CN105026564A

CN105026564A - 棉花离子通道类蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN105026564A
Application number: CN201280076370.2A
Authority: CN
Inventors: 崔洪志; 王建胜; 田大翠; 李晓霞; 陈淼
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2032-10-23
Also published as: CN105026564B; WO2014063270A1

Abstract

提供了源自棉花的离子通道蛋白NHX1-2及其编码基因，还提供了NHX1-2在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

Description

棉花离子通道类蛋白及其编码基因和应用技术领域本发明涉及离子通道类蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的离子通道类蛋白 NHX1-2及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。背景技术盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有 4亿公顷，占灌溉农田的 1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约 0. 4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0. 3%以下的土壤上，土壤中过量的 Na⁺会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展（Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53： 1247-1273； Zhang ZL. 2011. Arabidopsis Floral Initiator SKB1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre— mRNA Spl icing through Altering Histone H4R3 and Smal l Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cel l, 23 : 396 - 411 )。高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内，激活转录因子，而激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。发明内容本发明人利用 SSH与 RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个离子通道类蛋白（本文命名为 NHX1-2 ) 的编码基因的 DNA序列。并发现将其导入转基因植株后，可明显改善转基因植株的抗盐性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个离子通道类蛋白 NHX1-2的编码基因，其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图 2所示的 35S-GhNHXl-2-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因、本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。

本发明第七方面提供发明第一方面所述的基因编码的氨基酸序列，如 SEQ ID N0 : 1所示。附图说明图 1是 GhNHXl-2的植物表达载体（35S-GhNHXl-2-2300)的构建流程。

图 2是 GhNHXl-2的植物表达载体（35S-GhNHXl-2-2300)的质粒图。

图 3是 GhNHXl-2转基因 T1代烟草植株（图右， TJ2 ) 和作为对照的非转基因烟草植株（图左）的耐盐模拟实验结果。

图 4是 GhNHXl-2转基因 T1代烟草植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验证结果。 M为 Marker, 1_8为正常生长转基因植株， 9_12为对照植株， 13 为正对照（GhNHXl-2)。具体实施方式下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。实施例 1 盐胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以经 NaCl处理 6h的棉花幼苗的根的 mRNA作为样品（tester), 以未处理的棉花幼苗的根的 mRNA作为对照（ driver )。

( 1 ) 供试材料：

非洲棉（国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号： ZM-06838) 播种到灭过菌的蛭石上，在 25°C、光暗周期 16h/8h条件下培养，每周浇 1/2MS 培养基（9· 39 mM KN0₃， 0. 625 mM KH2P0₄， 10. 3 mM NH₄N0₃， 0. 75 mM MgS0₄， 1. 5 mM CaCl₂, 50 μ Μ ΚΙ , 100 μ Μ ¾Β0₃， 100 M MnS0₄ , 30 μ M ZnS0₄， 1 μ M N¾Mo0₄, 0. 1 M CoCl₂, 100 μ M N¾EDTA, 100 μ M FeS0₄) 一次。当苗株长高达 25-30 cm 时用于实验。

( 2) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组，每组 4株。第一组为对照组，在 25°C、光照下培养，放置到 1/2MS液体培养基中。第二组为处理组， 25°C、光照下培养，放置到添加有终浓度为 200 mM NaCl的 1/2MS液体培养基中，处理 6小时，处理完毕后及时剪取两组幼苗的根，用液氮迅速冷冻后，于 -70°C冰箱中保存。

(3) 总 RNA提取：

分别取对照和 NaCl处理的棉花根 0.5g，用植物 RNA提取试剂盒（invitrogen) 提取棉花的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm禾口 280 nm的吸光度值， 0D260/0D280比值为 1.8-2· 0，表明总 RNA纯度较高，用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen 公司的 Oligotex mRNA 纯化试剂盒 (purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

(4) 抑制消减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交。应用 Clontech的 PCR-Select cDNA Subtraction Kits 差减杂交试剂盒，先将 Driver和 Tester的 mRNA分别反转录，得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester 和 2μ g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsal酶切 1.5 h，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而 Driver cDNA不连接接头。两种连接有不同接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver混合，进行第一次差减杂交。将两种第一次差减杂交的产物混合，再与新鲜变性的 Driver cDNA进行第二次差减杂交，通过两次抑制性 PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。

(5) cDNA消减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物（QIAquick PCR Purification Kit 纯化，购自 Qiagen)与 pGEM_T Easy (购自 Promega试剂盒）载体连接，依照 pGEM_T Easy试剂盒的程序，具体步骤如下：用 200 μ 1 PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ 1，Τ4连接酶缓冲液 5 μ 1， pGEM-T Easy载体 1 μ 1， T4 DNA连接酶 1 μ ΐ ，于 4 °C连接过夜。取 10 μ L 连接反应产物，加入到 100 μ L感受态大肠杆菌 JMI09 (购自 TAKARA)中，冰浴 30 min、热休克 60 s、冰浴 2 min，另加 250 μ L LB培养液（ 1% Tryptone购自 0X0ID, 0.5% Yeast Extract购自 0X0ID, 1% NaCl购自国药）置 37°C水浴中，以 225 r/min 振荡培养 30 min, 取 200 μ L菌液种植于含 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB (同上） /X-gal/IPTG (X-gal/IPTG购自 TAKARA) 培养板上， 37 °C培育 18 h。计数培养板中直径> 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 300个白色菌落 (编号： Gh-S2-001至 Gh-S2-300)。将所有白色克隆挑于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%，于 - 80°C保存备用。以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R (Clontech 公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒自带）进行菌液 PCR扩增，得到 231个阳性克隆，对所有阳性克隆在送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序 ( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将上述 231个差异克隆的 DNA测序，将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后，共得到 203个有效 EST (uni gene)。实施例 2 棉花离子通道类编码基因 GhNHXl-2的克隆

克隆子 Gh-S2-054去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID No: 3，序列分析表明该序列的编码的氨基酸序列属于离子通道类蛋白 NHX1 ,本文将克隆子 Gh-S2-056 编码的全长基因命名为 GhNHXl-2，该基因对应的蛋白命名为 ΝΗΧ1-2。

SEQ ID No: 3

1 ACCATTCTTG GTGTAGTAGC GGGTCTTTTA AGTGCTTTTA TCATAAAAAC ACTTTACTTT

61 GGAAGGCATT CGACAGACCG GGAAGTTGCA CTCATGATGA TCATGGCTTA TTTGTCATAT

121 ATGTTGGCTG AGCTACTGAA TCTCAGTGGG ATTTTGACAG TTTTCTTCTG TGGCATTCTC

181 ATGTCACATT ACACATGGCA TAACGTTACT CAAAGCTCAA GGATAACAAC AAAGCATGCA

241 TTTGCAACAA TGTCATTCAT TGCAGAAACA TTTATATTCC TATATGTTGG CATGGATGCC

301 TTGGACATTG ACAAATGGAA AGCCAGCAGT GCAAGTGCAG GAACTTTTAT TGCTGTCAGC

361 TCAACACTGT TTGCATTGGT GTTAGTTGGA AGGGCAGCAT TTGTGTTCCC TCTAGCAAAC

421 TTCATCAATT GTATTCGTAG ACGAGACGGT TCAAATATCG CGTTTCGAAA ACAGTTTATA

481 ATGTGGTGGG CAGGCCTCAT GAGAGGTGCT GTTACTATTG CACTGTCTTA TAACCAGTTT

541 TCAAATTCCG ATGATAAAGA TACCCAAGAT TCAGCATTGA TGATCACCTC TACCATTATT

601 GTAGTCCTGT TTAGT

GhNHXl-2全长基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列，设计两条特异性引物，作为 3' RACE 的 5' 端特异性引物。

GhNHXl-2 GSP1 : SEQ ID NO: 4：

GGAAGGCATTCGACAGACCGGG GhNHXl-2 GSP2: SEQ ID NO: 5：

ATGTTGGCTGAGCTACTGAATC

实验步骤按试剂盒说明书操作（3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 4与 3' 端引物 AUAP (试剂盒自带），以 mRNA逆转录的 cDNA 为模板进行第一轮 PCR扩增。具体步骤如下： Ex Taq购自 TAKARA, 50 μ 1 PCR 反应体系： 5 μ 1 ΙΟΧΕχ Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA, 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 4禾 P AUAP各 2.0 μ 1，以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58 °C 退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双熘水稀释 50倍后取 2.0 μ 1作为模板，用 SEQ ID NO: 5与 3' 端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下： 50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ ΐ ΙΟΧΕχ Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR 产物， 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5和 AUAP各 2.0 μ 1，以及 35 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72V 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。第二次 PCR产物回收片段约为 1200bp条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA)连接于 pGEM-T Easy Vector, 转化到大肠杆菌 JM109(具体方法同上），随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID N0: 5与 3' 端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增，得到 6个阳性克隆，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 3' 端。

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列，设计三条特异性引物，作为 5' RACE 的 3' 端特异性引物。

GhNHXl-2 GSP3: SEQ ID NO: 6：

TCATGAGGCCTGCCCACCACAT

GhNHXl-2 GSP4: SEQ ID NO: 7：

GTCTACGAATACAATTGATGAA

GhNHXl-2 GSP5: SEQ ID NO: 8：

ACACCAATGCAAACAGTGTTGA 实验步骤按试剂盒说明书操作（5 ' RACE System for Rapid Ampl ification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 7与 5'通用引物 AAP (试剂盒自带），以 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO : 6 )为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下： Ex Taq 购自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2· 5 mM的 dNTP， 2. 0 μΐ mRNA反转录的 cDNA, 1. 0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO : 7和 AAP 各 2. 0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s , 55 °C退火 30 s , 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72 °C 延伸 10 min。所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2. 0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO : 8与 3'端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下： 50 μ1 ΡΟ?反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， 1. 0 μΐ Ex Taq, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO : 8和 AUAP各 2. 0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72 °C 延伸 10 min。第二次 PCR回收片段约为 1200bp条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 pGEM-T Easy Vector, 转化到 JM109 (具体方法同上)，随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37 °C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80 °C保存备用。 SEQ ID N0 : 8 与 3'端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆，送英潍捷基 (上海）贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 5，端。

所得的 5 ' RACE 产物克隆测序后，与 3 ' RACE 产物测序结果拼接。获得

GhNHXl-2的 cDNA序列 SEQ ID NO : 9。

SEQ ID NO : 9：

1 TTCATCTATA GACCTTCACA TATATCCACC ATTGAAATTG CAACTATGTC CCATCTTTCA

61 ACACTCCAAA GTTCATCAGA TTTTCTTAGT ACAACCACCA TAATTGCACT TACCATCTTC

121 TTTTCACTCC TTTGTGCTTG TATCATCATA GGTCACCTAC TTGAAGAGAA CCGGTGGGCT

181 AATGAATCGA TTACAGCACT TCTTTTGGGA TTGTGTGCTG GAGCTGTGGT GTTGTTGGCG

241 AGTAAAGGCA ATAGTTCAAA GATTCTAGTG TTCAGTGAGG ACTTGTTCTT CCTTTATTTG

301 CTTCCTCCAA TCATTTTCAA TGCCGGATTC CAAGTCAAGA AAAAGCAGTT CTTCAAGAAT

361 TTCACAATAA TTTTGATGTT TGGAATATTT GGTACAGTGA TTTCATTCTG CCTCATATCA

421 GTAGGTGCCT TTTTGCTGTT CAACAGAATT GGTGTGACAT CTTTAAATAC TCAAGATTAC

481 TTAGCTGTTG GTGCCATATT GTCAGCAACT GATACTGTGT GTACATTGCA GGTTCTCAGT

541 CAAGATGAAA CACCCTTCCT TTACAGTGTT ATATTTGGGG AAGGAGTGGT GAACGATGCT

601 ACTTCTATCG TGCTTTTCAA TGCAGTTCAA TCACTCGATT TCAACAATAT CGATGCCATG 661 ATATCCTTGA AACTGTTGGG GATTTTTCTT TACCTCTTCT TCACCAGTAC CATTCTTGGT

721 GTAGTAGCGG GTCTTTTAAG TGCTTTTATC ATAAAAACAC TTTACTTTGG AAGGCATTCG

781 ACAGACCGGG AAGTTGCACT CATGATGATC ATGGCTTATT TGTCATATAT GTTGGCTGAG

841 CTACTGAATC TCAGTGGGAT TTTGACAGTT TTCTTCTGTG GCATTCTCAT GTCACATTAC

901 ACATGGCATA ACGTTACTCA AAGCTCAAGG ATAACAACAA AGCATGCATT TGCAACAATG

961 TCATTCATTG CAGAAACATT TATATTCCTA TATGTTGGCA TGGATGCCTT GGACATTGAC

1021 AAATGGAAAG CCAGCAGTGC AAGTGCAGGA ACTTTTATTG CTGTCAGCTC AACACTGTTT

1081 GCATTGGTGT TAGTTGGAAG GGCAGCATTT GTGTTCCCTC TAGCAAACTT CATCAATTGT

1141 ATTCGTAGAC GAGACGGTTC AAATATCGCG TTTCGAAAAC AGTTTATAAT GTGGTGGGCA

1201 GGCCTCATGA GAGGTGCTGT TACTATTGCA CTGTCTTATA ACCAGTTTTC AAATTCCGAT

1261 GATAAAGATA CCCAAGATTC AGCATTGATG ATCACCTCTA CCATTATTGT AGTCCTGTTT

1321 AGTACAGTGG TTTTTGGTTC CATAACCAAA CCATTGATAG AAGCAGTGCT CCTAAGACAT

1381 GCAAAACCAA ATGTTTCAGA TGCTACTGAT ATCCCCAGCC TAGATGACTT GAGAATTATG

1441 TTCATTGAAA ATGGGGAACC AAGTGACATG GGAGAGAATC AACAAGCCGC AGCAGGCCCT

1501 AGGAGGAGTA GTTTGAGGTT GCTATTGACT CATCCAACTT GGACAGTTCA TTACTTATGG

1561 AGAAAATTTG ATGATAGATT CATGAGACCA GTTTTTGGAG GAAGAGGGTT TGTTCCTTTT

1621 GTGCCTGGTT CACCCACTGG TGCCTCTGAT GAAGCTTCAA GAACTTGAAG AACAATCACA

1681 TCTATGTTAC TCTGACTCTT TATAGGTATG AAGATATGAC CTTCTAGAGA TCCTCCTAAT

1741 ACAAGAAGAA AATACAGAAA ATTGAGCATA CTCATATGTG AAGATACACC AGAGTCCCAG

1801 TAACATAGCT ATGTAGGTAT TAAAAGTTAT TTATTTATTT ATTTTATTTT TTGGTTTGTT

1861 GATGATGCTA TAGTAAGTGT TTTTCCTATC CCACTATCAA ATATTATGTT GTTTTTTTTT

1921 TTTTTTGTAA AATAGTGCCA GTGTAGTTAC GAAAGCATCA GCGTACAAGT TTTGTTCAAT

1981 TCTAAGAATA AATAATTATC TTGTGAAAGT CGTGTTAAAA AAAA 根据 GhNHXl-2全长 cDNA序列设计一对引物如下：

GhNHXl-2F_: SEQ ID NO: 10：

ATGTCCCATCTTTCAACACTCC

GhNHXl-2R_: SEQ ID NO: 11：

TCAAGTTCTTGAAGCTTCATCAG

通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆 GhNXHl-2全长。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO : 11各 2. 0 μ 1，以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2. 5倍的无水乙醇， _20°C放置 10分钟，离心，去上清，晾干，用 21 μ ΐ双蒸水溶解。加入 2. 5 μ ΐ ΙΟ Χ Εχ Buffer, 0. 5 μ 1 5 mM的 dATP ， 2. 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Taq。反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到约 1600 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒），连接至 pGEM T-easy 载体上（得到 GhNHXl-2-pGEM质粒），转化 JM109 (方法同上），随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 9与 SEQ ID NO: 10进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID N0: 2，其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

NHX1-2蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MSHLSTLQSS SDFLSTTTI I

21 ALTIFFSLLC ACI I IGHLLE

41 ENRWANESIT ALLLGLCAGA

61 VVLLASKGNS SKILVFSEDL

81 FFLYLLPPI I FNAGFQVKKK

101 QFFKNFTI IL MFGIFGTVIS

121 FCLISVGAFL LFNRIGVTSL

141 NTQDYLAVGA ILSATDTVCT

161 LQVLSQDETP FLYSVIFGEG

181 VVNDATSIVL FNAVQSLDFN

201 NIDAMISLKL LGIFLYLFFT

221 STILGVVAGL LSAFIIKTLY

241 FGRHSTDREV ALMMIMAYLS

261 YMLAELLNLS GILTVFFCGI

281 LMSHYTWHNV TQSSRITTKH

301 AFATMSFIAE TFIFLYVGMD

321 ALDIDKWKAS SASAGTFIAV

341 SSTLFALVLV GRAAFVFPLA

361 NFINCIRRRD GSNIAFRKQF

381 IMWWAGLMRG AVTIALSYNQ

401 FSNSDDKDTQ DSALMITSTI

421 IVVLFSTVVF GSITKPLIEA

441 VLLRHAKPNV SDATDIPSLD

461 DLRIMFIENG EPSDMGENQQ

481 AAAGPRRSSL RLLLTHPTWT

501 VHYLWRKFDD RFMRPVFGGR

521 GFVPFVPGSP TGASDEASRT

541 氺

GhNHXl-2 编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2 1 ATGTCCCATC TTTCAACACT CCAAAGTTCA TCAGATTTTC TTAGTACAAC CACCATAATT

61 GCACTTACCA TCTTCTTTTC ACTCCTTTGT GCTTGTATCA TCATAGGTCA CCTACTTGAA

121 GAGAACCGGT GGGCTAATGA ATCGATTACA GCACTTCTTT TGGGATTGTG TGCTGGAGCT

181 GTGGTGTTGT TGGCGAGTAA AGGCAATAGT TCAAAGATTC TAGTGTTCAG TGAGGACTTG

241 TTCTTCCTTT ATTTGCTTCC TCCAATCATT TTCAATGCCG GATTCCAAGT CAAGAAAAAG

301 CAGTTCTTCA AGAATTTCAC AATAATTTTG ATGTTTGGAA TATTTGGTAC AGTGATTTCA

361 TTCTGCCTCA TATCAGTAGG TGCCTTTTTG CTGTTCAACA GAATTGGTGT GACATCTTTA

421 AATACTCAAG ATTACTTAGC TGTTGGTGCC ATATTGTCAG CAACTGATAC TGTGTGTACA

481 TTGCAGGTTC TCAGTCAAGA TGAAACACCC TTCCTTTACA GTGTTATATT TGGGGAAGGA

541 GTGGTGAACG ATGCTACTTC TATCGTGCTT TTCAATGCAG TTCAATCACT CGATTTCAAC

601 AATATCGATG CCATGATATC CTTGAAACTG TTGGGGATTT TTCTTTACCT CTTCTTCACC

661 AGTACCATTC TTGGTGTAGT AGCGGGTCTT TTAAGTGCTT TTATCATAAA AACACTTTAC

721 TTTGGAAGGC ATTCGACAGA CCGGGAAGTT GCACTCATGA TGATCATGGC TTATTTGTCA

781 TATATGTTGG CTGAGCTACT GAATCTCAGT GGGATTTTGA CAGTTTTCTT CTGTGGCATT

841 CTCATGTCAC ATTACACATG GCATAACGTT ACTCAAAGCT CAAGGATAAC AACAAAGCAT

901 GCATTTGCAA CAATGTCATT CATTGCAGAA ACATTTATAT TCCTATATGT TGGCATGGAT

961 GCCTTGGACA TTGACAAATG GAAAGCCAGC AGTGCAAGTG CAGGAACTTT TATTGCTGTC

1021 AGCTCAACAC TGTTTGCATT GGTGTTAGTT GGAAGGGCAG CATTTGTGTT CCCTCTAGCA

1081 AACTTCATCA ATTGTATTCG TAGACGAGAC GGTTCAAATA TCGCGTTTCG AAAACAGTTT

1141 ATAATGTGGT GGGCAGGCCT CATGAGAGGT GCTGTTACTA TTGCACTGTC TTATAACCAG

1201 TTTTCAAATT CCGATGATAA AGATACCCAA GATTCAGCAT TGATGATCAC CTCTACCATT

1261 ATTGTAGTCC TGTTTAGTAC AGTGGTTTTT GGTTCCATAA CCAAACCATT GATAGAAGCA

1321 GTGCTCCTAA GACATGCAAA ACCAAATGTT TCAGATGCTA CTGATATCCC CAGCCTAGAT

1381 GACTTGAGAA TTATGTTCAT TGAAAATGGG GAACCAAGTG ACATGGGAGA GAATCAACAA

1441 GCCGCAGCAG GCCCTAGGAG GAGTAGTTTG AGGTTGCTAT TGACTCATCC AACTTGGACA

1501 GTTCATTACT TATGGAGAAA ATTTGATGAT AGATTCATGA GACCAGTTTT TGGAGGAAGA

1561 GGGTTTGTTC CTTTTGTGCC TGGTTCACCC ACTGGTGCCT CTGATGAAGC TTCAAGAACT

1621 TGA 实施例 3 GhNHXl-2基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 PCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子，以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择 35S及 Tnos作为 GhNHXl-2基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13以植物表达载体 PBI 121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 PBI 121 , 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2. 0 μ 1 , 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。通过 EcoRI、 Bglll酶切连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 12 ：

GCACGAATTCGGCGGGAAACGACAATCTGA

SEQ ID NO: 13：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO: 12禾 P SEQ ID NO: 13以 PBI121为模板扩增 Tnos，采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5XPS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 PBI121, 1.0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 12禾 P SEQ ID NO: 13各 2.0 μ 1，以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后，72°C 延伸 10 min。通过 KpnI、EcoRI酶切连接到 pCAMBIA2300_l (promega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO: 14：

AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO: 15：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17以 pCAMBIA2300为模板扩增 35S启动子，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5XPS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP, 1.0 μ 1 pCambia2300质粒， 1· 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ 1，以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。通过 HindIII、 Sail酶切连接到 (连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3

SEQ ID NO: 16：

ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG SEQ ID NO: 17：

TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT SEQ ID NO : 18和 SEQ ID NO : 19扩增 GhNHXl_2 (模板是实施例 2所获得的 GhNHXl-2-pGEM质粒），采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR 反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP, 1. 0 μ 1 GhNHXl-2-pGEM 质粒， 1. 0 μ ΐ PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 18禾 P SEQ ID NO : 19各 2. 0 μ ΐ，以及 31 μ ΐ 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。通过 Kpnl、 Sai l酶切连接到（连接方法同上） pCAMBIA2300_3，获得植物表达载体 35S- GhNHXl- 2- 2300。

SEQ ID NO : 18：

TGAGTCGACATGTCCCATCTTTCAACACTCC SEQ ID NO : 19：

AAGGGTACCTCAAGTTCTTGAAGCTTCATCAG 实施例 4 35S-GhNHXl-2-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc ) 感受态制备：提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜（约 12-16 h) 至 0D600值为 0. 4，形成种子菌液。取 5 ml活化后的菌液（1 : 20的比例）接种于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2. 5 h至 0D₆。。=0. 8。冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10 min, 弃上清液；加入一定量预冷 10%甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀；用 10%甘油重复洗 3_4次；加入适量冰浴预冷的 10% 甘油重新悬浮细菌沉淀，以 40 μ ΐ/管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往 40 μ 1的感受态细胞中加入 1 μ 1 的质粒，混匀后冰浴约 10 min。将感受态和 DNA的混合物用枪转移到预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯（购自 bio-rad) 放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用 0. lcm的电击杯的时候， MicroPulser (购自 bio-rad)的程序设置为 "Agr" ，电击一次。立即取出电击杯，加入 28°C预热的 LB培养基。快速而轻柔的用枪将细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 28°C， 225 rpm培养 1 h。取 100〜200 μ 1的菌液涂布与相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 g/ml利福平、 50 y g/ml链霉素、 50 μ g/ml卡那霉素）， 28°C培养。实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子（国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号 I5A00660) 30 s，用灭菌双蒸水洗两次。再用 0.1%升汞浸泡 8 min，用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于 MS( 18.78 mM KN0₃, 1.25 mM KH₂P0₄， 20.6 mM N N0₃， 1.5 mM MgS0₄， 3.0 mM CaCl₂， 50 μ M KI， 100 μΜ Η₃Β0₃， 100 μ M MnS0₄ , 30 μ M ZnS0₄， 1 μ M N¾Mo0₄， 0.1 μΜ CoCl₂, 100 μ M N¾EDTA, 100 μ M FeS0₄， 7.4 g/L琼脂，蔗糖 30 g/L) 上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成 5 mmX5 mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体 35S-GhNHXl-2-2300的农杆菌浸染叶盘 10 min, 吸干菌液，在黑暗条件下共培养 2天（MS培养基）。将叶片转到分化培养基（MS+1 mg/L细胞分裂素（BA) +0.1 mg/L萘乙酸（NAA) +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素）上，光照条件下培养 45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基（MS+50 mg/L 卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素）中培养 30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有 500 mg/L头孢霉素的 MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法），用 SEQ IDN0: 9: 禾口 SEQ IDN0: 10 (50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 10 X Ex Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 DNA, 1.0 μ 1 Ex Taq、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10各 2.0 μ 1，以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min， 33个循环后， 72V 延伸 10 min)， PCR鉴定，保存阳性植株进行编号 T。Y1_T。Y20。实施例 6 过表达 GhNHXl-2转基因烟草 T1的耐盐模拟实验及功能鉴定将灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T。Y1-T。Y20及对照烟草种子分别播种在蛭石上，每盆播种 15颗种子， 25°C、 14小时光培养 /10小时暗培养循环，每 5天浇一次 1/2MS, 培养 25天之后， SEQ ID NO : 10禾 P SEQ ID NO: 11做 PCR检测，去除阴性植株。选取大小一致的转基因烟草及对照烟草做耐盐实验，每盆保留大小较一致的 4-5颗苗。转基因烟草、对照烟草浇含有 200mM NaCl的 1/2MS, 25°C、 14小时光培养 /10小时暗培养循环。 14天后观察结果， T1代转基因植株的耐盐性鉴定表明，对照植株都不能正常生长，而 T\Y2、 T\Y6、 T\Y7、 T\W14、 T\W15 五个株系共 19棵烟草能够正常生长，表现出明显的耐盐性（参见图 2，以 TJ2 为例， Ί\Υ6、 Ί\Υ7、 Ί\Υ14、 Ί\Υ15的结果与 Ί\Υ2类似，在此未示出）。实施例 7 在转录水平上验证 NHX1-2蛋白表达

实施 6中 T\Y2、 T\Y6、 T\Y7、 T\W14、 T\W15正常生长 Tl代植株随机选取 8棵，实施 6中对照植株随机选取 4棵，用植物 RNA提取试剂盒（invitrogen) 提取的总 RNA。紫外分光光度测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA浓度。依照 invitrogen反转录试剂盒 Superscript II I Reverse Transcriptase所不方法进行反转录（1 μ g总 RNA作为模板，反转录引物 SEQ ID NO: 11 )。通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 20扩增 GhNHXl_2，检测 NHXl-2蛋白相对表达情况。采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR 反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID N0: 20和 SEQ ID NO: 10各 2. 0 μ 1，以及 30 μ 1 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin， 28个循环后， 72°C 延伸 10 min。产物电泳结果如图 4所示： M 为 DNA Ladder Marker (DL2000,购自深圳瑞真生物技术有限公司）， 1_8为正常生长转基因植株， 9-12为对照植株， 13为正对照（GhNHXl-2， SEQ ID NO: 2)。图中所示条带大小与正对照大小一致。结果表明正常生长转基因植株对 GhNHXl-2转录较强，对照植株没有转录。

SEQ ID NO: 20 : GCTTCATCAGAGGCACCAGTGG

Claims

权利要求书

1. 棉花的一个离子通道类蛋白编码基因，其序列为 SEQ ID NO: 2。

2. —种重组表达载体，其含有权利要求 1所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。

3. 权利要求 2所述的载体，其为附图 2所示的 35S-GhNHXl-2-2300载体。

4. 一种重组细胞，其含有权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

5. 一种改善植物耐盐性的方法，包括：将权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达;优选地，所述植物是烟草。

6. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 1所述的基因或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体的植物或植物组织。

7. 权利要求 6所述的方法，其中所述植物是烟草。

8. 权利要求 1所述的基因、权利要求 2或 3所述的重组表达载体或者权利要求 4所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途。

9. 权利要求 8所述的用途，其中所述植物是烟草。

10. 权利要求 1所述的基因编码的蛋白，其序列如 SEQ ID NO: 1所示。