CN1761741A

CN1761741A - 在转基因生物中产生麦角甾－5,7－二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的方法

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Publication number: CN1761741A
Application number: CNA2004800070583A
Authority: CN
Inventors: A·金克尔; M·维恩; C·朗
Original assignee: BASF SE
Current assignee: Novozymes Berlin GmbH
Priority date: 2003-03-19
Filing date: 2004-03-12
Publication date: 2006-04-19
Also published as: AU2004221720A1; CA2518493A1; DE10312314A1; US7556937B2; JP2006520204A; EP1606390A1; WO2004083407A1; US20060269986A1

Abstract

本发明涉及通过培养经遗传修饰的生物产生麦角甾－5，7－二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的方法，还涉及经遗传修饰的生物自身，尤其是酵母。

Description

在转基因生物中产生麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的方法

本发明涉及通过培养遗传修饰的生物生产麦角甾-5，7-二烯醇(ergosta-5，7-dienol)和/或其生物合成中间物和/或代谢物的方法，还涉及遗传修饰的生物自身，尤其涉及酵母。

甾醇代谢的麦角甾-5，7-二烯醇和其生物合成中间物，如法呢醇、香叶醇、角鲨烯和羊毛甾醇和酵母甾醇，及其例如在哺乳动物中甾醇代谢的生物合成代谢物，如菜油甾醇、孕烯醇酮、17-OH-孕烯醇酮、孕酮、17-OH-孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇、脱氧皮质酮或皮质酮为高经济价值的化合物。

麦角甾-5，7-二烯醇可作为由生物转化、化学合成或生物技术生产制备类固醇激素的起始化合物。

皮质醇具有弱的糖皮质激素作用并为高的消炎、流产或抗增殖作用活性成分合成的广受欢迎的起始化合物。

角鲨烯用作萜合成的结构单元。角鲨烯以其氢化形式在皮肤病学和化妆品中用作角鲨烷，并以其多种衍生物形式用作护肤和护发产品的成分。

其他在经济上可利用的物质为甾醇，如酵母甾醇和羊毛甾醇，羊毛甾醇为皂苷和类固醇激素化学合成的核心原料和合成材料。由于其良好的皮肤渗透和铺展特性，羊毛甾醇用作乳剂助剂和护肤膏的活性成分。

因此生产麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的经济方法非常重要。

尤其经济的方法为利用天然生物和通过遗传修饰方法优化的生物生产麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的生物技术方法。

酵母中麦角甾醇代谢的基因为众所周知的并得到克隆，例如，

编码HMG-CoA还原酶(HMG)的核酸(Bason M.E.等，(1988)酵母和人类的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶——甾醇生物合成的限速酶之间的结构和功能保守性。Mol Cell Biol 8：3797-3808)，

编码截短的HMG-CoA还原酶(t-HMG)的核酸(Polakowski T，StahlU，Lang C(1998)胞质羟基甲基戊二酰-CoA还原酶的过量表达引起酵母中角鲨烯的累积。Appl Microbiol Biotechnol.Jan；49(1)：66-71)，

编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶(ERG11)的核酸(Kalb VF，Loper JC，Dey CR，Woods CW，Sutter TR (1986)从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中分离细胞色素P-450结构基因。Gene 45(3)：237-45)，

编码角鲨烯环氧酶(ERG1)的核酸(Jandrositz，A.等，(1991)酿酒酵母中编码角鲨烯环氧酶的基因：克隆及表征。Gene 107：155-160)和

编码角鲨烯合成酶(ERG9)的核酸(Jennings，S.M.，(1991)：酵母角鲨烯合成酶基因的分子克隆和表征。Proc Natl Acad Sci USA.Jul15；88(14)：6038-42)。

还有针对增加酵母和真菌中甾醇代谢特定中间物和分解代谢产物含量的已知方法。

从T.Polakowski，Molekularbiologische Beeinflussung desErgosteroltof wechsels der Hefe Saccharomyces cerevisiae[酿酒酵母麦角甾醇代谢的分子生物学效应]，Shaker Verlag Aachen，1999，59-66页已知增加HMG-CoA还原酶的表达速度引起早期甾醇如角鲨烯含量的轻度增加，而晚期甾醇如麦角甾醇的含量基本不变或者甚至有减少的趋势。

Tainaka等.，J，Ferment.Bioeng.1995，79，64-66还描述了ERG11(羊毛甾醇C14-脱甲基酶)的过量表达引起4，4-二甲基酵母甾醇的累积但不引起麦角甾醇的累积。依赖于发酵条件，转化体酵母甾醇的含量与野生型相比增力加到1.1-1.47倍。

WO99/16886描述了在过量表达tHMG、ERG9、SAT1和ERG1基因联合的酵母中产生麦角甾醇的方法。

EP486 290公开了通过增加HMG-CoA还原酶表达速度同时阻断麦角甾-5，7，24(28)-三烯醇-22-脱氢酶(下文也称为Δ22-去饱和酶(ERG5))代谢途径增加酵母中角鲨烯、酵母甾醇、麦角甾-5，7，-24(28)-三烯醇和麦角甾-5，7-二烯醇含量的方法。

然而此方法的缺点为麦角甾-5，7-二烯醇产量仍不尽人意。

本发明的目的是提供具有有利特性如更高产率的生产麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的其他方法。

我们发现此目的通过培养生物生产麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的方法实现，所述方法中所述的生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和至少一种选自羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性和角鲨烯合成酶活性的增加的活性。

降低的活性理解为不仅指活性的降低也指活性的完全消失。因此，活性的降低也包括生物中通过相关蛋白质完全缺失导致相关蛋白质的量降低，其可通过例如相关酶活性可检测性的缺乏或相关蛋白质免疫学可检测性的缺乏测定。

Δ22-去饱和酶活性理解为是指Δ22-去饱和酶的酶活性。

Δ22-去饱和酶理解为是指具有将麦角甾-5，7-二烯醇转化成麦角甾-5，7，22，24-四烯-3β-醇的酶活性的蛋白质。

因此，Δ22-去饱和酶活性理解为是指特定时间内通过蛋白质Δ22-去饱和酶转化的麦角甾-5，7-二烯醇的量或形成的麦角甾-5，7，22，24-四烯-3β-醇的量。

这样在与野生型相比Δ22-去饱和酶活性降低的情况下，特定时间内通过蛋白质Δ22-去饱和酶转化的麦角甾-5，7-二烯醇的量或形成的麦角甾-5，7，22，24-四烯-3β-醇的量与野生型相比降低。

Δ22-去饱和酶活性优选地降低到野生型Δ22-去饱和酶活性的至少90％，更优选地至少70％，更优选地至少50％，更优选地至少30％，甚至更优选地至少10％，甚至更优选地至少5％，尤其是0％。因此尤其优选的为生物中Δ22-去饱和酶活性消失。

Δ22-去饱和酶(ERG5)活性可通过如下所述确定：

从酿酒酵母Erg5突变体分离的多种浓度的麦角甾-5，7-二烯醇，(Parks等，1985，酵母甾醇.酵母突变体作为研究甾醇代谢的工具，MethodsEnzymol.111：333-346)和50μg二月桂酰磷脂酰胆碱混合并超声处理直到形成白色悬浮液。加入处理的微粒体(1ml)(3mg/ml蛋白质)。在检测混合物中加入NADPH(终浓度1mM)以开始酶反应。混合物在37℃孵育20分钟。反应通过加入3ml甲醇停止，甾醇通过加入2ml 60％(质量/体积(wt/vol))KOH水溶液水解。混合物在90℃孵育2小时。冷却后，混合物用5ml已烷萃取三次并通过在旋转蒸发器上蒸发浓缩。甾醇随后用双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(50μl于50μl甲苯中)60℃硅烷基化1小时。甾醇通过气相色谱/质谱(GC-MS)(例如VG 12-250型气相色谱-质谱仪；VG Biotech，Manchester，英国)分析。得到的Δ22-去饱和中间物可作为所用底物量的函数鉴定。不与底物孵育的微粒体作为参比。

此方法为Lamb等：致病性真菌光滑假丝酵母(Candida glabrata)细胞色素P-450甾醇Δ22-去饱和酶的纯化、重建和抑制。Antimicrob AgentsChemother.1999Jul；43(7)：1725-8中所述方法的修改。

Δ22-去饱和酶活性可通过不同的细胞学机制独立地降低，例如通过在蛋白质水平抑制相应的活性，例如通过加入该酶的抑制剂，或通过与野生型相比降低编码Δ22-去饱和酶的相应核酸的基因表达水平。

在根据本发明方法的优选实施方案中，通过降低编码Δ22-去饱和酶相应核酸的基因表达水平，与野生型相比降低Δ22-去饱和酶活性。

与野生型相比降低编码Δ22-去饱和酶核酸的基因表达水平同样可以多种方式实现，例如：

a)引入这样的核酸序列，其可转录成反义核酸序列，该反义核酸序列能例如通过抑制内源Δ22-去饱和酶活性的表达抑制Δ22-去饱和酶活性，

b)过量表达同源Δ22-去饱和酶核酸序列，其引起共抑制，

c)通过在生物中引入RNA/DNA寡核苷酸在内源基因(endogen)中引入无义突变，

d)引入特定DNA-结合因子，例如锌指转录因子类型的因子，其引起降低的基因表达，或者

e)产生敲除突变体，例如利用T-DNA诱变或同源重组产生基因敲除突变体。

在根据本发明方法优选的实施方案中，编码Δ22-去饱和酶核酸的基因表达水平通过，尤其是优选地通过同源重组产生敲除突变体来降低。

因此使用无功能性Δ22-去饱和酶基因的生物是优选的。

在优选的实施方案中，敲除突变体的产生，也就是说通过同源重组，靶基因座Δ22-去饱和酶基因的缺失与表达盒的整合同时进行，所述表达盒包含至少下述核酸之一，编码活性与野生型相比增加的蛋白质。

为此，可能使用这样的核酸构建体，其除了下述表达盒还包含启动子、编码序列和如果适当的话包含终止子，并且除了下述选择标记还在3’和5’端包含与待缺失基因开头和末尾核酸序列相同的核酸序列。

一旦选择发生，通过重组酶系统方法再次去除选择标记是优选的，例如通过选择标记3’和5’端的loxP信号使用Cre重组酶(Cre-LoxP系统)去除选择标记。

在优选生物酿酒酵母中，Δ22-去饱和酶基因称为基因ERG5(SEQ.ID.NO.1).SEQ.ID.NO.2组成了相应的酿酒酵母Δ22-去饱和酶(Skaggs，B.A.等，：编码另一种参与麦角甾醇生物合成的细胞色素P-450的酿酒酵母C-22甾醇去饱和酶基因的克隆和表征。Gene.1996Feb22；169(1)：105-9.)。

HMG-CoA还原酶活性理解为是指HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶)的酶活性。

HMG-CoA还原酶理解为是指具有将3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A转化成甲羟戊酸的酶活性的蛋白质。

因此，HMG-CoA还原酶活性理解为是指特定时间内通过蛋白质HMG-CoA还原酶转化的3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A的量或形成的甲羟戊酸的量。

这样在与野生型相比增加的HMG-CoA还原酶活性的情况下，特定时间内通过蛋白质HMG-CoA还原酶转化的3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A的量或形成的甲羟戊酸的量与野生型相比增加了。

此HMG-CoA还原酶活性的增加优选地达到野生型HMG-CoA还原酶活性的至少5％，更优选地至少20％，更优选地至少50％，更优选地至少100％，甚至更优选地至少300％，尤其优选地至少500％，特别优选地至少600％。

HMG-CoA还原酶活性如Th.Polakowski，MolekularbiologischeBeeinflussung des Ergosterolstoffwechsels der Hefe Saccharomycescerevisiae，Shaker-Verlag，Aachen 1999，ISBN 3-8265-6211-9中所述确定。

根据此参考，离心(3500xg，5分钟)收集培养48小时的10⁹个酵母细胞并在2ml缓冲液I(100mM磷酸钾缓冲液，pH7.0)中洗涤。细胞沉淀溶于500μl缓冲液1(胞质蛋白质)或缓冲液2(100mM磷酸钾缓冲液pH7.0；1％Triton X-100)(总蛋白)中，并加入1μl 500mM PMSF的异丙醇溶液。细胞中加入500μl玻璃珠(d＝0.5mm)，涡旋5次1分钟破碎细胞。玻璃珠间的液体转入新Eppendorf管中。离心15分钟(14000xg)去除细胞碎片和膜成分。上清液转入新Eppendorf管中并组成蛋白质级分。

HMG-CoA活性通过测量3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原中消耗的NADPH+H⁺确定，其中3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA作为底物加入。

1000μl的反应体积中加入20μl酵母蛋白质分离物和910μl缓冲液I；50μl 0.1M DTT和10μl 16mM NADPH+H⁺。反应混合物加热到30℃并在光度计中340nm下测量7.5分钟。此时间内测量的NADPH减少为不加入底物的分解速度并作为背景考虑。

此后加入底物(10μl 30mM HMG-CoA)，测量持续7.5分钟。HMG-CoA还原酶活性通过确定特定的NADPH分解速度计算。

羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性理解为是指羊毛甾醇C14-脱甲基酶的酶活性。

羊毛甾醇C14-脱甲基酶理解为是指具有将羊毛甾醇转化成4，4-二甲基胆-8，14，24-三烯醇的酶活性的蛋白质。

因此羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性理解为是指特定时间内通过蛋白质羊毛甾醇C14-脱甲基酶转化的羊毛甾醇的量或形成的4，4-二甲基胆-8，14，24-三烯醇的量。

这样在与野生型相比增加的羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性的情况下，特定时间内通过蛋白质羊毛甾醇C14-脱甲基酶转化的羊毛甾醇的量或形成的4，4-二甲基胆-8，14，24-三烯醇的量与野生型相比增加。

羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性的增加优选地达到野生型羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性的至少5％，更优选地至少20％，更优选地至少50％，更优选地至少100％，甚至更优选地至少300％，尤其优选地至少500％，特别是至少600％。

羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性如Omura，T和Sato，R.(1964)肝微粒体中的一氧化碳结合色素。J.Biol.Chem.239，2370-2378中所述确定。在此检测中，P450酶的量半定量为带有结合血红素的全酶。(活性)全酶(带有血红素)可被CO还原，并且只有CO还原的酶在450nm具有最大吸收。这样450nm的最大吸收用于测量羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性。

为进行活性确定，微粒体级分(100mM磷酸钾缓冲液中4-10mg/ml蛋白质)1∶4稀释，以使测定中使用的蛋白质浓度为2mg/ml。测定直接在细胞中进行。

在微粒体中加入spatula-tipful连二亚硫酸盐(S₂O₄Na₂)。用分光光度计在380-500nm范围记录基线。

大约20-30个CO泡随后从样品中冒出。现在在同样的范围内测量吸收。450nm的吸收水平与反应混合物中P450酶的量对应。

角鲨烯环氧酶活性理解为是指角鲨烯环氧酶的酶活性。

角鲨烯环氧酶理解为是指具有将角鲨烯转化成环氧化角鲨烯的酶活性的蛋白质。

因此角鲨烯环氧酶活性理解为是指特定时间内通过蛋白质角鲨烯环氧酶转化的角鲨烯的量或形成的环氧化角鲨烯的量。

这样在角鲨烯环氧酶活性与野生型相比增加的情况下，特定时间内通过蛋白质角鲨烯环氧酶转化的角鲨烯的量或形成的环氧化角鲨烯的量与野生型相比增加。

角鲨烯环氧酶活性的增加优选地达到野生型角鲨烯环氧酶活性的至少5％，更优选地至少20％，更优选地至少50％，更优选地至少100％，甚至更优选地至少300％，尤其优选地至少500％，特别是至少600％。

角鲨烯环氧酶活性如Leber R，Landl K，Zinser E，Ahorn H，Spok A，Kohlwein SD，Turnowsky F，Daum G(1998)酵母中角鲨烯环氧酶Erg1p的二元定位反映了内质网和脂质微粒之间的关系，Mol.Biol.Cell.1998，Feb；9(2)：375-86中所述确定。

此方法包括将100mM Tris-HCl，pH7.5中的0.35-0.7mg微粒体蛋白质或3.5-75μg脂质微粒蛋白质，1mM EDTA，0.1mM FAD，3mMNADPH，0.1mM角鲨烯2，3-环氧酶环化酶抑制剂U18666A、32μM[³H]角鲨烯分散于0.005％Tween 80中，总体积为500μl。

测定在30℃进行。预处理10分钟之后，加入角鲨烯开始反应并在15、30、45分钟后通过用3ml氯仿/甲醇(2∶1体积/体积(vol/vol))和750μl0.035％MgCl₂脂类萃取停止反应。

脂类在氮环境中干燥并再溶解于0.5ml氯仿/甲醇(2∶1体积/体积)中。为进行薄层层析，各部分置于硅胶60板(0.2mm)上并用氯仿作为洗脱剂分离。刮出含有[³H]2，3-环氧角鲨烯和[³H]角鲨烯的位置并用闪烁计数器定量。

角鲨烯合成酶活性理解为是指角鲨烯合成酶的酶活性。

角鲨烯合成酶理解为是指具有将焦磷酸法呢酯转化成角鲨烯的酶活性的蛋白质。

因此角鲨烯合成酶活性理解为是指特定时间内通过蛋白质角鲨烯合成酶转化的焦磷酸法呢酯的量或形成的角鲨烯的量。

这样在与野生型相比增加的角鲨烯合成酶活性的情况下，特定时间内通过蛋白质角鲨烯合成酶转化的焦磷酸法呢酯的量或形成的角鲨烯的量与野生型相比增加。

角鲨烯合成酶活性的增加优选地达到野生型角鲨烯合成酶活性的至少5％，更优选地至少20％，更优选地至少50％，更优选地至少100％，甚至更优选地至少300％，尤其优选地至少500％，特别是至少600％。

角鲨烯合成酶活性可如下所述确定：

反应混合物包含玻璃管中总体积200μl的50mM Mops，pH7.2，10mM MgCl₂，1％(v/v)Tween-80，10％(v/v)2-丙醇，1mM DTT，1mg/mlBSA，NADPH，FPP(或PSPP)和微粒体(蛋白质含量3mg)。含有放射性底物[1-³H]FPP(15-30mCi/μmol)的反应物在30℃孵育30分钟，悬浮混合物用1体积的1∶1(v/v)40％水性KOH∶甲醇装满。加入液体NaCl直到溶液饱和，同样加入含0.5％(v/v)角鲨烯的2ml石油醚。

悬浮液涡旋30秒。使用巴斯德吸管加入1ml石油醚层部分到填充的0.5×6cm铝柱(80-200网孔，Fisher)上。用含0.5％(v/v)角鲨烯的2ml石油醚预平衡柱子。随后用含0.5％(v/v)角鲨烯的5×1ml甲苯洗脱柱子。使用闪烁计数器(Beckman)在Cytoscint(ICN)闪烁液中测量角鲨烯放射性。

此方法为Radisky等，Biochemistry.2000Feb 22；39(7)：1748-60，Zhang等(1993)Arch.Biochem.Biophys.304，133-143和Poulter C.D.等(1989)J.Am.Chem.Soc.111，3734-3739中所述方法的修改。

野生型理解为是指非遗传修饰的起始生物。优选地并且特别是在生物或野生型不能明确鉴定的情况下，关于Δ22-去饱和酶活性的降低、HMG-CoA还原酶活性的增加、羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性的增加、角鲨烯环氧酶活性的增加和角鲨烯合成酶活性的增加和麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物含量的增加的野生型理解为是指参考生物。此参考生物优选地为酵母菌株酿酒酵母AH22。

HMG-CoA还原酶活性、羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性或角鲨烯合成酶活性可以多种方式独立地增加，例如通过在表达和蛋白质水平消除抑制调节机制，或通过与野生型相比增加相应核酸，也就是说编码HMG-CoA还原酶、羊毛甾醇C14-脱甲基酶、角鲨烯环氧酶或角鲨烯合成酶的核酸的基因表达水平。

与野生型相比增加相应核酸的基因表达水平也可以多种方式实现，例如通过激活剂诱导相应基因，也就是说通过激活剂诱导HMG-CoA还原酶基因、羊毛甾醇C14-脱甲基酶基因、角鲨烯环氧酶基因或角鲨烯合成酶基因或通过引入相应核酸的一种或多种基因拷贝，也就是说在生物中引入编码HMG-CoA还原酶、羊毛甾醇C14-脱甲基酶、角鲨烯环氧酶或角鲨烯合成酶的一种或多种核酸。

根据本发明，增加编码HMG-CoA还原酶、羊毛甾醇C14-脱甲基酶、角鲨烯环氧酶或角鲨烯合成酶的核酸的基因表达也理解为是指操作生物自身的，尤其是酵母自身的内源HMG-CoA还原酶、羊毛甾醇C14-脱甲基酶、角鲨烯环氧酶或角鲨烯合成酶的表达。

这可例如通过修饰编码HMG-CoA还原酶、羊毛甾醇C14-脱甲基酶、角鲨烯环氧酶或角鲨烯合成酶的基因的启动子DNA序列实现。引起所述基因表达速度增加的这种修饰可例如通过DNA序列的缺失或插入完成。

如上所述，可能通过应用外源刺激物修饰内源HMG-CoA还原酶、羊毛甾醇C14-脱甲基酶、角鲨烯环氧酶或角鲨烯合成酶的表达。这可通过特定生理条件实现，也就是说通过应用外来物质实现。

此外，内源HMG-CoA还原酶、羊毛甾醇C14-脱甲基酶、角鲨烯环氧酶或角鲨烯合成酶基因经修饰的或增加的表达可通过非转化生物中不存在并与这些基因的启动子相互作用的调节物蛋白质实现。

此种调节物可为例如WO96/06166中所述由DNA结合结构域和转录激活剂结构域组成的嵌合蛋白质。

在优选的实施方案中，与野生型相比羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性的增加通过增加编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的核酸的基因表达来实现。

在另一个优选的实施方案中，编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的核酸基因表达的增加通过在生物中引入编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的一种或多种核酸来实现。

原则上，任何羊毛甾醇C14-脱甲基酶基因(ERG11)，也就是说编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的任何核酸都可用于此目的。在真核来源的含有内含子的基因组羊毛甾醇C14-脱甲基酶核酸序列的情况下，如果宿主生物不能或不可使其能表达相应羊毛甾醇C14-脱甲基酶，优选使用预处理的核酸序列，如相应的cDNAs。

羊毛甾醇C14-脱甲基酶基因的实例为编码酿酒酵母(Kalb VF，LoperJC，Dey CR，Woods CW，Sutter TR(1986)酿酒酵母细胞色素P-450结构基因的分离，Gene 45(3)：237-45)、白色念珠茵(Candida albicans)(LambDC，Kelly DE，Baldwin BC，Gozzo F，Boscott P，Richards WG，KellySL(1997)用吡咯抗真菌立体异构体对白色念珠茵CYP51的分化抑制，FEMS Microbiol Lett 149(1)：25-30)、人类(Homo sapiens)(Stromstedt M，Rozman D，Waterman MR.(1996)遍在表达的人CYP51编码羊毛甾醇14a-脱甲基酶，表达受氧甾醇调节的细胞色素P450，Arch Biochem Biophys1996May 1；329(1)：73-81c)或褐鼠(Rattus norvegicus)(Aoyama Y，Funae Y，Noshiro M，Horiuchi T，Yoshida Y(1994)大鼠肝中存在与酵母羊毛甾醇14-脱甲基酶(P450(14DM))高度同源的P450，Biochem BiophysRes Commun.Jun 30；201(3)：1320-6)羊毛甾醇C14-脱甲基酶的核酸。

在根据本发明的转基因生物中，这样在此优选的实施方案中存在与野生型相比至少一种其他的羊毛甾醇C14-脱甲基酶基因。

根据本发明的转基因生物中羊毛甾醇C14-脱甲基酶基因的量至少为两种，优选地多于两种，尤其优选地多于三种，非常尤其优选地多于五种。

说明书中提到的所有核酸可为例如RNA、DNA或cDNA序列。

上述方法优选地使用编码包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.6或通过氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白质的核酸，其中所述衍生序列与序列SEQ.ID.NO.6在氨基酸水平上具有至少30％，优选地至少50％，更优选地至少70％，尤其优选地至少90％，最优选地至少95％的同一性，其中所述蛋白质具有羊毛甾醇C14-脱甲基酶的酶特征。

序列SEQ.ID.NO.6组成了酿酒酵母羊毛甾醇C14-脱甲基酶的氨基酸序列。

羊毛甾醇C14-脱甲基酶和羊毛甾醇C14-脱甲基酶基因的其他实例可例如通过氨基酸序列或数据库中相应回译(backtranslate)核酸序列与SEQ.ID.NO.2的同源性比较从基因组序列已知的多种生物中容易地发现。

羊毛甾醇C14-脱甲基酶和羊毛甾醇C14-脱甲基酶基因的其他实例可以本来已知的方式通过杂交和PCR技术，例如以序列SEQ.ID.NO.5开始从基因组序列未知的多种生物容易地找到。

在说明书中，术语“替代”理解为是指一个或多个氨基酸替代一个或多个氨基酸。优选地进行已知为保守替代的替代，其中替代的氨基酸具有与原来氨基酸相似的性质，例如天冬氨酸替代谷氨酸，天冬酰胺替代谷氨酰胺，异亮氨酸替代缬氨酸，异亮氨酸替代亮氨酸，苏氨酸替代丝氨酸。

缺失为通过直接键(direct bond)替代氨基酸。缺失的优选位置为多肽的末端和单独蛋白质结构域间的连接。

插入为在多肽链中引入氨基酸，直接键形式上被一个或多个氨基酸替代。

两种蛋白质间的同一性理解为是指每一种情况下整个蛋白质长度中氨基酸的同一性，尤其是指用Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.微型计算机上快速灵敏的多序列比对。Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2)：151-1)在来自DNASTAR，inc.Madison，Wisconsin(USA)的Lasergene软件辅助下通过比对计算的同一性，其中设置如下参数：

多重比对参数：

缺口罚分 10

缺口长度罚分 10

配对比对参数：

K-tuple 1

缺口罚分 3

窗口 5

节省的对角线 5

因此在蛋白质水平与序列SEQ.ID.NO.6有至少30％同一性的蛋白质理解为是指当该蛋白质的序列与序列SEQ.ID.NO.6比对，尤其是根据上面的程序算法用上面的参数设置比对时具有至少30％同一性的蛋白质。

在另一个优选的实施方案中，在生物中引入编码包含酿酒酵母羊毛甾醇C14-脱甲基酶氨基酸序列(SEQ.ID.NO.6)的蛋白质的核酸。

适当的核酸序列可根据遗传密码通过回译多肽序列获得。

优选地用于此目的的密码子为根据生物特异性密码子选择经常使用的密码子。密码子选择可在该生物其他已知基因的计算机评估的辅助下容易地确定。

如果例如蛋白质要在酵母中表达，当回译时使用酵母密码子选择经常是有利的。

在尤其优选的实施方案中，在生物中引入包含序列SEQ.ID.NO.5的核酸。

序列SEQ.ID.NO.5组成了酿酒酵母的基因组DNA(ORF S0001049)，其编码具有序列SEQ.ID.NO.6的羊毛甾醇C14-脱甲基酶。

所有上述羊毛甾醇C14-脱甲基酶基因也可以本来已知的方式通过化学合成如通过双螺旋单个重叠互补核酸单位的片段缩合从核苷酸单位产生。寡核苷酸可以已知的方式使用亚磷酸胺(phosphoamidite)法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897页)化学合成。合成寡核苷酸的退火和在DNA聚合酶Klenow片段辅助下缺口的填充以及连接反应在Sambrook等(1989)，Molecular cloning：A laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中作为常规克隆方法描述。

在优选的实施方案中，与野生型相比增加HMG-CoA还原酶活性通过增加编码HMG-CoA还原酶的核酸的基因表达来实现。

在根据本发明方法尤其优选的实施方案中，增加编码HMG-CoA还原酶的核酸的基因表达通过在生物中引入编码HMG-CoA还原酶的核酸的核酸构建体实现，其中所述的核酸在生物中的表达与野生型相比受下降调节。

与野生型相比下降调节理解为是指与上面定义的野生型相比降低的调节，所述野生型优选地在表达水平或蛋白质水平上无调节。

下降调节可优选地通过启动子方法完成，其中所述的启动子在核酸构建体中与编码序列有效连接并且在生物中与野生型启动子相比受下降调节。

例如在酵母中中间ADH启动子只受下降调节并因此尤其优选作为上述核酸构建体中的启动子。

ADH12s启动子的此启动子片段，以下也称为ADH1，表现出几乎组成型表达(Ruohonen L，Penttila M，Keranen S(1991)由酿酒酵母生产芽孢杆菌属a-淀粉酶的优化。Yeast-May-Jun；7(4)：337-462；Lang C，LoomanAC(1995)在酵母中有效表达和分泌黑曲霉(Aspergillus niger)RH5344多聚半乳糖醛酸酶，Appl Microbiol Biotechnol.Dec；44(1-2)：147-56.)，所以转录调节不再经过麦角甾醇生物合成中间物进行。

其他具有下降调节的优选启动子为组成型启动子，如酵母TEF1启动子、酵母GPD启动子或酵母PGK启动子(Mumberg D，Muller R，FunkM.(1995)用于不同遗传背景中异源蛋白质受控表达的酵母载体，Gene.1995Apr 14；156(1)：119-22；Chen CY，Oppermann H，Hitzeman RA.(1984)酿酒酵母中同源和异源基因表达，Nucleic Acid Res.Dec 11；12(23)：8951-70)。

在另一个优选的实施方案中，下降调节可通过使用如编码HMG-CoA还原酶的核酸完成，其中所述的核酸在生物中的表达与同源的、直向同源的核酸相比受下降调节。

尤其优选地使用只编码HMG-CoA还原酶催化区域(截短的(t-)HMG-CoA还原酶)的核酸作为编码HMG-CoA还原酶的核酸。在EP 486290和WO99/16886中描述的此核酸(t-HMG)只编码HMG-CoA还原酶的催化活性部分而缺少负责在蛋白质水平上调节的膜结构域。这样此核酸受下降调节，尤其在酵母中受下降调节并引起HMG-CoA还原酶基因表达的增加。

上述核酸构建体可使用整合载体在染色体水平或使用附加型质粒附加型地参入宿主生物，所述载体和质粒都包含上述核酸构建体。

在尤其优选的实施方案中，核酸优选地通过上述核酸构建体引入，其中所述的构建体编码包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.4或通过氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白质，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ.ID.NO.4具有至少30％同一性，其中所述的蛋白质具有HMG-CoA还原酶的酶特征。

序列SEQ.ID.NO.4组成了截短的HMG-CoA还原酶(t-HMG)的氨基酸序列。

HMG-CoA还原酶的其他实例，从而减少到催化部分的t-HMG-CoA还原酶的实例或者编码基因可例如通过氨基酸序列或来自数据库中相应回译核酸序列与SEQ ID.NO.4的同源性比较容易地从基因组序列已知的多种生物中发现。

HMG-CoA还原酶的其他实例，从而减少到催化部分的t-HMG-CoA还原酶的实例或者编码基因通过杂交和PCR技术，例如以序列SEQ.ID.NO.3开始从基因组序列未知的多种生物容易地找到。

尤其优选地使用包含序列SEQ.ID.NO.3的核酸作为编码截短的HMG-CoA还原酶的核酸。

在尤其优选的实施方案中，下降调节通过使用如编码HMG-CoA还原酶的核酸并使用启动子完成，其中所述的核酸在生物中的表达与该生物自身的直向同源核酸相比受下降调节；所述启动子与野生型启动子相比受下降调节。

在优选的实施方案中，与野生型相比增加角鲨烯环氧酶活性通过增加编码角鲨烯环氧酶的核酸的基因表达来实现。

在另一个优选的实施方案中，增加编码角鲨烯环氧酶的核酸的基因表达通过在生物中引入一种或多种编码角鲨烯环氧酶的核酸来实现。

原则上，任何角鲨烯环氧酶基因(ERG1)，也就是说编码角鲨烯环氧酶的任何核酸可用于此目的。在真核来源的含内含子的基因组角鲨烯环氧酶核酸序列的情况中，如果宿主生物不能或不能使其表达相应角鲨烯环氧酶，优选地使用预处理的核酸序列，如相应的cDNAs。

编码角鲨烯环氧酶的核酸的实例为编码来自酿酒酵母(Jandrositz，A.，等(1991)编码酿酒酵母角鲨烯环氧酶的基因：克隆及表征，Gene.107：155-160)、小鼠(Mus musculus)(Kosuga K，Hata S，Osumi T，SakakibaraJ，Ono T(1995)小鼠角鲨烯环氧酶cDNA的核苷酸序列，BiochimBiophys Acta，Feb 21；1260(3)：345-8b)、褐鼠(Sakakibara J，WatanabeR，Kanai Y，Ono T(1995)大鼠角鲨烯环氧酶的分子克隆和表达，J BiolChem Jan 6；270(1)：17-20c)或人(Nakamura Y，Sakakibara J，Izumi T，Shibata A，Ono T(1996)HeLa细胞中通过甾醇和抑制物对角鲨烯环氧酶的转录调节，J.Biol.Chem.1996，Apr 5；271(14)：8053-6)的角鲨烯环氧酶的核酸。

在根据本发明的转基因生物中，这样在此优选的实施方案中存在与野生型相比至少一种其他的角鲨烯环氧酶基因。

根据本发明的转基因生物中角鲨烯环氧酶基因的数目为至少两种，优选地多于两种，尤其优选地多于三种，非常尤其优选地多于五种。

上述方法优选地使用编码包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.8或通过氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白质的核酸，其中所述衍生序列与序列SEQ.ID.NO.8在氨基酸水平上具有至少30％，优选地至少50％，更优选地至少70％，尤其优选地至少90％，最优选地至少95％的同一性，其中所述的蛋白质具有角鲨烯环氧酶的酶特征。

序列SEQ.ID.NO.8组成了酿酒酵母角鲨烯环氧酶的氨基酸序列。

角鲨烯环氧酶和角鲨烯环氧酶基因的其他实例可例如通过氨基酸序列或数据库中相应回译核酸序列与SEQ.ID.NO.8的同源性比较从基因组序列已知的多种生物中容易地发现。

角鲨烯环氧酶和角鲨烯环氧酶基因的其他实例可以本来已知的方式通过杂交和PCR技术，例如以序列SEQ.ID.NO.7开始从基因组序列未知的多种生物容易地找到。

在另一个优选的实施方案中，在生物中引入编码包含酿酒酵母角鲨烯环氧酶氨基酸序列(SEQ.ID.NO.8)的蛋白质的核酸。

适当的核酸序列可例如通过根据遗传密码回译多肽序列获得。

优选地用于此目的的密码子为根据生物特异密码子选择经常使用的密码子。密码子选择可容易地在该生物其他已知基因的计算机评价辅助下确定。

如果例如蛋白质要在酵母中表达，回译时使用酵母密码子选择经常是有利的。

在尤其优选的实施方案中，在生物中引入包含序列SEQ.ID.NO.7的核酸。

序列SEQ.ID.NO.7组成了酿酒酵母的基因组DNA(ORF S0003407)，其编码序列SEQ ID NO.8的角鲨烯环氧酶。

所有上述角鲨烯环氧酶基因也可以本来已知的方式通过化学合成如通过双螺旋单个重叠互补核酸单位的片段缩合从核苷酸单位产生。寡核苷酸可以已知的方式使用亚磷酸胺法化学合成(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897页)。合成寡核苷酸的退火和在DNA聚合酶Klenow片段辅助下缺口的填充以及连接反应在Sambrook等(1989)，Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中作为常规克隆方法描述。

在优选的实施方案中，与野生型相比增加角鲨烯合成酶活性通过增加编码角鲨烯合成酶的核酸的基因表达来实现。

在另一个优选的实施方案中，增加编码角鲨烯合成酶的核酸的基因表达通过在生物中引入一种或多种编码角鲨烯合成酶的核酸来实现。

原则上，任何角鲨烯合成酶基因(ERG9)，也就是说编码角鲨烯合成酶的任何核酸可用于此目的。在真核来源的含内含子的基因组角鲨烯合成酶核酸序列的情况中，如果宿主生物不能或不能使其表达相应角鲨烯合成酶，优选地使用预处理的核酸序列，如相应的cDNAs。

编码角鲨烯合成酶的核酸的实例为编码酿酒酵母角鲨烯合成酶的核酸(ERG9)(Jennings，S.M.，(1991)酵母角鲨烯合成酶基因的分子克隆和表征，Proc Natl Acad Sci USA.Jul15；88(14)：6038-42)、编码Botryococcusbraunii Okada角鲨烯合成酶的核酸(Devarenne，T.P.等：绿色微合金产烃葡萄藻(green microalga Botryococcus braunii)角鲨烯合成酶raceB的分子表征，Arch.Biochem.Biophys.2000，Jan15，373(2)：307-17)、编码马铃薯块茎的角鲨烯合成酶的核酸(Yoshioka H.等，倍半萜环化酶和角鲨烯合成酶的cDNA克隆，和致病疫霉(Phytophthora infestans)感染的马铃薯块茎中这些基因的表达，Plant.Cell.Physiol.1999，Sep；40(9)：993-8)或编码光果甘草(Glycyrrhiza glabra)角鲨烯合成酶的核酸(Hayashi，H.等，光果甘草角鲨烯合成酶两种cDNA的分子克隆和表征，Biol.Pharm.Bull.1999，Sep；22(9)：947-50)。

在根据本发明的转基因生物中，从而在此优选的实施方案中与野生型相比存在至少一种其他的角鲨烯合成酶基因。

根据本发明的转基因生物中角鲨烯合成酶基因的数目为至少两种，尤其优选地多于三种，非常尤其优选地多于五种。上述方法优选地使用编码包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.10或通过氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白质的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ.ID.NO.10具有至少30％，，优选地至少50％，更优选地至少70％，尤其优选地至少90％，最优选地至少95％的同一性，其中所述的蛋白质具有角鲨烯合成酶的酶特征。

序列SEQ.ID.NO.10组成了酿酒酵母角鲨烯合成酶(ERG9)的氨基酸序列。

角鲨烯合成酶和角鲨烯合成酶基因的其他实例可通过氨基酸序列或来自数据库中相应回译核酸序列与SEQ ID.NO.10的同源性比较从基因组序列已知的多种生物中容易地发现。

角鲨烯合成酶和角鲨烯合成酶基因的其他实例可容易地以本来已知的方式通过杂交和PCR技术，例如以序列SEQ.ID.NO.9开始从基因组序列未知的多种生物容易地找到。

在另一个优选的实施方案中，在生物中引入编码包含酿酒酵母角鲨烯合成酶氨基酸序列(SEQ.ID.NO.10)的蛋白质的核酸。

在尤其优选的实施方案中，在生物中引入包含序列SEQ.ID.NO.9的核酸。

序列SEQ.ID.NO.9组成了酿酒酵母的基因组DNA(ORFYHR190W)，其编码序列SEQ.ID.NO.10的角鲨烯合成酶。

所有上述角鲨烯合成酶基因也可以本来已知的方式通过化学合成如通过双螺旋单个重叠互补核酸单位的片段缩合从核苷酸单位产生。寡核苷酸可以已知的方式使用亚磷酸胺法化学合成(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897页)。合成寡核苷酸的退火和在DNA聚合酶Klenow片段辅助下缺口的填充以及连接反应在Sambrook等(1989)，Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中作为常规克隆方法描述。

根据本发明的方法中培养的生物为与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性以及选自羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性和角鲨烯合成酶活性的至少一种活性增加的生物。

在优选的实施方案中，培养的生物为与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性或角鲨烯合成酶活性的生物。

根据本发明的方法的尤其优选的实施方案中，所述生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和选自羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性和角鲨烯合成酶活性至少两种活性增加的活性。

尤其优选的组合为与野生型相比降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性和角鲨烯环氧酶活性或羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性和角鲨烯合成酶活性或增加的角鲨烯环氧酶活性和角鲨烯合成酶活性。

根据本发明的方法的尤其优选的实施方案中，所述生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性和增加的角鲨烯环氧酶活性和增加的角鲨烯合成酶活性。

生物或经遗传修饰的生物根据本发明理解为是指例如细菌，尤其是芽孢杆菌属(Bacillus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸杆茵属(Lactobacillus spec)或链霉菌属(Streptomyces spec.)的细菌，例如酵母，尤其是酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或克鲁维酵母属(Klyveromyces spec.)的酵母，例如真菌，尤其是曲霉属(Aspergillus spec.)、青霉属(Penicillium spec.)、或网柄茵属(Dictyostelium spec.)的真菌，以及例如昆虫细胞系，这些生物作为野生型或由于前述遗传修饰而能够产生麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物。

尤其优选的生物或经遗传修饰的生物为酵母，尤其是酿酒酵母种，尤其是酵母菌株酿酒酵母AH22、酿酒酵母GRF、酿酒酵母DBY747和酿酒酵母BY4741。

麦角甾-5，7-二烯醇的生物合成中间物理解为是指所用生物的麦角甾-5，7-二烯醇生物合成中以中间物存在的所有化合物，优选指化合物甲羟戊酸、焦磷酸法呢酯、香叶醇焦磷酸酯、环氧化角鲨烯、4-二甲基胆-8，14，24-三烯醇、4，4-二甲基酵母甾醇、角鲨烯、法呢醇、香叶醇、羊毛甾醇、酵母甾酮(zymosterone)和酵母甾醇。

麦角甾-5，7-二烯醇的生物合成代谢物理解为是指为所用生物中麦角甾-5，7-二烯醇生物合成衍生物的所有那些化合物，也就是说其中麦角甾-5，7-二烯醇以中间物存在。所述化合物可为所用生物天然地从麦角甾-5，7-二烯醇产生的化合物。

然而麦角甾-5，7-二烯醇的生物合成代谢物也理解为是指只能通过引入起始生物其他生物的基因和酶活性在该经遗传修饰的生物中从麦角甾-5，7-二烯醇产生的化合物，其中所述起始生物不具有与所述其他生物直向同源的基因。

由于在酵母中引入其他植物基因和/或哺乳动物基因，可能例如在此酵母中产生仅在植物和/或哺乳动物中天然存在的生物合成麦角甾-5，7-二烯醇代谢物。

在酵母中引入例如编码植物Δ7-还原酶(DWF5)或其功能等价物或变体的核酸和编码CYP11A1、ADX(FDX1)、ADR(FDXR)和3β-HSD的成熟形式或它们的功能等价物或变体的核酸引起此酵母中孕酮的生物合成。酵母相应遗传修饰的步骤和方法和材料的详细描述公开在C.Duport等，Nat.Biotechnol.1998，16，186-189和其引用的参考文献中，将它们特别引用作为参考。

在酵母中引入例如编码植物Δ7-还原酶(DWF5)或其功能等价物或变体的核酸和编码CYP11A1、ADX(FDX1)和ADR(FDXR)的成熟形式或其功能等价物或变体的核酸和编码线粒体形式的ADX和CYP11B1、3b-HSD、CYP17A1和CYP21A1或其功能等价物或变体的核酸引起皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮和缩醛孕烯醇酮的生物合成。

为进一步增加生物合成的麦角甾-5，7-二烯醇代谢物如皮质醇的含量，抑制浪费的代谢途径，也就是说抑制导致目的产物的生物合成途径也是有利的。例如在酵母中降低ATF2、GCY1和YPR1基因产物的活性，尤其优选地是缺失这些活性引起皮质醇含量的进一步增加。

酵母相应遗传修饰的该步骤和方法以及材料的详细描述公开在F.M.Szczebara等，Nat.Biotechnol.2003，21，143-149和其引用的参考文献中，将它们特别引用作为参考。

因此生物合成的麦角甾-5，7-二烯醇代谢物理解为尤其是指菜油甾醇、孕烯醇酮、17-OH孕烯醇酮、孕酮、17-OH-孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇、脱氧皮质酮和/或皮质酮。

优选的生物合成代谢物为孕酮、皮质酮和皮质醇，尤其优选地为皮质醇。

根据本发明的方法产生的一些化合物本身为类固醇激素并可用于治疗目的。

产生的化合物，如麦角甾-5，7-二烯醇或皮质醇也可用于通过生物转化、化学合成或生物技术生产来制备类固醇激素或合成具有强烈消炎、流产或抗增殖活性的活性成分。

根据本发明的生产麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的方法中，培养经遗传修饰的生物(以下也称为转基因生物)的步骤后优选地为收获生物和从该生物分离麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物。

以本来已知的适合该生物的方式收获生物。通过发酵在液体营养培养基中生长的微生物如细菌、藓类、酵母和真菌或植物细胞可通过例如离心、倾析或过滤分离。

所收获的生物量中的麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物以本来已知的方式一起分离或分别分离每一种化合物，例如通过提取和如果适当的话，其他化学和物理纯化方法如沉淀法、结晶、热分离法像精馏法或物理分离法如层析。

本发明还涉及从起始生物开始产生经遗传修饰的生物的方法，所述经遗传修饰的生物中Δ22-去饱和酶活性降低，HMG-CoA还原酶活性增加并且选自羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性和角鲨烯合成酶活性的至少一种活性增加。

缺失目标基因座Δ22-去饱和酶基因的方法在上文中已详细描述。

转基因生物，尤其是酵母可优选地用核酸构建体转化起始生物，尤其是酵母来产生，其中所述核酸构建体包含至少一种编码HMG-CoA还原酶的核酸并包含至少一种选自编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的核酸、编码角鲨烯环氧酶的核酸和编码角鲨烯合成酶的核酸的核酸，其中所述核酸与一种或多种确保生物中转录和翻译的调节信号有效连接。在此实施方案中，使用核酸构建体产生转基因生物。

可用于此目的的核酸构建体为除了下述表达盒还包含启动子、编码序列和如果适当的话，终止子，和除了下述选择标记还含有在3’和5’端包含与待缺失基因开始和末尾的核酸序列相同的核酸序列的核酸构建体。

然而转基因生物也可优选地用几种核酸构建体的联合转化起始生物尤其是酵母产生，其中所述的核酸构建体包含这样的核酸构建体，其包含至少一种编码HMG-CoA还原酶的核酸，其中所述的核酸构建体还包含包含选自编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的核酸、编码角鲨烯环氧酶的核酸和编码角鲨烯合成酶的核酸至少一种核酸的核酸构建体或核酸构建体的联合，其中每一种情况下核酸构建体与确保在生物中转录和翻译的一种或多种调节信号有效连接。在此实施方案中，使用单个的核酸构建体或核酸构建体的联合产生转基因生物。

其中编码核酸序列与一种或多种确保在生物中尤其是酵母中转录和翻译的调节信号有效连接的核酸构建体在下文中也称为表达盒。

包含此表达盒的核酸构建体为例如载体或质粒。

调节信号优选地包含确保生物中尤其是酵母中转录和翻译的一个或多个启动子。

表达盒包含调节信号，也就是说控制宿主细胞中编码序列表达的调节核酸序列。根据优选的实施方案，表达盒包括启动子上游，即在编码序列的5’端，和终止子下游，即在3’端，以及如果适当的话，与至少一种上述基因的插入编码序列有效连接的其他调节元件。

有效连接理解为是指启动子、编码序列，如果适当的话，终止子和如果适当的话，其他调节元件的顺序排列使得每一种调节元件在编码序列的表达中可完成其计划的功能。

作为实例，酵母、真菌的优选核酸构建体、表达盒和质粒和产生转基因酵母的方法以及转基因酵母本身在下文中描述。

表达盒的适当启动子原则上为能控制生物中尤其是酵母中外源基因表达的任何启动子。

优选使用的启动子，尤其是在酵母中受下降调节的启动子为例如中间ADH启动子。

ADH12s启动子的此启动子片段以下也称为ADH1，其表现出接近组成型表达(Ruohonen L，Penttila M，Keranen S(1991)通过酿酒酵母优化芽孢杆菌α-淀粉酶生产，Yeast.May-Jun；7(4)：337-462；Lang C，LoomanAC(1995)黑曲霉RH5344多聚半乳糖醛酸酶在酿酒酵母中的有效表达和分泌，Appl Microbiol Biotechnol.Dec；44(1-2)：147-56.)，从而转录调节不再受麦角甾醇生物合成中间物的影响。

其他下降调节的优选启动子为组成型启动子如酵母TEF1启动子、酵母GPD启动子或酵母PGK启动子(Mumberg D，Muller R，Funk M.(1995)不同遗传背景中异源蛋白质受控表达的酵母载体，Gene.1995Apr 14；156(1)：119-22；Chen CY，Oppermann H，Hitzeman RA.(1984)酿酒酵母中同源和异源基因表达，Nucleic Acid Res.Dec 11；12(23)：8951-70.)。

表达盒也可以包含诱导型启动子，尤其是化学诱导型启动子，通过所述启动子，编码HMG-CoA还原酶、羊毛甾醇C14-脱甲基酶、角鲨烯环氧酶或角鲨烯合成酶的核酸在生物中的表达可在特定时间点受到控制。

作为实例，可以使用此类启动子，例如酵母CupI启动子(Etcheverry T.(1990)使用酵母铜金属硫蛋白启动子的诱导表达，Methods Enzymol.1990；185：319-29)、酵母Gall-10启动子(Ronicke V，Graulich W，MumbergD，Muller R，Funk M(1997)酿酒酵母中表达异源蛋白质的条件启动子的用途，Methods Enzymol.283：313-22)或酵母Pho5启动子(Bajwa W，Rudolph H，Hinnen A(1987)PHO5上游序列赋予组成型PHO3基因的磷酸控制，Yeast.1987Mar；3(1)：33-42)。

原则上，表达盒的适当终止子为能控制生物中尤其是酵母中外源基因表达的任何终止子。

优选的为酵母色氨酸终止子(TRP1终止子)。

表达盒优选地通过适当启动子与上述编码HMG-CoA还原酶、羊毛甾醇C14-脱甲基酶、角鲨烯环氧酶或角鲨烯合成酶的核酸和如果适当的话，终止子的融合来产生，所述融合使用例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中所述的常规重组和克隆技术进行。

根据本发明的核酸可以合成或天然获得或包含合成的和天然核酸成分的混合物或由来自多种生物的多种异源基因片段组成。

如上所述，优选的为具有酵母优选密码子的合成核苷酸序列。这些酵母优选的密码子可从在大多数目的酵母种类中表达的具有最高蛋白质频率密码子确定。

当制备表达盒时，可操作多种DNA片段以获得以正确方向方便阅读并配有正确阅读框的核苷酸序列。可在片段中加入接头或连接体以连接DNA片段与另一个DNA片段。

可方便地提供转录方向的启动子和终止子区域，它们具有包含用于此序列插入的一个或多个限制性切割位点的连接体或多聚连接体提供。通常，连接体具有1-10个，大多数情况下1-8个，优选地2-6个限制性切割位点。总之，调节区域中的连接体具有少于100bp，经常少于60bp，但至少5bp的大小。启动子可关于宿主生物为天然的或同源的，或者外源的或异源的。表达盒优选地在5’-3’转录方向上包含启动子、编码核酸序列或核酸构建体和转录终止的区域。多种终止区域可按需要互相替换。

还可以使用提供适当限制性切割位点或者除去多余DNA或限制性切割位点的操作。在插入、缺失或替代如转换和颠换适当的地方，可使用体外诱变、引物修复、限制或连接。

适当的操作如限制、chewing back或填补突出端得到平端可提供用于连接反应的片段互补末端。

本发明还涉及上述核酸、上述核酸构建体或上述蛋白质对产生转基因生物尤其是转基因酵母的用途。

这些转基因生物，尤其是转基因酵母与野生型相比优选地具有增加的麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物含量。

本发明还涉及根据本发明的上述核酸或核酸构建体对增加生物中麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物含量的用途。

上述蛋白质和核酸可用于在转基因生物中产生麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物。

外源基因向生物，尤其是酵母基因组中的转移称作转化。

本身已知的转化方法可用于此目的，尤其用于酵母中。

转化酵母的适当方法为例如Schiestl RH，Gietz RD(1989)使用单链核酸作为载体高效转化完整酵母细胞，Curr Genet.Dec；16(5-6)：339-46中所述的LiAC方法，如Manivasakam P，Schicstl RH(1993)通过电穿孔高效转化酿酒酵母，Nucleic Acid Res.Sep 11；21(18)：4414-5中描述的电穿孔，或如Morgan AJ.(1983)通过原生质体融合和转化对酵母菌株的改进，Experientia Suppl.46：155-66中所述的原生质体制备。

待表达的构建体优选地克隆到载体中，尤其克隆到适于转化酵母的质粒中，如载体系统Yep24(Naumovski L，Friedberg EC(1982)经UV辐射的DNA的切除修复所需的真核基因的分子克隆：酿酒酵母RAD3基因的分离和部分表征，J Bacteriol Oct；152(1)：323-31)、Yep13(Broach JR，Strathern JN，Hicks JB.(1979)酵母中的转化：开发杂合克隆载体和分离CAN1基因，Gene.1979Dec；8(1)：121-33)、pRS载体系列(着丝粒和附加体)(Sikorski RS，Hieter P.(1989)为在酿酒酵母中有效操作DNA设计的穿梭载体系统和酵母宿主菌株，Genetics.May；122(1)：19-27)和载体系统YCp19或pYEXBX。

因此本发明还涉及载体，尤其涉及包含上述核酸、核酸构建体或表达盒的质粒。

本发明还涉及通过在起始生物中功能性插入上述核酸或上述核酸构建体产生经遗传修饰的生物的方法。

本发明还涉及经遗传修饰的生物，其中遗传修饰与野生型相比降低Δ22-去饱和酶活性，增加HMG-CoA还原酶活性并增加选自羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性和角鲨烯合成酶活性的至少一种活性。

在优选的实施方案中，经遗传修饰的生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性。

在另一个优选的实施方案中，经遗传修饰的生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的角鲨烯环氧酶活性。

在另一个优选的实施方案中，经遗传修饰的生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的角鲨烯合成酶活性。

在尤其优选的实施方案中，经遗传修饰的生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性和增加的角鲨烯环氧酶活性。

在另一个尤其优选的实施方案中，经遗传修饰的生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性和增加的角鲨烯合成酶活性。

在另一个尤其优选的实施方案中，经遗传修饰的生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的角鲨烯环氧酶活性和增加的角鲨烯合成酶活性。

在非常尤其优选的实施方案中，经遗传修饰的生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA还原酶活性和增加的羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性和增加的角鲨烯环氧酶活性和增加的角鲨烯合成酶活性。

如上面提到的，这些活性优选地通过与野生型相比独立地增加编码HMG-CoA还原酶的核酸、编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的核酸、编码角鲨烯环氧酶的核酸或编码角鲨烯合成酶的核酸的基因表达来自增加。

根据本发明优选的经遗传修饰的生物的其他优选实施方案在上文的方法中描述。

上述经遗传修饰的生物与野生型相比具有增加的麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物含量。

因此本发明涉及上述经遗传修饰的生物，其中经遗传修饰的生物与野生型相比具有增加的麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物含量。

生物或经遗传修饰的生物根据本发明理解为是指例如细菌，尤其是芽孢杆菌属、大肠杆菌、乳酸菌属或链霉菌属的细菌，例如酵母，尤其是酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或克鲁维酵母属的酵母，例如真菌，尤其是曲霉属、青霉属、或网柄茵属的真菌，以及例如还有昆虫细胞系，这些生物作为野生型或由于前述遗传修饰而能够产生麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物。

对于本发明，优选地，增加麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的含量是指与未经遗传修饰的生物相比，经遗传修饰的生物中所提到的这些化合物中至少一种开始时的生物合成速度增加这一人工获得的能力。

与野生型相比麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物增加的含量尤其理解为指与野生型相比生物中至少一种上述化合物增加至少50％，优选100％，更优选地200％，尤其优选地400％。

确定至少一种上述化合物的含量优选地通过本来已知的分析法进行，并优选地涉及生物中甾醇产生的那些区室。

与现有技术相比本发明的优势如下：根据本发明的方法使生产生物中增加麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物含量成为可能。

本发明现将通过下面实施例描述，但不局限于这些实施例：

I.常规实验条件

1.限制酶反应

质粒(1-10μg)在30μl反应物中限制性切割。为此，将DNA溶于24μlH₂O中并用3μl目标缓冲液、1ml BSA(牛血清白蛋白)和2μl酶处理。根据DNA的量，酶浓度为1单位/μl或5单位/μl。一些情况下，反应物中也加入1μl RNA酶以分解tRNA。限制性反应物于37℃孵育2小时。用微型胶检测限制性反应。

2.凝胶电泳

凝胶电泳在微型胶或宽微型胶装置中进行。微型胶(约20ml，8孔)和宽微型胶(50ml，15或30孔)由溶于TAE的1％琼脂糖组成。所用的运行缓冲液为1×TAE。样品(10μl)用3μl终止溶液处理并应用。HindIII-切割的I-DNA作为标准(带位于：23.1kb；9.4kb；6.6kb；4.4kb；2.3kb；2.0kb；0.6kb)。为了分离，使用80伏特进行45-60分钟。此后，凝胶在溴化乙锭中染色并于紫外线下用视频记录系统INTAS记录或使用橙色滤光器拍照。

3.凝胶洗脱

目的片段通过凝胶洗脱方法分离。限制性反应物加入到微型胶的多个孔中并进行电泳。只有λ-HindIII和“牺牲泳道”(sacrificial lane)用溴化乙锭染色并在紫外线下观察，标记目的片段。这样避免了溴化乙锭和紫外线对剩余孔中DNA的破坏。通过将染色的和未染色的凝胶板相邻放置，可能以标记为参考从未染色凝胶板中切出目的片段。含待分离片段的琼脂糖部分放于透析管中，用少量无气泡的TAE缓冲液密封并放于BioRad微型胶装置中。运行缓冲液由1×TAE组成，所用的电压为100V 40分钟。此后，电流极性颠倒2分钟以再溶解粘附在透析管上的DNA。含DNA片段的透析管缓冲液移入反应容器中并用于进行乙醇沉淀。为此，向DNA溶液中加入1/10体积的3M醋酸钠，tRNA(每50μl溶液1μ1)和2.5体积用冰预冷的96％乙醇。反应物于-20℃孵育30分钟然后于4℃以12000转/分离心30分钟。干燥DNA沉淀并溶于10-50μl H₂O中(取决于DNA量)。

4.Klenow处理

Klenow处理引起DNA片段突出端的填充以产生平端。每微克DNA中将下列混合物吸取到一起：DNA沉淀+11μl H₂O

+1.5μl 10×Klenow缓冲液

+1μl 0.1 M DTT

+1μl寡核苷酸(dNTP 2mM)25+1μl Klenow聚合酶(1单位/μl)

用于此目的的DNA应来源于乙醇沉淀以防止污染物抑制Klenow聚合酶。混合物于37℃C孵育30分钟并再于70℃孵育5分钟停止反应。通过乙醇沉淀从混合物中获得DNA并溶于10μl H₂O中。

5.连接

合并待连接的DNA片段。13.1μl的终体积中含有载体：插入片段比例为1∶5的约0.5μl DNA。样品于70℃C孵育45秒，冷却到室温(约3分钟)然后在冰上孵育10分钟。此后，加入连接缓冲液：2.6μl 500mM trisHCl pH7.5和1.3μl 100mM MgCl₂，混合物在冰上再孵育10分钟。加入1μl 500mMDTT和1μl 10mM ATP并在冰上再孵育10分钟之后，加入1μl连接酶(1单位/pl)。整个处理过程应该尽可能得避免震动以防止再次分离已连接的DNA末端。连接反应在14℃过夜进行。

6.大肠杆菌转化

感受态大肠杆菌(E.coli)NM522细胞用连接反应的DNA转化。同时用50μg pScL3质粒作为阳性对照和无DNA的反应物作为零对照进行反应。每一个转化反应中，在台式离心机管中吸入100μl 8％PEG溶液、10μlDNA和200μl感受态细胞(大肠杆菌NM522)。反应物置于冰上30分钟并偶尔摇动。

然后施以热激处理：42℃ 1分钟。为了再生，向细胞中加入1ml LB培养基，混合物于摇动器上37℃孵育90分钟。将100μl未稀释反应物、1∶10稀释的反应物和1∶100稀释的反应物铺于LB+氨苄青霉素平板上并于37℃孵育过夜。

7.从大肠杆菌分离质粒(小量制备)

大肠杆菌克隆在1.5ml LB+氨苄青霉素培养基的台式离心机管中37℃120转/分培养过夜。次日于4℃5000转/分离心细胞5分钟，沉淀溶于50μl TE缓冲液中。每一种反应物用100μl 0.2N NaOH、1％SDS溶液处理，混合并放于冰上5分钟(细胞溶解)。此后，加入400μl醋酸钠/NaCl溶液(230μl H₂O，130μl 3M醋酸钠，40μl 5M NaCl)，混合反应物并再放于冰上15分钟(蛋白质沉淀)。11000转/分离心15分钟之后，含有质粒DNA的上清液转入Eppendorf管中。如果上清液不是完全澄清，将其再次离心。上清液用360μl冰上预冷的异丙醇处理并于-20℃孵育30分钟(DNA沉淀)。离心出DNA(15分钟，12000转/分，4℃)，弃上清液，沉淀用100μl冰上预冷96％乙醇洗涤，于-20℃孵育15分钟并再次离心(15分钟，12000转/分，4℃)。沉淀在Speed Vac装置中干燥然后溶于100μl H₂O中。质粒通过限制性分析来鉴定。为此，10μl每一种反应物进行限制性酶切并在宽微型胶中通过凝胶电泳分离(见上文)。

8.从大肠杆菌制备质粒(大量制备)

为分离大量质粒DNA，实施大量制备方法。含100ml LB+氨苄青霉素培养基的两个烧瓶中接种茵落或含有待分离质粒的100μl冰冻培养物并于37℃120转/分孵育过夜。次日，培养物(200ml)转入GSA烧杯中并以4000转/分(2600xg)离心10分钟。细胞沉淀溶于6ml TE缓冲液中。为消化细胞壁，加入1.2ml溶茵酶溶液(20mg/ml TE缓冲液)，混合物室温孵育10分钟。细胞随后用12ml 0.2N NaOH，1％SDS溶液裂解并再于室温孵育5分钟。通过加入9ml冷的3M醋酸钠溶液(pH4.8)并于冰上孵育15分钟沉淀蛋白质。离心(GSA：13000转/分(27500xg)，20分钟，4℃)之后，含有DNA的上清液转入新的GSA烧杯中，用15ml冰上预冷的异丙醇沉淀DNA，-20℃孵育30分钟。DNA沉淀在5ml冰上预冷的乙醇中洗涤并于空气中干燥(约30-60分钟)。然后将DNA沉淀溶于1mlH₂O中。质粒通过限制性分析验证。通过在微型胶中应用稀释确定浓度。微量透析(孔径0.025μm)进行30-60分钟以降低盐含量。

9.酵母转化

建立酿酒酵母AH22菌株的预培养物用于酵母转化。含有20ml YE培养基的烧瓶中接种100μl冷冻培养物并于28℃120转/分孵育过夜。主要培养在含有100ml YE培养基的烧瓶中于相同条件下进行，其中所述的培养基已用10μl、20μl或50μl预培养物接种。

9.1感受态细胞的产生

次日，烧瓶用血细胞计数器计数，选择具有3-5×10⁷个细胞/ml细胞浓度的烧瓶用于下一步操作。通过离心(GSA：5000转/分(4000xg)l0分钟)收获细胞。细胞沉淀溶于10ml TE缓冲液中并分到两个台式离心管中(每一个5ml)。6000转/分3分钟离心出细胞，用每一情况中5ml TE缓冲液洗涤细胞两次。细胞沉淀随后以每10⁹个细胞330μl醋酸锂缓冲液溶解，转入无菌50ml锥形瓶中并于28℃摇动1小时。这样细胞为转化的感受态。

9.2转化

每一次转化反应中，在台式离心管中吸入15μl鲱精DNA(10mg/ml)、10μl待转化DNA(约0.5μg)和330μl感受态细胞并于28℃孵育30分钟(不需摇动)。此后，加入700μl 50％PEG 6000，反应物于28℃不摇动再孵育一小时。然后于42℃热激处理5分钟。100μl悬浮物铺于选择培养基(YNB，Difco)上以选择亮氨酸光合营养性。对于G418抗性的选择，细胞在热激处理之后再生(见9.3，再生期)。

9.3再生期

因为选择标记为G418抗性，细胞需要时间表达抗性基因。转化反应物用4ml YE培养基处理并于振荡器上(120转/分)28℃孵育过夜。次日，离心出细胞(6000转/分，3分钟)，溶于1ml YE培养基中，100μl或200μl此培养基铺于YE+G418平皿上。平皿于28℃孵育数天。

10.PCR反应条件

聚合酶链式反应的反应条件必须为每一单独的情况优化并且不对每一操作均有效。这样就可能改变所用DNA的量、盐浓度和解链温度。对我们的方法来说，证明适宜的是在Eppendorf管中混合用于热循环仪中的下列物质：5μl Super Buffer、8μl dNTPs(每一种0.625μM)、5’-引物、3’-引物和0.2μg模板DNA，溶解于一定量的水中使PCR反应物总体积50μl，加入2μl(＝0.1U)Super Taq聚合酶。短暂离心反应物并用一滴油覆盖。选择37-40个循环用于扩增。

II.实施例

实施例1在酿酒酵母GRF中表达截短的HMG-CoA还原酶。

由ADH-启动子-tHMG-色氨酸-终止子组成的表达盒的编码核酸序列使用上文详述的标准方法在常规反应条件下通过PCR从载体YepH2(Polakowski等(1998)胞质羟基甲基戊二酰-CoA还原酶的过量表达引起酵母中角鲨烯的积累，Appl Microbiol Biotechnol.Jan；49(1)：66-71)扩增。

用于此目的的引物为DNA寡聚物AtHT-5’(正向：tHMGNotF：5’-CTGCGGCCGCATCATGGACCAATTGGTGAAAACTG-3’；SEQ.ID.NO.11)和AtHT-3’(反向：tHMGXhoR：5’-AACTCGAGAGACACATGGTGCTGTTGTGCTTC-3’；SEQ.ID.No.12)。

得到的DNA片段首先用Klenow处理然后平末端克隆到载体pUG6的EcoRV切割位点中，产生载体pUG6-tHMG(图1)。

分离质粒之后，通过PCR方法从载体pUG-tHMG扩增延长的片段以使得到的片段由下列成分组成：loxP-kanMX-ADH-启动子-tHMG-色氨酸-终止子-loxP。所选的引物为在5’和3’突出端分别包含URA3基因的5’或3’序列并在退火区域包含载体pUG-tHMG的loxP区域5’和3’的序列。这首先确保了包括KanR和tHMG的全部片段得到扩增并其次确保了此片段可随后转化酵母和全部片段通过同源重组整合到酵母URA3基因座中。

所用的选择标记为G418抗性。得到的菌株酿酒酵母GRF-tHlura3为尿嘧啶营养缺陷型并含有ADH启动子和色氨酸终止子控制下的基因tHMG的拷贝。

为随后再次去除G418抗性，得到的酵母菌株用cre重组酶载体pSH47(Guldener U，Heck S，Fielder T，Beinhauer J，Hegemann JH.(1996)在出芽酵母中重复使用的新的有效基因破坏盒，Nucleic Acid Res.Jul 1；24(13)：2519-24.)转化。由于此载体，cre重组酶在酵母中表达并且结果，两个loxP序列中的序列区域在基因外重组。结果是两个loxP序列中只有一个和ADH-tHMG-TRP盒保留在URA3基因座中。结果，酵母菌株再次丢失G418抗性并由此适于分别通过此cre-lox系统在酵母菌株中整合其他基因或去除这些基因。现在载体pSH47可通过在添加尿嘧啶(20mg/l)和FOA(5-氟乳清酸)(1g/l)的YNB琼脂板上反选择再次去除。为此，具有此质粒的细胞必须首先在非选择条件下培养并随后在含FOA的选择平板上生长。只有自身不能合成尿嘧啶的细胞能在这些条件下生长。在这种情况下，这些细胞为不再含有质粒(pSH47)的细胞。

酵母菌株GRFtH1ura3和原始茵株GRF在20ml的培养体积中于WMXIII培养基中28℃下以160转/分培养48小时。随后500μl此预培养物转入50ml相同培养基的主要培养基中并在带挡板摇瓶中28℃和160转/分培养4天。

4天后按照Parks LW，Bottema CD，Rodriguez RJ，Lewis TA.(1985)酵母甾醇：用作甾醇代谢研究工具的酵母突变体，Methods Enzymol.1985；111：333-46中所述的方法提取甾醇并通过气相层析分析。这得到了表1中所列数据。百分数基于酵母干重。

表1

甾醇含量[峰面积/gDM]	酿酒酵母GRFtH1ura3	酿酒酵母GRF
甾醇含量[峰面积/gDM]	酿酒酵母GRFtH1ura3	酿酒酵母GRF	角鲨烯	9.93	0.1
羊毛甾醇	0.83	0.31	角鲨烯	9.93	0.1
羊毛甾醇	0.83	0.31	酵母甾醇	1.18	1.07

粪甾醇(Fecosterol)	1.10	0.64
粪甾醇(Fecosterol)	1.10	0.64	表甾醇(Episterol)/麦角甾-5，7-二烯醇	1.04	0.72
二甲基-酵母甾醇	0.34	0.13	表甾醇(Episterol)/麦角甾-5，7-二烯醇	1.04	0.72

实施例2在酿酒酵母GRFtH1ura3中表达ERG1同时缺失ERG5；GRFtH1ura3ERG1erg5的产生

实施例2.1整合载体pUG6-ERG1的产生

由ADH-启动子-ERG1-色氨酸-终止子组成的盒的DNA序列通过用酶NheI和Bsp68I(NruI)限制性酶切使用常规方法从载体pFlat3-ERG1中分离。得到的DNA片段用Klenow处理然后以平端克隆到载体pUG6的EcoRV切割位点中，产生载体pUG6-ERG1(图2)。

实施例2.2整合转化

分离质粒之后，通过PCR从载体pUG6-ERG1扩增延长的片段以使得到的片段由下列组分组成：loxP-kanMX-loxP-ADH1-Pr.-ERG1-Trp-Term。所用的引物为寡核苷酸序列，其在退火区域分别含有载体pUG6-ERG1待扩增盒之外的序列和在5’和3’突出端含有整合基因座ERG5的5’或3’序列。这首先确保包括KanR和靶基因ERG1的完整片段得到扩增，其次确保此片段可随后转化到酵母中并通过同源重组整合到酵母靶基因座ERG5中。下列引物用于此目的：

ERG5-Crelox-5’(SEQ ID NO：13)：5’-ATGAGTTCTG TCGCAGAAAATATAATACAA CATGCCACTC CCAGCTGAAGCTTCGTACGC-3’和ERG5-Crelox-3’(SEQ ID NO：14)：5’-TTATTCGAAG ACTTCTCCAGTAATTGGGTC TCTCTTTTTG GCATAGGCCA CTAGTGGATCTG-3’

所用的选择标记为遗传霉素(G418)抗性。得到的菌株含有ADH1启动子和色氨酸终止子控制下的靶基因ERG1的一份拷贝。通过基因的整合同时可能缺失靶基因座的相应基因ERG5。为随后再次去除G418抗性，得到的酵母菌株用cre重组酶载体pSH47转化。由于此载体，cre重组酶在酵母中表达并作为结果两个loxP序列中的序列区域在所述基因外重组，其结果是两个loxP序列中只有一个和由ADH1-prom.-ERG1-TRPl-term组成的盒保留在靶基因座ERG5中。结果，酵母菌株再次丢失G418抗性。现在载体pSH47可通过在FOA培养基上培养选择性的除去。

得到的酵母菌株GRFtH1ura3ERG1erg5在20ml的培养体积中于WMVII培养基中28℃和160转/分培养48小时。随后500μl此预培养物转入50ml相同培养基的主要培养基中并在带挡板摇瓶中28℃和160转/分培养3天。

4天后按照Parks LW，Bottema CD，Rodriguez RJ，Lewis TA.(1985)酵母甾醇：用作甾醇代谢研究工具的酵母突变体，Methods Enzymol.1985；111：333-46中所述的方法提取甾醇并通过气相层析分析。这得到表2中所列的数据。百分比基于酵母干重。

表2

甾醇含量[峰面积/gDM]	酿酒酵母GRFtH1ura3ERG1erg5	酿酒酵母GRF
甾醇含量[峰面积/gDM]	酿酒酵母GRFtH1ura3ERG1erg5	酿酒酵母GRF	角鲨烯	8.1	0.1
羊毛甾醇	2.42	0.31	角鲨烯	8.1	0.1
羊毛甾醇	2.42	0.31	酵母甾醇	1.35	1.07
粪甾醇	2.01	0.64	酵母甾醇	1.35	1.07
粪甾醇	2.01	0.64	表甾醇/麦角甾-5，7-二烯醇	12.21	0.72
二甲基-酵母甾醇	1.02	0.13	表甾醇/麦角甾-5，7-二烯醇	12.21	0.72

比较实施例1 缺失酿酒酵母GRFtH1ura3中的ERG5；产生GRFtH1ura3erg5

酿酒酵母GRFtH1ura3中ERG5的缺失类似于实施例2进行。为了只缺失ERG5基因，使用相同的方法，但是使用载体pUG6代替载体pUG6-ERG1。此载体pUG6不含有由ADH-prom-ERG1-Trp-term组成的盒。通过使用此载体可以缺失一个基因，在这种情况下为基因ERG5。

得到的酵母菌株GRFtH1ura3erg5在20ml的培养体积中于WMVII培养基中28℃和160转/分培养48小时。随后500μl此预培养物转入50ml相同培养基的主要培养基中并在带挡板摇瓶中28℃和160转/分培养3天。

4天后按照Parks LW，Bottema CD，Rodriguez RJ，Lewis TA.(1985)酵母甾醇：用作甾醇代谢研究工具的酵母突变体，Methods Enzymol.1985；111：333-46中所述的方法提取甾醇并通过气相层析分析。这得到表3中所列的数据。百分比基于酵母干重。

表3

甾醇含量[峰面积/gDM]	GRFtH1ura3ERG1erg5(实施例2)	GRFtH1ura3erg5(对照实施例)
甾醇含量[峰面积/gDM]	GRFtH1ura3ERG1erg5(实施例2)	GRFtH1ura3erg5(对照实施例)	角鲨烯	8.1	13.18
羊毛甾醇	2.42	0.78	角鲨烯	8.1	13.18
羊毛甾醇	2.42	0.78	酵母甾醇	1.35	0.10
粪甾醇	2.01	1.03	酵母甾醇	1.35	0.10
粪甾醇	2.01	1.03	表甾醇/麦角甾-5，7-二烯醇	12.21	8.98
4，4-二甲基酵母甾醇	1.02	0.21	表甾醇/麦角甾-5，7-二烯醇	12.21	8.98

序列表

<110>巴斯福股份公司

<120>在转基因生物中产生麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的方法

<130>20020748

<160>14

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>1617

<212>DNA

<213>酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1617)

<223>

<400>1

atg agt tct gtc gca gaa aat ata ata caa cat gcc act cat aat tct 48

Met Ser Ser Val Ala Glu Asn Ile Ile Gln His Ala Thr His Asn Ser

1 5 10 15

acg cta cac caa ttg gct aaa gac cag ccc tct gta ggc gtc act act 96

Thr Leu His Gln Leu Ala Lys Asp Gln Pro Ser Val Gly Val Thr Thr

20 25 30

gcc ttc agt atc ctg gat aca ctt aag tct atg tca tat ttg aaa ata 144

Ala Phe Ser Ile Leu Asp Thr Leu Lys Ser Met Ser Tyr Leu Lys Ile

35 40 45

ttt gct act tta atc tgt att ctt ttg gtt tgg gac caa gtt gca tat 192

Phe Ala Thr Leu Ile Cys Ile Leu Leu Val Trp Asp Gln Val Ala Tyr

50 55 60

caa atc aag aaa ggt tcc atc gca ggt cca aag ttt aag ttc tgg ccc 240

Gln Ile Lys Lys Gly Ser Ile Ala Gly Pro Lys Phe Lys Phe Trp Pro

65 70 75 80

atc atc ggt cca ttt ttg gaa tcc tta gat cca aag ttt gaa gaa tat 288

Ile Ile Gly Pro Phe Leu Glu Ser Leu Asp Pro Lys Phe Glu Glu Tyr

85 90 95

aag gct aag tgg gca tcc ggt cca ctt tca tgt gtt tct att ttc cat 336

Lys Ala Lys Trp Ala Ser Gly Pro Leu Ser Cys Val Ser Ile Phe His

100 105 110

aaa ttt gtt gtt atc gca tct act aga gac ttg gca aga aag atc ttg 384

Lys Phe Val Val Ile Ala Ser Thr Arg Asp Leu Ala Arg Lys Ile Leu

115 120 125

caa tct tcc aaa ttc gtc aaa cct tgc gtt gtc gat gtt gct gtg aag 432

Gln Ser Ser Lys Phe Val Lys Pro Cys Val Val Asp Val Ala Val Lys

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Lys Asn Ser Thr Tyr Lys Asp Gly Val Lys Met Thr Asp Gln Glu Ile

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Ala Asn Leu Leu Ile Gly Val Leu Met Gly Gly Gln His Thr Ser Ala

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ggt gtt cta atg tcc att ttt atc aga aca tta aaa tgg cat tac cca 1488

Gly Val Leu Met Ser Ile Phe Ile Arg Thr Leu Lys Trp His Tyr Pro

485 490 495

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Glu Gly Lys Thr Val Pro Pro Pro Asp Phe Thr Ser Met Val Thr Leu

500 505 510

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Pro Thr Gly Pro Ala Lys Ile Ile Trp Glu Lys Arg Asn Pro Glu Gln

515 520 525

aag atc taa 1593

Lys Ile

530

<210>6

<211>530

<212>PRT

<213>酿酒酵母

<400>6

Met Ser Ala Thr Lys Ser Ile Val Gly Glu Ala Leu Glu Tyr Val Asn

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Ile Gly Leu Ser His Phe Leu Ala Leu Pro Leu Ala Gln Arg Ile Ser

20 25 30

Leu Ile Ile Ile Ile Pro Phe Ile Tyr Asn Ile Val Trp Gln Leu Leu

35 40 45

Tyr Ser Leu Arg Lys Asp Arg Pro Pro Leu Val Phe Tyr Trp Ile Pro

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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115 120 125

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340 345 350

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<223>

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l 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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100 105 110

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Glu Lys Leu Lys Asp Leu Val Lys Asp Gly Asn Asp Lys Val Leu Glu

115 120 125

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130 135 140

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Gly Val Ala Phe Val His Gly Arg Phe Leu Asn Asn Leu Arg Asn Ile

145 150 155 160

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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450 455 460

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Thr Ala Ile Arg Val Phe Thr Pro Phe Leu Phe Gly Glu Leu Ile Gly

485 490 495

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<210>8

<211>496

<212>PRT

<213>酿酒酵母

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<210>9

<211>1335

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<220>

<221>CDS

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<223>

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l 5 10 15

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20 25 30

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<213>酿酒酵母

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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<210>11

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

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<212>DNA

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<223>AtHT-3′

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<212>DNA

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<220>

<221>引物

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atgagttctg tcgcagaaaa tataatacaa catgccactc ccagctgaag cttcgtacgc 60

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<212>DNA

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<220>

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<400>14

ttattcgaag acttctccag taattgggtc tctctttttg gcataggcca ctagtggatc 60

tg 62

Claims

1.通过培养生物产生麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物的方法，其中所述生物与野生型相比具有降低的Δ22-去饱和酶活性和增加的HMG-CoA-还原酶活性和选自羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性和角鲨烯合成酶活性的至少一种活性的增加的活性。

2.权利要求1的方法，其中为了降低Δ22-去饱和酶活性，编码Δ22-去饱和酶的核酸的基因表达与野生型相比降低。

3.权利要求2的方法，其中使用无功能性Δ22-去饱和酶基因的生物。

4.权利要求1-3任意一项的方法，其中为了增加HMG-CoA还原酶活性，编码HMG-CoA还原酶的核酸的基因表达与野生型相比增加。

5.权利要求4的方法，其中为增加基因表达，将包含编码HMG-CoA还原酶的核酸的核酸构建体引入生物中，并且HMG-CoA还原酶在该生物中的表达与野生型相比受下降调节。

6.权利要求5的方法，其中核酸构建体包含与野生型启动子相比在生物中受下降调节的启动子。

7.权利要求6的方法，其中编码HMG-CoA还原酶的核酸为与同源的、直向同源的核酸相比在生物中的表达受下降调节的核酸。

8.权利要求7的方法，其中编码HMG-CoA还原酶的核酸为编码HMG-CoA还原酶催化区域的核酸。

9.权利要求8的方法，其中引入的核酸为编码包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.4或通过氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白质的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ.ID.NO.4具有至少30％同一性，其中所述的蛋白质具有HMG-CoA还原酶的酶特征。

10.权利要求9的方法，其中引入包含序列SEQ.ID.NO.3的核酸。

11.权利要求1-10任意一项的方法，其中为增加羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性，编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的核酸的基因表达与野生型相比增加。

12.权利要求11的方法，其中为增加基因表达，在生物中引入一种或多种编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的核酸。

13.权利要求12的方法，其中引入的核酸为编码包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.6或通过氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白质的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ.ID.NO.6具有至少30％同一性，其中所述蛋白质具有羊毛甾醇C14-脱甲基酶的酶特征。

14.权利要求13的方法，其中引入包含序列SEQ.ID.NO.5的核酸。

15.权利要求1-14任意一项的方法，其中为增加角鲨烯环氧酶活性，编码角鲨烯环氧酶的核酸的基因表达与野生型相比增加。

16.权利要求15的方法，其中为增加基因表达，在生物中引入一种或多种编码角鲨烯环氧酶的核酸。

17.权利要求16的方法，其中引入的核酸为编码包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.8或通过氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白质的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ.ID.NO.8具有至少30％同一性，其中所述的蛋白质具有角鲨烯环氧酶的酶特征。

18.权利要求17的方法，其中引入包含序列SEQ.ID.NO.7的核酸。

19.权利要求1-18任意一项的方法，其中为增加角鲨烯合成酶活性，编码角鲨烯合成酶的核酸的基因表达与野生型相比增加。

20.权利要求19的方法，其中为增加基因表达，在生物中引入一种或多种编码角鲨烯合成酶的核酸。

21.权利要求20的方法，其中引入的核酸为编码包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.10或通过氨基酸的替代、插入或缺失衍生于此序列的序列的蛋白质的核酸，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ.ID.NO.10具有至少30％同一性，，其中所述的蛋白质具有角鲨烯合成酶的酶特征。

22.权利要求21的方法，其中引入包含序列SEQ.ID.NO.9的核酸。

23.权利要求1-22任意一项的方法，其中所用的生物为酵母。

24.权利要求1-23任意一项的方法，其中在培养生物之后，收获该生物并随后从该生物中分离麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物。

25.经遗传修饰的生物，其中遗传修饰与野生型相比降低Δ22-去饱和酶活性，增加HMG-CoA还原酶活性，且增加选自羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性和角鲨烯合成酶活性的至少一种的活性。

26.权利要求25的经遗传修饰的生物，其中遗传修饰与野生型相比降低Δ22-去饱和酶活性，增加HMG-CoA还原酶活性，且增加羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性。

27.权利要求25或26的经遗传修饰的生物，其中经遗传修饰的生物与野生型相比具有增加的麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物含量。

28.权利要求25或26的经遗传修饰的生物，其中所用的生物为酵母。

29.权利要求25-27任意一项的经遗传修饰的生物的用途，用于产生麦角甾-5，7-二烯醇和/或其生物合成中间物和/或代谢物。

30.产生经遗传修饰的生物的方法，其中从起始生物开始降低Δ22-去饱和酶活性，增加HMG-CoA还原酶活性，且增加选自羊毛甾醇C14-脱甲基酶活性、角鲨烯环氧酶活性和角鲨烯合成酶活性的至少一种的活性。