DE19941768A1 - Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in der Kaliumaufnahme - Google Patents

Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in der Kaliumaufnahme

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Abstract

Gegenstand der Erfindung sind Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in den Kaliumtransportproteinen TKHp und Trk2. DOLLAR A Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamm, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG), aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert sowie ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des HERG Kaliumionen-Kanals, einschließlich: DOLLAR A a) Die Behandlung des Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamms, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutationsform dieses Kaliumionen-Kanals, aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert mit Testsubstanzen, DOLLAR A b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz, DOLLAR A c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.

Description

Die Erfindung betrifft Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs I.
Beschreibung
Gegenstand der Erfindung sind Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in der Kaliumaufnahme, deren Verwendung zur Expression von Kaliumionen Kanälen sowie Prozesse zur Identifizierung von Inhibitoren und/oder Aktivatoren solcher Kaliumkanalproteine.
Die Hefe Schizosaccharomyces pombe nimmt als einzelliger Eukaryont Kalium aus der extrazellulären Umgebung auf und akkumuliert dieses Kation intrazellulär bis zu einer Konzentration von 180 mM (180 µmol/µl Zellwasser). Diese Kaliumaufnahme geschieht auch unter Bedingungen, in denen die extrazelluläre Konzentration von Kalium unter 30 µM sinkt.
Verantwortlich für diesen einwärts gerichteten Kaliumtransport ist u. a. ein in der Plasmamembran dieser Hefe lokalisiertes Transportprotein TKHp (Transporter von Kalium und Protonen H+). Die Kaliumaufnahme und Kaliumtransportfunktion des Schizosaccharomyces pombe Proteins TKHp ist beispielsweise beschrieben in:
  • - Lichtenberg-Fraté, H., Reid, J. D., Heyer, M., Höfer, M. (1996). J. Membrane Biol. 152: 169-181
Ein Schizosaccharomyces pombe Hefestamm mit einer Mutation im TKHp ist im Vergleich zu dem Wildstamm weiterhin in der Lage auf Medien mit so geringen extrazellulären Kaliumkonzentrationen wie 1 mM oder weniger im Kulturmedium gut zu wachsen, wie z. B. beschrieben in:
  • - Balcells et al., (1999) Eur. J. Biochem. 260: 31-37
Vom Sanger Center, Cambridge, England wurde 1997 aus dem Gesamtgenom der Hefe Schizosaccharomyces pombe ein vermutliches Gen SPAC1F5.12 (Chromosom I, Cosmid C1F5, offener Leserahmen 12) veröffentlicht,
  • - http://www.sanger.ac.uk/yeast/home.html
dessen abgeleitete Aminosäuresequenz hohe Ähnlichkeit (37%) mit dem Kaliumaufnahme­ protein TKHp aus Schizosaccharomyces pombe aufweist. Dieses Gen ist bisher nicht isoliert und/oder funktionell charakterisiert worden.
Das bisher bekannte und zur Kaliumaufnahme notwendige Transportprotein TKHp und das vermutete zweite Kaliumtransportprotein aus Schizosaccharomyces pombe gehören aufgrund der hohen Homologie sowohl auf Nukleinsäure- als auch auf Aminosäureebene zu einer phylogenetisch konservierten Klasse von Kaliumtransportproteinen (Transporter von Kalium), deren nächst verwandte Mitglieder in der Hefe Saccharomyces cerevisiae beschrieben wurden, z. B. in:
  • - Rodriguez-Navarro, A. and Ramos, J. (1984). J. Bacteriol. 159: 940-945
  • - Gaber, R. F., Styles, C. A. and Fink, G. R. (1988). Mol. Cell. Biol. 8: 2848-2859
  • - Ko, C. and Gaber, R. F. (1991). Mol. Cell. Biol. 11: 4266-4273
Aus einer Vielzahl von Spezies wurden durch die Anwendung von molekularbiologischen Techniken eine Reihe von Kaliumkanälen isoliert. Allgemein sind Ionenkanäle Transmembranproteine, die selektiv den Fluß bestimmter, spezifischer Ionen durch Membranen vermitteln. Unter den bisher bekannten Ionenkanälen stellen Kaliumkanäle (K+-Kanäle) die zahlreichste und heterogenste Gruppe dar. Sowohl in erregbaren als auch in nicht-erregbaren Zellen sind sie ihr die Aufrechterhaltung des Ruhepotentials verantwortlich. Die durch Kaliumionen-Kanäle vermittelten Auswärtsströme sind die Grundlage sowohl der Form und Frequenz als auch der Repolarisierung von Aktionspotentialen in erregbarem Gewebe. Kaliumionen-Kanäle sind ubiquitäre Membranproteine mit einer erstaunlichen Vielfalt elektrischer Eigenschaften, wobei viele der "klassischen" spannungsabhängigen K+- Kanäle der sogenannte Kv-Familie (Abkürzung v ihr voltage = spannungsabhängig) zugeordnet werden.
Während der letzten Jahre demonstrierten eine Reihe von Arbeiten eine Anzahl menschlicher Krankheiten als Resultat von Mutationen in für Kaliumionen-Kanäle kodierenden Genen. So verursacht z. B. eine Punktmutation im Kaliumkanal Kv1.1 die Episodische Ataxie wie beschrieben in:
  • - Adelmann, J. P., Bond, C. T., Pessia, M. and Mylie, J. (1995). Neuron 15: 1449-1454
Das LQT Syndrom ist eine Krankheit, die die ventrikuläre Repolarisation betrifft. Eine verzögerte Repolarisation ventrikulärer Myocyten verursacht eine Verlängerung des QT Intervalls im Elektrokardiogramm (EKG). Das LQT Syndrom wird meist als autosomal dominante oder rezessive Krankheit vererbt. Wenn die ventrikulären Arrythmien zur Fibrillation degenerieren kann plötzlicher Tod die Folge sein.
In diesem Zusammenhang ist die Rolle des humanen erg (human eag related gene, HERG) Kaliumionen-Kanals im Herzen von besonderem Interesse. In ventriculären Myocyten sind repolarisierende Kaliumströme, genannt "delayed rectifier", aktiv, die sich aus mehreren Komponenten zusammensetzen. Diese multiplen Komponenten werden anhand der Geschwindigkeit ihrer Aktivierung (schnell = rapid = IKr; langsam = slow = IKs) und ihrer unterschiedlichen Pharmakologie unterschieden. Die schnelle Komponente IKr wird durch Klasse III anti-arrythmische Agentien wie D-Solatol, Dofetilid und Clofilium blockiert. Die durch den HERG Kaliumionenkanal-Kanal vermittelten Ströme entsprechen der in isolierten Herzmuskelzellen gemessenen schnellen IKr Komponente des "delayed rectifier", wie beschrieben in:
  • - Lees-Miller, J. P., Kondo, C., and Wang, L. (1997). Circ. Res. 81: 719-723
HERG vermittelte Kaliumionenströme tragen zur Verkürzung der Aktionspotentiale bei schnellerer Herzschlagrate bei. Mutationen in HERG verursachen eine erbliche Form der polymorphen ventrikulären Arrhythmie (torsades des pointes), auch bekannt als LQT2 Syndrom, wie beschrieben in:
  • - Sanguinetti, M. C., Jiang, C., Curran, M. E., and Keating, M. T. (1995). Cell 81: 299-307
  • - Curran, M. E., Splaski, I., Timothy, K. W., Vincent, G. M., Green, E. D. and Keating, M. T. (1995). Cell 80: 795-803
  • - Keating, M. T. and Sanguinetti, M. C. (1996). Science 272: 681-685
Ein weiteres Syndrom (LQT1) wird durch einen Defekt im Kaliumionen-Kanal Gen Kv-LQT1 bedingt, wie beschrieben in:
  • - Wang, Q., M. E. Curran, I. Splawski, T. C. Burn, J. M. Millholland, T. J. VanRaay, J. Shen, K. W. Timothy, G. M. Vincent, T. de Jager, P. J. Schwartz, J. A. Toubin, A. J. Moss, D. L. Atkinson, G. M. Landes, T. D. Connors & M. T. Keating (1996). Nat. Genet 12: 17-23
Kaliumionen-Kanal Modulatoren sind daher wertvolle pharmakologische Agentien mit therapeutischer Anwendung. Hoch-selektive Blocker (Toxine) und/oder Aktivatoren sind nur für eine relativ begrenzte Anzahl von Kaliumionen-Kanälen bekannt. Traditionell werden die meisten pharmakologisch wirksamen Substanzen und agrochemischen Produkte durch Massen-Durchmusterung chemischer oder natürlicher Banken entdeckt. Neue Substanzen werden üblicherweise in stabilen, Kaliumionen-Kanal Gene exprimierenden Säugerzellinien getestet. Jedoch ist dieses Verfahren durch das Vorhandensein endogener Kanäle in den verwendeten Zellinien erschwert und für biotechnologische Zwecke (homologe und heterologe Expression von Kaliumionen-Kanälen) verständlicherweise nicht geeignet. Die Nachteile zur Verwendung tierischer Zellinien sind insbesondere:
  • - Die Kultivierung tierischer Zellinien ist wesentlich komplizierter, finanziell aufwendig sowie kontaminationsanfällig.
  • - Homolog und/oder heterolog exprimierte Kaliumionen-Kanäle beeinflussen das Wachstum tierischer Zellinien nicht,
  • - Das Vorhandensein endogener Kaliumionen-Kanäle erschwert die Auswertung der experimentellen Daten.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, diese Nachteile zu vermeiden und Schizosaccharomyces pombe Hefestämme als alternatives Expressionssystem zur funktionellen Expression von Kaliumionen-Kanal Genen zu entwickeln und zur Verfügung zu stellen. In der Biotechnologie besteht ein Bedarf an gut wachsenden Hefewirtsstämmen für die heterologe Expression von Kaliumionen-Kanal Genen aus höheren Eukaryonten. Insbesondere besteht ein Bedarf an stabilen Hefewirtsstämmen für die heterologe Expression von in menschlichen Krankheiten involvierten, Kaliumionen transportierenden Kaliumionen- Kanal Genen für pharmakologische Zwecke.
Diese Aufgabe wird durch einen genetisch modifizierten Schizosaccharomyces pombe Hefestamm gelöst, erhältlich durch die Einführung eines oder mehrerer selektiver Marker (Auxotrophie und/oder Resistenzen), der die Nukleinsäuresequenz für ein humanes erg Kaliumionen-Kanalprotein (HERG) oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutationsform dieses Kaliumionen-Kanalproteins exprimiert, aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamm, der Mutationen in den Kaliumtransportproteinen TKHp und Trk2 beinhaltet. Das vermutete, aber bisher nicht charakterisierte Schizosaccharomyces pombe Gen SPAC1F5.12 (Chromosom I, Cosmid C1F5, offener Leserahmen 12) wurde Trk2 benannt und das Genprodukt (Protein) auf seine Kaliumtransportfunktion hin funktionell analysiert. Zum Erhalt des doppelt-mutanten Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamm wurden beide Kaliumtransportproteine sukzessive durch gezielte Gendeletion und Gendisruption ausgeschaltet. Der erzeugte doppelt-mutante Hefewirtsstamm mit Defekten in der Kaliumaufnahme zeigt Wachstumsdefekte auf Kulturmedien mit minimalen Kaliumkonzentrationen von 1 mM oder weniger. Im Vergleich zum Schizosaccharomyces pombe Wildstamm bedarf dieser mutante Hefewirtsstamm eines Zusatzes von mindestens 50 mM Kalium im Kulturmedium um vergleichbar gut zu wachsen.
Die selektierbaren biosynthetischen Markergene (Auxotrophiebedürfnisse und/oder Resistenzen) können durch rekombinante DNS Techniken in die Loci der Wildtyp Kaliumtransportergene eingeführt werden. Geeignete selektierbare Marker sind z. B. die Auxotrophiemarker Ura4, His7, ade2 und LEU2 oder Gene, die eine Resistenz z. B. gegen Kupfer (CUP1 Gen) oder G418 (Aminoglycosid Phosphotransferase Gen) bewirken. Solche modifizierten Allele können dann in Hefe transformiert werden, wo sie durch homologe Rekombination die Wildtyp Loci ersetzen. Die modifizierten Allele können durch Selektion auf den oder die biosynthetischen Marker ermittelt werden. Die in die Loci der Kaliumtransporter eingeführten selektierbaren biosynthetischen Marker stellen außerdem einen einfachen Weg zum Transfer dieser Mutationen in genetisch andere Linien dar (Kreuzung). Ein Stamm, der eine Mutation in einem Kaliumtransportergen (z. B. TKHp) beinhaltet, kann mit einem Stamm des entgegengesetzten Paarungstyps, der eine Mutation in einem anderen Kaliumtranportergen (z. B. Trk2) trägt, gekreuzt werden. Die Nachkommenschaft kann dann auf die Anwesenheit beider biosynthetischer Marker hin selektiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamm der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG), aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert sowie ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des HERG Kaliumionen-Kanals, einschließlich:
  • a) Die Behandlung des Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamms, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutationsform dieses Kaliumionen-Kanals aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert mit Testsubstanzen,
  • b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz,
  • c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.
Dieses Verfahren ist zur Identifizierung spezifischer Modulatoren des HERG Ionenkanals geeignet.
Der Wachstumsdefekt des mutanten Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamms kann zur Isolierung und Anreicherung von Kaliumionen-Kanalgenen aus Genbibliotheken (z. B. humane cDNS Bibliotheken) verwendet werden, wenn die exprimierten Gene die Mutationen in dem doppelt-mutanten Hefewirtsstamm komplementieren und ein Wildtypphänotyp hinsichtlich der benötigten Kaliumkonzentration resultiert. Damit können Kaliumionen-Kanäle identifiziert werden, die zwar physiologisch beschrieben, aber bisher noch nicht isoliert wurden. Alternativ können verschiedene Kaliumionen-Kanäle in die Doppel-Mutante eingeführt werden, um zu testen, ob der Wachstumsdefekt auf Kalium limitierten Medien komplementiert wird. Der Schizosaccharomyces pombe Wildtypphänotyp kann durch Auswahl derjenigen Stämme, welche nach Transformation, Selektion und nach Anzucht unter Bedingungen von 10 mg/l Kalium im Kulturmedium ermittelt werden.
Jede dieser Anwendungen resultiert in einem Hefestamm, der heterolog einen fremden Kaliumionen-Kanal exprimiert und zur Durchmusterung von Modulatoren des betreffenden Kaliumionen-Kanals verwendet werden kann. Ein Hefestamm, der heterolog einen fremden Kaliumionen-Kanal exprimiert, kann in einfachen Verfahren zur Durchmusterung verschiedener Testsubstanz-Bibliotheken verwendet werden. Diese einfache Verfahren, in denen Wachstumsveränderungen oder gesteigerte und/oder verminderte Kaliumaufnahme durch Agarplattentests und/oder in Flüssigkultur beobachtet werden kann, können somit spezifische Substanzen detektieren, die die Kaliumionen-Kanal Funktion modulieren. Zur Durchmusterung auf Aktivatoren einer Kaliumionen-Kanal Funktion kann das Durchmusterungsverfahren solche Veränderungen wie metabolische Aktivität, gesteigerte Wachstumsrate oder gesteigerte Kaliumionen Aufnahme beinhalten. Zur Durchmusterung auf Inhibitoren einer Kaliumionen-Kanal Funktion kann das Durchmusterungsverfahren solche Veränderungen wie verminderte Wachstumsrate oder verminderte Kaliumionen Aufnahme beinhalten. Die Testsubstanzen, die im Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren eingesetzt werden, können z. B. synthetische oder natürliche Produkte sein. Natürliche Produkte beinhalten pflanzliche, tierische oder mikrobielle Extrakte.
In Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der genomischen Fragmente, die die Wildtyp TKHp und Trk2 Loci enthalten sowie die entsprechenden mutierten Allele trk1::LEU2, trk2::Ura4 und trk2::adhHerg/Ura4 dargestellt. Die TKHp und Trk2 kodierenden Regionen sind durch schwarze Balken gekennzeichnet. Die mutanten Allele wurden zum Ersatz der entsprechenden Wildtyp Loci in Schizosaccharomyces pombe Stämme transformiert.
In Fig. 2 ist die abgeleitete Aminosäure- (SEQ. ID. NO. 2) und die Nukleinsäure­ sequenz (SEQ. ID. NO. 1) des Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransportproteins TKHp dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobene Region entspricht der deletierten und durch den biosynthetischen Marker LEU2 ersetzten Sequenz.
In Fig. 3 ist die abgeleitete Aminosäure- (SEQ. ID. NO. 4) und die Nukleinsäure­ sequenz (SEQ. ID. NO. 3) des Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransportproteins Trk2 dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobene Region entspricht der Eco RV Stelle, in die der biosynthetische Marker Ura4 eingeführt wurde.
In Fig. 4 ist die Nukleinsäure- (SEQ. ID. NO. 5) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NO. 6) des humanen erg Gens (HERG) dargestellt. Die Sequenz entspricht der in der Originalpublikation von Trudeau, M. C., Warmke, J. W., Ganetzky, B. and Robertson, G. (1995). Science 269: 92-95 beschriebenen.
In Fig. 5 ist das Wachstum der erzeugten Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransport defekten Mutanten in Abhängigkeit von der Kaliumkonzentration im Kulturmedium gezeigt. Die Stämme wurden auf Vollmedium, pH 4.5 bei 30°C über Nacht angezogen und anschießend auf 100 mM, 10 mM und 1 mM Kalium enthaltende Agarplatten replika-plattiert. Die Platten wurden bei 30°C für zwei Tage inkubiert. Der Schizosaccharomyces pombe Hefestamm mit Defekten in beiden Kaliumtransportproteinen (Doppel-Mutante) wächst unter Bedingungen von 1 mM Kalium im Medium nicht.
Fig. 6 zeigt das Wachstum vom Schizosaccharomyces pombe Wildstamm, der Kaliumtransport Doppel-Mutante sowie den modifizierten Hefestamm, der das humane erg Gen (HERG) exprimiert auf 100 mM, 10 mM und 1 mM Kalium enthaltenden Agarplatten. Die Platten wurden bei 30°C für zwei Tage inkubiert. Im Gegensatz zur Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransport Doppel-Mutante ist der das humane erg Gen (HERG) exprimierende Stamm in der Lage, auf 1 mM Kalium im Medium zu wachsen.
In Fig. 7 ist die Wirkung bekannter Inhibitoren des HERG Kaliumionen-Kanals dargestellt. Der HERG exprimierende modifizierte Schizosaccharomyces pombe Stamm wurde auf Vollmedium, pH 4.5 bei 30°C über Nacht angezogen und anschießend auf 1 mM Kalium enthaltende Agarplatten in der Gegenwart von 1 mM Barium, 1 mM Cäsium und 40 µM Lanthan replika-plattiert. Durch die Inhibierung des heterolog exprimierten Gens kann der modifizierte Schizosaccharomyces pombe Stamm mit Defekten in beiden Kaliumtransportproteinen nicht mehr wachsen.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiele Allgemeine Methoden Rekombinante DNA Technik
Zur Anreicherung und Manipulation von DNA wurden Standartmethoden benutzt, wie sie bei Sambrook, J. et al., In: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), beschrieben sind. Die verwendeten molekularbiologischen Reagenzien wurden nach den Angaben der Hersteller eingesetzt.
Hefetransformation
Schizosaccharomyces pombe Stämme wurden entsprechend der Methode, wie sie von Moreno, S. et al., (1991) Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology 194: 795-824, beschrieben sind, transformiert.
Beispiel 1 1.1 Konstruktion der Schizosaccharomyces pombe Mutante tkh
Die Mutation in dem Schizosaccharomyces pombe Kaliumionen-Transporter TKHp wurde in dem Plasmid pFL61SPT1, das die kodierende Nukleinsäuresequenz mit 2958 Basenpaaren (bp) für diesen Transporter enthält, wie beschrieben in Lichtenberg-Fraté, H., Reid, J. D., Heyer, M., Höfer, M. (1996). J. Membrane Biol. 152: 169-181, durchgeführt.
In dem Gen wurde eine 1102 bp Deletion in der kodierenden Region durch Spaltung mit der Restriktions-endonuklease Hind II eingeführt. Die DNS Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt und das größere Fragment (6684 bp), das die restlichen Transportersequenzen sowie Vektoranteile enthielt isoliert und gereinigt. Zum Erhalt einer Deletions/Insertionsmutation wurde das LEU2 Sma I/Hind II Gen aus Saccharomyces cerevisiae als biosynthetischer Marker durch Ligation mit dem TKH Restfragment eingeführt. Das resultierende mutante Allel tkh::LEU2 (Fig. 1) wurde als lineares Not I Konstrukt zur Transformation des Schizosaccharomyces pombe Wildstammes h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 verwendet. Die Auswahl erfolgreich transformierter Kolonien erfolgte durch die Selektion auf Leucin Prototrophie. Die Bestätigung der durch homologe Rekombination eingeführten Mutation im Kaliumtransporter TKHp erfolgte durch Restriktionsspaltung genomischer Schizosaccharomyces pombe DNS und Southern blot Hybridisierung, wie beschrieben in Sambrook, J. et al., In: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).
Der durch Mutation des Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransporters TKHp resultierende mutante Phänotyp (Genotyp h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2) wächst im Vergleich zum Wildstamm auf Kalium limitierten Medien gleich gut (Fig. 5). Daher wurde die Aktivität eines weiteren spezifischen Kaliumtransporters in dieser Schizosaccharomyces pombe Mutante postuliert.
1.2 Konstruktion der Schizosaccharomyces pombe Mutante trk2
Zur Konstruktion der Schizosaccharomyces pombe Mutante trk2 wurde mit den Oligonukleotiden SpTRK2#5 5' CAC GGA TCC ACA GAT TTT ATC ATG CAG TTA TCG GGT TTT TCT ACA AAC GGT TCC 3' (SEQ. ID. NO. 7) welches der 5' kodierenden Region des Start-Codons ATG entspricht (Position -21 bis +33), und SpTRK2#H3 5' CGC GAA AGA AGC TTG GGC GA 3' (SEQ. ID. NO. 8) welches komplementär zur 3' kodierenden Region der Hind III Restriktionsstelle an Position 625 ist (Position +593 bis +612), ein 625 bp langes Fragment durch die Polymerase-Ketten-Reaktion aus genomischer DNS der Schizosaccharomyces pombe Mutante h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2 amplifiziert. Nach Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Bam HI und Hind III wurde dieses Fragment mit dem entsprechend gespaltenem bakteriellen Plasmidvektor pBSKII (Firma Stratagene, Heidelberg) ligiert. Im resultierenden Plasmid pBT2 wurde durch Sequenzierung das 625 bp Teilfragment des Kaliumtransporters Schizosaccharomyces pombe Trk2 bestätigt. Das erhaltene Konstrukt wurde durch Spaltung mit der Restriktionsendonuklease Eco RV an Position 246 im Trk2 Genfragment linearisiert und das die Disruptions/Insertionsmutation durch Ligation des Ura4 Sma I/Hind II Gens aus Schizosaccharomyces pombe als biosynthetischer Marker eingeführt (Fig. 1). Das gewünschte Plasmid (pBT2URA), das das mutante Allel trk2::Ura4 enthält, wurde durch Restriktionskartierung und Polymerase-Ketten-Reaktion mit den o. g. Oligonukleotiden als 2.3 kb Fragment bestätigt. Das erhaltene mutante Allel trk2::Ura4 (Fig. 1) wurde als lineares Bam HI/Kpn I Konstrukt zur Transformation des Schizosaccharomyces pombe Wildstammes (h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31) verwendet. Die Transformation des Wildstammes führte zum Erhalt einer Schizosaccharomyces pombe Mutante in der singulär der Kaliumtransporter Trk2 (Genotyp h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 trk2::Ura4) disruptiert ist. Die Selektion positiver Transformanten erfolgte auf die Uracil Prototrophie hin. Die Bestätigung der durch homologe Rekombination eingeführten Mutation im Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransporter Trk2 erfolgte durch Southern blot Hybridisierung.
Nach Mutation des Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransporters Trk2 wurde der resultierende mutante Phänotyp (Genotyp h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 trk2::Ura4) im Vergleich zum Wildstamm-Phänotyp und der Kaliumtransporter Mutante tkh getestet (Fig. 5). Die singuläre Mutation des Kaliumtransporters Trk2 zeigte im Vergleich zum Wildstamm und der Kaliumtransporter Mutante tkh auf Kalium limitierten Medien gleiches Wachstum.
1.3 Konstruktion der Schizosaccharomyces pombe Doppel- Mutante tkh trk2
Das erhaltene mutante Allel trk2::Ura4 (Fig. 1) wurde als lineares Bam HI/Kpn I Konstrukt zur Transformation der Kaliumtransporter Mutante tkh (h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2) verwendet. Die Transformation Mutante tkh führte zum Erhalt einer Schizosaccharomyces pombe Doppel-Mutante in der beide Kaliumtransporter TKHp und Trk2 (Genotyp Mutante (h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2 trk2:: Ura4) deletiert und disruptiert sind. Die Selektion positiver Transformanten erfolgte auf die Leucin und Uracil Prototrophie hin. Die Bestätigung der durch homologe Rekombination eingeführten Mutation im Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransporter Trk2 erfolgte durch Southern blot Hybridisierung.
Die Bestätigung, daß Trk2 der gesuchte weitere Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransporter ist, erfolgte durch Ausplattierung des erzeugten Hefestamms im Vergleich zum Wildstamm und der Kaliumtransporter Mutante tkh auf Kalium limitierten Medien (Fig. 5). Der Phänotyp der Kaliumtransporter Doppel-Mutante tkh trk2 ist dadurch gekennzeichnet, daß Zellen dieses Hefestamms auf Konzentrationen kleiner 1 mM Kalium im Kulturmedium nicht lebensfähig sind.
1.4 Konstruktion des HERG exprimierenden Schizosaccharomyces pombe tkh trk2 Stammes
Das Gen für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) wurde durch Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Bam HI und Eco RI als 3.5 Kilobasenpaar (kb) Fragment aus dem Plasmid pcDNAHERG (erhalten von Dr. G. Robertson, University of Wisonsin, Madison, USA) und Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erhalten.
Zur Transkription eines humanen Gens in der Hefe Schizosaccharomyces pombe ist ein Hefe-eigener Promotor notwendig. Der in Schizosaccharomyces pombe konstitutiv aktive adh Promotor (Alkohol Dehydrogenase Gen) wurde als Sal I/Bam HI Fragment aus dem Plasmid pEVP11, wie beschrieben in Moreno, S. et al., (1991) Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology 194: 795-824, nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese isoliert. In einer Dreifach-Ligation wurden die adh Sal I/Bam HI und HERG Bam HI/Eco RI Fragmente mit dem Sal I/Eco RI gespaltenem Plasmidvektor pBSKII ligiert. Das gewünschte Plasmid pBSKaHerg wurde durch Restriktionskartierung bestätigt. Aus diesem Plasmid wurde ein 4.6 kb adhHerg Verbundfragment durch Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Hinc II und Xba I und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erhalten. In diesem Verbundfragment wurden die überstehenden Nukleotidenden der Xba I Stelle durch DNS Polymerase I aufgefüllt.
In dem Plasmid pBT2URA (siehe 1.2), welches das mutante Allel trk2::Ura4 enthält, wurde mit der Restriktionsendonuklease Eco RI eine Linearisierung an Position 251, direkt vor dem Ura4 Gen durchgeführt, die überstehenden Nukleotidenden der Eco RI Stelle durch DNS Polymerase I aufgefüllt und durch Alkaline Phosphatase dephosphoryliert. Dieses linearisierte Fragment wurde mit dem 4.6 kb adhHerg Verbundfragment ligiert (Fig. 1). Das gewünschte Plasmid wurde Restriktionskartierung identifiziert. Das erhaltene mutante Allel trk2::adhHerg/Ura4 (Fig. 1) wurde als lineares Xba I/Kpn I 7.0 kb Fragment nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese zur Transformation der Kaliumtransporter Mutante tkh (h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2) verwendet. Die Transformation dieser tkh Mutante führte zum Erhalt einer Schizosaccharomyces pombe Doppel-Mutante, in der der Kaliumtransporter TKHp deletiert ist und der Kaliumtransporter Trk2 durch die stabile Einführung des humanen erg Gens (HERG) disruptiert ist. Anstelle des Kaliumtransporters Trk2 wird in diesem Schizosaccharomyces pombe Stamm (Genotyp h- ade6-H210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2 trk2::adhHerg/Ura4) der HERG Kaliumionen-Kanal exprimiert. Die Selektion positiver Transformanten erfolgte auf die Leucin und Uracil Prototrophie hin. Die Bestätigung der durch homologe Rekombination eingeführten stabilen Integration des humanen erg Gens (HERG) an den Schizosaccharomyces pombe Trk2 Locus erfolgte durch RNS Analyse.
Die Expression des HERG Kaliumionen-Kanals den restauriert Phänotyp der Kaliumtransporter Doppel-Mutante tkh trk2 auf Kalium limitierten Medien (Fig. 6). Durch Expression des HERG Kaliumionen-Kanals können Zellen dieses genetisch modifizierten Hefestamms im Gegensatz zur Doppel-Mutante tkh trk2 auf Konzentration kleiner 1 mM Kalium gut wachsen. Die Restaurierung des Wildtyp Phänotyps ist abhängig von der heterologen Expression des HERG Kaliumionen-Kanals, wie anhand der Inhibierung von HERG auf 1 mM Kalium enthaltenden Agarplatten in der Gegenwart von 1 mM Barium, 1 mM Cäsium und 40 µM Lanthan bestätigt (Fig. 7). Durch die Inhibierung des HERG Kaliumionen-Kanals kann der Schizosaccharomyces pombe Stamm mit Defekten in beiden Kaliumtransportproteinen auf der 1 mM Kaliumkonzentration nicht mehr wachsen.
1.5 Wachstumstests auf Kalium limitierten Medien
Kulturen von Schizosaccharomyces pombe Wildstamm, der Kaliumtransport defekten Mutanten tkh, trk2 und tkh trk2 und dem HERG exprimierenden Stamm wurden im Vollmedium YEP (2% yeast extract, 1% peptone) mit 2% D-glucose, pH 4.5 bei 30°C über Nacht unter Schütteln angezogen. Serielle Verdünnungen wurden auf Vollmedium- Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht inkubiert und auf selektive Agarplatten (0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.5% NH4SO4, 2% D-glucose, pH 4.5) mit 100(A), 10(B) oder 1(C) mM KCl replika-plattiert. Diese Platten wurden für 48 Stunden bei 30°C inkubiert.
1.6 Wachstumstests in Gegenwart von Inhibitoren
Kulturen von Schizosaccharomyces pombe Wildstamm, der Kaliumtransport defekten Mutante tkh trk2 und dem HERG exprimierenden Stamm wurden im Vollmedium YEP (2% yeast extract, 1% peptone) mit 2% D-glucose, pH 4.5 bei 30°C über Nacht unter Schütteln angezogen. Serielle Verdünnungen wurden auf Vollmedium-Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht inkubiert und auf selektive Agarplatten (0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.5% NH4SO4, 2% D-glucose, pH 4.5) mit 1 mM KCl und 1 mM Barium (A), 1 mM Cäsium (B) und 40 µM Lanthan (C) replika-plattiert. Diese Platten wurden für 48 Stunden bei 30°C inkubiert.
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Sequenzliste

Claims (8)

1. Schizosaccharomyces pombe Mutanten mit Defekten in der Kaliumaufnahme die erhältlich sind durch Mutation der Kaliumtransporter TKHp und/oder Trk2p, Einführung einer oder mehrerer selektiver Marker (Auxotrophien und/oder Resistenzen),
2. Schizosaccharomyces pombe Mutanten tkh, trk2 und tkh trk2
3. Verwendung der Schizosaccharomyces pombe Mutanten nach Anspruch 1 oder 2 als Wirtsorganismus zur homologen oder heterologen Expression von Kaliumionen Kanälen.
4. Ein genetisch modifizierter Schizosaccharomyces pombe Hefestamm der die Nukleinsäuresequenz für das humane erg Kaliumionen-Kanal Gen (HERG) aber nicht die der Hefe eigenen Kaliumtransporter TKHp und Trk2p exprimiert.
5. Ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des HERG Kaliumionen-Kanals, einschließlich:
  • a) Die Behandlung des Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamms, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutationsform dieses Kaliumionen-Kanals aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert mit Testsubstanzen,
  • b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz,
  • c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.
6. Ein Verfahren nach Anspruch 4 zur Detektion von anti-arrythmische Substanzen.
7. Ein Verfahren nach Anspruch 4 zur Detektion von antifibrillatorische Substanzen.
8. Ein Verfahren nach Anspruch 4 zur Detektion von anti-entzündlichen Substanzen.
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