JPH0614667A - デサチュラーゼを使用しての植物油の改変 - Google Patents

デサチュラーゼを使用しての植物油の改変

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JPH0614667A
JPH0614667A JP5052559A JP5255993A JPH0614667A JP H0614667 A JPH0614667 A JP H0614667A JP 5052559 A JP5052559 A JP 5052559A JP 5255993 A JP5255993 A JP 5255993A JP H0614667 A JPH0614667 A JP H0614667A
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plant
acid
plant seed
yeast
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Candace Gloria Poutre
グロリア プートル キャンデス
Asha Mehra-Palta
メーラ−パルタ アシャ
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Abstract

(57)【要約】 【構成】酵母デルター9デチュラーゼ遺伝子により植物種
子を形質転換して、この種子から得られる植物の種子油
中の脂肪酸含有量を改変する。 【効果】種子油中の不飽和脂肪酸含有量が増した植物が
得られ、その植物から用途範囲の広い植物油が得られ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵母デルタ-9デサチュ
ラーゼ遺伝子を有する植物種子、ならびに、デサチュラ
ーゼ遺伝子を使用しての種子油の脂肪酸含有量を改変す
る方法に関する。
【０００２】さらに詳細には、本発明は、種子中に遺伝
子を発現させるプロモーターの制御下に酵母デルター9デ
サチュラーゼ遺伝子を有する、Brassica あるいはZea m
aysの種子のような植物種子に向けられており、ならび
に、それに付随して生じる、デサチュラーゼを使用して
の種子油の脂肪酸含有量を改変する方法に向けられてい
る。
【０００３】
【従来の技術】植物油は食品工業において使用されるだ
けではなく、徐々に化学工業においても使用され、従来
の潤滑剤として働く液体の代替物としての工業的応用に
その道が見いだされ始めている。油の用途は、基本的に
はその組成に依存する。トリグリセリドは、植物油のほ
とんどを構成するが（約95%）、リン脂質、遊離脂肪
酸、ワックス、ならびにステロール類などの、多くの他
の重要な脂質もまた存在する。抗酸化剤などの種々の他
の構成成分も存在し得、これらは比較的少量しか存在し
ないが、それにも関わらずその特性に対して、従ってそ
の油の有用性に対して、多大な影響を有し得る。
【０００４】トリグリセリドの特性は、それを構成する
脂肪酸に大きく依存する。種子油穀物類の耕種学的に受
容可能な株に天然に存在する脂肪酸は、得られる油が、
他の興味のもたれる使用には不適切であることがしばし
ばあり、特定のパラメーターを充たす、油の組成を変え
る能力を有することが非常に望まれる。
【０００５】植物油の改変は、化学的に行われる。この
試みは、約3%より少ない飽和脂肪酸を含有するサラダ／
クッキングオイルを得るために用いられてきた（米国特
許第4,948,811号）。この油は、化学反応により生成さ
れるか、あるいは飽和脂質の物理的分離により生成され
得る。一般的な参考としては、所望の特性を有する油に
到達するための「遺伝子工学」の使用がある（欄３、58
行目以下参照のこと）。しかし、特定の油種子植物が、
いかにして所望の特性の植物油を提供するように改変さ
れ得るかについての開示はなされていない。
【０００６】典型的には、植物油の脂肪酸組成は、従来
の育種法により改変されてきた。この方法は、脂肪酸組
成に影響する天然に発生する変異源として、既存の生殖
質を利用する。このような変異体は、その後の育種と結
び付けて、適切なスクリーニングの使用により明らかに
され、選択される。例えば、このような試みは、ナタネ
油中で長鎖の脂肪酸であるエルカ酸量を減少させるため
に使用されてきた（Stefansson, B.R. (1983) High and
Low Erucic Acid Rapeseed Oils、 Kramer JKGら編、
Academic Press, NY; pp.144-161)。ならびに、この試
みは、トウモロコシ油中にモノ不飽和脂肪酸であるオレ
イン酸量を増加させるためにも使用されてきた（米国特
許出願第07/554,526号）。
【０００７】最近、変異誘発原の使用により所望の特性
を選択するための、有用な変異個体のプールを増加させ
る試みがなされてきた。しかし、変異誘発原は、一般的
には、すでに存在する遺伝子の不活性化もしくは改変に
より作用し、その結果、特定の機能を喪失、あるいは減
少する。従って、変異誘発による新しい特性の導入は、
既存の特性のいくつかを喪失することに依存する。さら
に、変異誘発体による所望の目的の達成は、一般に不確
実である。植物油中の改変された脂肪酸組成の極くわず
かなタイプのみが、この方法により達成されてきた。こ
のような脂肪酸組成に影響する「造られた」変異の１例
は、ナタネ油中の、特にリノール酸およびリノレン酸と
いうポリ不飽和脂肪酸の減少、およびそれに付随して
の、モノ不飽和脂肪酸であるオレイン酸の増加である
（Auld, M.ら、(1992) Crop Sci.印刷中）。もう一つ
は、ナタネ油中の飽和脂肪酸の減少である（PCT国際特
許公開番号WO 91/15578）。しかし、種子油合成の生化
学は複雑であり、よく理解されていない。ナタネ油中に
見られる脂肪酸組成の変化に寄与する数種のメカニズム
があり得る（PCT国際特許公開番号WO 91/15578）。この
ような変化に影響を及ぼす変異誘発の使用は、本来はラ
ンダムであり、そして非特異的である。
【０００８】遺伝子工学を使用する脂肪酸組成の改変の
可能性は、理論的には、特定の所望の遺伝子を正確に制
御して導入し、および特定の所望しない遺伝子あるいは
遺伝子産物の不活性化を生じさせる。従って、新規な特
色が、既存の遺伝子とは完全に独立して植物に導入され
得るはずであるか、または予め選択された遺伝子が不活
性化もしくは改変され得るはずである。しかし、脂肪酸
組成の改変のために遺伝子工学を効果的に使用すること
は、植物細胞内での脂肪酸合成の調節およびプロセッシ
ングに作用するメカニズムに対し、理にかなった正確な
モデルであることが断言されている。
【０００９】油種子においては、脂肪酸合成は色素体で
なされ、新たに合成された脂肪酸は色素体から細胞質に
移出すると主張されている。そして、それらは、内網状
膜中で行われるトリグリセリドの組立てに使用される。
【００１０】脂肪酸合成の主要生成物はパルミチン酸
（16:0）であり、これは能率的にステアリン酸（18:0）
に伸長されると考えられている。一方、色素体中にあり
ながら、次に飽和脂肪酸が、デルター9デサチュラーゼと
して知られている酵素により不飽和化され、１つの（あ
るいはそれより多い）炭素ー炭素二重結合が導入され得
る。特に、ステアリン酸は、色素体性デルター9デサチュ
ラーゼ酵素により急速に不飽和化されてオレイン酸（1
8:1）を生成し得る。実際に、パルミチン酸は、色素体
性デルター9デサチュラーゼにより不飽和化されて、パル
ミトレイン酸（16:1）になり得るが、この脂肪酸はほと
んどの植物油中では極めて少量（0ー0.2%）であるよう
だ。
【００１１】従って、色素体での脂肪酸合成の主要生成
物は、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸で
ある。ほとんどの油では、飽和脂肪酸がかなり低比率で
しか存在しないので、オレイン酸が主として合成される
脂肪酸である。
【００１２】細胞質中の色素体外での次の植物脂肪酸の
不飽和化は、オレイン酸に限定されるようであり、これ
は、不飽和化されてリノール酸（18:2）およびリノレン
酸（18:3）になり得る。さらに、植物によっては、オレ
イン酸はさらに伸長し（20:1、22:1および／または24:1
に）、もしくは官能基の付加により改変され得る。これ
らの脂肪酸は、飽和脂肪酸であるパルミチン酸およびス
テアリン酸とともにグリセリドに組み合わされ得る。
【００１３】植物のデルター9デサチュラーゼ酵素は可溶
性である。これは色素体ストロマ中に存在し、基質とし
て、ACPでエステル化された新たに合成された脂肪酸、
主としてステアリル-ACPを使用する。これと比較して、
酵母デルター9デサチュラーゼ酵素は、小胞体膜に存在
し、基質としてCo-Aでエステル化された脂肪酸を使用し
て、飽和脂肪酸であるパルミチン酸およびステアリン酸
の両方を不飽和化する。
【００１４】酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子は、Sa
ccharomyces cerevisiae から単離され、クローン化さ
れ、そして配列決定された（Stukey, J.E.ら、J. Biol.
Chem. 264:16537-16544 (1989); Stukey, J.E.ら、J.
Biol. Chem. 265:20144-20149 (1990)）。この遺伝子は
さらに、明らかに過剰発現される条件下で、同じ酵母株
を形質転換するために使用され、その結果、トリグリセ
リド染色のためにNileRedを使用する蛍光顕微鏡での定
量により、形質転換酵母細胞において貯蔵脂質の蓄積の
増加が示された（米国特許第5,057,419号）。この脂肪
酸組成は、特徴づけされなかった。この参考文献には、
酵母あるいは他の微生物から他のデサチュラーゼをまず
単離し、続いて、産生される油の改変およびその脂肪酸
組成の改変のために、高度の発現を導き得ると考えられ
る条件下で、これらの遺伝子を酵母あるいは植物に再導
入するための、単離酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子
からの情報の使用についての一般的な考察が含まれてい
る（実施例２の欄９、24行目以下を参照のこと）。しか
し、この考察は一般的かつ仮説的である。実例は提供さ
れておらず、この目的を達成するために従来の組換えDN
A法が記載されているだけで、特定の実施に対する手引
も挙げられていない（欄10、25行目以下を参照のこ
と）。
【００１５】次に、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子
は、実際に、タバコの葉組織に導入された（Polashcok,
J.ら、FASEB J. 5:A1157 (1991)）。明かに、その遺伝
子はその組織中で発現されて、報告されたパルミトレイ
ン酸の10倍の増加、およびこれに対応してパルミチン酸
ならびにステアリン酸の減少が実証された。
【００１６】主要な食用油脂の構成成分としての、モノ
不飽和物の中の特にオレイン酸の高レベルの健康価（he
alth value）が、最近の研究で確立された。このような
食餌は、飽和脂肪酸が高度に含まれている食餌に起因す
る動脈硬化症の発生を減少させると考えられている。従
って、モノ不飽和物を高度に含有する食用植物油に対す
る必要性が存在する。4%を越えない飽和脂肪酸含有量の
ナタネ油を生産するために、種子変異誘発が使用された
（PCT国際特許公開番号第WO 91/15578号）。報告された
最低値は、１つの種子中に飽和脂肪酸含有量2.8％とい
う値であった。しかし、この飽和脂肪酸含有量が低い植
物油は、ナタネ油に限定されている。
【００１７】任意の植物種子組織中で酵母デルター9デサ
チュラーゼ遺伝子が発現されると、種子油中のモノ不飽
和脂肪酸の増加を伴う、飽和脂肪酸の減少を生じ得る。
この場合には、酵素は、色素体から移出され、そしても
はや色素体の脂肪酸不飽和化のための基質ではないこれ
らの飽和脂肪酸を、不飽和化するために提供される。従
って、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子による、この
遺伝子が種子組織中で発現される条件下での形質転換
は、飽和脂肪酸が減少した種子油をもたらす。
【００１８】さらに、通常の脂肪酸組成を有する植物中
での酵母デサチュラーゼ遺伝子の発現は、植物油中の通
常ではない脂肪酸の増加あるいは出現となり得た。例え
ば、油中にパルミチン酸を高レベルで含有する種子組織
中で酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子が発現される
と、パルミトレイン酸のレベルが増大され得た。脂肪酸
伸長が生じるそれらの組織（例えば、高エルカ酸含有ナ
タネ）において、通常ではない二重結合を有する、より
長い鎖の脂肪酸が蓄積され得た。このような脂肪酸に
は、cis-バクセン酸（18:1 cis 11）、20:1 cis 13、2
2:1 cis 15および24:1 cis 17が含まれる。これらの脂
肪酸例は、工業的に興味深い。例えば、18:1 cis 11の
酸化的オゾン分解で一塩基C7脂肪酸と二塩基C10脂肪酸
とが得られる。この一塩基脂肪酸および二塩基脂肪酸は
両方とも、工業的に未加工の物質であり、有用な脂肪酸
である。これらは代用品として、もしくは特定の機能性
が所望される様式で使用され得る。
【００１９】
【発明の要旨】従って、本発明は、酵母デルター9デサチ
ュラーゼ遺伝子および該酵母デルター9デサチュラーゼ遺
伝子を植物種子中において発現させるための手段を含
む、植物種子を提供する。発現の手段には、植物種子中
で酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子を発現するために
有効なプロモーターが含まれ、そしてこのプロモーター
は、例えば、ファゼオリンプロモーター、切り型ファゼ
オリンプロモーター、および35Sプロモーターであり得
る。好ましくは、このプロモーターは、種子特異的プロ
モーターであり、最も好ましくは、切り型ファゼオリン
プロモーターである。植物種子は、酵母デルター9デサチ
ュラーゼ終止配列、ファゼオリン3'終止配列、あるいは
ORF 25 3'終止配列などの、酵母デルター9デサチュラー
ゼ遺伝子に対する終止配列もまた含み得る。
【００２０】植物種子はトウモロコシおよびモロコシを
含む単子葉属の１種であり得、トウモロコシ、特にZea
maizeが好ましい。あるいは、植物種子は、アブラナ（B
rassica）、ヒマワリ（Helianthus）、ベニバナ（Carth
amus）、ゴマ（Sesamum）、ダイズ（Glycine）、ナンキ
ンマメ（Arachis）、ワタ（Gossypium）、Lesquerella
およびルリギク（Vernonia）などの双子葉属に属し得、
アブラナの場合には特にBrassica rapaおよびBrassica
napusが好ましい。
【００２１】さらなる実施態様では、本発明は、植物種
子を酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子を発現させるた
めに形質転換させることにより、植物種子の種子油の脂
肪酸含有量を改変するための方法に向けられている。改
変には、植物種子の種子油中のモノ不飽和脂肪酸含有パ
ーセントを増大させことが包含され得る。そのようなモ
ノ不飽和脂肪酸は、16から24の炭素原子の炭素鎖の長さ
を有し得、例えば、cis-9-ヘキサデセン酸（パルミトレ
イン酸）、cis-9-オクタデセン酸（オレイン酸）、cis-
11-オクタデセン酸（cis-バクセン酸）、cis-11-エイコ
セン酸、cis-13ーエイコセン酸、cis-13-ドコセン酸、ci
s-15-ドコセン酸、cis-15-テトラコセン酸、cis-17-テ
トラコセン酸およびそれらの組み合わせであり得る。モ
ノ不飽和脂肪酸は、さらに、オレイン酸、パルミトレイ
ン酸あるいはcis-バクセン酸であり得る。
【００２２】あるいは、脂肪酸含有量は、種子油中の飽
和脂肪酸の含有パーセントを減少させることにより改変
され得る。飽和脂肪酸は、ミリスチン酸、パルミチン
酸、ステアリン酸、エイコサン酸、ドコサン酸、テトラ
コサン酸およびその組み合わせであり得る。
【００２３】この方法では、改変されるべき植物種子
は、上記の単子葉および双子葉の属ならびに種から選択
され得る。
【００２４】形質転換は一般に、植物種子の未変性DNA
に、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子および酵母デル
ター9デサチュラーゼ遺伝子に対するプロモーターの形態
の外来性DNAを加えることにより完成される。適切な形
質転換法には、アグロバクテリウム、エレクトロポレー
ション、ポリエチレングリコール（PEG）、シリコンカ
ーバイドファイバー、粒子ガンおよび直接注入が含まれ
る。
【００２５】特定の実施態様では、形質転換には、酵母
デルター9デサチュラーゼ遺伝子およびそのプロモーター
を含有するベクターの構築、選択されたアグロバクテリ
ウム株へのベクターの導入、およびそのアグロバクテリ
ウムから植物細胞へベクターのいくつかがトランスファ
ーされるのに十分な条件下で選択植物細胞をアグロバク
テリウムで処理することが含まれ、このことによって、
酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子は植物細胞中で発現
される。
【００２６】最終的な実施態様においては、本発明は、
上記のような、植物種子から植物を生じさせることに向
けられている。ここにおいて、該植物の種子は、酵母デ
ルタ-9デサチュラーゼ遺伝子および該酵母デルター9デサ
チュラーゼ遺伝子を植物種子中で発現させる手段を、含
む。
【００２７】
【発明の構成】本発明の手段によって、酵母デルター9デ
サチュラーゼ遺伝子を有し、そしてこの遺伝子を発現さ
せる種子が提供される。さらに、酵母デルター9デサチュ
ラーゼ遺伝子が種子中で発現される条件下で酵母デルタ
ー9デサチュラーゼにより植物を形質転換することによっ
て、脂肪酸プロフィールの変化した植物油を得る方法が
提供される。
【００２８】概略すると、酵母デルター9デサチュラーゼ
遺伝子は以下の工程により単離され得る。その遺伝子
を、野生型酵母DNAから作られた酵母ゲノムバンクでの
形質転換によるolel変異株のOLE+に対するインビボ相補
性により、まずクローン化する。プラスミドに保持され
る相補化配列は、制限マッピング、遺伝子的手段による
確認、および配列決定により特徴付けられ得る。
【００２９】遺伝子のコーディング配列は、植物種子中
で機能する調節配列の制御下に設置され、植物の形質転
換ベクター中へ移される。陽性の形質転換体を選択する
ための適当な選択マーカーを有するこれらの構築物は、
次に、植物組織を形質転換するために使用される。得ら
れたカルスは植物に再生され、これらの植物からの組織
試料は、個々のものが実際に酵母デルター9デサチュラー
ゼ遺伝子を含有することを確認するために、少なくとも
１つの分子的あるいは生物学的アッセイにより、スクリ
ーニングされる。
【００３０】酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子を有す
るこれらの形質転換体は、成体に成長し種子をつける。
酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子の種子中での発現
は、PCRアッセイなどによるmRNA分析、および／または
ウエスタンアッセイなどのタンパク質分析により測定さ
れる。さらに、成熟種子の脂肪酸組成は、種子中の酵母
デルター9デサチュラーゼの存在に応じて生成されるあら
ゆる新規な脂肪酸組成を同定するために、測定される。
変化した脂肪酸組成を示すこれらの種子は、発芽され、
そして観察される特色のその安定性および遺伝学的特徴
は、適切な遺伝的交雑により特徴付けられる。
【００３１】本発明の各局面を、さらに詳細に考察す
る。
【００３２】下記に示す主たるDNAおよび酵母の遺伝子
操作は、標準的な十分に確立されたプロトコルであり、
数種のプロトコルマニュアルに見いだされる（Sherman,
Fら、 (1986) Laboratory Course Manual for Methods
in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Loboratory
Press, NY; Sambrook, Jら、(1989) Molecular Clonin
g, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Loborat
ory Press, NY; およびMethods in Enzym 152: Guide t
o Molecular Cloning Techniques, Berger, SLおよびKi
mmel, AR編 (1987)）。DNAは、製造業者（U.S. Bioche
m. Corp., Cleveland, OH）の指示に従って、二本鎖鋳
型のためのプロトコルを使用して、Sanger法などを含む
数種の方法により配列決定され得る。
【００３３】酵母からのデルター9デサチュラーゼ遺伝子
は、以下の工程により単離され得る。酵母株は、形質転
換および相補性に適するようにつくられる。このような
株は、デルター9デサチュラーゼ活性を欠損していて、従
って、成長のためには外因性の不飽和脂肪酸を必要とし
なければならない。さらに、この株は、第二の特性ある
いは形質転換された細胞を選択するためのマーカーを有
し得る。次に、野生型酵母DNAのゲノムバンクが、デル
ター9デサチュラーゼ活性を欠損している酵母株を形質転
換するために使用される。デルター9デサチュラーゼ機能
の復元が見られる（すなわち、野生型表現型を示し、も
はや成長ために外因性の不飽和脂肪酸を必要としない）
それらの株は、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子を含
むと推定される。デルター9デサチュラーゼ遺伝子を含む
と推測されるこの組換えプラスミド挿入断片が、次に単
離される。挿入断片の制限マップが調製され、すでに公
開されているマップ（Stukey, JE (1989) J. Biol. Che
m. 264: 16537-16544）と比較され得る。最後に、遺伝
子の同定が、標準的な遺伝子分析により確証される。挿
入断片DNAをサブクローン化し、酵母デルター9デサチュ
ラーゼ遺伝子のコーディング領域の位置決めおよび特徴
づけのために配列決定する。コーディング領域は、所望
の発現のための適切な調節配列を選択後、植物の発現カ
セットに移入される。調節配列は、プロモーターおよび
終止配列の両方を含有する。
【００３４】可能な調節配列には、限定はされないが、
発現のための構成要素としてすでに示されている任意の
プロモーター、例えば、対応する終止／ポリA+ 配列を
ともなったウイルス起源（CaMV 19S、TMV、AMV）のプロ
モーター、あるいは「ハウスキーピング」遺伝子（ユビ
キチン、アクチン、チューブリン）が含まれる。さら
に、種子および／または発育に特異的なプロモーター、
例えば、対応する終止／ポリA+ 配列をともなった、植
物脂肪酸／脂質生合成遺伝子（ACP、アシルトランスフ
ェラーゼ、デサチュラーゼ、脂質トランスファータンパ
ク質の遺伝子）からのプロモーター、あるいは、貯蔵タ
ンパク質遺伝子（ゼイン、ナピン(napin)、クルシフェ
リン(cruciferin)、コングリシニン(conglycinin)、レ
クチンの遺伝子）からのプロモーターが、目的とする発
現のために使用され得る。さらに、その遺伝子は、誘導
プロモーターおよび終止配列の制御下に配置されて、光
（rbcS-3A、cab-1）、熱（hsp遺伝子プロモーター）あ
るいは損傷（マンノピン(mannopine)、HRPG）によって
遺伝子発現が誘導される。プロモーターは未変性もしく
は切り型であっても使用され得、そしてそれ自身もしく
は異種の終止／ポリA+配列ともペアーになり得ること
は、当業者に明らかである。
【００３５】さらに、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝
子産物は、ペプチドリーダー配列をコードするDNAを、
デサチュラーゼ遺伝子と連結することにより、植物種子
中の特定の細胞小器官に存在し得る。このようなリーダ
ー配列は、植物あるいは他の起源からの数種の遺伝子か
ら得られ得る。これらの遺伝子は、細胞質で合成される
タンパク質をコードし、それらは、例えば、ミトコンド
リア（酵母あるいはタバコからのF1-ATPアーゼβサブユ
ニット、酵母のチトクロム c1）、クロロプラスト（酵
母のチトクロムオキシダーゼサブユニットVa 、エンド
ウからのルビスコ(rubisco)の小さなサブユニット）、
小胞体内腔（endoplasmic reticulum lumen）（タンパ
ク質ジスルフィドイソメラーゼ）、液胞（酵母からのカ
ルボキシペプチダーゼYおよびプロテイナーゼA、サヤイ
ンゲンからのフィトヘマグルチニン）、ペルオキシソー
ム（D-アミノ酸オキシダーゼ、ウリカーゼ）およびリソ
ソーム（ヒドロラーゼ）である。これらの構築物は、対
応の未変性プロモーターあるいは上記に示唆された任意
のプロモーターとともに使用され得る。
【００３６】最適な形質転換の選択マーカーが、さらに
選択される。このようなマーカーは、典型的には、抗生
物質および除草剤などの種々の毒性化学物質に対する耐
性をコードする遺伝子である。耐性は、通常は化学的に
非毒性にする酵素により与えられる。このような毒性化
学物質には、例えばハイグロマイシン、カナマイシン、
メトトレキセートおよびホスフィノスリシン（phosphin
othricin）などが含まれる。これらの化学物質に対する
耐性を与える酵素は、ハイグロマイシンホスホトランス
フェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、
ジヒドロホレートリダクターゼ、およびホスフィノスリ
シンアセチルトランスフェラーゼである。耐性をコード
する遺伝子は、植物形質転換の分野の当業者には公知で
ある。このような遺伝子で形質転換された植物は、毒性
化合物の存在下で成長が可能であるが、一方、形質転換
されていない植物は成長できない。従って、このような
遺伝子は、形質転換された植物を選択するための手段お
よび形質転換が生じたことを示す形質転換のマーカーと
して、機能する。
【００３７】最後に、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝
子を含む植物発現カセットは、植物の形質転換に使用す
るための選択マーカーをも含むベクター中に移される。
選択マーカーは、典型的には、上記のような構成プロモ
ーターの制御下にある。このベクターは、酵母デルター9
デサチュラーゼ遺伝子とマーカー遺伝子の両方が、とも
に植物ゲノムにトランスファーされるように構築され
る。
【００３８】形質転換に使用される植物組織は、任意の
適切な油種子植物から得られ得る。このような植物は、
アブラナ（Brassica）、ヒマワリ（Helianthus）、ベニ
バナ（Carthamus）、ゴマ（Sesamum）、ダイズ（Glycin
e）、ナンキンマメ（Arachis）、ワタ（Gossypium）、
トウゴマ（Ricinus）、アマ（Linum）、サルスベリ（Cu
phea）、ハナキリン（Euphorbia）、リンドウ(Limnanth
es)、ハマナ(Crambe)、Lesquerella、ルリギク（Vernon
ia）、Simmondsia、オリーブ（Olea）、ケシ（Papave
r）、アブラヤシ（Elaeis）、ココヤシ（Cocos）および
トウモロコシ（Zea）属に見いだされ得る。適切な植物
組織には、限定はされないが、葉、胚軸、子葉、茎、カ
ルス、単細胞および原形質体が含まれる。
【００３９】形質転換法は、植物形質転換分野の当業者
には公知であり、アグロバクテリウム、エレクトロポレ
ーション、ポリエチレングリコール（PEG）、シリコン
カーバイドファイバー、直接注入および粒子ガンにより
媒介される形質転換が含まれる。これらの方法は、植物
細胞へ外来性DNAを導入する種々の手段である。一度、
細胞に入ると、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子およ
び選択マーカーの両方を有するDNAの部分が植物ゲノム
中に組み込まれる。
【００４０】形質転換されたカルス組織は、選択培地
（例えば、毒性化学物質を含む培地であり、形質転換さ
れた植物が、それに対する耐性遺伝子を含む培地）にお
ける増殖によって選択される。形質転換された植物は再
生され、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子の存在がス
クリーニンングされる。これには、形質転換体が酵母デ
ルター9デサチュラーゼ特異的mRNAもしくはDNAの配列を
含むことを決定するための少なくとも１つの分子アッセ
イまたは生物学的アッセイにより、組織を分析すること
が含まれる。これらのアッセイには、耐性遺伝子酵素の
発現に対する組織アッセイ、およびサザンアッセイある
いはPCRアッセイなどによる、酵母デルター9デサチュラ
ーゼDNAの存在に対する組織アッセイが含まれる。
【００４１】酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子に対し
て陽性である植物は、成体に成長し、受粉して種子をつ
ける。形質転換植物から得た種子は、ウエスタン分析な
どによって、遺伝子にコードされたタンパク質、および
デサチュラーゼ活性の帰結としての変化した脂肪酸組成
の表現型、の両方を捜し求めることにより、酵母デルタ
ー9デサチュラーゼ遺伝子の発現について分析される。
【００４２】ウエスタン分析は、酵母デルター9デサチュ
ラーゼ遺伝子によりコードおよび発現されるタンパク質
の存在を決定するもので、植物種子組織中での遺伝子の
発現の検出のために使用される。このアッセイには、タ
ンパク質の存在を検出するために、酵母デルター9デチュ
ラーゼに対する抗体の使用が必要である。これまで精製
されたことがない、酵母デルター9デサチュラーゼタンパ
ク質に対し特異的な抗体が下記のように調製される。酵
母デルター9デサチュラーゼ酵素のコーディング配列を発
現ベクター（例えば、New England BiolabsからのpMAL-
p、pMAL-cRI）中にクローン化する。得られたタンパク
質を、製造業者の指示に従って単離および精製する。抗
体を、従来の方法により、デルター9デサチュラーゼ酵素
に対して生じさせる。抗体のデルター9デサチュラーゼ酵
素に対する特異性をELISAアッセイにより測定する。
【００４３】コントロールあるいはトランスジェニック
植物から得た全種子あるいは半分の種子のいずれかの脂
肪酸組成を、従来の方法により、油を抽出し、脂肪酸メ
チルエステルを調製し、そして脂肪酸メチルエステルを
分離および定量することによって測定する。新規脂肪酸
の特性は、トランスジェニック種子の脂肪酸組成を親植
物と比較して決定する。
【００４４】新規脂肪酸の特性の安定性および遺伝継承
は、従来の遺伝的交雑により決定する。酵母デルター9デ
サチュラーゼ遺伝子によって与えられた特性は、標準的
な育種法により、他の耕種学的に受容可能な栽培変種に
トランスファーされ得る。
【００４５】
【実施例】
〔実施例１〕遺伝子のクローン化、単離および配列決定 ａ．遺伝子のクローン化および単離 デルター9デサチュラーゼ遺伝子を、2ミクロンベクター
を用いての相補化およびマーカーの共分離を検索するこ
とによって酵母にクローン化した。Saccharomyces cere
visiae 株 X2180-1A（the Yeast Genetic Stock Cente
r, Berkeley, CA）からの野生型酵母DNAのゲノムバンク
を、酵母自律性プラスミドYEp13内に調製した。このプ
ラスミドは、高効率で形質転換し、染色体とは独立に複
製して多数のコピーを得る。YEp13は、形質転換体の選
択のための野生型LEU2遺伝子を含んでおり、非選択的条
件下で増殖する場合には有糸分裂的に不安定である。E.
coliへの形質転換では、このバンクは、1.7 x 104個の
形質転換体を与えた。これは、酵母デルター9デサチュラ
ーゼ遺伝子のコピーがこのバンク中に99%の確率で含ま
れるのに必要な算出された数値である9.5 x 103を充分
に上回る。
【００４６】形質転換に適した酵母株を、２つの半数体
酵母株を交配して、得られた半数体胞子を分析して構築
した。１つの株が、相補性に必要とされる両方の変異
（olel/leu2）を有することが見いだされた。酵母の形
質転換を行って、形質転換体を、プラスミド上のLEU2マ
ーカー、およびオレイン酸を含まない培地上での増殖に
よる野生型デサチュラーゼ活性の両方に対して選択し
た。この方法で、LEU2およびデサチュラーゼ活性の両方
に対する表現型上の野生型である、450個の形質転換体
を得た。次に、これらの形質転換体を非選択的条件下で
増殖し、LEU2プラスミドマーカーおよびデサチュラーゼ
活性の共欠損についてスクリーニングした。マーカーの
共欠損は、プラスミドに保持されているものであって、
染色体的に野生型に戻るものではないことを示した。
【００４７】この方法で、変異酵母細胞中に存在すると
野生型機能を復元する、プラスミドに保持された、数個
の挿入断片を同定した。5.7kbのHind IIIフラグメント
が、ほとんどの挿入断片に共通して見いだされ、挿入断
片の制限マップ分析は、公開されている制限マップ（St
ukey, JEら (1989) J. Biol. Chem. 264: 16537-1654
4）と広範な相同性を示した。２つのマップ間の主たる
相違は、本発明で単離されたHind IIIフラグメントが5.
7 kbであるのに対して、公開されている挿入断片は4.8k
bのHind IIIフラグメントであることである。しかし、
この領域は、種々の酵母株において、このゲノムバンク
（Stukey, JEら、上述）が由来する株の前駆株を含む、
多形性であることを示した。さらに、この制限マップ
は、挿入断片中の推定酵母デルター9デサチュラーゼコー
ディング領域に高度に保存されている。大きさの違い
は、コーディング領域外の下流配列によるものである。
【００４８】酵母デサチュラーゼ遺伝子に相同性を示す
植物DNA配列の同定を、サザン分析によって試みた。Bra
ssica napus、Brassica rapa、Arabidopsis thaliana、
ダイズ(soybean）およびトウモロコシ（maize）のゲノ
ムDNAを３種の各制限酵素で消化し、膜にブロットし
た。次に、膜を、２種のランダムプライマー標識サブク
ローン化挿入断片によりプローブした。この挿入断片
は、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子からのオープン
リーディングフレーム配列のみを含んでいた。ハイブリ
ダイゼーション後、任意の相同性に対するシグナル対ノ
イズ比が、適切な同じプローブを使用してゲノムバンク
をスクリーニングし得るために十分に減少させ得るかど
うかを決定するために、緊縮条件を増しながらフィルタ
ーを連続的に洗浄した。最も少ない緊縮洗浄条件を使用
して、全ゲノムに対してかすかなバンドが認められ得、
意外ではないが、濃いバックグラウンドが観察された。
最も緊縮な洗浄条件下（すなわち、「普通(normal)」）
では、バックグラウンドは顕著に薄くなった。しかし、
これらの条件下では、トウモロコシとダイズのDNAのみ
が明らかなバンドで示され、酵母DNA中のものと比較し
た場合は、このバンドは非常に不鮮明なものであった。
【００４９】これらのデーターは、酵母デルター9デサチ
ュラーゼ遺伝子がアブラナ中の対応する遺伝子と、少な
くともDNAレベルでは、ほとんど相同性を有さないこと
を示している。酵母デルター9デサチュラーゼは、植物酵
素と比較して、異なる配置（葉緑体に対してミクロソー
ム）、および基質特異性（脂肪酸アシル-ACPチオエステ
ルに対して脂肪酸アシル-CoAチオエステル）の両方の相
違を有するので、この２つの酵素は、同じ機能を有する
にもかかわらず、DNAあるいはタンパク質レベルにおい
てほとんど相同性を示し得ないことが予測される。
【００５０】遺伝子中断の研究は、クローン化された遺
伝子が実際に酵母デルター9デサチュラーゼであることを
示す相補性の結果を裏付けた。推定酵母デルター9デサチ
ュラーゼ遺伝子のコーディング領域へ機能性LEU2遺伝子
を挿入した構築物をつくり、それによってクローン化遺
伝子が中断される。標準的な酵母遺伝子の技術を用い
て、クローン化遺伝子の染色体コピーがLEU2中断型によ
り置換され、得られた細胞は、オレイン酸の補充なしに
増殖し得る能力について分析された。この分析では、ク
ローン化遺伝子が酵母デルター9デサチュラーゼでない場
合には、その中断は脂肪酸合成に影響しなかったはずで
ある。クローン化遺伝子が酵母デルター9デサチュラーゼ
である場合には、中断により細胞がオレイン酸をつくる
ことができず、従って補充源が必要とされた。事実、サ
ザン分析により、中断遺伝子を含むことが確認された酵
母細胞は、オレイン酸の補充なしでは増殖できなかっ
た。
【００５１】ｂ．遺伝子の配列決定 数種の異なる酵素による消化により生成された酵母デル
ター9デサチュラーゼ遺伝子の制限フラグメントを、ベク
ターpUC18中にサブクローン化した。これらのフラグメ
ントは、製造業者の指示に従って、シクエナーゼ（US
B）により二本鎖鋳型を使用して配列決定を行った。結
果を図１に示す。
【００５２】クローン化挿入断片のDNA配列決定によ
り、TATAA配列を伴った1530bpのオープンリーディング
フレームが同定された。これは、酵母のペプチドの開始
コドンとして一般に使用される推定タンパク質の最初の
ATGからー30に位置する、酵母中の好ましいプロモーター
配列である。ノーザン分析により、オープンリーディン
グフレームからのDNA配列が、約2.0kbのポリアデニル化
mRNAにハイブリダイズしたことが実証された。観察され
た転写物の大きさは1530bpのコーディング配列に良く適
合し、3'ポリAテールに適切な余地を与え、この転写物
が、大部分の酵母mRNAのようにイントロンを含んでいな
いことを示唆する。
【００５３】クローン化遺伝子の1530bpのコーディング
領域は、その翻訳開始点がTATAAボックス後のリーディ
ングフレーム内の最初のATGであると考えられており、5
10アミノ酸のタンパク質をコードする。既知タンパク質
のデータ−バンクの相同性のサーチにより、酵母デルタ
ー9デサチュラーゼ遺伝子の推定アミノ酸配列が、ラット
およびマウスのステアリル-CoAデサチュラーゼタンパク
質に相同であることが示された。興味深いことに、両方
の哺乳類タンパク質の相同性は、42アミノ酸付近から始
まり、397アミノ酸で終わる。Saccharomyces cerevisia
e株X2180-1Aから単離されたクローン化酵母デルター9デ
サチュラーゼ遺伝子の配列は、酵母株R254（もともとは
AB320と呼ばれる）から単離されたと報告された配列（S
tukey,JEら (1990) J. Biol. Chem. 265: 20144-2014
9）と非常に類似しているが、２つのコーディング領域
間には少なくとも１つのアミノ酸の相違がある。公表さ
れている配列では、アミノ酸位304はmetと報告されてい
るが、これに対し本発明で観察された同じ位置はleuで
ある。
【００５４】遺伝子相補性の研究、遺伝子中断の研究、
および配列決定から得られたデーターは、クローン化遺
伝子が酵母デルター9デサチュラーゼであることを実証し
た。
【００５５】〔実施例２〕ベクターの構築 酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子を異なるプロモータ
ーの制御下に配置し、そしてその後に異なる終止／ポリ
アデニル化配列を配置して、４つの発現ベクターを構築
した。植物の形質転換に使用されるベクターは、所望の
選択マーカーおよび酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子
発現カセットの両方を含有している。
【００５６】酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子発現カ
セットが配置される形質転換ベクターは、pH602（図２
を参照のこと）である。このベクターは、選択マーカー
として、ネオホスホトランスフェラーゼII（NPTII）遺
伝子のかわりにハイグロマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ（HPT）遺伝子を含んでいること以外は、前述のプ
ラスミドpH575（Hoffman, LMら (1987) EMBO J. 6:3213
-3221）と類似のミクロTiプラスミド二部分ベクターで
ある（Murray, EEら (1991) Plant Mol. Biol.Reporter
16:1035-1050）。抗生物質ハイグロマイシン耐性を与
えるHPT遺伝子は、構成プロモーターCaMV 35Sの制御下
にある。
【００５７】酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子の発現
を得るために、この遺伝子をインゲンマメPhaseolus vu
lgaris（Murai, Nら (1983) Science 222:475-482）か
ら得た種子特異的ファゼオリンプロモーターの制御下に
おいた。種子の発育および成熟の間に、種子貯蔵タンパ
ク質の蓄積よりも早く種子油の蓄積が生じるので、ファ
ゼオリンプロモーターは、一時的な調節の観点からは最
適ではない。従って、この遺伝子を、未変性ファゼオリ
ン（Bustosら (1991) EMBO J. 10: 1469-1479）よりも
早く発現されるように設計された改変ファゼオリンプロ
モーター、および構成的に発現されるCaMV 35Sプロモー
ターの制御下においた。
【００５８】ａ．ｐＨ．ＰＯ このベクターでは、酵母デサチュラーゼ遺伝子を、種子
特異的プロモーターである種子貯蔵タンパク質ファゼオ
リンプロモーターの制御下におき、その後に酵母デサチ
ュラーゼ終止配列をおいた（図２を参照）。
【００５９】ベクターｐＳＰＰｎｅｏは、ゲノムファゼ
オリン遺伝子を含み、この構築に使用されたプロモータ
ーの源であった。このベクターをEcoR1およびSca1で消
化し、多重クローン化部位とともにファゼオリンプロモ
ーターを含む、1.4kbのEcoR1-Sca1フラグメントを単離
し、pUC18へクローン化し、scp5'phasと呼ばれるベクタ
ーを得た。
【００６０】次の工程で、ファゼオリンプロモーターか
ら多重クローン化部位を除いた。scp5'phasをEcoR1およ
びEcoRVで消化し、両末端を満たしてベクターを再度連
結した。得られたベクターをscp5'phasーデルタと命名し
た。このベクターは、ファゼオリンプロモーター領域か
ら多重クローン化部位を除いたものを含有していた。
【００６１】酵母デサチュラーゼ遺伝子（上記を参照）
を含有する酵母ゲノムDNAの5.8kbのHindIIIフラグメン
トを単離し、pUC18のHindIII部位へクローン化してpUC2
6Aと呼ばれるベクターを得た。次に、酵母デサチュラー
ゼコーディング領域の全体および終止配列を含む、3.5k
bのSnaB1-XholフラグメントをpUC26Aから単離し、scp5'
phasーデルタのSma1-Sal1部位へクローン化した。得られ
たベクターをpPOと命名した。
【００６２】最後に、ファゼオリンプロモーター、酵母
デサチュラーゼコーディング配列なびに終止配列を含
む、4.5kbのNhe1-HindIIIフラグメントをpPOから単離し
た。このフラグメントを満たし、BamH1リンカーを加
え、フラグメントをpH602のBglII部位へクローン化し
た。得られたベクターをpH.POと命名した。
【００６３】ｂ．pH.POP このベクターでは、酵母デサチュラーゼ遺伝子を、ファ
ゼオリンプロモーターの制御下におき、その後にファゼ
オリン終止配列をおいた（図２を参照）。
【００６４】pPO（上記を参照）から、ファゼオリンプ
ロモーターおよひ酵母デサチュラーゼコーディング配列
を含む、2.6kbのNhe1-BspH1フラグメントを単離した。
このBspH1部位を満たし、Pst1リンカーを加えて、その
フラグメントをpUC18のXbal-Pst1部位へクローン化し
た。得られたベクターをpPO-2と命名した。
【００６５】ファゼオリン3'末端配列を含有する、1.5k
bのPst1-Sst1フラグメントをpSPPneoから単離した。Sst
1部位を満たし、Pst1リンカーを加えて、フラグメント
をpPO-2のPst1部位へクローン化した。得られたベクタ
ーをpPOPと命名した。
【００６６】pPOPをBamH1で消化し、ファゼオリンプロ
モーター、酵母デサチュラーゼ遺伝子、およびファゼオ
リン3'末端配列を含む挿入断片を、pH602のBglII部位へ
クローン化した。得られたベクターをpH.POPと命名し
た。
【００６７】ｃ．pH.PデルタBOP このベクターでは、酵母デサチュラーゼ遺伝子を、改変
ファゼオリンプロモーターの制御下におき、その後にフ
ァゼオリン終止配列をおいた（図２を参照）。ファゼオ
リンプロモーターを、切り取り（truncation）により改
変した。このようにすると、このプロモーターの調節に
よって遺伝子がより早期に発現されることが報告されて
いる（Bustosら (1991) The EMBO J 10: 1469-1479）。
【００６８】切り型ファゼオリンプロモーターおよび酵
母デサチュラーゼコーディグ配列を含む、pPO-2からの
2.0 kbのBcl1-Pst1フラグメントを単離した。切り型フ
ァゼオリンプロモーターは、もとのプロモーター配列の
約三分の一、すなわち295bpのみを含む。このフラグメ
ントをpUC18のBamH1-Pst1部位へクローン化した。得ら
れたベクターをpPOデルタBと命名した。
【００６９】ファゼオリン遺伝子の3'ポリアデニル化配
列を含む、1.5kbのPst1フラグメントをpPOP（上記を参
照）から単離した。このフラグメントをpPOデルタBのPs
t1部位へ挿入し、切り型ファゼオリンプロモーター、酵
母デサチュラーゼ遺伝子、およびファゼオリン終止配列
を含む構築物をつくった。得られたベクターをpPデルタ
BOPと命名した。
【００７０】切り型ファゼオリンプロモーター、酵母デ
サチュラーゼコーディング配列、およびファゼオリン終
止配列を含む、3.2kbのBamH1フラグメントをpPデルタBO
Pから単離した。このフラグメントを、pH602のBglIIク
ローン化部位へ挿入した。得られたベクターをpH.Pデル
タBOPと命名した。
【００７１】ｄ．pH.SOA このベクターでは、酵母デサチュラーゼ遺伝子を、構成
プロモーターである35Sプロモーターの制御下におき、
その後にORF25からの終止配列をおいた（図２を参
照）。
【００７２】ベクターpIC35/Aは、CaMV 35Sプロモータ
ーおよびORF25ポリアデニル化配列を含む。この２つ
は、多重クローン化部位により隔てられている。従っ
て、ベクターを構築するための戦略は、pUC26Aからの酵
母デサチュラーゼ遺伝子をpIC35Aのプロモーターと終止
配列との間へ移し、次にそれをベクターpH602へ移すこ
とである。
【００７３】ゲノム酵母デサチュラーゼコーディング配
列を含む、pUC26Aからの1665bpのBclI-BspH1フラグメン
トを単離した。このBspH1部位を満たし、BamH1リンカー
を加えた。このフラグメントを、次にpIC35AのBamH1部
位へクローン化した。得られたベクターをpSOAと命名し
た。35Sプロモーター、酵母デサチュラーゼ遺伝子コー
ディング配列およびORF25 3'ポリアデニル化配列を含
む、pSOAからの3075 Xbalフラグメントを単離した。こ
のフラグメントをT4 DNAで平滑末端化し、pH602のBglII
部位へクローン化した。この部位はT4 DNAポリメラーゼ
により平滑末端化されていた。得られたベクターをpH.S
OAと命名した。
【００７４】〔実施例３〕アグロバクテリウムへのベク
タートランスファー 上記４つ全てのプラスミド、pH.PO、pH.POP、pH.Pデル
タBOPおよびpH.SOAを、本質的には記載（Rogers SGら
(1988) Plant Molecular Biology Manual A2 (Kluwer A
cademic Publishers, Dordrecht), pp 1-12）のように
して、E. coli株DH15およびRK2013と三親交配すること
により、アグロバクテリウムへ移す。
【００７５】〔実施例４〕ナタネの形質転換 ナタネは、世界で最も重要な油種子作物の１つである。
選択育種法による耕種学的性質の改良のために多くの努
力がなされた。Brassica napusおよびBrassicarapa
は、北アメリカにおにけるナタネ生産の主要産物であ
る。
【００７６】Brassica napusは、非常に組織培養がしや
すく、外来遺伝子の導入に良好なシステムを提供する。
アグロバクテリウム媒介の形質転換により得られたB. n
apusのトランスジェニック植物が、以前に報告されてい
る（Puaら (1987) Bio/Technology 5: 815-817; Fryら
(1987) Plant Cell Reports 6: 321-325; Radkeら (198
8) Theor. Appl. Genet. 75: 685-694およびMoloneyら
(1989) Plant Cell Reports 8: 238-242）。マイクロイ
ンジェクション（Neuhausら(1987) Theor. Appl. Gene
t. 75: 30-36）および原形質体エレクトロポレーション
（Guercheら (1987)Plant Sci. 52:111-116）の技術も
また、B. napusの形質転換に使用された。Brassica rap
aもまた、最近Mehra-Paltaらにより会議で報告されたよ
うに、形質転換し得る（1991, Proceedings of the Rap
eseed GCIRC Congress, pp1108-1115）。
【００７７】ナタネ形質転換のこの実施例に使用された
植物は、Brassica napusの栽培変種植物であるProfitで
あった。種子は、通常の植物および以前に再生された植
物系の両方から得た。Profitの再生体ラインは、形質転
換の頻度が増大した組織の植物を生み出し、その場合そ
の頻度は、特定数の組織外植片から得られたトランスジ
ェニック植物の数として換算される。種子を1.05%の次
亜塩素酸ナトリウム（20% Chlorox）で20分間表面滅菌
し、滅菌蒸留水で３回すすいだ。これらの種子を、20 x
100 mmのペトリ皿中で基本培地（BM）上で無菌的に、4
ー6日間発芽させた。BM培地は、Murashige およびSkoog
(1962)のマクロー およびミクロー成分、40mg/l FeNa2EDT
Aの鉄、ならびに以下の成分（mg/l）から構成されてい
た：myoーイノシトール 100; ニコチン酸 0.1; ピリド
キシン HCl 0.1; チアミン HCl 0.02; グリシン 0.4;
スクロース 30,000; およびDifco細菌寒天 8,000 。こ
の芽ばえを、光周期16時間、25℃で成長させた。4ー6日
たった芽ばえから胚軸の切片（2ー3 mm）を切り出し、5
mg/lのαーナフタレン酢酸（NAA）あるいは1 mg/lの2,4-
ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）を含むBM培地またはG
amborgs' B5（Gamborgら、1968）培地（カルス化培地）
で、24時間前処理をした。処理の前に滅菌濾紙を培地上
に置いた。
【００７８】胚軸切片をアグロバクテリウム溶液（液体
基本培地で108／mlに希釈した）で30分間処置し、共培
養するために2ー3日間、カルス化培地上に置いた。胚軸
組織を、カルベニシリン（500 mg/l）およびハイグロマ
イシン（5-10 mg/l）を含む、カルス化培地に移した。
培養を光周期16時間、22±2℃で維持した。7日後、胚軸
切片を、BAP（1ー4 mg/l）、ゼアチン（0-4mg/l）、硝酸
銀（AgNO3 2.5-10mg/l）、カルベニシリン（500 mg/
l）、およびハイグロマイシン（5-10 mg/l）を含む、BM
あるいはB5の芽条(shoot)再生培地に移した。カルス化
培地あるいは再生培地を、Agarose（SeaKem, 0.5%）あ
るいはGelrite（0.2%）で凝固させた。組織を３週間ご
とに新鮮な選択培地に移した。培養の1ー3週間後にカル
スが形成され、その3ー6週間後に芽条が形成された。こ
れらの芽条を伸長させるために、BAP（0.01-0.1 mg/l）
およびカルベニシリン（100 mg/l）を含むBM培地に移
し、後に、インドール酪酸（IBA, 0.1 mg/l）を含むBM
上で根付かせた。
【００７９】〔実施例５〕植物の形質転換の決定 選択培地上に生残する各再生植物を、実際にトランスジ
ェニックであるかどうかを決定するために、少なくとも
１つの、以下の生物学的アッセイおよび分子アッセイに
より検定を行った。
【００８０】ａ．葉のディスクアッセイ 遺伝子の存在および発現は、その遺伝子によってコード
されるタンパク質の活性をアッセイすることにより決定
し得る。葉のディスクアッセイは、ハイグロマイシンの
存在下で組織の成長を測定することにより、選択マーカ
ー遺伝子であるHPT（形質転換された組織に対してハイ
グロマイシン耐性を与える）の活性を検出する、生物学
的アッセイである。HPT遺伝子および酵母デサチュラー
ゼ遺伝子の両方は、ともに単一DNA断片にトランスファ
ーされるので、HPT遺伝子の存在は、PCR分析により別々
に確認されるが、酵母デサチュラーゼ遺伝子がアッセイ
された組織中にも存在することを示す（以下を参照のこ
と）。
【００８１】選択培地上で成長した芽条から得られた小
さな葉の断片（2-3 mm四方）を、BAP(4 mg/l）、NAA
（0.5 mg/l）、およびハイグロマイシン（10 mg/l）を
含むBM培地上で3ー4週間培養した。緑色をとどめるこれ
らの葉の断片、生成されたカルス、根、あるいは芽条
は、トランスジェニック植物から生じたものであること
を決定した。形質転換されなかった組織（あるいは「逸
出組織(escapes)」）は褐色に変化し、枯れた。
【００８２】ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応：DNA 遺伝子の存在は、組織試料中に存在するそのDNAをアッ
セイすることにより決定され得る。このようなアッセイ
法の２つには、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイ
およびサザンアッセイがある。
【００８３】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイ
は、２つの遺伝子、即ち、酵母デサチュラーゼコーディ
ング領域およびHPT遺伝子（ハイグロマイシン耐性を与
える）の存在について、ごく少量のDNAを分析するため
に使用された。試料あたり、ナタネ葉組織から単離され
たDNAの100 ngのみが、本質的に記載（Current Protoco
ls in Molecular Biology (1987) Ausubel, RMら編； G
reene Publishing Associates ＆ Wiley-Interscienc
e）のようにしてアッセイされた。酵母デサチュラーゼ
遺伝子のコーディング配列中の+543位おおび+1277位に
対応するプライマーは、遺伝子を含む植物中に751 bpバ
ンドとして現れるDNAフラグメントを合成した。同様に
して、HPT遺伝子の特定の部分に対するプライマーは、H
PT遺伝子を含む植物中にDNAフラグメントを合成した。
【００８４】ｃ．サザン分析 サザン分析は、試料DNA中の配列を分析するため標識プ
ローブのハイブリダイゼーションにより、試料中のDNA
の特異的配列の存在を検出する。PCRアッセイ（上記を
参照のこと）に必要とされるDNAよりも多くのDNAを必要
とする。形質転換ナタネ植物へトランスファーされた酵
母デサチュラーゼ遺伝子のコピー数もまた、サザン分析
により決定され得る。
【００８５】ナタネ組織から単離された試料あたり10 u
gのDNAを、HindIIIで消化し、本質的に記載（Current P
rotocols in Molecular Biology (1987) Ausubel, RMら
編； Greene Publishing Associates ＆ Wiley-Intersc
ience）に従ってサザン分析を行った。酵母デサチュラ
ーゼ遺伝子のコーディング配列からの、402bpおよび422
bpの２つのEcoR1タブレットを、製造業者（United Stat
es Biochemical）の指示に従って、ランダムヘキサマー
法により標識し、プローブとして使用した。
【００８６】〔実施例６〕酵母デルター9デサチュラーゼ
の種子組織中での発現 酵母デルター9デサチュラーゼの種子組織中での発現は、
DNAをmRNAに転写させ、次にmRNAをタンパク質に翻訳す
る。最終的に、この活性タンパク質は、飽和脂肪酸を不
飽和化する。従って、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝
子の種子組織中での発現の決定は、種子油中の、mRNA、
タンパク質あるいは変化した脂肪酸組成のいずれかの存
在をアッセイすることにより決定され得る。
【００８７】ａ．ポリメラーゼ連鎖反応：mRNA 酵母デサチュラーゼ遺伝子の発現は、デサチュラーゼmR
NAの存在を検出することにより、転写レベルで決定され
る。これは、Frohmanら（1988; PNAS (USA) 85: 8998-9
002）の方法を改変した、逆転写とPCRを結び付けたアッ
セイで行われる。この方法では、少量の組織を、デサチ
ュラーゼ遺伝子からのRNA転写物の存在について分析す
る。
【００８８】ｂ．ウエスタン分析 ウエスタン分析は、ゲル電気泳動による分離の後に、タ
ンパク質を標識抗体に結合することにより、タンパク質
の存在を検出する。従って、この方法は、翻訳レベルあ
るいはタンパク質レベルで、遺伝子の発現を検出する。
遺伝子の最高レベルの発現が予測されるときに、例え
ば、種子生育中に油が蓄積されるときに、組織をアッセ
イするのが好ましい。
【００８９】トランスジェニック植物からの種子を、受
粉後の種々の時間に採集する。タンパク質試料を、各植
物から10個の種子を集めて、SDSゲル緩衝液（50mMトリ
スーHCl, pH 6.8、1% SDS、2 mM DTTおよび2 mM EDTA）
中でホモジナイズして調製する。ホモジネートを、５分
間のマイクロ遠心分離により透明にする。上清画分のタ
ンパク質を10% SDS-PAGE（Laemmli, UK (1970) Nature
227: 680-685）により分離し、ニトロセルロース膜(Tow
bin, Hら、(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA76:4350
-4354)に移し、連続的な操作として、酵母デサチュラー
ゼペプチドに対し誘発されたウサギポリクローナル抗血
清にまず反応させ、次に、抗ウサギ酵素結合（アルカリ
ホスファターゼあるいはホースラディッシュパーオキシ
ダーゼ）IgGと反応させる。結合抗体を、製造業者のプ
ロトコルに従って、活性染色により可視化する。
【００９０】ｃ．脂肪酸分析 ナタネの脂肪酸組成を、下記に示す「半分の種子」分
析、「１つ／全種子」分析、あるいは「大量の種子」分
析のいずれかで決定した（例えば、脂肪酸のメチル化法
は、Craig, BMおよびMurty, NL、1959、J Amer Oil Che
m Soc 36: 549-552に報告されている方法を改変したも
のである）。
【００９１】「半分の種子」分析用に、胚から子葉組織
の一部を取り出し、分析した。残りの種子は保存し、所
望のときに発芽され得た。
【００９２】１．試料の子葉組織を、2 mlのオートサン
プラーのバイアルに入れた。
【００９３】２．nーヘプタン（500 ul）を加え、16時
間、室温でインキュベートして、油を抽出した。
【００９４】３．メタノール中のナトリウムメトキシド
（0.5 Mを50 ul）を加え、脂肪酸を室温で60分間、エス
テル交換反応させた。
【００９５】４．次に、蒸留水（20 ul）を加え、バイ
アルを、TPFEを裏打うちしたクリンプトップキャップで
蓋をした。このようにして試料は、ガス液クロマトグラ
フィーにより処理される準備が整った。
【００９６】「１つの種子」分析用に、１つの種子を2.
0 mlのオートサンプラーのバイアルに入れ、ガラス棒で
粉砕した。
【００９７】１．nーヘプタン（1.0 ml）を加え、16時
間、室温でインキュベートして、油を抽出した。
【００９８】２．nーヘプタン（3.0 ml）を加え、１時
間、室温でインキュベートして、油を抽出した。
【００９９】３．メタノール中のナトリウムメトキシド
（0.5Nを50 ul）を加え、バイアルを攪拌して、脂肪酸
を室温で60分間、エステル交換反応させた。
【０１００】４．蒸留水（20 ul）を加え、バイアルを
攪拌し、そしてTPFEクリンプトップキャップで蓋をし
た。このようにして試料は、ガス液クロマトグラフィー
により処理される準備が整った。
【０１０１】「大量の種子」分析用に、６個の黒色の、
よく実った成熟種子を選択した。
【０１０２】１．これらの種子を、16 x 100 mmの使い
捨てのガラス製試験管に入れた。
【０１０３】２．nーヘプタン（1.5 ml）を加え、種子を
組織ホモジナイザーですりつぶした。１分間、油を抽出
した。
【０１０４】３．メタノール中のナトリウムメトキシド
（0.5Nを500 ul）を加え、試験管を攪拌して、試料を5
分間インキュベートした。
【０１０５】４．蒸留水（7.0 ml）を加え、試験管を攪
拌した。
【０１０６】５．有機相の一部（1.5 ml）を2.0 mlのオ
ートサンプラーのバイアルに移し、バイアルをTPFEクリ
ンプトップキャップで蓋をした。このようにして試料
は、ガス液クロマトグラフィーにより処理される準備が
整った。
【０１０７】GLC分析を、フレームイオン化検出器およ
びChromStationインテグレーターを備えたHewlett Pack
ard 5890ガス液クロマトグラフにより行った。バイアル
中の上相の有機相からメチル化遊離脂肪酸の１ulを取り
出すために、Hewlett Packard 7376オートサンプラーを
使用し、GLCに注入した。使用したカラムは、DB-23フュ
ーズドシリカキャピラリーカラム（フィルム厚が0.24ミ
クロン、内径0.25 mmx 長さ30 mmのカラム）であった。
【０１０８】GLC分析の操作条件には、250℃のインジェ
クター温度、および300℃のディテクター温度が含まれ
た。キャリアガスは、カラム内を1.1 cm3／分の流速
で、そしてディテクター内を30 cm3／分の流速で流れる
ヘリウムであった。各クロマトグラフィーの操作は、8
分間180℃ではじめ、次に、温度を１分間に5℃上昇させ
て220℃までにし、そして4分間220℃に維持する。この
プログラムで、植物油の全ての主要な脂肪酸メチルエス
テル（パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、
オレイン酸エステル、リノール酸エステルおよびリノレ
ン酸エステル）が溶出された。さらに、モノ不飽和18ー
炭素脂肪酸メチルエステルの２つの異性体であるオレイ
ン酸エステルとcisーバクセン酸エステルが、互いに他か
ら分離された。各脂肪酸の存在比は、種子中の総脂肪酸
含有量に対する重量パーセントとして示した。
【０１０９】〔実施例７〕形質転換植物 ナタネB. napusの栽培変種であるProfitは、種子油中の
オレイン酸含有量が高い、春Canola型ナタネである。50
個の種子を分析した結果は、下記に示される表１および
表２の脂肪酸プロフィールであった。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
【表２】
【０１１２】Profitから得た組織を、上述の４つの各ベ
クターによって形質転換した。根付いた形質転換植物
を、芽条が2 cm以上に長くなったときに土に移した。植
物を、Conviron生育チャンバー内に、明16時間20℃、暗
8時間15℃で、3ー4週間維持した。次に、温室に移し、そ
こで成体になるまで生育させた。花成時に、植物を自家
受粉させ、成熟種子を採集した。
【０１１３】成熟種子中に得られる油の脂肪酸含有量
を、全種子分析、あるいは子葉の一部を分析し残りの種
子は保存して植えられ得る半分の種子分析、のいずれか
で分析した。
【０１１４】あるいは、種子中の酵母デルター9デサチュ
ラーゼ遺伝子の発現を検出するために、発育種子を採集
し、mRNAをPCRアッセイで分析するか、あるいはウエス
タンアッセイでタンパク質を検定する。
【０１１５】第三のベクターであるpH.PデルタBOPによ
って形質転換し、次に再生し、そして自家受粉したナタ
ネ組織から得られた種子の脂肪酸含有量は、形質転換し
ていない「親」植物に見られる割合と比較して、飽和脂
肪酸であるパルミチン酸およびステアリン酸の割合の有
意な減少、それに伴い、パルミトレイン酸およびオレイ
ン酸レベルの増大がある（表１参照）。このベクターで
は、酵母デサチュラーゼ遺伝子を改変ファゼオリンプロ
モーターの制御下においた。プロモーターの最初の2/3
の欠失からなるこの改変の結果、種子の発育中に、調節
された遺伝子の発現がより早期になされる。遺伝子発現
は、脂質の蓄積の間に生じ、この不飽和脂肪酸は、トリ
グリセロール生成の間に不飽和化がなされたと考えられ
る。得られた植物油は、非常に低レベルの飽和脂肪酸を
有し、現在市場に出回っている植物油に代わる望ましい
ものである。
【０１１６】他の３つのベクターのいずれかで形質転換
し、再生し、自家受粉した植物から得られた種子の脂肪
酸は、飽和脂肪酸であるパルミチン酸およびステアリン
酸が種々の割合で含まれるが、それらは形質転換されて
いない「親」植物に見られる割合と等しいかあるいはよ
り少ないものである（表２を参照のこと）。種子の発育
中に遺伝子発現を起こす調節エレメントを有するこれら
のベクターは、脂質の蓄積の間に、種々のレベルで遺伝
子を発現させる。
【０１１７】形質転換、再生、および自家受粉植物から
得た種子は、発芽し、そして花成時に自家受粉する。得
られた種子を、特性の安定性および遺伝子継承について
決定するために分析する。
【０１１８】〔実施例８〕酵母デルター9デサチュラーゼ
遺伝子の他のアブラナ属へのトランスファー 酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子を、２つの方法のう
ちの１つにより、他のアブラナへトランスファーした。
１つ方法は、他のナタネおよび油種子カラシを、上記の
ように直接形質転換する方法である。もう１つの方法
は、その特性を従来の育種法により、他のナタネおよび
油種子カラシに移す方法である。Brassicarapa、Brassi
ca napusおよびBrassica junceaは植物形質転換（上記
を参照のこと）用の植物に適している。さらに、これら
は、育種プログラムにおいて相互交配され得る。
【０１１９】このことにより、最初の脂肪酸プロフィー
ルあるいは耕種学的特性に基づいて選択されたナタネお
よび油種子カラシへ、酵母デルター9デサチュラーゼがト
ランスファーされる。酵母デルター9デサチュラーゼがト
ランスファーされたナタネおよび油種子カラシの例は、
表３にまとめてある。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子、好ま
しくは、適切なプロモーターおよび終止配列をともに有
する植物種子。酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子で種
子を形質転換することにより、種子油の脂肪酸含有量を
改変する方法。
【０１２２】本発明は、必然的に、特定の方法および物
質を参考として、明細書において議論されている。これ
らの方法および物質の列挙は、単に例を示すのみであっ
て、本発明の範囲を限定する構成要素ではない。当業者
が、本明細書に提供されている特定の教示に対する変法
あるいは代替法を、本発明の範囲を逸脱することなく、
認識しおよび実施し得ることは、予測されるべきことで
ある。
【図面の簡単な説明】
【図１】DNA配列および酵母デルター9デサチュラーゼ遺
伝子の部分制限マップを示す。デサチュラーゼ遺伝子の
推定アミノ酸配列とともにDNAのコーディングストラン
ドを示す。
【図２】プラスミドpH602の図式、および、プラスミド
の唯一のBglII部位へクローン化された酵母デルター9デ
サチュラーゼ遺伝子を有する、４つの植物発現カセット
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アシャ メーラ−パルタ アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53716, マディソン，イースト ブッキー ロード 5649

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子およ
    び植物種子中で該酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子を
    発現させるための手段を含む、植物種子。
  2. 【請求項２】 前記発現させるための手段が、前記植物
    種子中で前記酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子を発現
    させるために有効なプロモーターを含む、請求項１に記
    載の植物種子。
  3. 【請求項３】 前記プロモーターが、ファゼオリンプロ
    モーター、切り型ファゼオリンプロモーター、および35
    Sプロモーターからなる群より選択される、請求項２に
    記載の植物種子。
  4. 【請求項４】 前記プロモーターが、種子特異的プロモ
    ーターである、請求項２に記載の植物種子。
  5. 【請求項５】 前記プロモーターが、切り型ファゼオリ
    ンプロモーターである、請求項３に記載の植物種子。
  6. 【請求項６】 さらに、前記酵母デルター9デサチュラー
    ゼ遺伝子に対する終止配列を含む、請求項１に記載の植
    物種子。
  7. 【請求項７】 前記終止配列が、酵母デルター9デサチュ
    ラーゼ終止配列、ファゼオリン 3'終止配列、およびORF
    25 3'終止配列からなる群より選択される、請求項６に
    記載の植物種子。
  8. 【請求項８】 前記終止配列が、ORF 25 3'終止配列で
    ある、請求項７に記載の植物種子。
  9. 【請求項９】 前記植物種子が、単子葉植物属の種子で
    ある、請求項１に記載の植物種子。
  10. 【請求項１０】 前記単子葉植物属が、トウモロコシお
    よびモロコシからなる群より選択される、請求項９に記
    載の植物種子。
  11. 【請求項１１】 前記単子葉植物属がトウモロコシであ
    る、請求項１０に記載の植物種子。
  12. 【請求項１２】 さらに、前記植物種子がZea maizeの
    種子である、請求項１１に記載の植物種子。
  13. 【請求項１３】 前記植物種子が、双子葉植物属の種子
    である、請求項１に記載の植物種子。
  14. 【請求項１４】 前記双子葉植物属が、アブラナ（Bras
    sica）、ヒマワリ（Helianthus）、ベニバナ（Carthamu
    s）、ゴマ（Sesamum）、ダイズ（Glycine）、ナンキン
    マメ（Arachis）、ワタ（Gossypium）、Lesquerellaお
    よびルリギク（Vernonia）からなる群より選択される、
    請求項１３に記載の植物種子。
  15. 【請求項１５】 前記双子葉植物属がアブラナである、
    請求項１４に記載の植物種子。
  16. 【請求項１６】 さらに、前記植物種子が、Brassica r
    apaおよびBrassicanapusからなる群より選択される種子
    である、請求項１５に記載の植物種子。
  17. 【請求項１７】 植物種子の種子油の脂肪酸含有量を改
    変する方法であって、該植物種子を形質転換して酵母デ
    ルター9デサチュラーゼ遺伝子を発現させる工程を包含す
    る、方法。
  18. 【請求項１８】 前記改変が、前記植物種子の種子油中
    のモノ不飽和脂肪酸含有パーセントを増大させることを
    包含する、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記モノ不飽和脂肪酸が、16から24炭
    素原子の長さの炭素鎖を有する、請求項１８に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 前記モノ不飽和脂肪酸が、cis-9-ヘキ
    サデセン酸（パルミトレイン酸）、cis-9-オクタデセン
    酸（オレイン酸）、cis-11-オクタデセン酸（cis-バク
    セン酸）、cis-11-エイコセン酸、cis-13ーエイコセン
    酸、cis-13-ドコセン酸、cis-15-ドコセン酸、cis-15-
    テトラコセン酸、cis-17-テトラコセン酸およびその組
    み合わせからなる群より選択される、請求項１９に記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】 前記モノ不飽和脂肪酸が、オレイン酸
    である、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記モノ不飽和脂肪酸が、パルミトレ
    イン酸である、請求項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記モノ不飽和脂肪酸が、cis-バクセ
    ン酸である、請求項２０に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記改変が、前記植物種子の種子油中
    の飽和脂肪酸含有パーセントを減少させることを包含す
    る、請求項１７に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記飽和脂肪酸が、ミリスチン酸、パ
    ルミチン酸、ステアリン酸、エイコサン酸、ドコサン
    酸、テトラコサン酸およびその組み合わせからなる群よ
    り選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記植物種子が、単子葉植物属の種子
    である、請求項２４に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記単子葉植物属が、トウモロコシお
    よびモロコシからなる群より選択される、請求項２６に
    記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記単子葉植物属がトウモロコシであ
    る、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 さらに、前記植物種子がZea maizeの
    種子である、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記植物種子が、双子葉植物属の種子
    である、請求項１７に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記双子葉植物属が、アブラナ（Bras
    sica）、ヒマワリ（Helianthus）、ベニバナ（Carthamu
    s）、ゴマ（Sesamum）、ダイズ（Glycine）、ナンキン
    マメ（Arachis）、ワタ（Gossypium）、Lesquerellaお
    よびルリギク（Vernonia）からなる群より選択される、
    請求項３０に記載の植物種子。
  32. 【請求項３２】 前記双子葉植物属が、アブラナであ
    る、請求項３１に記載の植物種子。
  33. 【請求項３３】 さらに、前記植物種子が、Brassica r
    apaおよびBrassicanapusからなる群より選択される種子
    である、請求項３２に記載の植物種子。
  34. 【請求項３４】 前記形質転換する工程が、前記植物種
    子の未変性DNAに外来性DNAを加えることを包含し、該外
    来性DNAが、酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子および
    該酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝子に対するプロモー
    ターを含有する、請求項１７に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記形質転換する工程が、アグロバク
    テリウム、エレクトロポレーション、ポリエチレングリ
    コール（PEG）、シリコンカーバイドファイバー、粒子
    ガンおよび直接注入からなる群より選択される、形質転
    換媒介法を使用して行われる、請求項３４に記載の方
    法。
  36. 【請求項３６】 前記酵母デルター9デサチュラーゼ遺伝
    子および前記プロモーターを含有するベクターを構築
    し、該ベクターを、アグロバクテリウムの選択された株
    に入れ、そして該アグロバクテリウムから植物細胞に該
    ベクターの少なくともいくつかがトランスファーするた
    めに十分な条件下で、選択された植物細胞を該アグロバ
    クテリウムで処理し、それによって該酵母デルター9デサ
    チュラーゼ遺伝子が該植物細胞中で発現される、ことを
    さらに包含する、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記植物の種子が、酵母デルター9デサ
    チュラーゼ遺伝子および該種子中で該酵母デルター9デサ
    チュラーゼ遺伝子を発現させるための手段を含む、請求
    項１に記載の植物種子から得た植物。
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