DE10312314A1 - Verfahren zur Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in transgenen Organismen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in transgenen Organismen Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten durch Kultivierung von genetisch veränderten Organismen sowie die genetisch veränderten Organismen, insbesondere Hefen selbst.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten durch Kultivierung von genetisch veränderten Organismen sowie die genetisch veränderten Organismen, insbesondere Hefen selbst.
  • Ergosta-5,7-dienol und dessen biosynthetischen Zwischenprodukte des Sterolstoffwechsels, wie beispielsweise Farnesol, Geraniol, Squalen und Lanosterol und Zymosterol, sowie dessen biosynthetischen Folgeprodukte des Sterolstoffwechsels, beispielsweise in Säugern, wie beispielsweise Campesterol, Pregnenolon, 17-OH Pregnenolon, Progesteron, 17-OH Progesteron, 11-Deoxycortisol, Hydrocortison, Deoxycorticosteron oder Corticosteron sind Verbindungen mit hohem wirtschaftlichen Wert.
  • Ergosta-5,7-dienol kann als Ausgangsverbindung für die Herstellung von Steroidhormonen über Biotransformationen, chemische Synthese oder biotechnologische Herstellung dienen.
  • Hydrocortison hat einen schwachen glucocorticoiden Effekt und ist eine gesuchte Ausgangsverbindung für die Synthese von Wirkstoffen mit starker entzündungshemmender, abortiver oder antiproliferativen Wirkung.
  • Squalen wird als Synthesebaustein für die Synthese von Terpenen benutzt. In hydrierter Form findet es als Squalan Verwendung in Dermatologie und Kosmetik sowie in verschiedenen Derivaten als Inhaltsstoff von Haut- und Haarpflegemitteln.
  • Weiterhin wirtschaftlich nutzbar sind Sterole, wie Zymosterol und Lanosterol, wobei Lanosterol Roh- und Synthesepivotal für die chemische Synthese von Saponinen und Steroidhormonen ist. Wegen seiner guten Hautpenetration und Spreadingeigenschaften dient Lanosterol als Emulsionshilfs- und Wirkstoff für Hautcremes.
  • Ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten ist daher von großer Bedeutung.
  • Besonders wirtschaftliche Verfahren sind biotechnologische Verfahren unter Ausnutzung natürlicher oder durch genetische Veränderung optimierter Organismen, die Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetische Zwischen- und/oder Folgeprodukte herstellen.
  • Die Gene des Ergosterol-Stoffwechsels in Hefe sind weitgehend bekannt und kloniert, wie beispielsweise
    Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase (HMG)(Bason M.E. et al, (1988) Structural and functional conservation between yeast and human 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductases, the rate-limiting enzyme of sterol biosynthesis. Mol Cell Biol 8: 3797-3808,
    die Nukleinsäure kodierend eine trunkierte HMG-CoA-Reduktase (t-HMG)(Polakowski T, Stahl U, Lang C. (1998) Overexpression of a cytosolic hydroxymethylglutaryl-CoA reductase leads to squalene accumulation in yeast. Appl Microbiol Biotechnol. Jan; 49(1): 66-71,
    die Nukleinsäure kodierend eine Lanosterol-C14-Demethylase (ERG11) (Kalb VF, Loper JC, Dey CR, Woods CW, Sutter TR (1986) Isolation of a cytochrome P-450 structural gene from Saccharomyces cerevisiae. Gene 45(3): 237-45,
    die Nukleinsäure kodierend eine Squalenepoxidase (ERG1) (Jandrositz, A., et al (1991) The gene encoding squalene epoxidase from Saccharomyces cerevisiae: cloning and characterization. Gene 107: 155-160 und
    und Nukleinsäuren kodierend eine Squalensynthetase (ERG9) (Jennings, S.M., (1991): Molecular cloning and characterization of the yeast gene for squalene synthetase. Proc Natl Acad Sci USA. Jul15;88(14): 6038-42).
  • Weiterhin sind Verfahren bekannt, die eine Erhöhung des Gehalts an spezifischen Intermediaten und Endprodukten des Sterolstoffwechsels in Hefen und Pilzen zum Ziel haben.
  • Aus T. Polakowski, Molekularbiologische Beeinflussung des Ergosterolstoffwechsels der Hefe Saccharomyces cerevisiae, Shaker Verlag Aachen, 1999, Seite 59 bis 66 ist bekannt, dass die Erhöhung der Expressionsrate der HMG-CoA-Reduktase zu einer leichten Erhöhung des Gehalts an frühen Sterolen, wie Squalen führt, während sich der Gehalt an späteren Sterolen, wie Ergosterol nicht signifikant ändert, bzw. tendentiell eher abnimmt.
  • Tainaka et al., J, Ferment. Bioeng. 1995, 79, 64-66, beschreiben ferner, dass die Überexpression von ERG11 (Lanosterol-C14-Demethylase) zu einer Anreicherung von 4,4-Dimethylzymosterol jedoch nicht von Ergosterol führt. Die Transformante zeigte gegenüber dem Wildtyp einen, je nach Fermentationsbedingungen, um den Faktor 1,1 bis 1,47 gesteigerten Zymosterolgehalt.
  • WO 99/16886 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Ergosterol in Hefen, die eine Kombination der Gene tHMG, ERG9, SAT1 und ERG1 überexprimieren.
  • EP 486 290 offenbart ein Verfahren zur Erhöhung von Squalen, Zymosterol, Ergosta-5,7,24(28)trienol und Ergosta-5,7-dienol in Hefe indem man die Expressionsrate der HMG-CoA-Reduktase erhöht und gleichzeitig den Stoffwechselweg der Ergosta-5,7,24(28)-trienol-22-dehydrogenase, im folgenden auch Δ22-Desaturase (ERG5) genannt, unterbricht.
  • Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass die Ausbeute an Ergosta-5,7-dienol noch nicht befriedigend ist.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein weiteres Verfahren zu Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten mit vorteilhaften Eigenschaften, wie einer höheren Produktausbeute, zur Verfügung zu stellen.
  • Demgemäss wurde ein Verfahren zur Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten gefunden, in dem man Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp
    eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und
    eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase Aktivität und
    eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität
    aufweisen.
  • Unter einer reduzierten Aktivität wird sowohl die reduzierte als auch das komplette Ausschalten der Aktivität verstanden. Eine Reduzierung einer Aktivität umfasst demnach auch eine mengenmässige Verringerung des entsprechenden Proteins in dem Organismus bis hin zu einem vollständigen Fehlen des entsprechenden Proteins, beispielsweise zu testen durch eine fehlende Nachweisbarkeit der entsprechenden Enzymaktivität oder eine fehlende immunologische Nachweisbarkeit der entsprechenden Proteine.
  • Unter Δ22-Desaturase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Δ22-Desaturase verstanden.
  • Unter einer Δ22-Desaturase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Ergosta-5,7-dienol in Ergosta-5,7,22,24-tetraen-3β-ol umzuwandeln.
  • Dementsprechend wird unter Δ22-Desaturase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ22-Desaturase umgesetzte Menge Ergosta-5,7-dienol bzw. gebildete Menge Ergosta-5,7,22,24-tetraen-3β-ol verstanden.
  • Bei einer reduzierten Δ22-Desaturase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ22-Desaturase die umgesetzte Menge Ergosta-5,7-dienol bzw. die gebildete Menge Ergosta-5,7,22,24-tetraen-3β-ol reduziert.
  • Vorzugsweise erfolgt diese Reduzierung der Δ22-Desaturase-Aktivität auf mindestens 90%, weiter bevorzugt auf mindestens 70%, weiter bevorzugt auf mindestens 50%, weiter bevorzugt auf mindestens 30%, bevorzugter auf mindestens 10%, noch bevorzugter auf mindestens 5%, insbesondere auf 0% der Δ22-Desaturase-Aktivität des Wildtyps. Besonders bevorzugt ist demnach ein Ausschalten der D22-Desaturase-Aktivität im Organismus.
  • Die Bestimmung der Aktivität der Δ22-Desaturase (ERG5) kann wie im folgenden beschrieben durchgeführt werden:
    Verschiedene Konzentrationen von Ergosta-5,7-dienol, aufgereinigt aus erg5 Mutantnen von S. cerevisiae (Parks et al, 1985. Yeast sterols.yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Methods Enzymol. 111:333-346) und 50 ∝g dilauroylphosphatidylcholin werden gemischt und mit Ultraschall behandelt, bis eine weisse Suspension entsteht. Aufgearbeitete Mikrosomen werden hinzugegeben (1 ml)(3 mg/ml Protein). NADPH (Endkonzentration, 1 mM) wird dem Testansatz zum Start der Enzymreaktion hinzugegeben. Der Ansatz wird 20 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 3 ml Methanol gestoppt und Sterole werden verseift durch Zugabe von 2 ml 60% (wt/vol) KOH in Wasser. Der Ansatz wird bei 90°C for 2 h inkubiert. Der Ansatz wird nach dem Abkühlen dreimal mit 5 ml Hexan extrahiert und durch Rotationsverdampfung eingeengt. Anschliessend werden die Sterole 1 h bei 60°C mit bis(Trimethylsilyl)trifluoroacetamid (50 μl in 50 μl Toluol) silyliert. Die Sterole werden durch Gas Chromatographie-Massen Spektroskopie (GC-MS) (beispielsweise Model VG 12-250 gas chromatograph-mass spectrometer; VG Biotech, Manchester, United Kingdom) analysiert. Das entstandene Δ22-desaturierte Intermediat kann abhängig von der eingesetzten Menge an Substrat identifiziert werden. Als Referenz dienen Mikrosomen, die nicht mit Substrat inkubiert werden.
  • Dieses Verfahren ist eine Abwandlung des in Lamb et al: Purification, reconstitution, and inhibition of cytochrome P-450 sterol delta22-desaturase from the pathogenic fungus Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 1999 Jul;43(7):1725-8., beschriebenen Verfahrens.
  • Die Reduzierung der Δ22-Desaturase-Aktivität kann unabhängig voneinander durch unterschiedliche zellbiologische Mechanismen erfolgen, beispielsweise durch Inhibition der entsprechenden Aktivität auf Proteinebene, beispielsweise durch Zugabe von Inhibitoren der entsprechenden Enzyme oder durch Reduzierung der Genexpression der entsprechenden Nukleinsäuren, codierend eine Δ22-Desaturase, gegenüber dem Wildtyp.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Reduzierung der Δ22-Desaturase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Reduzierung der Genexpression der entsprechenden Nukleinsäuren, codierend eine Δ22-Desaturase.
  • Die Reduzierung der Genexpression der Nukleinsäuren, codierend eine Δ22-Desaturase, gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch
    • a) Einbringen von Nukleinsäuresequenzen, welche zu einer antisense-Nukleinsäuresequenz transkribierbar sind, die zur Inhibition der Δ22-Desaturase-Aktivität befähigt ist, beispielsweise indem sie die Expression von endogener Δ22-Desaturase-Aktivität inhibiert,
    • b) die zu Kosuppression führende Überexpression homologer Δ22-Desaturase-Nukleinsäuresequenzen,
    • c) die Einführung von Nonsense-Mutationen in das Endogen mittels Einführung von RNA/DNA-Oligonukleotiden in den Organismus,
    • d) durch das Einbringen von spezifischen DNA-bindenden Faktoren, beispielsweise Faktoren vom Typus der Zinkfingertranskriptionsfaktoren, die eine Reduzierung der Genexpression bewirken oder
    • e) die Generierung von Knockout-Mutanten, beispielsweise mit Hilfe von T-DNA-Mutagenese oder homologer Rekombination.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Reduzierung der Genexpression der Nukleinsäuren, codierend eine Δ22-Desaturase durch Generierung von Knockout-Mutanten, besonders bevorzugt durch homologe Rekombination.
  • Demnach wird bevorzugt ein Organismus verwendet, der kein funktionelles Δ22-Desaturase-Gen aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Generierung von Knockout-Mutanten, also die Deletion des Ziellocus Δ22-Desaturase-Gen bei gleichzeitiger Integration einer Expressionskasette, enthaltend mindestens eine der nachstehend beschriebenen Nukleinsäuren, codierend ein Protein dessen Aktivität im Vergleich zum Wildtyp erhöht wird, durch homologe Rekombination.
  • Dazu können Nukleinsäurekonstrukte verwendet werden, die neben den nachstehend beschriebenen Expressionskasetten, enthaltend Promotor, kodierende Sequenz und gegebenenfalls Terminator und neben einem nachstehend beschriebenen Selektionsmarker am 3'- und 5'-Ende Nukleinsäuresequenzen enthalten, die mit Nukleinsäuresequenzen am Anfang und am Ende des zu deletierenden Gens identisch sind.
  • Vorzugsweise kann der Selektionsmarker nach der Selektion durch Rekombinase-Systeme wieder entfernt werden, beispielsweise durch loxP-Signale am 3'- und 5'-Ende des Selektionsmarkers unter Verwendung einer Cre-Rekombinase (Cre-LoxP-System).
  • Im bevorzugten Organismus Saccharomyces cerevisiae bedeutet das Δ22-Desaturase-Gen das Gen ERG5 (SEQ. ID. NO. 1). SEQ. ID. NO. 2 stellt die entsprechende Δ22-Desaturase aus Saccharomyces cerevisiae dar (Skaggs, B.A. et al,: Cloning and characterization of the Saccharomyces cerevisiae C-22 sterol desaturase gene, encoding a second cytochrome P-450 involved in ergosterol biosynthesis, Gene.1996 Feb22;169(1):105-9.).
  • Unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer HMG-CoA-Reduktase (3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduktase) verstanden.
  • Unter einer HMG-CoA-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A in Mevalonat umzuwandeln.
  • Dementsprechend wird unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A bzw. gebildete Menge Mevalonat verstanden.
  • Bei einer erhöhten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein NMG-CoA-Reduktase die umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A bzw. die gebildete Menge Mevalonat erhöht.
  • Vorzusgweise beträgt diese Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität des Wildtyps.
  • Die Bestimmung der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase erfolgt wie in Th. Polakowski, Molekularbiologische Beeinflussung des Ergosterolstoffwechsels der Hefe Saccharomyces cerevisiae, Shaker-Verlag, Aachen 1999, ISBN 3-8265-6211-9, beschrieben.
  • Demgemäß werden 109 Hefe-Zellen einer 48 h alten Kultur durch Zentrifugation (3500xg, 5 min) geerntet und in 2 ml Puffer I (100 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH7,0) gewaschen. Das Zellpellet wird in 500 ∝| Puffer 1 (cytosolische Proteine) oder 2 (100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH7,0; 1% Triton X-100) (Gesamtproteine) aufgenommen, und es wird 1 ∝| 500 mM PMSF in Isopropanol zugegegeben. Zu den Zellen kommen 500 ∝| Glasperlen (d = 0,5 mm), und die Zellen werden durch 5× eine Minute Vortexen aufgeschlossen. Die Flüssigkeit zwischen den Glasperlen wird in ein neues Eppi überführt. Zellreste bzw. Membranbestandteile werden durch 15 min Zentrifugieren (14000xg) abgetrennt. Der Überstand wird in ein neues Eppi überführt und stellt die Proteinfraktion dar.
  • Die Aktivität der HMG-CoA Aktivität wird durch Messung des Verbrauchs von NADPH+H+ bei der Reduktion von 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA, das als Substrat zugesetzt wird, bestimmt.
  • In einem Testansatz von 1000 ∝| werden 20 ∝| Hefeproteinisolat mit 910 ∝| Puffer I; 50 ∝| 0,1 M DTT und 10 ∝| 16 mM NADPH+H+ gegeben. Der Ansatz ist auf 30°C temperiert und wird für 7,5 min bei 340 nm im Photometer gemessen. Die Abnahme an NADPH, die in diesem Zeitraum gemessen wird, ist die Abbaurate ohne Substratzugabe und wird als Hintergrund berücksichtigt.
  • Danach erfolgt die Zugabe von Substrat (10 ∝| 30 mM HMG-CoA), und es werden weitere 7,5 min gemessen. Die Berechnung der HMG-CoA-Reduktase Aktivität erfolgt durch die Bestimmung der spezifischen NADPH-Abbaurate.
  • Unter Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Lanosterol-C14-Demethylase verstanden.
  • Unter einer Lanosterol-C14-Demethylase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Lanosterol in 4,4-Dimethylcholesta-8,14,24-trienol umzuwandeln.
  • Dementsprechend wird unter Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Lanosterol-C14-Demethylase umgesetzte Menge Lanosterol bzw. gebildete Menge 4,4-Dimethylcholesta-8,14,24-trienol verstanden.
  • Bei einer erhöhten Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Lanosterol-C14-Demethylase die umgesetzte Menge Lanosterol bzw. die gebildete Menge 4,4-Dimethylcholesta-8,14,24-trienol erhöht.
  • Vorzusgweise beträgt diese Erhöhung der Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität des Wildtyps.
  • Die Bestimmung der Aktivität der Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität erfolgt wie in Omura, T and Sato, R. (1964) The carbon monoxide binding pigment in liver microsomes. J.Biol.Chem. 239, 2370-2378, beschrieben. Bei diesem Test ist die Menge an P450-Enzym als Holoenzym mit gebundenem Häm semi-quantifizierbar. Das (aktive) Holoenzym (mit Häm) kann durch CO reduziert werden und nur das CO-reduzierte Enzym weist ein Absorbtionsmaximum bei 450 nm auf. So ist das Absorbtionsmaxi mum bei 450 nm ein Maß für die Aktivität der Lanosterol-C14-Demethylase.
  • Zur Durchführung der Aktivitätsbestimmung wird eine Microsomen-Fraktion (4-10 mg/ml Protein in 100 mM Kaliumphosphat Puffer) 1:4 verdünnt, so dass die für den Test eingesetzte Protein Konzentration 2 mg/ml beträgt. Der Test wird direkt in einer Küvette durchgeführt.
  • Zu den Microsomen wird eine Spartelspitze Dithionite (S2O4Na2) zugeben. Mit einem Spektralphotometer wird die Baselinie aufgenommen im Bereich von 380-500 nm.
  • Anschliessend werden ca. 20-30 Blasen von CO durch die Probe gesprudelt. Die Absorbtion wird nun im selben Bereich gemessen. Die Höhe der Absorbtion bei 450 nm entspricht dem Abteil an P450 Enzym im Testansatz.
  • Unter Squalenepoxidase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Squalenepoxidase verstanden.
  • Unter einer Squalenepoxidase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Squalen in Squalenepoxid umzuwandeln.
  • Dementsprechend wird unter Squalenepoxidase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Squalenepoxidase umgesetzte Menge Squalen bzw. gebildete Menge Squalenepoxid verstanden.
  • Bei einer erhöhten Squalenepoxidase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Squalenepoxidase die umgesetzte Menge Squalen bzw. die gebildete Menge Squalenepoxid erhöht.
  • Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Squalenepoxidase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der Squalenepoxidase-Aktivität des Wildtyps.
  • Die Bestimmung der Aktivität der Squalenepoxidase erfolgt wie in Leber R, Landl K, Zinser E, Ahorn N, Spok A, Kohlwein SD, Turnowsky F, Daum G. (1998) Dual localization of squalene epoxidase, Erg1p, in yeast reflects a relationship between the endoplasmic reticulum and lipid particles, Mol. Biol. Cell. 1998, Feb;9(2):375-86, beschrieben.
  • Diese Methode enthält 0,35 bis 0,7 mg microsomales Protein oder 3,5 bis 75 ∝g Lipidpartikel Protein in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM FAD, 3 mM NADPH, 0,1 mM squalene 2,3-epoxidase cyclase inhibitor U18666A, 32 ∝M [3H]Squalen dispergiert in 0,005% Tween 80 in einem Gesamtvolumen von 500 ∝|.
  • Der Test wird bei 30°C durchgeführt. Nach einer Vorbehandlung für 10 min, wird die Reaktion durch Zugabe von Squalen gestartet und nach 15, 30 oder 45 min durch Lipid Extraktion mit 3 ml Chloroform/Methanol (2:1 vol/vol) und 750 ∝| 0,035% MgCl2 beendet.
  • Die Lipide werden unter Stickstoff getrocknet und in 0,5 ml Chloroform/Methanol (2:1 vol/vol) rückgelöst. Für eine Dünnschicht Chromatographie werden Teile auf eine Silica Gel 60 Platte (0,2 mm) gegeben und mit Chloroform als Laufmittel aufgetrennt. Die Positionen, die [3H]2,3-oxidosqualen und [3H]Squalene enthalten wurden ausgekratzt und mit einem Szintilationzähler quantifiziert.
  • Unter Squalensynthetase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Squalensynthetase verstanden.
  • Unter einer Squalensynthetase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Farnesylpyrophosphat in Squalen umzuwandeln.
  • Dementsprechend wird unter Squalensynthetase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Squalensynthetase umgesetzte Menge Farnesylpyrophosphat bzw. gebildete Menge Squalen verstanden.
  • Bei einer erhöhten Squalensynthetase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Squalensynthetase die umgesetzte Menge Farnesylpyrophosphat bzw. die gebildete Menge Squalen erhöht.
  • Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Squalensynthetase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der Squalensynthetase-Aktivität des Wildtyps.
  • Die Bestimmung der Aktivität der Squalensynthetase kann wie im folgenden beschrieben durchgeführt werden:
    Die Tests enthalten 50 mM Mops, pH 7.2, 10 mM MgCl2, 1% (v/v) Tween-80, 10% (v/v) 2-propanol, 1 mM DTT, 1 mg/mL BSA, NADPH, FPP (or PSPP) und Mikrosomen (3 mg Proteingehalt) in einem Gesamtvolumen von 200 ∝| in Glassröhrchen. Reaktionen mit radioaktivem Substrat [1-3H]FPP (15-30 mCi/∝mol) werden bei 30 °C für 30 min inkubiert und der Suspensionsansatz mit einem Volumen von 1:1 (v/v) 40% wässriges KOH:Methanol aufgefüllt. Flüssiges NaCl wird zur Sättigung der Lösung hinzugegeben und 2 ml Ligroin enthaltend 0.5% (v/v) Squalen werden ebenfalls zugefügt.
  • Die Suspension wirde für 30 s gevortext. Je 1 ml der Ligroin Schicht wird in einer Pasteur Pipette auf eine gepackte 0.5 × 6 cm Aluminium Säule (80-200 mesh, Fisher) gegeben. Die Säule ist mit 2 ml Ligroin mit 0.5% (v/v) Squalen präequlibriert. Anschliesend wird die Säule mit 5 x 1 ml Toluol enthaltend 0.5% (v/v) Squalen eluiert. Die Radioaktivität von Squalen wird in Cytoscint (ICN) Szintillations Cocktail mit einem Szintilationszähler (Beckman) gemessen.
  • Dieses Verfahren ist eine Abwandlung der in Radisky et al., Biochemistry. 2000 Feb 22;39(7):1748-60, Zhang et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 304, 133-143 und Poulter, C. D. et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111, 3734-3739, beschriebenen Verfahren.
  • Unter einem Wildtyp wird der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus verstanden. Vorzugsweise und insbesondere in Fällen in denen der Organismus oder der Wildtyp nicht eindeutig zuordenbar ist, wird unter Wildtyp für die Reduzierung der Δ22-Desaturase-Aktivität, die Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, die Erhöhung der Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, die Erhöhung der Squalenepoxidase-Aktivität und die Erhöhung der Squalensynthetase-Aktivität sowie für die Erhöhung des Gehalts an Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten ein Referenzorganismus verstanden. Dieser Referenzorganismus ist vorzugsweise der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae AH22.
  • Die Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität oder Squalensynthetase-Aktivität kann unabhängig voneinander durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressions- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression der entsprechenden Nukleinsäuren, also Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase oder Squalensynthetase gegenüber dem Wildtyp.
  • Die Erhöhung der Genexpression der entsprechenden Nukleinsäure gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Induzierung der entsprechenden Gene durch Aktivatoren, also durch Induzierung des HMG-CoA-Reduktase-Gens, des Lanosterol-C14-Demethylase-Gens, des Squalenepoxidase-Gens, oder des Squalensynthetase-Gens durch Aktivatoren oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Genkopien der entsprechenden Nukleinsäuren, also durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase oder Squalensynthetase in den Organismus.
  • Unter Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase oder Squalensynthetase wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Organismus eigenen, insbesondere der Hefen eigenen, endogenen HMG-CoA-Reduktasen, Lanosterol-C14-Demethylasen, Squalenepoxidasen oder Squalensynthetasen verstanden.
  • Dies kann beispielsweise durch Veränderung der Promotor DNA-Sequenz für HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase oder Squalensynthetase kodierende Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine erhöhte Expressionsrate des entsprechenden Gens zur Folge hat, kann beispielsweise durch Deletion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.
  • Es ist, wie vorstehend beschrieben, möglich, die Expression der endogenen HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase oder Squalensynthetase durch die Applikation exogener Stimuli zu verändern. Dies kann durch besondere physiologische Bedingungen, also durch die Applikation von Fremdsubstanzen erfolgen.
  • Desweiteren kann eine veränderte bzw. erhöhte Expression endogener HMG-CoA-Reduktase-, Lanosterol-C14-Demethylase-, Squalenepoxidase- oder Squalensynthetase-Gens dadurch erzielt werden, dass ein im nicht transformierten Organismus nicht vorkommendes Regulator-Protein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung tritt.
  • Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Domäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpressi on einer Nukleinsäure codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase durch Einbringen von einer oder mehrer Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase in den Organismus.
  • Dazu kann prinzipiell jedes Lanosterol-C14-Demethylase-Gen (ERG11), also jede Nukleinsäuren die eine Lanosterol-C14-Demethylase codiert, verwendet werden. Bei genomischen Lanosterol-C14-Demethylase-Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall dass der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Lanosterol-C14-Demethylase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.
  • Beispiele für Lanosterol-C14-Demthylase-Gene sind Nukleinsäuren, codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase aus Saccharomyces cerevisiae (Kalb VF, Loper JC, Dey CR, Woods CW, Sutter TR (1986) Isolation of a cytochrome P-450 structural gene from Saccharomyces cerevisiae. Gene 45(3):237-45), Candida albicans (Lamb DC, Kelly DE, Baldwin BC, Gozzo F, Boscott P, Richards WG, Kelly SL (1997) Differential inhibition of Candida albicans CYP51 with azole antifungal stereoisomers. FEMS Microbiol Lett 149(1):25-30), Homo sapiens (Stromstedt M, Rozman D, Waterman MR. (1996) The ubiquitously expressed human CYP51 encodes lanosterol 14 alphademethylase, a cytochrome P450 whose expression is regulated by oxysterols. Arch Biochem Biophys 1996 May 1;329(1):73-81c) oder Raffus norvegicus, Aoyama Y, Funae Y, Noshiro M, Horiuchi T, Yoshida Y. (1994) Occurrence of a P450 showing high homology to yeast lanosterol 14-demethylase (P450(14DM)) in the rat liver. Biochem Biophys Res Commun. Jun 30;201(3):1320-6)
  • In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Lanosterol-C14-Demethylase-Gen vor.
  • Die Anzahl der Lanosterol-C14-Demethylase-Gene in den erfindungsgemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf.
  • Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können beispielsweise eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.
  • Bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 6 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 6, und die die enzymatische Eigenschaft einer Lanosterol-C14-Demethylase aufweisen.
  • Die Sequenz SEQ. ID. NO. 6 stellt die Aminosäuresequenz der Lanosterol-C14-Demethylase aus Saccharomyces cerevisiae dar.
  • Weitere Beispiele für Lanosterol-C14-Demethylasen und Lanosterol-C14-Demethylase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 2 leicht auffinden.
  • Weitere Beispiele für Lanosterol-C14-Demethylasen und Lanosterol-C14-Demethylase-gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No. 5 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
  • Unter dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr.
  • Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.
  • Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptidkette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.
  • Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, inc. Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
    Multiple alignment parameter:
    Gap penalty 10
    Gap length penalty 10
    Pairwise alignment parameter:
    K-tuple 1
    Gap penalty 3
    Window 5
    Diagonals saved 5
  • Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 6 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 6, insbesondere nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 30% aufweist.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Lanosterol-C14-Demethylase aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ. ID. NO. 6).
  • Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
  • Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismus-spezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
  • Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rückübersetzung zu verwenden.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 5 in den Organismus ein.
  • Die Sequenz SEQ. ID. NO. 5 stellt die genomische DNA aus Saccharomyces cerevisiae (ORF S0001049) dar, die die Lanosterol-C14-Demethylase der Sequenz SEQ ID NO. 6 codiert.
  • Alle vorstehend erwähnten Lanosterol-C14-Demethylase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase indem man ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase in den Organismus einbringt, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp, einer reduzierten Regulation unterliegt.
  • Unter einer reduzierten Regulation verglichen mit dem Wildtyp, wird eine im Vergleich zum vorstehend definierten Wildtyp verringerte, vorzugsweise keine Regulation auf Expressions- oder Proteinebene verstanden.
  • Die reduzierte Regulation kann vorzugsweise durch einen im Nukleinsäurekonstrukt mit der kodierenden Sequenz funktionell verknüpten Promotor erreicht werden, der in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp-Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt.
  • Beispielsweise unterliegt der mittlere ADH-Promotor in Hefe nur eine reduzierten Regulation und ist daher insbesondere als Promotor im vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukt bevorzugt.
  • Dieses Promotorfragment des ADH12s Promotors, im folgenden auch ADH1 bezeichnet, zeigt eine annähernd konstitutive Expression (Ruohonen L, Penttila M, Keranen S. (1991) Optimization of Bacillus alpha-amylase production by Saccharomyces cerevisi ae. Yeast. May-Jun;7(4): 337-462; Lang C, Looman AC. (1995) Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. Dec;44(1-2): 147-56.), so dass die transkriptionelle Regulation nicht mehr über Intermediate der Ergosterolbiosynthese abläuft.
  • Weitere bevorzugte Promotoren mit reduzierter Regulation sind konstitutive Promotoren wie beispielsweise der TEF1-Promotor aus Hefe, der GPD-Promotor aus Hefe oder der PGK-Promotor aus Hefe (Mumberg D, Muller R, Funk M. (1995) Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 1995 Apr 14;156(1): 119-22; Chen CY, Oppermann H, Hitzeman RA. (1984) Homologous versus heterologous gene expression in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. Dec 11;12(23): 8951-70.).
  • Die reduzierte Regulation kann in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dadurch erreicht werden, dass man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, orthologen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt.
  • Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Nukleinsäure, die nur den katalytischen Bereich der HMG-CoA-Reduktase kodiert (trunkierte (t-)HMG-CoA-Reduktase) als Nukleinsäure, codierend eine HMG-CoA-Reduktase. Diese in EP 486 290 und WO 99/16886 beschriebene Nukleinsäure (t-HMG) kodiert nur den katalytisch aktiven Teil der HMG-CoA-Reduktase, die für die Regulation auf Proteinebene verantwortliche Membran-Domäne fehlt. Diese Nukleinsäure unterliegt somit, insbesondere in Hefe, einer reduzierten Regulation und führt zu einer Erhöhung der Genexpression der HMG-CoA-Reduktase.
  • Der Einbau des vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukts in den Wirtsorganismus kann entweder chromosomal unter Verwendung von Intergrationsvektoren oder episomal unter Verwendung von episomalen Plasmiden, enthaltend jeweils das vorstehend beschriebene Nukleinsäurekonstrukt erfolgen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man Nukleinsäuren, vorzugsweise via vorstehend beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt, ein, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 4 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEO. ID. NO. 4, und die die enzymatische Eigenschaft einer HMG-CoA-Reduktase aufweisen.
  • Die Sequenz SEQ. ID. NO. 4 stellt die Aminosäuresequenz der trunkierten HMG-CoA-Reduktase (t-HMG) dar.
  • Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 4 leicht auffinden.
  • Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No. 3 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
  • Besonders bevorzugt verwendet man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 3 als Nukleinsäure, kodierend eine trunkierte HMG-CoA-Reduktase.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die reduzierte Regulation dadurch erreicht, dass man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, orthologen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt und einen Promotor verwendet, der in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp-Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung Squalenepoxidase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalenepoxidase.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalenepoxidase durch Einbringen von einer oder mehrer Nukleinsäuren codierend Squalenepoxidase in den Organismus.
  • Dazu kann prinzipiell jedes Squalenepoxidase-Gen (ERG1), also jede Nukleinsäuren die eine Squalenepoxidase codiert, verwendet werden. Bei genomischen Squalenepoxidase-Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall dass der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Squalenepoxidase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren kodierend eine Squalenepoxidase sind Nukleinsäuren, codierend eine Squalenepoxidase aus Saccharomyces cerevisiae (Jandrositz, A., et al (1991) The gehe encoding squalene epoxidase from Saccharomyces cerevisiae: cloning and characterization. Gene 107:155-160, aus Mus musculus (Kosuga K, Hata S, Osumi T, Sakakibara J, Ono T. (1995) Nucleotide sequence of a cDNA for mouse squalene epoxidase, Biochim Biophys Acta, Feb 21;1260(3):345-8b), aus Rattus norvegicus (Sakakibara J, Watanabe R, Kanai Y, Ono T. (1995) Molecular cloning and expression of rat squalene epoxidase. J Biol Chem Jan 6;270(1):17-20c) oder aus Homo sapiens (Nakamura Y, Sakakibara J, Izumi T, Shibata A, Ono T. (1996) Transcriptional regulation of squalene epoxidase by sterols and inhibitors in HeLa cells., J. Biol. Chem. 1996, Apr 5;271(14):8053-6).
  • In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Squalenepoxidase vor.
  • Die Anzahl der Squalenepoxidase-Gene in den erfindungsgemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf.
  • Bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 8 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 8, und die die enzymatische Eigenschaft einer Squalenepoxidase aufweisen.
  • Die Sequenz SEQ. ID. NO. 8 stellt die Aminosäuresequenz der Squalenepoxidase aus Saccharomyces cerevisiae dar.
  • Weitere Beispiele für Squalenepoxidasen und Squalenepoxidase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 8 leicht auffinden.
  • Weitere Beispiele für Squalenepoxidase und Squalenepoxidase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No. 7 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Squalenepoxidase aus Saccharomyces cerevisiae)(SEQ. ID. NO. 8).
  • Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
  • Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismus-spezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
  • Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rückübersetzung zu verwenden.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 7 in den Organismus ein.
  • Die Sequenz SEQ. ID. NO. 7 stellt die genomische DNA aus Saccharomyces cerevisiae (ORF S0003407) dar, die die Squalenepoxidase der Sequenz SEQ ID NO. 8 codiert.
  • Alle vorstehend erwähnten Squalenepoxidase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Squalensynthetase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalensynthetase.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalensynthetase durch Einbringen von einer oder mehrer Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase in den Organismus.
  • Dazu kann prinzipiell jedes Squalensynthetase-Gen (ERG9), also jede Nukleinsäuren die eine Squalensynthetase codiert, verwendet werden. Bei genomischen Squalensynthetase-Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall dass der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Squalensynthetase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren kodierend eine Squalensynthetase sind Nukleinsäuren, codierend eine Squalensynthetase aus Saccharomyces cerevisiae (ERG9), (Jennings, S.M., (1991): Molecular cloning and characterization of the yeast gene for squalene synthetase. Proc Natl Acad Sci USA. Jul15;88(14): 6038-42), Nukleinsäuren, codierend eine Squalensynthetase aus Botryococcus brauniiOkada (Devarenne, T.P. et al.: Molecular characterization of squalene synthase from the green microalga Botryococcus braunii, raceB, Arch. Biochem. Biophys. 2000, Jan15, 373(2): 307-17), Nukleinsäuren, codierend eine Squalensynthetase aus Potato tuber (Yoshioka N. et al.: cDNA cloning of sesquiter penecyclase and squalene synthase, and expression of the genes in potato tuber infected with Phytophthora infestans, Plant. Cell. Physiol.1999, Sep;40(9): 993-8) oder Nukleinsäuren, codierend eine Squalensynthetase aus Glycyrrhiza glabra (Hayashi, H. et al.: Molecular cloning and characterization of two cDNAs for Glycyrrhiza glabra squalene synthase, Biol. Pharm. Bull. 1999, Sep;22(9): 947-50.
  • In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Squalensynthetase-Gen vor.
  • Die Anzahl der Squalensynthetase-Gene in den erfindungsgemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf.
  • Bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 10 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleite te Sequenz, die eine Identität von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 10, und die die enzymatische Eigenschaft einer Squalensynthetase aufweisen.
  • Die Sequenz SEQ. ID. NO. 10 stellt die Aminosäuresequenz der Squalensynthetase (ERG9) aus Saccharomyces cerevisiae dar.
  • Weitere Beispiele für Squalensynthetasen und Squalensynthetase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID. NO. 10 leicht auffinden.
  • Weitere Beispiele für Squalensynthetase und Squalensynthetase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No. 9 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Squalensynthetase aus Saccharomyces cerevisiae)(SEQ. ID. NO. 10).
  • Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.
  • Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismus-spezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
  • Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rückübersetzung zu verwenden.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 9 in den Organismus ein.
  • Die Sequenz SEQ. ID. NO. 9 stellt die genomische DNA aus Saccharomyces cerevisiae (ORF YHR190W) dar, die die Squalensynthetase der Sequenz SEQ. ID. NO. 10 codiert.
  • Alle vorstehend erwähnten Squalensynthetase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase Aktivität und eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität aufweisen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase Aktivität und eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität oder Squalensynthetase-Aktivität aufweisen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die Organismen gegenüber dem Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase Aktivität und eine erhöhte Aktivität mindestens zwei der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität auf.
  • Besonders bevorzugte Kombinationen sind eine im Vergleich zum Wildtyp reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase Aktivität und eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und Squalenepoxidase Aktivität oder Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität oder eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität.
  • In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die Organismen gegenüber dem Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase Aktivität und eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität und eine erhöhte Squalensynthetase-Aktivität auf.
  • Unter Organismen oder genetisch veränderten Organismen werden erfindungsgemäß beispielsweise Bakterien, insbesondere Bakterien der Gattung Bacillus, Escherichia coli, Lactobacillus spec. oder Streptomyces spec.,
    beispielsweise Hefen, insbesondere Hefen der Gattung Saccharomyces cerecisiae, Pichia pastoris oder Klyveromyces spec.
    beispielsweise Pilze, insbesondere Pilze der Gattung Aspergillus spec., Penicillium spec. oder Dictyostelium spec.
    sowie beispielsweise auch Insektenzellinien verstanden, die in der Lage sind, als Wildtyp oder durch vorherige genetische Veränderung Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten herzustellen.
  • Besonders bevorzugte Organismen oder genetisch veränderte Organismen sind Hefen, insbesondere der Spezies Saccharomyces cerevisiae, insbesondere die Hefestämme Saccharomyces cerevisiae AH22, Saccharomyces cerevisiae GRF, Saccharomyces cerevisiae DBY747 und Saccharomyces cerevisiae BY4741.
  • Unter den biosynthetischen Zwischenprodukten des Ergosta-5,7-dienol, werden alle Verbindungen verstanden, die im verwendeten Organismus bei der Biosynthese von Ergosta-5,7-dienol als Zwischenprodukte auftreten, vorzugsweise die Verbindungen Mevalonat, Farnesylpyrophosphat, Geraniolpyrophosphat, Squalenepoxid, 4-Dimethylcholesta-8,14,24-trienol, 4,4 Dimethylzymosterol, Squalen, Farnesol, Geraniol, Lanosterol, Zymosteron und Zymosterol.
  • Unter den biosynthetischen Folgeprodukten des Ergosta-5,7-dienol, werden alle Verbindungen verstanden, die sich im verwendeten Organismus biosynthetisch von Ergosta-5,7-dienol ableiten, dass heißt bei denen Ergosta-5,7-dienol als Zwischenprodukt auftritt. Dies können Verbindungen sein, die der verwendete Organismus natürlicherweise aus Ergosta-5,7-dienol herstellt.
  • Es werden aber auch Verbindungen verstanden, die erst durch Einbringen von Genen und Enzymaktivitäten aus anderen Organismen, zu denen der Ausgangsorganismus kein orthologes Gen aufweist, im Organismus aus Ergosta-5,7-dienol hergestellt werden können.
  • Beispielsweise können durch Einbringen von weiteren pflanzlichen Genen und/oder Säugergenen in Hefe, biosynthetische Folgeprodukte aus Ergosta-5,7-dienol in der Hefe hergestellt werden, die natürlich nur in Pflanzen und/oder Säugern vorkommen.
  • Das Einbringen von beispielsweise Nukleinsäuren kodierend eine pflanzliche Δ7-Reduktase (DWF5) oder deren funktionelle Äquivalente oder Varianten und von Nukleinsäuren, kodierend reife Formen von CYP11A1, ADX(FDX1), ADR(FDXR) und 3β-HSD) oder deren funktionelle Äquivalente oder Varianten in Hefe führt zur Biosynthese von Progesteron in der Hefe. Eine ausführliche Beschreibung der Vorgehensweise und der Methoden und Materialien zur entsprechenden genetischen Veränderung der Hefe ist in C. Duport et al., Nat. Biotechnol. 1998, 16, 186-189 und in den darin angegebenen Literaturzitaten offenbart, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Das Einbringen von beispielsweise Nukleinsäuren kodierend eine pflanzliche Δ7-Reduktase (DWF5) oder deren funktionelle Äquivalente oder Varianten und von Nukleinsäuren, kodierend reife Formen von CYP11A1, ADX(FDX1) und ADR (FDXR) oder deren funktionelle Äquivalente oder Varianten und von Nukleinsäuren, kodierend mitochondriale Formen von ADX und CYP11B1, 3b-HSD, CYP17A1 und CYP21A1 oder deren funktionelle Äquivalente oder Varianten in Hefe führt zur Biosynthese von Hydrocortison, 11-Deoxycortisol, Corticosteron und Acetylpregnenolon.
  • Zur weiteren Steigerung des Gehalts an biosynthetischen Folgeprodukten des Ergosta-5,7-dienol, wie beispielsweise Hydrocortison, ist es zusätzlich vorteilhaft, abfließende Stoffwechselwege, also Biosynthesewege die nicht zum gewünschten Produkt führen, zu unterdrücken. Beispielsweise führt die Reduzierung der Aktivitäten der Genprodukte von ATF2, GCY1 und YPR1, besonders bevorzugte die Deletion dieser Aktivitäten in Hefe zu einer weiteren Steigerung des Gehalts an Hydrocortison.
  • Eine ausführliche Beschreibung dieser Vorgehensweise und der Methoden und Materialien zur entsprechenden genetischen Veränderung der Hefe ist in F.M. Szczebara et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21, 143-149 und in den darin angegebenen Literaturzitaten offenbart, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Unter den biosynthetischen Folgeprodukten des Ergosta-5,7-dienol werden daher insbesondere Campesterol, Pregnenolon, 17-OH Pregnenolon, Progesteron, 17-OH Progesteron, 11-Deoxycortisol, Hydrocortison, Deoxycorticosteron und/oder Corticosteron verstanden.
  • Bevorzugte biosynthetische Folgeprodukte sind Progesteron, Coritcosteron und Hydrocortison, besonders bevorzugt Hydrocortison.
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen stellen teilweise selbst Steroidhormone da und können zu therapeutischen Zwecken verwendet werden.
  • Ferner können die hergestellten Verbindungen, wie beispielsweise Ergosta-5,7-dienol oder Hydrocortison zu Herstellung von Steroidhormonen oder zur Synthese von Wirkstoffen mit starker entzündungshemmender, abortiver oder antiproliferativen Wirkung über Biotransformation, chemische Synthese oder biotschnologische Herstellung verwendet werden.
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der genetisch veränderten Organismen, im folgenden auch transgene Organismen bezeichnet, ein Ernten der Organismen und ein Isolieren von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten aus den Organismen angeschlossen.
  • Das Ernten der Organismen erfolgt in an sich bekannter Weise dem jeweiligen Organismus entsprechend. Mikroorganismen, wie Bakterien, Moose, Hefen und Pilze oder Pflanzenzellen, die durch Fermentation in flüssigen Nährmedien kultiviert werden, können beispielsweise durch Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtrieren abgetrennt werden.
  • Die Isolierung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten aus der geernteten Biomasse erfolgt gemeinsam oder jede Verbindung für sich in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Extraktion und gegebenenfalls weiterer chemische oder physikalischer Reinigungsprozesse, wie beispielsweise Fällungsmethoden, Kristallographie, thermische Trennverfahren, wie Rektifizierverfahren oder physikalische Trennverfahren, wie beispielsweise Chromatographie.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines genetisch veränderten Organismus indem man ausgehend von einem Ausgangsorganismus die Δ22-Desaturase-Aktivität reduziert und die HMG-CoA-Reduktase Aktivität erhöht und mindestens eine der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität erhöht.
  • Die Verfahren zur Deletion des Ziellocus Δ22-Desaturase-Gen sind bereits vorstehend ausführlich beschrieben.
  • Die Herstellung der transgenen Organismen, insbesondere Hefen kann vorzugsweise durch Transformation der Ausgangsorganismen, insbesondere Hefen, mit einem Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase und enthaltend mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase und Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten, erfolgen. Die Herstellung der transgenen Organismen erfolgt in dieser Ausführungsform mit einem Nukleinsäurekonstrukt.
  • Dazu können Nukleinsäurekonstrukte verwendet werden, die neben den nachstehend beschriebenen Expressionskasetten, enthaltend Promotor, kodierende Sequenz und gegebenenfalls Terminator und neben einem nachstehend beschriebenen Selektionsmarker am 3'- und 5'-Ende Nukleinsäuresequenzen enthalten, die mit Nukleinsäuresequenzen am Anfang und am Ende des zu deletierenden Gens identisch sind.
  • Die Herstellung der transgenen Organismen kann aber auch vorzugsweise durch Transformation der Ausgangsorganismen, insbesondere Hefen, mit einer Kombination von Nukleinsäurekonstrukten, enthaltend Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase und enthaltend Nukleinsäurekonstrukte oder eine Kombination von Nukleinsäurekonstruken, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase und Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase und diese jeweils mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten, erfolgen.
  • Die Herstellung der transgenen Organismen erfolgt in dieser Ausführungsform mit einzelnen Nukleinsäurekonstrukten oder einer Kombination von Nukleinsäurekonstrukten.
  • Nukleinsäurekonstrukte, in denen die kodierende Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Hefen gewährleisten, werden im folgenden auch Expressionskasetten genannt.
  • Nukleinsäurekonstrukte enthaltend diese Expressionskasette sind beispielsweise Vektoren oder Plasmide.
  • Vorzugsweise enthalten die Regulationssignale einen oder mehrere Promotoren, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Hefen gewährleisten.
  • Die Expressionskassetten beinhalten Regulationssignale, also regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3'-Ende einen Terminator und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für mindestens eines der vorstehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind.
  • Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, gegebenenfalls Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
  • Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäurekonstrukte, Expressionskassetten und Plasmide für Hefen und Pilze und Verfahren zur Herstellung von transgenen Hefen, sowie die transgenen Hefen selbst beschrieben.
  • Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Organismen, insbesondere in Hefen steuern kann.
  • Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen Promotor, der in der Hefe einer reduzierten Regulation unterliegt, wie beispielsweise der mittlere ADH-Promotor.
  • Dieses Promotorfragment des ADH12s Promotors, im folgenden auch ADH1 bezeichnet, zeigt eine annähernd konstitutive Expression (Ruohonen L, Penttila M, Keranen S. (1991) Optimization of Bacillus alpha-amylase production by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. May-Jun;7(4): 337-462; Lang C, Looman AC. (1995) Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. Dec;44(1-2): 147-56.), so dass die transkriptionelle Regulation nicht mehr über Intermediate der Ergosterolbiosynthese abläuft.
  • Weitere bevorzugte Promotoren mit reduzierter Regulation sind konstitutive Promotoren wie beispielsweise der TEF1-Promotor aus Hefe, der GPD-Promotor aus Hefe oder der PGK-Promotor aus Hefe (Mumberg D, Muller R, Funk M.(1995) Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 1995 Apr 14;156(1): 119-22; Chen CY, Oppermann H, Hitzeman RA.(1984) Homologous versus heterologous gene expression in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. Dec 11;12(23): 8951-70.).
  • Die Expressionskassette kann auch induzierbare Promotoren, insbesondere chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression der Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase oder Squalensynthetase im Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann.
  • Derartige Promotoren wie beispielsweise der Cupl-Promotor aus Hefe (Etcheverry T. (1990) Induced expression using yeast copper metallothionein promoter. Methods Enzymol. 1990;185: 319-29.), der Gal1-10-Promotor aus Hefe (Ronicke V, Graulich W, Mumberg D, Muller R, Funk M. (1997) Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae, Methods Enzymol.283: 313-22) oder der Pho5-Promotor aus Hefe (Bajwa W, Rudolph H, Hinnen A.(1987) PHO5 upstream sequences confer phosphate control on the constitutive PHO3 gene. Yeast. 1987 Mar;3(1): 33-42) können beispielsweise benutzt werden.
  • Als Terminator der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Terminator geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Organismen, insbesondere in Hefen steuern kann.
  • Bevorzugt ist der Tryptophan-Terminator aus Hefe (TRP1-Terminator).
  • Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase oder Squalensynthetase und gegebenenfalls einem Terminator nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen Nukleinsäure- Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
  • Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons, die von Hefen bevorzugt werden. Diese von Hefen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Hefespezies exprimiert werden.
  • Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
  • Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zum Wirtsorganismus sein. Die Expressionskassette beinhaltet vorzugsweise in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäurekonstrukt und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
  • Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.
  • Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
  • Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, der vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte oder der vorstehend besschriebenen Proteine zur Herstellung von transgenen Organismen, insbesondere Hefen.
  • Vorzugsweise weisen diese transgenen Organismen, insbesondere Hefen gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten auf.
  • Daher betrifft die Erfindung ferner die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte zur Erhöhung des Gehalts an Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in Organismen.
  • Die vorstehend beschriebenen Proteine und Nukleinsäuren können zur Herstellung von Ergosta-7,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in transgenen Organsimen verwendet werden.
  • Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom eines Organismus, insbesondere von Hefe wird als Transformation bezeichnet.
  • Dazu können insbesondere bei Hefen an sich bekannte Methoden zur Transformation genutzt werden.
  • Geeignete Methoden zur Transformation von Hefen sind beispielsweise die LiAC-Methode, wie in Schiestl RH, Gietz RD. (1989) High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier, Curr Genet. Dec;16(5-6): 339-46, beschrieben, die Elektroporation wie in Manivasakam P, Schiestl RH. (1993) High efficiency transformation of Saccharomyces cerevisiae by electroporation. Nucleic Acids Res. Sep 11;21(18): 4414-5, beschrieben oder die Protoplasierung, wie in Morgan AJ. (1983) Yeast strain improvement by protoplast fusion and transformation, Experientia Suppl. 46: 155-66 beschrieben.
  • Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor, insbesondere in Plasmide kloniert, die geeignet sind, Hefen zu transformieren, wie beispielsweise die Vektorsysteme Yep24 (Naumovski L, Friedberg EC (1982) Molecular cloning of eucaryotic genes required for excision repair of UV-irradiated DNA: isolation and partial characterization of the RAD3 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol Oct;152(1): 323-31), Yep13 (Broach JR, Strathern JN, Hicks JB. (1979) Transformation in yeast: development of a hybrid cloning vector and isolation of the CAN1 gene. Gene. 1979 Dec;8(1): 121-33), die pRS-Serie von Vektoren (Centromer und Episomal) (Sikorski RS, Hieter P. (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. May;122(1): 19-27) sowie die Vektorsysteme YCp19 oder pYEXBX.
  • Dementsprechend betrifft die Erfindung weiterhin Vektoren, insbesondere Plasmide enthaltend die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Expressionskasetten.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen indem man eine vorstehend beschriebene Nukleinsäure oder ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt in den Ausgangsorganismus funktionell einführt.
  • Die Erfindung betrifft ferner die genetisch veränderten Organismen, wobei die genetische Veränderung gegenüber dem Wildtyp
    die Δ22-Desaturase-Aktivität reduziert und
    die HMG-CoA-Reduktase Aktivität erhöht und
    mindestens eine der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität erhöht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die genetisch veränderten Organismen im Vergleich zum Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase und eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität auf.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die genetisch veränderten Organismen im Vergleich zum Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase und eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität auf.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die genetisch veränderten Organismen im Vergleich zum Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase und eine erhöhte Squalensynthetase-Aktivität auf.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die genetisch veränderten Organismen im Vergleich zum Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase und eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität auf.
  • In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die genetisch veränderten Organismen im Vergleich zum Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase und eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Squalensynthetase-Aktivität auf.
  • In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die genetisch veränderten Organismen im Vergleich zum Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase und eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität und eine erhöhte Squalensynthetase-Aktivität auf.
  • In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die genetisch veränderten Organismen im Vergleich zum Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase und eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität und eine erhöhte Squalensynthetase-Aktivität auf.
  • Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung dieser Aktivitäten, wie vorstehend erwähnt, unabhängig voneinander durch eine Erhöhung der Genexpression von Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, oder Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase gegenüber dem Wildtyp.
  • Die weiter bevorzugten Ausführungsformen der bevorzugten erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismen sind vorstehend bei den Verfahren beschrieben.
  • Die vorstehend beschriebenen genetisch veränderten Organismen weisen gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten auf.
  • Dementsprechend betrifft die Erfindung einen vorstehend beschriebenen genetisch veränderten Organismus, dadurch gekennzeichnet, dass der genetisch veränderte Organismus gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten aufweist.
  • Unter Organismen oder genetisch veränderten Organismen werden erfindungsgemäß beispielsweise Bakterien, insbesondere Bakterien der Gattung Bacillus, Escherichia coli, Lactobacillus spec. oder Streptomyces spec.,
    beispielsweise Hefen, insbesondere Hefen der Gattung Saccharomyces cerecisiae, Pichia pastoris oder Klyveromyces spec.
    beispielsweise Pilze, insbesondere Pilze der Gattung Aspergillus spec., Penicillium spec. oder Dictyostelium spec.
    sowie beispielsweise auch Insektenzellinien verstanden, die in der Lage sind, als Wildtyp oder durch vorherige genetische Veränderung Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten herzustellen.
  • Besonders bevorzugte Organismen oder genetisch veränderte Organismen sind Hefen, insbesondere der Spezies Saccharomyces cerevisiae, insbesondere die Hefestämme Saccharomyces cerevisiae AH22, Saccharomyces cerevisiae GRF, Saccharomyces cerevisiae DBY747 und Saccharomyces cerevisiae BY4741
  • Erhöhung des Gehaltes an Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen und/oder Folgeprodukten bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung mindestens einer dieser, eingangs erwähnten Verbindungen in dem genetisch veränderten Organsimus gegenüber dem nicht genetisch veränderten Organismus.
  • Unter einem erhöhten Gehalt an Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen und/oder Folgeprodukten im Vergleich zum Wildtyp wird insbesondere die Erhöhung des Gehaltes mindestens einer der vorstehend erwähnten Verbindungen im Organismus um mindestens 50%, vorzugsweise 100%, bevorzugter 200%, besonders bevorzugt 400% im Vergleich zum Wildtyp verstanden.
  • Die Bestimmung des Gehalts an mindestens einer der erwähnten Verbindungen erfolgt vorzugsweise nach an sich bekannten analytischen Methoden und bezieht sich vorzugsweise auf die Kompartimente des Organismus in denen Sterole produziert werden.
  • Die vorliegende Erfindung weist gegenüber dem Stand der Technik folgenden Vorteil auf:
    Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, den Gehalt an Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in den Produktionsorganismen zu steigern.
  • Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:
  • I. Allgemeine experimentelle Bedingungen
  • 1. Restriktion
  • Die Restriktion der Plasmide (1 bis 10 μg) wurde in 30 μl Ansätzen durchgeführt. Dazu wurde die DNA in 24 μl H2O aufgenommen, mit 3 μl des entsprechenden Puffers, 1 ml RSA (Rinderserumalbumin) und 2 μl Enzym versetzt. Die Enzymkonzentration betrug 1 Unit/μl oder 5 Units/μl je nach DNA Menge. In einigen Fällen wurde dem Ansatz noch 1 μl RNase zugegeben, um die tRNA abzubauen. Der Restriktionsansatz wurde für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Konrolliert wurde die Restriktion mit einem Minigel.
  • 2. Gelelektrophoresen
  • Die Gelelektrophoresen wurden in Minigel- oder Wide-Minigelapparaturen durchgeführt. Die Minigele (ca. 20 ml, 8 Taschen) und die Wide-Minigele (50 ml, 15 oder 30 Taschen) bestanden aus 1%iger Agarose in TAE. Als Laufpuffer wurde 1 × TAE verwendet. Die Proben (10 μl) wurden mit 3 μl Stopperlosung versetzt und aufgetragen. Als Standard diente 1-DNA geschnitten mit HindIII (Banden bei: 23,1 kb; 9,4 kb; 6,6 kb; 4,4 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,6 kb). Zur Auftrennung wurde eine Spannung von 80 V für 45 bis 60 min angelegt. Danach wurde das Gel in Ethidiumbromidlosung angefärbt und unter UV-Licht mit dem Video-Dokumentationssystem INTAS festgehalten oder mit einem Orange-Filter fotografiert.
  • 3. Gelelution
  • Mittels Gelelution wurden die gewünschten Fragmente isoliert. Der Restriktionsansatz wurde auf mehrere Taschen eines Minigels aufgetragen und aufgetrennt. Nur λ-HindIII und eine "Opferspur" wurden in Ethidiumbromidlösung angefärbt, unter UV-Licht betrachtet und das gewünschte Fragment markiert. Dadurch wurde verhindert, dass die DNA der restlichen Taschen durch das Ethidiumbromid und das UV-Licht geschädigt wird. Durch Aneinanderlegen des gefärbten und ungefärbten Gelstücks konnte anhand der Markierung das gewunschte Fragment aus dem ungefärbten Gelstück herausgeschnitten werden. Das Agarosestück mit dem zu isolierenden Fragment wurde in einen Dialyseschlauch gegeben, mit wenig TAE-Puffer luftblasenfrei verschlossen und in die BioRad-Minigelapparatur gelegt. Der Laufpuffer bestand aus 1 × TAE und die Spannung betrug 100 V für 40 min. Danach wurde für 2 min die Strompolaritat gewechselt, um am Dialyseschlauch klebende DNA wieder zu lösen. Der die DNA-Fragmente enthaltende Puffer des Dialyseschlauches wurde in Reaktionsgefäße überführt und damit eine Ethanol Fallung durchgefuhrt. Dazu wurde der DNA-Losung 1/10 Volumen an 3 M Natriumacetat, tRNA (1 μl pro 50 μl Lösung) und dem 2,5 fachem Volumen an eiskaltem 96%igem Ethanol zugegeben. Der Ansatz wurde 30 min bei -20°C inkubiert und dann bei 12000 rpm, 30 min, 4°C abzentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde getrocknet und in 10 bis 50 μl H2O (je nach DNA-Menge) aufgenommen.
  • 4. Klenow-Behandlung
  • Durch die Klenow-Behandlung werden uberstehende Enden von DNA Fragmenten aufgefüllt, so dass "blunt-ends" entstehen. Pro 1 μg DNA wurde folgender Ansatz zusammenpipettiert:
    DNA-Pellet + 11 μl H2O
    + 1,5 μl 10 × Klenow Puffer
    + 1 μl 0,1 M DTT
    + 1 μl Nucleotide (dNTP 2 mM)
    25+ 1 μl Klenow-Polymerase (1 Unit/∝|)
  • Die DNA sollte dabei aus einer Ethanolfällung stammen, um zu verhindern, dass Verunreinigungen die Klenow-Polymerase hemmen. Die Inkubation erfolgte für 30 min bei 37 °C, durch weitere 5 min bei 70 °C wurde die Reaktion abgestoppt. Die DNA wurde aus dem Ansatz durch eine Ethanolfällung gewonnen und in 10 μl H2O aufgenommen.
  • 5. Ligation
  • Die zu ligierenden DNA-Fragmente wurden vereinigt. Das Endvolumen von 13,1 μl enhielt ca. 0,5 μl DNA mit einem Vektor-Insert Verhaltnis von 1:5. Die Probe wurde 45 Sekunden bei 70 °C inkubiert, auf Raumtemperatur abgekühlt (ca. 3 min) und dann 10 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Ligationspuffer zugegeben: 2,6 μl 500 mM TrisHCl pH 7,5 und 1,3 μl 100 mM MgCl2 und weitere 10 min auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 1 μl 500 mM DTT und 1 μl 10 mM ATP und nochmaligen 10 min auf Eis wurde 1 μl Ligase (1 Unit/pl) zugegeben. Die ganze Behandlung sollte möglichst erschütterungsfrei erfolgen, um aneinanderliegende DNA-Enden nicht wieder zu trennen. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 14 °C.
  • 6. E. coli-Transformation
  • Kompetente Escherichia coli (E. coli) NM522 Zellen wurden mit der DNA des Ligationsansatzes transformiert. Als Positiv-Kontrolle lief ein Ansatz mit 50 μg des pScL3 Plasmids und als Null-Kontrolle ein Ansatz ohne DNA mit. Für jeden Transformationsansatz wurden 100 μl 8% PEG-Losung, 10 μl DNA und 200 μl kompetente Zellen (E. coli NM522) in ein Tischzentrifugenröhrchen pipettiert. Die Ansätze wurden für 30 min in Eis gestellt und gelegentlich geschüttelt.
  • Danach erfolgte der Hitzeschock: 1 min bei 42 °C. Fur die Regeneration wurde den Zellen 1 ml LB-Medium zugegeben und für 90 min bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert. Je 100 μl der unverdünnten Ansätze, einer 1:10 Verdünnung und einer 1:100 Verdünnung wurden auf LB + Ampicillin-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C bebrütet.
  • 7. Plasmid-Isolation aus E. coli (Minipräp)
  • E. coli-Kolonien wurden über Nacht in 1,5 ml LB + Ampicillin-Medium in Tischzentrifugenröhrchen bei 37 °C und 120 rpm angezogen. Am nächsten Tag wurden die Zellen 5 min bei 5000 rpm und 4 °C abzentrifugiert und das Pellet in 50 μl TE-Puffer aufgenommen. Jeder Ansatz wurde mit 100 μl 0,2 N NaOH, 1% SDS-Lösung versetzt, gemischt und für 5 min auf Eis gestellt (Lyse der Zellen). Danach wurden 400 μl Na-Acetat/NaCl-Losung (230 μl H20, 130 μl 3 M Natriumacetat, 40 μl 5M NaCl) zugegeben, der Ansatz gemischt und für weitere 15 min auf Eis gestellt (Proteinfällung). Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 11000 rpm wurde der Überstand, der die Plasmid-DNA enthalt, in ein Eppendorfgefäß uberführt. War der Überstand nicht vollstandig klar, wurde nochmal zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 360 μl eisgekühltem Isopropanol versetzt und für 30 min bei -20 °C inkubiert (DNA-Fällung). Die DNA wurde abzentrifugiert (15 min, 12000 rpm, 4 °C), der überstand vrworfen, das Pellet in 100 μl eisgekuhltem 96%igem Ethanol gewaschen, 15 min bei -20 °C inkubiert und erneut abzentrifugiert (15 min, 12000 rpm, 4 °C). Das Pellet wurde im Speed Vac getrocknet und dann in 100 μl H2O aufgenommen. Die Plasmid DNA wurde durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Dazu wurden 10 μl jedes Ansatzes restringiert und in einem Wide-Minigel gelelektrophoretisch aufgetrennt (siehe oben).
  • 8. Plasmid-Aufarbeitung aus E. coli (Maxipräp)
  • Um größere Mengen an Plasmid-DNA zu isolieren, wurde die Maxipräp Methode durchgeführt. Zwei Kolben mit 100 ml LB + Ampicillin-Medium wurden mit einer Kolonie bzw. mit 100 μl einer Gefrierkultur, die das zu isolierende Plasmid trägt, angeimpft und über Nacht bei 37 °C und 120 rpm bebrütet. Die Anzucht (200 ml) wurde am nachsten Tag in einen GSA-Becher uberführt und bei 4000 rpm (2600 × g) 10 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 6 ml TE-Puffer aufgenommen. Zum Abdau der Zellwand wurden 1,2 ml Lysozymlosung (20 mg/ml TE-Puffer) zugegeben und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte die Lyse der Zellen mit 12 ml 0,2 N NaOH, 1% SDS Lösung und weiteren 5 min Inkubation bei Raumtemperatur. Die Proteine wurden durch die Zugabe von 9 ml gekühlter 3 M Natriumacetat-Losung (pH 4,8) und einer 15 minütigen Inkubation auf Eis gefallt. Nach der Zentrifugation (GSA: 13000 rpm (27500 × g), 20 min, 4 °C) wurde der Überstand, der die DNA enthielt, in einen neuen GSA-Becher überführt und die DNA mit 15 ml eiskaltem Isopropanol und einer Inkubation von 30 min bei -20 °C gefällt. Das DNA-Pellet wurde in 5 ml eisgekühltem Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet (ca. 30-60 min). Danach wurde es in 1 ml H20 aufgenommen. Es fand eine Überprüfung des Plasmids durch Restriktionsanalyse statt. Die Konzentration wurde durch Auftragen von Verdünnungen auf einem Minigel bestimmt. Zur Verringerung des Salzgehaltes erfolgte eine 30-60 minutige Mikrodialyse (Porengröße 0,025 μm).
  • 9. Hefe-Transformation
  • Für die Hefe-Transformation wurde eine Voranzucht des Stammes Saccharomyces cerevisiae AH22 angesetzt. Ein Kolben mit 20 ml YE-Medium wurde mit 100 μl der Gefrierkultur angeimpft und über Nacht bei 28 °C und 120 rpm bebrütet. Die Hauptanzucht erfolgte unter gleichen Bedingungen in Kolben mit 100 ml YE-Medium, die mit 10 μl, 20 μl oder 50 μl der Voranzucht angeimpft wurden.
  • 9.1 Erstellen kompetenter Zellen
  • Am nächsten Tag wurden die Kolben mittels Thomakammer ausgezählt und es wurde mit dem Kolben, der eine Zellzahl von 3-5 × 107 Zellen/ml besaß weitergearbeitet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (GSA: 5000 rpm (4000 × g) 10 min) geerntet. Das Zellpellet wurde in 10 ml TE-Puffer aufgenommen und auf zwei Tischzentrifugenröhrchen aufgeteilt (je 5 ml). Die Zellen wurden 3 min bei 6000 rpm abzentrifugiert und noch zweimal mit je 5 ml TE-Puffer gewaschen. Anschließend wurde das Zellpellet in 330 μl Lithiumacetat-Puffer pro 109 Zellen aufgenommen, in einen sterilen 50 ml Erlenmeyerkolben überführt und eine Stunde bei 28 °C geschüttelt. Dadurch waren die Zellen kompetent für die Transformation.
  • 9.2 Transformation
  • Für jeden Transformationsansatz wurden 15 μl Heringssperma DNA (10 mg/ml), 10 μl zu transformierende DNA (ca. 0,5 μg) und 330 μl kompetente Zellen in ein Tischzentrifugenrohrchen pipettiert und 30 min bei 28 °C (ohne Schütteln) inkubiert. Danach wurden 700 μl 50% PEG 6000 zugegeben und für eine weitere Stunde bei 28 °C, ohne Schütteln, inkubiert. Es folgte ein Hitzeschock von 5 min bei 42 °C.
  • 100 μl der Suspension wurden auf Selektionsmedium (YNB, Difco) ausplattiert, m auf Leucinprototrophie zu selektionieren. Im Falle der Selektion auf G418 Resistenz wird nach dem Hitzeschock eine Regeneration der Zellen durchgeführt (s. unter 9.3 Regeneration sphase)
  • 9.3 Regenerationsphase
  • Da der Selektionsmarker die Resistenz gegen G418 ist, brauchten die Zellen Zeit für die Expression des Resistenz-Gens. Die Transformationsansätze wurden mit 4 ml YE-Medium versetzt und über Nacht bei 28 °C auf dem Schüttler (120 rpm) bebrütet. Am nächsten Tag wurden die Zellen abzentrifugiert (6000 rpm, 3 min) in 1 ml YE-Medium aufgenommen und davon 100 μl bzw. 200 μl auf YE + G418-Platten ausplattiert. Die Platten wurden mehrere Tage bei 28 °C bebrütet.
  • 10. Reaktionsbedingungen für die PCR
  • Die Reaktionsbedingungen für die Polymerase Chain Reaction müssen für den Einzelfall optimiert werden und sind nicht uneingeschränkt für jeden Ansatz gültig. So kann unter anderem die eingesetzte Menge an DNA, die Salzkonzentrationen und die Schmelztemperatur variiert werden. Für unsere Problemstellung erwies es sich als günstig, in einem Eppendorfhütchen, das für den Einsatz im Thermocycler geeignet war, folgende Substanzen zu vereinigen: Zu 2 μl (= 0,1 U) Super Taq Polymerase wurden 5 μl Super Buffer, 8 μl dNTP's (je 0,625 ∝M), 5'-Primer, 3'-Primer und 0,2 μg Matritzen DNA, gelöst in soviel Wasser, dass sich ein Gesamtvolumen von 50 μl für den PCR Ansatz ergibt, zugegeben. Der Ansatz wurde kurz abzentrifugiert und mit einem Tropfen Öl überschichtet. Es wurden zwischen 37 und 40 Zyklen zur Amplifizierung gewählt.
  • II. Beispiele
  • Beispiel 1
  • Expression einer trunkierten HMG-CoA-Reduktase in S.cerevisiae GRF Die kodierende Nukleinsäuresequenz für die Expressionskassette aus ADH-Promotor-tHMG-Trypophan-Terminator wurde aus dem Vektor YepH2 (Polakowski et al. (1998) Overexpression of a cytosolic hydroxymethylglutaryl-CoA reductase leads to squalene accumulation in yeast. Appl Microbiol Biotechnol. Jan;49(1): 66-71) durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden wie vorstehend unter den allgemeinen Reaktionsbedingungen angegeben amplifiziert.
  • Die hierbei verwendeten Primer sind die DNA Oligomere AtHT-5' (forward: tHMGNotF: 5'-CTGCGGCCGCATCATGGACCAATTGGTGAAAACTG-3'; SEQ. ID. NO. 11) und AtHT-3' (reverse: tHMGXhoR: 5'-AACTCGAGAGACACATGGTGCTGTTGTGCTTC-3'; SEQ. ID. No. 12).
  • Das erhaltene DNA-Fragment wurde nach einer Klenow-Behandlung in den Vekor pUG6 in die EcoRV-Schnittstelle Blunt-end einkloniert und ergab den Vektor pUG6- tHMG (1).
  • Nach Plasmidisolation wurde ein erweitertes Fragment aus dem Vektor pUG-tHMG mittels PCR amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-ADH-Promotor-tHMG-Tryptphan-Terminator-loxP. Als Primer wurden Oligonukleotid-sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz des URA3-Gens enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen der loxP-Regionen 5' und 3' des Vektors pUG-tHMG. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive KanR und tHMG amplifiziert werden und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den URA3-Genlocus der Hefe integriert.
  • Als Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418. Der resultierende Stamm S.cerevisiae GRF-tH1ura3 ist Uracil auxotroph und enthält eine Kopie des Genes tHMG unter der Kontrolle des ADH-Promotors und des Tryptophan-Terminators.
  • Um die Resistenz gegen G418 anschliessend wieder zu entfernen, wird der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. (1996) A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jul 1;24(13): 2519-24.) transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die ADH-tHMG-TRP Kassette in dem URA3-Genlocus enthalten bleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektivien Bedingungen kultiviert werden und anschliessend auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
  • Der Hefestamm GRFtH1ura3 und der Ausgangsstamm GRF wurden 48 Stunden lang in WMXIII-Medium bei 28°C und 160 rpm in einem 20 ml Kulturvolumen kultiviert. Anschliessend wurden 500 μl dieser Vorkultur in eine 50 ml Hauptkultur des gleichen Mediums überführt und für 4 Tage bei 28°C und 160 rpm in einem Schikanekolben kultiviert.
  • Die Sterole wurden nach der Methode wie in Parks LW, Bottema CD, Rodriguez RJ, Lewis TA. (1985) Yeast sterols: yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Methods Enzymol. 1985;111: 333-46, beschrieben, nach 4 Tagen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Es ergeben sich die in Tabelle 1 aufgelisteten Werte. Die prozentualen Angaben beziehen sich auf das Hefetrockengewicht.
  • Tabelle 1
    Figure 00410001
  • Beispiel 2
  • Expression von ERG1 in S. cerevisiae GRFtH1ura3 bei gleichzeitiger Deletion von ERGS; Herstellung von GRFtH1ura3ERG1erg5
  • Beispiel 2.1
  • Herstellung des Integrationsvektors pUG6-ERG1
  • Die DNA-Sequenz für die Kassette aus ADH-Promotor-ERG1-Tryptophan-Terminator wurde aus dem Vektor pFlat3-ERG1 durch Restriktion mit den Enzymen Nhel und Bsp68I(NruI) unter Verwendung von Standardmethoden isoliert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde nach einer Klenow-Behandlung in den Vektor pUG6 in die EcoRV-Schnittstelle Blunt-end einkloniert und ergab den Vektor pUG6-ERG1 (2)
  • Beispiel 2.2.
  • Integrative Transformationen
  • Nach Plasmidisolation wurde ein erweitertes Fragment aus dem Vektor pUG6-ERG1 mittels PCR amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP-ADH1-Pr.-ERG1-Tip-Term. Als Primer wurden Oligonucleotid-Sequenzen ausgewählt, die im annealenden Bereich die Sequenzen jenseits der zu amplifizierenden Kassette des Vektors pUG6-ERG1 enthalten und an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz des Integrationslocus ERG5 enthalten. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive KanR und Zielgen ERG1 amplifiziert wird und andererseits dieses Fragment anschliessend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination in den Ziel-Genlocus ERG5 der Hefe integriert. Dazu wurden folgende Primer verwendet:
    ERG5-Crelox-5' (SEQ ID NO: 13): 5'-ATGAGTTCTG TCGCAGAAAA TATAATACAA CATGCCACTC CCAGCTGAAGCTTCGTACGC-3' und
    ERG5-Crelox-3' (SEQ ID NO: 14): 5'-TTATTCGAAG ACTTCTCCAG TAATTGGGTC TCTCTTTTTG GCATAGGCCA CTAGTGGATC TG-3'
  • Als Selektionsmarker dient die Resistenz gegen Geneticin (G418). Der resultierende Stamm enthält eine Kopie des Zielgens ERG1 unter der Kontrolle des ADH1-Promotors und des Tryptophan-Terminators. Gleichzeitig ist es möglich, durch die Integration des Gens das entsprechende Gen ERG5 des Ziellocus zu deletieren. Um die Resistenz gegen G418 anschliessend wieder zu entfernen, wird der entstandene Hefestamm mit dem cre-Rekombinatase enthaltenden Vektor pSH47 transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre-Rekombinase in der Hefe exprimert, was zur Folge hat, dass der Sequenzbereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert, was wiederum zur Folge hat, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die Kassette aus ADH1-Prom.-ERG1-TRP1-Term. in dem Ziellocus ERG5 enthalten bleiben. Die Folge ist, dass der Hefestamm eine G418 Resistenz wieder verliert. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch Anzucht auf FOA-Medium selektiv entfernt werden.
  • Der erhaltene Hefestamm GRFtH1ura3ERG1erg5 wurde für 48 Stunden lang in WMVII-Medium bei 28°C und 160 rpm in einem 20 ml Kulturvolumen kultiviert. Anschliessend wurden 500 μl dieser Vorkultur in eine 50 ml Hauptkultur des gleichen Mediums überführt und für 3 Tage bei 28°C und 160 rpm in einem Schikankolben kultiviert.
  • Die Sterole wurden nach der Methode wie in Parks LW, Bottema CD, Rodriguez RJ, Lewis TA. (1985) Yeast sterols: yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Methods Enzymol. 1985;111:333-46, beschrieben, nach 4 Tagen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Es ergeben sich die in Tabelle 2 aufgelisteten Werte. Die prozentualen Angaben beziehen sich auf das Hefetrockengewicht.
  • Tabelle 2
    Figure 00430001
  • Vergleichsbeispiel 1
  • Deletion von ERG5 in S. cerevisiae GRFtH1ura3; Herstellung von GRFtH1ura3erg5
  • Die Deletion von ERG5 in S. cerevisiae GRFtH1ura3 erfolgte analog wie in Beispiel 2 beschrieben. Um lediglich das ERG5-Gen zu deletieren, wurde das gleiche Verfahren verwendet, jedoch anstatt des Vektors pUG6-ERG1 der Vektor pUG6 eingesetzt. Dieser Vektor enthält keine Kassette aus ADH-Prom-ERG1-Trp-Term. Durch den Einsatz dieses Vektors ist es möglich eine Gen, in diesem Fall das Gen ERG5 zu deletieren
  • Der erhaltene Hefestamm GRFtH1ura3erg5 wurde für 48 Stunden lang in WMVII-Medium bei 28°C und 160 rpm in einem 20 ml Kulturvolumen kultiviert. Anschliessend wurden 500 μl dieser Vorkultur in eine 50 ml Hauptkultur des gleichen Mediums überführt und für 3 Tage bei 28°C und 160 rpm in einem Schikankolben kultiviert.
  • Die Sterole wurden nach der Methode wie in Parks LW, Bottema CD, Rodriguez RJ, Lewis TA. (1985) Yeast sterols: yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Methods Enzymol. 1985;111:333-46, beschrieben, nach 4 Tagen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Es ergeben sich die in Tabelle 3 aufgelisteten Werte. Die prozentualen Angaben beziehen sich auf das Hefetrockengewicht.
  • Tabelle 3
    Figure 00440001
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Figure 00770001

Claims (30)

  1. Verfahren zur Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten durch Kultivierung von Organismen die gegenüber dem Wildtyp eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase Aktivität und eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität aufweisen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Reduzierung der Δ22-Desaturase-Aktivität die Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Δ22-Desaturase gegenüber dem Wildtyp reduziert.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Organismus verwendet, der kein funktionelles Δ22-Desaturase-Gen aufweist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität die Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase gegenüber dem Wildtyp erhöht.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Genexpression ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase in den Organismus einbringt, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp, einer reduzierten Regulation unterliegt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt einen Promotor enthält, der in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp-Promotor, einer reduzierten Regulation unterliegt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, orthologen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, die den katalytischen Bereich der HMG-CoA-Reduktase kodiert.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren einbringt, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 4 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 4, und die die enzymatische Eigenschaft einer HMG-CoA-Reduktase aufweisen.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 3 einbringt.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität die Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase gegenüber dem Wildtyp erhöht.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Genexpression eine oder mehrere Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, in den Organismus einbringt.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren einbringt, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 6 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 6, und die die enzymatische Eigenschaft einer Lanosterol-C14-Demethylase aufweisen.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 5 einbringt.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Squalenepoxidase-Aktivität die Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalenepoxidase gegenüber dem Wildtyp erhöht.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Genexpression eine oder mehrere Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, in den Organismus einbringt.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren einbringt, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 8 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 8, und die die enzymatische Eigenschaft einer Squalenepoxidase aufweisen.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 7 einbringt.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Squalensynthetase-Aktivität die Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalensynthetase gegenüber dem Wildtyp erhöht.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Erhöhung der Genexpression eine oder mehrere Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase, in den Organismus einbringt.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man Nukleinsäuren einbringt, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 10 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 10, und die die enzymatische Eigenschaft einer Squalensynthetase aufweisen.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 9 einbringt.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass man als Organismus Hefe verwendet.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Kultivieren den Organismus erntet und anschließend Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetische Zwischen- und/oder Folgeprodukte aus dem Organismus isoliert.
  25. Genetisch veränderter Organismus, wobei die genetische Veränderung gegenüber dem Wildtyp die Δ22-Desaturase-Aktivität reduziert und die HMG-CoA-Reduktase Aktivität erhöht und mindestens eine der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität erhöht.
  26. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch, wobei die genetische Veränderung gegenüber dem Wildtyp die Δ22-Desaturase-Aktivität reduziert und die HMG-CoA-Reduktase Aktivität erhöht und die Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität erhöht.
  27. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass der genetisch veränderte Organismus gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten aufweist.
  28. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass man als Organismus Hefe verwendet.
  29. Verwendung eines genetisch veränderten Organismus nach einem der Ansprüche 25 bis 27 zur Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten.
  30. Verfahren zur Herstellung eines genetisch veränderten Organismus indem man ausgehend von einem Ausgangsorganismus die Δ22-Desaturase-Aktivität reduziert und die HMG-CoA-Reduktase Aktivität erhöht und mindestens eine der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Lanosterol-C14- Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität und Squalensynthetase-Aktivität erhöht.
DE10312314A 2003-03-19 2003-03-19 Verfahren zur Herstellung von Ergosta-5,7-dienol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in transgenen Organismen Withdrawn DE10312314A1 (de)

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CN103695493B (zh) * 2013-12-24 2016-04-13 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法
CN110452931A (zh) * 2018-05-08 2019-11-15 中国科学院微生物研究所 一种提高酵母中角鲨烯含量的方法
WO2022011059A1 (en) * 2020-07-08 2022-01-13 The Regents Of The University Of California Modified yeast host cells useful for producing isoprenol

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5460949A (en) * 1990-11-15 1995-10-24 Amoco Corporation Method and composition for increasing the accumulation of squalene and specific sterols in yeast
DE19744212B4 (de) * 1997-09-30 2006-01-19 Schering Ag Verfahren zur Herstellung von Ergosterol und dessen Zwischenprodukten mittels rekombinanter Hefen
US6822142B2 (en) 2001-01-05 2004-11-23 Monsanto Company Transgenic plants containing altered levels of steroid compounds
DE10203352A1 (de) * 2002-01-29 2003-07-31 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in transgenen Organismen

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