-
Hintergrund der Erfindung
-
Das
Durchlaufen des Säugetierzellzyklus wird
durch eine ordnungsgemäße Aktivierung
von Cyclin-abhängigen
Kinasen (cyclin-dependent kinases, CDKs) angetrieben. Eine aktive
CDK ist aus einer katalytischen Untereinheit und einer als Cyclin bezeichneten
regulatorischen Untereinheit zusammengesetzt. Die CDK-Aktivität wird durch
Wechselwirkungen mit Cyclinen und CDK-Inhibitoren (CKIs) und durch
post-translationale Modifikationen (z. B. Phosphorylierung) reguliert.
-
Der Übergang
zwischen Zellzyklusstadien wird an definierten Kontrollpunkten durch
verschiedene Cyclinuntereinheiten reguliert: G1-Cyclin für den G1/S-Übergang,
S-Cycline für
das Durchlaufen der S-Phase und G2- oder mitotische Cycline für den Eintritt
in die Mitose. Die Festlegung einer Zelle, in die S-Phase einzutreten,
erfolgt an einem bestimmten Punkt (restriction point, R) spät in der
G1-Phase, nachdem mitogene Wachstumsfaktoren für eine vollständige Teilung
der Zellen nicht länger
erforderlich sind.
-
Die
Cycline D und E werden nacheinander während der G1-Phase synthetisiert,
und sie sind geschwindigkeitsbestimmend für den Eintritt in die S-Phase,
so dass sie als G1-Cycline betrachtet werden können. Mindestens drei Säugetiergene
kodieren Cycline vom Typ D (D1, D2 und D3). Cycline vom Typ D werden
stufenweise als Teil der verzögerten frühen Antwort
auf eine mitogene Stimulierung induziert, und sie werden auf eine
für eine
Zelllinie spezifische Weise exprimiert. Der Zusammenbau von Cyclinen
vom Typ D aus CDK4 und CDK6 wird post-translational durch Mitogene
reguliert. Sobald sie zusammengebaut sind, müssen Cyclin D-gebundene CDKs
durch eine CDK-aktivierende Kinase (CAK) phosphoryliert werden,
um katalytische Aktivität
zu erlangen.
-
Cyclin
D-Gene befinden sich auf einem anderen Ast des Evolutionsbaums als
Cycline vom Typ A, B oder E, und Cycline vom Typ D weisen einige
andere Eigenschaften auf als andere Cycline. Es handelt sich um
Proteine mit einer kurzen Halbwertszeit (t1/2 < 25 min). Ein Entzug
von Wachstumsfaktoren während
der G1-Phase verhindert eine kontinuierliche Akkumu lation von Cyclin
D, was mit der Unfähigkeit
von Zellen, denen Wachstumsfaktoren entzogen werden, hinter den
Punkt R fortzuschreiten, korreliert. Folglich wird die Expression
von Cyclin D, anders als die periodische Expression der Cycline
A, B und E, durch extrazelluläre
Signale reguliert.
-
Eine Überexpression
der menschlichen Cycline D1 und E in Nagetierfibroblasten oder menschlichen
Fibroblasten verkürzt
die G1-Phase, verringert die Zellgröße und vermindert die Notwendigkeit
von Serum für
den G1/S-Übergang
(Resnitzky et al., MCB 14; 1669-79 (1994); Quelle et al., Genes & Development 7,
1559-71 (1993); Ohtsubo & Roberts, Science
259, 1908-12 (1992). Diese Ergebnisse legen nahe, dass D-Cycline
eine Funktion, die physiologisch durch Cyclin E reguliert wird, überwinden könnten, oder
umgekehrt. Allerdings führt
eine Überexpression
von Cyclin D oder E nicht zu einer Transformation von Fibroblasten – die Zellen
bleiben serumabhängig,
kontaktinhibiert und unfähig,
in halbfestem Medium Kolonien zu bilden. Es ist festgestellt worden,
dass eine Überexpression
von Cyclin D die endogene Genamplifikation verstärkt, was nahelegt, dass Cyclin
D eine Rolle bei der genomischen Instabilität während der Tumorentwicklung
spielt (Zhou et al., Cancer Res. 56: 36-9 (1996)).
-
Kurzfassung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine eukaryotische Zelle, die Folgendes
umfasst:
- a) ein eingefügtes Cyclin D-Genprodukt, wobei das
Cyclin D-Genprodukt funktionell in der Zelle in einer Stärke exprimiert
wird, die größer ist
als jede native Expressionsstärke;
und
- b) ein eingefügtes
Protein von Interesse, wobei das Protein von Interesse in der Zelle
in einer Stärke
exprimiert wird, die größer ist
als jede native Expressionsstärke.
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen
eines Proteins von Interesse, welches Folgendes umfasst:
- A. Erzeugen einer eukaryotischen Zelle, die Folgendes exprimiert:
- 1. ein Cyclin D-Genprodukt in einer Stärke, die größer ist als jede native Expressionsstärke; und
- 2. ein Protein von Interesse in einer Expressionsstärke, die
größer ist
als jede native Expressionsstärke;
durch
Einführen
eines Expressionsvektors, der eine DNA-Sequenz für das Protein von Interesse umfasst,
und durch Einführen
eines Expressionsvektors, der eine DNA-Sequenz für das Cyclin D-Genprodukt umfasst;
- B. Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, welche eine Expression
des Proteins von Interesse und eine funktionelle Expression des
Cyclin D-Genprodukts erlauben; und
- C. Isolieren des Proteins von Interesse.
-
Die
Zellen dieser Erfindung sind vorzugsweise Säugetierzellen, wobei CHO-Zellen
am stärksten bevorzugt
werden. Das Cyclin D-Genprodukt ist vorzugsweise vom Säugetier,
wobei ein menschlicher Ursprung am stärksten bevorzugt wird. Das
Cyclin D-Genprodukt oder das Gen, welches das Protein von Interesse
kodiert, (oder beide) kann (können)
in einem Expressionsvektor oder in Vektoren im Inneren der Zellen
enthalten oder in das Zellgenom integriert sein.
-
Jede
Anzahl von Proteinen von Interesse kann im Zusammenhang mit der
vorliegenden Erfindung verwendet werden. Speziell EPO, OPG, Leptin und
alle Derivate davon können
eingesetzt werden.
-
Ebenfalls
offenbart wird eine eukaryotische Zelle, die Folgendes umfasst:
- (a) ein Cyclin D-Genprodukt, wobei das Cyclin D-Genprodukt
funktionell in der Zelle in einer Stärke exprimiert wird, die größer ist
als jede native Expressionsstärke;
und
- (b) ein Protein von Interesse, wobei das Protein von Interesse
in der Zelle in einer Stärke
exprimiert wird, die größer ist
als jede native Expressionsstärke.
Ebenfalls
offenbart wird ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins von Interesse,
welches Folgendes umfasst:
- A. Erzeugen einer eukaryotischen Zelle, die Folgendes exprimiert:
- 1. ein Cyclin D-Genprodukt in einer Stärke, die größer ist als jede native Expressionsstärke, und
- 2. ein Protein von Interesse in einer Stärke, die größer ist als jede native Expressionsstärke;
- B. Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, welche eine Expression
des Proteins von Interesse und eine funktionelle Expression des
Cyclin D-Genprodukts erlauben; und
- C. Isolieren des Proteins von Interesse.
-
Die
Zellen dieser Offenbarung sind vorzugsweise Säugetierzellen, wobei CHO-Zellen
am stärksten
bevorzugt werden. Das Cyclin D-Genprodukt ist vorzugsweise vom Säugetier,
wobei ein menschlicher Ursprung am stärksten bevorzugt wird. Das
Cyclin D-Gen oder das Gen, welches das Protein von Interesse kodiert,
(oder beide) kann (können)
in einem Expressionsvektor oder in Vektoren im Inneren der Zelle
enthalten oder in das Zellgenom integriert sein.
-
Jede
Anzahl von Proteinen von Interesse können im Zusammenhang mit der
vorliegenden Offenbarung verwendet werden. Speziell EPO, OPG, Leptin
und NESP und alle Derivate davon können eingesetzt werden.
-
Kurze Beschreibung der Figuren
-
1 zeigt einen Western blot von Lysaten aus
AM-1-Zellen, die mit pcDNA3.1/Cyclin D1 transfiziert und mit einem
menschlichen Cyclin D-spezifischen Antikörper behandelt wurden (siehe
Material und Methoden). Dieser Blot zeigt die Expression von menschlichem
Cyclin D1 in den AM-1/D-Zellen.
-
Die 2A, 2B, 2C und 2D sind
Histogramme, welche den relativen DNA-Gehalt (x-Achse) und die Zellzahl (y-Achse) von
nicht-synchronisierten Zellen der Zelllinien AM-1/D und AM-1, die
mit Propidiumiodid gefärbt
und durch FACScan (Becton Dickinson; siehe Material und Methoden) analysiert
wurden, zeigen. Diese Figuren zeigen, dass sich bei den AM-1/D-Zellen
signifikant mehr Zellen in der S-Phase befanden.
-
3 ist
eine Darstellung, welche die Anzahl von Klonen zeigt, die OPG-Fc
in verschiedenen Stärken
exprimieren. AM-1/D-Zellen wurden mit dem Plasmid pDSRα2/OPG-Fc
transfiziert, wie nachfolgend in Beispiel 1 beschrieben. Diese Darstellung zeigt,
dass die Klone mit der stärksten
Expression von der AM-1/D-Zelllinie abgeleitet wurden.
-
4 ist
eine Darstellung, welche die Expressionen von EPO, aufgetragen gegen
die Konzentration von MTX, das zur Amplifikation verwendet wurde,
zeigt. AM-1/D-Zellen wurden mit dem Plasmid pDSRα2/hEPO transfiziert, wie nachfolgend
in Beispiel 2 beschrieben. Zwei der Klone zeigten mit ansteigenden
Konzentrationen von MTX eine erhöhte EPO-Produktion,
was eine erfolgreich Genamplifikation zeigt.
-
5 zeigt
einen Vergleich der Expressionsstärken von OPG (22-194)-cys-Fs
bei 46 einzelnen Klonen, die sich von AM-1-CHO-Zellen oder AM-1/Cyclin
D-CHO-Zellen ableiteten. Klone, die sich von der Zelllinie AM-1/Cyclin
D-CHO ableiteten, zeigen signifikant geringere Expressionsstärken von OPG
(22-194)-cys-Fc als Klone, die sich von AM-1-CHO-Zellen ableiteten.
-
6 zeigt
einen Vergleich der Expression von OPG (22-201)-Fc bei den 24 Klonen
mit der stärksten
Expression, wie zuvor durch Western blot bestimmt. In jedem Fall
zeigen Klone, die sich von der Zelllinie AM-1/Cyclin D-CHO ableiteten,
signifikant höhere
Expressionsstärken
von OPG (22-201)-Fc als Klone, die sich von CHO(SF)-Zellen ableiteten.
-
7 zeigt
die mittlere NESP-Expression, bestimmt durch EIA, in den 14 besten
Klonen, die sich von jeder Stamm-CHO-Zelllinie (elterliche CHO-Zelllinie,
parent CHO cell line) ableiteten. Proben von konditioniertem Medium
wurden 24-Well-Platten entnommen, zweitägige Ernte. Die Proben wurden
vorab durch Western blot durchgemustert.
-
8 zeigt IEF-Western blots von Spinner- und
Bioreaktorernten, wobei die Verteilung von Isoformen von sezemiertem
NESP-Proteinen aus Spinner- und Bioreaktorkulturen verglichen werden.
Die Spinner-Ernten stammen von nicht-amplifizierten Klonen. Das
Standard-NESP-Protein,
gereinigt aus in Rollflaschen konditioniertem Medium, zeigt die
gewünschten
hochmolekularen Isoformen. Die Ernten von konditioniertem Medium
enthalten alle Isoformen. Die Blots zeigen, dass hochmolekulare
Isoformen in allen Proben vorhanden sind.
-
Genaue Beschreibung der Erfindung
-
Die
folgenden Definitionen treffen auf Begriffe zu, wie sie in dieser
Beschreibung durchgängig verwendet
werden, es sei denn, sie werden in bestimmten Fällen anderweitig beschränkt.
-
Die
Begriffe „eingefügt" oder „einfügen" von Nukleinsäuren bedeutet,
dass die Nukleinsäure
in eine Zelle oder einen Organismus durch externe Verfahren (z.
B. Transfektion) eingeführt
wird. Die eingefügte
Nukleinsäure
kann eine Sequenz aufweisen, die dem Genom der Zelle fremd ist oder
die dort bereits vorhanden ist. In letzterem Fall erlaubt die eingefügte Nukleinsäure eine
stärkere
oder anders regulierte Expression des Proteins, das durch die eingefügte Nukleinsäure kodiert
wird.
-
Der
Begriff „EPO-bezogenes
Protein" betrifft Erythropoetin
und Derivate und Analoga davon, die durch rekombinate DNA-Verfahren
oder anderen Verfahren hergestellt werden können. Derartige Derivate schließen Proteine
ein, die terminale Verkürzungen
(Trunkierungen), eine Entfernung von internen Aminosäuren (z.
B. durch Restriktion und Religation der assoziierten DNA), Aminosäuresubstitutionen und Ähnliches
aufweisen. Derartige Derivate schließen auch Fusionsproteine (z.
B. mit einer Fc-Region) ein. Beispielhafte Derivate für Erythropoetin
werden in den internationalen Patentanmeldungen
WO 91/05867 ,
94/09257 ,
88/03808 und
86/07594 beschrieben.
-
Der
Begriff „Leptin-bezogenes
Protein" betrifft
Leptin, vorzugsweise menschliches Leptin, und Derivate davon, die
durch rekombinante DNA-Verfahren und anderen Verfahren hergestellt
werden können.
Derartige Derivate schließen
Proteine ein, die terminale Verkürzungen,
eine Entfernung von internen Aminosäuren, Animosäuresubstitutionen
und Ähnliches
aufweisen. Ebenfalls eingeschlossen in diese Definition sind Fusionsproteine,
die Leptin umfassen, wie etwa ein Fusionsprotein, das Leptin und ein
Fc-Fragment umfasst. Geeignete Leptinderi vate werden in den Patentanmeldungen
WO 96/40912 (angemeldet
am 19. Dezember 1996),
WO 96/05309 (angemeldet
am 22. Februar 1996),
WO 97/06816 (angemeldet
am 27. Februar 1997) und
WO 97/18833 (angemeldet
am 29. Mai 1997) beschrieben.
-
Der
Begriff „OPG-bezogenes
Protein" bezieht
sich auf OPG und Derivate davon, die durch rekombinante DNA-Verfahren
und andere Verfahren hergestellt werden können.
-
Derartige
Derivate schließen
Proteinen ein, die terminale Verkürzungen, eine Entfernung von
internen Aminosäuren
(z. B. durch Restriktion und Religation der assoziierten DNA), Aminosäuresubstitutionen
und Ähnliches
aufweisen. Derartige Derivate schließen auch Fusionsproteine (z.
B. mit einer Fc-Region) ein. Beispielhafte Derivate von OPG werden
in der internationalen Patentanmeldung
WO 97/23614 beschrieben.
-
Herstellungsverfahren
-
Genkonstrukte
-
Die
Nukleinsäuren,
die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch
Verfahren zur Herstellung rekombinanter Nukleinsäuren hergestellt werden. Siehe
beispielsweise die rekombinanten DNA-Verfahren nach Nelles et al.,
J. Biol. Chem., 262, 10855 (1987).
-
Die
Nukleinsäuren
können
aus einer Vielfalt von Quellen abgeleitet werden, einschließlich genomischer
DNA, subgenomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA und Kombinationen
daraus. Genomische und cDNA können
auf einer Reihe von Wegen erhalten werden. Zellen, welche die gewünschte Sequenz
kodieren, können
isoliert, die genomische DNA kann fragmentiert (z. B. durch Behandlung
mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen) und die sich
ergebenen Fragmenten können
kloniert, mit einer Sonde, die zu der gewünschten Sequenz komplementär ist, identifiziert
und auf das Vorhandensein einer Sequenz, welche die gewünschte Aktivität kodiert,
durchgemustert werden. Für
cDNA kann cDNA kloniert werden und der sich ergebende Klon kann
mit einer Sonde für
cDNA, welche die gewünschte
Region kodiert, durchgemustert werden. Nach Isolierung des gewünschten
Klons kann die cDNA auf im wesentlichen gleiche Weise wie die genomische
DNA manipuliert werden.
-
Zusätzlich zu
der kodierenden Sequenz des Proteins von Interesse sollte das Genkonstrukt
eine Reihe von regulatorischen Regionen enthalten. Zur Expression
sind transkriptionelle und translationale Signale, die durch einen
geeigneten Wirt erkannt werden, notwendig. Die kodierende Sequenz
sollte mit einem Promotor verknüpft
sein, der mit der Wirtszelle kompatibel ist. Der Promotor kann induzierbar sein,
was eine weitere Steuerung der Expression erlaubt, oder konstitutiv.
Eine Reihe von geeigneten Promotoren sind im Stand der Technik bekannt.
-
Alternativ
kann die Promotorregion von genomischer DNA in Verbindung mit der
kodierenden Sequenz erhalten werden. In dem Ausmaß, in dem die
Wirtszellen die regulatorischen transkriptionellen und translationalen
Startsignale, die mit der kodierenden Region zusammenhängen, erkennen,
kann die 5'-Region,
die der kodierenden Sequenz benachbart ist, bewahrt und zur transkriptionellen
und translationalen Regulation eingesetzt werden. Diese Region wird
typischerweise solche Sequenzen einschließen, die am Start von Transkription
und Translation beteiligt sind, wie etwa die TATA-Box, eine capping sequence,
eine CAAT-Sequenz
und Ähnliches.
Typischerweise wird diese Region mindestens ungefähr 150 Basenpaare
lang sein, noch typischer ungefähr 200
bp, und sie wird selten mehr als 1-2 kb übertreffen.
-
Die
nicht-kodierende 3'-Region
kann ebenfalls bewahrt werden, insbesondere wegen ihrer regulatorischen
Sequenzen in Bezug auf ein Transkriptionsende, wie etwa das Stoppsignal
und eine Polyadenylierungsregion. Außerdem kann die nicht-kodierende
3'-Region auch einen
Enhancer (Verstärker) enthalten.
Wenn die Signale für
ein Transkriptionsende in der Wirtszelle nicht befriedigend funktionell sind,
dann können
diese durch eine funktionelle 3'-Region aus einem
anderen Gen ersetzt werden. Die Wahl der ersetzenden 3'-Region würde von
dem Zellsystem, das zur Expression ausgewählt worden ist, abhängen.
-
Eine
breite Vielfalt von transkriptionell und translational regulatorischen
Sequenzen können
eingesetzt werden, je nach Art des Wirts. Die transkriptionell und
translational regulatorischen Sequenzen können aus viralen Quellen stammen
(z. B. Adenovirus, Rinder-Papillomavirus,
Simianvirus, und Ähnliches),
bei denen die regulatorischen Signale von einem Gen stammen, das
in dem Wirt eine hohe Expressionsstärke aufweist. Alternativ können Promotoren
von Säugetierexpressionsprodukten
(z. B. Actin, Kollagen, Myosin und Ähnliches) eingesetzt werden.
Regulatorische Signale in Bezug auf den Transkriptionsstart können derart
ausgewählt
werden, dass eine Repression oder Aktivierung ermöglicht wird,
damit eine Expression der Gene moduliert werden kann. Eine derartige
steuerbare Modulationstechnik ist die Verwendung von regulatorischen Signalen,
die temperaturempfindlich sind, damit die Expression durch Ändern der
Temperatur unterdrückt oder
gestartet werden kann. Eine andere steuerbare Modulationstechnik
ist die Verwendung von regulatorischen Signalen, die gegenüber bestimmten
Chemikalien empfindlich sind.
-
Die
Konstrukte können
eine Nukleinsäuresequenz
umfassen, die in der Wirtzelle endogen vorliegt, zusammen mit einem
Promotor, Enhancer oder anderen regulatorischen Regionen, die in
der Zelle endogen vorliegen können
oder nicht. Derartige Konstrukte ermöglichen eine Expression der
endogenen Sequenz, die gesteigert (z. B. durch funktionsfähiges Koppeln
an einen konstitutiven Promotor) oder gesteuert (z. B. durch funktionsfähiges Koppeln
an regulatorische Signale) werden soll.
-
Um
die Genkonstrukte herzustellen, können DNA-Fragmente durch herkömmliche
Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, ligiert werden. Derartige
Techniken schließen
die Verwendung von Restriktionsenzymen ein, um Fragmente mit überhängenden
Enden in solche mit stumpfen Enden zu überführen (oder umgekehrt), Polymerasen
und Nukleotide, um die überhängenden
Enden aufzufüllen, um
stumpfe Enden zu bilden, alkalische Phosphatase, um unerwünschte Ligationen
zu vermeiden, und Ligasen, um Fragmente miteinander zu verbinden.
-
Die
Konstrukte können
in eine Zelle durch Transformation in Verbindung mit einem Gen,
welches die Selektion erlaubt, eingeführt werden, wobei das Konstrukt
in das Wirtsgenom integriert wird (z. B. durch homologe Rekombination).
Gewöhnlich
wird das Konstrukt Teil eines Vektors mit einem Replikationssystem
sein, das durch die Wirtszelle erkannt wird.
-
Expressionsvektoren
-
Expressionsvehikel
zur Herstellung der Moleküle
der Erfindung schließen
Plasmide oder andere Vektoren ein. Im allgemeinen enthalten derartige Vektoren
Steuersequenzen, welche eine Expression in verschiedenen Arten von
Zellen erlauben. Geeignete Expressionsvektoren, welche die gewünschten kodierenden
Sequenzen und Steuersequenzen enthalten, können unter Verwendung von rekombinanten
DNA-Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, konstruiert
werden, wobei viele davon in Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, N.Y. (1989) beschrieben werden.
-
Ein
Expressionsvektor, wie er durch die vorliegende Erfindung in Erwägung gezogen
wird, ist mindestens in der Lage, die Replikation und Expression
der Nukleinsäure,
welche das Protein von Interesse kodiert, oder die des Cyclin-D-Genprodukts
zu steuern. Eine Klasse von Vektoren verwendet DNA-Elemente, welche
sich autonom replizierende extrachromosomale Plasmide, die sich
von tierischen Viren (z. B. Rinder-Papillomavirus, Polyomavirus, Adenovirus
oder SV40) ableiten, verfügbar
machen. Eine zweite Klasse von Vektoren beruht auf der Integration
der gewünschten
Gensequenzen in das Wirtszellchromosom.
-
Expressionsvektoren,
die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, enthalten
normalerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor, der 5' zu (d. h. stromaufwärts von)
der zu exprimierenden DNA-Sequenz lokalisiert ist, und eine die
Transkription beendende Sequenz. Geeignete Replikationsurspünge schließen beispielsweise
die Replikationsursprünge Co1E1,
pSC101, M13, SV40 und EBV ein. Geeignete Stopsequenzen schließen beispielsweise
das Rinderwachstumshormon, SV40, lacZ und Polyadenylierungssignale
des Polyhedrovirus AcMNPV ein. Geeignete Promotoren schließen beispielsweise
den Cytomegaloviruspromotor, den lacZ-Promotor, den gal 10-Promotor
und den Promotor des Polyhedrovirus AcMNPV ein. Die Promotorsequenz
kann auch induzierbar sein, um eine Modulation der Expression zu
ermöglichen
(z. B. durch das Vorhandensein oder Fehlen von Nährstoffen oder anderen Induktoren
in dem Wachstumsmedium). Ein Beispiel ist das aus dem Bakteriophagen
lamda plac5 erhaltene lac-Operon, das durch IPTG induziert werden
kann.
-
Die
Expressionsvektoren können
auch andere regulatorische Sequenzen zur optimalen Expression des
gewünschten
Produkts einschließen.
Derartige Sequenzen schließen
Stabilitätsführersequenzen ein,
welche eine Stabilität
des Expressionsprodukts gewährleisten;
sekretorische Führersequenzen,
welche eine Sekretion des Expressionsprodukts gewährleisten;
Enhancer, welche die Expression der DNA-Sequenz aufregulieren; und
Erkennungssequenzen für
Restriktionsenzyme, welche Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen
verfügbar
machen. Alle diese Materialien sind im Stand der Technik bekannt
und kommerziell verfügbar.
Siehe beispielsweise Okayama, Mol. Cell Biol., 3, 280 (1983).
-
Ein
geeigneter Expressionsvektor kann auch Markierungssequenzen einschließen, welche
eine phänotypische
Selektion von transformierten Wirtzellen erlauben. Ein derartiger
Marker kann einem auxotrophen Wirt eine Phototrophie, eine Resistenz
gegen Biozide (z. B. Antibiotikaresistenz) und Ähnliches verleihen. Das selektionsfähige Markergen
kann entweder direkt mit den zu exprimierenden kodierenden Sequenzen
verbunden oder in dieselbe Zelle durch Co-transfektion eingeführt werden. Beispiele für selektionsfähige Marker
schließen
Gene für
eine Resistenz gegen Neomycin, Ampicillin, Hygromycin und Ähnliches
ein.
-
Die
Kennzeichen der verwendeten eigentlichen Expressionsvektoren müssen mit
der einzusetzenden Wirtszelle kompatibel sein. Für eine Wirtszelle kann der
Expressionsvektor beispielsweise Promotoren enthalten, die aus dem
Genom von Säugetierzellen,
(z. B. der Mäuse-Metallothionin-Promotor) oder
aus Viren, welche in diesen Zellen wachsen, (z. B. der Vacciniavirus
7.5 K-Promotor) isoliert wurden.
-
Geeignete
kommerziell verfügbare
Expressionsvektoren, in welche die kodierenden Sequenzen der vorliegenden
Erfindung eingefügt
werden können,
schließen
die Säugetierexpressionsvektoren pcDNA
I oder pcDNA I/Neo (welcher bevorzugt ist), den Baculovirus-Expressionsvektor
pBlueBac, den prokaryotischen Expressionsvektor pcDNA II und den
Hefeexpressionsvektor pYes2 ein, wobei alle von Invitrogen Corp.,
San Diego, Calif. erhalten werden können.
-
Wirtszellen
-
Die
vorliegenden Erfindung betrifft weiterhin Wirtszellen, welche Expressionsvektoren
enthalten, die DNA-Sequenzen für
das Protein von Interesse und das Cyclin-D-Genprodukt umfassen.
Geeignete Wirtszellen sind eukaryotische Zellen; beispielsweise Spodoptera
frugiperda-Insektenzellen, COS-7-Zellen, menschliche Fibroblasten
und Saccharomyces cerevisiae-Zellen.
Säugetierzellen,
die als Wirte nützlich
sein können,
schließen
Zellen ein, deren Ursprung Fibroblasten sind (z. B. VERO oder CHO-K1), oder
die lymphoiden Ursprungs sind (z. B. SP2/0-AG14 oder P3x63Sg8) oder
Derivate davon Bevorzugte Säugetierwirtszellen
sind CHO-Zellen.
-
Immortalisierte
Zellen, wie etwa Myelom- oder Lymphomzellen, sind ebenfalls geeignete
Wirtszellen. Diese Zellen können
in einem geeigneten Nährmedium
in Kulturflaschen wach sen gelassen werden oder in einen synergenen
Wirt (z. B. Maus oder Ratte) oder einen immundefizienten Wirt oder einen
entsprechenden Wirtsort (z. B. Nacktmaus oder Hamstertasche) injiziert
werden. Insbesondere können
die Zellen zur Produktion von Aszitesflüssigkeit und zum Ernten des
chimären
Moleküls
in die Abdominalhöhle
eingeführt
werden. Alternativ können
die Zellen subkutan injiziert und die Antikörper aus dem Blut des Wirts
geerntet werden. Die Zellen können
auf die gleiche Weise wie die Hybridomzellen verwendet werden. Siehe
Diamond et al., N. Eng. J. Med., 304, 1344 (1981); Monoclonal Antibodies:
Hybridomas – A
New Dimension in Biologic Analysis (Kennatt et al., Hrsg.) Plenum
(1980).
-
Es
können
Expressionsvektoren in Wirtszellen durch verschiedene Verfahren,
die im Stand der Technik bekannt sind, eingeführt werden. Beispielsweise
kann eine Transfektion von Wirtszellen mit Expressionsvektoren durch
die Methode der Calciumphosphatpräzipitation durchgeführt werden.
Allerdings können
auch andere Verfahren zum Einführen von
Expressionsvektoren in Wirtszellen (beispielsweise Elektroporation,
liposomale Fusion, Kerninjektion und eine Infektion durch Viren
oder Phagen) eingesetzt werden.
-
Wirtszellen,
die einen Expressionsvektor enthalten, können durch einen oder mehrere
der folgenden 6 allgemeinen Ansätze
identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung; (b) Vorhandensein oder
Fehlen von Markergenfunktionen; (c) Abschätzen der Trankriptionsstärke, wie
durch die Produktion von mRNA-Transkripten, welche die Genkonstrukte in
der Wirtszelle kodieren, gemessen; (d) immunologischer Nachweis
des Genprodukts; (e) Enzymtest; und (f) PCR. Diese Verfahren sind
im Stand der Technik gut bekannt; siehe beispielsweise
US-Patent Nr. 5,744,314 .
-
Die
Expressionsvektoren und DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung
können
auch sequenziert werden. Es sind verschiedene Sequenzierungsverfahren
im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise die Dideoxykettenabbruchmethode,
beschrieben in Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-7
(1977), und die Maxam-Gilbert-Methode, beschrieben in Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74, 560-4 (1977).
-
Sobald
ein Expressionsvektor in eine geeignete Wirtzelle eingeführt worden
ist, kann die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert werden, welche eine
Expression von großen
Mengen an dem Protein von Interesse erlauben. Das Protein von Interesse kann
isoliert und entsprechend herkömmlicher
Bedingungen, wie etwa Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Affinitätschromatographie,
Elektrophorese und Ähnliches,
gereinigt werden. Das bevorzugte Verfahren ist die Affinitätschromoatographie.
-
Es
sollte selbstverständlich
verstanden werden, dass nicht alle Expressionsvektoren und regulatorischen
DNA-Sequenzen gleich gut funktionieren werden, um die Nukleinsäuren der
vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Ebensowenig werden alle Wirtszellen
gleich gut mit demselben Expressionssystem funktionieren. Allerdings
kann jemand, der auf dem Gebiet sachkundig ist, eine Auswahl unter den
Expressionsvektoren, regulatorischen DNA-Sequenzen und Wirtzellen unter Anwendung
der hier gegebenen Anleitung ohne übermäßiges Experimentieren treffen
und ohne sich vom Umfang der vorliegenden Erfindung zu entfernen.
-
Genaue Beschreibung von bevorzugten
Ausführungen
-
Im
Folgenden werden spezielle Ausführungen
der vorliegenden Erfindung genau beschrieben. Diese Ausführungen
sind beispielhaft und dienen dazu, die breite Anwendbarkeit der
Erfindung zu veranschaulichen. Sofern nicht anders in der Beschreibung
angegeben, umfassen diese Ausführungen
bevorzugte Elemente der Erfindung.
-
Material und Methoden
-
Plasmide
-
Das
menschliche Cyclin D1-Gen (Genbank-Zugangsnummer M64349) wurde in
pcDNA 3.1 (Invitrogen) kloniert und konstitutiv unter dem Cytomegalovirus
(CMV)-Promotor/Enhancer exprimiert, um pcDNA 3.1/Cyclin D1 zu erzeugen.
Der Vektor trägt
auch das Gen für
die Neomycinresistenz zur Selektion von stabilen Säugetierzelllinien
in Gegenwart von G418.
-
Zellkultur
-
Es
wurden CHOd–(SF)-Zellen
in 100 mm-Schalen in Vollmedium {DMEM (Gibco/BRL), 5% fötales Rinderserum
(JRH Bioscience), 1% nicht-essentielle Aminosäuren (Gibco/BRL), 1% Hypoxanthin/Thymidin
(HT) (Gibco/BRL) und 1% Glutamin/Penicillin/Streptomycin (Gibco/BRL)}
wachsen gelassen. Die Zellen wurden trypsiniert, gezählt und 60
mm-Platten (Falcon) in einer Dichte von 1 × 106 Zellen/Schale
ausgesät.
Es wurden AM-1-CHOd–-Zellen in Suspensionsspinnerkultur
in Amgen VM-Sojamedium wachsen gelassen. Die Zellen wurden gezählt, zentrifugiert,
in Vollmedium resuspendiert und in 60 mm-Platten in einer Dichte
von 1 × 106 Zellen/Schale ausgesät. Die Zellen wurden über Nacht
inkubiert. Drei Stunden vor der Transfektion wurde das Medium auf
den Zellen durch 4 ml frisches Medium ersetzt.
-
Cyclin
D1-Transfektion. Die Transfektion verwendete den Vektor pcDNA3.1
neo® (Invitrogen),
der das Cyclin D1/cDNA-Insert enthielt. Für jede 60 mm-Platte mit Zellen
wurden 5 μg
pcDNA3.1/Cyclin D1 (2 mg/ml) und 5 μg genomische Träger-DNA
der Maus (Clontech) (100 μg/ml)
zu 172,5 μl
sterilem destilliertem Wasser gegeben. Es wurden 25 μl 2,5 M CaCl2 zu der DNA-Lösung gegeben, wodurch sind ein
Endvolumen von 250 μl
ergab. Als eine Vektorkontrolle wurden 5 μg pneo-Vektor-DNA (1,126 mg/ml)
zusammen mit 5 μg
Träger-DNA
zu 170,5 μl sterilem
Wasser gegeben, gefolgt durch 25 μl
2,5 M CaCl2. Als eine Lösungsmittelkontrolle wurden
25 μl 2,5
M CaCl2 zu 225 μl Wasser gegeben. Die DNA-Lösungen wurden
tropfenweise zu einem gleichen Volumen (250 μl) 2 × HBS (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5
mM NaHPO4 2 H2O,
0,2 mM Dextrose, 50 mM HEPES, pH 7,05) gegeben, wohindurch ständig Luft sprudeln
gelassen wurde. Die DNA/HBS-Lösungen wurden
bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Das Medium wurde von den
CHO-Zellplatten entfernt, und die DNA/HBS-Lösungen (500 μl Gesamtvolumen/Schale)
wurden tropfenweise zugegeben. Insgesamt drei Platten wurden mit
pcDNA 3.1/Cyclin D1 und jeweils eine Platte für den Vektor und die Lösungsmittelkontrollen
für jede
Zelllinie behandelt. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten
inkubiert, wonach 5 ml Vollmedium zu jeder Schale gegeben wurden.
Die Zellen wurden dann über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Medium durch frisches Medium
ersetzt.
-
Die
CHO(SF)-Zellen erreichten 48 Stunden nach der Transfektion Konfluenz.
Die Zellen wurden trypsiniert und in Vollmedium in einem Verhältnis von 1 × 60 mm-Schale
zu 8 × 100
mm-Schalen erneut ausplattiert. Am folgenden Tag wurde das Medium durch
Vollmedium, das 1 mg/ml Geneticin (G418) (Gibco/BRL) enthielt, ersetzt.
Die AM-1-CHO-Zellen erreichten 72 Stunden nach der Transfektion
Konfluenz und wurden auf ähnliche
Weise erneut ausplattiert. Das Medium auf den Zellen wurde durch
frisches Vollmedium + G418 zweimal wöchentlich ersetzt. Zehn Tage
nach der anfänglichen
Zugabe des G418-Selektivmediums wurden Kolonien von den Platten
mit transfizierten CHO(SF) und AM-1-CHO-Cyclin D1 unter Verwendung
von Glasklonierungszylindern (Bellco) isoliert. Die Zellen wurden
trypsiniert und in 24-Well-Platten erneut ausgesät. Die Transfektionshäufigkeit
der CHO(SF)-Zellen war sehr viel höher (> 100 Kolonien/Platte) als die der AM-1-CHO-Zellen
(20–30
Kolonien/Platte). Insgesamt 72 Kolonien wurden von den CHO(SF)/Cyclin D1-Platten
und 68 Kolonien von den AM-1-CHO/Cyclin D1-Platten isoliert. Auf
keinem Satz der Schalen der Lösungsmittelkontrolle,
die G418-Selektivmedium enthielten, waren Kolonien vorhanden. Nachdem Kolonien
gepickt worden waren, wurden die verbleibenden Zellen von jedem
Satz von Platten trypsiniert und in Poolkulturen in 100 mm-Platten
(3 Pools für CHO(SF)/Cyclin
D1 und 2 Pools für
AM-1-CHO/Cyclin D1) vereinigt.
-
Die
transfizierten Zellen wurden zur Konfluenz wachsen gelassen und
dann in 6-Well-Platten, 2 Wells/Klon/Pool, erneut ausplattiert.
Nachdem Konfluenz erreicht worden war, wurde 1 Well von Zellen für jeden
Klon/Pool mit 250 ml 1% Triton-Lysepuffer (1% Triton × 100, 1
mM NaVO3, 50 mM Tris/HCl, pH 8, 100 mM NaCl,
Proteaseinhibitoren) lysiert. Die Lysate wurden bei 14 K 15 Minuten
zentrifugiert. Die Überstände wurden
gesammelt und bei –20°C gelagert.
Die Lysate wurden durch Western blot auf eine Cyclin D1-Expression
analysiert. Es wurden 25 μl
von jeder Probe plus Kontrollproben der Stammzelllinien CHO(SF)
und AM-1-CHO mit
5 μl 5 × PAGE-Gel-Probenpuffer
gemischt, 3 Minuten gekocht und auf 12% Novex Tris-Glycin-Gele geladen.
Die Gele wurden auf 0,2 μm
Nitrozellulosefilter (Schleicher und Schuell) elektrisch geblottet.
Die Filter wurden mit monoklonalem anti-Cyclin D1-Ab-3-Antikörper (Calbiochem)
als Sonde in Kontakt gebracht und unter Verwendung von ECL-Reagenzien von Amersham
entwickelt. Die Ergebnisse zeigten verschiedene Grade einer Überexpression
von Cyclin D1 in den Poolkulturen und in den meisten Klonen.
-
Die
beiden AM-1-CHO/Cyclin D1-Poolkulturen und die beiden CHO(SF)/Cyclin
D1-Poolkulturen mit
der höchsten
Expression wurden in „Masterpools" für jede Zelllinie,
die in anschließenden
Transfektionen verwendet werden sollte, kombiniert. Die Masterpoolkulturen
wurden untersucht, um zu bestimmen, ob sie den negativen DHFR-Phänotyp beim
Wachsen der Zellen in Hypoxanthin/Thymidin-freiem Selektivmedium
(DMEM, 5% dialysiertes fötales
Rinderserum (Hyclone), nicht-essentielle Aminosäuren/Glutamin/Penicillin/Streptomycin)
beibehalten hatten. Es wurde kein Zellwachstum in diesem Medium
nachgewiesen.
-
EPO-Transfektion
-
Es
wurden Masterpoolkulturen von CHO(SF)/Cyclin D1 und AM-1-CHO/Cyclin
D1 in CHOd–-Vollmedium,
supplementiert mit 1 mg/ml G418, gehalten. Diese Zellen wurden in
60 mm-Platten mit einer Dichte von 8 × 105-Zellen/Schale
ausgesät
und über
Nacht inkubiert. Die Zellen wurden unter Verwendung des oben dargestellten
Protokolls mit pSW19 (einem nahem Derivat von pDSRα2)/EPO-Ziel-DNA,
pDSRα2-Vektor-Kontroll-DNA
und Träger-DNA aus Heringssperma
(Gibco/BRL) transfiziert. Es wurde eine Endkonzentration von 5 μg/Schale
von pSW 19/EPO-DNA verwendet. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion
wurde den Zellen frisches Medium zugegeben. Zweiundsiebzig Stunden
nach der Transfektion wurden die Zellen trypsiniert und in Selektivmedium
+ 1 mg/ml G418 in einem Verhältnis
von 1:8, 1:10 und 1:20 (60 mm-Platte bis 100-mm-Platte) erneut ausgesät. Das Medium
auf den Zellen wurde zweimal wöchentlich durch
frisches Medium, das G418 enthielt, ersetzt. Zwölf Tage nach dem erneuten Ausplattieren
wurden 48 Kolonien von den Platten mit transfizierten CHO(SF)/Cyclin
D1-EPO isoliert. Die verbleibenden Zellen wurden trypsiniert und
in zwei Poolkulturen vereinigt. Fünfzehn Tage nach dem erneuten
Ausplattieren wurden 48 Kolonien von den Platten mit den transfizierten
AM-1-CHO/Cyclin D1/EPO isoliert, und die verbleibenden Zellen wurden
in zwei Pools vereinigt. Eine EPO-Expression wurde durch Western
blot von Ernten aus serumfreiem konditioniertem Medium von konfluenten
24-Well-Kulturen
von isolierten Klonen oder Kulturen der Pools auf 100 mm/Platten
analysiert. Die Gele wurden unter reduzierenden Bedingungen laufen
gelassen, und die Blots wurden mit monoklonalem anti-EPO-Antikörper 2D8
als Sonde in Kontakt gebracht.
-
OPG-Transfektionen
-
Transfektionen
eines pSW19/OPG-DNA-Konstrukts in Masterpools von CHOd–(SF)/Cyclin
D1 und AM-1-CHOd–/Cyclin D1 und die Stammzelllinie
CHOd–(SF)
wurden auf dieselbe Weise wie die EPO-Transfektionen durchgeführt. Es
wurden zwei getrennte Transfektionen von OPG-Fc (22-201) in allen
drei Wirtszelllinien durchgeführt.
Insgesamt 124 Kolonien von CHO(SF), 110 Kolonien von CHO(SF)/cycD
und 147 Kolonien von AM-1-CHO/cycD wurden von den OPG-Fc(22-210)-Transfektionen
gepickt. Es wurde die OPG-Expression in den sich ergebenden Klonen und
Pools durch Western blot und unter Verwendung von antihuIgG-Fc-HRP-Antikörper (Pierce)
oder affinitätsgereinigtem
polyklonalem anti-huOPG-Kaninchenantikörper analysiert.
-
Propidiumiodid-Färbung von
DNA
-
Die
Zellen wurden in 100 mm-Platten ausgesät und bis zu einer Konfluenz
von ungefähr
50% wachsen gelassen. Die Zellen mussten sich für den Test in der log-Phase
befinden. Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet und in
ein Zentrifugenröhrchen,
das ein gleiches Volumen an DMEM/FBS enthielt, pipetiert. Ein Aliquot
der Zellsuspension wurde mit einem Hämocytometer gezählt. Die
Zelldichte sollte ungefähr
106 bis 107 Zellen/5
ml betragen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1000 × g pelletiert
und zweimal mit eiskalter PBS gewaschen. Die Zellen mussten in Form
einer Einzelzellsuspension vorliegen. Es wurden 0,5 ml PBS zugesetzt
und die Zellsuspension wurde gevortext. Die Zellen wurden dann durch
tropfenweises Zugeben von 2 ml 70% Ethanol entlang der Seite des
Röhrchens
fixiert, während
die Zellsuspension vorsichtig gemischt wurde. Die minimale Fixierungszeit
beträgt
30 Minuten (an diesem Punkt kann die Zellsuspension ungefähr 2 Wochen
bei 4°C
vor dem Färben
und der Analyse gelagert werden). Die Zellen wurden zentrifugiert,
um den Ethanolüberstand
zu entfernen, einmal mit PBS gewaschen und für 5 Minuten bei 4°C rehydratisieren gelassen.
Die Zellen wurden zentrifugiert, die PBS wurden entfernt und das
Pellet wurde in 0,5 ml Propidiumiodid-Lösung (Molecular Probes) (50 μg/ml, hergestellt
in PBS) resuspendiert. Es wurden 10 μl DNAse-freie RNAse (10 mg/ml)
(Boehringer Mannheim) zugegeben, und die Zellsuspension wurde bei
37°C 20
Minuten inkubiert. Die Proben wurden mit 1 ml PBS verdünnt und
durch FACS innerhalb von einer Stunde analysiert.
-
Genamplifikation
-
Eine
Genamplifikation in den Zellen wurde durch die allmähliche schrittweise
Zugabe von Methotrexat (MTX) zu dem Wachstumsmedium durchgeführt. Die
Zellen wurden in einem Verhältnis
von 1:10 in 100 mm-Platten in drei niedrigen Konzentrationen von
Methotrexat (1 nM, 2,5 nM und 5 nM) subkultiviert. Das Wachstum
der Zellen wurde beobachtet, und die Platte, welche zuerst Konfluenz
erreichte, wurde für
die nächste
Amplifizierungsrunde verwendet. Wenn die Zellen in mehr als einer
Konzentration von Methotrexat gleich gut wuchsen, wurde die höchste Konzentration
für die
nächste
Runde verwendet. Eine Ernte von 48 Stunden serumfreiem DMEM (4 ml/Platte)
wurde zur Analyse der Stärke der
Proteinexpression durch Western blot oder EIA entnommen. Man ließ die Zellen
sich 24 Stunden in Vollmedium mit Methotrexat erholen, und sie wurden dann
in einem Verhältnis
von 1:10 in drei höheren Methotrexatkonzentrationen
subkultiviert. Die Konzentration von MTX wurde in Stufen von 10
nM bis zu 100 nM erhöht.
Allgemein gilt, wenn die Stärke
der Proteinexpression bis 100 nM keinen Spitzenwert erreicht hat,
wird die Amplifikation in Stufen von 100 nM fortgesetzt, bis eine
maximale Expressionsstärke
erreicht wird. Die Zellen wurden in Gegenwart von MTX gehalten,
sobald eine optimale Konzentration bestimmt worden war.
-
Erzeugung der AM-1/D-Zelllinie
-
Die
AM-1/D-Zelllinie wurde von der CHOd(–)-Zelllinie abgeleitet, die
im
US-Patent Nr. 4,703,008 ,
erteilt am 27. Oktober 1987, und in Urlaub et al. (1980), Proc.
Natl. Acad. Sci. 77: 4461 beschrieben wurde. Die CHOd(–)-Zelllinie
wurde durch Passagieren in den VM-SOY-Medien mit abnehmenden Konzentrationen
von fötalem
Rinderserum und schließlich
bei dessem völligem
Fehlen adaptiert. Die sich ergebende serumfrei adaptierte Zelllinie
AM-1 behält
den dhfr(–)-Phänotyp noch
bei. Die AM-1-Zelllinie wurde konstruiert, um menschliches Cyclin
D1 zu überexprimieren.
-
pcDNA3.1/Cyclin
D1 wurde in die AM-1-Zelllinie durch das Standardverfahren der Calciumphosphatpräzipitation
zur Transfektion transfiziert. Nach Selektion mit G418 wurden die
Kolonien trypsiniert und in zwei Pools vereinigt. Die Expression
von menschlichem Cyclin D1-Protein wurde durch Western blots (1) der Zelllysate, die aus den Pools hergestellt
wurden, unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen
menschliches Cyclin D1 (anti-Cyclin D1-Ab-3, Calbiochem) gezeigt.
Es wurde eine Reihe von Kolonien mit Klonierungsringen zufallsverteilt
gepickt, und die Zelllysate wurden hergestellt und ebenfalls analysiert.
Die Expression von menschlichem Cyclin D1 war bei den Klonen wie
erwartet unterschiedlich. Im Vergleich mit den Klonen zeigten die
beiden Pools insgesamt hohe Werte für das menschliche Cyclin D1-Protein
(1). Die beiden Pools wurden in einer
Masterpoolkultur (AM-1/D) vereinigt, die als die Stammzelllinie
in allen nachfolgenden Experimenten verwendet wurde.
-
In
der Zelllinie AM-1/D exprimiertes menschliches Cyclin D1 ist funktionell
Wir stellten fest, dass menschliches Cyclin D1 funktionell durch
seine Änderung
der Zellzyklusdynamiken funktionell exprimiert wurde; siehe beispielsweise 2 und weiter unten.
-
Nicht-synchronisierte
Zellen der Zelllinien AM-1/D und AM-1 wurden mit Propidiumiodid
gefärbt und
durch FACScan (Becton Dickinson) analysiert. Die 2A bis 2D zeigen
den relativen DNA-Gehalt (x-Achse) und die Zellzahl (y-Achse). Es gab
signifikant mehr Zellen in der S-Phase bei den AM-1/D-Zellen (40,08%,
40,14%) im Vergleich zu den AM-1-Zellen (33,73%, 32,35%). Dies zeigte, dass
eine Überexpression
des menschlichen Cyclin D in AM-1/D,
einer CHO-Zelllinie, funktionell war insofern, als die Zellzyklusdynamiken
signifikant geändert
wurden.
-
Beispiel
1: Das Plasmid pDSRα2/OPG-Fc wurde
konstruiert, um ein menschliches OPG(Genbankzugangsnummer U94332)-Fc-Fusionsprotein mit
dem Expressionsvektor pDSRα2
zu exprimieren. Unter Verwendung der standardmäßigen Calciumphosphatpräzipitation
wurde liniarisierte DNA von pDSRα2/OPG-Fc
parallel in AM-1/D-Zellen und nicht-modifizierte, ursprüngliche
AM-1-Zellen transfiziert. Es wurden 44 Kolonien von jeder Transfektion zufallsverteilt
gepickt, woraufhin die Zellen in Selektivmedien, denen die HT-Supplemente
fehlten, für zwei
Wochen überführt wurden.
-
Die
Kolonien wurden einzeln in 24-Well-Platten überführt und zur Konfluenz wachsen
gelassen. Nach 48 Stunden wurden serumfrei konditionierte Medien
gesammelt und durch EIA unter Verwendung eines Antiserums, das für menschliches
OPG spezifisch war, analysiert. 3 zeigt
die Anzahl an Klonen, die OPG-Fc in unterschiedlichen Stärken aus diesen
beiden Zelllinien exprimieren. Es ist eindeutig, dass es signifikant
mehr Klone aus den AM-1/D-Zelllinien,
die das rekombinante Protein in größerem Ausmaß exprimieren, gibt, und dass
sich alle Klone mit der stärksten
Expression, die mehr als 20 mg/ml OPG-Fc exprimierten, von der Zelllinie
AM-1/D ableiteten.
-
Beispiel
2: Das Plasmid pDSRα2/hEpo
wurde konstruiert, um das menschliche Epo-Gen zu exprimieren und
nach der oben beschriebenen Calciumphosphatmethode in AM-1/D-Zellen
zu transfizieren. Es wurden 84 Kolonien zufallsverteilt zur weiteren
Analyse gepickt. Vier der Klone mit der stärksten Expression wurden durch
EIA-Analyse der konditionierten Medien identifiziert und einer Methotrexat-Amplifikation,
ausgehend von 1 nM, unterzogen. 4 zeigt
die Expression von EPO während
des Amplifikationsprozesses. Zwei der Klone, AM-1/D-Klon 2 und AM-1/D-Klon 33, zeigten
eine erhöhte
Epo-Produktion mit ansteigenden Konzentrationen von MTX, was eine
erfolgreiche Genamplifikation zeigt. Diese Klone wur den nach Einfrieren
und Auftauen untersucht, und zahlreiche Passagen ohne Verlust der
Epo-Expression zeigten
die Stabilität
der Epo-Genexpression in diesen Klonen.
-
Expression von OPG in AM-1/Cyclin D-CHO-Zellen
-
Die
Expression von zwei OPG-Konstrukten wurde in AM-1/Cyclin D-CHO-Zellen
und anderen CHO-Zelllinien verglichen. OPG(22-201)-Fc wurde in AM-1/Cyclin
D-CHO-Zellen und die Stamm-CHO-Zelllinie, die vorher adaptiert worden war,
um in serumfreiem Medium [CHO(SF)] zu wachsen, transfiziert. OPG(22-194) • cyc-Fc
wurde in AM-1-Cyclin D-CHO-Zellen
und in deren Stammzelllinie AM-1-CHO transfiziert. Die Transfektionen
wurden unter Verwendung der Calciumphosphat-Standardmethode und
der DHFR-Selektion durchgeführt. Die
transfizierten Kolonien wurden unter Verwendung von Glasklonierungszylindern
isoliert. Einzelne Kolonien wurden zur Konfluenz in 24-Well-Platten wachsen
gelassen. Es wurden Ernten von serumfrei konditioniertem Medium
auf sezerniertes OPG durch Western blot unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums
gegen OPG analysiert. Proben von konditioniertem Medium von diesen
Klonen, welche die höchsten
Expressionsstärken
im Western blot zeigten, wurden durch ELISA weiter analysiert. Wir
verglichen Expressionsstärken
von OPG(22-194)-cys-Fc in 46 einzelnen Klonen, die sich von AM-1-CHO-Zellen
oder AM-1/Cyclin
D-CHO-Zellen ableiteten (5). Wir verglichen auch die OPG(22-201)-Fc-Expression in den
24 Klonen mit der stärksten
Expression, wie zuvor durch Western blot bestimmt (6).
In jedem Fall zeigen Klone, die sich von der AM-1/Cyclin D-CHO-Zelllinie
ableiten, signifikant höhere
Expressionsstärken
als Klone, die sich von CHO(SF)- oder AM-1-CHO-Zellen ableiten.
-
Expression von NESP in an
serumfreies Medium angepasste CHO-Zellen
-
NESP-DNA,
die in den pDSR • 2-Expressionsvektor
eingefügt
war, wurde durch die Calciumphosphat-Standardmethode in drei verschiedene,
an serumfreie Bedingungen angepasste CHOd–-Zelllinien
transfiziert: CHOd–(SF), AM-1 und AM-1/Cyclin
D. Die Transfektion, Selektion und Isolierung von Klonen wurde in
Serum enthaltendem Medium in adhärenter
Kultur durchgeführt.
Klone, die NESP stark exprimierten, wurde anfänglich durch Western blot unter
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen EPO identifiziert.
Eine Quantifizierung der Expression wurde mittels EIA durchgeführt. Die
Klone mit der höchsten
Expression aus jeder Zelllinie wurden auf ein Wachstum in Suspensionskultur
in serumfreiem Medi um untersucht. Die Klone durchliefen auch eine
DNA-Amplifikation durch Wachstum in stufenweise ansteigenden Konzentrationen
von Methotrexat in Serum enthaltendem Medium in adhärenter Kultur.
Die NESP-Expression während
des Amplifikationsprozesses wurde durch Westen blot- und EIA-Analysen
beobachtet. In verschiedenen Stadien während des Amplifikationsprozesses
wurden die Klone auf ein Wachstum und eine Expression in serumfreier
Suspensionskultur analysiert. Klone, die sich von der AM-1/Cyclin-D-CHO-Zelllinie
ableiteten, wiesen eine insgesamt höhere NESP-Expressionsstärke auf
als solche, die sich von den anderen beiden CHO-Stammzelllinien
ableiteten (7). Die Klone wurden auch durch
isoelektrische Fokussierung analysiert, um die Verteilung von Isoformen
zu bestimmen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den
Verteilungen der Isoformen in den verschiedenen Klonen oder in einer
Kontrollzelllinie (61L), die sich von der Stamm-CHO-Zelllinie ableitete,
beobachtet.
-
Abkürzungen,
die in dieser Beschreibung durchgängig verwendet wurden, sind
wie folgt definiert:
- CHO
- Ovar vom Chinesischen
Hamster
- EBV
- Epstein-Barr-Virus
- EIA
- Enzymimmuntest
- EPO
- Erythropoetin
- HBS
- HEPES-gepufferte Salzlösung
- MTX
- Methotrexat
- NESP
- neues, die Erythropoese
stimulierendes Protein
- OPG
- Osteoprotegrin