DE19941768A1 - Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in der Kaliumaufnahme - Google Patents
Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in der KaliumaufnahmeInfo
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Abstract
Gegenstand der Erfindung sind Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in den Kaliumtransportproteinen TKHp und Trk2. DOLLAR A Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamm, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG), aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert sowie ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des HERG Kaliumionen-Kanals, einschließlich: DOLLAR A a) Die Behandlung des Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamms, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutationsform dieses Kaliumionen-Kanals, aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert mit Testsubstanzen, DOLLAR A b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz, DOLLAR A c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.
Description
Die Erfindung betrifft Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme entsprechend dem
Oberbegriff des Anspruchs I.
Gegenstand der Erfindung sind Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit
Defekten in der Kaliumaufnahme, deren Verwendung zur Expression von Kaliumionen
Kanälen sowie Prozesse zur Identifizierung von Inhibitoren und/oder Aktivatoren solcher
Kaliumkanalproteine.
Die Hefe Schizosaccharomyces pombe nimmt als einzelliger Eukaryont Kalium aus der
extrazellulären Umgebung auf und akkumuliert dieses Kation intrazellulär bis zu einer
Konzentration von 180 mM (180 µmol/µl Zellwasser). Diese Kaliumaufnahme geschieht auch
unter Bedingungen, in denen die extrazelluläre Konzentration von Kalium unter 30 µM sinkt.
Verantwortlich für diesen einwärts gerichteten Kaliumtransport ist u. a. ein in der
Plasmamembran dieser Hefe lokalisiertes Transportprotein TKHp (Transporter von Kalium
und Protonen H+). Die Kaliumaufnahme und Kaliumtransportfunktion des
Schizosaccharomyces pombe Proteins TKHp ist beispielsweise beschrieben in:
- - Lichtenberg-Fraté, H., Reid, J. D., Heyer, M., Höfer, M. (1996). J. Membrane Biol. 152: 169-181
Ein Schizosaccharomyces pombe Hefestamm mit einer Mutation im TKHp ist im
Vergleich zu dem Wildstamm weiterhin in der Lage auf Medien mit so geringen
extrazellulären Kaliumkonzentrationen wie 1 mM oder weniger im Kulturmedium gut zu
wachsen, wie z. B. beschrieben in:
- - Balcells et al., (1999) Eur. J. Biochem. 260: 31-37
Vom Sanger Center, Cambridge, England wurde 1997 aus dem Gesamtgenom der Hefe
Schizosaccharomyces pombe ein vermutliches Gen SPAC1F5.12 (Chromosom I, Cosmid
C1F5, offener Leserahmen 12) veröffentlicht,
- - http://www.sanger.ac.uk/yeast/home.html
dessen abgeleitete Aminosäuresequenz hohe Ähnlichkeit (37%) mit dem Kaliumaufnahme
protein TKHp aus Schizosaccharomyces pombe aufweist. Dieses Gen ist bisher nicht isoliert
und/oder funktionell charakterisiert worden.
Das bisher bekannte und zur Kaliumaufnahme notwendige Transportprotein TKHp und
das vermutete zweite Kaliumtransportprotein aus Schizosaccharomyces pombe gehören
aufgrund der hohen Homologie sowohl auf Nukleinsäure- als auch auf Aminosäureebene zu
einer phylogenetisch konservierten Klasse von Kaliumtransportproteinen (Transporter von
Kalium), deren nächst verwandte Mitglieder in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
beschrieben wurden, z. B. in:
- - Rodriguez-Navarro, A. and Ramos, J. (1984). J. Bacteriol. 159: 940-945
- - Gaber, R. F., Styles, C. A. and Fink, G. R. (1988). Mol. Cell. Biol. 8: 2848-2859
- - Ko, C. and Gaber, R. F. (1991). Mol. Cell. Biol. 11: 4266-4273
Aus einer Vielzahl von Spezies wurden durch die Anwendung von
molekularbiologischen Techniken eine Reihe von Kaliumkanälen isoliert. Allgemein sind
Ionenkanäle Transmembranproteine, die selektiv den Fluß bestimmter, spezifischer Ionen
durch Membranen vermitteln. Unter den bisher bekannten Ionenkanälen stellen Kaliumkanäle
(K+-Kanäle) die zahlreichste und heterogenste Gruppe dar. Sowohl in erregbaren als auch in
nicht-erregbaren Zellen sind sie ihr die Aufrechterhaltung des Ruhepotentials verantwortlich.
Die durch Kaliumionen-Kanäle vermittelten Auswärtsströme sind die Grundlage sowohl der
Form und Frequenz als auch der Repolarisierung von Aktionspotentialen in erregbarem
Gewebe. Kaliumionen-Kanäle sind ubiquitäre Membranproteine mit einer erstaunlichen
Vielfalt elektrischer Eigenschaften, wobei viele der "klassischen" spannungsabhängigen K+-
Kanäle der sogenannte Kv-Familie (Abkürzung v ihr voltage = spannungsabhängig)
zugeordnet werden.
Während der letzten Jahre demonstrierten eine Reihe von Arbeiten eine Anzahl
menschlicher Krankheiten als Resultat von Mutationen in für Kaliumionen-Kanäle
kodierenden Genen. So verursacht z. B. eine Punktmutation im Kaliumkanal Kv1.1 die
Episodische Ataxie wie beschrieben in:
- - Adelmann, J. P., Bond, C. T., Pessia, M. and Mylie, J. (1995). Neuron 15: 1449-1454
Das LQT Syndrom ist eine Krankheit, die die ventrikuläre Repolarisation betrifft. Eine
verzögerte Repolarisation ventrikulärer Myocyten verursacht eine Verlängerung des QT
Intervalls im Elektrokardiogramm (EKG). Das LQT Syndrom wird meist als autosomal
dominante oder rezessive Krankheit vererbt. Wenn die ventrikulären Arrythmien zur
Fibrillation degenerieren kann plötzlicher Tod die Folge sein.
In diesem Zusammenhang ist die Rolle des humanen erg (human eag related gene,
HERG) Kaliumionen-Kanals im Herzen von besonderem Interesse. In ventriculären Myocyten
sind repolarisierende Kaliumströme, genannt "delayed rectifier", aktiv, die sich aus mehreren
Komponenten zusammensetzen. Diese multiplen Komponenten werden anhand der
Geschwindigkeit ihrer Aktivierung (schnell = rapid = IKr; langsam = slow = IKs) und ihrer
unterschiedlichen Pharmakologie unterschieden. Die schnelle Komponente IKr wird durch
Klasse III anti-arrythmische Agentien wie D-Solatol, Dofetilid und Clofilium blockiert. Die
durch den HERG Kaliumionenkanal-Kanal vermittelten Ströme entsprechen der in isolierten
Herzmuskelzellen gemessenen schnellen IKr Komponente des "delayed rectifier", wie
beschrieben in:
- - Lees-Miller, J. P., Kondo, C., and Wang, L. (1997). Circ. Res. 81: 719-723
HERG vermittelte Kaliumionenströme tragen zur Verkürzung der Aktionspotentiale
bei schnellerer Herzschlagrate bei. Mutationen in HERG verursachen eine erbliche Form der
polymorphen ventrikulären Arrhythmie (torsades des pointes), auch bekannt als LQT2
Syndrom, wie beschrieben in:
- - Sanguinetti, M. C., Jiang, C., Curran, M. E., and Keating, M. T. (1995). Cell 81: 299-307
- - Curran, M. E., Splaski, I., Timothy, K. W., Vincent, G. M., Green, E. D. and Keating, M. T. (1995). Cell 80: 795-803
- - Keating, M. T. and Sanguinetti, M. C. (1996). Science 272: 681-685
Ein weiteres Syndrom (LQT1) wird durch einen Defekt im Kaliumionen-Kanal Gen
Kv-LQT1 bedingt, wie beschrieben in:
- - Wang, Q., M. E. Curran, I. Splawski, T. C. Burn, J. M. Millholland, T. J. VanRaay, J. Shen, K. W. Timothy, G. M. Vincent, T. de Jager, P. J. Schwartz, J. A. Toubin, A. J. Moss, D. L. Atkinson, G. M. Landes, T. D. Connors & M. T. Keating (1996). Nat. Genet 12: 17-23
Kaliumionen-Kanal Modulatoren sind daher wertvolle pharmakologische Agentien mit
therapeutischer Anwendung. Hoch-selektive Blocker (Toxine) und/oder Aktivatoren sind nur
für eine relativ begrenzte Anzahl von Kaliumionen-Kanälen bekannt. Traditionell werden die
meisten pharmakologisch wirksamen Substanzen und agrochemischen Produkte durch
Massen-Durchmusterung chemischer oder natürlicher Banken entdeckt. Neue Substanzen
werden üblicherweise in stabilen, Kaliumionen-Kanal Gene exprimierenden Säugerzellinien
getestet. Jedoch ist dieses Verfahren durch das Vorhandensein endogener Kanäle in den
verwendeten Zellinien erschwert und für biotechnologische Zwecke (homologe und
heterologe Expression von Kaliumionen-Kanälen) verständlicherweise nicht geeignet. Die
Nachteile zur Verwendung tierischer Zellinien sind insbesondere:
- - Die Kultivierung tierischer Zellinien ist wesentlich komplizierter, finanziell aufwendig sowie kontaminationsanfällig.
- - Homolog und/oder heterolog exprimierte Kaliumionen-Kanäle beeinflussen das Wachstum tierischer Zellinien nicht,
- - Das Vorhandensein endogener Kaliumionen-Kanäle erschwert die Auswertung der experimentellen Daten.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, diese Nachteile zu vermeiden und
Schizosaccharomyces pombe Hefestämme als alternatives Expressionssystem zur
funktionellen Expression von Kaliumionen-Kanal Genen zu entwickeln und zur Verfügung zu
stellen. In der Biotechnologie besteht ein Bedarf an gut wachsenden Hefewirtsstämmen für
die heterologe Expression von Kaliumionen-Kanal Genen aus höheren Eukaryonten.
Insbesondere besteht ein Bedarf an stabilen Hefewirtsstämmen für die heterologe Expression
von in menschlichen Krankheiten involvierten, Kaliumionen transportierenden Kaliumionen-
Kanal Genen für pharmakologische Zwecke.
Diese Aufgabe wird durch einen genetisch modifizierten Schizosaccharomyces pombe
Hefestamm gelöst, erhältlich durch die Einführung eines oder mehrerer selektiver Marker
(Auxotrophie und/oder Resistenzen), der die Nukleinsäuresequenz für ein humanes erg
Kaliumionen-Kanalprotein (HERG) oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutationsform
dieses Kaliumionen-Kanalproteins exprimiert, aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder
Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamm,
der Mutationen in den Kaliumtransportproteinen TKHp und Trk2 beinhaltet. Das vermutete,
aber bisher nicht charakterisierte Schizosaccharomyces pombe Gen SPAC1F5.12
(Chromosom I, Cosmid C1F5, offener Leserahmen 12) wurde Trk2 benannt und das
Genprodukt (Protein) auf seine Kaliumtransportfunktion hin funktionell analysiert. Zum
Erhalt des doppelt-mutanten Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamm wurden beide
Kaliumtransportproteine sukzessive durch gezielte Gendeletion und Gendisruption
ausgeschaltet. Der erzeugte doppelt-mutante Hefewirtsstamm mit Defekten in der
Kaliumaufnahme zeigt Wachstumsdefekte auf Kulturmedien mit minimalen
Kaliumkonzentrationen von 1 mM oder weniger. Im Vergleich zum Schizosaccharomyces
pombe Wildstamm bedarf dieser mutante Hefewirtsstamm eines Zusatzes von mindestens 50
mM Kalium im Kulturmedium um vergleichbar gut zu wachsen.
Die selektierbaren biosynthetischen Markergene (Auxotrophiebedürfnisse und/oder
Resistenzen) können durch rekombinante DNS Techniken in die Loci der Wildtyp
Kaliumtransportergene eingeführt werden. Geeignete selektierbare Marker sind z. B. die
Auxotrophiemarker Ura4, His7, ade2 und LEU2 oder Gene, die eine Resistenz z. B. gegen
Kupfer (CUP1 Gen) oder G418 (Aminoglycosid Phosphotransferase Gen) bewirken. Solche
modifizierten Allele können dann in Hefe transformiert werden, wo sie durch homologe
Rekombination die Wildtyp Loci ersetzen. Die modifizierten Allele können durch Selektion
auf den oder die biosynthetischen Marker ermittelt werden. Die in die Loci der
Kaliumtransporter eingeführten selektierbaren biosynthetischen Marker stellen außerdem
einen einfachen Weg zum Transfer dieser Mutationen in genetisch andere Linien dar
(Kreuzung). Ein Stamm, der eine Mutation in einem Kaliumtransportergen (z. B. TKHp)
beinhaltet, kann mit einem Stamm des entgegengesetzten Paarungstyps, der eine Mutation in
einem anderen Kaliumtranportergen (z. B. Trk2) trägt, gekreuzt werden. Die
Nachkommenschaft kann dann auf die Anwesenheit beider biosynthetischer Marker hin
selektiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Schizosaccharomyces pombe
Hefewirtsstamm der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal
(HERG), aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine
exprimiert sowie ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des HERG
Kaliumionen-Kanals, einschließlich:
- a) Die Behandlung des Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamms, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutationsform dieses Kaliumionen-Kanals aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert mit Testsubstanzen,
- b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz,
- c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.
Dieses Verfahren ist zur Identifizierung spezifischer Modulatoren des HERG Ionenkanals
geeignet.
Der Wachstumsdefekt des mutanten Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamms
kann zur Isolierung und Anreicherung von Kaliumionen-Kanalgenen aus Genbibliotheken (z.
B. humane cDNS Bibliotheken) verwendet werden, wenn die exprimierten Gene die
Mutationen in dem doppelt-mutanten Hefewirtsstamm komplementieren und ein
Wildtypphänotyp hinsichtlich der benötigten Kaliumkonzentration resultiert. Damit können
Kaliumionen-Kanäle identifiziert werden, die zwar physiologisch beschrieben, aber bisher
noch nicht isoliert wurden. Alternativ können verschiedene Kaliumionen-Kanäle in die
Doppel-Mutante eingeführt werden, um zu testen, ob der Wachstumsdefekt auf Kalium
limitierten Medien komplementiert wird. Der Schizosaccharomyces pombe Wildtypphänotyp
kann durch Auswahl derjenigen Stämme, welche nach Transformation, Selektion und nach
Anzucht unter Bedingungen von 10 mg/l Kalium im Kulturmedium ermittelt werden.
Jede dieser Anwendungen resultiert in einem Hefestamm, der heterolog einen fremden
Kaliumionen-Kanal exprimiert und zur Durchmusterung von Modulatoren des betreffenden
Kaliumionen-Kanals verwendet werden kann. Ein Hefestamm, der heterolog einen fremden
Kaliumionen-Kanal exprimiert, kann in einfachen Verfahren zur Durchmusterung
verschiedener Testsubstanz-Bibliotheken verwendet werden. Diese einfache Verfahren, in
denen Wachstumsveränderungen oder gesteigerte und/oder verminderte Kaliumaufnahme
durch Agarplattentests und/oder in Flüssigkultur beobachtet werden kann, können somit
spezifische Substanzen detektieren, die die Kaliumionen-Kanal Funktion modulieren. Zur
Durchmusterung auf Aktivatoren einer Kaliumionen-Kanal Funktion kann das
Durchmusterungsverfahren solche Veränderungen wie metabolische Aktivität, gesteigerte
Wachstumsrate oder gesteigerte Kaliumionen Aufnahme beinhalten. Zur Durchmusterung auf
Inhibitoren einer Kaliumionen-Kanal Funktion kann das Durchmusterungsverfahren solche
Veränderungen wie verminderte Wachstumsrate oder verminderte Kaliumionen Aufnahme
beinhalten. Die Testsubstanzen, die im Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren
eingesetzt werden, können z. B. synthetische oder natürliche Produkte sein. Natürliche
Produkte beinhalten pflanzliche, tierische oder mikrobielle Extrakte.
In Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der genomischen Fragmente, die die
Wildtyp TKHp und Trk2 Loci enthalten sowie die entsprechenden mutierten Allele
trk1::LEU2, trk2::Ura4 und trk2::adhHerg/Ura4 dargestellt. Die TKHp und Trk2
kodierenden Regionen sind durch schwarze Balken gekennzeichnet. Die mutanten Allele
wurden zum Ersatz der entsprechenden Wildtyp Loci in Schizosaccharomyces pombe Stämme
transformiert.
In Fig. 2 ist die abgeleitete Aminosäure- (SEQ. ID. NO. 2) und die Nukleinsäure
sequenz (SEQ. ID. NO. 1) des Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransportproteins TKHp
dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobene Region entspricht der deletierten und durch
den biosynthetischen Marker LEU2 ersetzten Sequenz.
In Fig. 3 ist die abgeleitete Aminosäure- (SEQ. ID. NO. 4) und die Nukleinsäure
sequenz (SEQ. ID. NO. 3) des Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransportproteins Trk2
dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobene Region entspricht der Eco RV Stelle, in die
der biosynthetische Marker Ura4 eingeführt wurde.
In Fig. 4 ist die Nukleinsäure- (SEQ. ID. NO. 5) und abgeleitete Aminosäuresequenz
(SEQ. ID. NO. 6) des humanen erg Gens (HERG) dargestellt. Die Sequenz entspricht der in
der Originalpublikation von Trudeau, M. C., Warmke, J. W., Ganetzky, B. and Robertson, G.
(1995). Science 269: 92-95 beschriebenen.
In Fig. 5 ist das Wachstum der erzeugten Schizosaccharomyces pombe
Kaliumtransport defekten Mutanten in Abhängigkeit von der Kaliumkonzentration im
Kulturmedium gezeigt. Die Stämme wurden auf Vollmedium, pH 4.5 bei 30°C über Nacht
angezogen und anschießend auf 100 mM, 10 mM und 1 mM Kalium enthaltende Agarplatten
replika-plattiert. Die Platten wurden bei 30°C für zwei Tage inkubiert. Der
Schizosaccharomyces pombe Hefestamm mit Defekten in beiden Kaliumtransportproteinen
(Doppel-Mutante) wächst unter Bedingungen von 1 mM Kalium im Medium nicht.
Fig. 6 zeigt das Wachstum vom Schizosaccharomyces pombe Wildstamm, der
Kaliumtransport Doppel-Mutante sowie den modifizierten Hefestamm, der das humane erg
Gen (HERG) exprimiert auf 100 mM, 10 mM und 1 mM Kalium enthaltenden Agarplatten.
Die Platten wurden bei 30°C für zwei Tage inkubiert. Im Gegensatz zur
Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransport Doppel-Mutante ist der das humane erg Gen
(HERG) exprimierende Stamm in der Lage, auf 1 mM Kalium im Medium zu wachsen.
In Fig. 7 ist die Wirkung bekannter Inhibitoren des HERG Kaliumionen-Kanals
dargestellt. Der HERG exprimierende modifizierte Schizosaccharomyces pombe Stamm
wurde auf Vollmedium, pH 4.5 bei 30°C über Nacht angezogen und anschießend auf 1 mM
Kalium enthaltende Agarplatten in der Gegenwart von 1 mM Barium, 1 mM Cäsium und 40
µM Lanthan replika-plattiert. Durch die Inhibierung des heterolog exprimierten Gens kann der
modifizierte Schizosaccharomyces pombe Stamm mit Defekten in beiden
Kaliumtransportproteinen nicht mehr wachsen.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Zur Anreicherung und Manipulation von DNA wurden Standartmethoden benutzt, wie sie bei
Sambrook, J. et al., In: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), beschrieben sind. Die verwendeten
molekularbiologischen Reagenzien wurden nach den Angaben der Hersteller eingesetzt.
Schizosaccharomyces pombe Stämme wurden entsprechend der Methode, wie sie von
Moreno, S. et al., (1991) Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces
pombe. Methods in Enzymology 194: 795-824, beschrieben sind, transformiert.
Die Mutation in dem Schizosaccharomyces pombe Kaliumionen-Transporter TKHp
wurde in dem Plasmid pFL61SPT1, das die kodierende Nukleinsäuresequenz mit 2958
Basenpaaren (bp) für diesen Transporter enthält, wie beschrieben in Lichtenberg-Fraté, H.,
Reid, J. D., Heyer, M., Höfer, M. (1996). J. Membrane Biol. 152: 169-181, durchgeführt.
In dem Gen wurde eine 1102 bp Deletion in der kodierenden Region durch Spaltung
mit der Restriktions-endonuklease Hind II eingeführt. Die DNS Fragmente wurden durch
Agarosegelelektrophorese getrennt und das größere Fragment (6684 bp), das die restlichen
Transportersequenzen sowie Vektoranteile enthielt isoliert und gereinigt. Zum Erhalt einer
Deletions/Insertionsmutation wurde das LEU2 Sma I/Hind II Gen aus Saccharomyces
cerevisiae als biosynthetischer Marker durch Ligation mit dem TKH Restfragment
eingeführt. Das resultierende mutante Allel tkh::LEU2 (Fig. 1) wurde als lineares Not I
Konstrukt zur Transformation des Schizosaccharomyces pombe Wildstammes h- ade6-M210
ura 4-D18 leu1-31 verwendet. Die Auswahl erfolgreich transformierter Kolonien erfolgte
durch die Selektion auf Leucin Prototrophie. Die Bestätigung der durch homologe
Rekombination eingeführten Mutation im Kaliumtransporter TKHp erfolgte durch
Restriktionsspaltung genomischer Schizosaccharomyces pombe DNS und Southern blot
Hybridisierung, wie beschrieben in Sambrook, J. et al., In: Molecular cloning: A laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).
Der durch Mutation des Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransporters TKHp
resultierende mutante Phänotyp (Genotyp h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2)
wächst im Vergleich zum Wildstamm auf Kalium limitierten Medien gleich gut (Fig. 5).
Daher wurde die Aktivität eines weiteren spezifischen Kaliumtransporters in dieser
Schizosaccharomyces pombe Mutante postuliert.
Zur Konstruktion der Schizosaccharomyces pombe Mutante trk2 wurde mit den
Oligonukleotiden SpTRK2#5 5' CAC GGA TCC ACA GAT TTT ATC ATG CAG TTA
TCG GGT TTT TCT ACA AAC GGT TCC 3' (SEQ. ID. NO. 7) welches der 5' kodierenden
Region des Start-Codons ATG entspricht (Position -21 bis +33), und SpTRK2#H3 5' CGC
GAA AGA AGC TTG GGC GA 3' (SEQ. ID. NO. 8) welches komplementär zur 3'
kodierenden Region der Hind III Restriktionsstelle an Position 625 ist (Position +593 bis
+612), ein 625 bp langes Fragment durch die Polymerase-Ketten-Reaktion aus genomischer
DNS der Schizosaccharomyces pombe Mutante h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2
amplifiziert. Nach Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Bam HI und Hind III wurde
dieses Fragment mit dem entsprechend gespaltenem bakteriellen Plasmidvektor pBSKII
(Firma Stratagene, Heidelberg) ligiert. Im resultierenden Plasmid pBT2 wurde durch
Sequenzierung das 625 bp Teilfragment des Kaliumtransporters Schizosaccharomyces pombe
Trk2 bestätigt. Das erhaltene Konstrukt wurde durch Spaltung mit der
Restriktionsendonuklease Eco RV an Position 246 im Trk2 Genfragment linearisiert und das
die Disruptions/Insertionsmutation durch Ligation des Ura4 Sma I/Hind II Gens aus
Schizosaccharomyces pombe als biosynthetischer Marker eingeführt (Fig. 1). Das gewünschte
Plasmid (pBT2URA), das das mutante Allel trk2::Ura4 enthält, wurde durch
Restriktionskartierung und Polymerase-Ketten-Reaktion mit den o. g. Oligonukleotiden als 2.3 kb
Fragment bestätigt. Das erhaltene mutante Allel trk2::Ura4 (Fig. 1) wurde als lineares Bam
HI/Kpn I Konstrukt zur Transformation des Schizosaccharomyces pombe Wildstammes
(h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31) verwendet. Die Transformation des Wildstammes führte zum
Erhalt einer Schizosaccharomyces pombe Mutante in der singulär der Kaliumtransporter Trk2
(Genotyp h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 trk2::Ura4) disruptiert ist. Die Selektion positiver
Transformanten erfolgte auf die Uracil Prototrophie hin. Die Bestätigung der durch homologe
Rekombination eingeführten Mutation im Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransporter
Trk2 erfolgte durch Southern blot Hybridisierung.
Nach Mutation des Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransporters Trk2 wurde der
resultierende mutante Phänotyp (Genotyp h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 trk2::Ura4) im
Vergleich zum Wildstamm-Phänotyp und der Kaliumtransporter Mutante tkh getestet (Fig. 5).
Die singuläre Mutation des Kaliumtransporters Trk2 zeigte im Vergleich zum Wildstamm und
der Kaliumtransporter Mutante tkh auf Kalium limitierten Medien gleiches Wachstum.
Das erhaltene mutante Allel trk2::Ura4 (Fig. 1) wurde als lineares Bam HI/Kpn I
Konstrukt zur Transformation der Kaliumtransporter Mutante tkh (h- ade6-M210 ura 4-D18
leu1-31 tkh::LEU2) verwendet. Die Transformation Mutante tkh führte zum Erhalt einer
Schizosaccharomyces pombe Doppel-Mutante in der beide Kaliumtransporter TKHp und Trk2
(Genotyp Mutante (h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2 trk2:: Ura4) deletiert und
disruptiert sind. Die Selektion positiver Transformanten erfolgte auf die Leucin und Uracil
Prototrophie hin. Die Bestätigung der durch homologe Rekombination eingeführten Mutation
im Schizosaccharomyces pombe Kaliumtransporter Trk2 erfolgte durch Southern blot
Hybridisierung.
Die Bestätigung, daß Trk2 der gesuchte weitere Schizosaccharomyces pombe
Kaliumtransporter ist, erfolgte durch Ausplattierung des erzeugten Hefestamms im Vergleich
zum Wildstamm und der Kaliumtransporter Mutante tkh auf Kalium limitierten Medien (Fig.
5). Der Phänotyp der Kaliumtransporter Doppel-Mutante tkh trk2 ist dadurch gekennzeichnet,
daß Zellen dieses Hefestamms auf Konzentrationen kleiner 1 mM Kalium im Kulturmedium
nicht lebensfähig sind.
Das Gen für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) wurde durch Spaltung mit
den Restriktionsendonukleasen Bam HI und Eco RI als 3.5 Kilobasenpaar (kb) Fragment aus
dem Plasmid pcDNAHERG (erhalten von Dr. G. Robertson, University of Wisonsin,
Madison, USA) und Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erhalten.
Zur Transkription eines humanen Gens in der Hefe Schizosaccharomyces pombe ist ein
Hefe-eigener Promotor notwendig. Der in Schizosaccharomyces pombe konstitutiv aktive adh
Promotor (Alkohol Dehydrogenase Gen) wurde als Sal I/Bam HI Fragment aus dem Plasmid
pEVP11, wie beschrieben in Moreno, S. et al., (1991) Molecular genetic analysis of fission
yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology 194: 795-824, nach Auftrennung
durch Agarosegelelektrophorese isoliert. In einer Dreifach-Ligation wurden die adh Sal I/Bam
HI und HERG Bam HI/Eco RI Fragmente mit dem Sal I/Eco RI gespaltenem Plasmidvektor
pBSKII ligiert. Das gewünschte Plasmid pBSKaHerg wurde durch Restriktionskartierung
bestätigt. Aus diesem Plasmid wurde ein 4.6 kb adhHerg Verbundfragment durch Spaltung
mit den Restriktionsendonukleasen Hinc II und Xba I und nach Auftrennung durch
Agarosegelelektrophorese erhalten. In diesem Verbundfragment wurden die überstehenden
Nukleotidenden der Xba I Stelle durch DNS Polymerase I aufgefüllt.
In dem Plasmid pBT2URA (siehe 1.2), welches das mutante Allel trk2::Ura4 enthält,
wurde mit der Restriktionsendonuklease Eco RI eine Linearisierung an Position 251, direkt
vor dem Ura4 Gen durchgeführt, die überstehenden Nukleotidenden der Eco RI Stelle durch
DNS Polymerase I aufgefüllt und durch Alkaline Phosphatase dephosphoryliert. Dieses
linearisierte Fragment wurde mit dem 4.6 kb adhHerg Verbundfragment ligiert (Fig. 1). Das
gewünschte Plasmid wurde Restriktionskartierung identifiziert. Das erhaltene mutante Allel
trk2::adhHerg/Ura4 (Fig. 1) wurde als lineares Xba I/Kpn I 7.0 kb Fragment nach
Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese zur Transformation der Kaliumtransporter
Mutante tkh (h- ade6-M210 ura 4-D18 leu1-31 tkh::LEU2) verwendet. Die Transformation
dieser tkh Mutante führte zum Erhalt einer Schizosaccharomyces pombe Doppel-Mutante, in
der der Kaliumtransporter TKHp deletiert ist und der Kaliumtransporter Trk2 durch die stabile
Einführung des humanen erg Gens (HERG) disruptiert ist. Anstelle des Kaliumtransporters
Trk2 wird in diesem Schizosaccharomyces pombe Stamm (Genotyp h- ade6-H210 ura 4-D18
leu1-31 tkh::LEU2 trk2::adhHerg/Ura4) der HERG Kaliumionen-Kanal exprimiert. Die
Selektion positiver Transformanten erfolgte auf die Leucin und Uracil Prototrophie hin. Die
Bestätigung der durch homologe Rekombination eingeführten stabilen Integration des
humanen erg Gens (HERG) an den Schizosaccharomyces pombe Trk2 Locus erfolgte durch
RNS Analyse.
Die Expression des HERG Kaliumionen-Kanals den restauriert Phänotyp der
Kaliumtransporter Doppel-Mutante tkh trk2 auf Kalium limitierten Medien (Fig. 6). Durch
Expression des HERG Kaliumionen-Kanals können Zellen dieses genetisch modifizierten
Hefestamms im Gegensatz zur Doppel-Mutante tkh trk2 auf Konzentration kleiner 1 mM
Kalium gut wachsen. Die Restaurierung des Wildtyp Phänotyps ist abhängig von der
heterologen Expression des HERG Kaliumionen-Kanals, wie anhand der Inhibierung von
HERG auf 1 mM Kalium enthaltenden Agarplatten in der Gegenwart von 1 mM Barium, 1 mM
Cäsium und 40 µM Lanthan bestätigt (Fig. 7). Durch die Inhibierung des HERG
Kaliumionen-Kanals kann der Schizosaccharomyces pombe Stamm mit Defekten in beiden
Kaliumtransportproteinen auf der 1 mM Kaliumkonzentration nicht mehr wachsen.
Kulturen von Schizosaccharomyces pombe Wildstamm, der Kaliumtransport defekten
Mutanten tkh, trk2 und tkh trk2 und dem HERG exprimierenden Stamm wurden im
Vollmedium YEP (2% yeast extract, 1% peptone) mit 2% D-glucose, pH 4.5 bei 30°C über
Nacht unter Schütteln angezogen. Serielle Verdünnungen wurden auf Vollmedium-
Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht inkubiert und auf selektive Agarplatten
(0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.5% NH4SO4, 2% D-glucose, pH 4.5) mit
100(A), 10(B) oder 1(C) mM KCl replika-plattiert. Diese Platten wurden für 48 Stunden bei
30°C inkubiert.
Kulturen von Schizosaccharomyces pombe Wildstamm, der Kaliumtransport defekten
Mutante tkh trk2 und dem HERG exprimierenden Stamm wurden im Vollmedium YEP (2%
yeast extract, 1% peptone) mit 2% D-glucose, pH 4.5 bei 30°C über Nacht unter Schütteln
angezogen. Serielle Verdünnungen wurden auf Vollmedium-Agarplatten ausgestrichen, bei
30°C über Nacht inkubiert und auf selektive Agarplatten (0.67% yeast nitrogen base without
amino acids, 0.5% NH4SO4, 2% D-glucose, pH 4.5) mit 1 mM KCl und 1 mM Barium (A),
1 mM Cäsium (B) und 40 µM Lanthan (C) replika-plattiert. Diese Platten wurden für 48
Stunden bei 30°C inkubiert.
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Claims (8)
1. Schizosaccharomyces pombe Mutanten mit Defekten in der Kaliumaufnahme die
erhältlich sind durch Mutation der Kaliumtransporter TKHp und/oder Trk2p, Einführung
einer oder mehrerer selektiver Marker (Auxotrophien und/oder Resistenzen),
2. Schizosaccharomyces pombe Mutanten tkh, trk2 und tkh trk2
3. Verwendung der Schizosaccharomyces pombe Mutanten nach Anspruch 1 oder 2 als
Wirtsorganismus zur homologen oder heterologen Expression von Kaliumionen Kanälen.
4. Ein genetisch modifizierter Schizosaccharomyces pombe Hefestamm der die
Nukleinsäuresequenz für das humane erg Kaliumionen-Kanal Gen (HERG) aber nicht die
der Hefe eigenen Kaliumtransporter TKHp und Trk2p exprimiert.
5. Ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des HERG Kaliumionen-Kanals,
einschließlich:
- a) Die Behandlung des Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstamms, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutationsform dieses Kaliumionen-Kanals aber nicht die der Hefe eigenen TKHp oder Trk2 Kaliumionen-Transportproteine exprimiert mit Testsubstanzen,
- b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz,
- c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.
6. Ein Verfahren nach Anspruch 4 zur Detektion von anti-arrythmische Substanzen.
7. Ein Verfahren nach Anspruch 4 zur Detektion von antifibrillatorische Substanzen.
8. Ein Verfahren nach Anspruch 4 zur Detektion von anti-entzündlichen Substanzen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1999141768 DE19941768A1 (de) | 1999-09-02 | 1999-09-02 | Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in der Kaliumaufnahme |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1999141768 DE19941768A1 (de) | 1999-09-02 | 1999-09-02 | Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in der Kaliumaufnahme |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DE19941768A1 true DE19941768A1 (de) | 2001-03-15 |
Family
ID=7920515
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1999141768 Withdrawn DE19941768A1 (de) | 1999-09-02 | 1999-09-02 | Schizosaccharomyces pombe Hefewirtsstämme mit Defekten in der Kaliumaufnahme |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19941768A1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003031600A1 (de) * | 2001-10-05 | 2003-04-17 | Lichtenberg-Frate Hella | Saccharomyces-cerevisiae-hefestamm mit stabiler integration und expression der nukleinsäuresequenz für einen heterologen kaliumionen-kanal |
EP1391510A1 (de) * | 2001-05-29 | 2004-02-25 | Asahi Glass Company Ltd. | Verfahren zur konstruktion eines wirts und herstellungsverfahren für fremdprotein |
-
1999
- 1999-09-02 DE DE1999141768 patent/DE19941768A1/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (3)
Title |
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1999 * |
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EP1391510A1 (de) * | 2001-05-29 | 2004-02-25 | Asahi Glass Company Ltd. | Verfahren zur konstruktion eines wirts und herstellungsverfahren für fremdprotein |
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US7723098B2 (en) | 2001-05-29 | 2010-05-25 | Asahi Glass Company, Limited | Method of constructing host and method of producing heterologous protein |
WO2003031600A1 (de) * | 2001-10-05 | 2003-04-17 | Lichtenberg-Frate Hella | Saccharomyces-cerevisiae-hefestamm mit stabiler integration und expression der nukleinsäuresequenz für einen heterologen kaliumionen-kanal |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
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8130 | Withdrawal |