KR102207288B1

KR102207288B1 - 변이형 전사조절인자 Upc2p 발현 최적화 벡터 및 이를 이용한 스테롤 전구체 과생산 방법

Info

Publication number: KR102207288B1
Application number: KR1020180170419A
Authority: KR
Inventors: 강현아; 문혜연; 이동욱; 김선창
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2021-01-26
Also published as: KR20190080790A

Abstract

본 발명은 변이형 전사조절인자 Upc2p 발현 최적화 벡터 및 이를 이용한 스테롤 전구체 과생산 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 에르고스테롤에 대한 친화력이 감소된 변이형 전사조절인자(Upc2p)의 발현을 최적화하여 피드백 조절이 완화되어 에르고스테롤 생합성 경로가 전체적으로 증폭되어 에폭시스쿠알렌과 스쿠알렌과 같은 스테롤 전구체 및 담마레네디올과 같은 진세노사이드 전구체 생합성능이 더욱 증진된 재조합 효모를 제작하는 것이다. 본 발명에서 개발된 변이형 UPC2 발현 카세트 및 크리스퍼 시스템을 이용한 교체 카세트와 이를 이용하여 제작된 재조합 효모 균주들은 추가적인 대사공학을 통해 진세노사이드 혹은 UDCA 전구물질 대량 생합성 재조합 효모 제작에 활용이 가능하다.

Description

변이형 전사조절인자 Upc2p 발현 최적화 벡터 및 이를 이용한 스테롤 전구체 과생산 방법{Expression vectors for optimal expression of mutated Upc2p and method for overproducing sterol precursors using the same}

본 발명은 변이형 전사조절인자 Upc2 단백질을 제작하고 발현을 최적화시켜 에르고스테롤 및 관련 전구체 생합성 활성이 증대된 재조합 효모 균주를 제작하는 것으로, 상세하게는 에르고스테롤과의 결합에 중요한 아미노산 부위가 치환된 Upc2 변이 단백질을 코딩하는 UPC2 변이 유전자의 발현을 카피 수 및 프로모터 활성 조절, 발현 숙주로의 대사 흐름 변경을 통해 최적화시켜 에폭시스쿠알렌을 비롯한 스테롤 전구체를 고발현하는 재조합 효모 균주를 제작하는 것이다. 또한, 크리스퍼 시스템을 이용해 에르고스테롤과의 결합에 중요한 아미노산 부위가 치환된 Upc2 변이 단백질을 코딩하도록 UPC2 유전자를 크리스퍼 시스템을 이용해 염색체 상에서 변이형으로 교체시켜 재조합 효모 균주를 제작하는 것이다.

전통효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 오랜 기간 동안 맥주와 빵 발효에서 사용된 균주로 인체에 대한 안전성이 보증된 GRAS (Generally Recognized as Safe) 미생물로서 안전성이 높다. 특히, 효모는 고등생물과 매우 유사한 유전자 전사 및 번역 시스템과 더불어 단백질 분비기관을 갖추고 있어서 번역 후 수식을 통해 활성화된 단백질들을 생산할 수 있어 대장균에 비해 고등생물 유래의 의약용 단백질 대량생산에 보다 유용한 숙주시스템으로 이용되고 있다. 또한 균주의 배양 및 세포외 분비단백질의 정제가 용이하여 scale-up이 간단하므로 식품 및 재조합 의약용 단백질의 산업적 생산에 유용한 숙주 시스템이다.

한편, 효모는 다양한 이차대사산물 생합성 경로를 도입하여 발현시킬 수 있는 숙주로 관심을 받고 있다. 다양한 생명체들이 생산하는 이차대사산물은 고부가가치 화학화합물의 주요 공급처로서 많은 경우 중요한 의약적인 성질을 지니고 있다. 특히 식물의 대사산물들은 항산화제 또는 항생제 기능을 통해 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등의 감염을 막아주며, 또한 인체 건강에 유익한 기능성 물질로 치료제로서의 활용도가 높아 미생물을 활용한 대량생산 기술에 대한 수요가 높다. 이차대사 생합성 경로가 자체적으로 제한적인 효모는 유전공학을 통해 도입된 외래 대사 경로를 방해하거나 경쟁하지 않으며, 무엇보다 다양한 오믹스 분석 시스템이 잘 구축되어 있어 전사체와 대사체 분석을 통해 효모 숙주의 생리 상태에 대한 총체적인 정보를 확보할 수 있는 장점이 있다. 또한 대사과정에 대한 상세한 모델이 개발되어 변형된 대사 네트워크의 행동을 예측할 수 있는 인실리코(in silico) 효모가 구축되어 있어 이를 활용한 인공 세포 디자인 및 제작이 더욱 용이한 점이 큰 장점이다. 더 나아가 단세포 진핵 미생물로서 효모는 소포체 및 미토콘드리아 같은 소기관에서 발현되어야만 활성을 갖게 되는 cytochrome P450 같은 외래 효소 발현에 적합한 숙주이며, 식물 및 동물 유래의 효소 활성에 필수적인 단백질 번역 후 변형능이 있는 점도 원핵 미생물 숙주에 비해 갖는 장점이다.

스테롤(sterol)은 유동성과 기능을 조정하는 세포막의 부분을 형성하여 진핵생물체의 생리에 중요한 역할을 하고 있다. 효모에서는 에르고스테롤(ergosterol)이 주요 스테롤이고 세포막 구성요소 이면서 비타민 D2의 전구체로서 상업적으로 중요한 대사산물이다. 뿐만 아니라 그 중간 대사산물인 아이소프레노이드(isoprenoid)는 항산화제(carotenoids), 풍미제(terpens), 기능식품(ubiquinone), 항암 화합물(taxol)로 상업적으로 널리 사용되고 있다. 또 다른 중간 대사산물인 스쿠알렌은 가장 잘 알려진 건강 증진 식품이며, 그 다음 단계의 대사물질인 라노스테롤(lanosterol)과 함께 피부보습제 및 화장품 원료로 유용하게 활용되고 있다. 이와 같이 중간대사산물 그대로를 이용한 산업분야 외에 최근에는 에르고스테롤 합성 과정을 유전공학적 기술로 변경함으로써 더 많은 유용 물질을 효모에서 생산하는 대사공학 분야가 각광 받고 있다. 스쿠알렌 다음 단계 중간대사산물인 에폭시스쿠알렌(epoxysqualene)은 인삼(Panax ginseng)의 담마레네디올 II 합성효소 (dammarenediol Ⅱ synthase)의해 담마레네디올로 전환될 수 있고 두 종류의 cytochrome P450와 여러 종류의 당전이효소(glucosyltransferase)에 의해 다양한 진세노사이드로 만들어진다. 또한 중간대사물질인 자이모스테롤(zymosterol)로부터 에르고스테롤로의 대사경로를 차단하고 새로운 유전자를 외부로부터 도입하여 발현시킴으로써 관절염, 피부병, 부신기능부전증(adrenal insufficiency) 등의 치료에 사용되는 항염 스테로이드 호르몬인 하이드로코티슨(hydrocortisone)이나 간 질환 치료제인 우르소데옥시콜산(UDCA, ursodeoxycholic acid)의 전구체인 콜레스테롤과 같은 의약품 전구물질 생산 재조합 효모를 제작할 수 있다(도 1).

한편, 효모의 에르고스테롤 생합성 과정에 관여하는 여러 유전자들의 발현을 유도하는 전사조절인자인 Upc2p는 세포막의 주성분인 에르고스테롤을 인지하여 결합한 상태로 세포질에 비활성화 상태로 존재하다가, 에르고스테롤이 부족해지면 결합이 되지 않은 Upc2p가 핵 내부로 들어가 에르고스테롤 합성 관여 유전자들의 프로모터에 이합체 형태로 결합할 수 있게 된다. 이 결합을 통해 스테롤 합성 관여 유전자들의 발현이 유도되고, 결과적으로 에르고스테롤 합성 과정을 촉진시키는 역할을 한다.

한국등록특허 제10-1655696호(2016.09.01 등록)

본 발명의 목적은 사카로마이세스 세레비시애( Saccharomyces cerevisiae) 유래 Upc2p의 리간드 결합 도메인 부위가 변이된 UPC2 변이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애 재조합 균주, 상기 재조합 균주를 이용한 총 콜레스테롤 생산 증진 방법 및 상기 재조합 균주를 이용한 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올 생산 증진 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 UPC2 프로모터 유전자, 서열번호 1로 표시되는 UPC2 변이 유전자, UPC2 종결 유전자, URA3 마커 유전자 및 UPC2 종결 유전자를 순서대로 포함하는 UPC2 변이 유전자 삽입 카세트, 상기 UPC2 변이 유전자 삽입 카세트를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애 재조합 균주 및 상기 재조합 균주를 이용한 총 콜레스테롤 생산 증진 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Cas9 유전자 및 UPC2 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA)를 포함하는 크리스퍼-카스9(CRISPR-Cas9) 재조합벡터; 및 UPC2 변이 유전자 도입용 기증자(Donor) DNA로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애 재조합 균주 및 상기 재조합 균주를 이용한 스테롤 생산 증진 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 유래 Upc2p의 리간드 결합 도메인 부위가 변이된 UPC2 변이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애 재조합 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 UPC2 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비시애 균주를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 균주를 배양하는 단계를 포함하는 총 콜레스테롤 생산 증진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올을 생산하는 사카로마이세스 세레비시애 균주를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 균주를 배양하는 단계를 포함하는 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올 생산 증진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 UPC2 프로모터 유전자, 서열번호 1로 표시되는 UPC2 변이 유전자, UPC2 종결 유전자, URA3 마커 유전자 및 UPC2 종결 유전자를 순서대로 포함하는 UPC2 변이 유전자 삽입 카세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 UPC2 변이 유전자 삽입 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애 재조합 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 총 콜레스테롤 생산 증진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Cas9 유전자 및 UPC2 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA)를 포함하는 크리스퍼-카스9(CRISPR-Cas9) 재조합벡터; 및 UPC2 변이 유전자 도입용 기증자(Donor) DNA로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애 재조합 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 스테롤 생산 증진 방법을 제공한다.

본 발명은 변이형 전사조절인자 Upc2p 발현 최적화 벡터 및 이를 이용한 스테롤 전구체 과생산 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 C-말단 아미노산 치환 변이형 UPC2 _G888D 유전자 발현수준을 UPC2 자체 프로모터를 통해 발현되는 카세트를 제작하고 유전자 카피수를 1~2 카피로 낮게 조절함으로써 에르고스테롤 대사 경로 유전자들의 발현을 증진시켜 에폭시스쿠알렌과 자이모스테롤을 포함하는 진세노사이드 및 콜레스테롤 전구물질들의 생산증대를 유도하였다. 상세하게는 크리스퍼-카스9 발현 벡터를 이용해 내재 UPC2 유전자에서 DNA 이중가닥 절단을 일으키고, 이를 회복시키는 과정에서 기증자 DNA를 이용하여 C-말단 아미노산 치환 변이형 UPC2 _G888D(=UPC2-1)로 변이되도록 한다. 이를 통해 에르고스테롤 생합성 대사 경로 유전자들의 발현을 증진시켜 에폭시스쿠알렌을 포함하는 진세노사이드 전구물질들의 생산증대를 유도하였다. 에르고스테롤 결합 부위 치환 Upc2p 변이 단백질을 코딩하는 UPC2 _G888D 변이 유전자의 발현이 최적화된 재조합 효모는 에폭시스쿠알렌을 비롯한 스테롤 전구체 생산 효율이 현저하게 증진되어 면역 증가 효과가 탁월한 진세노사이드 전구체인 담마레네디올 또는 간질환 치료제인 UDCA의 전구체인 콜레스테롤을 대량생산하는 숙주로 개발되어 생산품의 안정성 및 가격의 경제성을 높이는 유용한 산업용 숙주로 활용될 수 있다.

도 1은 효모에서의 에르고스테롤 생합성 경로 활용 유용 대사산물 생산 모식도를 나타낸 것이다.
도 2은 전사조절인자 Upc2p 변이부품 개발을 통한 피드백 조절이 완화된 에르고스테롤 생합성 경로를 지닌 재조합 효모 제작 전략도를 나타낸 것이다.
도 3은 C- 또는 N-말단 도메인 결손 또는 리간드 결합 도메인 치환을 통해 제작된 다양한 변이형 Upc2p의 구조(A) 및 변형된 아미노산 시퀀스(B), 다양한 조합의 발현 벡터(C)의 모식도를 나타낸 것이다. 효모 S. cerevisiae 전사조절인자 Upc2p의 C-말단에 존재하는 아미노산의 변이 G888D(글라이신 -> 아스팔틱 엑시드) 위치는 볼드로 표시, 제거된 양 말단 N-, C- 도메인은 밑줄로 표시되었다.
도 4은 여러 변이형 Upc2p를 TEF1 프로모터(A) 또는 자체 UPC2 프로모터(B), CEN 또는 2μ벡터(C)로 발현하는 조건에 따른 재조합 효모 균주들의 항진균제 플루코나졸(fluconazole) 내성 비교 분석 및 상기 실험에서 효과가 확인된 변이형 Upc2p 도입에 의한 총체적 스테롤 생산량 변화를 분광광도계(spectrometry) 측정으로 비교 분석(D)한 결과이다.
도 5는 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올 생산 재조합 효모 균주를 YCpH-Tp-UPC2-1와 YCpH-np-UPC2-1로 각각 형질전환시킨 후 HPLC를 통해 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올의 생산효율을 비교 분석한 결과이다. 메티오닌이 첨가되지 않은 배지로 배양된 재조합 효모 세포 추출물(A), 메티오닌이 첨가된 배지로 배양된 재조합 효모 세포 추출물(B). 메티오닌 첨가로 MET3 프로모터에 의해 발현이 조절되는 ERG7 유전자를 억제시켜 에폭시스쿠알렌과 담마레네디올의 축적율을 높여주었다.
도 6은 upc2△결손 균주에 Upc2-1p을 발현한 효과를 갖도록, UPC2-1 변이유전자를 야생형 UPC2 유전자를 가지고 있는 사카로마이세스 세레비지애 숙주의 염색체상에서 야생형 UPC2 유전자와 교체할 수 있는 발현 카세트 도면(A), 이를 이용한 Upc2-1 변이주 제작 전략(B) 모식도이다.
도 7은 도 6에서 제작한 발현 카세트를 이용해 얻은 CEN-PK2-1C 기반 Upc2 -1 변이주 확인을 위한 중합효소반응 결과와 총체적 스테롤 생합성 비교를 위한 분광광도계 분석 결과(A)와, URA3 유전자 팝-아웃 후 변이주 확인용 중합효소반응 및 총체적 스테롤 생합성 효율 재확인용 분광광도계 분석 결과(B)이다.
도 8은 UPC2 유전자의 DNA 서열에서 sgRNA가 인식하는 부위, 카스9 효소에 의해 이중 가닥 절단과 변이가 일어나는 부위(A) 및 888번째 아미노산이 달라지는 변이형 UPC2 -1 유전자 교체를 위한 기증자 DNA 서열이다(B). 변이가 일어나는 유전자 서열 GGT는 대문자로, sgRNA가 인식하는 DNA 서열은 밑줄 표시, 카스9 효소의 이중 가닥 절단이 일어나도록 정해주는 PAM 부위는 기울어져있다.
도 9는 Upc2 단백질 변이에 사용되는 카스9 효소와 이 효소를 게놈상의 UPC2 유전자 위치로 인도해주는 sgRNA를 같이 발현하는 벡터 YCpH-SpCas9-sgUPC2의 모식도(A)와 위 벡터가 효모 내에서 발현되었을 때, 게놈상의 내재 UPC2 유전자에 변이가 일어나는 과정을 나타내는 모식도(B)이다.
도 10은 YCpH-SpCas9-sgUPC2 벡터를 이용해 형질전환 시킨 CEN.PK 후보 균주의 세포당 스테롤 생산량 비교를 위한 분광광도계 분석 결과(A) 및 검증을 위한 UPC2 유전자 C-말단 부분의 중합효소연쇄반응 및 시퀀싱 결과(B) 및 YPD 배지에서의 연속적인 배양을 통해 YCpH-SpCas9-sgUPC2 벡터를 제거한 후의 세포당 스테롤 생산량 재 비교를 위한 분광광도계 분석 결과(C)와 C-말단 부분의 중합효소연쇄반응 및 시퀀싱 결과(D)이다. EV는 야생형 CEN.PK 균주에 HIS3 마커를 가지는 공벡터를 넣은 균주이고, #1~6은 YCpH-SpCas9-sgUPC2 벡터 형질전환 후보균주이다.
도 11은 YCpH-SpCas9-sgUPC2 벡터를 이용해 UPC2 -1 변이형 유전자로 교체된 BY4742 균주, Cas9 (A)와 담마레네디올 생산 균주인 EmD/tHle7 (B)의 세포당 스테롤 생산량 비교를 위한 분광광도계 분석 결과와 두 균주의 후보 균주 일부의 UPC2 유전자 C-말단 부분의 중합효소연쇄반응 및 시퀀싱 결과(C)이다. EV는 각각 야생형 BY4742 균주와 EmD/tHle7 균주에 HIS3 마커를 가지는 공벡터를 넣은 균주이고, #1~5는 YCpH-SpCas9-sgUPC2 벡터 형질전환 후보균주이다.
도 12는 UPC2 -1 변이형 유전자로 교체된 BY4742 변이 균주(Cas9), 공벡터를 지닌 야생형(WT+EV), centromere 복제 기작을 가지면서 UPC2 promoter와 UPC2 -1 ORF를 가지는 벡터인 YCpH-npUPC2-1이 들어가 있는 야생형(WT+YCpH-npUPC2-1), 공벡터를 지닌 BY-△upc2 결손(upc2+EV) 및 YCpH-npUPC2-1 벡터를 지닌 BY-△upc2 결손(upc2+npUPC2-1) 균주들에 대한 스테롤 생합성을 저해하는 물질인 Fluconazole 첨가 조건에서 저항성을 관찰하는 스파팅 실험(A)과 위 실험에 사용된 균주들의 세포당 스테롤 생산량 비교를 위한 분광광도계 분석 결과(B)이다.
도 13은 상기 도 12 실험에 사용된 BY4742 변이 균주들의 성장 속도 및 최종 성장 정도 비교를 위한 SC-H 선택배지(A)와 도 11 실험에 사용된 공벡터와 크리스퍼-카스9이 적용된 EmD/tHle7 균주, Centromere 복제 기작을 가지면서 UPC2 promoter와 UPC2-1 ORF를 가지는 벡터인 YCpH-npUPC2-1이 들어 있는 EmD/tHle7 균주간 성장 정도 비교를 위해 HIS3를 마커로 가지는 벡터가 빠질 수 있는 SC-L 선택배지(B)와 벡터가 빠지지 않는 SC-LUTH 선택배지(C) 에서의 OD 측정 결과이다.

이에 본 발명자들은 에르고스테롤 생합성 관련 전자조절인자(Upc2p)에 관한 단백질 공학 및 발현 최적화를 통하여 에르고스테롤 생합성 경로가 활성화된 재조합 효모를 제작하여, 본 발명을 완성하였다(도 2).

본 발명에서 개발된 에르고스테롤 부착 도메인의 아미노산 치환 변이형 UPC2-1 (Upc2p_G888D)발현 최적화 카세트는 에폭시스쿠알렌, 자이모스테롤 등을 포함한 여러 에르고스테롤 생합성 전구체들의 생산 증대를 유도하므로 진세노사이드 전구체 외에도 UDCA의 전구체인 콜레스테롤 대량생산 숙주 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

또한, 본 발명자들은 에르고스테롤에 의한 활성 억제가 되지 않는 변이형 전사조절인자 UPC2 유전자를 제작하기 위해 크리스퍼-카스9 방법을 도입하여 염색체 상에서 야생형 UPC2 유전자를 변이형으로 교체시켜 총체적으로 에르고스테롤 생합성 경로가 활성화된 재조합 효모를 개발하였다. 본 발명에서 제작된 YCpH-SpCas9-sgUPC2 벡터와 기증자 DNA 서열정보는 효율적으로 내재 UPC2 유전자에 변이를 일으킬 수 있으며 게놈 상에 단일염기 다형성만을 일으키며, 벡터를 내보내면 항생제 내성, 영양요구성 표지가 효모 내에 남지 않기 때문에 GRAS 평가에 적합하다.

본 발명은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 유래 Upc2p의 리간드 결합 도메인 부위가 변이된 UPC2 변이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

바람직하게는, 상기 UPC2 변이 유전자는 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 1로 표시되는 UPC2 변이 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 Upc2p 변이 단백질을 코딩한다. 서열번호 2의 888번째 아미노산은 야생형 Upc2p 단백질의 글라이신(glycine; G) 코돈(GGT)이 아스팔틱 엑시드(aspartic acid; D) 코돈(GAT)으로 치환되었다. 본 발명의 명세서에 기재된 UPC2 _G888D은 상기 기재된 서열번호 1로 표시되는 UPC2 변이 유전자를 의미한다.

UPC2 유전자의 NCBI accession no.는 851799이고, Upc2p 단백질의 NCBI accession no.는 LBMA01000004.1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 재조합 발현벡터는 UPC2 프로모터 유전자, 서열번호 1로 표시되는 UPC2 변이 유전자, GAL7 종결 유전자 및 HIS3 마커 유전자를 순서대로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.

본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

바람직하게는 상기 재조합 균주는 UPC2 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비시애 균주를 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 재조합 균주는 KCTC 13401BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 BY-upc2Δ/npUPC2-1 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 상기 KCTC 13401BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 BY-upc2Δ/npUPC2-1 균주는 총 콜레스테롤 생산이 증진된 균주이다.

바람직하게는 상기 재조합 균주는 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올을 생산하는 사카로마이세스 세레비시애 균주를 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올을 생산하는 사카로마이세스 세레비시애 균주는 KCTC 13399BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 EmD/tH1e7 균주일 수 있으며, 상기 재조합 균주는 KCTC 13400BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 EmD/tHle7/npUPC2-1 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 상기 KCTC 13400BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 EmD/tHle7/npUPC2-1 균주는 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올 생산이 증진된 균주이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 UPC2 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비시애 균주를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 균주를 배양하는 단계를 포함하는 총 콜레스테롤 생산 증진 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 형질전환된 균주는 KCTC 13401BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 BY-upc2Δ/npUPC2-1 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올을 생산하는 사카로마이세스 세레비시애 균주는 KCTC 13399BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 EmD/tH1e7 균주일 수 있으며, 상기 형질전환된 균주는 KCTC 13400BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 EmD/tHle7/npUPC2-1 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 KCTC 13399BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 EmD/tH1e7 균주는 담마레네디올 합성효소(DDS) 발현벡터로 형질전환된 스쿠알렌 과생산 사카로마이세스 세레비시애의 rDNA 상에 서열번호 3으로 표시되는 ERG1 변이 유전자가 삽입된 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올 과생산 사카로마이세스 세레비시애 재조합 균주이다.

또한, 본 발명은 상기 UPC2 변이 유전자 삽입 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애 재조합 균주를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 균주는 KCTC 13404BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 CEN.PK-upc2-1 균주일 수 있고, 상기 KCTC 13404BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 CEN.PK-upc2-1 균주는 내생(endogenous) UPC2 유전자가 서열번호 1로 표시되는 UPC2 변이 유전자로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 사용된 사카로마이세스 세레비시애 야생형 균주는 CEN-PK2-1C 균주로서, Entian and Kotter, Methods in Microbiology (2007) 36:629-666에 기재되어 있다.

본 발명에서 사용된 URA3 마커 유전자 및 HIS3 마커 유전자는 영양요구성 선택 표지 마커로서 사용되며, URA3 마커 유전자(NCBI accession no. NM_001178836.3) 또는 HIS3 마커 유전자(GENE ID: 854377)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 UPC2 프로모터 유전자는 서열번호 4로 표시하였으며, GAL7 종결 유전자는 서열번호 5로 표시하였고, UPC2 종결 유전자는 서열번호 6으로 표시하였다.

바람직하게는, 상기 UPC2 유전자를 표적으로 하는 sgRNA는 서열번호 7로 표시될 수 있고, 상기 UPC2 변이 유전자 도입용 기증자(Donor) DNA는 서열번호 8로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 크리스퍼-카스9(CRISPR-Cas9) 재조합벡터는 도 9(A)의 개열지도는 갖는 YCpH-SpCas9-sgUPC2 재조합벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 재조합 균주는 염색체 내 내생(endogenous) UPC2 유전자가 서열번호 1로 표시되는 UPC2 변이 유전자로 치환될 수 있다.

본 발명에서 사용된 크리스퍼-카스9(CRISPR-Cas9) 시스템은 박테리아와 진핵생물에 적용시킬 수 있는 유전체 엔지니어링 도구로써 떠오르고 있다. Cas9은 sgRNA에 의해 결정된 타겟 DNA를 절단하는 엔도뉴클라아제(endonuclease) 기능을 가지고 있다. Cas9에 의한 이중나선 절단(double-strand break; DSB)은 sgRNA가 지정하는 protospacer adjacent motif (PAM)의 앞쪽 서열인 특정 서열에 일어난다. 상동성 서열을 지닌 공여 DNA와 함께 가이드 RNA와 Cas9 발현 벡터로 형질전환시키면, 상동성 수리(HR; homologous repair) 기작에 의해 높은 효율로 유전자 교정이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 다양한 전사조절인자 Upc2p 변이 부품 및 발현 벡터 제작

에르고스테롤 생합성 경로 활성을 조절하는 데 핵심적인 역할을 지닌 Upc2p 전사조절인자의 피드백 조절을 완화시켜 에르고스테롤을 비롯한 총체적인 스테롤 생합성 활성을 증가시키고자 하였다. 일차적으로 야생형 Upc2p 발현벡터인 YCpH-Tp-UPC2는 UPC2-fw, UPC2-bw 프라이머로 중합효소연쇄반응을 진행하여 야생형 UPC2 유전자를 합성한 뒤 YCpH-Tp벡터와 UPC2 유전자를 SpeI/XhoI 으로 절단하여 이어 붙여 제작하였다. 에르코스테롤 결합 부위 변이 Upc2p를 코딩하는 유전자를 합성하기 위해서는 표1에 표시된 프라이머 중 UPC2-fw, UPC2-bw, UPC2-1-F2-fw, UPC2-1-F1-bw를 이용해 각각 N-, C-단편을 얻고 확보한 후 융합 중합효소연쇄반응을 진행하여 888번째 글라이신 코돈(GGT)에 단일염기 변이가 생겨 아스파르트산 코돈(GAT)으로 치환된 UPC2-1 유전자를 제작하였다. 상세하게는 UPC2 유전자의 개시코돈 ATG부터 변이 도입 부위까지 2,673 bp의 N-PCR 절편을 합성하기 위해 UPC2-fw와 UPC2-1-F1-bw를 이용하였고, 변이 위치에서 종결코돈까지 포함된 86 bp C-PCR 절편을 합성하기 위해 UPC2-1-F2-fw와 UPC2-bw를 이용하였다. 확보된 UPC2-1 유전자는 YCpH-Tp-UPC2 벡터와 SpeI/XhoI 으로 절단하여 야생형 UPC2를 대신해 삽입하여 YCpH-Tp-UPC2-1 벡터를 만들었다. 또한 N-도메인 부분을 결손시킨 Upc2p 변이 부품들을 제작하기 위해, UPC2-fw, UPC2-NTT-F1-bw, UPC2-NTT-F2-fw, UPC2-NTT-F2-bw 프라이머를 이용한 융합 중합효소연쇄반응을 진행하여 개시코돈 ATG부터 시작하는 300 bp N-단편과 390 번 아미노산 코돈에서 시작해 300 bp의 길이를 가지는 C-단편을 이용하여 100-390 아미노산 서열 부분이 제거된 UPC2 _NΔ 절편을 합성하였다. 확보된 UPC2 _NΔ변이 유전자 단편과 YCpH-Tp-UPC2 벡터를 SpeI/SauI 제한효소로 절단하여 야생형 UPC2 유전자가 클로닝된 YCpH-Tp-UPC2에서 UPC2의 개시 코돈에서 390 아미노산 서열이 포함된 SpeI / SauI UPC2 _NΔ 절편과 바꾸는 과정을 진행하여 DNA 결합, 리간드 결합 도메인을 연결해주는 링커(linker) 부분이 제거된 UPC2_NΔ(N-terminal 100-390 amnio acids truncation)를 코딩하는 유전자를 발현하는 벡터 YCpH-Tp-UPC2_NΔ를 제작하였다. 또한 UPC2-fw, UPC2-CTT-bw 프라이머로 중합효소연쇄반응을 진행해 UPC2 C-단편 일부(792-913 a.a.)가 제거된 UPC2 _CΔ 유전자를 합성하고 SauI/XhoI 제한효소로 절단하여 SauI / XhoI으로 절단된 YCpH-Tp-UCP2 벡터와 연결하여 792-913 아미노산 서열이 포함된 UPC2 C-절편을 야생형 UPC2와 바꾸는 과정을 진행하여 리간드 결합 도메인(ligand binding domain)이 제거된 UPC2_CΔ(C-terminal 792-913 amino acids truncation) 발현 벡터 YCpH-Tp-UPC2_CΔ를제작하였다. 또한 YCpH-Tp-UPC2-1 벡터와 UPC2 _NΔ 절편을 SpeI/SauI 제한효소로 절단하여 야생형 UPC2 유전자의 N-절편과 UPC2 _NΔ를 교체하여 C-절편에도 UPC2-1 변이를 동시에 가지는 UPC2-1 _NΔ 유전자를 발현하는 벡터 YCpH-Tp-UPC2-1_NΔ를 제작하였다(도 3).

본 발명에 사용된 프라이머 리스트, 본 발명에 사용된 효모 균주 및 본 발명에 사용된 플라스미드는 각각 표 1, 표 2 및 표 3에 나타냈다.

유전자	프라이머	염기서열	용도
HIS3	ScHIS3-FW	5'-catgccatggtaattctcgttttaagagcttg-3'	선별표지용 유전자 증폭
HIS3	ScHIS3-BW-ApaI	5'-gcgcgggcccctcgagttcaagagaaaaaaaaag-3'	선별표지용 유전자 증폭
UPC2	UPC2-fw	5'-gcgctctagactagtatgagcgaagtcggtatac-3’	변이형 유전자 증폭
	UPC2-bw	5'-gcgcctcgagcccgggctataacgaaaaatcagagaaatttg-3’
	UPC2-1-Fu2-fw	5'-gaatacagtggaggtggtgata-3’
	UPC2-1-Fu1-bw	5'-ctagcatcatatgcatatcacc-3’
	UPC2-NTT-F1-bw	5'-ctttctcgtgacatacttc-3’
	UPC2-NTT-F2-fw	5'-gaagtatgtcacgagaaagttacaagctgatgcattatct-3’
	UPC2-NTT-F2-bw	5'-tataggcgccattgtcga-3’
	UPC2-CTT-bw	5'-gcgcctcgagaatgacatcgcctaaatc-3’
	pUPC2-fw	5'-gcgcggatccgcgcgttaacgcgcttactgctaagcc-3’
	pUPC2-FW-BamHI-HpaI	5'-gcgcggatccgcgcgttaacgcgcttactgctaagcc-3’
	Seq-ScUPC2-3B	5'-tccagaaggcaatggcggt-3’
	UPC2tL-FW	5'-gttgacgaatacagtggagg-3'
	UPC2tR-FW-SalI	5'-gcgcgtcgacgcagaatattcgaaatagattccc-3'
	UPC2tL-BW-NdeI	5'-gcgccatatgcttatcgacccagtgccag-3'
	UPC2tR-BW-XhoI	5'-gcgcctcgagcctgaatgtcattaccatgg-3'
	Upc2-1-int-confirm-fw (2-1)	5'-gcattgctagacaagacattc-3'	유전자 교체 및 팝-아웃 확인
	Upc2-1-int-confirm-bw(ura3)	5'-cagtcaagatatccacatgtg-3'	유전자 교체 및 팝-아웃 확인

¹제한효소는 밑줄로 표시하였다.

²888번 글라이신을 아스팔틱 엑시드로 바꾼 시퀀스는 굵게 표시하였다.

Strain	Genotype	Reference
CEN-PK2-1C	MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-1 MAL2-8C SUC2	Entian and Kotter(2007)
E_mD/tH1e7	CEN-tH1e7 with an integrated copy of the 403bp pTEF1-ERG1_K311R cassette andharboringYEpL-PgDDS	KCTC 13399BP
BY4742	MATa his3D1 leu2D0 lys2D0 ura3D0	Open Biosystems
BY-upc2Δ	MATα;ura3Δ0 ; leu2Δ0 ; his3Δ1 ; lys2Δ0 ; upc2::kanMX4	Open Biosystems
BY4742/EV	BY4742 harboring YCpU-Tp or YCpH-Tp	본 발명
BY-upc2Δ/EV	BY-upc2Δharboring YCpU-Tp or YCpH-Tp	본 발명
BY/Tp-UPC2	BY4742 harboring YCpH-Tp-UPC2	본 발명
BY/Tp-UPC2-1	BY4742 harboring YCpH-Tp-UPC2-1	본 발명
BY/Tp-UPC2_CΔ	BY4742 harboring YCpH-Tp-UPC2_CΔ	본 발명
BY/Tp-UPC2_NΔ	BY4742 harboring YCpH-Tp-UPC2_NΔ	본 발명
BY/Tp-UPC2-1_NΔ	BY4742 harboring YCpU-Tp-UPC2-1_NΔ	본 발명
BY/npUPC2	BY4742 harboring YCpH-np-UPC2	본 발명
BY/npUPC2-1	BY4742 harboring YCpH-np-UPC2-1	본 발명
BY-upc2Δ/Tp-UPC2	BY-upc2Δharboring YCpH-Tp-UPC2	본 발명
BY-upc2Δ/Tp-UPC2-1	BY-upc2Δharboring YCpH-Tp-UPC2-1	본 발명
BY-upc2Δ/npUPC2	BY-upc2Δharboring YCpH-np-UPC2	본 발명
BY-upc2Δ/npUPC2-1	BY-upc2Δharboring YCpH-np-UPC2-1	본 발명
BY-upc2Δ/npUPC2_CΔ	BY-upc2Δharboring YCpH-np-UPC2_CΔ	본 발명
BY-upc2Δ/npUPC2_NΔ	BY-upc2Δharboring YCpH-np-UPC2_NΔ	본 발명
BY-upc2Δ/npUPC2-1_NΔ	BY-upc2Δharboring YCpH-np-UPC2-1_NΔ	본 발명
BY/YE-np-UPC2-1	BY4742 harboring YEpH-np-UPC2-1	본 발명
BY-upc2Δ/YE-npUPC2-1	BY-upc2Δharboring YEpH-np-UPC2-1	본 발명
E_mD/tH1e7/Tp-UPC2-1	Em/D/tH1e7 harboring YCpH-Tp-UPC2-1	본 발명
E_mD/tH1e7/npUPC2-1	Em/D/tH1e7 harboring YCpH-np-UPC2-1	본 발명
CEN.PK-upc2-1	CEN-PK2-1C replaced with UPC2-1 mutant allele	본 발명

Plasmid	Description	Reference
pRE316	pScGAL1/10-URA3-CEN vector	Cheon et al, (2010)
pTcUR190	ScURA3 containing vector without yeast replication origin	본 발명
YCpU-Tp	CEN-based pRE316 derivative containing the TEF1 promoter, the GAL7 terminatoer and the URA3 marker	본 발명
YCpH-Tp	YCpU-Tp derivative containing the HIS3 marker	본 발명
YCpH-Tp-UPC2	YCpH-Tp containing the wild type UPC2 fused to the TEF1 promoter	본 발명
YCpH-Tp-UPC2-1	YCpH-Tp containing a single amino acid variant UPC2 _G888Dfused to the TEF1 promoter	본 발명
YCpH-Tp-UPC2_CΔ	YCpH-Tp containing a C-terminal truncated UPC2 fused to the TEF1 promoter	본 발명
YCpH-Tp-UPC2_NΔ	YCpH-Tp containing a N-terminal truncated UPC2 fused to the TEF1 promoter	본 발명
YCpH-Tp-UPC2-1_NΔ	YCpH-Tp containing the double variant UPC2-1_NΔ fused to the TEF1 promoter	본 발명
YCpH-np-UPC2	YCpH derivative expressing the wild type UPC2 under the control of its own promoter	본 발명
YCpH-np-UPC2-1	YCpH derivative expressing UPC2 -1 under the control of its own promoter	본 발명
YCpH-np-UPC2_CΔ	YCpH derivative expressing a C-terminal truncated UPC2 under the control of ts own promoter	본 발명
YCpH-np-UPC2_NΔ	YCpH derivative expressing a N-terminal truncated UPC2 under the control of its own promoter	본 발명
YCpH-np-UPC2-1_NΔ	YCpH derivative expressing a double variant UPC2-1_NΔ under the control of its own promoter	본 발명
YEpH-np-UPC2	2μ-based vector expressing UPC2 under the control of its own promoter and carrying HIS3 marker	본 발명
YEpH-np-UPC2-1	2μ-based vector expressing UPC2 -1 under the control of its own promoter and carrying HIS3 marker	본 발명
NP-UPC2-1-integration	UPC2 promoter, UPC2 -1, UPC2 terminator and URA3 marker	본 발명

실시예 2 : Upc2p 변이 부품 발현 최적화를 통한 에르고스테롤 생산성 증대

상기 제작된 YCpH-Tp-UPC2 벡터들을 야생형 사카로마이세스 세레비지애 BY4742 균주와 UPC2 유전자가 파쇄된 BY-upc2△변이주에 도입하여 SC-HIS 배지에서 성장하는 HIS+ 형질전환체들을 선별하였다. 이들 재조합 효모 균주들의 에르고스테롤 생합성을 억제하는 항균제인 플루코나졸(fluconazole)에 대한 내성을 측정한 결과, 야생형 균주에서 야생형 Upc2p 과발현은 오히려 플루코나졸 내성의 감소를 유발하였고, 변이형 Upc2p 단백질들의 과발현은 약간 증가된 플루코나졸 내성을 보였다. 그 반면 upc2△결손 변이주에서는 야생형 Upc2p 과발현 경우에만 플루코나졸 내성이 야생형 균주 수준으로 회복되었고 변이형 Upc2p 과발현은 그 회복 수준이 떨어졌다(도 4A). 이는 제작된 Upc2p 변이 단백질들의 전사 활성이 야생형에 비해 상당히 저하되어 있음을 시사한다.

이에 본 발명자들은 Upc2p 단백질의 발현 수준을 최적화하는 것이 중요함을 인식하고 항상 높은 발현수준을 유지하는 TEF1 프로모터 대신에 UPC2 자체 프로모터에 의해 발현이 되도록 pUPC2-FW-BamHI-HpaI, Seq-ScUPC2-3B 프라이머를 이용하여 사카로마이세스 세레비지애 게놈을 대상으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 UPC2 프로모터(pUPC2, 480 bp)를 지닌 UPC2 N-단편 (658 bp)을 증폭하였다. 상기 확보된 1,138 bp UPC2 프로모터를 지닌 N-단편을 BamHI과 EcoRI 제한효소로 절단하고 YCpU-Tp-UPC2, YCpU-Tp-UPC2-1, YCpH-Tp-UPC2_CΔ 벡터들을 EcoRI과 XhoI 제한효소로 절단하여 확보된 UPC2 C-단편, UPC2 -1 단편, UPC2 _CΔ 단편을 BamHI / XhoI 제한효소로 절단한 pRE316 벡터와 세 조각 연결반응(three-piece ligation)을 수행하여 YCpH-np-UPC2, YCpH-np-UPC2-1, YCpH-np-UPC2_CΔ를 각각 제작하였다(도 3C). YCpH-np-UPC2_NΔ 벡터는 YCpH-pT-UPC2_NΔ 벡터를 만드는 데 이용한UPC2-fw, UPC2-NTT-F1-bw, UPC2-NTT-F2-fw, UPC2-NTT-F2-bw 프라이머 세트 중 UPC2-fw 대신 pUPC2-FW-BamHI-HpaI 프라이머를 이용해 융합 중합효소 연쇄반응을 진행하여 UPC2 프로모터와 N-절편이 포함된 1,070 bp 유전자 절편과 390 번 아미노산 코돈에서 시작해 300 bp의 길이를 가지는 C-단편을 이어붙은 후 BamHI과 Eco81I 제한효소로 절단한 후 YCpH-np-UPC2 백터의 BamHI/Eco81I UPC2 절편과 교체하여 완성하였다. 이들 YCpH-np-UPC2 벡터들로 upc2△결손 변이주를 형질전환시킨 후 플루코나졸 내성을 비교 분석한 결과 UPC2 자체 프로모터로부터 Upc2-1p 변이 단백질이 적당한 수준으로 발현되는 균주에게 가장 높은 프루코나졸 내성을 보였다(도 4B). 이와 같은 발현 수준의 중요성은 UPC2 자체 프로모터로부터 발현이 되는 경우에도 2μ-기반의 높은 카피 수로 발현되는 경우는 야생형 균주와 변이주 모두에서 오히려 플루코나졸 내성이 현저히 감소되는 결과로 재확인되었다(도 4C). 상기 제작된 Upc2-1p 변이부품을 자체 프로모터로 발현시키는 재조합 효모 균주의 총체적인 콜레스테롤 생산성을 분광광도계(spectrometry)로 측정하여 비교분석한 결과 플루코나졸 내성 증가와 마찬가지로 야생형 균주에 비해서 upc2△결손 균주에 Upc2-1p이 발현된 경우 스테롤 생합성 효율이 더욱 증가됨을 확인하였다(도 4D).

실시예 3 : 발현 최적화된 Upc2 -1p에 도입에 의한 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올 생산성 증대

Upc2-1p 발현 최적화를 통한 총제적인 콜레스테롤 생산 증진 효과를 확인한 후, 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올을 생산하는 E_mD/tH1e7 재조합 균주를 YCpH-Tp-UPC2-1과 YCpH-np-UPC2-1로 각각 형질전환시킨 후 HPLC를 통해 분석하였다. SC (YNB+amino acid mixture, leucine, uracil, tryptophan, histidine 제외) 배지에 균주 1~2 colony 접종하여 전배양 수행한 후 초기 접종 OD600=0.5가 되게 10 mM 메티오닌이 첨부되거나 또는 되지 않은 SC 배지에서 배양하였다. 24 시간 배양(28℃, 220 rpm)후 효모 세포 OD₆₀₀=100을 2 ml 튜브에 회수한 후, 70% 에탄올에 KOH를 13%로 녹인 용액 1 ml에 현탁 후 85℃ 인큐베이터에서 1 시간 동안 반응시켜 효모세포를 파쇄하였다. 이후 헵테인 800 ul를 각 샘플에 추가한 뒤 30초 vortexing로 섞어준 후 원심분리(12,000 rpm, 1 min, 25℃)하여 헵테인 상등액(600ul)을 회수한 후 건조하였다. 건조된 샘플에 아세톤 200 ul 첨가하여 녹여낸 샘플을 가지고 HPLC 분석 수행을 수행하였다. HPLC 분석시 컬럼은 Cosmosil C18-PAQ (4.6 mm*250 mm)을 사용하였고 유속(flow rate)은 1 ml/min, 분석 용매는 100% 아세토니트릴(Acetonitrile), 분석 시간 30 min 이었다. 그 결과 TEF1 프로모터에 의한 Upc2-1p 발현 벡터가 도입된 재조합 효모 균주(E_mD/tHle7/Tp-UPC2-1)의 경우 별다른 증가 효과가 없는 데 반해, UPC2 프로모터에 의한 Upc2-1p 발현 벡터(YCpH-np-UPC2-1)가 도입된 재조합 효모 균주(E_mD/tHle7/npUPC2-1)에서는 에폭시스쿠알렌과 더불어 담마레네디올 생합성 양이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 5). MET3 프로모터에 의한 ERG7 발현이 조절되는 E_mD/tH1e7 재조합 균주를 10 mM 메티오닌이 첨부되지 않은 SC 배지에서 배양한 경우에는 Upc2-1p 도입에 의해 에폭시스쿠알렌과 담마레네디올 생합성 뿐만 아니라 에르고스테롤 생합성도 눈에 띄게 증가됨이 관찰되었다(도 5A), 메티오닌 첨부로 인해 ERG7 발현이 억제된 배양조건에서는 E_mD/tH1e7 재조합 균주에서 생산되는 에폭시스쿠알렌, 담마레네디올 및 스쿠알렌의 전체적인 생산량은 크게 증가된 상태이며 Upc2-1p 도입 후 에르고스테롤 생합성은 크게 증가되지 않지만 에폭시스쿠알렌과 담마레네디올의 생산성은 크게 증가됨이 관찰되었다(도 5B).

실시예 4 : 발현 최적화된 UPC2 -1 유전자 교체용 카세트 제작 및 활용

Upc2-1p이 upc2 결손 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시 항진균제인 플루코나졸에서의 저항성이 가장 높고(도 4C), 가장 많은 양의 스테롤(sterol)을 생산해냄에 따라(도 4D), 진세노사이드, 콜레스테롤 전구체 과생산을 위한 균주 제작에서 더 높은 스테롤 생산을 위해 내생(endogenous) UPC2 유전자를 가지는 사카로마이세스 세레비지애에 내생 UPC2를 없애면서 동시에 UPC2-1 유전자를 삽입하여 교체시킬 수 있는 벡터를 제작하였다. 이를 위해 YCpH-np-UPC2-1 벡터와 pTcUR190 벡터에 BamHI/NdeI 제한효소로 절단한 뒤 YCpH-np-UPC2-1 벡터에서 얻은 UPC2 프로모터-UPC2-1 ORF (1-889 아미노산) 단편을 pTcUR190 벡터에 넣어 NP-UPC2-int. step1 벡터를 만들었다. 이 후 표 1에 표시된 UPC2tL-FW, UPC2tL-BW-NdeI 프라이머를 이용해 야생형 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 889-912 아미노산 부위의 ORF와 424bp의 UPC2 고유 터미네이터(terminator)를 포함한 단편을 중합효소연쇄반응으로 얻었다. 앞서 제작한 NP-UPC2-int. step1 벡터와 UPC2 ORF (889-912 아미노산)-UPC2 터미네이터 단편에 NdeI 제한효소를 처리한 뒤 단편을 NP-UPC2-int. step1 벡터에 도입한 뒤 방향성을 확인하여 NP-UPC2-int. step2 벡터를 만들었다. 표 1에 있는 UPC2tR-FW-SalI, UPC2tR-BW-XhoI 프라이머를 이용해 야생형 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 상동재조합 작용을 이용해 URA3 유전자를 제거하기 위한 885bp 길이의 UPC2 터미네이터 단편을 한번 더 제작하였다. 이 단편과 NP-UPC2-int. step2 벡터에 SalI/XhoI 제한효소를 처리한 뒤 단편을 벡터에 삽입하여 최종적인 NP-UPC2-1 integration 벡터를 제작하였다(도 6A).

제작된 상기 NP-UPC2-1 벡터를 SpeI / XhoI 제한효소로 절단하여 선형화시킨 후 야생형 UPC2 유전자를 가지고 있는 사카로마이세스 세레비지애 CEN-PK2-1C 균주에 형질전환시켜 UPC2 프로모터 및 터미네이터 부분을 통한 이중 상동재조합에 의해 내생 UPC2를 없애면서 동시에 UPC2 -1 유전자가 삽입 교체를 유도하였다(도 6B). Uracil이 제거된 배지에서 일차적으로 URA3 선별표지를 지닌 형질전환체를 얻은 후, UPC2-1 유전자 카세트가 정확하게 내생 UPC2 부위로 삽입 교체된 형질전환체들을 프라이머 Upc2-1-int-confrim-fw(2-1)/ Upc2-1-int-confirm-bw(ura3)를 이용한 중합효소 연쇄반응을 통해 선별해내었다(도 7A, 왼쪽 패널). 또한 URA3 형질전환체들의 콜레스테롤 전구체 생산량 증가능 유지 여부도 분광광도계로 측정로 분석하여 중합효소 연쇄반응 분석 결과와 일치되는 양상을 보이는 형질전환체 #3를 선발하고(도 7A, 오른쪽 패널), 증폭된 PCR 단편을 시퀀싱하여 최종적으로 UPC2 -1 유전자로 교체되어 있음을 검증하였다(도 7A, 아래 패널). UPC2 -1 유전자 삽입 카세트에 포함되어 있는 두 개의 UPC2 터미네이터 서열 간의 상동재조합을 일으켜 삽입되어 있는 URA3 유전자를 팝-아웃시켜 원래 형태의 UPC2 터미네이터로 회복시키기 위해, 플르루오로틱 엑시드 (5-Fluoroorotic Acid)와 Uracil이 첨가된 배지에서 형질전환체 #3을 배양하였다. 두 개의 UPC2 터미네이터 서열간의 상동재조합을 통해 URA3 선별 표지가 정학하게 제거됨을 형질전환체 선별에 사용하였던 Upc2-1-int-confrim-fw(2-1), Upc2-1-int-confirm-bw(ura3) 프라이머를 이용해 중합효소 연쇄반응 분석을 진행하여 URA3가 팝-아웃된 UPC2 -1 변이체들을 얻을 수 있다(도 7B, 왼쪽 패널). 최종적으로 사카로마이세스 세레비지애 야생형 CEN.PK2-1C 균주에 상기 카세트로 형질전환 시킨 뒤 얻은 UPC2-1 변이체(CEN.PK-upc2-1)에서 야생형보다 높은 수준의 스테롤 합성능을 유지하고 있는 지를 분광광도계로 측정 및 분석하여 확인하였다. 그 결과 형질전환체 #3-2이 균주가 URA3 팝-아웃 과정을 거친 뒤에도 스테롤 합성이 야생형에 비해 높은 상태로 유지되고 있는 것을 확인하였다(도 7B, 오른쪽 패널).

실시예 5 : UPC2 -1 유전자 변이 교체용 크리스퍼 - 카스9 기반 YCpH - SpCas9 -sgUPC2 벡터 제작

야생형 UPC2 유전자를 발현하는 사카로마이세스 세레비지애가 UPC2-1 유전자 변이를 가질 수 있도록 게놈상에 존재하는 UPC2 유전자의 DNA 서열을 보다 효율적으로 바꾸기 위하여 카스9 시스템을 이용하였다. 서울대에서 제공 받은 Coex 413-Cas9-UCC1 gRNA 벡터를 주형으로 사용하여 표 4에 표시된 UPC2-gRNA-L-FW, UPC2-gRNA-L-BW 프라이머를 이용해 얻은 181bp 중합효소 연쇄 반응 생산물과, UPC2-gRNA-R-FW, UPC2-gRNA-R-BW 프라이머를 이용해 얻은 291bp 중합효소 연쇄 반응 생산물 두 개를 주형으로 다시 한 번 UPC2-gRNA-L-FW, UPC2-gRNA-R-BW 두 프라이머를 이용해 혼합 중합효소 연쇄 반응을 일으켜 sgRNA의 구조를 이루는 tracrRNA 부분은 그대로 두고, URA3 유전자의 ORF 일부에 상보적인 염기 서열을 가지고 있던 spacerRNA 부분을 UPC2 유전자의 C-terminal 부분(2,641-2,660bp)에 상보적인 서열을 가지도록 만든 452bp의 단편을 제작하였다. Coex 413-Cas9-UCC1 gRNA 벡터에 XbaI / SalI 제한효소를 처리하여 URA3 유전자의 ORF에 상보적인 서열을 가지는 spacerRNA 부분을 제거한 뒤, 합성된 중합효소 연쇄 반응 단편에 XbaI/SalI 제한효소를 처리하여 라이게이션 과정을 통해 연결함으로서 UPC2 유전자의 C-말단에서 이중 가닥 절단을 일으키는 YCpH-SpCas9-sgUPC2 벡터를 제작하였다(도 9A).

Cas9을 UPC2 유전자 위치로 이끌어주는 sgRNA가 결합하는 부위 및 DNA 절단 위치를 결정하는 일어날 수 있는 PAM 염기서열 부분은 도 8A에 기재하였다. 카스9 효소에 의해 게놈상에 이중 가닥 절단이 발생하면 이를 회복하는 과정에서 기존의 야생형 UPC2 유전자 상태로 회복되거나 비특이적 변이를 일으키는 대신 UPC2-1 유전자가 될 수 있도록 UPC2 -1 유전자에 해당하는 DNA 단편을 의도적으로 넣어 기증자 DNA로서 주형으로서 게놈 회복에 사용되도록, 효모 내에 같이 형질전환 해주어야 한다. 이를 위해, 표 1에 표시된 UPC2-1 donor-DNA-FW, UPC2-1 donor-DNA-BW 두 프라이머를 이용해 주형 없이 중합효소 연쇄 반응을 이용해 UPC2-1 C- 말단에 해당하는 유전자 서열을 가지는 78bp DNA 단편을 얻었다(도 8B).

본 실시예에 사용된 프라이머 목록, 본 발명에 사용된 플라스미드 및 본 발명에 사용된 효모 균주는 각각 표 4, 표 5 및 표 6에 나타냈다.

유전자	프라이머	염기서열	용도
UPC2	UPC2-gRNA-L-FW	5'-gcgctctagattttgtagtgccctct-3'	UPC2 인식용 sgRNA 내 spacerRNA 교체 단편 증폭
	UPC2-gRNA-L-BW	5'-ccacctccactgtattcgtcgatcatttatctttcactgcgg-3'
	UPC2-gRNA-R-FW	5'-gacgaatacagtggaggtgggttttagagctagaaatagcaa-3'
	UPC2-gRNA-R-BW	5'-gcgcgtcgacgaataatgtaatcgtg-3’
	UPC2-1 donor-DNA-FW	5'-tgctgcctcaagatgttgacgaatacagtggaggtggtgAtatgcatatg-3'	UPC2 -1 변이 유전자 교체용 기증자 DNA 증폭
	UPC2-1 donor-DNA-BW	5'-gtaatccgccaccgaggaaatctagcatcatatgcataTcaccacctcca-3'	UPC2 -1 변이 유전자 교체용 기증자 DNA 증폭

¹제한효소 인식 부위는 밑줄로 표시하였다.

²888번 아미노산인 글라이신을 아스팔틱 엑시드로 바꾼 DNA 서열은 대문자로 표시하였다.

Plasmid	Description	Reference
Coex 413-Cas9-UCC1 gRNA	Yeast CEN -HIS3 vector containing Cas9 and UCC1 targeting sgRNA	SNU, Hahn J.-S. (unpublished)
YCpH-SpCas9-sgUPC2	YCpH-SpCas9-sgURA3 derivative containing sgRNA targeting UPC2 gene	본 발명

Strain	Genotype	Reference
Cas9	BY4742 replaced with UPC2 -1 mutant allele	본 발명
EmD/tHe7-Cas	EmD/tHe7 replaced with UPC2 -1 mutant allele	본 발명

실시예 6 : 크리스퍼 시스템 도입을 통한 게놈 상의 UPC2 유전자 변이체 확보 및 분석

상기 제작된 YCpH-SpCas9-sgUPC2 벡터와 UPC2-1 기증자 DNA를 야생형 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1C 균주에 도입하여 SC-HIS 선택 배지에서 성장하는 HIS⁺ 형질전환체들을 선별하였다. 형질전환에는 소량의 벡터와 3μg 씩의 기증자 DNA가 이용되었다. 게놈 상에 변이가 일어난 균주를 얻기 위하여 선택배지 사용에 이은 2차 선별 과정으로 스테롤 정량 분석을 수행하였다. 얻은 형진전환체들 중 6개를 후보로 이용하여 SC-HIS 액체 배지에서 24시간 배양한 뒤 OD₆₀₀ 10만큼의 효모를 얻었다. 효모를 2ml microtube로 옮긴 뒤 배양액을 제거한 다음, KOH 6.25%, H₂O 8.75%가 들어간 에탄올 용액 1ml에 녹여 85℃ 조건에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 heptane을 0.8ml 넣고 잘 섞어준 다음 층 분리가 되어 위 층에 모여 있는 heptane 상층액을 새 튜브에 옮긴다. 얻은 heptane 상층액과 100% 에탄올을 1:5로 섞은 뒤 분광광도계의 스캐닝 기능을 이용해 240-310nm의 파장에서 값을 측정한다. HIS3를 발현하는 공벡터가 들어간 CEN.PK2-1C 효모가 기준 균주로 사용되었으며, 스테롤 정량 분석 컨트롤은 순수한 heptane과 에탄올을 섞은 용액이 사용되었다. 분석 결과, 6개 후보 균주 중에서 5개 균주가 공벡터가 들어간 균주보다 높은 스테롤 합성 수준을 나타내었다(도 10A). 6개 후보 균주들의 gDNA를 얻어 UPC2 유전자 C- 말단 부분을 표 1에 나와 있는 Upc2-1-int-confirm-fw(2-1), Upc2-1-confirm-bw(2-1) 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응을 통해 확보하여 시퀀싱 분석도 진행한 결과, 6개 모두에서 크리스퍼 시스템을 통해 의도했던 GGT에서 GAT로의 변이가 일어났으며, 스테롤 합성 수준이 낮게 나타난 5번 후보 균주에서는 추가적으로 2,655nt에서 단일 염기 결손이 일어난 것을 확인하였다(도 10B).

PAM 시퀀스에 의해 카스9 효소가 게놈상에 이중 가닥 절단을 일으키면, UPC2-1 유전자의 시퀀스에 해당하는 기증자 DNA를 주형으로 회복이 일어난다. 이때, 야생형 UPC2 유전자의 PAM 시퀀스인 NGG가 UPC2-1 변이 유전자에서는 NGA 시퀀스로 바뀌면서 카스9 효소가 한 번 변이를 일으킨 게놈 상에서는 더 이상 이중 가닥 절단이 일어나지 않도록 디자인 되어있다(도 9A). 하지만, 낮은 확률이라도 추가적인 이중 가닥 절단이 발생하여 UPC2 유전자 내부에 Non-Homologous-End-Joining을 포함한 비특이적 변이가 발생할 수 있기 때문에 YPD 배지에서 형질 전환체들을 연속적으로 배양하여 벡터가 빠진 것을 확인한 뒤 다시 스테롤 정량과 시퀀싱 분석을 진행하여, 벡터가 효모에서 빠져 나간 뒤 스테롤 생합성 기능이나 유전자 서열에 변화가 없음을 확인하였다(도 10C 및 도 10D).

실시예 7 : 크리스퍼 시스템을 이용한 다른 균주(strain)의 사카로마이세스 세레비시애에서 UPC2 -1 유전자 교체

사카로마이세스 세레비시애에는 여러 종류의 균주(strain)가 존재하며 조금씩 게놈의 DNA 서열에 차이가 존재한다. 따라서, 본 특허에서 제작한 크리스퍼 시스템이 여러 균주(strain)에 동일하게 적용되는지, 야생형이 아닌 유전적 조작이 일어난 균주에도 적용이 되는지 확인해보기 위한 형질전환을 진행하였다. CEN.PK2-1C와 함께 실험실에서 자주 사용되는 균주인 BY4742와, CEN.PK2-1C에서 유래된 스테롤 합성에 관련된 유전자들 일부에 변이와 외래 유전자를 가지고 있어서 옥시도스쿠알렌과 스쿠알렌이 과생산 및 축적되며 진세노사이드의 전구물질인 담마레네디올을 생산 할 수 있는 EmD/tHle7(표 2) 균주에 형질전환을 시도하였다. 그 결과, 두 균주 모두에서 쉽게 형질전환 후보 균주들을 얻을 수 있었으며 이들 후보 균주들도 스테롤 정량 분석과 시퀀싱을 진행한 결과, 10개 후보 균주 중에 1개를 제외한 9개에서 디자인한대로 UPC2-1 변이 유전자로 교체되어 스테롤을 과생산 시키는 것을 확인하였다(도 11A, 도 11B 및 도 11C). 나머지 1개 균주의 경우 앞선 CEN.PK2-1C 균주와는 또 다른 부위에서 단일 염기 결손이 일어난 것을 확인하였다.

실시예 8 : Upc2-1 유전자 교체 균주의 스테롤 생합성 억제제 저항성 테스트

플루코나졸은 효모의 에르고스테롤 합성 과정에 존재하는 Erg11p의 기능을 억제함으로서 세포의 스테롤 생합성을 억제시킴으로서 항진균제로 사용된다. 스테롤 합성능이 증가한 효모에서는 생장 억제 현상이 약화된다는 점을 이용해 플루코나졸이 0, 8, 15, 20μg/ml의 농도로 들어간 SC-H 배지에 위 실험에서 얻은 크리스퍼 시스템 적용 BY4742 후보 균주와 실시예 2에서 제작한 균주들과 함께 배양한 스파팅 실험을 수행한 결과(도 12A), Upc2-1 유전자로 교체된 Cas9 균주는 YCpH-npUPC2-1이 들어간 BY4742 야생형 균주와 비슷한 수준의 성장을 나타내었다. BY-upc2Δ 돌연변이에 YCpH-npUPC2-1 벡터가 들어간 균주의 경우 좀 더 높은 플루코나졸 저항성을 나타내었으며 야생형 BY4742 균주에 공벡터가 들어간 균주는 약한 저항성을, BY-upc2Δ 돌연변이 균주에 공벡터가 들어간 균주는 저항성이 매우 낮았다. 스파팅 실험에 사용된 균주들을 이용해 실시예 3의 실험과 마찬가지로 스테롤 정량 분석도 진행한 결과(도 12B), 가장 스테롤 생합성 억제제에 가장 저항성이 높았던 BY-upc2Δ 돌연변이에 YCpH-npUPC2-1 벡터를 넣은 균주에서 가장 높은 스테롤 생합성 수준을 나타내었다. 또한, BY4742 야생형과 BY-upc2Δ 돌연변이에 공벡터를 넣은 균주들은 비슷한 수준의 가장 낮은 스테롤 생합성 수치를 나타냈으며, 야생형 UPC2 유전자와 UPC2-1 유전자를 함께 발현하는 WT+YCpH-npUPC2-1 균주와 크리스퍼 시스템을 통해 얻은 UPC2-1 변이 교체 균주(Cas9)의 스테롤 수치가 비슷한 결과를 확인하였다. 추가로, 스파팅 실험을 진행하면서, 야생형, BY-upc2Δ 돌연변이에 YCpH-npUPC2-1 벡터를 가지는 균주(upc2+YCpH-npUPC2-1)들의 경우, 기준 조건인 SC-H 배지에서 공벡터가 들어간 균주들보다도 낮은 성장 정도를 확인하였다.

실시예 9 : UPC2-1 유전자 교체 균주의 성장 억제 현상 유무 확인

야생형 균주에 크리스퍼 시스템을 적용하여 제작된 UPC2-1 변이 교체 균주(Cas9)의 경우, YCpH-npUPC2-1 벡터를 가진 야생형(WT+2-1) 및 upc2Δ 돌연변이(upc2+2-1) 균주들이 보여준 SC-H 배지에서 성장이 억제되는 현상이 나타나지 않았다. 이를 확인하고자 SC-H 배지에서의 성장 곡선 및 최종 성장 정도를 확인하였다(도 13A). 결과, 스파팅 실험과 마찬가지로 야생형, upc2Δ 돌연변이 균주에 YCpH-npUPC2-1 벡터를 가지는 균주(upc2+YCpH-npUPC2-1)들은 SC-H 배지에서 성장 정도가 공벡터가 들어간 기준 균주들보다 약 10-30%까지 낮게 나타났다. 반면에 UPC2-1 변이 유전자 교체 균주의 경우 오히려 공벡터가 들어간 기준 균주들보다 비슷하거나 더 높은 성장정도를 나타내는 것을 확인하였다.

담마레네디올을 생산 균주인 EmD/tHle7에서도 성장 정도를 비교해본 결과, YCpH-npUPC2-1 벡터가 빠져나올 수 있는 조건인 SC-L 배지에서는 공벡터가 들어간 균주(Em+EV)가 가장 높은 성장을 보였으며, 벡터가 배양 중간에 빠져나가 기능을 하지 못함으로서 YCpH-npUPC2-1 벡터를 가지는 균주(Em+2-1)가 그 다음 성장 정도를, UPC2-1 변이 유전자 교체 균주(Em+Cas)가 가장 낮은 성장을 보였다(도 13B). 다만 OD 값 1 내로 큰 차이는 나지 않았다. 벡터가 빠져나오지 않는 조건인 SC-LUTH 배지에서의 성장 결과, 공벡터를 가지는 균주가 여전히 가장 높은 성장을 나타내었으며, UPC2-1 변이 유전자 교체 균주가 그 다음 순서, YCpH-npUPC2-1 벡터를 가지는 균주가 가장 낮은 성장을 나타내었다(도 13C). 이 결과를 통해, 세포당 스테롤 생합성은 YCpH-npUPC2-1 벡터를 가지는 균주들이 높지만 성장억제 현상이 나타나며, UPC2 -1 변이 유전자 교체 균주는 스테롤 생합성 효과도 존재하면서 성장에서 억제 효과가 거의 발견되지 않는 장점이 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13399BP

20171120

한국생명공학연구원

KCTC13400BP

20171120

한국생명공학연구원

KCTC13401BP

20171120

한국생명공학연구원

KCTC13404BP

20171124

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation Intelligent Synthetic Biology Center <120> Expression vectors for optimal expression of mutated Upc2p and method for overproducing sterol precursors using the same <130> ADP-2018-0372 <150> KR 10-2017-0182422 <151> 2017-12-28 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2739 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 atgagcgaag tcggtataca gaatcacaag aaagcggtga caaaacccag aagaagagaa 60 aaagtcatcg agctaattga agtggacggc aaaaaggtga gtacgacttc aaccggtaaa 120 cgtaaattcc ataacaaatc aaagaatggg tgcgataact gtaaaagaag aagagttaag 180 tgtgatgaag ggaagccagc ctgtaggaag tgcacaaata tgaagttgga atgtcagtat 240 acaccaatcc atttaaggaa aggtagagga gcaacagtag tgaagtatgt cacgagaaag 300 gcagacggta gcgtggagtc tgattcatcg gtagatttac ctcctacgat caagaaggag 360 cagacaccgt tcaatgatat ccaatcagcg gtaaaagctt caggctcatc caatgattcc 420 tttccatcaa gcgcctctac aactaagagt gagagcgagg aaaagtcatc ggcccctata 480 gaggacaaaa acaatatgac tcctctaagt atgggcctcc 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Ala Cys Arg Lys Cys Thr Asn Met Lys Leu Glu Cys Gln Tyr 65 70 75 80 Thr Pro Ile His Leu Arg Lys Gly Arg Gly Ala Thr Val Val Lys Tyr 85 90 95 Val Thr Arg Lys Ala Asp Gly Ser Val Glu Ser Asp Ser Ser Val Asp 100 105 110 Leu Pro Pro Thr Ile Lys Lys Glu Gln Thr Pro Phe Asn Asp Ile Gln 115 120 125 Ser Ala Val Lys Ala Ser Gly Ser Ser Asn Asp Ser Phe Pro Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Thr Lys Ser Glu Ser Glu Glu Lys Ser Ser Ala Pro Ile 145 150 155 160 Glu Asp Lys Asn Asn Met Thr Pro Leu Ser Met Gly Leu Gln Gly Thr 165 170 175 Ile Asn Lys Lys Asp Met Met Asn Asn Phe Phe Ser Gln Asn Gly Thr 180 185 190 Ile Gly Phe Gly Ser Pro Glu Arg Leu Asn Ser Gly Ile Asp Gly Leu 195 200 205 Leu Leu Pro Pro Leu Pro Ser Gly Asn Met Gly Ala Phe Gln Leu Gln 210 215 220 Gln Gln Gln Gln Val Gln Gln Gln Ser Gln Pro Gln Thr Gln Ala Gln 225 230 235 240 Gln Ala Ser Gly Thr Pro Asn Glu Arg Tyr Gly Ser Phe Asp Leu Ala 245 250 255 Gly Ser Pro Ala Leu Gln Ser Thr Gly Met Ser Leu Ser Asn Ser Leu 260 265 270 Ser Gly Met Leu 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Gly Gly Ser Ala Ser Ile Met Glu Pro Gln Ala Ala 485 490 495 Asp Ala Val Ser Thr Met Ala Pro Ile Ser Met Ile Glu Arg Asn Met 500 505 510 Asn Arg Asn Ser Asn Ile Ser Pro Ser Thr Pro Ser Ala Val Leu Asn 515 520 525 Asp Arg Gln Glu Met Gln Asp Ser Ile Ser Ser Leu Gly Asn Leu Thr 530 535 540 Lys Ala Ala Leu Glu Asn Asn Glu Pro Thr Ile Ser Leu Gln Thr Ser 545 550 555 560 Gln Thr Glu Asn Glu Asp Asp Ala Ser Arg Gln Asp Met Thr Ser Lys 565 570 575 Ile Asn Asn Glu Ala Asp Arg Ser Ser Val Ser Ala Gly Thr Ser Asn 580 585 590 Ile Ala Lys Leu Leu Asp Leu Ser Thr Lys Gly Asn Leu Asn Leu Ile 595 600 605 Asp Met Lys Leu Phe His His Tyr Cys Thr Lys Val Trp Pro Thr Ile 610 615 620 Thr Ala Ala Lys Val Ser Gly Pro Glu Ile Trp Arg Asp Tyr Ile Pro 625 630 635 640 Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Pro Phe Leu Met His Ala Leu Leu Ala Phe 645 650 655 Ser Ala Thr His Leu Ser Arg Thr Glu Thr Gly Leu Glu Gln Tyr Val 660 665 670 Ser Ser His Arg Leu Asp Ala Leu Arg Leu Leu Arg Glu Ala Val Leu 675 680 685 Glu Ile Ser Glu Asn 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360 cgtagaaatt cctacgatag ttattagtcc taattggatg ttgcagcaag gctcattgtc 420 ggtgtcgtta tcga 434 <210> 6 <211> 885 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 tgatagaaaa tttaaaagtg cagaatattc gaaatagatt cccaaaaaaa aaaaaaggga 60 tattgtgtta cccagttcac aatggaattt tctagaagaa aaaacaaaga agcctcgcaa 120 caaaccaaga tggattcaaa atgcctactt accgcattgt atgtgggaga atgaacatat 180 ctgtaattgt attatataaa agtagttagt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240 ttatgtgtaa tgcaaataca aaaagaactg caggcatttt gaaagttcac tcgtatagga 300 aactttgata gagaggcaat tccttacttt cgttattcct ttcagtctta ttcttaatcg 360 tttatagtag caacaatata tcaatatggt cgtgaataac ccaaataact ggcactgggt 420 cgataagaac tgcatcggat gggccaagga gtatttcaaa cagaaactgg ttggagtgga 480 ggccggttcg gtgaaggata aaaagtatgc caaaatcaag tctgtttcgt ccattgaagg 540 tgattgtgaa gttaatcagc gtaaggggaa ggttatatct ttgtttgatt tgaaaatcac 600 ggtgttaata gagggacacg tggactctaa ggacggatcg gcattgccat tcgagggtag 660 cattaacgtt cctgaagttg ccttcgatag cgaggcctca agctatcaat ttgacatatc 720 tatatttaag gagactagcg aattgagtga agccaagcca ctaattagat ccgagttatt 780 gcccaagttg agacaaattt tccaacaatt tggcaaggat ttgctggcca cccatggtaa 840 tgacattcag gtgcccgaat ctcaggtgaa atctaactac acaag 885 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 7 gacgaataca gtggaggtgg 20 <210> 8 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Donor DNA <400> 8 tgctgcctca agatgttgac gaatacagtg gaggtggtga tatgcatatg atgctagatt 60 tcctcggtgg cggattac 78

Claims

UPC2 프로모터 유전자, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 유래 Upc2p의 리간드 결합 도메인 부위가 변이된, 서열번호 1로 표시되는 UPC2 변이 유전자, GAL7 종결 유전자 및 HIS3 마커 유전자를 순서대로 포함하며, CEN 기반의 1~2 카피의 낮은 카피수로 복제되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
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제1항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애 재조합 균주.
제4항에 있어서, 상기 재조합 균주는 UPC2 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비시애 균주를 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 재조합 균주로서, KCTC 13401BP로 기탁되고, 총 콜레스테롤 생산이 증진된 사카로마이세스 세레비시애 BY-upc2Δ/npUPC2-1 재조합 균주.
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제5항에 따른 사카로마이세스 세레비시애 BY-upc2Δ/npUPC2-1 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 총 콜레스테롤 생산 증진 방법.
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제1항에 따른 재조합 발현벡터로 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올을 생산하는 사카로마이세스 세레비시애 균주를 형질전환시킨 재조합 균주로서, KCTC 13400BP로 기탁되고, 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올 생산이 증진된 사카로마이세스 세레비시애 EmD/tHle7/npUPC2-1 재조합 균주.
제10항에 있어서, 상기 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올을 생산하는 사카로마이세스 세레비시애 균주는 KCTC 13399BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비시애 E_mD/tH1e7 균주인 것을 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비시애 EmD/tHle7/npUPC2-1 재조합 균주.
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제10항 또는 제11항에 따른 사카로마이세스 세레비시애 EmD/tHle7/npUPC2-1 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 에폭시스쿠알렌 및 담마레네디올 생산 증진 방법.
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