DE10030976A1 - DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren - Google Patents
DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter FettsäurenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren. Die Erfindung betrifft die Herstellung eines transgenen Organismusses, bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit DELTA6-Doppelverbindungen aufgrund der Expression einer DELTA6-Desaturase aus Moos. DOLLAR A Außerdem betrifft die Erfindung transgene Organismen, die ein DELTA6-Desaturasegen enthalten, sowie die Verwendung der im Verfahren hergestellten ungesättigten Fettsäuren bzw. Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren
zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren sowie ein Verfahren
zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an
ungesättigten Fettsäuren. Die Erfindung betrifft die Herstellung
eines transgenen Organismusses bevorzugt einer transgenen Pflanze
oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an
Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Δ6-Doppelbindungen aufgrund
der Expression einer Δ-6-Desaturase aus Moos.
Außerdem betrifft die Erfindung transgene Organismen, die ein
Δ6-Desaturasegen enthalten, sowie die Verwendung der im Verfahren
hergestellten ungesättigten Fettsäuren bzw. Triglyceride mit
einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren.
Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen
in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und
im Pharmabereich. Je nachdem ob es sich um freie gesättigte oder
ungesättigte Fettsäuren oder um Triglyceride mit einem erhöhten
Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind
sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet, so werden
beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren Babynahrung zur
Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Hauptsächlich werden die ver
schiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie
Mortierella oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps,
Sonnenblume und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form
ihrer Triacylglyceride anfallen. Sie können aber auch aus Tieren
wie Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden vor
teilhaft durch Verseifung hergestellt.
Je nach Anwendungszweck sind Öle mit gesättigten oder ungesättig
ten Fettsäuren bevorzugt, so sind z. B. in der humanen Ernährung
Lipide mit ungesättigten Fettsäuren speziell mehrfach ungesättig
ten Fettsäuren bevorzugt, da sie einen positiven Einfluß auf den
Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Möglichkeit einer
Herzerkrankung haben. Auch eine positive Wirkung auf die Carcino
genese wird den ungesättigten Fettsäuren zugeschrieben. Sie
sind außerdem wichtige Ausgangsstoffe für die Synthese von
Verbindungen, die wichtige biologische Vorgänge innerhalb des
Organismus steuern. Sie finden deshalb in verschiedenen
diätischen Lebensmitteln oder Medikamenten Anwendung.
Aufgrund ihrer positiven Eigenschaften hat es in der Vergangen
heit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese
von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Her
stellung von Ölen in verschiedenen Organismen mit geändertem
Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So
wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ9-Desaturase
beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ15-Desaturase in
WO 94/11516 wird eine Δ12-Desaturase beansprucht. Δ6-Desaturasen
werden in Girke et al. (The Plant Journal, 15, 1998: 39-48),
Napier et al. (Biochem. J., 330, 1998: 611-614), Murata et al.
(Biosynthesis of γ-linolenic acid in cyanobacterium Spirulina
patensis, pp 22-32, In: γ-linolenic acid, metabolism an its roles
in nutrition and medicine, Huang, Y. and Milles, D.E. [eds.], AOC
Press, Champaign, Illinois), Sayanova et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 94, 1997: 4211-4216), WO 98/46764, Cho et al. (J. Biol.
Chem., 274, 1999: 471-477), Aki et al. (Biochem. Biophys. Res.
Commun., 255, 1999: 575-579), und Reddy et al. (Plant Mol. Biol.,
27, 1993: 293-300) beschrieben. Weitere Desaturasen werden
beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582,
WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol.
Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990:
200-203 oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659 beschrieben.
Weitere Δ6-Desaturasen werden in WO 93/06712, US 5,614,393,
US 5,614,393, WO 96/21022, WO 00/21557 und WO 99/27111 beschrieben.
Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen
ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als
membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und
charakterisieren sind (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71,
1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26,
1988: 777-792). In der Regel erfolgt die Charakterisierung
membrangebundener Desaturasen durch Einbringung in einen
geeigneten Organismus, der anschließend auf Enzymaktivität
mittels Edukt- und Produktanalyse untersucht wird. Die An
wendung zur Produktion in transgenen Organismen beschrieben
wie in WO 98/46763, WO 98/46764, WO 98/46765. Dabei wird auch die
Expression verschiedener Desaturasen wie in WO 99/64616 oder
WO 98/46776 und Bildung polyungesättigter Fettsäuren beschrieben
und beansprucht. Bezüglich der Effektivität der Expression von
Desaturasen und ihren Einfluß auf die Bildung polyungesättigter
Fettsäuren ist anzumerken, daß durch Expression einer einzelnen
Desaturase wie im vorgenannten Stand der Technik beschrieben
lediglich geringe Gehalte an ungesättigten Fettsäuren beispiels
weise an Δ-6 ungesättigten Fettsäuren/Lipiden wie z. B. γ-Linolen
säure erreicht wurden und werden.
Nach wie vor besteht daher ein großer Bedarf an neuen und besser
geeigneten Genen, die für Enzyme codieren, die an der Biosynthese
ungesättigter Fettsäuren beteiligt sind und es ermöglichen, diese
in einem technischen Maßstab herzustellen. Weiterhin besteht
nach wie vor ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Gewinnung
möglichst hoher Gehalte an polyungesättigten Fettsäuren.
Es bestand daher die Aufgabe ein Verfahren zur Herstellung
von ungesättigten Fettsäuren unter Verwendung von Genen, die
beispielsweise für Desaturase-Enzyme codieren und die an der
Synthese mehrfach ungesättigter Fettsäuren in den Samen einer
Ölsaat beteiligt sind, bereitzustellen und so den Gehalt poly-
ungesättigter Fettsäuren zu erhöhen. Diese Aufgabe wurde durch
ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
gelöst, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine isolierte
Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Δ6-Desaturase
aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dar gestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 ableiten,
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist,
in einen Organismus eingebracht wird, dieser Organismus angezogen
wird, wobei der angezogene Organismus mindestens 1 Mol-% unge
sättigte Fettsäuren bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt
im Organismus enthält.
Unter Anzucht des Organismus ist die Kultivierung von Pflanzen
ebenso zu verstehen wie die Anzucht von eukaryontischen oder
prokaryontischen Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Pilzen,
Ciliaten, Algen, Cyanobakterien, tierischen oder pflanzlichen
Zellen oder Zellverbänden oder die Anzucht von Tieren.
Die in den im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Organismen
enthalten in der Regel ungesättigte Fettsäuren in Form von
gebundenen Fettsäuren, das heißt die ungesättigten Fettsäuren
liegen überwiegend in Form ihrer Mono-, Di- oder Triglyceride,
Glycolipide, Lipoproteine oder Phospholipide wie Öle oder Lipide
oder sonstig als Ester oder Amide gebundenen Fettsäuren vor.
Auch freie Fettsäuren sind in den Organismen in Form der freien
Fettsäuren oder in Form ihrer Salze enthalten. Die freien oder
gebundenen ungesättigten Fettsäuren enthalten vorteilhaft gegen
über den Ausgangsorganismen einen erhöhten Gehalt an Fettsäuren
mit Δ6-Doppelbindungen wie vorteilhaft γ-Linolensäure. Die durch
Anzucht im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Organismen
und die in ihnen enthaltenen ungesättigten Fettsäuren können
direkt beispielsweise zur Herstellung von pharmazeutischen
Zubereitungen, von Agrochemikalien, Futtermitteln oder Lebens
mitteln verwendet werden oder aber nach Isolierung aus den
Organismen. Dabei können alle Stufen der Aufreinigung der unge
sättigten Fettsäuren verwendet werden, das heißt von Rohextrakten
der Fettsäuren bis zu vollständig gereinigten Fettsäuren sind für
die Herstellung der vorgenannten Produkte geeignet. In einer vor
teilhaften Ausführungsform können die gebundenen Fettsäuren aus
beispielsweise den Ölen bzw. Lipiden beispielsweise über eine
basische Hydrolyse z. B. mit NaOH oder KOH freigesetzt werden.
Diese freien Fettsäuren können direkt im erhaltenen Gemisch oder
nach weiterer Aufreinigung zur Herstellung von pharmazeutischen
Zubereitungen, von Agrochemikalien, Futtermitteln oder Lebens
mitteln verwendet werden. Auch können die gebundenen oder freien
Fettsäuren zur Umesterung oder Veresterung beispielsweise mit
anderen Mono-, Di- oder Triglyceriden oder Glycerin verwendet
werden, um den Anteil an ungesättigten Fettsäuren in diesen
Verbindungen beispielsweise in den Triglyceriden zu erhöhen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur
Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an unge
sättigten Fettsäuren, indem man Triglyceride mit gesättigten oder
ungesättigten oder gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit
mindestens einem der Protein, das durch die Sequenz SEQ ID NO: 2
codiert wird, inkubiert. Vorteilhaft wird das Verfahren in Gegen
wart von Verbindungen durchgeführt, die Reduktionsäquivalente
aufnehmen oder abgeben können. Anschließend können die Fettsäuren
aus den Triglyceriden freigesetzt werden.
Die oben genannten Verfahren ermöglichen vorteilhaft die Synthese
von Fettsäuren oder gebundenen Fettsäuren wie Triglyceriden mit
einem erhöhten Gehalt an Fettsäuren mit Δ6-Doppelbindungen.
Als Organismen für die genannten Verfahren seien beispielhaft
Pflanzen wie Arabidopsis, Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais,
Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Tee, Karotte, Paprika, Canola,
Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Triticale, Tabak, Tomate,
Raps, Kaffee, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa,
Erdnuß, Rizinus, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus
tinctorius), Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Wein
spezies, oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze Mortierella,
Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia,
Cyanobakterien, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie
Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die
natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können
wie Mikroorganismen wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium
insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuß, Ölpalme,
Canola, Färbersaflor (Carthamus tinctorius), Rizinus, Calendula,
Lein, Borretsch, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume, besonders
bevorzugt werden Soja, Raps oder Sonnenblume.
Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach
Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw.
gezüchtet. Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze, Ciliaten,
pflanzliche oder tierische Zellen werden in der Regel in einem
flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von
Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen
Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat,
Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenen
falls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C,
bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter je nach Organismus Sauer
stoffbegasung oder in Abwesenheit von Sauerstoff angezogen. Dabei
kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten
werden, das heißt der pH wird während der Anzucht reguliert
oder der pH wird nicht reguliert und verändert sich während
der Anzucht. Die Anzucht kann batch Weise, semi batch Weise
oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der
Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuier
lich nach gefüttert werden. Auch eine Anzucht auf festen Medien
ist möglich.
Pflanzen werden nach Transformation in der Regel zunächst
regeneriert und anschließend wie üblich angezogen bzw. angebaut.
Dies kann im Gewächshaus oder im Freiland erfolgen.
Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicher
weise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst
aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide
werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare
Lösungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen
wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei
Temperaturen zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 20°C bis
50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Über
schuß an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Überschuß
von Lösungsmittel zu Biomasse von 1 : 4. Das Lösungsmittel wird
anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt.
Die Extraktion kann auch mit superkritischem CO2 erfolgen.
Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispielsweise
über Filtration entfernt werden.
Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt
werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen
mit polaren Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform und
anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden.
Auch eine weitere Reinigung über chromatographische Verfahren,
Destillation oder Kristallisation ist möglich.
Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyceriden werden
diese in üblicher Weise, wie oben beschrieben, verseift.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind ungesättigte Fett
säuren sowie Trigylceride mit einem erhöhten Gehalt an unge
sättigten Fettsäuren, die nach den oben genannten Verfahren
hergestellt wurden, sowie deren Verwendung zur Herstellung von
Nahrungsmitteln, Tierfutter, Kosmetika oder Pharmazeutika. Hierzu
werden diese den Nahrungsmitteln, dem Tierfutter, den Kosmetika
oder Pharmazeutika in üblichen Mengen zugesetzt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wurden durch Expression einer
Δ6-Desaturase aus Moos in Organismen wie Pilze, Bakterien,
Tieren oder Pflanzen, bevorzugt Pilzen, Bakterien und Pflanzen,
besonders bevorzugt in Pflanzen, ganz besonders bevorzugt in
Ölfruchtpflanzen wie Raps, Canola, Lein, Soja, Sonnenblume,
Borretsch, Rizinus, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius),
Kokosnuß, Erdnuß oder Kakaobohne höhere Gehalte an ungesättigten
Fettsäuren wie γ-Linolensäure erhalten. Auch die Expression in
Feldfrüchten, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis,
Gerste, Alfalfa, oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee) ist
vorteilhaft. Durch die Expression eines Gens, das für eine
Δ-6-Desaturase aus Moos codiert, in den oben genannten Organismen
können Gehalte an ungesättigten Fettsäuren in den Organismen von
mindestens 1 Mol-%, bevorzugt mindestens 3 Mol-%, besonders be
vorzugt mindestens 4 Mol-%, ganz besonders bevorzugt mindestens
5 Mol-% erreicht werden.
Unter Derivate(n) sind beispielsweise funktionelle Homologe
der von SEQ ID NO: 1 codierten Enzyme oder deren enzymatischer
Aktivität, das heißt Enzyme, die dieselben enzymatischen
Reaktionen wie die von SEQ ID NO: 1 katalysieren, zu verstehen.
Diese Gene ermöglichen ebenfalls eine vorteilhafte Herstellung
von ungesättigten Fettsäuren mit Doppelbindungen in Δ6-Position.
Unter ungesättigten Fettsäuren sind im folgenden doppelt oder
mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die Doppelbindungen aufweisen,
zu verstehen. Die Doppelbindungen können konjugiert oder nicht
konjugiert sein. Die in SEQ ID NO: 1 genannte Sequenz codiert
für ein Enzym, das eine Δ6-Desaturase-Aktivität aufweist.
Das erfindungsgemäße Enzym Δ6-Desaturase führt vorteilhaft in
Fettsäurereste von Glycerolipiden eine cis-Doppelbindung in
Position C6-C7 ein (siehe SEQ ID NO: 1). Das Enzym hat außerdem
eine Δ6-Desaturase-Aktivität, die vorteilhaft in Fettsäurereste
von Glycerolipiden ausschließlich eine cis-Doppelbindung in
Position C6-C7 einführt. Diese Aktivität hat auch das Enzym mit
der in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz, bei dem es sich um eine
monofunktionelle Δ6-Desaturase handelt.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure
sequenz(en) (für die Anmeldung soll der singular den plural
umfassen und umgekehrt) oder Fragmente davon können vorteilhaft
zur Isolierung weiterer genomischer Sequenzen über Homologie
screening verwendet werden.
Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen
Organismen eukaryontischen Organismen wie Pflanzen wie speziell
Moosen, Dinoflagellaten oder Pilze isolieren.
Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der
in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz beispielsweise Allelvarianten
zu verstehen, die mindestens 50% Homologie auf der abgeleiteten
Aminosäureebene, vorteilhaft mindestens 70% Homologie, bevorzugt
mindestens 80% Homologie, besonders bevorzugt mindestens 85%
Homologie, ganz besonders bevorzugt 90% Homologie aufweisen.
Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich be
rechnet. Es wurde das Programm PileUp, BESTFIT, GAP, TRANSLATE
bzw. BACKTRANSLATE (= Bestandteil des Programmpaketes UWGCG,
Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics
Computer Group, Inc., Deverux et al., Nucleic. Acid Res., 12,
1984: 387-395) verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987,
Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Die von den genannten
Nukleinsäuren abgeleitete Aminosäuresequenz ist Sequenz
SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Unter Homologie ist Identität zu
verstehen, das heißt die Aminosäuresequenzen sind zu mindestens
50% identisch. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auf Nuklein
säureebene mindestens 65% homolog, bevorzugt mindestens 70%,
besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt mindestens
80%.
Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die
durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus
der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei
die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten
Proteine erhalten bleibt.
Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von der in
SEQ ID NO: 1 beschriebenen DNA-Sequenz oder Teilen dieser
Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren
oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie beispielsweise
den oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren
unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur
Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide bei
spielsweise der konservierten Bereiche, die über Vergleiche mit
anderen Desaturasegenen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt
werden können, verwendet. Vorteilhaft werden die Histidin-Box-
Sequenzen verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen
für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten
Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige
Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für
die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standard
bedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für
DNA : DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA : RNA-Hybriden
gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein
säure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Puffer
lösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC
= 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in
Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC,
50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die
Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und
Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa
30°C bis 45°C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs
bedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen
etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese
angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft
kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit
einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von
50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen
für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der
Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning",
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich
nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von
der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G +
C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann
der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al.
(eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids
Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford
University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular
Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University
Press, Oxford.
Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenz SEQ ID NO: 1
beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Ein
zelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz
oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu
verstehen.
Außerdem sind unter Homologen der Sequenz SEQ ID NO: 1 Derivate
wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Diese Varian
ten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch
Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber
die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt
sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer
Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirk
samere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen,
deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -2000 vor dem Startcodon
so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Protein
expression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter
Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3'-Ende verändert
wurden.
Die Nukleinsäuresequenzen, die für eine Δ6-Desaturase codiert,
können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder
eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen
enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Δ6-Desaturase-Gen
abschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen
werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die
von den entsprechenden Wirtsorganismen beispielsweise Pflanzen
bevorzugt werden. Dies führt in der Regel zu einer optimalen
Expression der heterologen Gene. Diese von Pflanzen bevorzugten
Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit
bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzen
spezies exprimiert werden. Ein Beispiel für Corynebacterium
glutamicum ist gegeben in: Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res.
20: 2111-2118). Die Durchführung solcher Experimente sind mit
Hilfe von Standardmethoden durchführbar und sind dem Fachmann
auf dem Gebiet bekannt.
Funktionell äquivalente Sequenzen, die für das Δ6-Desaturase-Gen
codieren, sind solche Derivate der erfindungsgemäßen Sequenz,
welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten
Funktionen, das heißt die enzymatische Aktivität der Proteine
besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich
vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie
künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den
Codon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-
Sequenzen.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie,
wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispiels
weise der Erhöhung des Gehaltes von Δ6-Doppelbindungen in Fett
säuren, Ölen oder Lipiden in der Pflanze durch Überexpression
des Δ6-Desaturase-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche
artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rück
übersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine,
die Δ6-Desaturase-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-
Selektion ermittelt werden. Mögliche Techniken zur in vitro-
Evolution von DNA zur Veränderung bzw. Verbesserung der DNA-
Sequenzen sind beschrieben bei Patten, P.A. et al., Current
Opinion in Biotechnology 8, 724-733 (1997) oder bei Moore, J.C.
et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997).
Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch
Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die
Wirtspflanze spezifischen odon-Nutzung erhalten werden.
Die spezifische Codon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen
Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer,
bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind
zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine codieren, wobei
Bestandteil des Fusionsproteins ein Δ6-Desaturase-Polypeptid
oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite
Teil des Fusionsproteins kann z. B. ein weiteres Polypeptid mit
enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz
mit deren Hilfe ein Nachweis auf Δ6-Desaturase-Expression mög
lich ist (z. B. myc-tag oder his-tag). Bevorzugt handelt es sich
dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z. B. ein
Signalsequenz für das ER, das das Δ6-Desaturase-Protein an den
gewünschten Wirkort leitet.
Vorteilhaft können die Δ6-Desaturase-Gene im erfindungsgemäßen
Verfahren mit weiteren Genen der Fettsäurebiosynthese kombiniert
werden. Beispiele für derartige Gene sind die Acetyltransferasen,
weitere Desaturasen oder Elongasen ungesättigter oder gesättigter
Fettsäuren wie in WO 00/12720 beschrieben. Für die in-vivo und
speziell in-vitro Synthese ist die Kombination mit z. B. NADH-
Cytochrom B5 Reduktasen vorteilhaft, die Reduktionsäquivalente
aufnehmen oder abgeben können.
Unter den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteine
sind Proteine zu verstehen, die eine in der Sequenz SEQ ID NO: 2
dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substi
tution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder
mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei
die enzymatische Aktivität des in SEQ ID NO: 2 dargestellten
Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich reduziert wird.
Unter nicht wesentlich reduziert sind alle Enzyme zu verstehen,
die noch mindestens 10%, bevorzugt 20%, besonders bevorzugt
30% der enzymatischen Aktivität des Ausgangsenzyms aufweisen.
Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche
mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung,
Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise
werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucin
reste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste aus
getauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in
ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden,
oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert
werden.
Unter Derivaten sind auch funktionelle Äquivalente zu verstehen,
die insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer
ursprünglich isolierten für Δ6-Desaturase codierende Sequenz
beinhalten, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen, das
heißt das deren enzymatische Aktivität nicht wesentlich reduziert
ist. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen,
Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotid
reste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen
durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch
Modifikation der Δ6-Desaturase Nukleotidsequenz erhält. Ziel
einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung
der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z. B. auch die
Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren
Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment,
abgeschwächt (= nicht wesentlich reduziert) oder verstärkt ist
(= Enzymaktivität ist stärker als die Aktivität des Ausgangs
enzyms, das heißt Aktivität ist höher als 100%, bevorzugt höher
als 110%, besonders bevorzugt höher als 130%).
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten oben genannten
Nukleinsäuresequenzen werden vorteilhaft zum Einbringen in
einen Wirtsorganismus in eine Expressionskassette inseriert.
Die Nukleinsäuresequenzen können jedoch auch direkt in den Wirts
organismus eingebracht werden. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei
vorteilhaft beispielsweise eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein.
Zur Insertion in eine Expressionskassette geeignete codierende
Sequenzen sind beispielsweise solche, die für eine Δ6-Desaturase
mit den oben beschriebenen Sequenzen codieren und die dem Wirt
die Fähigkeit zur Überproduktion von Fettsäuren, Ölen oder
Lipiden mit Doppelbindungen in Δ6-Position verleihen. Diese
Sequenzen können homologen oder heterologen Ursprungs sein.
Unter einer Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt oder
-fragment) ist die in SEQ ID NO: 1 genannte Sequenz, die sich
als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktionellen
oder nicht funktionellen Derivate zu verstehen, die mit einem
oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung
der Genexpression funktionell verknüpft wurden und welche die
Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression
der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei
spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst
nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß
es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise
handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen
an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression
der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regu
lationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natür
liche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Struktur
genen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert
worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und
die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber
auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätz
lichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen
Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regu
lation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche
Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt
und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten
Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit
Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein
vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht
werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch
eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell
verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression
der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-
Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert
werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.
Das Δ6-Desaturase-Gen kann in einer oder mehreren Kopien in
der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein. Auch
eventuell mit exprimierte Gene, die vorteilhaft an der Fettsäure
biosynthese beteiligt sind, können in einer oder mehreren Kopien
in der Expressionskassette vorhanden sein.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie
oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten
Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Ver
stärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der
Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale
wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist
aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem bei
spielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Als Promotoren in der Expressionskassette sind grundsätzlich
alle Promotoren geeignet, die die Expression von Fremdgenen in
Organismen vorteilhaft in Pflanzen oder Pilzen steuern können.
Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen
Promotor oder Promotoren, die beispielsweise aus einem Pflanzen
virus entstammen. Vorteilhafte Regulationssequenzen für das
erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie
cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-,
T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor
enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien
Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind
beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in
den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH,
TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S
[Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], RUBISCO SSU, OCS, B33,
nos (= Nopalin Synthase Promotor) oder im Ubiquitin-Promotor
enthalten. Die Expressionskassette kann auch einen chemisch
induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des
exogenen Δ6-Desaturase-Gens in den Organismen vorteilhaft in den
Pflanzen zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann.
Derartige vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise
der PRP1-Promotor [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993),
361-366], ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186),
ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant
J. 2, 397-404), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor
(WO 95/19443), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP 335528)
bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer
(WO 93/21334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind bei
spielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel,
der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J.
8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat
Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession
Nummer U87999) oder ein Nodien-spezifischen Promotor wie in
EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden. Vorteilhaft sind
insbesondere solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in
Geweben oder Pflanzenteilen/-organen sicherstellen, in denen die
Fettsäurebiosynthese bzw. dessen Vorstufen stattfindet wie bei
spielsweise im Endosperm oder im sich entwickelnden Embryo. Ins
besondere zu nennen sind vorteilhafte Promotoren, die eine samen
spezifische Expression gewährleisten wie beispielsweise der USP-
Promotor oder Derivate davon, der LEB4-Promotor, der Phaseolin-
Promotor oder der Napin-Promotor. Der erfindungsgemäß aufgeführte
und besonders vorteilhafte USP-Promotor oder dessen Derivate ver
mitteln in der Samenentwicklung eine sehr früh Genexpression
(Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67). Weitere
vorteilhafte samenspezifische Promotoren, die für monokotyle und
dikotyle Pflanzen verwendet werden können, sind die für Dikotyle
geeignete Promotoren wie ebenfalls beispielhaft ausgeführte
Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der Oleosin-Promotor
aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus
Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica
(WO 91/13980) oder der Leguminosen B4-Promotor (LeB4, Baeumlein
et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233-239) oder für Monokotyle
geeignete Promotoren wie die Promotoren die Promotoren des lpt2-
oder lpt1-Gens aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die
Promotoren des Gersten Hordein-Gens, des Reis Glutelin-Gens, des
Reis Oryzin-Gens, des Reis Prolamin-Gens, des Weizen Gliadin-
Gens, des Weizen Glutelin-Gens, des Mais Zein-Gens, des Hafer
Glutelin-Gens, des Sorghum Kasirin-Gens oder des Roggen Secalin-
Gens, die in WO 99/16890 beschrieben werden.
Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die
die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in
denen beispielsweise die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen und
Lipiden bzw. deren Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen
sind Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewähr
leisten. Zu nennen sind der Promotor des Napin-Gens aus Raps
(US 5,608,152), des USP-Promotor aus Vicia faba (USP = unbekanntes
Samenprotein, Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):
459-67), des Oleosin-Gens aus Arabidopsis (WO 98/45461), des
Phaseolin-Promotors (US 5,504,200) oder der Promotor des Legumin
B4-Gens (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):
233-9). Weiterhin sind zu nennen Promotoren, wie der des lpt2-
oder lpt1-Gens aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), die in
monokotylen Pflanzen samenspezifische Expression vermitteln.
In der Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäurekon
strukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in
die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese
Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen
Regulationsregion wie das Δ6-Desaturase-Gen liegen. Bei diesen
Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene
vorteilhaft der Fettsäurebiosynthese, die eine gesteigerte
Synthese ermöglichen. Beispielsweise seien die Gene für die Δ15-,
Δ12-, Δ9-, Δ5-, Δ4-Desaturase, die verschiedenen Hydroxylasen,
die Acyl-ACP-Thioesterasen, β-Ketoacyl-Synthasen oder β-Ketoacyl-
Reductasen genannt. Vorteilhaft werden die Desaturasegene im
Nukleinsäurekonstrukt verwendet.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regu
lationssequenzen wie die oben genannten für die erfindungsgemäße
Expressionskassette und das erfindungsgemäße Verfahren, wie
unten beschrieben, verwendet werden. Darüberhinaus können auch
synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Es können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um
eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in
der korrekten Richtung gelesen wird und die mit einem korrekten
Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente
(= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die
Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-
Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Poly
linker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die
Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel
hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis
6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb
der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp,
häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor
kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. hetero
log zum Wirtsorganismus beispielsweise zur Wirtspflanze sein.
Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptions
richtung den Promotor, eine DNA-Sequenz, die für ein im er
findungsgemäßen Verfahren verwendetes Δ6-Desaturase-Gen codiert
und eine Region für die transkriptionale Termination. Ver
schiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig
austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt
stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrik
tionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen,
Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans
versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, -primer
repair-, Restriktion oder Ligation verwandet werden. Bei geeig
neten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, -chewing-back- oder
Auffüllen von Überhängen für -bluntends-, können komplementäre
Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt
werden.
Von Bedeutung für eine vorteilhafte hohe Expression kann u. a.
das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein
(Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die
durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis
vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natür
licherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen
Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt
werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Poly
adenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen
T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens,
insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des
Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984),
835 ff) oder entsprechende funktionelle Äquivalente.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion
eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Δ6-Desaturase-
DNA-Sequenz sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen
Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise
in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W.
Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M.
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben werden.
Die DNA Sequenz codierend für eine Δ6-Desaturase aus Phsyco
mitrella patens beinhaltet alle Sequenzmerkmale, die notwendig
sind, um eine dem Ort der Fettsäure-, Lipid- oder Ölbiosynthese
korrekte Lokalisation zu erreichen. Daher sind keine weiteren
Targetingsequenzen per se notwendig. Allerdings kann eine solche
Lokalisation wünschenswert und vorteilhaft sein und daher künst
lich verändert oder verstärkt werden, sodaß auch solche Fusions
konstrukte eine bevorzugte vorteilhafte Ausführungsform der
Erfindung sind.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in
Plastiden gewährleisten. Unter bestimmten Umständen kann auch
ein Targeting in andere Kompartimente (referiert: Kermode, Crit.
Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423) z. B. in in die Vakuole,
in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER),
Peroxisomen, Lipidkörper oder durch ein Fehlen entsprechender
operativer Sequenzen ein Verbleib im Kompartiment des Entstehens,
dem Zytosol, wünschenswert sein.
Vorteilhafterweise werden die für Δ6-Desaturase-Gene codierenden
Nukleinsäuresequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen
in eine Expressionskassette kloniert, die in den Organismus über
einen Vektor oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses
Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen
Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenz
assay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Bei
spielhaft seien als Reportergene Antibiotika- oder Herbizid
resistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumin
eszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Bio
synthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen,
das β-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6-
phosphat-Phosphatasegen, das β-Glucuronidase-Gen, β-Lactamasegen,
das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotrans
ferasegen oder das BASTA(= Gluphosinatresistenz)-Gen genannt.
Diese Gene ermöglichen eine leichte Meßbarkeit und Quantifizier
barkeit der Transkriptionsaktivität und damit der Expression der
Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine
unterschiedliche Produktivität zeigen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressions
kassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der codierenden Sequenz,
einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Poly
adenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische
Elemente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz
für die Δ6-Desaturase DNA Sequenz operativ verknüpft sind. Unter
einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle
Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf.
weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen
Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden
Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen
Verknüpfung bevorzugten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur
Gewährleistung der subzellulären Lokalisation in Plastiden. Aber
auch Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären
Lokalisation im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum
(= ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten
sind bei Bedarf einsetzbar sowie Translationsverstärker wie die
5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al.,
Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven
Promotor (bevorzugt den USP- oder Napin-Promotor), das zu
exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthalten. Als
ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL
(Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.
Die Expressionskassette wird zur Expression in einem pro
karyontischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus beispielsweise
einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteil
hafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid,
einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, der eine optimale
Expression der Gene im Wirtsorganismus ermöglicht. Geeignete
Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR-
Serie wie z. B. pBR322, pUC-Serie wie pUC18 oder pUC19, M113mp-
Serie, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,
pIN-III113-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364,
pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in
Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder
pBB116, weitere vorteilhafte Pilzvektoren werden von Romanos,
M.A. et al., [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a
review", Yeast 8: 423-488] und von von den Hondel, C.A.M.J.J. et al.
[(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi]
sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L.
Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego] und in "Gene
transfer systems and vector development for filamentous fungi"
[von den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied
Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28,
Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Vorteilhafte
Hefevektoren sind beispielsweise 2µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder
pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind
pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt,
R. and Willmitzer, L., 1988). Die oben genannten Vektoren oder
Derivate der vorstehend genannten Vektoren stellen eine kleine
Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem
Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch
Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New
York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete
pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant
Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7,
S. 71-119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle-
Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium
replizieren.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem
Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren
wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente,
Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu
verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus
repliziert oder chromosomal repliziert werden, bevorzugt ist
eine chromosomale Replikation.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die
erfindungsgemäße Expressionskassette auch vorteilhafterweise in
Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und
über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des
Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus
einem linearisierten Plasmid oder nur aus der Expressionskassette
als Vektor oder den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
bestehen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die
erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz auch alleine in einen
Organismus eingebracht werden.
Sollen neben der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weitere
Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen
mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes ein
zelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor oder mehrere
Gene zusammen in verschiedenen Vektoren in den Organismus ein
gebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig
oder sukzessive eingebracht werden können.
Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der Nuklein
säuresequenzen, die für eine Δ6-Desaturase codieren, und/oder der
Expressionskassette.
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den
Transformationsvektor pRT ((a) Toepfer et al., 1993, Methods
Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al. 1987, Nucl. Acids.
Res. 15: 5890 ff.) eingebaut werden.
Alternativ kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor)
auch in-vitro transkribiert und translatiert werden, z. B. durch
Nutzung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase.
In Prokaryoten verwendete Expressionsvektoren nutzen häufig
induzierbare Systeme mit und ohne Fusionsproteinen bzw Fusions
oligopeptiden, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch
C-terminal oder anderen nutzbaren Domänen eines Proteins erfolgen
können. Solche Fusionsvektoren dienen in der Regel dazu: i.) die
Expressionsrate der RNA zu erhöhen, ii.) die erzielbare Protein
syntheserate zu erhöhen, iii.) die Löslichkeit des Proteins zu
erhöhen, iv.) oder die Reinigung durch einen für die Affinitäts
chromatographie nutzbare Bindesequenz zu vereinfachen. Häufig
werden auch proteolytische Spaltstellen über Fusionsproteine
eingeführt, was die Abspaltung eines Teils des Fusionsproteins
auch der Reinigung ermöglicht. Solche Erkennungssequenzen für
Proteasen erkennen sind z. B. Faktor Xa, Thrombin und Entero
kinase.
Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX
[Pharmacia Biotech Inc., Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene
67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5
(Pharmacia, Piscataway, NJ), welches Glutathion S-transferase
beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A.
Weitere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc
[Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315] und pET Vektoren [Studier
et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,
Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene,
Amsterdam, Niederlande].
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind
pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa
(Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz
et al., (1987) Gene 54: 113-123), und pYES-Derivate (Invitrogen
Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in fila
mentösen Pilzen sind beschrieben in: von den Hondel, C.A.M.J.J. &
Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development
for filamentous fungi", in: Applied Molecular Genetics of Fungi,
J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press:,
Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvekto
ren genutzt werden z. B. für die Expression in Sf 9 Zellen. Dies
sind z. B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol.
Cell Biol. 3: 2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers
(1989) Virology 170: 31-39).
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzen
zellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzen
expressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al. (1992)
"New plant binary vectors with selectable markers located
proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197
oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for
plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
Weiterhin können die für die Δ6-Desaturase codierenden Nuklein
säuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel
für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC
genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 oder Kaufman et al.
(1987) EMBO J. 6: 187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende
Promotoren viralen Ursprungs wie z. B. Promotoren des Polyoma,
Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere
prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt
in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
1989.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der
Expressionskassette oder des Vektors in Organismen beispiels
weise in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann
bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den
Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning:
A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von
F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular bio
logy, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning
Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al.
(1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory
Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular
Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird
als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen
Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen
Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten
transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme,
das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte
particle bombardment Methode -, die Elektroporation, die Inku
bation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro
injektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer.
Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al.,
Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1,
Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R.
Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev.
Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben.
Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor
kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans
formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res.
12 (1984) 8711). Mit einem solchen Vektor transformierte Agro
bakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von
Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Tabak
pflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete
Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet
und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die
Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird
beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res.
(1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus
F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Trans
genic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben
von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Mit einem wie oben beschriebenen Expressionsvektor transformierte
Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Trans
formation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder
Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen,
Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Triticale, Reis,
Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Kaffee,
Kakao, Tee, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz,
Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß-
und Weinspezies, insbesondere von Ölhaltigen Kulturpflanzen,
wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Borretsch, Lein, Sonnenblume,
Canola, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor
(Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne verwendet werden, z. B.
indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterien
lösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert
werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem
Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende
Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und
R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäßen
Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die verwendete Expressions
kassette oder den verwendeten Vektor eignen sich prinzipiell
vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren
speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die
Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien
Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kultur
pflanzen wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baum
wolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus
tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze bei
spielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium,
Bakterien wie die Gattung Escherichia, Cyanobakterien, Ciliaten,
Thrausto- oder Schizichytrien, Algen oder Protozoen wie Dino
flagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden
Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen
synthetisieren können wie Pilze der Gattungen Mortierella oder
Pythium wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen
wie Soja, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus,
Calendula, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume, besonders bevor
zugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Rizinus, Mortierella oder
Pythium. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene
Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.
Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,
San Diego, CA (1990).
Verwendbare Expressionsstämme z. B. solche, die eine geringere
Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S.,
Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression des
Δ6-Desaturase-Gens spezifisch in den Blättern, in den Samen, den
Knollen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche Fett
säuren, Öle oder Lipide mit Δ6-Doppelbindungen überproduzierenden
transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzen
zellen, -gewebe oder -teile, sind ein weiterer Gegenstand der
vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Gegen
stand sind transgene Pflanzen beispielsweise Kulturpflanzen wie
Mais, Hafer, Roggen, Weizen, Gerste, Mais, Reis, Soja, Zucker
rübe, Canola, Triticale, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Tabak,
Tomate, Kaffee, Kakao, Tee, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka,
Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen
Baum-, Nuß- und Weinspezies, Kartoffel, insbesondere Ölhaltige
Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Borretsch, Lein,
Sonnenblume, Canola, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme,
Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Testpflanzen
wie Arabidopsis oder sonstige Pflanzen wie Moose oder Algen ent
haltend eine erfindungsgemäße funktionelle Nukleinsäuresequenz
oder eine funktionelle Expressionskassette. Funktionell bedeutet
hierbei, daß ein enzymatisch aktives Enzym gebildet wird.
Die Expressionskassette oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäure
sequenzen enthaltend eine Δ6-Desaturasegensequenz kann darüber
hinaus auch zur Transformation der oben beispielhaft genannten
Organismen wie Bakterien, Cyanobakterien, filamentösen Pilzen,
Ciliaten, Tiere oder Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des
Gehaltes an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden Δ6-Doppelbindungen ein
gesetzt werden. Bevorzugte transgene Organismen sind Bakterien,
Cyanobakterien, filamentöse Pilze oder Algen.
Unter transgenen Organismen sind Organismen zu verstehen, die
eine Fremde aus einem anderen Organismus stammende Nuklein
säure, die für eine im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete
Δ6-Desaturase codiert, enthalten. Unter transgenen Organismen
sind auch Organismen zu verstehen, die eine Nukleinsäure, die
aus demselben Organismus stammt und die für eine Δ6-Desaturase
codiert, enthält, wobei diese Nukleinsäure als zusätzliche
Genkopie enthalten ist oder nicht in der natürlichen Nuklein
säureumgebung des Δ6-Desaturase-Gens enthalten ist. Transgene
Organismen sind auch Organismen, bei denen die natürliche 3'-
und/oder 5'-Region des Δ6-Desaturase-Gens durch gezielte gen
technologische Veränderungen gegenüber dem Ausgangsorganismus
verändert wurde. Bevorzugt sind transgene Organismen, bei denen
eine Fremd-DNA eingebracht wurde. Besonders bevorzugt sind trans
gene Pflanzen, in die Fremd-DNA eingebracht wurde. Unter trans
genen Pflanzen sind einzelne Pflanzenzellen und deren Kulturen
wie beispielsweise Kalluskulturen auf Festmedien oder in Flüssig
kultur, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu verstehen.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind transgene Organismen
ausgewählt aus der Gruppe Pflanzen, Pilze, Ciliaten, Algen,
Bakterien, Cyanobakterien oder Tiere, bevorzugt transgene
Pflanzen oder Algen, die mindestens eine isolierte Nukleinsäure
sequenz enthalten, die für ein Polypeptid mit Δ6-Desaturase
aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dar gestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 ableiten,
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.
Erhöhung des Gehaltes von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit
Δ6-Doppelbindungen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung
beispielsweise die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten
Biosyntheseleistung durch funktionelle Überexpression des
Δ6-Desaturase-Gens in den erfindungsgemäßen Organismen vorteil
haft in den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen gegenüber den
nicht gentechnisch modifizierten Ausgangspflanzen zumindest für
die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Der Biosyntheseort von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden beispiels
weise ist im allgemeinen der Samen oder Zellschichten des Samens,
so daß eine samenspezifische Expression des Δ6-Desaturase-Gens
sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Biosynthese
von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden nicht auf das Samengewebe
beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der
Pflanze - beispielsweise in Epidermiszellen - oder in dem Knollen
gewebe spezifisch erfolgen kann.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen
Δ6-Desaturase-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch
eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Die Wirksamkeit der Expression des Δ6-Desaturase-Gens kann
beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt
werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression
des Δ6-Desaturase-Gens und deren Auswirkung auf die Fettsäure-,
Öl- oder Lipidbiosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshaus
versuchen getestet werden.
Gegenstand der Erfindung sind wie oben beschrieben transgene
Pflanzen, transformiert mit einer Nukleinsäuresequenz, die für
eine Δ6-Desaturase codiert, einem Vektor oder einer Expressions
kassette enthaltend eine Δ6-Desaturase-Gensequenz oder mit dieser
hybridisierende DNA-Sequenzen, sowie transgene Zellen, Gewebe,
Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt
sind dabei transgene Kulturpflanzen wie oben beschrieben.
Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen
oder Algen.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind:
- - Verwendung einer Δ6-Desaturase-DNA-Gensequenz mit der in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz oder mit dieser hybridisierende DNA-Sequenzen zur Herstellung von Pilzen, Bakterien, Tieren oder Pflanzen bevorzugt Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Δ6-Doppelbindungen durch Expression dieser Δ6-Desaturase DNA-Sequenz in Pflanzen.
- - Verwendung der Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2 zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen, Pilzen, Bakterien oder Tieren bevorzugt Pflanzen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Die Klonierungsverfahren wie z. B. Restriktionsspaltungen,
Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer
von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Ver
knüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli
Zellen, Anzucht von Organismen und die Sequenzanalyse rekombinan
ter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor
Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
Das Protonema von Physcomitrella patens (= P. patens) wurde in
Flüssigmedium, wie von Reski et al. (Mol. Gen. Genet., 244, 1994:
352-359) beschrieben, angezogen.
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem
Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode
von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Ketten
reaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu
exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.
Die Lipide wurden mit Chloroform/Methanol wie bei Siebertz
et al. (Eur. J. Biochem., 101, 1979: 429-438) beschrieben
aus dem Protonema von S. patens oder aus Hefezellen extrahiert
und über Dünnschichtchromatographie (= TLC) mit Diethylether ge
reinigt. Die erhaltenen Fettsäuren wurden zu den entsprechenden
Methylestern transmethyliert und mit Gaschromatographie (= GC)
analysiert. Die verschiedenen Methylester wurden mit den ent
sprechenden Standards identifiziert. Entsprechende Fettsäure
pyrrolididen wurden, wie bei Anderson et al. (Lipids, 9, 1974:
185-190) beschrieben, erhalten und mit GC-MS bestimmt.
Die Expression-Experimente in Hefen wurden mit PPDES6-cDNA durch
geführt. Knock-out-Exprimente hatten gezeigt (Daten und Versuchs
durchführung nicht gezeigt bzw. beschrieben), daß der Knock-out
zu einem Verlust an 20 : 311,14,17-, 20 : 45,8,11,14-, 20 : 45,11,14,17- und
20 : 55,8,11,14,17-Fettsäuren führt. Gleichzeitig steigen die 18 : 29,12-
und 18 : 39,12,15-Fettsäuren an. Für die Expression in Hefe wurde
der PPDES6-cDNA in den Hefe-Expressionsvektor pYES2 (Invitrogen)
subkloniert. Der erhaltene Vektor erhielt die Bezeichnung pYES
delta6. Mit pYES2 (Kontrolle) und pYESdelta6 (Δ6-Desaturase-cDNA)
transformierte Hefekulturen wurden auf Uracil-dop-out Medium mit
2% Raffinose und 1% Tergitol NP-40 (zur Stabilisierung der
Fettsäuren) angezogen. Für die Expression wurden die Zellen mit
Galactose (Endkonzentration 2%) bis zu einer optischen Dichte
(= OD) von 0,5 bei 600 nm angezogen. In Fütterungsexperimenten
wurden Fettsäuren in 5% Tergitol solubilisiert und mit einer
Endkonzentration von 0,0003% zugesetzt. Die Ergebnisse der
Expression sind Tabelle I zu entnehmen. Die Synthese von Fett
säuren mit einer Doppelbindung an Position 6 ist nur in Gegenwart
des Expressionskonstrukts mit der Δ6-Desaturase-cDNA möglich.
Dieses Δ6-Desaturase-Enzym hat eine größere Aktivität gegenüber
Fettsäuren, die schon eine Doppelbindung an Position 9 oder 12
(Bezug auf Kohlenstoffatom in der Kette) enthalten. Es wurden
die Fettsäuremethylester des gesamten Lipids der Hefen mit GC
analysiert. Die einzelnen synthetisierten Fettsäuren werden in
der Tabelle in Mol-% der gesamten Fettsäuren angegeben.
Die Polyethylenglycol vermittelte direkte DNA-Transformation von
Protoplasten wurde, wie von Schäfer et al. (Mol. Gen. Genet.,
226, 1991: 418-424) beschrieben, durchgeführt. Die Selektion
der Transformanten erfolgte auf G418-enthaltenden Medium (Girke
et al., The Plant Journal, 15, 1998: 39-48).
Mit Hilfe eines PCR-Ansatzes mit den folgenden degenerierten
Oligonukleotiden als Primer:
und dem folgenden Temperaturprogramm:
94°C, 3 min; [94°C, 20 sec; 45°C, 30 sec; 72°C, 1 min], 30 Zyklen; 72°C, 5 min, wurden schließlich Fragmente einer Δ6-Desaturase-Gen kloniert. Für die Klonierung wurde poly(A)RNA aus 12 Tage alten P. patens Protonema-Kultur isoliert. Mit dieser poly(A)RNA wurde die oben beschriebene PCR durchgeführt. Fragmente der erwarteten Fragmentlänge (500 bis 600 bp) wurden in pUC18 kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz eines PCR-Frag ments zeigte Ähnlichkeiten zu bekannten Δ6-Desaturasen. Da bekannt war, daß P. patens eine Δ6-Desaturase besitzt, wurde angenommen, daß dieser Klon für einen Teil einer Δ6-Desaturase codiert.
94°C, 3 min; [94°C, 20 sec; 45°C, 30 sec; 72°C, 1 min], 30 Zyklen; 72°C, 5 min, wurden schließlich Fragmente einer Δ6-Desaturase-Gen kloniert. Für die Klonierung wurde poly(A)RNA aus 12 Tage alten P. patens Protonema-Kultur isoliert. Mit dieser poly(A)RNA wurde die oben beschriebene PCR durchgeführt. Fragmente der erwarteten Fragmentlänge (500 bis 600 bp) wurden in pUC18 kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz eines PCR-Frag ments zeigte Ähnlichkeiten zu bekannten Δ6-Desaturasen. Da bekannt war, daß P. patens eine Δ6-Desaturase besitzt, wurde angenommen, daß dieser Klon für einen Teil einer Δ6-Desaturase codiert.
Ein vollständiger cDNA-Klon (= PPDES6-cDNA) wurde aus einer
P. patens cDNA-Bank von 12 Tage alten Protonemata mit Hilfe des
oben genannten PCR-Fragments isoliert. Die Nukleotidsequenz wird
in SEQ ID NO: 1 wiedergegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz
ist SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Die zugehörige genomische Sequenz
(= PPDES6-Gen) konnte mit Hilfe der PCR und den folgenden Oligo
nukleotiden als Primer isoliert werden:
Tabelle II gibt die Ergebnisse des Vergleichs zwischen der neuen
P. patens Δ6-Desaturase über die gesamte Nukleinsäuresequenz mit
folgenden bekannten Δ6-Desaturase wieder: Borago officinalis
(U79010), Synechocystis sp (L11421), Spirulina platensis
(X87094), Caenorhabiditis elegans (AF031477), Mortierella alpina
(WO 98/46764), Homo sapiens (Cho et al., J. Biol. Chem., 274,
1999: 471-477), Rattus norvegicus (AB021980) und Mus musculus
(Cho et al., J. Biol. Chem., 274, 1999: 471-477). Die Analyse
wurde mit dem Gap Programm (GCG-Package, Version 9,1) und den
folgenden Analysenparametern durchgeführt: scoring matrix,
blosum62, gap creation penalty, 12; gap extension penalty, 4.
Die Ergebnisse geben die bestimmte Identität oder Ähnlichkeit [ ]
in Prozent (%) im Vergleich zur P. patens-Sequenz wieder.
Die genomische Δ6-Acyllipid-Desaturase aus Physcomitrella patens
wurde auf Grundlage der veröffentlichten Sequenz (Girke et al.,
Plant J., 15, 1998: 39-48) mittels Polymerasekettenreaktion und
Klonierung modifiziert, isoliert und für das erfindungsgemäße
Verfahren eingesetzt. Dazu wurde zunächst mittels Polymerase
kettenreaktion unter Verwendung von zwei genspezifischen Primern
ein Desaturase-Fragment isoliert und in das bei Girke et al.
(siehe oben) beschriebene Desaturasegen eingesetzt.
dienten zunächst zur Amplifizierung eines Genfragmentes mittels
Polymerasekettenreaktion (30 Zyklen, 30 sek. 94° V, 30 sek. 50°C,
60 sek. 72°C, 10 min Nachinkubation bei 72°C, in einem Perkin
Elmer Thermocycler).
a) Klonierung eines Expressionsplasmids, das die Δ6-Desaturase
unter Kontrolle des 35S CaMV Promotors exprimiert:
Durch Primer TG5 wurde eine XhoI Schnittstelle in das Fragment eingeführt. Ein XhoI/Eco47III Fragment wurde durch Restriktion erhalten und in die bei Girke et al. beschriebene PPDES6-Gensequenz nach analoger Restriktion mit XhoI/Eco47III ausgetauscht. Das Konstrukt erhielt den Namen pZK. Das Insert von pZK wurde als XhoI/HindIII Fragment nach Auffüllen der HindIII-Schnittstelle mit Nukleotiden durch Behandlung mit dem Klenow Fragment der DNA Polymerase I in die XhoI/SmaI Schnittstellen von pRT99/35S kloniert. Das resultierende Plasmid pSK enthält den 35S-Promotor [Cauliflower-Mosaik-Vi rus, Franck et al. (1980) Cell 21, 285], die Δ6-Desaturase aus Moos und den 35S-Terminator im Vektor pRT.
Durch Primer TG5 wurde eine XhoI Schnittstelle in das Fragment eingeführt. Ein XhoI/Eco47III Fragment wurde durch Restriktion erhalten und in die bei Girke et al. beschriebene PPDES6-Gensequenz nach analoger Restriktion mit XhoI/Eco47III ausgetauscht. Das Konstrukt erhielt den Namen pZK. Das Insert von pZK wurde als XhoI/HindIII Fragment nach Auffüllen der HindIII-Schnittstelle mit Nukleotiden durch Behandlung mit dem Klenow Fragment der DNA Polymerase I in die XhoI/SmaI Schnittstellen von pRT99/35S kloniert. Das resultierende Plasmid pSK enthält den 35S-Promotor [Cauliflower-Mosaik-Vi rus, Franck et al. (1980) Cell 21, 285], die Δ6-Desaturase aus Moos und den 35S-Terminator im Vektor pRT.
b) Konstruktion eines Expressionskonstruktes unter Kontrolle
des Napin-Promotors:
Durch Schneiden des Plasmides pSK mit XhoI, Behandlung mit T4-DNA Polymerase und PstI-Restriktion wurde das erhaltene Promotor-Desaturase-Fragment mit Terminator in den Vektor pJH3 kloniert. Dazu wurde der Vektor BamHI geschnitten und mit Klenow-Enzym die Überhänge aufgefüllt sowie anschließend mit PstI nachgeschnitten. Es entstand durch Ligation des Desaturase-Terminator-Fragmentes in den Vektor das Plasmid pJH7, das einen Napin-Promotor beinhaltet (Scofield et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 12202-8). Die Expressionskassette aus pJH7 wurde mit Bsp120I und NotI geschnitten und in den binären Vektor pRE kloniert. Es entstand das Plasmid pRE- Ppdes6.
Durch Schneiden des Plasmides pSK mit XhoI, Behandlung mit T4-DNA Polymerase und PstI-Restriktion wurde das erhaltene Promotor-Desaturase-Fragment mit Terminator in den Vektor pJH3 kloniert. Dazu wurde der Vektor BamHI geschnitten und mit Klenow-Enzym die Überhänge aufgefüllt sowie anschließend mit PstI nachgeschnitten. Es entstand durch Ligation des Desaturase-Terminator-Fragmentes in den Vektor das Plasmid pJH7, das einen Napin-Promotor beinhaltet (Scofield et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 12202-8). Die Expressionskassette aus pJH7 wurde mit Bsp120I und NotI geschnitten und in den binären Vektor pRE kloniert. Es entstand das Plasmid pRE- Ppdes6.
In einer PCR Reaktion wurde die erfindungsgemäße
Δ6-Desaturase cDNA aus P. patens als Matrize verwendet.
Mithilfe der nachfolgend aufgeführten Oligonukleotide wurde
eine BamHI-Restriktionsschnittstelle vor dem Startcodon und
drei Adeninnukleotide als Konsensustranslationssequenz für
Eukaryoten in die Δ6-Desaturase cDNA eingeführt. Es wurde
ein 1512 Basenpaarfragment der Δ6-Desaturase amplifiziert
und sequenziert.
Die Reaktionsgemische enthielten ca. 1 ng/micro l Matrizen
DNA, 0,5 µM der Oligonukleotide und 200 µM Desoxy-Nukleotide
(Pharmacia), 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C,
1,5 mM MgCl2) und 0,02 U/µl Pwo Polymerase (Boehringer Mann
heim) und werden in einer PCR-Maschine der Firma Perkin Elmer
mit folgendem Temperaturprogramm inkubiert:
Anlagerungstemperatur | 50°C, 30 sec |
Denaturierungstemperatur | 95°C, 30 sec |
Elongationstemperatur | 72°C, 90 sec |
Anzahl der Zyklen | 30 |
c) Konstruktion eines Expressionskonstruktes unter Kontrolle des
USP-Promotors:
Das erhaltene Fragment von ca. 1,5 kB Basenpaaren wurde in den mit EcoRV gespaltenen Vektor pBluescript SK-(Stratagene) ligiert und stand für weitere Klonierungen als BamHI Fragment zur Verfügung.
Das erhaltene Fragment von ca. 1,5 kB Basenpaaren wurde in den mit EcoRV gespaltenen Vektor pBluescript SK-(Stratagene) ligiert und stand für weitere Klonierungen als BamHI Fragment zur Verfügung.
Für die Transformation von Pflanzen wurde ein weiterer Trans
formationsvektor auf Basis von pBin-USP erzeugt, der das
BamHI-Fragment der Δ6-Desaturase enthält. pBin-USP ist ein
Derivat des Plasmides pBin19. pBinUSP entstand aus pBin19,
indem in pBin19 [Bevan et al. (1980) Nucl. Acids Res. 12,
8711] ein USP-Promotor als EcoRI-BaMHI-Fragment inseriert
wurde. Das Polyadenylierungssignal ist das des Gens 3 der
T-DNA des Ti-Plasmides pTiACH5 (Gielen et al., (1984) EMBO
J. 3, 835), wobei Nukleotide 11749-11939 als PvuII-HindIII-
Fragment isoliert und nach Addition von SphI-Linkern an die
PvuII-Schnittstelle zwischen die SpHI-HindIII Schnittstelle
des Vektors kloniert. Der USP-Promotor entspricht den Nukleo
tiden 1-684 (Genbank Accession X56240), wobei ein Teil der
nichtcodierenden Region des USP-Gens im Promotor enthalten
ist. Das 684 Basenpaar große Promotorfragment wurde mittels
käuflichen T7-Standardprimer (Stratagene) und mit Hilfe eines
synthetisierten Primers über eine PCR-Reaktion nach Standard
methoden amplifiziert (Primersequenz: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTG
GGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3'). Das PCR-
Fragment wurde mit EcoRI/SalI nachgeschnitten und in den
Vektor pBin19 mit OCS Terminator eingesetzt. Es entstand
das Plasmid mit der Bezeichnung pBinUSP.
d) Konstruktion eines Expressionskonstruktes unter Kontrolle
des vATPase-C1-Promotors aus Beta vulgaris:
Analog zum Expressionsplasmid mit dem USP-Promotor wurde ein Konstrukt unter Verwendung des v-ATPase-c1-Promotors erstellt. Der Promotor wurde als EcoRI/KpnI Fragment in das Plasmid pBin19 mit OCS Terminator kloniert und über BamHI das Δ6-Desaturasegen aus P. patens zwischen Promotor und Terminator inseriert. Der Promotor entspricht einem 1153 Basenpaarfragment aus beta-Vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39: 463-475).
Analog zum Expressionsplasmid mit dem USP-Promotor wurde ein Konstrukt unter Verwendung des v-ATPase-c1-Promotors erstellt. Der Promotor wurde als EcoRI/KpnI Fragment in das Plasmid pBin19 mit OCS Terminator kloniert und über BamHI das Δ6-Desaturasegen aus P. patens zwischen Promotor und Terminator inseriert. Der Promotor entspricht einem 1153 Basenpaarfragment aus beta-Vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39: 463-475).
Das Konstrukt wurde zur Transformation von Arabidopsis
thaliana und Rapspflanzen eingesetzt.
Zur Erzeugung transgener Rapspflanzen wurden binäre Vektoren in
Agrobacterium tumefaciens C58C1 : pGV2260 oder Escherichia coli
genutzt (Deblaere et al. 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788).
Zur Transformation von Rapspflanzen (Var. Drakkar, NPZ Nord
deutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Deutschland), wurde eine 1: 50
Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten
Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und
Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) mit 3% Saccharose (3MS-
Medium) benutzt. Petiolen oder Hypokotyledonen frisch gekeimter
steriler Rapspflanzen (zu je ca. 1 cm2) wurden in einer Petri
schale mit einer 1 : 50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten
inkubiert. Es folgte eine 3-tägige Inkubation in Dunkelheit bei
25°C auf 3MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde
nach 3 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weiter
geführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/l
Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20 µM Benzyl
aminopurin (BAP) und 1,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende
Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l
Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt. Bildeten sich nach
drei Wochen keine Wurzeln, so wurde als Wachstumshormon 2-Indol
buttersäure zum Bewurzeln zum Medium zugegeben.
Regenerierte Sprosse wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin
und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und
nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer oder im
Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet
und auf Δ6-Desaturase-Expression mittels Lipidanalysen unter
sucht. Linien mit erhöhten Gehalten an oder Doppelbindungen an
der Δ6-Position wurden identifiziert. Es konnte in den stabil
transformierten transgenen Linien, die das Transgen funktionell
exprimierten, ein erhöhter Gehalt von Doppelbindungen an
der Δ6-Position im Vergleich zu untransformierten Kontroll
pflanzen feststellt werden.
Das Pflanzenmaterial wurde zunächst mechanisch durch Mörsern
homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen.
Dann wurde es 10 min bei 100°C abgekocht und nach dem Abkühlen auf
Eis sedimentiert. Das Zellsediment wurde mit 1 N methanolischer
Schwefelsäure und 2% Dimethoxypropan 1 h bei 90°C hydrolysiert
und die Lipide transmethyliert. Die resultierenden Fettsäure
methylester (FAME) wurden in Petrolether extrahiert. Die extra
hierten FAME wurden durch Gasflüssigkeitschromatographie mit
einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB,
25 m, 0,32 mm) und einem Temperaturgradienten von 170°C auf 240°C
in 20 min und 5 min bei 240°C analysiert. Die Identität der Fett
säuremethylester wurde durch Vergleich mit entsprechenden FAME-
Standards (Sigma) bestätigt. Die Identität und die Position der
Doppelbindung konnte durch geeignete chemische Derivatisierung
der FAME-Gemische z. B. zu 4,4-Dimethoxyoxazolin-Derivaten
(Christie, 1997, in: Advances in Lipid Methodology, 4. Auflage:
Christie, Oily Press, Dundee, 119-169, und 1998, Gaschromato
graphie-Massenspektrometrie Verfahren, Lipide 33: 343-353) mittels
GC-MS weiter analysiert werden. Die GC-Analysen der Fettsäure
methylester aus den transgenen Rapssamen, die samenspezifisch die
Δ6-Desaturase exprimierten sind in Tabelle III dargestellt. Die
transgenen Rapssamen weisen mindestens 4,95% γ-Linolensäure im
Samen auf.
Tabelle III gibt die GC-Analysen der Fettsäuremethylester
aus reifen, transgenen Rapssamen, die Δ6-Desaturase samen
spezifisch exprimieren, wieder. Die Fettsäurezusammensetzung ist
in [mol %] der Gesamtfettsäuren angegeben. Es ist festzustellen,
daß einzelne Pflanzen der T2 Generation, die aus positiv trans
formierten und geselbsteten Pflanzen erhalten wurden, bis zu ca.
4,95% γ-Linolensäure enthalten.
Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren, da
durch gekennzeichnet, daß mindestens eine isolierte Nuklein
säuresequenz, die für ein Polypeptid mit Δ6-Desaturase
aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dar gestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 ableiten,
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dar gestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist,
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Nukleinsäuresequenz von einer Pflanze oder Alge stammt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäuresequenz von Physcomitrella patens stammt.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß es sich bei dem Organismus um einen Organismus
ausgewählt aus der Gruppe Bakterium, Pilz, Ciliat, Alge,
Cyanobakterium, Tier oder Pflanze handelt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn
zeichnet, daß es sich bei dem Organismus um eine Pflanze
oder Alge handelt.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn
zeichnet, daß es sich bei dem Organismus um eine Ölfrucht
pflanze handelt.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekenn
zeichnet, daß der angezogene Organismus mindestens 5 Gew-%
ungesättigte Fettsäuren bezogen auf den gesamten Fettsäure
gehalt im Organismus enthält.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß die ungesättigten Fettsäuren aus dem Organismus
isoliert werden.
9. Transgener Organismus ausgewählt aus der Gruppe Pflanzen,
Pilze, Ciliaten, Algen, Bakterien, Cyanobakterien oder Tiere,
die mindestens eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten,
die für ein Polypeptid mit Δ6-Desaturaseaktivität codiert,
ausgewählt aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 ableiten,
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dar gestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.
10. Transgener Organismus nach Anspruch 9, dadurch gekenn
zeichnet, daß es sich bei dem Organismus um eine Pflanze
oder Alge handelt.
11. Öl, Lipide oder Fettsäuren oder eine Fraktion davon, her
gestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1
bis 8.
12. Verwendung der Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung nach
Anspruch 11 oder transgene Organismen nach Anspruch 9 in
Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.
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