRPK1及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，为一种双特异性蛋白激酶，来源于大豆属大豆(Glycinemax.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中序列1的蛋白质由492个氨基酸残基组成，自氨基端第1位置第7位氨基酸残基序列为N端豆蔻酰化位点，第63位至第312位氨基酸残基序列为保守的的丝氨酸/苏氨酸，酪氨酸蛋白激酶激活区，自氨基端第392位-481位氨基酸残基序列为C端TPR保守区。GmTPRPK1激酶含有11个蛋白激酶共有的保守域(Hanks and Hunter，1995)。激酶保守区从第66位氨基酸到第312位氨基酸，跨度为247个氨基酸。N端的肉豆蔻位点具有膜锚定功能，将蛋白定位在细胞膜内膜上，而C端的TPR保守区的主要功能是协助蛋白相互作用，也有引导蛋白定位在细胞核上的功能。

为了使(a)中的GmTPRPK1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的GmTPRPK1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的GmTPRPK1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第77至1555位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’端第56至1605位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列2所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列2中的cDNA序列由1716个核苷酸组成，开放阅读框架为自5′端第77位到1555位核苷酸。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为pBI121-GmTPRPK1；所述pBI121-GmTPRPK1为将所述基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第56至1605位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的SmalI和Spe I酶切识别位点之间得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物，如拟南芥(如哥伦比亚生态型拟南芥)、烟草(如W38)等。

所述耐逆性具体可为耐旱性和/或耐盐性。

所述耐盐性可体现为：在盐胁迫下，所述转基因植物的根系增长量和/或根长增加值高于所述目的植物。所述耐旱性可体现为：在干旱胁迫下，所述转基因植物的根系增长量和/或根长增加值高于所述目的植物。

扩增所述基因的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

GmTPRPK1在干旱、高盐、ABA、高盐、乙烯等诱导下表达，在低温胁迫下表达受抑制。GmTPRPK1能够提高植物对高盐、干旱的抗性，促进根系的发育。GmTPRPK1表达的蛋白GmTPRPK1能够自磷酸化及磷酸化通用底物MBP。亚细胞定位显示GmTPRPK1定位在细胞核和细胞膜上，分布范围较大。本发明的GmTPRPK1为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为GmTPRPK1与水稻、拟南芥同源蛋白氨基酸序列的同源性比对结果。

图2为GmTPRPK1基因在胁迫诱导表达的实时荧光定量PCR图谱。

图3为分子检测在转基因拟南芥中的目的基因；A：DNA水平检测目的基因，M1为Marker，col0为哥伦比亚生态型拟南芥，其余泳道分别为各个待鉴定植株，具有预期条带的为转基因植株；B：cDNA水平检测目的基因，col0为哥伦比亚生态型拟南芥，其余两个泳道为待鉴定植株，具有预期条带的为转基因植株。

图4为野生型和转基因拟南芥抗旱性比较；A：干旱处理前野生型植株；B：复水一周后的野生型植株；C：干旱处理前转基因植株；D：复水一周后的转基因植株。

图5为野生型和转基因烟草抗盐性差异比较。

图6为野生型和转基因烟草抗旱性差异比较。

图7为GmTPRPK1蛋白自磷酸化(A)及底物磷酸化(B)。

图8为GmTPRPK1亚细胞定位。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、GmTPRPK1的克隆

一、mRNA的分离

将土盆栽培的生长20天左右的大豆品种铁丰8号(购自中国农业科学院作物科学研究所)幼苗用液氮速冻，-80℃保存备用。

采用Trizol法(TianGen)提取大豆叶片总RNA，第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

二、GmTPRPK1基因全长序列的获得

通过5’RACE和3’RACE的方法获得大豆双特异性蛋白激酶基因全长序列。

将序列表的序列1所示的蛋白命名为GmTPRPK1蛋白，由492个氨基酸残基组成，具有保守的双特异性蛋白激酶激活区和TPR结构域。GmTPRPK1的序列在Genabnk上进行比对，与水稻(GeneBank：NP_190971)和拟南芥(GeneBank：NP_175512)中的双特异性蛋白激酶具有较高同源性(图1)，在大豆中发现有12个同源蛋白基因，证明GmTPRPK1是一个双特异性蛋白激酶家族成员之一。将GmTPRPK1蛋白的编码基因命名为GmTPRPK1基因，其开放阅读框架为自序列表的序列2的5′端第77位到1555位核苷酸。

实施例2、实时荧光定量PCR分析GmTPRPK1的表达特性

一、胁迫处理

苗龄为20天的大豆品种铁丰8号幼苗，进行以下处理：

(1)干旱处理(图2A)：将盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)盐渍处理(图2B)：将大豆幼苗置于200mM的由NaCl溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)脱落酸处理(图2C)：将大豆幼苗置于200μM的脱落酸(ABA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(4)冷害处理(图2D)：将大豆幼苗置于4℃培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(5)茉莉酸甲酯处理(图2E)：将大豆幼苗置于50μM的茉莉酸甲酯(JA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(6)乙烯处理(图2F)：大豆幼苗置于含有乙烯的塑料袋中，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(7)水杨酸处理(图2G)：将大豆幼苗置于50μM的水杨酸(SA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(8)高温处理(图2H)：将大豆幼苗置于42℃下，光照培养30分钟、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(9)对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

二、mRNA的分离

采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)进行mRNA的分离。

三.反转录为cDNA

采用R103-Quant_Reverse_Transcriptase(TIANGEN)将纯化的mRNA反转录为cDNA。

四、实时荧光定量PCR

根据GmTPRPK1，在可变区设计特异引物GmTPRPK1realtimeF和GmTPRPK1realtimeR(产物大小为201bp)。以actin为内参基因，引物为actin-2F和actin-2R。

GmTPRPK1realtimeF：5’-TCACCAACCGTGTATGCC-3’；

GmTPRPK1realtimeR：5’-GGTTTCCAGTGTTGTGCC-3’。

actin-2F：5’-acattgttcttagtggtggct-3’；

actin-2R：5’-ctgt tggaaggtgctgag-3’。

GmTPRPK1对各个胁迫及激素表现出不同的响应，见图2。

实施例3、GmTPRPK1提高了拟南芥的耐旱性

一、重组表达载体的构建

1、GmTPRPK1基因的克隆

根据GmTPRPK1基因的序列设计引物对(GmTPRPK1-121F和GmTPRPK1-121R)，引物末端分别引入SmalI和Spe I酶切识别位点，以铁丰8号大豆cDNA为模板PCR扩增GmTPRPK1。

GmTPRPK1-121F：5’-TCCCGGGCGTGTGATTGCACTCTCACCAATG-3’；

GmTPRPK1-121R：5’-TACTAGTCAATGAGGGGAAGTAGAAG-3’。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化1.5Kb左右的条带。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶SmalI和Spe I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶SmalI和Spe I酶切pBI121(Clontech公司购买)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(购自北京天根公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pBI121-GmTPRPK1(在pBI121的SmalI和Spe I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’端第55-1605位核苷酸所示的DNA片段)。

二、转基因植物的获得

1、用重组质粒pBI121-GmTPRPK1转化农杆菌C58(北京拜尔迪生物技术公司购买)，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌接种于LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素)液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；

3、将步骤2的菌液转至LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；

4、收集菌体，4℃、4000g离心10min，用含10％蔗糖MS液体培养基(含0.02％silwet)稀释至OD600约为0.8-1.0；

5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司购买)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子，卡那霉素筛选(浓度为50μg/L卡那霉素)阳性植株。T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。将T₃代植株进行在DNA和cDNA水平鉴定(预期条带均为1550bp)，部分结果见图3。从阳性植株中筛选得到转基因植株(转GmTPRPK1基因植株)。

DNA和cDNA水平鉴定所用的引物对：

GmTPRPK1-121F：5’-TCCCGGGCGTGTGATTGCACTCTCACCAATG-3’；

GmTPRPK1-121R：5’-TACTAGTCAATGAGGGGAAGTAGAAG-3’。

三、转空载体对照植物的获得

用质粒pBI121转化农杆菌，得到重组农杆菌，用重组农杆菌转化拟南芥，得到转空载体对照植株，方法同步骤二。

四、转基因植物的耐旱性鉴定

分别将T₃代转基因植株(Transgenic line)、T₃代转空载体对照植株和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐旱性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将正常生长的萌发15天的幼苗不浇水，直至野生型植株枯萎(4周左右)，然后复水一周，观察表型、拍照并统计存活率。照片见图4。拟南芥Col-0的存活率为22％，67％转基因植株存活且能正常生长。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。

实施例4、GmTPRPK1提高了烟草的耐盐性和耐旱性

一、重组表达载体的构建

同实施例3的步骤一。

二、转基因植物的获得

1、用重组质粒pBI121-GmTPRPK1电击转化农杆菌C58(北京拜尔迪生物技术公司购买)，得到重组农杆菌。

2、接种重组农杆菌于LB培养基(含100mg/ml卡那霉素，50mg/ml利福平，50mg/ml庆大霉素)中，28℃培养1-2天；转接到20mL LB培养基中，28℃继续培养至OD600约0.5；将菌液与MS培养基等体积混合，得到浸泡液。

3、取无菌烟草W38(购自中国农业科学院烟草所)叶片去除叶脉，剪成0.5cm×0.5cm叶片，放入浸泡液中，浸泡10-15min，期间不断轻摇几次。

4、取出材料，用无菌纸吸去多余菌液，MS固体培养基中28℃暗培养2天；

5、用无菌水清洗材料，用无菌纸吸去生长过度的菌体，把材料转接到分化培养基(MS培养基加1mg/ml 6-BA，0.1mg/ml IAA，500mg/ml羧苄和100mg/ml卡那霉素)中，25℃光下培养，每两周换一次培养基，至分化出愈伤组织，直至出芽。

6、将长至1cm的芽转入生根培养基(1/2MS培养基加100mg/ml的卡那霉素)上诱导生根得到转基因植株(T₀代)

三、转空载体对照植物的获得

用质粒pBI121转化农杆菌，得到重组农杆菌，用重组农杆菌转化无菌烟草W38，得到转空载体对照植株，方法同步骤二。

四、转基因植物的耐盐性鉴定

分别将T₀代转基因植株、T₀代转空载体对照植株和野生型植株(W38)(各10株)进行耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将处于相同生长期的幼苗转移到含有NaCl的MS培养基(NaCl浓度为200mM)上生长，作为实验组；将处于相同生长期的幼苗转移到MS培养基上生长，作为对照组。

20天后拍照并测量根长。照片见图5。20天后的根长与移栽前相比，增加的长度，作为植株的根长增加值。转基因的植株根系增加值明显比野生型植株大。在盐胁迫处理下转基因植株的平均根长增加值为1.5cm，而野生型植株的平均根长增加值为0.27cm。转空载体对照植株的平均根长增加值与野生型植株没有明显差异。

五、转基因植物的耐旱性鉴定

分别将T₀代转基因植株和野生型植株(W38)(各10株)进行耐旱性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将处于相同生长期的幼苗转移到含有4％PEG6000的MS培养基上生长，作为实验组；将处于相同生长期的幼苗转移到MS培养基上生长，作为对照组。

20天后拍照并测量根长。照片见图6。20天后的根长与移栽前相比，增加的长度，作为植株的根长增加值。转基因的植株根系增加值明显比野生型植株大。在干旱处理下，转基因植株的平均根长增加值为17cm，而野生型植株的平均根长增加值为7.13cm。转空载体对照植株的平均根长增加值与野生型植株没有明显差异。

实施例5、GmTPRPK1蛋白自磷酸化

一、构建pET-GmTPRPK1原核表达载体

根据已克隆的GmTPRPK1基因的序列设计引物，引物末端分别加BamH1和EcoR I酶切位点，PCR扩增获得编码氨基酸部分的全序列，程序及体系如下：

引物序列：

GmTPRPK1-pET-28a(+)F：5’-AAAGGATCCACCTCCTGCTGCTGCCTCC-3’；

GmTPRPK1-pET-28a(+)R：5’-AAAGAATTCGTTCAGMTTCAGCGTCCGCTGC-3’。

二、原核表达GmTPRPK1蛋白及纯化

将构建好的pET-GmTPRPK1热击转化BL21大肠杆菌，挑取单克隆于5mL LB液体培养基中，230rpm/37℃过夜培养；按1∶50的比例转接至200mL培养基中，230rpm/37℃培养2-3h至OD600到0.6-0.8之间。加IPTG诱导2h。8000rpm/min离心10分钟，弃上清，用lysis buffer重新悬浮细胞，超声破碎。将破碎后的悬浮液16000rpm/min离心30min，取上清，加入30ul His-Ni beads，低温孵育3h，然后700g离心，用wash buffer洗3-5次。

三、GmTPRPK1蛋白自磷酸化

将纯化出来的GmTPRPK1蛋白体外进行磷酸化。

磷酸化Buffer：

40mM Hepes，pH 7.5，20mM MgSO4，10mM MnCl2，1mM

CaCl2，200mM ATP，10 Ci of[γ-³²P]-ATP

反应体系(20ul)：

GmTPRPK1纯化蛋白 9.75ul

10磷酸化Buffer 2ul

[γ-³²P]-ATP 0.25ul

1×PBS 8ul

30℃反应30min，加入5×SDS buffer，进行SDS-PAGE电泳。电泳完成后，压磷屏。底物磷酸化在自磷酸化体系内含5mg/ml MBP 3ul，总体系还是20ul。结果见图7。

实施例6、GmTPRPK1亚细胞定位

一、构建亚细胞定位载体GmTPRPK1-16318GFP

根据GmTPRPK1基因的序列设计引物，引物末端分别加Hind III和Sal I酶切位点，PCR扩增获得GmTPRPK1：

GmTPRPK1-16318GFPF：5’-AAAAAGCTTACCTCCTGCTGCTGCCTCC-3’；

GmTPRPK1-16318GFPR：5’-AAAGTCGACGTTCAGMTTCAGCGTCCGCTGC-3’。

二、基因枪法轰击洋葱表笔细胞进行亚细胞定位

1、材料准备：在9cm培养皿上铺一薄层MS培养基，将洋葱表皮(第五层)撕下后内表面朝上，平铺于MS培养基中心，直径在3cm范围内，22℃预培养4h。

2、金粉的处理：取100mg直径为1.0μm的金粉放入1.5mL离心管中，加入1mL无水乙醇，充分振荡3min，以12000rpm离心1min，去上清，再加入1mL无菌水充分混匀后，以12000rpm离心，重复上述步骤3次。最后，将金粉悬浮于1mL超纯水中，-20℃保存备用。

3、制备微粒子弹：3μg重组质粒DNA加入直径为1.0μm的金粉悬液6μl(50mg/ml)，0.1M亚精胺(spermidine)4μl，2.5M CaCl₂ 6μl，将金粉、DNA、亚精胺和氯化钙先分别振荡混匀，然后混合振荡混匀3min后，冰上静置15min。12,000rpm离心10s(指转速达到12000rpm后10s)，弃上清。加入140μl无水乙醇，粗振荡后(打散金粉)12,000rpm离心10s，收集金粉沉淀。20μl无水乙醇悬浮沉淀，点膜。

4、基因枪轰击受体材料

(1)选用一定压力的可裂膜(本实验用1100psi)，与轰击膜一起，在70％的酒精中浸泡1-2h，取出晾干；

(2)金属挡板用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净工作台紫外灭菌；

(3)取20μl上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不要涂于整个膜上，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后固定在载体固定圈上；

(4)将上述载体固定圈安装到发射装置上；

(5)将可裂膜安装到气体加速管下端；

(6)将洋葱表皮培养皿放入真空室内，取下培养皿盖；

(7)抽真空指针到26In/Hg；

(8)放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破开；

(9)气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金粉-质粒复合体却透过金属挡板的网孔射向靶细胞；

(10)将轰击好的洋葱表皮细胞放入22℃培养箱中，暗培养16~24h后在激光共聚焦显微镜下观察(见图8)。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>植物耐逆性相关蛋白GmTPRPK1及其编码基因和应用

<130>CGGNARY102248

<160>2

<210>1

<211>492

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max.)

<400>1

Met Gly Ala Arg Cys Ser Lys Phe Ser Leu Cys Trp Trp Pro Ser His

1 5 10 15

Leu Lys Ser Asn Leu His Asn Leu Ser Asp Asn Asp Asp Asp Gly Lys

20 25 30

Arg Asp Glu Asn Asp Pro Arg Gly Gly Phe Ser Glu Tyr Ser Leu Asp

35 40 45

Gln Leu Arg Val Ala Thr Ser Gly Phe Ser Pro Asp Asn Ile Val Ser

50 55 60

Glu His Gly Glu Lys Ala Pro Asn Val Val Tyr Arg Gly Met Leu Glu

65 70 75 80

Asp Asp Arg Leu Val Ala Val Lys Arg Phe Asn Lys Ser Ala Trp Pro

85 90 95

Asp Ser Arg Gln Phe Leu Asp Glu Ala Arg Ala Val Gly Gln Leu Arg

100 105 110

Ser Glu Arg Leu Ala Asn Leu Val Gly Cys Cys Cys Glu Gly Glu Glu

115 120 125

Arg Leu Leu Val Ala Glu Phe Met Pro Asn Glu Thr Leu Ser Lys His

130 135 140

Leu Phe His Trp Glu Ala Gln Pro Met Lys Trp Ala Met Arg Leu Arg

145 150 155 160

Val Ala Leu Tyr Leu Ala Gln Ala Leu Glu Tyr Cys Ser Ser Lys Glu

165 170 175

Arg Ala Leu Tyr His Asp Leu Asn Ala Tyr Arg Ile Leu Phe Asp Gln

180 185 190

Glu Ala Asn Pro Arg Leu Ser Cys Phe Gly Leu Met Lys Asn Ser Arg

195 200 205

Asp Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Asn Leu Ala Phe Thr Pro Pro Glu Tyr

210 215 220

Leu Arg Thr Gly Arg Ile Thr Pro Glu Ser Val Val Tyr Ser Phe Gly

225 230 235 240

Thr Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser Gly Lys His Ile Pro Pro Ser His

245 250 255

Ala Leu Asp Leu Ile Arg Gly Lys Asn Phe Leu Leu Leu Met Asp Ser

260 265 270

Cys Leu Glu Ser His Phe Ser Asn Asp Asp Gly Thr Glu Leu Val Arg

275 280 285

Leu Ala Ser Arg Cys Leu Gln Tyr Glu Pro Arg Glu Arg Pro Asn Val

290 295 300

Lys Leu Leu Val Thr Ala Leu Thr Pro Leu Gln Lys Glu Thr Ser Val

305 310 315 320

Pro Ser Asn Val Leu Met Gly Ile Pro Asp Arg Ser Leu Ser Ser Lys

325 330 335

Glu Thr Val Ser Leu Thr Pro Phe Gly Asp Ala Cys Ser Arg Arg Asp

340 345 350

Leu Thr Ala Ile His Glu Ile Leu Glu Lys Ile Gly Tyr Lys Asp Asp

355 360 365

Glu Asp Val Ala Asn Glu Leu Ser Phe Gln Met Trp Thr Asn Gln Ile

370 375 380

Gln Glu Thr Leu Asn Ser Lys Lys Gln Gly Asp Ser Ala Phe His Ala

385 390 395 400

Arg Asp Phe Ser Thr Ala Ile Asp Cys Tyr Thr Gln Phe Ile Asp Gly

405 410 415

Gly Thr Met Val Ser Pro Thr Val Tyr Ala Arg Arg Cys Leu Cys Tyr

420 425 430

Leu Met Asn Asp Met Ala Gln Glu Ala Leu Gly Asp Ala Met Gln Ala

435 440 445

Gln Ser Ile Ser Pro Thr Trp Pro Thr Ala Tyr Tyr Leu Gln Ala Ala

450 455 460

Ala Leu Phe Thr Leu Gly Met Asp Asn Asp Ala Gln Glu Ser Leu Lys

465 470 475 480

Asp Gly Thr Thr Leu Glu Thr Arg Lys Tyr Arg Asn

485 490

<210>2

<211>1716

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max.)

<400>2

aaaaaaaggt ctcattcact cacacacaca caacacaaga caactctttc tctctcgtgt 60

gattgcactc tcaccaatgg gagctcgttg ctctaaattc tctctctgct ggtggccttc 120

ccacctcaag tcaaaccttc acaacttgtc tgataatgat gatgatggga agagggatga 180

gaatgatcct cggggagggt tcagtgagta cagtttggat cagttaagag ttgcaacctc 240

aggattttca cctgacaaca ttgtctcaga gcatggagag aaggctccaa acgttgtcta 300

cagagggatg cttgaagatg ataggttggt tgctgtgaag cgcttcaaca agtctgcttg 360

gcctgattct cgacaattcc tagatgaggc acgtgctgtg gggcagctaa ggagtgaaag 420

attggctaac ttggttgggt gttgctgtga gggagaagag aggttgcttg tggcagagtt 480

catgcccaat gaaactctct caaaacacct ttttcattgg gaagcccagc ctatgaaatg 540

ggcaatgagg ctgagggtgg ccttgtattt agctcaagca ttggaatact gcagcagtaa 600

agaaagggca ttgtaccatg atcttaatgc atatagaatt ttgtttgatc aggaagccaa 660

ccctagactc tcttgttttg gactcatgaa aaacagtagg gatggcagaa gctatagtac 720

aaatttagcc ttcactcctc cagagtactt gaggacagga aggatcaccc ctgaaagtgt 780

agtctacagt tttggcaccc tattgcttgg tcttctgagt ggaaagcata tcccacccag 840

tcatgcactt gaccttatac gaggcaaaaa ttttctgttg ctgatggact catgtttgga 900

aagtcatttt tcaaatgatg atgggactga gttagtgaga ttagcttcac gctgtttaca 960

gtatgaacct cgtgagagac caaatgttaa gttgcttgtg actgctctaa cccctcttca 1020

gaaagaaact tcagtaccat caaatgtttt aatgggcata ccagatagga gtctatcatc 1080

aaaggaaacg gtttcgttga cgccttttgg tgatgcttgt tcaagaagag atctgactgc 1140

aatacatgaa attttggaaa agataggcta caaggatgat gaagatgttg caaatgagct 1200

gtcctttcaa atgtggacaa atcaaataca agaaactcta aattctaaga agcaaggcga 1260

ttctgctttt catgctagag acttctccac ggccattgac tgctatacac aattcatcga 1320

tggtggaact atggtatcac caaccgtgta tgccaggcgc tgcttgtgct acctgatgaa 1380

tgacatggca caagaagcac ttggagatgc catgcaagct caatcaatat ctcccacttg 1440

gcccactgca tactatcttc aagcagctgc tctcttcacc cttggcatgg acaatgatgc 1500

acaggaaagc cttaaagatg gcacaacact ggaaaccagg aagtatagaa attgaaagtt 1560

gaactgtata tagtcttttt cctttcttct acttcccctc attgatcaag caaaattttt 1620

atatatcact tttagctgta tgtagtaatt ttatatgtgc tttagactcc taattgcgat 1680

ggctatggct ccccctgcaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1716

Claims

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2、编码权利要求1所述蛋白的基因。

3、如权利要求2所述的基因，其特征在于：它为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）序列表中序列2自5’端第77至1555位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2自5’端第56至1605位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表中序列2所示的DNA分子。

4、含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

5、如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pBI121-GmTPRPK1；所述pBI121-GmTPRPK1为将权利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒。

6、如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将序列表的序列2自5'端第56至1605位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的SmalI和Spe I酶切识别位点之间得到的重组质粒。

7、一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物；所述目的植物为拟南芥，所述耐逆性为耐旱性。

8、如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述拟南芥为哥伦比亚生态型拟南芥。

9、如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4-6中任一所述重组表达载体导入所述目的植物中。

10、一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物；所述目的植物为烟草，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

11、如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述烟草为烟草品种W38；所述耐盐性体现为：在盐胁迫下，所述转基因植物的根长增加值高于所述目的植物；所述耐旱性体现为：在干旱胁迫下，所述转基因植物的根长增加值高于所述目的植物。

12、如权利要求10或11所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4-6中任一所述重组表达载体导入所述目的植物中。