DE10023893A1 - Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren - Google Patents
Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter FettsäurenInfo
- Publication number
- DE10023893A1 DE10023893A1 DE10023893A DE10023893A DE10023893A1 DE 10023893 A1 DE10023893 A1 DE 10023893A1 DE 10023893 A DE10023893 A DE 10023893A DE 10023893 A DE10023893 A DE 10023893A DE 10023893 A1 DE10023893 A1 DE 10023893A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- pse
- gene
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 336
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 143
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 title claims abstract description 143
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 title claims abstract description 143
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 87
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 title claims description 6
- -1 carbon fatty acids Chemical class 0.000 title abstract description 19
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 title description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 217
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 192
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 192
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 136
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 111
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 92
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 89
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 40
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims abstract description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 14
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 184
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 98
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 88
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 72
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 70
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 59
- 241000233675 Thraustochytrium Species 0.000 claims description 51
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 42
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 41
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 39
- 241000195888 Physcomitrella Species 0.000 claims description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 11
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 4
- 101000912235 Rebecca salina Acyl-lipid (7-3)-desaturase Proteins 0.000 claims description 3
- 101000877236 Siganus canaliculatus Acyl-CoA Delta-4 desaturase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010019608 3-Oxoacyl-(Acyl-Carrier-Protein) Synthase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037149 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 claims description 2
- 108700021044 acyl-ACP thioesterase Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims 1
- 108091007187 Reductases Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 107
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 64
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 abstract description 40
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 39
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000556 agonist Substances 0.000 abstract description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 179
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 119
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 115
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 70
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 61
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 57
- 238000000899 pressurised-fluid extraction Methods 0.000 description 49
- 241000199913 Crypthecodinium Species 0.000 description 45
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 44
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 44
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 44
- 239000000047 product Substances 0.000 description 44
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 42
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 42
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 40
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 32
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 31
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 31
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 29
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 29
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 27
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 26
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 26
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 25
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 23
- 230000008859 change Effects 0.000 description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 23
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 23
- 241000195887 Physcomitrella patens Species 0.000 description 22
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 22
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 description 20
- 239000002585 base Substances 0.000 description 19
- 230000006870 function Effects 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 17
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 17
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 16
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 16
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 13
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 13
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 13
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 13
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 12
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 11
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N (-)-phaseollin Chemical compound C1OC2=CC(O)=CC=C2[C@H]2[C@@H]1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N 0.000 description 10
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 10
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 9
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 9
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 9
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 9
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 9
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 9
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 8
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 8
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 8
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 8
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 8
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 8
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 8
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 7
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 7
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 7
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 7
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 7
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 6
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 6
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 6
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 6
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 6
- 241000199912 Crypthecodinium cohnii Species 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 6
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 6
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 6
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 6
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 6
- YUFFSWGQGVEMMI-JLNKQSITSA-N (7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCC(O)=O YUFFSWGQGVEMMI-JLNKQSITSA-N 0.000 description 5
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 5
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 5
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 5
- 235000021294 Docosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 5
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 5
- 244000127993 Elaeis melanococca Species 0.000 description 5
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 5
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 description 5
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 5
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 5
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 5
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 5
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 5
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 5
- LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N phaseollin Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2C2C1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 5
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 4
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 4
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 4
- 235000007689 Borago officinalis Nutrition 0.000 description 4
- 240000004355 Borago officinalis Species 0.000 description 4
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 4
- 241000248395 Colpidium Species 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 4
- 101000825071 Homo sapiens Sclerostin domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 4
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 4
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 4
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- 241000219925 Oenothera Species 0.000 description 4
- 235000004496 Oenothera biennis Nutrition 0.000 description 4
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 4
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 4
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 102100022432 Sclerostin domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 4
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 235000020978 long-chain polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 4
- HXQHFNIKBKZGRP-URPRIDOGSA-N (5Z,9Z,12Z)-octadecatrienoic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CC\C=C/CCCC(O)=O HXQHFNIKBKZGRP-URPRIDOGSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- 101000972350 Bombyx mori Lebocin-4 Proteins 0.000 description 3
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 3
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 3
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPGOLNDOMSBSCW-CLNHMMGSSA-N Fursultiamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CCOC1CSSC(\CCO)=C(/C)N(C=O)CC1=CN=C(C)N=C1N OPGOLNDOMSBSCW-CLNHMMGSSA-N 0.000 description 3
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 3
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 3
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000235575 Mortierella Species 0.000 description 3
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 3
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 101150013761 PSE1 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 3
- 241000206731 Phaeodactylum Species 0.000 description 3
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 3
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 3
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 3
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 3
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 3
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 3
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 3
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 3
- HXQHFNIKBKZGRP-UHFFFAOYSA-N Ranuncelin-saeure-methylester Natural products CCCCCC=CCC=CCCC=CCCCC(O)=O HXQHFNIKBKZGRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 3
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 3
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 3
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 3
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 3
- 235000012308 Tagetes Nutrition 0.000 description 3
- 241000736851 Tagetes Species 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219873 Vicia Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 3
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- IQLUYYHUNSSHIY-HZUMYPAESA-N eicosatetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O IQLUYYHUNSSHIY-HZUMYPAESA-N 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 235000004426 flaxseed Nutrition 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 3
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- JIWBIWFOSCKQMA-UHFFFAOYSA-N stearidonic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O JIWBIWFOSCKQMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KBGYPXOSNDMZRV-UHFFFAOYSA-N (7Z,10Z,13Z)-hexadecatrienoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCCCCCC(O)=O KBGYPXOSNDMZRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 1-methylguanine Chemical compound O=C1N(C)C(N)=NC2=C1N=CN2 RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethoxypropane Chemical compound COC(C)(C)OC HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)oxy]acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CNC(=O)NC1=O YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMKDEQUXYDZSNN-OKLKQMLOSA-N 6E,9E-octadecadienoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC(O)=O ZMKDEQUXYDZSNN-OKLKQMLOSA-N 0.000 description 2
- KBGYPXOSNDMZRV-IUQGRGSQSA-N 7,10,13-hexadecatrienoic acid Chemical compound CC\C=C\C\C=C\C\C=C\CCCCCC(O)=O KBGYPXOSNDMZRV-IUQGRGSQSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 241001605719 Appias drusilla Species 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 2
- 241000195898 Ceratodon Species 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 241001480508 Entomophthora Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101150000102 LEB4 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N N(6)-dimethylallyladenine Chemical compound CC(C)=CCNC1=NC=NC2=C1N=CN2 HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100396751 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ilv-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 101150101414 PRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000206744 Phaeodactylum tricornutum Species 0.000 description 2
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000248520 Stylonychia Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 2
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 2
- ZMKDEQUXYDZSNN-UHFFFAOYSA-N linolelaidic acid Natural products CCCCCCCCC=CCC=CCCCCC(O)=O ZMKDEQUXYDZSNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 150000002759 monoacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000028201 sequestering of triglyceride Effects 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SZQQHKQCCBDXCG-BAHYSTIISA-N (2e,4e,6e)-hexadeca-2,4,6-trienoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C(O)=O SZQQHKQCCBDXCG-BAHYSTIISA-N 0.000 description 1
- DQGMPXYVZZCNDQ-KBPWROHVSA-N (8E,10E,12Z)-octadecatrienoic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C=C/C=C/CCCCCCC(O)=O DQGMPXYVZZCNDQ-KBPWROHVSA-N 0.000 description 1
- HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N (8Z,11Z,14Z)-8,11,14-eicosatrienoic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUXYLFPMQMFGPL-UHFFFAOYSA-N (9Z,11E,13E)-9,11,13-Octadecatrienoic acid Natural products CCCCC=CC=CC=CCCCCCCCC(O)=O CUXYLFPMQMFGPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVGRZDASOHMCSK-UHFFFAOYSA-N (Z,Z)-13,16-docosadienoic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O HVGRZDASOHMCSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHDHNVFIKWGRJR-UHFFFAOYSA-N 1-cyclohexenol Chemical compound OC1=CCCCC1 QHDHNVFIKWGRJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 1-methylinosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)-2-hydroxyacetic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CNC(=O)NC1=O HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)methylamino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC1=CNC(=O)NC1=O SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 2-dimethylamino-6-hydroxypurine Chemical compound N1C(N(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710099475 3'-phosphoadenosine 5'-phosphate phosphatase Proteins 0.000 description 1
- KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 3-methylcytosine Chemical compound CN1C(N)=CC=NC1=O KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000157 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase Human genes 0.000 description 1
- 108010055468 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase Proteins 0.000 description 1
- SOWUYFYWTFVKPP-UHFFFAOYSA-N 4,4-dimethoxy-5h-1,3-oxazole Chemical class COC1(OC)COC=N1 SOWUYFYWTFVKPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 4-acetyl-4-amino-1,3-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound CC(=O)C1(N)NC(=O)NC=C1 GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003143 4-hydroxybenzyl group Chemical group [H]C([*])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 5-(methylaminomethyl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CNCC1=CNC(=O)NC1=O MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKLFQTYNHLDMDP-PNHWDRBUSA-N 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C(CNCC(O)=O)=C1 VKLFQTYNHLDMDP-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 1
- ZFTBZKVVGZNMJR-UHFFFAOYSA-N 5-chlorouracil Chemical compound ClC1=CNC(=O)NC1=O ZFTBZKVVGZNMJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 5-iodouracil Chemical compound IC1=CNC(=O)NC1=O KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound COC1=CNC(=O)NC1=O KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDZRZGNQQSUDNP-UHFFFAOYSA-N 6-(aminomethyl)-5-methoxy-2-sulfanylidene-1H-pyrimidin-4-one Chemical compound COC=1C(NC(NC=1CN)=S)=O UDZRZGNQQSUDNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBYXPOFIGCOSSB-GOJKSUSPSA-N 9-cis,11-trans-octadecadienoic acid Chemical compound CCCCCC\C=C\C=C/CCCCCCCC(O)=O JBYXPOFIGCOSSB-GOJKSUSPSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- 102100034544 Acyl-CoA 6-desaturase Human genes 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000206761 Bacillariophyta Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101001074429 Bacillus subtilis (strain 168) Polyketide biosynthesis acyltransferase homolog PksD Proteins 0.000 description 1
- 101000936617 Bacillus velezensis (strain DSM 23117 / BGSC 10A6 / FZB42) Polyketide biosynthesis acyltransferase homolog BaeD Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000005881 Calendula officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001432 Calendula officinalis Species 0.000 description 1
- 229920000049 Carbon (fiber) Polymers 0.000 description 1
- 235000008692 Carum bulbocastanum Nutrition 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 1
- 241000398616 Chloronema Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000009091 Cordyline terminalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000289527 Cordyline terminalis Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010073542 Delta-5 Fatty Acid Desaturase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000380130 Ehrharta erecta Species 0.000 description 1
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000486463 Eugraphe sigma Species 0.000 description 1
- 241000248488 Euplotes Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 102000036181 Fatty Acid Elongases Human genes 0.000 description 1
- 108010058732 Fatty Acid Elongases Proteins 0.000 description 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710196411 Fructose-1,6-bisphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710186733 Fructose-1,6-bisphosphatase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101710109119 Fructose-1,6-bisphosphatase, cytosolic Proteins 0.000 description 1
- 101710198902 Fructose-1,6-bisphosphate aldolase/phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001148462 Funaria <moss> Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000288105 Grus Species 0.000 description 1
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 101710139492 Hexitol phosphatase B Proteins 0.000 description 1
- 241001465965 Holotrichia Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000006391 Ion Pumps Human genes 0.000 description 1
- 108010083687 Ion Pumps Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 101710094902 Legumin Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037138 Linoleoyl-CoA Desaturase Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 235000005135 Micromeria juliana Nutrition 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100026933 Myelin-associated neurite-outgrowth inhibitor Human genes 0.000 description 1
- SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N N(2)-methylguanine Chemical compound O=C1NC(NC)=NC2=C1N=CN2 SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000035028 Nucleic proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000021319 Palmitoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000223785 Paramecium Species 0.000 description 1
- 241000243198 Peritrichia Species 0.000 description 1
- 241000018149 Platyophrya Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000315943 Psedna Species 0.000 description 1
- 241001491893 Pseudocohnilembus Species 0.000 description 1
- 101100368710 Rattus norvegicus Tacstd2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 101100434411 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ADH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100342406 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007315 Satureja hortensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000002114 Satureja hortensis Species 0.000 description 1
- 241000233671 Schizochytrium Species 0.000 description 1
- 241000598397 Schizochytrium sp. Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 241001467592 Spirotrichea Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000248518 Stylonychia lemnae Species 0.000 description 1
- 241001531212 Suctoria Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 240000003480 Talinum paniculatum Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001298230 Thraustochytrium sp. Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N Vesnarinone Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)N1CCN(C=2C=C3CCC(=O)NC3=CC=2)CC1 ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 239000004164 Wax ester Substances 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 108010055615 Zein Proteins 0.000 description 1
- HMDDXIMCDZRSNE-UHFFFAOYSA-N [C].[Si] Chemical compound [C].[Si] HMDDXIMCDZRSNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- YRRFBANPGRXQNJ-UHFFFAOYSA-M acetyl(trimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CC(=O)[N+](C)(C)C YRRFBANPGRXQNJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 101150102866 adc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- CUXYLFPMQMFGPL-SUTYWZMXSA-N all-trans-octadeca-9,11,13-trienoic acid Chemical compound CCCC\C=C\C=C\C=C\CCCCCCCC(O)=O CUXYLFPMQMFGPL-SUTYWZMXSA-N 0.000 description 1
- 230000008848 allosteric regulation Effects 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Chemical group C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004917 carbon fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N cis-palmitoleic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 229940108924 conjugated linoleic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- PQANGXXSEABURG-UHFFFAOYSA-N cyclohexenol Natural products OC1CCCC=C1 PQANGXXSEABURG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N dihomo-γ-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L disodium;4-(4-chloro-2-methylphenoxy)butanoate;4-(2,4-dichlorophenoxy)butanoate Chemical compound [Na+].[Na+].CC1=CC(Cl)=CC=C1OCCCC([O-])=O.[O-]C(=O)CCCOC1=CC=C(Cl)C=C1Cl NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 101150036185 dnaQ gene Proteins 0.000 description 1
- CVCXSNONTRFSEH-UHFFFAOYSA-N docosa-2,4-dienoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC=CC=CC(O)=O CVCXSNONTRFSEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108010050792 glutenin Proteins 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- SBHCLVQMTBWHCD-UHFFFAOYSA-N icosa-2,4,6,8,10-pentaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC=CC=CC=CC=CC=CC(O)=O SBHCLVQMTBWHCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150045896 ilv-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 150000004667 medium chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- IZAGSTRIDUNNOY-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)oxy]acetate Chemical compound COC(=O)COC1=CNC(=O)NC1=O IZAGSTRIDUNNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- MYYQSUKBWORIIV-UHFFFAOYSA-N n-(3-methylbutyl)-2-methylsulfanyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CSC1=NC(NCCC(C)C)=C2NC=NC2=N1 MYYQSUKBWORIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000001320 near-infrared absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000010397 one-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 108090000021 oryzin Proteins 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- ABOYDMHGKWRPFD-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 ABOYDMHGKWRPFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000021085 polyunsaturated fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 description 1
- 201000005484 prostate carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229940058287 salicylic acid derivative anticestodals Drugs 0.000 description 1
- 150000003872 salicylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N thiouracil Chemical compound O=C1C=CNC(=S)N1 ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019386 wax ester Nutrition 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- WCNMEQDMUYVWMJ-JPZHCBQBSA-N wybutoxosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N3C(CC([C@H](NC(=O)OC)C(=O)OC)OO)=C(C)N=C3N(C)C=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WCNMEQDMUYVWMJ-JPZHCBQBSA-N 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007221 ypg medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft neue Elongasegene mit den in Sequenz SEQ IN NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ IN NO: 7 genannten Sequenzen oder ihre Homologen, Derivate oder Analoga, ein Genkonstrukt, das diese Gene oder ihre Homologen, Derivate oder Analoga enthält, sowie seine Verwendung. Die Erfindung betrifft zudem Vektoren oder transgene Organismen, die ein Elongasegen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 oder seine Homologen, Derivate oder Analoga enthalten. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Elongasegensequenzen allein oder in Kombination mit weiteren Elongasen und/oder weiteren Fettsäure-Biosynthesegenen. Diese Erfindung betrifft ein neues Elongasegen mit der Sequenz SEQ ID NR: 1 oder seine Homologa, Derivate oder Analoga. DOLLAR A Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren sowie ein Verfahren zum Einbringen von DNA in Organismen, die große Mengen an Ölen und insbesondere Ölen mit hohem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren produzieren. Außerdem betrifft die Erfindung ein Öl und/oder eine Fettsäure-Zubereitung mit höherem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen und/oder eine Triacylglycerin-Zubereitung mit höherem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen.
Description
Die Erfindung betrifft ein neue Elongasegene mit den in Sequenz
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 ge
nannten Sequenzen oder ihre Homologen, Derivate oder Analoga, ein
Genkonstrukt, das diese Gene oder ihre Homologen, Derivate oder
Analoga enthält, sowie seine Verwendung. Die Erfindung betrifft
zu dem Vektoren oder transgene Organismen, die ein Elongasegen
mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 oder seine Homologen, Derivate oder Analoga ent
halten. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der
Elongasegensequenzen allein oder in Kombination mit weiteren
Elongasen und/oder weiteren Fettsäure-Biosynthesegenen. Diese
Erfindung betrifft ein neues Elongasegen mit der Sequenz
SEQ ID NR: 1 oder seine Homologa, Derivate oder Analoga.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung mehr
fach ungesättigter Fettsäuren sowie ein Verfahren zum Einbringen
von DNA in Organismen, die große Mengen an Ölen und insbesondere
Ölen mit hohem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren produzieren.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Öl und/oder eine Fettsäure-
Zubereitung mit höherem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fett
säuren mit mindestens zwei Doppelbindungen und/oder eine Triacyl
glycerin-Zubereitung mit höherem Gehalt an mehrfach ungesättigten
Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen.
Bestimmte Produkte und Nebenprodukte natürlich vorkommender
Stoffwechselprozesse in Zellen sind für ein breites Spektrum an
Industrien, einschließlich der Futtermittel-, Nahrungsmittel-,
Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie, nützlich. Zu diesen
gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichneten Molekülen gehören
auch Lipide und Fettsäuren, unter denen eine beispielhafte Klasse
die mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind. Mehrfach ungesättigte
Fettsäuren (golyunsaturated fatty acids, PUFAs) werden beispiels
weise zu Nahrungsformulierungen für Kinder gegeben, um einen
höheren Nährwert dieser Formulierungen zu erzeugen. PUFAs haben
zum Beispiel einen positiven Einfluß auf den Cholesterinspiegel
im Blut von Menschen und eignen sich daher zum Schutz gegen Herz
krankheiten. Feinchemikalien und mehrfach ungesättigte Fettsäuren
(polyunsaturated fatty acids, PUFAs) lassen sich aus tierischen
Quellen, wie beispielsweise Fisch oder Mikroorganismen, iso
lieren. Durch Anzucht dieser Mikroorganismen lassen sich große
Mengen eines oder mehrerer gewünschter Moleküle produzieren und
isolieren.
Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAs
sind Mikroorganismen wie Thraustochytrien oder Schizochytrien-
Stämme, Algen wie Phaeodactylum tricornutum oder Crypthecodinium-
Arten, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, wie
Mortierella, Entomophthora oder Mucor. Durch Stammselektion
ist eine Anzahl von Mutantenstämmen der entsprechenden Mikro
organismen entwickelt worden, die eine Reihe wünschenswerter Ver
bindungen, einschließlich PUFAs, produzieren. Die Selektion von
Stämmen mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls ist
jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Von Nachteil
ist außerdem, daß sich mit einem definierten Mikroorganismus nur
bestimmte ungesättigte Fettsäuren bzw. nur ein bestimmtes Fett
säurespektrum herstellbar ist.
Alternativ kann die Produktion von Feinchemikalien geeigneter
weise über die Produktion von Pflanzen, die so entwickelt sind,
daß sie die vorstehend genannten PUFAs herstellen, im großen
Maßstab durchgeführt werden. Besonders gut für diesen Zweck
geeignete Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an
Lipidverbindungen enthalten wie Raps, Canola, Lein, Soja, Sonnen
blumen, Borretsch und Nachtkerze. Aber auch andere Nutzpflanzen,
die Öle oder Lipide und Fettsäuren enthalten, sind gut geeignet,
wie in der eingehenden Beschreibung dieser Erfindung erwähnt.
Mittels herkömmlicher Züchtung sind eine Reihe von Mutanten
pflanzen entwickelt worden, die ein Spektrum an wünschenswerten
Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen produzieren.
Die Selektion neuer Pflanzensorten mit verbesserter Produktion
eines bestimmten Moleküls ist jedoch ein zeitaufwendiges und
schwieriges Verfahren oder sogar unmöglich, wenn die Verbindung
in der entsprechenden Pflanze nicht natürlich vorkommen, wie im
Fall von mehrfach ungesättigten C20-Fettsäuren und C22-Fettsäuren
und solchen mit längeren Kohlenstoffketten.
Die Erfindung stellt neue Nukleinsäuremoleküle bereit, die zur
Identifizierung und Isolierung von Elongasegenen der PUFA-Bio
synthese geeignet sind und zur Modifikation von Ölen, Fettsäuren,
Lipiden, von Lipiden stammenden Verbindungen und am stärksten
bevorzugt zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren ver
wendet werden können, danach wie vor ein großer Bedarf an neuen
Genen, die für Enzyme codieren, die an der Biosynthese unge
sättigter Fettsäuren beteiligt sind und es ermöglichen, diese
in einem technischen Maßstab herzustellen, besteht. Insbesondere
besteht ein Bedarf an Fettsäurebiosyntheseenzymen, die die
Elongation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren bevorzugt mit
zwei oder mehr Doppelbindungen im Molekül ermöglichen. Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäure codieren für Enzyme, die diese
Fähigkeit besitzen.
Mikroorganismen, wie Phaeodactylum, Colpidium, Mortierella, Ent
omophthora, Mucor, Crypthecodinium sowie andere Algen und Pilze
und Pflanzen, insbesondere Ölfruchtpflanzen, werden gemeinhin in
der Industrie zur Produktion einer Vielzahl von Feinchemikalien
im großen Maßstab verwendet.
Unter der Voraussetzung der Verfügbarkeit von Klonierungs
vektoren und Techniken zur genetischen Manipulation der oben
genannten Mikroorganismen und Ciliaten, wie in WO 98/01572 und
WO 00/23604 offenbart, oder Algen und verwandten Organismen,
wie Phaeodactylum tricornutum, beschrieben in Falciatore
et al. [1999, Marine Biotechnology 1(3): 239-251]; sowie Dunahay
et al. [1995, Genetic transformation of diatoms, J. Phycol.
31: 10004-1012] und den Zitaten darin, können die erfindungs
gemäßen Nukleinsäuremoleküle zur gentechnologischen Veränderung
dieser Organismen verwendet werden, so daß sie bessere oder
effizientere Produzenten einer oder mehrerer Feinchemikalien
speziell ungesättigter Fettsäuren werden. Diese verbesserte
Produktion oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie
kann durch eine direkte Wirkung der Manipulation eines
erfindungsgemäßen Gens oder durch eine indirekte Wirkung
dieser Manipulation hervorgerufen werden.
Moose und Algen sind die einzigen bekannten Pflanzensysteme,
die erhebliche Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren,
wie Arachidonsäure (= ARA) und/oder Eicosapentaensäure (= EPA)
und/oder Docosahexaensäure (= DHA) herstellen. Moose enthalten
PUFAs in Membranlipiden während Algen, algenverwandte Organismen
und einige Pilze auch nennenswerte Mengen an PUFAs in der
Triacylglycerolfraktion akkumulieren. Daher eignen sich Nuklein
säuremoleküle, die aus solchen Stämmen isoliert werden, die PUFAs
auch in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren, besonders zur
Modifikation des Lipid- und PUFA-Produktionssystems in einem
Wirt, insbesondere in Mikroorganismen, wie den vorstehend
erwähnten Mikroorganismen, und Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen,
beispielsweise Raps, Canola, Lein, Soja, Sonnenblume, Borretsch,
Rizinus, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius), Kokosnuß,
Erdnuß oder Kakaobohne. Ferner können Nukleinsäuren aus Triacylglycerol-akkumulierenden
Mikroorganismen zur Identifikation
solcher DNA-Sequenzen und Enzyme in anderen Arten, die sich
zur Modifikation der Biosynthese von Vorläufermolekülen von
PUFAs in den entsprechenden Organismen eignen, verwendet werden.
Insbesondere Mikroorganismen wie Crypthecodinium cohnii und
Thraustochytrium species sind Mikrooganismen, die PUFAs wie ARA,
EPA oder DHA in Triacylglycerolen akkumulieren. Thraustochytrien
sind phylogenetisch auch eng verwandt mit den Schizochytrien
Stämmen. Obwohl diese Organismen nicht eng mit Moosen wie
Physcomitrella verwandt sind, sind auf DNA-Sequenz- und ins
besondere Polypeptid-Ebene Sequenzähnlichkeiten in einem solchen
Maße feststellbar, daß DNA-Moleküle in heterologen Hybridi
sierungsexperimenten, Sequenzvergleichen und Experimenten
unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion auch aus evolutiv
weit entfernten Organismen identifizierbar und isolierbar und
funktionell charakterisierbar sind. Insbesondere lassen sich
Konsensussequenzen ableiten, die sich zum heterologen Sichten
oder zur funktionellen Komplementierung und Vorhersage von
Genfunktionen in dritten Arten eignet. Die Fähigkeit, diese
Funktionen zu identifizieren, z. B. die Vorhersage der Substrat
spezifität von Enzymen, kann daher von signifikanter Bedeutung
sein. Ferner können diese Nukleinsäuremoleküle als Bezugs
sequenzen zur Kartierung verwandter Genome oder zur Ableitung
von PCR-Primern dienen.
Die neuen Nukleinsäuremoleküle codieren für Proteine, die hier
als PUFA-spezifische Elongasen (= PSEs oder im Singular PSE)
bezeichnet werden. Diese PSEs können beispielsweise eine Funktion
ausüben, die am Stoffwechsel (z. B. an der Biosynthese oder am
Abbau) von Verbindungen, die zur Lipid- oder Fettsäuresynthese
notwendig sind, wie PUFAs, beteiligt sind oder am Transmembran
transport einer oder mehrerer Lipid-/Fettsäureverbindungen ent
weder in die oder aus der Zelle teilnehmen.
In dieser neuen Anmeldung wird die Isolierung solcher neuen
Elongasegene eingehender dargestellt. Wir haben zum ersten Mal
Elongasegene isoliert, die zur Produktion langkettiger mehrfach
ungesättigter Fettsäuren, vorzugsweise mit mehr als achtzehn oder
zwanzig Kohlenstoffatomen im Kohlenstoffgrundgerüst der Fettsäure
und/oder mindestens zwei Doppelbindungen in der Kohlenstoffkette,
geeignet sind und dabei aus typischen Organismen stammen, die
hohe Mengen an PUFAs in der Triacylgycerolfraktion enthalten.
Daher ist hierin im Singular von einem PSE-Gen oder -Protein die
Rede bzw im Plural von PSE-Genen oder -Proteinen. Andere bekannte
Patentanmeldungen und Publikationen offenbaren oder zeigen kein
funktionell aktives PSE-Gen, obgleich es verschiedene bekannte
Patentanmeldungen gibt, welche die Verlängerung gesättigter
Fettsäuren mit kurzer oder mittlerer Kette (WO 98/46776 und
US 5,475,099) oder die Verlängerung oder Produktion langkettiger
Fettsäuren, die dann aber nicht mehr als eine Doppelbindung
haben oder zu langkettigen Fettsäure-Wachsestern führen (siehe:
WO 98/54954, WO 96/13582, WO 95/15387) zeigen. Die hier vor
liegende Erfindung beschreibt die Isolierung neuartiger Elongasen
mit neuen Eigenschaften. Ausgehend von der in SEQ ID NO: 1
genannten Sequenz konnten, weitere Nukleinsäuren, die für
Elongasen codieren, die ungesättigte Fettsäuren verlängern,
gefunden werden.
WO 99/64616, WO 98/46763, WO 98/46764, WO 98/46765 beschreiben
die Herstellung von PUFAs in transgenen Pflanzen und zeigen die
Klonierung und funktionelle Expression entsprechender Desaturase-
Aktivitäten, insbesondere aus Pilzen, zeigen aber kein PSE
codierendes Gen und keine funktionelle PSE-Aktivität. Die
Expression der Desaturase-Aktivitäten führt zu einer Verschiebung
der Fettsäurezusammensetzung in den transgenen Pflanzen eine
Erhöhung des Gehalts an ungesättigten Fettsäuren wurde nicht
beobachtet. Die Herstellung einer Triensäure mit C18-Kohlenstoff
kette ist gezeigt und anhand von gamma-Linolensäure beansprucht
worden, es wurde jedoch bisher nicht die Herstellung sehr lang
kettiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren (mit C20- und längerer
Kohlenstoffkette sowie von Triensäuren und höher ungesättigten
Typen) gezeigt.
Zur Herstellung langkettiger PUFAs müssen die mehrfach unge
sättigten C16 oder C18-Fettsäuren durch die enzymatische Aktivität
einer Elongase um mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängert
werden. Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1
codiert die erste Pflanzenelongase, die C16 oder C18-Fettsäuren
mit mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure um
mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängern kann. Nach einer
Elongationsrunde führt diese Enzymaktivität zu C20-Fettsäuren,
und nach zwei, drei und vier Elongationsrunden zu C22-, C24-
oder C26-Fettsäuren. Mit Hilfe der weiteren offenbarten Elongasen
(SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7) können ebenfalls
längerkettige PUFAs synthetisiert werden. Diese können sowohl
einzeln als auch additiv zur PUFA Elongase aus dem Moos
Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 1) zur Erhöhung des PUFA
Gehaltes in einem neuen Verfahren zur Produktion von PUFAs ein
gesetzt werden. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Elongasen
führt vorzugsweise zu C20-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppel
bindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei oder vier
Doppelbindungen, besonders bevorzugt drei Doppelbindungen im
Fettsäuremolekül und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei
Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit vier, fünf
oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt mit fünf oder
sechs Doppelbindungen im Molekül. Nachdem die Verlängerung mit
dem erfindungsgemäßen Enzym stattgefunden hat, können weitere
Desaturierungsschritte erfolgen, um die hoch desaturierten Fett
säuren zu erhalten. Daher führen die Produkte der Elongase
aktivitäten und der möglichen weiteren Desaturierung zu bevor
zugten PUFAs mit einem höheren Desaturierungsgrad, wie Docosa
diensäure, Arachidonsäure, ω6-Eicosatriendihomo-γ-linolensäure,
Eicosapentensäure, ω3-Eicosatriensäure, ω3-Eicosatetraensäure,
Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure. Substrate der
erfindungsgemäßen Enzymaktivität sind zum Beispiel Taxolsäure;
7,10,13-Hexadecatriensäure, 6,9-Octadecadiensäure, Linolsäure,
Pinolensäure, α-oder γ±Linolensäure oder Stearidonsäure sowie
Arachidonsäure, Eicosatetraensäure, Docosapentaensäure, Eicosa
pentaensäure. Bevorzugte Substrate sind Linolsäure, γ-Linolen
säure und/oder α-Linolensäure sowie Arachidonsäure, Eicosa
tetraensäure, Docosapentaensäure, Eicosapentaensäure. Besonders
bevorzugt sind Arachidonsäure, Docosapentaensäure, Eicosapentaen
säure. Die C16 oder C18-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppel
bindungen in der Fettsäure können durch die erfindungsgemäße
enzymatische Aktivität in Form der freien Fettsäure oder in
Form der Ester, wie Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide,
Phosphoglyceride, Monoacylglycerin, Diacylglycerin oder Triacyl
glycerin, verlängert werden.
Für die menschliche Ernährung ist konjugierte Linolsäure "CLA"
von besonderer Bedeutung. Unter CLA versteht man insbesondere
Fettsäuren wie C18 : 2 9 Cis, 11trans oder das Isomer C18 : 2 10trans, 12 cis,
die aufgrund menschlicher Enzymsysteme nach Aufnahme im Körper
desaturiert bzw. elongiert werden können und zu gesundheits
fördernden Effekten beitragen können. Mit erfindungsgemäßen
Elongasen können auch solche konjugierten Fettsäuren mit
wenigstens zwei Doppelbindungen im Molekül elongiert werden und
damit solche gesundheitsfördernden Fettsäuren der menschlichen
Ernährung zugeführt werden. Weitere Beispiel für konjugierte
Fettsäuren sind alpha-Parinarsäure, Eleostearinsäure und
Calendulasäure.
Unter der Voraussetzung von Klonierungsvektoren zur Verwendung in
Pflanzen und bei der Pflanzentransformation, wie denjenigen, die
veröffentlicht sind in und dort zitiert sind: Plant Molecular
Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida),
Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene
Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1,
Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic
Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Trans
fer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization,
Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143;
Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991),
205-225)), lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren
zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an
Pflanzen verwenden, so daß diese ein besserer, effizienterer
oder veränderter Produzent eines oder mehrerer von Lipiden herge
leiteter Produkte, wie PUFAs, wird. Diese verbesserte Produktion
oder Effizienz der Produktion eines von Lipiden hergeleiteten
Produktes, wie PUFAs, kann durch direkte Wirkung der Manipulation
oder eine indirekte Wirkung dieser Manipulation hervorgerufen
werden.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung
eines erfindungsgemäßen PSE-Proteins die Ausbeute, Produktion
und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus einer
Ölfruchtpflanze oder einem Mikroorganismus aufgrund eines ver
änderten Proteins direkt beeinflussen kann. Die Anzahl oder
Aktivität des PSE-Proteins oder -Gens kann erhöht sein, so daß
größere Mengen dieser Verbindungen de novo hergestellt werden,
weil den Organismen diese Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese
vor dem Einbringen des entsprechenden Gens fehlte. Auch die
Verwendung verschiedener divergenter, d. h. auf DNA-Sequenzebene
unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein.
Das Einbringen eines PSE-Gens oder mehrerer PSE-Gene in einen
Organismus oder eine Zelle kann nicht nur den Biosynthesefluß
zum Endprodukt erhöhen, sondern auch die entsprechende Triacyl
glycerin-Zusammensetzung erhöhen oder de novo schaffen. Ebenso
kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Import von
Nährstoffen, die zur Biosynthese einer oder mehrerer Feinche
mikalien (z. B. Fettsäuren, polaren und neutralen Lipiden) nötig
sind, erhöht sein, so daß die Konzentration dieser Vorläufer,
Cofaktoren oder Zwischenverbindungen innerhalb der Zellen oder
innerhalb des Speicherkompartiments erhöht ist, wodurch die
Fähigkeit der Zellen zur Produktion von PUFAs, wie im folgenden
beschrieben, weiter gesteigert wird. Fettsäuren und Lipide sind
selbst als Feinchemikalien wünschenswert; durch Optimierung der
Aktivität oder Erhöhung der Anzahl einer oder mehrerer PSEs, die
an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch
Zerstören der Aktivität einer oder mehrerer PSEs, die am Abbau
dieser Verbindungen beteiligt sind, kann es möglich sein, die
Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fett
säure- und Lipidmolekülen aus Pflanzen oder Mikroorganismen zu
steigern.
Die Mutagenese des erfindungsgemäßen PSE-Gens kann auch zu
einem PSE-Protein mit geänderten Aktivitäten führen, welche die
Produktion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien direkt
oder indirekt beeinflussen. Beispielsweise kann die Anzahl oder
Aktivität des erfindungsgemäßen PSE-Gene gesteigert werden, so
daß die normalen Stoffwechselabfälle oder -nebenprodukte der
Zelle (deren Menge möglicherweise aufgrund der Überproduktion
der gewünschten Feinchemikalie erhöht ist) effizient exportiert
werden, bevor sie andere Moleküle oder Prozesse innerhalb der
Zelle (welche die Lebensfähigkeit der Zelle senken würden) zer
stören oder die Biosynthesewege der Feinchemikalie stören würden
(wodurch die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion
der gewünschten Feinchemikalie verringert wird). Ferner können
die relativ großen intrazellulären Mengen der gewünschten Fein
chemikalie selbst toxisch für die Zelle sein oder Enzym-Rück
kopplungsmechanismen, wie die allosterische Regulation, stören,
beispielsweise könnte sie durch Steigerung der Aktivität oder An
zahl anderer stromabwärts folgender Enzyme oder Entgiftungsenzyme
des PUFA-Wegs die Allokation der PUFA in die Triacylgylcerin-
Fraktion steigern, man könnte die Lebensfähigkeit von Saatzellen
erhöhen, was wiederum zu besserer Entwicklung von Zellen in
Kultur oder zu Saaten führt, die die gewünschte Feinchemikalie
produzieren. Das erfindungsgemäße PSE-Gen kann auch so mani
puliert werden, daß die entsprechenden Mengen der verschiedenen
Lipid- und Fettsäuremoleküle hergestellt werden. Dies kann eine
einschneidende Wirkung auf die Lipidzusammensetzung der Membran
der Zelle haben und erzeugt neue Öle zusätzlich zum Auftreten
neusynthetisierter PUFAs. Da jeder Lipidtyp unterschiedliche
physikalische Eigenschaften hat, kann eine Veränderung der Lipid
zusammensetzung einer Membran die Membranfluidität erheblich
verändern. Änderungen der Membranfluidität können sich auf den
Transport von Molekülen über die Membran sowie auf die Unver
sehrtheit der Zelle auswirken, die beide eine entscheidende
Wirkung auf die Produktion von Feinchemikalien besitzen. In
Pflanzen können diese Änderungen überdies auch andere Merk
male, wie Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Streß
situationen, beeinflussen.
Biotische und abiotische Streßtoleranz ist ein allgemeines Merk
mal, das man an ein breites Spektrum von Pflanzen, wie Mais,
Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erd
nuß, Baumwolle, Raps und Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume
und Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine
und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee,
Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölpalme, Kokosnuß) und aus
dauernde Gräser und Futterfeldfrüchte, vererben möchte. Diese
Feldfrüchte sind als weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
auch bevorzugte Zielpflanzen für die Gentechnologie. Besonders
bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie
Sojabohne, Erdnuß, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor, Bäume
(Ölpalme, Kokosnuß) oder Feldfrüchte, wie Mais, Weizen, Roggen,
Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Alfalfa, oder Buschpflanzen
(Kaffee, Kakao, Tee).
Folglich betrifft ein Aspekt der Erfindung isolierte Nuklein
säuremoleküle (z. B. cDNAs), umfassend Nukleotidsequenzen,
die eine PSE oder mehrere PSEs oder biologisch aktive Teile
davon codieren, oder Nukleinsäurefragmente, die sich als Primer
oder Hybridisierungssonden zum Nachweis oder zur Amplifikation
PSE-codierender Nukleinsäuren (z. B. DNA oder mRNA) eignen. Bei
besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das Nukleinsäure
molekül eine der in Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 5
oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleotidsequenzen oder die
codierende Region oder ein Komplement einer dieser Nukleotid
sequenzen. Bei anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen
umfaßt das erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäuremolekül eine
Nukleotidsequenz, die an eine Nukleotidsequenz, wie in der
Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
dargestellt, oder einen Teil davon hybridisiert oder zu min
destens etwa 50%, vorzugsweise mindestens etwa 60%, stärker
bevorzugt mindestens etwa 70%, 80% oder 90% und noch stärker
bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder
mehr dazu ist. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen codiert
das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in der Sequenz
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 8 dar
gestellten Aminosäuresequenzen. Das bevorzugte erfindungsgemäße
PSE-Gen besitzt vorzugsweise auch mindestens eine der hier
beschriebenen PSE-Aktivitäten.
Bei einer weiteren Ausführungsform codiert das isolierte
Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Teil davon, wobei
das Protein oder der Teil davon eine Aminosäuresequenz enthält,
die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 ist, daß
das Protein oder der Teil davon eine PSE-Aktivität beibehält.
Vorzugsweise behält das Protein oder der Teil davon, das/der von
dem Nukleinsäuremolekül codiert wird, die Fähigkeit, am Stoff
wechsel von zum Aufbau von Zellmembranen von Pflanzen notwendigen
Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen
teilzunehmen. Bei einer Ausführungsform ist das von dem Nuklein
säuremolekül codierte Protein zu mindestens etwa 50%, vorzugs
weise mindestens etwa 60% und stärker bevorzugt mindestens etwa
70%, 80% oder 90% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa
95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer Amino
säuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6 und
SEQ ID NO: 8. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist
das Protein ein Vollängen-Protein, das im wesentlichen in Teilen
homolog zu einer gesamten Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 (die von dem in
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 gezeigten
offenen Leserahmen herrührt) ist und in Vollänge mit dem Fachmann
geläufigen Methoden und Experimenten isolierbar ist.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform rührt das isolierte
Nukleinsäuremolekül von, Physcomitrella patens, Crypthecodinium
cohnii oder Thraustochytrium her und codiert ein Protein (z. B.
ein PSE-Fusionsprotein), das eine biologisch aktive Domäne
enthält, die zu mindestens etwa 50% oder mehr homolog
zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 ist und die Fähigkeit, am Stoff
wechsel von zum Aufbau von Zellmembranen von Pflanzen notwendigen
Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen
teilzunehmen, beibehält oder zumindest eine der Elongations
aktivitäten resultierend in PUFAs wie ARA, EPA oder DHA oder
deren Vorläufermoleküle oder eine der in der Tabelle 1 aufge
führten Aktivitäten besitzt, und umfaßt auch heterologe Nuklein
säuresequenzen, die ein heterologes Polypeptid oder regula
torische Proteine codieren.
Bei einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Nukleinsäure
molekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter
stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das eine
Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder
SEQ ID NO: 7 enthält. Vorzugsweise entspricht das isolierte
Nukleinsäuremolekül einem natürlich vorkommenden Nukleinsäure
molekül. Stärker bevorzugt codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül
natürlich vorkommende Crypthecodiniun- oder Thrausto
chytrium-PSE oder einen biologisch aktiven Teil davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, z. B.
rekombinante Expressionsvektoren, die mindestens ein erfindungs
gemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten, und Wirtszellen, in die
diese Vektoren eingebracht worden sind, insbesondere Mikro
organismen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe, -organe oder ganze
Pflanzen. Bei einer Ausführungsform kann eine solche Wirtszelle
Feinchemikalien-Verbindungen, insbesondere PUFAs, speichern; zur
Isolation der gewünschten Verbindung werden die Zellen geerntet.
Die Verbindung (Öle, Lipide, Triacylglyceride, Fettsäuren) oder
die PSE können dann aus dem Medium oder der Wirtszelle, welche
bei Pflanzen Zellen sind, die Feinchemikalien enthalten oder
speichern, am stärksten bevorzugt Zellen von Speichergeweben,
wie Samenhüllen, Knollen, Epidermis- und Samenzellen, isoliert
werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine genetisch
veränderte Pflanze, bevorzugt ein Ölfruchtpflanze, wie vor
stehend erwähnt, besonders bevorzugt eine Raps-, Lein- oder
Physcomitrella patens-Pflanze, in die ein PSE-Gen eingebracht
worden ist. Bei einer Ausführungsform ist das Genom von
Raps, Lein oder Physcomitrella patens durch Einbringen eines
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, das eine Wildtyp- oder
mutierte PSE-Sequenz codiert, als Transgen verändert worden. Bei
einer anderen Ausführungsform ist ein endogenes PSE-Gen im Genom
der Spenderorganismen Physcomitrella patens, Crypthecodinium oder
Thraustochytrium beispielsweise durch homologe Rekombination mit
einem veränderten PSE-Gen oder Mutagenese und Detektion mittels
DNA-Sequenzen verändert, das heißt funktionell zerstört worden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform gehört der Pflanzen
organismus zur Gattung Physcomitrella, Ceratodon, Funaria,
Raps oder Lein, wobei Physcomitrella, Raps oder Lein bevorzugt
ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird Physcomitrella,
Raps oder Lein auch zur Produktion einer gewünschten Verbindung,
wie Lipiden und Fettsäuren, wobei PUFAs besonders bevorzugt sind,
verwendet.
Bei noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das
Moos Physcomitrella patens zur Demonstration der Funktion eines
Elongasegens unter Verwendung homologer Rekombination auf der
Basis der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuren ver
wendet werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes
PSE-Gen oder einen Teil, z. B. einen biologisch aktiven Teil,
davon. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die isolierte
PSE oder ein Teil davon am Stoffwechsel von zum Aufbau von
Zellmembranen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanzenzelle
notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über
dessen/deren Membranen teilnehmen. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform ist die isolierte PSE oder der Teil davon aus
reichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 das dieses Protein oder
der Teil davon die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von
Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzenzellen notwendigen
Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen
teilzunehmen, beibehält.
Die Erfindung stellt auch eine isolierte Präparation einer PSE
bereit. Bei bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das PSE-Gen eine
Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und
SEQ ID NO: 8. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein isoliertes Vollängenprotein, das im
wesentlichen homolog zu einer gesamten Aminosäuresequenz der
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 (die von
den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7
gezeigten offenen Leserahmen codiert werden) ist. Bei einer
weiteren Ausführungsform ist das Protein zu mindestens etwa 50%,
vorzugsweise mindestens etwa 60% und stärker bevorzugt minde
stens etwa 70%, 80% oder 90% und am stärksten bevorzugt min
destens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu
einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8. Bei anderen Ausführungsformen umfaßt
die isolierte PSE eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens etwa
50% homolog zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 ist und am Stoffwechsel
von zum Aufbau von Fettsäuren in einem Mikroorganismus oder einer
Pflanzenzelle notwendigen Verbindungen oder am Transport von
Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann oder eine oder
mehrere der PUFA-verlängernden Aktivitäten hat, wobei die Ver
längerung vorteilhaft von desaturierten C16 oder C18- oder
C20-Kohlenstoffketten mit Doppelbindungen an mindestens zwei
Stellen erfolgt.
Alternativ kann die isolierte PSE eine Aminosäuresequenz um
fassen, die von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die an eine
Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 hybridisiert, z. B. unter stringenten Bedingungen
hybridisiert, oder zu mindestens etwa 50%, vorzugsweise min
destens etwa 60%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70%, 80%
oder 90% und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%,
97%, 98%, 99% oder mehr homolog dazu ist. Es ist ebenfalls
bevorzugt, daß die bevorzugten PSE-Formen ebenfalls eine der hier
beschriebenen PSE-Aktivitäten besitzen.
Das PSE-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon kann
funktionsfähig mit einem nicht-PSE-Polypeptid verbunden werden,
so daß ein Fusionsprotein gebildet wird. Bei bevorzugten Aus
führungsformen hat dieses Fusionsprotein eine Aktivität, die
sich von derjenigen der PSE allein unterscheidet. Bei anderen
bevorzugten Ausführungsform nimmt dieses Fusionsprotein am Stoff
wechsel von Verbindungen, die zur Synthese von Lipiden und Fett
säuren, Cofaktoren und Enzymen in Mikroorganismen oder Pflanzen
notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese
Membranen teil. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen
moduliert das Einbringen dieses Fusionsproteins in eine Wirts
zelle die Produktion einer gewünschten Verbindung durch die
Zelle. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthalten diese
Fusionsproteine auch Δ4-, Δ5- oder Δ6-, Δ8-, Δ15-, Δ17- oder
Δ19-Desaturase-Aktivitäten allein oder in Kombination.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung einer Feinchemikalie. Dieses Verfahren beinhaltet
entweder die Züchtung eines geeigneten Mikroorganismus oder
die Züchtung von Pflanzenzellen, -geweben, -organen oder ganzen
Pflanzen, umfassend die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen der
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder ihre
Homologen, Derivate oder Analoga oder ein Genkonstrukt, das die
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder
ihre Homologen, Derivate oder Analoga umfaßt, oder einen Vektor,
der diese Sequenzen oder das Genkonstrukt umfaßt, welches die
Expression eines erfindungsgemäßen PSE-Nukleinsäuremoleküls her
beiführt, so daß eine Feinchemikalie produziert wird. Bei einer
bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren ferner den
Schritt des Gewinnens einer Zelle, die eine solche erfindungs
gemäße Elongase-Nukleinsäuresequenz enthält, wobei eine Zelle
mit einer Elongase-Nukleinsäuresequenz, einem Genkonstrukt oder
einem Vektor, welche die Expression einer erfindungsgemäßen PSE-
Nukleinsäure herbeiführen, transformiert wird. Bei einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform umfaßt dieses Verfahren ferner den
Schritt des Gewinnens der Feinchemikalie aus der Kultur. Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform gehört die Zelle zur
Ordnung der Ciliaten, zu Mikroorganismen, wie Pilzen, oder zum
Pflanzenreich, insbesondere zu Ölfruchtpflanzen, besonders bevor
zugt sind Mikroorganismen oder Ölfruchtpflanzen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur
Modulation der Produktion eines Moleküls durch einen Mikro
organismus. Diese Verfahren umfassen das Zusammenbringen der
Zelle mit einer Substanz, welche die PSE-Aktivität oder die
PSE-Nukleinsäureexpression moduliert, so daß eine zellassoziierte
Aktivität relativ zu der gleichen Aktivität in Abwesenheit der
Substanz verändert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
wird/werden ein oder zwei Stoffwechselweg(e) der Zelle für Lipide
und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzyme moduliert oder der Trans
port von Verbindungen über diese Membranen moduliert, so daß die
Ausbeute oder die Rate der Produktion einer gewünschten Fein
chemikalie durch diesen Mikroorganismus verbessert ist. Die
Substanz, welche die PSE-Aktivität moduliert, kann eine Substanz
sein, welche die PSE-Aktivität oder PSE-Nukleinsäureexpression
stimuliert oder die als Zwischenprodukt bei der Fettsäurebio
synthese verwendet werden kann. Beispiele für Substanzen, welche
die PSE-Aktivität oder PSE-Nukleinsäureexpression stimulieren,
sind u. a. kleine Moleküle, aktive PSEs sowie PSEs-codierende
Nukleinsäuren, die in die Zelle eingebracht worden sind. Bei
spiele für Substanzen, welche die PSE-Aktivität oder -Expression
hemmen, sind u. a. kleine Moleküle und/oder Antisense-PSE-Nuklein
säuremoleküle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur
Modulation der Ausbeuten einer gewünschten Verbindung aus einer
Zelle, umfassend das Einbringen eines Wildtyp- oder Mutanten-PSE-
Gens, das entweder auf einem separaten Plasmid gehalten oder in
das Genom der Wirtszelle integriert wird, in eine Zelle. Bei
Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein
oder durch derartige Rekombination erfolgen, daß das native Gen
durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion
der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder
durch Verwendung eines Gens in trans, so daß das Gen mit einer
funktionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die
Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens
eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten Gens
gewährleistende Sequenz enthält, funktionell verbunden ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Ausbeuten
modifiziert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird
die gewünschte Chemikalie vermehrt, wobei unerwünschte störende
Verbindungen vermindert werden können. Bei einer besonders bevor
zugten Ausführungsform ist die gewünschte Feinchemikalie ein
Lipid oder eine Fettsäure, ein Cofaktor oder ein Enzym. Bei
besonders bevorzugten Ausführungsform ist diese Chemikalie eine
mehrfach ungesättigte Fettsäure. Stärker bevorzugt ist sie ausgewählt
aus Arachidonsäure (= ARA), Eicosapentaensäure (= EPA)
oder Docosahexaensäure (= DHA).
Die vorliegende Erfindung stellt PSE-Nukleinsäuren und -Protein
moleküle bereit, die am Stoffwechsel von Lipiden und Fettsäuren,
PUFA-Cofaktoren und Enzymen in dem Moos Physcomitrella patens,
Crypthecodinium oder Traustochytrium oder am Transport lipophiler
Verbindungen über Membranen beteiligt sind. Die erfindungsgemäßen
Verbindungen lassen sich zur Modulation der Produktion von Fein
chemikalien aus Organismen, beispielsweise Mikroorganismen, wie
Ciliaten, Pilzen, Hefen, Bakterien, Algen, und/oder Pflanzen,
wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Soja
bohne, Erdnuß, Baumwolle, Brassica-Arten, wie Raps, Canola und
Rübsen, Pfeffer, Sonnenblume, Borretsch, Nachtkerze und Tagetes,
Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate,
Vicia-Arten, Erbse, Maniok, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee,
Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölpalme, Kokosnuß) und aus
dauernden Gräsern und Futterfeldfrüchten, entweder direkt (z. B.
wenn die Überexpression oder Optimierung eines Fettsäurebio
synthese-Proteins einen direkten Einfluß auf die Ausbeute,
Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Fettsäure aus
modifizierten Organismen hat) verwenden oder können eine indirekt
Auswirkung haben, die dennoch zu einer Steigerung der Ausbeute,
Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten
Verbindung oder einer Abnahme unerwünschter Verbindungen führt
(z. B. wenn die Modulation des Stoffwechsels von Lipiden und
Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen zu Veränderungen der Ausbeute,
Produktion und/oder Effizienz der Produktion oder der Zusammen
setzung der gewünschten Verbindungen innerhalb der Zellen führt,
was wiederum die Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien
beeinflussen kann). Aspekte der Erfindung sind nachstehend weiter
erläutert.
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und
umfaßt Moleküle, die durch einen Organismus produziert worden
sind und Anwendungen in verschiedenen Industrien finden, wie,
aber nicht beschränkt auf, die pharmazeutische, Landwirt
schafts-, Nahrungsmittel- und Kosmetik-Industrie. Diese Ver
bindungen umfassen Lipide, Fettsäuren, Cofaktoren und Enzyme
usw. (wie z. B. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides
and related compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm
et al., Hrsgb., VCH: Weinheim und darin enthaltenen Literatur
stellen), Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (z. B.
Arachidonsäure), Vitamine und Cofaktoren (wie beschrieben
in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27,
Vitamins, S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und darin enthaltenen
Literaturstellen; und Ong, A. S., Niki, E., & Packer, L. (1995)
Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/
Confederation of Scientific and Technological Associations in
Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien,
abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS
Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983)
in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN:
0818805086, und darin angegebenen Literaturstellen beschriebenen
Chemikalien. Der Stoffwechsel und die Verwendungen bestimmter
Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.
Die Kombination verschiedener Vorläufermoleküle und Biosynthese
enzyme führt zur Herstellung verschiedener Fettsäuremoleküle, was
eine entscheidende Auswirkung auf die Zusammensetzung der Membran
hat. Es kann angenommen werden, daß PUFAs nicht nur einfach in
Triacylglycerin, sondern auch in Membranlipide eingebaut werden.
Die Synthese von Membranen ist ein gut charakterisierter Prozeß,
an dem eine Anzahl von Komponenten, einschließlich Lipiden als
Teil der Bilayer-Membran, beteiligt sind. Die Produktion neuer
Fettsäuren, wie PUFAs, kann daher neue Eigenschaften von Membran
funktionen innerhalb einer Zelle oder eines Organismus erzeugen.
Zellmembranen dienen einer Vielzahl von Funktionen in einer
Zelle. Zuerst und in erster Linie grenzt eine Membran den Inhalt
einer Zelle von der Umgebung ab, wodurch sie der Zelle Integrität
verleiht. Membranen können auch als Schranken gegenüber dem
Einstrom gefährlicher oder unerwünschter Verbindungen und auch
gegenüber dem Ausstrom gewünschter Verbindungen dienen.
Detailliertere Beschreibungen und Beteiligungen von Membranen
und die beteiligten Mechanismen siehe in: Bamberg, E., et al.
(1993) Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes,
Q. Rev. Biophys. 26: 1-25; Gennis, R. B. (1989) Pores, Channels
and Transporters, in: Biomembranes, Molecular Structure and
Function, Springer: Heidelberg, S. 270-322; und Nikaido, H.,
und Saier, H. (1992) Transport proteins in bacteria: common
themes in their design, Science 258: 936-942, und den in jeder
dieser Literaturstellen enthaltenen Zitaten.
Die Lipidsynthese läßt sich in zwei Abschnitte unterteilen:
die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an sn-Glycerin-3-
Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer polaren
Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Membranen verwendet werden,
umfassen Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide und Phospho
glyceride. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der Umwandlung von
Acetyl-CoA entweder in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxy
lase oder in Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach
einer Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle
zusammen Acetoacetyl-ACP, das über eine Reihe von Kondensations-,
Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so
daß ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Ketten
länge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren
aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen kataly
siert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff
oder anaerob (bezüglich der Fettsäuresynthese in Mikroorganismen
siehe F. C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella.
ASM Press: Washington, D. C., S. 612-636 und darin enthaltene
Literaturstellen; Lengeler et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of
Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene
Literaturstellen, sowie Magnuson, K., et al. (1993) Micro
biological Reviews 57: 522-542 und die enthaltenen Literatur
stellen).
Vorläufer für die PUFA-Biosynthese sind beispielsweise Linol-
und Linolensäure. Diese C18-Kohlenstoff-Fettsäuren müssen auf
C20 oder C22 verlängert werden, damit Fettsäuren vom Eicosa-
und Docosa-Kettentyp erhalten werden. Mit Hilfe verschiedener
Desaturasen, wie Enzymen, welche Δ6-Desaturase-, Δ5- und
Δ4-Desaturaseaktivität aufweisen, können Arachidonsäure,
Eicosapentensäure und Docosahexaensäure sowie verschiedene
andere langkettige PUFAs erhalten, extrahiert und für ver
schiedene Zwecke bei Nahrungsmittel-, Futter-, Kosmetik- oder
pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden.
Zur Herstellung langkettiger PUFAs müssen, wie oben erwähnt,
die mehrfach ungesättigten C16 oder C18- bzw C20-Fettsäuren um
mindestens zwei Kohlenstoffatome durch die Enzymaktivität einer
Elongase verlängert werden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure
sequenzen codieren erste mikrobielle Elongasen aus typischen PUFA
in der Triacylglycerolfraktion enthaltenden Produzenten, die C16
oder C18- bzw C20-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen
in der Fettsäure um mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängern
können oder dies z. B. sequentiell nacheinander durch Überführen
einer C16 oder C18-Fettsäure in eine C20-Fettsäure und dann eine
C20- in eine C22 oder höhere geradzahlinge 2C-Atomeinheiten ent
haltende Fettsäure überführt. Nach einer Elongationsrunde führt
diese Enzymaktivität zu C20-Fettsäuren, und nach zwei, drei und
vier Elongationsrunden zu C22-, C24- oder C26-Fettsäuren. Mit der
erfindungsgemäßen Elongase können auch längere PUFAs syntheti
siert werden. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Elongasen führt
vorzugsweise zu C20- und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei
Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, C20-Fettsäuren vorzugsweise
mit drei, vier oder fünf Doppelbindungen, besonders bevorzugt
drei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, C22-Fettsäuren vorzugs
weise mit drei, vier fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders
bevorzugt fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül.
Nach der Elongation mit dem erfindungsgemäßen Enzym können
weitere Desaturierungsschritte erfolgen. Daher führen die
Produkte der Elongaseaktivitäten und der möglichen weiteren
Desaturierung zu bevorzugten PUFAs mit höherem Desaturierungs
grad, wie Docosadiensäure, Arachidonsäure, ω6-Eicosatriendi
homo-γ-linolensäure, Eicosapentaensäure, ω3-Eicosatriensäure,
ω3-Eicosatetraensäure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure.
Substrate dieser erfindungsgemäßen Enzymaktivität sind zum
Beispiel Taxolsäure, 7,10,13-Hexadecatriensäure, 6,9-Octadeca
diensäure, Linolsäure, γ-Linolensäure, Pinolensäure, α-Linolen
säure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure oder Stearidonsäure.
Bevorzugte Substrate sind Linolsäure, γ-Linolensäure und/oder
α-Linolensäure bzw Arachidonsäure, Eicosatetraensäure oder
Eicosapentaensäure. Die C16 oder C18- oder C20-Fettsäuren mit
mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure können durch die
erfindungsgemäße Enzymaktivität in Form der freien Fettsäure oder
in Form der Ester, wie Phospholipide, Glykolipide, Sphingolipide,
Phosphoglyceride, Monoacylglycerin, Diacylglycerin oder Triacyl
glycerin, verlängert werden.
Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene
Modifikationen transportiert und in das Triacylglycerin-
Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt
bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die
polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure-
Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5): 161-166).
Veröffentlichungen über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese,
Desaturierung, den Lipidstoffwechsel und Membrantransport
von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäure
modifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und
-Assemblierung einschließlich der Literaturstellen darin siehe
in den folgenden Artikeln: Kinney, 1997, Genetic Engeneering,
Hrsgb.: JK Setlow, 19: 149-166; Ohlrogge und Browse, 1995, Plant
Cell 7: 957-970; Shanklin und Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 611-641; Voelker, 1996, Genetic
Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18: 111-13; Gerhardt, 1992, Prog.
Lipid R. 31: 397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim.
Biophys Acta 1256: 181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res.
34: 267-342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular
Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.:
Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant
Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal.
13(1): 1-16.
Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutical, wie PUFAs, umfassen eine
Gruppe von Molekülen, die höhere Tiere nicht mehr synthetisieren
können und somit aufnehmen müssen oder die höhere Tiere nicht
mehr ausreichend selbst herstellen können und somit zusätzlich
aufnehmen müssen, obwohl sie leicht von anderen Organismen, wie
Bakterien, synthetisiert werden. Die Biosynthese dieser Moleküle
in Organismen, die sie produzieren können, wie in Bakterien,
ist im großen und ganzen charakterisiert worden (Ullmann's
Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27,
S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical
Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology,
John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E., & Packer, L. (1995)
"Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the
UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations
in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia,
abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press,
Champaign, IL X, 374 S).
Die oben erwähnten Moleküle sind entweder selbst biologisch
aktive Moleküle oder Vorstufen biologisch aktiver Substanzen, die
entweder als Elektronenüberträger oder Zwischenprodukte bei einer
Vielzahl von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben
neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert
als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Ver
arbeitungshilfsstoffe. (Einen Überblick über Struktur, Aktivität
und industrielle Anwendungen dieser Verbindungen siehe z. B.
in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins",
Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Mehrfach ungesättigte
Fettsäuren haben verschiedene Funktionen und gesundheitsfördernde
Wirkungen, beispielsweise bei koronarer Herzerkrankung, Ent
zündungsmechanismen, Kinderernährung usw. Veröffentlichungen
und Literaturstellen, einschließlich darin zitierter Literatur
stellen, siehe in: Simopoulos, 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70
(3. Suppl.): 560-569, Takahata et al., Biosc. Biotechnol. Biochem.
1998, 62(11): 2079-2085, Willich und Winther, 1995, Deutsche
Medizinische Wochenschrift 120(7): 229ff.
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der
Entdeckung neuer Moleküle, die hier als PSE-Nukleinsäure- und
-Proteinmoleküle bezeichnet werden, welche eine Wirkung auf
die Produktion von Zellmembranen in Physcomitrella patens,
Crypthecodinium cohnii, Thraustochytrium und/oder Ceratodon
purpureus ausüben und beispielsweise die Bewegung von Molekülen
über diese Membranen beeinflussen. Bei einer Ausführungsform
nehmen die PSE-Moleküle am Stoffwechsel von zum Aufbau von
Zellmembranen in Organismen, wie Mikroorganismen und Pflanzen,
notwendigen Verbindungen teil oder beeinflussen indirekt den
Transport von Molekülen über diese Membranen. Bei einer bevor
zugten Ausführungsform hat die Aktivität der erfindungsgemäßen
PSE-Moleküle zur Regulation der Produktion von Membrankomponenten
und des Membrantransports eine Auswirkung auf die Produktion der
gewünschten Feinchemikalie durch diesen Organismus. Bei einer
besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität der
erfindungsgemäßen PSE-Moleküle moduliert, so daß die Ausbeute,
Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Stoffwechselwege
von Mikroorganismen oder Pflanzen, welche die erfindungsgemäßen
PSEs regulieren, moduliert sind und die Effizienz des Transport
von Verbindungen durch die Membranen verändert ist, was entweder
direkt oder indirekt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz
der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch Mikro
organismen und Pflanzen moduliert.
Der Begriff PSE oder PSE-Polypeptid umfaßt Proteine, die am
Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Organismen,
wie Mikroorganismen und Pflanzen, notwendigen Verbindungen oder
am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen. Bei
spiele für PSEs sind in der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5
und SEQ ID NO: 7 oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga
offenbart. Die Begriffe PSE oder PSE-Nukleinsäuresequenz(en) um
fassen Nukleinsäuresequenzen, die eine PSE codieren und bei denen
ein Teil eine codierende Region und ebenfalls entsprechende 5'-
und 3'-untranslatierte Sequenzbereiche sein können. Beispiele
für PSE-Gene sind die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5
und SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenzen. Die Begriffe Produktion
oder Produktivität sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten
die Konzentration des Fermentationsproduktes (zum Beispiel der
gewünschten Feinchemikalie), das in einer bestimmten Zeitspanne
und einem bestimmten Fermentationsvolumen gebildet wird (z. B.
kg Produkt pro Stunde pro Liter). Der Begriff Effizienz der
Produktion umfaßt die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten
Produktionsmenge nötig ist (z. B. wie lange die Zelle zur Auf
richtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie
benötigt). Der Begriff Ausbeute oder Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute
ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Effizienz der Umwandlung
der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d. h. die Feinchemikalie).
Dies wird gewöhnlich beispielsweise ausgedrückt als kg Produkt
pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Erhöhen der Ausbeute oder
Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle
oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in
einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum
erhöht. Die Begriffe Biosynthese oder Biosyntheseweg sind im
Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung,
vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus
Zwischenverbindungen, beispielsweise in einem Mehrschritt- und
stark regulierten Prozeß. Die Begriffe Abbau oder Abbauweg sind
im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung,
vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle
in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger
komplexe Moleküle) beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark
regulierten Prozeß. Der Begriff Stoffwechsel ist im Fachgebiet
bekannt und umfaßt die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen,
die in einem Organismus stattfinden. Der Stoffwechsel einer
bestimmten Verbindung (z. B. der Stoffwechsel einer Fettsäure)
umfaßt dann die Gesamtheit der Biosynthese-, Modifikations- und
Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle, die diese Verbindung
betreffen.
Bei einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen
PSE-Moleküle die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie
einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus oder in Pflanzen
modulieren. Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die
Veränderung einer erfindungsgemäßen PSR die Ausbeute, Produktion
und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus
einem Mikroorganismus- oder Pflanzenstamm, die dieses veränderte
Protein enthalten, direkt beeinflussen kann. Die Anzahl oder
Aktivität von PSEs, die am Transport von Feinchemikalienmolekülen
innerhalb oder aus der Zelle beteiligt sind, kann erhöht werden,
so daß größere Mengen dieser Verbindungen über Membranen trans
portiert werden, aus denen sie leichter gewonnen und ineinander
umgewandelt werden. Ferner sind Fettsäuren, Triacylglycerine
und/oder Lipide selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch
Optimierung der Aktivität oder Steigern der Anzahl einer oder
mehrerer erfindungsgemäßer PSEs, die an der Biosynthese dieser
Verbindungen beteiligt sind, oder durch Stören der Aktivität
einer oder mehrerer PSEs, die am Abbau dieser Verbindungen
beteiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion
und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipid
molekülen aus Organismen, wie Mikroorganismen oder Pflanzen,
zu erhöhen.
Die Mutagenese des erfindungsgemäßen PSE-Gens kann auch PSEs
mit veränderten Aktivitäten hervorbringen, welche die Produktion
einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien aus Mikro
organismen oder Pflanzen indirekt beeinflussen. Beispielsweise
können erfindungsgemäße PSEs, die am Export von Abfallprodukten
beteiligt sind, eine größere Anzahl oder höhere Aktivität auf
weisen, so daß die normalen Stoffwechselabfälle der Zelle (deren
Menge möglicherweise aufgrund der Überproduktion der gewünschten
Feinchemikalie erhöht ist) effizient exportiert werden, bevor
sie die Moleküle in der Zelle schädigen können (was die Lebens
fähigkeit der Zelle herabsetzen würde) oder die Feinchemikalien-
Biosynthesewege stören können (was die Ausbeute, Produktion oder
Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie senken
würde). Die relativ großen intrazellulären Mengen der gewünschten
Feinchemikalie selbst können ferner für die Zelle toxisch sein,
so daß man durch Steigern der Aktivität oder Anzahl von Trans
portern, die diese Verbindungen aus der Zelle exportieren können,
die Lebensfähigkeit der Zelle in Kultur steigern kann, was
wiederum zu einer größeren Anzahl an Zellen in der Kultur führt,
welche die gewünschte Feinchemikalie produzieren. Die erfindungs
gemäßen PSEs können auch so manipuliert werden, daß die ent
sprechenden Mengen unterschiedlicher Lipid- und Fettsäuremoleküle
produziert werden. Dies kann eine erhebliche Auswirkung auf die
Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp
unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufweist, kann eine
Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die Membran
fluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität
können den Transport von Molekülen über die Membran sowie die
Integrität der Zelle beeinflussen, was jeweils eine erhebliche
Auswirkung auf die Produktion von Feinchemikalien aus Mikro
organismen und Pflanzen in Fermentationskultur im großen Maß
stab hat. Pflanzenmembranen verleihen spezifische Eigenschaften,
wie Toleranz gegenüber Wärme, Kälte, Salz, Trockenheit sowie
Toleranz gegen Pathogene, wie Bakterien und Pilze. Daher kann
die Modulation der Membrankomponenten eine grundlegende Wirkung
auf die Überlebensfähgikeit der Pflanzen unter den oben genannten
Streßparametern haben. Dies kann über Änderungen in Signal
kaskaden oder direkt über die veränderte Membranzusammensetzung
erfolgen (siehe zum Beispiel: Chapman, 1998, Trends in Plant
Science, 3(11): 419-426) und Signalkaskaden (siehe Wang 1999,
Plant Physiology, 120: 645-651) oder die Kältetoleranz, wie
offenbart in WO 95/18222, beeinflussen.
Die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenzen sind
beispielsweise im Genom eines Thraustochytrium-Stamms enthalten,
der über die American Type Culture Collection (ATCC-Samnlung) mit
der Stammnummer ATCC26185 (Thraustochytrium) verfügbar ist, bzw
im Fall von Crypthecodinium beispielsweise vom Provasoli-Guillard
National Center for Culture of Marine Phytoplancton ((CCMP) West
Boothbay Harbour, ME, USA)mit der Stammkultur-Nr. CCMP316 zugäng
lich ist.
Die Nukleotidsequenz der isolierten Physcomitrella, Crypthe
codinium- oder Thraustochytrium -cDNA und die abgeleiteten
Aminosäuresequenzen der Physcomitrella patens-PSEs sind in den
SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 8 gezeigt. Es wurden Computeranalysen
durchgeführt, die diese Nukleotidsequenzen als Sequenzen klassi
fizieren und/oder identifizieren, die am Stoffwechsel von Zell
membrankomponenten beteiligte Proteine oder am Transport von
Verbindungen über Zellmembranen beteiligte Proteine bzw. der
PUFA Biosynthese codieren. ESTs mit der Datenbankeingabe-Nr.
PP001019019F, CC001042041R sowie TC002034029R und TC002014093R
in der Datenbank des Erfinders stellen die erfindungsgemäßen
Sequenzen in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 dar. Auf analoge Weise wurden die partiellen
Polypeptide als PP001019019F, CC001042041R sowie TC002034029R
und TC002014093R bezeichnet und stellen die erfindungsgemäßen
Sequenzen in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und
SEQ ID NO: 8 gemäß Tabelle 2 dar. Das vollständige Fragment-
Insert des ESTs TC002034029R wurde sequenziert und ergab die
SEQ ID NO: 3, welche die vollständige Sequenz von TC002034029R
ist. Die Namensgebung der übrigen Klone ist analog. Zudem
wurde den verschiedenen Klonen Gennamen entsprechend zugewiesen.
Abkürzungen: Tc = Thraustochytrium, Cc = Crypthecodinium,
Pp = Physcomitrella patens.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Proteine mit einer Amino
säuresequenz, die im wesentlichen homolog zu einer Aminosäure
sequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8
ist. Wie hier verwendet, ist ein Protein mit einer Aminosäure
sequenz, die im wesentlichen homolog zu einer ausgewählten Amino
säuresequenz ist, zu mindestens etwa 50% homolog zu der aus
gewählten Aminosäuresequenz, z. B. der gesamten ausgewählten
Aminosäuresequenz. Ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die
im wesentlichen homolog zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz
ist, kann auch zu mindestens etwa 50 bis 60%, vorzugsweise
mindestens etwa 60 bis 70% und stärker bevorzugt mindestens
etwa 70 bis 80%, 80 bis 90% oder 90 bis 95% und am stärksten
bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homo
log zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz sein.
Die erfindungsgemäße PSE oder der biologisch aktive Teil oder
das Fragment davon kann am Stoffwechsel von zum Aufbau von
Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendigen
Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen
teilnehmen oder eine oder mehrere der zur Elongation von C16 oder
C18- bzw C20-PUFAs benötigten Aktivitäten besitzen, so daß C20-,
C22- oder C24-PUFAs sowie verwandte PUFAs erhalten werden.
Verschiedene Aspekte der Erfindung sind eingehender in den
folgenden Unterabschnitten beschrieben.
Eine Ausführungsform der Erfindung sind isolierte Nukleinsäuren,
die von PUFA produzierenden Mikroorganismen stammen und für Poly
peptide codieren, die C16 oder C18-Fettsäuren mit mindestens zwei
Doppelbindungen in der Fettsäure um mindestens zwei Kohlenstoff
atome verlängern oder C20-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppel
bindungen in der Fettsäure um mindestens zwei Kohlenstoffatome
verlängern.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sind isolierte
Nukleinsäuren, umfassend Nukleotidsequenzen, die für Polypeptide
codieren, die C16, C28- oder C20-Fettsäuren mit mindestens zwei
Doppelbindungen in der Fettsäure verlängern und ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus
- a) den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenzen,
- b) einer Nukleinsäuresequenz, die gemäß dem degenerierten genetischen Code von einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenzen stammt, oder
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz, die für Polypeptide der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.
Die oben genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die als
C16-, C18- oder C20-Elongase wirken, stammen von Organismen,
wie Ciliaten, Pilzen, Algen, Pflanzen oder Dinoflagellaten,
die PUFAs synthetisieren können, vorzugsweise von Pflanzen oder
Algen, besonders bevorzugt aus der Gattung Physcomitrella,
Crypthecodinium, Thraustochytrium oder Schizochytrium und am
stärksten bevorzugt von Physcomitrella patens, Crypthecodinium
cohnii oder Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp. oder nah
verwandten Organismen.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäure
moleküle, die PSE-Polypeptide oder biologisch aktive Teile davon
codieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als
Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Ampli
fizierung einer PSE-codierenden Nukleinsäure (z. B. PSE-DNA) aus
reichen. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", wie hier verwendet,
soll DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Mole
küle (z. B. mRNA) sowie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleo
tidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfaßt zudem
die am 3'- und am 5'-Ende des codierenden Genbereichs gelegene
untranslatierte Sequenz: mindestens etwa 100 Nukleotide der
Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes des codierenden Bereichs und
mindestens etwa 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des
3'-Endes des codierenden Genbereichs. Das Nukleinsäuremolekül
kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugs
weise doppelsträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül
wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der
natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorliegen. Eine "isolierte"
Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, welche die
Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die
Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (z. B. Sequenzen,
die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden). Bei
verschiedenen Ausführungsformen kann das isolierte PSE-Nuklein
säuremolekül zum Beispiel weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb,
2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten,
die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen
DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (z. B. eine
Physcomitrella patens-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes"
Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, kann überdies im
wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kultur
medium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt
wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien
sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, z. B. ein Nukleinsäure
molekül mit einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder eines Teils davon, kann unter
Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier
bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch kann
mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen beispielsweise eine homologe
Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA oder
Aminosäureebene identifiziert werden. Beispielsweise kann eine
Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder Thraustochtrium-cDNA aus
einer Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder Thraustochtrium-Bank
isoliert werden, indem die vollständige SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 5 und/oder SEQ ID NO: 7 oder ein Teil davon als Hybridi
sierungssonde sowie Standard-Hybridisierungstechniken (wie z. B.
beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet
werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend
eine vollständige Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 oder einen Teil davon, durch Poly
merasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotidprimer, die
auf der Basis dieser Sequenz oder von Teilen davon, insbesondere
Regionen um His-Box-Motive der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 erstellt werden oder Modifikationen
ebensolcher in einzelnen definierten Aminosäuren, verwendet
werden (z. B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die voll
ständigen Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion
unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden,
die auf der Basis dieser gleichen Sequenz der SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 erstellt worden sind).
Weiterhin sind hierfür besonders geeignet solche Teilsequenzen,
wie sie in Fi r 10 dar estellt sind. Zum Beis iel läßt sich
Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry
18: 5294-5299) und cDNA mittels Reverser Transkriptase (z. B.
Moloney-MLV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL,
Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von
Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) herstellen.
Synthetische Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung mittels
Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in
SEQ ID NR: 1, 3 und 5 gezeigten Nukleotidsequenzen oder mit Hilfe
der in Fig. 10 dargestellten Aminosäuresequenzen erstellen. Eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA
oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und geeigneten
Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifikationstechniken
amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in
einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA-Sequenz
analyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer PSE-
Nukleotidsequenz entsprechen, können durch Standard-Synthese
verfahren, beispielsweise mit einem automatischen DNA-Synthese
gerät, hergestellt werden.
Die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
gezeigte cDNA umfaßt Sequenzen, die PSEs codieren, (d. h. den "co
dierenden Bereich") sowie 5'-untranslatierte Sequenzen und 3'-un
translatierte Sequenzen. Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül
nur den codierenden Bereich einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und 7 umfassen oder kann ganze genomi
sche Fragmente, die aus genomischer DNA isoliert sind, enthalten.
Die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 wird
durch die gleiche EST-Eingabenummer-Bezeichnung identifiziert,
wie SEQ ID N = : 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7,
so daß sie leicht korreliert werden können.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein
erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül ein Nuklein
säuremolekül, das ein Komplement einer der in SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 gezeigten Nukleotid
sequenzen oder eines Teils davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül,
das zu einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5
und SEQ ID NO: 7 gezeigten Nukleotidsequenzen komplementär ist,
ist dann ausreichend komplementär, wenn es mit einer der in
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 angegebenen
Sequenzen hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex ent
steht.
Homologe der neuen Elongase-Nukleinsäuresequenzen mit der Sequenz
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 bedeutet
beispielsweise allelische Varianten mit mindestens etwa 50 bis
60%, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70%, stärker bevorzugt
mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90% oder 90 bis 95% und
noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%,
99% oder mehr Homologie zu einer in SEQ ID NR: 1, 3 und 5
gezeigten Nukleotidsequenzen oder ihren Homologen, Derivaten
oder Analoga oder Teilen davon. Bei einer weiteren bevor
zugten Ausführungsform umfaßt ein isoliertes erfindungsgemäßes
Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die an eine der in
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 gezeigten
Nukleotidsequenzen oder einen Teil davon hybridisiert, z. B.
unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Allelische Varianten
umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die sich durch
Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus/in der
in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 dar
gestellten Sequenz erhalten lassen, wobei aber die Absicht ist,
daß die Enzymaktivität der davon herrührenden synthetisierten
Proteine für die Insertion eines oder mehrerer Gene vorteil
hafterweise beibehalten wird. Proteine, die noch die enzymatische
Aktivität der Elongase besitzen, bedeutet Proteine mit mindestens
10%, vorzugsweise 20%, besonders bevorzugt 30%, ganz besonders
bevorzugt 40% der ursprünglichen Enzymaktivität, verglichen mit
dem durch SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8
codierten Protein. Elongasen, noch die vorgenannten Aktivitäten
aufweisen, sind Elongasen deren enzymatische Aktivität nicht
wesentlich reduziert sind.
Homologen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 bedeutet beispielsweise auch bakterielle, Pilz-
und Pflanzenhomologen, verkürzte Sequenzen, einzelsträngige
DNA oder RNA der codierenden und nicht-codierenden DNA-Sequenz.
Homologen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 bedeutet auch Derivate, wie beispielsweise
Promotorvarianten. Die Promotoren stromaufwärts der angegebenen
Nukleotidsequenzen können durch einen oder mehrere Nukleotid
austausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) modifiziert
werden, ohne daß jedoch die Funktionalität oder Aktivität der
Promotoren gestört wird. Es ist weiterhin möglich, daß die
Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz
erhöht ist oder daß sie vollständig durch aktivere Promotoren,
sogar aus heterologen Organismen, ersetzt werden.
Überdies kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül nur einen
Teil des codierenden Bereichs einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 umfassen, zum Beispiel
ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann,
oder ein Fragment, welches einen biologisch aktiven Abschnitt
einer PSE codiert. Die aus der Klonierung des PSE-Gens von
Physcomitrella patens, Thraustochytrium und Crypthecodinium er
mittelten Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden
und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von PSE-
Homologen in anderen Zelltypen und Organismen sowie PSE-Homologen
aus anderen Moosen oder verwandten Arten gestaltet sind. Die
Sonde/der Primer umfaßt gewöhnlich im wesentlichen gereinigtes
Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfaßt gewöhnlich einen
Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an
mindestens etwa 12, vorzugsweise etwa 16, stärker bevorzugt etwa
25, 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-
Stranges einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 angegebenen Sequenzen, eines Antisense-Stranges einer
der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
angegebenen Sequenzen oder seiner Homologen, Derivate oder
Analoga oder natürlich vorkommender Mutanten davon hybridisiert.
Primer auf der Basis einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 können in PCR-Reaktionen
zur Klonierung von PSE-Homologen verwendet werden. Sonden auf der
Basis der PSE-Nukleotidsequenzen können zum Nachweis von Trans
kripten oder genomischen Sequenzen, die das gleiche oder homologe
Proteine codieren, verwendet werden. Bei bevorzugten Ausführungs
formen umfaßt die Sonde zudem eine daran gebundene Markierungs
gruppe, z. B. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung,
ein Enzym oder einen Enzym-Cofaktor. Diese Sonden können als Teil
eines Test-Kits für genomische Marker zur Identifizierung von
Zellen, die eine PSE misexprimieren, beispielsweise durch Messen
einer Menge einer PSE-codierenden Nukleinsäure in einer Zellen
probe, z. B. Messen der PSE-mRNA-Spiegel, oder zur Bestimmung, ob
ein genomisches PSE-Gen mutiert oder deletiert ist, verwendet
werden.
Bei einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nuklein
säuremolekül ein Protein oder einen Teil davon, das/der eine
Aminosäuresequenz umfaßt, die ausreichend homolog zu einer Amino
säuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und
SEQ ID NO: 8 ist, daß das Protein oder der Teil davon die Fähig
keit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikro
organismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Trans
port von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen, beibehält.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "ausreichend homolog"
Proteine oder Teile davon, deren Aminosäuresequenzen eine mini
male Anzahl identischer oder äquivalenter Aminosäurereste (z. B.
einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette, wie ein
Aminosäurerest in einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2 bis 8) zu
einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
und SEQ ID NO: 8 aufweisen, so daß das Protein oder der Teil
davon am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Mikro
organismen oder Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Trans
port von Molekülen über diese Membranen teilnehmen kann. Protein
bestandteile dieser Stoffwechselwege für Membrankomponenten
oder Membrantransportsysteme können, wie hier beschrieben, eine
Rolle bei der Produktion und Sekretion einer oder mehrerer Fein
chemikalien spielen. Beispiele für diese Aktivitäten sind hier
ebenfalls beschrieben. Somit trägt die "Funktion einer PSE" ent
weder direkt oder indirekt zur Ausbeute, Produktion und/oder
Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien bei.
Beispiele für PSE-Substratspezifitäten der katalytischen Aktivi
tät sind in Tabelle 1 angegeben.
Bei einer weiteren Ausführungsform codieren Derivate des
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls Proteine mit mindestens
etwa 50 bis 60%, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70% und
stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90%,
90 bis 95% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96%,
97%, 98%, 99% oder mehr Homologie zu einer vollständigen
Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
oder SEQ ID NO: 8. Die Homologie der Aminosäuresequenz wurde
über den gesamten Sequenzbereich mit dem Programm PileUp
(J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS,
5, 1989: 151-153) oder BESTFIT oder GAP bestimmt (Henikoff, S.
and Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices
from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.)
Teile von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen PSE-Nuklein
säuremolekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch
aktive Teile einer der PSEs. Wie hier verwendet, soll der Begriff
"biologisch aktiver Teil einer PSE", einen Abschnitt, z. B. eine
Domäne/ein Motiv, einer PSE umfassen, der am Stoffwechsel von zum
Aufbau von Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzen not
wendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese
Membranen teilnehmen kann oder eine in Tabelle 1 angegebene
Aktivität aufweist. Zur Bestimmung, ob eine PSE oder ein bio
logisch aktiver Teil davon am Stoffwechsel von zum Aufbau von
Zellmembranen in Mikroorganismen oder Pflanzen notwendigen Ver
bindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen
teilnehmen kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität durch
geführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend in Beispiel 8
des Beispielteils beschrieben, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzliche Nukleinsäurefragmente, die biologisch aktive
Abschnitte einer PSE codieren, lassen sich durch Isolierung
eines Teils einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8, Exprimieren des codierten Abschnitt
der PSE oder des Peptids (z. B. durch rekombinante Expression in
vitro) und Bestimmen der Aktivität des codierten Teils der PSE
oder des Peptids herstellen.
Die Erfindung umfaßt zudem Nukleinsäuremoleküle, die sich
von einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 gezeigten Nukleotidsequenzen (und Teilen davon)
aufgrund des degenerierten genetischen Codes unterscheiden
und somit die gleiche PSE codieren wie diejenige, die von den in
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 gezeigten
Nukleotidsequenzen codiert wird. Bei einer anderen Ausführungs
form hat ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül
eine Nukleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 gezeigten Aminosäure
sequenz codiert. Bei einer weiteren Ausführungsform codiert das
erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein Vollängen-PSE-Protein,
das zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 (die von einem in SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 gezeigten offenen
Leseraster codiert wird) im wesentlichen homolog ist und durch
gängige Methoden identifizierbar und isolierbar ist.
Zusätzlich zu den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 gezeigten PSE-Nukleotidsequenzen erkennt der Fach
mann, daß DNA-Sequenzpolymorphismen, die zu Änderungen in den
Aminosäuresequenzen der PSEs führen, innerhalb einer Population
(z. B. der Physcomitrella, Crypthecodinium- oder Thraustochytrium-
Population) existieren können. Diese genetischen Polymorphismen
im PSE-Gen können zwischen Individuen innerhalb einer Population
aufgrund von natürlicher Variation existieren. Wie hier ver
wendet, bedeuten die Begriffe "Gen" und "rekombinantes Gen"
Nukleinsäureinoleküle mit einem offenen Leserahmen, der eine PSE,
vorzugsweise eine Physcomitrella, Crypthecodinium- oder Thrausto
chytrium -PSE, codiert. Diese natürlichen Varianten bewirken
üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz
des PSE-Gens. Sämtliche und alle dieser Nukleotidvariationen
und daraus resultierende Aminosäurepolymorphismen in PSE, die
das Ergebnis natürlicher Variation sind und die funktionelle
Aktivität von PSEs nicht verändern, sollen im Umfang der
Erfindung enthalten sein.
Nukleinsäuremoleküle, die den natürlichen Varianten entsprechen,
und nicht - Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder Thraustochytrium
-Homologen, -Derivate und -Analoga der Physcomitrella-, Crypthe
codinium- oder Thraustochytrium -cDNA können auf der Grundlage
ihrer Homologie zu der hier offenbarten Physcomitrella-, Crypthe
codinium- oder Thraustochytrium -PSE-Nukleinsäure unter Verwen
dung der Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder Thraustochytrium
cDNA oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde gemäß
Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridi
sierungsbedingungen isoliert werden. Bei einer anderen Aus
führungsform ist ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäure
molekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter
stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül, das eine
Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5
und SEQ ID NO: 7 umfaßt. Bei anderen Ausführungsformen ist die
Nukleinsäure mindestens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide
lang. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen",
wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen
beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60%
homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert
bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, daß Sequenzen,
die mindestens etwa 65%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70%
und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 75% oder stärker
zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert
bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt
und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., finden. Ein bevor
zugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridi
sierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/
Natriumcitrat (sodium chloridetaodiumcitrate = SSC) bei etwa 45°C,
gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC,
0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, daß diese
Hybridisierungsbedingungen sich je nach dem Typ der Nukleinsäure
und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen,
hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers
unterscheiden. Die Temperatur unterscheidet sich beispielsweise
unter "Standard-Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der
Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wäßrigem Puffer mit einer
Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Falls organisches
Lösungsmittel im obengenannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50%
Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C.
Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-
Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise
zwischen 30°C und 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungs
bedingungen für DNA : RNA-Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 30°C
bis 5500 vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die vorstehend
genannten Hybridisierungstemperaturen sind beispielsweise für
eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem
G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der
Fachmann weiß, wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen
anhand von Lehrbüchern, wie dem vorstehend erwähnten oder aus den
folgenden Lehrbüchern Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold
Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames und Higgins (Hrsgb.) 1985,
"Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at
Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential
Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford
University Press, Oxford, bestimmt werden können.
Vorzugsweise entspricht ein erfindungsgemäßes isoliertes Nuklein
säuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz
der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül.
Wie hier verwendet, betrifft ein "natürlich vorkommendes"
Nukleinsäuremolekül ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer
Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z. B. ein natür
liches Protein codiert). Bei einer Ausführungsform codiert die
Nukleinsäure eine natürliche vorkommende Physcomitrella patens-
PSE, Crypthecodinium cohnii-PSE oder Thraustochytrium-PSE.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der PSE-Sequenz,
die in der Population existieren können, erkennt der Fachmann
ferner, daß auch Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz
der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
eingebracht werden können, was zu Änderungen der Aminosäure
sequenz der codierten PSE führt, ohne daß die Funktionsfähigkeit
des PSE-Proteins beeinträchtigt wird. Beispielsweise lassen sich
Nukleotidsusbtitutionen, die an "nicht-essentiellen" Aminosäure
resten zu Aminosäuresubstitutionen führen, in einer Sequenz der
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 herstellen.
Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der sich
in einer Wildtypsequenz einer der PSEs (SEQ ID N: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8) verändern läßt, ohne daß die Aktivi
tät der PSE verändert wird, wohingegen ein "essentieller" Amino
säurerest für die PSE-Aktivität erforderlich ist. Andere Amino
säurereste (z. B. diejenigen, die in der Domäne mit PSE-Aktivität
nicht konserviert oder lediglich semikonserviert sind) können
jedoch für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen sich
somit wahrscheinlich verändern, ohne daß die PSE-Aktivität ver
ändert wird.
Folglich betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung Nukleinsäure
moleküle, die PSEs codieren, die veränderte Aminosäurereste ent
halten, die für die PSE-Aktivität nicht essentiell sind. Diese
PSEs unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer
Sequenz in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8
und behalten dennoch zumindest eine der hier beschriebenen PSE-
Aktivitäten. Das isolierte Nukleinsäuremolekül umfaßt bei einer
Ausführungsform eine Nukleotidsequenz, die ein Protein codiert,
wobei das Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa
50% Homologie zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ TD NO: 8 umfaßt und am Stoff
wechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in Physcomitrella,
Crypthecodinium- oder Thraustochytrium notwendigen Verbindungen
oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilnehmen
kann. Das von dem Nukleinsäuremolekül codierte Protein ist
vorzugsweise mindestens etwa 50 bis 60% homolog zu einer
der Sequenzen in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder
SEQ ID NO: 8 stärker bevorzugt mindestens etwa 60 bis 70% homolog
zu einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
oder SEQ ID NO: 8 noch stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis
80%, 80 bis 90%, 90 bis 95% homolog zu einer der Sequenzen
in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 und
am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98% oder
99% homolog zu einer der Sequenzen in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie von zwei Aminosäure
sequenzen (z. B. einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 und einer mutierten Form davon)
oder von zwei Nukleinsäuren werden die Sequenzen zum Zweck des
optimalen Vergleichs untereinander geschrieben (z. B. können
Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure
eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen
Protein oder der anderen Nukleinsäure zu erzeugen). Die Amino
säurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäure
positionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn
eine Position in einer Sequenz (z. B. einer der Sequenzen der
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8) durch
den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid wie
die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz (z. B. einer
mutierten Form der aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
und SEQ ID NO: 8 ausgewählten Sequenz) belegt wird, dann sind
die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. Aminosäure- oder
Nukleinsäure-"Homologie", wie hier verwendet, entspricht Amino
säure- oder Nukleinsäure-"Identität"). Die prozentuale Homologie
zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an
identischen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind (d. h. %
Homologie = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der
Positionen × 100).
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine PSE codiert, die zu
einer Proteinsequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
und SEQ ID NO: 8 homolog ist, kann durch Einbringen einer oder
mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in
eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5
und SEQ ID NO: 7 erzeugt werden, so daß eine oder mehrere Amino
säuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte
Protein eingebracht werden. Mutationen können in eine der Sequen
zen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
durch Standardtechniken, wie stellenspezifische Mutagenese und
PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise
werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder
mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten
hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution"
wird der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer
ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien
von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden.
Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten
(z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B.
Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten
(z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin,
Cystein), unpolaren Seitenketten, (z. B. Alanin, Valin, Leucin,
Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-
verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und
aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Trypto
phan, Histidin). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest
in einer PSE wird somit vorzugsweise durch einen
anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie aus
getauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform
die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil
der PSE-codierenden Sequenz eingebracht werden, z. B. durch
Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können
nach der hier beschriebenen PSE-Aktivität durchmustert werden,
um Mutanten zu identifizieren, die PSE-Aktivität beibehalten.
Nach der Mutagenese einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 kann das codierte
Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des
Proteins kann z. B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests
(siehe Beispielteil) bestimmt werden.
Zusätzlich zu den Nukleinsäuremolekülen, welche die vorstehend
beschriebenen PSEs codieren, betrifft ein weiterer Aspekt der
Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle, die "Antisense" dazu
sind. Eine "Antisense"-Nukleinsäure umfaßt eine Nukleotidsequenz,
die zu einer "Sense"-Nukleinsäure, welche ein Protein codiert,
komplementär ist, z. B. komplementär zum codierenden Strang eines
doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-
Sequenz. Eine Antisense-Nukleinsäure kann folglich über Wasser
stoffbrückenbindungen an eine Sense-Nukleinsäure b 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002010023893 00004 99880inden. Die
Antisense-Nukleinsäure kann zu einem gesamten PSE-codierenden
Strang oder nur zu einem Teil davon komplementär sein. Bei einer
Ausführungsform ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül "Antisense"
zu einem "codierenden Bereich" des codierenden Strangs einer
Nukleotidsequenz, die eine PSE codiert. Der Begriff "codierender
Bereich" betrifft den Bereich der Nukleotidseguenz, der Codons
umfaßt, die in Aminosäurereste translatiert werden (z. B. den
gesamten codierenden Bereich, der mit dem Stopcodon beginnt und
endet, d. h. dem letzten Codon vor dem Stopcodon). Bei einer
weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül
"Antisense" zu einem "nicht-codierenden Bereich" des codierenden
Strangs einer Nukleotidsequenz, die PSE codiert. Der Begriff
"nicht-codierender Bereich" betrifft 5'- und 3'-Sequenzen, die
den codierenden Bereich flankieren und nicht in Aminosäuren
translatiert werden (d. h. die man auch als 5'- und 3'-untrans
latierte Bereiche bezeichnet).
Unter Voraussetzung der hier offenbarten PSE-codierenden
Sequenzen des codierenden Stranges (z. B. die in SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenzen)
können erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuren gemäß den Regeln
der Watson-Crick-Basenpaarung gestaltet werden. Das Antisense-
Nukleinsäuremolekül kann komplementär zum gesamten codierenden
Bereich von PSE-mRNA sein, ist aber stärker bevorzugt ein Oligonukleotid,
das nur zu einem Teil des codierenden oder nicht
codierenden Bereichs von PSE-mRNA "Antisense" ist. Das Antisense-
Oligonukleotid kann z. B. zu dem Bereich, der die Translations
startstelle von PSE-mRNA umgibt, komplementär sein. Ein Anti
sense-Oligonukleotid kann z. B. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35,
40, 45 oder 50 und mehr Nukleotide lang sein. Vorteilhaft ist
ein Antisense-Oligonukleotis 15 bis 25 Nukleotide lang. Eine
erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann unter Verwendung
chemischer Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen mittels
im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Anti
sense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) kann
z. B. chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende
Nukleotide oder verschiedentlich modifizierte Nukleotide ver
wendet werden, die so gestaltet sind, daß sie die biologische
Stabilität der Moleküle erhöhen oder die physikalische Stabilität
des zwischen der Antisense- und der Sense-Nukleinsäure gebildeten
Duplexes erhöhen, beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate
und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele
für modifizierte Nukleotide, die zur Erzeugung der Antisense-
Nukleinsäure verwendet werden können, sind u. a. 5-Fluoruracil,
5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin,
4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxy
methylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil,
Dihydrouracil, Beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyl
adenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin,
2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin,
N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxy
aminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxy
carboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentyl
adenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil,
Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil,
4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester,
Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-
3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Die
Antisense-Nukleinsäure kann alternativ biologisch unter Ver
wendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in den
eine Nukleinsäure in Antisense-Richtung subkloniert worden ist
(d. h. RNA, die von der eingebrachten Nukleinsäure transkribiert
wird, ist zu einer Zielnukleinsäure von Interesse in Antisense-
Richtung orientiert, was im nachstehenden Unterabschnitt weiter
beschrieben ist).
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden
üblicherweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt,
so daß sie mit der zellulären mRNA und/oder der genomischen
DNA, die eine PSE codiert, hybridisieren oder daran binden,
um dadurch die Expression des Proteins, z. B. durch Hemmung der
Transkription und/oder Translation, zu hemmen. Die Hybridisierung
kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung
eines stabilen Duplexes oder z. B. im Fall eines Antisense-
Nukleinsäuremoleküls, das DNA-Duplices bindet, durch spezifische
Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen.
Das Antisense-Molekül kann so modifiziert sein, daß es spezifisch
an einen Rezeptor oder an ein auf einer ausgewählten Zellober
fläche exprimiertes Antigen bindet, z. B. durch Binden des Anti
sense-Nukleinsäuremoleküls an ein Peptid oder einen Antikörper,
das/der an einen Zelloberflächenrezeptor oder ein Antigen bindet.
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung
der hier beschriebenen Vektoren den Zellen zugeführt werden.
Zur Erzielung ausreichender intrazellulärer Konzentrationen
der Antisense-Moleküle sind Vektorkonstrukte, in denen sich das
Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken
prokaryotischen, viralen oder eukaryotischen, einschließlich
pflanzlichen, Promotors befindet, bevorzugt.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße
Antisense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül.
Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppel
strängige Hybride mit komplementärer RNA, wobei die Stränge im
Gegensatz zu gewöhnlichen β-Einheiten parallel zueinander ver
laufen. [Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641].
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zudem ein 2'-o-Methylribo
nukleotid [Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148]
oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon [Inoue et al. (1987) FEBS
Lett. 215: 327-330] umfassen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße
Antisense-Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische
RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die eine einzelsträngige
Nukleinsäure, wie eine mRNA, spalten können, zu der sie einen
komplementären Bereich haben. Somit können Ribozyme z. B. Hammer
head-Ribozyme [beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature
334: 585-591] zur katalytischen Spaltung von PSE-mRNA-Transkripten
verwendet werden, um dadurch die Translation von PSE-mRNA zu
hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine PSE-codierende
Nukleinsäure kann auf der Basis der Nukleotidsequenz einer
hier offenbarten PSE-cDNA (d. h. 38_ck21_g07fwd in SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7) oder auf der Basis
einer gemäß den in dieser Erfindung gelehrten Verfahren zu
isolierenden heterologen Sequenz gestaltet werden. Beispiels
weise kann ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert
werden, wobei die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komple
mentär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer PSE-codierenden
mRNA gespalten werden soll. Siehe z. B. Cech et al., US 4,987,071
und Cech et al., US 5,116,742. Alternativ kann PSE-mRNA zur
Selektion einer katalytischen RNA mit einer spezifischen Ribo
nukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet
werden [siehe z. B. Bartel, D., und Szostak, J. W. (1993) Science
261: 1411-1418].
Alternativ läßt sich die PSE-Gen-Expression hemmen, indem Nukleo
tidsequenzen, die komplementär zum regulatorischen Bereich einer
PSE-Nukleotidsequenz (z. B. einem PSE-Promotor und/oder -Enhancer)
sind, so dirigiert werden, daß Dreifachhelix-Strukturen gebildet
werden, welche die Transkription eines PSE-Gens in Zielzellen
hemmen [siehe allgemein Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res.
6(6) 569-84; Helene, C., et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci.
660: 27-36; und Maher. L. J. (1992) Bioassays 14(12): 807-815].
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein neues Gen
konstrukt, was eine isolierte Nukleinsäure enthält, die von
Physcomitrella, Crypthecodinium oder Thraustochytrium stammt und
ein Polypeptid codiert, das C16, C18- oder C20-Fettsäuren mit
mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure um mindestens
zwei Kohlenstoffatome verlängert, oder die Gensequenz der
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7, ihre
Homologen, Derivate oder Analoga, die funktionsfähig mit einem
oder mehreren Regulationssignalen, vorteilhafterweise zur
Steigerung der Genexpression, verbunden sind, enthält. Beispiele
für diese Regulationssequenzen sind Sequenzen, an die Induktoren
oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure
regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen kann
die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen
Strukturgenen noch vorhanden sein und, wenn geeignet, genetisch
modifiziert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausge
schaltet worden ist und die Expression der Gene gesteigert worden
ist. Das Genkonstrukt kann jedoch auch eine einfachere Struktur
haben, d. h. daß keine zusätzlichen Regulationssignale vor der
Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
oder ihren Homologen inseriert worden sind und der natürliche
Promotor mit seiner Regulation nicht deletiert worden ist. Statt
dessen ist die natürliche Regulationssequenz so mutiert worden,
daß keine Regulation mehr stattfindet und die Genexpression ver
stärkt ist. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise
eine oder mehrere sogenannte Enhancer-Sequenzen, die funktions
fähig mit dem Promotor verbunden sind und die gesteigerte
Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen, umfassen. Es
ist auch möglich, am 3'-Ende der DNA-Sequenzen zusätzlich
vorteilhafte Sequenzen zu inserieren, beispielsweise weitere
Regulationselemente oder Terminatoren. Die Elongasegene können
im Genkonstrukt in einer oder mehreren Kopien vorliegen. Es ist
vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene in Organismen, wenn
weitere Gene im Genkonstrukt vorliegen.
Vorteilhafte Regulationsseguenzen für das neue Verfahren liegen
beispielsweise in Promotoren vor, wie dem cos-, tac-, trp-, tet-,
trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7 -, T5-, T3-, gal-, trc-,
ara-, SP6-, λ-PR- oder λ-PL-Promotor und werden vorteilhafterweise
in Gram-negativen Bakterien angewendet. Weitere vorteilhafte
Regulationssequenzen liegen beispielsweise in den Gram-positiven
Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1,
MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzen
promotoren CaMV/355 [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1
[Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)1, SSU, OCS, lib4, usp,
STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor.
In diesem Zusammenhang vorteilhaft sind ebenfalls induzierbare
Promotoren, wie die in EP-A-0 388 186 (Benzylsulfonamid-indu
zierbar), Plant J. 2, 1992: 397-404 (Gatz et al., Tetracyclin
induzierbar), EP-A-0 335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder
WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol -induzierbar) beschrie
benen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind
der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor
der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der
Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase-Promotor aus Glycine
max (Genbank-Zugangsnr. U87999) oder der in EP-A-0 249 676
beschriebene nodienspezifische Promotor. Besonders vorteilhafte
Promotoren sind Promotoren, welche die Expression in Geweben er
möglichen, die an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind. Ganz
besonders vorteilhaft sind samenspezifische Promotoren, wie der
usp-, LEB4-, Phaseolin- oder Napin-Promotor. Weitere besonders
vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für
monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und in
US 5,608,152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Phaseolin-
Promotor aus Arobidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus
Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica),
von Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233-239 (LEB4-
Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese
Promotoren für Dikotyledonen eignen. Die folgenden Promotoren
eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen lpt-2- oder
lpt-1-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), Hordein-
Promotor aus Gerste und andere, in WO 99/16890 beschriebene
geeignete Promotoren.
Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren
Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Ver
fahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft,
zusätzlich synthetische Promotoren zu verwenden.
Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene
umfassen, die in die Organismen eingebracht werden sollen. Es ist
möglich und vorteilhaft, in die Wirtsorganismen Regulationsgene,
wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch
ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene
eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und darin zu
exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen
Ursprungs sein. Die inserierten Gene können ihren eigenen
Promotor haben oder auch unter der Kontrolle des Promotors
der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
oder seiner Homologen, Derivate oder Analoga stehen.
Das Genkonstrukt umfaßt vorteilhafterweise zur Expression der
anderen vorliegenden Gene weitere 3'- und/oder 5'-terminale
Regulationssequenzen zur Steigerung der Expression, die in
Abhängigkeit vom gewählten Wirtsorganismus und dem Gen oder
den Genen für die optimale Expression ausgewählt werden.
Diese Regulationssequenzen sollen, wie oben erwähnt, die
spezifische Expression der Gene und die Proteinexpression
ermöglichen. Dies kann je nach dem Wirtsorganismus beispiels
weise bedeuten, daß das Gen nur nach Induktion exprimiert oder
überexprimiert wird oder daß es sofort exprimiert und/oder
überexprimiert wird.
Die Regulationssequenzen oder -faktoren können außerdem vorzugs
weise eine vorteilhafte Wirkung auf die Expression der einge
brachten Gene haben und diese somit steigern. Auf diese Weise ist
es möglich, daß die Regulationselemente unter Verwendung starker
Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder Enhancer, vorteil
hafterweise auf Transkriptionsebene verstärkt werden. Es ist
jedoch weiterhin auch möglich, die Translation zum Beispiel
durch Verbesserung der mRNA-Stabilität zu verstärken.
Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäure
sequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen in ein
Genkonstrukt (= Expressionskassette, Nukleinsäurekonstrukt)
kloniert, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt
in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine
leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-,
Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photo
metrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reporter
gene Antibiotika-oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene,
Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zucker- oder
Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-
Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das b-Galactosidasegen,
das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6-phosphat-Phosphatasegen,
das b-Glucuronidase-Gen, b-Lactamasegen, das Neomycinphospho
transferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen oder das
BASTA (= Gluphosinatresistenz)-Gen genannt. Diese Gene ermög
lichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der
Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit
lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschied
liche Produktivität zeigen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7, die für Elongasen
codieren können in einer oder mehreren Kopien in der Expressions
kassette ( = Genkonstrukt) enthalten sein.
In der Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäure
konstrukt) kann noch mindestens eine weitere Nukleinsäure, die
für ein Gen bevorzugt aus der Fettsäurebiosynthese codiert,
enthalten sein, die in die Wirtsorganismen eingebracht werden
sollen. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter
der gleichen Regulationsregion wie die Gene erfindungsgemäßen
Elongase liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise
um weitere Biosynthesegene vorteilhaft der Fettsäurebiosynthese,
die eine gesteigerte Synthese ermöglichen. Beispielsweise seien
die Gene für die Δ19-, Δ17-, Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ8-, Δ6-,
Δ5-, Δ4-Desaturase, die verschiedenen Hydroxylasen, die
Δ12-Acetylenase, die Acyl-ACP-Thioesterasen, β-Ketoacyl-ACP-
Synthasen oder β-Ketoacyl-ACP-Reductasen genannt. Vorteilhaft
werden die Desaturasegene im Nukleinsäurekonstrukt verwendet.
Auch diese Gene können in einer oder mehreren Kopien im Gen
konstrukt enthalten sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugs
weise Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure
oder ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt enthalten, die eine PSE
(oder einen Teil davon) codieren. Wie hier verwendet, betrifft
der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere
Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist.
Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppel
strängige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA-Segmente
ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler
Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom
ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle,
in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren
(z. B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung und
episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale
Säugervektoren) werden beim Einbringen in die Wirtszelle in
das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit
dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die
Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden
sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressions
vektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die
für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von
Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und
"Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am
häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch
diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (z. B.
replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte
Viren), die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll
der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt
sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus,
Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare
oder zirkuläre DNA sowie RNA umfassen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren um
fassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungs
gemäßes Genkonstrukt in einer Form, die sich zur Expression der
Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, daß die
rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulations
sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu ver
wendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nuklein
säuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfaßt. In einem
rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig ver
bunden", daß die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die
Regulationssequenz(en) gebunden ist, daß die Expression der
Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander gebunden sind, so
daß beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene
Funktion erfüllen (z. B. in einem In-vitro-Transkriptions-/Trans
lationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die
Wirtszelle eingebracht wird). Der Begriff "Regulationssequenz"
soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente
(z. B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese Regulations
sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,
CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant
Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton,
Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, ein
schließlich der Literaturstellen darin. Regulationssequenzen
umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer
Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche,
welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in
bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern.
Der Fachmann weiß, daß die Gestaltung des Expressionsvektors von
Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle,
dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw., abhängen
kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirts
zellen eingebracht werden, um dadurch Proteine oder Peptide,
einschließlich Fusionsproteinen oder -peptiden, herzustellen,
die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden
(z. B. PSEs, mutante Formen von PSEs, Fusionsproteine usw.).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können
zur Expression von PSEs in prokaryotischen oder eukaryotischen
Zellen gestaltet sein. Beispielsweise können PSE-Gene in
bakteriellen Zellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen (unter
Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefe- und
anderen Pilzzellen [siehe Romanos, M. A., et al. (1992) "Foreign
gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; von den
Hondel, C. A. M. J. J., et al. (1991) "Heterologous gene expression
in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi,
J. W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press:
San Diego; und von den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991)
"Gene transfer systems and vector development for filamentous
fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F.,
et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge],
Algen [Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology. 1,
3: 239-251)], Ciliaten der Typen: wie Holotrichia, Peritrichia,
Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium,
Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes,
Engelmaniella und Stylonychia, insbesondere der Gattung
Stylonychia lemnae, mit Vektoren nach einem Transformations
verfahren, wie beschrieben in WO 98/01572, sowie Zellen viel
zelliger Pflanzen [siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988)
"High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated trans
formation of Arabidopsis thaliana leafand cotyledon explants"
Plant Cell Rep.: 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechno
logy, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993);
F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in:
Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.:
Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu,
Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (und
darin zitierte Literaturstellen)] oder Säugerzellen exprimiert
werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner erörtert in Goeddel,
Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, CA (1990). Der rekombinante Expressionsvektor
kann alternativ, zum Beispiel unter Verwendung von T7-Promotor-
Regulationssequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert
und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt meist
mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren
enthalten, welche die Expression von Fusions- oder nicht-
Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen eine Reihe
von Aminosäuren an ein darin codiertes Protein an, gewöhnlich am
Aminoterminus des rekombinanten Proteins, aber auch am C-Terminus
oder fusioniert innerhalb geeigneter Bereiche in den Proteinen.
Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die
Verstärkung der Expression von rekombinantem Protein; 2) die
Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins und 3) die
Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch
Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreinigung beispielsweise
über sogenannte His-Tags. Bei Fusions-Expressionsvektoren wird
oft eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindungsstelle der
Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so daß
die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit
nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist. Diese Enzyme
und ihre entsprechenden Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa,
Thrombin und Enterokinase.
Typische Fusions-Expressionsvektoren sind u. a. pGEX [Pharmacia
Biotech Inc. Smith, D. B., und Johnson, K. S. (1988) Gene
67: 31-40], pMAL [New England Biolabs, Beverly, MA] und pRIT5
[Pharmacia, Piscataway, NJ], bei denen Glutathion-S-Transferase
(GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das
rekombinante Zielprotein fusioniert wird. Bei einer Ausführungs
form ist die PSE-codierende Sequenz in einen pGEX-Expressions
vektor kloniert, so daß ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusions
protein codiert, das vom N-Terminus zum C-Terminus GST-Thrombin-
Spaltstelle-X-Protein umfaßt. Das Fusionsprotein kann durch
Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-
Agarose-Harz gereinigt werden. Rekombinante PSE, die nicht an
GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins
mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele für geeignete induzierbare nicht-Fusions-E. coli-
Expressionsvektoren sind u. a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene
69: 301-315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,
Kalifornien (1990) 60-89). Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor
beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem
Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET
11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-
Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten viralen RNA-Polymerase
(T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird
von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem
residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter
der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.
Andere in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem
Fachmann bekannt, diese Vektoren sind beispielsweise in E. coli
pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe, wie pBR322, die pUC-Reihe, wie
pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2,
pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, pgt11 or pBdCI,
in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus
pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667.
Eine Strategie zur Maximierung der Expression von rekombinantem
Protein ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium,
dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten
Proteins gestört ist [Gottesman, S., Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien
(1990) 119-128]. Eine weitere Strategie ist die Veränderung der
Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserieren
den Nukleinsäure, so daß die einzelnen Codons für jede Amino
säure diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression
ausgewählten Bakterium, wie C. glutamicum, verwendet werden
[Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118]. Diese
Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen erfolgt
durch Standard-DNA-Synthesetechniken.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der PSE-Expressionsvektor
ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression
in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSecl [Baldari et al.
(1987) Embo J. 6: 229-234], pMFa [Kurjan und Herskowitz (1982)
Cell 30: 933-943], pJRY88 [Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123]
sowie pYES2 [Invitrogen Corporation, San Diego, CA]. Vektoren und
Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung
in anderen Pilzen, wie den filamentösen Pilzen, eignen, umfassen
diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: von den Hondel,
C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector
development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics
of fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge
University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in
Fungi [J. W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic
Press: San Diego]. Weitere geeignete Hefevektoren sind beispiels
weise pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23.
Alternativ können die erfindungsgemäßen PSEs in Insektenzellen
unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert
werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen
in gezüchteten Insektenzellen (z. B. Sf9-Zellen) verfügbar sind,
umfassen die pAc-Reihe [Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol..
3: 2156-2165] und die pVL-Reihe [Lucklow und Summers (1989)
Virology 170: 31-39].
Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick
über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem
Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning
Vectors (Hrsgb. Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-
New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungs
gemäße Nukleinsäure in Säugerzellen unter Verwendung eines
Säuger-Expressionsvektors exprimiert. Beispiele für Säuger-
Expressionsvektoren umfassen pCDM8 [Seed, B. (1987) Nature
329: 840] und pMT2PC [Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195].
Bei der Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen
des Expressionsvektors oft von viralen Regulationselementen
bereitgestellt. Üblicherweise verwendete Promotoren stammen z. B.
aus Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalievirus und Simian Virus 40.
Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und
eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von
Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
1989.
Bei einer anderen Ausführungsform kann der rekombinante Säuger-
Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in
einem bestimmten Zelltyp steuern (z. B. werden gewebespezifische
Regulationselemente zur Expression der Nukleinsäure verwendet).
Gewebespezifische Regulationselemente sind im Fachgebiet bekannt.
Nicht beschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische
Promotoren sind u. a. der Albuminpromotor [leberspezifisch;
Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277], lymphoidspezifische
Promotoren [Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275],
insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren [Winoto und
Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733] und Immunglobulinen (Banerji
et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell
33: 741-748], neuronspezifische Promotoren [z. B. Neurofilament-
Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477], pankreas
spezifische Promotoren [Edlund et al., (1985) Science
230: 912-916] und milchdrüsenspezifische Promotoren [z. B. Milch
serum-Promotor; US 4,873,316 und EP-A-0 264 166). Auch ent
wicklungsregulierte Promotoren sind umfaßt, z. B. die hox-
Promotoren der Maus [Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374-379]
und der Fetoprotein-Promotor [Campes und Tilghman (1989) Genes
Dev. 3: 537-546].
Bei einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen
PSEs in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore
et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 und darin
zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren
Pflanzen (z. B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert
werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen sol
che, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E.,
Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors
with selectable markers located proximal to the left border",
Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; und Bevan, M. W. (1984) "Binary
Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res.
12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in:
Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.:
Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Weitere geeignete
pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant
Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7,
S. 71-119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle-
Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium
replizieren.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise
Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzen
zellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so daß
jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription,
erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevor
zugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agro
bacterium tumefaciens-t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase
bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 [Gielen et al., EMBO J. 3
(1984) 835ff.] oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch
alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind
geeignet.
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptions
ebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette
vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden Sequenzen, wie
Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz,
welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaik
virus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält [Gallie
et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711].
Die Pflanzengenexpression muss funktionsfähig mit einem
geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf
rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt.
Bevorzugt sind Promotoren, welche die konstitutive Expression
herbeiführen [Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202],
wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 355 CAMV
[Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], 19S CaMV (siehe auch
US 5,352,605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in
US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktions
fähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind
Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein
entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind [siehe eine Über
sicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 und
darin zitierte Literaturstellen], beispielsweise in die Vakuole,
den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloro
plasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochon
drien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und
andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Die Pflanzengenexpression läßt sich auch über einen chemisch
induzierbaren Promotor erleichtern [siehe eine Übersicht in Gatz
1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108].
Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn
gewünscht wird, daß die Genexpression auf zeitspezifische Weise
erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure
induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzier
barer Promotor [Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404] und ein
Ethanol-induzierbarer Promotor.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Streß
bedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise
der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor [Ward et al., Plant.
Mol. Biol. 22 (1993) 361-366], der hitzeinduzierbare hsp80-
Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare Alpha
amylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch
Wunden induzierbare pinII-Promotor (EP-A-0 375 091).
Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die
Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen
die Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie
den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos.
Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps
(US 5,608,152), der USP-Promotor aus Vicia faba [Baeumlein
et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67], der Oleosin-
Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor
aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus
Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor [LeB4;
Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9] sowie
Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Monokotyledonen-Pflanzen,
wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw.
herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der lpt2-
oder lpt1-Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230)
oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem
Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen,
dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-
Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-
Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen).
Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die
plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Plastiden
das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige End
produkte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete
Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind
beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP-
Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394.
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressions
vektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül,
das in Antisense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert
ist. d. h. das DNA-Molekül ist derart mit einer regulatorischen
Sequenz funktionsfähig verbunden, daß die Expression (durch
Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das zur PSE
mRNA "Antisense" ist, ermöglicht wird. Es können Regulations
sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig mit einer in
Antisense-Richtung klonierten Nukleinsäure verbunden sind und
die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in
einer Vielzahl von Zelltypen steuern, zum Beispiel können virale
Promotoren und/oder Enhancer oder Regulationssequenzen ausgewählt
werden, welche die konstitutive, gewebespezifische oder zelltyp
spezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-
Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids,
Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisense-
Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regula
torischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch
den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingebracht
worden ist. Eine Erläuterung der Regulation der Genexpression
mittels Antisense-Genen siehe in Weintraub, H., et al., Anti
sense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-
Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die
ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht
worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirts
zelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Selbst
verständlich betreffen diese Begriffe nicht nur die bestimmte
Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen
dieser Zelle. Da in aufeinanderfolgenden Generationen auf
grund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen
auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der
Parentalzelle identisch, sind jedoch immer noch vom Umfang des
Begriffs, wie hier verwendet, umfaßt.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische
Zelle sein. Zum Beispiel kann eine PSE in Bakterienzellen, wie
C. glutamicum, Insektenzellen, Pilzzellen oder Säugerzellen (wie
Chinesischer Hamster-Ovarzellen (CHO) oder COS-Zellen), Algen,
Ciliaten, Pflanzenzellen, Pilzen oder anderen Mikroorganismen,
wie C. glutamicum, exprimiert werden. Andere geeignete Wirts
zellen sind dem Fachmann geläufig.
Vektor-DNA läßt sich in prokaryotische oder eukaryotische Zellen
über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken
einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion",
Konjugation und Transduktion, wie hier verwendet, sollen eine
Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Ein
bringen fremder Nukleinsäure (z. B. DNA) in eine Wirtszelle, ein
schließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation,
DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche
Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer, Elektroporation oder
Teilchenbeschuß, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation
oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzen
zellen, lassen sich finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning:
A Laboratory Manual., 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
1989) und anderen Labor-Handbüchern, wie Methods in Molecular
Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland
und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Über die stabile Transfektion von Säugerzellen ist bekannt,
daß je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Trans
fektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA
in ihr Genom integriert. Zur Identifikation und Selektion dieser
Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren
Marker (z. B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit
dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte
selektierbare Marker umfassen solche, welche Resistenz gegen
Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen,
oder in Pflanzen solche, welche Resistenz gegen ein Herbizid, wie
Glyphosphat oder Glufosinat, verleihen. Weitere geeignete Marker
sind beispielsweise Marker, welche Gene codieren, die an Bio
synthesewegen von zum Beispiel Zuckern oder Aminosäuren beteiligt
sind, wie β-Galactodsidase, ura3 oder ilv2. Marker, welche Gene,
wie Luziferase, gfp oder andere Fluoreszenzgene codieren, sind
ebenfalls geeignet. Diese Marker lassen sich in Mutanten ver
wenden, in denen diese Gene nicht funktionell sind, da sie bei
spielsweise mittels herkömmlicher Verfahren deletiert worden
sind. Ferner können Marker, welche eine Nukleinsäure codieren,
die einen selektierbaren Marker codiert, in eine Wirtszelle auf
dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der eine
PSE codiert, oder können auf einem gesonderten Vektor ein
gebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure
stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch
Medikamentenselektion identifiziert werden (z. B. überleben
Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, wohin
gegen die anderen Zellen absterben).
Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird
ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines PSE-
Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution
eingebracht worden ist, um dadurch das PSE-Gen zu verändern,
z. B. funktionell zu disrumpieren. Dieses PSE-Gen ist vorzugs
weise ein Physcomitrella, Crypthecodinium- oder Thraustochytrium
PSE-Gen, es kann jedoch ein Homologon oder Analogon aus anderen
Organismen, sogar aus einer Säuger- Pilz- oder Insektenquelle
verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der
Vektor so gestaltet, daß das endogene PSE-Gen bei homologer
Rekombination funktionell disruptiert wird (d. h. nicht länger
ein funktionelles Protein codiert, auch als Knock-out-Vektor
bezeichnet). Alternativ kann der Vektor so gestaltet sein, daß
das endogene PSE-Gen bei homologer Rekombination mutiert oder
anderweitig verändert wird, aber immer noch ein funktionelles
Protein codiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulato
rische Bereich so verändert sein, daß dadurch die Expression der
endogenen PSE verändert wird). Zur Erzeugung einer Punktmutation
über homologe Rekombination können auch als Chimeraplasty be
kannte DNA-RNA-Hybride verwendet werden, die aus Cole-Strauss
et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5): 1323-1330 und Kmiec,
Gene therapy, 19999, American Scientist, 87(3): 240-247 bekannt
sind.
Im Vektor für die homologe Rekombination ist der veränderte Ab
schnitt des PSE-Gens an seinem 5'- und 3'-Ende von zusätzlicher
Nukleinsäure des PSE-Gens flankiert, so daß homologe Rekombi
nation zwischen dem exogenen PSE-Gen, das auf dem Vektor vor
liegt, und einem endogenen PSE-Gen in einem Mikroorganismus oder
einer Pflanze möglich ist. Die zusätzliche flankierende PSE-
Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit
dem endogenen Gen hinreichend lang. Gewöhnlich sind im Vektor
mehrere hundert Basenpaare bis zu Kilobasen flankierende DNA (so
wohl am 5'- als auch am 3'-Ende) enthalten [eine Beschreibung von
Vektoren zur homologen Rekombination siehe z. B. in Thomas, K. R.,
und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503 oder der Rekombination
in Physcomitrella patens auf cDNA-Basis in Strepp et al., 1998,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (8): 4368-4373]. Der Vektor wird in
einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle (z. B. mittels Poly
ethylenglycol-vermittelter DNA) eingebracht, und Zellen, in denen
das eingebrachte PSE-Gen mit dem endogenen PSE-Gen homolog
rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet bekannter
Techniken selektiert.
Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Organismen,
wie Mikroorganismen, hergestellt werden, die ausgewählte Systeme
enthalten, welche eine regulierte Expression des eingebrachten
Gens ermöglichen. Der Einschluß eines PSE-Gens in einem Vektor,
wobei es unter die Kontrolle des lac-Operons gebracht wird,
ermöglicht z. B. die Expression des PSE-Gens nur in Gegenwart
von IPTG. Diese Regulationssysteme sind im Fachgebiet bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder
eukaryotische Wirtszelle, in Kultur oder auf einem Feld wachsend,
kann zur Produktion (d. h. Expression) einer PSE verwendet werden.
In Pflanzen kann zusätzlich ein alternatives Verfahren durch
direkten Transfer von DNA in sich entwickelnde Blüten über
Elektroporation oder Gentransfer mittels Agrobacterium ange
wendet werden. Die Erfindung stellt folglich ferner Verfahren
zur Produktion von PSEs unter Verwendung der erfindungsgemäßen
Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Ver
fahren die Anzucht der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in die
ein rekombinanter Expressionsvektor, der eine PSE codiert, ein
gebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht
worden ist, das eine Wildtyp- oder veränderte PSE codiert) in
einem geeigneten Medium, bis die PSE produziert worden ist. Das
Verfahren umfaßt bei einer weiteren Ausführungsform das Isolieren
der PSEs aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Wirtszellen, die im Prinzip zum Aufnehmen der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure, des erfindungsgemäßen neuen Genproduktes oder
des erfindungsgemäßen Vektors geeignet sind, sind alle pro
karyotischen oder eukaryotischen Organismen. Die vorteilhafter
weise verwendeten Wirtsorganismen sind Organismen, wie Bakterien,
Pilze, Hefen, Tier- oder Pflanzenzellen. Weitere vorteilhafte
Organismen sind Tiere oder vorzugsweise Pflanzen oder Teile da
von. Pilze, Hefen oder Pflanzen werden vorzugsweise verwendet,
besonders bevorzugt Pilze oder Pflanzen, ganz besonders bevor
zugt Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipid
verbindungen enthalten, wie Raps, Nachtkerze, Rizinus, Canola,
Erdnuß, Lein, Soja, Safflor, Sonnenblume, Borretsch, Ölpalme,
Kokosnuß oder Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer,
Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes,
Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate,
Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee),
Salix-Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuß) sowie ausdauernde Gräser
und Futterfeldfrüchte. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße
Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Raps, Canola,
Rizinus, Lein, Nachtkerze, Sonnenblume, Safflor, Bäume (Ölpalme,
Kokosnuß).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte PSEs
und biologisch aktive Teile davon. Ein "isoliertes" oder
"gereinigtes" Protein oder ein biologisch aktiver Teil davon ist
im wesentlichen frei von zellulärem Material, wenn es durch DNA-
Rekombinationstechniken produziert wird, oder von chemischen Vor
stufen oder andern Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert
wird. Der Begriff "im wesentlichen frei von zellulärem Material"
umfaßt PSE-Präparationen, in denen das Protein von zellulären
Komponenten der Zellen, in denen es natürlich oder rekombinant
produziert wird, getrennt ist. Bei einer Ausführungsform umfaßt
der Ausdruck "im wesentlichen frei von zellulärem Material" PSE-
Präparationen mit weniger als etwa 30% (bezogen auf das Trocken
gewicht) nicht-PSE (hier auch als "verunreinigendes Protein"
bezeichnet), stärker bevorzugt weniger als etwa 20% nicht-PSE,
noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10% nicht-PSE und am
stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% nicht-PSE. Wenn die PSE
oder ein biologisch aktiver Teil davon rekombinant hergestellt
worden ist, ist sie/er auch im wesentlichen frei von Kultur
medium, d. h. das Kulturmedium macht weniger als etwa 20%,
stärker bevorzugt weniger als etwa 10% und am stärksten bevor
zugt weniger als etwa 5% des Volumens der Proteinpräparation
aus. Der Begriff "im wesentlichen frei von chemischen Vorstufen
oder anderen Chemikalien" umfaßt PSE-Präparationen, in denen
das Protein von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien
getrennt ist, die an der Synthese des Proteins beteiligt sind.
Bei einer Ausführungsform umfaßt der Begriff "im wesentlichen
frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" PSE-
Präparationen mit weniger als etwa 30% (bezogen auf das Trocken
gewicht) chemischen Vorstufen oder nicht-PSE-Chemikalien, stärker
bevorzugt weniger als etwa 20% chemischen Vorstufen oder nicht-
PSE-Chemikalien, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10%
chemischen Vorstufen oder nicht-PSE-Chemikalien und am stärksten
bevorzugt weniger als etwa 5% chemischen Vorstufen oder nicht-
PSE-Chemikalien. Bei bevorzugten Ausführungsformen weisen iso
lierte Proteine oder biologisch aktive Teile davon keine verunreinigenden
Proteine aus dem gleichen Organismus auf, aus dem die
PSE stammt. Diese Proteine werden gewöhnlich durch rekombinante
Expression zum Beispiel Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder
Thraustochytrium-PSE in Pflanzen wie Physcomitrella patens bzw.
o. g. oder Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien, wie E. coli,
Bacillus subtilis, C. glutamicum, Pilzen, wie Mortierella, Hefe,
wie Saccharomyces, oder Ciliaten wie Colpidium oder Algen wie
Phaeodactylum hergestellt.
Eine erfindungsgemäße isolierte PSE oder ein Teil davon
kann auch am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in
Physcomitrella, Crypthecodinium oder Thraustochytrium notwendigen
Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen
teilnehmen. Bei bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das Protein
oder der Teil davon eine Aminosäuresequenz, die ausreichend homo
log zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 ist, daß das Protein oder der Teil
davon die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zell
membranen in Physcomitrella, Crypthecodinium oder Thrausto
chytrium notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen
über diese Membranen teilzunehmen, beibehält. Der Teil des
Proteins ist vorzugsweise ein biologisch aktiver Teil, wie hier
beschrieben. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat
eine erfindungsgemäße PSE eine der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 gezeigten Aminosäuresequenzen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die PSE
eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz codiert
wird, die, zum Beispiel unter stringenten Bedingungen, an eine
Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 7 hybridisiert. Bei noch einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform hat die PSE eine Aminosäuresequenz, die von einer
Nukleotidsequenz codiert wird, die mindestens etwa 50 bis 60%,
vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70%, stärker bevorzugt
mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90%, 90 bis 95% und noch
stärker bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder
noch homologer zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 ist. Die erfindungs
gemäße bevorzugte PSE besitzt vorzugsweise auch mindestens eine
der hier beschriebenen PSE-Aktivitäten. Zum Beispiel umfaßt
eine erfindungsgemäße bevorzugte PSE eine Aminosäuresequenz,
die von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die, zum Beispiel
unter stringenten Bedingungen, an eine Nukleotidsequenz der
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 hybridi
siert und am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen in
Physcomitrella, Crypthecodinium oder Thraustochytrium notwendigen
Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen
teilnehmen kann oder eine oder mehrere polyungesättigte Fettsäuren
mit wenigstens zwei Doppelbindungen und einer Kettenlänge
von C16 oder C18 verlängern kann.
Bei anderen Ausführungsformen ist die PSE im wesentlichen homo
log zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 und behält die funktionelle Aktivität
des Proteins einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 bei, ihre Aminosäuresequenz unter
scheidet sich jedoch aufgrund von natürlicher Variation oder
Mutagenese, wie eingehend im obigen Unterabschnitt I beschrieben.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist die PSE folglich ein
Protein, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die mindestens etwa
50 bis 60%, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70% und stärker
bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80%, 80 bis 90%, 90 bis 95%
und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99%
oder noch homologer zu einer vollständigen Aminosäuresequenz der
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 ist und
zumindest eine der hier beschriebenen PSE-Aktivitäten aufweist.
Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein
vollständiges Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder Thrausto
chytrium -Protein, das im wesentlichen homolog zu einer voll
ständigen Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 ist.
Biologisch aktive Teile einer PSE umfassen Peptide, umfassend
Aminosäuresequenzen, die von der Aminosäuresequenz einer PSE her
geleitet sind, z. B. eine in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
und SEQ ID NO: 8 gezeigte Aminosäuresequenz oder die Aminosäure
sequenz eines Proteins, das zu einer PSE homolog ist, welche
weniger Aminosäuren als die Vollängen-PSE oder das Vollängen
protein aufweisen, das zu einer PSE homolog ist, und zumindest
eine Aktivität einer PSE aufweisen. Gewöhnlich umfassen bio
logisch aktive Teile (Peptide, z. B. Peptide, die zum Beispiel 5,
10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr
Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens
einer Aktivität einer PSE. Überdies können andere biologisch
aktive Teile, in denen andere Bereiche des Proteins deletiert
sind, durch rekombinante Techniken hergestellt und bezüglich
einer oder mehrerer der hier beschriebenen Aktivitäten untersucht
werden. Die biologisch aktiven Teile einer PSE umfassen vorzugs
weise ein/eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Teile
davon mit biologischer Aktivität.
PSEs werden vorzugsweise durch DNA-Rekombinationstechniken
hergestellt. Zum Beispiel wird ein das Protein codierendes
Nukleinsäuremolekül in einen Expressionsvektor (wie vorstehend
beschrieben) kloniert, der Expressionsvektor wird in eine
Wirtszelle (wie vorstehend beschrieben) eingebracht, und die
PSE wird in der Wirtszelle exprimiert. Die PSE kann dann
durch ein geeignetes Reinigungsschema mittels Standard-Protein
reinigungstechniken aus den Zellen isoliert werden. Alternativ
zur rekombinanten Expression kann eine PSE, ein -Polypeptid,
oder -Peptid mittels Standard-Peptidsynthesetechniken chemisch
synthetisiert werden. Überdies kann native PSE aus Zellen
(z. B. Endothelzellen) z. B. unter Verwendung eines Anti-PSE-
Antikörpers isoliert werden, der durch Standardtechniken
produziert werden kann, wobei eine erfindungsgemäße PSE oder
ein Fragment davon verwendet wird.
Die Erfindung stellt auch chimäre PSE-Proteine oder PSE-
Fusionsproteine bereit. Wie hier verwendet, umfaßt ein
"chimäres PSE-Protein" oder "PSE-Fusionsprotein" ein PSE-Poly
peptid, das funktionsfähig an ein nicht-PSE-Polypeptid gebunden
ist. Ein "PSE-Polypeptid" betrifft ein Polypeptid mit einer
Aminosäuresequenz, die einer PSE entspricht, wohingegen ein
"nicht-PSE-Polypeptid" ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz
betrifft, die einem Protein entspricht, das im wesentlichen
nicht homolog zu der PSE ist, z. B. ein Protein, das sich vom
der PSE unterscheidet und aus dem gleichen oder einem anderen
Organismus stammt. Innerhalb des Fusionsproteins soll der Begriff
"funktionsfähig verbunden" bedeuten, daß das PSE-Polypeptid und
das nicht-PSE-Polypeptid so miteinander fusioniert sind, daß
beide Sequenzen die vorhergesagte, der verwendeten Sequenz zu
geschriebene Funktion erfüllen. Das nicht-PSE-Polypeptid kann an
den N-Terminus oder den C-Terminus des PSE-Polypeptids fusioniert
sein. Bei einer Ausführungsform ist das Fusionsprotein zum Bei
spiel ein GST-PSE-Fusionsprotein, bei dem die PSE-Sequenzen an
den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Diese Fusions
proteine können die Reinigung der rekombinanten PSEs erleichtern.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Fusionsprotein eine
PSE, die eine heterologe Signalsequenz an ihrem N-Terminus auf
weist. In bestimmten Wirtszellen (z. B. Säuger-Wirtszellen) kann
die Expression und/oder Sekretion einer PSE durch Verwendung
einer heterologen Signalsequenz gesteigert werden.
Ein erfindungsgemäßes chimäres PSE-Protein oder PSE-Fusions
protein wird durch Standard-DNA-Rekombinationstechniken herge
stellt. Zum Beispiel werden DNA-Fragmente, die unterschiedliche
Polypeptidsequenzen codieren, gemäß herkömmlicher Techniken
im Leseraster aneinander ligiert, indem beispielsweise glatte
oder überhängende Enden zur Ligation, Restriktionsenzymspaltung
zur Bereitstellung geeigneter Enden, Auffüllen kohäsiver Enden,
wie erforderlich, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um
ungewollte Verknüpfungen zu vermeiden, und enzymatische Ligation
eingesetzt werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das
Fusionsgen durch herkömmliche Techniken, einschließlich DNA-
Syntheseautomaten, synthetisiert werden. Alternativ kann eine
PCR-Amplifizierung von Genfragmenten unter Verwendung von Anker
primern durchgeführt werden, die komplementäre Überhänge zwischen
aufeinanderfolgenden Genfragmenten erzeugen, die anschließend
miteinander hybridisiert und reamplifiziert werden können, so
daß eine chimäre Gensequenz erzeugt wird (siehe zum Beispiel
Current Protocols in Molecular Biology, Hrsgb. Ausubel et al.,
John Wiley & Sons: 1992). Überdies sind viele Expressionsvektoren
kommerziell erhältlich, die bereits eine Fusionseinheit (z. B. ein
GST-Polypeptid) codieren. Eine PSE-codierende Nukleinsäure kann
in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, so daß die
Fusionseinheit im Leseraster mit dem PSE-Protein verbunden ist.
Homologe der PSE können durch Mutagenese, z. B. durch spezifische
Punktmutation oder Verkürzung der PSE, erzeugt werden. Der
Begriff "Homologe", wie hier verwendet, betrifft eine variante
Form der PSE, die als Agonist oder Antagonist der PSE-Aktivität
wirkt. Ein Agonist der PSE kann im wesentlichen die gleiche
Aktivität wie die oder einen Teil der biologischen Aktivitäten
der PSE beibehalten. Ein Antagonist der PSE kann eine oder
mehrere Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form der PSE durch
zum Beispiel kompetitive Bindung an ein stromabwärts oder -auf
wärts gelegenes Element der Stoffwechselkaskade für Zellmembran
komponenten, welche die PSE umfaßt, oder durch Bindung an eine
PSE, welche den Transport von Verbindungen über Zellmembranen
vermittelt, hemmen, wodurch die Translokation gehemmt wird.
Bei einer alternativen Ausführungsform können Homologe der
PSE durch Sichten kombinatorischer Banken von Mutanten, z. B.
Verkürzungsmutanten, der PSE hinsichtlich PSE-Agonisten- oder
-Antagonisten-Aktivität identifiziert werden. Bei einer Aus
führungsform wird eine variegierte Bank von PSE-Varianten durch
kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt und
durch eine variegierte Genbank codiert. Eine variegierte Bank
von PSE-Varianten kann z. B. durch enzymatische Ligation eines
Gemisches von synthetischen Oligonukleotiden in Gensequenzen her
gestellt werden, so daß sich ein degenerierter Satz potentieller
PSE-Sequenzen als individuelle Polypeptide oder alternativ als
Satz größerer Fusionsproteine (z. B. für das Phage-Display),
die diesen Satz von PSE-Sequenzen enthalten, exprimieren läßt.
Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von
Banken potentieller PSE-Homologen aus einer degenerierten
Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische
Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-
Syntheseautomaten durchgeführt und das synthetische Gen dann
in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Ver
wendung eines degenerierten Satzes von Genen ermöglicht die
Bereitstellung sämtlicher Sequenzen, die den gewünschten Satz an
potentiellen PSE-Sequenzen codieren, in einem Gemisch, Verfahren
zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Fachgebiet
bekannt [siehe z. B. Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura
et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984)
Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477].
Zusätzlich können Banken von PSE-Fragmenten zur Herstellung einer
variegierten Population von PSE-Fragmenten für das Sichten und
für die anschließende Selektion von Homologen einer PSE verwendet
werden. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von Fragmenten
der codierenden Sequenz durch Behandeln eines doppelsträngigen
PCR-Fragmentes einer codierenden PSE-Sequenz mit einer Nuklease
unter Bedingungen, unter denen Doppelstrangbrüche nur etwa ein
mal pro Molekül erfolgen, Denaturieren der doppelsträngigen
DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA,
welche Sense/Antisense-Paare von verschiedenen Produkten mit
Doppelstrangbrüchen umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger
Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit
S1-Nuklease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen
Expressionsvektor erzeugt werden. Mit diesem Verfahren kann eine
Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale
und interne Fragmente der PSE verschiedener Größen codiert.
Im Fachgebiet sind mehrere Techniken für das Sichten von Gen
produkten in kombinatorischen Banken, die durch Punktmutationen
oder Verkürzung hergestellt worden sind, und für das Sichten von
cDNA-Banken nach Genprodukten mit einer ausgewählten Eigenschaft
bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Sichtung der
Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von PSE-
Homologen erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten
Techniken zum Sichtung großer Genbanken, die einer Analyse mit
hohem Durchsatz unterworfen werden können, umfassen gewöhnlich
das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren,
Transformieren von geeigneten Zellen mit der resultierenden
Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter
Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität
die Isolation des Vektors, der das Gen codiert, dessen Produkt
nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese
(REM), eine neue Technik, die die Häufigkeit funktioneller
Mutanten in den Banken erhöht, kann in Kombination mit den
Sichtungstests zur Identifikation von PSE-Homologen verwendet
werden [Arkin und Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering
6(3): 327-331]. Es können auch vorteilhaft Kombinationen der
oben genannten Methoden verwendet werden.
Eine weitere bekannte Technik zur Veränderung von katalytischen
Eigenschaften von Enzymen bzw. deren codierenden Genen ist
das sogenannte "Gen-Shuffling" (siehe z. B. WO 97/20078 oder
WO 98/13487), das eine Kombination von Genfragmenten darstellt,
wobei diese Neukombination zusätzlich noch durch fehlerhafte
Polymerasekettenreaktionen variiert werden kann und somit
eine hohe zu testende Sequenzdiversität schafft. Voraus
setzung für den Einsatz eines solchen Ansatzes ist jedoch
ein geeignetes Screeningsystem, um die erstellte Gendiversität
auf Funktionalität zu überprüfen.
Insbesondere für die Sichtung von Elongaseaktivitäten ist ein
Sichtungsverfahren Voraussetzung, das PUFA-abhängig Enzym
aktivität(en) erfaßt. Bzgl. Elongaseaktivitäten mit Spezifität
für PUFAs kann man in Mucor-Species, die durch bekannte Trans
formationsverfahren mit gewünschten Genkonstrukten transformier
bar sind, die Toxizität von Arachidonsäure in Anwesenheit eines
toxischen Metaboliten (hier: Salicylsäure oder Salicylsäure
derivate) nutzen (Eroshin et al., Mikrobiologiya, Vol. 65, No.1,
1996, Seiten 31-36), um eine wachstumsbasierte Erstsichtung
durchzuführen. Resultierende Klone können dann einer Analyse
ihrer Lipidinhaltstoffe mittels Gaschromatographie und Massen
spektroskopie unterzogen werden, um Edukte und Produkte in Art
und Menge zu erfassen.
Bei einer weiteren Ausführungsform können Tests auf Zellbasis
zur Analyse einer variegierten PSE-Bank unter Verwendung von
weiteren im Fachgebiet bekannten Verfahren ausgenutzt werden.
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Protein
homologen, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen
können bei einem oder mehreren der nachstehenden Verfahren ver
wendet werden: Identifikation Physcomitrella patens, Crypthe
codinium oder Thraustochytrium und verwandten Organismen,
Kartierung der Genome von Organismen, die mit Physcomitrella
Crypthecodinium oder Thraustochytrium verwandt sind, Identi
fikation und Lokalisierung von Physcomitrella-, Crypthecodinium-
oder Thraustochytrium -Sequenzen von Interesse, Evolutions
studien, Bestimmung von PSE-Proteinbereichen, die für die
Funktion notwendig sind, Modulation einer PSE-Aktivität;
Modulation des Stoffwechsels einer oder mehrerer Zellmembran
komponenten; Modulation des Transmembrantransports einer oder
mehrerer Verbindungen sowie Modulation der zellulären Produktion
einer gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie. Die
erfindungsgemäßen PSE-Nukleinsäuremoleküle haben eine Vielzahl
von Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines
Organismus als Physcomitrella, Crypthecodinium oder Thrausto
chytrium oder als naher Verwandter davon verwendet werden. Sie
können auch zur Identifikation des Vorliegens von Physcomitrella,
Crypthecodinium oder Thraustochytrium oder eines Verwandten
davon in einer Mischpopulation von Mikroorganismen verwendet
werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäuresequenzen einer
Reihe von Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder Thraustochytrium
-Genen bereit; durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA
einer Kultur einer einheitlichen oder gemischten Population von
Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde,
die einen Bereich eines Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder
Thraustochytrium -Gens oder von Teilen davon überspannt, das
für diesen Organismus einzigartig ist, kann man bestimmen,
ob dieser Organismus vorliegt. Physcomitrella, Crypthecodinium
oder Thraustochytrium selbst werden zur kommerziellen Produktion
mehrfach ungesättigter Säuren verwendet. Die erfindungsgemäßen
Nukleinsäuren eignen sich darüber hinaus zur PUFA-Produktion auch
in anderen Organismen insbesondere wenn erreicht werden soll, daß
resultierende PUFAs auch in die Triacylglycerolfraktion eingebaut
werden sollen.
Ferner können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Protein
moleküle als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen.
Diese sind nicht nur zur Kartierung des Genoms, sondern auch für
funktionelle Studien von Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder
Thraustochytrium -Proteinen geeignet. Zur Identifikation des
Genombereichs, an den ein bestimmtes DNA-bindendes Protein von
Physcomitrella, Crypthecodinium oder Thraustochytrium bindet,
könnte das Physcomitrella-, Crypthecodinium- oder Thrausto
chytrium -Genom zum Beispiel gespalten werden und die Fragmente
mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die
das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremolekülen, vorzugsweise mit leicht nachweisbaren
Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nuklein
säuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisierung
des Fragments auf der Genomkarte von Physcomitrella, Crypthe
codinium oder Thraustochytrium und erleichtert, wenn dies mehr
mals mit unterschiedlichen Enzymen durchgeführt wird, eine rasche
Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein bindet.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem aus
reichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, daß
diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer
genomischen Karte bei verwandten Pilzen oder Algen dienen können.
Die erfindungsgemäßen PSE-Nukleinsäuremoleküle eignen sich
auch für Evolutions- und Proteinstruktur-Untersuchungen. Die
Stoffwechsel- und Transportprozesse, an denen die erfindungsge
mäßen Moleküle beteiligt sind, werden von vielen prokaryotischen
und eukaryotischen Zellen genutzt; durch Vergleich der Sequenzen
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen, die
ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der
Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden.
Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung,
welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was
bei der Bestimmung von Bereichen des Proteins hilfreich sein
kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der
Bestimmung ist für Proteinengineering-Untersuchungen wertvoll und
kann einen Hinweis darauf geben, wieviel Mutagenese das Protein
tolerieren kann, ohne die Funktion zu verlieren.
Die Manipulation der erfindungsgemäßen PSE-Nukleinsäuremoleküle
kann zur Produktion von PSEs mit funktionellen Unterschieden zu
den Wildtyp-PSEs führen. Die Effizienz oder Aktivität dieser
Proteine kann verbessert sein, sie können in größeren Anzahlen
als gewöhnlich in der Zelle zugegen sein, oder ihre Effizienz
oder Aktivität kann verringert sein. Verbesserte Effizienz oder
Aktivität bedeutet beispielsweise, daß das Enzym eine höhere
Selektivität und/oder Aktivität, vorzugsweise eine mindestens
10% höhere, besonders bevorzugt eine mindestens 20% höhere
Aktivität, ganz besonders bevorzugt eine mindestens 30% höhere
Aktivität als das ursprüngliche Enzym aufweist.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung
einer erfindungsgemäßen PSE die Ausbeute, Produktion und/oder
Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie, welche ein
solches verändertes Protein enthält, direkt beeinflussen kann.
Die Gewinnung von Feinchemikalien-Verbindungen aus Kulturen
von Ciliaten, Algen oder Pilzen im großen Maßstab ist signi
fikant verbessert, wenn die Zelle die gewünschten Verbindungen
sezerniert, da diese Verbindungen aus dem Kulturmedium (im Gegen
satz zur Extraktion aus der Masse der gezüchteten Zellen) leicht
gereinigt werden können. Ansonsten läßt sich die Reinigung ver
bessern, wenn die Zelle in vivo Verbindungen in einem speziali
sierten Kompartiment mit einer Art Konzentrationsmechanismus
speichert. Bei Pflanzen, die PSEs exprimieren, kann ein ge
steigerter Transport zu besserer Verteilung innerhalb des
Pflanzengewebes und der -organe führen. Durch Vergrößern der
Anzahl oder der Aktivität von Transportermolekülen, welche Fein
chemikalien aus der Zelle exportieren, kann es möglich sein, die
Menge der produzierten Feinchemikalie, die im extrazellulären
Medium zugegen ist, zu steigern, wodurch Ernte und Reinigung oder
bei Pflanzen eine effizientere Verteilung erleichtert werden. Zur
effizienten Überproduktion einer oder mehrerer Feinchemikalien
sind dagegen erhöhte Mengen an Cofaktoren, Vorläufermolekülen und
Zwischenverbindungen für die geeigneten Biosynthesewege erforder
lich. Durch Vergrößern der Anzahl und/oder der Aktivität von
Transporterproteinen, die am Import von Nährstoffen, wie Kohlen
stoffquellen (d. h. Zuckern), Stickstoffquellen (d. h. Aminosäuren,
Ammoniumsalzen), Phosphat und Schwefel, beteiligt sind, kann man
die Produktion einer Feinchemikalie aufgrund der Beseitigung
aller Einschränkungen des Nährstoffangebots beim Biosynthese
prozeß verbessern. Fettsäuren, wie PUFAs, und Lipide, die PUFAs
enthalten, sind selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch
Optimieren der Aktivität oder Erhöhen der Anzahl einer oder
mehrerer erfindungsgemäßer PSEs, die an der Biosynthese dieser
Verbindungen beteiligt sind, oder durch Stören der Aktivität
einer oder mehrerer PSEs, die am Abbau dieser Verbindungen
beteiligt sind, kann man somit die Ausbeute, Produktion und/oder
Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmoleküle in
Ciliaten, Algen, Pflanzen, Pilzen, Hefen oder anderen Mikro
organismen steigern.
Die Manipulation eines oder mehrerer erfindungsgemäßer PSE-Gene
kann ebenfalls zu PSEs mit veränderten Aktivitäten führen, welche
die Produktion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien
aus Algen, Pflanzen, Ciliaten oder Pilzen indirekt beeinflussen.
Die normalen biochemischen Stoffwechselprozesse führen z. B. zur
Produktion einer Vielzahl an Abfallprodukten (z. B. Wasserstoff
peroxid und andere reaktive Sauerstoffspezies), die diese Stoff
wechselprozesse aktiv stören können [z. B. nitriert Peroxynitrit
bekanntlich Tyrosin-Seitenketten, wodurch einige Enzyme mit
Tyrosin im aktiven Zentrum inaktiviert werden, Groves, J. T.
(1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2); 226-235]. Diese Abfall
produkte werden zwar üblicherweise ausgeschieden, aber die zur
fermentativen Produktion im großen Maßstab verwendeten Zellen
werden für die Überproduktion einer oder mehrerer Feinchemikalien
optimiert und können somit mehr Abfallprodukte produzieren als
für eine Wildtypzelle üblich. Durch Optimieren der Aktivität
einer oder mehrerer erfindungsgemäßer PSEs, die am Export von
Abfallmolekülen beteiligt sind, kann man die Lebensfähigkeit der
Zelle verbessern und eine effiziente Stoffwechselaktivität auf
rechterhalten. Auch das Vorliegen hoher intrazellulärer Mengen
der gewünschten Feinchemikalie kann tatsächlich für die Zelle
toxisch sein, so daß man durch Steigern der Fähigkeit der Zelle
zur Sekretion dieser Verbindungen die Lebensfähigkeit der Zelle
verbessern kann.
Die erfindungsgemäßen PSEs können ferner so manipuliert sein, daß
die relativen Mengen verschiedener Lipid- und Fettsäuremoleküle
verändert werden. Dies kann eine entscheidende Auswirkung auf
die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipid
typ unterschiedliche physikalische Eigenschaften hat, kann die
Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die Membran
fluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität
können den Transport von Molekülen über die Membran beeinflussen,
was, wie vorstehend erläutert, den Export von Abfallprodukten
oder der produzierten Feinchemikalie oder den Import notwendiger
Nährstoffe modifizieren kann. Diese Änderungen der Membran
fluidität können auch die Integrität der Zelle entscheidend
beeinflussen; Zellen mit vergleichsweise schwächeren Membranen
sind anfälliger gegenüber abiotischen und biotischen Streß
bedingungen, welche die Zelle beschädigen oder abtöten können.
Durch Manipulieren von PSEs, die an der Produktion von Fettsäuren
und Lipiden für den Membranaufbau beteiligt sind, so daß die
resultierende Membran eine Membranzusammensetzung hat, die für
die in den Kulturen, die zur Produktion von Feinchemikalien ver
wendet werden, herrschenden Umweltbedingungen empfänglicher sind,
sollte ein größerer Anteil der Zellen überleben und sich ver
mehren. Größere Mengen an produzierenden Zellen sollten sich
in größeren Ausbeuten, höherer Produktion oder Effizienz der
Produktion der Feinchemikalie aus der Kultur manifestieren.
Die vorstehend genannten Mutagenesestrategien für PSEs, die zu
erhöhten Ausbeuten einer Feinchemikalie führen sollen, sollen
nicht beschränkend sein; Variationen dieser Strategien sind dem
Fachmann leicht ersichtlich. Unter Verwendung dieser Mechanismen
und mit Hilfe der hier offenbarten Mechanismen können die
erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle zur Erzeugung
von Algen, Ciliaten, Pflanzen, Tieren, Pilzen oder anderen Mikro
organismen, wie C. glutamicum, verwendet werden, die mutierte
PSE-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, so daß die
Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer ge
wünschten Verbindung verbessert wird. Diese gewünschte Verbindung
kann ein beliebiges natürliches Produkt von Algen, Ciliaten,
Pflanzen, Tieren, Pilzen oder Bakterien sein, welches die End
produkte von Biosynthesewegen und Zwischenprodukte natürlich vor
kommender Stoffwechselwege umfaßt, sowie Moleküle, die im Stoff
wechsel dieser Zellen nicht natürlich vorkommen, die jedoch von
den erfindungsgemäßen Zellen produziert werden.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Verfahren
zur Produktion von PUFAs, wobei das Verfahren das Züchten
eines Organismus, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein
erfindungsgemäßes Genkonstrukt oder einen erfindungsgemäßen
Vektor enthält, welche für ein Polypeptid codieren, das C16-,
C18- oder C20-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen
im Fettsäuremolekül um mindestens zwei Kohlenstoffatome unter
Bedingungen, unter denen PUFAs in dem Organismus produziert
werden, verlängert, umfaßt. Durch dieses Verfahren hergestellte
PUFAs lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der
Kultur, in der sie wachsen, oder von dem Feld, Aufbrechen und/
oder Extrahieren des geernteten Materials mit einem organischen
Lösungsmittel isolieren. Aus diesem Lösungsmittel kann das Öl,
das Lipide, Phospholipide, Sphingolipide, Glycolipide, Triacyl
glycerine und/oder freie Fettsäuren mit höherem Gehalt an PUFAs
enthält, isoliert werden. Durch basische oder saure Hydrolyse
der Lipide, Phospholipide, Sphingolipide, Glycolipide, Triacyl
glycerine können die freien Fettsäuren mit höherem Gehalt an
PUFAs isoliert werden. Ein höherer Gehalt an PUFAs bedeutet
mindestens 5%, vorzugsweise 10%, besonders bevorzugt 20%,
ganz besonders bevorzugt 40% mehr PUFAs als der ursprüngliche
Organismus, der keine zusätzliche Nukleinsäure, die für die
erfindungsgemäße Elongase codiert, besitzt.
Vorzugsweise sind die durch dieses Verfahren produzierten
PUFAs C18-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle mit mindestens zwei
Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise drei, vier,
fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt drei oder
fünf Doppelbindungen. Diese C18-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle
lassen sich aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids oder
einer freien Fettsäure isolieren. Geeignete Organismen sind
beispielsweise die vorstehend erwähnten. Bevorzugte Organismen
sind Mikroorganismen, Tiere oder Pflanzen, besonders bevorzugt
Pflanzen oder Algen, ganz besonders bevorzugt transgene Pflanzen.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform sind Öle, Lipide oder Fett
säuren oder Fraktionen davon, die durch das oben beschriebene
Verfahren hergestellt worden sind, besonders bevorzugt Öl, Lipid
oder eine Fettsäurezusammensetzung, die PUFAs umfassen und von
transgenen Pflanzen herrühren.
Eine Ausführungsform der Erfindung sind Öle, Lipide oder Fett
säuren, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt
wurden. Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind Öl-, Lipid-
oder Fettsäurezusammensetzungen, die PUFAs hergestellt nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren enthalten und von transgenen Pflanzen
stammen, welche eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein Gen
konstrukt oder Vektor enthalten.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung
des Öls, Lipids oder der Fettsäurezusammensetzung in Futter
mitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter
veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefaßt werden
sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung
zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und
veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme
aufgenommen.
Klonierungsverfahren, wie beispielsweise Restriktionsspaltungen,
Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer
von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose- und Nylonmembranen, Ver
bindung von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia
coli- und Hefe-Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse
rekombinanter DNA, wurden durchgeführt wie beschrieben in
Sambrook et al. [(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press:
ISBN 0-87969-309-6] oder Kaiser, Michaelis und Mitchell [(1994),
"Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory
Press: ISBN 0-87969-451-3]. Die Transformation und Anzucht
von Algen, wie Chlorella oder Phaeodactylum werden durchge
führt wie beschrieben von El-Sheekh [(1999), Biologia Plantarum
42: 209-216]oder Apt et al. [(1996) Molecular and General
Genetics 252 (5): 872-9].
Die verwendeten Chemikalien wurden, wenn im Text nicht anders
angegeben, in p. A.-Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm),
Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und
Sigma (Deisenhofen) bezogen. Lösungen wurden unter Verwendung
von reinem pyrogenfreiem Wasser, im nachstehenden Text als H2O
bezeichnet, aus einer Milli-Q-Wassersystem-Wasserreinigungsanlage
(Millipore, Eschborn) hergestellt. Restriktionsendonukleasen,
DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden
bezogen von den Firmen AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig),
Biometra (Göttingen), Boehringer (Mannheim), Genomed (Bad
Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen
(Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia
(Freiburg), Qiagen (Hilden) und Stratagene (Amsterdam, Niederlande).
Wenn nicht anders angegeben, wurden sie nach den
Anweisungen des Herstellers verwendet.
Für diese Untersuchungen wurde eine Thraustochytrium-Stamm ver
wendet, der über die American Type Culture Collection (ATCC-Samm
lung) mit der Stammnummer ATCC26185 (Thraustochytrium) verfügbar
ist, bzw im Fall von Crypthecodinium vom Provasoli-Guillard
National Center for Culture of Marine Phytoplancton ((CCMP)
West Boothbay Harbour, ME, USA) mit der Stammkultur-Nr. CCMP316
zugänglich ist. Die Algen wurden bei 25 Grad Celsius im Dunkeln
kultiviert in Glasröhren, die von unten mit Luft begast wurden.
Die Anzucht von Thraustochytrium erfolgte alternativ wie
detailliert beschrieben bei Singh & Ward (1997, Advances in
Microbiology, 45, 271-311).
Als Kulturmedium für Crypthecodinium wurde das f/2 Kulturmedium
mit 10% organischen Medium nach Guillard, R. R. L. verwendet
[1975; Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates.
In: Smith, W. L. and Chanley, M. H. (Eds.) Culture of marine
Invertebrate animals, NY Plenum Press, pp. 29-60.]: Es enthält
995,5 ml Seewasser (artifiziell) 1 ml NaNO3 (75 g/l), 1 ml NaH2PO4 (5 g/l), 1 ml Trace metal solution, 1 ml Tris/Cl pH 8.0, 0.5 ml f/2 vitamin solution
Trace metal solution: Na2EDTA (4,36 g/l), FeCl3 (3,15 g/l), Primary Trace metals: CuSO4 (10 g/l), ZnSO4 (22 g/l), CoCl2 (10 g/l), MnCl2 (18 g/l), NaMoO4 (6,3 g/l)
f/2 vitamin solution: Biotin: 10 mg/l, Thiamin 200 mg/l, Vit B12 0,1 mg/l
org-Medium: Na-Acetat (1 g/l), Glucose (6 g/l), Na-Succinat (3 g/l), Bacto-Trypton (4 g/l), Hefe-Extrakt (2 g/l)
995,5 ml Seewasser (artifiziell) 1 ml NaNO3 (75 g/l), 1 ml NaH2PO4 (5 g/l), 1 ml Trace metal solution, 1 ml Tris/Cl pH 8.0, 0.5 ml f/2 vitamin solution
Trace metal solution: Na2EDTA (4,36 g/l), FeCl3 (3,15 g/l), Primary Trace metals: CuSO4 (10 g/l), ZnSO4 (22 g/l), CoCl2 (10 g/l), MnCl2 (18 g/l), NaMoO4 (6,3 g/l)
f/2 vitamin solution: Biotin: 10 mg/l, Thiamin 200 mg/l, Vit B12 0,1 mg/l
org-Medium: Na-Acetat (1 g/l), Glucose (6 g/l), Na-Succinat (3 g/l), Bacto-Trypton (4 g/l), Hefe-Extrakt (2 g/l)
Für diese Untersuchung wurden Pflanzen der Art Physcomitrella
patens (Hedw.) B. S. G. aus der Sammlung der Abteilung für
Genetische Untersuchungen der Universität Hamburg verwendet.
Sie stammen von dem Stamm 16/14, der von H. L. K. Whitehouse in
Gransden Wood, Huntingdonshire (England) gesammelt und von Engel
(1968, Am J Bot 55, 438-446) aus einer Spore subkultiviert wurde.
Die Proliferation der Pflanzen erfolgte mittels Sporen und
mittels Regeneration der Gametophyten. Das Protonema entwickelte
sich aus der haploiden Spore zu chloroplastenreichem Chloronema
und chloroplastenarmem Caulonema, woraus sich nach etwa 12 Tagen
Knospen bildeten. Diese wuchsen zu Gametophoren mit Antheridien
und Archegonien. Nach der Befruchtung entstand der diploide
Sporophyt mit kurzer Seta und Sporenkapsel, in der die Meio
sporen reifen.
Die Anzucht erfolgte in einer klimatisierten Kammer bei einer
Lufttemperatur von 25°C und einer Lichtintensität von 55 Mikro
mol-1m-2 (Weißlicht; Phillips TL 65 W/25 Fluoreszenzröhre) und
einem Licht-Dunkel-Wechsel von 16/8 Stunden. Das Moos wurde ent
weder in Flüssigkultur unter Verwendung von Knop-Medium nach
Reski und Abel (1985, Planta 165, 354-358) modifiziert oder auf
festem Knop-Medium unter Verwendung von 1% Oxoidagar (Unipath,
Basingstoke, England) angezogen.
Die zur RNA- und DNA-Isolation verwendeten Protonemata wurden in
belüfteten Flüssigkulturen gezüchtet. Die Protonemata wurden alle
9 Tage zerkleinert und in frisches Kulturmedium überführt.
Die Einzelheiten der Isolation von Gesamt-DNA betreffen die Auf
arbeitung von Pflanzenmaterial mit einem Frischgewicht von einem
Gramm.
CTAB-Puffer: 2% (Gew./Vol.) N-Acetyl-N,N,N-trimethylammonium
bromid (CTAB); 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA.
N-Laurylsarkosin-Puffer: 10% (Gew./Vol.) N-Laurylsarkosin;
100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM EDTA.
Das Pflanzenmaterial oder Crypthecodinium- oder Thraustochytrium-
Zellmaterial wurde unter flüssigem Stickstoff in einem Mörser
verrieben, so daß ein feines Pulver erhalten wurde, und in 2-ml-
Eppendorfgefäße überführt. Das gefrorene Pflanzenmaterial wurde
dann mit einer Schicht von 1 ml Zersetzungspuffer (1 ml CTAB-
Puffer, 100 ml N-Laurylsarkosin-Puffer, 20 ml β-Mercaptoethanol
und 10 ml Proteinase K-Lösung, 10 mg/ml) überschichtet und eine
Stunde unter kontinuierlichem Schütteln bei 60°C inkubiert. Das
erhaltene Homogenat wurde in zwei Eppendorfgefäße (2 ml) auf
geteilt und zweimal durch Schütteln mit dem gleichen Volumen
Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Zur Phasentrennung
wurde eine Zentrifugation bei 8000 × g und RT (= Raumtemperatur
= ~ 23°C) jeweils 15 min lang durchgeführt. Die DNA wurde dann
30 min unter Verwendung von eiskaltem Isopropanol bei -70°C
gefällt. Die gefällte DNA wurde bei 10000 g 30 min bei 4°C
sedimentiert und in 180 ml TE-Puffer (Sambrook et al., 1989,
Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6)
resuspendiert. Zur weiteren Reinigung wurde die DNA mit NaCl
(1,2 M Endkonzentration) behandelt und erneut 30 min unter Ver
wendung des zweifachen Volumens an absolutem Ethanol bei -70°C
gefällt. Nach einem Waschschritt mit 70% Ethanol wurde die DNA
getrocknet und anschließend in 50 ml H2O + RNAse (50 mg/ml End
konzentration) aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4°C
gelöst und die RNAse-Spaltung wurde anschließend 1 Std. bei
37°C durchgeführt. Die Aufbewahrung der DNA erfolgte bei 4°C.
Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen wie Lein und
Raps etc. erfolgt nach einer bei Logemann et al beschriebenen
Methode (1987, Anal. Biochem. 163, 21) isoliert. Aus Moos kann
die Gesamt-RNA Protonema-Gewebe nach dem GTC-Verfahren (Reski
et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352-359) gewonnen werden.
RNA Isolation aus Crypthecodinium und Thraustochytrium:
Tiefgefrorene Algenproben (-70°C) werden in einem eiskaltem
Mörser unter Flüssigstickstoff zu feinem Pulver zerreiben.
2 Volumen Homogenisationsmedium (12,024 g Sorbitol, 40,0 ml 1 M
Tris-HCl, pH 9 (0,2 M); 12,0 ml 5 M NaCl (0,3 M), 8,0 ml 250 mM
EDTA, 761,0 mg EGTA, 40,0 ml 10% SDS werden auf 200 ml mit H2O
aufgefüllt und der pH auf 8,5 eingestellt)und 4 Volumen Phenol
mit 0,2% Mercaptoethanol werden bei 40-50°C unter gutem Mischen
zu gefrorenem Zellpulver gegeben. Danach werden 2 Volumen Chloro
form hinzufügen und für 15 min kräftig gerührt. Es wird 10 min
bei 10000 g zentrifugiert und die wässrige Phase mit Phenol/
Chloroform (2 Vol/2 Vol) und abschließend mit Chloroform extra
hiert.
Das erhaltene Volumen der wässrigen Phase wird mit 1/20 Vol 4 M
Na-Acetat (pH 6) und 1 Vol Isopropanol (eiskalt) versetzet und
die Nukleinsäuren bei -20°C ÜN gefällt. Es wird 30 min bei 10000 g
zentrifugiert und der Überstand abgesogen. Es folgt ein Wasch
schritt mit 70% EtOH und erneute Zentrifugation. Das Sediment
wird in Tris-Borat-Puffer (80 mM Tris-Borat-Puffer, 10 mM EDTA,
pH 7,0). Dann wird der Überstand mit 1/3 Vol 8 M LiCl versetzt,
gemischt 30 min bei 4°C inkubiert. Nach erneutem zentrifugieren
wird das Sediment mit 70% Ethanol gewaschen, zentrifugiert und
das Sediment in RNAse-freiem Wasser gelöst.
Die Isolierung von poly(A)+-RNA erfolgt unter Verwendung von Dyna
Beads® (Dynal, Oslo, Finnland) nach den Anweisungen im Protokoll
des Herstellers.
Nach der Bestimmung der RNA- oder poly(A)+-RNA-Konzentration wird
die RNA durch Zugabe von 1/10 Volumina 3 M Natriumacetat, pH 4,6,
und 2 Volumina Ethanol gefällt und bei -70°C aufbewahrt.
Für die Analyse werden jeweils 20 µg RNA in einem Formaldehyd
haltigen 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt und auf Nylon Membranen
(Hybond, Amersham) überführt. Der Nachweis spezifischer Trans
kripte wird wie bei Amasino beschrieben durchgeführt ((1986)
Anal. Biochem. 152, 304)).
Zur Konstruktion der cDNA-Bank aus Physcomitrella, Crypthe
codinium bzw. Thraustochytrium wurde die Erststrangsynthese unter
Verwendung von Reverser Transkriptase aus Maus-Leukämie-Virus
(Roche, Mannheim, Deutschland) und Oligo-d(T)-Primern, die Zweit
strangsynthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, Klenow-
Enzym und RNAse H-Spaltung bei 12°C (2 Std.), 16°C (1 Std.)
und 22°C (1 STd.) erzielt. Die Reaktion wurde durch Inkubation
bei 65°C (10 min) gestoppt und anschließend auf Eis überführt.
Doppelsträngige DNA-Moleküle wurde mit T4-DNA-Polymerase
(Roche, Mannheim) bei 37°C (30 min) mit glatten Enden versehen.
Die Nukleotide wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion
und Sephadex-G50-Zentrifugiersäulen entfernt. EcoRI/XhoI-Adapter
(Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden mittels T4-DNA-Ligase
(Roche, 12°C, über Nacht) an die cDNA-Enden ligiert, mit XhoI
nachgeschnitten und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase
(Roche, 37°C, 30 min) phosphoryliert. Dieses Gemisch wurde der
Trennung auf einem Low-Melting-Agarose-Gel unterworfen. DNA-
Moleküle über 300 Basenpaaren wurden aus dem Gel eluiert, Phenol
extrahiert, auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schüll, Dassel,
Deutschland) konzentriert und an Vektorarme ligiert und in
lambda-ZAPII-Phagen oder lambda-ZAP-Express-Phagen unter Ver
wendung des Gigapack Gold-Kits (Stratagene, Amsterdam, Nieder
lande) verpackt, wobei Material des Herstellers verwendet und
seine Anweisungen befolgt wurden.
cDNA-Banken, wie im Beispiel 4 beschrieben, wurden zur DNA-
Sequenzierung nach Standardverfahren, insbesondere durch das
Kettenterminationsverfahren unter Verwendung des ABI PRISM Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-Kit (Perkin-Elmer,
Weiterstadt, Deutschland), verwendet. Die Sequenzierung zu
fälliger, vereinzelter Klone wurde anschließend an die präpara
tive Plasmidgewinnung aus cDNA-Banken über in vivo-Massenexcision
und Retransformation von DH10B auf Agarplatten durchgeführt (Ein
zelheiten zu Material und Protokoll von Stratagene, Amsterdam,
Niederlande). Plasmid-DNA wurde aus über Nacht gezüchteten
E. coli-Kulturen, die in Luria-Brühe mit Ampicillin (siehe
Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press:
ISBN 0-87969-309-6)) gezüchtet worden waren, an einem Qiagen-
DNA-Präparations-Roboter (Qiagen, Hilden) nach den Protokollen
des Herstellers präpariert. Sequenzierprimer mit den folgenden
Nukleotidsequenzen wurden verwendet:
Die Sequenzen wurden unter Verwendung des Standard-Softwarepa
kets EST-MAX, das kommerziell von Bio-Max (München, Deutschland)
geliefert wird, prozessiert und annotiert. Durch Nutzung von Ver
gleichsalgorithmen und unter Verwendung einer Suchsequenz wurde
mithilfe des BLAST-Programms nach homologen Genen gesucht (Alt
schul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation
of protein database search programs", Nucleic Acids Res.
25: 3389-3402.). Eine Sequenz aus Crypthecodinium und Thrausto
chytrium mit Homologien zur Suchsequenz der Mooselongase aus
Physcomitrella patens wurden eingehender charakterisiert.
Die Vollängensequenz der erfindungsgemäßen Mooselongase Pp_PSE1
(Bezeichnung siehe auch Tabelle 2) wurde für die Sequenz
vergleiche im TBLASTN Suchalgorythmus eingesetzt:
Die vollständige Nukleotidsequenz der Mooselongase Pp_PSE1 cDNA
besteht aus etwa 1200 bp. Sie enthält einen offenen Leserahmen
von 873 bp, der 290 Aminosäure mit einer berechneten Molekülmasse
von 33,4 Da codiert. Die Proteinsequenz besitzt nur 38,5%
Identität und 48,3% Ähnlichkeit mit dem PSE1-Genprodukt von
Saccharomyces cerevisiae, das zur Elongation von Fettsäuren
mit mittlerer Kettenlänge in der Hefe erforderlich ist (Toke &
Martin, 1996, Isolation and characterization of a gene affecting
fatty acid elongation in Saccharomyces cerevisiae. Journal of
Biological Chemistry 271, 18413-18422).
Die EST-Sequenz CC001042041R sowie TC002034029R und TC002014093R
wurden zunächst aufgrund schwacher Homologien mit der Elongase
aus Physcomitrella patens (siehe Tabelle 2), dem PSE1 Gen unter
anderen Kandidatengenen als Zielgen in Betracht gezogen. In Fig.
5 ist das Ergebnis des Vergleiches der Pp_PSE1 Peptidsequenz mit
der gefundenen Sequenz dargestellt. Sie ist Teil der erfindungs
gemäßen Nukleinsäure aus Seq ID NO: 3. (Genname: Tc_PSE1, eigene
Datenbank Nr. der Erfinder TC002034029R). Buchstaben zeigen
identische Aminosäuren an, während das Pluszeichen eine chemisch
ähnliche Aminosäure bedeutet. Die Identitäten bzw. Homologien
aller erfindungsgemäß gefundener Sequenzen gehen aus Tabelle 3
zusammenfassend hervor.
Die Sequenzierung des vollständigen cDNA Fragmentes aus Klon
TC002034029R ergab eine 693 Basenpaare lange Sequenz beginnend
mit erster Base im offenen Leseraster. Die Sequenz codiert für
ein Polypeptid von 195 Aminosäuren dargestellt in Seg ID NO: 42
mit einem Stopcodon in Basenpaarposition übersetzt aus
SEQ ID NO: 3 in Basenpaarposition 586-588. Der Klon TC002014093R
beinhaltet ein nahezu vollständiges Elongase-Polypeptid, wie aus
dem Sequenzvergleich in Fig. 7 zu ersehen ist. Striche bedeuten
identische Aminosäuren während Doppelpunkte und Einzelpunkte
chemisch austauschbare, d. h. chemisch äquivalente Aminosäuren
darstellen. Der Vergleich wurde mit der BLOSUM62 Austauschmatrix
für Aminsoäuren nach Henikoff & Henikoff durchgeführt ((1992)
Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Verwendete Parameter:
Gap Weight: 8; Average Match: 2.912, Length Weight: 2, Average
Mismatch: -2.003.
Weiterhin wurde durch den Sequenzvergleich ein zweiter est
identifiziert. Dargestellt in Fig. 6 ist der Vergleich der
Pp_PSE1 Peptidsequenz mit der gefundenen Sequenz. Wenngleich sich
die Homologie unter gewählten Parametern auf wenige Aminosäuren
beschränkt, so bezieht sich dies auf einen stark konservierten
Bereich der PUFA-spezifischen Elongasen. Es wurde daher die
Sequenz des vollständigen klonierten Fragmentes ermittelt.
Die Sequenzierung des vollständigen cDNA Fragmentes aus Klon
TC002014093R ergab eine 955 Basenpaare lange Sequenz beginnend
mit erster Base im offenen Leseraster. Diese ist erfindungsgemäß
mit SEQ ID NR: 5 angegeben. Die Sequenz codiert für ein Poly
peptid von 297 Aminosäuren mit einem Stopcodon in Basenpaar
position 892-894 erfindungsgemäß dargestellt in SEQ ID NR: 6.
Mithilfe der Sequenz PpPSEl wurde der est CC001042041R
aus Crypthecodinium cohnii codierend für das Ge 41798 00070 552 001000280000000200012000285914168700040 0002010023893 00004 41679n Cc_PSE1
identifiziert. Der isolierte est CC001042041R, erfindungsgemäß
dargestellt als SEQ ID NR: 7 ist 708 Basenpaaren lang mit einem
offenen Leseraster ab erster Base von 642 Basenpaaren codierend
für 214 Aminosäuren und mit einem Stopcodon in Position 643-645.
Die Aminosäuresequenz bis zum Stopcodon ist erfindungsgemäß dar
gestellt in SEQ ID NR: 8.
Neben der Ähnlichkeit mit dem PSE1-Genprodukt kann auch die Ähn
lichkeit zur Elongase aus Saccharomyces cerevisiae (sce ab P)
herangezogen werden, die zur Elongation von Fettsäuren mit
mittlerer Kettenlänge in der Hefe erforderlich ist (Toke &
Martin, 1996, Isolation and characterization of a gene affecting
fatty acid elongation in Saccharomyces cerevisiae. Journal of
Biological Chemistry 271, 18413-18422). In Tabelle 3 sind die
Identitäten und Homologien erfindungsgemäßer Elongasen unter
einander und mit den Elongasen aus Physcomitrella patens und aus
Hefe dargestellt. Die Angaben wurden mithilfe des Programms GAP
als Teilprogramm folgender Software erhalten: Wisconsin Package
Version 10.0 (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.,
USA).
Insbesondere lassen sich aus Fig. 5 bis 10 die folgenden
Sequenzmotive als Bereiche hoher Homologie und entsprechende
daraus abgeleitete Consensussequenzen ableiten, die durch
Rückübersetzung der Aminsoäuren in Drei-Basenpaar-Codons zu
Oligonukleotiden führen, die zur Isolation neuer Elongasen
mittels Polymerasekettenreaktion genutzt werden können.
Dies sind insbesondere die in Fig. 10 dargestellten Sequenz
motive. Aus diesen Motiven lassen sich Oligonukleotide ab
leiten und in Kombination mit zwei Oligonukleotiden in PCR-
Experimenten zur Isolation weiterer Elongasefragmente einsetzen.
Dabei wird zweckmäßigerweise ein Oligonukleotid passend für
den konventionell definierten 5'-3'Strang und ein zweites
mit einem strangabwärts für den 3'-5'Strang passenden Oligo
nukleotid konstruiert und synthetisiert. Dabei ergibt sich eine
definierbare Anzahl an Primerkombinationen, die durch Permutation
der möglichen Varianten begrenzt ist.
Dabei können auch Oligo-dT Primer und Varianten davon genutzt
werden, z. B. indem die letzte Base Spezifität für einen Pool von
Transkripten zuläßt wie z. B. Oligo dT (12-20) X, wobei X ein G,
C oder T sein kann. Auch läßt sich eine zweite Base Oligo dT
(12-20) XY nutzen, wobei X ein G, C oder A sein kann, während
das Y ein A, G, C, oder T sein kann.
Aus oben definierten Sequenzen lassen sich 17- bis 20mere
Oligonukleotide ableiten, die unter Variation der Primer
kombinationen und Versuchsparameter wie Temperaturprogramm,
Mg-Ionenkonzentration etc. zur Isolation von Genfragmenten
genutzt werden können. Die so erhaltenen Fragmente können in
geeignete Vektoren kloniert werden und die Sequenz erhaltener
Klone zur Identifizierung neuer Elongasen nach gängigen ver
fahren ermittelt werden.
Gensequenzen lassen sich zur Identifikation homologer oder
heterologer Gene aus cDNA- oder genomischen Banken verwenden.
Homologe Gene (d. h. Volllängen-cDNA-Klone, die homolog sind,
oder Homologen) lassen sich über Nukleinsäurehybridisierung
unter Verwendung von beispielsweise cDNA-Banken isolieren: Ins
besondere zur Isolation von funktionell aktiven Voll-Längengenen
der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7
kann die Methode genutzt werden. Je nach der Häufigkeit des
Gens von Interesse werden 100000 bis zu 1000000 rekombinante
Bakteriophagen plattiert und auf eine Nylonmembran überführt.
Nach der Denaturierung mit Alkali wird die DNA auf der Membran
z. B. durch UV-Vernetzung immobilisiert. Die Hybridisierung
erfolgt bei hoch-stringenten Bedingungen. In wäßriger Lösung
werden die Hybridisierung und die Waschschritte bei einer Ionen
stärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt.
Hybridisierungssonden wurden z. B. durch Markierung mittels radio
aktiver (32P-) Nicktranskription (High Prime, Roche, Mannheim,
Deutschland) hergestellt. Die Signale werden mittels Autoradio
graphie nachgewiesen.
Partiell homologe oder heterologe Gene, die verwandt, aber nicht
identisch sind, lassen sich analog zum oben beschriebenen Ver
fahren unter Verwendung niedrig-stringenter Hybridisierungs- und
Waschbedingungen identifizieren. Für die wäßrige Hybridisierung
wurde die Ionenstärke gewöhnlich bei 1 M NaCl gehalten, wobei
die Temperatur nach und nach von 68 auf 42°C gesenkt wurde.
Die Isolation von Gensequenzen, die nur zu einer einzelnen
Domäne von beispielsweise 10 bis 20 Aminosäuren Homologien auf
weisen, läßt sich unter Verwendung synthetischer, radioaktiv
markierter Oligonukleotidsonden durchführen. Radioaktiv markierte
Oligonukleotide werden mittels Phosphorylierung des 5'-Endes
zweier komplementärer Oligonukleotide mit T4-Polynukleotidkinase
hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden aneinander
hybridisiert und ligiert, so daß Konkatemere entstehen. Die
doppelsträngigen Konkatemere werden beispielsweise durch Nick
transkription radioaktiv markiert. Die Hybridisierung erfolgt
gewöhnlich bei niedrig-stringenten Bedingungen unter Verwendung
hoher Oligonukleotidkonzentrationen.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:
6 × SSC
0,01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0,5% SDS
100 mikrog/ml denaturierte Lachssperma-DNA
0,1% fettarme Trockenmilch
6 × SSC
0,01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0,5% SDS
100 mikrog/ml denaturierte Lachssperma-DNA
0,1% fettarme Trockenmilch
Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5
bis 10°C unter die berechnete Oligonukleotid-Tm oder bis auf Raum
temperatur (bedeutet RT = ~23°C in allen Experimenten, wenn nicht
anders angegeben) gesenkt, gefolgt von Waschschritten und Auto
radiographie. Das Waschen wird mit extrem niedriger Stringenz
durchgeführt, zum Beispiel 3 Waschschritte unter Verwendung von
4 × SSC. Weitere Einzelheiten sind wie von Sambrook, J., et al.
(1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory Press, oder Ausubel, F. M., et al. (1994)
"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons,
beschrieben.
Es werden cDNA-Seguenzen zur Herstellung von rekombinantem
Protein zum Beispiel in E. coli verwendet (z. B. Qiagen QIAexpress
pQE-System). Die rekombinanten Proteine werden dann gewöhnlich
über Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitäts
gereinigt. Die rekombinanten Proteine werden dann zur Her
stellung spezifischer Antikörper beispielsweise unter Verwendung
von Standardtechniken zur Immunisierung von Kaninchen verwendet.
Die Antikörper werden dann unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule,
die mit rekombinantem Antigen vorgesättigt wird, affinitäts
gereinigt, wie von Gu et al., (1994) BioTechniques 17: 257-262
beschrieben. Der Antikörper kann dann zur Durchmusterung von
Expressions-cDNA-Banken mittels immunologischem Sichtung ver
wendet werden (Sambrook, J., et al. (1989), "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder
Ausubel, F. M., et al. (1994) "Current Protocols in Molecular
Biology", John Wiley & Sons).
Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR
verwendet werden (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990)
221-230). Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch
Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in
T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die
Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet
sich 3' von der cDNA.
Die gewebespezifische Expression läßt sich unter Verwendung eines
gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die
samenspezifische Expression erreicht werden, indem der Napin-
oder der LeB4- oder der USP-Promotor 5' der cDNA einkloniert
wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement kann
verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen
Pflanzen läßt sich der CaMV-35S-Promotor verwenden.
Das exprimierte Protein kann unter Verwendung eines Signal
peptids, beispielsweise für Plastiden, Mitochondrien oder das
Endoplasmatische Retikulum, in ein zelluläres Kompartiment
dirigiert werden (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996)
285-423). Das Signalpeptid wird 5' im Leseraster mit der cDNA
einkloniert, um die subzelluläre Lokalisierung des Fusionsprotein
zu erreichen.
Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum
Beispiel unter Verwendung des GV3101- (pMP90-) (Koncz und Schell,
Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383-396) oder LBA4404- (Clontech)
Agrobacterium tumefaciens-Stamns durchgeführt werden. Die
Transformation kann durch Standard-Transformationstechniken
durchgeführt werden (Deblaere et al., Nucl. Acids. Tes. 13
(1984), 4777-4788).
Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter
Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerations
techniken durchgeführt werden (Gelvin, Stanton B., Schilperoort,
Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht:
Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur:
BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E.,
Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton:
CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).
Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledoneh- oder Hypokotyl
transformation transformiert werden (Moloney et al., Plant Cell
Report 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91
(1989) 694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die
Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die
Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-
Stamm ab. Die Rapsselektion wird gewöhnlich unter Verwendung
von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.
Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum
usitatissimum) läßt sich unter Verwendung von beispielsweise
einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285
beschriebenen Technik durchführen.
Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispiels
weise einer in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International)
oder in EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University
Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.
Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchen
beschuß, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder
über die Siliziumcarbonatfaser-Technik ist beispielsweise
beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993)
ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).
Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR
verwendet werden (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990)
221-230). Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch
Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in
T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die
Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet
sich 3' von der cDNA.
Die gewebespezifische Expression läßt sich unter Verwendung eines
gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die
samenspezifische Expression erreicht werden, indem der Napin-
oder der LeB4- oder der USP-Promotor 5' der cDNA einkloniert
wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement kann
verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen
Pflanzen läßt sich der CaMV-35S-Promotor verwenden.
Insbesondere lassen sich Gene codierend für Elongasen und
Desaturasen durch Konstruktion mehrerer Expressionskassetten
hintereinander in einen binären Vektor klonieren, um den Stoff
wechselweg in der Pflanzen nachzubilden.
Innerhalb einer Expressionskassette kann das zu exprimierende
Protein unter Verwendung eines Signalpeptids, beispielsweise für
Plastiden, Mitochondrien oder das Endoplasmatische Retikulum,
in ein zelluläres Kompartiment dirigiert werden (Kermode, Crit.
Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423). Das Signalpeptid wird 5'
im Leseraster mit der cDNA einkloniert, um die subzelluläre
Lokalisierung des Fusionsprotein zu erreichen.
Die in vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann mittels Passage
der Plasmid- (oder einer anderen Vektor-) DNA durch E. coli
oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen,
wie Saccharomyces cerevisiae), bei denen die Fähigkeiten, die
Unversehrtheit ihrer genetischen Information aufrechtzuerhalten,
gestört ist, erfolgen. Übliche Mutator-Stämme haben Mutationen in
den Genen für das DNA-Reparatursystem (z. B. mutHLS, mutD, mutT
usw.; als Literaturstelle siehe Rupp, W. D. (1996) DNA repair
mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, S. 2277-2294,
ASM: Washington). Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die
Verwendung dieser Stämme ist beispielsweise in Greener, A., und
Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34, erläutert. Der Transfer
mutierter DNA-Moleküle in Pflanzen erfolgt vorzugsweise nach
Selektion und Test der Mikrooganismen. Transgene Pflanzen werden
nach verschiedenen Beispielen im Beispielteil dieses Dokumentes
erzeugt.
Die Aktivität eines rekombinanten Genproduktes im transformierten
Wirtsorganismus wurde auf der Transkriptions- und/oder der
Translationsebene gemessen.
Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge an
Transkription des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA,
die für die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht)
ist die Durchführung eines Northern-Blots wie unten ausgeführt
(als Bezugsstelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols
in Molecular Biology, Wiley: New York, oder den oben erwähnten
Beispielteil), wobei ein Primer, der so gestaltet ist, daß er an
das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung
(gewöhnlich radioaktiv oder chemilumineszent) markiert wird, so
daß, wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert,
auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert
und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß
der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA
für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der
Transkription des transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA
kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren,
die alle im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel das
von Bormann, E. R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326
beschriebene, präpariert werden.
Für die RNA-Hybridisierung wurden 20 ∝g Gesamt-RNA oder 1 ∝g
poly(A)+-RNA mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit
einer Stärke von 1,25% unter Verwendung von Formaldehyd, wie
beschrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) auf
getrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 ×
SSC auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham,
Braunschweig) übertragen, mittels UV-Licht immobilisiert und
3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridisierungspuffer
(10% Dextransulfat Gew./Vol., 1 M NaCl, 1% SDS, 100 mg Herings
sperma-DNA) vorhybridisiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit
dem Highprime DNA labeling-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland)
erfolgte während der Vorhybridisierung unter Verwendung von
alpha-32P-dCTP (Amersham, Braunschweig, Deutschland). Die
Hybridisierung wurde nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im
gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgeführt. Die Wasch
schritte wurden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 × SSC
und zweimal für 30 min unter Verwendung von 1 × SSC, 1% SDS,
bei 68°C durchgeführt. Die Exposition der verschlossenen Filter
wurde bei -70°C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt.
Zur Untersuchung des Vorliegens oder der relativen Menge an von
dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie
ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausubel
et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley:
New York). Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt-
Proteine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt,
auf eine Matrix, wie Nitrozellulose, übertragen und mit einer
Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte
Protein bindet, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer
chemilumineszenten oder kolorimetrischen Markierung versehen,
die sich leicht nachweisen läßt. Das Vorliegen und die Menge der
beobachteten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des
gewünschten, in der Zelle vorliegenden mutierten Proteins an.
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, Pilzen,
Algen, Ciliaten oder auf die Produktion einer gewünschten Ver
bindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die
modifizierten Mikroorganismen oder die modifizierte Pflanze
unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen)
gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Kompo
nenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d. h.
von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analyse
techniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie,
Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art,
enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische
Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemis
try, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985);
Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry"
in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,
Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III:
"Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim;
Belter, P. A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing
for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und
Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materi
als, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A., und Henry, J. D. (1988),
Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial
Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und
Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in
biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus
Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic
Biochemistry 152: 141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative
und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben
bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/
Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie,
William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide -
Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily
Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford:
Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u. d. T.: Progress in the
Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist
es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu
analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung ver
wendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamteffizienz
der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die
Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium
(z. B. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat
und andere Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und
des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite
von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der
Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese
Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical
Approach, P. M. Rhodes und P. F. Stanbury, Hrsgb., IRL Press,
S. 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und darin angegebenen
Literaturstellen beschrieben.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME,
Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-
Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschicht
chromatographie).
Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäure
produkten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach
Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC,
wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literatur
stellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte
Aufl.: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromato
graphie-Massenspektrometrie-Verfahren, Lipide 33: 343-353).
Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung,
Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder
über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das
Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das
Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C
erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von
Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2% Dimethoxy
propan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipid
verbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese
Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und
schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule
(Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm)
bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min
und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen
Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus
kommerziellen Quellen erhältlich sind (d. h. Sigma), definiert
werden.
Bei Fettsäuren, für die keine Standards verfügbar sind, muss die
Identität über Derivatisierung und anschließende GC-MS-Analyse
gezeigt werden. Beispielsweise muss die Lokalisierung von Fett
säuren mit Dreifachbindung über GC-MS nach Derivatisierung mit
4,4-Dimethoxyoxazolin-Derivaten (Christie, 1998, siehe oben)
gezeigt werden.
Der Escherichia coli-Stamm XL1 Blue MRF' kan (Stratagene)
wird zur Subklonierung der neuen Elongasen wie PpPSE1 aus
Physcomitrella patens verwendet. Für die funktionelle Expression
dieses Gens verwenden wir den Saccharomyces cerevisiae-Stamm
INVSc 1 (Invitrogen Co.). E. coli wird in Luria-Bertini-Brühe
(LB, Duchefa, Haarlem, Niederlande) bei 37°C kultiviert. Wenn
nötig, wird Ampicillin (100 mg/Liter) zugegeben, und 1,5% Agar
(Gew./Vol.) wird für feste LB-Medien hinzugefügt. S. cerevisiae
wird bei 30°C entweder in YPG-Medium oder in komplettem Minimal
medium ohne Uracil (CMdum; siehe in: Ausubel, F. M., Brent, R.,
Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl,
K., Albright, L. B., Coen, D. M., und Varki, A. (1995) Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)
mit entweder 2% (Gew./Vol.) Raffinose oder Glucose kultiviert.
Für feste Medien werden 2% (Gew./Vol.) Bacto™-Agar (Difco) hin
zugefügt. Die zur Klonierung und Expression verwendeten Plasmide
sind pUC18 (Pharmacia) und pYES2 (Invitrogen Co.).
Die Vollängengene erfindungsgemäßer Sequenzen können wie in
Beispiel 7 beschrieben isoliert und wie nachfogend ausgeführt
weiter bearbeitet werden. Ausführungsweise werden konkrete
Expressionsbeispiele dargestellt.
Für die Expression in Hefe wurde der P. patens-cDNA-Klon PpPSE1
(früherer Datenbanksequenzname: 08_ck19_b07, neuer Name:
pp001019019f), der das PUFA-spezifische Elongase-(PSE1-)Gen
codiert, zuerst so modifiziert, daß eine BamHI-Restriktionsstelle
und die Hefe-Konsensussequenz für hocheffiziente Translation
(Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the
AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic
ribosomes, Cell 44, 283-292) neben dem Startcodon und eine
BamHI-Restriktionsstelle, die das Stopcodon flankierte, erhalten
wurden. Zur Amplifikation des offenen Leserahmens wurde ein
Primerpaar, das komplementär zu dessen 5'- und 3'-Enden war,
synthetisiert.
Das Gen erfindungsgemäßer Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1
wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion in pYES kloniert und
das Plasmid pYPp_PSE1 erhalten:
Folgende Oligonukleotide wurden für das PCR-Experiment ein
gesetzt:
Die PCR-Reaktion wurde mit Plasmid-DNA des Klones PP001019019F
als Matrize in einem Thermocycler (Biometra) mit der Pfu-DNA-
(Stratagene)Polymerase und dem folgenden Temperaturprogramm
durchgeführt: 3 min bei 96°C, gefolgt von 25 Zyklen mit 30 s
bei 96°C, 30 s bei 55°C und 1 min bei 72°C, 1 Zyklus mit 10 min
bei 72°C.
Die korrekte Größe des amplifizierten DNA-Fragments wurde mittels
Agarose-TBE-Gelelektrophorese bestätigt. Die amplifizierte DNA
wurde aus dem Gel mit dem QIAquick-Gelextraktionskit (QIAGEN)
extrahiert und unter Verwendung des Sure Clone Ligation Kit
(Pharmacia)zunächst in pUC18 kloniert. Das so klonierte Fragment
wurde mit BamHI geschnitten, in pYES ligiert, wobei pYPp_SE1
erhalten wurde. Die Fragmentorientierung wurde mittels HindIII
überprüft. Nach der Transformation von E. coli XL1 Blue MRF'
kan wurde eine DNA-Minipräparation (Riggs, M. G., & McLachlan,
A. (1986) A simplified screening procedure for large numbers
of plasmid mini-preparation. BioTechniques 4, 310-313) von
Transformanten durchgeführt, und positive Klone mittels BamHI-
Restriktionsanalyse identifiziert. Die Sequenz des klonierten
PCR-Produktes wurde mittels Resequenzierung unter Verwendung des
ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
(Perkin-Elmer, Weiterstadt) bestätigt.
Ein Klon wurde für die DNA-Maxipräparation mit dem Nucleobond®
AX 500 Plasmid-DNA-Extraktionskit (Macherey-Nagel, Düringen)
angezogen.
Saccharomyces INVSc1 wurde mit pYPp_PSE1 bzw. mit pYES2 als
Kontrolle mittels eines modifizierten PEG/Lithiumacetat-
Protokolls transformiert (Ausubel et al., 1995). Nach der
Selektion auf CMdum-Agarplatten mit 2% Glucose wurden
Transformanten und eine pYES2-Transformante zur weiteren
Anzucht und funktionellen Expression wie bereits ausgeführt
ausgewählt und mit verschiedenen Fettsäuren im Medium gefüttert.
- a) Lipidmuster von Hefen, die mit dem pYES Plasmid ohne Fragmentinsertion transformiert sind oder das Pp-PSE1 Gen exprimieren (Angaben in mol%) nach Fütterung mit mit 250 mikrom Hexadekatriensäure (16 : 3Δ7c,10c,13c).
- a) Lipidmuster von Hefen, die mit dem pYES Plasmid ohne Fragmentinsertion transformiert sind oder das Pp-PSE1 Gen exprimieren (Angaben in mol%) nach Fütterung mit 500 mikrom Pinolensäure (18 : 3Δ6c,9c,12c).
- a) Lipidmuster von Hefen, die mit dem pYES Plasmid ohne Fragmentinsertion transformiert sind oder das Pp-PSE1 Gen exprimieren (Angaben in mol%) nach Fütterung mit 500 mikrom Stearidonsäure (18 : 4Δ6c,9c,12c,15c).
- a) Lipidmuster von Hefen, die mit dem pYES Plasmid ohne Fragmentinsertion transformiert sind oder das Pp-PSE1 Gen exprimieren (Angaben in mol%) nach Fütterung mit 500 mikrom Linolsäure (18 : 2Δ9c,12c).
Für die Expression in Hefe wird der ThraustochytriumcDNA-
Klon aus SEQ ID NR: 3 (Tc_PSE2), der ein PUFA-spezifisches
Elongase-(PSE)-Gen codiert, zuerst so modifiziert, daß es ein
funktionell aktives Polypeptid darstellt. Zu diesem Zweck wird
der N-Terminus des Proteins auf DNA-Ebene durch die wenigen
fehlenden Basen aus der Physcomitrella patens Elongase um
42 Basenpaare verlängert. Es kann aber auch lediglich ein Start
codon im passenden Leseraster zur Sequenz hinzugefügt werden.
Folgende Oligonukleotide werden für das PCR-Experiment ein
gesetzt:
Zusätzlich ist in beiden Oligonukleotiden eine BamHI-
Restriktionsstelle und die Hefe-Konsensussequenz für hoch
effiziente Translation enthalten (Kozak, M. (1986) Point
mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon
that modulates translation by eukaryotic ribosomes, Cell 44,
283-292).
Die PCR-Reaktion wird mit Plasmid-DNA als Matrize in einem
Thermocycler (Biometra) mit der Pfu-DNA-(Stratagene) Polymerase
und dem folgenden Temperaturprogramm durchgeführt: 3 min bei 96°C,
gefolgt von 25 Zyklen mit 30 s bei 96°C, 30 s bei 55°C und 3 min
bei 72°C, 1 Zyklus mit 10 min bei 72°C und Stop bei 4°C.
Die korrekte Größe des amplifizierten DNA-Fragments wird
mittels Agarose-TBE-Gelelektrophorese bestätigt. Die ampli
fizierte DNA wird aus dem Gel mit dem QIAquick-Gelextraktions
kit (QIAGEN) extrahiert und in die SmaI-Restriktionsstelle des
dephosphorylierten Vektors pUC18 unter Verwendung des Sure
Clone Ligation Kit (Pharmacia) ligiert, wobei pUC-hybrid-Tc_PSE2
erhalten wird. Nach der Transformation von E. coli XL1 Blue MRF'
kan wurde eine DNA-Minipräparation (Riggs, M. G., & McLachlan,
A. (1986) A simplified screening procedure for large numbers
of plasmid mini-preparation. BioTechniques 4, 310-313) an
24 ampicillinresistenten Transformanten durchgeführt, und
positive Klone wurden mittels BamHI-Restriktionsanalyse
identifiziert. Die Sequenz des klonierten PCR-Produktes wurde
mittels Resequenzierung unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer,
Weiterstadt) bestätigt.
Die Plasmid-DNA von pUC-PSE1 sowie pUC-hybrid-Tc_PSE2 wurden
zudem mit BamHI gespalten und die erhaltene Fragmente wurden in
die BamHI-Restriktionsstelle des dephosphorylierten Hefe-E. coli-
Shuttlevektors pYES2 ligiert, wobei pY2 hybrid-Tc_PSE2 erhalten
wird. Nach der Transformation von E. coli und DNA-Minipräparation
aus den Transformanten wurde die Orientierung des DNA-Fragments
im Vektor durch HindIII-Spaltung überprüft. Ein Klon wurde
jeweils für die DNA-Maxipräparation mit dem Nucleobond® AX 500
Plasmid-DNA-Extraktionskit (Macherey-Nagel, Düringen) angezogen.
Saccharomyces INVSc1 wird mit pY2PSE1, pYES2, pY2-hybrid-Tc_PSE2
und pYES2 mittels eines modifizierten PEG/Lithiumacetat-
Protokolls transformiert (Ausubel et al., 1995). Nach der
Selektion auf CMdum-Agarplatten mit 2% Glucose werden je vier
pY2PSE1-Transformanten (pY2PSEla-d), pY2-hybrid-Tc_PSE2-Trans
formanten (pY2-hybrid-Tc_PSE2 1a-d) und eine pYES2-Transformante
zur weiteren Anzucht und funktionellen Expression ausgewählt.
20 ml CMdum-Flüssigmedium mit 2% (Gew./Vol.) Raffinose wurden
mit den transgenen Hefeklonen (pY2- hybrid-Tc_PSE2 1a-d, pYES2)
angeimpft und 3 T bei 30°C, 200 rpm gezüchtet, bis eine optische
Dichte bei 600 nm (OD600) von 1,5-2 erreicht wurde.
Für die Expression wurden 20 ml CMdum-Flüssigmedium mit 2%
Raffinose und 1% (Vol./Vol.) Tergitol NP-40 mit Fettsäure
substraten auf eine Endkonzentration von 0,003% (Gew./Vol.)
angereichert. Die Medien werden mit den Vorkulturen auf eine
OD600 von 0,05 angeimpft. Die Expression wurde bei einer OD600
von 0,2 mit 2% (Gew./Vol.) Galaktose für 16 Std. induziert,
wonach die Kulturen eine OD600 von 0,8-1,2 geerntet wurden.
Die Gesamt-Fettsäuren wurden aus Hefekulturen extrahiert und
mittels Gaschromatographie analysiert. Davon wurden Zellen von
5 ml Kultur mittels Zentrifugation (1000 × g, 10 min. 4°C)
geerntet und einmal mit 100 mM NaHCO3, pH 8,0, gewaschen, um
restliches Medium und Fettsäuren zu entfernen. Zur Herstellung
des Fettsäuremethylester (FAMES) wurden die Zellsedimente mit
1 M methanolischer H2SO4 und 2% (Vol./Vol.) Dimethoxypropan
für 1 Std. bei 80°C behandelt. Die FAMES wurden zweimal mit 2 ml
Petrolether extrahiert, einmal mit 100 mM NaHCO3, pH 8,0, und ein
mal mit destilliertem Wasser gewaschen und mit Na2SO4 getrocknet.
Das organische Lösungsmittel wurde unter einem Argonstrom ver
dampft, und die FAMES wurden in 50 mikrol Petrolether gelöst.
Die Proben wurden auf einer ZEBRON-2B-Wax-Kapillarsäule (30 m,
0,32 mm, 0,25 mikro m; Phenomenex) in einem Hewlett Packard-
6850-Gaschromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor auf
getrennt. Die Ofentemperatur wurde von 70°C (1 min halten) bis
200°C mit einer Rate von 20°C/min, dann auf 250°C (5 min halten)
mit einer Rate von 5°C/min und schließlich auf 260°C mit einer
Rate von 5°C/min programmiert. Stickstoff wurde als Trägergas
verwendet (4,5 ml/min bei 70°C). Die Fettsäuren wurden durch
Vergleich mit Retentionszeiten von FAME-Standards (SIGMA)
identifiziert.
Die Fettsäuremuster von fünf transgenen Hefestämmen in Mol.-%
sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die Verhältnisse der zugegebenen und aufgenommenen g-Linolen
säure sind durch fettgedruckte Zahlen hervorgehoben, die der
elongierten Produkte durch rote Zahlen und die der elongierten
g-Linolensäure durch fettgefruckte Zahlen (letzte Zeile).
Die GC-Analyse von FAMES, die aus Gesamt-Lipiden der mit pYES2
(i/Kontrolle) und pY2PSE1 (ii-iv c + d/jeweils transformiert mit
pY2PSE1A, pY2PSE1B, pY2PSE1C, pY2PSE1D) transformierten Hefen
ist in Fig. 2a-e gezeigt. Für die Analyse wurden die transgenen
Hefen in Anwesenheit von g-18 : 3 gezüchtet. Die Tab. 1 zeigt
ihre Fettsäuremuster in Mol.-%. Die Aufnahme von g-18 : 3 ist
durch fettgedruckte Zahlen hervorgehoben, das Elongationsprodukt
Dihomo-g-linolensäure (20 : 3D8,11,14) ist unterstrichen und
das Verhältnis g-18 : 3-Elongationsprodukt (ebenfalls in Mol.-%)
durch fettgedruckte Zahlen (letzte Zeile). Die Struktur und die
Massenspektren des DMOX-Derivates von cis-D6,9,12 C18 : 3 sind aus
Fig. 3a + b ersichtlich. Die Struktur und die Massenspektren des
DMOX-Derivates von D8, 11, 14 C20 : 3 sind aus Fig. 4a + b ersichtlich.
Die Ergebnisse zeigen, daß g-18 : 3 in großen Mengen in alle trans
genen Hefen eingebaut worden ist. Alle vier transgenen Hefeklone,
die mit pY2PSE1 transformiert wurden, zeigen einen zusätzlichen
Peak im Gaschromatogramm, der durch Vergleich der Retentions
zeiten als 20 : 3 D8,11,14 identifiziert wurde. Eine Gaschromato
graphie/Massenspektroskopie kann zusätzliche Unterstützung zur
Bestätigung dieser Identität liefern. Der Anteil an elongierter
g-18 : 3 betrug, wie in Tabelle 1 gezeigt, 23,7 bis 40,5%. Ferner
konnte keine signifikante Elongation von Palmitinsäure (16 : 0),
Palmitoleinsäure (16 : 1), Stearinsäure (18 : 0) oder Ölsäure (18 : 1
D9) beobachtet werden.
Die identifizierten Produkte zeigen, daß die Nukleotidsequenz
von PpPSE1 eine D6-selektive Fettsäure-Elongase aus dem Moos
Physcomitrella patens codiert, die zur Bildung neuer Fettsäuren
in transgenen Hefen führt.
Die Verhältnisse der zugegebenen und aufgenommenen Fettsäure
substrate können wie vorstehend ermittelt werden und so
Quantität und Qualität der Elongasereaktion erfaßt werden.
Die Struktur und die Massenspektren von DMOX-Derivaten ergeben
auch die jeweilige Position einer Doppelbindung.
Weitere Fütterungsexperimente mit verschiedensten anderen Fett
säuren (z. B. Arachidonsäure, Eicosapentaensäure etc.) können
zur detaillierteren Bestätigung der Substratselektivität dieser
Elongase durchgeführt werden.
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus Pflanzenmaterial oder
Pilzen, Algen, Ciliaten, tierischen Zellen oder aus dem Überstand
der vorstehend beschriebenen Kulturen kann durch verschiedene,
im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte
Produkt nicht aus den Zellen sezerniert, können die Zellen aus
der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die
Zellen können durch Standardtechniken, wie mechanische Kraft oder
Ultraschallbehandlung, lysiert werden. Organe von Pflanzen können
mechanisch von anderem Gewebe oder anderen Organen getrennt
werden. Nach der Homogenisation werden die Zelltrümmer durch
Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, welche
die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung
der gewünschten Verbindung aufbewahrt. Wird das Produkt aus
gewünschten Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame
Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstands
fraktion wird zur weiteren Reinigung aufbewahrt.
Die Überstandsfraktion aus jedem Reinigungsverfahren wird einer
Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das
gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurück
gehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht,
oder die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe
hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können wenn nötig
wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromato
graphieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl
geeigneter Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung
für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert. Das
gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration
konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei
der die Stabilität des Produktes maximal ist.
Im Fachgebiet ist ein breites Spektrum an Reinigungsverfahren
bekannt, und das vorstehende Reinigungsverfahren soll nicht
beschränkend sein. Diese Reinigungsverfahren sind zum Bei
spiel beschrieben in Bailey, J. E., & Ollis, D. F., Biochemical
Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann
durch Standardtechniken des Fachgebiets bestimmt werden.
Dazu gehören Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromato
graphie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologisch. Eine Übersicht
über diese Analyseverfahren siehe in: Patek et al. (1994)
Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996)
Biotekhnologiya 11: 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess
Engineer. 19: 67-70; Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry
(1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547,
S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical
Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John
Wiley and Sons; Fallon, A., et al. (1987) Applications of HPLC
in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology, Bd. 17.
Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier
beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen
feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet.
Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfaßt sein.
Claims (23)
1. Isolierte Nukleinsäure, die von einer Pflanze oder Alge
stammt und ein Polypeptid codiert, das C16-, C18- oder
C20-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in der
Fettsäure um mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängert.
2. Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz,
die ein Polypeptid codiert, das C16-, C18- oder C20-Fettsäuren
mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül
verlängert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
- a) einer in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz,
- b) einer Nukleinsäuresequenz, die gemäß dem degenerierten genetischen Code von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz stammt,
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:S oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz, die für Poly peptide der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesent lich reduziert ist.
3. Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei die
Sequenz von einer Pflanze, Alge oder Pilz stammt.
4. Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder
Anspruch 3, wobei die Sequenz von Physcomitrella, Thrausto
chytrium oder Crythecodinium stammt.
5. Aminosäuresequenz, die durch eine isolierte Nukleinsäure
sequenz nach den Ansprüchen 1 bis 4 codiert wird.
6. Genkonstrukt, umfassend eine isolierte Nukleinsäure nach
einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäure
funktionell mit einem oder mehreren Regulationssignalen
verbunden ist.
7. Genkonstrukt nach Anspruch 6, dessen Genexpression durch
die Regulationssignale verstärkt wird.
8. Genkonstrukt enthalten eine Nukleinsäuresequenz nach den
Ansprüchen 1 bis 4 und mindestens eine weitere Nukleinsäure,
die für ein Gen der Fettsäurebiosynthese codiert.
9. Genkonstrukt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
die Nukleinsäure, die für ein Gen der Fettsäurebiosynthese
codiert ausgewählt aus der Gruppe Δ19-, Δ17-, Δ15-, Δ12-,
Δ9-, Δ8-, Δ6-, Δ5-, Δ4-Desaturase, die verschiedenen
Hydroxylasen, die Δ12-Acetylenase, die Acyl-ACP-Thio
esterasen, β-Ketoacyl-ACP-Synthasen oder β-Ketoacyl-ACP-
Reductasen ist.
10. Vektor, umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder
ein Genkonstrukt nach Anspruch 6.
11. Organismus, umfassend mindestens eine Nukleinsäure nach
Anspruch 1, ein Genkonstrukt nach Anspruch 6 oder einen
Vektor nach Anspruch 10.
12. Organismus nach Anspruch 11, wobei der Organismus ein Mikro
organismus, ein Tier oder eine Pflanze ist.
13. Organismus nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Organismus
eine transgene Pflanze ist.
14. Verfahren zur Herstellung von PUFAs, wobei das Verfahren
das Züchten eines Organismus umfaßt, der eine Nukleinsäure
nach Anspruch 1, ein Genkonstrukt nach Anspruch 6 oder einen
Vektor nach Anspruch 10 umfaßt, codierend ein Polypeptid,
das C16-, C18- oder C20-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppel
bindungen im Fettsäuremolekül um mindestens zwei Kohlen
stoffatome unter Bedingungen verlängert, unter denen PUFAs
in dem Organismus gebildet werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die durch das Verfahren
hergestellten PUFAs C18-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle mit
mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül sind.
16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die C18-, C20- oder
C22-Fettsäuremoleküle aus dem Organismus in Form eines Öls,
Lipids oder einer freien Fettsäure isoliert werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei der
Organismus ein Mikroorganismus, ein Tier oder eine Pflanze
ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei der
Organismus eine transgene Pflanze ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die
C16-, C18- oder C20-Fettsäure eine Fettsäure mit drei Doppel
bindungen im Molekül ist.
20. Öl, Lipide oder Fettsäuren oder eine Fraktion davon, her
gestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 14
bis 19.
21. Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung, die PUFAs ent
halten und von transgenen Pflanzen stammen.
22. Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung nach Anspruch 21,
wobei die PUFAs von transgenen Pflanzen stammen, welche eine
Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 umfassen.
23. Verwendung der Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung in
Futter, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.
Priority Applications (27)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10023893A DE10023893A1 (de) | 2000-05-17 | 2000-05-17 | Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren |
PL362905A PL207026B1 (pl) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Wyizolowany kwas nukleinowy, konstrukt genowy zawierający ten kwas, sekwencja aminokwasowa kodowana przez wyizolowaną sekwencję tego kwasu nukleinowego, wektor zawierający kwas nukleinowy lub konstrukt genowy, roślina transgeniczna lub mikroorganizm transgeniczny zawierający kwas nukleinowy, konstrukt genowy lub wektor, przeciwciało specyficznie wiążące się z polipeptydem kodowanym przez kwas nukleinowy, cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego oraz sposób wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA) |
CNB018046924A CN1247784C (zh) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | 新延伸酶基因以及制备多不饱和脂肪酸的方法 |
RU2002124122/13A RU2311457C2 (ru) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Новый ген элонгазы и способ получения полиненасыщенных кислот жирного ряда |
JP2001558464A JP4547122B2 (ja) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | 新規エロンガーゼ遺伝子および高度不飽和脂肪酸の生産方法 |
CZ20022502A CZ20022502A3 (cs) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Elongázový gen a způsob přípravy polynenasycených mastných kyselin |
PT01913791T PT1254238E (pt) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Novo gene de elongase e processo para a preparação de ácidos gordos poli-insaturados |
CA2399349A CA2399349C (en) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acids |
US10/182,634 US7544859B2 (en) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acids |
MXPA02007078A MXPA02007078A (es) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Nuevo gen de elongasa y procedimiento para la obtencion de acidos grasos poliinsaturados. |
DK01913791T DK1254238T3 (da) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Nyt elongasegen og fremgangsmåde til fremstilling af flerumættede fedtsyrer |
EEP200200443A EE200200443A (et) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Uus elongaasigeen ning polüküllastumata rasvhapete saamise meetod |
AU2001239244A AU2001239244B2 (en) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acids |
HU0300081A HUP0300081A3 (en) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acids |
ES01913791T ES2331228T3 (es) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Nuevo gen de elongasa y proceso para la preparacion de acidos grasos poliinsaturados. |
AU3924401A AU3924401A (en) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acids |
EP01913791A EP1254238B1 (de) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Neues elongasegen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren |
DE50115107T DE50115107D1 (de) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Neues elongasegen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren |
BR0108198-5A BR0108198A (pt) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | ácido nucleico isolado, construção de gene, sequência de aminoácidos, vetor, organismo, anticorpo, molécula de ácido nucleico anti-sentido, processo para a preparação de pufas, óleo, lipìdeo ou ácido graxo ou uma fração destes, composição, uso da composição oleaginosa, lipìdica ou de ácido graxo, kit, e, processo para identificar um antagonista de elongases |
IL15041401A IL150414A0 (en) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acid |
AT01913791T ATE443146T1 (de) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Neues elongasegen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren |
KR1020027010216A KR20020073580A (ko) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | 신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법 |
PCT/EP2001/001346 WO2001059128A2 (de) | 2000-02-09 | 2001-02-08 | Neues elongasegen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren |
ARP010100619A AR030051A1 (es) | 2000-02-09 | 2001-02-09 | Acido nucleico aislado, secuencia aislada, constructo genico, secuencias de aminoacidos, vector y organismo aislado que lo comprende, anticuerpo, molecula de acido nucleico antisentido, procedimiento para preparar acidos grasos poliinsaturados que lo emplea, aceite, lipidos o acidos grasos o una fra |
IL150414A IL150414A (en) | 2000-02-09 | 2002-06-25 | Extender gene, a method of generating unsaturated fatty acids in several positions and a process for identifying antagonists of allogenees |
NO20023757A NO20023757L (no) | 2000-02-09 | 2002-08-08 | Nytt elongase-gen og fremgangsmåte for fremstilling av multippel-umettede fettsyrer |
US11/682,269 US8933300B2 (en) | 2000-02-09 | 2007-03-05 | Elongase gene, and process for the preparation of polyunsaturated fatty acids |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10023893A DE10023893A1 (de) | 2000-05-17 | 2000-05-17 | Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10023893A1 true DE10023893A1 (de) | 2001-11-22 |
Family
ID=7642209
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE10023893A Withdrawn DE10023893A1 (de) | 2000-02-09 | 2000-05-17 | Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE10023893A1 (de) |
-
2000
- 2000-05-17 DE DE10023893A patent/DE10023893A1/de not_active Withdrawn
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1254238B1 (de) | Neues elongasegen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren | |
EP1356067B1 (de) | Verfahren zur herstellung mehrfach ungesaettigter fettsaeuren, neue biosynthesegene sowie neue pflanzliche expressionskonstrukte | |
CA2442010C (en) | New elongase gene and production of.delta. 9-polyunsaturated fatty acids | |
DE10102338A1 (de) | Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten | |
EP1472357B1 (de) | Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren mittels eines neuen elongase-gens | |
AU2002310891A1 (en) | New elongase gene and production of delta9-polyunsaturated fatty acids | |
DE10219203A1 (de) | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen | |
DE10063387A1 (de) | Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungestättigter Fettsäuren | |
DE10023893A1 (de) | Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren | |
DE10205607A1 (de) | Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren | |
DE10005973A1 (de) | Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren | |
DE10203713A1 (de) | Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8130 | Withdrawal |