DE19828850A1 - Sphingolipid-Desaturase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Enzyme, die selektiv eine Doppelbindung in die Sphingobase des Ceramidrestes von Sphingolipiden und von Capnoiden einführen und für diese Enzyme kodierende DNA-Sequenzen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Enzyme und DNA-Sequenzen zur Veränderung des Gehaltes und/oder der Struktur von Sphingolipiden, deren Katabolite und/oder deren synthetischer Folgeprodukte in transgenen Zellen und/oder Organismen. Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung von Sphingolipiden und von Capnoiden mit ungesättigter Sphingobase offenbart.

Description

Die Erfindung betrifft Enzyme, die selektiv eine Doppelbindung in die Sphingobase des Ceramidrestes von Sphingolipiden und von Capnoiden einführen (nachfolgend auch kurz "Sphingolipid-Desaturase" oder "Desaturase" genannt). Die Erfindung betrifft weiterhin für diese Sphingolipid-Desaturasen kodierende DNA-Sequenzen, die Verwendung der Sphingolipid-Desaturasen und der DNA-Sequenzen zur Veränderung des Gehaltes und/oder der Struktur von Sphingolipiden, deren Katabolite und/oder deren synthetischer Folgeprodukte in transgenen Zellen und/oder Organismen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Sphingolipiden und von Capnoiden mit ungesättigter Sphingobase (nachfolgend auch "Sphingolipid") und die so erhaltenen Sphingolipide.

Sphingolipide sind Membrankomponenten, die in allen eukaryoten Zellen und nur in wenigen Bakterien vorkommen. Der hydrophobe Bestandteil, das Ceramid, enthält eine langkettige Base (2-Amino-1,3-dihydroxy-alkan), die über eine Säureamidbindung mit einer langkettigen Fettsäure verknüpft ist. Anhand der polaren Kopfgruppe unterscheidet man Sphingophosphatide, Sphingoglycolipide, und Sphingophosphoglycolipide. Ein solcher Ceramidrest ist weiterhin in Capnoiden (1-Deoxy-ceramid-1-sulfonsäure) gleitender Bakterien zu finden. Auch dort sind entsprechende Enzyme für die Desaturierung von Capnoiden in gleitenden Bakterien verantwortlich (R. A. Drijber et al., "Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406 contains a structural variant of the sulfonolipid N-acylcapnine", Can. J. Microbiol. 43: 689-693 1997).

Sphingolipide fungieren als inter- und intrazelluläre Botenstoffe bei Zellwachstum und -differenzierung, bei Apoptosiseffekten und bei der Pathogenabwehr von Mikroorganismen (A. H. Merrill et al., "Sphingolipids: metabolism and cell signalling", in 'Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes', Vol. 31: 309-339, D. E. Vance und J. E. Vance (Hrsg.), Elsevier Science B. V., Amsterdam (1996)).

Diverse strukturelle Modifikationen des Ceramids sind möglich; jedoch sind nur wenige Gene für dessen enzymatische Variation bislang kloniert worden. So ist es erst Ende 1997 gelungen, die Gene für die delta-4-Hydroxylase der langkettigen Base (D. Haak et al., "Hydroxylation of Saccharomyces cerevisiae Ceramide Requires Sur2p and Scs7p", J. Biol. Chem. 272: 29704-29710 (1997)) und für die alpha-Hydroxylase der langkettigen Fettsäure (A. G. Mitchell et al., "Fah1p, a Saccharomyces cerevisiae Cytochrome b₅ Fusion Protein, and Its Arabidopsis thaliana Homolog that Lacks the Cytochrome b₅ Domain Both Function in the α- hydroxylation of Sphingolipid-associated Very Long Chain Fatty Acids", J. Biol. Chem. 272: 28281-28288 (1997)) zu identifizieren. Es ist jedoch noch kein Gen oder DNA-Sequenz bekannt, das bzw. die für eine Sphingolipid-Desaturase kodiert.

Zwar sind eine Reihe von Enzymen und Nukleinsäuren bekannt, deren Aminosäurensequenzen bzw. DNA-Sequenzen eine gewisse Ähnlichkeit mit den erfindungsgemäßen Sequenzen besitzen. Es handelt es sich jedoch hierbei entweder a) um stereoselektive Glycerolipid-Desaturasen bzw. um für solche Glycerolipid-Desaturasen kodierende DNA-Sequenzen, die eine cis-Doppelbindung in Acylreste einführen (J. Shanklin et al., "Eight Histidine Residues Are Catalytically Essential in a Membrane-Associated Iron Enzyme, Stearoyl-CoA Desaturase, and Are Conserved in Alkane Hydroxylase and Xylene Monooxygenase", Biochemistry 33: 12787-12794 (1994); O. Sayanova et al., "Expression of a borage desaturase cDNA containing an N-terminal cytochrome b₅ domain resuits in the accumulation of high levels of Δ⁶-desaturated fatty acids in transgenic tobaco", Proc. Netl. Acad. Sci. USA 94: 4211-4216 (1997); und WO 96/21022) und nicht um Sphingolipid- Desaturasen, oder b) um DNA-Sequenzen bei denen die enzymatische Funktion des davon kodierten Proteins unbekannt ist (P. Sperling et al., "A cytochrome-b₅- containing fusion protein similar to plant acyl lipid desaturases", Eur. J. Biochem. 232: 798-805 (1995)). Weiterhin sind DNA-Sequenzen von Arabidopsis thaliana als EST-Klone in Genbanken veröffentlicht (EMBL Accession Numbers: T42569, N37558, F13728, T42806 und F13717).

Sphingolipide sind komplexe Naturstoffe mit hoher Heterogenität, die in Pflanzen, Tieren, Insekten, Pilzen und einigen Bakterien gefunden werden. Eine preiswerte Herstellung homogener Verbindungen im großtechnischen Maßstab war bislang nicht möglich, da entsprechende Gene noch nicht kloniert waren. Seit gefunden wurde, daß Sphingolipide als ein wesentlicher Bestandteil der epidermalen Lipide eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung der Barrierefunktionen der Haut spielen, werden sie inzwischen weitverbreitet in der Kosmetik eingesetzt. Da natürliche Sphingolipide durch aufwendige Verfahren extrahiert und gereinigt werden müssen, sind sie allerdings sehr teuer, so daß es nicht an Bemühungen fehlt, sogar analoge Strukturen zu suchen, die sich aus preisgünstigen Edukten leicht synthetisieren lassen (H. Möller et al., "Neue Pseudoceramide durch Verknüpfung von speziellen Fettstoffen mit Kohlenhydrat-Derivaten", Abstract und Kurzreferat präsentiert auf der Tagung der Deutschen Gesellschaft für Fettwissenschaft e.V. (DGF) 'Innovation durch Kombination: Fette-Kohlenhydrate-Proteine', Bremen, 7. Okt. 1996).

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, zur biochemischen Synthese von ungesättigten Sphingolipiden bzw. für die Modifikation von Sphingolipiden benötigte Enzyme zur Verfügung zu stellen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß gewisse aus den Pflanzen Arabidopsis thaliana und Brassica napus isolierte cDNA-Sequenzen für Sphingolipid- Desaturasen kodieren, mit denen Sphingolipide mit unterschiedlicher Regio- und Stereoisomerie der Doppelbindung in der Sphingobase zugänglich sind.

Die Erfindung betrifft somit (1) Sphingolipid-Desaturasen die selektiv eine Doppelbindung in die Sphingobase des Ceramidrestes von Sphingolipiden und von Capnoiden einführen. Die erfindungsgemäße Sphingolipid-Desaturase führen bevorzugt eine Δ-6 Doppelbindung in die Sphingobase ein. Unter "Δ-6" ist in der vorliegenden Anmeldung die relative Position der eingeführten Doppelbindung zu verstehen (eine Doppelbindung in Position C₆-C₇ nach dem letzten sauerstoffaktivierten C-Atom (C₁); siehe Fig. 14). Daneben wird mit "delta-4", "delta- 8", "delta-9" und "delta-10" im nachfolgenden die absolute Position der Doppelbindung bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Enzym unterscheidet sich von den o. g. Glycerolipid- Desaturasen hinsichtlich seiner Substratspezifität (langkettige Base der Sphingolipide), seiner Regioselektivität (Position der eingeführten Doppelbindung delta-8 bei Pflanzen bzw. delta-8 und delta-9 in transgener Hefe) und seiner Stereoselektivität (cis und trans).

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Aminosäuresequenz eine oder mehrere der Fragmente a)-c) oder c)-e), wobei solche Sphingolipid-Desaturasen besonders bevorzugt sind, deren Aminosäuresequenz alle drei Fragmente a)-c) oder c)-e) umfaßt:

• a) HDAGH,
• b) HN[A,S]HH (d. h. HNAHH oder HNSHH);
• c) QLEHH;
• d) AYX_aX_bHD[A,S]GH, wobei X_a und X_b beliebige Aminosäurereste sind, und
• e) THNAHH.

Das Fragment d) weist vorzugsweise die Sequenz AYXaGHDAGH auf, wobei X_a ein beliebiger Aminosäurerest ist. Neben den Fragmenten a)-e) können die erfindungsgemäßen Desaturasen auch noch die Fragmente AWWKWT und/oder FGGLQF enthalten.

Die erfindungsgemäßen Desaturasen umfassen dabei nicht eine Desaturase mit der in Fig. 15 gezeigten Aminosäuresequenz. Besonders bevorzugte Sphingolipid- Desaturasen der vorliegenden Erfindung umfassen die in Fig. 2 oder 4 gezeigte Aminosäuresequenzen.

Die Erfindung betrifft weiterhin (2) DNA-Sequenzen, die für die vorstehenden in (1) definierten Desaturasen kodieren, wobei die in Fig. 15 gezeigte DNA-Sequenz nicht mit eingeschlossen ist. Die DNA-Sequenz ist dabei bevorzugt aus Arabidopsis thaliana und Brassica napus erhältlich, wobei DNA-Sequenzen, die die in Fig. 1 oder 3 gezeigten Sequenzen umfassen, besonders bevorzugt sind.

Weiterhin werden (3) Vektoren, die die in (2) definierte DNA-Sequenzen umfassen, offenbart. Die erfindungsgemäßen Vektoren können zusätzlich zu den DNA- Sequenzen noch die Expression dieser DNA-Sequenzen fördernde funktionelle DNA-Sequenzen wie z. B. Promotoren, ein Terminationssignal und/oder Sekretionssequenzen enthalten, die mit den DNA-Sequenzen (2) funktionell verknüpft sind.

Weiterhin betrifft die Erfindung
(4) Zellen, die mit einem der in (3) definierten Vektoren transformiert sind, wobei diese Zellen vorzugsweise Pflanzen-, Pilz-, Bakterien- oder Tierzellen sind;
(5) transgene Organismen, die

• a) eine DNA-Sequenz, wie vorstehend unter (2) definiert, umfassen
• b) einen Vektor, wie vorstehend unter (3) definiert, umfassen und/oder
• c) aus einer Zelle, wie vorstehend unter (4) definiert, generierbar sind;
  (6) Pflanzen oder deren Nachkommschaft, die aus der Pflanzenzelle, wie vorstehend unter (5) definiert, generierbar sind, wobei die Pflanzen bevorzugt Nutzpflanzen sind und/oder ein verändertes delta-8-Basenmuster aufweisen; und
  (7) ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen die einen erhöhten oder reduzierten Anteil oder ein verändertes cis/trans-Verhältnis an delta-8-ungesättigten langkettigen Basen aufweist, umfassend
• d) die Transformation einer Pflanzenzelle mit einer DNA-Sequenz, wie vorstehend unter (2) definiert, einschließlich der DNA Sequenzen aus Fig. 15, und
• e) die Regeneration einer Pflanze mit verändertem delta-8-Basenmuster in ihren Sphingolipiden.

Das Verfahren gemäß (7) ist dabei

• a) zum Kompensieren eines Mangels an delta-8-ungesättigten langkettigen Basen in einem Organismus
• b) zum Ausschalten der Produktion an delta-8-ungesättigten Basen,
• c) zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserter Toleranz und Resistenz gegenüber Bodenversalzung und/oder Ionenstress bzw. -toxizität und/oder Trockenheit und/oder Feuchte und/oder Kälte bzw. Frost und pflanzenpathogenen Mikroorganismen und
• d) zur Herstellung von Pflanzen mit geändertem Größenwachstum und Blütezeit geeignet.

Zur Herstellung transgener Pflanzen mit einem stark reduziertem Gehalt an delta-8- ungesättigten langkettigen Basen in ihren Sphingolipiden kann z. B. das o. g. Gen aus A. thaliana in antisense-Orientierung und das o. g. Gen aus B. napus in sense- Orientierung (Co-Supression) in einen konstitutiven Pflanzen-Expressionsvektor kloniert werden. Die Transformation von A. thaliana erfolgt dann z. B. mit Hilfe der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten in planta Vakuum-Infiltration (N. Bechthold et al., "In Planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltratio of adult Arabidopsis thaliana plants", C. R. Acad. ScL, Paris, Life Science 316: 1194-1199 (1993); A. F. Bent et al., "RPS2 of Arabidopsis thaliana: A Leucine-Rich Repeat Class of Plant Disease Resistance Genes", Science 265: 1856-1860 (1994)). Die erfolgreiche Suppression der delta-8-Sphingolipid-Desaturierung kann in den transgenen Pflanzen durch die Analyse der langkettigen Basen, die aus den Sphingolipiden isoliert werden, nachgewiesen werden.

Weiterhin betrifft die Erfindung
(8) ein Verfahren zur Herstellung von Sphingolipiden und von Capnoiden mit ungesättigten Sphingobase, umfassend das Kultivieren von Zellen, Organismen oder Pflanzen, wie vorstehend unter (4)-(6) definiert. Das Verfahren umfaßt weiterhin die Isolierung der Sphingolipide aus der Kultur. Das hergestellte Sphingolipid ist dabei vorzugsweise eine Verbindung mit der Formel (I)

worin
R¹ -OH, -OPO₃HR⁶, ein Kohlenhydratrest oder -SO₃H ist;
R² ein C₁-C₃₃-Alkylrest ist, der ein- oder mehrfach ungesättigt und/oder mit einem oder mehreren Hydroxylresten substituiert sein kann;
R³ und R⁵ unabhängig voneinander -H oder -OH sind, oder R³ und R⁵ zusammen eine trans-Doppelbindung bilden;
R⁴ -H oder ein C₁-C₅-Alkylrest ist, der ein- oder mehrfach ungesättigt und/oder mit einem oder mehreren Methylresten substituiert sein kann;
R⁶ -H, ein Polyhydroxyalkylrest, ein Aminoalkylrest oder ein Kohlenhydratrest ist;
und entweder a, b oder c eine Doppelbindung ist, wobei,
(a) wenn R³ und R⁵ -H sind, a eine Doppelbindung ist, und
(b) wenn R³ -OH ist und R⁵ -H ist, a oder b eine Doppelbindung ist.

In den hergestellten Sphingolipiden ist vorzugsweise R² ein C₁₀-C₂₄-Alkylrest und R⁴ ein C₃-C₁₂-Alkylrest, insbesondere ein C₇-, C₉- oder C₁₁-Alkylrest. Ein Kohlenhydratrest im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einer oder mehreren glycosidisch verknüpften Aldopentosen, Aldohexosen, Ketohexosen sowie den daraus abgeleiteten Amino-, Uron- und Desoxyderivaten. Unter Polyhydroxyverbindungen sind von Alkanpolyolen wie Glycol, Glycerin und Mannit abgeleiteten Reste zu verstehen. Aminoalkylreste im Sinne der vorliegenden Erfindung sind 2-Aminoethyl- und 2-(Trimethylammonium)alkylreste. Insbesondere ist das hergestellte Sphingolipid eine Verbindung mit der Formel (II)

worin R¹, R², R³, a und b die oben angegebene Bedeutung aufweisen.

Bei der erfindungsgemäßen Klonierung und Expression des für eine Sphingolipid- Desaturase codierenden Gens sld1 aus cDNA der Pflanzen Arabidopsis thaliana und Brassica napus in der Hefe Saccharomyces konnten neuartiger Produkte in den transgenen Hefen nachgewiesen werden, deren chemische Struktur eindeutig identifiziert wurde. Es handelt sich um verschiedene Sphingolipide deren Spingobasen unterschiedliche Regio- und Stereoisomerie der Doppelbindung aufweisen:

• a) D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-(8Z)-octadecen (t18 : 1^8c)
• b) D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-(8E)-octadecen (t18 : 1^8t)
• c) D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-(9Z)-octadecen (t18 : 1^9c)
• d) D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-(9E)-octadecen (t18 : 1^9t).

Überraschenderweise wurden in den transgenen Hefen nicht nur die pflanzentypischen delta-8 Stereoisomere (i) und (ii), wie sie z. B. aus H. Imai et al., "Sphingoid Base Composition of Cerebrosides from Plant Leaves", Biosci. Biotech. Biochem. 61: 351-353 (1997), bekannt sind, sondern auch das in der Natur nicht vorkommende delta-9 Regioisomer (iii) und (iv) des Phytosphingenins gebildet.

Die Erfindung betrifft somit auch (9) Spingobasen und Capnoide mit ungesättigter Sphingobase mit der Formel

worin
R¹ -OH, -OPO₃HR⁶, ein Kohlenhydratrest oder -SO₃H ist;
R² ein C₁-C₃₃-Alkylrest ist, der ein- oder mehrfach ungesättigt und/oder mit einem oder mehreren Hydroxylresten substituiert sein kann;
R³ und R⁵ unabhängig voneinander -H oder -OH sind, oder R³ und R⁵ zusammen eine trans-Doppelbindung bilden;
R⁴ -H oder ein C₁-C₁₅-Alkylrest ist, der ein- oder mehrfach ungesättigt und/oder mit einem oder mehreren Methylresten substituiert sein kann;
R⁶ -H, ein Polyhydroxyalkylrest, ein Aminoalkylrest oder ein Kohlenhydratrest ist;
und entweder a, b oder c eine Doppelbindung ist, wobei,
(a) wenn R³ und R⁵ -H sind, a eine Doppelbindung ist,
(b) wenn R³ -OH ist und R⁵ -H ist, a oder b eine Doppelbindung ist, und
(c) wenn R⁴ ein C₇-, C₉- oder C₁₁-Alkylrest ist, a keine Doppelbindung ist, und Derivate derselben.

Bevorzugte Ausführungsformen sind vorstehend unter (8) erwähnt. Unter "Derivate" sind Produkte aus chemischen oder enzymatischen Umsetzungen zu verstehen, wobei durch diese Umsetzung das Molgewicht der Sphingobase sowohl erhöht (z. B. durch O-Acylierung und Hydroxylierung von Doppelbindungen) als auch durch Spaltungsreaktionen verringert sein kann (z. B. durch Abspaltung des Fettsäurerests des Ceramidrests). Unter "Derivat" ist somit auch die freie Sphingobase zu verstehen.

Bevorzugt Sphingolipide sind solche mit der nachfolgenden Formel:

wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵, b und c die oben angegebene Bedeutung haben.

Schließlich betrifft die Erfindung (10) Kosmetika, Arznei- oder Nahrungsmittel oder chemische Rohstoffe, die eine Verbindung, wie gemäß dem Verfahren (8) hergestellt oder wie in (9) definiert, umfassen. Unter Arzneimittel sind dabei Mittel zur Regulation des Blutdrucks und Herzrythmus, zur Modulation der Insulinsekretion, Mittel zur Wundheilung, Mittel mit Anti-Tumor-Aktivität, Schutzwirkung gegen Radioaktivität, Stimulation des Zellwachstums, Beeinflussung der Leukozytendifferenzierung, Immunrezeptoren für Viren, bakterielle und Mycotoxine.

Die zahlreichen humanen Sphingolipid-Speicherkrankheiten, wie z. B. Niemann-Pick- und Tay-Sachs-Disease, legen ebenfalls eine Anwendung als therapeutisch wirksame Feinchemikalie beim Menschen nahe, mit einem hohen pharmacologischen, toxicologischen und Ernährungspotential.

Weitere Möglichkeiten diese Substanzen wirtschaftlich zu nutzen bestehen darin, deren Gehalt und/oder Zusammensetzung in bestimmten Organismen zu manipulieren und damit ökonomisch relevante Eigenschaften dieser Organismen positiv zu verändern. Marktchancen sehen wir im Bereich von Veränderungen hinsichtlich des Wachstumsverhalten (Längenzuwachs und Blattspreitengröße) sowie der Beeinflussung des Blühbeginns bei transgenen Nutzpflanzen. Durch eine heterologe Expression und/oder homologe Überexpression und/oder antisense- Ausschaltung der Sphingolipid-Desaturase Gene könnten Kulturpflanzen mit verbesserter Toleranz oder Resistenz 1.) gegenüber schädlichen Umwelteinflüssen wie Bodenversalzung, Ionenstress und -toxizität, Trockenheit, Feuchte und Kälte/Frost (M. Uemura et al., "Cold Acclimation of Arabidopsis thaliana", Plant Physiol. 109: 15-30 (1995) bzw. 2.) gegenüber pflanzenpathogenen Mikroorganismen (z. B. Pilzresistenz) erzeugt werden. Die meisten kühleresistenten Pflanzen zeichnen sich durch einen höheren Anteil an delta-8-cis-Phytosphingenin aus (H. Imai et al., s. o.). Weiterhin ist gezeigt worden, daß pflanzliche und pilzeigene Cerebroside mit delta-8-ungesättigten langkettigen Basen die Fruchtkörperbildung von Pilzen induzieren bzw. steigern können (Kawai et al., "Stimulatory effect of certain plant sphingolipids on fruiting of Schyzophyllum commune", J. Biol. Chem. 261: 779-784 (1986)).

Durch eine Antisense-Ausschaltung des entsprechenden Δ6-Sphingolipid- Desaturasegens in Mikroorganismen, wie z. B. Hefen und Pilze, könnte deren Phyto- und/oder Humanpathogenität vermindert werden. Durch eine heterologe Expression der pflanzlichen Sphingolipid-Desaturase in Mikroorganismen wie z. B. Bäcker-, Brauhefe und deren Mutanten (R. C. Dickson et al., "Isolation of mutant Saccharomyces cerevisiae strains that survive without sphingolipids", Mol. Cell Biol. 10: 2176-2181 (1990); W. J. Pinto et al., "Characterization of Enzymatic Synthesis of Sphingolipid Long-Chain Bases in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Strains Exhibiting Long-Chain-Base Auxotrophy Are Deficient in Serine palmitoyltransferase Activity", J. Bacteriol. 174: 2575-2581 (1992)) könnten diese in ihren Wachstumseigenschaften, z. B. Temperaturtoleranz, verbessert werden und als Bioreaktoren für natürliche und artifizielle Spingolipide und deren Folgeprodukte dienen.

Eine Expression der pflanzlichen Sphingolipid-Desaturase kann auch in Prokaryoten zu modifizierten Sulfonolipiden und Folgeprodukten führen, die einerseits deren Beweglichkeit verändern und andererseits als neue chemische Verbindungen wirtschaftlich interessant sein könnten.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert.

Figurenbeschreibung

Fig. 1 Nukleotidsequenz (1594 bp) der Sphingolipid-Desaturase (sld1) aus Brassica napus mit 5'- und 3'-untranslatierten Regionen und offenem Leseraster.

Fig. 2 Deduzierte Aminosäuresequenz (449 aa) der Sphingolipid-Desaturase aus B. napus.

Fig. 3 Nukleotidsequenz (1678 bp) der Sphingolipid-Desaturase (sld1) aus Arabidopsis thaliana mit 5'- und 3'-untranslatierten Regionen und offenem Leseraster.

Fig. 4 Deduzierte Aminosäuresequenz (449 aa) der Sphingolipid-Desaturase aus A. thaliana.

Fig. 5 Proteinsequenzvergleiche der Sphingolipid-Desaturasen aus B. napus (BnDES8, Fig. 2), A. thaliana (AtDES8, Fig. 4) und Sonnenblume (HaDES?, (Sperling et al., 1995), Fig. 15) mit der delta-6-Glycerolipid-Desaturase aus Borretsch (BoDES6 (Sayanova et al., 1997)). Die N-terminale Domäne bis Position 121 der Sonnenblumensequenz ist mit dem hydrophilen Teil von Cytochrome b₅ homolog, dessen konservierte Aminosäuren unterstrichen sind. Die drei hoch konservierten Histidinboxen (Shanklin et al., 1994), die charakteristisch für Lipid-Desaturasen sind, sind eingezeichnet. Identische Aminosäuren sind durch graue Schattierung hervorgehoben.

Fig. 6 Vektorkonstrukt zur Expression des sld1-Gens aus B. napus (pYES2Bn) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Fig. 7 Vektorkonstrukt zur Expression des sld1-Gens aus A. thaliana (pYES2At) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Fig. 8 Bildung von Phytosphingeninen in Hefezellen durch heterologe Expression pflanzlicher Sphingolipid-Desaturasen. Die langkettigen Basen (LCB) der Sphingolipide wurden aus ganzen Zellen durch starke alkalische Hydrolyse (Morrison und Hay, 1970) gewonnen, in ihre Dinitrophenyl-Derivate (Karlsson, 1970) überführt und mittels RP-HPLC analysiert. (A) Trennung der Referenzsubstanzen (Sigma) Phytosphinganin (t18 : 0), 4-trans-Sphingenin (d18 : 1) und Sphinganine (d18 : 0). (B) LCB-Muster der Wildtyp-Hefezellen (INVSc1) bzw. transformiert mit dem Leervektor pYES2. Bildung von cis- und trans-Phytosphingenin (t18 : 1) in Hefezellen, die entweder (C) das A. thaliana Fusionsprotein (pYES2At) oder (D) das B. napus Fusionsprotein (pYES2Bn) exprimieren. (E) LCB-Muster von A. thaliana (Wildtyp)- Pflanzen.

Fig. 9 GC-MS Elutionsprofil von Fettsäuremethylestern, die durch KMnO₄-Oxidation eines ungesättigten Phytosphinganin-Isomerengemischs erhalten werden (Beispiel 5).

Fig. 10 Partielle ¹H-NMR-Spektren (600 MHz) von (A) trans-Δ^8,9- und (B) cis-Δ^8,9- Phytosphingenin. Die Zuordnung der Signale erfolgte mittels COSY Experimenten.

Fig. 11 Vektorkonstrukt zur heterologen Überexpression in Sense-Orientierung des sld1-Gens aus B. napus (pBIB5Bn) in A. thaliana.

Fig. 12 Vektorkonstrukt zur homologen Antisense-Suppression des sld1-Gens aus A. thaliana (pBIB5At) in A. thaliana.

Fig. 13 Suppression der delta-8-Sphingolipid-Desaturierung in transgenen A. thaliana-Pflanzen. Die langkettigen Basen (LCB) der Sphingolipide wurden aus Mischproben (350 mg Frischgewicht) ganzer T2-Pflanzen, 34 d nach Keimung, durch starke alkalische Hydrolyse (Morrison und Hay, 1970) gewonnen, in ihre Dinitrophenyl-Derivate (Karlsson, 1970) überführt und mittels RP-HPLC analysiert. (A) Trennung der Referenzsubstanzen (Sigma) Phytosphinganin (t18 : 0), 4-trans- Sphingenin (d18 : 1) und Sphinganine (d18 : 0). (B) LBC-Muster der Wildtyp-Pflanzen bzw. transformiert mit dem Leervektor pBI121. Reduktion von cis- und trans-Δ8- Phytosphingenin (t18 : 1) in T2-Pflanzen (C) durch homologe Antisense-Expression des sld1-Gens aus A. thaliana (pBIB5At) und (D) durch heterologe Sense- Expression (Co-Suppression) des sld1-Gens aus B. napus (pBIB5Bn).

Fig. 14 Regioselektivität der pflanzlichen Sphingolipid-Desaturase. Die Δ-6- Sphingolipid-Desaturasen führen eine delta-8- und -9-Doppelbindung in cis- und trans-Konfiguration in langkettige Basen ein, was zur Bildung von Phytosphingenin bzw. phytosphingininhaltiger Sphingolipide (t18 : 1) in den transformierten Hefezellen führt (R repräsentiert eine Vielzahl möglicher Fettsäurereste).

Fig. 15 Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz aus P. Sperling et al. (1995), s. o.

Fig. 16 Erweiterter Proteinsequenzvergleich von Sphingolipid-Desaturasen (die oberen 5 Sequenzen) mit Δ6-Fettsäuredesaturasen (BnDES8, AtDES8, HaDES? Und BoDES6 s. Fig. 5; d51pu, b51bo und d52pu sind unveröffentlichte Teilsequenzen der Anmelderin; b5cae, 2b5ce und b5pp haben die EMBC Accession Numbers Z70271, Z81122 und AJ222980).

Beispiele

Nachfolgend werden folgende Abkürzungen verwendet:
cDNA copy-Desoxyribonukleinsäure
FAME Fettsäuremethylester
GC-MS Gaschromatographie-Massenspektroskopie
HPLC Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
LCB langkettige Basen (der Sphingolipide)
mRNA Boten-Ribonukleinsäure
NMR 'Nuclear Magnetic Resonance' Spektroskopie
PCR Polymerasekettenreaktion
TLC Dünnschichtchromatographie

Beispiel 1 Isolierung und Klonierung von sld1 aus B. napus

Restriktionsendonukleasen und DNA modifizierende Enzyme wurden, wenn nicht anders angegeben von den Firmen New England Biolabs und Boehringer Mannheim bezogen und nach Angaben des Herstellers verwendet. E. coli XL1blue, MRF' (Stratagene) wurde bei 37°C in LB-Medium (J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)) angezogen. Für die Selektion von mit Plasmiden transformierten E. colis wurden die Antibiotika Ampicillin (100 µg/ml) und Kanamycin (30 µg/ml) dem Medium zugesetzt. Die Transformation kompetenter E. coli erfolgte nach H. Inoue et al., "High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids", Gene 96: 23-28(1990) und die DNA-Minipräparation nach M. G. Riggs et al., "A simplified screening procedure for large numbers of plasmid mini-preparation", Bio Techniques 4: 310-313 (1986).

Um eine homologe DNA-Sequenz aus Brassica napus zu isolieren, wurden degenerierte Oligonucleotideprimer von der funktional unbekannten DNA-Sequenz aus Helianthus annuus (Sperling et al. (1995), s. o.) abgeleitet. Ein 571 bp langes DNA-Fragmentes wurde aus einer lambda-ZAP cDNA-Bank aus reifenden Schoten von Brassica napus cv. Ascari (M. Fulda et al.," Brassica napus cDNAs encoding fatty acyl-CoA synthetase", Plant Mol. Biol. 33: 911-922 (1997)) mittels PCR (Polymerasekettenreaction) isoliert. Hierzu wurden die degenerierten Primer

BN1 (5'-G[GC][ATGC]TGGTGGAA[AG]TGG-3') und
BN2 (5'-GG[AG]AA[ATGC]A[AG][AG]TG[AG]TG-3')

eingesetzt, die den Aminosäuresequenzen [GA] WWKW und HHLFP aus H. annuus entsprechen.

Es wurde folgendes Programm für die Amplifizierung benutzt: 5 min bei 96°C, gefolgt von 30 Zyklen von 20 s bei 96°C, 1 min bei 40°C (Bindungstemperatur, T_m) und 2 min bei 72°C, 1 Zyklus von 10 min bei 72°C. Für die Amplifikation wurde die Taq-DNA-Polymerase, wenn nicht anders angegeben, von Gibco BRL verwendet. Das 5'-Ende der cDNA wurde mit dem T3-Primer (20 mer) von Stratagene und dem spezifischen Rückprimer

BN3 (5'-TTATGCGTCCATTTCCACCA-3')

wie beschrieben mittels PCR amplifiziert, nur daß die T_m 55°C betrug.

Um das 3'-Ende der DNA zu amplifizieren, wurde cDNA aus mRNA reifender Embryonen von B. napus cv. Drakkar eingesetzt. Dazu wurde mRNA mit Hilfe von oligo(dT) Dynabeads nach Gebrauchsanweisung der Fa. Dynal GmbH (Hamburg) aus reifenden Embryonen von B. napus cv. Drakkar isoliert. Diese mRNA wurde mittels der Reversen Transkriptase Reaktion zur Einzelstrang cDNA Synthese mit dem SuperScript Preamplification System (Gibco BRL) und einem synthetischen oligo(dT)-Primer

(5'-GA TCTAGA CTCGAG GTCGAC T₁₄-3'),

der die drei Restriktionsschnittstellen für XbaI, XhoI und Sall trägt (unterstrichen), eingesetzt. Die synthetisierte cDNA wurde über SizeSep 400 Säulen der Fa. Pharmacia nach deren Anweisung gereinigt. Anschließend wurde das 3'-Ende der DNA mit dem spezifischen Forwärtsprimer

BN4 (5'-TTCTTTGGCGGGTTGCAGTT-3')

und einem synthetischen oligo(dT)-Primer

(5'-GA TCTAGA CTCGAG GTCGAC T₄-3')

mittels der o. g. PCR-Bedingungen bei T_m 54°C amplifiziert.

Die Klonierung und Sequenzierung der doppelsträngigen cDNA-Fragmente aus den verschiedenen PCR-Amplifikationen (571 bp, 5'- und 3'-Ende) erfolgte wie beschrieben (P. Sperling et al. (1995), s. o.): Die DNA-Fragmente wurden mit dem SureClone Ligation Kit (Pharmacia, Freiburg) in den Plasmidvektor pUC18/Smal legiert, in E. coli XL1blue (Stratagene) transformiert und mit dem ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt) beidsträngig sequenziert. Die, aus den sich überlappenden Teilsequenzen, abgeleitete Länge des vollständige Klons beträgt 1594 bp (Abb. 1), der für ein offenes Leseraster von 449 Aminosäuren codiert (Abb. 2).

Spezifische Primer

BN5 (5'-AACCATCTCTGTTTCAAC-3') und
BN6 (5'-CAA GTGATGATGAGTTAC-3'),

die von den 5'- und 3'-untranslatierten Regionen abgeleitet wurden, wurden in einer weiteren PCR (T_m 55°C) mit cDNA aus B. napus cv. Drakkar eingesetzt. Diese Reaktion wurde mit der Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) durchgeführt. Ein vollständiger Klon von 1502 bp (PCR-Klon 1) wurde isoliert, mit dem SureClone Ligation Kit (Pharmacia) in pUC18/Smal legiert und in in E. coli XL1blue (Stratagene) transformiert. Der Klon wurde beidsträngig mit dem ABI PRISM Dye Terminator Kit (Perkin-Elmer) sequenziert und stimmt mit der Nukleotidsequenz in Fig. 1 und und der Aminosäuresequenz in Fig. 2 überein.

Für die spätere Expression in Hefe wurde ein vollständiger Klon (1347 bp), der die kodierende Sequenz beinhaltete, mittels PCR mit den abgeleiteten Primern

BN7, vorwärts 5'-CCGGTACCATGTCGGAGCAGACAAAG-3' und
BN8, revers 5'-CCGAATTCCTAGCCATGAGTATTCAGA-3'

bei T_m 56°C amplifiziert. Start- und Stopcodon sind fettgedruckt und die angefügten Restriktionsschnittstellen KpnI und EcoRI sind unterstrichen. Ein vollständiger Klon von 1363 bp (PCR-Klon 2) wurde isoliert und mit Hilfe des pGEM-T Vektor Systems von Promega in E. coli XL1blue kloniert. Zur Überprüfung wurde dieser Klon mit dem ABI PRISM Dye Primer Kit (Perkin-Elmer) ansequenziert.

Beispiel 2 Isolierung und Klonierung von sld1 aus A. thaliana

Um das sld1 Gen aus Arabidopsis thaliana zu isolieren, wurde eine TBLASTN-Suche (S. F. Altschul et al., "Basic local alignment search tool", J. MoL Biol. 215: 403-410 (1990)) in Datenbanken mit der abgeleiteten Proteinsequenz aus B. napus (Fig. 2) durchgeführt. Teile der Proteinsequenz aus B. napus wiesen eine signifikante Ähnlichkeit zu folgenden EST-Klonen aus A. thaliana auf, deren EMBL Accession- Nummern lauten: T42569 (27-93), N37558 (33-195), F13728 (113-201), T42806 (366-396), F13717 (421-449). Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Aminosäurepositionen der Rapssequenz (Fig. 2), die von diesen EST-Klonen abgedeckt werden.

Spezifische Oligonucleotidprimer wurden von den Nukleotidsequenzen der EST- Klone

T42569: (AT1, vorwärts) 5'-GCGATTCAAGGCAAGGTCTAC-3' und
F13717: (AT2, revers) 5'-TTAGCCATGAGTATTCAAAGC-3'

abgeleitet, wobei das Stopcodon Fett gedruckt ist. Diese Primer wurden für die PCR- Amplifikation (2 min bei 95°C, 30 Zyklen mit 20 s bei 95°C, 30 s bei T_m 59°C, 1 min bei 72°C, 1 Zyklus 10 min bei 72°C) eines 1272 bp DNA-Fragmentes aus einer lambda-ZAP cDNA-Bank aus A. thaliana eingesetzt. Diese cDNA-Bank wurde von dem Genetic Stock Center des Max-Planck Institutes in Köln bezogen, die hauptsächlich aus grünen Pflanzenteilen (Blätter, einige Blüten, wenig Wurzeln) isoliert worden war. Das 5'- bzw. 3'-Ende wurde mittels o. g. PCR (T_m 50°C) mit der Primer-Kombination T3-Primer (Stratagene) und AT2 bzw. T7-Primer und AT1 amplifiziert. Das 1272 bp DNA-Fragment (PCR-Klon 3) wurde in pUC 19/Smal und die 5'- und 3'-DNA-Fragmente wurden mit dem pGEM-T Vector System (Promega) in E. coli XL1blue (MRF', Stratagene) kloniert. Die Sequenzierung erfolgte mit dem dem ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt). Aus diesen drei überlappenden Teilsequenzen konnte eine vollständige Sequenz von 1678 bp (Abb. 3) abgeleitet werden, die für ein offenes Leseraster von 449 Aminosäuren kodiert (Abb. 4). Ein vollständiger Klon, der die kodierende Sequenz beinhaltete, wurde mittels PCR mit den abgeleiteten Primern

AT3, vorwärts: 5'-CCGGTACCATGGCGGAAGAGACGGAG-3' und
AT4, revers: 5'-CCGAATTCTTAGCCATGAGTATTCAAAGC-3'

bei T_m 56°C amplifiziert. Start- und Stopcodon sind fett gedruckt und die angefügten Restriktionsschnittstellen KpnI und EcoRI für die spätere Klonierung in einen Hefe- Expressionsvektor sind unterstrichen. Ein vollständiger Klon von 1363 bp (PCR- Klon 4) wurde isoliert, mit dem pGEM-T Vektor von Promega kloniert und in E. coli XL1blue transformiert. Dieser Klon wurde mit dem ABI PRISM Dye Terminator Kit (Perkin-Elmer) beidsträngig sequenziert und stimmt mit der Nukleotidsequenz in Fig. 3 und der Aminosäuresequenz in Fig. 4 überein.

Die sld1-Nukleotidsequenzen aus B. napus und A. thaliana weisen beide ein offenes Leseraster gleicher Länge auf, das am N-Terminus 9 Aminosäuren kürzer ist als das entsprechende Protein aus der Sonnenblume (P. Sperling et al. (1995), s. o.). Die zwei abgeleiteten Polypeptide von ca. 51-52 kD weisen untereinander 76% identische Aminosäuren auf und 65% bzw. 64% zu der Sonnenblumensequenz. Die höchste Ähnlichkeit der sld1-Proteine besteht zu der delta-6 Glycerolipid- Desaturase aus Borretsch (O. Sayanova et al. (1997), s. o.), dessen Proteinsequenz um eine Aminosäure kürzer ist, wobei 60% bzw. 58% der Aminosäuren identisch sind (Fig. 5).

Beispiel 3 Klonierung und Expression von sld1 in Saccharomyces cerevisiae

Die Klonierung und Expression von sld1 erfolgte in Anlehnung an die erfolgreiche Expressionsmethode des fad2-Gens aus A. thaliana in Hefe (S. Kajiwara et al., "Polyunsaturated fatty Acid Biosynthesis in Saccaromyces cerecisiae: Expression of Ethanol Tolerance and the FAD2 Gene from Arabidopsis thailana", AppL Environ. Microbiol. 62: 4309-4313 (1996)). Die amplifizierte sld1 DNA aus B. napus und A. thaliana (PCR-Klone 2 und 4), die in die multiple Klonierungsstelle des Vektors pGEM-T Vektors (Promega) kloniert worden war (s. o.), wurde mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und EcoRI geschnitten. Die 1,4 Kb KpnI/EcoRI- Fragmente wurden in die KpnI/EcoRI-Stelle des gezippten Hefe-E. coli shuttle- Expressionsvektors pYES2 legiert (Invitrogen Co.). Die daraus resultierenden neuen Plasmide, pYES2Bn und pYES2At, sind in Abb. 6 und Abb. 7 dargestellt und wurden in E. coli TOP10F' (Invitrogen Co.) transformiert.

Die DNA-Maxipräparation wurde mit dem Plasmid Maxi Kit (Qiagen) durchgeführt. Die isolierten Plasmide pYES2Bn und pYES2At wurden zur Kontrolle nochmals mit dem ABI PRISM Dye Primer Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer) ansequenziert und dann in S. cerevisiae INVSc1 (Invitrogen Co.) mit der Polyethylenglycol-Methode (M. von Pein, Dissertation, Heinrich Heine-Universität Düsseldorf (1992)) transformiert.

Die Selektion erfolgte auf Agarplatten aus komplettem Minimal-Dropout-Uracil (CM)- Medium mit 2% Glucose (F. M. Asubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York 1995). Die Überprüfung der transgenen Hefekolonien erfolgte mittels einer Minipräparation von Hefeplasmid-DNA (Asubel et al. (1995), s. o.) deren Retransformation in E. coli TOP10F', anschließender Minipräparation und Restriktionsanalyse der E. coli-Plasmid-DNA mit KpnI/EcoRI. Für den analytischen Vergleich der Transformanten mit dem Hefe-Wildtyp wurde auch der ungeschnittene pYES2-Vektor in INVSc1 (Kontrolle) transformiert.

Die Vorkultur erfolgte durch Animpfen von 2-5 ml CM- 2% Raffinose-Medium mit einer transgenen Hefekolonie und anschließender Inkubation für 2d bei 30°C im Roller bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von 4-5. Für die Hauptkultur wurde CM- 2% Raffinose-Medium mit einem Aliquot der Vorkultur (500fache Verdünnung) ad OD₆₀₀ 0,01-0,02 angeimpft und 24 h bei 30°C, 250 rpm im Schüttler inkubiert. Die Induktion der Testkulturen erfolgte in der logarithmischen Wachstumsphase 600 0,1-0,5) durch Zugabe von Galaktose ad 1,8%. Die Ernte der induzierten Zellen erfolgte nach weiteren 24 h aeroben Wachstum bei 30°C bei OD₆₀₀ 4-5.

Beispiel 4 Analyse der langkettigen Basen aus den Sphingolipiden der Hefetransformanten

Die induzierten Hefezellen wurden durch 10 min Zentrifugation bei 2000 g geerntet, zweimal mit Aqua dest. gewaschen, 20 min in Aqua dest. abgekocht, und nach dem Abkühlen auf Eis erneut sedimentiert.

Da S. cerevisiae hauptsächlich nur die schwer extrahierbaren Sphingophosphoglycolipide enthält, wurden die langkettigen Basen (LCB) durch starke alkalische Hydrolyse (24 h bei 110°C) ganzer Zellen (350 mg Frischgewicht) in 10% Ba(OH)₂/Dioxan (1 : 1, v/v) freigesetzt (W. R. Morrison et al., "Polar lipids in bovine milk II. Long-chain Bases, normal and 2-hydroxy fatty acids, and isomeric cis and trans monoenoic fatty acids in the sphingolipids", Biochim. Biophys. Acta 202: 460-467 (1970)). Die LCB wurden aus dem Hydrolysat ad CHCl₃/Dioxan/H₂O (6 : 1 : 5) extrahiert, die CHCl₃ Phase abdestilliert. Die freien LCB des Hydrolysats wurden direkt in ihre Dinitrophenyl-Derivate überführt (K.-A. Karlsson, "On the occurrence of sphingolipid long-chain bases", Chem. Phys. Lipids 5: 6-43 (1970)). Die Dinitrophenyl-LCB wurden mit CHCl₃/Methanol/H₂O (8 : 4 : 3) extrahiert, dünnschichtchromatographisch in CHCl₃/Methanol (90 : 10) gereinigt (K.-A. Karlsson (1970), s. o.) und mit Methanol aus dem Kieselgel extrahiert.

Für die Analyse der Dinitrophenyl-LCB wurde eine Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC)-Methode entwickelt. Die Trennung der verschiedenen Spezies erfolgte mit einer ODS Hypersil® RP18-Säule (5 µm, 25 × 4,6 cm) von der Fa. Bischoff. Die Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten bei einer Flußrate von 1 ml/min. Von 80% Methanol/Acetonitrile/2-Propanol (10 : 3 : 1, v/v/v) und 20% Aqua dest. auf 0% Aqua dest. in 40 min. Die Elution der Dinitrophenyl-Derivate wurde bei 350 nm massenproportional detektiert (Fig. 8). Die Referenz-LCB wurden von der Fa. Sigma bezogen (Fig. 8 A).

Die HPLC-Analyse zeigte, daß transgene Hefezellen, die das Plasmid pYES2At bzw. pYES2Bn enthalten, mindestens zwei neuartige LCB produzieren (Abb. 8C, D), die in Wildtyp- und mit pYES2 transformierten Hefen (Fig. 8B) nicht enthalten sind. Kalkuliert aus den HPLC-Daten, betrug das Verhältnis der neuartigen cis- und trans- Phytosphingenine (t18 : 1) bei transgenen Hefen mit pYES2Bn 1 : 6,7 und mit pYES2At 1 : 3. Die Stereoisomere delta-8 und delta-9 wurden durch die HPLC nicht getrennt.

Beispiel 5 Analyse der neuartigen langkettigen Sphingobasen mittels NMR und MS

Isolierung und Derivatisierung der Phytosphingenine: Für eine chemische Strukturanalyse wurden die LCB aus transgenen Hefezellen (5,7 g Frischgewicht) mittels alkalischer Hydrolyse isoliert (siehe Beispiel 4.). Die Fraktion der freien C18- Trihydroxybasen (Phytosphinganin und Phytosphingenin, R_f 0,34) wurde über Dünnschichtchromatographie in CHCl₃/Methanol/NH₄ (40 : 40 : 1) von den restlichen Basen des Hydrolysats abgetrennt (M. Ohnishi et al., Biochim. Biophys. Acta 752: 416-422 (1983)), mit CHCl₃/Methanol/1 N KOH (2 : 1 : 0,75) extrahiert und mit Essigsäureanhydrid, 4-(Dimethylamino)-pyridin in Pyridin per-O-acetyliert (C. M. Gupta et al., "Glycerophospholipid synthesis: improved general method and new analogs containing photoactivable groups", Proc. natl. Acad. Sci. USA 74 : 4315-­ 4319 (1977)). Die per-O-acetylierten C18-Trihydroxybasen wurden in n-Hexan gegen Wasser (1 : 1) extrahiert und in 100% Diethylether dünnschichtchromatographisch gereinigt. Die Detektion erfolgte mit 0,2% methanolischer 8-Anilinonaphthalin-1- sulfonsäure unter UV-Licht und die Extraktion erfolgte mit n-Hexan. Die Auftrennung der per-O-acetylierten Basenfraktion (0,73 mg) in Phytosphinganin (125 µg t18 : 0, R_f 0,46), in trans- (300 µg t18 : 1^t, R_f 0,44) und in cis-Phytosphingenin (100 µg t18 : 1^c, R_f 0,44) erfolgte dünnschichtchromatographisch über 10%ige Silbernitrat- Kieselgelplatten (O. Renkonen et al., "Structure of plasma sphingadienine", J. Lipid Res. 10: 687-693 (1969)) in CHCl₃/Methanol (95 : 5) bei 4°C. Die Detektion der Banden erfolgte mit 0,2% methanolischem Dichlorofluorescein unter UV-Licht und die Extraktion erfolgte mit n-Hexan.

NMR-Spektroskopie: ¹H-NMR-Spektren wurden mit einem 600 MHz Bruker Avance DRX 600 Spektrometer, ausgerüstet mit einem Mikroprobenkopf (PH TXI 600SB), mit Kapillarröhrchen von 2,5 mm O. D. (Wilmad, Buena, NJ, USA) gemessen. Die per-O-acetylierten Proben (50-300 µg) wurden in 100 µl CDCl₃ (Cambridge Isotope Lab., MA., USA) gelöst und ihre Spektren bei 300 K mit TMS als internem Standard (δ_H = 0,000 ppm) aufgenommen. Ein- und zweidimensionale homonucleare ¹H, ¹H COSY-Experimente wurden mit der Standard-Bruker-Software (XWINNNMR, Version 1.3) dargestellt.

GC-MS-Analyse: Die gaschromatographische Massenspektroskopie (GC-MS) wurde mit einem Hewlett-Packard Spektrometer Modell 5989 mit einer HP-5 Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm) durchgeführt. Die folgenden Temperaturgradienten wurden für die Analyse der verschiedenen Derivate benutzt: Per-O-acetylierte Phytosphingenine: 3 min bei 230°C, Gradient von 5°C/min ad 330°C und mittelkettige Fettsäuremethylester: 3 min bei 100°C, Gradient von 10°C/min ad 330°C. GC-MS- Analyse wurde im Cl- (mit Ammoniak) und EI-Mode (70 eV) durchgeführt.

Derivatisierung der Phytosphingenine für GC-MS

• A) Bleitetraacetat-Oxidation: Ein Aliquot der unfraktionierten, peracetylierten C18- Trihydroxybasen (0,36 mg) wurden mit Natriummethylat desacyliert und anschließend mit Pb(OAc)₄ in Chloroform oxidiert. Die resultierenden Aldehyde wurden in Chloroform extrahiert, zur Trockne eingedampft und mit LiAIH₄ in Ether zu den entsprechenden Alkoholen reduziert. 1/10 der Alkohole wurde mit BSTFA (Sigma) in ihre Trimethylsilyl-Derivate überführt und direkt mittels GC-MS analysiert. Die restlichen Alkohole (9/10) wurden mit Nikotinsäurechlorid in Pyridin zu Nikotinaten umgesetzt, in n-Hexan gegen Wasser extrahiert und mittels GC-MS analysiert.
• B) Kaliumpermanganat-Oxidation: Ein Aliquot der peracetylierten C18- Trihydroxybasen wurde unter alkalischen Bedingungen mit KMnO₄ in Methanol/Wasser (2 : 1) oxidiert. Nach dem Ansäuern wurden die resultierenden Fettsäuren extrahiert und mit etherischem Diazomethan in ihre Methyl-Ester überführt und mittels GC-MS analysiert.

Die Fraktion der per-O-acetylierten C18-Trihydroxybasen aus den mit pYES2At transformierten Hefen wurde mittels GC-MS analysiert, wobei drei distinkte Peaks erhalten wurden. Ein Peak, der bei 15,72 min eluierte, wurde als 2-N-acetamido- 1,3,4-tri-O-acetyl-octadecan (Phytosphinganin, t18 : 0) identifiziert. Die zusätzlichen beiden Peaks eluierten bei 15,30 und 15,45 min wurden als als 2-N-acetamido-1,3,4- tri-O-acetyl-octadecen (m/z^-144, 423[M-60]⁺, 483[M]⁺) (Phytosphingenin, t18 : 1) identifziert. Das t18 : 0 und die beiden t18 : 1-Isomere lagen im Verhältnis 3 : 2 : 1 vor. Die, nach Bleitetraacetat-Oxidation erhaltenen, zwei Nikotinat-Derivate von t18 : 1 führten bei der GC-MS-Analyse zu zwei Peaks (15,80 und 15,95 min) mit dem erwarteten, molekularen Masseion (M = 331). Basierend auf das beobachtete Fragmentierungsmuster der Nikotinate, konnte die Position der Doppelbindung nur annäherungsweise im ersten Peak zwischen C6 und C7 (Penta-Δ6-decen, m/z = 137, 151, 165, 178, 192, 206, 218, 232) und im zweiten Peak zwischen C7 und C8 (Penta-Δ5-decen, m/z = 137, 151, 165, 178, 192, 204, 218, 232) lokalisiert werden.

Für eine eindeutige Lokalisation der Doppelbindung wurde die Fraktion der C18- Trihydroxybasen mit Kaliumpermanganat oxidiert und in ihre Fettsäuremethylester (FAME) überführt. Aus dem per-O-acetylierten t18 : 0 wurde, aufgrund der Oxidation der Diolgruppen zwischen C3 und C4, ein Pentadecansäure-Methylester (C15 : 0) erhalten. Zusätzlich wurden zwei mittelkettige FAME erhalten und mittels GC-MS als Nonansäure-Methylester (C9 : 0, 7,5 min) und Decansäure-Methylester (C10 : 0, 9,0 min) identifiziert. Beide Fettsäuren lagen in einem Verhältnis von 1 : 3 vor, woraus folgert, daß in der Originalprobe zwei Phytosphingenin-Isomere (t18 : 1⁸ und t18 : 1⁹) mit unterschiedlicher Lage der Doppelbindung in Position delta-8 und -9 vorlagen. Weiterhin wurden die per-O-acetylierten C₁₈-Trihydroxybasen über AgNO₃- Dünnschichchromatographie (TLC) in 125 µg t18 : 0, 300 µg t18 : 1^trans8,9 und 100 µg t18 : 1^cis8,9 aufgetrennt. Obwohl die Regioisomere t18 : 1^trans8 und t18 : 1^trans9 bzw. t18 : 1^cis8 und t18 : 1^cis9 nicht durch die AgNO₃-TLC voneinander getrennt wurden, konnte die Bestimmung der cis- (Fig. 10B) und trans-Stereoisomere (Fig. 10A) mittels NMR durchgeführt werden. Ein- (1D) und zweidimensionale (2D) ¹H-NMR-Experimente (COSY) der gereinigten t18 : 1^trans und t18 : 1^cis Stereoisomere wurden durchgeführt. Die t18 : 1^trans-Fraktion wies nicht-distinkte, aber charakteristische Multiplets für die olefinischen Protonen (-CH=CH-) bei 5.038 ppm auf, die im COSY-Experiment Kreuz-Signale zu den α- Methylenprotonen (1.879 ppm) zeigen, die charakteristisch für trans-olefinische Protonen sind (D. J. Frost et al., The PMR analysis of non-conjugated alkenoic and alkynoic acids and esters, Chem. Phys. Lipis 15: 53-85 (1975)). In der t18 : 1^cis- Fraktion wurden diese Signale leicht in das höhere Feld für die olefinischen Protonen (5,275 ppm) verschoben, wohingegen die α-Methylenprotonen in das niedrigere Feld (1,927 ppm) verschoben werden, was wiederum charakteristisch für das cis- Isomer ist (D. J. Frost et al. (1975), s. o.).

Von den relativen Anteilen der vier Derivate kann das Verhältnis aller ungesättigten Phytosphingenin-Isomere bestimmt werden. Bei der GC-MS-Analyse der FAME (C10 : 0 und C9 : 0), erhalten nach Kaliumpermanganat-Oxidation, wiesen die beiden Regioisomere ein Verhältnis von 3 : 1 auf, was für eine dreifach stärkere delta-8- als delta-9-Desaturase-Aktivität spricht. Die relativen Massenverteilungen der Stereoisomere bei der AgNO₃-TLC weisen auf eine dreifach höhere Dominanz des trans-Isomers gegenüber der cis-Desaturase-Aktivität hin. Die heterologe Expression des sld1-Gens aus A. thaliana in Hefe führte zur Neubildung von vier Phytosphingenin-Isomeren t18 : 1^8trans, t18 : 1^9trans, t18 : 1^8cis und t18 : 1^9cis im Verhältnis von 9 : 3 : 3 : 1.

Die MS- und NMR-Spektren sind in Fig. 9 und 10 gezeigt.

Beispiel 6 Klonierung und Transformation von sld1 in Arabidopsis thaliana

Für eine heterologe Überexpression des sld1-Gens aus B. napus wurde der 1502 bp PCR-Klon 1 in puc19/Smal kloniert (siehe Beispiel 1.) und mit den Restriktiosenzymen BamHI und SacI geschnitten. Das resultierende 1521 bp DNA- Fragment wurde in Sense-Orientierung in den mit BamHI und SacI geschnittenen Pflanzenexpressionsvektor pBI121 der Fa. CLONTECH hinter den konstitutiven 35S-Promotor (CaMV), anstelle des GUS-Gens, legiert. Das resultierende Plasmid pBIB5Bn ist in Fig. 11 dargestellt.

Für eine homologe Antisense-Ausschaltung des sld1-Gens wurde der 1272 bp PCR- Klon 3 aus A. thaliana in puc18/Smal kloniert (siehe Beispiel 2.) und mit BamHI und SacI verdaut. Das resultierende 1283 bp DNA-Fragment wurde in antisense- Orientierung in die BamHI/SacI-Schnittstellen des Vektors pBI121 legiert. Das resultierende Plasmid pBIB5At ist in Abb. 12 dargestellt.

Die Plasmide pBIB5Bn und pBIB5At wurden in E. coli XL1blue transformiert und eine DNA-Maxipräparation mit dem Plasmid Maxi Kit (Qiagen) durchgeführt. Die Vollständigkeit und richtige Orientierung der PCR-Klone in pBIB5Bn und pBIB5At wurde einerseits durch verschiedene Restriktionsverdaus (BamHI + SacI, BamHI + EcoRI; XbaI + SacI), andererseits durch erneute Teilsequenzierungen überprüft mit dem ABI PRISM Dye Terminator Kit (Perkin-Elmer) bei T_m 50°C und folgenden spezifischen Primern:

35S-Promotor-Primer PR01 : 5'-CACAATCCCACTATCCTT-3' (vorwärts)
BN9 : 5'-GGAGCTTTGTAAGAAGCAT-3' (revers) und
AT5 : 5'-GGAATCTCAATCGCGTGG-3' (revers).

Der Agrobacterium tumefaciens Stammes GV3101 mit dem Ti-Helferplasmid pMP90 (C. Koncz et al., "The promotor of T_L-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes by a novel type of Agrobacterium binary vector", Mol. Gen Genet. 204: 383-396 (1986)) wurde mit je einem der binären Vektoren pBI121 (Kontrolle), pBIB5Bn und pBIB5At nach der Methode von H. Chen et al., "Enhanced Recovery of Transformation of Agrobacterium tumefaciens after Freeze-Thaw Transformation and Drug Selection", Bio Techniques 16: 664-669 (1994) transformiert. Die transformierten Bakterien wurden 24 h bei 28°C in Luria-Bertani (LB) Selektivmedium mit 100 µg/ml Rifampicin, 40 µg/ml Gentamycin und 50 µg/ml Kanamycin (Sigma) angezogen. Nach der Antibiotika-Selektion auf LB-Agarplatten wurden positive Einzelkolonien mittels PCR bei T_m 50°C mit folgenden Primerkombinationen überprüft: PRO1 und BN6 für pBIB5Bn; PRO1 und AT1 für pBIB5At. Die Transformation ganzer A. thaliana Pflanzen, Ecotyp Columbia (C24) erfolgte in planta durch Agrobacterium-vermittelte Vakuum Infiltration (N. Bechthold et al. (1993), s. o. und modifiziert von A. F. Bent et al. (1994), s. o.).

Beispiel 7 Anzucht und Selektion der transgenen Arabidopsis-Pflanzen

Die Agrobacterium-infiltrierten T0-Pflanzen wurden in Töpfen mit Einheitserde/Sand (2 : 1) in der Klimakammer unter Langtagbedingungen (16 h Licht) bei 22°C Tages- und 17°C Nachttemperatur und 60% Luftfeuchte bis zur Reife angezogen und die T1-Samen vereint geerntet. Die getrockneten Samen wurden mit 4% NaOCl in 0,02­ % Triton® X-100 oberflächensterilisiert, auf Selektiv-Nährmedium (1 × MS-salts incl. Gamborg's Vit. B5, Sigma M5519, 0,05% MES-KOH pH 5,8, 1% Sucrose, 0,8% Agar) mit 60 µg/ml Kanamycin ausplattiert. Nach einer 2d Kältebehandlung bei 4°C, um die Keimung zu synchronisieren, wurden die Platten in die Klimakammer transferiert (s. o.). Nach 14-20d wurden die Kanamycin-resistenten T1-Pflanzen in Erde umgetopft, als Einzelpflanzen geselbstet und die T2-Samen geerntet. Daraus wurden, wie oben beschrieben (V. Katavic et al., "in planta transformation of Arabidopsis thaliana", Mol. Gen Genet. 245: 363-370 (1994)), wiederum Antibiotika­ resistente T2-Pflanzen selektioniert, die in einem Verhältnis hetero- zu homozygoter Pflanzen von 2 : 1 aufspalten.

Beispiel 8 Analyse der LCB aus den Sphingolipiden transgener Arabidopsis- Pflanzen

Für die nachfolgenden Analysen der Fettsäuren und langkettigen Basen der Sphingolipide wurden Mischproben ganzer T2-Pflanzen (Blätter und Wurzel) direkt von den Selektivplatten verwendet, die aus der Selbstung unabhängiger T1-Pflanzen hervorgegangen sind.

Nach einer Lipidextraktion ganzer T2-Pflanzen in CHCl₃/Methanol/Wasser (2 : 1 : 0,75) wurden die Gesamt-Fettsäuren als Bromphenacylester-Derivate mittels RP-HPLC analysiert (H. P. Haschke et al. (1990), s. o.). Die Analyse transgener T2-Pflanzen, die mit pBIB5Bn bzw. pBIB5At transformiert worden waren, 19d und 36d nach Keimung zeigte keine signifikanten Änderungen im Fettsäuremuster gegenüber Wildtyp und Kontrollpflanzen (+pBI121) und entsprach der Fettsäurezusammensetzung in, Arabidopsis-Wildtyp Blättern (B. Lemieux et al., "Mutants of Arabidopsis with alterations in seed lipid fatty acid composition", Theor. Appl. Genet. 80: 234-240 (1990)). Eine dünnschichtchromatographische Auftrennung des Lipidextraktes in AcetonfloluollWasser (91 : 30 : 8) zeigte ebenfalls keine signifikanten Veränderungen des Ceramid- und Cerebrosidgehaltes in T2- Pflanzen 37d nach Keimung.

Die Analyse der langkettigen Basen (LCB) aus Sphingolipiden erfolgte wie unter Beispiel 4. beschrieben mit ganzen T2-Pflanzen (Gesamt-Sphingolipide) 19d, 23d und 34d nach Keimung, mit Lipidextrakten (Cerebroside und Ceramide) 21d und 28d nach Keimung und mit Lipid-extrahierten T2-Pflanzen (nicht extrahierbare Sphingophosphoglycolipide) 28d nach Keimung. Die LCB-Analysen der Mischproben zeigten, daß der Gehalt an cis- und trans-Phytosphingenin (t18 : 1) in den Gesamt-Sphingolipiden von 80-85% im Wildtyp bzw. in T2-Kontrollpflanzen (+ pBI121) auf bis zu 5% in T2-Pflanzen mit pBlBSAt (Antisense) bzw. pBIB5Bn (sense) reduziert wurde (Fig. 13). Während die Antisense-Wirkung in T2-Pflanzen mit pBIB5Bn (sense) auf Co-Suppression-Effekte zurückzuführen ist (Review von J. Finnegan et al., "Transgene Inactivation: Plants Fight Back!", BIO/TECHNOLOGY 12: 883-888 (1994)), war eine Steigerung des Phytosphingenin-Gehaltes in A. thaliana durch heterologe Überexpression des sld1-Gens aus B. napus bei den hohen Ausgangswerten im Wildtyp (s. o.) nur noch um max. 6-9% möglich. Da der Gehalt und das Verhältnis von cis- und trans-Phytosphingenin z. B. mit der Pflanzenart variiert (Imai et al., s. o.), würde eine heterologe Überexpression des sld1 Gens in anderen Organismen zu einer größeren Modifikation der Basenzusammensetzung führen. Weitere Analysen der o. g. Subfraktionen zeigten, daß Cerebroside mehr cis-Phytosphingenin und Sphingophosphoglycolipide wesentlich mehr trans-Phytosphingenin enthalten. Während der Phytosphingeningehalt in den Cerebrosiden relativ konstant gehalten wird, führt der Antisense-Effekt zu einer drastischen Reduktion dieser LCB-Spezies in den Sphingophosphoglycolipiden.

Die chemische Strukturanalyse des Phytosphingenins in Arabidopsis thaliana erfolgte durch direkte Ba(OH)₂-Hydrolyse von Wildtyp-Blättern und Extraktion der freien LCB aus dem Hydrolysat (siehe Beispiel 4.). Die C18-Trihydroxybasen wurden wie unter Beispiel 5 beschrieben isoliert und entsprechend analysiert. Die NMR- und MS-Analysen ergaben, daß Arabidopsis-Pflanzen im Gegensatz zu den transgenen Hefezellen nur das delta-8-Phytosphingenin (t18 : 1^8trans und t18 : 1^8cis) enthalten. Die HPLC-Analysen der LCB aus Arabidopsis-Pflanzen (Fig. 8E) sprechen für ein ähnliches Verhältnis der Stereoisomere (t18 : 1^trans und t18 : 1^cis) von 3 : 1, wie es bei der heterologen Expression des sld1-Gens aus A. thaliana in Hefe vorliegt.

Beispiel 9 Substratspezifität

Enzymatische Studien haben gezeigt, daß nicht die freien langkettigen Basen, sondern die N-acylierten Basen (Ceramide und komplexe Sphingolipide) desaturiert werden (C. Michel et al., "Characterization of Ceramide Synthesis. A Dihydroceramide Desaturase introduces the 4,5-frans-double bond of sphingosine at the level of dihydroceramide", J. Biol. Chem. 272: 22432-22437 (1997); J. K. Kok et al., "Dihydroceramide Biology. Structure-specific metabolism and intracellular localization", J. Biol. Chem. 272: 21128-21136 (1997)).

Unsere Ergebnisse und die Zusammensetzung der LCB-Spezies in Spingolipiden von Pflanzen (Imai et al., s. o.) zeigen, daß die hier isolierten Nukleinsäuren (sld1) für eine Sphingolipid-Desaturase codieren, die zur Bildung folgender cis (Z)- und trans (E)-delta-8-ungesättigter Basen aus D-erythro-2-Amino-1,3-dihydroxy-octadecan (Sphinganin, d18 : 0), das zum größten Teil außerdem noch delta-4-desaturiert bzw. -hydroxyliert wird, in Pflanzen führt:

• - D-erythro-2-Amino-1,3-dihydroxy-8-octadecen (8-Sphingenin, d18 : 1⁸)
• - D-erythro-2-Amino-1,3-dihydroxy-4(E),8-octadecadien(4t,8-Sphingadienin, d18 : 1^4t,8)
• - D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-8-octadecen (8-Phytosphingenin, t18 : 1⁸)

Die Expression der pflanzlichen sld1-Nukleinsäuren aus Arabidopsis thaliana und Brassica napus in der Hefe Saccharomyces cerevisiae führt zur Produktion neuartiger cis (Z)- und trans (E)-ungesättigter Basen in diesem Organismus:

• - D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-8-octadecen (8-Phytosphingenin, t18 : 1⁸)
• - D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-9-octadecen (9-Phytosphingenin, t18 : 1⁹)

Die Desaturierung von D-erythro-2-Amino-1,3-dihydroxy-octadecan (Sphinganin, d18 : 0) und anschließende delta-4-Hydroxylierung (Haak et al. (1997), s. o.) führt in den transgenen Hefen zum pflanzentypischen 8-Phytosphingenin, während hier auch die Desaturierung des delta-4-hydroxylierten D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy­ octadecans (Phytosphinganin, t18 : 0) möglich ist und so zur Bildung des, in der Natur nicht vorkommenden, 9-Phytosphingenins führt. Daraus folgt, daß das pflanzliche Enzym die neue Doppelbindung im Abstand Δ-6 zu dem letzten Sauerstoff­ aktivierten C-Atom der LCB (Hydroxygruppe an C3 des Sphinganins bzw. an C4 des Phytosphinganins) einführt (Abb. 14).

Transgene T2-Pflanzen, die mit pBIB5Bn, pBIB5At bzw. pBI121 transformiert worden waren, wiesen das unveränderte Fettsäuremuster des Wildtyps auf, der keine γ- Linolensäure und damit auch keine delta-6-Desaturase-Aktivität aufweist (Lemieux et al. (1990), s. o.). Wie für die transgenen Pflanzen unter Beispiel 8. beschrieben, wurden Gesamtfettsäure-Analysen von induzierten Hefezellen durchgeführt, die mit pYES2Bn, pYES2At oder pYES2 transformiert worden waren (siehe Beispiel 3). Die Analysen der drei Kulturen zeigten das mit dem Wildtyp identische Fettsäuremuster, wodurch eine delta-12-Desaturierung zu Hexadecadien- und Linolsäure ausgeschlossen werden konnte. Transformierte und Wildtyphefen, die exogen applizierte 9,12-Linolsäure in ihre Glycerolipide inkorporieren, zeigten keine delta- 15- oder delta-6-Desaturase-Aktivität, die zur Bildung von α- bzw. γ-Linolensäure geführt hätte (Girke et al., "Identification of a novel Δ6-acyl-lipid-desaturase by targeted gene disruption in Physcomitrella patens", Plant J, in press). Die hier identifizierte Sphingolipid-Desaturase unterscheidet sich eindeutig von einer delta-6- cis-Glycerolipid-Desaturase, hinsichtlich ihrer Regio-, Stereo- und Substratspezifität.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (31)

1. Sphingolipid-Desaturase die selektiv eine Doppelbindung in die Sphingobase des Ceramidrestes von Sphingolipiden und von Capnoiden einführt.

2. Sphingolipid-Desaturase gemäß Anspruch 1, die eine Doppelbindung in Position C₆-C₇ nach dem letzten sauerstoffaktivierten Kohlenstoffatom (C₁) der Sphingobase einführt.

3. Sphingolipid-Desaturase gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Aminosäuresequenz der Desaturase eines oder mehrere der Fragmente a)-c) umfaßt:

• a) HD[A,S]GH,
• b) HNAHH und
• c) QLEHH.

4. Sphingolipid-Desaturase gemäß Anspruch 3, wobei die Aminosäuresequenz der Desaturase eine oder mehrere der Fragmente c)-e) umfaßt:

• a) QLEHH
• b) AYX_aX_bHD[A,S]GH, wobei X_a und X_b beliebige Aminosäurereste sind, und
• c) THNAHH.

5. Sphingolipid-Desaturase gemäß Anspruch 4, wobei das Fragment d) die Aminosäuresequenz AYX_aGHDAGH aufweist, worin X_a ein beliebiger Aminosäurerest ist.

6. Sphingolipid-Desaturase gemäß Anspruch 3, 4 oder 5, wobei die Aminosäuresequenz der Desaturase alle drei Fragmente a)-c) oder c)-e) umfaßt.

7. Sphingolipid-Desaturase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Aminosäuresequenz der Desaturase weiterhin die Aminosäuresequenz AWWKWT und/oder FGGLQF umfaßt.

8. Sphingolipid-Desaturase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Desaturase eine der in Fig. 2 oder 4 gezeigten Aminosäuresequenzen umfaßt.

9. DNA-Sequenz, die für eine Sphingolipid-Desaturase gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 codiert.

10. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 9, die aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus erhältlich ist.

11. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 9 oder 10, die die in Fig. 1 oder 3 gezeigten Nukleotidsequenzen umfaßt.

12. Vektor umfassend eine DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11.

13. Vektor gemäß Anspruch 12, in dem die DNA-Sequenz mit einem Promotor und optional mit einem Terminationssignal funktional verknüpft ist.

14. Zelle, die mit einem Vektor gemäß Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.

15. Zelle gemäß Anspruch 14, die eine Pflanzen-, Pilz-, Bakterien- oder Tierzelle ist.

16. Transgener Organismus, der

• a) eine DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11 umfaßt,
• b) einen Vektor gemäß Anspruch 12 oder 13 umfaßt und/oder
• c) aus einer Zelle gemäß Anspruch 14 oder 15 generierbar ist.

17. Transgener Organismus gemäß Anspruch 16, der eine Pflanze, Pilz, Bakterium oder Tier ist.

18. Pflanze oder deren Nachkommschaft, die aus der Pflanzenzelle gemäß Anspruch 14 oder 15 generierbar ist.

19. Pflanze gemäß Anspruch 18, die eine Nutzpflanze ist.

20. Pflanze gemäß Anspruch 18 oder 19, die ein verändertes delta-8-Basenmuster in ihren Sphingolipiden aufweist.

21. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen die einen erhöhten oder reduzierten Anteil oder ein verändertes cis/trans-Verhältnis an delta-8-ungesättigten langkettigen Basen aufweisen, umfassend

• a) die Transformation einer Pflanzenzelle mit einer DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9-11 oder mit einem Vektor gemäß Anspruch 12 oder 13 und
• b) die Regeneration einer Pflanze mit verändertem delta-8-Basenmuster in ihren Sphingolipiden.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze ist.

23. Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 22, das

• a) zum Kompensieren eines Mangels an delta-8-ungesättigten langkettigen Basen in einem Organismus
• b) zum Ausschalten der Produktion an delta-8-ungesättigten Basen,
• c) zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserter Toleranz und Resistenz gegenüber Bodenversalzung und/oder Ionenstress bzw. -toxizität und/oder Trockenheit und/oder Feuchte und/oder Kälte bzw. Frost und pflanzenpathogenen Mikroorganismen und
• d) zur Herstellung von Pflanzen mit geändertem Größenwachstum und Blütezeit geeignet ist.

24. Verfahren zur Herstellung von Sphingolipiden und von Capnoiden mit ungesättigter Sphingobase, umfassend das Kultivieren von Zellen gemäß Anspruch 14 oder 15, von transgenen Organismus gemäß Anspruch 16 oder 17 oder von Pflanzen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 18 bis 21.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das hergestellte Sphingolipid oder Capnoid die Formel (I)
aufweist, worin
R¹ -OH, -OPO₃HR⁶, ein Kohlenhydratrest oder -SO₃H ist;
R² ein C₁-C₃₃-Alkylrest ist, der ein- oder mehrfach ungesättigt und/oder mit einem oder mehreren Hydroxylresten substituiert sein kann;
R³ und R⁵ unabhängig voneinander -H oder -OH sind, oder R³ und R⁵ zusammen eine trans-Doppelbindung bilden;
R⁴ -H oder ein C₁-C₁₅-Alkylrest ist, der ein- oder mehrfach ungesättigt und/oder mit einem oder mehreren Methylresten substituiert sein kann;
R⁵ -H, ein Polyhydroxyalkylrest, ein Aminoalkylrest oder ein Kohlenhydratrest ist;
und entweder a, b oder c eine Doppelbindung ist, wobei,

• a) wenn R³ und R⁵ -H sind, a eine Doppelbindung ist, und
• b) wenn R³ -OH ist und R⁵ -H ist, a oder b eine Doppelbindung ist.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei
R³ ein C₁₀-C₂₄-Alkylrest ist und
R⁴ ein C₃-C₁₂-Alkylrest ist.

27. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei das hergestellte Sphingolipid oder Capnoid die Formel (II)
aufweist, worin R¹, R², R³, a und b die in Anspruch 25 angegebene Bedeutung haben.

28. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei das hergestellte Sphingolipid oder Capnoid eine Sphingobase, ausgewählt aus:
D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-(8Z)-octadecen (t18 : 1^8c)
D-eryfhro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-(8E)-octadecen (t18 : 1^8t)
D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-(9Z)-octadecen (t18 : 1^9c)
D-erythro-2-Amino-1,3,4-trihydroxy-(9E)-octadecen (t18 : 1^9t),
enthält.

29. Sphingolipid oder Capnoid mit ungesättigter Sphingobase mit der Formel (I):
worin
R¹ -OH, -OPO₃HR⁶, ein Kohlenhydratrest oder -SO₃H ist;
R² ein C₁-C₃₃-Alkylrest ist, der ein- oder mehrfach ungesättigt und/oder mit einem oder mehreren Hydroxylresten substituiert sein kann;
R3 und R5 unabhängig voneinander -H oder -OH sind, oder R³ und R⁵ zusammen eine trans-Doppelbindung bilden;
R⁴ -H oder ein C₁-C₁₅-Alkylrest ist, der ein- oder mehrfach ungesättigt und/oder mit einem oder mehreren Methylresten substituiert sein kann;
R⁶ -H, ein Polyhydroxyalkylrest, ein Aminoalkylrest oder ein Kohlenhydratrest ist;
und entweder a, b oder c eine Doppelbindung ist, wobei,

• a) wenn R³ und R⁵ -H sind, a eine Doppelbindung ist,
• b) wenn R³ -OH ist und R⁵ -H ist, a oder b eine Doppelbindung ist, und
• c) wenn R⁴ ein C₇-, C₉- oder C₁₁-Alkylrest ist, a keine Doppelbindung ist, und Derivate derselben.

30. Sphingolipid oder Capnoid gemäß Anspruch 29 mit der Formel (III):
wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵, b und c die in Anspruch 29 angegebene Bedeutung haben.

31. Kosmetikum, Arznei- oder Nahrungsmittel oder chemischer Rohstoff, umfassend

• a) ein gemäß Anspruch 24 bis 28 hergestelltes Sphingolipid oder Capnoid oder
• b) ein Sphingolipid oder Capnoid gemäß Anspruch 29 oder 30.