JP3313724B2 - 脂肪酸の不飽和化酸素遺伝子，当該遺伝子を含むベクター，当該遺伝子が導入された植物及びその作出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、脂質に結合した脂肪酸のΔ９位を不飽和化
する活性を有するタンパク質（以下、Δ９位不飽和化酵
素という）をコードする遺伝子、当該遺伝子を含むベク
ター、当該遺伝子が導入された植物およびその作出方法
に関するものである。

背景技術 生物の生体膜を構成する脂質である膜脂質は外界温度
の低下に伴って、液晶状態から個体状態へと変化（相分
離）する。そして、かかる相分離に伴い生体膜の性質が
変化する。すなわち、膜脂質が固体状態では物質透過の
選択性がなくなるため、生体膜が本来の機能を果たせな
くなり、その結果細胞に傷害（低温傷害）が生ずると考
えられている。

液晶状態から固体状態あるいはその逆に変化する温度
である膜脂質の相転移温度は、主に脂質に結合している
脂肪酸アシル基の不飽和度（炭素鎖中の二重結合の数）
によって決定付けられる。すなわち、結合している脂肪
酸アシル基が二つとも飽和脂肪酸である場合、この脂質
分子種の相転移温度は室温よりも高いが、結合した脂肪
酸アシル基に二重結合を少なくとも１個持つような脂質
分子種の相転移温度は、ほぼ０℃以下である（Santare
n,J.F.et al.,Biochim.Biophys.Acta,687:231,1982）。

なお、一般に脂肪酸の二重結合の位置は、そのカルボ
キシル基末端から二重結合のある炭素までの炭素数をΔ
（デルタ）に続いて示す。また、二重結合の総数は全炭
素数の後にコロンに続いて記載する。例えば、リノール
酸は18:2Δ9,12と記述され、その構造は CH₃（CH₂）₄CH＝CHCH₂CH＝CH（CH₂）₇COOH である。また、二重結合の位置をω（オメガ）に続いて
記載する場合があるが、これは脂肪酸のメチル基末端か
ら二重結合のある炭素までの炭素数を示している。

高等植物の膜脂質の中で、飽和分子種が比較的多いの
はホスファチジルグリセロール（GP）のみであり、植物
の低温傷害の起因がPGの相転移によること（Murata,N.e
t al.,Plant Cell Physiol.,23:1071,1982;Roughan,P.
G.,Plant Physiol.,77:740,1985）、またPGの分子種組
成が葉緑体に存在するグリセロール−３−リン酸アシル
トランスフェラーゼ（以下Atase）の基質選択性によっ
て決められていること（Frentzen,M.et al.,Eur.J.Bioc
hem.,129:629,1983;Murata,N.,Plant Cell Physiol.,2
4:81,1983;Frentzen,M.et al.,Plant Cell Physiol.,2
8:1195,1988）が強く示唆されていた。

これらの仮定に基づき西澤らは、低温に強い植物のシ
ロイヌナズナから取得したATase遺伝子をタバコに導入
・発現することによりPGの飽和分子種含量を下げ、タバ
コを野生株よりも低温に対して強くすることができるこ
とを示した（PCT特許出願:PCT/JP92/0024,1992）。しか
し、ATaseは元の植物中にも存在し、かりに外来のATase
を植物中で大量発現させたとしても、内在性のATaseと
競合しあうことは避けられず、外来のATaseの効果が希
釈される可能性は否めない。例えば、作成した形質転換
タバコのうちシロイヌナズナのATaseを最も大量に発現
しているクローンの葉のPGの飽和分子種含量は約28％で
ありタバコ野生株よりも約８％少ないが、シロイヌナズ
ナ野生株よりも約８％多かった（PCT特許出願:PCT/JP92
/0024,1992）。

さらに、一般にプラスチドで作られるアシル−ACPは
主に16:0−ACPと18:1−ACPであり、またそれらの割合は
ほぼ等量であると考えられているが、組織によっては1
6:0−ACPや18:0−ACPの割合が18:1−ACPより高いことも
考えられる（Toriyama,S.et al.,Plant Cell Physiol.,
29:615,1988）。このような組織では外来のAtaseによっ
て飽和分子種含量を充分に減少させることが困難である
とも考えられる。

ところで、光合成細菌のシアノバクテリア（ラン藻）
の膜脂質の組成は、高等植物の葉緑体を構成している膜
系の脂質組成と類似している（Murata,N.et al.,in“Th
e Biochemistry of Plants",Academic Press,1987）。
またラン藻では、膜脂質に結合した脂肪酸の不飽和度
は、脂質に結合した脂肪酸を不飽和化する酵素によって
制御されている。そして、脂質に結合した脂肪酸に二重
結合を１つしか入れられないAnacystis nidulans（別名
Synechococcus PCC 7942）は低温感受性であるが（Ono,
T.et al.,Plant Physiol.,67:176,1981）、２つ以上入
れられるSynechocystis PCC6803は低温耐性であること
が知られていた（Wada,H.et al.,Plant Cell Physiol.,
30:971,1989）。

また、ラン藻における脂肪酸の不飽和化酵素は、すべ
て脂質を基質とし、脂質に結合した脂肪酸に二重結合を
導入する。従って、ラン藻は16:0/16:0−および18:0/1
6:0−の飽和分子種からなる膜脂質のPG、SQDG、MGDGお
よびDGDGの脂肪酸にcis−型の二重結合を導入すること
が可能である（Murata,N.et al.,in“The Biochemistry
of Plants",Academic Press,1987）。かかる点は脂肪
酸不飽和化酵素として、ステアロイル−ACP（18:0−AC
P）のΔ９位に二重結合を導入する酵素を有し、一旦16:
0/16:0−（および、わずかに存在する18:0/16:0−）の
飽和分子種からなるPGおよびSQDGが合成されると、これ
らの脂肪酸に決してcis−型の二重結合を導入しない高
等植物と大きく異なる点である。

現在Synechocystis PCC6803のΔ12位不飽和化酵素遺
伝子をAnacystis nidulansに導入・発現させることによ
り本来Anacystis nidulansには存在しない16:2Δ9,12お
よび18:2Δ9,12を生産させることが可能であり、結果と
して本来低温感受性であるAnacystis nidulansを低温耐
性へと転換可能であることが示されている（Wada,H.et
al.,Nature,347:200,1990）。

なお、これまでにラン藻の不飽和化酵素のうちΔ６位
（Reddy,A.S.et al.,Plant Mol.Biol.,27:293,1993）お
よびΔ12位（Wada,H.et al.,Nature,347:200,1990）不
飽和化酵素の遺伝子が取得されている。しかし、Δ９位
に二重結合が導入されていなければ、Δ６位およびΔ12
位不飽和化酵素は、それぞれΔ６位とΔ12位を不飽和化
することはできない。また、Δ９位とΔ12位がともに不
飽和化されていなければΔ15位不飽和化酵素はΔ15位を
不飽和化することはできない。従って、脂肪酸のΔ９位
を不飽和化する酵素の遺伝子を高等植物に導入し発現さ
せれば、高等植物における飽和分子種含量を低下させ、
その結果として該高等植物を低温耐性にすることができ
るはずである。しかしながら、現在まで、脂肪酸のΔ９
位を不飽和化する酵素の遺伝子は得られていなかった。

従って、本発明は、脂肪酸のΔ９位を不飽和化する酵
素の遺伝子およびその一部を含むポリヌクレオチドを提
供することを目的とする。

また、本発明は、脂肪酸のΔ９位を不飽和化する酵素
の遺伝子またはその一部を含むポリヌクレオチドを含む
ベクターを提供することも目的とする。

さらに、本発明は、脂肪酸のΔ９位を不飽和化する酵
素の遺伝子またはその一部を含むポリヌクレオチドが導
入された植物細胞および植物を提供することも目的とす
る。

発明の開示 上記目的を達成するため、本発明者は、Anacystis属
に属するラン藻のゲノムDNAからΔ９位不飽和化酵素を
コードする遺伝子をクローニングし、該遺伝子を組み込
んだベクターDNAを得た後、該ベクターDNAで植物細胞を
形質転換し、これを分化させて植物体を再生させること
により、植物に低温耐性を付与することに成功し、本発
明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の
事項を要旨とするものである。

（１） 脂質に結合した脂肪酸のΔ９位を不飽和化する
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。

（２） 脂質に結合した脂肪酸のΔ９位を不飽和化する
活性を有するタンパク質が実質的に配列番号４に記載さ
れたアミノ酸配列を有するものである（１）に記載の遺
伝子又は当該遺伝子の一部を含むポリヌクレオチド。

（３） 脂質に結合した脂肪酸のΔ９位を不飽和化する
活性を有するタンパク質コードする遺伝子が配列番号３
に記載の塩基配列を含むDNA鎖である（１）に記載の遺
伝子又は当該遺伝子の一部を含むポリヌクレオチド。

（４） （１）乃至（３）のいずれかに記載の遺伝子又
は当該遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドを含むベク
ター。

（５） （１）乃至（３）のいずれかに記載の遺伝子又
は当該遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドが導入され
た植物細胞。

（６） （５）に記載の植物細胞を分化させて植物体を
再生させることを特徴とする植物の作出方法。

（７） （１）乃至（３）のいずれかに記載の遺伝子又
は当該遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドが導入され
た植物。

図面の簡単な説明 第１図は、des 9 var断片がコードするアミノ酸配列
とマウスのステアロイル−CoA不飽和化酵素（MSCD2）の
アミノ酸配列の比較を示す。図中で両者が同一のアミノ
酸の場合は：、性質が類似したアミノ酸の場合は・を付
け比較した。Ｘは、その間での相同性が高い範囲を示
す。

第２図は、des 9 var断片をプローブとして、Anacyst
is nidulansのゲノムDANをサザン分析したオートラジオ
グラムを示す電気泳動写真である。

第３図は、λ５、λ15およびp15XのインサートDNA断
片の相互関係を示す。太い矢印はタンパク質をコードし
ている部分と方向を、細い矢印はシーケンスを決定した
部位とその方向を示す。

第４図は、des 9 nidとマウスのステアロイル−CoA不
飽和化酵素（MSCD2）のアミノ酸配列の比較を示す。ア
ミノ酸配列の比較は第１図と同様にして行った。

第５図は、植物体レベルでの形質転換タバコに対する
低温処理の影響を示す生物の形態の写真である。左は不
飽和化酵素遺伝子を導入したタバコを低温処理した結果
を、右は対照としてpBI121を導入したタバコを低温処理
した結果を示す。

発明の実施するための最良の形態 本発明にいう、Δ９位不飽和化酵素は、上記「従来の
技術」等に記載したごとく本来ラン藻に存在する酵素で
ある。Δ９位不飽和化酵素の化学構造は、マウス（Kaes
tner,K.H.et al.,J.Biol.Chem.,264:14755,1989）、ラ
ット（Mihara,K.,J.Biochem.,108:1022,1990）及び酵母
（Stukey,J.E.et al.,J.Biol.Chem.,265:20144,1990）
のステアロイル−CoA不飽和化酵素の化学構造と局所的
に類似しているが全体的には大きく異なる。また既知の
ラン藻の脂質に結合した脂肪酸のΔ６位およびΔ12位の
不飽和化酵素及び高等植物の脂質に結合した脂肪酸のω
３位の不飽和化酵素（Yadav,N.S.et al.,Plant Physio
l.,103:467,1993）の化学構造とは全く類似していな
い。本発明遺伝子を天然素材から製造する場合は、ラン
藻を原材料として使用するとよい。ここで用いられるラ
ン藻は特に限定されず、例えばAnacystis属、Synechocy
stis属、Anabaena属等に属するラン藻を挙げることがで
きる。なお、以下の理由により、高等植物の飽和分子種
を不飽和化するためにはAnacystis型（Murata,N.et a
l.,Plant Cell Physiol.,33:933,1992。この文献で言う
グループ１型のラン藻）のΔ９位不飽和化酵素の方がAn
abaena型及びSynechocystis型の酵素よりも好ましい。

すなわち、Synechocystis PCC6803とAnabaena variab
ilisでは、その膜脂質のほとんどがsn−１とsn−２にそ
れぞれ炭素数18の脂肪酸（C18）と炭素数16の脂肪酸（C
16）を結合している（Sato,N.et al.,Biochim.Biophys.
Acta,710;279,1982;Wada,H.et al.,Plant Cell Physio
l.,30:971,1989）のに対して、Anacystis nidulansでは
ほとんどがsn−１とsn−２ともにC16を結合している（B
ishop,D.G.et al.,Plant Cell Physiol.,27:1593,198
6）。従って、AnabaenaとSynechocystisのΔ９位不飽和
化酵素は主に18:0/16:0−の分子種を基質としてsn−１
の18:0を18:1Δ９に不飽和化する活性を有すると思われ
る。これに対してAnacystisのΔ９位不飽和化酵素は主
に16:0/16:0−の分子種を基質としてsn−１の16:0を16:
1Δ９に不飽和化する活性を有すると思われる。さら
に、高等植物に多く見られる飽和分子種が16:0/16:0−
であることから、高等植物の飽和分子種を不飽和化する
ためにはAnacystis型のΔ９位不飽和化酵素のほうがAna
baenaおよびSynechocystis型の酵素より適切である。

本発明遺伝子は後述する実施例に示すように、実質的
に配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有するΔ９位
不飽和化酵素をコードするものを含み、縮重コドンにお
いてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコードする
ことのできる縮重異性体を含むものである。本発明遺伝
子は、主にDNA鎖としての具体的形態を有する。なお、
「実質的に配列番号４に記載されたアミノ酸配列」と
は、配列番号４に記載されたアミノ酸配列に加えて、Δ
９位不飽和化酵素活性を有するかぎり、配列番号４に記
載されたアミノ酸配列の一部に欠失、置換、付加などが
あってもよいアミノ酸配列を含むものである。

本発明遺伝子は、上記ラン藻細胞から通常公知の手法
を用いて製造することができる。

すなわち、ラン藻細胞を培養して集積し、当該ラン藻
細胞からエタノール沈澱法等の通常公知の手法によりゲ
ノムDNAを調製し、当該ゲノムDNAを基にした遺伝子ライ
ブラリーを調製し、当該ライブラリーより所望の遺伝子
を含むクローンを選抜し、これを増幅することで製造す
ることが可能である。

ここで用いる遺伝子ライブラリー作成用ベクターとし
ては、当該ベクターとして通常用いられるものを挙げる
ことができる。具体的には、λ DASH II（Stratagene）
等のファージ;pWE15（Stratagene）等のコスミド;pBlue
script II（Stratagene）等のファージミド等を挙げる
ことができる。上記ベクターへの具体的な遺伝子導入方
法は、それぞれのベクターに応じた通常公知の方法を用
いることができる。

このようにして調製した遺伝子ライブラリーから本発
明遺伝子が導入されたクローンを選抜する。

当該選抜方法としては通常公知の選抜方法、例えば抗
体によるプラークハイブリダイゼーション法若しくはコ
ロニーハイブリダイゼーション法等の免疫学的方法はヌ
クレオチドプローブによるプラークハイブリダイゼーシ
ョン法若しくはコロニーハイブリダイゼーション法等を
用いることができる。なお、上記ヌクレオチドプローブ
の選択基準として、本発明遺伝子に類似すると推測され
る塩基配列の一部（例えば、第１図のMSCD2のアミノ酸
配列番号260から295の一部を塩基配列に読みかえたも
の）をプローブとして用いるのが好ましい。

このようにして選抜したクローンにおける本発明遺伝
子の塩基配列の決定及び確認は、通常公知の方法を用い
て行うことができる。例えば、マキサム−ギルバート法
（Maxam−Gilbert,Methods Enzymol.,65:499;1980）やM
13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
（Messing,J.et al.,Gene,19:269,1982）等により行う
ことができる。

なお、Δ９位不飽和化酵素が実際に発現しているか否
かの確認は例えば、和田らの方法（J.Bacteriol.,175:6
056,1993）に従って行うことができる。

上記のようにして塩基配列が決定された本発明遺伝子
は、通常公知の手段、例えばホスファイト法を用いた市
販のDNAシンセサイザーで合成することも可能である。

本発明遺伝子又は本発明遺伝子の一部を含みΔ９位不
飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを上記クローンから分離し、これを植物体への
遺伝子導入用ベクターに組み込み、このベクターを植物
細胞へ導入し、Δ９位不飽和化酵素を植物体中で発現さ
せることにより、所望の植物に低温耐性を付与すること
ができる。

なお、上記の遺伝子導入が可能な植物の種類には特に
制限はない。

ここでいう遺伝子導入用ベクターは、Δ９位不飽和化
酵素遺伝子が植物体中で安定に発現しうるように構成さ
れることが必要である。具体的には、プロモーター、翻
訳調節領域をコードするDNA鎖、葉緑体への転移ペプチ
ドをコードするDNA鎖、本発明遺伝子又は本発明遺伝子
の一部を含みΔ９位不飽和化活性を有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、翻訳終止コドンをコー
ドするDNA鎖及びターミネーターが適切な位置関係で組
み込まれていることが必要である。なお、本発明遺伝子
以外の遺伝子導入用ベクターの構成要素としては通常公
知のものを用いることができる。上記葉緑体への転移ペ
プチドをコードするDNA鎖としては、例えばエンドウの
リブロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼの小サブ
ユニット遺伝子を当該転移ペプチドをコードするDNA鎖
として好適に用いることができる。プロモーターとして
は、例えばカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモ
ーターを、またターミネーターとしては、例えばノパリ
ン合成酵素のターミネーターを用いることができる。

植物細胞への遺伝子導入方法としては、通常公知の方
法、例えば「“Plant genetic transformation and gen
e expression;a laboratory manual",Draper,J.et al.e
ds.,Blackwell Scientific Publications,1988」記載の
方法を用いて行うことができる。その例としては、生物
的方法であるウィルスを用いる方法、アグロバクテリウ
ムを用いる方法など、物理・化学的方法であるエレクト
ロポレーション法、ポリエチレングリコール法、マイク
ロインジェクションなどが挙げられる。これらのうち、
タバコを初めとする双子葉植物に対しては、安定な形質
転換を確実に行える点から、アグロバクテリウムを用い
る方法が好ましい。アグロバクテリウムを用いる方法に
は、野生型腫瘍プラスミドを用いる中間ベクター法（Na
ture,287（1980）,p.654;Cell,32（1983）p.1033;EMBO
J.,3（1984）P.1525）、Ｔ−DNA上の腫瘍形成遺伝子領
域を欠損させたベクターを利用する中間ベクター法（EM
BO J.,2（1983）P.2143;Bio/Technology,3（1985）p.62
9）、バイナリーベクター法（Bio/Technology,1（198
3）p.262;Nature,303（1983）p.179;Nucl.Acids Res.,1
2（1984）p.8711）などがあり、これらのいずれの方法
を用いてもよい。アグロバクテリウムを植物に感染させ
る方法としては、培養細胞への直接接種法、プロトプラ
スト共存培養法、リーフディスク法等が挙げられるが、
直接かつ容易に多数の形質転換植物体を作成することが
できるという点から、リーフディスク法を使用すること
が好ましい。

さらに、植物体を再分化させるには、MS−HF培地等の
公知の培地に選択用の抗生物質や植物成長ホルモン等を
添加した培地で培養すればよい。発根した幼植物体を土
壌に移植して栽培すれば、完全な植物体にまで成長させ
ることができる。

完全な植物体にまで成長させた形質転換植物が低温耐
性を有しているか否かについては、以下のようにして検
討することができる。

低温傷害を受けない温度（例えば25℃）で検定植物を
栽培した後、一時的に（例えば一週間）低温下（例えば
４℃）で栽培し、植物への傷害、例えば葉のクロロシス
や稔性の低下を測定すること、あるいは、低温下での生
長量を対照植物と比較することにより検討できる。

以下実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

〔実施例１〕Anabaena variabilisのΔ12位不飽和化酵
素遺伝子（desA）の上流に隣接してあるオープンリーデ
ィングフレームのDNA断片のクローニングAnabaena vari
abilis IAM Ｍ−３（東京大学分子細胞生物学研究所よ
り分譲）を、約100mlのBG−11培地（“Plant Molecular
Biology",Shaw,C.H.ed.,p.279,IRL PRESS,1988）で培
養した。25℃、1,000luxの蛍光灯下で毎分120回振とう
し、充分菌を生育させた。培養液を室温で5,000gで10分
間遠心分離することにより菌体を沈殿物として回収し
た。

ゲノムDANを調製するため、菌体を50mlのＡ液（50mM
Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0）に懸濁して洗浄し、遠心分
離することにより菌体を沈殿物として回収した。次に、
15mlのＢ液（50mM Tris−HCl,20mM EDTA,50mM NaCl,0.2
5Msucrose,pH8.0）に懸濁し、Ｂ液で溶解した40mgのリ
ゾチーム（Sigma）を加え37℃で１時間振とうした。次
にプロテナーゼＫを15mgとSDSを終濃度で１％になるよ
うに加え37℃で１晩振とうした。その後、NaClO₄を終濃
度で1Mになるように加え、さらに20mlのクロロホルム／
イソアミルアルコール（24:1）を加えて10分間振とうし
た後、遠心分離により水層を回収した。クロロホルム／
イソアミルアルコール（24:1）により再抽出した後、水
層に50mlのエタニールを加え、ゲノムDNA調製物をガラ
ス棒に巻き付けて回収した。このDNA調製物を20mlのＡ
液に溶かし、NaClを終濃度で0.1Mにし、さらにRNaseを
終濃度で50mg/mlになるように加え、37℃で１時間イン
キュベートした。次に、Ａ液で飽和した等量のフェノー
ルで２回抽出した後、水層中のゲノムDNAをエタノール
を加えることにより沈殿物として回収し、70％エタノー
ルで洗浄後、1mlのＡ液に溶かしAnabaena variabilisの
ゲノムDNA溶液とした。

坂本らはAnabaena variabilis由来の膜脂質に結合し
た脂肪酸のΔ12位不飽和化酵素遺伝子のクローニングに
ついて発表（1993年日本植物生理学会年会、講演要旨
集、No.3aFO4）した際、Δ12位不飽和化酵素遺伝子の上
流に隣接してオープンリーディングフレーム（ORF）が
存在し、これが不飽和化酵素と何らかの関係を有する可
能性を報告したが、その機能は同定されていなかった。
本発明者らはそのORFおよび機能に関心をもち、そのORF
のDNA鎖中の３箇所の塩基配列に着目して、４本のプラ
イマー（配列番号５〜配列番号８）を合成し、Anabaena
variabilisのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行なった。

上記４本のプライマーのうち、配列番号５と６に示さ
れた塩基配列を有するプライマーがセンス鎖、配列番号
７と８に示された塩基配列を有するプライマーがアンチ
センス鎖をコードし、配列番号６と７に示された塩基配
列は同一のアミノ酸配列に由来している。センス鎖およ
びアンチセンス鎖からそれぞれ任意に１種類ずつのプラ
イマーを選び、計４種類のプライマーの組み合わせでPC
Rを行なった。反応は、100μｌの反応液中にプライマー
を各20μＭ、Anabaena variabilisのゲノムDNAを１μｇ
入れ、GeneAmp PCR Kit（宝酒造）を用いて行なった。
反応の温度制御は、95℃（１分）、45℃（１分）、72℃
（２分）を１サイクルとして35サイクル行なった。但
し、１サイクル目の95℃は３分間とした。反応終了後、
反応液10μｌを２％アガロースゲルで電気泳動して合成
されたDNAを分離し分析した。その結果、配列番号６と
８に示された塩基配列を有するプライマーの組み合わせ
で合成されたDNA中に、予想される大きさ（約190bp）の
DNA断片が主要なバンドとして検出された。このDNA（以
下、des 9 varという）断片の両末端をKlenowフラグメ
ントで平滑化した後、プラスミドpTZ18R（Pharmacia）
のSma I部位にクローニングし、蛍光DNAシーケンサー
（Applied Biosystems）を用いて塩基配列を決定した。
得られた塩基配列を配列番号１に示す。この塩基配列か
ら推定されるアミノ酸配列（配列番号２）は、マウスの
ステアロイル−CoA不飽和化酵素と有意な相同性を示し
た〔第１図:des 9 var断片がコードするアミノ酸配列と
マウスのステアロイル−CoA不飽和化酵素（MSCD2）のア
ミノ酸配列の比較を示す〕。

次に、des 9 var断片をプローブとして、Anacystis n
idulansのゲノムDNAをサザン分析した。制限酵素Xho I,
Pst IおよびBamH Iの各々を単独で用いて約0.1μｇのAn
acystis nidulansのゲノムDNAを切断し、0.8％アガロー
スゲル電気泳動でDNA断片を分離後、ナイロンメンブレ
ン（Hybond−N^-;Amersham）ブロッティングした。プロ
−ブDNAはMultiprime DNA labelling Kit（Amersham）
を用いて〔α−³²P〕dCTPで標識した。６×SSPE［１×S
SPEは10mMリン酸緩衝液（pH7.0）,1mM EDTA,0.15M NaC
l］,0.2％SDSおよび100μg/mlニシン精子DNAから成る液
中で55℃、16時間インキュベーションしてプローブDNA
とメンブレンを反応させた。その後、メンブレンを２×
SSC〔１×SSCは0.15M NaCl,15mMクエン酸ナトリウム〕
中で室温、15分を２回、次いで0.1×SSC中で40℃、15分
を２回振とうして洗い、オートラジオグラフィーを行な
った。その結果、いずれかの制限酵素で切断した場合も
１本のDNA断片のみが検出された（第２図：図中、Nonは
ゲノムDNAを制限酵素で切断していないことを示す）。

〔実施例２〕des 9 var断片と相同性の高いAnacystis n
idulansゲノム中のDNA鎖のクローニング Anacystis nidulans R2−SDc（東京大学分子細胞生物
学研究所より分譲）の培養およびゲノムDNAの調製は、A
nabaena variabilisの場合と同様に行なった。約100μ
ｇのゲノムDNAをSau3A Iで部分消化した後、Molecular
Cloning 2ndedition,pp.2.85−2.87（Sambrook,J.et a
l.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,1989）の方法
に従って、ショ糖密度勾配下での超遠心分離により約９
から23kbpのDNA断片を回収した。これをBamH IとHind I
IIで切断したラムダファージベクターλ DASH II（Stra
tagene）にクローニングした後、ファージ粒子にパッケ
ージングしAnacystis nidulansのゲノムDNAライブラリ
ーを得た。このファージライブラリーを大腸菌P2392に
感染させ、NZYM培地を入れた直径的15cmのシャーレにま
いて総数約10万個のプラークを形成させた後、ナイロン
メンブレン（Hybond−N⁺;Amersham）にブロッティング
した。上記のサザン分析と同様に、〔α−³²P〕dCTPで
標識したdes 9 var断片をこのメンブレンと反応させ、
オートラジオグラフィーによって検出した陽性ファージ
を再度同様にスクリーニングすることにより、シグナル
強度の異なる約30個のファージクローンを得た。この中
から任意に12クローンを選び、常法に従ってファージDN
Aを得た。得られたファージDNAを数種類の制限酵素で切
断し、0.8％アガロースゲル電気泳動で分離後、ナイロ
ンメンブレンにブロッテイングした。このメンブレンを
上記のスクリーニングと同じ条件でサザン分析し、プロ
ーブDNAとハイブリダイズするDNA断片の長さとそのシグ
ナル強度を比較した。その結果、λ５とλ15の２クロー
ンが最も強いシグナルを示し、またインサートDNA断片
の長さもそれぞれ11および15kbpであったため目的のORF
全体を含むのに十分と判断し、この２クローンのインサ
ートDNAにつき更に幾つかの制限酵素で切断してサザン
分析を行なった。その結果Xho Iで切断しハイブリダイ
ズすると、２クローンとも約5kbpのDNA断片が検出され
たので、これをpBluescript SK−（Stratagene）のXho
Iサイトにサブクローニングし、λ５とλ15由来のDNA断
片をそれぞれ含むプラスミドp5Xとp15Xを得た。p5Xとp1
5Xの詳細な制限酵素地図を作り比較したところ、ともに
同一のゲノムDNA断片を含むと判断された〔第３図：λ
５、λ15およびp15XのインサートDNA断片の相互関係を
示す。網かけした長方形はスクリーニングの過程でプロ
ーブのdes 9 var断片がハイブリダイズしたDNA断片を示
す。太い矢印はdes 9 nid（後述）の領域とセンス鎖の
方向を示す。細い矢印はdes 9 nidを含む領域のシーケ
ンスの方向を示す。5,1.25および0.5kbpの各バーは左の
各図におけるサイズマーカーを示す。制限酵素の略号
は、B,BamH I;H,Hind III;N,Not I;Hp,Hpa I;RI,EcoR
I;RV,EcoR V;S,Sal I;P,Pst I;X,Xho Iを示す〕。

そこで、制限酵素あるいはExo IIIによるディリーシ
ョンプラスミドをp15Xより作成し、des 9 var断片がハ
イブリダイズする領域を含む約2kbpのDNA断片の塩基配
列を蛍光DNAシーケンサーを用いて決定した（第３
図）。その結果そのDNA断片中には834bpからなるORF（d
es 9 nid）が存在し（配列番号３）、278残基のアミノ
酸がコードされていると推定された（配列番号４）。先
にクローニングしたAnabaena variabilis由来のdes 9 v
ar断片がコードしているアミノ酸配列（配列番号２）と
の相同性は約80％であった。さらに、核酸およびアミノ
酸配列の解析ソフト（GENETYX;ソフトウエア開発）と核
酸およびアミノ酸配列のデータベース（EMBLおよびDDB
J）を用いて相同性の高いアミノ酸配列の検索を行なっ
たところ、マウスのステアロイル−CoA不飽和化酵素と
の相同性が全体では約30％であるが局所的に非常に高い
こと〔第４図:des 9 nidとマウスのステアロイル−CoA
不飽和化酵素（MSCD2）のアミノ酸配列の比較〕から、
取得したdes 9 nidは脂肪酸を不飽和化する酵素をコー
ドすることが強く示唆された。

〔実施例３〕 des 9 nid遺伝子の大腸菌での発現によ
る活性測定 Anacystis nidulansは不飽和化酵素として脂質に結合
した飽和脂肪酸の９位を不飽和化するΔ９位不飽和化酵
素活性しか持たない（Bishop,D.G.et al.,Plant Cell P
hysiol.,27:1593,1986）ため、des 9 nidがコードする
ポリペプチドを大腸菌で発現させ活性測定することを試
みた。

p15Xから直接発現させることは困難なので、大腸菌で
の発現用のベクターを作成した。即ち、ベクターとして
pET3a（Novagen）用い、そのNde IとBamH Iの間にdes 9
nidをアミノ末端に余計なアミノ酸を付けない用にして
クローニングすることを以下のようにして行なった。de
s 9 nidのコードするタンパクのＣ末端側直後にBamH I
サイトを入れるために、Ｃ末端を鋏む２箇所の塩基配列
を使ってPCR反応を行なった。即ち、 p15Xを鋳型として上記の２つのプライマーを用いてPC
R反応を行なうと約140bpの産物が得られ、これをpUC19
のSma I部位にサブクローニングして塩基配列に間違い
のないことを確認した。この結果得られたプラスミドの
BamH Iの下流にはEcoR I部位が生じた。これをEcoR Iと
Pst Iで順に切断し、一方、p15Xも同じ制限酵素で切断
することにより、ストップコドンの直後にBamH I部位を
導入した。このプラスミドをSal Iで切断した後、４種
のdNTP存在下でDNAポリメラーゼKlenow断片を用いてFil
ll in反応を行ない、引き続きHind IIIで切断した。こ
れに、以下の２種の合成DNAから成るアダプターを導入
する事によりアミノ末端側にNde I部位を導入した。即
ち、 を等モル量混合しアダプターとした。以上のようにして
出来たプラスミド（pDes9Nde）を、常法（Molecular cl
oning pp.250−251;1982）に従って調整した大腸菌株BL
21（DE3）（Novagen）のコンピテントセルに導入し、ア
ンピシリン耐性による選別により形質転換株BLDES1を得
た。

BLDES1及びpET3aのみを有するBL21株（BL1）を100ml
のM9培地（200μg/mlのアンピシリン,4mg/mlグルコー
ス、10μM FeCl3,0.5μg/mlビタミンB1,1mg/mlカザミノ
酸を含む）に接種し、37℃で培養した。培養液の濁度
が、波長600nmで0.5O.D.になるまで培養を続けた後、イ
ソプロピルチオガラクトシド（IPTG）を最終濃度1mMに
なるように加えた。更に１時間培養し、Δ９位不飽和化
酵素遺伝子の発現を誘導した。回収した大腸菌ペレット
を1.2％ NaClで洗った後、脂質を抽出した。脂質はBlig
hとDyerの方法（Can J.Biochem.Physiol.,37:911,195
9）に従って抽出し、2.5mlの５％塩酸メタノールで完全
密封化して85℃２時間半反応させ脂肪酸をメチル化し
た。生じた脂肪酸メチルエステルを2.5mlのヘキサンで
４回抽出し、窒素ガスで溶液を除去して濃縮した。脂肪
酸メチルエステルの分析には、ガスクロマトグラフィー
を用いた。脂肪酸の同定は標準脂肪酸メチルとの保持時
間を比較して行なった。定量にはクロマトパックＣ−R7
A plus（島津製作所）を用いた。結果を次の第１表に示
す。

ここで時間はIPTGによるタンパクの誘導時間を示す。

BLDES1では16:1が増加していることが明らかである。
即ち、本遺伝子は16:0への不飽和化活性を有することが
示された。

また、これらの菌株を0.1mMのステアリン酸を含むM9
培地で培養し、同様に比較したところ、BL1株に比べBLD
ES1では16:1のみならず、18:1（９）も生成し、des 9 n
idがコードするペプチドは16:0ばかりではなく18:0も基
質として不飽和脂肪酸を作出することが示された。

〔実施例４〕 des 9 nid遺伝子のタバコ植物体への導
入 Anacystis nidulans由来のdes 9 nid遺伝子を次のよ
うにしてタバコに組み込んだ。

（１）植物発現ベクタープラスミドの構築 pDes9NdeをSac IとSal Iで切断する事により両酵素の
切断部位で挾まれたdes 9 nid遺伝子断片が得られる。
一方、エンドウのRuBisCO遺伝子を含むクローンpSNIP9
（Schreicherら、EMBO J.4,25（1985））から葉緑体へ
のtransit配列をHind IIIとSph Iで切り出し、それと同
一の制限酵素で切断したpUC118にクローニングすること
により、transit配列の下流にマルチクローニングサイ
トを有するプラスミド（pTRA3）を得た。このHind III
サイトを切断後Klenow酵素でFillinしXba Iリンカーを
いれた（pTRA3X）。このプラスミドpTRA3XをSal IとSac
Iで切断し、さきに同一の制限酵素で切断する事によっ
て得たdes 9 nid遺伝子断片を挿入した（pTRA3Xdes
9）。このプラスミドではRuBisCOのtransit配列に引き
続き、それと同一の読み枠でdes 9 nid遺伝子が翻訳さ
れる。これをSac IとXba Iで切断して次に述べる植物用
のベクターに挿入する。植物発現型バイナリープラスミ
ドpB I 121（Clonetech）を制限酵素Sac IとXba Iで切
断して得たプラスミドpB I（−GUS）はβ−Glucuronida
se遺伝子（GUS遺伝子）を含んでおらず、これにカリフ
ラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターとノパリン
合成酵素（NOS）ターミネーターの間に前述した導入遺
伝子を挿入することにより、植物への導入用ベクター
（pB I 121（−GUS）Rbsc−bes9）を得た。

（２）pB I 121（−GUS）Rbsc−bes9のアグロバクテリ
ウムへの導入 Agrobacterium tumefaciens LBA4404（Clonetech）を50
mlのYEB培地（11当たりビーフエスキ5g、酵母エキス1
g、ペプトン1g、ショ糖5g、2mM MgSO4（pH7.4））に接
種し、28℃で24時間培養後、培養液を3,000rpm、４℃、
20分の遠心で集菌した。菌体を10mlの1mM Hepes−KOH
（PH7.4）で３回洗った後、3mlの10％グリセロールで１
回洗い、最終的に3mlの10％グリセロールに懸濁してDNA
導入用アグロバクテリウムとした。

このようにして得た菌液50μｌ及び前記のプラスミド
pB I 121（−GUS）Rbsc−bes9 1μｇをキュベットに入
れ、エレクトロポレーション装置（Gene Pulser;BioRa
d）を用いて25μＦ、2500V、200Ωの条件で電気パルス
をかけ、プラスミドDNAをアグロバクテリウムに導入し
た。この菌液をエッペンドルフチューブに移し、800μ
ｌのSOC培地（11当たりトリプトン20g、酵母エキス5g、
NaCl 0.5g、2.5mM Kcl、10mM MgSO4,10mM MgCl2,20mMグ
ルコース、pH7.0）を加え、28℃で1.5時間静置培養し
た。この培養液50μｌを、100ppmのカナマイシンを含む
YEB寒天培地（寒天1.2％）上にまき、28℃で２日間培養
した。

得られたコロニー群からシングルコロニーを選び、こ
のコロニーからアルカリ法でプラスミドDNAを調整し
た。このプラスミドDNAを適当な制限酵素で消化後、１
％アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、32P
でラベルしたdes 9 nid遺伝子断片をプローブとしたサ
ザン分析により、プラスミドpB I 121（−GUS）Rbsc−b
es9を含んでいることを確認した。このAgrobacterium t
umefaciensをALBBSDESと呼ぶ。

（３）タバコの形質転換 上記の菌株ALBBSDESを、50ppmのカナマイシンを含むL
B液体培地で28℃、２日振とう培養した。培養液1.5mlを
10,000rpm、３分間遠心して集菌後、カナマイシンを除
くために1mlのLB培地で洗浄した。更に10,000rpm、３分
間遠心して集菌後、1.5mlのLB培地に再懸濁し感染用菌
液とした。

タバコへの感染に当たっては、若い葉を採取し、0.5
％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に10分間浸せき後、滅菌
水で３回洗い、滅菌済みの濾紙上で水を拭って感染用の
葉とした。この葉を１片が1cm²になるようにメスで無菌
的に切断し、上記のアグロバクテリウムの菌液上に葉の
裏を上にして置き、２分間静かに振とうした後、滅菌済
みの濾紙上に葉を置いた過剰のアグロバクテリウムを除
いた。シャーレ内のMS−B5培地（ベンジルアデニン1.0p
pm、ナフタレン酢酸0.1ppm、及び寒天0.8％を含む）（M
urashige,T.and Skoog,F.Plant Physiol.,15:473,（196
2））上に、ワットマンNo.1濾紙（φ7.0cm）を置き、こ
の濾紙に裏を上にして葉を置いた。シャーレをパラフィ
ルムでシールし、16時間明、８時間暗の周期で25℃、２
日間培養した。ついでクラフォラン250ppmを含むMS−B5
培地上に移し、同様に10日間培養してアグロバクテリウ
ムを除去した。更にクラフォラン250ppm及びカナマイシ
ン100ppmを含むMS−B5培地上に置床し、同様に７日間培
養した。この間に葉片の周囲がカルス化し、シュート原
基が生じた。更に10日間培養後、伸張したシュートをク
ラフォラン250ppm及びカナマイシン100ppmを含むMS−HF
培地（ベンジルアデニン及びナフタレン酢酸を含まない
MS−B5培地）に置床した。10日間培養後、発根したシュ
ートをカナマイシン耐性の形質転換体とし、プラントボ
ックス内のクラフォン250ppmを含むMS−HF培地に移植し
た。

〔実施例５〕形質転換タバコのゲノムサザン及びノーザ
ン分析 目的遺伝子の導入を確認するため、カナマイシン耐性
のタバコからDNAを抽出し、サザン及び分析を行った。
ゲノムDNAの抽出法はCTAB法で成書（Rogere,S.O.＆ Ben
dich,A.J.;Plant Molecular Biology Manual A6;1（198
8））に従って行なった。即ち、2gのタバコの葉を液体
窒素内で粉砕し、CTAB抽出緩衝液でゲノムDNAを得た。1
0μｇのDNAを制限酵素EcoR IとXba Iで切断後0.7％アガ
ロースゲルで電気泳動し、その後ナイロン膜（Hybond N
＋;Amersham）に0.4N NaOHで転写した。この膜にpTRA3X
des9からtransit付きの不飽和化酵素遺伝子をプローブ
として、、65℃で16時間ハイブリダイゼーションするこ
とにより目的遺伝子がタバコゲノムに組み込まれている
ことを確認した。

また、導入遺伝子の発現を調べるために、タバコの葉
約2gからRNAの分析を行なった。方法はグアニジウムチ
オシアン酸による抽出を行ない（Nagy,F.ら:Plant Mole
cular Biology Manual B4;1（1988））、poly（Ａ）＋R
NAをホルムアルデヒド入りのアガロースゲルで電気泳動
後、ナイロン膜（Hybond N;Amersham）に転写し、サザ
ン法と同様のハイブリダイゼーションにより分析した。
様々の量のRNAを発現している個体があったが、その中
から発現量の多い個体について脂質分析を行なった。

〔実施例６〕形質転換タバコ脂質の脂肪酸分析 実施例５でRNAの高発現が確認されたタバコ形質転換
体、及び対照としてpB I 121で形質転換したタバコの葉
から、以下の方法によりホスファチジルグリセロール
（PG）、スルフォキノボシルジアシルグリセロール（SQ
DG）等の脂質を調整し、その脂肪酸組成を分析した。な
お、一部の個体からは根の脂質も分析した。

（１）全脂質の抽出 脂質の抽出はBligh−Dyer法（Can J.Biochem.Physio
l.,37:911,1959）で行なった。湿重量2gの葉（一部の根
を試料とするときは1g）をメスで細断し、これに20mlの
クロロホルム：メタノール（1:2、体積比）を加え、ホ
モジナイザーで葉を破砕後、15分間静置した。これにク
ロロホルム12ml及び蒸留水12mlを加え激しく混合した
後、3000rpm、４℃、30分間の遠心で水層と有機層の２
層に分け、有機層（下層）を回収した。これに適当量の
エタノールを加えて、ロータリーエバポレーターを用
い、30℃減圧下で溶媒を除いた。これを2mlのクロロホ
ルム：メタノール（1:4、体積比）に溶かし、全脂質抽
出物とした。この一部を５％メタノール性塩酸を用いて
後述の方法により処理することで、メチル化脂肪酸を得
た。

（２）脂質の分画 DEAE−Toyopearl 650（東ソー）の懸濁液2.5mlを1M酢
酸ナトリウム水溶液（pH7.0）25mlと混ぜ酢酸型とし
た。これを、蒸留水、メタノールで順次洗浄し、最後に
メタノールに懸濁して、内径2cmのカラムに高さ1.5cmま
で詰め、更に50mlのクロロホルム：メタノール（1:4、
体積比）で洗浄した。

次に全脂質抽出物をカラムにかけ、50mlのクロロホル
ム：メタノール（1:4、体積比）でモノガラクトシルジ
アシルグリセロール（MGDG）、ジガラクトシルジアシル
グリセロール（DGDG）、ホスファチジルエタノールアミ
ン（PE）、ホスファチジルコリン（PC）を溶出して、中
性脂質（MGDG、DGDG、PE、PC）画分とした。次に5mlの
酢酸でホスファチジルセリン（PS）を溶出して除き、20
mlのクロロホルム：メタノール（1:4、体積比）で酢酸
を洗浄した後、50mlのクロロホルム：メタノール:10M酢
酸アンモニウム水溶液（20:80:0.2、体積比）でPG、SQD
G、ホスファチジルイノシトール（PI）を含む画分を得
た。この画分に15mlのエタノールを加え、減圧下で溶媒
を除いた。これを0.2mlのクロロホルム：メタノール
（2:1、体積比）に溶かし、酸性脂質（PG、SQDG、PI）
画分とした。

MGDG、DGDG、PE、PC画分は、ケイ酸カラムクロマトグ
ラフィー（イアトロビーズ、ヤトロン社）により、さら
に分画した。即ち、クロロホルム1mlに溶かした試料を
クロロホルムで平衡化したカラムにかけ、クロロホル
ム：アセトン（4:1）、アセトン、メタノールで順に溶
出すると、糖脂質（MGDG、DGDG）はアセトンで、リン脂
質（PC、PE）はメタノールで溶出された。

（３）薄層クロマトグラフィー（TLC）によるPGの単離
精製と脂肪酸分析 （２）で得た画分をシリカゲルーTLCプレート＃5721
（Merck）で分離した。展開溶媒としては、酸性脂質の
場合はクロロホルム：アセトン：メタノール：酢酸：水
（50:20:10:15:5、体積比）を、中性脂質の場合はクロ
ロホルム：メタノール：水（70:21:3、体積）を用い
た。TLCで分離後、プリムリン（80％アセトン溶液）を
噴霧して紫外線光下で蛍光発色させ、標準となる脂質と
移動度を比較することにより各クラスの脂質の画分を推
定し、発色した脂質をシリカゲルごと削り取りネジ栓付
試験管に入れた。この脂胞酸組成を推定する場合には、
この試験管に3mlのメタノール性５％塩酸を加え、完全
密封下85℃で２時間半反応させ、脂肪酸メチル化した。
一方、sn−１、２ごとの脂肪酸組成を決めるために、削
り取ったシリカゲルから5mlのクロロホルム：メタノー
ル（2:1）混液で脂質を回収し、乾固した後、1mlの50mM
TrisCl（pH7.2）及び0.05％Triton X−100を加え、激
しく攪拌して脂質を分散させて、クモノスカビ（Rhizop
us delemar）由来のリパーゼ（2500U;ベーリンガー社）
を加え37℃で30分間保温することにより選択的にsn−１
位の脂肪酸を分解させた。この反応産物を濃縮後、TLC
（クロロホルム：アセトン：メタノール：酢酸：水＝1
0:4:2:3:1）により未反応の脂質、リゾ体、及び脂肪酸
に分離した。これらのゲルから回収し前述のようにメタ
ノール性塩酸でメチル化脂肪酸を得た。生じた脂肪酸メ
チルエステルを3mlのヘキサンで４回抽出し、減圧下で
溶媒を除去して濃縮した。脂肪酸メチルの分析には、ガ
スクロマトグラフィーを用いた。脂肪酸の同定は標準脂
肪酸メチルとの保持時間を比較して行なった。定量には
クロマトパックＣ−R7A plus（島津製作所）を用いた。
全脂質の結果を第２表、PGについて第３表、その他の代
表的な脂質ごとの分析結果を第４表に示す。表は、対照
植物体については２個体に、形質転換体については独立
した２又は３個体の分析値の平均値を示している。

PGに結合した脂肪酸分析の結果から、Anacystis nidu
lans由来の脂肪酸不飽和化酵素を発現している形質転換
タバコでは16:0（パルミチン酸）が大幅に減り、そのか
わりに16:1cisが増えている事、また、少量在った18:0
もほとんど無くなり、逆に18:1が増えていることが判明
した。その結果、飽和脂肪酸（16:0＋16:1trans＋18:0
（ステアリン酸））含量は、対照のタバコでは70％であ
るのに対し、不飽和化酵素の遺伝子を形質転換したタバ
コでは55％と著しく低くなっている。PGのsn−１、２位
別の分析結果から、sn−２は98％以上飽和脂肪酸（16:0
又は16:1trans）で占められており、新たに遺伝子導入
により生成した16:1はすべてsn−１にあることが判明し
た。従って、この不飽和化酵素遺伝子を形質転換したタ
バコのPGのsn−１位の飽和脂肪酸は極めて少なくなって
いることが明らかである。従って、sn−１、２両位共
に、飽和脂肪酸から成る、所謂、飽和分子種の量も大幅
に減少し、脂質の分子種の組成上著しく低温に耐性な型
に変化した事がわかる。

一方、その他の脂質のMGDG、DGDG、SQDG、PC、PE、PI
でも、16:0の減少と、それに呼応した16:1の10％前後の
増加が明らかであり、また、18:0の不飽和化も進んでい
た。このうち、MGDGとDGDGについては16:1の生成は主と
してsn−１位にあったが、sn−２位からも少量検出され
た。MGDG、DGDG、SQDG及びPGは主に葉緑体に存在する脂
質であり、ラン藻であるAnacystis nidulansの不飽和化
酵素を高等植物の葉緑体で発現させることにより驚くほ
ど不飽和化が進展したことがわかる。それにも増して、
これらの４種の脂質はAnacystis nidulansの膜にも存在
する物であり、不飽和化の基質になる可能性は高かった
が、それ以外のPC、PE及びPIはAnacystis nidulansの膜
には存在しない脂質であり、しかも高等植物では主に葉
緑体外に存在する脂質であることから、それらにおいて
もパルミチン酸、及びステアリン酸が不飽和化されたの
は驚くべきことである。

このように、形質転換タバコの脂質分析の結果から、
Anacystis nidulans由来の脂肪酸不飽和化酵素が、高等
植物であるタバコの形質転換体において、ほとんど総て
の脂質の16:0と18:0を極めて効率良く不飽和化できるこ
とを本実施例は証明した。

また、根の全脂質について、脂肪酸分析をした結果を
第５表に示す。

この結果から、Anacystis nidulans由来の脂肪酸不飽
和化酵素は、驚くべきことに、葉のみならず根において
も16:0と18:0の不飽和化を触媒したことがわかる。この
ことは、本発明の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が植物の低
温耐性を変化させる可能性ばかりでなく、不飽和脂肪酸
含量を増やす可能性を有し、植物を油の原料とする産業
においても有用であることを示す。

〔実施例７〕形質転換タバコの低温耐性試験 上記のRNAの発現解析及び脂質分析で有望と思われた
個体については、自殖することにより次世代の種子を採
取した。その一部をカナマイシン800ppmを含むMS−HF培
地に蒔き、25℃、16時間明、８時間暗の日長で２週間栽
培後にカナマイシン耐性の実生を選抜した。この実生を
プラントボックスに移植して、更に４週間栽培した。ま
た、コントロールとして、pB I 121により形質転換した
個体についても、上記の操作を行った。

次に、４℃連続光のもとで11日間低温処理した後、25
℃で２日間栽培した。その結果、コントロール植物（pB
I 121により形質転換した植物）では葉に対して大幅な
萎縮症状及びクロロシスが観察されたのに対し、形質転
換植物ではほとんど傷害は観察されなかった。従って、
不飽和化酵素遺伝子の導入により低温耐性が向上したと
推定された。

産業上の利用可能性 本発明のΔ９位不飽和化酵素をコードする遺伝子を植
物に導入することにより、植物に低温耐性を付与するこ
とおよび植物中の不飽和脂肪酸含量を増やすことが可能
となった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 欧州特許出願公開561569（ＥＰ，Ａ １) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 265，Ｎｏ．33，Ｐ．20144−20149 （1990) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 A01H 1/00 A01H 5/00 C12N 5/10 C12N 9/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】脂質に結合した脂肪酸のΔ９位を不飽和化
   する活性を有し、実質的に配列番号４に記載されたアミ
   ノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオ
   チド、又は脂質に結合した脂肪酸のΔ９位を不飽和化す
   る活性を有するタンパク質をコードするそのフラグメン
   ト。
2. 【請求項２】脂質に結合した脂肪酸のΔ９位を不飽和化
   する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオ
   チドであって、配列番号３に記載の塩基配列を含むDNA
   鎖である前記ポリヌクレオチド、又は脂質に結合した脂
   肪酸のΔ９位を不飽和化する活性を有するタンパク質を
   コードするそのフラグメント。
3. 【請求項３】請求の範囲第１項又は第２項記載のポリヌ
   クレオチド又はそのフラグメントを含むベクター。
4. 【請求項４】請求の範囲第１項又は第２項記載のポリヌ
   クレオチド又はそのフラグメントが導入された植物細
   胞。
5. 【請求項５】低温耐性を向上させるために、請求の範囲
   第１項又は第２項記載のポリヌクレオチド又はそのフラ
   グメントが導入された、請求の範囲第４項記載の植物細
   胞。
6. 【請求項６】請求の範囲第４項又は第５項記載の植物細
   胞を分化させて植物体を再生させることを特徴とする植
   物の作出方法。
7. 【請求項７】作出された植物の低温耐性が向上する、請
   求の範囲第６項記載の方法。
8. 【請求項８】請求の範囲第１項又は第２項記載のポリヌ
   クレオチド又はそのフラグメントが導入された植物。
9. 【請求項９】低温耐性を向上させるために、請求の範囲
   第１項又は第２項記載のポリヌクレオチド又はそのフラ
   グメントが導入された、請求の範囲第８項記載の植物。