JP2002532114A - トランスジェニック植物およびその作出法 - Google Patents
トランスジェニック植物およびその作出法Info
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- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
- C12N15/8294—Auxins
Abstract
(57)【要約】
化学物質または生理学的ストレスの適用によって増殖部位から選択的に取り出すことができるトランスジェニック植物の作出のために遺伝子構築物、形質転換ベクターおよび方法が教示される。本発明は選択的に発現して植物を枯死させる条件的致死遺伝子に対して商業上注目される形質に関する標的遺伝子に関わるものである。この遺伝子構築物の使用により本発明の形質転換ベクターおよび方法、トランスジェニック植物による環境中への侵入および商業上非操作生産物の混入」が回避できる。アブラナ属種の形質転換のための方法も教示される。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、トランスジェニック植物、特に、環境上信頼できる圃場への解放に
適したトランスジェニック植物、ならびにその作出のための遺伝子構築物および
ベクターに関する。本発明はまたトランスジェニック植物を便宜に選抜および同
定するための新規の遺伝子構築物ならびにその植物に由来する後代に関する。本
発明はさらにトランスジェニックアブラナ種の作出のための新規なベクターおよ
び形質転換法に関する。
適したトランスジェニック植物、ならびにその作出のための遺伝子構築物および
ベクターに関する。本発明はまたトランスジェニック植物を便宜に選抜および同
定するための新規の遺伝子構築物ならびにその植物に由来する後代に関する。本
発明はさらにトランスジェニックアブラナ種の作出のための新規なベクターおよ
び形質転換法に関する。
【０００２】背景技術 トランスジェニック植物 改変された新規な形質（いわゆる「新規な形質」）が組換えＤＮＡ技術によっ
て作物種に付与できることが知られている。新規な形質を有するこれらの作物を
得るためには、作物のゲノムに組換えＤＮＡを挿入する方法が必要である。この
方法は、一般に形質転換と呼ばれているが、培養、それ自体の形質転換、および
完全な植物体への再分化の手順を開発するのは技術的な挑戦であり、多大な努力
を要する。形質転換が定着した種もあるが、別の種では形質転換は依然として困
難で時間がかかる。しかしながら、新規な形質を発現するよう遺伝子操作した作
物種の中にはすでに一連の商業生産に投入されているものもあり、市場流出の準
備段階で圃場試験下にあるものもある。
て作物種に付与できることが知られている。新規な形質を有するこれらの作物を
得るためには、作物のゲノムに組換えＤＮＡを挿入する方法が必要である。この
方法は、一般に形質転換と呼ばれているが、培養、それ自体の形質転換、および
完全な植物体への再分化の手順を開発するのは技術的な挑戦であり、多大な努力
を要する。形質転換が定着した種もあるが、別の種では形質転換は依然として困
難で時間がかかる。しかしながら、新規な形質を発現するよう遺伝子操作した作
物種の中にはすでに一連の商業生産に投入されているものもあり、市場流出の準
備段階で圃場試験下にあるものもある。
【０００３】 これらのトランスジェニック作物種の多くは表現型を改変された新規な形質を
有する。これらの表現型には、病虫害耐性または環境的ストレス耐性、および除
草剤耐性を向上させる新規な組成が含まれる。かかる耐性は農業者に新しい雑草
管理手段や新しい生産の機会を提供する。
有する。これらの表現型には、病虫害耐性または環境的ストレス耐性、および除
草剤耐性を向上させる新規な組成が含まれる。かかる耐性は農業者に新しい雑草
管理手段や新しい生産の機会を提供する。
【０００４】 農業上の特徴に影響を及ぼす、市場流通している現行の新規な形質の多くは、
ひとまとめにして「インプット」形質、すなわち、生産の経済性に関する形質と
呼ばれる。例えば除草剤耐性は、雑草管理において農業者により多くの選択肢を
与えるのでインプット形質であり、典型的にはこれら新規な除草剤耐性により雑
草管理コストを低減することができる。このように生産すなわち作物を生育させ
るために必要な「インプット」の経済性は好ましく改変される。昆虫に対する耐
性などの他の形質は化学物質（殺虫剤）の散布量の減少によって農業者のコスト
を低減できる。
ひとまとめにして「インプット」形質、すなわち、生産の経済性に関する形質と
呼ばれる。例えば除草剤耐性は、雑草管理において農業者により多くの選択肢を
与えるのでインプット形質であり、典型的にはこれら新規な除草剤耐性により雑
草管理コストを低減することができる。このように生産すなわち作物を生育させ
るために必要な「インプット」の経済性は好ましく改変される。昆虫に対する耐
性などの他の形質は化学物質（殺虫剤）の散布量の減少によって農業者のコスト
を低減できる。
【０００５】 インプット形質に加えて、収穫した植物の組成または品質を改変する「アウト
プット」形質がある。かかる形質は作物からの最終生産物すなわち「アウトプッ
ト」に影響を及ぼし、かかる形質には油またはミールの組成の変化、栄養分吸収
阻害物質含量の低下、および作物の加工特性の改変などが含まれる。新製品、経
済価値および利便の向上を提供するアウトプット形質を有する作物の開発にはか
なりの努力がはらわれてきた。
プット」形質がある。かかる形質は作物からの最終生産物すなわち「アウトプッ
ト」に影響を及ぼし、かかる形質には油またはミールの組成の変化、栄養分吸収
阻害物質含量の低下、および作物の加工特性の改変などが含まれる。新製品、経
済価値および利便の向上を提供するアウトプット形質を有する作物の開発にはか
なりの努力がはらわれてきた。
【０００６】 いくつかの形質は高付加価値「アウトプット」形質として分類される。かかる
形質は、商業用または医薬用の新規なタンパク質を生産する「分子農業」に用い
られる作物内にある。分子農業は商業上有用かつ価値のあるタンパク質を大量に
経済的に生産するのにかなり有望である。作物をタンパク質の量産に使用するこ
とは、生産の容易さ、塊茎または種子などの植物の貯蔵器官内で合成された場合
の生産物の安定性、および植物由来のミール、油またはデンプンといった価値あ
る副産物を回収できる可能性などをはじめ、発酵技術に多くの利点を提供する。
形質は、商業用または医薬用の新規なタンパク質を生産する「分子農業」に用い
られる作物内にある。分子農業は商業上有用かつ価値のあるタンパク質を大量に
経済的に生産するのにかなり有望である。作物をタンパク質の量産に使用するこ
とは、生産の容易さ、塊茎または種子などの植物の貯蔵器官内で合成された場合
の生産物の安定性、および植物由来のミール、油またはデンプンといった価値あ
る副産物を回収できる可能性などをはじめ、発酵技術に多くの利点を提供する。
【０００７】 分子農業による量産を意図したタンパク質としては、工業用酵素、例えば、プ
ロテアーゼ、デンプンまたは炭水化物修飾酵素（例えばαアミラーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、
またはペクチナーゼ）などの微生物起源のものがある。さらに、パルプおよび製
紙業で特に価値のあるリグニナーゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素の生産も
多様な作物種内で提案されている。分子農業を用いて製造され得る商業上または
工業上重要な酵素の別の例として、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、お
よびフィターゼがある。工業上価値のある酵素は多数あり、植物は発酵に匹敵す
ると予想されるコストでこれらのタンパク質を量産するのに便利な伝達体を提供
する。
ロテアーゼ、デンプンまたは炭水化物修飾酵素（例えばαアミラーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、
またはペクチナーゼ）などの微生物起源のものがある。さらに、パルプおよび製
紙業で特に価値のあるリグニナーゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素の生産も
多様な作物種内で提案されている。分子農業を用いて製造され得る商業上または
工業上重要な酵素の別の例として、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、お
よびフィターゼがある。工業上価値のある酵素は多数あり、植物は発酵に匹敵す
ると予想されるコストでこれらのタンパク質を量産するのに便利な伝達体を提供
する。
【０００８】 さらに、分子農業は、ワクチン、抗体（Hein, M. B. and Hiatt, A. C. 米国
特許第５，２０２，４２２号)、ペプチドホルモン(Vandekerckhove, J. S., 米
国特許第５，４８７，９９１号)、血液因子などの製造および送達において、そ
の使用が意図されている。選択された治療薬を生産するように操作された食用植
物は、コスト効率がよい上に田園地帯または発展途上国での治療薬の投与に特に
適した薬剤送達手段となり得るであろうと仮定されている。治療薬を含有する植
物素材は、栽培して食餌に配合することが可能であろう(Lam, D. M. and Arntze
n, C. J., 米国特許第５，４８４，７１９号)。
特許第５，２０２，４２２号)、ペプチドホルモン(Vandekerckhove, J. S., 米
国特許第５，４８７，９９１号)、血液因子などの製造および送達において、そ
の使用が意図されている。選択された治療薬を生産するように操作された食用植
物は、コスト効率がよい上に田園地帯または発展途上国での治療薬の投与に特に
適した薬剤送達手段となり得るであろうと仮定されている。治療薬を含有する植
物素材は、栽培して食餌に配合することが可能であろう(Lam, D. M. and Arntze
n, C. J., 米国特許第５，４８４，７１９号)。
【０００９】 全体として、作物に関して意図される新規なインプットおよびアウトプット形
質はきわめて広範囲であり、多くの新製品および新製法の開発につながる。従っ
て、新規な形質を有する植物を作出する確かな方法、および最初のトランスジェ
ニック植物を育種および品種改良プログラムに組み込む方法は、これらの製品を
商業化するための重要な手段である。
質はきわめて広範囲であり、多くの新製品および新製法の開発につながる。従っ
て、新規な形質を有する植物を作出する確かな方法、および最初のトランスジェ
ニック植物を育種および品種改良プログラムに組み込む方法は、これらの製品を
商業化するための重要な手段である。
【００１０】 トランスジェニック植物作出の問題は、植物細胞内でのトランスジェニックの
結果の回収にあり、続く育種計画で用いる、形態学的に正常で稔性のある植物を
再生するにはかなりの努力が必要である。従って、導入遺伝子を受け取った植物
を簡単に同定できる方法が商業化に向けての主たる目的となる。
結果の回収にあり、続く育種計画で用いる、形態学的に正常で稔性のある植物を
再生するにはかなりの努力が必要である。従って、導入遺伝子を受け取った植物
を簡単に同定できる方法が商業化に向けての主たる目的となる。
【００１１】 トランスジェニック植物を、生化学的アッセイまたは比色アッセイを必要とし
ない信頼できる方法によって選択または同定することが特に便利である。トラン
スジェニック種の発達におけるどのポイントでも使用可能な計画など、柔軟性を
考慮した方法はさらに価値がある。最も好ましい方法は、圃場レベルでの同定お
よび識別はもちろん、培養中の選択、育種中の同定および遺伝子移入活性を考慮
したものである。
ない信頼できる方法によって選択または同定することが特に便利である。トラン
スジェニック種の発達におけるどのポイントでも使用可能な計画など、柔軟性を
考慮した方法はさらに価値がある。最も好ましい方法は、圃場レベルでの同定お
よび識別はもちろん、培養中の選択、育種中の同定および遺伝子移入活性を考慮
したものである。
【００１２】トランスジェニック植物の圃場解放に関する問題 遺伝子を改変した作物は、自然選抜によってまたは有性組換えを通じて通常に
は達し得ない遺伝的可能性を発現するので、環境を損なう可能性があると示唆さ
れてきた。さらに、解放されたトランスジェニック植物は、その植物自体の拡散
または野生近縁種との雑種形成により自然の生態系を侵害する可能性があると示
唆されている。これらの論点は包括的に議論され、トランスジェニック植物が生
存し続けるかどうか、および作物種から野生近縁種へ形質が伝播するかどうかを
試験する実験が始められている（例えば、University of California, Risk ass
essment in agricultural biology： proceedings of an international confer
ence, 1990, Casper, R., & Landsman, J., 1992：The bio-safety results of
field tests of genetically modified plants and microorganisms. Proceedin
gs of the 2nd International Symposium on The Biosafety Results of Field
Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms, 1992, Goslar, G
ermany, Dale, P. et al. 1992; The field release of transgenic plants, Th
e British Crop Protection Council. Brighton Crop Protection Conference:
Pests and Diseases, Vols. I, II and III; Proceedings of the 3nd Internat
ional Symposium on The Biosafety Results of Field Tests of Genetically M
odified Plants and Microorganisms, 1994, Monterey, California, Jones, D
.D., 1994）。
は達し得ない遺伝的可能性を発現するので、環境を損なう可能性があると示唆さ
れてきた。さらに、解放されたトランスジェニック植物は、その植物自体の拡散
または野生近縁種との雑種形成により自然の生態系を侵害する可能性があると示
唆されている。これらの論点は包括的に議論され、トランスジェニック植物が生
存し続けるかどうか、および作物種から野生近縁種へ形質が伝播するかどうかを
試験する実験が始められている（例えば、University of California, Risk ass
essment in agricultural biology： proceedings of an international confer
ence, 1990, Casper, R., & Landsman, J., 1992：The bio-safety results of
field tests of genetically modified plants and microorganisms. Proceedin
gs of the 2nd International Symposium on The Biosafety Results of Field
Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms, 1992, Goslar, G
ermany, Dale, P. et al. 1992; The field release of transgenic plants, Th
e British Crop Protection Council. Brighton Crop Protection Conference:
Pests and Diseases, Vols. I, II and III; Proceedings of the 3nd Internat
ional Symposium on The Biosafety Results of Field Tests of Genetically M
odified Plants and Microorganisms, 1994, Monterey, California, Jones, D
.D., 1994）。
【００１３】 これまでの研究および実験結果の一致は、導入遺伝子が野生近縁種へ拡散する
可能性の程度は、種および環境条件に大いに依存するとの見解を支持している。
近縁種との交雑はある種には起こりにくく、別の種には起こりやすい（Raybould
& Grey, J., Applied Ecology 30: 199-219, 1993)。形質転換植物が他の生育
地をどの程度侵害するのか、またその環境リスクはどの程度であるのかも植物種
自身によって異なる。多くの作物が高度に分化し、非競合的栽培習慣に適合して
いるので、これらが一般に重大な環境リスクであるとは考えられない(Dale et a
l., Plant Breeding lll: 1-22, 1993; Fishlock, D., The PROSAMO Report, p
ublished by the Laboratory of the Government Chemist, Queens Road, Teddi
ngton, Middlesex, UK TWll OLY) 。
可能性の程度は、種および環境条件に大いに依存するとの見解を支持している。
近縁種との交雑はある種には起こりにくく、別の種には起こりやすい（Raybould
& Grey, J., Applied Ecology 30: 199-219, 1993)。形質転換植物が他の生育
地をどの程度侵害するのか、またその環境リスクはどの程度であるのかも植物種
自身によって異なる。多くの作物が高度に分化し、非競合的栽培習慣に適合して
いるので、これらが一般に重大な環境リスクであるとは考えられない(Dale et a
l., Plant Breeding lll: 1-22, 1993; Fishlock, D., The PROSAMO Report, p
ublished by the Laboratory of the Government Chemist, Queens Road, Teddi
ngton, Middlesex, UK TWll OLY) 。
【００１４】 しかし、現状、農業生産に影響を及ぼしている雑草種の多くがしばしば観賞、
料理または医療上の理由で別の環境から一度に導入されたものであるため、ある
作物、観賞植物または天然の薬理目的に栽培された植物は、雑草性の有害生物と
なり得るリスクがおそらくあるであろうとの合意が一般になされている(Keeler,
K. H., Biotechnology 7: 1134-1139, 1989)。
料理または医療上の理由で別の環境から一度に導入されたものであるため、ある
作物、観賞植物または天然の薬理目的に栽培された植物は、雑草性の有害生物と
なり得るリスクがおそらくあるであろうとの合意が一般になされている(Keeler,
K. H., Biotechnology 7: 1134-1139, 1989)。
【００１５】 トランスジェニック植物の環境への潜在的な影響を完全に理解するには何年も
の研究が必要であるが、近々の可能性のあるさらに重大な問題は、トランスジェ
ニック植物由来の新規な形質を有する農産物の汚染に関するものである。キセニ
ア作用（種子の組成に対する交雑花粉の直接的な影響）と、圃場に残留する自生
植物または種子の双方が二次農産物を汚染する可能性がある。このようなことは
過去には主要な問題ではなかったが、一般消費向けの作物が、他の目的で開発さ
れた視覚によって区別できない品種、例えば医薬上有効なタンパク質を含有する
作物によって偶然汚染されることが特に関心のある論点となってきている。従っ
て、簡単かつ確かな方法でトランスジェニック作物を識別できることは価値があ
る。
の研究が必要であるが、近々の可能性のあるさらに重大な問題は、トランスジェ
ニック植物由来の新規な形質を有する農産物の汚染に関するものである。キセニ
ア作用（種子の組成に対する交雑花粉の直接的な影響）と、圃場に残留する自生
植物または種子の双方が二次農産物を汚染する可能性がある。このようなことは
過去には主要な問題ではなかったが、一般消費向けの作物が、他の目的で開発さ
れた視覚によって区別できない品種、例えば医薬上有効なタンパク質を含有する
作物によって偶然汚染されることが特に関心のある論点となってきている。従っ
て、簡単かつ確かな方法でトランスジェニック作物を識別できることは価値があ
る。
【００１６】 これまでには、花粉のトラップとして機能する境界の畝を併用する物理的隔離
が、研究開発中のトランスジェニック形質を有する植物を含めて用いられている
（例えば、Agriculture and Agri-Food Canada, Regulatory Directive 94-08;
Assessment Criteria for Determining Environmental Safety of Plants with
Novel Traits, Regulatory Directive 94-09: The Biology of Brassica napus
L. (Canola/Rapeseed), Regulatory Directive 95-01; Field Testing Plants
with Novel Traits in Canada)。しかし、トランスジェニック植物の商業生産の
増加につれて、商品内の汚染の可能性が飛躍的に上昇した。この汚染可能性はナ
タネ産業にとって主要な関心事となっており、種々の組換え遺伝子型が多数、市
場へ達しているため、他の主要作物（例えばトウモロコシ）に関しても重大な論
点となる。
が、研究開発中のトランスジェニック形質を有する植物を含めて用いられている
（例えば、Agriculture and Agri-Food Canada, Regulatory Directive 94-08;
Assessment Criteria for Determining Environmental Safety of Plants with
Novel Traits, Regulatory Directive 94-09: The Biology of Brassica napus
L. (Canola/Rapeseed), Regulatory Directive 95-01; Field Testing Plants
with Novel Traits in Canada)。しかし、トランスジェニック植物の商業生産の
増加につれて、商品内の汚染の可能性が飛躍的に上昇した。この汚染可能性はナ
タネ産業にとって主要な関心事となっており、種々の組換え遺伝子型が多数、市
場へ達しているため、他の主要作物（例えばトウモロコシ）に関しても重大な論
点となる。
【００１７】 品質および特性に影響する、別の栽培品種に由来する形質を有する商業作物生
産物の汚染は重大な問題となる可能性がある。しかし、食品汚染が起こり得るた
めに商業上または医薬上価値のある異種タンパク質の生産伝達体としてのアブラ
ナ（または他の作物）の使用がさらに重大な問題となる可能性がある。上記に述
べた生産標準を実行すれば個々のトランスジェニック系統の同一性は保たれ、意
図しない汚染は少なくなるが、他の栽培品種への遺伝子の流出が結果として起こ
る可能性がある。形態の違いまたは容易に同定できる形質（除草剤耐性など）を
付与しない遺伝子の出現および拡散に関する問題は未だ解決されていない。
産物の汚染は重大な問題となる可能性がある。しかし、食品汚染が起こり得るた
めに商業上または医薬上価値のある異種タンパク質の生産伝達体としてのアブラ
ナ（または他の作物）の使用がさらに重大な問題となる可能性がある。上記に述
べた生産標準を実行すれば個々のトランスジェニック系統の同一性は保たれ、意
図しない汚染は少なくなるが、他の栽培品種への遺伝子の流出が結果として起こ
る可能性がある。形態の違いまたは容易に同定できる形質（除草剤耐性など）を
付与しない遺伝子の出現および拡散に関する問題は未だ解決されていない。
【００１８】 多くの技術が遺伝子を植物に導入するため用いられているが、先行技術では遺
伝子構築物はトランスジェニック植物培養細胞の同定および選択、または導入遺
伝子の持続性あるいは拡散の可能性の制御に有効な特徴を含んでいない。従って
、非トランスジェニック植物からトランスジェニック植物を区別する、または違
った形質を有するトランスジェニック植物の中から識別することのできるメカニ
ズムの範囲内で取り扱える遺伝子構築物がこの汚染問題を解決するであろう。非
トランスジェニック植物には全く影響を及ぼさないが、特異的な導入遺伝子を含
有する植物が確認された場合に排除できるようメカニズムも１つの解決法となる
であろう。さらに、特異的な導入遺伝子を含有する作物を、これらの導入遺伝子
を持たない他の商用作物から選択的に取り除くメカニズムもまた価値があるであ
ろう。
伝子構築物はトランスジェニック植物培養細胞の同定および選択、または導入遺
伝子の持続性あるいは拡散の可能性の制御に有効な特徴を含んでいない。従って
、非トランスジェニック植物からトランスジェニック植物を区別する、または違
った形質を有するトランスジェニック植物の中から識別することのできるメカニ
ズムの範囲内で取り扱える遺伝子構築物がこの汚染問題を解決するであろう。非
トランスジェニック植物には全く影響を及ぼさないが、特異的な導入遺伝子を含
有する植物が確認された場合に排除できるようメカニズムも１つの解決法となる
であろう。さらに、特異的な導入遺伝子を含有する作物を、これらの導入遺伝子
を持たない他の商用作物から選択的に取り除くメカニズムもまた価値があるであ
ろう。
【００１９】植物の形質転換法 一般に、ＤＮＡを植物細胞に導入する二つの方法が現在広く用いられている。
一番目の方法はアグロバクテリウム(Agrobacterium)、または同様の土壌細菌を
ＤＮＡを導入するのに用いることである。標的植物組織または細胞を、プラスミ
ドＤＮＡを植物細胞に注入する好適なアグロバクテリウム株とともに培養する(S
chilperoot, R. A. et al., 米国特許第４，９４０，８３８号; Schilperoot, R
. A. and Hoekema, A., 米国特許第５，４６４，７６３号)。その後、個々の形
質転換植物細胞を完全な植物体へと再分化させる。
一番目の方法はアグロバクテリウム(Agrobacterium)、または同様の土壌細菌を
ＤＮＡを導入するのに用いることである。標的植物組織または細胞を、プラスミ
ドＤＮＡを植物細胞に注入する好適なアグロバクテリウム株とともに培養する(S
chilperoot, R. A. et al., 米国特許第４，９４０，８３８号; Schilperoot, R
. A. and Hoekema, A., 米国特許第５，４６４，７６３号)。その後、個々の形
質転換植物細胞を完全な植物体へと再分化させる。
【００２０】 アグロバクテリウムの形質転換系は歴史的には、根こぶ病の病原体である天然
の微生物ベクターの使用に基づく。根こぶ病は植物の形質転換の自然形態の結果
を表す。天然に存在するアグロバクテリアの腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドは：植
物細胞へＤＮＡを転移するのに必要なＤＮＡ配列；宿主植物ＤＮＡに外来ＤＮＡ
を組み込むのに必要なＤＮＡ配列（ボーダーフラグメントと呼ばれる）；および
感染部位でクラウンゴール形成を引き起こす植物生長調節物質を生成する遺伝子
（腫瘍遺伝子と呼ばれる）を含んでなる。Ｔｉプラスミドはまた典型的には、ア
グロバクテリアには代謝できるが植物細胞には代謝されないある種の特異なアミ
ノ酸（オピン類）を形成する遺伝子をコードする。天然の系では、受容体である
植物宿主（Ｔ−ＤＮＡ）へ導入されるＴｉプラスミドの一部は通常これらの遺伝
子およびＤＮＡ配列の総てを含有する。
の微生物ベクターの使用に基づく。根こぶ病は植物の形質転換の自然形態の結果
を表す。天然に存在するアグロバクテリアの腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドは：植
物細胞へＤＮＡを転移するのに必要なＤＮＡ配列；宿主植物ＤＮＡに外来ＤＮＡ
を組み込むのに必要なＤＮＡ配列（ボーダーフラグメントと呼ばれる）；および
感染部位でクラウンゴール形成を引き起こす植物生長調節物質を生成する遺伝子
（腫瘍遺伝子と呼ばれる）を含んでなる。Ｔｉプラスミドはまた典型的には、ア
グロバクテリアには代謝できるが植物細胞には代謝されないある種の特異なアミ
ノ酸（オピン類）を形成する遺伝子をコードする。天然の系では、受容体である
植物宿主（Ｔ−ＤＮＡ）へ導入されるＴｉプラスミドの一部は通常これらの遺伝
子およびＤＮＡ配列の総てを含有する。
【００２１】 腫瘍誘導アグロバクテリウム株の腫瘍遺伝子は包括的に研究されてきた。一般
に、アグロバクテリアプラスミドには二種類の腫瘍遺伝子がある。ｔｍｒ腫瘍遺
伝子とｔｍｓ腫瘍遺伝子である。ｔｍｒ腫瘍遺伝子（ｉｐｔ遺伝子としても知ら
れている）は、好適な宿主内でシュート形成を誘導する植物ホルモンサイトカイ
ニンであるイソペンチルアデノシン５’−モノホスフェートを合成する酵素をコ
ードする。ｔｍｓと呼ばれる腫瘍細胞（ｔｍｓ腫瘍細胞１およびｔｍｓ腫瘍細胞
２を含む）は好適な宿主内でオーキシンの過剰生産を担う酵素をコードし、根の
形成を導く。これらが合わされると、ｔｍｓ遺伝子およびｔｍｒ遺伝子は通常、
好適な宿主でクラウンゴールの形成を導く。
に、アグロバクテリアプラスミドには二種類の腫瘍遺伝子がある。ｔｍｒ腫瘍遺
伝子とｔｍｓ腫瘍遺伝子である。ｔｍｒ腫瘍遺伝子（ｉｐｔ遺伝子としても知ら
れている）は、好適な宿主内でシュート形成を誘導する植物ホルモンサイトカイ
ニンであるイソペンチルアデノシン５’−モノホスフェートを合成する酵素をコ
ードする。ｔｍｓと呼ばれる腫瘍細胞（ｔｍｓ腫瘍細胞１およびｔｍｓ腫瘍細胞
２を含む）は好適な宿主内でオーキシンの過剰生産を担う酵素をコードし、根の
形成を導く。これらが合わされると、ｔｍｓ遺伝子およびｔｍｒ遺伝子は通常、
好適な宿主でクラウンゴールの形成を導く。
【００２２】 Ｔｉ腫瘍遺伝子を含有する植物体は表現型上異常であり、生長ホルモンの不均
衡のためクラウンゴール腫瘍または巻いたりよじれたりする葉を持つ。これらの
異常な植物体は商業用途に適さない。これらの植物体は形質転換後容易に同定で
きるが、形態学的に正常な植物とはならない。従って、アグロバクテリウムＴｉ
プラスミドは様々に改変されており、典型的には腫瘍遺伝子の除去によってＤＮ
Ａを植物細胞へ手段となっている。一般に、これまで用いられてきたアグロバク
テリウム形質転換法は、サイトカイニンおよびオーキシンを形成する遺伝子、お
よびオピン合成遺伝子が除去されたＴｉプラスミドが用いられてきた。かかるプ
ラスミドは一般に「無力化した」（disarmed）と言われる。従って、「無力化さ
れない」（armed）Ｔｉプラスミドは一般に腫瘍遺伝子を含有するとみなされる
。
衡のためクラウンゴール腫瘍または巻いたりよじれたりする葉を持つ。これらの
異常な植物体は商業用途に適さない。これらの植物体は形質転換後容易に同定で
きるが、形態学的に正常な植物とはならない。従って、アグロバクテリウムＴｉ
プラスミドは様々に改変されており、典型的には腫瘍遺伝子の除去によってＤＮ
Ａを植物細胞へ手段となっている。一般に、これまで用いられてきたアグロバク
テリウム形質転換法は、サイトカイニンおよびオーキシンを形成する遺伝子、お
よびオピン合成遺伝子が除去されたＴｉプラスミドが用いられてきた。かかるプ
ラスミドは一般に「無力化した」（disarmed）と言われる。従って、「無力化さ
れない」（armed）Ｔｉプラスミドは一般に腫瘍遺伝子を含有するとみなされる
。
【００２３】 植物の形質転換で用いられるＴｉプラスミドは、１以上のボーダーフラグメン
トとの間にまたは隣接して外来遺伝子を便宜に導入するための制限部位、および
抗生物質耐性遺伝子またはβグルクロニダーゼシンターゼ（ＧＵＳ）遺伝子など
の形質転換細胞の同定および選択のための遺伝子を含むようにさらに操作されて
いる。しばしば複製遺伝子をＴｉプラスミドに導入して非アグロバクテリア宿主
内でこのプラスミドを複製させる。ＤＮＡの代謝に必要なｖｉｒ（有毒）遺伝子
および細菌細胞由来のプラスミドの導入は、しばしば個々のプラスミド上または
導入されるＤＮＡを含有するものとは異なるＴｉプラスミドの位置に保持され、
それ自体は受容植物細胞へ導入されない。
トとの間にまたは隣接して外来遺伝子を便宜に導入するための制限部位、および
抗生物質耐性遺伝子またはβグルクロニダーゼシンターゼ（ＧＵＳ）遺伝子など
の形質転換細胞の同定および選択のための遺伝子を含むようにさらに操作されて
いる。しばしば複製遺伝子をＴｉプラスミドに導入して非アグロバクテリア宿主
内でこのプラスミドを複製させる。ＤＮＡの代謝に必要なｖｉｒ（有毒）遺伝子
および細菌細胞由来のプラスミドの導入は、しばしば個々のプラスミド上または
導入されるＤＮＡを含有するものとは異なるＴｉプラスミドの位置に保持され、
それ自体は受容植物細胞へ導入されない。
【００２４】 形質転換植物の生成に用いる２番目に広がっている技術には、ターゲッティン
グされたマイクロプロジェクティル（microprojectil）の使用を伴う。これらの
方法はアグロバクテリウム法に従わない単子葉植物および双子葉植物の双方を形
質転換するのに用いられている。種々の違ったマイクロプロジェクティルおよび
衝撃法が、例えば、Sanford, et al., 米国特許第４，９４５，０５０号; McCab
e, et al., 米国特許第５，１４９，６５５号; Fitzpatrick-McElligott et al.
, 米国特許第５，４６６，５８７号; およびCoffee et al., 米国特許第５，３
０２，５２３号, 同第５，４６４，７６５号に記載されている。ターゲッティン
グされたマイクロプロジェクティルを用いて導入されたＤＮＡは、アグロバクテ
リウム系によって導入されたものと同等の、植物細胞での発現のために機能的な
特徴を含んでなる。例えば、しばしば用いられるベクターは、外来遺伝子挿入の
ために操作された部位と形質転換体の同定または選択に必要な遺伝子を含んでな
る。
グされたマイクロプロジェクティル（microprojectil）の使用を伴う。これらの
方法はアグロバクテリウム法に従わない単子葉植物および双子葉植物の双方を形
質転換するのに用いられている。種々の違ったマイクロプロジェクティルおよび
衝撃法が、例えば、Sanford, et al., 米国特許第４，９４５，０５０号; McCab
e, et al., 米国特許第５，１４９，６５５号; Fitzpatrick-McElligott et al.
, 米国特許第５，４６６，５８７号; およびCoffee et al., 米国特許第５，３
０２，５２３号, 同第５，４６４，７６５号に記載されている。ターゲッティン
グされたマイクロプロジェクティルを用いて導入されたＤＮＡは、アグロバクテ
リウム系によって導入されたものと同等の、植物細胞での発現のために機能的な
特徴を含んでなる。例えば、しばしば用いられるベクターは、外来遺伝子挿入の
ために操作された部位と形質転換体の同定または選択に必要な遺伝子を含んでな
る。
【００２５】 形質転換植物を得るために用いられてきた別の方法としては：細胞核への直接
マイクロインジェクション(Crossway et al., 米国特許第４，７４３，５４８号
)；およびプロトプラストによるＤＮＡの直接取り込み(Paszkowski et al., 米
国特許第５，２３１，０１９号,同第５，４５３，３６７号)が挙げられる。
マイクロインジェクション(Crossway et al., 米国特許第４，７４３，５４８号
)；およびプロトプラストによるＤＮＡの直接取り込み(Paszkowski et al., 米
国特許第５，２３１，０１９号,同第５，４５３，３６７号)が挙げられる。
【００２６】 植物形質転換の一般的なアプローチは十分理解されているが、植物形質転換プ
ロセスの実際の適用は形質転換や培養条件に対する植物細胞の遺伝子型的応答に
より制限されている場合が多い。種内の１、２の狭い遺伝子型でしか形質転換に
従わないというのも珍しいことではない。従って、作物種内のあらゆる遺伝子型
を効率的に形質転換することは簡単ではないが、あるいはいくつかの場合では可
能でもある。培養および形質転換プロトコールを変更する多くの試みがあるにも
かかわらず、いくつかの植物の遺伝子型はその他の遺伝子型内で有効な技術によ
る形質転換には従わない。このように多くの場合では、まず形質転換に従う特異
な遺伝子型を用い、次ぎにそのトランスジェニック結果を同じ形質転換法には従
わない生殖質と交雑、すなわち「遺伝子移入」する。この方法は過度の努力なく
しては形質転換できない系統へ導入遺伝子を結果的に導入することを考慮し得る
ものであるが、これらのプロセスは有性交雑ごとに導入遺伝子を選択しなければ
ならないので時間と努力を要する。
ロセスの実際の適用は形質転換や培養条件に対する植物細胞の遺伝子型的応答に
より制限されている場合が多い。種内の１、２の狭い遺伝子型でしか形質転換に
従わないというのも珍しいことではない。従って、作物種内のあらゆる遺伝子型
を効率的に形質転換することは簡単ではないが、あるいはいくつかの場合では可
能でもある。培養および形質転換プロトコールを変更する多くの試みがあるにも
かかわらず、いくつかの植物の遺伝子型はその他の遺伝子型内で有効な技術によ
る形質転換には従わない。このように多くの場合では、まず形質転換に従う特異
な遺伝子型を用い、次ぎにそのトランスジェニック結果を同じ形質転換法には従
わない生殖質と交雑、すなわち「遺伝子移入」する。この方法は過度の努力なく
しては形質転換できない系統へ導入遺伝子を結果的に導入することを考慮し得る
ものであるが、これらのプロセスは有性交雑ごとに導入遺伝子を選択しなければ
ならないので時間と努力を要する。
【００２７】 このように、導入遺伝子が形質転換または遺伝子移入のいずれかによって導入
された植物の迅速な識別を可能とする方法はトランスジェニック植物の作出を大
いに助けるであろう。特に非破壊的な視覚アッセイは多数の育種系統および分離
集団の迅速なスクリーニングを可能にするであろう。このスクリーニング法を実
生段階で、あるいは種子の発達段階（例えば、胚救出）にも適用すれば、初期段
階で系統選抜が可能となり、従って植物を成熟期まで生育させる必要がなくなり
、それによって時間や圃場資源が節約されるので商業品種の作出プログラムでの
有用性が見出せるであろう。またかかる方法を用いて、栽培からかなりの数の陰
性系統を除き、簡略化された育種・遺伝子移入プログラムが可能となる。特にか
かる方法は、高付加価値アウトプット形質をはじめインプットまたはアウトプッ
ト形質に関する導入遺伝子を有するアブラナ属植物の作出に有用であると考えら
れる。
された植物の迅速な識別を可能とする方法はトランスジェニック植物の作出を大
いに助けるであろう。特に非破壊的な視覚アッセイは多数の育種系統および分離
集団の迅速なスクリーニングを可能にするであろう。このスクリーニング法を実
生段階で、あるいは種子の発達段階（例えば、胚救出）にも適用すれば、初期段
階で系統選抜が可能となり、従って植物を成熟期まで生育させる必要がなくなり
、それによって時間や圃場資源が節約されるので商業品種の作出プログラムでの
有用性が見出せるであろう。またかかる方法を用いて、栽培からかなりの数の陰
性系統を除き、簡略化された育種・遺伝子移入プログラムが可能となる。特にか
かる方法は、高付加価値アウトプット形質をはじめインプットまたはアウトプッ
ト形質に関する導入遺伝子を有するアブラナ属植物の作出に有用であると考えら
れる。
【００２８】アブラナ属の形質転換 アグロバクテリウムまたはその他の方法によるアブラナ科(Crusiferae)に属す
るものの形質転換が報告されている。しかしながら、特にアブラナ属の形質転換
に関する多くの報告ではアグロバクテリウムに媒介される形質転換によって形質
転換されたアブラナ種を一貫して得ることは困難であると詳述されている。これ
らの報告の多くは１つまたは２つの特定品種で成功を示しているが、アブラナ属
内の総ての種に一般的に適用できる詳細な方法の教示はない。培養条件には多く
の操作を用いることができるが、いくつかの品種ではこれまで報告されている方
法によって形質転換するのが極めて難しいことが分かっている。従って交雑や遺
伝子導入によってこれらの遺伝子型に導入遺伝子を導入するにはかなりの努力が
展開される。これらの遺伝子型に由来するトランスジェニック植物の信頼できる
作出を考えた、またはこれらの形質を導入するより有効な手段を考えた改良およ
び開発は当技術分野にわたって極めて重要であると考えられる。
るものの形質転換が報告されている。しかしながら、特にアブラナ属の形質転換
に関する多くの報告ではアグロバクテリウムに媒介される形質転換によって形質
転換されたアブラナ種を一貫して得ることは困難であると詳述されている。これ
らの報告の多くは１つまたは２つの特定品種で成功を示しているが、アブラナ属
内の総ての種に一般的に適用できる詳細な方法の教示はない。培養条件には多く
の操作を用いることができるが、いくつかの品種ではこれまで報告されている方
法によって形質転換するのが極めて難しいことが分かっている。従って交雑や遺
伝子導入によってこれらの遺伝子型に導入遺伝子を導入するにはかなりの努力が
展開される。これらの遺伝子型に由来するトランスジェニック植物の信頼できる
作出を考えた、またはこれらの形質を導入するより有効な手段を考えた改良およ
び開発は当技術分野にわたって極めて重要であると考えられる。
【００２９】 初期のアブラナ属の形質転換研究の多くは単一の遺伝子型ナタネ品種Westerを
用いて行われたものである(Radke et al., Theor. Appl. Genet. 75:685-694, 1
988; Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238-242, 1989; Moloney et al.,
1989, 米国特許第５，１８８，９５８号; Moloney et al., 1989, 米国特許第
５，４６３，１７４号)。Westerは上記に挙げた参照文献に記載された組織培養
および形質転換プロトコールに応答してトランスジェニック植物の再生を可能と
したので便宜な選択であった。Westerは形質転換実験の遺伝子型の選抜を残すが
、その変種の農業特性は最近の栽培品種と比較して劣っているものと考えられる
。ゆえに信頼性のある形質転換技術とナタネ(Brassuca napus)の商業的遺伝子型
の間には依然としてギャップがある。
用いて行われたものである(Radke et al., Theor. Appl. Genet. 75:685-694, 1
988; Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238-242, 1989; Moloney et al.,
1989, 米国特許第５，１８８，９５８号; Moloney et al., 1989, 米国特許第
５，４６３，１７４号)。Westerは上記に挙げた参照文献に記載された組織培養
および形質転換プロトコールに応答してトランスジェニック植物の再生を可能と
したので便宜な選択であった。Westerは形質転換実験の遺伝子型の選抜を残すが
、その変種の農業特性は最近の栽培品種と比較して劣っているものと考えられる
。ゆえに信頼性のある形質転換技術とナタネ(Brassuca napus)の商業的遺伝子型
の間には依然としてギャップがある。
【００３０】 さらに記載の方法またはその変法を用いて行われたアブラナ属の形質転換研究
の多くは極めて多様かつ形質転換プロトコールに対する特定の植物材料の生来の
応答に依存的な結果をもたらした。一例として、ナタネで達成された形質転換頻
度は多様であって極めて低い場合がある(Fry et al., Plant Cell Reports 6:32
1-325; Mehra-Palta et al., In Proc 8th Int. Rapeseed Congress, Saskatoon
, Saskatchewan, 1991; Swanson and Erickson, Theor. Appl. Genet. 78:831-8
35, 1989)。多様でしばしば低い形質転換頻度はハボタン(B. oleracea)などの他
のアブラナ種でも観察されている(Christie and Earle, In Proc 5th Crucifer
Genetics Workshop, Davis, pp 46-47, 1989; Metz et al., Plant Cell Report
s 15: 287-292, 1995; Eimert and Siegemund, Plant Molec. Biol. 19:485-490
, 1992; Deblock et al., Plant Physiol. 91694-701, 1989; Berthomieu and J
ouanin, Plant Cell Reports 11:334-338; Toriyama et al, Theor. Appl. Gene
t. 81:769-776, 1991)、アブラナ(B. rapa)(Radke et al., Plant Cell Reports
11:499-505, 1992; Mukhopadhyay et al., Plent Cell Reports 11:506-513, 1
992)；セイヨウカラシナ(B.juncea)(Barfield and Pua, Plant Cell Reports 10
:308-314, 1991; Deepak et al., Plant Cell Reports 12:462-467, 1993; Pua
and Lee, Planta 196:69-76, 1995)、クロガラシ(B. nigra)(Gupta et al., Pla
nt Cell Reports 12:418-421, 1993),、およびアビシアガラシ(B. carinata)(Na
rasimhulu et al., Plant Cell Reports 11:359-362, 1992; Babic, M.Sc. Thes
is, Univ of Saskatchewan, 1994)。
の多くは極めて多様かつ形質転換プロトコールに対する特定の植物材料の生来の
応答に依存的な結果をもたらした。一例として、ナタネで達成された形質転換頻
度は多様であって極めて低い場合がある(Fry et al., Plant Cell Reports 6:32
1-325; Mehra-Palta et al., In Proc 8th Int. Rapeseed Congress, Saskatoon
, Saskatchewan, 1991; Swanson and Erickson, Theor. Appl. Genet. 78:831-8
35, 1989)。多様でしばしば低い形質転換頻度はハボタン(B. oleracea)などの他
のアブラナ種でも観察されている(Christie and Earle, In Proc 5th Crucifer
Genetics Workshop, Davis, pp 46-47, 1989; Metz et al., Plant Cell Report
s 15: 287-292, 1995; Eimert and Siegemund, Plant Molec. Biol. 19:485-490
, 1992; Deblock et al., Plant Physiol. 91694-701, 1989; Berthomieu and J
ouanin, Plant Cell Reports 11:334-338; Toriyama et al, Theor. Appl. Gene
t. 81:769-776, 1991)、アブラナ(B. rapa)(Radke et al., Plant Cell Reports
11:499-505, 1992; Mukhopadhyay et al., Plent Cell Reports 11:506-513, 1
992)；セイヨウカラシナ(B.juncea)(Barfield and Pua, Plant Cell Reports 10
:308-314, 1991; Deepak et al., Plant Cell Reports 12:462-467, 1993; Pua
and Lee, Planta 196:69-76, 1995)、クロガラシ(B. nigra)(Gupta et al., Pla
nt Cell Reports 12:418-421, 1993),、およびアビシアガラシ(B. carinata)(Na
rasimhulu et al., Plant Cell Reports 11:359-362, 1992; Babic, M.Sc. Thes
is, Univ of Saskatchewan, 1994)。
【００３１】 多くのアブラナ種、品種および栽培品種は根本的に異なる形態および生理学的
特徴を有する極めて多様な群をなす。商業的に重要な多くのアブラナ種はこれま
でに記載されている方法には十分応答しないか、あるいは全く応答しない。特に
特異な脂肪酸組成を有するセイヨウアブラナ（ナタネ）種は従来の形質転換の試
みに従わないようである。米国特許第５，９６５，７５５号に記載のようにＡＧ
０１９として類型化される１つの遺伝子型は高オレイン酸、低リノール酸遺伝子
型であり、これは例えばMoloney（上記）によって記載された従来の形質転換法
に応答しない。ＡＧ０１９種およびそれから派生した変種は酸化安定性と栄養価
が改良された油をもたらす有用な脂肪酸を含む。導入遺伝子を導入する手段とし
ての従来の油組成のセイヨウアブラナ、例えば形質転換Westarとの交配では、油
組成に欠損が生じ、かつ所望の油組成を再構築する著しい育種努力が必要となる
。ほとんどの場合では、これが得られるという保証はない。従って、不応答性の
油組成が改変されたアブラナ属、特にセイヨウアブラナ（ナタネ）種の形質転換
、さらに特にはアブラナ種ＡＧ０１９およびそれらに由来する後代の形質転換に
有用な形質転換法が必要とされる。
特徴を有する極めて多様な群をなす。商業的に重要な多くのアブラナ種はこれま
でに記載されている方法には十分応答しないか、あるいは全く応答しない。特に
特異な脂肪酸組成を有するセイヨウアブラナ（ナタネ）種は従来の形質転換の試
みに従わないようである。米国特許第５，９６５，７５５号に記載のようにＡＧ
０１９として類型化される１つの遺伝子型は高オレイン酸、低リノール酸遺伝子
型であり、これは例えばMoloney（上記）によって記載された従来の形質転換法
に応答しない。ＡＧ０１９種およびそれから派生した変種は酸化安定性と栄養価
が改良された油をもたらす有用な脂肪酸を含む。導入遺伝子を導入する手段とし
ての従来の油組成のセイヨウアブラナ、例えば形質転換Westarとの交配では、油
組成に欠損が生じ、かつ所望の油組成を再構築する著しい育種努力が必要となる
。ほとんどの場合では、これが得られるという保証はない。従って、不応答性の
油組成が改変されたアブラナ属、特にセイヨウアブラナ（ナタネ）種の形質転換
、さらに特にはアブラナ種ＡＧ０１９およびそれらに由来する後代の形質転換に
有用な形質転換法が必要とされる。
【００３２】 従ってアブラナ属の不応答性の遺伝子型を形質転換する方法が有用である。さ
らに、形質転換した植物細胞ならびに植物体およびそれらに由来する後代を同定
する方法もまた、特にそれらの方法が簡単で本質的に非破壊性であって、注目さ
れる導入遺伝子を含む植物体または細胞の視覚による同定を可能とするならば有
用である。かかる方法がさらに圃場レベルでの識別を提供するならば広範囲の適
用が実行できる。
らに、形質転換した植物細胞ならびに植物体およびそれらに由来する後代を同定
する方法もまた、特にそれらの方法が簡単で本質的に非破壊性であって、注目さ
れる導入遺伝子を含む植物体または細胞の視覚による同定を可能とするならば有
用である。かかる方法がさらに圃場レベルでの識別を提供するならば広範囲の適
用が実行できる。
【００３３】 これらの必要性にある程度まで接近する方法が開発されている。β−グルクロ
ニダーゼまたはＧＵＳ遺伝子などの視覚的マーカー遺伝子が利用できるが、生化
学的または組織化学的アッセイを必要とする。適用された化学物質に応答する遺
伝子はいわゆる「条件的致死」遺伝子として類型化される。しかしながら、これ
らは典型的には致死表現型をもたらすので、育種プロセスにおいて導入遺伝子を
追跡するには有用でない。従って、本発明の目的は育種プログラム、ならびにそ
の他の商業的に重要な目的に有用な条件的致死遺伝子を提供することにある。
ニダーゼまたはＧＵＳ遺伝子などの視覚的マーカー遺伝子が利用できるが、生化
学的または組織化学的アッセイを必要とする。適用された化学物質に応答する遺
伝子はいわゆる「条件的致死」遺伝子として類型化される。しかしながら、これ
らは典型的には致死表現型をもたらすので、育種プロセスにおいて導入遺伝子を
追跡するには有用でない。従って、本発明の目的は育種プログラム、ならびにそ
の他の商業的に重要な目的に有用な条件的致死遺伝子を提供することにある。
【００３４】条件的致死遺伝子 条件的致死形質およびこれらの形質に影響を及ぼす遺伝子は公知である。条件
的致死遺伝子の多くはは致死表現型をもたらし、植物を枯死させる。しかしなが
ら、いくつかの条件的致死遺伝子は必ずしも細胞死をもたらさない様式で使用で
きる。かかる条件的致死遺伝子の例としては、アグロバクテリウム(Agrobacteri um )Ｔｉプラスミドｔｍｓ腫瘍遺伝子２がある。この腫瘍遺伝子はインドールア
セトアミド加水分解酵素（ＩＡＭＨ）をコードし、インドールアセトアミドシン
ターゼ（ＩＡＭＳ）をコードする腫瘍遺伝子とともにこの種の細菌に典型的なイ
ンドール酢酸（ＩＡＡ）合成経路の一部となっている。
的致死遺伝子の多くはは致死表現型をもたらし、植物を枯死させる。しかしなが
ら、いくつかの条件的致死遺伝子は必ずしも細胞死をもたらさない様式で使用で
きる。かかる条件的致死遺伝子の例としては、アグロバクテリウム(Agrobacteri um )Ｔｉプラスミドｔｍｓ腫瘍遺伝子２がある。この腫瘍遺伝子はインドールア
セトアミド加水分解酵素（ＩＡＭＨ）をコードし、インドールアセトアミドシン
ターゼ（ＩＡＭＳ）をコードする腫瘍遺伝子とともにこの種の細菌に典型的なイ
ンドール酢酸（ＩＡＡ）合成経路の一部となっている。
【００３５】 植物体によるインドール酢酸の形成はアグロバクテリウムものとは異なる経路
によって起こる。従って植物体においてＩＡＭＨ（腫瘍遺伝子２）が発現すると
、その酵素の基質であるインドールアセトアミドが植物細胞には存在しないので
インドール酢酸の形成は起こらない。しかしながらインドールアセトアミドをＩ
ＡＭＨ遺伝子を発現する植物体に適用すると急激なＩＡＡの蓄積が起こる。たと
えＩＡＡが天然に存在する植物生長調節物質オーキシンであっても、制御されな
い高レベルのＩＡＡはすぐさま細胞代謝を阻害して老化そして細胞死をもたらす
。この酵素ＩＡＭＨはナフタレンアセトアミドをはじめその他のインドールアミ
ド関連物質を加水分解して十分公知の植物合成生長調節物質ナフタレン酢酸（Ｎ
ＡＡ）の産生をもたらす。
によって起こる。従って植物体においてＩＡＭＨ（腫瘍遺伝子２）が発現すると
、その酵素の基質であるインドールアセトアミドが植物細胞には存在しないので
インドール酢酸の形成は起こらない。しかしながらインドールアセトアミドをＩ
ＡＭＨ遺伝子を発現する植物体に適用すると急激なＩＡＡの蓄積が起こる。たと
えＩＡＡが天然に存在する植物生長調節物質オーキシンであっても、制御されな
い高レベルのＩＡＡはすぐさま細胞代謝を阻害して老化そして細胞死をもたらす
。この酵素ＩＡＭＨはナフタレンアセトアミドをはじめその他のインドールアミ
ド関連物質を加水分解して十分公知の植物合成生長調節物質ナフタレン酢酸（Ｎ
ＡＡ）の産生をもたらす。
【００３６】 トウモロコシ植物体を間引くためのＩＡＭＨ腫瘍遺伝子などの条件的致死遺伝
子の使用は１９９４年１月に発行された米国特許第５，１８０，８７３号(Jorge
nsen)に記載されている。Jorgensenは条件的致死遺伝子を持たせるための植物の
形質転換を教示している。次ぎにこの植物を連鎖解析にかけ、致死遺伝子と、す
でに存在するかまたは従来の育種技術で導入されたかいすれかの標的遺伝子座と
の間の連鎖関係に関して選抜する。１９９５年６月に発行されたFabijanski et
alの米国特許第５，４２６，０４１号は、ＩＡＭＨをＩＡＭＨと併用してハイブ
リッド種子を生産する方法を教示している。この特許には非致死的手段において
腫瘍遺伝子２を使用する方法も形質転換中および形質転換後の選抜に関する方法
も教示されていない。この特許には形質転換された遺伝子材料を獲得した関連の
種を選択的に取り出すための腫瘍遺伝子２を用いる方法も教示されていない。
子の使用は１９９４年１月に発行された米国特許第５，１８０，８７３号(Jorge
nsen)に記載されている。Jorgensenは条件的致死遺伝子を持たせるための植物の
形質転換を教示している。次ぎにこの植物を連鎖解析にかけ、致死遺伝子と、す
でに存在するかまたは従来の育種技術で導入されたかいすれかの標的遺伝子座と
の間の連鎖関係に関して選抜する。１９９５年６月に発行されたFabijanski et
alの米国特許第５，４２６，０４１号は、ＩＡＭＨをＩＡＭＨと併用してハイブ
リッド種子を生産する方法を教示している。この特許には非致死的手段において
腫瘍遺伝子２を使用する方法も形質転換中および形質転換後の選抜に関する方法
も教示されていない。この特許には形質転換された遺伝子材料を獲得した関連の
種を選択的に取り出すための腫瘍遺伝子２を用いる方法も教示されていない。
【００３７】 従って新規な形質も含む遺伝子構築物内の条件的致死遺伝子は新規な形質の拡
散を制御する便宜な手段を提供する。しかしながら致死遺伝子は形質転換された
植物細胞、特にアブラナ細胞を同定または選抜するための非破壊的手段を提供す
るわけではないので、従来の条件的致死遺伝子はトランスジェニック植物および
それらに由来する後代を選抜、同定し、追跡することについての当該の問題を解
決するものではない。
散を制御する便宜な手段を提供する。しかしながら致死遺伝子は形質転換された
植物細胞、特にアブラナ細胞を同定または選抜するための非破壊的手段を提供す
るわけではないので、従来の条件的致死遺伝子はトランスジェニック植物および
それらに由来する後代を選抜、同定し、追跡することについての当該の問題を解
決するものではない。
【００３８】 従って本発明のもう１つの目的は、育種および商品化のプロセスで、ならびに
圃場条件下で導入遺伝子を追跡するためにこれまでに同定されている条件的致死
遺伝子を改変して用いることにある。
圃場条件下で導入遺伝子を追跡するためにこれまでに同定されている条件的致死
遺伝子を改変して用いることにある。
【００３９】
本発明は視覚的かつ非破壊的に同定可能なトランスジェニック植物の作出のた
めの方法および遺伝子構築物を提供する。本発明はさらに発現した遺伝子構築物
の存在下で植物に有害な物質に変換される良性の化学物質の適用によって増殖し
ている部位から安全かつ特異的に取り出され得るトランスジェニック植物を提供
する。本発明の方法、遺伝子構築物および植物体は特にインプットもしくいはア
ウトプット形質、またはタンパク質の異種生産に関する適用に好適である。
めの方法および遺伝子構築物を提供する。本発明はさらに発現した遺伝子構築物
の存在下で植物に有害な物質に変換される良性の化学物質の適用によって増殖し
ている部位から安全かつ特異的に取り出され得るトランスジェニック植物を提供
する。本発明の方法、遺伝子構築物および植物体は特にインプットもしくいはア
ウトプット形質、またはタンパク質の異種生産に関する適用に好適である。
【００４０】 本発明は植物細胞内で機能するプロモーターに機能し得る形で連結された条件
的致死遺伝子を提供する。この遺伝子は、発現する植物を選抜、同定、または選
択的に枯死させるために用いられる。
的致死遺伝子を提供する。この遺伝子は、発現する植物を選抜、同定、または選
択的に枯死させるために用いられる。
【００４１】 本発明はまた、植物細胞内での発現に適合した２つの遺伝子を含んでなる遺伝
子構築物を提供する。一方の遺伝子は条件的致死遺伝子である。いずれか一方ま
たは両方の遺伝子は植物細胞内で機能するプロモーターと機能し得る形で連結さ
れている。
子構築物を提供する。一方の遺伝子は条件的致死遺伝子である。いずれか一方ま
たは両方の遺伝子は植物細胞内で機能するプロモーターと機能し得る形で連結さ
れている。
【００４２】 この遺伝子構築物は適用された化学配合物に応答して発現して植物を枯死させ
る条件的致死遺伝子を含んでなる。従って本発明の広い態様によれば、ａ）植物
細胞内での発現に適合した条件的致死遺伝子、およびｂ）タンパク質、ペプチド
またはアンチセンスＲＮＡをコードする新規な形質の遺伝子を含んでなる遺伝子
構築物が提供され、この新規な形質の遺伝子は植物細胞内での発現に適合してお
り、発現した際に所望の表現型がもたらされる。
る条件的致死遺伝子を含んでなる。従って本発明の広い態様によれば、ａ）植物
細胞内での発現に適合した条件的致死遺伝子、およびｂ）タンパク質、ペプチド
またはアンチセンスＲＮＡをコードする新規な形質の遺伝子を含んでなる遺伝子
構築物が提供され、この新規な形質の遺伝子は植物細胞内での発現に適合してお
り、発現した際に所望の表現型がもたらされる。
【００４３】 本発明のもう１つの広い態様によれば、同定可能な組換え植物体を作出する方
法が提供され、その方法はａ）新規な形質の遺伝子と条件的致死遺伝子を含む遺
伝子構築物で植物細胞を形質転換し、この新規な形質の遺伝子と条件的致死遺伝
子は植物体内での独立した発現に適合しており、さらにｂ）この植物細胞を完全
な植物体へ再分化させることを含んでなる。
法が提供され、その方法はａ）新規な形質の遺伝子と条件的致死遺伝子を含む遺
伝子構築物で植物細胞を形質転換し、この新規な形質の遺伝子と条件的致死遺伝
子は植物体内での独立した発現に適合しており、さらにｂ）この植物細胞を完全
な植物体へ再分化させることを含んでなる。
【００４４】 本発明のもう１つの広い態様によれば、条件的致死導入遺伝子を含む植物体
またはそれに由来する後代の視覚による同定方法が提供され、その方法は（ａ）
条件的致死遺伝子の産物の基質である良性の化学物質を含んでなる配合物で植物
体または植物体集団を処理し（良性の化学物質は条件的致死遺伝子の産物による
植物毒素に変換された際に致死レベル以下の植物毒素をもたらすレベルで適用さ
れる）、（ｂ）致死に至らない表現型を示す植物体を視覚的に同定し、さらに（
ｃ）同定された植物体を選抜して正常な植物体への再生を可能とすることを含ん
でなる。
またはそれに由来する後代の視覚による同定方法が提供され、その方法は（ａ）
条件的致死遺伝子の産物の基質である良性の化学物質を含んでなる配合物で植物
体または植物体集団を処理し（良性の化学物質は条件的致死遺伝子の産物による
植物毒素に変換された際に致死レベル以下の植物毒素をもたらすレベルで適用さ
れる）、（ｂ）致死に至らない表現型を示す植物体を視覚的に同定し、さらに（
ｃ）同定された植物体を選抜して正常な植物体への再生を可能とすることを含ん
でなる。
【００４５】 本発明はまた導入遺伝子として腫瘍遺伝子２を含む発芽種子または植物胚を視
覚的に同定する方法を提供し、その方法は（ａ）所望によりオーキシン輸送阻害
剤を含むインドールアミドまたは関連の誘導体を含む培地上で種子または胚を培
養し、さらに（ｂ）その表現型を示す発芽種子または胚を視覚的に同定すること
を含んでなる。
覚的に同定する方法を提供し、その方法は（ａ）所望によりオーキシン輸送阻害
剤を含むインドールアミドまたは関連の誘導体を含む培地上で種子または胚を培
養し、さらに（ｂ）その表現型を示す発芽種子または胚を視覚的に同定すること
を含んでなる。
【００４６】 本発明はまた導入遺伝子として腫瘍遺伝子２を含む発芽種子または植物胚を選
抜する方法を提供し、その方法は（ａ）所望によりオーキシン輸送阻害剤を含む
インドールアミドまたは関連の誘導体を含む培地上で種子または胚を培養し、さ
らに（ｂ）その表現型を示す発芽種子または胚を視覚的に同定し、さらに（ｃ）
同定された種子または胚をインドールアミドまたはオーキシン輸送阻害剤を含ま
ない培地に移行し、それにより導入遺伝して腫瘍遺伝子２を含む発芽種子または
植物胚を得ることを含んでなる。本発明のもう１つの態様によれば、形質転換の
際にトランスジェニックアブラナ属植物細胞を選抜する方法が提供され、その方
法は腫瘍遺伝子および所望により新規な形質をコードする遺伝子を含んでなる遺
伝子構築物でアブラナ属植物細胞を形質転換し、その植物細胞を、培養過程で一
工程でその腫瘍遺伝子によって作用され得る良性の植物ホルモンであるオーキシ
ン誘導体に曝し、その細胞を培養し、その良性の活性型の植物ホルモン誘導体へ
の変換を手段として用いて、活性なホルモンと関連のある表現型を示す形質転換
植物細胞を同定し、さらに形質転換植物細胞を再生させることを含んでなる。
抜する方法を提供し、その方法は（ａ）所望によりオーキシン輸送阻害剤を含む
インドールアミドまたは関連の誘導体を含む培地上で種子または胚を培養し、さ
らに（ｂ）その表現型を示す発芽種子または胚を視覚的に同定し、さらに（ｃ）
同定された種子または胚をインドールアミドまたはオーキシン輸送阻害剤を含ま
ない培地に移行し、それにより導入遺伝して腫瘍遺伝子２を含む発芽種子または
植物胚を得ることを含んでなる。本発明のもう１つの態様によれば、形質転換の
際にトランスジェニックアブラナ属植物細胞を選抜する方法が提供され、その方
法は腫瘍遺伝子および所望により新規な形質をコードする遺伝子を含んでなる遺
伝子構築物でアブラナ属植物細胞を形質転換し、その植物細胞を、培養過程で一
工程でその腫瘍遺伝子によって作用され得る良性の植物ホルモンであるオーキシ
ン誘導体に曝し、その細胞を培養し、その良性の活性型の植物ホルモン誘導体へ
の変換を手段として用いて、活性なホルモンと関連のある表現型を示す形質転換
植物細胞を同定し、さらに形質転換植物細胞を再生させることを含んでなる。
【００４７】 本発明はまたセイヨウアブラナを形質転換する方法を提供し、その方法はカル
ス形成および再生段階で培地にナフタレン酢酸を配合することを含んでなる。
ス形成および再生段階で培地にナフタレン酢酸を配合することを含んでなる。
【００４８】 本発明は大規模の農業および工業用のアブラナ種／品種などの作物の生産に十
分適している、本方法は育種プロセス中の導入遺伝子の追跡および同定に用途が
見出せる。本方法はまた交雑受粉または自生種子による同種のその他の商業生産
の混入を避けなければならない新規な形質を含む商業的植物品種の生産にも用途
が見出せる。さらに本発明は、いずれかの環境から導入遺伝子を有する植物を選
択的に除去する方法を提供することによる環境保護も提供する。
分適している、本方法は育種プロセス中の導入遺伝子の追跡および同定に用途が
見出せる。本方法はまた交雑受粉または自生種子による同種のその他の商業生産
の混入を避けなければならない新規な形質を含む商業的植物品種の生産にも用途
が見出せる。さらに本発明は、いずれかの環境から導入遺伝子を有する植物を選
択的に除去する方法を提供することによる環境保護も提供する。
【００４９】 本発明は特に異種タンパク質を発現する作物を生産する方法を提供する。本発
明のその方法はその他の商業用生産物から異種タンパク質を発現するものの混入
を実施的に除去するのに使用できる。
明のその方法はその他の商業用生産物から異種タンパク質を発現するものの混入
を実施的に除去するのに使用できる。
【００５０】 さらに本発明は、これまでに不応答であること、または極めて低い効率でしか
形質転換できないと分かっているものを含むアブラナ種および品種を形質転換す
る方法を提供する。これには商業上重要な高オレイン酸／低リノール酸品種、特
にＡＧ０１９およびそれらに由来する後代が含まれる。
形質転換できないと分かっているものを含むアブラナ種および品種を形質転換す
る方法を提供する。これには商業上重要な高オレイン酸／低リノール酸品種、特
にＡＧ０１９およびそれらに由来する後代が含まれる。
【００５１】
本発明は視覚的に容易に同定できるトランスジェニック植物を作出するための
遺伝子構築物を提供する。この遺伝子構築物はまたトランスジェニック植物にだ
け作用する化学製剤の適用によって増殖場所から容易に取り出せる組換え植物を
提供する。この遺伝子構築物はまた、形質転換工程中に使用できる新規な選抜方
法を提供する。
遺伝子構築物を提供する。この遺伝子構築物はまたトランスジェニック植物にだ
け作用する化学製剤の適用によって増殖場所から容易に取り出せる組換え植物を
提供する。この遺伝子構築物はまた、形質転換工程中に使用できる新規な選抜方
法を提供する。
【００５２】 好ましい態様によれば、この遺伝子構築物は条件的致死遺伝子と所望の形質を
コードする第二の遺伝子を含む。いずれか一方または両方の遺伝子は植物細胞内
で発現し得るように改変してもよい。
コードする第二の遺伝子を含む。いずれか一方または両方の遺伝子は植物細胞内
で発現し得るように改変してもよい。
【００５３】 遺伝子構築物は転写および翻訳調節領域と、標的および条件的致死遺伝子の双
方をコードするＤＮＡとを含んでなるＤＮＡ配列が便宜な代替物またはさらなる
標的および／または条件的致死ＤＮＡ配列との置換を考慮した複数のクローニン
グ部位に連結されるように構築されるのが望ましい。
方をコードするＤＮＡとを含んでなるＤＮＡ配列が便宜な代替物またはさらなる
標的および／または条件的致死ＤＮＡ配列との置換を考慮した複数のクローニン
グ部位に連結されるように構築されるのが望ましい。
【００５４】 本発明の遺伝子構築物は植物の形質転換のためベクターに導入できる。このベ
クターは植物体内での発現に適合した標的遺伝子とも連結した、植物体内での選
択的発現に適合した条件的致死遺伝子を含んでなる。
クターは植物体内での発現に適合した標的遺伝子とも連結した、植物体内での選
択的発現に適合した条件的致死遺伝子を含んでなる。
【００５５】 このベクターは知られているように例えば複製、形質転換および植物体での選
抜に必要な遺伝子構築物を含んでなってもよい。例えばこのベクターは右側およ
び所望により左側のＴ−ＤＮＡ境界（ここではベクターはアグロバクテリウムに
媒介される形質転換系に用いられる）または形質転換体の選抜のためのカナマイ
シン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）を含み得る。
抜に必要な遺伝子構築物を含んでなってもよい。例えばこのベクターは右側およ
び所望により左側のＴ−ＤＮＡ境界（ここではベクターはアグロバクテリウムに
媒介される形質転換系に用いられる）または形質転換体の選抜のためのカナマイ
シン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）を含み得る。
【００５６】 この遺伝子構築物は例えばアグロバクテリウムに媒介される方法、エレクトロ
ポレーションまたはパーティクルガンなどの好適な方法によって植物細胞に導入
されて組換え細胞を生じ得る。これらの植物細胞は好適な方法によって完全な植
物体へと再分化させることができる。これらの組換え植物は植物育種にまたは直
接的には農業生産に使用できる。
ポレーションまたはパーティクルガンなどの好適な方法によって植物細胞に導入
されて組換え細胞を生じ得る。これらの植物細胞は好適な方法によって完全な植
物体へと再分化させることができる。これらの組換え植物は植物育種にまたは直
接的には農業生産に使用できる。
【００５７】 構築物の第二の遺伝子は所望のタンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮ
Ａをコードする。この遺伝子は例えばいずれの起源に由来する天然に存在する遺
伝子（すなわち異種遺伝子）の一部もしくは総てであってもよく、天然に存在す
る遺伝子の改変型であってもよく、合成ＤＮＡ配列、または天然に存在する配列
と合成配列との組合せであってもよい。標的産物のコード配列内には１以上のイ
ントロンが存在してもよい。この第二の遺伝子は、例えば適当な転写および翻訳
開始・終結領域を持つことで植物系で転写または翻訳産物として発現できる。こ
の第二の遺伝子の発現は例えば条件的致死表現型の発現を調節するプロモーター
と同じであっても異なっていてもよい非改変もしくは改変された天然の、構成的
、誘導性、発達段階によって調節されるまたは組織特異的なプロモーターによっ
て調節できる。遺伝子のためのプロモーターの選択は達成されるべき所望の作用
または結果によって異なる。
Ａをコードする。この遺伝子は例えばいずれの起源に由来する天然に存在する遺
伝子（すなわち異種遺伝子）の一部もしくは総てであってもよく、天然に存在す
る遺伝子の改変型であってもよく、合成ＤＮＡ配列、または天然に存在する配列
と合成配列との組合せであってもよい。標的産物のコード配列内には１以上のイ
ントロンが存在してもよい。この第二の遺伝子は、例えば適当な転写および翻訳
開始・終結領域を持つことで植物系で転写または翻訳産物として発現できる。こ
の第二の遺伝子の発現は例えば条件的致死表現型の発現を調節するプロモーター
と同じであっても異なっていてもよい非改変もしくは改変された天然の、構成的
、誘導性、発達段階によって調節されるまたは組織特異的なプロモーターによっ
て調節できる。遺伝子のためのプロモーターの選択は達成されるべき所望の作用
または結果によって異なる。
【００５８】 分子農業の適用では、第二の遺伝子の種子特異的発現が特に有用である。従っ
てこれらの系における第二の遺伝子は好ましくは発達中の植物種子で、さらに詳
しくは種子胚、またはトリグリセリドの貯蔵ができるその他の種子組織で発現し
得る転写および翻訳調節領域を含む。かかる調節領域は例えばオレオシンプロモ
ーターを含んでもよい(Plant et al., Plant Molecular Biology 25:193-205, 1
994)。好ましくは第二の遺伝子は（ｉ）転写および終結領域をはじめ植物内で機
能する転写および翻訳調節領域、および（ii）キメラペプチドまたはタンパク質
をコードする領域を含んでなる。このコード領域は好ましくは（ａ）油体へのキ
メラ産物のターゲッティングまたは隔離をもたらすに十分な油体特異的タンパク
質の少なくとも一部をコードする領域、および（ｂ）所望のタンパク質または形
質をコードする領域を含んでなる。このキメラ遺伝子の油体領域は油体特異的プ
ロモーターを含んでもよい。このキメラペプチドまたはタンパク質はまた油体特
異的タンパク質を所望のタンパク質に結合させ、かつ化学的または酵素的手段に
よって特異的に切断できるるペプチド配列も含んでなる(Moloney, ＰＣＴ／ＣＡ
９２／００１６１)。
てこれらの系における第二の遺伝子は好ましくは発達中の植物種子で、さらに詳
しくは種子胚、またはトリグリセリドの貯蔵ができるその他の種子組織で発現し
得る転写および翻訳調節領域を含む。かかる調節領域は例えばオレオシンプロモ
ーターを含んでもよい(Plant et al., Plant Molecular Biology 25:193-205, 1
994)。好ましくは第二の遺伝子は（ｉ）転写および終結領域をはじめ植物内で機
能する転写および翻訳調節領域、および（ii）キメラペプチドまたはタンパク質
をコードする領域を含んでなる。このコード領域は好ましくは（ａ）油体へのキ
メラ産物のターゲッティングまたは隔離をもたらすに十分な油体特異的タンパク
質の少なくとも一部をコードする領域、および（ｂ）所望のタンパク質または形
質をコードする領域を含んでなる。このキメラ遺伝子の油体領域は油体特異的プ
ロモーターを含んでもよい。このキメラペプチドまたはタンパク質はまた油体特
異的タンパク質を所望のタンパク質に結合させ、かつ化学的または酵素的手段に
よって特異的に切断できるるペプチド配列も含んでなる(Moloney, ＰＣＴ／ＣＡ
９２／００１６１)。
【００５９】 本発明は増殖環境から選択的に取り出すことができるトランスジェニック植物
を作出する方法を提供する。条件的致死遺伝子と、所望の形質をコードする第二
の遺伝子とを含む遺伝子構築物が提供される。植物細胞はこの遺伝子構築物で形
質転換され、完全な植物体へと再分化させる。遺伝子構築物の製造、形質転換お
よび再分化は好適ないずれかの手法を用いて行う。
を作出する方法を提供する。条件的致死遺伝子と、所望の形質をコードする第二
の遺伝子とを含む遺伝子構築物が提供される。植物細胞はこの遺伝子構築物で形
質転換され、完全な植物体へと再分化させる。遺伝子構築物の製造、形質転換お
よび再分化は好適ないずれかの手法を用いて行う。
【００６０】 具体的には、本発明はインプットまたはアウトプット形質、またはいずれかの
所望の形質を、所望であればかかるトランスジェニック植物およびそれに由来す
る後代が増殖部位から特異的に取り出すことができるさらなる新規な特徴ととも
に含んでなる導入遺伝子を含む植物の作出を提供する。本発明は（ａ）それに連
結された新規な形質の遺伝子、（ｂ）良性の物質を、表現型を変化させる、また
は植物全体を枯死させる物質へ変換し得る産物をコードする遺伝子を含む遺伝子
構築物を使用する。（ｂ）とみなされる遺伝子は本明細書では条件的致死遺伝子
と呼ばれている。
所望の形質を、所望であればかかるトランスジェニック植物およびそれに由来す
る後代が増殖部位から特異的に取り出すことができるさらなる新規な特徴ととも
に含んでなる導入遺伝子を含む植物の作出を提供する。本発明は（ａ）それに連
結された新規な形質の遺伝子、（ｂ）良性の物質を、表現型を変化させる、また
は植物全体を枯死させる物質へ変換し得る産物をコードする遺伝子を含む遺伝子
構築物を使用する。（ｂ）とみなされる遺伝子は本明細書では条件的致死遺伝子
と呼ばれている。
【００６１】 もう１つの態様によれば、この遺伝子構築物は植物細胞で機能するプロモータ
ーに機能し得る形で連結された条件的致死遺伝子を含んでなる。このような例で
は、この条件的致死遺伝子を用いてそれを発現する植物体を選抜、同定または選
択的に枯死させる。
ーに機能し得る形で連結された条件的致死遺伝子を含んでなる。このような例で
は、この条件的致死遺伝子を用いてそれを発現する植物体を選抜、同定または選
択的に枯死させる。
【００６２】 条件的致死遺伝子は例えば植物、細菌、ウイルスまたは動物系などのいずれの
起源から得てもよく、野生型であってもよいし、改変されていてもよいし、合成
されたものであってもよい。これらの遺伝子は植物系の転写および翻訳に適合さ
れており、例えば必須の転写および翻訳開始・終結配列を含む。条件的致死遺伝
子は例えば化学物質の適用に応答して、または熱および／または低温ショックな
どの生理学的ストレスの適用に応答して細胞死を開始するよう調節できる。１つ
の態様では、増殖環境に既知の悪影響を及ぼさない物質の適用によって細胞死を
引き起こすように活性化される条件的致死遺伝子が用いられる。
起源から得てもよく、野生型であってもよいし、改変されていてもよいし、合成
されたものであってもよい。これらの遺伝子は植物系の転写および翻訳に適合さ
れており、例えば必須の転写および翻訳開始・終結配列を含む。条件的致死遺伝
子は例えば化学物質の適用に応答して、または熱および／または低温ショックな
どの生理学的ストレスの適用に応答して細胞死を開始するよう調節できる。１つ
の態様では、増殖環境に既知の悪影響を及ぼさない物質の適用によって細胞死を
引き起こすように活性化される条件的致死遺伝子が用いられる。
【００６３】 当技術分野では多くの条件的致死遺伝子が知られている。条件的致死遺伝子は
典型的には２つの作用機構を有する。致死表現型は無毒な物質の存在または遺伝
子活性の誘導のいずれかに関して条件づけられている。第一の例では、遺伝子は
無毒な物質に作用し得る産物を発現し、これは通常外的に適用され、植物細胞に
有毒となり、これを枯死させることができる。この例では条件的致死遺伝子は無
毒な物質の存在に依存する。無毒な物質の不在下では致死表現型は発現せず、そ
の物質の存在下では致死表現型が見られる。
典型的には２つの作用機構を有する。致死表現型は無毒な物質の存在または遺伝
子活性の誘導のいずれかに関して条件づけられている。第一の例では、遺伝子は
無毒な物質に作用し得る産物を発現し、これは通常外的に適用され、植物細胞に
有毒となり、これを枯死させることができる。この例では条件的致死遺伝子は無
毒な物質の存在に依存する。無毒な物質の不在下では致死表現型は発現せず、そ
の物質の存在下では致死表現型が見られる。
【００６４】 第二の例では、条件的致死遺伝子は植物細胞に直接有害な産物をコードする。
しかしながらこの有毒遺伝子の発現はプロモーターによって調節され、従って所
望であれば有毒物質の発現は抑制されて植物の生育が可能となる。この例では、
致死表現型はプロモーターが誘導されて発現した場合に見られる。外生物質の適
用は必要ではない。
しかしながらこの有毒遺伝子の発現はプロモーターによって調節され、従って所
望であれば有毒物質の発現は抑制されて植物の生育が可能となる。この例では、
致死表現型はプロモーターが誘導されて発現した場合に見られる。外生物質の適
用は必要ではない。
【００６５】 以下に記載される遺伝子に加え、当業者ならば植物における致死性に関する候
補遺伝子を容易にアッセイできる。さらにこの遺伝子は独自に使用できるかどう
か、または調節可能な、おそらくは異種のプロモーターが条件的致死表現型を誘
導するのに必要かどうかをアッセイすればよい。
補遺伝子を容易にアッセイできる。さらにこの遺伝子は独自に使用できるかどう
か、または調節可能な、おそらくは異種のプロモーターが条件的致死表現型を誘
導するのに必要かどうかをアッセイすればよい。
【００６６】 本発明および分子農業に有用な条件的致死遺伝子の例としては、限定されるも
のではないが、サイトカインの過剰発現を誘導し、例えばＮ，Ｎ−ジアリル２，
２−ジクロロアセトアミドおよび関連化合物によって誘導されるグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼII遺伝子由来のプロモーターなどの化学的に誘導される
プロモーターを有する、イソフェニルトランスフェラーゼ酵素をコードする腫瘍
遺伝子４などの腫瘍遺伝子（ＷＯ９３０１２９４; Albertsen, N.C. et al., 米
国特許第５，４７８，３６９号）、または例えばアラビドプシス由来の(Baker e
t al., Plant Molecular Biology 24:701-713, 1994; Lang and Pulva, Plant M
olecular Biology, 20:951-962, 1992; Nordin et al., Plant Molecular Biolo
gy 21:641-653, 1993)もしくはアブラナ属(White et al., Plant Physilogy 106 :917-928, 1994)に由来する低温誘導性の遺伝子などの低温誘導プロモーターの
制御下にある腫瘍遺伝子が挙げられる。その他の有用な条件的致死遺伝子として
は無毒な物質を有毒物質に変換するもの、例えば２−アミノ−４−メトキシ酪酸
（メトキシニン）を有毒なメトキシビニルグリシンに変換する酵素メトキシニン
デヒドロゲナーゼの遺伝子(Margraff, R., et al., Experimentia 36:846, 1980
)；無毒なメトキシニンを有毒な２−アミノ−４−［２−アミノ−３−ヒドロキ
シプロピル］−トランス−３−酪酸（リゾビトキシン）に変換する酵素リゾビト
キシンシンターゼの遺伝子(Owens, L.D., et al., Weed Science 21:63-66, 197
3)；および除草剤グリホセートの無毒な誘導体を植物に有害なグリホセート化合
物へと加水分解し得るホスホン酸モノエステル加水分解酵素の遺伝子(Dotson, S
.B. and Kishore, G.M., 米国特許第５，２５４，８０１号)がある。
のではないが、サイトカインの過剰発現を誘導し、例えばＮ，Ｎ−ジアリル２，
２−ジクロロアセトアミドおよび関連化合物によって誘導されるグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼII遺伝子由来のプロモーターなどの化学的に誘導される
プロモーターを有する、イソフェニルトランスフェラーゼ酵素をコードする腫瘍
遺伝子４などの腫瘍遺伝子（ＷＯ９３０１２９４; Albertsen, N.C. et al., 米
国特許第５，４７８，３６９号）、または例えばアラビドプシス由来の(Baker e
t al., Plant Molecular Biology 24:701-713, 1994; Lang and Pulva, Plant M
olecular Biology, 20:951-962, 1992; Nordin et al., Plant Molecular Biolo
gy 21:641-653, 1993)もしくはアブラナ属(White et al., Plant Physilogy 106 :917-928, 1994)に由来する低温誘導性の遺伝子などの低温誘導プロモーターの
制御下にある腫瘍遺伝子が挙げられる。その他の有用な条件的致死遺伝子として
は無毒な物質を有毒物質に変換するもの、例えば２−アミノ−４−メトキシ酪酸
（メトキシニン）を有毒なメトキシビニルグリシンに変換する酵素メトキシニン
デヒドロゲナーゼの遺伝子(Margraff, R., et al., Experimentia 36:846, 1980
)；無毒なメトキシニンを有毒な２−アミノ−４−［２−アミノ−３−ヒドロキ
シプロピル］−トランス−３−酪酸（リゾビトキシン）に変換する酵素リゾビト
キシンシンターゼの遺伝子(Owens, L.D., et al., Weed Science 21:63-66, 197
3)；および除草剤グリホセートの無毒な誘導体を植物に有害なグリホセート化合
物へと加水分解し得るホスホン酸モノエステル加水分解酵素の遺伝子(Dotson, S
.B. and Kishore, G.M., 米国特許第５，２５４，８０１号)がある。
【００６７】 植物において通常には見られない物質に作用する条件的致死遺伝子産物は、そ
れらの天然プロモーター、誘導プロモーターまたは構成プロモーターのうちの１
以上によって調節され得る。植物において通常に見られない物質に作用する条件
的致死遺伝子産物は植物に致死的なプロモーターの作用によって決定されるよう
なある条件下でのみ活性であるような誘導プロモーターによって調節されるのが
好ましい。好適なプロモーターの同定のためのスクリーニング方法と同様、多く
の誘導プロモーターが知られている。有用なプロモーターは総てのまたは特異的
な細胞種で活性であり、かつ／または発達段階により調節される。多くの異なる
細胞種または組織特異的かつ発達段階により調節されるプロモーターは文献に記
載されており（例えば、Rosha-Sosa et al., 米国特許第５，４３６，３９３号;
Allen and Lonsdale, 米国特許第５，４１２，０８５号; Coruzzi et al., 米
国特許第５，３９１，７２５号; Conklin and Yamamoto, 米国特許第５，４５９
，２５２号）、商業上重要な形質と考えられるものは本発明の実施の中で選択お
よび使用できる。しかしながら形質転換した植物において細胞死を誘導するに十
分なレベルの発現をもたらすプロモーターはいずれも本発明での使用に好適であ
ると理解すべきである。長期にわたって、または必要とされる時と場合で高レベ
ルの発現をもたらすプロモーターが好ましい。
れらの天然プロモーター、誘導プロモーターまたは構成プロモーターのうちの１
以上によって調節され得る。植物において通常に見られない物質に作用する条件
的致死遺伝子産物は植物に致死的なプロモーターの作用によって決定されるよう
なある条件下でのみ活性であるような誘導プロモーターによって調節されるのが
好ましい。好適なプロモーターの同定のためのスクリーニング方法と同様、多く
の誘導プロモーターが知られている。有用なプロモーターは総てのまたは特異的
な細胞種で活性であり、かつ／または発達段階により調節される。多くの異なる
細胞種または組織特異的かつ発達段階により調節されるプロモーターは文献に記
載されており（例えば、Rosha-Sosa et al., 米国特許第５，４３６，３９３号;
Allen and Lonsdale, 米国特許第５，４１２，０８５号; Coruzzi et al., 米
国特許第５，３９１，７２５号; Conklin and Yamamoto, 米国特許第５，４５９
，２５２号）、商業上重要な形質と考えられるものは本発明の実施の中で選択お
よび使用できる。しかしながら形質転換した植物において細胞死を誘導するに十
分なレベルの発現をもたらすプロモーターはいずれも本発明での使用に好適であ
ると理解すべきである。長期にわたって、または必要とされる時と場合で高レベ
ルの発現をもたらすプロモーターが好ましい。
【００６８】 従って本発明の態様では、条件的致死遺伝子は植物細胞で発現し得る異種タン
パク質をコードする遺伝子に連結されている。かかる条件的致死遺伝子は特定の
化学配合物のストレス曝露下では致死表現型を発現し得る。
パク質をコードする遺伝子に連結されている。かかる条件的致死遺伝子は特定の
化学配合物のストレス曝露下では致死表現型を発現し得る。
【００６９】 好ましい条件的致死遺伝子はインドールアセトアミド加水分解酵素（ＩＡＭＨ
）をコードするアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド由来の
腫瘍遺伝子２である。例として、腫瘍遺伝子２のコード領域およびプロモーター
配列を含む、オクトピンＴ−ＤＮＡのＤＮＡ配列がBarker et alの米国特許第５
，４２８，１４７号に記載されている。ＩＡＭＨの基質は、合成化学物質のナフ
タレンアセトアミド（ＮＡＭ）をはじめ種々のインドールアミドおよび関連のオ
ーキシン誘導体を含む。腫瘍遺伝子２を発現する植物細胞へのＮＡＭの適用は植
物に有害な物質ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）の産生を誘導する。条件的致死遺伝子
をコードするＤＮＡはまた植物細胞において条件的致死表現型を与えるのに十分
な量でそれからＩＡＭＨは発現するプロモーターを含んでなる。このプロモータ
ーは腫瘍遺伝子２に本来備わっているプロモーター、カリフラワーモザイクウイ
ルスプロモーターＣａＭＶ３５Ｓなどの構成プロモーター、または細胞もしくは
組織特異的プロモーターであり得る。
）をコードするアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド由来の
腫瘍遺伝子２である。例として、腫瘍遺伝子２のコード領域およびプロモーター
配列を含む、オクトピンＴ−ＤＮＡのＤＮＡ配列がBarker et alの米国特許第５
，４２８，１４７号に記載されている。ＩＡＭＨの基質は、合成化学物質のナフ
タレンアセトアミド（ＮＡＭ）をはじめ種々のインドールアミドおよび関連のオ
ーキシン誘導体を含む。腫瘍遺伝子２を発現する植物細胞へのＮＡＭの適用は植
物に有害な物質ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）の産生を誘導する。条件的致死遺伝子
をコードするＤＮＡはまた植物細胞において条件的致死表現型を与えるのに十分
な量でそれからＩＡＭＨは発現するプロモーターを含んでなる。このプロモータ
ーは腫瘍遺伝子２に本来備わっているプロモーター、カリフラワーモザイクウイ
ルスプロモーターＣａＭＶ３５Ｓなどの構成プロモーター、または細胞もしくは
組織特異的プロモーターであり得る。
【００７０】 本発明の最も好ましい態様では、アグロバクテリウムの腫瘍遺伝子２が植物形
質転換ベクターの一部として用いられる。植物形質転換ベクターにおける腫瘍遺
伝子２の存在は多くの利点をもたらす。これらには、形質転換ベクターを含んで
なる植物における表現型の視覚的変化をもたらすのに致死量以下のオーキシンイ
ンドールアミドおよび関連のオーキシン誘導体を使用できること、形質転換プロ
セス中に植物細胞の選抜するためにインドールアミドおよび関連のオーキシン誘
導体を使用することができること、および形質転換ベクターを含んでなるトラン
スジェニック植物の同定を考慮した種子および胚救済法の構成要素として腫瘍遺
伝子２を用いることを含む。
質転換ベクターの一部として用いられる。植物形質転換ベクターにおける腫瘍遺
伝子２の存在は多くの利点をもたらす。これらには、形質転換ベクターを含んで
なる植物における表現型の視覚的変化をもたらすのに致死量以下のオーキシンイ
ンドールアミドおよび関連のオーキシン誘導体を使用できること、形質転換プロ
セス中に植物細胞の選抜するためにインドールアミドおよび関連のオーキシン誘
導体を使用することができること、および形質転換ベクターを含んでなるトラン
スジェニック植物の同定を考慮した種子および胚救済法の構成要素として腫瘍遺
伝子２を用いることを含む。
【００７１】 本発明はさらに上記の構築物またはベクターで形質転換された植物または細胞
を提供する。好ましい態様では、植物または細胞はアブラナ属である。特定の態
様は油の組成が改変されたアブラナ属である。好ましくはこのアブラナ属はＡＧ
０１９またはその近縁種および派生種など、高オレイン酸および低リノール酸を
含有するものである。
を提供する。好ましい態様では、植物または細胞はアブラナ属である。特定の態
様は油の組成が改変されたアブラナ属である。好ましくはこのアブラナ属はＡＧ
０１９またはその近縁種および派生種など、高オレイン酸および低リノール酸を
含有するものである。
【００７２】 本発明の１つの態様では、条件的致死遺伝子は分子農業に用いられるものをは
じめ、新規な遺伝子の拡散を制御するのに有用である。
じめ、新規な遺伝子の拡散を制御するのに有用である。
【００７３】 １つの態様では、腫瘍遺伝子２などの条件的致死遺伝子を含むトランスジェニ
ック植物は、条件的致死遺伝子の産物の存在下で植物に有毒な物質に変換される
化学物質の適用により、増殖環境から取り出される。この化学物質は植物毒素が
致死レベルとなるように適用される。１つの態様では、腫瘍遺伝子２は条件的致
死遺伝子として用いられる。この例における遺伝子産物はＩＡＭＨであり、これ
はインドールアミドまたは関連の誘導体を植物毒素ＮＡＡへ変換する。好ましい
態様では、インドールアミドはＮＡＭである。
ック植物は、条件的致死遺伝子の産物の存在下で植物に有毒な物質に変換される
化学物質の適用により、増殖環境から取り出される。この化学物質は植物毒素が
致死レベルとなるように適用される。１つの態様では、腫瘍遺伝子２は条件的致
死遺伝子として用いられる。この例における遺伝子産物はＩＡＭＨであり、これ
はインドールアミドまたは関連の誘導体を植物毒素ＮＡＡへ変換する。好ましい
態様では、インドールアミドはＮＡＭである。
【００７４】 好ましい態様では、本発明は腫瘍遺伝子２など、トランスジェニック植物を非
トランスジェニック植物から識別できる評価可能な視覚的マーカーとしての条件
的致死遺伝子を提供する。本方法は一定量の化学物質の適用を含み、この化学物
質は発現した条件的致死遺伝子によって変換されると致死レベル以下の植物毒素
が生じる。条件的致死導入遺伝子を含む植物は致死には至らない表現型を示すも
のとして視覚的に同定される。
トランスジェニック植物から識別できる評価可能な視覚的マーカーとしての条件
的致死遺伝子を提供する。本方法は一定量の化学物質の適用を含み、この化学物
質は発現した条件的致死遺伝子によって変換されると致死レベル以下の植物毒素
が生じる。条件的致死導入遺伝子を含む植物は致死には至らない表現型を示すも
のとして視覚的に同定される。
【００７５】 本発明はさらに、トランスジェニック体であると同定された植物は化学物質の
不在下で正常な植物体へ再生するので、トランスジェニック植物を選抜する方法
を提供する。上記のように、腫瘍遺伝子２を条件的致死遺伝子として用いる場合
、化学物質はインドールアミドまたは関連の誘導体である。好ましい態様では、
インドールアミドはＮＡＭである。
不在下で正常な植物体へ再生するので、トランスジェニック植物を選抜する方法
を提供する。上記のように、腫瘍遺伝子２を条件的致死遺伝子として用いる場合
、化学物質はインドールアミドまたは関連の誘導体である。好ましい態様では、
インドールアミドはＮＡＭである。
【００７６】 視覚的マーカーとして腫瘍遺伝子２などの条件的致死遺伝子を用いると、異種
タンパク質、または「インプット」もしくは「アウトプット」形質をコードする
ものをはじめとする所望の遺伝子をいずれも、例えばＡＧ０１９などの特定のア
ブラナ属など、かかる植物が形質転換に従わない場合であっても植物体へ導入可
能となる。
タンパク質、または「インプット」もしくは「アウトプット」形質をコードする
ものをはじめとする所望の遺伝子をいずれも、例えばＡＧ０１９などの特定のア
ブラナ属など、かかる植物が形質転換に従わない場合であっても植物体へ導入可
能となる。
【００７７】 性殖交雑の後に発達の初期段階で後代を視覚的に観察することがトランスジェ
ニック植物を同定する便宜で非破壊的かつ非生化学的な手段となる。事実上 何千という植物が一度にスクリーニングできる。本方法は大きな育種集団内で新
規な形質の導入を追跡するための、コストがかからず正確な手段となる。ＧＵＳ
アッセイまたはＰＣＲのような核酸解析といった生化学的アッセイは必要とされ
ない。従って、インプットまたはアウトプット形質をコードする遺伝子を含む植
物形質転換ベクターに腫瘍遺伝子２などの条件的致死遺伝子が含まれれば、これ
らの形質が多くの植物品種へ迅速に導入できるようになる。
ニック植物を同定する便宜で非破壊的かつ非生化学的な手段となる。事実上 何千という植物が一度にスクリーニングできる。本方法は大きな育種集団内で新
規な形質の導入を追跡するための、コストがかからず正確な手段となる。ＧＵＳ
アッセイまたはＰＣＲのような核酸解析といった生化学的アッセイは必要とされ
ない。従って、インプットまたはアウトプット形質をコードする遺伝子を含む植
物形質転換ベクターに腫瘍遺伝子２などの条件的致死遺伝子が含まれれば、これ
らの形質が多くの植物品種へ迅速に導入できるようになる。
【００７８】 腫瘍遺伝子２を発現するトランスジェニック植物をスクリーニングするには単
純な手法が提供される。ナフタレンアセトアミドの配合混合物を植物集団に噴霧
する。トランスジェニック植物では２４時間内に上偏生長と明らかな視覚的表現
型変化が見られる。腫瘍遺伝子２を持たない植物体は影響を受けない。影響を受
けた植物体を選抜する。これらの再生は７２時間内で、生育を継続し、種子をつ
ける。この表現型応答は次世代に受け継がれる。
純な手法が提供される。ナフタレンアセトアミドの配合混合物を植物集団に噴霧
する。トランスジェニック植物では２４時間内に上偏生長と明らかな視覚的表現
型変化が見られる。腫瘍遺伝子２を持たない植物体は影響を受けない。影響を受
けた植物体を選抜する。これらの再生は７２時間内で、生育を継続し、種子をつ
ける。この表現型応答は次世代に受け継がれる。
【００７９】 本発明はさらに、腫瘍遺伝子２を発現する発芽種子または植物胚の選抜を可能
とする評価可能な視覚的マーカーとしての腫瘍遺伝子２を提供する。この方法は
（ａ）インドールアミドまたは関連の誘導体、および（ｂ）オーキシン輸送阻害
剤を含む培地で種子または胚を培養し、次ぎにその表現型を示す発芽種子または
胚を視覚的に同定することを含む。同定されたトランスジェニック種子または胚
はインドールアミドまたはオーキシン輸送阻害剤を含まない培地に移行すること
で容易に再生する。
とする評価可能な視覚的マーカーとしての腫瘍遺伝子２を提供する。この方法は
（ａ）インドールアミドまたは関連の誘導体、および（ｂ）オーキシン輸送阻害
剤を含む培地で種子または胚を培養し、次ぎにその表現型を示す発芽種子または
胚を視覚的に同定することを含む。同定されたトランスジェニック種子または胚
はインドールアミドまたはオーキシン輸送阻害剤を含まない培地に移行すること
で容易に再生する。
【００８０】 本発明はさらに、形質転換中にトランスジェニック植物を選抜する方法を提供
する。この方法は細胞を形質転換するのに用いる発現構築物またはベクターの一
部として腫瘍遺伝子を用いる。ベクターが植物細胞に浸透したところで、その細
胞を（ａ）腫瘍遺伝子発現産物の存在下で活性なホルモンとなる良性の植物ホル
モン誘導体と（ｂ）オーキシン輸送阻害剤を含む配合物に曝す。細胞を増殖させ
て集塊とした後、その細胞集塊を、活性なホルモンと関連のある表現型を示すも
のについて視覚的に同定する。次ぎに同定された細胞群をホルモン誘導体の不在
下で再生させ、通常の方法で完全な植物体へと再分化させる。腫瘍遺伝子が腫瘍
遺伝子２である場合、次ぎに好ましい良性の誘導体はＮＡＭなどのインドールア
ミドまたは関連の誘導体であり、好ましい阻害剤はナフチルフタラミン酸である
。
する。この方法は細胞を形質転換するのに用いる発現構築物またはベクターの一
部として腫瘍遺伝子を用いる。ベクターが植物細胞に浸透したところで、その細
胞を（ａ）腫瘍遺伝子発現産物の存在下で活性なホルモンとなる良性の植物ホル
モン誘導体と（ｂ）オーキシン輸送阻害剤を含む配合物に曝す。細胞を増殖させ
て集塊とした後、その細胞集塊を、活性なホルモンと関連のある表現型を示すも
のについて視覚的に同定する。次ぎに同定された細胞群をホルモン誘導体の不在
下で再生させ、通常の方法で完全な植物体へと再分化させる。腫瘍遺伝子が腫瘍
遺伝子２である場合、次ぎに好ましい良性の誘導体はＮＡＭなどのインドールア
ミドまたは関連の誘導体であり、好ましい阻害剤はナフチルフタラミン酸である
。
【００８１】 ＮＡＭに加えてオーキシン輸送阻害剤を適用するとＩＡＭＨによりＮＡＡへ変
換されて、ＮＡＡの作用が著しく高まる。従って、所望の形質と腫瘍遺伝子２と
を含むトランスジェニック植物細胞は、（ａ）インドールアセトアミドおよび関
連の化合物と、（ｂ）オーキシン輸送阻害剤とを含む配合物の適用によって同定
される。
換されて、ＮＡＡの作用が著しく高まる。従って、所望の形質と腫瘍遺伝子２と
を含むトランスジェニック植物細胞は、（ａ）インドールアセトアミドおよび関
連の化合物と、（ｂ）オーキシン輸送阻害剤とを含む配合物の適用によって同定
される。
【００８２】 Ｎ−（１−ナフチル）フタラミン酸 "Naptalam" (NPA)、２，３，５−トリヨ
ード安息香酸(TIBA)、９−ヒドロキシフルオレン−９−カルボン酸(HFCA)、エリ
トロシン、エオシン、フルオレセイン、セミカルバゾン(SCB)、およびエタンホ
ンをはじめ多くのオーキシン輸送阻害剤（Phytotrophis）が使用できる。典型的
にはオーキシン輸送阻害剤は適用されるオーキシン誘導体の割合の約１０〜１０
０％の割合で適用される。いくつかの例では適用されるオーキシン誘導体に対し
て２００〜４００％のオーキシン輸送阻害剤が用いられる。
ード安息香酸(TIBA)、９−ヒドロキシフルオレン−９−カルボン酸(HFCA)、エリ
トロシン、エオシン、フルオレセイン、セミカルバゾン(SCB)、およびエタンホ
ンをはじめ多くのオーキシン輸送阻害剤（Phytotrophis）が使用できる。典型的
にはオーキシン輸送阻害剤は適用されるオーキシン誘導体の割合の約１０〜１０
０％の割合で適用される。いくつかの例では適用されるオーキシン誘導体に対し
て２００〜４００％のオーキシン輸送阻害剤が用いられる。
【００８３】 本発明の方法にはいずれの植物または細胞を用いることもできるが、好ましい
態様では用いる植物または細胞はアブラナ属である。特定の態様は油の組成が変
更されたアブラナ属である。このアブラナ属はＡＧ０１９またはその近縁種およ
び派生種のような高オレイン酸および低リノール酸を含有するものが好ましい。
態様では用いる植物または細胞はアブラナ属である。特定の態様は油の組成が変
更されたアブラナ属である。このアブラナ属はＡＧ０１９またはその近縁種およ
び派生種のような高オレイン酸および低リノール酸を含有するものが好ましい。
【００８４】アブラナ属の形質転換 形質転換セイヨウアブラナを得る新規な方法も開示される。本方法はこれまで
の方法を用いて形質転換が困難であることが分かっている栽培種の形質転換に特
に有用である。特にＡＧ０１９種およびそれに由来する後代が好ましい。
の方法を用いて形質転換が困難であることが分かっている栽培種の形質転換に特
に有用である。特にＡＧ０１９種およびそれに由来する後代が好ましい。
【００８５】 本発明のこの特定の態様では、セイヨウアブラナＡＧ０１９形質転換植物を得
る本方法は形質転換、選抜および再分化の工程を含む。本方法はセイヨウアブラ
ナＡＧ０１９植物およびそれに由来する後代を所望のいずれの遺伝子材料で形質
転換するのにも使用できる。遺伝子材料を公知のアグロバクテリウム形質転換に
用いるのに好適な形質転換ベクターに挿入する。
る本方法は形質転換、選抜および再分化の工程を含む。本方法はセイヨウアブラ
ナＡＧ０１９植物およびそれに由来する後代を所望のいずれの遺伝子材料で形質
転換するのにも使用できる。遺伝子材料を公知のアグロバクテリウム形質転換に
用いるのに好適な形質転換ベクターに挿入する。
【００８６】 形質転換法は植物細胞と好適なアグロバクテリウム・ツメファシエンス株とを
ともに培養することを含む。アブラナ属の形質転換に用いられてきた株は多くあ
り、例えばＧＶ３１０３／ｐ ＭＰ９０株(Konez & Schell, Molecular Gen. Ge
net. 204:383-396, 1986)、ＬＡＢ４４０４／ｐＡＬ４４０４株(Ooms et al, Pl
asmid 7:25-29, 1992)およびＡ２８１／ｐＥＨＡ１０５株(Hood et al., Transg
enic Res. 2:208-218, 1983)が挙げられる。
ともに培養することを含む。アブラナ属の形質転換に用いられてきた株は多くあ
り、例えばＧＶ３１０３／ｐ ＭＰ９０株(Konez & Schell, Molecular Gen. Ge
net. 204:383-396, 1986)、ＬＡＢ４４０４／ｐＡＬ４４０４株(Ooms et al, Pl
asmid 7:25-29, 1992)およびＡ２８１／ｐＥＨＡ１０５株(Hood et al., Transg
enic Res. 2:208-218, 1983)が挙げられる。
【００８７】 このアグロバクテリウムを用いて、選択した遺伝子構築物でアブラナ属細胞を
形質転換する。アブラナ属細胞は例えば培養細胞、カルスまたは植物組織中の細
胞などいずれの形態であってもよいが、子葉のものが好ましい。形質転換する細
胞を前培養する。この処理では３日間細胞を再分化培地に置く。再分化培地は多
量および微量栄養素、ビタミンおよびシュート形成を誘導する生長調節物質を含
む。
形質転換する。アブラナ属細胞は例えば培養細胞、カルスまたは植物組織中の細
胞などいずれの形態であってもよいが、子葉のものが好ましい。形質転換する細
胞を前培養する。この処理では３日間細胞を再分化培地に置く。再分化培地は多
量および微量栄養素、ビタミンおよびシュート形成を誘導する生長調節物質を含
む。
【００８８】 前培養処理の後、細胞を選択されたアグロバクテリウム株の培養物と接触させ
る。次ぎにこの細胞を好適な期間、好ましくは約３日間、好ましくは約１５℃の
温度で同時培養培地に置く。
る。次ぎにこの細胞を好適な期間、好ましくは約３日間、好ましくは約１５℃の
温度で同時培養培地に置く。
【００８９】 同時培養後、細胞を７日間、カルス形成・再生培地に移行する。次ぎに外植体
を多量および微量栄養素、ビタミンおよびシュート形成を誘導する生長調節物質
を含む選択培地に置く。この選択培地はまた抗菌物質、例えばカルベニシリンも
含む。選択物質もまた含むのが好ましい。この細胞を選択培地でシュートが発達
する（形質転換体と推定）まで生育させる。油組成が変更されたセイヨウアブラ
ナの形質転換の場合は、このカルス形成・再生培地にホルモンＮＡＡを添加する
とトランスジェニックシュートの形成が著しく高まる。再分化を高めるには発達
したシュートを規定に基づく新鮮な選択培地に移す。植物体はシュート伸長培地
に置き、最後に発根培地に置く。
を多量および微量栄養素、ビタミンおよびシュート形成を誘導する生長調節物質
を含む選択培地に置く。この選択培地はまた抗菌物質、例えばカルベニシリンも
含む。選択物質もまた含むのが好ましい。この細胞を選択培地でシュートが発達
する（形質転換体と推定）まで生育させる。油組成が変更されたセイヨウアブラ
ナの形質転換の場合は、このカルス形成・再生培地にホルモンＮＡＡを添加する
とトランスジェニックシュートの形成が著しく高まる。再分化を高めるには発達
したシュートを規定に基づく新鮮な選択培地に移す。植物体はシュート伸長培地
に置き、最後に発根培地に置く。
【００９０】 上記のアブラナ属形質転換植物を得る方法は特にセイヨウアブラナＡＧ０１９
種に有用であることが分かっている。
種に有用であることが分かっている。
【００９１】
以下に示される実施例は例示を目的とするものであり、本発明の範囲を何ら限
定するものではない。
定するものではない。
【００９２】例１：新規なアブラナ属の形質転換法 以下に概略を記載する方法はセイヨウアブラナ、特にセイヨウアブラナＡＧ０
１９種およびそれに由来する後代の便宜な形質転換を可能にする。ＡＧ０１９形
質転換プロトコールの全工程には以下の組織培養（ＴＣ）条件を用いる：２２＋
／−１℃、１６時間明期・１８時間暗期サイクル、光度１００ミクロＥ／ｍ２／
秒。
１９種およびそれに由来する後代の便宜な形質転換を可能にする。ＡＧ０１９形
質転換プロトコールの全工程には以下の組織培養（ＴＣ）条件を用いる：２２＋
／−１℃、１６時間明期・１８時間暗期サイクル、光度１００ミクロＥ／ｍ２／
秒。
【００９３】 種子は１００％エタノール中で１０秒間表面殺菌する。エタノール浴の後、種
子を１００％Ｊａｖｅｘ（５．６４％次亜塩素酸ナトリウム）＋０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０（ｖ／ｖ）に１０分間移した後に１００％Ｊａｖｅｘ＋０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０（ｖ／ｖ）浴中ににさらに１０分間移す。表面殺菌した種子を次ぎに約
８００ｍＬの滅菌水で洗浄する。表面殺菌種子を１／２強度のＭＭＯＭ（Murash
ige最小有機物培地）、１％（ｗ／ｖ）スクロース、０．８％（ｗ／ｖ）寒天、
ｐＨ５．８に移す。この表面殺菌種子を上記のＴＣ条件下で５〜７日間インキュ
ベートする。
子を１００％Ｊａｖｅｘ（５．６４％次亜塩素酸ナトリウム）＋０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０（ｖ／ｖ）に１０分間移した後に１００％Ｊａｖｅｘ＋０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０（ｖ／ｖ）浴中ににさらに１０分間移す。表面殺菌した種子を次ぎに約
８００ｍＬの滅菌水で洗浄する。表面殺菌種子を１／２強度のＭＭＯＭ（Murash
ige最小有機物培地）、１％（ｗ／ｖ）スクロース、０．８％（ｗ／ｖ）寒天、
ｐＨ５．８に移す。この表面殺菌種子を上記のＴＣ条件下で５〜７日間インキュ
ベートする。
【００９４】 植物形質転換ベクター構築物を含むアグロバクテリウムの単一のコロニーを２
８℃で４８時間、ＡＢ最小培地(Watson et al., 1975)に移行して、約６×１０
８ｃｆｕ／ｍＬの密度とする。発芽した種子から子葉を取り、前培養培地（ＭＭ
ＯＭ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、５．０ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．７％（ｗ／ｖ
）寒天およびＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）に移し、上記のＴＣ条件下で
３日間インキュベートする。次ぎにこの子葉外植体を前培養培地から注目される
アグロバクテリウム株を含むＡＢ最小培地に移して少なくとも２分間インキュベ
ートする。次ぎにその子葉外植体を再び前培養培地に戻し、上記のＴＣ条件下で
３日間インキュベートする。
８℃で４８時間、ＡＢ最小培地(Watson et al., 1975)に移行して、約６×１０
８ｃｆｕ／ｍＬの密度とする。発芽した種子から子葉を取り、前培養培地（ＭＭ
ＯＭ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、５．０ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．７％（ｗ／ｖ
）寒天およびＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）に移し、上記のＴＣ条件下で
３日間インキュベートする。次ぎにこの子葉外植体を前培養培地から注目される
アグロバクテリウム株を含むＡＢ最小培地に移して少なくとも２分間インキュベ
ートする。次ぎにその子葉外植体を再び前培養培地に戻し、上記のＴＣ条件下で
３日間インキュベートする。
【００９５】 同時培養の後、子葉外植体をカルス形成／再生培地（ＭＭＯＭ、３％（ｗ／ｖ
）スクロース、５．０ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、０．７％（
ｗ／ｖ）寒天、ｐＨ７．５＋３００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｔｉｎ）に移し、上記の
ＴＣ条件下でインキュベートしてアグロバクテリウムを除き、子葉外植体をカル
ス形成および再生させる。この工程はトランスジェニックシュートの再生を著し
く助けるホルモンＮＡＡの添加を含むことに注意すべきである。カルス形成／再
生後、子葉外植体をシュート誘導培地（ＭＭＯＭ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、
４．５ｍｇ／Ｌ、０．７％（ｗ／ｖ）寒天、ｐＨ５．８＋３００ｍｇ／Ｌ Ｔｉ
ｍｅｔｉｎ、５．０ｍｇ／Ｌ硝酸銀および適当であればカナマイシンなどの選択
物質）に移し、上記のＴＣ条件下で約４週間インキュベートしてシュート形成を
誘導する。４週間シュート誘導培地でインキュベートした後、緑のシュートとカ
ルスをＭＭＯＭ、３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび４．５ｍｇ／Ｌ、０．７％（
ｗ／ｖ）寒天、ｐＨ５．８＋３００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｔｉｎ＋選択物質、ｐＨ
５．８を含むシュート伸長培地に移す。これらの緑のシュートおよびカルスを上
記のＴＣ条件下でさらに４週間インキュベートする。緑のシュートをシュート伸
長培地から発根培地（ＭＭＯＭ、３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．７％（ｗ
／ｖ）寒天；０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡまたはＩＢＡ；ｐＨ７．５）に移し、さら
に４週間、すなわち土に移行するための根が発達するまでインキュベートする。
根の形成後、植物体を土に移し、温室条件下で生育させる。
）スクロース、５．０ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、０．７％（
ｗ／ｖ）寒天、ｐＨ７．５＋３００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｔｉｎ）に移し、上記の
ＴＣ条件下でインキュベートしてアグロバクテリウムを除き、子葉外植体をカル
ス形成および再生させる。この工程はトランスジェニックシュートの再生を著し
く助けるホルモンＮＡＡの添加を含むことに注意すべきである。カルス形成／再
生後、子葉外植体をシュート誘導培地（ＭＭＯＭ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、
４．５ｍｇ／Ｌ、０．７％（ｗ／ｖ）寒天、ｐＨ５．８＋３００ｍｇ／Ｌ Ｔｉ
ｍｅｔｉｎ、５．０ｍｇ／Ｌ硝酸銀および適当であればカナマイシンなどの選択
物質）に移し、上記のＴＣ条件下で約４週間インキュベートしてシュート形成を
誘導する。４週間シュート誘導培地でインキュベートした後、緑のシュートとカ
ルスをＭＭＯＭ、３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび４．５ｍｇ／Ｌ、０．７％（
ｗ／ｖ）寒天、ｐＨ５．８＋３００ｍｇ／Ｌ Ｔｉｍｅｔｉｎ＋選択物質、ｐＨ
５．８を含むシュート伸長培地に移す。これらの緑のシュートおよびカルスを上
記のＴＣ条件下でさらに４週間インキュベートする。緑のシュートをシュート伸
長培地から発根培地（ＭＭＯＭ、３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．７％（ｗ
／ｖ）寒天；０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡまたはＩＢＡ；ｐＨ７．５）に移し、さら
に４週間、すなわち土に移行するための根が発達するまでインキュベートする。
根の形成後、植物体を土に移し、温室条件下で生育させる。
【００９６】例２：条件的致死遺伝子（腫瘍遺伝子２）を含む新規な植物形質転換ベクターの 構築 条件的致死遺伝子としてアグロバクテリウム由来の腫瘍遺伝子２を含む新規な
植物形質転換ベクターはこの例および例３〜７に記載のようにして構築した。こ
れらのベクターにより、それらで形質転換した植物が非形質転換植物集団から選
択的に取り出すことができるようになる。これらのベクターによって付与される
かかる特徴はトランスジェニックアブラナ属植物を作出するのに通常用いられて
きたベクターには見られないものである。
植物形質転換ベクターはこの例および例３〜７に記載のようにして構築した。こ
れらのベクターにより、それらで形質転換した植物が非形質転換植物集団から選
択的に取り出すことができるようになる。これらのベクターによって付与される
かかる特徴はトランスジェニックアブラナ属植物を作出するのに通常用いられて
きたベクターには見られないものである。
【００９７】 ベクターはまずＰＣＲ法によってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２
４８株から条件的致死腫瘍遺伝子２を単離し、その遺伝子の５’および３’末端
の制限部位に導入することで作出する。ＤＮＡコード配列はプラスミドｐＴｉＡ
６由来の天然プロモーターおよびターミネーター配列とともにＧｅｎｂａｎｋか
ら入手できる（受託番号Ｘ００４０９）。
４８株から条件的致死腫瘍遺伝子２を単離し、その遺伝子の５’および３’末端
の制限部位に導入することで作出する。ＤＮＡコード配列はプラスミドｐＴｉＡ
６由来の天然プロモーターおよびターミネーター配列とともにＧｅｎｂａｎｋか
ら入手できる（受託番号Ｘ００４０９）。
【００９８】 アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２４８株から全ＤＮＡを抽出した。
腫瘍遺伝子１（ＩＡＡ−Ｍ）の５’末端付近のＨｉｎｄIII部位から、全長双方
向性プロモーターへ、腫瘍遺伝子２（ＩＡＡ−Ｈ）のコード領域へと延び、その
ターミネーターで終わる２．３ＫｂのＰＣＲ産物をＴｉプラスミドｐＴｉＡ６か
ら増幅させた。用いたプライマーｐｒ８３４９およびｐｒ７４９５は腫瘍遺伝子
２の公開配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ００４０９）を用いて設計した。この
産物のクローニングを助けるため、得られたＰＣＲ産物であるそのプライマーの
５’伸長部は５’末端には３つの制限部位ＸｂａＩ、ｐｓｔＩおよびＫｐｎＩを
、またその３’末端にはＢａｍＨＩ部位を導入した。
腫瘍遺伝子１（ＩＡＡ−Ｍ）の５’末端付近のＨｉｎｄIII部位から、全長双方
向性プロモーターへ、腫瘍遺伝子２（ＩＡＡ−Ｈ）のコード領域へと延び、その
ターミネーターで終わる２．３ＫｂのＰＣＲ産物をＴｉプラスミドｐＴｉＡ６か
ら増幅させた。用いたプライマーｐｒ８３４９およびｐｒ７４９５は腫瘍遺伝子
２の公開配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ００４０９）を用いて設計した。この
産物のクローニングを助けるため、得られたＰＣＲ産物であるそのプライマーの
５’伸長部は５’末端には３つの制限部位ＸｂａＩ、ｐｓｔＩおよびＫｐｎＩを
、またその３’末端にはＢａｍＨＩ部位を導入した。
【００９９】
【化１】
【０１００】 ０．１μｇの鋳型ＤＮＡ、５単位（１μＬ）のStratagene(San Diego, Califo
rnia)製のＴａｑＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ、１０μｌのExtend Taqバッファ
ー(Stratagene)、０．５Ｕ（０．２μｌ）のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ(Strat
agene)、８μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ、５μＭのプライマー（各２．５μｌ）お
よび２１．２μｌの水を含むＰＣＲ反応ではアグロバクテリウムＡ２４８株から
の全ＤＮＡを用いる。反応は９４℃２分間で始め、次いで９４℃３０秒、５５℃
３０秒、７２℃２分間の３５サイクルとする。これらのサイクルの後、反応物を
７２℃にて７分間維持し、ＤＮＡを単離する。
rnia)製のＴａｑＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ、１０μｌのExtend Taqバッファ
ー(Stratagene)、０．５Ｕ（０．２μｌ）のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ(Strat
agene)、８μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ、５μＭのプライマー（各２．５μｌ）お
よび２１．２μｌの水を含むＰＣＲ反応ではアグロバクテリウムＡ２４８株から
の全ＤＮＡを用いる。反応は９４℃２分間で始め、次いで９４℃３０秒、５５℃
３０秒、７２℃２分間の３５サイクルとする。これらのサイクルの後、反応物を
７２℃にて７分間維持し、ＤＮＡを単離する。
【０１０１】 １．８Ｋｂの産物が得られ、これは始原腫瘍遺伝子２に対応する制限解析によ
り確認する。
り確認する。
【０１０２】 このＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＨＳ７２
３の対応する部位に連結する(Hirji, R., Hammerlindl, J.K., Woytowich, A.E.
, Khachatourian, G.G., Datla, R.S.S., Keller, W.A., Selveraj, G.(1996) P
lasmid pHS723 and its derivatives: plant transformation vectors that ena
ble efficient selection and progeny analysis. Fourth Canadian Plant Tiss
ue Culture and Gnetic Engineering Conference, Saskatoon, Saskatchewan, C
anada)の対応する部位に連結してｐＪＨ１２１を得る。得られたベクターをアグ
ロバクテリウムＧＶ３１０３：：ｐＭＰ９０に導入し、同時培養試験に用いて、
腫瘍遺伝子２を発現する形質転換植物を作出した。このベクターはまたトランス
ジェニック体のスクリーニングのためにカナマイシン耐性とＧＵＳ活性を付与す
る。ｐＪＨ１２１の誘導は図１に示されている。
３の対応する部位に連結する(Hirji, R., Hammerlindl, J.K., Woytowich, A.E.
, Khachatourian, G.G., Datla, R.S.S., Keller, W.A., Selveraj, G.(1996) P
lasmid pHS723 and its derivatives: plant transformation vectors that ena
ble efficient selection and progeny analysis. Fourth Canadian Plant Tiss
ue Culture and Gnetic Engineering Conference, Saskatoon, Saskatchewan, C
anada)の対応する部位に連結してｐＪＨ１２１を得る。得られたベクターをアグ
ロバクテリウムＧＶ３１０３：：ｐＭＰ９０に導入し、同時培養試験に用いて、
腫瘍遺伝子２を発現する形質転換植物を作出した。このベクターはまたトランス
ジェニック体のスクリーニングのためにカナマイシン耐性とＧＵＳ活性を付与す
る。ｐＪＨ１２１の誘導は図１に示されている。
【０１０３】例３：植物形質転換ベクターｐＪＨ１２２の構築 腫瘍遺伝子２およびカナマイシン耐性マーカーを含む植物形質転換ベクターは
以下のようにして構築した。プラスミドｐＪＨ１２１をまずＸｂａＩで、次ぎに
ＢａｍＨＩで順次消化し、その天然全長プロモーターによって駆動される２．３
Ｋｂの腫瘍遺伝子２コード領域とターミネーターを切り出した。この断片をゲル
精製し、電気溶出した。バイナリー植物形質転換ベクターｐＲＤ４００も同様に
ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ｐＲＤ４００は、ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子において選択マーカーの発現を高めるためにただ１つの
塩基対が変異していること以外はｐＢＩＮ１９と同一のプラスミドである(Datla
et al., Gene 122:383-384, 1992)。電気溶出させた腫瘍遺伝子カセットをベク
ターの対応する部位に連結した。得られたプラスミドｐＪＨ１２２を植物へ形質
転換するためのアグロバクテリウムＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０へ三親接合によ
って導入した。ｐＪＨ１２２の誘導は図２に示されている。
以下のようにして構築した。プラスミドｐＪＨ１２１をまずＸｂａＩで、次ぎに
ＢａｍＨＩで順次消化し、その天然全長プロモーターによって駆動される２．３
Ｋｂの腫瘍遺伝子２コード領域とターミネーターを切り出した。この断片をゲル
精製し、電気溶出した。バイナリー植物形質転換ベクターｐＲＤ４００も同様に
ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ｐＲＤ４００は、ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子において選択マーカーの発現を高めるためにただ１つの
塩基対が変異していること以外はｐＢＩＮ１９と同一のプラスミドである(Datla
et al., Gene 122:383-384, 1992)。電気溶出させた腫瘍遺伝子カセットをベク
ターの対応する部位に連結した。得られたプラスミドｐＪＨ１２２を植物へ形質
転換するためのアグロバクテリウムＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０へ三親接合によ
って導入した。ｐＪＨ１２２の誘導は図２に示されている。
【０１０４】例４：植物形質転換ベクターｐＪＨ１２３の構築 条件的致死遺伝子および植物細胞で発現できる異種タンパク質をコードする遺
伝子を含む植物形質転換ベクターを構築した。この例では、条件的致死腫瘍遺伝
子２を、融合タンパク質をコードする異種遺伝子に連結した。この場合、融合は
プラスミドＳＢＳ２００２のオレオシンプロモーターの制御下のオレオシン遺伝
子とβグルクロニダーゼ遺伝子との間のものである。プラスミドＳＢＳ２００２
は、アラビドプシス・オレオシンプロモーターとコード領域（βグルクロニダー
ゼコード領域に翻訳的に融合され、ノパリンシンターゼターミネーターで終わる
）からなる３．８Ｋｂのカセットを含む植物形質転換ベクターである。このカセ
ットは、Van Rooijen and Moloney(Structural requirements of oleosin domai
ns for subcellurar targeting to the oil body. Plant Physiology 109 (1995
): 1353-1361)に記載のｐＣＧＹＯＢＰＧＵＳＡに見られることから不可欠なも
のである。プラスミドＳＢＳ２００２はＰｓｔＩで消化し、その断片をアガロー
スゲルで分離した。３．８Ｋｂのオレオシン−ＧＵＳ−ＮＯＳ ｔｅｒ．カセッ
トを電気溶出し、ＰｓｔＩ−ＢｇｌIIアダプターに連結した。これらのアダプタ
ーはＰｓｔＩ末端ではリン酸化されたが、ＢｇｌII末端ではされなかった。得ら
れた産物を次ぎにキナーゼ反応によりＢｇｌII部位でリン酸化した。例３に記載
の植物形質転換ベクターｐＪＨ１２２はＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化した。
キナーゼ処理されたオレオシン−ＧＵＳ断片を次ぎにＢａｍＨＩ酵素の存在下で
ベクターのＢａｍＨＩ部位に連結した。Ｂａｍ／Ｂｇｌ連結物だけが大腸菌(E.
coli)へ形質転換した際に生存する。
伝子を含む植物形質転換ベクターを構築した。この例では、条件的致死腫瘍遺伝
子２を、融合タンパク質をコードする異種遺伝子に連結した。この場合、融合は
プラスミドＳＢＳ２００２のオレオシンプロモーターの制御下のオレオシン遺伝
子とβグルクロニダーゼ遺伝子との間のものである。プラスミドＳＢＳ２００２
は、アラビドプシス・オレオシンプロモーターとコード領域（βグルクロニダー
ゼコード領域に翻訳的に融合され、ノパリンシンターゼターミネーターで終わる
）からなる３．８Ｋｂのカセットを含む植物形質転換ベクターである。このカセ
ットは、Van Rooijen and Moloney(Structural requirements of oleosin domai
ns for subcellurar targeting to the oil body. Plant Physiology 109 (1995
): 1353-1361)に記載のｐＣＧＹＯＢＰＧＵＳＡに見られることから不可欠なも
のである。プラスミドＳＢＳ２００２はＰｓｔＩで消化し、その断片をアガロー
スゲルで分離した。３．８Ｋｂのオレオシン−ＧＵＳ−ＮＯＳ ｔｅｒ．カセッ
トを電気溶出し、ＰｓｔＩ−ＢｇｌIIアダプターに連結した。これらのアダプタ
ーはＰｓｔＩ末端ではリン酸化されたが、ＢｇｌII末端ではされなかった。得ら
れた産物を次ぎにキナーゼ反応によりＢｇｌII部位でリン酸化した。例３に記載
の植物形質転換ベクターｐＪＨ１２２はＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化した。
キナーゼ処理されたオレオシン−ＧＵＳ断片を次ぎにＢａｍＨＩ酵素の存在下で
ベクターのＢａｍＨＩ部位に連結した。Ｂａｍ／Ｂｇｌ連結物だけが大腸菌(E.
coli)へ形質転換した際に生存する。
【０１０５】 最終的に得られたｐＪＨ１２３を三親接合により植物の形質転換のためのアグ
ロバクテリウムＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０株へ導入した。このベクターは形質
転換組織および植物に、選抜のためのカナマイシン耐性ならびに腫瘍遺伝子２の
発現を付与する。さらにオレオシン−ＧＵＳカセットは、種子の油体へターゲッ
ティングされるグルクロニダーゼ活性の発現を与える(van Rooije and Moloney,
1995))。ｐＪＨ１２３の誘導は図３に示されている。
ロバクテリウムＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０株へ導入した。このベクターは形質
転換組織および植物に、選抜のためのカナマイシン耐性ならびに腫瘍遺伝子２の
発現を付与する。さらにオレオシン−ＧＵＳカセットは、種子の油体へターゲッ
ティングされるグルクロニダーゼ活性の発現を与える(van Rooije and Moloney,
1995))。ｐＪＨ１２３の誘導は図３に示されている。
【０１０６】例５：植物形質転換ベクターｐＪＨ１２５の構築 腫瘍遺伝子２のコード領域の翻訳開始コドンから延び、そのターミネーターで
終わる領域を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２４８株の全ＤＮＡか
ら抽出したＴｉプラスミドｐＴｉＡ６からＰＣＲによって増幅した。用いたプラ
イマーｐｒ１０１０９およびｐｒ７４９５は公開されている腫瘍遺伝子２の配列
（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ００４０９）を用いて設計した。この産物のクロー
ニングを助けるため、得られたＰＣＲ産物であるそのプライマーの５’伸長部は
、５’末端には２つの制限部位ＸｂａＩおよびＮｃｏＩを、またその３’末端に
はＢａｍＨＩ部位を導入した。
終わる領域を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２４８株の全ＤＮＡか
ら抽出したＴｉプラスミドｐＴｉＡ６からＰＣＲによって増幅した。用いたプラ
イマーｐｒ１０１０９およびｐｒ７４９５は公開されている腫瘍遺伝子２の配列
（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ００４０９）を用いて設計した。この産物のクロー
ニングを助けるため、得られたＰＣＲ産物であるそのプライマーの５’伸長部は
、５’末端には２つの制限部位ＸｂａＩおよびＮｃｏＩを、またその３’末端に
はＢａｍＨＩ部位を導入した。
【０１０７】
【化２】
【０１０８】 このＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐ３５Ｓ−
３５Ｓ−ＮＯＳの対応する部位に連結した。このプラスミドｐ３５Ｓ−３５ｓ−
ＮＯＳは二重エンハンサー配列を有する３５Ｓカリフラワーモザイクプロモータ
ーからなる６００ｂｐ断片を含む(Kay, R., Chan, A., Daly, M., and McPhers
on, J., Duplication of CaMV 35S Promotor sequences creates a strong enha
ncer for plant genes. Science, 236 (1987) 1299-1302)およびＮＯＳターミネ
ーターからなる６００ｂｐ断片を含む。プロモーター−ターミネーター断片は一
般のクローニングベクターｐＴＺ１７Ｒ内に含まれ、Dr. Raju Datla(Plent Bio
technology Institute, National Research Council of Canada, 110 Gymnasium
Road, Saskatoon, Saskatchewan, S7N OW9)から入手してｐＪＨ１２４を得た。
２３００ｂｐのプロモーター−腫瘍遺伝子カセットをｐＪＨ１２４からＨｉｎｄ
III〜ＢａｍＨＩ断片として単離し、バイナリー植物形質転換ベクターｐＲＤ４
００のマルチプルクローニング部位の対応する部位に連結して植物形質転換ベク
ターｐＪＨ１２５を得た。このベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１：：
ｐＭ９０に導入し、外植体との同時培養に用い、腫瘍遺伝子２を発現する形質転
換植物を作出した。
３５Ｓ−ＮＯＳの対応する部位に連結した。このプラスミドｐ３５Ｓ−３５ｓ−
ＮＯＳは二重エンハンサー配列を有する３５Ｓカリフラワーモザイクプロモータ
ーからなる６００ｂｐ断片を含む(Kay, R., Chan, A., Daly, M., and McPhers
on, J., Duplication of CaMV 35S Promotor sequences creates a strong enha
ncer for plant genes. Science, 236 (1987) 1299-1302)およびＮＯＳターミネ
ーターからなる６００ｂｐ断片を含む。プロモーター−ターミネーター断片は一
般のクローニングベクターｐＴＺ１７Ｒ内に含まれ、Dr. Raju Datla(Plent Bio
technology Institute, National Research Council of Canada, 110 Gymnasium
Road, Saskatoon, Saskatchewan, S7N OW9)から入手してｐＪＨ１２４を得た。
２３００ｂｐのプロモーター−腫瘍遺伝子カセットをｐＪＨ１２４からＨｉｎｄ
III〜ＢａｍＨＩ断片として単離し、バイナリー植物形質転換ベクターｐＲＤ４
００のマルチプルクローニング部位の対応する部位に連結して植物形質転換ベク
ターｐＪＨ１２５を得た。このベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１：：
ｐＭ９０に導入し、外植体との同時培養に用い、腫瘍遺伝子２を発現する形質転
換植物を作出した。
【０１０９】例６：植物形質転換ベクターｐＪＨ１２６の構築 ｐＳＢＳ２００２からオレオシン−ＧＵＳカセットを単離し、ｐＪＨ１２３の
構築について記載されたように架橋し、キナーゼで処理した。植物形質転換ベク
ターｐＪＨ１２６（３５Ｓ−３５Ｓプロモーターによって駆動される腫瘍遺伝子
２コード領域とターミネーターからなる）をＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化し
た。キナーゼ処理したオレオシン−ＧＵＳ断片を次ぎに、ｐＪＨ１２３に関して
上記したようにＢａｍＨＩ酵素の存在下で脱リン酸化したベクターのＢａｍＨＩ
部位に連結した。
構築について記載されたように架橋し、キナーゼで処理した。植物形質転換ベク
ターｐＪＨ１２６（３５Ｓ−３５Ｓプロモーターによって駆動される腫瘍遺伝子
２コード領域とターミネーターからなる）をＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化し
た。キナーゼ処理したオレオシン−ＧＵＳ断片を次ぎに、ｐＪＨ１２３に関して
上記したようにＢａｍＨＩ酵素の存在下で脱リン酸化したベクターのＢａｍＨＩ
部位に連結した。
【０１１０】 最終的に得られたベクターｐＪＨ１２６は三親接合によって植物の形質転換の
ためのアグロバクテリウムＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０株に導入した。このベク
ターは形質転換組織および植物に、選抜のためのカナマイシン耐性ならびに腫瘍
遺伝子２の発現を付与する。さらにオレオシン−ＧＵＳカセットは、種子の油体
へターゲッティングされるグルクロニダーゼ活性の発現を与える。ｐＪＨ１２６
の誘導は図５に示されている。
ためのアグロバクテリウムＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０株に導入した。このベク
ターは形質転換組織および植物に、選抜のためのカナマイシン耐性ならびに腫瘍
遺伝子２の発現を付与する。さらにオレオシン−ＧＵＳカセットは、種子の油体
へターゲッティングされるグルクロニダーゼ活性の発現を与える。ｐＪＨ１２６
の誘導は図５に示されている。
【０１１１】例７：植物形質転換ベクターｐＪＨ１３０の構築 ２３００ｂｐ３５Ｓ−３５Ｓプロモーター−腫瘍遺伝子カセットをｐＪＨ１２
４からＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ断片として単離し、植物形質転換ベクターｐＨ
Ｓ７２３の対応する部位へクローニングしてプラスミドｐＪＨ１３０を得た。骨
格ベクターｐＨＳ７２３はＧＵＳ／ＮＰＴ融合タンパク質を発現し、これがカナ
マイシン耐性に基づく形質転換細胞、植物およびそれらの後代の選抜、およびグ
ルクロニダーゼ活性の発現に基づく形質転換組織の容易なスクリーニングを可能
にする。腫瘍遺伝子カセットが導入されれば、細胞、植物およびそれらの後代も
付加的に腫瘍遺伝子２産物を発現する。ｐＪＨ１３０の誘導は図６に示されてい
る。
４からＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ断片として単離し、植物形質転換ベクターｐＨ
Ｓ７２３の対応する部位へクローニングしてプラスミドｐＪＨ１３０を得た。骨
格ベクターｐＨＳ７２３はＧＵＳ／ＮＰＴ融合タンパク質を発現し、これがカナ
マイシン耐性に基づく形質転換細胞、植物およびそれらの後代の選抜、およびグ
ルクロニダーゼ活性の発現に基づく形質転換組織の容易なスクリーニングを可能
にする。腫瘍遺伝子カセットが導入されれば、細胞、植物およびそれらの後代も
付加的に腫瘍遺伝子２産物を発現する。ｐＪＨ１３０の誘導は図６に示されてい
る。
【０１１２】例８：ベクターｐＪＨ１２１を含むタバコ形質転換植物の解析 上記のｐＪＨ１２１構築物を含むタバコ形質転換植物を回収し、標準的な解析
法を用いて試験して挿入されたベクターの存在を調べる。確認された形質転換体
を選抜し、一定数の代表的植物をＮＡＭで処理して以下のようにして条件的致死
遺伝子を証明する。２００μｇ／ｍＬのＮＡＭを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ととも
に含む溶液を調製する。加圧式スプレーを用いて植物体に葉面散布した。条件的
致死表現型を発現する植物では、散布２日後に葉がしおれ、葉縁がカールする。
５日以内に葉はよじれ、植物体は典型的なオーキシン傷害を示す。非形質転換植
物はこの処理によって影響を受けない。
法を用いて試験して挿入されたベクターの存在を調べる。確認された形質転換体
を選抜し、一定数の代表的植物をＮＡＭで処理して以下のようにして条件的致死
遺伝子を証明する。２００μｇ／ｍＬのＮＡＭを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ととも
に含む溶液を調製する。加圧式スプレーを用いて植物体に葉面散布した。条件的
致死表現型を発現する植物では、散布２日後に葉がしおれ、葉縁がカールする。
５日以内に葉はよじれ、植物体は典型的なオーキシン傷害を示す。非形質転換植
物はこの処理によって影響を受けない。
【０１１３】 形質転換植物から種子を採集し、ＮＡＭの存在下で発芽させ、条件的致死表現
型の種子での発現を確認する。
型の種子での発現を確認する。
【０１１４】例９：ベクターｐＪＨ１２１を含むセイヨウアブラナ形質転換植物の解析 上記の構築物ｐＪＨ１２１を含むセイヨウアブラナ形質転換植物を回収し、標
準的な解析法を用いて試験して挿入されたベクターの存在を調べる。確認された
形質転換体を選抜し、３〜４葉生育期の一定数の代表的植物をＮＡＭで処理して
以下のようにして条件的致死遺伝子を証明する。２００μｇ／ｍＬのＮＡＭを０
．１％Ｔｗｅｅｎ２０とともに含む溶液を調製する。加圧式スプレーを用いて植
物体に葉面散布した。条件的致死表現型を発現する植物では、トランスジェニッ
ク植物では散布後２５日でも依然として生育が阻害されていたが、非トランスジ
ェニック種では正常に生育して開花した。
準的な解析法を用いて試験して挿入されたベクターの存在を調べる。確認された
形質転換体を選抜し、３〜４葉生育期の一定数の代表的植物をＮＡＭで処理して
以下のようにして条件的致死遺伝子を証明する。２００μｇ／ｍＬのＮＡＭを０
．１％Ｔｗｅｅｎ２０とともに含む溶液を調製する。加圧式スプレーを用いて植
物体に葉面散布した。条件的致死表現型を発現する植物では、トランスジェニッ
ク植物では散布後２５日でも依然として生育が阻害されていたが、非トランスジ
ェニック種では正常に生育して開花した。
【０１１５】 形質転換植物から種子を採集し、ＮＡＭの存在下で発芽させ、条件的致死表現
型の種子での発現を確認する。
型の種子での発現を確認する。
【０１１６】例１０：ベクターｐＪＨ１２５を含むセイヨウアブラナ形質転換植物の解析 上記の構築物ｐＪＨ１２５（３５Ｓ腫瘍遺伝子２）を含むセイヨウアブラナ形
質転換植物を回収し、標準的な解析法を用いて試験して挿入されたベクターの存
在を調べる。確認された形質転換体を選抜し、一定数の代表的な植物をＮＡＭで
処理して以下のようにして条件的致死遺伝子を証明する。２００μｇ／ｍＬのＮ
ＡＭを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０とともに含む溶液を調製する。加圧式スプレーを
用いて植物体に葉面散布した。条件的致死表現型を発現する植物では、散布２日
後に葉がしおれ、葉縁がカールする。５日以内に葉はよじれ、植物体は典型的な
オーキシン傷害を示す。非形質転換植物はこの処理によって影響を受けない。
質転換植物を回収し、標準的な解析法を用いて試験して挿入されたベクターの存
在を調べる。確認された形質転換体を選抜し、一定数の代表的な植物をＮＡＭで
処理して以下のようにして条件的致死遺伝子を証明する。２００μｇ／ｍＬのＮ
ＡＭを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０とともに含む溶液を調製する。加圧式スプレーを
用いて植物体に葉面散布した。条件的致死表現型を発現する植物では、散布２日
後に葉がしおれ、葉縁がカールする。５日以内に葉はよじれ、植物体は典型的な
オーキシン傷害を示す。非形質転換植物はこの処理によって影響を受けない。
【０１１７】例１１：育種プログラムにおける陽性選択／評価マーカーとしての腫瘍遺伝子２ の証明 腫瘍遺伝子２は注目される形質導入遺伝子と連結させた場合、注目される形質
の遺伝子を追跡するための単一の視覚的マーカーとしての、形質転換、結果の転
換および従来の育種戦略における陽性の選択・評価マーカーとして使用できる。
結果の転換（戻し交雑、遺伝子移入）および従来の育種プログラムにおいて植物
を視覚的に選抜できることは、トランスジェニック結果と農業上優良な生殖質と
の間の交雑から注目される導入遺伝子を含む後代を同定するのに要される時間お
よび分析的な支援（ＥＬＩＳＡ；ＰＣＲ；サザンブロット解析など）を軽減する
。さらに育種プログラムにおける迅速な視覚的選抜は取り扱う組織サンプル数を
少なくし、実験室から分析的解析の結果が得られるまでその育種プログラムで注
目されない分離集団中の非トランスジェニック植物の維持を少なくする。 この例では、ＪＨ２９８４およびＪＨ２９７３の形質転換実験から２０個体の
植物を植え付けた。これらのトランスジェニック種は挿入された植物形質転換ベ
クターｐＪＨ１２５に関して３：１で分離した。ＮＡＭは３葉期に１ｍｇ／ｍＬ
の割合で適用した。ＮＡＭの適用２４時間後、視覚的表現型に関して植物体を評
価した。視覚的外観のよじれた葉から、８個体の無作為のサンプリングを推定ト
ランスジェニック体であるとして選択し、４個体を非トランスジェニック体とし
て選択した。これらの植物を形質転換ベクターの存在に関してＰＣＲ解析にかけ
た。８個体の推定トランスジェニック植物は総てＰＣＲにより形質転換ベクター
を有することが確認されたが、陰性、すなわち非トランスジェニックと推定され
る４個体の植物は総てＰＣＲ解析により非形質転換体であることが分かった。こ
のように分離集団内のトランスジェニック種を同定するための評価マーカーとし
ての腫瘍遺伝子２の迅速かつ信頼性のある使用（例えば育種プログラムまたは遺
伝子移入の際）が証明される。
の遺伝子を追跡するための単一の視覚的マーカーとしての、形質転換、結果の転
換および従来の育種戦略における陽性の選択・評価マーカーとして使用できる。
結果の転換（戻し交雑、遺伝子移入）および従来の育種プログラムにおいて植物
を視覚的に選抜できることは、トランスジェニック結果と農業上優良な生殖質と
の間の交雑から注目される導入遺伝子を含む後代を同定するのに要される時間お
よび分析的な支援（ＥＬＩＳＡ；ＰＣＲ；サザンブロット解析など）を軽減する
。さらに育種プログラムにおける迅速な視覚的選抜は取り扱う組織サンプル数を
少なくし、実験室から分析的解析の結果が得られるまでその育種プログラムで注
目されない分離集団中の非トランスジェニック植物の維持を少なくする。 この例では、ＪＨ２９８４およびＪＨ２９７３の形質転換実験から２０個体の
植物を植え付けた。これらのトランスジェニック種は挿入された植物形質転換ベ
クターｐＪＨ１２５に関して３：１で分離した。ＮＡＭは３葉期に１ｍｇ／ｍＬ
の割合で適用した。ＮＡＭの適用２４時間後、視覚的表現型に関して植物体を評
価した。視覚的外観のよじれた葉から、８個体の無作為のサンプリングを推定ト
ランスジェニック体であるとして選択し、４個体を非トランスジェニック体とし
て選択した。これらの植物を形質転換ベクターの存在に関してＰＣＲ解析にかけ
た。８個体の推定トランスジェニック植物は総てＰＣＲにより形質転換ベクター
を有することが確認されたが、陰性、すなわち非トランスジェニックと推定され
る４個体の植物は総てＰＣＲ解析により非形質転換体であることが分かった。こ
のように分離集団内のトランスジェニック種を同定するための評価マーカーとし
ての腫瘍遺伝子２の迅速かつ信頼性のある使用（例えば育種プログラムまたは遺
伝子移入の際）が証明される。
【０１１８】例１２：胚および種子の発芽における評価マーカーとしての条件的致死腫瘍遺伝 子２の使用 腫瘍遺伝子２はin vitroアッセイにおける種子の発芽および胚の救出において
選択マーカーとして使用でき、分離集団中の形質転換ベクターの存在の初期段階
の検定でさえ考慮する。ｐＪＨ１２５を含むトランスジェニック植物 の種子ま
たは胚は、ＮＡＭおよびオーキシン輸送阻害剤を含む培地で培養すると、非形質
転換実生と比較した場合の表現型に基づいて視覚的選抜が可能となる。in vitro
アッセイは同型接合トランスジェニック系統を同定するの要される時間および物
理的スペース（例えば生育チャンバー内または栽培下の植物体数）を少なくし、
胚の救出法は形質転換された実生の選抜および再生を可能とし、これにより育種
プログラムにおける世代から世代への周期の時間を短縮する。
選択マーカーとして使用でき、分離集団中の形質転換ベクターの存在の初期段階
の検定でさえ考慮する。ｐＪＨ１２５を含むトランスジェニック植物 の種子ま
たは胚は、ＮＡＭおよびオーキシン輸送阻害剤を含む培地で培養すると、非形質
転換実生と比較した場合の表現型に基づいて視覚的選抜が可能となる。in vitro
アッセイは同型接合トランスジェニック系統を同定するの要される時間および物
理的スペース（例えば生育チャンバー内または栽培下の植物体数）を少なくし、
胚の救出法は形質転換された実生の選抜および再生を可能とし、これにより育種
プログラムにおける世代から世代への周期の時間を短縮する。
【０１１９】 この例では、形質転換ベクターｐＪＨ１２５に関する分離集団を代表するＪＨ
２９７３およびＪＨ２９８４からの種子をin vitroにてＮＡＭおよびオーキシン
輸送阻害剤ナフチルフタラミン酸（ＮＰＡ）の存在下で発芽させた。トランスジ
ェニック実生は生育が阻害された実生、小さな子葉、生育が阻害され膨潤した根
および根／シュート接合部のカルスを含む表現型に基づいて選択される。非形質
転換分離体は正常に生育した。推定トランスジェニック実生は非選択培地に移行
した場合、植物体が精製し、正常に生育した。これらの植物体における形質転換
ベクターの存在は上記のようにして確認した。
２９７３およびＪＨ２９８４からの種子をin vitroにてＮＡＭおよびオーキシン
輸送阻害剤ナフチルフタラミン酸（ＮＰＡ）の存在下で発芽させた。トランスジ
ェニック実生は生育が阻害された実生、小さな子葉、生育が阻害され膨潤した根
および根／シュート接合部のカルスを含む表現型に基づいて選択される。非形質
転換分離体は正常に生育した。推定トランスジェニック実生は非選択培地に移行
した場合、植物体が精製し、正常に生育した。これらの植物体における形質転換
ベクターの存在は上記のようにして確認した。
【０１２０】 セイヨウアブラナに関しては、評価マーカーとしての腫瘍遺伝子２を併用して
小胞子由来の胚を形成させるための小胞子培養物の使用することで同型接合トラ
ンスジェニック系統を誘導するための便宜な手段となる。
小胞子由来の胚を形成させるための小胞子培養物の使用することで同型接合トラ
ンスジェニック系統を誘導するための便宜な手段となる。
【０１２１】例１３：セイヨウアブラナの形質転換中の選択マーカーとしての腫瘍遺伝子２の 使用 例１で詳細に記載された形質転換プロトコールはその手法内で腫瘍遺伝子２の
使用を可能とするために改良できる。特に例１に記載の形質転換プロトコールは
前培養、同時培養、カルス形成／再生および根誘導期においてＡＧ０１９および
それらに由来する後代のトランスジェニック種を上手く再生するためにＮＡＡに
よる処理を要する。カルス形成および再生においてＮＡＡをＮＡＭで置き換える
と形質転換ベクターに腫瘍遺伝子２が含まれる場合には７日間のインキュベーシ
ョンすることが、トランスジェニック植物細胞の増殖を誘導する便宜な手段とな
り、トランスジェニックアブラナ属の再生に関して陽性の選抜法となる。この培
地はＮＡＡの代わりにＮＡＭからなり、典型的にはオーキシン輸送阻害剤を１：
２〜２：１（ＮＡＭ：オーキシン輸送阻害剤）の割合で含む。
使用を可能とするために改良できる。特に例１に記載の形質転換プロトコールは
前培養、同時培養、カルス形成／再生および根誘導期においてＡＧ０１９および
それらに由来する後代のトランスジェニック種を上手く再生するためにＮＡＡに
よる処理を要する。カルス形成および再生においてＮＡＡをＮＡＭで置き換える
と形質転換ベクターに腫瘍遺伝子２が含まれる場合には７日間のインキュベーシ
ョンすることが、トランスジェニック植物細胞の増殖を誘導する便宜な手段とな
り、トランスジェニックアブラナ属の再生に関して陽性の選抜法となる。この培
地はＮＡＡの代わりにＮＡＭからなり、典型的にはオーキシン輸送阻害剤を１：
２〜２：１（ＮＡＭ：オーキシン輸送阻害剤）の割合で含む。
【０１２２】 上記の特許、特許出願および刊行物は各々、引用することにより本明細書の一
部とされる。 本発明の教示を踏まえつつも上記の態様に対する改変は当業者には明らかであ
る。かかる改変は総て添付の請求の範囲に含まれるものとする。
部とされる。 本発明の教示を踏まえつつも上記の態様に対する改変は当業者には明らかであ
る。かかる改変は総て添付の請求の範囲に含まれるものとする。
【配列表】
【図１】 ベクターｐＨＳ７２３中に条件的致死アグロバクテリウム腫瘍遺伝子２を含ん
でなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１２１構築物を示す。腫瘍遺伝子の他、この
ベクターは植物細胞の選抜のためのβグルクロニダーゼ−カナマイシン耐性融合
タンパク質をコードする遺伝子を含む。 なお、本願において、図面中、「Ｃ．Ｒ．」は「コード領域」をさし、「ＴＥ
Ｒ．」は終結領域をさし、「ＰＲＯＭ．」は「プロモーター」をさし、「ＲＰ」
は「プライマー」をさす。
でなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１２１構築物を示す。腫瘍遺伝子の他、この
ベクターは植物細胞の選抜のためのβグルクロニダーゼ−カナマイシン耐性融合
タンパク質をコードする遺伝子を含む。 なお、本願において、図面中、「Ｃ．Ｒ．」は「コード領域」をさし、「ＴＥ
Ｒ．」は終結領域をさし、「ＰＲＯＭ．」は「プロモーター」をさし、「ＲＰ」
は「プライマー」をさす。
【図２】 ベクターｐＲＤ４００中に条件的致死アグロバクテリウム腫瘍遺伝子２を含ん
でなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１２２構築物を示す。腫瘍遺伝子の他、この
ベクターは植物細胞の選抜のためのカナマイシン耐性遺伝子を含む。
でなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１２２構築物を示す。腫瘍遺伝子の他、この
ベクターは植物細胞の選抜のためのカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【図３】 ＧＵＳコード配列にフレーム内融合したアラビドプシス(Arabidopsis)種子オ
レオシンコード領域である異種遺伝子に連結した条件的致死アグロバクテリウム
腫瘍遺伝子２を含んでなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１２３の誘導を示す。種
子オレオシンコード誘導体は種子の油体への融合タンパク質の特異的局在化をも
たらす。この異種遺伝子は種子オレオシンプロモーターの制御下にある。
レオシンコード領域である異種遺伝子に連結した条件的致死アグロバクテリウム
腫瘍遺伝子２を含んでなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１２３の誘導を示す。種
子オレオシンコード誘導体は種子の油体への融合タンパク質の特異的局在化をも
たらす。この異種遺伝子は種子オレオシンプロモーターの制御下にある。
【図４】 ベクターｐＲＤ４００中に３５Ｓプロモーターの制御下で条件的致死アグロバ
クテリウム腫瘍遺伝子２を含んでなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１２５構築物
を示す。腫瘍遺伝子の他、このベクターは植物細胞の選抜のためのカナマイシン
耐性遺伝子を含む。
クテリウム腫瘍遺伝子２を含んでなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１２５構築物
を示す。腫瘍遺伝子の他、このベクターは植物細胞の選抜のためのカナマイシン
耐性遺伝子を含む。
【図５】 ＧＵＳコード配列にフレーム内融合したアラビドプシス種子オレオシンコード
領域である異種遺伝子に連結した条件的致死遺伝子アグロバクテリウム腫瘍遺伝
子２を３５Ｓプロモーターの制御下に含んでなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１
２６の誘導を示す。種子オレオシンコード誘導体は種子の油体への融合タンパク
質の特異的局在化をもたらす。この異種遺伝子は種子オレオシンプロモーターの
制御下にある。
領域である異種遺伝子に連結した条件的致死遺伝子アグロバクテリウム腫瘍遺伝
子２を３５Ｓプロモーターの制御下に含んでなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１
２６の誘導を示す。種子オレオシンコード誘導体は種子の油体への融合タンパク
質の特異的局在化をもたらす。この異種遺伝子は種子オレオシンプロモーターの
制御下にある。
【図６】 ベクターｐＨＳ７２３中に３５Ｓプロモーターの制御下で条件的致死アグロバ
クテリウム腫瘍遺伝子２を含んでなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１３０構築物
を示す。腫瘍遺伝子の他、このベクターは植物細胞の選抜のためのβグルクロニ
ダーゼ−カナマイシン耐性融合タンパク質コードする遺伝子を含む。
クテリウム腫瘍遺伝子２を含んでなる植物形質転換ベクターｐＪＨ１３０構築物
を示す。腫瘍遺伝子の他、このベクターは植物細胞の選抜のためのβグルクロニ
ダーゼ−カナマイシン耐性融合タンパク質コードする遺伝子を含む。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年２月１日（２００１．２．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ダブリュ．エイ．ケラー カナダ国サスカチワン、サスカトゥーン、 エメリーン、ロード、234 (72)発明者 エス．エフ．ファビアンスキー カナダ国オンタリオ州、グロスター、フォ レストグレン、クレセント、6068 (72)発明者 ピー．ジー．アーニソン カナダ国オンタリオ州、オーリンズ、マル クー、ドライブ、1612 (72)発明者 ジョセフ、ケイ．ハマーリンドル カナダ国サスカチワン、サスカトゥーン、 メイン、ストリート、１イー‐1800 (72)発明者 スティーブン、アール．ウェブ カナダ国サスカチワン、サスカトゥーン、 ハスラム、クレセント、935 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD13 CD14 4B024 AA08 BA07 BA11 CA04 DA01 EA04 FA02 GA11 4B065 AA01X AA57X AA87X AA88X AA88Y AB01 AC20 BA02 BA24 CA53
Claims (59)
- 【請求項１】 植物細胞内で機能するプロモーターに機能し得る形で連結された条件的致死遺
伝子であって、その遺伝子を発現する植物体を選抜、同定、または選択的に枯死
させるために用いられる遺伝子を含んでなる遺伝子構築物。 - 【請求項２】 植物細胞内での発現に適合した第一の条件的致死遺伝子と、 植物細胞内での発現に適合した第二の遺伝子と を含んでなる遺伝子構築物であって、 そのいずれかまたは双方の遺伝子が植物細胞内で機能するプロモーターと機能
し得る形で連結されている遺伝子構築物。 - 【請求項３】 第二の遺伝子が異種である、請求項２に記載の構築物。
- 【請求項４】 該異種遺伝子が医薬製剤をコードする、請求項３に記載の構築物。
- 【請求項５】 該異種遺伝子が工業的に有用な酵素をコードする、請求項３に記載の構築物。
- 【請求項６】 該異種遺伝子がレンニンおよび／またはヒルジンをコードする、請求項３に記
載の構築物。 - 【請求項７】 第二の遺伝子が発現した場合、植物体の表現型を変更する、請求項２に記載の
構築物。 - 【請求項８】 第二の遺伝子がタンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡをコードする
、請求項２に記載の構築物。 - 【請求項９】 第二の遺伝子がインプットまたはアウトプット形質をコードする、請求項２に
記載の構築物。 - 【請求項１０】 条件的致死遺伝子が腫瘍遺伝子である、請求項１または２に記載の構築物。
- 【請求項１１】 条件的致死遺伝子がアグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来する腫瘍遺
伝子２である、請求項１または２に記載の構築物。 - 【請求項１２】 条件的致死遺伝子が化学物質またはストレスに応じて発現する、請求項１また
は２に記載の構築物。 - 【請求項１３】 条件的致死遺伝子が外因性物質を適用した場合のみ致死的である、請求項１ま
たは２に記載の構築物。 - 【請求項１４】 条件的致死遺伝子が、発現した場合および外因性物質を適用する必要のない場
合に致死的である、請求項１または２に記載の構築物。 - 【請求項１５】 条件的致死遺伝子が、腫瘍遺伝子４、アラビドプシス由来の低温誘導性遺伝子
、メトキシニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、リゾビトキシンシンター
ゼをコードする遺伝子、またはホスホン酸モノエステル加水分解酵素をコードす
る遺伝子である、請求項１または２に記載の構築物。 - 【請求項１６】 条件的致死遺伝子が、メトキシニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、リ
ゾビトキシンシンターゼをコードする遺伝子、またはホスホン酸モノエステル加
水分解酵素をコードする遺伝子である、請求項１３に記載の構築物。 - 【請求項１７】 プロモーターが誘導性である、請求項１または２に記載の構築物。
- 【請求項１８】 プロモーターが組織特異的である、請求項１または２に記載の構築物。
- 【請求項１９】 プロモーターが構造的である、請求項１または２に記載の構築物。
- 【請求項２０】 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含んでなる、植物形質
転換ベクター。 - 【請求項２１】 請求項１〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含んでなる、植物体。
- 【請求項２２】 請求項１１、１２、１３および１５のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含
んでなる、植物体。 - 【請求項２３】 請求項２０に記載のベクターで形質転換された、植物体。
- 【請求項２４】 アブラナ属である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の植物体。
- 【請求項２５】 油の組成が改変された、請求項２４に記載のアブラナ属植物。
- 【請求項２６】 高オレイン酸、低リノール酸遺伝子型を有する、請求項２５に記載のアブラナ
属植物。 - 【請求項２７】 ＡＧ−０１９種またはその派生物である、請求項２６に記載のアブラナ属植物
。 - 【請求項２８】 増殖環境から移行させることができるトランスジェニック植物を作出する方法
であって、 請求項１〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子構築物またはベクターを用いて
植物細胞を形質転換させ、さらに、 この植物細胞を完全な植物体に再分化させる ことを含んでなる方法。 - 【請求項２９】 請求項２２に記載の植物体を増殖環境から移行する方法であって、 条件的致死遺伝子の産物によって植物に有毒な薬剤に変換される化学物質の適
用を含んでなり、かつ、その物質は遺伝子産物によって変換された際に致死レベ
ル以下の変換基質をもたらすレベルで適用される、方法。 - 【請求項３０】 請求項２２に記載の植物体を視覚的に同定する方法であって、 条件的致死遺伝子の産物の基質である化学物質を適用し、ここでその物質は遺
伝子産物によって変換された際に致死レベル以下の変換基質をもたらすレベルで
適用され； 致死に至らない表現型を示す植物体を視覚によって同定する ことを含んでなる、方法。 - 【請求項３１】 遺伝子構築物またはベクターが条件的致死遺伝子として腫瘍遺伝子２を含んで
なり、かつ化学物質がインドールアミドまたは関連誘導体である、請求項２９ま
たは３０に記載の方法。 - 【請求項３２】 インドールアミドがナフタレンアセトアミドである、請求項３１に記載の方法
。 - 【請求項３３】 請求項２２のトランスジェニック植物を選抜する方法であって、 条件的致死遺伝子の産物の基質である化学物質を適用し、ここでその物質は遺
伝子産物によって変化された際に致死レベル以下の変換基質をもたらすレベルで
適用され； 致死に至らない表現型を示す植物体を視覚によって同定し；さらに 同定した植物体を化学物質の不存在下で正常な植物体へと再生させる ことを含んでなる、方法。 - 【請求項３４】 遺伝子構築物またはベクターが条件的致死遺伝子として腫瘍遺伝子２を含んで
なり、かつ化学物質がインドールアミドまたは関連誘導体である、請求項３３に
記載の方法。 - 【請求項３５】 インドールアミドがナフタレンアセトアミドである、請求項３４に記載の方法
。 - 【請求項３６】 植物体がアブラナ属である、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
- 【請求項３７】 アブラナ属植物の油の組成が改変されている、請求項３６に記載の方法。
- 【請求項３８】 アブラナ属植物が高オレイン酸、低リノール酸を含有する、請求項３７に記載
の方法。 - 【請求項３９】 アブラナ属植物がＡＧ−０１９種またはその派生物である、請求項３８に記載
の方法。 - 【請求項４０】 導入遺伝子として腫瘍遺伝子２を含有する発芽種子または植物胚を視覚的に同
定する方法であって、 インドールアミドまたは関連誘導体を含む培地でこの種子または胚を培養し；
さらに その表現型を示す発芽種子または胚を視覚によって同定する ことを含んでなる、方法。 - 【請求項４１】 導入遺伝子として腫瘍遺伝子２を含有する発芽種子または植物胚を視覚的に同
定する方法であって、 インドールアミドまたは関連誘導体を含む培地でこの種子または胚を培養し； その表現型を示す発芽種子または胚を視覚によって同定し；さらに 同定した種子または胚をインドールアミドを含まない培地へ移し； それにより、導入遺伝子として腫瘍遺伝子２を含有する発芽種子または植物胚
を得る、 ことを含んでなる、方法。 - 【請求項４２】 工程（ａ）の培地がオーキシン輸送阻害剤を含み、かつ工程（ｂ）の培地がオ
ーキシン輸送阻害剤を含まない、請求項４０または４１に記載の方法。 - 【請求項４３】 該阻害剤がＮ−（１−ナフチル）フタラミン酸、２，３，５−トリヨード安息
香酸、９−ヒドロキシフルオレン−９−カルボン酸、エリトロシン、エオシン、
フルオレセイン、セミカルバゾン、またはエタンホンである、請求項４０〜４２
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項４４】 インドールアミドがナフタレンアセトアミドであり、かつ阻害剤がナフチルフ
タラミン酸である、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項４５】 種子または胚がアブラナ属である、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項４６】 アブラナ属種子または胚の油の組成が改変された、請求項４５に記載の方法。
- 【請求項４７】 アブラナ属種子または胚が高オレイン酸、低リノール酸を含有する、請求項４
６に記載の方法。 - 【請求項４８】 アブラナ属種子または胚がＡＧ−０１９種またはその派生物である、請求項４
７に記載の方法。 - 【請求項４９】 形質転換中にトランスジェニック植物細胞を選抜する方法であって、 植物細胞内での発現に適合した腫瘍遺伝子を含んでなる遺伝子構築物またはベ
クターで植物細胞を形質転換し； 腫瘍遺伝子の産物により活性ホルモンへと変換される植物ホルモンの良性のオ
ーキシン誘導体とオーキシン輸送阻害剤とを含んでなる配合物にその植物細胞を
曝し； その細胞を培養して細胞群とし； 活性ホルモンに関連する表現型を示す細胞群を視覚によって同定し；さらに 同定した細胞群をこの誘導体の不存在下で再生させる、 ことを含んでなる、方法。 - 【請求項５０】 腫瘍遺伝子が腫瘍遺伝子２である、請求項４９に記載の方法。
- 【請求項５１】 良性の誘導体がナフタレンアセトアミドであり、かつ阻害剤がナフチルフタラ
ミン酸である、請求項４９に記載の方法。 - 【請求項５２】 植物細胞がアブラナ属である、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法
。 - 【請求項５３】 アブラナ属植物細胞の油の組成が改変された、請求項５２に記載の方法。
- 【請求項５４】 アブラナ属植物細胞が高オレイン酸、低リノール酸を含有する、請求項５３に
記載の方法。 - 【請求項５５】 アブラナ属植物細胞がＡＧ−０１９種またはその派生物である、請求項５４に
記載の方法。 - 【請求項５６】 カルス形成および再生工程において培地中にナフタレン酢酸を添加することを
含んでなる、セイヨウアブラナを形質転換する方法。 - 【請求項５７】 セイヨウアブラナの油の組成が改変された、請求項５６に記載の方法。
- 【請求項５８】 セイヨウアブラナがＡＧ−１９種である、請求項５６に記載の方法。
- 【請求項５９】 ｐＪＨ１２１、ｐＪＨ１２２、ｐＪＨ１２３、ｐＪＨ１２５、ｐＪＨ１２６お
よびｐＪＨ１３０からなる群から選抜される、プラスミド。
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