CZ292780B6 - Způsob produkce acetylenových sloučenin, cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu a její použití a organismy transformované acetylenázovou cDNA - Google Patents
Způsob produkce acetylenových sloučenin, cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu a její použití a organismy transformované acetylenázovou cDNA Download PDFInfo
- Publication number
- CZ292780B6 CZ292780B6 CZ19983135A CZ313598A CZ292780B6 CZ 292780 B6 CZ292780 B6 CZ 292780B6 CZ 19983135 A CZ19983135 A CZ 19983135A CZ 313598 A CZ313598 A CZ 313598A CZ 292780 B6 CZ292780 B6 CZ 292780B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- acetylenase
- delta
- acid
- cdna
- Prior art date
Links
- 108010056748 acetylenase Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 239000002299 complementary DNA Chemical group 0.000 title claims abstract description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 10
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 title abstract description 4
- 241001250698 Crepis alpina Species 0.000 claims abstract description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 21
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 28
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 6
- SAOSKFBYQJLQOS-KTKRTIGZSA-N (9Z)-octadec-9-en-12-ynoic acid Chemical compound CCCCCC#CC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SAOSKFBYQJLQOS-KTKRTIGZSA-N 0.000 abstract 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 28
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 28
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 28
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 23
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000723221 Crepis Species 0.000 description 12
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 12
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 12
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 12
- 108010011713 delta-15 desaturase Proteins 0.000 description 11
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- SAOSKFBYQJLQOS-MDZDMXLPSA-N (e)-octadec-9-en-12-ynoic acid Chemical compound CCCCCC#CC\C=C\CCCCCCCC(O)=O SAOSKFBYQJLQOS-MDZDMXLPSA-N 0.000 description 10
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 10
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 9
- -1 acetylene fatty acids Chemical class 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 7
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical class CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 4
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 102220056331 rs730880069 Human genes 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 3
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 229940049918 linoleate Drugs 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- PBUBQZYMYOKABE-ZHACJKMWSA-N methyl (e)-octadec-9-en-12-ynoate Chemical compound CCCCCC#CC\C=C\CCCCCCCC(=O)OC PBUBQZYMYOKABE-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- BITHHVVYSMSWAG-KTKRTIGZSA-N (11Z)-icos-11-enoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCC(O)=O BITHHVVYSMSWAG-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XWDULLADLUEGPT-UHFFFAOYSA-N CCCCCC#CCC=CCCCCCCCC(=O)N(CC)CC Chemical class CCCCCC#CCC=CCCCCCCCC(=O)N(CC)CC XWDULLADLUEGPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 101150115493 FAD3 gene Proteins 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002066 eicosanoids Chemical class 0.000 description 2
- 229940108623 eicosenoic acid Drugs 0.000 description 2
- BITHHVVYSMSWAG-UHFFFAOYSA-N eicosenoic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCC(O)=O BITHHVVYSMSWAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-UHFFFAOYSA-N 9,12-Octadecadienoic Acid Chemical compound CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 0 CC*(C)*(C)C(*CN)C(*)**C(C)* Chemical compound CC*(C)*(C)C(*CN)C(*)**C(C)* 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N Carbon-12 Chemical compound [12C] OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000848267 Crepis alpina Delta(12) fatty acid dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000125469 Crepis rubra Species 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025287 Cytochrome b Human genes 0.000 description 1
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 description 1
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241001138417 Limnanthes douglasii Species 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102100028897 Stearoyl-CoA desaturase Human genes 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-YPZZEJLDSA-N carbon-10 atom Chemical compound [10C] OKTJSMMVPCPJKN-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- UZBQIPPOMKBLAS-UHFFFAOYSA-N diethylazanide Chemical compound CC[N-]CC UZBQIPPOMKBLAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- VJZWIFWPGRIJSN-NBTZWHCOSA-N octadeca-9,12-dienoic acid;(9z,12z)-octadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O.CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O VJZWIFWPGRIJSN-NBTZWHCOSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000003348 petrochemical agent Substances 0.000 description 1
- 108010018089 phosphatidylcholine 12-monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
- C12P7/6431—Linoleic acids [18:2[n-6]]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Je popsán způsob produkce acetylenových sloučenin, při kterém se kyselina linolová přemění na kyselinu krepeninovou pomocí delta 12 acetylenázy z Crepis alpina podle aminokyselinové sekvence ze seznamu sekvencí 2, cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu z Crepis alpina obsahující nukleotidovou sekvenci podle seznamu sekvencí 2, použití této sekvence pro transformování organismů, které jsou vybrány ze souboru skládajícího se z olejnatých plodin, oleogenních kvasinek a plísní a také organismy transformované touto acetylenázovou cDNA.ŕ
Description
Způsob produkce acetylenových sloučenin, cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu a její použití a organismy transformované acetylenázovou cDNA
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu produkce acetylenových sloučenin, cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu a jejího použití a organismů transformovaných acetylenázovou cDNA.
Dosavadní stav techniky
Ve světě je značný zájem o produkci chemických surovin, jako jsou mastné kyseliny, pro průmyslové použití z obnovitelných rostlinných zdrojů, spíše než z neobnovitelných petrochemikálií. Toto pojetí má značný význam jak pro výrobce, tak pro spotřebitele, vzhledem k zachování zdroje a kromě toho poskytuje významné možnosti pro vývoj nových industriálních plodin pro zemědělství.
Existuje značná rozmanitost neobvyklých mastných kyselin v olejích z přirozených druhů rostlin, které byly dobře charakterizovány (viz například Badami a Patil, 1981). Mnoho z těchto kyselin je potenciálně možno použít v průmyslu. Toto vedlo k zájmu o umožnění zemědělské produkce určitých mastných kyselin v domestikovaných odpovídajících druzích rostlin. Nicméně, rozvoj genového inženýrství v kombinaci s důkladnějším pochopením biosyntézy neobvyklých mastných kyselin nyní umožňuje provést genový přenos genů kódujících klíčové enzymy, které se účastní syntézy určité aminokyseliny z přirozených druhů, do vybrané domestikované plodiny s olejnatými semeny. Tímto způsobem mohou být produkovány specifické mastné kyseliny vysoké čistoty a množství za přijatelných nákladů.
Jednou třídou mastných kyselin, která je zejména zajímavá, jsou acetylenové mastné kyseliny, skládající se z acylového řetězce majícího dva sousední uhlíkové atomy navázané acetylenovou neboli trojnou vazbou. Vzhledem ke své vysoké reaktivitě mohou být ideálně vhodné pro produkci potahů, plastů a mazacích činidel. Přenosem genů odpovědných za produkci specifických acetylenových kyselin z přirozených druhů do komerčních druhů s olejnatými semeny, nebo do jakéhokoliv jiného organismu, který akumuluje oleje, který může být snadno množen, by mělo být možné vyvinout obnovitelný primární zdroj tohoto oleje obsahujícího acetylenové mastné kyseliny pro průmyslové použití.
Tvorba acetylenových vazeb v mastných kyselinách v různých druzích mechu probíhá pomocí odstranění vodíků z dvojné vazby (Kohn a kol., 1994).
Druhy Crepis mají olejnatá semena s vysokým obsahem acetylenových kyselin (Badami a Patil, 1981; Hirsinger, 1991).
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je způsob produkce acetylenových sloučenin, jehož podstata spočívá v tom, že kyselina linolová se přemění na kyselinu krepeninovou neboli kyselinu 9-oktadecen12-inovou pomocí delta 12 acetylenázy z Crepis alpina (EC číslo 1.14.99.33) podle aminokyselinové sekvence ze seznamu sekvencí 2.
Předmětem tohoto vynálezu také je cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu z Crepis alpina, obsahující nukleotidovou sekvenci podle seznamu sekvencí 2.
Předmětem tohoto vynálezu dále je použití cDNA sekvence uvedené výše pro transformování organismů, které jsou vybrány ze souboru skládajícího se z olejnatých plodin, oleogenních kvasinek a plísní. Výhodné použití spočívá vtom, že organismy jsou oleje akumulující organismy, které jsou vybrány ze souboru skládajícího se z olejnatých plodin, oleogenních kvasinek a plísní.
Předmětem tohoto vynálezu konečně jsou organismy transformované acetylenázovou cDNA popsanou výše. Podle výhodného provedení tohoto vynálezu organizmy jsou oleje akumulující organismy, vybrané ze souboru, skládajícího se z olejnatých plodin, oleogenních kvasinek a plísní.
Dále se uvádí podrobnější popis tohoto vynálezu v širších souvislostech.
Přítomný vynález je založen na novém způsobu produkce acetylenových mastných kyselin z transgenních organismů akumulujících oleje.
Původci charakterizovali enzym (acetylenázu), který je odpovědný za produkci 9-oktadecen-12inové kyseliny (dále též „krepeninová kyselina“) z 9,12-oktadekadienové kyseliny (kyselina linolová) v membránových frakcích z vyvíjejících se semen Crepis alpina. Charakterizace acetylenázy z Crepis alpina ukázala, že acetylenáza má velmi podobné biochemické vlastnosti jako non-hem obsahující monooxygenázy oleát delta 12 a linoleát delta 15 (omega 3) desaturázy. Na základě předpokladu, že biochemická podobnost pozorovaná mezi acetylenázou a enzymy produkujícími kyselinu linolovou a kyselinu linolenovou (delta 12 a delta 15 desaturázy) by mohla být také spojena s podobností v primární sekvenci kompletní cDNA těchto proteinů (pCrepl), kódující sekvenci kompletní cDNA těchto proteinů (pCrepl), kódující domnělou acetylenázu, byla izolována z Crepis alpina.
Nejprve byly z Crepis alpina charakterizovány dva typy cDNA fragmentů, získaných za použití PCR a primerů navržených za pomoci seřazení proteinových sekvencí delta 12 desaturáz. Analýza DNA sekvence ukázala, že je vysoce homologní ke všem jiným rostlinným endoplazmatickým retikulámím (ER) delta 12 desaturázám a hydroxyláze z ricinových bobů. Další charakterizovaný cDNA fragment měl sekvenci, která byla homologní k sekvenci rostlinné ER delta 12 desaturázy, ale byl odlišný nejen v počtu nekonzervovaných aminových zbytků, ale také v počtu aminokyselinových zbytků, které byly vysoce konzervované ve všech delta 12 ER desaturázách. Za použití Northem blot analýz genu kódujícího tuto cDNA (pCrepl) bylo zjištěno, že je vysoce exprivována specificky pouze v semenech, ve srovnání s expresí v tkáni listu. Tato zjištění dohromady a uvážení jedinečného biochemického charakteru buněk v semenech poskytují silný důkaz toho, že izolovaná cDNA (pCrepl) zC. alpina kóduje enzym odpovědný za konverzi kyseliny linolové na 9-oktadecen-12-inovou kyselinu, tedy „krepeninovou kyselinu“.
Nakonec, konečný důkaz, že cDNA, pCrepl, z C. alpina kóduje rostlinný enzym acetylenáza, byl získán expresí tohoto genu ve kvasinkách. Exprese tohoto genu spolu s přidáním kyseliny linolové do kultury těchto kvasinek vedla k produkci delta 12 acetylenové kyseliny, 9-oktadecen-12inové kyseliny („krepeninové kyseliny“), jak bylo potvrzeno analýzou extrahovaných kvasinkových mastných kyselin za použití analýzy hmotnostní spektrometrií.
Proto, v prvním aspektu, se předkládaný vynález týká způsobů pro produkci acetylenových sloučenin, ve kterých je dvojná vazba konvertována na acetylenovou vazbu acetylenázou.
Ve výhodném provedení způsobu jsou acetylenové mastné kyseliny produkovány konverzí nenasycených mastných kyselin na acetylenové mastné kyseliny působením acetylenázy mastných kyselin.
Ve druhém aspektu se vynález týká cDNA kódující acetylenázu monooxygenázového typu se smíšenou funkcí obsahující tři konzervované histidinové motivy (HX(3 nebo 4)H, HX(2 nebo 3)HH a HX(2 nebo3)HH) podle obrázku 1 na připojených výkresech.
-2CZ 292780 B6
V dalším provedení se vynález týká cDNA kódující acetylenázu mastných kyselin, jako je Crepis alpina delta 12 acetylenáza obsahující sekvenci podle obrázku 3 na připojených výkresech nebo jakoukoliv nukleotidovou sekvenci, která je k ní významně homologní.
Ve třetím aspektu se vynález týká použití výše popsané cDNA pro transformaci organizmů. Organizmem může být organizmus akumulující acetylenové sloučeniny nebo organizmus akumulující oleje, v příslušném pořadí.
Ve čtvrtém aspektu se vynález týká organizmů transformovaných cDNA pro acetylenázu jak byla popsána výše. Organizmy akumulující acetylenové sloučeniny nebo oleje, jejich příklady jsou olejnaté plodiny, oleogenní kvasinky a plísně.
V pátém aspektu se vynález týká acetylenových sloučenin akumulovaných v organizmech popsaných výše.
V šestém aspektu se vynález týká olejů z organizmů akumulujících oleje popsaných výše.
Ve výhodném provedení se předkládaný vynález týká transformace organismů akumulujících oleje uvedenou izolovanou cDNA z cDNA knihovny semen Crepis alpina za účelem produkce acetylenových mastných kyselin a konkrétně 9-oktadecen-12-inové kyseliny („krepeninové kyseliny“).
Olej semen C. alpina je bohatý na 9-oktadecen-12-inovou kyselinu („krepeninovou kyselinu“) (Hirsinger, 1989)). Původci studovali syntézu kyseliny 9-oktadecen-12-inové („krepeninové kyseliny“) v semenech C. alpina. Přívod exogenních l-14C-značených volných mastných kyselin do intaktních vyvíjejících se kotyledonů semen C. alpina prokázalo, že linoleát je prekurzor kyseliny 9-oktadecen-12-inové („krepeninová kyselina“). Toto je v protikladu k dříve publikovaným výsledkům pro biosyntézu kyseliny 9-oktadecen-12-inové („krepeninové kyseliny“) v Crepis rubra (Haigh a James, 1967). Ačkoliv bylo prokázáno, že reakce tvorby acetylenových kyselin v mechách je desaturační proces (Kohn a kol., 1994), může být takový desaturační proces proveden mnoha různými typy nepříbuzných rostlinných enzymů, jako jsou fytogen desaturázy (Wieland a kol., 1994) nebo non-hem obsahující proteiny, kde z druhé uvedené třídy enzymů některé vykazují velmi malé homologie aminokyselinové sekvence, kromě tří konzervovaných histidinových motivů (Shanklin a kol., 1994). Bylo naznačeno, že biosyntéza acetylenových mastných kyselin probíhá přes sekvenci meziproduktů katalyzovaných různými enzymatickými reakcemi. Například, soudilo se, že acetylenové vazby jsou tvořeny jako vedlejší metabolická dráha syntézy nasycených mastných kyselin (Diedrich a Henschel, 1991); nebo přes epoxygenaci dvojné vazby s následnou konverzí na diol, který je potom dehydratován ve dvou krocích za tvorby acetylenové vazby (Van de Loo a kol., 1993). Vzhledem k těmto protikladným alternativám nebyl v době podání předkládané patentové přihlášky SE 9601236-4 znám vůbec nebo nebyl zřejmý charakter enzymu acetylenáza ani mechanismus jeho účinku.
Enzym podle předkládaného vynálezu, který je odpovědný za syntézu kyseliny 9-oktadecen-12inové („krepeninové kyseliny“) (nazvaný delta 12 acetylenáza), byl podle vynálezců prokázán aktivní pouze v membránových (mikrosomálních) frakcích připravených z vyvíjejících se semen Crepis alpina, za podmínek, že homogenizační pufr obsahoval NADH nebo NADPH, katalázu a volný koenzym A. Charakterizace mikrosomální acetylenázy a její srovnání s delta 12 desaturázou (odpovědnou za desaturaci oleátu na linoleát) ukázala, že tyto enzymy mají velmi podobné vlastnosti. Oba enzymy vyžadují O2 a NADH nebo NADPH; kde obě koredukční činidla působí stejně s oběma enzymy. Kyanid (CN-) a protilátky proti květákovému cytochromu b5 inhibovaly oba tyto enzymy, zatímco oxid uhelnatý neměl signifikantní účinek na aktivitu ani jednoho enzymu. Tato data naznačují, že oba enzymy jsou biochemicky podobné. Oleát delta 12 hydroxyláza z ricinových bobů má také podobné biochemické vlastnosti jako delta 12 desaturáza i přesto, že katalyzuje různé reakce (Bafor a kol., 1991; Smith a kol., 1992). Později bylo
-3CZ 292780 B6 prokázáno, že gen pro delta 12 hydroxylázu z ricinových bobů má signifikantní homologii sekvence s geny pro ER delta 12 desaturázu (FAD 2 geny) (Van de Loo a kol., 1995). Protože delta 12 acetylenáza, stejně jako delta 12 desaturázy (FAD2), katalyzuje dehydrogenaci mezi uhlíky 12 a 13 acylového řetězce a podobně jako delta 15 desaturáza (FAD3) utilizuje kyselinu linolovou jako substrát, vynálezci usoudili, že gen pro acetylenázu by mohl mít určitou homologii sekvence s geny pro FAD2 a/nebo FAD3.
Vynález bude nyní podrobněji popsán v následujících příkladech a připojených \ýkresech.
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1: Restrikční mapa pCrepl.
Obrázek 2: Restrikční mapa pVT-Crepl.
Obrázek 3: Superponované chromatogramy jednotlivých iontů 333, 365, 367 zFADEA připravených z celkových mastných kyselin extrahovaných z kvasinek kmene YN94-1 transformovaných pVT-Crepl. Písmena označují píky představující následující diethylamidové deriváty mastných kyselin: A, kyselina eikosanová; B, kyselina eikosaenová; C, 9-oktadecen-12-inová kyselina.
Obrázek 4: Superponované chromatogramy jednotlivých iontů 333, 365, 367 zFADEA připravených z celkových mastných kyselin extrahovaných z kvasinek kmene YN94-1 transformovaných prázdným vektorem (pVTlOOU; kontrola). Písmena označují píky představující následující diethylamidové deriváty mastných kyselin: A, kyselina eikosanová; B, kyselina eikosaenová.
Obrázek 5: Celkový iontový chromatogram FADEA připravených z mastných kyselin obohacených v domnělé 9-oktadecen-12-ionové kyselině z lipidových extraktů zYN94-l transformovaných pVT-Crepl. Písmena označují píky představující následující diethylamidové deriváty mastných kyselin: A, kyselina hexadekanová; B, kyselina oktadekanová; C, oktadekan9,12-dienová kyselina; D, 9-oktadecen-12-inová kyselina.
Obrázek 6: Hmotnostní spektrum sloučenin odpovídajících píku D na obrázku 5.
Příklady provedení vynálezu
Klonování předpokládaného genu pro acetylenázu
Srovnání aminokyselinových sekvencí z různých druhů ukázalo, že desaturázy mastných kyselin vázané na membrány mohou být přiřazeny do tří různých skupin podle homologie jejich předkládaného zralého proteinu (plastid delta 12 desaturázy, ER delta 12 desaturázy a delta 15 desaturázy; viz seznam sekvencí 1). Hydroxyláza z ricinových bobů (Van de Loo a kol., 1995) má vysokou homologii s ER delta 12 desaturázami, která je takového stupně, že tyto sekvence nejsou snadno rozlišitelné. Kromě toho, sekvence ze všech tří tříd enzymů vykazují mezi sebou určitý stupeň homologie sekvence.
Na základě tohoto srovnání byly navrženy oligonukleotidové primery a byly syntetizovány pro tyto tři skupiny sekvencí a pro konsenzus všech těchto sekvencí. Sekvence těchto primerů jsou uvedeny dále.
(i) konsenzuální primery (primery navržené pro konsenzus všech tří skupin desaturáz vázaných na membrány a hydroxylázu mastných kyselin z ricinových bobů):
-4CZ 292780 B6 sense primer: GSN CAY GAN TGY GSN CAY antisense primer: RAN ADR TGR TGN RBN AYR TG.
(ii) primery pro plastid delta 12 desaturázy:
sense primer: TGG MGN TTY AAR CAY GAY MG antisense primer: GTN SWC ATC CAR AAR TGR TA.
(iii) primery pro ER delta 12 desaturázy včetně hydroxylázy mastných kyselin z ricinových bobů:
sense primer: CAY GAR TGY GGN CAY CAY GC antisense primer: CCN CKN ARC CAR TCC CAY TC.
(iv) primery pro delta 15 desaturázy:
sense primer: ACN CAY CAY CARAAY CAY GG antisense primer: CAY TGY TTN CCN CKR TAC CA.
Póly A+ RNA byla izolována z vyvíjejících se semen (100 mg) C. alpina za použití QuickPrep Micro mRNA přečišťovacího kitu od Pharmacia Biotech. Všechny póly A+ RNA z tohoto přečištění byla vysrážena a použita k syntéze prvního řetězce cDNA, který byl započat jako oligo dT, tak náhodnými hexamery a který byl syntetizován za použití Superscript II reverzní transkriptázy od Gibco BRL. Potom byla použita polymerázová řetězová reakce (PCR), s uvedenými primery a touto cDNA, pro amplifíkaci produktů s následujícími podmínkami pro cykly: 1 cyklus při 94 °C po dobu 2 minut, 30 cyklů (94 °C, 30 sekund; 50 °C, 30 sekund; 72 °C, 30 sekund) a nakonec jeden cyklus 72 °C po dobu 5 minut.
Produkty byly získány pro všechny použité primery; zajímavé je, že primery proti ER delta 12 desaturázám dávaly výrazně více produktu, než ostatní použité primery. Velikost PCR produktů z delta 12 a delta 15 primerů odpovídala předpokládané velikosti.
PCR produkty získané amplifíkaci s ER delta 12 primery a delta 15 primery byly tupě zakončeny T4 a klenow polymerázami a byly klonovány do EcoRV místa plazmidového vektoru Bluescript. DNA sekvencování mnoha klonů ukázalo, že za použití těchto dvou sad primerů byly amplifíkovány alespoň tři různé sekvence: (i) vysoce konzervovaná sekvence delta 15 desaturázy, (ii) vysoce konzervovaná sekvence ER delta 12 a (iii) sekvence (D12V) mající homologii kER delta 12 sekvencím, ale vykazující různé odlišnosti i v některých aminokyselinových zbytcích, které byly vysoce konzervovány ve všech jiných sekvencích pro desaturázy.
Analýza mastných kyselin z C. alpina ukázala, že kyselina 9-oktadecen-12-inová („krepeninová kyselina“) je pravděpodobně přítomna pouze v semenech. Northem blot analýza při vysoké přísnosti ukázala, že mRNA zD12V sekvence popsané výše byla exprivována ve vysokém množství v semenech, ale nikoliv v listech, což je v souladu s pozorováním, že kyselina 9-oktadecen-12-inová („krepeninová kyselina“) byla pozorována pouze v semenech.
cDNA knihovna byla připravena z vyvíjejících se semen zC. alpina za použití Uni-ZAP XR klonovacího kitu pro cDNA od Stratagene a byla vyšetřována náhodně značenou D12V sekvencí. Z tohoto vyšetřování bylo hodnoceno, že cDNA kódující D12V sekvence byla přítomna ve značném množství; což předpokládá vysoký stupeň exprese tohoto genu. Po izolaci jednotlivě hybridizujících lambda plaků byl pBluescript fagemid excidován za použití ExAssist/SOLR systémů od Stratagene. Takto získané fagemidy byly potom použity pro produkci dvojřetězcového DNA plazmidu. T těchto kolonií byl izolován kompletní klon (pCrepl, viz obrázek 1) za použití DNA sekvencování a restrikčního mapování izolovaného plazmidu. Inzert zpCrepl,
-5CZ 292780 B6
1,5 kb inzert obsažený ve vektoru pBluescript SK, byl sekvencován a z tohoto inzertu byl odvozen otevřený čtecí rámeček kódující 375 aminokyselinový protein (seznam sekvencí 2). Analýza sekvence tohoto proteinu ukázala přibližně 60% identitu a 80% podobnost sjinými rostlinnými delta 12 desaturázovými proteiny a přítomnost zaznamenání hodných rozdílů v homologii, kdy určité zbytky, které byly konzervovány mezi všemi ostatními desaturázami, nebyly v této sekvence (viz seznam sekvencí 1). Byly přítomné tři histidinové motivy, které byly prokázány jako konzervované v mnoha non-hem obsahujících monooxygenázách katalyzujících hydroxylaci a desaturační reakce (Shanklin a kol., 1994).
Exprese pCrep cDNA a detekce kyseliny 9-oktadecen-12-inové („krepeninové kyseliny“) v transgenních kvasinkách.
pCrep 1 otevřený čtecí rámeček byl uvolněn z pCrep 1 na Smal/Xhol restrikčním fragmentu a 1,5 kb Crepl otevřeného čtecího rámečku získaného zgelového přečištění (Landridge a kol., 1980). pVTlOO-U DNA (Vemet a kol., 1987) byla trávena za použití PvuII a Xhol. 50 ng PvuII/XhoI-linearizováného pVTlOO bylo ligováno s 100 ng 1,5 kb Smal/Xhol fragmentu odpovídajícího Crepl otevřenému čtecímu rámečku za použití T4 DNA ligázy (NBL Genen Science Ltd., UK). Část ligační směsi byla použita pro transformaci kompetentních E. coli DHa buněk. Byl vybrán jeden klon (pVT-Crepl), který obsahoval očekávaný 1,5 kb inzert a konstrukt byl ověřen trávením EcoRI nebo HindlII + Xbal. Obě trávení dávala očekávané produkty (přibližně 5,3, 2,3 a 0,8 kb pro EcroRI trávení a 1,5 kb otevřený čtecí rámeček pro HindlII + Xbal trávení). pVT-Crepl DNA (viz obrázek 2), nebo prázdný vektor pVTlOOU, byly použity pro transformaci Saccharomyces cerevisiae kmenů YN94-1 a C13-ABYS86, za použití PLATE metody podle Elble (1992). Kvasinky transformované přes noc byly kultivovány na SCD minus uráčil agaru a jednotlivé kolonie byly přeneseny na čerstvé selektivní (minus uráčil) plotny. YN94-1 a C13-ABYS86 kmeny kvasinek transformované pVT-Crepl DNA a prázdným vektorem (pVTlOOU; kontrola) byly kultivovány v kulturách střepáním při 28 °C po dobu pěti hodin v selektivním médiu (bez uracilu; 400 ml) a potom bylo 40 ml kultivačního média, obsahujícího kyselinu linolovou, rozpuštěnou v Tween 40R, přidáno do kultury v konečné koncentraci 0,03 % kyseliny linolové a 1 % Tween 40R (hmotnost/hmotnost). Po kultivaci po dobu dalších 78 hodin při 28 °C byly buňky peletovány centrifugací a byly promyty disperzí ve 20 ml 0,1 M Tris-HCl pufru pH 7,8 obsahujícím 1% Tween 40R a byly znovu peletovány centrifugací. Buňky byly dále promyty resuspendováním ve 20 ml 0,1 M Tris-HCl pufru pH 7,8 a byly znovu peletovány. Buňky byly potom extrahovány ve směsi chloroform/methanol/0,15 M kyselina octová (1:2:0,8, uvedeno objemově) v Braun MSK buněčném homogenizátoru se skleněnými korálky (B. Braun Biotech Intemational, Melsungen, Germany) při frekvenci otáček 4000 za minutu po dobu 20 sekund. Kvasinkové lipidy byly extrahovány ze směsi do chloroformové fáze přidáním chloroformu a 0,15 M kyseliny octové v konečných poměrech 1:1:0,9 (uvedeno objemu) chloroformu, methanolu a 0,15 M kyseliny octové. Po centrifugací směsi byla chloroformová fáze obsahující lipidy odstraněna a odpařena do sucha pod proudem dusíku.
Lipofilní zbytek byl methylován methanolickou HC1 (4% hmotnost/hmotnost) při 85 °C po dobu 45 minut a potom byly methylestery mastných kyselin extrahovány do n-hexanu. Plynové kapalinové (GC) chromatogramy methylesterů separovaných na skleněných kolonách (2,5 m x 3 mm, vnitřní průměr) obsahujících 3% SP-2300 Supelcoport 100/120 mesh (rozměr částice 0,122 až 0,147) (Supelco, Bellefonte, P. USA) ukázaly pík se stejným retenčním časem jako autentický methylester 9-oktadecen-12-inové kyseliny vytvářející více než 0,3 % celkové plochy píků ve vzorcích připravených z kvasinek transformovaných pVT-Crepl, ale nikoliv ve vzorcích připravených z kvasinek obsahujících prázdný vektor (pVTlOOU; kontrola).
Protože methylestery acetylenových mastných kyselin mohou být částečně separovány od jiných methylesterů mastných kyselin na silikagelové chromatografii na tenké vrstvě, byly methylestery připravené z YN94-1 transformovaných pVT-Crepl separovány na silikagelových 60 plotnách pro chromatografii na tenké vrstvě (Měrek, Darmstadt, SRN) vyvíjením ploten ve směsi hexan/diethylether/kyselina octová (85:15:1, uvedeno objemově). Oblast ihned pod hlavní methyl
-6CZ 292780 B6 esterovou oblastí byla odebrána z plotny a lipidy byly eluovány směsí methanol/chloroform (2:1) a byly analyzovány kapalinovou chromatografií. Frakce se skládaly z methylesterů mastných kyselin, kde pík se stejným retenčním časem jako methylester 9-oktadecen-12-inové kyseliny tvořil více než 12,5 % celkové plochy píku.
Methylesterové frakce obohacené o domnělý methylester 9-oktadecen-12-inové kyseliny a celkové methylestery mastných kyselin připravené zYN94-l transformovaných pVT-Crepl aYN94-l transformovaných prázdným vektorem (pVTlOOU; kontrola) byly hydrolyzovány v 2,5M KOH ve vodném methanolu (15 % objemových methanolu) při 90 °C po dobu 1 hodiny. Volné mastné kyseliny byly extrahovány do hexanu po okyselení HC1 a hexanová fáze byla odpařena do sucha pod proudem dusíku.
Diethvlamidy mastných kyselin (FADEA) byly připraveny z volných mastných kyselin způsobem podle Nilssona a Liljenberga (1991). FADEA byly buď přímo injikovány do plynové chromatografie s kapalnou stacionární fází spojené s hmotnostním spektrometrem (GS-MS) nebo byly podrobeny dalšímu přečištění silikagelovou chromatografií na tenké vrstvě vyvíjením ploten směsí heptan/diethylether/kyselina octová (50:50:1, uvedeno objemově).
FADEA byly analyzovány na Hawlett-Packard 5890 II plynovém chromatografií vybaveném DB225 (0,25 mm (vnitřní průměr) x 30 m, J and W, Folsom, USA) v sérii s Rtx 2330 (Restek Corp., PA, USA) kapilární kolonou ze slinutého oxidu křemičitého, spojenou s Hewlett-Packard 5989A hmotnostním spektrometrem pracujícím v elektronovém impaktním módu při 70 eV. Injekční technika byla nepřerušovaná při 100 °C a potom byla teplota co nejrychleji zvýšena na 240 °C. Teplota v pícce byla 100 °C po dobu 7 minut, potom 20 °C za minutu do 190 °C a potom 1 °C za minutu do konečné teploty 225 °C, která je udržována po dobu dalších 20 minut. Pozice dvojné vazby byly určeny podle Nilssona a Liljenberga (1991).
Jednoiontové chromatogramy hmotnostní odpovídající molekulárnímu iontovému FADEA, připravených z celkových mastných kyselin z YN94-1 transformovaných pVT-Crepl a z YN941 transformovaných prázdným vektorem (pVTlOOU; kontrola), jsou ukázány na obrázku 5 a 6, v příslušném pořadí. Chromatogram FADEA zYN94-l transformovaných pVT-Crepl ukázal pík o hmotnosti 333 (odpovídající molekulové hmotnosti diethylamidu kyseliny 9-oktadecylen12-inové), který nebyl přítomen na chromatogramu FADEA ZYN94-1 transformovaných prázdným vektorem (pVTlOOU, kontrola). Pík měl retenční čas 57,3 minuty a byl umístěn mezi píky odpovídaj ící eikosanoidovým a eikosanoidovým FADEA derivátům.
Celkový iontový chromatogram FADEA připravených z mastných kyselin obohacených o domnělou kyselinu 9-oktadecen-12-inovou provedený za použití chromatografie na tenké vrstvě (jak je popsána výše), kde mastné kyseliny pocházejí zlipidových extraktů ZYN94-1 transformovaných pVT-Crepl, je ukázán na obrázku 5. Hmotnostní spektrum (obrázek 6) domnělých diethylamidových derivátů kyseliny 9-oktadecen-12-inové (pík D na obrázku 5) ukazuje mezeru v hmotnosti 26 amu místo řádných 28 mezi uhlíkem 7 a 9, což ukazuje na dvojnou vazbu v pozici 9. Kromě toho zde byla mezera 24 amu místo řádných 28 mezi uhlíkem 10 a 12, což ukazuje na přítomnost acetylenové vazby v pozici 12. Pík D produkoval hmotnostní spektrum identické se spektrem autentického diethylamidu kyseliny 9-oktadecen-12-inové připravené z olejů ze semen Crepis alpina. Tak pík D v chromatogramu na obrázku 5 byl jednoznačně identifikován jako diethylamidový derivát kyseliny 9-oktadecen-12-inové. Jelikož sloučenina nebyla přítomná v kmenech kvasinek, které nebyly transformovány Crepl cDNA, je jasné, že Crepl cDNA kóduje delta 12 acetylenázou mastných kyselin.
Odkazy:
Badami, R. C., and Patil, K. B. (1981). Structure and occurrence of unusual fatty acids in minor seed oils. Progress in Lipid Research, 19,119-53.
-7CZ 292780 B6
Banas, A., Bafor, M., Wiberg, E., Lenman, M., Stáhl, U. and Stymme, S. (1997) Biosyntesis of an acetylenic fatty acid in microsomal preparations from developing seeds of Crepis alpina. In: Williams, J. P., Mobasher, K. U., Lem, N. W. (eds) Physiology, biochemistry and molecular biology of plant lipids. Kluwer Academie Publisher, Dordrecht. In-press.
Bimboim, H. C., and Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction proceduře for sereening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7,1513-1523.
Diedrich, M. & Henschel, K. P. (1991) The natural occurence of unusual fatty acids: Part 3. Acetylenic fatty acids. Nahrung 35, 193-202.
Elble, R. (1992) A simple and effícient proceduře for transformation of yeasts. Biotechniques 13, 18-20.
Haigh, W. G. & James, A. T. Biochim. Biophys. Acta 137, 391-392.
Hirsinger, F. (1989). New annual oil crops. In Oil crops of the world, (eds. G. Robbelen, R. K. Downey and A. Ashri), pp.518-532. Mc-Graw-Hill lne.
Kohn, G., Hartmann, E., Stymne, S. & Beutelmann, P. (1994) Biosynthesis of acetylenic acids in the moss Ceratodon purpureus. J. Plant Physiol. 144,265-271.
Langridge, J., Langridge, P and Bergquist P. L. (1980) Extraction of nucleic acids from agarose gels. Anal. Biochem. 103, 264-271.
Nilsson, R. and Liljenberg, C. (1991) The determination of double bond positions in polyunsaturated fatty acids - Gaschromatography/mass spectrometry of the diethylamide derivative. Phytochemical analysis 2, 253-259.
Shanklin, J., Whittle, E. & Fox, B. G. (1994) Eight histidine residues are catalytically essential in membrane - associated iron enzyme, stearoyl-CoA desaturase and are conserved in alkane hydroxylase and xylene monoxygenase. Biochemistry 33,12787-12794.
Stymne, S. & Lenman, M. (1996) Novel plant enzyme and use thereof. Swedish patent application no. 9601236-4, 96-03-29.
Vemet, T., Dignard, D. and Thomas, D. Y. (1987) A family of yeast expression vectors containing the phafe fl intergenic region. Gene 52, 225-233.
Wieland, B., Feil, C., Gloria-Maercker, E., Thumm, G., Lechner, M., Bravo, J. M., Poralla, K. &Goetz, F. (1994) Genetic and biochemical analysis of the biosynthesis of the yellow carotenoid 4,4'-diaponeurosporene of Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 176, 7719-7726.
van de Loo, F. J., Broun, P., Turner, S. & Somerville, C. (1995) An oleáte D12-hydroxylase from Ricinus communis L. is a fatty acid acyl desaturase homolog. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, 6743-6747.
van de Loo, F. J., Fox G. & Somerville, C. (1993) Unusual fatty acids. In. T. S. Moore
Jr (ed.) Lipid Metabolism in Plants. CRC Press, Boča Raton, str. 105.
-8CZ 292780 B6
Informace o seznamu sekvencí č. 1
Je uvedeno seřazení aminokyselinových sekvencí pro delta 12 ER a plastidových desaturáz, delta 15desaturáz a hydroxyláz z ricinových bobů. Také je v tomto seřazení uvedena proteinová sekvence odvozená od pCrepl (crepis). Podtržené jsou tři histidinové motivy, které jsou konzervovány v non-hem obsahujících monooxygenázách.
Sekvence uvedené v tomto seřazení spolu s jejich přírůstkovými čísly jsou:
bnomódes.seq, delta 12 desaturáza z Brassica napus (L29214); gmomódes.seq, delta 12 desaturáza z Glycine max (L29215);
atom3des.seq, delta 15 desaturáza z Arabidopsis thaliana (L22961); bnom3des.seq, delta 15 z Brassica napus (L22963);
rcom3des.seq, delta 15 desaturáza z Ricinus communis (L25897); siom3des.seq, delta 15 desaturáza z orientálního sesamu (U25817);
lddl5des.seq, delta 15 desaturáza z Limnanthes douglasii (U17063); gsom3des, delta 15 desaturáza z Glycine max (L22965);
atom3bdes.seq, delta 15 desaturáza z Arabidopsis thaliana (Dl7597); bnom31des.seq, delta 15 z Brassica napus (L22962);
gsom3bdes.seq, delta 15 desaturáza z Glycine max (L22964); atdl2des.seq, delta desaturáza z Arabidopsis thaliana (L26296);
gmomóbdes.seq, delta 12 desaturáza z Glycine max (L43921); scoml2des.seq, delta 12 desaturáza z S. commesonii (X92847);
gmomóades.seq, delta 12 desaturáza z Glycine max (L43920);
rchyd.seq, oleát 12-hydroxyláza z Ricinus communis (U22378);
crepis, acetylenáza Crepis alpina podle této přihlášky.
-9CZ 292780 B6
Seznam sekvencí 1 br.omódes.seq gmomódes.seq acor?.3des. seq br.ornldes . seq rcomSdes.seq siamodes.seq IddlSdes.seq gson>.3des. seq acom3bdes. seq bnorr.Sldes.seq gsom3bdes. seq atd!2des.seq gntomSbdes. seq scoml2des.seq gmomóades.seq rchyd.seq crepis bnomúdes.seq gmom6des.seq acom3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq IddlSdes.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes. seq atdl2des.seq grnomfibdes .seq scor?.12des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis bnomódes.seq gmomfides .seq ahoia3des. seq bnom3des. seq rcom3des.seq siom3des.seq IddlSdes.seq gsom3des.seq acam3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atd!2des.seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq gmomfiades.seq rchyd.seq crepis i so ........................MASRIA DSLFAFTGPQ QCÍ.PRAPKLA ........................MACTLA DSLLLFKGSY Q.KPVLRRDI .MANLVLSEC GIRPLPRIYT TPRSNFLSMN N...KFRPSL SS55YKTSSS
MAAGWVLSEC GLRPLPRIYS RPRIGFTSKT TtlLLKLRELP DSKSYNLCSS .MASWVLSEC GLRPLPRVYP KPRTGHPLLN SNPTKLRFSR TDLGNGSS.. •MASWVLSQY ALNPLPHIFR TPRTSITSHK .........L TVSHTNNRAT •MATWYHQKC GLKPIAPVI? RPRTGAALSS TSRVEF......LDTNKWA
100 SARLSPGVYA VRPIDLLLKG TRRTFLVPAK KRIGCIKAVF VPVAPPSADN AARYSPGIFS LNSNGLIQKR FRRQRNFVTR NKVTVIHAVA 1PVQPAPVES PL3FGLNSRD GFTRNWALNV STPLTTPIFE ESP...........LEEDNK
FKVSSWSNSK QSNWALNVAV PVNVSTVSGE DDREREEFNG IVN.VDEGKG ...FCLSSGI LREKNWALRV SAPLRVLQVE EEEENKEGER VIN.GGEE. . PDLTKLSLIK FRERKLGLRV SAPFQIASTT PE.............EEDEV GPKFQPERCN LRERNWGLKV SAPLRVASIE EEQKSVDLTN GTNGVEHEKL ...........................MW AMDQRTNVNG DPGAGDRKKE ...........................MW AMDQRSNANG D......... ............................MV KDTKP1AYAA NNGYQQKGSS ..........................MGAG GRMPVP.... TSSKKSETDT ..........................MGAG GRTDVP. ... PANRKSEVD? ..........................MGAG GRMSAP.... NGETEVKRN? .................... MGLAKETTMG GRGRVA. . . . KVEVQGK.KP .................... ......MGGG GRMSTVITSN NSEKKGGSSH ..........................MGGG GR..........GRTSQKPL
101
AEDREQLAES AEYRKQLAED QRFDPGAPPP
YGFKQIGQDL YGFRQVGEPL FNLADIRAAI
PDNVTLKDIM SDDVTLKDVI PKHCWVKNPW
EFFDAGAPPP ..FDPGAPPP AEFDPGSPPP PEFDPGAPPP ERFDPSAQPP ERFDPSAQPP FDFDPSAPPP TKRVPCEKPP LKRVPFEKPQ LQKVPTSKPP LSRVPNTKPP LKRAPHTKPP MERVSVD.PP
FTLADIRAAI FKLSDIREAI FKLADIRAAI FNLADIRAAI FKIGDIRAAI FKIGDIRAAI FKIAEIRASI FSVGDLKKAI FSLSQIKKAI FTVGDIKKAI FTVGQLKKAI FTLGDLKRAI FTVSDLKQAI
PKHCWVKNPW PKHCWVKDPW PKHCWVKNQW PKHCWVKDPW PKHCWVKSPL PKHCWVKSPL PKHCWVKNPW PPHCFKRSIP PPHCFQRSVI. PPHCFQRSLI PPHCFQRSLL PPHCFERSFV PPHCFKRSVI
DTLPKEVFEI NPLPKEVFEI KSLSYWRDV . .MSYWREL RSMSYVLRDV RSMGYWRDV RSMSYWRDV RSMSYWRDV RSMSYWRDI RSMSYVARDI RSLSYVLRDV RSFSYLISDI RSFSYWYDL RSFSYWYDL TSFSYWYDL RSFSYVAYDV RSSYYIVHDA
1S0
DDVKAWKSVL DDVKAWKSVL AIVFA..... AIVFA..... VWFG..... AWFG..... VTVLG..... IAVFG..... IAVAA..... FAWA..... LVIAA..... IIASC..... TIAFC..... ILVSI..... SFAF...... CLSFL..... ΙΣΑΪΙ.....
Seznam sekvencí 1 (pokračování)
200 br.amódes. seq □móda 5 .seq atomldes.seq cr.om3des . seq rcotr.3des . seq siom3des .seq lddl5des.seq gsom3des. seq acom3bdes.seq bnom31des . seq gsom3bdes.seq acdl2des.seq gmomóbdes.seq scotnl2des. seq gmomóades.seq rchyd.seq crepis
ÍSVTSYALGL
ÍSVTSYALGL FMISKAPWYL
LAAGAAYL. . LAAGAAYL · · LAAVAAYF.. LAAVAAYF. · LAAAAVAA. . LAAAAAYL.LAIAAVYV.. LAVAAVYF.. LVAAAIHF.. FYYVATNYFS LYYVATHYFH MYYVANTYFH IFYIATTYFH FYSIATNFFP FYFLADKYIP . . . řrWwTXV . . .NNWLV ...NNWVA . . . NNWW ...NSWAV ...NNWLV ...DSWFL ...DSWFF ...DNWLL LLPQPL5YLA LLPGPLSFRG LLPSPYCYIA LLPQPF5LIA YISSPLSYVA ILPAPLAYLA
WPLYWLAQGT WPLYWIAQGT WPLYWFCQGT WPLYWFAQST WPLYWVAQGT WPLYWAAQGT WPLYWAAQGT WPLYWAAQGT WLIYCPIQGT WPLYWACQGC MAIYWAVQGC WPIYWICQGC WPIYWVLQGC WLVYWLFQGC WPLYWFCQAS
A'.~TGFFVIGH DCAHKS~SKM AITGFEVIGH DCAHRSFSSN MFWALFVLGH DCGHGSFSND t··.fwalfvlg:-: dcghgs fsnd MFWALFVLGH DCGHGSFSNN MFWALFVLGH DCGHGSFSND MFWALFVLGH DCGHGSFSNN MFWALFVLGH DCGHGS FSNM LFWAIFVLGH DCGHGSFSDI L FWAIFVLGH DCGHGS FS DI MFWALFVLGH DCGHGSFS DS VLTGIWVIAH ECGHHAFSDY ILTGVWVIAH ECGHHAFSDY VCTGIWVNAH ECGHHAFSDY LLTGVWVIAH ECGHHAFSKY ILTGLWVIGH ECGHHAFSEY ILTGLWVIGH ECGHHAFSDY
201
2S0 br.omSdes.seq graomódes .seq acom.3des . seq bnom3des .seq rcom3des. seq sionúdes.seq lddlSdes.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsotn3bdes. seq aCdl2des. seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq gmoni6ades .seq rchyd.seq crepis
KLVEDIVGTL AFLPLVYPYE KLVEDIVGTL AFMPLIYPYE PKLNSWGHL LHSSILVPYH PRLNSWGHL LHSSILVPYH PKLNSWGHL LHSSILVPYH PKLNSWGHI LHSSILVPYH HKLNSWGHL LHSSILVPYH SKLNSWGHL LHSSILVPYH PLLNSWGHI LHSFILVPYH PLLNTAVGHI LHSFILVPYH PLLNSLVGHI LHSSILVPYH QWLDDTVGLI FHSFLLVPYF QLLDDIVGLI LHSALLVPYF QWVDDTVGLI LHSALLVPYF’ QWVDDWGLT LHSTLLVPYF QLADDIVGLI VHSALLVPYF QWVDDTVGFI LHSFLMTPYF
PWRFKHDRHH AKTNMLVHDT PWRFKHDRHH AKTNMLREDT GWRISHRTHH QNHGHVENDE GWRI5HRTHH QNHGHVENDE GWRISHRTHH QNHGHVENDE GWRISHRTHH QNHGHVENDE GWRIRHRTHH QNHGHVENDE GWRISHRTHH QHHGHAENDE GWRISHRTHH QNHGHVENDE GWRISHRTHH QNHGHVENDE GWRISHRTHH QNHGHIEKDE SWKYSHRRHH SNTGSLERDE SWKYSHRRHH SNTGSLERDE SWKYSHRRHH SNTGSLERDE SWKISHRRHH SNTGSLDRDE SWKYSHRRHH SNIGSLERDE SWKYSHRNHH ANTNSLDNDE
AWQPVPPEEF AWHPVWKDEF SWHPM5EKIY SWHPMSEKIY SWHPLSEKIF SWHPLSEKIY SWHPMSEKLF SWHPLPEKLF SWVPLPERVY SWVPLPEKLY SWVPLTEKIY VFVPKQKSAI VFVPKQKSCI VFVPKPKSQL VFVPKPKSKV VFVPKSKSKI VYIPKSKAKV
251
| bnomSdes.seq | DS........ |
| gmomódes.seq | ES........ |
| atom3des. seq | NTLDK..... |
| bnom3des.seq | KSLDK..... |
| rcom3des.seq | KSLDN..... |
| siom3des.seq | KNLDT..... |
| lddlSdes.seq | RSL7K..... |
| gsom3des.seq | RSLDT..... |
| atom3bdes.seq | KKLPH..... |
| bnom31des.seq | KNLSH..... |
| gsom3bdes.seq | KNLDS..... |
| atdlZdes.seq | KWYGKYLNNP |
| gmom6bdes.seq | KWYSKYLNNP |
| scoml2des.seq | GWYSKYLNNP |
| gmomSades.seq | AWFSKYLNNP |
| rchyd.seq | SWYSKYSNNP |
| crepis | ALYYKVLNHP |
.SPVLRKAII 1 .TPLLRKAII ' PTRFFRETLP : PTRFFRFTLP VTKTLRFSLP ATKKLRFTLP IALTFRFKAP VTRMLRFTAP STRMLRYTVP STRMLRYTVP MTRLIRFTVP LGRIMMLTVQ PGRVLTLAVT PGRVLSLTIT LGRAVSLLVT PGRVLTLAAT
PGRLLIMFIT
FGYGPIRPWL i YGYGPFRCWM : LVMLAYPFYL ’ LVMLAYPFYL ' FPMLAYPFYL ' FPLLAYPIYL FPMLAYPFYL FPLLAFPVYL LPMLAYPLYL LPMLAYPLYL FPLFVYPIYL F.VLGWPLYL L.TLGWPLYL L.TLGWPLYL L.TIGWPMYL 1 L.LLGWPLYL • F.TLGFPLYL
300 WVNWHFNLRK WLMWHFDLKK ..GSHYHPDS ..GSHYHPDS ..GSHFHPDS ..GSHFHPDS ..GSHYHPDS ..GSHFDPSS ..GSHFNPYS ..GSHYNPYS ..GSHFNPYS
SI......AH
SI......AH
WARSPGKK. . WARSPGKK.. WSRSPGKK.. WSRSPGKQ.. WERSPGKT.. FSRSPGKT.. CYRSPGKE.. WYRSPGKE.. FSRSPGKE.. AFNVSGRPÝD GFACHFFPNA , ALNVSGRPYD , AFNVSGRPÝD , AFNVSGRPÝD . AFNVSGRPÝD FTNISGKKYE
RFACHYDPYG RFACHYDPYG SFASHYHPYA RFACHYDPYG RFANHFDPMS
- 11 CZ 292780 B6
Seznam sekvencí 1 (pokračování) br.omódes. seq gr.omódes. seq arom3des.sec br:c~3de.s. sec rc3-.3des .sec siont3des. seq IddlSdes.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsotr.3bdes. seq atd!2des.seq gmomSbdes. seq scorr.L2des. seq gmoraSades. seq rchyd.seq crepis
301 350 ..FRPSEVNR VKISLACVFA FMAVGWPLII ykvgvlgwvk fž;l:-:?wlgyh . .FRPSEVPF. VKISLACVFA FIAIGWPLII YKT3IMGWIK LGYH DLFLPKERKD VLTSTACWTA .MAALLVCLL' FTIGPIQMLK LYGIPYWINV DLFLPKERND VLTSTACWTA .KAVLLVCLN ΓΛ-tGPMQMLK LYVIPYWINV GLFVPKERKD IITSTACWTA .MAALLVYLN ESMGPVQMLK LYGIPYWIFV DLFVPNEKKD VITSTVCWTA .MLALLVGLS FVIGPVQLLK LYGIPYLGNV DLFVPSEKKD VITSTICWTT .MVGLLIGLS FVMGPIQILK LYWPYWIFV dlfvpnerkd vitstacwaa .mlgllvglg fvmgpiqllk lygvpyvifv SLFAPSERKL IATSTTCWSI .HFVSLIALS FVFGPLAVLK VYGVPYIIFV SLFAPSERKL IATSTTCWSI .MLATLVYLS FLVGPVTVLK VYGVPYIIFV NLFPPSERKG IAISTLCWAT .MFSLLIYLS FITSPLLVLK LYGIPYWIFV PIYNDRERLQ IYLSDAGILA .VCFGLYRYA AAQGMASMIC LYGVPLLIVN PIYSDRERLQ IYISDAGVLA .WYGLFRLA MAKGLAWWC VYGVPLLVVN PIYNNRERLQ IFISDAGVLG .VCYLLYRIA LVKGLAWLVC VYGVPLLVVN PIYSNRERLL IYVSDVALFS .VTYSLYRVA TLKGLVWLLC VYGVPLLIVN PIFSERERLQ IYIADLGIFA .TTFVLYQAT MAKGLAWVMR IYGVPLLIVN PIFKERERFQ VLLSDLGLLA .VLYGVKLAV AAKGAAWVTC IYGIPVLGVF bnom6des.seq gmomfides. seq aconi3des. seq bnom3des. sec rcom3des.seq siom3des. seq lddlSdes.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atd!2des.seq gmomébdes. seq scoml2des.seq gmoaSades.seq rchyd.seq crepis
351 FWMSTFTMVH FWMSTFTMVH MWLDFVTYLH MWLDFVTYLH MWLDFVTYLH MWLDLVTYLH MWLDFVTYLD MWLDLVTYLH MWLDAVTYLH MWLDAVTYLH MWLDFVTYLH AFLVLITYLQ GFLVLITFLQ GFLVLITYLQ GFLVTITYLQ CFLVMITYLQ IFFDIITYLH
HTAPH..ΣΡΕ HTAPY..IPF HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHDEKLPW HHGHDDKLPW HHGHHQKLPW H. .THPSLPH H..THPALPH H..THPSLPH H..THFALPH
H..THPAIPR H..THLSLPH
KPADEWNAAQ KYSEEWNRAQ YRGKEWSYLR YRGKEWSYLR YRGKAWSYLR YRGKEWSYLR YRGEEWSYLR YRGKEWSYLR YRGKEWSYLR YRGKEWSYLR YRGKEWSYLR YDSSEWDWLR YTSSEWDWLR YDSTEWDWLR YDSSEWDWLK YGSSEWDWLR YDSSEWNWLR
AQLNGTVHCD AQLNGTVHCD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTIDRD GGL.TTIDRD GGL.TTVDRD GAL.ATVDRD GAL.ATVDRD GAL.ATCDRD
GAL. ATMDRD
GAM. VTVDRD GAL.STIDRD
400
YPSWIEILCH YPKWIEILCK YGLINNIHHD YGLINNIHHD YGWINNIHHD YGWINNIHHD YGLINNIHHD YGWINNIHHD YGIFNNIHHD YGIFNNIHHD YGWIYNIHHD YGILNKVFHN YGILNKVFHN YGVLNKVFHN YGILNKVFHH YGVLNKVFHN FGFLNSVLHD
401
450 bnom6des.seq gmom6des.seq atomSdes.seq bno:a3des .seq rcom3des.seq siom3des.seq IddlSdes.seq gsom3des.seqatom3bdes.seq bnom31des.seq gsottt3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scom!2des.seq .gmomfiades .seq rchyd.seq crepis
DINVHIPHHI DINVHIPHHI I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL ITDTHVAHHL ITDTHVAHHL ITDTHWHHL ITDTHVAHHL IADTHVAHHL VTHTHVMHHL
SPRIPSYNLR SPRIPSYNLR FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLI FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FSTMPHYNAM FSTMPHYHAM FSTMPHYNAM FSTMPHYHAM FATVPHYHAM FSYIPHYHAK
AAHQSIQENW AAHKSLQENW EATEAAKPVL EATEAAKPVL EATEAAKPVM EATEAAKPVL EATQAAKPIF EATEAAKPVF DATKAAKHVL DATKSAKHVL EATQAAKPVL EATKAIKPIL EATKAIKPIL EATKAVKPLL EATNAIKPIL EATKAIKPIM EARDAINTVL
GKYTNLATWN GQYLNEASWN GKYYREPDKS GKYYREPDKS GKYYREPKKS GKYYREPKKS GKYYKEPAKS GKYYREPKKS GRYYREPKTS GRYYREPKTS GDYYREPERS GDYYQFDGTP GEYYRFDETP GDYYQFDGTP GEYYQFDDTP GEYYRYDGTP GDFYKIDRTP
WRLMKTIMTV WRLMKTIMTV .GPLPLHLLE .CPLPLHLLG .GPLPLHLLG • APLPFHLLG .KPLPFHLID AAPLPFHLIG .GAIPIHLVE .GAIPIHLVE •APLPFHLIK .......WYV .......FVK .......IYK .......FYK .......FYK .......ILK
- 12CZ 292780 B6
Seznam sekvencí 1 (pokračování)
453
493 bnomódes.seq gmomódes.seq atom3des.seq bnom3des.seq rcom3des. seq siom3des. seq lddlódes.seq gsom3des.seq atom3bdes .seq bnom31des. seq gsom3bdes.seq acdl2des.seq gmomSbdes.seq scoml2des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis
CHVYDKEENY IPFDRLAPEE SQPITFLKKA MPDYAA....... CQVYDKEKSL CCLRRTCP......................... Z1AKSIKEDH YV.....SDE GEWYYKADP NLYGEVKVRA D. . ILAKSIKEDH FV.....SDE GDWYYEADP NLYGEIKVTA E. . SLVRSMKEDH YV.....SDT GDWYYQKDP KLSGIGGEKT E. . DLTRSLKRDH YV.....SDV GDWYYQTDP QLTGAEKS..... VLLKSLKRDH FV.....PDT GDTVYYQSDP QISGSLKPE. ... EIIRSFKTDH FV.....SDT GDWYYQTDS KINGSSKLE. ... SLVASIKKDH YV.....SDT GDIVFYETDP DLYVYASDKS KIN SLVASIKKDH YV.....SDT GDIVFYETDP DLYVYASDKS KIN YLIQSMRQDH FV.....SDT GDWYYQTDS LLLHSQRD..... AMYREAKECI YVEPDREGDK KGVYWYNNKL .............
AMWREARECI YVEPDQSTES EMWREAKECL YVEKDESSQG ALWREARECL YVEPDEGTSE ALWREAKECL FVEPDEGAPT AMWREAKECI FIEPEKGRES
KGVFWYNNKL ............. KGVFWYKNKL.......... . . . KGVYWYRNKY ............. QGVFWYRNKY ............. KGVYWY.NKF .............
- 13CZ 292780 B6
Seznam sekvencí 2
Nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence otevřeného čtecího rámečku z plazmidu pCrepl.
ATGGGTGGCGGTGGCCGTGGTCGGACTTCGCAAAAACCCCTCATGGAACGTGTCTCAGTT
MGGGGRGRTSQKPLMERVSV
GATCCACCCTTCACCGTGAGTGATCTCAAGCAAGCAATCCCTCCCCATTGCTTCAAGCGA
D PPFTVSDLKQAIPPHCFKR
TCTGTAATCCGTTCCTCTTACTACATAGTCCACGATGCTATTATCGCCTACATCTTCTAC
SVIRSSYYIVHDAxIAYIFY
TTCCTTGCCGACAAATACATTCCGATTCTCCCTGCCCCTCTAGCCTACCTCGCTTGGCCC
FLADKYIPILPAPLAYLAWP
CTTTACTGGTTCTGTCAAGCTAGCATCCTCACCGGCTTATGGGTCATCGGTCACGAATGC LYWFCQASILTGLWVIGHEC
GGTCACCATGCCTTCAGCGACTACCAGTGGGTTGACGACACTGTGGGCTTCATCCTCCAC
GHHAFS DY QWVDD TVGFILH
TCGTTTCTCATGACCCCGTATTTCTCCTGGAAATACAGCCACCGGAACCACCATGCCAAC
S FLMTPYFSWKYSHRNHHAN
ACAAATTCGCTTGACAACGATGAAGTTTACATCCCCAAAAGCAAGGCCAAAGTCGCGČTT
TNSLDNDEVYIPKSKAKVAL
TACTATAAAGTTCTCAACCACCCACCTGGCCGACTGTTGATTATGTTCATCACCTTCACC
YYKV LNHPPGRLLIMFITFT
CTAGGCTTCCCTCTATACCTCTTTACCAATATTTCCGGCAAGAAGTATGAAAGGTTTGCC LGFPLYLFTNISGKKYERFA
AACCATTTCGACCCCATGAGTCCGATTTTCAAAGAGCGTGAGCGGTTTCAGGTCTTGCTA NHFDPMS PIFKERERFQVLL
TCGGATCTTGGCCTTCTTGCTGTGCTTTACGGAGTTAAACTTGCGGTAGCAGCGAAAGGC
S DLGLLAVLYG VKLAVAAKG
GCCGCCTGGGTGACGTGCATTTACGGAATTCCAGTTTTAGGCGTGTTTATCTTTTTCGAT AAWVTCIYGIFVLGVFIFFD
ATCATCACCTACTTGCACCACACCCATCTGTCGTTGCCTCATTATGATTCATCTGAATGG
I ITYLHHTHLSLPHYDSSEW
AACTGGCTCAGAGGGGCTTTGTCAACAATCGATAGGGACTTTGGGTTCCTGAATAGTGTG
NWLRGALSTIDRDFGFLNSV
CTCCATGATGTTACACACACTCACGTTATGCATCATCTGTTTTCATACATTCCACACTAT LHDVTHTH VMHHLFSYIPHY
CATGCGAAGGAGGCAAGGGATGCAATCAACACAGTCTTGGGCGACTTTTATAAGATCGAT HAKEARDAINTVLGDFYKID
AGGACTCCAATTCTGAAAGCAATGTGGAGAGAGGCCAAGGAATGCATCTTCATCGAGCCT RTPILKAMW REAKECIFIEP
GAAAAAGGTAGGGAGTCCAAGGGTGTATATTGGTACAATAAATTCTGA
EKGRESKGVYWYNKF*
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob produkce acetylenových sloučenin, vyznačující se tím, že kyselina linolová se přemění na kyselinu krepeninovou neboli kyselinu 9-oktadecen-12-inovou pomocí delta 12 acetylenázy z Crepis alpina EC číslo 1.14.99.33, s aminokyselinovou sekvencí ze seznamu sekvencí 2.
- 2. cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu z Crepis alpina, obsahující nukleotidovou sekvenci podle seznamu sekvencí 2.
- 3. Použití cDNA sekvence podle nároku 2 pro transformování organizmů, které jsou vybrány ze souboru skládajícího se z olejnatých plodin, oleogenních kvasinek a plísní.
- 4. Použití podle nároku 3, kde organizmy jsou oleje akumulující organizmy, které jsou vybrány ze souboru skládajícího se z olejnatých plodin, oleogenních kvasinek a plísní.
- 5. Organizmy transformované acetylenázovou cDNA podle nároku 2.
- 6. Organizmy podle nároku 5, kterými jsou oleje akumulující organizmy vybrané ze souboru skládajícího se z olejnatých plodin, oleogenních kvasinek a plísní.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9601236A SE9601236D0 (sv) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Novel plant enzyme and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ313598A3 CZ313598A3 (cs) | 1999-05-12 |
| CZ292780B6 true CZ292780B6 (cs) | 2003-12-17 |
Family
ID=20402028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19983135A CZ292780B6 (cs) | 1996-03-29 | 1997-02-14 | Způsob produkce acetylenových sloučenin, cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu a její použití a organismy transformované acetylenázovou cDNA |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6333448B1 (cs) |
| EP (1) | EP0889970B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000507450A (cs) |
| AT (1) | ATE253124T1 (cs) |
| CA (1) | CA2250234C (cs) |
| CZ (1) | CZ292780B6 (cs) |
| DE (1) | DE69725841T2 (cs) |
| DK (1) | DK0889970T3 (cs) |
| ES (1) | ES2210493T3 (cs) |
| NO (1) | NO326619B1 (cs) |
| PL (1) | PL187096B1 (cs) |
| PT (1) | PT889970E (cs) |
| SE (1) | SE9601236D0 (cs) |
| WO (1) | WO1997037033A1 (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6872872B1 (en) | 1992-11-17 | 2005-03-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants |
| US7589253B2 (en) | 1997-04-15 | 2009-09-15 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism |
| BR9808676B1 (pt) | 1997-04-15 | 2010-10-05 | construção genética, processos para produzir um polipeptìdeo epoxigenase enzimaticamente ativo, recombinante, e, polipeptìdeo recombinante de ocorrência não natural. | |
| ATE334206T1 (de) | 1999-06-07 | 2006-08-15 | Basf Plant Science Gmbh | Delta6-acetylenase und delta6-desaturase aus ceratodon purpureus |
| DE19941609A1 (de) * | 1999-09-01 | 2001-03-08 | Inst Pflanzenbiochemie Ipb | Fettsäure-Desaturase-Gen aus Pflanzen |
| BRPI0407296A (pt) * | 2003-02-05 | 2006-03-07 | Divergence Inc | ácidos nucléicos que codificam agentes antelmìnticos e plantas produzidas a partir deles |
| AU2003252953A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-25 | The University Of York | Fatty acid biosynthesis 2 |
| WO2005014832A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-17 | The University Of York | Fatty acid biosynthesis 4 |
| US7368629B2 (en) * | 2004-02-04 | 2008-05-06 | Divergence, Inc. | Nucleic acids encoding anthelmintic agents and plants made therefrom |
| EP2163638A1 (en) * | 2004-12-20 | 2010-03-17 | BASF Plant Science GmbH | Nucleic acid molecules encoding fatty acid desaturase genes from plants and methods of use |
| WO2012003545A1 (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Acetylenation of fatty acids |
| KR102386838B1 (ko) | 2013-12-18 | 2022-04-15 | 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 | 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질 |
| EP3160482A4 (en) | 2014-06-27 | 2018-02-14 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | Lipid comprising docosapentaenoic acid |
| EP3398442A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-07 | Takasago International Corporation | Use of acetylenic fatty acid compounds as kokumi flavor |
-
1996
- 1996-03-29 SE SE9601236A patent/SE9601236D0/xx unknown
-
1997
- 1997-02-14 DE DE69725841T patent/DE69725841T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 JP JP9535180A patent/JP2000507450A/ja active Pending
- 1997-02-14 DK DK97903713T patent/DK0889970T3/da active
- 1997-02-14 PL PL97329175A patent/PL187096B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-14 CA CA002250234A patent/CA2250234C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-14 WO PCT/SE1997/000247 patent/WO1997037033A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-14 PT PT97903713T patent/PT889970E/pt unknown
- 1997-02-14 EP EP97903713A patent/EP0889970B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 CZ CZ19983135A patent/CZ292780B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-14 ES ES97903713T patent/ES2210493T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 AT AT97903713T patent/ATE253124T1/de not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-09-24 NO NO19984448A patent/NO326619B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-09-29 US US09/161,994 patent/US6333448B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO984448D0 (no) | 1998-09-24 |
| EP0889970B1 (en) | 2003-10-29 |
| SE9601236D0 (sv) | 1996-03-29 |
| CZ313598A3 (cs) | 1999-05-12 |
| JP2000507450A (ja) | 2000-06-20 |
| US6333448B1 (en) | 2001-12-25 |
| ES2210493T3 (es) | 2004-07-01 |
| PL329175A1 (en) | 1999-03-15 |
| CA2250234A1 (en) | 1997-10-09 |
| NO984448L (no) | 1998-11-30 |
| EP0889970A1 (en) | 1999-01-13 |
| DE69725841D1 (de) | 2003-12-04 |
| DK0889970T3 (da) | 2004-03-08 |
| DE69725841T2 (de) | 2004-07-29 |
| ATE253124T1 (de) | 2003-11-15 |
| AU720765B2 (en) | 2000-06-08 |
| CA2250234C (en) | 2007-05-15 |
| PT889970E (pt) | 2004-03-31 |
| PL187096B1 (pl) | 2004-05-31 |
| NO326619B1 (no) | 2009-01-19 |
| WO1997037033A1 (en) | 1997-10-09 |
| AU1818797A (en) | 1997-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Broun et al. | Accumulation of ricinoleic, lesquerolic, and densipolic acids in seeds of transgenic Arabidopsis plants that express a fatty acyl hydroxylase cDNA from castor bean | |
| US20200002712A1 (en) | Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, novel fatty acid desaturase family members and uses thereof | |
| Sperling et al. | A bifunctional Δ6‐fatty acyl acetylenase/desaturase from the moss Ceratodon purpureus: A new member of the cytochrome b5 superfamily | |
| Hernández et al. | Molecular cloning and characterization of genes encoding two microsomal oleate desaturases (FAD2) from olive | |
| Lu et al. | A high‐throughput screen for genes from castor that boost hydroxy fatty acid accumulation in seed oils of transgenic Arabidopsis | |
| Covello et al. | Functional expression of the extraplastidial Arabidopsis thaliana oleate desaturase gene (FAD2) in Saccharomyces cerevisiae | |
| AU723161B2 (en) | Alteration in an amount of an unsaturated fatty acid by genetic manipulation | |
| AU2007272252B2 (en) | Fatty acid desaturases and uses thereof | |
| CZ292780B6 (cs) | Způsob produkce acetylenových sloučenin, cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu a její použití a organismy transformované acetylenázovou cDNA | |
| EP3778866B1 (en) | Recombinant yeast strain for producing nervonic acids and application thereof | |
| US6433250B1 (en) | Use of plant fatty acyl hydroxylases to produce hydroxylated fatty acids and derivatives in plants | |
| NZ552254A (en) | Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids | |
| US5668292A (en) | Use of plant fatty acyl hydroxylases to produce hydroxylated fatty acids and derivatives in plants | |
| US6291742B1 (en) | Production of hydroxylated fatty acids in genetically modified plants | |
| US7923598B2 (en) | Fatty acid hydroxylases and uses thereof | |
| Hatanaka et al. | Expression of a Stokesia laevis epoxygenase gene | |
| Chellamuthu et al. | Increase in alpha-linolenic acid content by simultaneous expression of fatty acid metabolism genes in Sesame (Sesamum indicum L.) | |
| AU720765C (en) | Novel plant enzyme and use thereof | |
| Huffman Sr | A New Polyacetylenic Alcohol in Fistulina Hepatica: Progress Towards the Identification of Acetylenases in Basidiomycetes | |
| Lin | Functional Characterization of Plant Patatin-like Phospholipase A III in Transgenic Arabidopsis thaliana Producing 18 Carbon Hydroxy Fatty Acids | |
| US20160298148A1 (en) | Enrichment of oils with polyunsaturated fatty acids | |
| SakamOtO | Fatty acid desaturases of cyanobacteria and the modification of membrane lipid unsaturation. | |
| Dahmen | Deciphering the role of cytochrome b5-desaturase interactions for fatty acid desaturation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100214 |