DE69725841T2 - Neues pflanzenenzym und dessen verwendungen - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Pflanzenenzym. Konkreter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von acetylenischen Verbindungen, insbesondere acetylenischen Fettsäuren, eine cDNA, die für eine Pflanzenfettsäure-Acetylenase kodiert, die Verwendung dieser cDNA zur Transformation von öl-anreichernden Organismen zum Zwecke der Herstellung von acetylenischen Fettsäuren und solche öl-anreichernden Organismen an sich sowie Öle daraus.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Weltweit besteht beträchtliches Interesse an der Produktion chemischer Rohstofffe, wie z. B. Fettsäuren für die industrielle Verwendung, aus erneuerbaren Pflanzenresourcen statt aus nicht-erneuerbaren Petrochemikalien. Dieses Konzept ist aufgrund der Resourcenerhaltung für sowohl Hersteller als auch Verbraucher allgemein attraktiv und bietet darüber hinaus beträchtliche Möglichkeiten, neue industrielle Erntepflanzen für die Landwirtschaft zu entwickeln.
  • Es gibt eine enorme Vielfalt ungewöhnlicher Fettsäuren in Ölen aus wilden Pflanzenspezies, die gut charakterisiert wurden (siehe z. B. Badami & Patil, 1981). Viele dieser Säuren sind potentiell in der Industrie verwendbar. Dies führte zu einem Interesse an der Domestizierung relevanter Pflanzenspezies, um die landwirtschaftliche Produktion spezieller Fettsäuren zu ermöglichen. Jedoch macht es die Entwicklung der Gentechnik in Verbindung mit einem größeren Verständnis der Biosynthese ungewöhnlicher Fettsäuren nunmehr möglich, Gene, welche für Schlüsselenzyme, die an der Synthese einer speziellen Fettsäure von einer wilden Spezies beteiligt sind, kodieren, auf eine gewählte domestizierte Ölpflanze zu übertragen. Auf diese Weise können spezielle Fettsäuren in hoher Reinheit und hohen Mengen bei mäßigen Kosten hergestellt werden.
  • Eine Klasse von Fettsäuren von besonderem Interesse sind die acetylenischen Fettsäuren, bestehend aus einer Acylkette mit zwei benachbarten Kohlenstoffatomen, die durch eine acetylenische Bindung oder Dreifachbindung verknüpft sind. Aufgrund ihrer hohen Reaktivitäten könnten sie ideal zur Herstellung von Beschichtungen, Kunststoffen und Gleitmitteln geeignet sein. Durch Übertragung der Gene, die für die Bildung einer speziellen acetylenischen Säure verantwortlich sind, von einer wilden Spezies auf kommerzielle Ölpflanzen oder irgendeinen anderen öl-anreichernden Organismus, der leicht vermehrt werden kann, sollte es möglich sein, eine erneuerbare primäre Quelle dieses Öls, das acetylenische Fettsäuren enthält, für industrielle Anwendungen zu entwickeln.
  • Stand der Technik
  • Die Bildung von acetylenischen Bindungen in Fettsäuren in Moosen geschieht durch Subtraktion von Wasserstoffatomen von einer Doppelbindung (Kohn et al., 1994).
  • Crepis-Spezies haben Samenöle mit einem hohen Gehalt an acetylenischen Säuren (Badami & Patil, 1981; Hirsinger, 1991).
  • Lipids, Bd. 3, Nr. 4, 1968, S. 307, und Biochem. Biophys. Acta, Bd. 137, 1967, S. 391–392, offenbaren die Transformation von Oleat zu Crepeninsäure in Crepis rubra. Es wird explizit erwähnt, dass Linolsäure nicht in Crepeninsäure überführt wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Herstellung acetylenischer Fettsäuren aus transgenen öl-anreichernden Organismen bereit.
  • Die Erfinder haben ein Enzym (Acetylenase) charakterisiert, welches für die Bildung von 9-Octadecen-12-in-säure (Crepeninsäure) aus 9,12-Octadecandiensäure (Linolsäure) in Membranfraktionen aus sich entwickelnden Crepis alpina-Samen verantwortlich ist. Die Charakterisierung der Acetylenase aus Crepis alpina offenbarte, dass die Acetylenase sehr ähnliche biochemische Eigenschaften wie die nicht-häm-enthaltenden Monooxygenasen Oleat-Delta-12- und Linoleat-Delta-15 (Omega 3) -Desaturasen aufwies. Auf Grundlage der Annahme, dass die biochemischen Ähnlichkeiten, die zwischen der Acetylenase und den Linolsäure und Linolensäure produzierenden Enzymen (Delta-12- und Delta-15-Desaturasen) beobachtet wurden, auch mit einer Ähnlichkeit hinsichtlich der Primärsequenz dieser Proteine assoziiert sein würden, wurde eine Vollängen-cDNA (pCrepl), kodierend für eine mutmaßliche Acetylenase, aus Crepis alpina isoliert.
  • Zunächst wurden zwei Typen von cDNA-Fragmenten, erhalten durch Einsatz von PCR und Primern, welche durch Zuordnung von Proteinsequenzen von Delta-12-Desaturasen konstruiert worden waren, aus C. alpina charakterisiert. Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte, dass eines stark homolog zu allen anderen Pflanzen-Delta-12-Desaturasen des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der Rizinussamen-Hydroxylase war. Das andere charakterisierte cDNA-Fragment besaß eine Sequenz, welche homolog zu den ER-Delta-12-Desaturase-Sequenzen von Pflanzen war, jedoch nicht nur in einer Anzahl nicht-konservierter Aminosäurereste abwich, sondern auch in einer Anzahl von Aminosäureresten, welche bei allen Delta-12-ER-Desaturasen hoch konserviert waren. Unter Einsatz von Northernblot-Analyse wurde festgestellt, dass das für diese cDNA kodierende Gen (pCrepl) beim Vergleich zur Expression in Blattgewebe nur in samenspezifischer Weise stark exprimiert wurde. Diese Befunde zusammengenommen und eine Betrachtung der einmaligen biochemischen Natur einer Zelle in einem Ölsamen lieferten starke Indizien dafür, dass die aus C. alpina isolierte cDNA (pCrepl) für ein Enzym kodiert, welches für die Überführung von Linolsäure in Crepeninsäure verantwortlich ist.
  • Schließlich wurde ein schlüssiger Beweis dafür, dass die cDNA, pCrepl, aus C. alpina für ein Pflanzen-Acetylenase-Enzym kodierte, durch die Expression dieses Gens in Hefe erhalten. Die Expression dieses Gens in Verbindung mit der Zugabe von Linolsäure bei der Kultivierung dieser Hefe führte zur Bildung einer Delta-12-Acetylensäure, 9-Octadecen-12-in-säure (Crepeninsäure), wie bestätigt durch massenspektroskopische Analyse von extrahierten Hefefettsäuren.
  • Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von acetylenischen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass Linolsäure durch Crepis alpina-Delta-12-acetylenase in Crepeninsäure (9-Octadecen-12-in-säure) überführt wird.
  • In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine cDNA, welche für eine Fettsäure-Acetylenase, wie z. B. Crepis alpina-Delta-12-acetylenase gemäß der Aminosäuresequenz von Sequenzverzeichnis 2, kodiert.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen cDNA zur Transformation von Organismen, welche aus der Gruppe, die aus eine acetylenische Verbindung anreichernden Organismen bzw. öl-anreichernden Organismen besteht, ausgewählt sind.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung mit einer Acetylenase-cDNA wie oben beschrieben transformierte Organismen, welche aus der Gruppe, die aus eine acetylenische Verbindung oder Öl anreichernden Organismen besteht, ausgewählt sind, wobei Beispiele der letzteren Ölpflanzen, ölhaltige Hefen und Schleimpilze sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Transformation von öl-anreichernden Organismen mit der genannten isolierten cDNA aus einer Crepis alpina-Samen-cDNA-Bank zum Zwecke der Herstellung von acetylenischen Fettsäuren und insbesondere 9-Octadecen-12-in-säure (Crepeninsäure).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • C. alpina-Samenöl ist reich an Crepeninsäure [9-Octadecen-12-in-säure (Hirsinger, 1989)]. Die Erfinder untersuchten die Biosynthese von Crepeninsäure in C. alpina-Samen. Die Vrsorgung von intakten, sich entwickelnden Cotyledonen von C. alpina-Samen mit exogenen 1-14C-markierten freien Fettsäuren demonstrierte, dass Linoleat ein Vorläufer von Crepeninsäure ist. Dies steht im Gegensatz zu früher veröffentlichten Ergebnissen für die Biosynthese von Crepeninsäure in Crepis rubra (Haigh & James, 1967). Obwohl gezeigt wurde, dass die Reaktion der Acetylensäurebildung in Moosen ein Desaturierungsprozess ist (Kohn et al., 1994), können solche Desaturierungsprozesse von einer Vielfalt verschiedener, nicht-verwandter Typen von Pflanzenenzymen, wie z. B. Phytoen-Desaturasen (Wieland et al., 1994) oder nicht-häm-enthaltenden Proteinen, bewirkt werden, wobei die letzteren eine Klasse von Enzymen sind, von denen einige sehr geringe Aminosäuresequenzhomologien mit Ausnahme von drei konservierten Histidin-Motiven zeigen (Shanklin et al., 1994). Es wurde postuliert, dass die Biosynthese von acetylenischen Fettsäuren über eine Folge von Zwischenprodukten geschieht, welche durch separate enzymatische Reaktionen katalysiert werden. Beispielsweise wurde angenommen, dass acetylenische Bindungen als Seitenweg der Synthese einer gesättigten Fettsäure gebildet werden (Diedrich & Henschel, 1991) oder über eine Epoxygenierung einer Doppelbindung mit anschließender Überführung in ein Diol, das wiederum in zwei Schritten dehydriert wird, um eine acetylenische Bindung zu bilden (Van de Loo et al., 1993). In Anbetracht dieser widersprechenden Alternativen war die Natur eines Acetylenase-Enzyms und dessen Wirkungsmechanismus zum Zeitpunkt der prioritätsbegründenden Patentanmeldung SE 9601236-4 keineswegs bekannt oder offensichtlich.
  • Das Enzym, welches gemäß dieser Erfindung für die Synthese von Crepeninsäure verantwortlich ist (als Delta-12-Acetylenase bezeichnet), wurde von den Erfindern befunden, nur in (mikrosomalen) Membranfraktionen aktiv zu bleiben, welche aus sich entwickelnden Samen von Crepis alpina hergestellt wurden, vorausgesetzt, dass der Homogenisierungspuffer NRDH oder NADPH, Catalase und freies Coenzym A enthält. Die Charakterisierung der mikrosomalen Acetylenase und deren Vergleich mit der Delta-12-Desaturase (verantwortlich für die Desaturierung von Oleat zu Linoleat) offenbarte, dass diese Enzyme sehr ähnliche Eigenschaften hatten. Beide Enzyme benötigten O2 und NRDH oder NADPH; wobei beide Coreduktionsmittel gleichermaßen gut mit beiden Enzymen funktionierten. Cyanid (CN–) und Antikörper gegen Blumenkohl-Cytochrom-b5 inhibierten beide dieser Enzyme, wohingegen Kohlenmonoxid keine signifikante Wirkung auf eine dieser Enzymaktivitäten besaß. Diese Daten legten nahe, dass beide Enzyme biochemisch ähnlich waren. Die Oleat-Delta-12-Hydroxylase aus Rizinussamen wurde ebenfalls befunden, ähnliche biochemische Eigenschaften wie die Delta-12-Desaturase aufzuweisen, obwohl sie eine unterschiedliche Reaktion katalysierte (Bafor et al., 1991, Smith et al., 1992). Es wurde später gezeigt, dass das Rizinussamen-Delta-12-Hydroxylase-Gen eine signifikante Sequenzhomologie zu den ER-Delta-12-Desaturase-Genen (FAD2-Genen) aufweist (Van de Loo et al., 1995). Nachdem die Delta-12-Acetylenase wie die Delta-12-Desaturase (FAD2) eine Dehydrierung zwischen den Kohlenstoffen 12 und 13 einer Acylkette katalysiert und wie die Delta-15-Desaturase (FAD3) Linolsäure als Substrat nutzte, rechneten die Erfinder mit der Möglichkeit, dass das Acetylenase-Gen einige Sequenzhomologie zu den FAD2- und/oder den FAD3-Genen haben könnte.
  • Die Erfindung wird nun im folgenden unter Bezug auf die Begleitzeichnungen und einen experimentellen Teil näher beschrieben werden.
  • Die Zeichnungen zeigen:
  • 1. Restriktionskarte von pCrepl
  • 2. Restriktionskarte von pVT-Creel
  • 3. Überlagerte Einzelionenchromatogramme der Ionen 333, 365, 367 von FADEA, hergestellt aus den Gesamtfettsäuren, die aus dem mit pVT-Crepl transformierten Hefestamm YN94-1 extrahiert wurden. Die Buchstaben bezeichnen Peaks, welche die folgenden Diethylamid-Derivate von Fettsäuren repräsentieren: A, Eicosansäure; B, Eicosaensäure; C, 9-Octadecen-12-in-säure.
  • 4. Überlagerte Einzelionenchromatogramme der Ionen 333, 365, 367 von FADEA, hergestellt aus den Gesamtfettsäuren, die aus dem mit dem leeren Vektor (pVT100U; Kontrolle) transformierten Hefestamm YN94-1 extrahiert wurden. Die Buchstaben bezeichnen Peaks, welche die folgenden Diethylamid-Derivate von Fettsäuren repräsentieren: A, Eicosansäure; B, Eicosaensäure.
  • 5. Ein Gesamtionenchromatogramm von FADEA, hergestellt aus Fettsäuren, die hinsichtlich der mutmaßlichen 9-Octadecen-12-in-säure angereichert waren, aus Lipidextrakten von mit pVT-Crepl transformiertem YN94-1. Die Buchstaben bezeichnen Peaks, welche die folgenden Diethylamid-Derivate von Fettsäuren repräsentieren: A, Hexadecansäure; B, Octadecansäure; C, Octadeca-9,12-dien-säure; D, 9-Octadecen-12-in-säure.
  • 6. Massenspektrum der Verbindung, welche Peak D in 5 entspricht.
  • Experimenteller Teil
  • Klonierung eines mutmaßlichen Acetylenase-Gens
  • Eine Zuordnung der Aminosäuresequenzen von verschiedenen Spezies zeigte, dass die membrangebundenen Fettsäure-Desaturasen entsprechend der Homologie ihres mutmaßlichen reifen Proteins in drei unterschiedliche Gruppen eingeteilt werden konnten (Plastid-Delta-12-Desaturasen, ER-Delta-12-Desaturasen und Delta-15-Desaturasen; siehe Sequenzverzeichnis 1). Die Rizinussamen-Hydroxylase (Van de Loo et al., 1995) zeigte eine hohe Homologie mit den ER-Delta-12-Desaturasen bis einem Ausmaß, dass sie nicht leicht von diesen Sequenzen unterscheidbar war. Ferner zeigten die Sequenzen aller drei Klassen von Enzymen einen gewissen Grad an Sequenzhomologie zueinander.
  • Auf Grundlage dieser Zuordnung wurden Oligonukleotid-Primer für diese drei Gruppen von Sequenzen und für einen Consensus aller dieser Sequenzen konstruiert und synthetisiert. Die Sequenzen dieser Primer sind im folgenden angegeben.
    • (i) Consensus-Primer (Primer, die für einen Consensus von allen drei Gruppen von membrangebundenen Desaturasen und der Rizinussamen-Fettsäurehydroxylase konstruiert wurden): Sense ist GSN CAY GAN TGY GSN CAY Antisense ist RAN ADR TGR TGN RBN AYR TG.
    • (ii) Plastid-Delta-12-Desaturase-Primer: Sense ist TGG MGN TTY AAR CAY GAY MG Antisense ist GTN SWC ATC CAR AAR TGR TA.
    • (iii) ER-Delta-12-Desaturase-Primer, einschließlich der Rizinussamen-Fettsäurehydroxylase: Sense ist CAY GAR TGY GGN CAY CAY GC Antisense ist CCN CKN ARC CAR TCC CAY TC.
    • (iv) Delta-15-Desaturase-Primer: Sense ist ACN CAY CAY CAR AAY CAY GG Antisense ist CAY TGY TTN CCN CKR TAC CA.
  • Poly-A+-RNA wurde aus sich entwickelnden Samen (100 mg) von C. alpina unter Einsatz eines QuickPrep Micro-mRNA-Reinigungskits von Pharmacia Biotech isoliert. Die gesamte Poly-A+-RNA aus dieser Reinigung wurde gefällt und zur Synthese der cDNA des ersten Stranges verwendet, welche mit sowohl Oligo-dT als auch statistischen Hexameren geprimt und mit reverser Superscript II-Transkriptase von Gibco BRL synthetisiert wurde. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde dann mit den beschriebenen Primern und dieser cDNA eingesetzt, um Produkte unter den folgenden Zyklisierungsbedingungen zu amplifizieren: 1 Zyklus von 94°C für 2 Min., 30 Zyklen von (94°C, 30 Sek.; 50°C, 30 Sek.; 72°C, 30 Sek.) und schließlich ein Zyklus von 72°C für 5 Min.
  • Es wurden Produkte für alle verwendeten Primer erhalten; besonders bemerkenswert war, dass die Primer für die ER-Delta-12-Desaturasen signifikant mehr Produkt als die anderen verwendeten Primer ergaben. Die Größen der PCR-Produkte von den Delta-12- und Delta-15-Primern entsprachen den erwarteten Größen.
  • Die PCR-Produkte, welche durch Amplifizierung mit den ER-Delta-12-Primern und Delta-15-Primern erhalten worden waren, wurden mit T4- und Klenow-Polymerasen glattendig gemacht und in die EcoRV-Stelle des Plasmidvektors Bluescript kloniert. Eine DNA-Sequenzierung einer Anzahl der Klone offenbarte, dass mindestens drei verschiedene Sequenzen bei Verwendung dieser beiden Sets von Primern amplifiziert worden waren: (i) eine hoch konservierte Delta-15-Desaturase-Sequenz, (ii) eine hoch konservierte ER-Delta-12-Sequenz und (iii) eine Sequenz (D12V), welche Homologie zu den ER-Delta-12-Sequenzen besaß, aber deutliche Unterschiede sogar bei einigen Aminosäureresten zeigte, die bei allen anderen Desaturase-Sequenzen hoch konserviert waren.
  • Die Analyse der Fettsäuren von C. alpina hatte darauf hingewiesen, dass die Crepeninsäure wahrscheinlich nur in Samen vorhanden war. Eine Northernblot-Analyse mit hoher Stringenz zeigte an, dass die mRNA von der oben beschriebenen D12V-Sequenz stark in Samen, nicht jedoch in Blättern, exprimiert wurde, was mit der Beobachtung in Einklang steht, dass Crepeninsäure nur in Samen beobachtet wurde.
  • Eine cDNA-Bank wurde aus sich entwickelnden Samen von C. alpina unter Verwendung eines Uni-ZAP XR-Klonierungskits für cDNA von Stratagene erstellt und mit der statistisch markierten D12V-Sequenz gescreent. Anhand dieses Screenings wurde abgeschätzt, dass für die D12V-Sequenzen kodierende cDNAs sehr häufig vorkamen, was zusätzlich das hohe Expressionsniveau dieses Gens unterstrich. Nach der Isolierung einzelner hybridisierender Lambda-Plaques wurde das pBluescript-Phagemid unter Verwendung des ExAssist/SOLR-Systems von Stratagene ausgeschnitten. Damit erhaltene Phagemide wurden anschließend eingesetzt, um doppelsträngiges DNA-Plasmid herzustellen. Aus diesen Kolonien wurde ein Vollängen-Klon (pCrepl, siehe 1) mit Hilfe von DNA-Sequenzierung und Restriktionskartierung von isoliertem Plasmid isoliert. Das Insert aus pCrepl, ein 1,5-kb-Insert, das in dem Vektor pBluescript SK enthalten war, wurde sequenziert und davon ein offener Leserahmen abgeleitet, der für ein 375 Aminosäuren langes Protein kodierte (Sequenzverzeichnis 2). Die Analyse dieser Proteinsequenz offenbarte etwa 60% Identität und 80 Ähnlichkeit mit anderen Pflanzen-Delta-12-Desaturase-Proteinen und zeigte merkliche Hoomologieunterschiede, wobei bestimmte Reste, welche bei allen anderen Desaturasen konserviert waren, nicht in dieser Sequenz vorlagen (siehe Sequenzverzeichnis 1). Es waren drei Histidin-Motive vorhanden, von denen gezeigt worden war, dass sie bei einer Reihe von nicht-häm-enthaltenden Monooxygenasen, welche Hydroxylierungs- und Desa turierungsreaktionen katalysieren, konserviert sind (Shanklin et al., 1994).
  • Expression der pCrep-cDNA und Nachweis von Crepeninsäure in transgener Hefe
  • Der offene Leserahmen von pCrepl wurde aus pCrepl auf einem SmaI/XhoI-Restriktionsfragment freigesetzt und der offene Crep1-Leserahmen von 1,5 kb durch Gelreinigung gewonnen (Langridge et al., 1980). pVT100-U-DNA (Vernet et al., 1987) wurde mittels PvuII und XhoI verdaut. 50 ng PvuII/XhoI-linearisiertes pVT100 wurde mit 100 ng 1,5-kb-SmaI/XhoI-Fragment, entsprechend dem offenen Leserahmen von Crep1, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (NBL Genen Science Ltd., UK) ligiert. Ein Teil der Ligierungsmischung wurde zur Transformation kompetenter E. coli-DHa-Zellen verwendet. Ein Klon (pVT-Crepl), welcher das erwartete 1,5-kb-Insert enthielt, wurde ausgewählt und das Konstrukt durch Verdauung mit EcoRI oder HindIII + XbaI überprüft. Beide Verdauungen ergaben die erwarteten Produkte (etwa 5, 3, 2, 3 und 0,8 kb für den EcoRI-Verdau und Freisetzung des offenen Leserahmens von 1,5 kb mit dem HindIII + XbaI-Verdau). pVT-Crep1-DNA (siehe 2) oder leerer Vektor pVT100U wurden zur Transformation der Saccharomyces cerevisiae-Stämme YN94-1 und C13-ABYS86 unter Anwendung des PLATE-Verfahrens von Elble (1992) eingesetzt. Übernacht-Hefetransformanten wurden auf SCD-Minus-Uracil-Agar ausgebreitet und Einzelkolonien auf frische selektive (Uracil-minus)-Platten ausgestrichen.
  • Die YN94-1 und C13-ABYS86-Stämme von Hefe, welche mit pVT-Crep1-DNA und mit leerem Vektor (pVT100U; Kontrolle) transformiert waren, wurden in Schüttelkulturen bei 28°C fünf Stunden lang in selektivem Medium (ohne Uracil; 400 ml) kultiviert, wonach 40 ml Kultivierungsmedium, enthaltend Linolsäure in Tween 40® dispergiert, der Kultur zugegeben wurden, um eine Endkonzentration von 0,03% Linolsäure und 1 Tween 40® (Gew./Gew.) zu ergeben. Nach Kultivierung für weitere 78 h bei 28°C wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und mittels Dispersion in 20 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,8, enthaltend 1% Tween 40®, gewaschen und erneut durch Zentrifugation pelletiert. Die Zellen wurden durch Resuspension in 20 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,8, weiter gewaschen und erneut pelletiert. Die Zellen wurden danach in einer Mischung von Chloroform/Methanol/0,15 M Essigsäure (1 : 2 : 0,8 nach Volumen) in einem Braun MSK-Glasperlen-Zellhomogenisator (B. Braun Biotech International, Melsungen, Deutschland) mit 4000 UpM 20 Sek. lang extrahiert. Die Hefelipide wurden aus der Mischung durch Zugabe von Chloroform und 0,15 M Essigsäure, um Endverhältnisse von 1 : 1 : 0,9 (nach Volumen) von Chloroform, Methanol und 0,15 M Essigsäure zu ergeben, in eine Chloroformphase extrahiert. Nach Zentrifugation der Mischung wurde die Lipid enthaltende Chloroformphase entfernt und unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockne eingedampft.
  • Die lipophilen Reste wurden mit methanolischer HCl (4 Gew./Gew.) bei 85°C für 45 Min. methyliert, wonach die Fettsäure-Methylester in n-Hexan extrahiert wurden. Gas-Flüssigkeit (GC)-Chromatogramme der Methylester, die auf einer Glassäule (2,5 m × 3 mm Innendurchmesser), enthaltend 3% SP-2300 auf einem Supelcoport 100/120-Sieb (Supelco, Bellefonte, P., USA), aufgetrennt worden waren, offenbarten einen Peak mit derselben Retentionszeit wie authentischer 9-Octadecen-12-in-säure-methylester, der bis zu 0,3% der Gesamtpeakflächen in Proben ausmachte, die aus mit pVT-Creel transformierter Hefe hergestellt wurden, jedoch nicht in Proben, die aus Hefe, welche mit leerem Vektor (pVT100U; Kontrolle) transformiert worden war, hergestellt wurden.
  • Nachdem Acetylenfettsäure-Methylester teilweise von anderen Fettsäure-Methylestern durch Silicagel-Dünnschichtchromatographie abgetrennt werden können, wurden die Methylester, die aus mit pVT-Creel transformiertem YN94-1 hergestellt worden waren, auf Silicagel-60-Dünnschichtchromatographieplatten (Merck, Darmstadt, Deutschland) durch Entwicklung der Platte in Hexan/Diethylether/Essigsäure (85 : 15 : 1 nach Volumen) aufgetrennt. Ein Areal, das gerade unterhalb dem hauptsächlichen Methylesterareal lag, wurde von der Platte entfernt und die Lipide wurden mit Methanol/Chloroform (2 : 1) eluiert und durch Gas-Flüssigkeit-Chromatographie analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Fraktion aus Fettsäure-Methylestern bestand, wobei der Peak mit derselben Retentionszeit wie 9-Octadecen-12-in-säure-methylester 12,5% der gesamten Peakfläche ausmachte.
  • Die Methylesterfraktion, die hinsichtlich des mutmaßlichen 9-Octadecen-12-in-säure-methylesters angereichert war, sowie die gesamten Fettsäure-Methylester, die aus mit pVT-Crepl transformiertem YN94-1 und mit leerem Vektor (pVTl00U; Kontrolle) transformiertem YN94-1 hergestellt worden waren, wurden in 2,5 M KOH in wässrigem Methanol (15% Methanol, nach Volumen) bei 90°C eine Stunde lang hydrolysiert. Die freien Fettsäuren wurden nach Ansäuerung mit HCl in Hexan extrahiert und die Hexanphase wurde unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockne eingedampft.
  • Fettsäurediethylamide (FADEA) wurden aus den freien Fettsäuren nach Nilsson und Liljenberg (1991) hergestellt. Die FADEA wurden entweder direkt in einen Gas-Flüssigkeit-Chromato graphen eingespritzt, der mit einem Massenspektrometer gekoppelt war (GC-MS), oder einer weiteren Reinigung mittels Silicagel-Dünnschichtchromatographie durch Entwicklung der Platte in Heptan/Diethylether/Essigsäure (50 : 50 : 1, nach Volumen) unterworfen.
  • Die FADEA wurden auf einem Hewlett-Packard 5890 II-Gaschromatographen analysiert, der mit einer DB225-Säule (0,25 mm Innendurchmesser × 30 m, J&W, Folsom, USA) in Reihe mit einer Rtx 2330 (Restek Corp., PA, USA) Kieselglaskapillarsäule, gekoppelt mit einem Hewlett-Packard 5989A-Massenspektrometer, der im Elektronenstoßmodus bei 70 eV arbeitete, ausgerüstet war. Die Einspritztechnik war kalt und ungeteilt bei 100°C und dann wurde die Temperatur so schnell wie möglich auf 240°C erhöht.
  • Die Ofentemperatur betrug 100°C für 7 Min., dann 20°C pro Minute bis 190°C und dann 1°C pro Minute bis zu einer Endtemperatur von 225°C, wo sie weitere 20 Min. lang gehalten wurde. Die Doppelbindungspositionen wurden gemäß Nilsson und Liljenberg (1991) bestimmt.
  • Einzelionenchromatogramme von Massen, welche dem Molekülion von FADEA, hergestellt von den Gesamtfettsäuren aus mit pVT-Crep1 transformiertem YN94-1 und aus mit leerem Vektor (pVT100U; Kontrolle) transformiertem YN94-1, entsprachen, sind in 5 bzw. 6 gezeigt. Das Chromatogramm von FADER von mit pVT-Crepl transformiertem YN94-1 zeigte einen Peak der Masse 333 (entsprechend dem Molekulargewicht von 9-Octadecen-12-in-säure-diethylamid), welcher bei dem Chromatogramm von FADER von mit leerem Vektor (pVT100U; Kontrolle) transformiertem YN94-1 fehlte. Der Peak wies eine Retentionszeit von 57,3 Min. auf und befand sich zwischen den Peaks, die den Eicosan- und Eicosaen-FADEA-Derivaten entsprachen.
  • Ein Gesamtionenchromatogramm von FADEA, erstellt von Fettsäuren, die hinsichtlich der mutmaßlichen 9-Octadecen-12-in-säure durch Dünnschichtchromatographie (wie oben beschrieben) angereichert waren, aus Lipid-Extrakten von mit pVT-Crepl transformiertem YN94-1 ist in 5 gezeigt. Das Massenspektrum (6) des mutmaßlichen 9-Octadecen-12-in-säure-diethylamid-Derivats (Peak D in 5) zeigte eine Lücke in der Masse von 26 atomaren Masseeinheiten anstatt regulär 28 zwischen Kohlenstoff 7 und 9, was eine Doppelbindung bei Position 9 anzeigte. Ferner gab es eine Lücke von 24 atomaren Masseeinheiten anstelle von regulär 28 zwischen Kohlenstoffatom 10 und 12, was eine acetylenische Bindung an Position 12 anzeigte. Der Peak D ergab ein Massenspektrum, das mit dem von authentischem 9-Octadecen-12-in-säure-diethylamid, hergestellt aus Ölen von Crepis alpina-Samen, identisch war. Somit wurde der Peak D in dem Chromatogramm in 5 eindeutig als 9-Octadecen-12-in-säure-diethylamid-Derivat identifiziert. Nachdem die Verbindung in Hefestämmen fehlte, die nicht mit der Crep1-cDNA transformiert worden waren, ist es klar, dass die Crep1-cDNA für eine Delta-12-Fettsäure-Acetylenase kodiert.
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  • INFORMATION ZU SEQUENZVERZEICHNIS Nr. 1
  • Zuordnung von Aminosäuresequenzen von Delta-12-ER- und Plastid-Desaturasen, Delta-15-Desaturasen und von der Rizinussamen-Hydroxylase. Ebenfalls in dieser Zuordnung eingeschlossen ist die von pCrepl abgeleitete Proteinsequenz (crepis). Unterstrichen sind drei Histidin-Motive, die in nicht-hämenthaltenden Monooxygenasen konserviert sind.
  • Bei dieser Zuordnung zusammen mit ihren Hinterlegungsnummern angegebene Sequenzen sind:
    bnom6des.seq, Delta-12-Desaturase von Brassica napus (L29214);
    gmom6des.seq, Delta-12-Desaturase von Glycine max (L29215);
    atom3des.seq, Delta-15-Desaturase von Arabidopsis thaliana (L22961);
    bnom3des.seq, Delta-15 von Brassica napus (L22963);
    rcom3des.seq, Delta-15-Desaturase von Ricinus communis (L25897);
    siom3des.seq, Delta-15-Desaturase von Orientalischem Sesam (U25817);
    ldd15des.seq, Delta-15-Desaturase von Limnanthes douglasii (U17063);
    gsom3des, Delta-15-Desaturase von Glycine max (L22965);
    atom3bdes.seq, Delta-15-Desaturase von Arabidopsis thaliana (D17579);
    bnom31des.seq, Delta-15 von Brassica napus (L22962);
    gsom3bdes.seq Delta-15-Desaturase von Glycine max (L22964);
    atd12des.seq, Delta-12-Desaturase von Arabidopsis thaliana (L26296);
    gmom6bdes.seq Delta-12-Desaturase von Glycine max (L43921);
    scom12des.seq, Delta-12-Desaturase von S. commersonii (X92847);
    gmom6ades.seq, Delta-12-Desaturase von Glycine max (L43920);
    rchyd.seq, Oleat-12-Hydroxylase von Ricinus communis (U22378); crepis, Crepis alpina-Acetylenase dieses Dokuments.
  • SEQUENZVERZEICHNIS 1
    Figure 00200001
  • SEQUENZVERZEICHNIS 1 (FORTS.)
    Figure 00210001
  • SEQUENZVERZEICHNIS 1 (FORTS.)
    Figure 00220001
  • SEQUENZVERZEICHNIS 1 (FORTS.)
    Figure 00230001
  • SEQUENZVERZEICHNIS 2 Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens des Plasmids pCrepl.
    Figure 00240001

Claims (6)

  1. Verfahren zur Herstellung von acetylenischen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß Linolsäure durch Crepis alpina-Delta-12-Acetylenase (EC-Nr. 1.14.99.33) gemäß der Aminosäuresequenz von Sequenzverzeichnis 2 in Crepeninsäure (9-Octadecen-12-in-säure) überführt wird.
  2. cDNA-Sequenz, kodierend für Crepis alpina-Delta-12-Acetylenase, welche die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzverzeichnis 2 umfaßt.
  3. Verwendung einer cDNA-Sequenz nach Anspruch 2 zur Transformation von Organismen, welche aus der aus Ölpflanzen, ölhaltigen Hefen und Schleimpilzen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, worin die Organismen öl-anreichernde Organismen sind, welche aus der aus Ölpflanzen, ölhaltigen Hefen und Schleimpilzen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  5. Organismen mit Ausnahme von Menschen, welche mit einer Acetylenase-cDNA nach Anspruch 2 transformiert sind.
  6. Organismen nach Anspruch 5, welche öl-anreichernde Organismen sind, die aus der aus Ölpflanzen, ölhaltigen Hefen und Schleimpilzen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
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