DE19710964A1 - Cis/trans-Isomerase aus Pseudomonas - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym, das die Konfiguration der Doppelbindung ungesättigter Fettsäuren von cis nach trans umwandeln sowie die umgekehrte Reaktion durchführen kann.

Es ist bekannt, daß das Bakterium Pseudomonas putida die Doppelbindung einfach ungesättig­ ter Fettsäuren von der cis-Konfiguration in die trans-Konfiguration umwandeln sowie die umgekehrte Reaktion durchführen kann [H. Keweloh und H.J. Heipieper, Lipids 31 (1996) 129-137; H. Keweloh, B. Loffeld und H.J. Heipieper, Biospektrum 3 (1996) 18-25]. Die Pseudomonaden nutzen diese Umwandlung, indem sie auf verschiedene Arten von Stress mit Veränderung der Fettsäurezusammensetzung ihrer Membran reagieren. Physikalische und che­ mische Umweltfaktoren, die die Fluidität der Zellmembran verändern, aktivieren das Fett­ säuren-modifizierende System und können dann offensichtlich besser toleriert werden. Das für die genannte Konfigurationsänderung notwendige System ist von der Fettsäure-Neusynthese unabhängig. In vivo ist die Isomerisierungsaktivität eng an die Zellmembran der Pseudomo­ naden gekoppelt. In dieser membranassoziierten Form des cis/trans-Isomerisierungssystems werden Fettsäuren nur als Substrate akzeptiert, wenn sie in veresterter Form, das heißt als Komponenten der Phospholipide vorliegen. Das cis/trans-isomerisierende Wirkprinzip ist allerdings auch in zell- und membranfreien Extrakten aktiv und akzeptiert in dieser löslichen Form auch freie Fettsäuren als Substrate [H. Okuyama, D. Enari, A. Shibahara, K. Yamamoto und N. Morita, Arch. Microbiol. 165 (1996) 415-417].

Da sowohl cis- als auch trans-konfigurierte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen keine freie Drehbarkeit beziehungsweise Rotation aufweisen, unterscheiden sich die Reaktionsedukte und -produkte des Isomerisierungssystems in ihrer räumlichen Konformation (siehe Fig. 1). Für Lipidaggregate wie biologische Membranen hat dies deutliche Konsequenzen: Aufgrund der höheren Packungsdichte zum Beispiel von Lipiden mit trans-isomeren Fettsäuren weisen solche Membranen eine geringere Fluidität beziehungsweise eine niedrigere Übergangs­ temperatur von der gelförmigen zur flüssig-kristallinen Phase auf [R.R. Brenner, Lipid Res. 23 (1984) 69-96].

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein aus Pseudomonas-Bakterien, insbesondere aus Pseudomonas putida DSM 11306 erhältliches Enzym, welches die cis/trans-Isomerisierung von ungesättigten Fettsäuren, insbesondere einfach ungesättigten Fettsäuren, und deren Derivaten wie Estern, Amiden und Anhydriden katalysiert (cis/trans-Isomerase, cti), und deren Gene, insbesondere das für die cis/trans-Isomerase aus Pseudomonas putida DSM 11306 kodierende Gen, das im Rahmen der Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führten, identifiziert und sequenziert worden ist. Diese Gene können gewünschtenfalls in im Prinzip bekannter Weise in anderen Bakterien kloniert und dort die cis/trans-Isomerase exprimiert werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher auch durch im wesentlichen mikrobiologische Verfahren erhältliche Wirtsorganismen, welche die genannten Gene enthalten. Die Sequenz des cis/trans-Isomerase-Gens (SEQ ID-NO:1) aus Pseudomonas putida DSM 11306 wie auch die Aminosäuresequenz der aus diesem Mikroorganismus erhältlichen erfindungsgemäßen cis/trans-Isomerase (SEQ ID-NO:2) ist in Fig. 5 wiedergege­ ben. Das Gen besteht aus 2295 Basenpaaren, enthält eine Signalsequenz zur Ausschleusung durch die Cytoplasmamembran und weist keine signifikanten Homologien zu bislang publizier­ ten Gensequenzen auf. Der entsprechende Mikroorganismus (P8) ist am 17.12.1996 bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig hinterlegt worden und hat die Eingangsnummer DSM 11306 erhalten.

Vorzugsweise weist eine erfindungsgemäße cis/trans-Isomerase aus Pseudomonas-Bakterien eine Homologie von mindestens 30% zur cis/trans-Isomerase aus Pseudomonas putida DSM 11306 auf. Gleiches gilt für das zugrundeliegende Gen.

Das erfindungsgemäße Enzym ist in wäßrigen Medien relativ stabil. Das in-vivo membran­ assoziierte Protein weist auch in unpolaren Medien und mehrphasigen Systemen eine gute Stabilität auf. Letzteres ist insofern von Bedeutung, da Fettsäuren und Fettsäuren-enthaltende Ausgangs- und Endprodukte der Isomerisierungsreaktion von hydrophober Natur sind.

Durch die Identifizierung und Klohierung des Isomerase-Gens ergibt sich die Möglichkeit, mit Hilfe von gentechnischen Methoden ein wirtschaftliches biotechnologisches Verfahren zur Gewinnung des enzymatischen Katalysators zu entwickeln. Eine effiziente Proteinsynthese der Isomerase in einem rekombinanten Organismus bildet dazu die Voraussetzung.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms zur Umwandlung cis-konfigurierter Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen von ungesättigten Fettsäuren, insbesondere von einfach ungesättigten Fettsäuren, und deren Derivaten wie Estern, Amiden und Anhydriden, in trans-konfigurierte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbin­ dungen und ein Verfahren zur Herstellung von trans-konfigurierten ungesättigten Fettsäuren, insbesondere von einfach ungesättigten Fettsäuren, und deren Derivaten wie Estern, Amiden und Anhydriden, aus entsprechenden cis-konfigurierten Verbindungen unter Einsatz des erfindungsgemäßen Enzyms, sowie die entsprechende Verwendung und das entsprechende Verfahren zur Umwandlung trans-konfigurierter Doppelbindungen in cis-konfigurierte Doppelbindungen. Zu den Derivaten ungesättigter Fettsäuren mit Esterfunktion gehören auch insbesondere natürlich vorkommende oder aus diesen erhältliche Fette und Öle. Im Rahmen dieses Aspekts der Erfindung ist die Konfigurationsumwandlung von Fettsäuren beziehungs­ weise deren Derivaten, die Inhaltsstoffe von kosmetischen Zubereitungen und beispielsweise als Bestandteile von Liposomen in diesen enthalten sind, von besonderer Bedeutung.

Zu den im Sinne der Erfindung geeigneten Fettsäuren, die wie angegeben derivatisiert sein können, gehören beispielsweise Lauroleinsäure, Myristoleinsäure, Palmitoleinsäure, Petroselin­ säure, Petroselaidinsäure, Ölsäure, Elaidinsäure, Ricinolsäure, Linolsäure, Linolaidinsäure, Linolensäure, Eläostearinsäure, Gadoleinsäure, Arachidonsäure, Erucasäure, Brassidinsäure und Clupanodonsäure.

Die erfindungsgemaße cis/trans-Isomerase wandelt die Konfiguration der Doppelbindung un­ gesättigter Fettsäuren überraschenderweise ohne Veränderung ihrer Position um. Somit kann zum Beispiel spezifisch Ölsäure (18 : 1 cis9) in Elaidinsäure (18 : 1 trans9) umgewandelt werden und umgekehrt. Bislang bekannte cis/trans-Isomerasen ändern nicht allein die Konfiguration der Doppelbindung, sondern verschieben gleichzeitig ihre Position [S. Seltzer in dem von P.D. Boyer herausgegebenen Standardwerk The Enzymes, Band 6, Seiten 381-406, Academic Press (1972); G. Müller-Newen, U. Janssen und W. Stoffel, Europ. J. Biochem. 228 (1995) 68-73]. Auch nicht-enzymatische Verfahren mit Hilfe von Metallkatalysatoren führen neben der geometrischen Isomerisierung in der Regel zu Positionsveränderungen der Doppelbindung.

Bei der cis/trans-Isomerisierung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen handelt es sich unter mechanistischer Betrachtung wahrscheinlich um eine gekoppelte Hydratation/Dehydrata­ tion. Das erfindungsgemäße isomerisierende Enzym benötigt zur Katalyse dieser Reaktion allerdings keine Cofaktoren wie ATP oder NADPH. Mit dem erfindungsgemaßen Enzym ist eine postbiosynthetische Modifikation der Fettsäuren, zum Beispiel innerhalb einer Membran, und damit eine Veränderung der Membraneigenschaften wie der Fluidität beziehungsweise der Phasenübergangstemperatur, in einfacher Weise möglich. Zur praktischen Anwendung dieses Aspekts wird eine erfindungsgemäße cis/trans-Isomerase vorzugsweise in kosmetischen Zubereitungen verwendet.

Der Einsatz der cis/trans-Isomerase aus Pseudomonas putida ist insbesondere bei der Modifizierung ungesättigter Fettsäuren von Vorteil. Natürliche Fettsäuren sind wertvolle Ausgangsprodukte für die Herstellung von Tensiden, Emulgatoren, Dispergiermitteln und Schmierstoffen. Das erfindungsgemäße Enzym wird daher vorzugsweise in der Waschmittel-, Kunststoff- und Farbstoffindustrie eingesetzt. Auch für die Feinchemikalienindustrie ist das erfindungsgemaße Enzym von Bedeutung, denn mit seiner Hilfe können aus preiswerten Ausgangssubstanzen, wie zum Beispiel pflanzlichen Ölen und Fetten, hochwertige und auf anderem Wege nicht leicht zugängliche Substanzen stereoselektiv synthetisiert werden.

Da Öle und Fette als nachwachsende Rohstoffe auch aus umweltpolitischen Gründen zunehmende Bedeutung gewinnen, sind Fettsäuren preislich günstige Ausgangsverbindungen zur Synthese verschiedenster Substanzen. Technisch sind die Fettsäuren aus den natürlichen Rohstoffen, in der Regel Glyceriden, über bekannte chemische oder enzymatische Methoden leicht zugänglich. Zur Variation der Eigenschaften dieser Verbindungen bietet sich neben der Carboxylgruppe nur die Doppelbindung an, die in natürlichen Verbindungen fast ausschließlich in der cis-Konfiguration vorkommt. Doppelbindungen ungesättigter Fettsäuren und derer Derivate sind aufgrund ihrer hohen Reaktivität die bevorzugten Angriffspunkte für Reaktionen an der Fettsäurekette. Allein durch Isomerisierung in die trans-Konfiguration verändern sich die chemisch-physikalischen Eigenschaften der betroffenen Fette und Öle in erheblichem Maße. Nach Umwandlung der cis-konfigurierten Doppelbindung von Fettsäuren in die trans- Konfiguration können außerdem nachfolgende Derivatisierungen wie beispielsweise enzyma­ tische Hydroxylierungen durchgeführt werden, die dann zu neuen optisch aktiven Hydroxy- Verbindungen oder weiteren Derivaten führen.

Weitere Vorteile durch die Anwendung der erfindungsgemäßen cis/trans-Isomerase ergeben sich in der Lebensmitteltechnologie. So stellt die selektive Hydrierung mehrfach ungesättigter Fettsäuren im Gegensatz zur Fetthärtung ein nur unvollkommen gelöstes Problem dar, da gerade aufgrund von cis/trans-Isomerisierungen trans-Isomere wie zum Beispiel Elaidinsäure üblicherweise in hohen Mengen als Nebenprodukte auftreten [A. Behr, N. Döring, S. Durowicz-Heil, B. Ellenberg, C. Kozik, C. Lohr und H. Schmidke, Fat Sci. Technol. 95 (1993) 2]. Mit Hilfe der cis/trans-Isomerase aus Pseudomonas putida kann in diesem Fall eine spezifische Umwandlung in die cis-Isomere ohne eine Verschiebung der Doppelbindungspo­ sition erfolgen.

Die Entwicklung von Verfahren, die der Reduzierung der gesundheitlich als bedenklich angesehenen trans-Fettsäuren in Lebensmitteln dienen, ist angesichts des stark ausgeprägten Gesundheitsbewußtseins unserer Gesellschaft von großer wirtschaftlicher Bedeutung. Bei der bisher angewendeten katalytischen Hydrierung von pflanzlichen Ölen zur Härtung von Fetten entstehen verschiedene trans-Fettsäureisomere in oft unerwünscht hohen Anteilen. Die Rolle von trans-Fettsäuren bei der Entwicklung von Hypercholesterie ist zur Zeit stark umstritten, da diese Verbindungen die Zusammensetzung von und den Gehalt an Serumlipoproteinen in ungünstiger Weise beeinflussen können. Ernährungsstudien der letzten Jahre [R.P. Mensink und M.B. Katan, New England J. Med. 323 (1990) 439; P.L. Zock und M.B. Katan, J.Lipid Res. 33 (1992) 399] sprechen dafür, daß trans-ungesättigte Fettsäuren in Nahrungsmitteln einen noch schädlicheren Einfluß bei der Entstehung von Koronarkrankheiten haben als gesättigte Fettsäuren. Auch zur Lösung dieses Problems kann die Erfindung beitragen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen cis/trans-Isomerase in der Lebensmittelindustrie zur Umwandlung unerwünschter trans­ konfigurierter Fettsäuren, die Bestandteile von Speisefetten und -ölen sind, in die cis­ konfigurierten Isomere.

Erläuterung der Zeichnungen

Fig. 1 Cis/trans-Isomerisierung ungesättigter Fettsäuren und Einfluß auf die Packung der Lipide in einer Membran.

Fig. 2 Physikalische Karte des Vektors pUT-Km® [V. de Lorenzo, M. Herrero, U. Jacubzik und K.N. Timmis, J. Bacteriol. 172 (1990) 6568-6572]. Der Vektor trägt eine mini- Tn5-Kanamycinkartusche. Die dickeren schwarzen Balken sind die 19 Basenpaare der terminalen Repeats des Transposon Tn5. Das Transposase-Gen (tnp*) liegt außerhalb des mobilen Elementes. Der Vektor besitzt als Replikationsursprung einen π-Protein abhängigen Ori des Plasmides R6K. Für den konjugativen Transfer trägt der Vektor den oriT des Plasmides RP4. Das bla-Gen vermittelt Resistenz gegen β-Lactam- Antibiotika.

Fig. 3 Physikalische Karte des Vektors pISA9-2. Tn5-Km: Km-Kartusche des mini-Tn5 Vektors pUT-Km flankiert von den 19 Bp terminalen Repeats und einer multiplen Klonierungsstelle; cti': ein Teil der cis/trans-Isomerase, metH': ein Teil des Methionin-Synthasegens; lacZ' und 'lacZ': durch die Klonierung disruptiertes lacZ-Gen des Vektors pUCBM20; amp: Ampicillin-Resistenzgen.

Fig. 4 Physikalische Karte des cti-Genlocus und benachbarter DNA-Regionen. Restriktions­ karte der analysierten Region und Anordnung der identifizierten Strukturgene. Zur besseren Übersicht sind nur die für die Klonierungen relevanten Schnittstellen angegeben. Die Methioninsynthase ist nicht vollständig auf dem klonierten Fragment vorhanden und daher durch methH' gekennzeichnet. Die Pfeile verdeutlichen die Sequenzierungsstrategie.

Fig. 5 Nukleotidsequenz des XhoI-Bg/II-Fragmentes des cti-Gens mit 5' und 3' flankieren­ den Regionen. Die von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind im "Ein-Buchstaben-Code" wiedergegeben und die darunter stehenden Zahlen geben die Position der Aminosäuren im Protein an. Die potentielle Ribosomen- Bindungsstelle ist unterstrichen und mit "S/D" gekennzeichnet. Der Integrationsort von Tn5 in der Mutante A9 ist durch eine schwarze Raute dargestellt.

Beispiele Beispiel 1 Isolierung und Klonierung der cis/trans-Isomerase aus Pseudomonas putida

Durch Transposonmutagenese wurden zunächst Mutanten des Pseudomonas putida Stammes (DSM 11306) hergestellt, die ihre Fähigkeit verloren hatten, eine cis/trans-Isomerisierung von ungesättigten Fettsäuren in ihren Membranen durchführen zu können. Über den Mini-Tn5- Vektor pUT-Km® (Fig. 2) wurden Transkonjuganten unter Verwendung des E. coli Stammes SM10λpir hergestellt. Aus über 6000 gegen Kanamycin resistenten Pseudomonas putida P8-Transkonjuganten wurde ein Stamm ermittelt, der eine erhöhte Temperatur­ sensitivität (fehlendes Wachstum bei 37°C, normales Wachstum bei 30°C) zeigte. Bei Messungen der isomeren Fettsäuren mittels Gaschromatographen korrelierte dieser temperatursensitive Phänotyp mit dem Fehlen einer Isomerisierung der Fettsäuren. In dieser Mutante waren auch nach Exposition gegen Ethanol (10%) und Phenol (1 g/l) keine trans­ konfigurierten Fettsäuren nachweisbar. Durch Restriktionsanalysen und Southern-Blot- Hybridisierungen mit dem Mini-Tn5 als Sonde wurde die Integration des Mini-Tn5 im Genom nachgewiesen. Nach Rückklonierung des Mini-Tn5 mit flankierenden Sequenzen ergab sich der Vektor pISA9-2 (Fig. 3). Es wurde eine Lambda-Genbank des Pseudomonas putida P8 Stammes mit den das Transposon flankierenden Sequenzen als Sonde überprüft. Zwei Lambda- Klone mit identischem Insert wurden identifiziert. Die anschließende Sequenzierung eines BglII-Fragments (4,5 kb) erfolgte nach der in Fig. 4 angegebenen Sequenzierungsstrategie. Auf diesem BglII-Fragment konnten 2 offene Leserahmen identifiziert werden. Der mit metH' bezeichnete offene Leserahmen codiert vermutlich für eine Methionin-Synthase, wie aus Datenbankenvergleichen abgeleitet. Die Apostrophierung weist darauf hin, daß dieser offene Leserahmen nicht gänzlich auf dem Fragment vorhanden ist. Überraschenderweise liegt der Insertionsort des Transposons in der Mutante am aminoterminalen Ende des metH-Gens. Wie in Fig. 4 dargestellt, erstreckt sich der cis/trans-Isomerase-Leserahmen von Basenpaar 1999 bis 4294. Die Insertion des Transposons in die Nähe des offenen Leserahmens hat offensichtlich einen negativen Positionseffekt auf die Expression dieses Gens. Die Klonierung eines XhoI- BglII-Fragments erbrachte eine Komplementation des Defekts in der Pseudomonas putida- Mutante, so daß in der Membran wieder trans-konfigurierte Fettsäuren nachweisbar waren. Damit einher ging der temperatur- und ethanolresistente Phänotyp. Die Klonierung des XhoI- BglII-Fragments in E.coli erbrachte darüber hinaus den überraschenden Befund, daß nun auch in einem heterologen System eine cis/trans-Isomerisierung von ungesättigten Fettsäuren in der Membran zu beobachten war. Die ermittelte Nukleotidsequenz des cis/trans-Isomerase-Gens ist in SEQ. ID-NO. 1 und zusammen mit der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz für die cis/trans-Isomerase in Fig. 5 angegeben.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (13)

1. Aus Pseudomonas, insbesondere aus Pseudomonas putida DSM 11306 erhältliches Enzym, welches die cis/trans-Isomerisierung von ungesättigten Fettsäuren katalysiert.

2. Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 5 wiedergegebene Aminosäuresequenz aufweist oder eine Homologie von mindestens 30% zu der in SEQ ID-NO:2 wiedergegebenen Aminosäuresequenz aufweist.

3. Gen, das für ein Enzym gemäß Anspruch 1 oder 2 kodiert.

4. Gen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID-NO.:1 wiedergege­ bene Sequenz oder eine Homologie von mindestens 30% zu dieser Sequenz aufweist.

5. Durch im wesentlichen mikrobiologische Verfahren erhältlicher Wirtsorganismus, welcher ein Gen gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4 enthält.

6. Verwendung eines aus Pseudomonas, insbesondere aus Pseudomonas putida DSM 11306 erhältlichen Enzyms, welches die cis/trans-Isomerisierung von ungesättigten Fettsäuren katalysiert, zur Umwandlung cis-konfigurierter Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen von ungesättigten Fettsäuren, insbesondere von einfach ungesättigten Fettsäuren, und deren Derivaten wie Estern, Amiden und Anhydriden, in trans-konfigurierte Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbindungen.

7. Verwendung eines aus Pseudomonas, insbesondere aus Pseudomonas putida DSM 11306 erhältlichen Enzyms, welches die cis/trans-Isomerisierung von ungesättigten Fettsäuren katalysiert, zur Umwandlung trans-konfigurierter Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbin­ dungen von ungesättigten Fettsäuren, insbesondere von einfach ungesättigten Fettsäuren, und deren Derivaten wie Estern, Amiden und Anhydriden, in cis-konfigurierte Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbindungen.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäuren Bestandteile von Speisefetten und -ölen sind.

9. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäuren beziehungsweise deren Derivate Inhaltsstoffe von kosmetischen Zubereitungen sind.

10. Verwendung eines aus Pseudomonas, insbesondere aus Pseudomonas putida DSM 11306 erhältlichen Enzyms, welches die cis/trans-Isomerisierung von ungesättigten Fettsäuren katalysiert, in kosmetischen Zubereitungen

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym die in SEQ ID-NO:2 wiedergegebene Aminosäuresequenz aufweist oder eine Homologie von mindestens 30% zu der in Fig. 5 wiedergegebenen Aminosäuresequenz aufweist.

12. Verfahren zur Herstellung von trans-konfigurierten ungesättigten Fettsäuren, insbesondere von einfach ungesättigten Fettsäuren, und deren Derivaten wie Estern, Amiden und Anhydriden, aus entsprechenden cis-konfigurierten Verbindungen unter Einsatz eines Enzyms gemäß Anspruch 1 oder 2.

13. Verfahren zur Herstellung von cis-konfigurierten ungesättigten Fettsäuren, insbesondere von einfach ungesättigten Fettsäuren, und deren Derivaten wie Estern, Amiden und Anhydriden, aus entsprechenden trans-konfigurierten Verbindungen unter Einsatz eines Enzyms gemäß Anspruch 1 oder 2.