PL194895B1

PL194895B1 - Sposób poprawiania żywieniowego profilu rośliny i genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne

Info

Publication number: PL194895B1
Application number: PL342736A
Authority: PL
Inventors: Wilfred A. Keller; Raju S.S. Datla; Jin-Zhuo Dong; Fawzy Goerges; Atta A.K. Hussain; Gopalan Selvaraj
Original assignee: Nat Research Council
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 2007-07-31
Also published as: JP2002502587A; CA2318887C; EP1049785A2; RO122151B1; CN1292822A; AU2146199A; BR9907223A; RU2260050C2; WO1999037786A2; KR100816113B1; CN1246461C; HUP0100315A3; CA2318887A1; KR20010040379A; WO1999037786A3; PL342736A1; AU763969B2; HUP0100315A2; TR200002166T2; US6703539B1

Abstract

1. Sposób poprawiania zywieniowego profilu rosliny, znamienny tym, ze obejmuje etapy w których dostarcza sie sekwencje nukleotydowa kodujaca enzym modyfikujacy wykorzystanie substratu posredniego we wtórnym szlaku metabolicznym zwiazanym zzywieniowym profilem rosliny, przy czym enzym jest inny niz enzymy wystepujace naturalnie we wtórnym szlaku metabolicznym, nastep- nie komórki rosliny transformuje sie kaseta ekspresyjna zawierajaca te sekwencje nukleotydowa funk- cjonalnie polaczona z promotorem specyficznym dla nasion, po czym z komórek roslinnych uzyskuje sie genetycznie zmieniona rosline, która ma poprawiony profil zywieniowy w porównaniu do rosliny typu dzikiego. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Niniejsze zgłoszenie jest częściową kontynuacją amerykańskiego zgłoszenia, patentowego nr 09/012453 i stanowi pierwszeństwo zastrzeżeń z tymczasowego zgłoszenia nr 60/072156.

Wynalazek dotyczy sposobu poprawiania żywieniowego profilu rośliny i genetycznie zmienionych komórek rośliny, nasion lub komórek potomnych obejmujących zrekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego stabilnie włączoną w genom tej komórki. Przedmiotem wynalazku jest ponadto karma dla zwierząt zawierająca genetycznie zmienioną roślinę, komórki roślinne lub nasiona i ich potomstwo obejmujące zrekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego stabilnie włączoną w genom tej komórki.

Rośliny wytwarzają wiele związków drogą wtórnego metabolizmu. Jakkolwiek nie są one uważane za istotne dla metabolizmu roślin, to we wtórnych szlakach metabolicznych często rośliny produkują unikalne związki biochemiczne, z których niektóre uważa się za przeciwżywieniowe albo nawet toksyczne. Wtórne szlaki metaboliczne i związki wytwarzane w tych szlakach są specyficzne dla indywidualnego gatunku albo rodzaju rośliny. Zatem w wyniku modyfikacji wtórnych szlaków metabolicznych można otrzymać nowe układy związków biochemicznych albo uzyskać tkankę roślinną o zmienionym składzie produktów metabolizmu wtórnego. W szczególności modyfikacja wtórnych szlaków metabolicznych prowadząca do zmiany wtórnych metabolitów, które mają naturę przeciwżywieniową albo toksyczną, możne znaleźć zastosowanie w produkcji żywności i pasz.

Ważne jest, aby modyfikacja wtórnego metabolizmu nie powodowała zmian w procesach biochemicznych uważanych za podstawowe dla wzrostu i przeżycia komórek roślinnych. Procesy biochemiczne i związki będące substratami lub produktami tych procesów, istotne dla wzrostu i przeżycia rośliny, określa się jako pierwotne szlaki metaboliczne i ich produkty. Uważa się, że metabolizm pierwotny obejmuje te procesy biochemiczne, które prowadzą do tworzenia się podstawowych cukrów (takich jak glukoza), aminokwasów, kwasów tłuszczowych, nukleotydów i pochodzących z nich polimerów (odpowiednio: polisacharydów, np. skrobi, białek, lipidów, cząsteczek RNA i DNA, itd., Yeoman i Yeoman, Tansley Review nr 90, Manipulating Secondary Metabolism in Cultured Plant Cells w New Phytologist, 134:553-569, 1996.

Zatem, zgodnie ze stanem techniki, przyjmuje się, że pierwotny metabolizm obejmuje te procesy metaboliczne, które są istotne dla przeżycia i wzrostu wszystkich komórek roślinnych, natomiast jako metabolizm wtórny można określić te procesy biochemiczne, które nie są krytyczne dla wszystkich komórek roślinnych. Na przykład wtórne szlaki metaboliczne wyznaczają takie cechy rośliny jak barwa, morfologia i jej smak, itp. W wyniku metabolizmu wtórnego wytwarzanych jest szereg związków, które są rozpoznawane przez owady albo biorą udział w reakcji rośliny na atak patogenu. Niektóre z tych związków mogą być korzystne dla wzrostu i rozprzestrzeniania się roślin pewnych gatunków w warunkach naturalnych, lecz w uprawie związki te mogą niekorzystnie wpływać na jakość zebranego produktu albo mogą ograniczać zakres jego wykorzystywania. Niektóre wtórne metabolity są szczególnymi związkami, wytwarzanymi jedynie przez roślinę określonego gatunku w wyniku wyewoluowania wyspecjalizowanych szlaków biochemicznych. W przeciwieństwie do metabolizmu pierwotnego, który charakteryzuje się dużą liczbą różnych szlaków biochemicznych prowadzących do tego samego produktu, produkty metabolizmu wtórnego są wytwarzane w roślinie w pojedynczych szlakach metabolicznych. Typowo metabolity wtórne są bardziej specyficzne dla roślin niż wszechobecne związki biochemiczne, będące produktami metabolizmu pierwotnego.

W wyniku licznych prób modyfikacji pierwotnych szlaków metabolicznych uzyskano komórki roślinne o zmienionej zawartością skrobi albo oleju (lipidy). Jednak można się spodziewać, że nadmierne modyfikowanie szlaków metabolizmu pierwotnego doprowadzi do śmierci rośliny. Na przykład można zmienić skład lipidów, lecz całkowita eliminacja lipidów prowadziłaby oczywiście do śmierci komórek. Zmiana metabolizmu pierwotnego nie zawsze kończy się pełnym powodzeniem, ponieważ inne mechanizmy biochemiczne mogą przejąć funkcje zmodyfikowanych szlaków metabolicznych i próba zakończy się fiaskiem. Zatem często bardzo trudne jest uzyskanie zmienionych pierwotnych szlaków metabolicznych w roślinach w sposób przewidywalny, użyteczny i dający zamierzone efekty w uprawie.

W pewnych przypadkach udało się zmodyfikować metabolizm pierwotny z powodzeniem, uzyskując nowy fenotyp, który reprezentuje raczej zmianę składu metabolitów pierwotnych niż zmniejszenie zawartości albo wyeliminowanie specyficznej substancji. Takie modyfikacje przeprowadzono typowo drogą ektopowej ekspresji genu roślinnego, takiej jak nadekspresja genu w pewnych tkankach,

PL 194 895 B1 raczej w sposób konstytutywny niż w sposób regulowany, albo drogą hamowania aktywności specyficznego genu przez antysensowny RNA, rybozymy albo metodą kosupresji. Jednak trudno było przewidzieć a priori wyniki takich modyfikacji.

Ekspresję enzymu roślinnego można modyfikować na wielu poziomach. Obejmuje to regulację na poziomie ekspresji genów, translacji, obróbki białka i allosterycznej regulacji funkcji białka. Zatem ektopowa ekspresja genu roślinnego biorącego udział w metabolizmie pierwotnym może nie przezwyciężyć złożonych biochemicznych kontroli regulacji metabolizmu pierwotnego. Co więcej, trudną do pokonania przeszkodą w takich modyfikacjach jest obecność (ze względu na ich znaczenie dla wzrostu i przeżycia roślin) równoległych, nadmiarowych szlaków metabolizmu pierwotnego. Zgodnie z powyższym wszelkie wysiłki prowadzące do zmiany pierwotnego metabolizmu i uzyskania przewidywanego fenotypu często zawodzą. Co więcej, ocena takich zmodyfikowanych roślin na poziomie uprawy polowej albo w różnych skrajnych warunkach środowiskowych prowadziła często do stwierdzenia, że brak jest przewidywanego efektu albo wydajność produkcji roślinnej jest obniżona. Zatem przy modyfikacji pierwotnego metabolizmu należy drobiazgowo rozważyć szlak metabolizmu pierwotnego albo określonego etapu w szlaku, aby uzyskać specyficzny fenotyp.

Trudności w modyfikowaniu wtórnych szlaków metabolicznych wynikają ze słabego rozumienia procesów biochemicznych zachodzących we wtórnych szlakach metabolicznych, niedostatecznej wiedzy o ekspresji genów we wtórnych szlakach metabolicznych oraz ogólnie ze złożonych współzależności pomiędzy szlakami biochemicznymi.

Jednak sposoby modyfikacji wtórnego metabolizmu mogą stanowić cenny środek uzyskiwania nowych fenotypów, takich jak fenotypów o zmienionych poziomach wtórnych metabolitów, na przykład związków uważanych za przeciwżywieniowe. Stąd wtórne szlaki metaboliczne są ważne w uzyskiwaniu roślin modyfikowanych genetycznie.

Przedmiotem badań prowadzących do zmiany poziomów produktów końcowych w roślinach są dwa biochemiczne szlaki, które uważa się za wtórne szlaki metaboliczne. Sposoby stosowane do modyfikacji tych szlaków nie dały pożądanych wyników. Przykładem może być szlak fenylopropanoidowy, uważany za wtórny szlak metaboliczny, który bierze udział w tworzeniu ligniny. Biosynteza ligniny jest częścią podstawowego fenylopropanoidowego szlaku biosyntezy, w którym wytwarzane są co najmniej trzy pierwotne prekursory fenolowe, a mianowicie kwas kumarowy, ferulowy i synapowy, których produkty polimeryzują do ligniny i innych związków fenolowych.

Próby zmiany wtórnego metabolicznego szlaku fenylopropanoidowego doprowadziły do zidentyfikowania genów kodujących wiele enzymów biorących udział w tworzeniu się monomerów ligniny. Ograniczenie ekspresji tych genów z wykorzystaniem techniki antysensowej lub kosupresji może doprowadzić do zmniejszenia produkcji ligniny (na przykład jak opisano w amerykańskich opisach patentowych opublikowanych pod nr US 5451514, US 5633439, WO 93/05160, WO 94/08036). Do tych genów należą geny kodujące dehydrogenazę alkoholu cynamonowego, O-metylo-transferazę kwasu kofeinowego i amoniakoliazę fenyloalaniny. Obniżenie poziomu ligniny w roślinie uważa się za korzystne, gdyż niższy poziom ligniny ułatwia przetwarzanie i trawienie rośliny przez zwierzęta.

Jednak zmniejszenie produkcji ligniny w wyniku zahamowania ekspresji jednego z genów w szlaku fenylopropanoidowym techniką antysensową albo kosupresyjną na może mieć szereg niepożądanych skutków, na przykład może prowadzić do zwiększonej podatności na choroby, zmienionej szybkości wzrostu albo zmniejszenia fizycznej wytrzymałości włókien rośliny, a zatem do zmniejszenia jej wydajności agronomicznej. Wykazano, że hamowanie aktywności enzymatycznej amoniakoliazy fenyloalaniny prowadzi do licznych niepożądanych fenotypów (Elkind i wsp., Abnormal Plant Development and Down-Regulation of Phenylpropanoid Biosynthesis in Transgenic Tobacco Containing a Heterologous Phenylalanine Ammonia Lyase Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9057-9061, 1990). Enzym, amoniakoliaza fenyloalaniny, działa na pierwotny metabolit, aminokwas tj. fenyloalaninę. Wyniki tych doświadczeń pokazują, że zmiana wtórnego metabolizmu drogą modyfikacji jednego z pierwotnych metabolitów, biorącego udział określonym wtórnym szlaku metabolicznym, może prowadzić do niepożądanych i uszkodzonych fenotypów. Zgodnie z powyższym, wybór etapu biochemicznego (etapów biochemicznych) we wtórnym szlaku metabolicznym jest decydujący przy wytwarzaniu roślin fenotypowo normalnych, lecz wykazujących niższy poziom produkcji określonego wtórnego metabolitu. Co więcej, zastosowanie antysensowego RNA albo kosupresji, może nie zapewnić obniżonego poziomu ani specyficzności zmniejszenia wtórnego metabolitu, który jest żądany z handlowego punktu widzenia. Ponadto hamowanie ekspresji genów kodujących aktywność kluczowych enzymów może wpływać na ekspresję genów pokrewnych. Zatem wykorzystanie poczyniono

PL 194 895 B1 niewielki postęp, w dziedzinie obniżania zawartości w komórkach roślinnych związków fenolowych, uważanych za związki przeciwżywieniowe, albo ligniny, wykorzystując antysensowe RNA albo technikę kosupresji bez towarzyszących im szkodliwych skutków ubocznych.

Drugim przykładem są wysiłki mające na celu modyfikację szlaku biosyntezy glukozynolanu w roślinie rzepaku canola, które zakończyły się niepowodzeniem. Przedstawiono próby modyfikacji zawartości glukozynolanu w śrucie z nasion rzepaku canola drogą modyfikacji szlaku glukozynolanowego. Jeden z zaproponowanych sposobów modyfikacji biosyntezy glukozynolanów polegał na stworzeniu nowego szlaku, który konkuruje o siarkę wykorzystywaną przy wytwarzaniu glukozynolanów, albo na obniżeniu poziomu tryptofanu wykorzystywanego przy wytwarzaniu glukozynolanów drogą przekształcenia tryptofanu w tryptaminę (Ibrahim, Chavadej i De Luca „Engineering Altered Glucosinolate Biosynthesis by Two Alternative Strategies”, opublikowany w: Genetic engineering of plant secondary metabolism 1994, Plenum Publishing Corporation, Nowy Jork, USA). Jednakże stosując ten sposób nie udało się zmniejszyć zawartości glukozynolanu w śrucie z nasion rzepaku canola. Sposób nie doprowadził do zmniejszenia przeciwżywieniowej zawartości glukozynolanów w śrucie z nasion rzepaku canola. Glukozynolany są wytwarzane w liściach rośliny, a następnie transportowane do nasion. Stąd opisane rozwiązanie opierało się na przekonaniu, że prosta zmiana dostępności jednego z pierwotnych metabolitów (siarka, aminokwas tj. tryptofan) wykorzystywanych do wytwarzania glukozynolanów zmniejszy ich produkcję. Jednak pierwotne glukozynolany w nasionach są glukozynolanami alifatycznymi, w przypadku których aminokwas, tryptofan, nie jest wykorzystywany do wytwarzania łańcuchów bocznych. Co więcej, wyniki tych doświadczeń (na przykład Chavadej i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2166-2170, 1994) wykazały, że rośliny transgeniczne, które zawierały enzym zdolny do przekształcenia w nasionach, pierwotnego aminokwasu, tryptofanu, nie zawierały w nasionach zredukowanych glukozynolanów, a zawartość alifatycznych glukozynolanów alifatycznych w nasionach była taka sama albo nawet większa niż w roślinach nietransgenicznych. Zatem całkowita wytworzona ilość glukozynolanów w nasionach nie była mniejsza, mimo, że ilość jednego składnika (indologlukozynolany) wydawała się mniejsza. Z badań genetycznych wynika, że rośliny o niskiej zawartości glukozynolanów można otrzymać drogą konwencjonalnej selekcji oraz że istnieje szereg centrów regulujących niższe zawartości glukozynolanów w roślinach krzyżowych. W syntezie glukozynolanów występują liczne przekształcenia biochemiczne i etapy te wspólnie ze wszystkimi albo większością syntez glukozynolanów są etapami, które muszą być zmodyfikowane, aby uzyskać sposób zmniejszania całkowitej ilości glukozynolanów. Zatem przy opracowywaniu sposobu modyfikacji wytwarzania glukozynolanów w roślinach krzyżowych należy wziąć pod uwagę różne enzymy i substraty wykorzystywane w biosyntezie glukozynolanów, aby sposób ten był użyteczny.

Wydaje się jednak, że enzymy wykorzystywane do uzyskania tej modyfikacji wpływały także na poziom pierwotnych metabolitów (aminokwas tryptofan i siarka mineralna), zatem jak można się było spodziewać, każda znacząca zmiana poziomu tych związków w komórce roślinnej, mogłaby mieć szkodliwy wpływ. Zgodnie z powyższym zaproponowany sposób nie sprawdził się praktycznie w modyfikacji wtórnego szlaku metabolicznego. W rzeczywistości można spodziewać się, że zmiana poziomu tryptofanu jest niekorzystna. Zatem zmiana poziomów pierwotnego metabolitu nie daje zamierzonego skutku w postaci śruty z nasion rzepaku canola o niskiej zawartości glukozynolanów, co jeszcze podkreśla trudność modyfikowania pierwotnego metabolizmu.

Zgodnie z powyższym ogólny sposób modyfikacji wtórnego metabolizmu będzie cennym sposobem zmiany składu biochemicznego tkanek roślinnych. Sposób ten można stosować na przykład w celu zmniejszenia zawartości związków przeciwżywieniowych, zmiany wtórnych profili metabolicznych, nadania tkance roślinnej zmienionej charakterystyki przetwarzania, zmiany poziomów związków wykorzystywanych w przemyśle albo interesujących z punktu widzenia farmaceutycznego, wytwarzania roślin o zmodyfikowanym smaku, układzie włókien albo wyglądzie, wytwarzania roślin ze zmienionymi wtórnymi metabolitami, przyciągającymi owady, odpornych na choroby albo uzyskania innych procesów biologicznych, na które wpływają wtórne metabolity, albo roślin o charakterystyce wzrostu zmodyfikowanej przez zmiany wtórnych metabolitów.

Przedmiotem wynalazku jest sposób poprawiania żywieniowego profilu rośliny, który charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy w których dostarcza się sekwencję nukleotydową kodującą enzym modyfikujący wykorzystanie substratu pośredniego we wtórnym szlaku metabolicznym związanym z żywieniowym profilem rośliny, przy czym enzym jest inny niż enzymy występujące naturalnie we wtórnym szlaku metabolicznym, następnie komórki rośliny transformuje się kasetą ekspresyjną zawierającą tę sekwencję nukleotydową funkcjonalnie połączoną z promotorem specyficznym dla nasion,

PL 194 895 B1 po czym z komórek roślinnych uzyskuje się genetycznie zmienioną roślinę, która ma poprawiony profil żywieniowy w porównaniu do rośliny typu dzikiego. Korzystnie wtórnym szlakiem metabolicznym jest szlak fenylopropanoidu, a enzymem metabolicznym jest enzym metabolizujący cholinę, taki jak oksydaza cholinowa. Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem kaseta ekspresyjna zawiera również sekwencję nukleotydową kodującą dehydrolazę aldehydu betainy przekształcającą aldehyd betainy w betainę.

W innym korzystnym rozwiązaniu enzym działa na kwas ferulowy, korzystnie taki jak dekarboksylaza kwasu ferulowego.

Korzystnie wtórnym szlakiem metabolicznym jest wtórny szlak metaboliczny alkoholu wielowodorotlenowego, przy czym substrat jest wybrany z grupy obejmującej mioinozytol, galaktynol i pochodne UDP cukrów, przy czym najkorzystniej substratem jest mioinozytol, a enzymem - transferaza mio-inozytolo-O-metylu. Korzystnie transferaza mio-inozytolo-O-metylu ma sekwencję aminokwasową transferazy mio-inozytolo-O-metylu z Mesembryanthemum crystallinum.

W korzystnych rozwiązaniach w sposobie według wynalazku poprawiony profil żywieniowy rośliny obejmuje obniżenie względem rośliny typu dzikiego, poziomu kwasu fitynowego albo poziomu synapiny albo poziomu ligniny.

Korzystnie substrat jest inny niż metabolit pierwotny wybrany z grupy obejmującej: glukozę, aminokwasy, typowe kwasy tłuszczowe i nukleotydy, a promotorem specyficznym dla nasion jest promotor fazeolinowy lub promotor napinowy. W innym korzystnym rozwiązaniu sposób według wynalazku obejmuje dodatkowy etap hodowli genetycznie zmienionej rośliny w warunkach umożliwiających tworzenie i uzyskiwanie nasion. Roślina w sposobie według wynalazku korzystnie jest wybrana z grupy obejmującej Dicotyledoneae i Monocotyledoneae albo z rodziny Brassicaceae, korzystnie rodziny Brassica, gatunku Brassica rapa lub Brassica napus. Korzystniej roślina jest wybrana z grupy obejmującej: kukurydzę, rzepak canola, pszenicę, grykę, lucernę siewną, soję i sorgo.

W innej odmianie przedmiotem wynalazku są genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne, obejmujące zrekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego stabilnie włączoną w genom tej komórki, gdzie zrekombinowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera:

promotor specyficzny dla nasion, sekwencję kwasu nukleinowego funkcjonalnie połączoną z promotorem specyficznym dla nasion, kodującą enzym modyfikujący wykorzystanie substratu pośredniego we wtórnym szlaku metabolicznym związanym z żywieniowym profilem rośliny, przy czym enzym jest inny niż enzymy występujące naturalnie we wtórnym szlaku metabolicznym.

Korzystnie w genetycznie zmienionych komórkach rośliny, nasion lub komórkach potomnych wtórnym szlakiem metabolicznym jest szlak fenylopropanoidu, korzystniej enzymem metabolicznym jest enzym metabolizujący cholinę, a enzymem metabolizującym cholinę jest oksydaza cholinowa. Korzystnie kaseta ekspresyjna zawiera również sekwencję nukleotydową kodującą dehydrolazę aldehydu betainy do przekształcania aldehydu betainy w betainę.

W innym korzystnym rozwiązaniu genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne sekwencja kwasu nukleinowego obejmuje gen kodujący enzym działający na kwas ferulowy, korzystnie enzymem jest dekarboksylaza kwasu ferulowego. W kolejnym korzystnym rozwiązaniu wtórnym szlakiem metabolicznym jest wtórny szlak metaboliczny alkoholu wielowodorotlenowego.

Korzystnie genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według wynalazku zawierają sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą enzym modyfikujący wykorzystanie substratu, który jest wybrany z grupy obejmującej mio-inozytol, galaktynol i pochodne UDP cukrów, korzystniej substratem jest mio-inozytol.

W genetycznie zmienionych komórkach rośliny, nasion lub komórkach potomnych według wynalazku enzymem jest transferaza mio-inozytolo-O-metylu, korzystniej transferaza mio-inozytolo-O-metylu ma sekwencję aminokwasową transferazy mio-inozytolo-O-metylu z Mesembryanthemum crystallinum.

Korzystnie genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według wynalazku zawierają sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą enzym modyfikujący wykorzystanie substratu, który jest inny niż metabolit pierwotny wybrany z grupy obejmującej: glukozę, aminokwasy, typowe kwasy tłuszczowe i nukleotydy.

W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne zawierają fazeolinowy lub napinowy promotor specyficzny dla nasion.

PL 194 895 B1

W jeszcze inny rozwiązaniu w komórkach według wynalazku poprawiony profil żywieniowy rośliny obejmuje obniżenie względem rośliny typu dzikiego, poziomu kwasu fitynowego, albo poziomu synapiny, albo poziomu ligniny.

Korzystnie roślina jest wybrana z grupy obejmującej Dicotyledoneae i Monocotyledoneae, korzystniej z rodziny Brassicaceae, korzystnie rodziny Brassica, gatunku Brassica rapa lub Brassica napus, albo roślina jest wybrana z grupy obejmującej: kukurydzę, rzepak canola, pszenicę, grykę, lucernę siewną, soję i sorgo.

W kolejnej odmianie przedmiotem wynalazku jest karma dla zwierząt zawierająca genetycznie zmienioną roślinę, komórki roślinne lub nasiona i ich potomstwo obejmujące zrekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego stabilnie włączoną w genom tej komórki, gdzie zrekombinowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera:

promotor specyficzny dla nasion, sekwencję kwasu nukleinowego funkcjonalnie połączona z tym promotorem specyficznym dla nasion, kodującą enzym modyfikujący wykorzystanie substratu pośredniego we wtórnym szlaku metabolicznym związanym z żywieniowym profilem rośliny, przy czym enzym jest inny niż enzymy występujące naturalnie we wtórnym szlaku metabolicznym.

Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym:

Figura 1 schematycznie przedstawia ogólny schemat sposobu zmiany każdego z wtórnych szlaków metabolicznych;

Figura 2 schematycznie przedstawia podstawowy szlak metaboliczny fenylopropanoidowy i wytwarzanie synapiny;

Figura 3 przedstawia zapoczątkowanie i postęp syntezy synapiny w rozwijających się nasionach oraz analizę nasion Brassica napus cv Westar drogą chromatografii cienkowarstwowej;

Figura 4 przedstawia analizę ilościową techniką HPLC nagromadzenia synapiny w rozwijających się nasionach;

Figura 5 przedstawia określanie zdolności rozwijających się nasion do syntezy synapiny, badanie prowadzono podając promieniotwórczą cholinę, poprzez szypułkę naciętego strąka, wprowadzenie znacznika do synapiny nastąpiło w ciągu 7 do 43 dni po zapyleniu;

Figura 6 przedstawia określanie zdolności się nasion do syntezowania synapiny, badanie prowadzono stosując roztwór zawierający promieniotwórczą cholinę, drogą przenikania do wydzielonych nasion i wprowadzania znacznika do synapiny w ciągu 43 do 64 dni po zapyleniu;

Figura 7 przedstawia nagromadzenie się nowo zsyntezowanej synapiny w liścieniu, osiach zarodkowych i częściach powłokowych rozwijających się nasion, jako frakcji całej znakowanej synapiny w nasionach;

Figura 8 przedstawia zawartość synapiny w liścieniach i osiach zarodkowych rozwijających się nasion na jednostkę masy próbki tkanki;

Figura 9 przedstawia oznaczanie zawartości synapiny w liścieniach i osi zarodkowych rozwijających się nasion w stosunku do całego nasiona, to jest osi albo pary liścieni;

Figury 10A i 10B: przedstawiają sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu genu kodującego cholinooksydazę:(SEQ ID NO: 3);

Figura 11 przedstawia wyznaczoną sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu genu kodującego cholinooksydazę (SEQ ID NO: 4);

Figura 12 przedstawia diagram wektora pHS 731 do transformacji roślin, zawierającego gen COX pod kontrolą promotora selektywnego względem tkanki;

Figura 13 przedstawia zmniejszenie zawartości synapiny w nasionach Brassica sp. W wyniku ekspresji genu COX;

Figura 14 przedstawia diagram wektora pHS 981 do transformacji roślin, zawierającego gen BADH pod kontrolą promotora selektywnego względem tkanki;

Figura 15 przedstawia zmniejszenie zawartości synapiny w nasionach Brassica sp. W wyniku ekspresji genów COX i BADH;

Figura 16 przedstawia zmianę zawartości składników fenolowych w nasionach Brassica sp.

w wyniku ekspresji genu COX i BADH;

Figura 17 przedstawia sekwencję nukleotydową syntetycznego genu kodującego dekarboksylazę kwasu ferulowego z B. pumulis, zoptymalizowanego pod kątem ekspresji w komórkach roślinnych (SEQ ID NO: 1);

PL 194 895 B1

Figura 18 przedstawia wyznaczoną sekwencję aminokwasową białka kodowanego przez otwartą ramkę odczytu syntetycznego genu kodującego dekarboksylazę kwasu ferulowego z B. pumulis (SEQ ID NO: 2);

Figura 19 przedstawia mapę restrykcyjną wektora do transformacji roślin, zawierającego gen kodujący dekarboksylazy kwasu ferulowego pod kontrolą konstytutywnego promotora 35S.

Figura 20 przedstawia mapę restrykcyjną do transformacji roślin, zawierającego gen kodujący dekarboksylazę kwasu ferulowego pod kontrolą napinowego promotora selektywnego względem nasion;

Figura 21 przedstawia nagromadzenie kwasu fitowego w czasie rozwoju nasion;

Figura 22 przedstawia tkankową specyficzność odkładania się kwasu fitowego w rozwijających się nasionach;

Figura 23 przedstawia udział procentowy znakowanego metabolizowanego mio-inozytolu, wykrytego w kwasie fitowym, lipidach, ścianach komórkowej rozpuszczalnej w TEA i frakcjach pozostałości komórkowych;

Figura 24 przedstawia sekwencję amplifikowanego fragmentu DNA genu kodującego O-metylotransferazę mio-inozytolu (SEQ ID NO: 5);

Figura 25 przedstawia mapę restrykcyjną wektora pSIMT zawierającego kasetę terminatorową promotora IMT-GUS-Nos 35S w pRD400 5;

Figura 26 przedstawia mapę restrykcyjną wektora pMIMT zawierającego selektywny względem nasion promotor-IMT-GUS-Nos-terminator w pRD400;

Figura 27 przedstawia analizę PCR roślin transgenicznych zawierających gen IMT;

Figura 28 przedstawia analizę Northerna roślin wykazujących ekspresję genu IMT;

Figura 29 przedstawia wykres słupkowy, który ilustruje zmniejszenie zawartości kwasu fitowego obserwowane w roślinach transgenicznych;

Figura 30 przedstawia tabelę ilustrującą zmniejszenie zawartości kwasu fitowego w roślinach, zawierających wektor pSIMT, wyrosłych na polu F1, F2 i F3;

Figura 31 przedstawia tabelę ilustrującą zmniejszenie zawartości kwasu fitowego w roślinach, zawierających wektor pNIMT, wyrosłych na poletku F1 i F2;

Stwierdzono, że sposób według wynalazku może być przykładowo stosowany do zmiany poziomów zmodyfikowanych cukrów, takich jak galaktoza i przeciwżywieniowe glikozydy sacharozylowe, takie jak stachyoza i rafinoza. Galaktoza ulega przekształceniu w galaktynol, który jest jednym z prekursorów przeciwżywieniowych glikozydów sacharozylowych. Prekursorowa postać galaktozy występuje w postaci sprzężonej i jest nazywaną galaktozą UDP. W sposobie według wynalazku, wytwarzaniu i gromadzeniu galaktozy UDP (z dalszym przekształceniem do galaktynolu) zapobiega się wykorzystując aktywność enzymatyczną, obcego pochodzenia względem komórek roślinnych, przy czym enzym taki jest wpływa na poziom galaktozy UDP. Enzym 4-epimeraza galaktozy UDP (galE) bierze udział w jednym z tych głównych etapów metabolizmu galaktozy w żywych komórkach. Katalizuje ona przekształcenie galaktozy UDP w glukozę UDP. Gen kodujący ten enzym występuje u ludzi, w drożdżach i bakteriach. W rozwiązaniu według wynalazku stosuje się enzym kodowany przez bakterie.

W wyniku ekspresji tego heterologicznego enzymu w komórce roślinnej dostępność galaktozy UDP ulegnie zmniejszeniu i będzie wytwarzany korzystny związek, glukoza UDP. Uważa się, że ekspresja enzymu 4-epimerazy galaktozy UDP będzie prowadzić do obniżenia poziomu biosyntezy galaktynolu, który jest jednym z prekursorów przeciwżywieniowych glikozydów sacharozowych. Poza zmniejszaniem szybkości gromadzenia się niepożądanych glikozydów sacharozowych aktywność nowo wprowadzonego enzymu będzie prowadzić do zwiększonej dostępności glukozy UDP, i w konsekwencji do wytwarzania sacharozy. Należy się spodziewać, że sacharoza będzie uczestniczyć w aktywności i zwiększać aktywność innych szlaków metabolicznych, w których uczestniczy sacharoza albo jako źródło węgla przy zwiększonej produkcji roślinnej (na przykład w wytwarzaniu białek, lipidów, ogólnej wydajności, itd.) albo bezpośrednio jako sacharoza zmagazynowana.

Rozwiązania sposobu według wynalazku obejmują również zmianę poziomów różnych pochodnych cukrowych, takich jak fosforan 1-glukozy i fosforan 6-glukozy, stosując enzymatyczną fosfoglukomutazę (pgm). Enzym ten katalizuje wzajemne przekształcanie glukozo-1-fosforanu i glukozo-6-fosforanu (G-1-P, G-6-P) w syntezie i wykorzystywaniu sacharozy. Enzym ten odgrywa główną rolę w syntezie i wykorzystaniu sacharozy, skrobi i glikogenu, i występuje we wszystkich organizmach. Gen kodujący ten enzym występuje w wielu organizmach zarówno eukariotycznych, jak i bakteryjnych (na przykład Agrobacterium).

PL 194 895 B1

G-6-P jest głównym materiałem wyjściowym w szeregu wzajemnych przekształceń cukrów, między innymi w syntezie mio-inozytolu-1-P, który jest głównym substratem i kofaktorem w syntezie odpowiednio kwasu fitowego i przeciwżywieniowych glikozydów sacharozylowych. Stwierdzono, że ekspresja enzymu spowoduje obniżenie poziomu G-6-P, co przełoży się na obniżenie poziomów wspomnianych wyżej czynników przeciwżywieniowych. Stąd sposób według wynalazku obejmuje to rozwiązanie, jako jedno z wielu prowadzących do modyfikacji szlaku metabolicznego. Sposób według wynalazku można stosować w celu modyfikacji wtórnych szlaków metabolicznych, wspólnych dla wielu cennych pod względem handlowych gatunków roślin uprawnych, zarówno roślin jednoliściennych jak i dwuliściennych, albo modyfikacji wtórnego metabolitu, który ma szczególne znaczenie dla określonej uprawy.

Podstawą biochemiczną sposobu według wynalazku jest koncepcja regulacji aktywności enzymatycznej drogą dostępności substratów. Dostępność substratów ma na ogół wpływ na szybkości reakcji enzymatycznej. Mówiąc inaczej, enzym uczestniczy w wytwarzaniu produktu przy szybkości proporcjonalnej do ilości dostępnego substratu. Zmniejszenie stężenia substratu prowadzi do uzyskania mniejszej ilości produktu. Co więcej, aktywność wielu enzymów podlega hamowaniu przez produkty końcowe, co oznacza, że szybkość reakcji enzymatycznej zmniejsza się w obecności dużego nadmiaru produktu końcowego. Zatem poprzez zmianę poziomu dostępnego substratu albo poziomu produktu reakcji enzymatycznej można wpływać na ogólną produkcję związków wytworzonych w danym szlaku biochemicznym.

Przykłady wtórnych szlaków metabolicznych, które można modyfikować sposobem według wynalazku, obejmują syntezę izoprenoidów, biosyntezę alkaloidów, biosyntezę terpenoidów, biosyntezę substancji fenolowych, biosyntezę alkoholi cukrowych i wszelkie inne szlaki metaboliczne, które wytwarzają związki przeciwżywieniowe albo cenne pod względem komercyjnym. Do specyficznych wtórnych metabolitów, których poziom można modyfikować sposobem według niniejszego wynalazku, należą przeciwżywieniowe związki fenolowe, takie jak synapina albo glukozynolany w roślinach krzyżowych, produkty na bazie alkoholi cukrowych, takie jak kwas fitowy albo stachyoza albo rafinoza, gossypol w bawełnie, nikotyna, kwas chlorogeniczny, skondensowane taniny albo inny dowolny przeciwżywieniowy metabolit wtórny. Związek, kwas chlorogeniczny, występuje powszechnie w soi, bawełnie, słoneczniku i pochodzi od kwasu kofeinowego, związku wytwarzanego w szlaku fenylopropanoidowym. Do jeszcze innych przeciwżywieniowych związków należą saponiny, związki przeciwżywieniowe obecne w wielu roślinach, włącznie z lucerną. Saponiny są wielkocząsteczkowymi glikozydami, składającymi się z grupy cukrowej związanej z aglikonem trierpenowym albo steroidowym. Istnieją co najmniej trzy klasy znanych saponin - glikozydy triterpenowe, glikozydy sterydowe i glikozydy sterydo-alkaloidowe. Biosynteza saponin w roślinach wymaga obecności materiału wyjściowego skwalenu. Od skwalenu pochodzą także inne ważne klasy wtórnych metabolitów, takie jak fitosterole, kardenolidy, kukurbitacyny, kwassinoidy i limonidy. Nadmiar saponin w diecie zwierząt jest związany ze stanem nazywanym „wzdęciem”.

Wynalazek został wyjaśniony przykładowo na szeregu różnych, niepowiązanych wtórnych szlaków metabolicznych. Jednak użyteczność sposobu według wynalazku do modyfikowania dowolnego wtórnego szlaku metabolicznego w roślinach będzie oczywista dla specjalistów w tej dziedzinie, a zatem opracowano ogólny sposób realizacji wynalazku.

Każdy wtórny szlak metaboliczny w roślinach wiązał się z ograniczoną liczbą enzymów i substratów tych enzymów, które są wyjątkowe albo wykorzystywane w wyjątkowy sposób. We wtórnym szlaku metabolicznym wytwarzane są różne związki, które są wykorzystywane albo obecne w roślinie. Zatem aby zmodyfikować szlaki wtórnego metabolizmu wykorzystuje się aktywności wyjątkowych enzymów do specyficznej zmiany drogi przekształcania związków w specyficznym szlaku. Poniżej przedstawiono jako ilustrację sposobu według wynalazku sposób modyfikacji dwóch różnych wtórnych szlaków metabolicznych. W celu pełnego zrozumienia sposobu według wynalazku opisano podstawowe informacje o tych szlakach.

(A) Wtórny szlak metabolizmu fenylopropanoidowego

Rośliny wytwarzają szereg związków fenolowych drogą wtórnego szlaku metabolicznego, szlaku fenylopropanoidowego. Fenylopropanoidowy szlak metaboliczny uczestniczy w wielu procesach fizjologicznych w roślinach, włącznie z odpornością na choroby, ochroną przed promieniowaniem UV i regulacją wzrostu roślin. Produkty tego szlaku są niezbędne do syntezy suberyny i ligniny, które są składnikami tkanek roślinnych i biorą udział w tworzeniu się włókna roślinnego. Jest to ogólne określenie, które obejmuje znaczeniem węglowodan niecałkowicie ulegający metabolizmowi w nasionach

PL 194 895 B1 albo śrucie z nasion. Uważa się, że lignina bierze udział w tworzeniu się nierozpuszczalnych włókien i stąd wysokie poziomy ligniny w nasionach albo śrucie są związane z niedostatecznym wykorzystaniem śruty z nasion albo nasion, zwłaszcza u zwierząt jednożołądkowych. Stąd substancje fenolowe roślin, a zwłaszcza fenolowe prekursory ligniny można uważać za czynniki przeciwżywieniowe w karmie dla zwierząt, a zmniejszenie zawartości albo odpowiednia zmiana ilości fenolowych substancji w roślinie, a zwłaszcza fenoli wykorzystywanych przy tworzeniu się ligniny, może dać śrutę, która jest lepsza jakościowo.

Fenole roślinne biorą także udział w tworzeniu się różnych innych związków, z których niektóre mają naturę przeciwżywieniową.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano sposób zmniejszania zawartości specyficznych związków fenolowych, które uważa się za związki przeciwżywieniowe w komórkach roślinnych, nasionach albo mące stosowanej do karmy. Rozpatruje się zwłaszcza zmniejszenie poziomu przeciwżywieniowego związku o gorzkim smaku, synapiny (albo choliny synapoilowej), w komórkach roślinnych, które go wytwarzają. Uważa się także, że synapina tworzy kompleksy z białkami w śrucie, utrudniając ich trawienia i wykorzystanie przez zwierzę. Gorzki smak może mieć wpływ także na poziomy skarmiania. Ponadto, po podaniu karmy kurom niektórych gatunków, które składają jaja o brązowej skorupie, synapina obecna w karmie powoduje rybi zapach jaj, nie do przyjęcia dla konsumenta. W takich przypadkach ilość śruty z nasion zawierającej synapinę musi być utrzymywana na poziomie poniżej około 10%, co ogranicza jej stosowanie w mieszankach paszowych. Stąd zmniejszenie zawartości synapiny w nasionach i śrucie z nasion roślin krzyżowych jest ważnym celem handlowym.

Wytwarzanie synapiny następuje w wyniku przedłużenia szlaku fenylopropanoidowego. Szlak zdefiniowany w zakresie niniejszego wynalazku obejmuje etapy biochemiczne, które prowadzą do tworzenia się kwasu synapowego, jak również szlaki biochemiczne, które odgałęziają się od różnych etapów, takich jak odgałęzione szlaki prowadzące do utworzenia monomerów ligniny i innych produktów biochemicznych, pochodzących z produktów szlaku fenylopropanoidowego.

W szlaku fenylopropanoidowym L-fenyloalanina, aromatyczny aminokwas, jest substratem enzymu amoniakoliazy fenyloalaniny (PAL). Aktywność enzymatyczna PAL prowadzi do tworzenia kwasu cynamonowego, który jest substratem cynamoniano-4-hydrolazy (C4H). Produkt C4H jest kwasem p-kumarowym, który jest prekursorem wielu związków flawonoidowych, z których pewne mogą powstawać także z L-tyrozyny przez działanie enzymu, amoniakoliazy tyrozyny (TAL). Kwas kumarowy może być także prekursorem w biosyntezie ligniny. Enzym, p-kumaroniano-3-hydrolaza (C3H) katalizuje reakcję kwasu p-kumarowego, prowadzącą do wytworzenia kwasu kofeinowego. Kwas kofeinowy ulega rozkładowi w obecności kofeiniano/5-hydroksyferulano-O-metylo-transferazy (OMT) z wytworzeniem kwasu ferulowego. Kwas ferulowy jest jednym z trzech znanych pierwotnych monomerów fenolowych, uczestniczących w biosyntezie ligniny. Kwas ferulowy może być także substratem enzymu, ferulano-5-hydrolazy (F5H), z wytworzeniem kwasu 5-hydroksy-ferulowego, który może dalej ulegać modyfikacji przez enzym OMT z utworzeniem kwasu synapowego. Kwas synapowy jest innym głównym fenolowym monomerem ligniny. Kwas synapowy może również ulegać sprzęganiu z utworzeniem synapoiloglukozy w wyniku działania enzymu UDP-glukozo synapoilotransferazy (SGT). Synapoiloglukoza jest substratem transferazy synapoiloglukozy : synapoilo-choliny (SCT), która prowadzi do wytworzenia synapoilocholiny albo synapiny. Te dwa ostatnie etapy przeważają w roślinach krzyżowych, a w roślinach z rodzaju Brassica zgromadzona synapina w nasionach stanowi główny, niepolimeryczny związek fenolowy znaleziony w dojrzałych nasionach. Ogólny szlak metabolizmu fenylopropanoidowego jest przedstawiony na fig. 2. Należy nadmienić, że w roślinach niektórych gatunków dodatkowa aktywność enzymatyczna może być częścią szlaku fenylopropanoidowego.

Synapina albo synapoilocholina jest najbardziej rozpowszechnionym związkiem fenolowym w nasionach roślin krzyżowych, a w B. napus może stanowić 4% śruty (Blair i Reichert, 1984, J. Sci. Food Agric. 35:29). Synteza synapiny ma miejsce w niedojrzałych nasionach, które wciąż mają jeszcze jasnozieloną barwę i wydaje się, że w miarę dojrzewania nasion degradacja netto nie zachodzi (Vogt i wsp., 27 1993, Aren. Biochem. Biophys. 300:622). Rozwój siewek (na przykład kiełkowanie nasion) powoduje degradację synapiny drogą reakcji esterazowej, która prowadzi do kwasu synapowego i choliny. Postuluje się, lecz nie zostało to udowodnione, że degradacja synapiny dostarcza cholinę w syntezie fosfolipidów w czasie kiełkowania nasion (Strack i wsp., 1981, Z. Naturforsch. 36c: 215). Ponieważ jednak większość nasion roślin poza roślinami krzyżowymi nie zawiera synapiny, to jest mało prawdopodobne, aby synapina była głównym składnikiem w rozwoju nasion albo ogólnie kiełkowania.

PL 194 895 B1

Mutanty o uszkodzonym szlaku fenylopropanoidowym uzyskano z Arabidosis thaliana (Chapple i wsp., 1992, The Plant Cell 4:1413-1424). O ile te mutanty stanowią doskonały materiał w badaniach fizjologicznych, biochemicznych i genetycznych, to nie mają one żadnej wartości uprawnej, gdyż mutacje te prowadzą do szkodliwych zaburzeń, które obejmują nadwrażliwość na światło UV, będącą wynikiem manifestacji mutacji w fenotypie rośliny, a zwłaszcza w liściach. U tych mutantów, nazwanych SIN1 (mutanty biosyntezy jabłczanu SINapoilu), synteza estrów kwasu synapowego, została zahamowana zmniejszając zawartość synapiny (estru synapoilocholiny), w wyniku czego nastąpiła zmiana składu monomerów ligniny w roślinie. Zmiana zawartości ligniny może prowadzić do uzyskania roślin o unikalnym składzie ligniny, a zatem o zmienionych włóknach roślinnych.

Chapple i wsp. przedstawili możliwość stosowania mutantów, takich jak SINI, do zmniejszania zawartości ligniny albo zmiany zawartości ligniny w nasionach ważnych roślin krzyżowych, takich jak nasiona rzepaku canola, lecz nie ma żadnych wskazówek, co do tego, w jaki sposób można tego dokonać. Dyskutowano również skierowanie badań na zmniejszenie zawartości synapiny w nasionach rzepaku, lecz nie podano żadnych wskazówek, dotyczących sposób uzyskania takiego obniżenia wykorzystując mutacje SINI. Wrażliwość mutanta SINI na promieniowanie UV powoduje, że mutacja taka ma małą wartość zastosowania w warunkach rolniczych. Mimo, że opisano już sposoby zmniejszania zawartości synapiny w nasionach w stanie techniki, to mutacja SINI dostarcza ważnego dowodu naukowego, że synapina nie jest ważną substancją dla wzrostu i rozwoju roślin oraz że nasiona o zmniejszonej zawartości synapiny są zdolne do wzrostu i rozwoju. Mutacja SINI nie może jednak być wykorzystana do opracowania sposobu zmniejszania zawartości synapiny w nasionach roślin krzyżowych na skalę handlową, bez związanej z nią szkodliwą wrażliwością na UV.

Poza przeciwżywieniowymi związkami fenolowymi, takimi jak synapina, w tworzeniu się ligniny bierze udział wiele innych produktów ze szlaku fenylopropanoidowego. Biosynteza ligniny jest częścią ogólnego fenylopropanoidowego szlaku biosyntezy, w którym wytwarzane są co najmniej trzy pierwotne prekursory fenolowe: kwas kumarowy, ferulowy i synapowy, których produkty polimeryzują do ligniny i innych związków fenolowych.

Mechanizm biochemiczny tworzenia lignin z tych prekursorów jest złożony i obejmuje on szereg innych enzymów, takich jak O-metylotransferaza kwasu 5-hydroksy-ferulowego/ kwasu kofeinowego (COMT), kofeoilo-CoA-reduktaza (CCoAOMT), dehydrogenaza alkoholu cynamonowego (CAD), cynamoilo-CoA-reduktaza (CCR), peroksydaza, 4-kumarano:CoA-ligaza (4CL) i beta-glukuronidaza specyficzna względem koniferyny (CBG). W procesie tym mogą brać udział także inne enzymy, przy czym pełen mechanizm biochemiczny tworzenia się ligniny nie jest całkowicie zrozumiały.

Lignina jest skomplikowanym polimerem złożonym głównie z połączonych pomiędzy sobą jednostek tych polimerycznych związków fenolowych w różnych proporcjach i z różnymi typami wiązań w różnych typach komórek i w różnych gatunkach rośliny. Ligniny są podstawowymi składnikami ścian komórkowych roślin, których tkanki muszą wykazywać wytrzymałość mechaniczną albo biorą udział w transporcie wody. Poza tym uważa się, że ligniny biorą udział w mechanizmach odporności na atak patogenów. W roślinach dwuliściennych rozpowszechniona jest lignina guajacylo-syryngilowa, złożona zarówno z jednostek guajacylowych pochodzących z kwasu ferulowego, jak i reszt syryngilowych pochodzących z kwasu synapowego. Zgodnie z powyższym do tworzenia się ligniny w roślinie typu dzikiego konieczny jest zarówno kwas synapowy, jak i kwas ferulowy. Uważa się, że uleganie degradacji albo łatwość obróbki drewna, na przykład wytwarzanie miazgi, są w wysokim stopniu zależne od składu monomerycznego ligniny, który zależy przede wszystkim na dostępności specyficznych monomerów ligniny. Uważa się, że obecność grup 5-O-metylowych w synapoilo-syringiloligninach zmniejsza sieciowanie poprzeczne, a zatem powoduje, że lignina złożona głównie z jednostek syringilowych, jest łatwiejsza do przetwarzania niż lignina złożona głównie z jednostek guajacylowych, pochodzących z kwasu ferulowego. Zgodnie z tym sposoby zwiększania zawartości ligniny syringilowej mogą prowadzić do miazgi, która jest bardziej podatna na trawienie dzięki zmniejszonemu usieciowaniu ligniny.

Łatwość trawienia uprawnych roślin paszowych zależy od ilości włókna, ponieważ usieciowane ligniny są odporne na degradację i ich funkcja polega na wiązaniu ze sobą poszczególnych fizycznych elementów ścian komórkowych.

Zatem jest oczywiste, że wszelkie wysiłki ulepszenia śruty z nasion drogą obniżenia zawartości albo wyeliminowania synapiny i zmiany ogólnej zawartości substancji fenolowych powinny być skierowane na rozwijające się nasiona. Aby osiągnąć specyficzną zmianę biochemicznego szlaku syntezy synapiny w nasionach najwłaściwsze jest podejście na poziomie genetyki molekularnej, uwzględniając brak plazmy zarodkowej, która w sposób naturalny jest odpowiedzialna za niską zawartość synapiny.

PL 194 895 B1

Jednym z rozwiązań jest sposób modyfikacji zawartości związków fenolowych w nasionach, oraz modyfikacji zawartości kwasu synapowego i podobnych związków fenolowych. Sposób polega na wprowadzaniu nowych aktywności enzymatycznych, które wpływają na dostępność związków wykorzystywanych jako prekursory i substraty enzymów w szlaku fenylopropanoidowym. Brak albo zmniejszenie ilości tych związków prowadzi do biochemicznego przesunięcia w normalnym szlaku metabolicznym i do produkcji zmienionej ilości różnych produktów fenylopropanoidowych.

W przykładzie opisanego sposobu nową aktywność enzymatyczną, cholinooksydazę (COX), wykorzystuje się do zmniejszania zasobów choliny w komórce roślinnej, a zwłaszcza w nasionach roślinnych. Cholinę wykorzystuje się między innymi do wytwarzania synapiny z synapoiloglukozy. Zmniejszenie zasobów choliny powoduje zmianę ilości zasobów prekursorów synapiny (choliny i synapoiloglukozy), a zatem zmienia skład prekursorów utworzonych we wcześniejszych enzymatycznych etapach szlaku fenylopropanoidowego, włącznie z kwasem synapowym. Wynikiem jest nasiono o znacznie zmniejszonej zawartości synapiny i zmienionej zawartości składników fenolowych. Wiadomo, że utlenianie choliny przez cholinooksydazę prowadzi do nadtlenku wodoru. Wytwarzanie nadtlenku wodoru w komórkach roślinnych uważa się za korzystne, a zatem istnieje dodatkowa korzyść polegająca na ekspresji genu kodującego cholinooksydazę w roślinach. Ilustracją innego aspektu opisanego sposobu jest wykorzystanie aktywności enzymatycznej, dehydrogenazy aldehydobetainy (BADH), którą stosuje się w celu zwiększenia poziomu przekształcenia produktu cholinooksydazy, aldehydobetainy, w glicynobetainę, która działa jako czynnik zabezpieczający przed stresem. Betaina jest cennym związkiem o różnorodnym zastosowaniu w przemyśle spożywczym oraz jako dodatek do zwiększania wzrostu roślin.

Zgodnie z powyższym korzystny wpływ zmiany zawartości składników fenolowych w komórkach roślinnych i specyficzne zmniejszenie zawartości synapiny są wykazane przez zmniejszenie zawartości pojedynczego prekursora w szlaku fenylopropanoidowym. Dla specjalisty w tej dziedzinie jest oczywiste, że w ramach sposobu zmiany różnych innych produktów końcowych w szlaku fenylopropanoidowym stosować można także inne enzymy.

Innym przykładem w ramach niniejszego wynalazku jest zastosowanie nowych aktywności enzymatycznych do degradowania kwasu ferulowego, także tworzonego w szlaku fenylopropanoidowym. Uważa się, że z trzech głównych monomerów ligniny kwas ferulowy nadaje sztywność i wytrzymałość ścianie komórkowej dzięki sieciującym łańcuchom pentozowym, arabinoksylanom i hemicelulozom, powodując że ściana komórkowa jest bardziej sztywna i mniej podatna na degradację enzymatyczną. Zatem jako składnik ligniny kwas ferulowy odgrywa ważną rolę w mechanicznej wytrzymałości tkanek roślinnych. Zmiana zawartości kwasu ferulowego w specyficzny sposób może prowadzić do wielu korzystnych dla człowieka skutków.

Kwas ferulowy syntezuje się, jak opisano wyżej, w ramach podstawowego szlaku fenylopropanoidowego i stanowi prekursor różnych produktów szlaku (przegląd JPN Rosazza i wsp., Journal of Industrial Microbiology 15: 457-471, 1995, R. Whetten i R Seredoff, Plant Cell 7:1001-1013, 1995, RA Dixon i NL Paiva, 1995, Plant Cell 7: 1085-1097, 1995).

Sposób według wynalazku umożliwia modyfikację zawartości kwasu ferulowego, zmieniając przez to wytwarzanie różnych innych związków w szlaku fenylopropanoidowym, a zwłaszcza synapiny. W jednym z aspektów niniejszego wynalazku wymienia się sposób zmiany poziomu kwasu ferulowego w komórkach roślinnych. Sposób polega na wprowadzaniu heterologicznych enzymatycznych aktywności, które powodują rozkład kwasu ferulowego. Niektóre z tych enzymów mogą również uczestniczyć w wytwarzaniu związków o użyteczności handlowej. Na przykład stosuje się enzym, dekarboksylazę kwasu ferulowego do uzyskania winylogwajakolu, związku, który można stosować jako surowiec przemysłowy i który może gromadzić się w komórkach roślinnych bez szkodliwego wpływu na rozwój rośliny. Brak albo zmniejszenie ilości kwasu ferulowego w roślinie prowadzi do biochemicznego przesunięcia w normalnym szlaku fenylopropanoidowym i wytwarzania zmienionych ilości różnych produktów szlaku fenylopropanoidowego.

Sposób według wynalazku nie jest ograniczony do szlaku fenylopropanoidowego. Innym przykładem może być sposób modyfikacji wtórnego szlaku metabolizmu, w którym wytwarza się alkohole cukrowe.

(B) Wtórny szlak metabolizmu alkoholi cukrowych

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem opracowano także sposób i kompozycje DNA do zmiany zawartości alkoholi cukrowych w komórkach roślinnych. W wyniku zastosowania sposobu według niniejszego wynalazku otrzymuje się komórki roślinne o zmodyfikowanych związkach pochodzących

PL 194 895 B1 z alkoholi cukrowych, takich jak kwas fitowy, stachyoza, rafinoza, sacharozyloglikozydy, uronidy i pentozy, fosfoinozytydy i glikofosfoceramidy. Sposób ten prowadzi, w niektórych rozwiązaniach, do uzyskania nasion roślin o zmniejszoną zawartości kwasu fitowego. Zgodnie z wynalazkiem opracowano także nasiona roślin o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego, odpowiednie jako karma, nasiona roślinne o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego, odpowiednie do wytwarzania zmodyfikowanej śruty, oraz komórki roślinne o zmodyfikowanym metabolizmie inozytolu. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zmodyfikowano poziom także innych związków uzyskanych w wyniku metabolizmu alkoholi cukrowych, obejmujących przeciwżywieniowe związki pochodzące z alkoholu cukrowego, takie jak stachyoza i rafinoza. Szczególnie interesujące jest wykorzystanie jako karmy nasion modyfikowanych pod względem zawartości fitanów.

Fitan jest ważnym składnikiem wielu nasion, stanowiącym typowo 2-4% masy nasion, przy czym w niektórych gatunkach może osiągać zawartość 10%. Stwierdzono zbieżność obecności znacznych ilości fitanu w racjach paszowych z utratą apetytu zwierząt, zmniejszoną wielkością miotu i innymi niekorzystnymi współczynnikami wydajności produkcji zwierzęcej. Jest to prawdopodobnie spowodowane zdolnością fitanu do wiązania cynku. Kompleksy kwasu fitowego z innymi składnikami nasion nazywa się ogólnie fityną. Podobnie uważa się, że wysokie zawartości fityny powodują niekorzystne działania u zwierząt.

Poza niekorzystnym wpływem na wydajność karmy, obecność kwasu fitowego w kompozycjach paszowych prowadzi także do szeregu niepożądanych skutków dla środowiska. W przypadku zwierząt jednożołądkowych fosfor związany z kwasem fitowym jest na ogół niedostępny, a zatem musi być dodawany do diety, co oznacza dodatkowy koszt. Fosfor związany z kwasem fitowym jest wydzielany przez zwierzęta jednożołądkowe i w wyniku rozkładu odchodów przez drobnoustroje, fosfor obecny w kwasie fitowym jest wydzielany do środowiska. Wysokie zawartości kwasu fitowego w miazgach (śrutach) z nasion roślin wielu gatunków prowadzą do wydzielania znacznych ilości fosforu. Ciągle rosnąca produkcja żywego inwentarza prowadzi często do eutrofizacji zasobów wodnych i innych problemów środowiskowych związanych ze skażeniem fosforem. Należy spodziewać się, że te problemy będą narastać i mogą stać się w przyszłości głównym ograniczeniem produkcji żywego inwentarza. Stąd sposoby zmniejszania poziomu wydzielonego kwasu fitowego będą ważnym czynnikiem umożliwiającym rozwiązywanie tych problemów środowiskowych.

Mimo, że rzeczywiste koszty związane z dodawaniem fosforu do kompozycji paszowej stanowią nieznaczącą część kosztów paszy, to skutki wydzielonego fosforu dla środowiska generują znaczne koszty z tym związane, których można by uniknąć wykorzystując śrutę o niskiej zawartości fitanu.

U zwierząt przeżuwających w wyniku obecności fauny drobnoustrojowej w żwaczu może nastąpić uwalnianie fosforu związanego z kwasem fitowym, a zatem fosfor staje się bardziej dostępny. W wyniku tego może zostać obniżona ilość dodawanego fosforu do racji dla zwierząt przeżuwających w porównaniu ze zwierzętami jednożołądkowymi. Jednak ilość kwasu fitowego w nasionach większości roślin przekracza to, co jest w rzeczywistości wymagane, a zatem nawet u zwierząt przeżuwających skażenie fosforem jest przedmiotem głównej troski.

Do chwili obecnej główne sposoby stosowane do zmniejszenia zawartości fitanu, obejmowały degradację fitanu drogą działania enzymów fitazowych obecnych w miazdze z nasion. Chociaż sposób ten prowadzi do większej dostępności fosforu, to nie umożliwia produkcji nasion albo miazgi o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego, a tylko miazgi (śruty), w której na ogół jest bardziej dostępny fosfor zawarty w kwasie fitowym. Zatem zastosowanie enzymu fitazy jest użyteczne tylko do uzyskiwania bardziej dostępnego fosforu z kwasu fitowego.

Aktywność fitazy stwierdzono na ogół w drobnoustrojach, takich jak pleśnie (Aspergillus), bakterie (Bacillus, Pseudomonas) i drożdże (Saccharomyces). Usuwanie fitanu przez traktowanie materiału roślinnego mieszaniną enzymów zawierających fitazę z drobnoustrojów jest znane na przykład z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5554399. Większość drobnoustrojów syntezuje szereg fitaz, które mogą obejmować aktywność samej fitazy, poza różnymi fosfatazami, które dalej rozkładają kwas fitowy. Całkowite uwolnienie dostępnego fosforu z kwasu fitowego może zależeć od szeregu różnych aktywności enzymatycznych.

Opisano także alternatywny sposób podejścia do przekształcania roślin z wykorzystaniem fitazy z drobnoustrojów. Z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5593963 jest znana ekspresja fitazy w roślinach transgenicznych pod kontrolą sekwencji regulatorowych, do których należą sekwencje zdolne do regulacji ekspresji konstytutywnie albo w sposób specyficzny dla etapu albo tkanki. Można

PL 194 895 B1 wytwarzać komórki roślinne albo bardziej specyficznie komórki nasion, które wykazują aktywność fitazy, która może prowadzić do wydzielania części fosforu związanego z kwasem fitowym.

Jednak proste uwolnienie fosforu z kwasu fitowego nie rozwiązuje całkowicie problemu zmniejszania ilości odpadów fosforowych ani potencjalnych przeciwżywieniowych skutków kwasu fitowego. Ważniejsze jest, że zawartość kwasu fitowego albo fitanu w postaci kompleksu nie jest mniejsza. Zatem w stanie techniki znane są sposoby uwalniania fosforu z kwasu fitowego, lecz sposoby kontroli poziomu wytworzonego kwasu fitowego.

Każdy środek, za pomocą którego można by dogodnie manipulować poziomami kwasu fitowego, byłby bardzo użyteczny przy produkcji pasz. Na przykład dzięki zastosowaniu nasion o niższej zawartości kwasu fitowego uzyskano by o większej dostępności składników mineralnych. Również śruta z nasion roślinnych o zmniejszonej ilości kwasu fitowego wykazywałby zmniejszoną zawartość fityny i mógłby być zatem bardziej odżywczy i lekkostrawny dzięki zmniejszeniu zawartości kompleksów kwasu fitowego.

Poza śrutami (miazgami) o większej wartości odżywczej, śruty o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego umożliwią wydzielanie mniejszych ilości fosforu do środowiska oraz mniejsze jego skażenie. Mimo, że stosowanie sposobu uwalniania fosforu z kwasu fitowego może prowadzić do obniżenia poziomu dodawanego i wydzielanego fosforu, to rzeczywiste poziomy kwasu fitowego, a zatem i potencjalnie dostępny fosfor nadal są większe niż konieczność uzupełnienia fosforu dla większości zwierząt.

Zgodnie z powyższym sposoby modyfikacji poziomów kwasu fitowego będą użyteczne w produkcji wszystkich pasz, a ponadto zapewniają miazgę (śrutę) i kompozycje paszowe, które są nowe i bardziej wartościowe.

Rozpatrując te problemy jest oczywiste, że konieczne jest opracowanie sposobu, który umożliwiłby modyfikowanie wytwarzania fitanu w czasie rozwoju nasion i który zapewniłby rozwiązanie problemów związanych ze skażeniem fosforem i przeciwżywieniowymi skutkami kwasu fitowego. Poza tym szczególnie cenne byłoby opracowanie mechanizmu genetycznego, który byłby użyteczny u wielu gatunków roślin. Niniejszy wynalazek dostarcza takich rozwiązań.

Do zrozumienia zakresu niniejszego wynalazku konieczna jest ocena mechanizmu biochemicznego odpowiedzialnego za tworzenie się kwasu fitowego. Chociaż biosynteza kwasu fitowego nie jest w pełni poznana, to istnieje szereg etapów kluczowych, które są znane. Kwas fitowy jest sześciofosforanową pochodną mio-inozytolu. Szlak biochemiczny syntezy kwasu fitowego wykorzystuje mioinozytol, alkohol cukrowy, wyłącznie jako substrat wyjściowy. Związek ten (mio-inozytol, nazywany powszechnie także inozytolem) jest także głównym związkiem uczestniczącym w wytwarzaniu innych pochodnych i epimerów inozytolu. Niektóre z tych pochodnych, takie jak glikozydy sacharozylowe, są związkami przeciwżywieniowymi, a zatem jest także pożądane zmniejszenie zawartości tych związków.

Mio-inozytol jest alkoholem cukrowym, który jest szeroko rozpowszechniony w komórkach roślinnych. Jednak proste zabezpieczenie dowolnej z hydroksylowych grup mio-inozytolu powoduje, że nie wchodzi on do szlaku biosyntezy kwasu fitowego i do innych szlaków. Zabezpieczenie mioinozytolu można przeprowadzić in vivo drogą metylowania w specyficznych centrach za pomocą różnych metylotransferaz. Na przykład mio-inozytol przekształca się w ononitol drogą jednometylowania w położeniu 6. Metylowanie w położeniu 5 daje sekwoitol, który epimeryzuje do pinitolu. Pinitolu nie można wykorzystać do biosyntezy kwasu fitowego. Wiadomo, że metylowane pochodne mio-inozytolu nadają roślinie korzystne właściwości, takie jak tolerancja na stres, i biorą udział w transporcie substancji rozpuszczalnych i stabilizowaniu białek błonowych. Zatem modyfikację inozytolu drogą wykorzystania aktywności enzymów heterologicznych, nie związanych normalnie z metabolizmem alkoholi cukrowych, uważa się za objętą zakresem niniejszego wynalazku.

Mechanizm biochemiczny syntezy fitanu nie jest dobrze poznany, przy czym jednak są znane co najmniej dwa potencjalne szlaki i wydaje się, że istnieje szereg różnych enzymów biorących udział w biosyntezie kwasu fitowego. Fitan występuje w większości tkanek roślinnych, przy czym jednak przeważa w nasionach i pyłku roślin, które pełnią przewidywaną rolę w magazynowaniu fosforu. Stąd okazało się trudne opracowanie sposobu modyfikowania biosyntezy fitanu z wykorzystaniem znanych środków, zwłaszcza dlatego, że mechanizm jego tworzenia, nie jest dobrze znany.

W celu zminimalizowania wytwarzania kwasu fitowego opracowano zgodnie z wynalazkiem sposoby i stosowane w sposobach sekwencje DNA kodujące enzym(y) modyfikujące mio-inozytol, zapobiegając w ten sposób wykorzystaniu mio-inozytolu w biosyntezie kwasu fitowego. Zgodnie z wynalazkiem stosuje się heterologiczny gen kodujący metylo-transferazę, która specyficznie uczestniczy w metylowaniu mio-inozytolu w nasionach, zwłaszcza w tkankach nasion odpowiedzialnych za

PL 194 895 B1 biosyntezę kwasu fitowego (przez określenie „heterologiczny” rozumie się enzym normalnie nie związany z biosyntezą fitanu w wymienionej komórce roślinnej). W sposobie według wynalazku wykorzystuje się heterologiczną aktywność enzymatyczną, uzyskaną z rośliny halofitycznej, przy czym enzym takie nie występuje w roślinach uprawowych, takich jak kukurydza, soja, bawełna, lucerna, pszenica, jęczmień, żyto, sorgo, słonecznik, rośliny oleiste Brassica i innych roślinach uprawnych, stosowanych typowo w gospodarstwach rolnych.

Wytwarzanie metyloinozytolu z mio-inozytolu daje także dodatkową korzyść polegającą na wytwarzaniu nieszkodliwego związku bez ujemnych skutków dla komórki roślinnej. Zatem przez zmniejszenie ogólnej zawartości dostępnego mio-inozytolu zmniejsza się zawartość kwasu fitowego.

Fitan jest jednym z głównych przeciwżywieniowych czynników obecnych w miazdze z nasion. Do skutków przeciwżywieniowych kwasu fitowego należy wiązanie składników mineralnych, tworzenie się kompleksów z białkami oraz ujemne skutki, zwłaszcza związane z wydzielaniem się nadmiaru fosforu w postaci kwasu fitowego, który ulega metabolizmowi w środowisku tworzącym skażenie fosforem. Zgodnie z powyższym sposoby zmniejszania zawartości kwasu fitowego w komórkach roślinnych są użyteczne przy zastosowaniach paszowych. W hodowlach wodnych wysokie poziomy kwasu fitowego są także głównym problemem dla stosowania białek pochodzących z roślin jako substytutu mączki śledziowej. Stąd sposoby zmniejszania zawartości kwasu fitowego w komórkach roślinnych, a zwłaszcza w komórkach tkanek roślinnych stosowanych w karmie dla zwierząt, są cenne i bardzo użyteczne. Sposoby zmniejszania zawartości kwasu fitowego w nasionach wielu gatunków roślin, stosowanych w paszy dla zwierząt, są szczególnie cenne w przemyśle paszowym.

Gen roślinny kodujący O-metylo-transferazę mio-inozytolu (IMT) wydzielono z Mesebryanthemum crystallinum i wykazano, że ten enzym przekształca mio-inozytol w pinitol w heterologicznych roślinach transgenicznych (amerykański opis patentowy US 5563324). Ten gen roślinny umieszczono pod kontrolą substytucyjnego promotora w celu zwiększenia tolerancji na stres roślin poprzez nadprodukcję metylowanej pochodnej mio-inozytolu, ononitolu, który można następnie poddać epimeryzacji do pinitolu. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem gen roślinny umieszcza się pod kontrolą selektywnego promotora z nasion w celu zmiany metabolizmu inozytolu w nasionach.

Wykazano, że wytwarzanie pinitolu znanego z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5563324 nadaje tolerancję względem stężenia soli, po konstytutywnej ekspresji w transgenicznych roślinach tytoniu. Podobnie ekspresja genu kodującego dehydrogenazę 1-P mannitu, gdy prowadzi ona do konstytutywnej ekspresji w komórce roślinnej, katalizuje wytwarzanie mannitu, alkoholu albo poliolu cukrowego i powoduje, że komórka roślinna staje się tolerancyjna na stres solny. Stąd z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5563324 jest znane wytwarzanie alkoholi cukrowych w wyniku zastosowania enzymu, zdolnego do wytwarzania alkoholu cukrowego z cukrów rodzimych w komórkach roślinnych, jako sposobu nadawania komórkom roślinnym tolerancji na sól.

Jednak amerykański opis patentowy nr US 5563324 nie dostarcza żadnych informacji odnośnie genu kodującego enzym zdolny do modyfikowania poziomu mio-inozytolu w celu zapobiegania wykorzystaniu mio-inozytolu jako prekursora dla innych związków, które są pochodnymi rodzimymi. Z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5563324 wynika jednak jasny dowód, że modyfikacja mioinozytolu nie ma żadnego ujemnego wpływu na roślinę, a zatem nie należy się spodziewać, aby modyfikacje poziomu mio-inozytolu były szkodliwe dla rośliny.

Zgodnie z powyższym stwierdzono, że modyfikacja mio-inozytolu z wykorzystaniem genu kodującego metylotransferazę nie będzie szkodliwa dla komórek roślinnych, a metylowany produkt tej reakcji enzymatycznej jest znany jako nieszkodliwy dla komórek roślinnych.

Jednak mio-inozytol jest związkiem podstawowym w wielu różnych aspektach wzrostu i rozwoju roślin. Poza swoją rolą jako prekursora w biosyntezie kwasu fitowego inozytol może być wykorzystany także w biosyntezie uronidów i pentoz i jest on także obecny w fosfoinozytydach błon komórek roślinnych, jak również innych złożonych lipidach roślinnych, włącznie z glikofosfoceramidami. Ponadto jest on także prekursorem innych naturalnie występujących izomerów inozytolowych, z których wiele, w tym również mio-inozytol, ulegają rozmieszczeniu jako etery metylowe zgodnie ze specyficznym wzorem dla danego gatunku w królestwie roślin.

Rola mio-inozytolu w ogólnym metabolizmie roślin jest znacząca i modyfikacja wszystkich mioinozytolów mogłaby mieć nieprzewidziane skutki, zwłaszcza w warunkach upraw rolnych. Chociaż z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5563324 jest znana konstytutywna ekspresja genu kodującego metylotransferazę, to brak jest dowodu, że otrzymane tak rośliny są użyteczne. W amerykańskim opisie patentowym nr US 5563324 stwierdzono, że „nawet jeżeli nowo wprowadzone geny nie

PL 194 895 B1 powodują lepszego funkcjonowania rośliny w warunkach rolniczych, to rośliny transgeniczne zawierające takie geny są użyteczne do celów badawczych, a zwłaszcza do badania jak zmiany wewnętrznych procesów roślinnych (na przykład regulacja osmozy) wpływają na funkcjonowanie roślin w warunkach polowych” (kolumna 2, wiersze 60-65). Zatem według amerykańskiego opisu patentowego nr US 5563324 nie przewiduje się modyfikacji poziomów mio-inozytolu w celu zmniejszenia zawartości kwasu fitowego, ani nie należy całkowicie spodziewać się, że w wyniku zawartych w nim informacji uzyska się rośliny o użytecznej charakterystyce agronomicznej. Zgodnie z powyższym z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5563324 jest znana ekspresja genu kodującego enzym modyfikujący poziom mio-inozytolu ogólnie w roślinie, w celu nabycia tolerancji na stres albo do dalszych badań naukowych.

Zgodnie z powyższym ogólnie uważa się, że w niniejszym wynalazku opracowano nowe podejście do zmniejszania zawartości kwasu fitowego. Wykorzystanie genu metylo-transferazy jest podejściem specyficznym do zmniejszania zawartości kwasu fitowego. Niniejszy wynalazek nie opiera się na sposobach już znanych w stanie techniki, takich jak ekspresja genów kodujących enzymy, fitazy, które nie rozwiązują problemu nadmiaru kwasu fitowego w roślinach albo miazdze z nasion. W czasie prowadzonych prac ustalono, że poziomy kwasu fitynowego można regulować zmieniając poziomy mio-inozytolu dostępnego dla biosyntezy kwasu fitowego. Odkryto, że ekspresja genu metylotransferazy w tkankach nasion prowadzi do zmniejszenia zawartości kwasu fitowego w nasionach bez jakichkolwiek obserwowalnych zmian innych cech charakterystycznych rośliny. Jest oczywiste, że ograniczenie zakresu ekspresji genu kodującego metylo-transferazę do tkanek nasion odpowiedzialnych za biosyntezę fitanu w dojrzałych nasionach pozostaje bez żadnego dodatkowego wpływu na rośliny, nawet wyhodowane w skrajnie niekorzystnych środowiskowych warunkach polowych. Zastosowanie promotora selektywnego względem tkanek daje wiele korzyści w porównaniu ze stanem techniki, włącznie z ograniczeniem aktywności enzymatycznej do tkanek nasion, pozostawiając jednocześnie nienaruszony metabolizm mio-inozytolu w innych tkankach.

Celem niniejszego wynalazku jest zmiana drogi wykorzystywania mio-inozytolu jako materiału wyjściowego w biosyntezie kwasu fitowego i skierowanie na metaboliczny zespół mio-inozytolu, gdzie jest on przekształcany w związki, które nie są szkodliwe dla rośliny. Sposób polega na wprowadzaniu nowych aktywności enzymatycznych, obejmujących w jednym z rozwiązań gen kodujący metylotransferazę, która wykorzystuje albo modyfikuje zgromadzony inozytol inaczej wykorzystywany przez komórki roślinne do wytwarzania kwasu fitowego. Zużycie albo zmiana zawartości tego prekursora prowadzi do biochemicznego przesunięcia w normalnym szlaku biosyntezy kwasu fitowego i powoduje zmniejszenie ilości wytworzonego kwasu fitowego.

Podstawą mechanizmu biochemicznego tego wynalazku jest regulowanie aktywności enzymatycznej drogą dostępności substratów. Na ogół szybkości reakcji enzymatycznych reguluje się dostępnością substratu. Enzym wytwarza produkt z szybkością, która jest na ogół proporcjonalna do ilości dostępnego substratu. Zmniejszanie stężeń substratu prowadzi do niższych poziomów ostatecznych produktów końcowych.

Zgodnie z powyższym w niniejszym wynalazku stosuje się nową aktywność enzymatyczną, metylotransferazę, która eliminuje dostępność substratu inozytolowego wykorzystywanego do tworzenia się kwasu fitowego. W ramach niniejszego wynalazku możliwe jest stosowanie dowolnego enzymu zdolnego do działania na całą ilość mio-inozytolu w nasieniu roślinnym. Sposób polega na wprowadzaniu aktywności enzymatycznej, która na wiele różnych sposobów wpływa na całą zawartość mioinozytolu wykorzystywanego w biosyntezie kwasu fitowego.

W przeciwieństwie do amerykańskiego opisu patentowego nr 5563324 w niniejszym wynalazku poszukuje się sposobu modyfikowania wytwarzania fitanu w sposób selektywny względem ekspresji genu kodującego enzym zdolny do modyfikowania mio-inozytolu powodując jego niedostępność w celu wytworzenia kwasu fitowego. Zadziwiające, że nawet konstytutywna ekspresja genu modyfikującego mio-inozytol prowadzi do zmniejszonych poziomów fitanu w nasieniu. Jednak w najkorzystniejszym rozwiązaniu niniejszego wynalazku stosuje się promotor selektywny względem nasienia w celu zabezpieczenia, aby agronomiczna skuteczność rośliny nie była ograniczona, a otrzymana roślina była normalna pod każdym względem z wyjątkiem zmniejszonych poziomów fitanu w nasionach. Zatem, w przeciwieństwie do amerykańskiego opisu patentowego nr US 5563324, w niniejszym wynalazku nie przewiduje się wytwarzania roślin tolerancyjnych na stres, ani nie liczy się na uzyskanie roślin do celów badawczych.

PL 194 895 B1

Sposób według wynalazku zapewnia wiele korzyści w porównaniu ze stanem techniki, związanych z obniżeniem zawartości kwasu fitowego drogą ekspresji genów kodujących fitazy. Obejmują one rośliny ze zmienionymi poziomami kwasu fitowego w specyficznych tkankach, roślinę z nasionami ze zmniejszonymi poziomami kwasu fitowego i miazgę z nasion ze zmniejszonym poziomem kwasu fitowego. Do zalet takich roślin, nasion i śruty należy lepsze wykorzystanie karmy i wydajność śruty, preparatów z nasion i kompozycji paszowych o zmniejszonych zawartościach fosforu, a zatem mniej szkodliwych dla środowiska i możliwością wykorzystania śruty do stosowania w przemyśle paszowym, ograniczonego poprzednio przez zbyt wysoką ilość przeciwżywieniowego kwasu fitowego w śrucie albo paszy.

Opisany sposób znajduje zastosowanie w wielu gatunkach roślin. Do tych gatunków należą, rośliny jednoliścienne i dwuliścienne oraz rośliny zbożowe i oleiste. Sposób jest szczególnie użyteczny w przypadku nasion oleistych i roślin krzyżowych.

Wynikiem takiej modyfikacji genetycznej są komórki roślinne ze zmodyfikowanym metabolizmem alkoholu cukrowego, a zwłaszcza metabolizmem inozytolu, oraz komórki roślinne ze zmniejszoną zawartością kwasu fitowego, a zwłaszcza nasiona roślin ze zmniejszoną zawartością fitanów. Stąd sposób według niniejszego wynalazku dostarcza ważny sposób modyfikacji metabolizmu wtórnego związanego z alkoholami cukrowymi.

Mimo, że rozwiązanie według tego wynalazku obejmuje zmianę metabolizmu alkoholi cukrowych, na przykład komórki roślinne ze zmniejszoną zawartością kwasu fitowego, jak wykazano w komórkach rośliny rzepaku canola, to rośliny zbożowe mają także wysoką zawartość kwasu fitowego i podobnie można uzyskać zmniejszenie zawartości kwasu fitowego w komórkach roślin zbożowych.

Zmniejszenie zawartości kwasu fitowego prowadzi się stosując nowo opisane sposoby i kompozycje DNA. Sposób polega na opracowaniu „bocznego szlaku metabolicznego” albo nowego szlaku biochemicznego, zdolnego do ukierunkowania prekursora w biochemicznym szlaku kwasu fitowego na nowo wprowadzony „szlak z martwym końcem”, który zmniejsza wytwarzanie kwasu fitowego. W wyniku specyficznego rozwiązania tego sposobu produkt(y) „szlaku z martwym końcem” są związkami, które są znane jako nieszkodliwe dla wymienionej komórki roślinnej. Zgodnie z tym, sądzi się w pełni, że bocznikowanie prekursorowych związków mio-inozytolu do tych związków nie stanowi w żaden sposób ograniczenia dla wzrostu rośliny.

Zgodnie z wynalazkiem zmodyfikowaną miazgę (śrutę) pochodzącą z genetycznie zmienionych nasion można stosować do karmienia rożnych zwierząt, takich jak drobiu, świń, cieląt i ryb.

Sposób polega na dodawaniu nowej aktywności enzymatycznej, która może zmieniać zawartość mio-inozytolu w nasionach i która może być stosowana bezpośrednio do wszystkich gatunków i odmian roślin. Ten sam gen można stosować w każdym gatunku roślin, ponieważ zmiana poziomu mio-inozytolu będzie odbywać się w taki sam sposób w każdym gatunku rośliny. Sposób nie polega na stosowaniu genowych technologii supresyjnych, które zależą od sekwencji DNA, a zatem wymagałyby specyficznych genów dopasowanych do każdego specyficznego genu albo gatunku uprawowego. Zatem niniejszy wynalazek jest przydatny dla wszelkich upraw. W ramach sposobu można stosować liczne odpowiednie enzymy z drobnoustrojów, roślin albo zwierząt. Te same genetyczne konstrukty można wykorzystać w wielu różnych gatunkach roślin.

W kontekście niniejszego wynalazku metabolizm inozytolu obejmuje hydroksylowanie, izomeryzację, metylowanie, rozszczepianie albo jakąkolwiek inną modyfikację biochemiczną, która powoduje, że mio-inozytol nie może być wykorzystany w żadnym ze szlaków metabolicznych, prowadzących typowo do wytworzenia kwasu fitowego. Zatem metabolizm inozytolu obejmuje każdą modyfikację, która skutecznie zmniejsza dostępność mio-inozytolu z zapasów substratów do biosyntezy kwasu fitowego.

Przykładowo w sposobie według wynalazku, stosuje się gen kodujący metylo-transferazę mioinozytolu. Enzym ten, pod kontrolą promotora selektywnego względem ekspresji w komórkach nasion roślin, jest zdolny do całkowitego wykorzystania zapasu mio-inozytolu w innym przypadku dostępnego w wymienionych nasionach roślinnych do produkcji fitanu. Zgodnie z innym aspektem wynalazku metylo-transferaza jest zdolna do przekształcania mio-inozytolu w nieszkodliwą substancję.

Komórki roślinne wytworzone sposobem według niniejszego wynalazku mają niezmieniony metabolizm pierwotny i fenotypy, które są nieodróżnialne od niezmodyfikowanych roślin, z wyjątkiem zmiany produktu albo produktów w specyficznym wtórnym szlaku metabolicznym.

Aby sprawdzić czy metabolizm pierwotny nie został zmodyfikowany, opisano tutaj sposób wytwarzania w sposób specyficzny dla tkanki, wtórnego metabolitu przez zmianę dostępności substratu,

PL 194 895 B1 który jest specyficzny dla wtórnego szlaku metabolicznego i istotny dla końcowego produktu tego szlaku, a zwłaszcza substratu z jednego z pięciu biochemicznych etapów tworzenia się produktu końcowego. W ten sposób uzyskano zmniejszenie zawartości specyficznych produktów wtórnego szlaku metabolicznego.

W kontekście niniejszego wynalazku związki stosowane jako prekursory produktów fenylopropanoidowego wtórnego szlaku metabolicznego obejmują między innymi kwas cynamonowy, kwas pkumarowy, kwas kofeinowy, kwas ferulowy, kwas 5-hydroksyferulowy, kwas synapowy, cholina, różne związki synapoilowe, obejmujące między innymi, synapoiloglukoza i synapoilojabłczan oraz synapoilocholina. W kontekście niniejszego wynalazku produkty szlaku fenylopropanoidowego obejmują między innymi, flawonoidy, ligniny, różne monomeryczne i spolimeryzowane związki fenolowe oraz synapinę. Dobór specyficznego enzymu umożliwia otrzymanie dowolnej liczby zmian zawartości produktów w szlaku fenylopropanoidowym. Enzymy do modyfikowania albo usuwania związków stosowanych jako prekursory mogą być pochodzenia drobnoustrojowego, zwierzęcego albo roślinnego. Enzymy mogą występować naturalnie albo pochodzić z mutacji znanego enzymu prowadzącej do zmiany specyficzności względem jego substratu, a zatem o nowej aktywności enzymatycznej.

Enzymy stosowane według niniejszego wynalazku mogą być enzymami zdolnymi do modyfikowania związków stosowanych jako prekursory produktów obecnych w szlaku fenylopropanoidowym drogą izomeryzacji, sprzęgania, fosforylowania, hydroksylacji, utleniania, odwodorniania, metylowania albo innej podobnej aktywności biochemicznej (włącznie z wiązaniem albo sekwestrowaniem), albo mogą stanowić enzymy zdolne do rozkładu związków będących prekursorami w szlaku fenylopropanoidowym, takie jak hydrolazy, dekarboksylazy, oksydazy, esterazy albo każdy inny enzym zdolny do degradowania L-fenyloalaniny, kwasu cynamonowego, kwasu p-kumarowego, kwasu kofeinowego, kwasu ferulowego, kwasu 5-hydroksyferulowego, kwasu synapowego, synapoiloglukozy, synapoilojabłczanu albo choliny (stosowane do wytwarzania synapiny z synapoiloglukozy). W jednym z aspektów sposobu według wynalazku stosuje się enzymy, które wytwarzają substancje zabezpieczające przed stresami ze związków stosowanych jako prekursory produktów utworzonych normalnie w szlaku fenylopropanoidowym. Podobnie do zmniejszania poziomu zawartości wymienionego produktu można wykorzystać aktywności enzymatyczne do specyficznego zmniejszania poziomu dodatkowego substratu, nie wytworzonego jako część szlaku fenylopropanoidowego, lecz wymaganego do tworzenia produktu ze szlaku fenylopropanoidowego. Zgodnie z powyższym obydwa związki stosowane jako prekursory w szlaku fenylopropanoidowym i każdy inny związek wymagany w szlaku fenylopropanoidowym do wytwarzania produktów, mogą być w ramach niniejszego sposobu związkami docelowymi.

W wynalazku związki stosowane jako prekursory produktów wtórnego szlaku metabolicznego alkoholi cukrowych obejmują między innymi, mio-inozytol, galaktynol i pochodne cukrów UDP. Produkty metabolizmu alkoholi cukrowych obejmują między innymi, kwas fitowy, stachyozę, rafinozę, sacharozyloglikozydy, urohidy i pentozy, fosfoinozytydy i glikofosfoceramidy. W kontekście niniejszego wynalazku aktywności enzymatyczne stosowane do modyfikacji związków w szlaku metabolizmu alkoholi cukrowych obejmują enzymy zdolne do hydroksylacji, izomeryzacji, metylowania, rozszczepiania albo jest to każda inna modyfikacja biochemiczna (taka jak wiązanie albo sekwestrowanie), która powoduje, że alkohol cukrowy nie podlega działaniu odpowiedniej aktywności enzymatycznej, która normalnie działa na wymieniony alkohol cukrowy. W ilustracji niniejszego wynalazku we wtórnym szlaku metabolizmu alkoholi cukrowych pokazano metylowanie inozytolu, który jest prekursorem kwasu fitowego, aby zmniejszyć dostępność inozytolu w biosyntezie kwasu fitowego.

Zgodnie z powyższym dla specjalistów z tej dziedziny jest oczywiste, że prekursorami produktu końcowego we wtórnym szlaku metabolizmu są te prekursory, które stosuje się bezpośrednio do tworzenia metabolitu wtórnego, albo te związki biochemiczne, które uczestniczą w reakcji biochemicznej prowadzącej do utworzenia specyficznego metabolitu wtórnego, przy czym wymienione związki biochemiczne nie są metabolitami pierwotnymi.

Enzymy stosowane do modyfikacji ilości związków albo całkowitego wykorzystania tych związków, które działają jako prekursory produktów we wtórnym szlaku metabolizmu, wytwarzają korzystnie wymienione związki, substancje, które są nieszkodliwe dla komórki roślinnej, a zatem mogą gromadzić się w dużych ilościach bez zmiany właściwości komórki roślinnej. Enzymy mogą wytwarzać także substancje, które mają korzystny wpływ na komórkę roślinną, takie jak środki zabezpieczające przed stresem, z wymienionych związków stosowanych jako prekursory produktów wtórnego szlaku metabolicznego. Stosowane enzymy mogą wytwarzać także substancje użyteczne, takie jak chemikalia przemysłowe, substancje farmaceutyczne albo substancje żywieniowe. W ramach niniejszego wynalazku

PL 194 895 B1 można stosować jeden albo więcej enzymów oraz można stosować więcej niż jedną różną aktywność w celu zmniejszenia poziomów specyficznych związków stosowanych jako prekursor produktu we wtórnym szlaku metabolicznym.

Enzymy stosowane w kontekście niniejszego wynalazku mogą pochodzić z różnych źródeł albo mogą być otrzymane różnymi sposobami. Na przykład zręczny specjalista może zidentyfikować docelowy związek stosowany jako prekursor we wtórnym etapie przemiany materii. Budowa chemiczna tych związków jest dobrze znana albo może być zidentyfikowana na podstawie literatury opisującej enzymy, w celu zidentyfikowania enzymu o znanej aktywności na chemicznie podobnych substratach. Zgodnie z powyższym można zidentyfikować odpowiedni enzym, uzyskać gen kodujący ten enzym i wykorzystać w sposobie według niniejszego wynalazku. Ponadto jako podstawę do otrzymania syntetycznego genu można wykorzystać także chemię kombinatoryczną albo podobne schematy, w których bada się sztucznie wytworzone białka pod kątem pożądanej aktywności. Enzymy stosowane w ramach niniejszego wynalazku można modyfikować stosując sposoby dobrze znane w stanie techniki.

Jednym przykładem modyfikacji enzymatycznej może być gen kodujący enzym oddziałujący na chemicznie podobne związki stosowane jako prekursory we wtórnym szlaku metabolicznym, który zmodyfikowano i ewentualnie wyselekcjonowano pod kątem zwiększonej aktywności, stosując takie techniki jak modyfikacja specyficzna względem miejsca, mutacja i wybór zmienionych specyficzności w układach heterologicznych, takich jak komórki bakteryjne albo grzybowe. Może to obejmować ekspresję genu kodującego wymieniony zmieniony enzym w komórkach bakteryjnych niezdolnych do reakcji metabolicznej wymienionych związków, selekcję bakterii, u których zachodzi ekspresja enzymu i które są zdolne do wzrostu w obecności wymienionych związków w pożywce albo źródle węgla i odzyskiwanie aktywności enzymatycznej zdolnej do działania na specyficzny związek stosowany jako prekursor we wtórnym szlaku metabolicznego. W ten sposób jest możliwe wytwarzanie enzymu specyficznego względem określonego związku stosowanego jako prekursor w specyficznym wtórnym szlaku metabolicznego. Alternatywnie do wzrostu na różnych związkach stosowanych jako prekursory we wtórnym szlaku metabolicznego można wykorzystać bakterie. Zręczny specjalista może łatwo dokonać wyboru zmutowanych bakterii albo innych komórek na specyficznych związkach stosowanych jako prekursory, dostarczając środka do identyfikowania specyficznych aktywności enzymatycznych, zdolnych do przekształcania wymienionych związków w nieszkodliwe substancje. Taki sposób podejścia może obejmować bezpośredni wybór specyficznych aktywności enzymatycznych albo stopniową modyfikację i wybór pożądanych aktywności enzymatycznych.

Podobnie zastosowanie znanych aktywności enzymatycznych, stosowanych aktualnie w handlu, takich jak preparaty enzymatyczne, wykorzystujące wyciągi z grzybów Trichoderma zdolne do degradowania ligniny do wytwarzania miazgi papierniczej, może stanowić źródło odpowiedniej aktywności enzymatycznej, na przykład uzyskanie enzymów biorących udział w degradacji związków fenolowych. Dla specjalisty w tej dziedzinie jest oczywiste, że w celu specyficznego oddziaływania na jeden ze związków stosowanych jako prekursor w szlaku fenylopropanoidowym można w ramach sposobu według wynalazku wykorzystywać geny kodujące enzymy stosowane w przemyśle papierniczym do przetwarzania ligniny, albo bezpośrednio, albo po modyfikacji. Zgodnie z powyższym przyjmuje się, że w ramach niniejszego sposobu można stosować szereg różnych aktywności enzymatycznych. Stąd sposób nie jest ograniczony źródłem albo specyficznością stosowanego enzymu.

Na przykład w jednym z aspektów sposobu stosuje się enzym, który wpływa na związek stosowany jako prekursor albo substrat dla produktu w szlaku fenylopropanoidowym z wytworzeniem substancji, na którą nie działa już enzym, który normalnie wykorzystywałby wymieniony związek jako prekursor w szlaku fenylopropanoidowym. Zgodnie z tym poziomy specyficznego produktu szlaku fenylopropanoidowego zmniejszają się w wyniku zmniejszenia poziomu prekursorów koniecznych do utworzenia wymienionego produktu. Otrzymaną komórkę roślinną można wykorzystać także bezpośrednio albo można poddać ją indukcji w celu zregenerowania całej rośliny ze zmienionymi poziomami produktów szlaku fenylopropanoidowego, który jest użyteczny w szeregu procesów przemysłowych, nie ograniczonych do zastosowań paszowych, wytwarzania miazgi papierniczej albo do wytwarzania roślin z nowymi kompozycjami związków fenolowych, włącznie z nadprodukcją niektórych produktów w szlaku fenylopropanoidowym. Drzewa o zmienionych poziomach produktów szlaku fenylopropanoidowego będą użyteczne w przemyśle celulozowo-papierniczym. Rośliny o zmienionych poziomach produktów fenylopropanoidowych będą użyteczne w przemyśle paszowym.

PL 194 895 B1

Zmiany rozpatrywanego szlaku fenylopropanoidowego, mogą prowadzić także do pozytywnych zmian w agronomicznej wydajności roślin uzyskanych wymienionymi sposobami, a zwłaszcza te aspekty wynalazku, w których wytwarzanie składnika chroniącego przed stresami wynika z dodanej aktywności enzymatycznej. Można przewidywać inne korzystne skutki, takie jak zwiększona odporność na choroby i promieniowanie UV, wytrzymałość mechaniczna, itp.

Geny kodujące enzymy zdolne do działania na związki stosowane jako prekursory produktów szlaku fenylopropanoidowego mogą być pochodzenia naturalnego, syntetycznego albo mogą być uzyskane w wyniku ich połączena. Zręczny praktyk łatwo oceni, że kodującą sekwencję genu można zmodyfikować umożliwiając wysokie poziomy ekspresji w komórkach roślinnych. Można tego dokonać przez zmianę sekwencji kodonów, tak aby przypominały one kodony obecne normalnie w komórce roślinnej, w której prowadzi się ekspresję genu. Ponadto jest oczywiste, że specyficzne miejsca restrykcyjne zmienić metodami inżynierii genetycznej umożliwiając dogodne modyfikacje sekwencji kodującej. Przyjmuje się także, że do zapewnienia odpowiedniej ekspresji sekwencji kodującej można wykorzystać dodanie różnych sekwencji, takich jak czynniki zwiększające translację, introny, itp. Enzymy można modyfikować także drogą zmiany centrów wiążących substraty albo innej modyfikacji względem pierwotnej sekwencji aminokwasowej, która zwiększa aktywność enzymatyczną. Wszystkie te modyfikacje są powszechnie znane w stanie techniki i mogą być łatwo wykorzystane przez zręcznych pracowników.

Enzym znajduje się pod kontrolą promotora selektywnego względem tkanki, a zwłaszcza promotora selektywnego względem nasion. Promotor selektywny względem nasion jest promotorem, który działa wyłącznie albo preferencyjnie powodując, że ekspresja sekwencji pod jego kontrolą jest ograniczona do tkanki w nasieniu roślinnym. Zgodnie z powyższym poziomy specyficznego produktu w szlaku fenylopropanoidowym zmieniają się w sposób selektywny względem tkanki, tak że inne tkanki roślinne wykazują normalne poziomy produktów szlaku fenylopropanoidowyego. Tkankę, w której gen kodujący enzym ulega selektywnej ekspresji, wykorzystuje się do wytwarzania paszy albo w każdym innym procesie przemysłowym.

Dla wykształconego technika jest oczywiste, że w ramach niniejszego wynalazku można stosować dowolną liczbę promotorów selektywnych względem tkanek. Promotor selektywny względem tkanek stosuje się zwłaszcza do zmiany produktów szlaku fenylopropanoidowego w tych uprawach, w których nasiona albo miazgę z nasion stosuje się na paszę. W innych uprawach różne promotory selektywne względem tkanek można stosować w zależności od części rośliny, w której jest pożądana zmiana zawartości składników fenolowych. Na przykład promotor selektywny względem korzenia albo bulwy można stosować do zmiany zawartości składników fenolowych albo ligniny w uprawach korzeniowych albo bulwowych, takich jak ziemniak, rzepa, manioka, itp. W warunkach, w których jako paszę wykorzystuje się liście albo łodygi, promotor selektywny względem łodyg można stosować do ograniczania ekspresji enzymów zdolnych do działania na związki stosowane jako prekursory w szlaku fenylopropanoidowym. Inne promotory selektywne względem tkanek można stosować w takich roślinach jak drzewa, które ścina się do wytwarzania miazgi papierniczej. Zatem w ramach niniejszego wynalazku stosuje się promotor, który ogranicza aktywność enzymu działającego na drewno w drzewach.

W sposobie według wynalazku może być również wykorzystana ekspresja genu kodującego enzym przekształcający cholinę, w wyniku czego usuwany zapas dostępnej choliny wykorzystywanej do tworzenia synapiny z synapoiloglukozy. Niektóre gatunki roślin, a mianowicie gatunki z rodziny Cruciferae, wytwarzają przeciwżywieniowy związek nazywany synapiną. Uważa się, że synapina jest syntetyzowana drogą wymiany ugrupowania glukozowego synapoiloglukozy (sin-glu) z choliną. Zmniejszenie zawartości związku przeciwżywieniowego, synapiny, zwiększa wartość nasion i otrzymanej z nich produktów. W niniejszym wynalazku stosowany jest enzym modyfikujący cholinę, taki jak cholinooksydaza.

Wiadomo, że w roślinach paszowych, takich jak pszenica, szpinak, trzcina cukrowa i jęczmień, choliną utlenia się do betainy (Rhodes i Hanson, 1993, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 44:357-384). Ten szlak oksydacyjny jest katalizowany dwoma enzymami (znany w kategoriach rodzajowych jako „układ utleniania choliny”), a produkty tego szlaku są pokazano niżej:

Cholina —> aldehyd betainowy —> glicynobetaina (betaina)

Pierwszy etap jest katalizowany przez dehydrogenazę choliny (CDH) albo oksydazę choliny (COX) w bakteriach i zwierzętach (Rozwadowski, Khachatourians i Selvaraj, 1991, Journal of Bacteriology, 173: 472-478) i przez monooksygenazę choliny (CMO) w roślinach (Rhodes i Hanson, 1993).

PL 194 895 B1

Drugi etap jest katalizowany przez dehydrogenazę aldehydu betainy (BADH) (Rhodes i Hanson, 1993). Zgodnie z powyższym zastosowanie enzymu katalizującego metabolizm choliny może doprowadzić do usunięcia dostępnej choliny w ogólny albo specyficzny sposób, z wykorzystaniem promotorów konstytucyjnych, indukowanych albo specyficznych dla tkanki. Zmniejszenie dostępności choliny zmniejsza wytwarzanie synapiny. Poza tym zmniejszenie ilości synapiny może wywołać zmiany w poziomach innych produktów szlaku fenylopropanoidowego, prowadząc do uzyskania tkanek o zmienionej zawartości składników fenolowych.

W innym specyficznym rozwiązaniu wynalazku gen kodujący cholinooksydazę z bakterii (COX) (Rozwadowski, Khachatourians i Selvaraj, 1991, Journal of Bacteriology, 173.: 472-478) umieszcza się pod kontrolą promotora selektywnego względem nasion. Ekspresja genu kodującego cholinooksydazy w nasionach zamienia cholinę, jeden z prekursorów biosyntezy synapiny w nasionach rzepaku canola, w nieszkodliwą substancję, betainę, poprzez tworzenie się betainoalkoholu, który przekształca się powoli z udziałem enzymu COX, w betainę. Nasiona zawierające zrekombinowany DNA mają zmniejszone poziomy synapiny i zmienione poziomy innych produktów szlaku fenylopropanoidowego. Produkty pochodzące z takich nasion są odpowiednie do stosowania w paszach.

W kolejnym rozwiązaniu niniejszego wynalazku gen COX stosuje się pod kontrolą promotora selektywnego względem nasion, a drugi gen kodujący enzym BADH, stosuje się w cel uzwiększania tworzenia się betainy z betaino-aldehydu. W tym rozwiązaniu BADH (Boyd, L.A, L. Adam, L.E. Pelcher, A. McHughen, R. Hirji and G. Selvaraj, 1990, Gene 103:45-52) ulega ekspresji pod kontrolą promotora selektywnego względem nasion.

Betaina jest związkiem obecnym w jadalnych częściach wielu roślin pastewnych i pokarmowych i w niektórych warunkach jest stosowana także jako dodatek do paszy i żywności. Betaina pełni także funkcję środka zabezpieczającego przed stresem.

W innym rozwiązaniu wynalazku gen COX stosuje się w komórce rośliny krzyżowej (Brassica sp.) pod kontrolą promotora selektywnego względem nasion, a drugi gen kodujący enzym BADH, który także ulega ekspresji pod kontrolą promotora selektywnego względem nasion, wykorzystuje się do zabezpieczenia tworzenia betainy z betainoaldehydu.

Zmiana zawartości choliny w nasionach roślin krzyżowych powoduje zmniejszenie zawartości synapiny, a w konsekwencji zmianę różnych produktów w szlaku fenylopropanoidowym. Uważa się, że zmiana poziomów choliny w nasionach prowadzi do wyższych poziomów synapoiloglukozy albo innych związków synapoilowych, takich jak jabłczan synapoilu, który z kolei modyfikuje poziomy kwasu synapowego, prekursora ligniny. Zatem jest uzyskany biochemiczny mechanizm regulacyjny, nazywany powszechnie hamowaniem produktu końcowego, prowadzący do zmiany poziomu różnych produktów w szlaku fenylopropanoidowym. Zgodnie z powyższym zapobieganie tworzeniu się synapiny skutkuje zmianami poziomów szeregu produktów tworzonych w etapach szlaku fenylopropanoidowego przed końcowym etapem tworzenia się synapiny.

Wtórny fenylopropanoidowy szlak metaboliczny można osiągnąć także za pomocą enzymu, który ulega ekspresji w komórkach roślinnych i działa na kwas ferulowy. Kwas ferulowy jest innym prekursorem w szlaku fenylopropanoidowym. Zgodnie z powyższym zmniejszają się poziomy kwasu ferulowego, a zmniejszenie dostępności kwasu ferulowego prowadzi do zmian poziomów związków fenolowych, włącznie że zmniejszeniem zawartości synapiny w roślinach krzyżowych.

Geny kodujące enzymy zdolne do działania na kwas ferulowy mogą być pochodzenia naturalnego, syntetycznego albo mogą być ich połączeniem. Wykształcony technik może łatwo ocenić, że kodującą sekwencję genu można modyfikować w celu umożliwienia wyższych poziomów ekspresji w komórkach roślinnych.

Zgodnie z innym aspektem wynalazku gen kodujący enzym zdolny do działania na kwas ferulowy jest umieszczony pod kontrolą promotora selektywnego względem tkanki. Zgodnie z powyższym poziomy kwasu ferulowego zmienia się w sposób selektywny względem tkanki, podczas gdy inne tkanki rośliny mają normalne poziomy kwasu ferulowego. Tkankę, w której gen kodujący enzym ulega selektywnej ekspresji, wykorzystuje się do wytwarzania preparatów paszowych, pokarmowych albo w innym procesie przemysłowym.

Enzymy, które są stosowane w tych rozwiązaniach obejmują enzymy zdolne do modyfikowania kwasu ferulowego, a zwłaszcza enzymy znane z wytwarzania cennych związków z kwasu ferulowego.

Dla specjalisty w ten dziedzinie jest oczywiste, że w ramach niniejszego wynalazku, aby poddać metabolizmowi kwas ferulowy, można stosować także inne enzymy. Wiadomo, że katalizują metabolizm kwasu ferulowego eznymy z następujących drobnoustrojów: Aerobacter sp., Bacillus megaterium,

PL 194 895 B1

B. subtilis, Corynebacterium glutamicum, Enterobacter sp., Psettdomonas sp., Streptomyces sp., Aspergillus sp., Candida sp., Fusarium sp., Hansenula sp., Penicillum sp., Rhodotorula sp., Saccharomyces sp. Ta lista nie jest wyczerpująca i służy jedynie do ilustracji wielu źródeł enzymów, które katalizują metabolizm ferulanu i które są znane w stanie techniki. Stąd sposób nie jest ograniczony źródłem enzymu stosowanego do poddawania metabolizmowi kwasu ferulowego. W ramach niniejszego wynalazku przewiduje się zmianę genu kodowanego przez drobnoustroje w celu zabezpieczenia optymalnej ekspresji w komórkach roślinnych. Wymienione sposoby są dobrze znane w stanie techniki. Enzymami stosowanymi przykładowo są: dekarboksylaza kwasu ferulowego z B. pumulis. Wyodrębniono gen kodujący ten enzym i poddano go sekwencjonowaniu (Zago i wsp, Applied and Environmental Microbiology 61:4484-4486). Sekwencje genu można modyfikować, tak aby bardziej przypominał gen roślinny, zachowując jednocześnie przewidywaną sekwencję aminokwasową. Enzym jest zdolny do wytwarzania winylogwajakolu z kwasu ferulowego drogą dekarboksylacji. Zgodnie z powyższym w jednym z przykładów sposobu według wynalazku cenny związek (winylogwajakol, VG) wytwarza się wykorzystując aktywność enzymatyczną wprowadzonego genu zdolnego do działania na kwas ferulowy. Enzym nie wymaga dodatkowych kofaktorów i ma masę cząsteczkową w przybliżeniu około 22 kilopar zasad.

W innym specyficznym rozwiązaniu niniejszego wynalazku enzym dekarboksylazy ferulanu umieszcza się pod kontrolą promotora selektywnego względem tkanki, co prowadzi do rośliny zawierającej tkanki zmienione specyficznie w szlaku metabolizmu kwasu ferulowego.

Zmiana poziomu kwasu ferulowego prowadzi do obniżenia zawartości kwasu ferulowego, a dalej do zmiany różnych produktów szlaku fenylopropanoidowego.

Poza bezpośrednim skarmianiem całymi albo częściowo rozdrobnionymi nasionami istnieje wiele sposobów stosowanych do wytwarzania śruty z tych nasion. Szczególnie ważne jest w przypadku nasionach roślin krzyżowych wytwarzanie śruty w czasie ekstrakcji oleju z oleistych nasion roślin krzyżowych. Na ogół olej ekstrahuje się z nasion oleistych stosując albo rozpuszczalnik albo korzystając ze sposobów nierozpuszczalnikowych. Placek albo pozostałe części stałe wytworzone w tym procesie stosuje się do kompozycji śrutowych i zawierają one zwykle większość składników fenolowych nasion roślin krzyżowych. Sposób wytwarzania śruty z niższą zawartością składników fenolowych daje nową kompozycję, aktualnie nie występującą w śrucie z nasion roślin krzyżowych.

W sposobie według wynalazku możliwe jest wykorzystywanie genetycznie zmodyfikowanych nasion wytworzonych sposobem według wynalazku do otrzymywania produktu śrutowego o zmienionej zawartości składników fenolowych.

Opisany sposób ma wiele korzyści odnośnie zmiany fenotypu rośliny. Poza tym sposób umożliwia wytwarzanie różnych związków o znanej użyteczności przemysłowej. Opisany sposób znajduje zastosowanie w każdym gatunku rośliny albo tkance roślinnej.

Opisany sposób ma wiele zalet w porównaniu ze stanem techniki w zakresie modyfikacji szlaku fenylopropanoidowego. Sposób nie polega na mutacjach, takich jak mutacja SINI, która ujawnia się w całej roślinie i jest związana z wrażliwością na promieniowanie UV. W sposobie nie wykorzystuje się mechanizmów genetycznych przewidzianych do blokowania ekspresji genów, takich jak antysensywny RNA albo ko-supresja, które wymagają klonowania genów roślinnych ze szlaku fenylopropanoidowego. W sposobie nie modyfikuje się specyficznie żadnego genu rodzimego dla rośliny. Zgodnie z powyższym nie zmienia się niekorzystnie różnych funkcji szlaku metabolicznego, takich jak wytwarzanie flawonoidów, wytwarzanie środków chroniących przed promieniowaniem UV, udział w reakcji na patogeny i inne biochemiczne funkcje szlaku. Przez stosowanie promotorów selektywnych względem tkanek zawartość składników fenolowych można zmienić w dowolnej tkance, podczas gdy inne tkanki rośliny pozostają niezmienione.

Opisany sposób znajduje zastosowanie w wielu gatunkach roślin, a szczególnie w roślinach krzyżowych. Dzięki temu sposobowi uzyskuje się dodatkową korzyść przez wytwarzanie środka chroniącego przed stresem albo cennego związku przemysłowego w wyniku wprowadzenia aktywności enzymatycznej. Jest oczywiste, że za pomocą sposobu można uzyskać modyfikację szeregu etapów w szlaku fenylopropanoidowym, a w podobny sposób można modyfikować inne szlaki biochemiczne.

Niniejszy wynalazek jest stosowany również do modyfikowania innych wtórnych szlaków metabolizmu. Na przykład w jednym z rozwiązań niniejszego wynalazku opracowano sposoby i konstrukty DNA do wytwarzania roślin ze zmienionym metabolizmem alkoholi cukrowych, a zwłaszcza ze zmianą zawartości fitanu w komórkach roślinnych. Fitan pochodzi z alkoholu cukrowego, mio-inozytolu, który służy także jako prekursor albo związek pośredni przy tworzeniu się innych związków, włącznie ze

PL 194 895 B1 stachyozą, rafinozą, sacharozyloglikosacharydami, uronidami i pentozami, fosfo-inozytydami i glikofosfoceramidami. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem opracowano ponadto sposoby i kompozycje DNA do zmniejszania zawartości fitanu w nasionach roślin krzyżowych. Zgodnie z wynalazkiem opracowano ponadto nasiona roślinne o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego, nadające się do zastosowań paszowych, nasiona roślinne o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego, nadające się do wytwarzania zmodyfikowanego śrutu oraz komórki roślinne ze zmodyfikowanym metabolizmem inozytolu.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem opracowano sposoby i konstrukty DNA do wytwarzania roślin ze zmienioną zawartością fitanu w komórkach roślinnych. Zgodnie z wynalazkiem opracowano dalej sposoby i kompozycje DNA do zmniejszania zawartości fitanu w roślinach jednoliściennych, dwuliściennych, nasionach oleistych i nasionach roślin krzyżowych. Zgodnie z wynalazkiem opracowano także nasiona roślinne o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego, odpowiednie do zastosowań paszowych, nasiona roślinne o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego, odpowiednie do wytwarzania zmodyfikowanej śruty oraz komórki roślinne ze zmodyfikowanym metabolizmem inozytolu.

W niniejszym wynalazku wykorzystuje się ekspresję genów kodujących enzymy, które działają na prekursor, alkohol cukrowy, w biosyntezie kwasu fitowego, mio-inozytol, powodujący metaboliczne przekształcenie tego prekursora w związki w szlaku z „martwym końcem” albo ulegające reakcji metabolicznej w niewielkim stopniu, które mogą być gromadzone w komórce roślinnej bez szkodliwego działania. W ten sposób uzyskuje się zmniejszenie poziomu biosyntezy kwasu fitowego. Sposobami opisanymi w niniejszym wynalazku można uzyskać szlaki metaboliczne innych alkoholi cukrowych. Enzym działający na mio-inozytol może być pochodzenia drobnoustrojowego, zwierzęcego albo roślinnego. W celu zmiany specyficzności swojego substratu, a zatem wytworzenia nowej aktywności enzymatycznej, może być stosowany enzym występujący naturalnie albo uzyskany w wyniku mutacji ze znanego enzymu.

Enzym stosowany do modyfikowania mio-inozytolu katalizuje wytwarzanie korzystnych związków, które są nieszkodliwe dla komórki roślinnej, a zatem mogą być one gromadzone w komórce roślinnej nawet do wysokich poziomów bez szkodliwych skutków dla komórki roślinnej. W ramach niniejszego wynalazku można stosować jeden albo więcej enzymów, a jedną albo więcej aktywności enzymatycznych można wykorzystać do zmniejszenia poziomu mio-inozytolu.

Enzymy stosowane w ramach niniejszego wynalazku są enzymami zdolnymi do modyfikowania mio-inozytolu drogą izomeryzacji, sprzęgania, fosforylacji, hydroksylowania, metylowania albo za pomocą jakiejkolwiek innej podobnej aktywności biochemicznej albo mogą być enzymami zdolnymi do eliminowania mio-inozytolu albo innych alkoholi cukrowych.

Enzymy stosowane w sposobie według wynalazku mogą pochodzić z wielu źródeł albo można je uzyskać różnymi sposobami. Na przykład wykształcony technik może zidentyfikować enzym o znanej aktywności względem chemicznie podobnych substratów. Zgodnie z powyższym można zidentyfikować enzym, wyodrębnić i wykorzystywać w sposobie według wynalazku gen kodujący ten enzym. Enzymy stosowane w sposobie według wynalazku można modyfikować stosując sposoby znane w stanie techniki.

Sposób według wynalazku polega również na wykorzystywaniu transformacji w celu wprowadzenia do komórek roślinnych genu kodującego enzym. Transformację komórki roślinnej można przeprowadzić różnymi technikami. Ogólnie stosuje się układy oparte na Agrobacterium, stosując plazmidy wahadłowe albo kointegracyjne zarówno z A. tumifaciens, jak i A. rhyzogenes (na przykład US 4940838, US 5464763), technikę biobalistyczną (na przykład US 4945050, US 5015580, US 5149655), mikroiniekcję (na przykład US 4743548), bezpośrednie przenikanie DNA do protoplastów (na przykład US 5231019, US 5453367) albo igłopodobne wąsy (needle-like whiskers; na przykład US 5302523). W sposobie według wynalazku stosować można dowolną technikę genetycznej transformacji komórki roślinnej.

Przykładem komórek roślinnych według wynalazku są komórki roślinne ze zmienionym metabolizmem alkoholu cukrowego. Od alkoholi cukrowych pochodzą liczne związki, lecz główne znaczenie ma kwas fitowy albo fitan. Sposoby zmniejszania zawartości fitanu w niektórych komórkach roślinnych są bardzo użyteczne w produkcji pasz.

Geny kodujące enzymy katalizujące reakcje mio-inozytolu mogą być genami naturalnymi, syntetycznymi albo ich połączeniem. Wykształcony technik łatwo oceni, że sekwencję kodującą genu można tak zmodyfikować, aby uzyskać wysokie poziomy ekspresji w komórkach roślinnych. Można tego dokonać przez zmianę sekwencji kodonów, aby bardziej przypominały one zastosowanie kodonów występujących normalnie w komórce roślinnej, w której gen ulega ekspresji. Ponadto jest oczywiste,

PL 194 895 B1 że odpowiednie miejsca restrykcyjne można poddawać modyfikacjom genetycznym w celu umożliwienia dogodnej modyfikacji sekwencji kodującej. W celu uzyskania odpowiedniej ekspresji sekwencji kodującej można również stosować dodanie różnych sekwencji, takich jak enchancery translacji, introny, itp. Wszystkie te modyfikacje są powszechnie znane w stanie techniki i mogą być łatwo wykorzystane przez wykształconego technika.

Jest także oczywiste, że promotor selektywny względem tkanki można stosować do ograniczenia ekspresji enzymu zdolnego do modyfikowania mio-inozytolu do tych tkanek, w których wytwarza się kwas fitowy, takich jak tkanka nasienia. Do odpowiednich promotorów selektywnych względem nasion należy promotor napinowy z Brassica napus, promotor fazeolinowy z Phaseolls albo dowolny inny promotor, który jest selektywny względem nasion.

W sposobie według wynalazku możliwe jest zastosowanie genetycznie modyfikowanych nasion, wytworzonych drogą ekspresji genów kodujących enzymy katalizujące reakcje mioinozytolu, przy czym gen kodujący enzym znajduje się pod kontrolą promotora selektywnego dla roślin. Zgodnie z powyższym uzyskuje się zmniejszenie poziomów kwasu fitowego. Po przetworzeniu nasion otrzymuje się produkt o obniżonej zawartości kwasu fitowego. Zgodnie z powyższym w wyniku sposobu według wynalazku uzyskuje się paszę o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego. Wykształcony technik z łatwością oceni, że w wyniku niniejszego wynalazku można wytwarzać śrutę o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego z nasion roślin krzyżowych.

Wiadomo, że obecność kwasu fitowego w śrucie z nasion jest szkodliwa dla ryb hodowanych w gospodarce wodnej. Jednak śruty z niektórych nasion, takie jak śruta rzepakowa z rzepaku canola, ma skład białkowy, który jest odpowiedni do karmienia ryb. Wysokie stężenie kwasu fitowego w śrucie rzepakowej z rzepaku canola ogranicza ilość karmy, którą można stosować w diecie ryb.

Zatem śruta o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego, wytworzona z nasion roślin krzyżowych, jest bardzo użyteczna w gospodarce wodnej.

Zgodnie z powyższym niniejszy wynalazek znajduje zastosowanie przy wytwarzaniu nasion ze zmodyfikowaną zawartością kwasu fitowego oraz śruty z nasion o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego. Zmodyfikowane nasiona i śruta są przydatne w szeregu zastosowań do wytwarzania paszy, włącznie z paszą dla drobiu, świń, w gospodarce wodnej, dla zwierząt przeżuwających i nieprzeżuwających. Jest ponadto oczywiste z dalszego opisu, że do modyfikowania mio-inozytolu według niniejszego wynalazku stosować można każdą liczbę różnych enzymów. Jest także oczywiste, że do uzyskania specyficznego zmniejszenia zawartości kwasu fitowego można stosować różne połączenia tych enzymów stosując promotory selektywne względem nasion.

Zastosowanie wynalazku do wtórnego szlaku alkoholu cukrowego nie ogranicza się do przykładowych gatunków roślin. Sposobem według niniejszego wynalazku można modyfikować każdy gatunek rośliny, który wytwarza kwas fitowy. Sposób jest przydatny w każdym gatunku uprawowym, ponieważ stosowany enzym, O-metylo-transferaza, jest heterologiczna względem każdego głównego gatunku uprawowego o znaczeniu handlowym. Stąd w celu wytworzenia roślin o zmniejszonej zawartości fitanu według niniejszego sposobu można modyfikować każdy gatunek uprawowy, który stosuje się do karmienia zwierząt albo który wytwarza nasienie, które stosuje się częściowo albo w całości do karmienia zwierząt. Zgodnie z powyższym sposób można stosować do każdej uprawy, włącznie z roślinami jednoliściennymi (na przykład kukurydzą, ryżem, pszenicą, jęczmieniem i żytem), jak i roślinami dwuliściennymi (na przykład soją, bawełną, lucerną, roślinami z rodzaju Brassica, lnem, słonecznikiem, itp.).

Niniejszym sposobem według wynalazku uzyskuje się modyfikację szlaku metabolicznego zarówno fenylopropanoidowego, jak i alkoholu cukrowego. W opisie wynalazku przedstawiono szczegółowe przykłady dotyczące niezawodnych i przewidywalnych sposobów według wynalazku zmniejszenia zawartości specyficznych związków metabolicznych, a zwłaszcza związków przeciwżywieniowych.

Dla specjalisty w tej dziedzinie jest oczywiste, że w ramach zakresu niniejszego wynalazku można zmienić każdy wtórny szlak metaboliczny. Wynalazek zademonstrowano w dwóch niezwiązanych ze sobą wtórnych szlakach metabolicznych i daje on przewidywalne i realne wyniki. Zmniejszenie zawartości środków przeciwżywieniowych, na przykład w komórkach rośliny rzepaku canola, komórkach roślin zbożowych, komórkach roślinnych ryżu i komórkach roślinnych bawełny, uzyskuje się korzystając z informacji zawartych w niniejszym opisie.

Sposób według niniejszego wynalazku obejmuje również wskazówki, wystarczające wykształconemu technikowi do przeprowadzenia oceny wytwarzania specyficznego wtórnego metabolitu. Stąd wykształcony specjalista łatwo oceni, że wystarczająca jest podstawowa wiedza o tkankach, w których

PL 194 895 B1 wtórny metabolit albo związek stosowany jako jego prekursor ulega syntezie oraz kiedy proces ten zachodzi w rozwoju rośliny. Taka informacja dostarcza wskazówek do wyboru promotora do regulacji ekspresji enzymu, który działa na wtórny metabolit albo jego prekursor. W ten sposób wykształcony technik łatwo stwierdzi jakiego enzymu skierowanego na wtórny metabolit będzie potrzebować, aby uzyskać wpływ na prekursor wymienionego wtórnego metabolitu w tkance, w której wytwarza się wymieniony wtórny metabolit, jak również kiedy proces ten zachodzi w rozwoju rośliny. Zatem enzym, który działa na prekursor wymienionego wtórnego metabolitu, powinien ulegać ekspresji w czasie albo blisko czasu syntezy prekursora.

Wykształcony pracownik uzyskał ponadto wskazówkę aby przeprowadził analizę biochemiczną tkanki, w której chce zrealizować wynalazek. Wspomniana analiza może obejmować oznaczanie poziomów różnych związków w tkance w czasie rozwoju, każdy podział na przedziały albo umiejscowienie biosyntezy w komórce, okres w czasie rozwoju, gdy związek jest syntetyzowany albo już nie jest syntetyzowany i każdą inną odpowiednią informację biochemiczną. Dzięki przeprowadzeniu tej analizy wykształcony technik będzie mógł wybrać promotor, który zapewni odpowiednie poziomy ekspresji w celu wprowadzenia pożądanej zmiany zawartości wtórnego metabolitu w tkance roślinnej. Ocenia się, że pożądany skutek można uzyskać nawet przy małych zmianach poziomów związków stosowanych jako prekursory.

Na przykład część rozwiązania obniżenia poziomu kwasu fitowego według niniejszego wynalazku obejmuje wskazówkę, że podstawowe zrozumienie tkanek, w których syntezowany jest kwas fitowy i okresu rozwoju, w którym wytwarzany jest kwas fitowy, dostarczy wskazówek co do wyboru promotora do regulacji ekspresji enzymu oddziałującego z mio-inozytolem. W ten sposób wykształcony technik łatwo oceni, jaki enzym będzie konieczny, aby oddziaływać na mio-inozytol w tkance, w której jest wytwarzany kwas fitowy, jak również odnośnie okresu rozwoju, w którym wytwarzany jest kwas fitowy. Stąd ekspresja enzymu katalizującego reakcje mio-inozytolu, powinna zachodzić w czasie albo blisko czasu syntezy kwasu fitowego. Poziom ekspresji enzymu można modyfikować w celu uzyskania specyficznego poziomu zmniejszenia zawartości kwasu fitowego. Ten poziom zmniejszenia zawartości może zmieniać się od małego udziału procentowego do prawie zupełnego wyeliminowania kwasu fitowego. Wykształcony technik łatwo oceni, że zmniejszenie zawartości kwasu fitowego, zwłaszcza w niektórych gatunkach uprawowych bogatych w kwas fitowy, może wymagać wyższych poziomów ekspresji genu kodującego enzym, który modyfikuje mio-inozytol, niż w tych gatunkach uprawowych, w których kwas fitowy jest obecny w niższych poziomach. Modyfikacja poziomów ekspresji różnymi technikami jest dobrze znana w tej dziedzinie. Może to obejmować wprowadzenie sekwencji DNA, które zwiększają translację, silnych promotorów, które umożliwiają wysokie poziomy transkrypcji albo dodanie sekwencji DNA, takich jak obszary przyłączenia matrycy albo przyłączenia podłoża, które mają zapewnić niezawodne wysokie poziomy transkrypcji modyfikowanych genów.

W tym rozwiązaniu sposobu według wynalazku przewiduje się także, wytwarzanie tkanki roślinnej, a zwłaszcza nasion roślinnych, które są użyteczne w zastosowaniach paszowych. Zakresem niniejszego wynalazku jest objęte zarówno bezpośrednie skarmianie nasionami, jak i zastosowanie zmodyfikowanej śruty z przetworzonych nasion. Zmniejszenie zawartości kwasu fitowego w nasionach roślinnych jest pożądane w zastosowaniach paszowych, a modyfikowane genetycznie nasiona ze zmienioną zawartością kwasu fitowego są bardzo użyteczne w przemyśle paszowym.

W niektórych rozwiązaniach zwierzęta można karmić całym ziarnem albo ziarno może być minimalnie przetworzone lecz nie frakcjonowane. Na przykład ziarno kukurydziane stosuje się do skarmiania często z minimalnym przetworzeniem. Jednak ziarno kukurydziane może być przetwarzane, a otrzymane produkty przetwarzania, takie jak kukurydziana śruta glutenowa, także może być podwana zwierzętom. Obydwa rodzaje paszy kukurydzianej mogą korzystać ze zmniejszonych poziomów kwasu fitowego, zwłaszcza gdy odnosi się to degradacji środowiska na skutek nadmiaru fosforu wydzielanego przez zwierzęta. Z niniejszego wynalazku korzystać można w celu otrzymania także innych ziaren stosowanych do karmienia zwierząt, takich jak pszenica, jęczmień i owies. Stąd niniejszy wynalazek znajduje zastosowanie w bardzo wielu, ekonomicznie ważnych gatunkach roślin uprawowych. Ustalono, że gen zademonstrowany w niniejszym wynalazku jako odpowiedni zmiany poziomów mioinozytolu będzie działać w każdym gatunku uprawowym, ponieważ mio-inozytol jest obecny we wszystkich gatunkach roślin uprawowych i jest jedynym znanym prekursorem w biosyntezie kwasu fitowego. Stąd wykazano wyraźnie przydatność genu metylo-transferazy do zmiany poziomu mioinozytolu. Wykształcony technik może łatwo ocenić, że kodującą sekwencję kodującego obszaru spePL 194 895 B1 cyficznej sekwencji DNA promotora albo niepoddanej translacji sekwencji liderowej, terminatora, itp., można modyfikować w celu uzyskania optymalnej ekspresji w komórce roślinnej określonego gatunku rośliny. Wszystko to mieści się w ramach umiejętności przeciętnego technika. Stąd niniejszy wynalazek można zrealizować w każdym gatunku rośliny odpowiednim do transformacji genetycznej, włącznie z tymi gatunkami roślin, których ziarno przetwarza się przed wykorzystaniem do produkcji pasz.

Zgodnie z powyższym w wyniku stosowania sposobu według wynalazku może być wytworzony preparat paszowy z całego ziarna, o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego.

Poza bezpośrednim stosowaniem do karmy całego albo częściowo pokruszonego nasienia istnieje wiele sposobów stosowanych do wytwarzania śruty z nasion. Na przykład do wytwarzania, między innymi, glutenowej śruty kukurydzianej stosuje się mielenie kukurydzy na mokro. Poza przetworzonymi kukurydzianymi produktami paszowymi sposobem według niniejszego wynalazku można wytwarzać całe ziarno kukurydziane o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego. Niniejszy wynalazek znajduje zastosowanie także przy wytwarzaniu glutenowej śruty kukurydzianej o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego.

Poza głównymi uprawami paszowymi, takimi jak kukurydza, dużą ilość śruty roślinnej stosowanej do paszy uzyskuje się z upraw roślin oleistych. W przypadku nasion oleistych szczególne znaczenie ma wytwarzanie śruty przy ekstrakcji oleju. Na ogół olej ekstrahuje się z nasion oleistych stosując albo rozpuszczalnik albo korzystając z procesu bezrozpuszczalnikowego. Placek albo stałe wytłoki wytworzone w tym procesie wykorzystuje się w mieszankach paszowych i zawierają one zwykle większość kwasu fitowego z nasion.

Najbardziej rozpowszechniony sposób przetwarzania nasion oleistych polega na ekstrakcji oleju i odzyskiwaniu placka albo pozostałych składników nasion po ekstrakcji oleju. Niniejszy wynalazek znajduje zastosowanie w tym procesie, a dzięki zmniejszonej zawartości kwasu fitowego otrzymane produkty śrutowe mogą być cenniejsze niż konwencjonalnie wytworzona śruta.

Stąd sposób wytwarzania śruty o obniżonej zawartości kwasu fitowego dostarcza nowego składu, nie występującego naturalnie w śrucie z nasion oleistych. Większość upraw roślin oleistych, w których wykorzystuje się niniejszy wynalazek, obejmują krzyżowe uprawy roślin oleistych, takie jak Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, Brassica nigra, Sinapis alba, Crambe, Eruca sativa i inne nasiona oleiste roślin krzyżowych, które mogą mieć znaczenie handlowe i mogą być stosowane na śrutę. Do nasion oleistych roślin niekrzyżowych, które wykorzystuje się często w zastosowaniach paszowych, należy soja, bawełna, kukurydza, szafran barwierski, słonecznik i orzech ziemny.

W sposobie według wynalazku możliwe jest stosowanie genetycznie modyfikowanych nasion roślinnych wytworzonych przez ekspresję enzymów katalizujących reakcje mio-inozytolu, przy czym enzym znajduje się pod kontrolą promotora selektywnego względem nasion. Zgodnie z powyższym zmniejszone są poziomy kwasu fitowego. Po przetworzeniu nasion oleistych otrzymuje się produkt śrutowy o zmniejszonej zawartości kwasu fitowego.

Poniższe przykłady służą do zilustrowania sposobu według wynalazku i w żaden sposób nie ograniczają zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1: Ogólne sposoby stosowane do identyfikacji produktów szlaku fenylopropanoidowego: oznaczanie zawartości synapiny, końcowego produktu szlaku fenylopropanoidowego w roślinach krzyżowych

Jest oczywiste, że wykształcony technik może przystosować wszystkie przedstawione sposoby do oznaczania produktów szlaku fenylopropanoidowego przez odniesienie do licznych publikacji z dziedziny chemii analitycznej. W pierwszym podanym przykładowo sposobie prostą próbę identyfikacji synapiny w tkance roślinnej, a mianowicie w tkance nasion roślin krzyżowych, opracowano na podstawie opublikowanych sposobów (Chapple, C.C.S., T. Vogt, B.E. Ellis i C. R. Somerville, 1002, Plant Cell 4:1413-1424). Protokół chromatografii cienkowarstwowej (TLC) poddano standaryzacji pod kątem oceny produktu szlaku fenylopropanoidowego, synapiny. W tym sposobie wykorzystano rozdzielenie wyciągów roślinnych i znanej ilości synapiny w postaci plamek na płytkach krzemionkowych (na przykład Whatman 60A SilicaG). Synapinę można oczyszczać według opublikowanych sposobów (na przykład D. Strack, 1977, Z. Pflanzenphysiol. 84:139-145). Rozdzielanie odbywało się drogą przesuwania się mieszaniny rozpuszczalników - n-butanolu, kwasu octowego i wody - w proporcji odpowiednio 10:2:3, w przybliżeniu do 10 cm od momentu naniesienia. Wyciągi z nasion przygotowywano drogą moczenia w ciągu nocy zważonej wcześniej próbki w szczelnie zamkniętej probówce zawierającej 100-500 mikrolitrów roztworu metanolowego (98% metanolu, 2% kwasu octowego), a następnie dodawania jednakowej objętości metanolu, takiej samej jak dodano uprzednio i mielenia. Po wirowa26

PL 194 895 B1 niu z prędkością około 12000 x g otrzymano klarowną ciecz, którą ekstrahowano mieszaniną chloroform:woda (CW, 400 mikrolitrów: 100 mikrolitrów), wirowano jak wyżej, fazę lipidową usuwano, a fazę wodną suszono na powietrzu albo suszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Próbki rozpuszczano w wodzie i otrzymywano plamki na płytkach TLC. Z określonej ilości próbki, jak określono na podstawie prób doświadczalnych, uzyskiwano plamki na płytkach TLC przed wystawieniem na działanie rozpuszczalnika wstępującego. Pomiary masy suchej, tam gdzie je stosowano, uzyskiwano przez ważenie po suszeniu znanej ilości świeżych próbek.

Następnie płytkę TLC oglądano w świetle UV, w którym synapina widoczna jest jako jasna plamka. Wcześniej oczyszczoną próbkę synapiny wykorzystano jak standard, samodzielnie, a także w postaci sztucznej mieszaniny z wyciągiem z nasion w celu upewnienia się, że oczyszczona synapina migruje razem z synapina z wyciągu z nasion, gdy jest obecna w składnikach wyciągów z nasion. Gdy monitorowaniu poddaje się synapinę znakowaną promieniotwórczo, to płytki TLC poddaje się skanowaniu w skanerze Ambis4000 (Scananalytica), który obrazuje ilościowo emisję promieniotwórczą.

Następnie do weryfikowania zawartości synapiny stosuje się wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Wyciągi metanolowe materiału roślinnego jak wyżej, lecz bez ekstrakcji chloroformwoda, poddaje się analizie HPLC w aparaturze HPLC Varian wyposażonej w kolumnę Nucleosil C18AB. Objętość wtrysku wynosiła typowo 10 mikrolitrów, a faza ruchoma była mieszaniną roztworu A (2% kwas octowy w wodzie) i roztworu B (2% kwas octowy w acetonitrylu). Typowe warunki przebiegu procesu w fazie ruchomej: roztwór A zmieniający się od 90% do 80% w ciągu 17 minut, a następnie dalszy spadek do 10% w ciągu 1 minuty. Kolumnę utrzymywano przy 10% roztworu A w ciągu czterech minut, a następnie przepłukiwano i doprowadzano do równowagi za pomocą 90% roztworu A. Aby ulepszyć rozdzielenie wymytych substancji warunki HPLC można zmieniać. Na przykład roztwór A można zmieniać od 90% w czasie początkowym do 80% w ciągu 15 minut, do 70% w ciągu 15 minut, a następnie do 10% w ciągu 2 minut, a następnie w ciągu dalszych 2 minut przy 10%, i doprowadzaniu do równowagi za pomocą 90%. Do monitorowania absorbancji promieniowania UV stosowano detektor z układem diodowym. Do analizy próbek stosowano ustawienie absorbancji promieniowania UV przy długości fali 330 nanometrów. Wykreślano krzywą wzorcową dla oczyszczonej synapiny i wykorzystywano ją do ilościowego oznaczenia synapiny w wyciągach roślinnych. Dla specjalisty jest oczywiste, że warunki HPLC (na przykład proporcje i gradient rozpuszczalników, różne rodzaje rozpuszczalników) można zmieniać. Pożądane jest oznaczenie warunków, które są odpowiednie dla sprzętu i złożoności stosowanej próbki. Opublikowana literatura podaje informacje o szeregu warunków HPLC do analizowania związków fenolowych, włącznie z synapiną.

Badania z wykorzystaniem znaczników promieniotwórczych wykorzystywano do uzyskania dokładniejszego przedstawienia rozpoczęcia syntezy synapiny oraz do oznaczenia proporcji nowo zsyntezowanej synapiny w różnych częściach nasienia. Metoda znaczników promieniotwórczych może być wykorzystana także do oznaczenia kompetencji poszczególnych składników nasion (na przykład liścieni, zarodka, powłoki nasienia) do syntezowania synapiny z egzogenicznie dostarczonej choliny. Znaczone promieniotwórczo produkty można tak analizować pod względem synapiny, na przykład drogą protokołu TLC, a następnie skanowania za pomocą Ambis4000.

Protokół HPLC wykorzystywano do jakościowej analizy całej zawartości synapiny w nasionach i składnikach nasion. Chromatografię TLC wykorzystywano do jakościowej analizy zawartości synapiny w różnych etapach rozwoju nasion, a znacznik promieniotwórczy razem z TLC, a następnie liczenie plamek promieniotwórczych, wykorzystywano do oznaczania rozpoczęcia i rozdziału synapiny w nasionach i tkance nasiennej, takiej jak liścienie, osie zarodkowe i powłoki nasienne.

W celu określenia możliwie reprezentatywnych warunków doświadczalnych in vivo w technice znaczników promieniotwórczych do ustalania syntezy de novo synapiny z choliny stosowano raczej całe strąki, niż oddzielne nasiona. Strąki z różnych etapów rozwoju uzyskiwano z roślin hodowanych w kontrolowanych warunkach, typowo w temperaturze 20°C w ciągu dnia, 15°C w ciągu nocy, w cyklu 16/8 godzin dzień/noc. Część szypułkową strąka zanurzano w roztworze zawierającym cholinę znakowaną C, nabytą w New England Nuclear (aktywność właściwa roztworu podstawowego 2,0 GBq/mmol, stężenie, 7,4 MBq/ml, co jest tym samym co 0,2 mCi/ml, cholina, 3,7 mikromoli/ml). Strąki ze swoją szypułką zanurzone w probówce zawierającej 1,8 ml wodnej pożywki, takiej jak pożywka Murashige-Skoog o połowie mocy i 1 mM niepromieniotwórcza cholina oraz od 1,8 do 9 mikrolitrów promieniotwórczego podstawowego roztworu choliny, poddawano inkubacji w komorze do hodowli roślin w ciągu 24 do 72 godzin w cyklu dzień/noc - 16 godzin światło/9 godzin ciemności, w temperaturze 20°C. Warunki dzienne wynosiły 51 mikroensteinów/m² na sekundę, a nasiona wyjęte

PL 194 895 B1 w tych strąków wykorzystywano do analizy TLC. Takie próbki ekstrahowano w roztworze metanolu, a następnie drogą ekstrakcji chloroform-woda (CW), jak opisano wyżej.

Tam, gdzie analizowano nasiona starsze, poza powyższym sposobem, prowadzono infiltrację nasion oddzielonych od strąków. Dwadzieścia nasion poddawano infiltracji za pomocą 500 mikrolitrów opisanej wyżej promieniotwórczej pożywki cholinowej w warunkach lekkiego podciśnienia w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej około 23°C. Następnie promieniotwórczą pożywkę usuwano i zastępowano przez 500 mikrolitrów niepromieniotwórczej pożywki o powyższym składzie, bez

C-choliny i poddawano inkubacji w temperaturze 23°C w ciągu 24 godzin. Następnie nasiona ekstrahowano w sposób opisany wyżej.

Materiał roślinny można ekstrahować także mieszaniną chloroform:metanol:kwas mrówkowy (CMF) w stosunku odpowiednio 5:12:3. Typowo dodaje się 2 mikrolitry CMF na mg próbki, próbkę miele się i pozostawia w temperaturze pokojowej (21-23°C) na noc (16 godzin), po czym poddaje wirowaniu z prędkością 12000 x g w ciągu 5 minut. Klarowną ciecz zbiera się, a osad miesza ostrożnie z drugą objętością CMF, jaką dodano poprzednio, pozostawia na 20 minut i poddaje wirowaniu, jak wyżej. Klarowne ciecze zbiera się, prowadzi ekstrakcję mieszaniną chloroform-wodą (CW), jak opisano przedtem i analizuje frakcję wodną, jak poprzednio.

P r z y k ł a d 2: Identyfikacja umiejscowienia syntezy produktu ze szlaku fenylopropanoidowego w określonej tkance

W tym przykładzie oznaczano okres rozwoju syntezy produktu szlaku fenylopropanoidowego. Ten szczególny przykład ilustruje syntezę i gromadzenie się synapiny w tkance nasion roślin krzyżowych. W tym przykładzie wykorzystywano rozwijające się nasiona Brassica napus. Analizę TLC wyciągów ze strąków uzyskanych z ręcznie zapylanych kwiatów prowadzono w celu ustalenia czasu rozpoczęcia się gromadzenia synapiny. Próbki pobierano po 7, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 i 34 dniach po zapyleniu (DAP) i po osiągnięciu przez nasiona dojrzałości. Wyciągi z nasion przygotowywano sposobami opisanymi w przykładzie 1, a zawartość synapiny określano wizualnie drogą analizy TLC. Synapina była widoczna od 18 DAP do osiągnięcia przez nasiona dojrzałości, przy czym wykazano, że największą ilość synapiny zawierały dojrzewające nasiona, co sugeruje, że nagromadzenie się netto synapiny występowało w nasionach dojrzewających.

Frakcja ze ścianek strąków, z których wyjmowano nasiona, nie zawierała synapiny, która była także nieobecna w młodszych nasionach z próbek 7-, 14- i 16-dniowych. Ta analiza wskazywała na rozpoczęcie gromadzenia się synapiny w przybliżeniu po 18 dniach, przy czym jednak, ponieważ w sposobie wykorzystywano fluorescencję UV, obecność bardzo małych ilości, jeżeli w ogóle, w młodszych nasionach byłaby niewykrywalna. Na fig. 3 przedstawiono przykład analizy TLC próbek do 28 DAP, natomiast druga płytka pokazuje próbkę materiału hodowanego aż do osiągnięcia dojrzałości. Ponieważ powyższe wyniki nie były ilościowe, to przeprowadzono analizę HPLC wyciągów z całych nasion, uzyskanych za pomocą roztworu metanolowego, jak opisano w przykładzie 1. Wyniki przedstawione na fig. 4 potwierdzają rozpoczęcie się syntezy synapiny od 20 dnia po zapyleniu, wzrastając szybko i w sposób ciągły aż do dojrzałości nasion. Ilość synapiny w dojrzałych nasionach wynosiła około 0,8% w odniesieniu do masy suchych nasion, a ponieważ olej stanowił 45% nasion, to przekłada się to na około 1,5% w śrucie z odtłuszczonych nasion.

P r z y k ł a d 3: Określanie czasowych i przestrzennych aspektów syntezy produktu w szlaku fenylopropanoidowym - synteza synapiny względem rozwoju nasion

W oparciu o informacje uzyskane w przykładzie 2 wykazano ponadto, że synapina jest syntezowana przez rozwijające się nasiona. Było także oczywiste, że w czasie rozwoju nasion degradacja synapiny była minimalna. W celu potwierdzenia tej analizy rozwijające się nasiona poddawano inkubacji z C-choliną, prekursorem wykorzystywanym do syntezy synapiny z synapoiloglukozy, ostatnim etapie szlaku fenylopropanoidowego w roślinach. Obecność promieniotwórczego prekursora prowadzi do wytwarzania znakowanej synapiny. Dzięki temu jest możliwa ocena ilościowa biosyntezy synapiny. Jak przedstawiono na fig. 5, synteza synapiny (wprowadzenie C-choliny do synapiny) nie była wykrywalna w 10 dniu po zapyleniu i po raz pierwszy pojawiała się w 14 dniu. Zatem synteza synapiny (to jest wytwarzanie produktu końcowego, synapiny, z prekursorów synapoiloglukozy i choliny) ma miejsce od 14 dnia po zapyleniu prawie do dojrzałości nasion. Zgodnie z powyższym rozpoczęcie gromadzenia się synapiny w nasionach odbywa się po 14 dniach i rozwijające się nasiona kontynuują syntezę i gromadzenie się synapiny aż do dojrzałości.

Chociaż 18 dni po zapyleniu wydaje się być czasem, w którym gromadzenie się synapiny staje się widoczne w analizie niepromieniotwórczej, to próba promieniotwórcza jest bardziej czuła i umożli28

PL 194 895 B1 wia wykrywanie nawet małych ilości wykrywanych produktów biosyntezy. Zatem, jak przedstawiono za pomocą próby promieniotwórczej, synteza synapiny rozpoczyna się najpierw z bardzo małą szybkością w 14 dniu po zapyleniu. Badania infiltracji wykazują, że zdolność do syntezowania synapiny ma miejsce również w starszych, bliskich dojrzałości nasionach (fig. 6).

Oprócz oznaczania rozwojowej ramy czasowej gromadzenia się produktów szlaku fenylopropanoidowego wykształcony technik bada ponadto tkankową specyficzność biosyntezy produktu szlaku fenylopropanoidowego. W tej części przykładu mierzono gromadzenie się synapiny w liścieniach, osiach i powłokach nasiennych. Analizę drogą znaczników promieniotwórczych prowadzono z całymi strąkami od 18 do 42 dnia po zapyleniu. Szypułkę i strąki zanurzano w ciągu 24 do 72 godzin w roztworze zawierającym C-cholinę, a trzy składniki nasion wycinano i analizowano pod względem zawartości synapiny. Wyniki zebrane na fig. 7 pokazują, że liścienie zawierały maksymalną ilość synapiny (w stosunku do nasienia), i kolejno mniej osie i powłoki nasienne. Wyciągi synapinowe z liścieni i osi nasiennych od 25 dnia do dojrzałości wykazywały, że licząc w stosunku do suchej masy osie zawierały około 50% synapiny obecnej w liścieniach (fig. 8). Ponieważ jednak liścienie są stosunkowo duże pod względem masy w porównaniu z osiami (około sześć razy msy osi w stanie dojrzałości), to zawartość w nich synapiny stanowi aż do 90% całej synapiny obecnej w nasieniu (fig. 9).

P r z y k ł a d 4: Transformacja genetyczna rośliny genem kodującym enzym zdolny do działania na prekursor szlaku fenylopropanoidowego

W tym przykładzie gen kodujący enzym, cholinooksydaza (COX), oddziałująca na prekursor wykorzystywany przy syntezie synapiny, ulega ekspresji w komórce roślinnej. Gen kodujący enzym, cholinooksydazę, wprowadza do wektora do transformacji rośliny pod kontrolą promotora selektywnego względem nasion. Cholina jest prekursorem wytwarzania synapiny z synapoiloglukozy, a zatem zmniejszenie ogólnej ilości choliny zmniejsza wytwarzanie synapiny.

Genetyczna transformacja Brassica napus, gatunku rośliny krzyżowej, konstruktem kodującym cholinooksydazę (COX) selektywnie ulegającym ekspresji w nasionach. Sekwencją DNA genu kodującego cholinooksydazę jest pokazana na fig. 10, natomiast przewidywana sekwencja aminokwasowa jest przedstawiona na fig. 11. Do zapewnienia specyficznej ekspresji w nasieniu wykorzystano sekwencje promotora napinowego (Kohno-Murase, J., M. Murase, H, Ichikawa i J. Imamura, 1994, Plant Molecular Biology, 26:115-1124). Ten końcowy plazmid, pHS731, konstruowano drogą szeregu klonowań i subklonowań zgodnie ze standardowymi protokołami. Szkielet wektora pochodzi z RD400 (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E., i Keller, W., 1992, Gene 211:383-384), który zmodyfikowano w celu wprowadzenia, zamiast roślinnego markera selekcyjnego NosP-Nptll RD400, genu fuzyjnego pomiędzy gus i npt (Gus::npt). Gus-npt opisano już poprzednio (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L., i G. Selvaraj, 1991, Gene 101:239-246). Klonowano go w postaci fragmentu o długości 2,6 Kilozasad, zawierającego terminator Nos (PolyA signal) na końcu sekwencji npt, z pGKK14 (Datla i wsp., 1991) do pośredniego plazmidu, który utracił cały T-DNA RD400, częściowo podwojony promotor CaMV35S razem z liderem wirusa mozaiki lucerny z pBI525 (Datla, R.S.S., F. Bekkaoui, J.K. Hammerlindl, G. Pilate, D.l. Dunstan i W.L. Crosby, 1993, Plant Science 94:139-149) klonowano jako fragment Hindlll-BamHI na końcu 5' sekwencji Gus:npt. Miejsca restrykcyjne Hindlll, BamHI i przyległe Xbal usuwano przez wypełnienie końców fragmentem Klenova polimerazy l otrzymując pHS722. Funkcyjny obszar lac-alfa, zawierający centra wielokrotnego klonowania z pTZ19R (Mead, D.A., E. Szczesna-Skorupa, i B. Kemper, 1986, Protein Engineering 1:67-74) otrzymywano w postaci fragmentu o długości 0,25 kilozasad drogą reakcji łańcuchowej polimerazy. Ten fragment trawiono za pomocą Munl i EcoRI i wprowadzano do miejsce restrykcyjne EcoRI w pHS722 otrzymując pHS723. Oznaczano sekwencję nukleotydową części T-DNA wektora, a unikalne miejsca restrykcyjne w polilinkerze identyfikowano drogą analizy restrykcyjnej. pHS725 jest pochodną pHS723 i zawierającą otwartą ramkę genu kodującego cholinooksydazę, początkowo z pKR11 (patrz Rozwadowski i wsp., 1991) poprzez szereg wektorów pośrednich, które dostarczały dogodnych miejsc restrykcyjnych albo Poly A wirusa mozaiki kalafiora. Wektor pHS725 niesie opartą na pHS723 otwartą ramkę odczytu genu COX z sekwencją PolyA CaMV na końcu 3'. Część 5' otwartej ramki odczytu, zawierająca promotor CaMV35S została zastąpiona napinowym promotorem z plazmidu pośredniego dając pHS731. Plazmid pośredni zawierał pochodną pUC19 zawierającą promotor napinowy w postaci kasety Hindlll-NapinP-BamHI, otrzymanej od J. Kohno-Murase (KohnoMurase i wsp., 1994), którą poddawano ligacji jako insert Hindlll-BamHI w miejsce Hindlll-BamHI plazmidu RD400 (Datla i wsp., 1992). Otrzymany plazmid był plazmidem pHS974. Kasetę PolyA-Kpnl otwartej ramki odczytu BamHI-BADH wyodrębniono w postaci fragmentu o długości 2,1 Kilozasad

PL 194 895 B1 z pRKJ6A (pRKJ6A jest opisany szczegółowo przez R.K. Jain, 1995, Genetic Engineering of Osmolyte Biosynthesis in Plants: Manipulation of Betaine Aldehyde Dehydrogenase Gene Expression Tobacco, Ph. D. Thesis, University of Saskatchewan, Saskatoon, Kanada) i poddano ligacji w miejsce BamHI-Kpn pHS974 otrzymanego z pHS981. pHS981 wykorzystano do otrzymywania pochodnej pHS731. Na fig. 12 przedstawiono otrzymany plazmid pHS731, który zawierał sekwencję PolyA otwartej ramki odczytu CaMV napinowego promotora Cox w górę i w dół od sekwencji. Sekwencja nukleotydowa segmentu sekwencji PolyA otwartej ramki odczytu napinowego promotora Cox została oznaczona na podstawie elementów konstrukcyjnych. Możliwe jest także dodatkowe potwierdzenie sekwencji, ponieważ wektory wyjściowe dla pHS723 zawierają cały pBIN19 (Bevan, M., 1984, Nukleic Acids Research 12:8711-8721), włącznie z fragmentem w górę i w dół od sekwencji oraz wszystkie inne obszary, przy czym opublikowano pełna sekwencja nukleotydowa pBIN19. Zatem opisana wyżej konstrukcja genu COX może być łatwo dostosowana do klonowania do innych wektorów. Wektor plazmidu pHS731 w E. coli DH5 został złożony w dniu 22 stycznia 1997 roku w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville MD, USA 20852, pod numerem dostępu ATCC Designation 98300.

W oparciu o opublikowaną informację (DeLisle, A.J., i Crouch, M.L., 1989, Plant Physiology 91:617-623, Hoglund, A.-S., T. Rodin, E. Larsson, i L. Rask, 1992, Plant Physiology, 98:509-515) i nasze wyniki z promotorem napinowym, spodziewano się, że ekspresja genu napinowego obejmie środkową część okresu rozwoju nasion B. napus.

Wektor pHS731 został wprowadzony do szczepu MP90 Agrobacterium techniką standardowej koniugacji trójrodzicielskiej i tak uzyskanymi bakteriami transformowano roślinę z rodziny Brassica. Transformację prowadzono w zasadzie w sposób opisany przez Moloney'a i wsp., 1989, Plant Cell Reports 8:238-242.

Do badań transformacyjnych wykorzystywano szczep GV3101/pMP90 Agrobacterium tumifaciens, zawierający wahadłowy wektor pHS731 (Koncz C. i Shell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204-383396). Hodowlę bakterii w fazie stacjonarnej w bulionie LB (Difco, USA) (100 ml) zbierano drogą wirowania i ponownego zawieszania w 10 ml świeżego bulionu LB z 1% DMSO (sulfotlenek dimetylu) (Sigma, USA) jako środkiem zabezpieczającym przy zamrożeniu. Podwielokrotności 200 mJ przechowywano w temperaturze -20°C do czasu użycia do transformacji, w której odmierzone ilości bakterii dodawano do 2 ml bulionu Brain Heart Infusion Broth (Difco, USA), zawierającego 2% sacharozy, 50 mm acetosyryngonu, pH 5,6 i poddawano inkubacji w ciągu nocy w temperaturze 28°C. Gęstość komórek bakteryjnych wynosiła w przybliżeniu 1 x 10⁹ komórek na ml.

Tkanki liścieniowe poddawano działaniu Agrobacterium, zawierającego wektor do transformacji rośliny, sposobem według Moloneya i wsp., 1989, Plant Cell Rep. 8:238-242. Powierzchnie cięcia ogonków liścieni zanurzano na krótko w hodowli bakteryjnej. Tkanki umieszczano w pożywce do wspólnej hodowli, tak że powierzchnie cięcia stykały się z pożywką. Dziesięć tkanek liścieniowych umieszczano oddzielnie w szalkach Petriego o wymiarach 100x15 mm. Szalki ze wspólną hodowlą zabezpieczano folii z tworzywa sztucznego Stretch'n Seal™. Szalki poddawano inkubacji w ciągu trzech dni w komorze hodowlanej o temperaturze i warunkach świetlnych, jak wyżej, dostosowanych do etapu kiełkowania nasion. Następnie tkanki przenoszono do pożywki selekcyjnej.

Po 3 do 4 tygodniach w pożywce selekcyjnej regenerujące się zielone odrosty (prawdopodobne transformanty) wycinano i przenoszono do świeżej pożywki selekcyjnej w celu kontynuowania wzrostu. Gdy odrosty osiągnęły długość 1,5-2,0 cm przenoszono je do pożywki ukorzeniającej, prawdopodobne odrosty transgeniczne badano pod kątem ekspresji genu gus w zasadzie w sposób opisany przez Jeffersona, R.A., 1987, Plant. Mol. Biol. Rep. 5:387-405. Obecność błękitnego barwnika była dowodem zajścia transformacji.

Transformację potwierdzano za pomocą prób NPTII i PAT, analizy Southerna, metody PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) i analizy potomstwa. Nasiona transgeniczne Brassica napus cv. Westar, zawierające wektor pHS731, oznaczone jako 202622, zostały złożone w dniu 22 stycznia 1997 roku w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn:Drive, Rockville MD, USA 20852, pod numerem dostępu ATCC Designation 97854.

Następnie oznaczano ekspresję genu kodującego cholinooksydazę w nasionach Brassica napus. Wyhodowano kilka niezależnych linii transgenicznych. Aktywność COX wykazywano stosując sprzężoną reakcję enzymatyczną. COX katalizuje wytwarzanie betaino-aldehydu z choliny, który łatwo poddawać próbie drogą niezależnego od NAD utleniania go przez BADH. Redukcję NAD monitoruje się drogą zmiany absorbancji przy długości fali 340 nm. W celu standaryzowania próby zmienne ilości

PL 194 895 B1 dostępnego w handlu preparatu COX (na przykład Sigma) i stałej ilości BADH z E. coli (50 jednostek, 1U = 1 nmol NAD redukowanego na minutę na mg białka) ze szczepu bakteryjnego dającego nadekspresję BADH stosuje się do standaryzowania warunków reakcji oraz do ustalania krzywej wzorcowej, w których COX jest ograniczony, lecz nie BADH. Następnie prowadzi się próbę z wyciągami roślinnymi z linii transgenicznych i kontroli. BADH można wzbogacać albo oczyszczać zgodnie opublikowanymi sposobami (na przykład Faikenberg, P. i Strom, A.R., 1990, Biochemica Biophysica Acta 1034:253-259).

Wyciągi roślinne otrzymywano w sposób następujący. Liście roślin o masie w przybliżeniu 100 mg zamrażano w ciekłym azocie, mielono z chłodzonym lodem buforem ekstrakcyjnym przy dwóch objętościach na ciężar próbki.

Próbki wirowano z prędkością około 10000 x g i wirowano ponownie klarowną ciecz. Wirowanie powtarzano aż do braku widoczności materiału w postaci cząstek. Do nasion, około 20 nasion na próbkę, po pierwszym wirowaniu dodawano 20 mg węgla aktywnego i kontynuowano dalsze postępowanie. Bufor ekstrakcyjny, pH 8,0, doprowadzony za pomocą KOH zawiera na 100 ml 1,92 g HEPES, 0,2 ml 0,5M EDTA, 10 ml gliceryny i demineralizowaną wodę do 100 ml. Przed próbą z 1M roztworu podstawowego dodano DTT do stężenia końcowego 25 mM oraz pełny koktail inhibitora proteazy (Boehringer-Mannheim, nr katalogowy: 1697-498) z 10X roztworu podstawowego w buforze HEPES. Bufor do prób enzymatycznych (bufor BADH) zawiera 50 mM Hepes-KOH, pH 8,0, 1 mM EDTA i DTT świeżo dodany do stężenia końcowego 1 mM. Sprzężoną próbę prowadzono w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 50 mikrolitrów buforu BADH, 50 mikrolitrów 10 mM roztworu podstawowego NAD, 50 mikrolitrów próbki roślinnej, 30 mikrolitrów albo równoważnik, otrzymując 50 U BADH, oraz odmineralizowaną wodę do objętości 450 mikrolitrów. Mieszaninę reakcyjną zmieszano, a następnie poddawano monitorowaniu w ciągu 20 minut. W celu zmiany absorbancji tła przy 340 nm dodano 50 mikrolitrów chlorku choliny i kontynuowano odczyt spektrofotometryczny w ciągu 10 do 20 minut. Dla ustalenia krzywej wzorcowej opuszczano próbkę roślinną i zamiast niej dodawano różne ilości oczyszczonej COX. Jednostki obliczano stosując programowany, rejestrujący spektrofotometr typu Beckman DU65. Wykształcony technik może modyfikować opisane protokoły w celu dostosowania dostępności równoważnika korzystając z danych dostępnych w literaturze dla współczynnika ekstynkcji dla NAD. Sama redukcja NAD jest próbą standardową prowadzoną dla dehydrogenazy.

P r z y k ł a d 5: Analiza nasion transgenicznych pod względem zawartości składników fenolowych

W tym przykładzie nasiona analizowano pod względem zawartości synapiny. Nasiona z roślin transgenicznych uzyskanych w przykładzie 4 hodowano w celu uzyskania naturalnego potomstwa i takie linie potomne analizowano w celu określenia obecności lub braku zmodyfikowanego genu kodującego beta-glukuronidazę (GUS). Ten gen (patrz Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L. i G. Selvaraj, 1991, Gene 101:239-246) jest obecny w górę i dół wektora T-DNA pHS731, a zatem służy jako dogodny marker do selekcji segregacji genetycznej. Brak segregacji genetycznej wskazywał na homozygotyczną naturę rośliny, od której pochodziło potomstwo. Te linie, które wykazywały segregację, były hemizygotyczne, a segreganty bez aktywności GUS zatrzymywano jako kontrole, które nie zawierały genu COX. Uzyskano linie homozygotyczne zawierających COX i ich odpowiedniki nie zawierające tego genu. Te linie analizowano pod względem zawartości w nich synapiny stosując protokół HPLC. Wyniki przedstawione na fig. 13 wyraźnie pokazują, że transgeniczne segreganty mają znacznie obniżone poziomy synapiny w przeciwieństwie do ich niezmodyfikowanych odpowiedników. Segreganty niezmodyfikowane stanowią najlepszą kontrolę, ponieważ wyrosły one z tej samej pierwotnej rośliny transgenicznej. Te wyniki wskazują na użyteczność opisanego sposobu. Dla specjalisty jest oczywiste, że różne poziomy zmniejszenia zawartości można uzyskać drogą zmian poziomów, rozkładu czasowego i usytuowania ekspresji genów, a także poszukiwania korzystnych wariantów wśród indywidualnych linii transgenicznych, które dzięki wielu przyczynom wykazują pożądane wyniki, obejmujące pozytywne skutki i liczbę kopii.

P r z y k ł a d 6. Wytwarzanie produktu chroniącego roślinę przed stresem drogą zmiany prekursora w szlaku fenylopropanoidowym

W tym przykładzie betainę zabezpieczającą przed stresami wytwarzano za pomocą połączonej aktywności COX i BADH, obydwie pod kontrolą promotora selektywnego względem nasion. Jako pierwszą część tego przykładu wytwarzano transgeniczną roślinę Brassica napus zawierającą gen

BADH pod kontrolą promotora selektywnego względem nasion. Prowadzono analizę tych roślin pod względem ekspresji BADH.

PL 194 895 B1

Ekspresja genu kodującego dehydrogenazę betainoaldehydu w nasionach Brassica napus. Gen BADH z E. coli (betB) wyodrębnia się i poddaje modyfikacji pod względem ekspresji specyficznej dla nasion drogą wiązania z napinowym promotorem B. napus (Boyd i wsp., Gene 103-45-52 (1990). Plazmid RD400 (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E. i Keller, W., 1992, Gene 211:393-384) stosowano jako wektor, z którego otrzymywano końcową pochodną pHS974, zawierającą w górę i w dół sekwencji T-DNA otwartą ramkę odczytu betB z jej miejscem restrykcyjnym ATG pod ekspresyjną kontrolą napinowego promotora i sekwencją PolyA wirusa mozaiki kalafiora. Kaseta Napina-betB-PolyA (o długości około 3,3 Kilo par zasad) zawierała, w podanej kolejności, miejsce restrykcyjne Hindlll, promotor napinowy, miejsce restrykcyjne BamHI, betB ORF, miejsce restrykcyjne EcoRI - sekwencję PolyA DNA wirusa mozaiki kalafiora, miejsce restrykcyjne Ppnl i miejsce restrykcyjne EcoRI. Promotor napinowy otrzymano od Kohno-Murase i wsp. (Plant Molecular Biology, 26:115-1124, 1994), a sekwencja PolyA pochodził z plazmidu pJIT117 (Guerineau, F., Woolston, S., Brooks, L. l Mullineaux, 1988, Nucleic Acids Research 16:11380). Końcowy plazmid pHS981 o długości około 15 Kilo par zasad przedstawiono na fig. 14. Wektor ten wprowadzano do Agrobacterium tumefaciens GV3101 [pMP90] (Koncz, C. i. Schell, J., 1986, Molecular and General Genetics 204:383-396), a otrzymany szczep wykorzystywano do transformacji Brassica napus.

Otrzymano kilka linii transgenicznych, a nasiona w różnych etapach rozwoju badano pod kątem aktywności BADH. Ustalono, że aktywność BADH osiąga swoje maksimum po około 35 dniach po zapyleniu, a dojrzałe nasiona zachowywały aktywność resztkową. Specyficzna aktywność jako funkcja etapu rozwoju wykazywała, że początek aktywności BADH jest równoległy z syntezą synapiny.

Linie wykazujące ekspresję genu BADH krzyżowano z liniami zawierającymi gen COX opisany w przykładzie 4. Rośliny zawierające gen COX i rośliny zawierające zarówno gen BADH, jak i gen COX, analizowano pod względem zawartości synapiny i całkowitej zawartości składników fenolowych. Te wyniki są przedstawiono na fig. 15 (zawartość synapiny) i fig. 16 (całkowita zawartość składników fenolowych). Analizowane nasiona zbierano z roślin uprawianych w warunkach polowych latem 1999 roku. Jak przedstawiono na fig. 15, połączona aktywność COX i BADH prowadzi do dalszego zmniejszenia nagromadzenia się synapiny w porównaniu z samą aktywnością COX. Jak przedstawiono na fig. 16, następuje zmniejszenie całkowitej zawartości składników fenolowych w roślinach transgenicznych w porównaniu z kontrolą.

P r z y k ł a d 7: Sekwencja nukleotydowa genu kodującego dehydrogenazę syntetycznego kwasu ferulowego

W tym przykładzie opublikowaną sekwencję dekarboksylazy kwasu ferulowego z Bacillus pumilus (Zago i wsp. Applied and Environmental Microbiology 61:4484-4486, 1995) stosowano do konstrukcji genu optymalnego pod względem ekspresji w komórkach roślinnych. Otwartą ramkę odczytu dekarboksylazy kwasu ferulowego syntezowano poprzez ligację syntetycznych oligonukleotydów opartych na opublikowanej sekwencji. Oligonukleotydy syntezowano szeroko w oparciu o preferencję kodonową genów Brassica napus o wysokiej ekspresji.

Syntetyczne oligonukleotydy miały w przybliżeniu długość około 60 nukleotydów. Struktura dupleksów nukleotydowych zawierała na końcu 5' koniec kohezyjny z BamHI (5' GATC-) i koniec kohezyjny EcoRI (3'-TTAA-5') na końcu 3'. Indywidualne dupleksy składano i tworzono otwartą ramkę odczytu o pełnej długości z centrami 5' BamHI i 3' EcoHI. Reakcje ligacji prowadzono według standardowych protokołów. Produkty ligacji poddawano z kolei ligacji do wektora klonującego.

Po ligacji powyższego syntetycznego genu do pBlue-script SK- trawionego BamHI-EcoRI (Stratagene) klony z insercją o długości 0,5 kilo zasad identyfikowano przez przeszukiwanie minipreparatywnego plazmidowego DNA z klonów E. coli. Potencjalne klony badano i oznaczono nukleotydową sekwencję dwóch klonów. Ustalono, że każdy klon miał mutację punktową i te dwie mutacje punktowe były od siebie oddalone. Rozmieszczenie mutacji umożliwiło rekonstrukcję nienaruszonego genu w wyniku połączenia dwóch nie zawierających mutacji części genu z tych klonów. Ten klon oznaczono jako pGS97b1. Sekwencję nukleotydową tego syntetycznego genu przedstawiono na fig. 17. Przewidywaną sekwencję aminokwasową przedstawiono na fig. 18.

Funkcjonalność syntetycznego genu ustalano za pomocą prostej próby. Dekarboksylaza kwasu ferulowego przekształca kwas ferulowy w 4-winylogwajakol (4-VG). 4-VG ma przyjemny zapach goździków i uważa się, że 4-VG jest jednym z najważniejszych związków, które nadają naturalny zapach goździków. Szczep Escherichia coli z pGS97b1, hodowany w obecności 1 mM kwasu ferulowego w pożywce hodowlanej, dawał przyjemny zapach goździków, natomiast hodowla bez kwasu ferulowego albo hodowla szczepu z samym wektorem nie dawała zapachu. Analiza HPLC hodowli z kwasem

PL 194 895 B1 ferulowym potwierdzała ubytek kwasu ferulowego. W oparciu o powyższe wyniki wywnioskowano, że funkcyjny gen jest sklonowany w pGS97b1.

P r z y k ł a d 8: Transformacja genetyczna rośliny genem kodującym dekarboksylazę kwasu ferulowego pod kontrolą promotora konstytuwnego

W tym przykładzie enzym, dekarboksylaza kwasu ferulowego, sklonowany w pGS97b1, wprowadzono do wektora RD400 do transformacji rośliny (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E. i Keller W., 1992, Gene 211:383-394), który zmodyfikowano w celu wprowadzenia genu fuzyjnego pomiędzy gus i npt (Gus::npt) zamiast roślinnego markera selekcyjnego NosP-Nptll wektora RD400. Gus-npt opisano już poprzednio (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L. i G. Selvaraj, 1991, Gene 101:239-246). Gen kodujący dekarboksylazę kwasu ferulowego umieszczano pod kontrolą promotora 35S, a plazmid wykorzystywano do transformacji roślin tytoniu zgodnie ze standardowymi protokołami.

Mapę restrykcyjną wektora przedstawiono na fig. 19. Wektor pGS97b3, przedstawiony na fig. 19, jest podobny do pHS731 z wyjątkiem tego, co następuje. Na podstawie wektora pHS731 kasetę Hindlll-napina P-BamHI zastąpiono kasetą liderową promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora/wirusa mozaiki lucerny (jak opisano w R.S.S. Datla, F. Ba:ekkaoui, J. K. Hammerlindl, G. Pilate, D. l. Dunstan i W.L. Crosby. lmproved high-level constitutive foreign gene expression in plants using an AMV RNA3 leader seguence. Plant Science 94:139-149, 1993). Ta część promotora została przedstawiona skrócona na fig. 19 do postaci 35S. Za 35S znajduje się otwarta ramka odczytu genu kodującego dekarboksylazę ferulanu, związana przez BamHI na końcu 5' i przez EcoRI na końcu 3', zamiast otwartej ramki odczytu COS w pHS731.

Uzyskano rośliny transgeniczne, wykazujące ekspresję genu kodującego dehydrogenazę kwasu ferulowego. Rośliny analizowano pod kątem zawartości składników fenolowych i wytwarzania winylogwajakolu.

Ustalono, że niezależne rośliny transgeniczne tytoniu, które zawierają gen kodujący dekarboksylazę kwasu ferulowego, zawierają immunoreaktywny polipeptyd o przewidywanej wielkości w analizie Westerna z poliklonalnymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko dekarboksylazie kwasu ferulowego. Rośliny nie poddane transformacji nie zawierały peptydu immunoreaktywnego. Dostarcza to dowodu wystąpienia transgenicznej ekspresji białka dekarboksylazy kwasu ferulowego w tych roślinach transgenicznych.

P r z y k ł a d 9. Genetyczna transformacja rośliny genem kodującym dekarboksylazę kwasu ferulowego pod kontrolą promotora selektywnego względem tkanki

W tym przykładzie gen kodujący enzym, dekarboksylazę kwasu ferulowego, sklonowany w pGS97bl, wprowadzono do wektora RD400 do transformacji rośliny. Gen kodujący dekarboksylazę kwasu ferulowego umieszczano pod kontrolą napinowego promotora specyficznego dla nasion z B. napus, a plazmid wykorzystywano do transformacji roślin tytoniu według standardowych protokołów. Mapę restrykcyjną wektora przedstawiono na fig. 20. Wektor pGS97b2, przedstawiony na fig. 20, jest podobny do wektora pGS97b3 z tym wyjątkiem, że na bazie tego samego wektora, kasetę Hindlll35S-BamHI zastąpiono kasetą Hindlll-promotor napinowy-BamHI, pokazaną na fig. 12 dla pHS731. Uzyskano rośliny transgeniczne, u których zachodziła ekspresja genu kodującego dehydrogenazę kwasu ferulowego. Nasiona roślinne analizowano pod kątem zawartości składników fenolowych i wytwarzania winylo-gwajakolu.

P r z y k ł a d 10. Oznaczanie specyficzności tkankowej i trybu gromadzenia się kwasu filowego w rozwijających się nasionach rośliny krzyżowej, Brassica napus

Biosynteza kwasu fitowego

W tym przykładzie badano szlak biosyntezy kwasu fitowego w nasionach rośliny Brassica. Ponieważ kwas fitowy jest sześciofosforanową pochodną mio-inozytolu (kwas fitowy jest oznaczony jako IP6), to określano ilości poszczególnych fosforylowanych pochodnych składników mio-inozytolowych (na przykład IP₁, IP₂, IP3, IP4 i IP5) wszystkich fosforylowanych pochodnych inozytolu. Czysty kwas fitowy, częściowo zdegradowany przez autoklawizację w celu wytworzenia różnych fosforylowanych pochodnych, stosowano jako wzorzec do analizy HPLC prowadzonej według Vernona i Bohnerta (1992, The EMBO Journal 11:2077-2085) i Vernona DM, Tarczynskiego MC i Jensena RG i Bohnerta HJ, (1993. The Plant Journal 4:199-205). Analiza ta umożliwia łatwe rozróżnienie różnych postaci fosforylowanego izozytolu (na przykład IP1, IP₂, IP3, IP4 i IP₅) i kwasu fitowego. Znaleziono tylko jeden pik, w analizie próbki fosforanu inozytolu, wyekstrahowanej z rozwijających się nasion Brassica, który odpowiadał IP6 (to jest kwasowi fitowemu). Ten wynik wskazywał, że IP6 jest przeważającą postacią

PL 194 895 B1 fosforanu inozytolu w rozwijających się nasionach, a inne pośrednie postacie fosforylowanego inozytolu mogły być niewykrywalne opisanymi sposobami, drogą analizy HPLC. Zgodnie z powyższym uważa się, że biosynteza kwasu fitowego z mio-inozytolu zachodzi szybko i w zasadzie ilościowo.

Biosynteza rozwojowa kwasu fitowego

W tej części przykładu określano rozkład czasowy gromadzenia się kwasu fitowego wraz z rozwojem nasion. Sposoby oznaczania zawartości kwasu fitowego w nasionach są następujące:

Nasiona miele się w moździerzu w obecności ciekłego azotu i przenosi proszek do 15 ml sterylnej probówki zawierającej 5 ml 0,5M HCI. Po usunięciu lipidów drogą ekstrakcji heksanem pozostałą fazę (faza ciekła z resztkami tkanek) poddaje się sonikacji w ciągu 90 sekund na poziomie 3 za pomocą ultradźwiękowego ciekłego procesora (Model XL2020, Heat Systems, Inc., Farmingdale, NY, USA). Po odwirowaniu ciecz przenosi się do świeżej probówki w celu analizy kwasu ferulowego drogą HPLC. Ten sposób zastosowano do nasion w różnych etapach rozwoju.

Gromadzenie się kwasu fitowego w czasie rozwoju nasion jest pokazano na fig. 21. Chociaż kwas fitowy jest najpierw wykrywany w nasionach w bardzo wczesnych etapach rozwoju (to jest 12 dni po zapyleniu), to jego zawartość nie wzrasta znacznie aż do 22 dni po zapyleniu. W czasie 10-dniowego okresu po jego pierwszym pojawieniu się kwas fitowy osiąga maksimum zawartości w przybliżeniu 240 mg/nasienie. Zawartość kwasu fitowego wyrażona w stosunku do suchego ciężaru dojrzałych nasion wynosi w przybliżeniu 3,2%. Te wyniki wskazują, że zmniejszenie zawartości kwasu fitowego drogą zakłócenia biosyntezy kwasu fitowego wymaga promotora, który jest zdolny do ekspresji w przybliżeniu od 12 dnia po zapyleniu prawie do dojrzałości nasion.

Dalsza analiza wskazywała, że kwas fitowy odkłada się głównie raczej w tkance zarodkowej niż w powłoce nasiennej (fig. 22), liścienie zawierają prawie 90% nasiennego kwasu fitowego, a 10% jego zawartości w nasieniu znajduje się w osi zarodkowej. Te odkrycia sugerują ponadto, że różne tkanki zarodkowe są tkankami najbardziej docelowymi przy zmniejszaniu zawartości kwasu fitowego drogą genetycznej modyfikacji biosyntezy kwasu fitowego.

P r z y k ł a d 11. Oznaczanie metabolizmu bio-inozytolu w tkance rozwijającego się nasienia

Ten przykład ilustruje część puli mio-inozytolu, która wykorzystywana jest w biosyntezie kwasu fitowego. Chociaż bio-inozytol jest prekursorem w syntezie kwasu fitowego w roślinach, to jest wykorzystywany także w innych szlakach anabolicznych wytwarzania fosfatydoinozytolu i składników ścian komórkowych. Obecny przykład ilustruje część całkowitego inozytolu, która wykorzystywana jest w biosyntezie kwasu fitowego w rozwijających się nasionach. Znakowanie in vivo nasion Brassica z zastosowaniem ³H-mio-inozytolu stosowano do śledzenia rozmieszczenia izozytolu w różnych frakcjach wyekstrahowanych różnymi rozpuszczalnikami. Technika stosowana do impulsowego znakowania in vivo rozwijających się nasion za pomocą ³H-mio-inozytolu jest następująca. Strąki w różnych etapach rozwoju zdejmowano, a odcięte końce umieszczano natychmiast w 10 ml sterylnej pożywki hodowlanej, zawierającego 5 pCi ³H-mio-inozytolu w 50 ml probówkach i hodowano w standardowych warunkach wzrostu (20°C w ciągu 16 godzin na świetle, 15°C w ciągu 8 godzin bez światła) w ciągu dwóch dni. Nasiona zbierano w celu ekstrakcji lipidów, kwasów fitowych, składników ścian komórkowych rozpuszczalnych w kwasie trifluorooctowym (TFA) i resztek ścian komórkowych. Promieniotwórczość oznaczano w każdej frakcji za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego.

W celu oddzielenia rozpuszczalnych w wodzie składników komórek (do analizy kwasu fitowego), składników rozpuszczalnych w heksanie (do analizy lipidów), składników ścian komórkowych rozpuszczalnych w kwasie trifluorooctowym (TFA) i resztek komórek prowadzono cztery rodzaje ekstrakcji nasion znakowanych impulsowo. Na fig. 23 zestawiono listę średnich promieniotwórczości w każdej frakcji w różnych etapach rozwoju nasion. Dane wskazują, że więcej niż 20% całego znacznika w nasionach znajduje się we frakcji lipidowej po 25-30 dniach po zapyleniu (DAP). Promieniotwórczość we frakcjach ścian komórkowych (rozpuszczalne w TFA ściany komórkowe i resztki komórek) są odpowiedzialne w przybliżeniu za 5% całego znacznika wprowadzonego w czasie rozwoju nasienia. Promieniotwórczość we frakcji rozpuszczalnej w wodzie analizowano ponadto metodą HPLC w celu identyfikacji części kwasu fitowego. Ustalono, że w przybliżeniu 10% znacznika w ekstrakcie rozpuszczalnym w wodzie odzyskuje się w piku kwasu fitowego, a około 10% znacznika znajduje się w iniekcyjnym piku próbki, który jest wolny od mio-inozytolu. Inny znaczony materiał obecny w wyciągu rozpuszczalnym w wodzie odzyskiwano w pikach przed i po piku kwasu fitowego, reprezentujących niezidentyfikowane związki.

Udział procentowy znacznika obecny, w wyniku procesów metabolicznych, w kwasie fitowym, lipidach, rozpuszczalnych w TFA frakcjach ściany komórkowej i pozostałości komórek przedstawiono

PL 194 895 B1 na fig. 3. Po 20 do 30 dniach po zapyleniu w metabolitach pochodzących z ³H-mio-inozytolu w przybliżeniu 30% znacznika występuje w postaci kwasu fitowego. Odpowiednio około 60% znacznika było obecne w lipidach (fosfolipidy zawierające izozytol) i mniej niż 10% we frakcji ścian komórkowych.

Stąd część całej puli mio-inozytolu, który wykorzystywany jest do biosyntezy kwasu fitowego, wynosi w przybliżeniu 30% w okresie rozwoju nasion, w którym biosynteza kwasu fitowego wydaje się być maksymalna.

P r z y k ł a d 12. Klonowanie genu kodującego enzym działający na mio-inozytol

W tym przykładzie wyodrębniono gen kodujący enzym działający na mio-inozytol. Gen ten był genem kodującym O-metylo-transferazę inozytolu z Mesembryanthemum crystallinum. Odwrotne klonowanie transkryptazy stosowano do wyodrębnienia genu, jak opisano niżej. Standardową modyfikację DNA prowadzono według Maniatisa i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Cały RNA ekstrahowano z tkanek liściowych M. crystallinum traktowanych 500 mM NaCI, a następnie oczyszczano Poly (A)+RNA. Ten RNA wykorzystywano do odwrotnej transkrypcji za pomocą zestawu Superscript II Reverse Transcriptase (Promega, Madison, Wl.) w następujących warunkach: trzy mikrogramy mRNA rozpuszczonego w 20 mikrolitrach wody wykorzystywano jako matrycę. RNA poddawano denaturacji przez ogrzewanie w temperaturze 65°C w ciągu 5 minut, a następnie chłodzeniu na lodzie. Do mieszaniny dodano 3 mikrolitry oligo-dT (500 mikrogramów/ml), 8 mikrolitrów buforu 5X odwrotnej transkryptazy, 4 mikrolitry 0,1 M DTT, 2 mikrolitry 10 mM dNTPs. Mieszaninę ogrzewano do temperatury 42°C, a następnie dodano 3 mikrolitry (60 jednostek) odwrotnej transkryptazy Supertranscript II. Reakcję prowadzono w ciągu 1 godziny w temperaturze 42°C. Po tym okresie czasu dodano 1 mikrolitr RNazy H (1,5 jednostki/mikrolitr) i prowadzono reakcję w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Otrzymany cDNA wykorzystywano jako matrycę w reakcji PCR stosując polimerazę Vent w następujących warunkach: reakcję PCR prowadzono w objętości 100 mikrolitrów w następujących cyklach: 94°C w ciągu jednej minuty, 55°C w ciągu 1 minuty, 72°C w ciągu jednej minuty, z dalszymi dwoma sekundami dla każdego cyklu, ogółem w 30 cyklach. Startery stosowane w tej reakcji opierały się na opublikowanej sekwencji IMT DNA (numer dostępu w GenBank M87340). Stosowany starter w przód miał sekwencję ID NO 6:

5'-TTTTTGGATCCATGACTACTTACA CAATGGCAACTACA-3' która zawiera miejsce restrykcyjne BamHI na końcu 5' (podkreślone).

Stosowany starter w dół miał sekwencję ID NO 7:

5'-TTTTTTTTGCGGCCGCATAAAGGCAAATCATACACTG-3' która zawiera miejsce restrykcyjne Notl na końcu 5' (podkreślone).

Zamplifikowany fragment DNA trawiono BamHI i Notl, a następnie wklonowano w pSPORT 1 (Bri, Bethesda, MD). Fragment z PCR trawiony BamHI, Notl klonowano w odpowiednie miejsca restrykcyjnego wektora pSPORT otrzymując pochodną pSportlMT. Na fig. 24 (sekwencja ID NO 5) przedstawiono sekwencję zamplifikowanego fragmentu z PCR, który jest identyczny z opublikowaną sekwencją IMT DNA, z wyjątkiem różnicy w dwóch zasadach, w nie ulegającym translacji obszarze 3'. Przewidywana sekwencja białka jest identyczna z opublikowaną informacją dostępną w GeneBank.

P r z y k ł a d 13: Konstrukcja wektorów do transformacji roślin genem kodującym enzym oddziałujący na mio-inozytol, zastosowanie genu kodującego O-metylo-transferazę mio-inozytolu z M. crystallinum

Ten przykład ilustruje konstrukcję wektora do transformacji rośliny, zawierającego gen pod kontrolą promotora aktywnego w komórkach roślinnych, kodujący enzym oddziałujący na mio-inozytol. Przykładowy wektor do transformacji rośliny zawiera gen kodujący O-metylo-transferazę mio-inozytolu pod kontrolą promotora aktywnego w komórkach nasion, promotora 35S. Konstrukcja wektora była następująca: pSportlMT trawiono za pomocą BamHI i EcoRI uzyskując gen IMT. Fragment genu IMT klonowano do odpowiednich miejsc restrykcyjnych pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA), a otrzymamy plazmid oznaczono jako pBluelMT. PBluelMT trawiono za pomocą Spel i klonowano do wektora pBI 221 (CloneTech), poprzednio odciętego za pomocą Xbal. Plazmid, który zawierał gen IMT we właściwej orientacji względem promotora 35S w pBI 221 wybrano i trawiono za pomocą Hindlll i EcoRI. Fragment terminatora 35S-IMT-Nos przenoszono do wektora pRD 400 w wektorze p35SIMT do transformacji rośliny.

Otrzymany konstrukt, p35SIMT, zawiera kasetę terminatora promotor 35S-IMT-GUS-Nos w pRD400 i jest pokazana na fig. 25.

PL 194 895 B1

P r z y k ł a d 14: Konstrukcja wektorów do transformacji roślin genem kodującym enzym oddziałujący na mio-inozytol pod kontrolą promotora selektywnego względem roślin

W tym przykładzie gen kodujący enzym oddziałujący na mio-inozytol pod kontrolą promotora selektywnego względem roślin konstruowano w wektorze transformacji rośliny. Stosowany gen był genem O-metylo-transferazy mio-inozytolu, a promotor był napinowym promotorem selektywnym względem nasion. Wektor oznaczono jako pNIMT.

Wektor pNIMT konstruowano w sposób następujący:

fragment IMT DNA trawiono za pomocą Spel (Przykład 4) poddawano ligacji z pDHI w miejscach restrykcyjnych Xbal, otrzymując kasetę terminatora promotor napinowy-IMT-Nos. Tę kasetę ekspresyjną przenoszono następnie do pRD400. Otrzymany wektor przedstawiono na fig. 26.

P r z y k ł a d 15: Transformacja Brassica napus (Westar) za pomocą p35SIMT

Wektor p35SIMT wprowadzono do zabarwionego MP90 Agrobacterium techniką standardowej koniugacji trójrodzicielskiej, a następnie transformowano roślinę z rodzaju Brassica za pośrednictwem Agrobacterium. Transformację prowadzono w sposób opisany w przykładzie 4. Otrzymano rośliny poddane transformacji za pomocą pSSSIMT, które analizowano pod kątem zawartości fitanu.

P r z y k ł a d 16: Analiza molekularna roślin transgenicznych

Rośliny transgeniczne F_o zawierające kasetę ekspresyjną CaMV 35S-IMT analizowano drogą PCR, analizy Southerna i Northerna, jak również enzymatycznej próby IMT. Wstępna analiza PCR wskazywała, że wszystkie rośliny transgeniczne zawierały gen IMT (fig. 27). Hybrydyzacja Southerna wskazywała, że gen IMT był zintegrowany w genomie Brassica przy różnych liczbach kopii. Cały RNA ekstrahowano z rozwijających się nasion w celu analizy hybrydyzacyjnej Northerna, jak pokazano na fig. 28.

P r z y k ł a d 17: Analiza kwasu fitowego w roślinach transgenicznych

Zawartość kwasu fitowego analizowano w dojrzałych nasionach zebranych z transgenicznych roślin F_o. Ekstrakcję nasion prowadzono w sposób opisany w przykładzie 10. Zebrane dane wskazują, że w roślinach transgenicznych występuje średnio większe niż 15% zmniejszenie zawartości kwasu fitowego. Na fig. 29 i 30 przedstawiono podsumowanie danych. Zebrane dane wskazują, że w roślinach transgenicznych wytworzonych z wektorem pSIMT znajduje się średnio większe niż 15% zmniejszenie zawartości kwasu fitowego. Na skutek segregacji nasiona F₁ są mieszaninami nasion transgenicznych i nietransgenicznych, a zatem rzeczywiste zmniejszenie zawartości kwasu fitowego jest znacznie wyższe licząc w stosunku do nasion poddanych transformacji. Nasiona F2 i F3 są liniami homo-zygotycznymi, zawierającymi wektor pSIMT. Jest oczywiste, że w warunkach polowych linie homozygotyczne, zawierające wektor pSIMT wykazują średnio 30% zmniejszenie poziomów kwasu fitowego w nasionach. Poza analizą kwasu fitowego prowadzono analizę Southerna w celu określenia liczby kopii wprowadzonych genów. Nawet w roślinach z pojedynczą, wprowadzoną kopią genu widoczne jest znaczne zmniejszenie (34%) zawartości kwasu fitowego (na przykład roślina numer TP #11). Stąd ekspresja aktywności enzymatycznej zdolnej do modyfikowania mio-inozytolu w tkankach, odpowiedzialna za biosyntezę, prowadzi wyraźnie do zmniejszenia zawartości kwasu fitowego w nasieniu. Jest także oczywiste, że cechę niskiej zawartości kwasu fitowego można przenosić płciowo, ponieważ jest ona dziedziczna. Stąd sposób stosowania obejmuje także przenoszenie cechy konwencjonalnymi technikami kojarzenia, gdy cecha niskiej zawartości kwasu fitowego już się ustabilizowała.

P r z y k ł a d 18: Transformacja Brassica napus za pomocą pNIMT

Wektor p35SNIMT wprowadzano do szczepu MP90 Agrobacterium techniką standardowej koniugacji trójrodzicielskiej, a następnie stosując otrzymany Agrobacterium transformowano roślinę z rodzaju Brassica. Transformację prowadzono w sposób opisany w przykładzie 4.

Rośliny poddane transformacji p35NIMT otrzymywano i analizowano pod kątem zmniejszonej zawartości kwasu fitowego, jak w przykładzie 17. Na fig. 31 przedstawiono tabelę danych zebranych z nasion transgenicznych F1 i F2, zawierających wektor pNIMT, wyhodowanych w warunkach polowych. W roślinach F1 insercja pNIMT jest insercją segregującą, a zatem analizowane nasiona były mieszaniną segregantów transgenicznych i nietransgenicznych. W pokoleniu F2 większość linii była populacją homozygotyczną albo bliską homozygotycznej. Analiza pokolenia F2 wykazała blisko 40% zmniejszenie zawartości kwasu fitowego w nasionach z roślin wyhodowanych w warunkach polowych. Stąd ekspresja enzymu zdolnego do zmniejszania dostępności mio-inozytolu w szlaku biosyntezy kwasu fitowego w sposób selektywny względem nasion prowadzi do znacznego zmniejszenia poziomów kwasu fitowego.

PL 194 895 B1

P r z y k ł a d 19: Zapobieganie tworzeniu i gromadzeniu się galaktozy UDP poprzez zastosowanie enzymatycznej aktywności heterologicznej w komórkach roślinnych

Enzym, 4-epimeraza galaktozy UDP (galE) bierze udział w jednym z głównych etapów metabolizmu galaktozy w żywych komórkach. Katalizuje ona przekształcenie galaktozy UDP w glukozę UDP. Gen kodujący ten enzym występuje u ludzi, w drożdżach i bakteriach.

Celem tego przykładu jest przedstawienie przeprowadzenia nadekspresji tego enzymu w specyficznych tkankach rośliny docelowej, uzyskując zwiększenie puli glukozy UDP z wykorzystaniem galaktozy UDP. Przewidywanym wynikiem byłby zmniejszony poziom biosyntezy galaktynolu, który jest prekursorem przeciwżywieniowych glikozydów sacharozowych (glikozydy RFO, na przykład rafinoza, stachyoza, itp.). Osiągnięcie tego celu doprowadzi jednocześnie do zwiększonej dostępności glukozy UDP i sacharozy oraz zmniejszenia szybkości gromadzenia się niepożądanych glikozydów UDP. Należy się spodziewać, że sacharoza będzie uczestniczyć i wzmacniać inne szlaki metaboliczne, w których sacharoza jest konieczna albo do wytwarzania innych metabolitów, które są istotne dla rośliny, albo jako źródło węgla dla zwiększonej produktywności rośliny (na przykład białka, lipidy, ogólna wydajność, itp.).

W przykładzie tym zilustrowano zastosowanie, w celu uzyskania przekształcenia w procesie metabolicznym jednego podstawowego substratu w inny, enzymu bakteryjnego w roślinach wyższych, przy czym otrzymany nowy substrat będzie łatwo zużytkowany przez roślinę w szeregu kolejnych przekształceń metabolicznych.

P r z y k ł a d 20: Zmiana poziomów pochodnych cukrowych w wyniku zastosowania enzymatycznej fosfoglukomutazy (pgm)

Enzym, fosfoglukomutaza (pgm) katalizuje wzajemne przekształcenie fosforanu glukozy (Glc)-1 i Glc-6 w syntezie i wykorzystywaniu sacharozy. Enzym odgrywa główną rolę w syntezie i użytkowaniu sacharozy, skrobi i glikogenu, i jest obecny we wszystkich organizmach. Gen kodujący ten enzymu jest dostępny z wielu źródeł zarówno eukariotycznych, jak i bakteryjnych (na przykład z Agrobacterium).

G-1-P i G-6-P są podstawowymi substratami w szeregu pierwotnych węglowodanowych szlaków metabolicznych we wszystkich żywych układach. Specyficznie G-1-P jest pierwotnym substratem przy wytwarzaniu glukozy UDP, która jest głównym substratem w biosyntezie sacharozy. Natomiast G-6-P jest głównym materiałem wyjściowym dla szeregu wzajemnych przekształceń cukrów, z których jedna jest syntezą mio-inozytolo-1-P. Mio-inozytol-1-P jest głównym substratem i kofaktorem w syntezie odpowiednio kwasu fitowego i RFO-sów.

Celem tego przykładu jest wykazanie, że w wyniku nadekspresji bakteryjnego genu PGM w roślinie docelowej można modyfikować stosunek G-1-P do G-6-P na korzyść jednego albo drugiego z dwóch fosforylowanych postaci glukozy (w zależności od tkanki). Przez właściwe ukierunkowanie tej aktywności, na przykład w rozwijających się nasionach, można by spodziewać się wzrostu poziomu G-1-P, co byłoby pożądane dla wytwarzania glukozy-UDP albo -ADP, a następnie sacharozy i innych substancji spichrzowych, takich jak białka, lipidy albo skrobia. Z drugiej strony efekt obniżenia poziomu G-6-P przełożyłby się na obniżenie poziomów wspomnianych wyżej czynników przeciwżywieniowych.

P r z y k ł a d 21: Wytwarzanie komórek kukurydzy transgenicznej i uzyskiwanie rośliny transgenicznej

Hodowle kalusowe typu II zakłada się z niedojrzałych zarodków zygotycznych genotypu Hi-ll (Armstrong i wsp. (1991) Maize Genet. Coop. Newslett., 65:92-93). Niedojrzałe zarodki wyodrębnia się po około 14 dniach po zapyleniu z kłosów wyhodowanych w szklarni z krzyżówek pomiędzy szczepami wyjściowymi Hi-ll A i szczepami wyjściowymi Hi-ll B albo zarodkami pokolenia F2 pochodzącymi z samozapylenia albo zapylenia siostrzanego rośliny Hi-ll. Niedojrzałe zarodki (od 1,5 do 3,5 mm) hoduje się na pożywce inicjującej zawierającej sole azotu i witaminy (Chu i wsp. (1978), The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, 43-56), 1,0 mg/l 2,4-D, 25 mM L-proliny, 100 mg/l produktów hydrolizy kazeiny, 10 mg/l AgNO3, 2,5 g/l GELRITE (Schweizerhall, South Plainfieid, NJ) i 20 g/l sacharozy z pH 5,8. Po czterech do sześciu tygodni kalus poddaje się dalszej hodowli na pożywce hodowlanej (pożywka inicjująca, w której pominięto AgNO3, a zawartość proliny obniżono do 6 mM). Selekcję komórek kalusa typu II prowadzi się w ciągu około 12-16 tygodni.

Do wstrzeliwania albo wprowadzania obcego DNA do komórek roślinnych (transformacja drogą wstrzeliwania mikrocząstek) 140 mg DNA plazmidu (na przykład 35S-PAT/promotor globuliny kukurydzianej/IMT) osadza się na 60 mg sferycznych cząstek złota przemytych alkoholem (średnica 1,5 do 3,0 mm, Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, Wl, USA) przez dodanie 74 ml 2,5M CaCh, H2O i 30 ml

PL 194 895 B1

0,1M spermidyny (wolna zasada) do 300 μΙ DNA plazmidu i H2O. Roztwór poddaje się natychmiast mieszaniu na mieszadle Vortex i cząstki złota powleczone DNA pozostawia się, aby osiadły. Otrzymany klarowny supernatant usuwa się, a cząstki złota zawiesza ponownie w 1 ml absolutnego etanolu. Tę zawiesinę rozcieńcza się absolutnym etanolem otrzymując 15 mg złota pokrytego DNA/ml.

Stosowany DNA plazmidowy zawiera korzystnie wybrany marker, taki jak gen bar albo pat, nadający odporność na fosfinotrycynę albo herbicydowy glufozynian amonowy, oraz konstrukt genetyczny powodujący zmianę wtórnego metabolizmu, taki jak obszar kodujący genu IMT przedstawiony na fig. 24 albo kodujący obszar genu kodującego dehydrogenazę kwasu ferulowego przedstawiony na fig. 17, pod kontrolą odpowiedniego promotora selektywnego względem nasion, takiego jak promotor globuliny 1 kukurydzy albo promotor zeiny kukurydzy. W innym rozwiązaniu, aby uzyskać ekspresję IMT albo dekarboksylazy kwasu ferulowego można stosować konstytucyjny promotor, taki jak promotor ubikwityny z kukurydzy albo promotor aktyny z ryżu.

W przybliżeniu 600 mg zarodkowej tkanki kalusa rozprowadza się na powierzchni pożywki hodowlanej kalusa, nie zawierającej produktów hydrolizy kazeiny i L-proliny, lecz uzupełnionej 0,2M sorbitem i 0,2M mannitem jako czynnikami zapewniającymi właściwe ciśnienie osmotyczne. Wstępnie kalus hoduje się przez 4 godziny, a następnie komórki przenosi do szalek hodowlanych, zawierających pożywkę do wstrzeliwania DNA (pożywka osmotyczna zestalona za pomocą 20 g/l agaru TC (PhytoTechnology Laboratories, LLC, Shawnee Mission, KS) zamiast 7 g/l GELRITE. Aby uzyskać odpowiednią szybkość wstrzeliwanych w tak przygotowaną tkankę, zawieszonych cząsteczek złota pokrytych DNA stosuje się gazowy hel. Stosowane urządzenie jest znane z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5141131, które jest tu włączone tytułem referencji. Tkanki przykrywa się siatką ze stali nierdzewnej (oczka o średnicy 104 mm) i umieszcza się pod częściowo zmniejszonym ciśnieniem 645 mm słupa Hg (8,5x10⁴ Pa) w komorze urządzenia. Następnie cząstki złota pokryte DNA rozcieńcza się przed wstrzeliwaniem w stosunku 1:1 absolutnym etanolem i nadaje się im przyśpieszenie w kierunku komórek kalusa stosując hel pod ciśnieniem 1500 psi, przy czym każda seria dostarcza 20 ml zawiesiny DNA/złoto. Natychmiast po zakończeniu wstrzeliwania tkankę przenosi się do pożywki osmotycznej, aby komórki się zregenerowały, na okres 16-24 godziny. Następnie podłoże z tkanką dzieli się na małe części i przenosi do pożywki selekcyjnej (pożywka hodowlana nie zawierająca produktów hydrolizy kazeiny i L-proliny, lecz zawierające 30 mg/l BASTA (AgrEvo, Berlin, Niemcy). Co cztery tygodnie przez 3 miesiące części tkanki przenosi się bez selekcji do świeżej pożywki selekcyjnej. Po 7 tygodniach i do 22 tygodni usuwa się i oddziela części tkanki kalusa, które jak ustalono, namnożyły się na tle tkanek z zahamowanym wzrostem. Otrzymaną tkankę oporną na BASTA® poddaje się dwutygodniowej hodowli na świeżym podłożu selekcyjnym. Po odpowiedniej analizie identyfikuje się pozytywne linie transgeniczne i przenosi do pożywek do uzyskiwania roślin.

Uzyskiwanie roślin zapoczątkowuje się przenosząc kalus do pożywki indukcyjnej opartej na cytokininie, która obejmuje sole Murashige i Skoog, nazywane dalej solami MS i witamin (Murashige i Skoog, (1962) Physiol. Plant. 15:473-497), 30 g/l sacharozy, 100 mg/l mio-inozytolu, 30 g/l mannitu, ⁵ m^g/l ^enz^oammo^uryny naz^ywanej ^datej BAP ^0,025 m^{g/l 2,4}-D ³⁰ m^g/l BA^STA® ^{i 2/5 g/l}GELRITE przy pH 5,7. Hodowle umieszcza się w słabym świetle (1250 luksów) na okres jednego tygodnia, a następnie w ciągu jednego tygodnia w świetle intensywnym (3250 luksów). Po dwóch tygodniach indukcji tkankę przenosi się bez selekcji do pożywki regeneracyjnej bez hormonów, która jest identyczne z pożywką indukcyjną z tym wyjątkiem, że nie zawiera 2,4-D i BAP, i hodowlę kontynuuje się w intensywnym świetle. Małe odrosty roślinne (1,5-3 cm) wyjmuje się i umieszcza w probówkach hodowlanych 150x25 mm zawierających pożywkę SH (sole SH i witaminy (Schenk i Hildebrand, (1972) Can. J. Bot. 50:199-204), 10 g/l sacharozy, 100 mg/l mio-inozytolu, 5 mg/l FeEDTA i 2,5 g/l GELRITE, pH 5,8).

Większe odrosty roślinne przenosi się do szklarni, do doniczek o śr. 12 cm, zawierających w przybliżeniu 0,25 kg METRO-MIX 360 (The Scotts Co., Marysville, OH), gdy tylko odrosty wykażą wzrost i mają wystarczająco ukształtowany system korzeniowy. Odrosty hoduje się z 16-godzinnym dostępem światła, uzupełnionym połączeniem wysokociśnieniowej lampy sodowej i lampy z halogenkiem metalu, i nawadnia w miarę potrzeby, dodając łącznie trzy niezależne kompozycje nawozowe Peters Excel (Grace-Sierra Horti-cultural Products Company, Milpitas, CA). Na etapie 6-8 liści, rośliny przesadza się do doniczek o pojemności ok. 20 litrów, zawierających w przybliżeniu 4 kg METRO-MIX 360 i hoduje do uzyskania dojrzałej, płodnej rośliny kukurydzy transgenicznej. Nasiona wytwarzane przez te rośliny zawierają w niedojrzałych zarodkach geny z insercją, które wraz ze wzrostem rośliny dają ekspresję białek kodowanych przez DNA wprowadzony przez insercję.

PL 194 895 B1

P r z y k ł a d 22: Wytwarzanie transgenicznych roślin ryżu

Aby uzyskać hodowlę zarodkową kalusa dojrzałe nasiona ryżu kultywaru Japonica 308 poddaje się łuszczeniu i sterylizuje powierzchniowo w 70% etanolu przez 2-5 minut, a następnie moczy przez 30-45 minut w 50% środku bielącym dostępnym na rynku (2,6% podchloryn sodowy) z kilkoma kroplami mydła „Liquinox”. Następnie nasiona spłukuje się trzy razy sterylną, destylowaną wodą i umieszcza na bibule filtracyjnej przed przeniesieniem do pożywki „indukcyjnej komórek kalusa” (to jest pożywki NB). Pożywka NB zawiera makroelementy N6 (Chu, 1978, The N6 media and its application to anther culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, strony 43-56), mikroelementy B5 i witaminy (Gamborg i wsp., 1968, Nutrient reguirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151-158), 300 mg/l produktów hydrolizy kazeiny, 500 mg/l L-proliny, 500 mg/l L-glutaminy, 30 g/l sacharozy, 2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) i 2,5 g/l geirite (Schweizerhall, NJ) przy pH 5,8. Dojrzałe nasiona wyhodowane na pożywce indukcyjnej komórek kalusa poddaje się inkubacji w ciemności w temperaturze 28°C. Po 3 tygodniach hodowli pojawiający się pierwotny kalus, zaindukowany z obszaru tarczki dojrzałego zarodka, przenosi się do świeżej pożywki NB do dalszej hodowli.

Prowadzi się transformację przez wstrzeliwanie obcego DNA do tkanki roślinnej. Około 140 mg DNA plazmidowego osadza się na 60 mg cząstek złota o wielkości 1,0 mikrona (Bio-RAD), jak opisano w przykładzie 21. Stosuje się plazmid zawierający promotor ubikwityny kukurydzy genu hpt (fosfotransferaza higromycyny) i ubikwityny l kukurydzy, globuliny l kukurydzy, albo promotor zeiny genu IMT. Około 140 ng DNA plazmidowego osadza 60 mg cząstek złotą o wielkości 1,0 mikrona (Bio-Rad), jak opisano wyżej.

Aby rozpocząć przepuszczanie helu, rosnące zarodkowe kultury komórek kalusa o wielkości 2-4 mm poddaje się silnej obróbce osmotycznej. Taka obróbka obejmuje umieszczanie komórek kalusa na pożywce NB z 0,2 M mannitu i 0,2 M sorbitu (Vain i wsp., 1993, Osmoticum treatment enhances particle bombardement-mediated transient and stable transformation of maize. Plant Cell Rep. 12:8488) przez 4 godziny przed wstrzeliwaniem DNA. Po obróbce osmotycznej hodowle komórek kalusa przenosi się do pożywki „do wstrzeliwania” (NB + 2% agaru) i pokrywa się siatką ze stali nierdzewnej (gęstość 230 mikronów). Do hodowli komórek kalusa dwukrotnie wstrzeliwuje się DNA pod ciśnieniem helu 2000 psi (13,8 MPa). Po zakończeniu wstrzeliwania kalus przenosi się na noc ponownie do pożywki z wysoką zawartością składnika osmotycznego, przed umieszczeniem na podłożu selekcyjnym, które stanowi pożywka NM z 30 mg/l higromycyny. Po dwóch tygodniach kultury przenosi się do świeżej pożywki selekcyjnej o wyższym stężeniu środka selekcyjnego, to jest NB + 50 mg/l higromycyny (Li i wsp., 1993, An improved rice transformation system using the biolistic method. Plant Cell Rep. 12:250-255).

Ze zwartych, biało-żółtych, zarodkowych kultur tkanek kalusa, uzyskanych na NB + 50 mg/l higromycyny, uzyskuje się rośliny transgeniczne drogą przenoszenia do pożywki „do wstępnej regeneracji” (PR) + 50 mg/l higromycyny. Pożywka PR składa się z pożywki NB z 2 mg/l benzyloaminopuryny (BAP), 1 mg/l kwasu naftalenoocotwego (NAA) i 5 mg/l kwasu abscysynowego (ABA). Po 2 tygodniach hodowli w ciemnościach kalus przenosi się do pożywki „regeneracyjnej” (RN). Skład pożywki RN obejmuje pożywkę RB z 3 mg/l BAP i 0,5 mg/l NAA. Kultury tkanek kalusa na pożywce RN poddaje się inkubacji przez 2 tygodnie w temperaturze 28°C z naświetlaniu światłem fluorescencyjnym o wysokim natężeniu (3250 luksów). Po osiągnięciu przez odrosty roślinne wysokości 2 cm przenosi się je do skrzynek z fuksyną zawierających pożywkę 1/2 MS (Murashige i Skoog, 1962, A revised media for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497) z witaminami 1/2 B5, 10 g/l sacharozy, 0,05 mg/l NAA, 50 mg/l higromycyny i 2,5 g/l geirite i przy pH 5,8. Duże rośliny o wysokości 8-15 cm z dobrze rozwiniętymi systemami korzeniowymi przenosi się do gleby (1 metromix: 1 gleba wierzchnia) i hoduje w szklarni (21/24°C dzień/12 godzin okresu światła). Rośliny ryżu rosną aż do płodnych, transgenicznych roślin ryżu. Nasiona uzyskane z tych roślin zawierają geny wprowadzone do komórek kalusa i gdy wraz ze wzrostem roślin, uzyskuje się ekspresję białek kodowanych przez wprowadzony DNA.

PL 194 895 B1

Lista sekwencji <110> GEORGES, FAWZY DONG, JIN-ZHUO KELLER, WILF HUSSAIN, ATTA A. K.

SELVARAJ, GOPALAN DATLA, RAJU <120> Sposób poprawiania żywieniowego profilu rośliny i genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne <130> pet <140>

<141>

<1500 US 60/072156 <151> 1998-01-22 <150> US 09/012453 <151> 1998-01-23 <160 7 <170> Patentln Ver. 2.0 <210 1 <211> 483 <212> DNA <213> Arthrobacter pascens <4000 1 atggaccaat ttgttgggtt cccacatgatc tacacatacg agaacgcgttg ggagtacgaa 60 atctacatca agtaagtcgc cacaatcgac taccttatcc acagtggtat tgtttgtttt 120 atttttgtga gtgtaccagt cgtgaacatc gtgaagctca caaagggtgt ttacaaggtg 180 agcttgacag aatccggcgg Cacagacgtg aę^c^c^tc^^^c^t tcatgccaga tgaggatatt 24 0 at^a^t^ tgtacetcet cccaaagtgg c^tę^c^^c^ę^^^a ggccagacat cacatttttc 300 taccaagacg aaCcacatgt cctcatgaag gagagcatgg agaagtacta tacaCaccca 360 aattactttg tctccgtgtt cgctgacatc ^c^^t^^c^^t^c^c accacgctgg attgaacgac 420 tatataatca tcgttctggt Cccatactag gcCatgacag acgagatcat tttttgCatg 480 aat 483 <210> 2 <211> 161 <212> PRT <213> Bacillus pumilus

<400> 2

His

Met

Ile 10

Tyr

Thr

Tyr

Glu

Asn 15

Gly

Met 1

Asp

Gin

Phe Val 5

Gly

Leu

Trp

Glu

Tyr

Glu 20

Ile

Tyr

Ile

Lys

Asn 25

Asp

His

Thr

Ile

Asp 30

Tyr

Art

Ile

His

Ser 35

Gly

Met

Val

Gly

Gly 40

Art

Trp

Val

Art

Asp 45

Gln

Glu

Val

Asn

Ile 50

Val

Lys

Leu

Thr

Lys 55

Gly

Val

Tyr

Lys

Val 60

Ser

Trp

Thr

Glu

PL 194 895 Β1

Pro Thr Gly Thr Asp Val Ser Leu 65 70

Met His Gly Val Ile Phe Phe Pro 85

Ile Thr Val Cys Tyr Gin Asn Asp 100

Arg Glu Lys Tyr Glu Thr Tyr Pro 115 120

Asp Ile Thr Tyr Ile His His Ala 130 135

Ala Glu Ala Pro Tyr Glu Gly Met 145 150

Lys

Asn Phe Met Pro Glu Glu Lys Arg 75 80

Lys Trp Val His Glu Arg Pro Asp 90 95

Tyr Ile Asp Leu Met Lys Glu Ser 105 110

Lys Tyr Val Val Pro Glu Phe Ala 125

Gly Val Asn Asp Glu Thr Ile Ile 140

Thr Asp Glu Ile Arg Ala Gly Arg 155 160 <210> 3 <211> 546 <212> PRT <213> Arthrobacter pascens <400> 3

Met His Ile Asp Asn Val Glu Asn 1 5

Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Ala 20

Ser Glu Glu Pro Thr Val Ser Val 35 40

Asp Arg Gly Val Pro Glu Val Leu 50 55

Leu Glu Ser Gly Tyr Asp Trp Asp 65 70

Gly Asn Ser Phe Met Arg His Ala 85

Ser Ser His Asn Ser Cys Ile Ala 100

Asp Glu Trp Glu Ser Lys Tyr Gly 115 120

Ala Trp Pro Leu Tyr Gin Arg Leu 130 135

Asp Ala Pro His His Gly Asp Ser 145 150

Pro Pro Ala Asp Pro Ala Gly Val 165

Leu Asn Asp Arg Glu Phe Asp Tyr 10 15

Gly Ala Ala Val Ala Ala Arg Leu 25 30

Ala Leu Val Glu Ala Gly Pro Asp 45

Gin Leu Asp Arg Trp Met Glu Leu 60

Tyr Pro Ile Glu Pro Gin Glu Asn 75 80

Arg Ala Lys Ile Met Gly Gly Cys 90 95

Phe Trp Ala Pro Arg Glu Asp Leu 105 110

Ala Thr Gly Trp Asn Ala Glu Ser 125

Glu Thr Asn Glu Asp Ala Gly Pro 140

Gly Pro Val His Leu Met Asn Val 155 160

Ala Leu Leu Asp Ala Cys Glu Gin 170 175

PL 194 895 B1

Ala Gly

Ile

Pro 180

Arg Ala

Lys

Phe

Asn 185

Thr

Gly

Thr

Val 190

Ile

Asn

Gly

Ala

Asn

Phe

Gin

Ile

Thr

Arg

Ala

Asp

Gly

Thr

Arg

Ser

195

200

205

Ser

Val

Ser

Tyr

Ile

His

Pro

Ile

Glu

Arg

Gly

Asn

Phe

210

215

220

Thr

Leu

Thr

Gly

Leu

Arg

Ala

Arg

Gln

Leu

Val

Phe

Asp

Ala

Asp

225

230

235

240

Lys

Arg

Cys

Thr

Gly

Val

Asp

Val

Asp

Ser

Ala

Phe

Gly

Arg

Thr

245

250

255

His

Arg

Leu

Ser

Ala

Arg

Cys

Glu

Val

Ile

Leu

Ser

Thr

Gly

Ala

Ile

260

265

270

Asp

Ser

Pro

Lys

Leu

Met

Leu

Ser

Gly

Ile

Gly

Pro

Ala

His

275

280

285

Leu

Ala

Glu

His

Gly

Val

Glu

Val

Leu

Val

Asp

Ser

Pro

Gly

Val

Gly

290

295

300

Glu

His

Leu

Gin

Asp

His

Pro

Glu

Gly

Val

Gin

Phe

Glu

Ala

Lys

305

310

315

320

Gin

Met

Val

Gin

Thr

Ser

Thr

Gin

Trp

Glu

Ile

Gly

Ile

Phe

325

330

335

Thr

Pro

Thr

Glu

Asn

Gly

Leu

Asp

Arg

Pro

Asp

Leu

Met

His

Tyr

340

345

350

Gly

Ser

Val

Pro

Phe

Asp

Met

Asn

Thr

Leu

Arg

Tyr

Gly

Tyr

Pro

Thr

355

360

365

Thr

Glu

Asn

Gly

Phe

Ser

Leu

Thr

Pro

Asn

Val

Thr

His

Ala

Arg

Ser

370

375

380

Arg

Gly

Thr

Val

Arg

Leu

Arg

Ser

Arg

Asp

Phe

Arg

Asp

Lys

Pro

Ala

385

390

395

400

Val

Asp

Pro

Arg

Tyr

Phe

Thr

Asp

Pro

Glu

Gly

His

Asp

Met

Arg

Val

405

410

415

Met

Val

Ala

Gly

Ile

Arg

Lys

Ala

Arg

Glu

Ile

Ala

Gin

Pro

Ala

420

425

430

Met

Ala

Glu

Trp

Thr

Gly

Arg

Glu

Leu

Ser

Pro

Gly

Thr

Glu

Ala

Gin

435

440

445

Thr

Asp

Glu

Leu

Gin

Asp

Tyr

Ile

Arg

Lys

Thr

His

Asn

Thr

Val

450

455

460

Tyr

His

Pro

Val

Gly

Thr

Val

Arg

Met

Gly

Pro

Ala

Asp

Met

465

470

475

480

Ser

Pro

Leu

Asp

Pro

Glu

Leu

Arg

Val

Lys

Gly

Val

Thr

Gly

Leu

Arg

485

490

495

Val Ala Asp Ala Ser Val Met Pro Glu His Val Thr Val Asn Pro Asn

PL 194 895 Β1

500 505 510

Ile

Thr

Val 515

Met

Ile

Gly

Glu 520

Arg

Cys Ala Asp

Leu 525

Ile

Arg

Ala

Ser

Arg

Thr

Gly

Glu

Thr

Ala

Glu

Ala

Glu

Leu

Ser

Ala

Ser

530

535

540

Leu Ala 545 <210> 4 <211> 1641 <212> DNA <213> Arthrobacter pascens <400> 4 atgcacatcg acaacgtcga aaacctcaac gaccgcgagt tcgactacat catcatcggc 60 ggcggttccg ccggagcggc agtcgccgcc cgcctgagcg aggagcccac cgtgtccgtg 120 gcgctggtgg aggccggccc ggacgaccgc ggcgttcccg aggtactgca gctcgaccgc 180 tggatggagc tgctggaatc cggctacgac tgggactacc cgatcgaacc gcaggagaac 240 ggcaactcct tcatgcgcca cgcccgcgcg aagatcatgg gtggctgctc cagccacaac 300 tcctgcatcg ccttctgggc cccgcgcgaa gacctggacg agtgggagtc caagtacggc 360 gccaccggct ggaacgctga gtccgcctgg ccgctgtacc agcggctgga gaccaacgag 420 gacgccggcc cggacgcgcc gcaccacggc gactcaggcc cggtgcacct gatgaacgtg 480 cccccggcgg accccgccgg cgtcgcactc ctggacgcct gcgaacaggc aggcattccg 540 cgcgcgaagt tcaacaccgg caccaccgtg atcaatggcg ccaacttttt ccagatcaca 600 cgccgcgcgg acggcacccg ttcctccagc tcggtctcct acatccaccc gatcatcgag 660 cgcgggaact tcaccctgct gaccgggttg cgcgcccggc aactggtgtt cgacgcggac 720 aagcgctgca ccggcgtcga cgttgtggac tcggcgttcg gccggactca ccggctctcc 780 gcgcgttgcg aggtcatcct gtccaccggc gccattgact cgcctaagct gctcatgctc 840 tccggcatcg gccccgccgc gcacctcgcc gagcacggcg tcgaggtcct ggtcgactcc 900 cccggtgtcg gcgagcacct gcaggaccac cccgaaggcg tcgtccagtt cgaggccaag 960 cagcagatgg tgcagacttc gacgcagtgg tgggagatcg gcatcttcac ccccaccgag 1020 aacggcctgg accgcccgga cctgatgatg cactacggct ccgtcccgtt cgacatgaac 1080 accctgcggt acggctaccc caccacggag aacggcttca gcctcacgcc gaacgtcacg 1140 cacgcccgct cccgcggcac cgtccggctg cgcagccgcg acttccgcga caagcccgcc 1200 gtcgacccgc ggtacttcac tgatccggag ggccacgaca tgcgcgtcat ggtggccggc 1260 atccgcaagg cccgtgaaat cgccgcccag cctgccatgg ccgaatggac cggccgcgag 1320 ctctcgcccg gcaccgaggc gcagaccgac gaggaactgc aggactacat ccgcaagacg 1380 cacaacaccg tttaccaccc cgtcggcacc gtccgcatgg gaccagccga cgacgacatg 1440 tcgccgctcg accccgagct gcgggtgaag ggcgtgaccg gcctgcgcgt cgccgatgcc 1500 tctgtcatgc ctgaacacgt cacggtcaat cccaacatca ccgtcatgat gatcggcgaa 1560 cgctgcgccg acctcatccg cgccagccgg accggcgaaa caacgacggc ggaggcggag 1620 ctcagcgcgt ccctcgcctg a 1641 <210> 5 <211> 1494 <212> DNA <213> Mesembryanthemum crystallinum <400> 5 aaaaaaaaaa ttttacttct ctgttttacc aaaaagagaa aaaaaaatga ctacttacac 60 caatggcaac tacacacaac caaaaaccct agacaaagat gaacaattag ctggtttggc 120 agtgacatta gcaaatgcag ctgcttttcc aatgatcctg aaatcagcct ttgagctaaa 180 aatccttgac atattctcaa aagcagggga aggcgtgttt gtatcgactt ctgagatcgc 240 tagccaaatc ggggcaaaga accctaatgc cccggtgttg ttggaccgga tgctccggct 300 cctggctagc cactctgtgt taacatgcaa gctccaaaag ggtgagggtg gttctcaaag 360 ggtgtatggt ccagctcccc tttgcaacta tcttgctagt aatgatggtc aaggctctct 420 tggccctttg cttgttttgc atcatgacaa ggtcatgatg gagagttggt ttcacttgaa 480

PL 194 895 B1 tgattacata ctagaaggag gtgttccattcaagcgcgct catgggatga tccaattcga 540 ctacactggg tctgatgaat ggttcccttcagtgttcaac caagggatgg cacaccacac €500 ttCcctggtc atgatgaagc tccatcccaa acaccatęigg tttaatgatg tcaaggtcct 660 agCtgatgtg ggtggtaact ttcctgttcatctgagcatg atcgtcgcta agcatactca 720 ctCtaagggc atcttataCg actaccgacctgtcattgct gatgctcctt cttaccccgg 785O tgtggagctt gtCggtggCt actatttCccgggcaaacca aaagcagatg ccattttcaa 8340 gttgtgggCg tCgcatgaCt ggggagcgtcgcattgcgt;g aagaUacUca acaagUgcUa 9500 ^agatc^g gaaatgggag ggggtagacaccaagaggaa UcgcUUaUac cagaaaaccc 9)60 ctcgaatcac agaCactgtgtagggttgat tggaaaaata tggtgcacaa 1020 cataggtggt aaagagagat UUagcUUcca agaatggata :6080 cCcttcagtt gttgCaattC gctatgcgacUgacacUUgg gacaaggagc tataaaagaa 1140 gCgtttcaag cCctaaaCgc agtgtggaag taattgttga tagaaaaaga agatagatag 1200 cCggtttttt CCCctccCaa clccagatCgttttatggga aagttgagga gattcatgta 1260 tCgtaaatgC tgtgtttggg ttatttgtatt tgtgttttgt tgttgtgtct 1320 tCgtagataa g^ga^tcc tgctccactaggctggctgc attttttettg aggctgcctg ^9380 aatttgtaga attCgtggCt ttcCCtcaataaagcatcta aagaaccata gttaacagtg 1460 tttgatctga ctCCatCCCC cttgtaaaaa acca 1.494 <216> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja utworzona sztucznie <226>

<223> Opis sekwencji utworzonej sztucznie: Starter <966> 6 tctttggatc aatgtcCaat Cacacaatgt ctacCaaa 38 <216> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja utworzona sztucznie <226>

<223> Opis sekwencji utworzonej sztucznie: Starter <966> 7

CCCCtCtCgc ggacgcttaa aggcaaatca tacacCg 37

Claims

1. Sposób poprawiania żywieniowego profilu rośliny, znamienny tym, że obejmuje etapy w których dostarcza się sekwencję nukieotydową kodującą enzym modyfikujący wykorzystanie substratu pośredniego we wtórnym sziaku metabolicznym związanym z żywieniowym yrofiiem rośliny, yrzy czym enzym jest inny niż enzymy występujące naturalnie we wtórnym sziaku metabolicznym, następnie komórki rośiiny transformuje się kasetą ekspresyjną zawierającą tę sekwencję nukieotydową funkcjonainie połączoną z promotorem specyficznym dia nasion, yo czym z komórek rośiinnych uzyskuje się genetycznie zmienioną rośiinę, która ma poprawiony profii żywieniowy w porównaniu do rośiiny typu dzikiego.

2. Sppoóó według zastrz. 1, zznmieenn tym, Zż wtórnnm szlakiem metabblicznnm j est szlak fenyiopropanoidu.

3. ;pyoZówedługzaktrZι2,zznmieenytym, żż eszamem metakbliczanm jeeS eszay^ medakbf iizujący choiinę.

4. SpyoZó wedługzaktrZι3, zznmieenytym. żż eszamem metakblizajecym chhfnęjest ooksdaza choiinowa.

5. SpyoZó wedługzaktrZι4, zzya'lieeyytym. żż kakztaeSkzressjna zawiedaróweied szSwescję nukieotydową kodującą dehydroiazę aidehydu betainy przekształcająca aidehyd betainy w betainę.

PL 194 895 B1

6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że enzym działa na kwas ferulowy.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że enzymem jest dekraboksylaza kwasu ferulowego.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wtórnym szlakiem metabolicznym jest wtórny szlak metaboliczny alkoholu wielowodorotlenowego.

9. Sppsóó weeług zzstrz. 8, ζ^πιιε^ tym, że subbtrat j est wybrany z grupp obbjmująccj mio-inozytol, galaktynol i pochodne UDP cukrów.

10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że substratem jest mio-inozytol.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że enzymem jest transferaza mio-inozytolo-O-metylu.

12. Sppośó weeług gzasz j 1, gnnmieenytym. 6ż t ranyóesaaz mio-inyoztolo-0-rτlujylu mm gse kwencję aminokwasową transferazy mio-inozytolo-O-metylu z Mesembryanthemum crystallinum.

13. Sppsóóweeług zzasze, zznmieenytym. żż pporawiosyproSI żżwiesioweraSliny o0ejmuje obniżenie względem rośliny typu dzikiego, poziomu kwasu fitynowego.

14. Sppsóóweeług zzasz^, znnmieenytym. żż pporawiosyproSI żżwiesioweraSliny o0ejmuje obniżenie względem rośliny typu dzikiego, poziomu synapiny.

15. Sppsóóweeług zzasze, znnmieenytym. żż pporawiosyproSI żżwiesioweraSliny o0ejmuje obniżenie względem rośliny typu dzikiego, poziomu ligniny.

16. Sppsóóweeługzzαtrz. I. glbb2, glbb I, glbb4, glbb g, glbb6, glbb I, glbb g, glbb g, glbb 10 albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, że substrat jest inny niż metabolit pierwotny wybrany z grupy obejmującej: glukozę, aminokwasy, typowe kwasy tłuszczowe i nukleotydy.

17. Sppsóóweeługzzαtrz. I. glbb2, glbb I, glbb4, glbb g, glbb6, glbb I, glbb g, glbb g, glbb 10 albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, że promotorem specyficznym dla nasion jest promotor fazeolinowy lub promotor napinowy.

W. Sppsóóweeługzzαtra. I. glbb2, glbb I, glbb4, glbb g, glbb 6, glbb I, glbb g, glbb g, glbb 10 albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap hodowli genetycznie zmienionej rośliny w warunkach umożliwiających tworzenie i uzyskiwanie nasion.

19. Sppsóóweeługzzαtrz. I. glbb2, glbb I, glbb4, glbb g, glbb6, glbb I, glbb g, glbb g, glbb 10 albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, że roślina jest wybrana z grupy obejmującej Dicotyledoneae i Monocotyledoneae.

20. Sppsóóweeług zaa^ I. glbb2, glbb I, glbb4, glbb g, glbb6, glbb I, glbb g, glbb g, glbb 10 albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, że roślina jest wybrana z rodziny Brassicaceae, korzystnie rodziny Brassica, gatunku Brassica rapa lub Brassica napus.

21. Sppsóóweeługzzαtrz. I. glbb2, glbb g, IlbbA glbb g, glbb6, glbb g, glbb g, glbb g, glbb 10 albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, że roślina jest wybrana z grupy obejmującej: kukurydzę, rzepak canola, pszenicę, grykę, lucernę siewną, soję i sorgo.

22. Gesyjyycaie gmiesiosy Ιοιη^ϊ ιζ^^, I uP Ιοιη^ϊ pptomuy, gOejmujecc gaaSombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego stabilnie włączoną w genom tej komórki, gdzie zrekombinowaną cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera:

23. Genejyccnie zmienione komórki rc^i^llr^i^, naaion Iub komórki potomne wedłuu ζθι^ζ. 22, znamienne tym, że wtórnym szlakiem metabolicznym jest szlak fenylopropanoidu.

24. Geneeyccnie zmiennone ^1^0^ roSllny, naason Il-ió kor'^^ potomne wedłuu 23, znamienne tym, że enzymem metabolicznym jest enzym metabolizujący cholinę.

25. Geneeyccnie zmienione ^1^0^ roninn, naason Iub ^1^0^ potomne według ζθι^ζ. 24, znamienne tym, że enzymem metabolizującym cholinę jest oksydaza cholinowa.

2,. Geneeyccnie zmienione ^1^0^ roSllny, naason Iub ^1^0^ potomne według ζθι^ζ. 25, znamienne tym, że kaseta ekspresyjna zawiera również sekwencję nukleotydową kodującą dehydrolazę aldehydu betainy do przekształcania aldehydu betainy w betainę.

2,. Geneeyccnie zmienione ^1^0^ roSllny, naason Iub ^1^0^ potomne według zaatrua 23, znamienne tym, że enzym działa na kwas ferulowy.

2,. Geneeyccnie zmienione ^1^0^ roSllny, naason Iub ^1^0^ potomne według zaatrua 27, znamienne tym, że enzymem jest dekraboksylaza kwasu ferulowego.

PL 194 895 B1

29. Genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według zastrz. 22, znamienne tym, że wtórnym szlakiem metabolicznym jest wtórny szlak metaboliczny alkoholu wielowodorotlenowego.

30. Genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według zastrz. 22, znamienne tym, że substrat jest wybrany z grupy obejmującej mioinozytol, galaktynol i pochodne UDP cukrów.

31. Genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według zastrz. 22, znamienne tym, że substratem jest mio-inozytol.

32. Genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według zastrz. 23, znamienne tym, że enzymem jest transferaza mio-inozytolo-O-metylu.

33. Genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według zastrz. 32, znamienne tym, że transferaza mio-inozytolo-O-metylu ma sekwencję aminokwasową transferazy mio-inozytolo-O-metylu z Mesembryanthemum crystallinum.

34. Genetycznie zmienionekomórki rośllny, nasionlub komórki potomnewedług zastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, albo 31, albo 32, albo 33, znamienne tym, że substrat jest inny niż metabolit pierwotny wybrany z grupy obejmującej: glukozę, aminokwasy, typowe kwasy tłuszczowe i nukleotydy.

35. Geneeyczn ie zmienionekomórki rośHny, nastonl ubkomórki potomnewedługzastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, albo 31, albo 32, albo 33, znamienny tym, że promotorem specyficznym dla nasion jest promotor fazeolinowy lub promotor napinowy.

36. Genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według zastrz. 22, znamienne tym, że poprawiony profil żywieniowy rośliny obejmuje obniżenie względem rośliny typu dzikiego, poziomu kwasu fitynowego.

37. Genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według zastrz. 22, znamienne tym, że poprawiony profil żywieniowy rośliny obejmuje obniżenie względem rośliny typu dzikiego, poziomu synapiny.

38. Genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne według zastrz. 22, znamienne tym, że poprawiony profil żywieniowy rośliny obejmuje obniżenie względem rośliny typu dzikiego, poziomu ligniny.

39. Genetycznie ζϋΐβηΐοηβ^ϋόΓ^ rośllny, nastonl ub komórki potomnewedługzastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, albo 31, albo 32, albo 33, albo 36, albo 37, albo 38, znamienny tym, że roślina jest wybrana z grupy obejmującej Dicotyledoneae i Monocotyledoneae.

40. Geneeycznie zmienionekomórki rosUny, nassonl ub komórki potomnewedługzastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, albo 31, albo 32, albo 33, albo 36, albo 37, albo 38, znamienny tym, że roślina jest wybrana z rodziny Brassicaceae, korzystnie rodziny Brassica, gatunku Brassica rapa lub Brassica napus.

41. Genetycznie zmienionekomórki rośHny, nassonl ub komórki potomnewedługzastrz. 212 albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, albo 28, albo 29, albo 30, albo 31, albo 32, albo 33, albo 36, albo 37, albo 38, znamienny tym, że roślina jest wybrana z grupy obejmującej: kukurydzę, rzepak canola, pszenicę, grykę, lucernę siewną, soję i sorgo.

42. Karma dla zwierząt zawierająca genetycznie zmienioną rośllnę, komórki rośllnne Iuó nasiona i ich potomstwo obejmujące zrekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego stabilnie włączoną w genom tej komórki, gdzie zrekombinowaną cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera: