DE69233387T2

DE69233387T2 - Genmanipulation und Expression mittels genomischer Elemente

Info

Publication number: DE69233387T2
Application number: DE69233387T
Authority: DE
Inventors: Stephen Sherwin; Sue Klapholz; Arthur Skoultchi
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1991-05-06
Filing date: 1992-05-05
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2012-05-06
Also published as: SG93780A1; DE69233387D1; ATE272121T1; CA2102628A1; CA2102594C; WO1992019255A1; JPH06507550A; EP0584214A4; KR100259933B1; NO934011D0; JP2008086326A; AU1973292A; AU671801B2; NO934011L; EP0584214B1; CA2102594A1; EP0584214A1

Description

EINFÜHRUNG
Technisches Gebiet
Das Gebiet dieser Erfindung betrifft die Manipulation und Expression von Säugergenen.
Hintergrund
Mit der Entwicklung der Gentechnologie über die letzten beiden Jahrzehnte, einschließlich der Restriktionsenzyme, der Umkehrtranskriptase, des Klonens, der Polymerase-Kettenreaktion, Sequenzanalyse und monoklonaler Antikörper entstand eine außergewöhnliche Steigerung der Fähigkeit zur Isolierung, Identifizierung und Manipulation von Nukleinsäuresequenzen. Diese Fähigkeiten führten zur Identifizierung und Manipulation zahlreicher Gene und der Elemente für ihre Transkriptionskontrolle. Die Gene wurden zur Herstellung großer Mengen eines erwünschten Proteins in heterologen Wirtsorganismen (bakterielle und eukaryotische Wirtszellensysteme) verwendet.
In vielen Fällen war der Prozess der Gewinnung codierender Sequenzen und des Herausfindens ihrer Expression langwierig und mühsam. Die Identifizierung der codierenden Sequenz, der komplementären DNA (cDNA) oder genomischen DNA, war häufig mit der Erstellung von Bibliotheken, der Identifizierung von Fragmenten des offenen Leserasters, der Untersuchung flankierender DNA-Sequenzen und dergleichen verbunden. Bei Säugergenen, wo man häufig auf dazwischenliegende Sequenzen – Introns – trifft, ist der codie rende Bereich nur ein kleiner Bruchteil der gesamten, mit dem Gen zusammenhängenden Nukleinsäure. In anderen Fällen haben Pseudogene oder Multigenfamilien die Fähigkeit zur Isolierung eines bestimmten Gens von Interesse verdeckt. Nichtsdestoweniger ergab sich mit verbesserten Verfahren eine kontinuierliche Entwicklung der erfolgreichen Identifizierung und Isolierung interessierender Gene.
Aus vielen Gründen kann es wünschenswert sein, den codierenden Bereich oder die Regulationsbereiche für die Transkription zu manipulieren, ohne den codierenden Bereich zu isolieren oder den codierenden Bereich an einem Fragment zu klonen, wo der codierende Bereich die primäre Sequenz ist. Zu diesen Gründen kann eine einfachere Manipulation, die Entwicklung verschiedener Wege für die Expression oder dergleichen gehören.
In vielen Situationen besteht auch vor allem Interesse an einer Quelle für das Proteinprodukt. Der Zelltyp in dem Körper, der das Produkt hervorbringt, ist oft eine unzulängliche Quelle. Deshalb besteht ein bedeutendes Interesse an der Entwicklung alternativer Verfahren für die Produktion interessierender Proteine in Kulturen mit Zellen, die eine wirtschaftliche und effiziente Produktion des erwünschten Proteins und wenn möglich eine angemessene Verarbeitung des Proteinproduktes ermöglichen.
Einschlägige Literatur
Mansour et al Nature, 336: 348–352 (1988) beschreibt eine allgemeine Strategie für zielgerichtete Mutationen von nicht selektionsfähigen Genen. Weidle et al, Gene, 66: 193–203 (1988) beschreibt die Amplifizierung eines Plasminogen-Aktivators eines Gewebetyps mit einem DHFR-Gen und den Verlust der Amplifizierung wenn der Selektionsdruck fehlt. Murnane und Yezzi, Somatic Cell and Molecular Genetics (Körperzellen und Molekulargenetik), 14: 273–286, (1988), beschreiben die Transformation einer Zelllinie des Menschen mit einem integrierten, selektionsfähigen Markierungsgen ohne Transkriptionspromoter, mit Tandem-Duplizierung und Amplifizierung des Genmarkers. Thomas und Campecchi, Cell, 51: 503–512 (1987) beschreiben eine positionsorientierte Mutagenese durch Ziel-Gene in Stammzellen, die von Mäuseembryos gewonnen wurden. Song et al., Proc. National Academy of Science, USA, 84: 6820–6824, (1987) beschreiben die homologe Rekombination in Zellen des Menschen durch Integration in zwei Phasen. Liskey et al., "Homologous Recombination Between Repeated Chromosomal Sequences in Mouse Cells" (Homologe Rekombination zwischen wiederholten Chromosomensequenzen in Mäusezellen), Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol. 49: 13–189, (1984) beschreiben die Integration von zwei verschiedenen Mutationen des gleichen Gens und eine Rekombination zwischen den Mutantengenen. Rubnitz und Subramani, Mol. and Cell. Biol. 4: 2253–2258, (1984) beschreiben das Minimum an Homologie, das für eine homologe Rekombination in Säugerzellen erforderlich ist. Kim und Smithies, Nucl. Acids. Research 16: 8887–8903, (1988) beschreiben einen Versuch zur homologen Rekombination unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion.
Burke et al., Science 236: 806–812 (1987) beschreiben künstliche Hefechromosome (YACs). Siehe auch Garza et al., Science 246: 641–646 (1989) und Brownstein et al., Science 244: 1348–1351 (1989).
Siehe auch U.S. Anmeldung Serie Nr. 432,069, eingereicht am 6. November 1989 und Serien-Nummern 466,088, eingereicht am 12. Januar 1990 und 610,515, eingereicht am 11. November 1990, die mit diesem Hinweis in die gegenwärtige Beschreibung aufgenommen werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Ausprägung von Säuger-Proteinen wird durch homologe Rekombination erreicht, wobei eine DNA-Sequenz in das Genom oder in ein großes Fragment desselben eingebaut wird, um die Ausprägung des Zielgens zu verstärken. Die modifizierte Sequenz kann dann zu Ausprägung an einen Zwischenwirt übertragen werden. Wo ein amplifizierbares Gen angrenzend an das Zielgen eingebaut wird, kann der Zielbereich für eine verstärkte Ausprägung amplifiziert werden.
Zwei verschiedene Ziele können angepeilt werden: die homologe Rekombination in einer Wirtszelle, die den "wilden" Standardtyp des Zielgens beinhaltet oder die Aufnahme in einem ausgewählten künstlichen Hefechromosom oder in einer Bank künstlicher Hefechromosome und Übertragung des Zielbereichs auf den Ausprägungswirt. Bei Verwendung eines künstlichen Hefechromosoms oder einer Genombank für künstliche Hefechromosome, die Säuger-DNA, insbesondere DNA des Menschen, enthält, wird das interessierende Gen durch homologe Rekombination manipuliert, einschließlich der Einführung eines amplifizierbaren Gens in der Nähe des Zielgens zur Ermöglichung der Amplifizierung und ferner, abhängig vom Wirt für die Ausprägung, einschließlich einer Modifizierung des Transkriptionssystems und einer Modifizierung des codierenden Bereichs. Abhängig davon, ob das Gen im Hefewirt ausgeprägt werden kann, wird das künstliche Hefechromosom zur Integration und Ausprägung des Zielgens gewöhnlich in einen Wirt für die Säugerzellenausprägung transformiert. Dann kann die Amplifizierung induziert werden und die Zellen können im Hinblick auf ein stabil hohes Niveau der Ausprägung des Zielgens ausgewählt werden.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Verfahren und Zusamensetzungen für die Produktion interessierender Säuger-Proteine in Kulturen sind insbesondere dort vorgesehen, wo eine Manipulation des nativen Transkriptionssystems und/oder des codierenden Bereichs erwünscht ist. Das Verfahren verwendet die Integrations-DNA durch homologe Rekombination in genomische DNA, entweder in der nativen Primärwirtszelle oder in einer Hefe-Primärwirtszelle unter Verwendung künstlicher Hefechromosome oder einer Genombank für künstliche Hefechromosome als Quelle des Zielgens. Das erstere Verfahren ist in der am 6. November 1989 eingereichten Patentanmeldung Serie Nr. 432,069 beschrieben.
Zur Transformation der Primärwirtszelle können die Zellen mit der DNA-Zielkonstruktion gezüchtet und transformiert werden, unter Verwendung einer Reihe von Selektionsverfahren zur Auswahl der Zellen mit dem geeigneten Einbauverhalten. Gewöhnlich erfolgen nur ein oder zwei Integrationsschritte. Größtenteils werden die gleichen Konstrukte und Verfahren für den gezielten Einbau eines Gens in ein Chromosom einer nativen Zelle oder in einem großen Genomfragment in einem künstlichen Hefechromosom verwendet.
Die aus künstlichen Hefechromosomen bestehende Bank beziehungsweise Bibliothek wird in einem Hefewirt aufrechterhalten und weitergeführt und dann für die Integration in ein DNA-Zielkonstrukt verwendet, das gewöhnlich ein amplifizierbares Gen enthält, für die Integration in ein Zielgebiet, welches das Zielgen enthält und dieses Zielgen codiert das interessierende Protein und gestattet im gleichen oder einem getrennten Schritt eine Manipulation des Transkriptionssystems und/oder des codierenden Bereichs. Die modifizierten Hefezellen können dann analysiert und Sequenzen für die erwünschten Modifikationen identifiziert werden. Dann lässt sich der amplifizierbare Bereich in geeigneter Weise in den Ausprägungswirt transformieren, und der amplifizierbare Bereich amplifizieren.
Der Begriff "transformieren" schließt Transformation, Transfektion, Transduktion, Konjugation, Fusion, Elektroporation oder jedes andere Verfahren zur Einführung von DNA in eine lebensfähige Zelle ein.
Nach der Amplifikation unter Verwendung des amplifizierbaren Gens werden die transformierten Wirte in einem Screening-Suchtest auf die Produktion des Zielproteins und auf Stabilität durchforstet und daraus abgeleitete Zelllinien werden für das gewünschte Produktionsniveau ausgewählt und die entsprechenden Zellen für die Produktion des gewünschten Proteins in Kulturen zum Wachstum gebracht.
DNA-Quelle, wie etwa die Primärzelle oder DNA im künstlichen Hefechromosom, können interessierende Säugerzellen sein, insbesondere Säugerzellen, die nicht leicht in Kulturen zu züchten sind, insbesondere Primatenzellen, speziell menschliche Zellen und bei den menschlichen Zellen kann es sich um normale Zellen handeln, einschließlich von embryonalen oder neoplastischen Zellen, insbesondere um normale Zellen. Als Primärzellen kön nen verschiedene Zelltypen Verwendung finden, einschließlich von Fibroblasten, insbesondere Fibroblasten der Haut mit doppeltem Chromosomensatz, Keratinozyten, Myoblasten, Lymphozyten, Glia, Epithelzellen, Neuronen, Endothelzellen, oder andere Somazellen oder Keimzellen. Von besonderem Interesse sind Fibroblasten der Haut, die ohne weiteres vermehrt werden können, um große Mengen normaler Zellen, embryonaler Nierenzellen und dergleichen zu produzieren. Diese Zellen können das interessierende Gen ausprägen oder nicht ausprägen. In den Fällen, in denen das Zielgen induzierbar ist oder nur in bestimmten differenzierten Zellen ausgeprägt werden kann, ist es möglich, Zellen auszuwählen, in denen das Zielgen ausgeprägt ist, wozu eventuell zu unbegrenztem Wachstum in Kultur fähige Zellen erforderlich sind.
Es gibt eine Reihe amplifizierbarer Gene, bei denen unter Verwendung einer geeigneten Auswahlsubstanz ein in das Genom integriertes Gen mit angrenzender, flankierender DNA amplifiziert werden kann. Amplifizierbare Gene schließen Dihydrofolatreductase (DHFR), Metallothionein-I, Metallothionein-II, vorzugsweise Metallothionein-Gene von Primaten, Adenosindesaminase, Ornithin-Decarboxylase, Glutaminsynthetase, etc., ein. Das amplifizierbare Gen besitzt Transkriptionssignale, die im Zwischenwirt oder Ausprägungswirt funktionell wirken und im Primärwirt insbesondere dort funktionell wirken können, wo die Amplifizierung im Primärwirt erfolgt oder wo das amplifizierbare Gen als Markierungssubstanz verwendet wird.
Zielgene können alle interessierenden Gene sein und es wurde bereits eine große Anzahl interessierender Proteine identifiziert und isoliert, wobei ständig weitere Proteine in die Liste aufgenommen werden. Zu den Proteinen, die von Interesse sind, gehören Cytokine, wie etwa die Interleukine 1–11; Wachstumsfaktoren, wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor PDGF und die Somatotropine TGF; Wachstumshormone; andere Hormone, wie das follikelstimulierende Hormon FSH, das Gelbkörperreifungshormon LH, etc.; koloniestimulierende Faktoren, wie G- (Granulozyten-), M- (Makrophagen-) und GM-CSF (Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierende Faktoren); Erythropoetin; Stahlfaktor; Rezeptorantagonisten, wie IL-1rA; Plasminogen-Aktivatoren, wie Gewebe und Urin; Enzyme, wie Superoxiddismutase; Interferon-α, -β, -γ oder Modifikationen davon; T-Zellen-Rezeptoren; Oberflächenmembran-Proteine; Insulin; Lipoproteine; α₁-Antitrypsin; CD-Proteine, wie CD3, 4, 8, 19; Gerinnungsfaktoren, wie zum Beispiel Faktor VIIIc, IX und von Willebrand Faktor; gerinnungshemmende Faktoren, wie Protein C; Vorkammer-Natriuretic-Faktor, Tumornekrose-Faktor; Transport-Proteine; Homing-Rezeptoren; Kommunikationsempfänger; Regulations-Proteine; etc.
Die künstlichen Hefechromosome werden in Übereinstimmung mit herkömmlichen Verfahren zubereitet. Die genomische DNA wird enzymatisch, mechanisch oder auf andere Weise aufgespaltet, um Fragmente zu erhalten, die gewöhnlich mindestens 50 Kilobasenpaare (kbp), eher mindestens 100 kbp, in passender Weise mindestens 200 kbp und gewöhnlich nicht mehr als 2000 kbp aufweisen. Die genomische DNA wird in ein künstliches Hefechromosom eingesetzt und dann einem Screening unterzogen, unter Verwendung geeigneter Sonden zur Identifizierung des Vorhandenseins des Zielgens. Das Vorhandensein des künstlichen Hefechromosoms kann durch ein selektives Medium für die auf dem künstlichen Hefechromosom vorhandenen Marker überprüft werden. Hefezellen, die ein künstliches Hefechromosom oder eine Bibliothek künstlicher Hefechromosome enthalten, können durch Hybridisierungsanalysen oder durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Startern charakterisiert werden. Die identifizierten künstlichen Hefechromosome können dann zur Manipulation benützt werden.
Normalerweise wird das künstliche Hefechromosom vom ursprünglichen Hefewirt auf einen anderen Hefewirt übertragen, der sich für die Manipulation eignet. Der neue Wirt ist ein haploider Stamm, das heißt mit einfachem Chromosomensatz oder ein diploider Stamm, das heißt mit doppeltem Chromosomensatz, der eine Vielzahl, gewöhnlich mindestens zwei und vielleicht auch 5 oder mehr Mutationen in verschiedenen Genen aufweist, was eine Auswahl durch Ergänzung ermöglicht. Die gesamte Hefe-DNA des ursprünglichen Hefewirts kann in Hefezellen oder in Sphäroplastzellen transformiert werden, die als Wirt für die Manipulation dienen können. Die resultierenden Transformanten können auf selektiven Medien ausplattiert werden, um eine Auswahl treffen zu können, die verhindert, dass Transformanten gewählt werden, bei denen die auf den künstlichen Hefechromosomen vorhandenen Marker für die Ergänzung fehlen.
Alternativ kann das künstliche Hefechromosom durch genetische Kreuzung übertragen werden. Der Empfängerwirt für die Manipulation ist normalerweise ein haploider oder diploider Wirt mit einem genetischen Defekt, der durch den Genotyp des ursprünglichen Hefestamms komplementiert wird. Wenn der Wirt diploid ist, bildet er Sporen und Askosporen werden auf einem geeigneten Medium mit dem ursprünglichen Hefewirt vermischt, um eine Kreuzung zu ermöglichen. Wenn der Wirt haploid und sein Kreuzungstyp dem des ursprünglichen Wirtsstammes entgegengesetzt ist, können die Zellen direkt gekreuzt werden. Hybride Diploide werden auf selektiven Medien ausgewählt, auf denen wegen der Komplementierung zwischen den nicht-allelen auxotrophen Markierungssubstanzen nur Kreuzhybride wachsen. Die Hybriden können dann Sporen bilden und entweder können Sporen in Zufallsauswahl gewählt werden, zum Beispiel mit Ausprägung des heterozygoten, rezessiven Markers can1 für die Arzneimittelresistenz zur Auswahl für haploide meiotische Produkte oder man verwendet einen Mikromanipulator für die Tetradenaufspaltung. Die meiotischen Produkte können dann einer genetischen Analyse unterzogen werden, um das Vorhandensein der Marker für das künstliche Hefechromosom und der im Empfängerstamm vorhandenen genetischen Marker festzustellen. Die Gegenwart des künstlichen Hefechromosoms kann durch Hybridisierung oder durch die Analyse mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestätigt werden.
Die Manipulation der Säuger-DNA-Sequenz im künstlichen Hefechromosom lässt sich nach bekannten Verfahren für die homologe Rekombination in Hefe erreichen. So hat die Sequenz, die in die Säugersequenz integriert wer den soll, einen Homologiebereich von mindestens 50 bp, gewöhnlich eher mindestens 200 bp, gewöhnlich mindestens 50 bp an einem Terminus der Sequenz homolog zum Zielbereich der Rekombination, eher mindestens 200 bp und gewöhnlich mindestens 5 bp am anderen Terminus. Die größere Homologie besteht gewöhnlich beim 5'-Terminus für die Genaktivierung oder beim 3'-Terminus für die Erzeugung anderer Modifikationen, wie etwa Proteinfusionen oder Modifikationen, die auf eine Erhöhung der mRNA-Stabilität gerichtet sind. Vorzugsweise hat die homologe Sequenz insgesamt mindestens 100 bp, wobei mindestens 200 bp noch mehr vorzuziehen sind, mit mindestens 50 bp an jedem Terminus. Die homologe Sequenz kann 1 kbp oder mehr aufweisen.
Es können verschiedene Sequenzen Verwendung finden, die eine Homologie zum Zielbereich aufweisen. Zusätzlich zu der Verwendung von Sequenzen, die nur im Zielbereich vorkommen, können auch Sequenzen verwendet werden, die homolog zu den im Säugergenom wiederholt auftretenden Sequenzen sind, wie die Alu-Sequenz, das mittelrepetitive Element LINE, THE usw., wo diese Sequenz am Zielkonstrukt in einer oder mehreren Kopien, gewöhnlich nicht mehr als 10 Kopien, vorhanden sein kann. Alternativ kann man Sequenzen aus einem Arm des künstlichen Hefechromosoms verwenden, wie etwa prokaryotische Sequenzen, die mit dem Arm des künstlichen Hefechromosoms verbunden sind, genetische Marker am künstlichen Hefechromosom, die im Hefegenom fehlen, oder dergleichen. Wo homologe Vektorarm-Sequenzen verwendet werden, kann eine Homologie von einem oder mehreren kbp verwendet werden.
Die Verwendung dieser alternativen Sequenzen ist besonders nützlich, wenn nur wenig über den nicht-translatierten Bereich 5' oder die N-terminale Aminosäure-Sequenz von der Information des Zielgens bekannt ist. Der Terminus 3'- weist allgemein eine Homologie von circa 20 bp auf.
Alternativ kann ein Homologiebereich vorhanden sein, wobei weitere Sequenzen eingefügt werden, mit einem Telomer als Konstrukt (als halbes künstliches Hefechromosom bezeichnet) und wobei ein Centromer vorhanden sein kann oder nicht.
Die in die Säugersequenz zu integrierende Sequenz kann in jeder geeigneten Weise in den Primärwirt eingeführt werden, einschließlich der Ausfällung von DNA in Calcium, Sphäroplastenfusion, Transformation, Elektroporation, Einschleusung mit Partikelpistolen, Lipofektion, Mikroinjektion oder anderer geeigneter Mittel. Wo ein amplifizierbares Gen verwendet wird, kann dieses als Markierungssubstanz für die Auswahl der Wirte dienen, in die das amplifizierbare Gen aufgenommen wurde. Alternativ kann in das amplifizierbare Gen ein anderer Marker aufgenommen werden, wie zum Beispiel ein Wirkstoffresistenzmarker, zum Beispiel für die Neomycinresistenz (G418 in Säugerzellen), Hygromycin-Resistenz usw., oder ein Auxotrophiemarker (HIS3, TRP1, LEU2, URA3, ADE2, LYS2, usw.) zum Einsatz in Hefezellen.
Abhängig von der Art der Modifizierung und dem damit verbundenen Zielkonstrukt können verschiedene Verfahren für die Identifizierung der angestrebten Integration zum Einsatz kommen. In passender Weise kann die DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen aufgeschlossen werden und die Fragmente können mit einem geeigneten DNA-Fragment sondiert werden, womit dann das mit der Integration verbundene richtig dimensionierte Restriktionsfragment identifiziert wird.
Neben einem amplifizierbaren Gen können auch andere DNA-Sequenzen zur verstärkten Ausprägung verwendet werden, entweder allein oder in Kombination mit dem amplifizierbaren Gen. So können verschiedene Promotersequenzen, Verstärkersequenzen oder andere Sequenzen zum Einsatz kommen, die ein höheres Niveau der Ausprägung im Expressionswirt ermöglichen. So lässt sich etwa ein Verstärker aus einer Quelle, ein Promoterbereich aus einer anderen Quelle, ein nichtcodierender 5'-Bereich oberhalb des Initiations-Methionins aus der gleichen Quelle oder einer anderen Quelle wie die anderen Sequenzen kombinieren und dergleichen. Es kann ein Intron im nichtcodierenden Bereich mit geeigneten Spleiss-Stellen vorgesehen werden oder eine alternative nicht-translatierte 3'-Sequenz oder ein Polyade nylierungsort. Je nach dem Zweck der Modifikation kann jede gewünschte Sequenz der vorstehend beschriebenen Art eingeführt werden.
Auch andere Modifikationen können einbezogen werden. Mit relativ kleinen Auslassungen, Einfügungen, Punktmutationen und dergleichen, wobei relativ klein weniger als 1 kbp, gewöhnlich weniger als 500 bp bedeutet, kann der flankierende Bereich die Modifikation einschließen, wenn wünschenswerter Weise mindestens 50 bp der homologen Sequenz am Terminus vorhanden sind. So können Modifikationen etwa die Einführung einer Verstärkersequenz, die Einführung oder die Substitution oder Entfernung einer Signal-/Leitsequenz, die Entfernung einer Donor- oder Akzeptor-Spleißstelle oder einer dazwischenliegenden Sequenzmodifikation davon, Änderungen in der codierenden Sequenz, wie Auslassungen, Einfügungen oder Substitutionen, bei denen die Substitution eine Änderung in der Aminosäure bewirkt, oder Kombinationen davon einschließen. Wo zwei nicht aneinander angrenzende Mutationen einzuführen sind, kann es abhängig von der Art und von der Stelle der Mutationen wünschenswert sein, die Mutationen in zwei Schritten durchzuführen, wobei jeder der zwei Schritte zuerst durchgeführt werden kann.
Eine breite Vielfalt von Mutationen kann von Interesse sein, nicht nur für Modifizierungen der codierenden Sequenz, sondern auch für die Darstellung von Fusionsproteinen, wobei das Zielgen intakt gehalten werden kann oder andererseits ein Abschnitt des Zielgens durch die einzubauende Sequenz substituiert werden kann. Eine Reihe von Fusionsproteinen hat sich dort als interessant erwiesen, wo ein konstanter Bereich eines Mitgliedes der Immunoglobulin-Überfamilie, insbesondere Antikörper und ganz speziell der Isotypus A IgG, mit dem Zielprotein fusionieren kann. Alternativ kann es erwünscht sein, ein Enzym, ein Metallothionein, einen homing-Rezeptor, eine Glycosid-Erkennungsstelle, Phospholipid-Erkennungsstelle oder dergleichen einzubauen. Auf diese Weise kann das Zielprotein für die Schaffung erwünschter Merkmale, die von Natur aus nicht im Zielprotein vorhanden sind, modifiziert werden.
Bei der Durchführung von einem oder mehreren Transformationsschritten kann jeder Schritt im Wesentlichen in der gleichen Weise durchgeführt werden, es sei denn, dass man sich für verschiedene andere Verfahren als die Auswahl an einem oder beiden Schritten entscheidet. Wo eine Selektion beabsichtigt ist, wird mit der einzubauenden Sequenz ein Markierungs-Gen aufgenommen, das eine Auswahl erlaubt. Das Markierungs-Gen kann passenderweise stromabwärts auf das Zielgen bezogen gelegen sein und Resistenz gegen eine cytotoxische Substanz, zum Beispiel gegen Antibiotika, Schwermetalle oder dergleichen, Resistenz gegen oder Empfänglichkeit für das Selektionsmedium HAT (mit Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin), Gancyklovir, usw., Ergänzung zu einem auxotrophen Wirt insbesondere unter Verwendung einer auxotrophen Hefe als Wirt für die betreffenden Manipulationen oder dergleichen, einschließen. Das Markierungs-Gen kann auch auf einem separaten DNA-Molekül, insbesondere bei primären Säugerzellen, vorhanden sein. Alternativ können die verschiedenen Transformanten wegen der hochwirksamen Rekombination in der Hefe einem Screening-Test unter Verwendung einer Hybridisierungsanalyse, Polymerase-Kettenreaktion, Sequenzanalyse oder dergleichen unterzogen werden.
Hefen sind besonders empfänglich für eine homologe Rekombination, mit einem hohen Wirkungsgrad. So erlaubt dieses Verfahren eine Modifizierung des Zielortes mit einer hohen Erfolgsrate, wobei eine oder mehrere homologe Rekombinationen durchgeführt werden können, um eine bestimmte Modellgestaltung des Systems der Transkriptionseinleitung, des codierenden Bereichs oder eines anderen Gesichtspunktes der interessierenden Sequenzen, sowie den Einbau anderer Sequenzen in cis-Lage, zum Beispiel von amplifizierbaren Genen, zu erzielen.
Für die homologe Rekombination wird ein Konstrukt vorbereitet, bei dem das amplifizierbare Gen normalerweise auf beiden Seiten von einer DNA flankiert wird, die zur DNA der Zielregion homolog ist. Abhängig von der Art der Einbau-DNA und dem Zweck der Integration beträgt die homologe DNA im allgemeinen nicht mehr als 100 kb, gewöhnlich 50 kb, vorzugsweise circa 25 kb des transkribierten Bereichs des Zielgens, wobei nicht mehr als 2 kb des Zielgens noch mehr zu bevorzugen ist. Wo eine Modellgestaltung des Gens beabsichtigt ist, ist die Homologie gewöhnlich proximal zur Mutationsstelle vorhanden. Als Gen ist der codierende Bereich vorgesehen und die Sequenzen, die zur Transkription einer reifen mRNA erforderlich sind. Die homologe DNA kann den Bereich 5'- stromaufwärts außerhalb des Regulierungsbereichs der Transkription einschließen oder etwaige Verstärkersequenzen, Sequenzen für die Einleitung der Transkription, angrenzende Sequenzen oder dergleichen umfassen. Der homologe Bereich kann einen Abschnitt des codierenden Bereichs einschließen, wobei der codierende Bereich nur aus einem offenen Leseraster oder einer Kombination von Exons und Introns besteht. Der homologe Bereich kann einen Abschnitt eines Introns oder das ganze Intron umfassen, wobei jeweils auch ein Abschnitt eines oder mehrerer Exons oder jeweils das ganze Exon vorhanden sein kann. Alternativ kann der homologe Bereich den Bereich 3'- so umfassen, dass der ganze Bereich der Transkriptionstermination oder ein Abschnitt davon oder der Bereich 3'- davon erfasst wird. Die homologen Bereiche können sich über das ganze Zielgen oder einen Abschnitt desselben erstrecken oder außerhalb des Zielgens liegen und den ganzen Bereich der Transkriptionstermination oder einen Abschnitt davon und/oder das strukturelle Gen umfassen.
Im Fall des amplifizierbaren Gens wird die homologe Sequenz dem amplifizierbaren Gen proximal oder distal angefügt. Gewöhnlich wird eine andere Sequenz als der normalerweise mit dem Zielgen verbundene "wilde" Standardtyp der Sequenz verwendet, um die homologe Sequenz mindestens auf einer Seite vom amplifizierbaren Gen zu trennen. Als Ergebnis der mit dem amplifizierbaren Gen verbundenen Manipulationen kann ein Abschnitt der Sequenz die mit dem amplifizierbaren Gen verbundene Sequenz 5'- oder 3'- sein.
Das Einbaukonstrukt kann jeweils auf herkömmliche Weise zubereitet werden, wo Sequenzen synthetisiert, von natürlichen Quellen getrennt, manipuliert, geklont, einer Ligation oder einer Mutagenese in vitro oder einer Primer-Reparatur oder dergleichen unterzogen werden. In verschiedenen Phasen können die zusammengefügten Sequenzen geklont, einer Restriktions- oder Sequenzanalyse unterzogen werden oder dergleichen. Gewöhnlich werden bei der Herstellung eines Konstrukts, bei dem verschiedene Fragmente zusammengefügt werden, die Fragmente, Zwischenkonstruktionen und Konstrukte auf einem Klonierungsvektor aufgenommen, der ein Replikationssystem beinhaltet, das in einem prokaryotischen Wirt funktionsfähig ist, zum Beispiel E. coli und einen Marker für die Auswahl, zum Beispiel für Biocidresistenz, Ergänzung zu einem auxotrophen Wirt, usw. enthalten. Es können auch weitere funktionelle Sequenzen vorhanden sein, wie etwa Polylinker, zum leichteren Einbauen und Ausschneiden des Konstruktes oder von Abschnitten desselben. Eine große Anzahl von Klonierungsvektoren ist verfügbar, wie etwa pBR322, die Reihe pUC, usw.. Diese Konstrukte können dann zum Einbau in den primären Säugerwirt oder in die Hefe, die das künstliche Hefechromosom enthält, verwendet werden.
Im Fall des primären Säugerwirts kann ein Replikationsvektor zum Einsatz kommen. Ein solcher Vektor weist gewöhnlich ein virales Replikationssystem auf, wie etwa SV40, das Rinderpapillomvirus, Adenovirus oder dergleichen. Der Vektor für lineare DNA-Sequenzen kann auch einen Marker für die Selektion zur Identifizierung transfektierter Zellen aufweisen. Solche auswahlfähigen Marker schließen das Neo-Gen ein, das eine Selektion mit G418 ermöglicht, das Herpes tk-Gen zur Selektion mit dem HAT-Medium, das gpt-Gen mit Mycophenolsäure, die Komplementierung eines auxotrophen Wirtes, usw..
Der Vektor kann zu einer stabilen Aufrechterhaltung fähig sein oder nicht. Wo der Vektor zu einer stabilen Aufrechterhaltung fähig ist, werden die Zellen einem Screening-Test für den homologen Einbau des Vektors in das Genom des Wirtes unterzogen, wobei verschiedene Verfahren zur Entfernung der Zellen eingesetzt werden können. Wo der Vektor nicht zu einer stabilen Aufrechterhaltung fähig ist, zum Beispiel, wenn ein temperaturempfindliches Replikationssystem verwendet wird, kann die Temperatur vom permissiven Niveau auf das nicht-permissive Niveau geändert werden, so dass die Zellen aus dem Vektor entfernt werden. In diesem Fall sind nur die Zellen, in die das Konstrukt mit dem amplifizierbaren Gen und gegebenenfalls dem Marker eingebaut ist, fähig, die Selektion zu überleben.
Wo ein selektierbarer Marker vorhanden ist, kann die Auswahl hinsichtlich der Gegenwart des Zielkonstrukts mittels des selektionsfähigen Markers erfolgen. Wo der selektierbare Marker nicht vorhanden ist, kann die Auswahl hinsichtlich der Gegenwart des Konstrukts durch das amplifizierbare Gen erfolgen. Für das Neo-Gen oder das Herpes tk-Gen könnten als Medium für das Wachstum der Transformanten circa 0,1–1 mg/ml G418 oder das HAT-Medium verwendet werden. Handelt es sich bei dem amplifizierbaren Gen um DHRF, dann kann das selektive Nährsubstrat circa 0,01–0,5 μM Methotrexat einschließen oder einen Mangel an Glycin-Hyprxanthin-Thymidin haben und dialysiertes Serum aufweisen (GHT-Medien).
Bei der Durchführung der homologen Rekombination wird die DNA im Ausprägungswirt eingebaut. Die dafür verwendbaren Verfahren schließen Calciumphosphat/DNA-Copräzipitat, Mikroinjektion von DNA in den Zellkern, Elektroporation, Hefeprotoplastfusion mit intakten Zellen, Transfektion, Polykationen usw., Polybren, Polyornithin usw. und ähnliches ein. Die DNA kann einsträngig oder doppelsträngig, linear oder ringförmig sein. Verschiedene Verfahren für die Transformation von Säugerzellen sind beschrieben bei Keown et al., Methods in Enzymology (Verfahren in der Enzymologie) (1989), Keown et al., Methods in Enzymology (1990), Band 185, Seiten 527–537 und Mansour et al., Nature, 336: 348–352 (1988).
Stromaufwärts und/oder stromabwärts, auf das Konstrukt des Zielbereichs bezogen, kann sich ein Gen befinden, das es ermöglicht, festzustellen, ob ein Doppel-Crossover, das heisst, ob zwei dicht benachbarte crossing-over Ereignisse, vorliegen. Zu diesem Zweck kann das Thymidinkinase Gen des Herpes-simplex-Virus verwendet werden, weil das Vorhandensein des Thymidinkinase Gens durch den Einsatz von Nukleosidanalogen, wie Acyclovir oder Gancyclovir wegen ihrer cytotoxischen Wirkung auf Zellen, die einen Mangel an dem funktionellen HSV-tk-Gen haben, nachgewiesen werden kann. Das Fehlen der Empfindlichkeit gegen diese Nukleosidanalogen lässt auf das Fehlen der Thymidinkinase schließen und lässt deshalb beim Eintreten einer homologen Rekombination darauf schließen, dass auch ein Doppel-Cross-over-Ereignis stattgefunden hat.
Sobald die Zielregion modifiziert und das Vorhandensein der geeigneten Modifikationen unter Einsatz der Restriktionsanalyse, Sequenzanalyse, Hybridisierung, PCR usw., festgestellt ist, kann das manipulierte künstliche Hefechromosom direkt verwendet oder weiter manipuliert werden, um seine Größe zu vermindern, zum Beispiel durch Restriktionsaufschließung oder gezielte Fragmentierung mit wiederholten Säugersequenzen.
Es kann wünschenswert sein, die Anzahl von Kopien des künstlichen Hefechromosoms pro Hefezelle zu erhöhen, um die Effizienz der Übertragung in die Säugerzellen zu erhöhen. Man kann das künstliche Hefechromosom mit seinem geeigneten Wirtsstamm verwenden, der eine vielfache Amplifizierung des künstlichen Hefechromosoms ermöglicht. Siehe zum Beispiel Smith et al., PNAS (1990) 87: 8242–8246. Das künstliche Hefechromosom kann in geeigneter Weise manipuliert werden, um geeignete Marker zum Einbau des Konstruktes in das amplifizierbare künstliche Hefechromosom zu erhalten. Wenn das amplifizierbare künstliche Hefechromosom amplifiziert ist, kann es auch für eine verbesserte Effizienz der Genanpeilung und der homologen Rekombination eingesetzt werden.
Verschiedene Zwischenwirte sind für die Ausprägung in Säugern verfügbar und einsatzfähig. Zu diesen Zwischenwirten gehören CHO-Zellen, Affennierenzellen, Mausfibroblasten C127, Mäusezellen 3T3, Verozellen usw.. Bei der Amplifizierung ist es wünschenswert, dass ein negativer Hintergrund für das amplifizierbare Gen oder ein amplifizierbares Gen vorliegt, das wesentlich geringer auf die Amplifizierungssubstanz anspricht.
In Gegenwart eines Markers werden die transformierten Zellen in einem selektiven Medium gezüchtet, das zum Beispiel für das DHFR-Gen ungefähr 0,01–0,5 μM Methotrexat enthält oder das GHT-Medium mit dialysiertem Serum und wo ein weiterer Marker vorhanden ist, zum Beispiel das Neo-Gen, kann das Medium circa 0,1–1 mg/ml G418 enthalten. Die resistenten Kolonien werden isoliert und können dann analysiert werden, um das Vorhandensein des Konstruktes in einer zum Zielgen benachbarten Position festzustellen. Dies kann durch Nachweis der Ausprägung des Zielgenproduktes geschehen, wo normalerweise ein negativer Hintergrund für das Ziel-Genprodukt vorliegt, durch Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion, Southern-Hybridisierung oder ähnliches.
Die Zellen, die das Amplifizierungskonstrukt enthalten, werden dann gestreckt und der Selektion und Amplifikation mit Medien von zunehmend höheren Konzentrationen des Amplifizierungsreagens unterzogen, zum Beispiel 0,1 bis 200 μM Methotrexat für das DHFR-Gen und bei jedem Selektionsschritt kann eine Analyse zur Bestimmung der Produktion des Zielproduktes durchgeführt werden. Die Streckung schließt mindestens eine Duplizierung ein und kann mindestens 5 Kopien ergeben, vorzugsweise 10 Kopien oder mehr in einer Tandemanordnung. So wird die Proteinproduktion aus der Ausprägung einer einzigen Kopie mindestens um das 1,5fache erhöht, gewöhnlich mindestens um das 3fache, vorzugsweise mindestens um das 5fache.
Die verschiedenen Klone können dann einem Screening-Test unterzogen werden, um eine optimale stabile Produktion des Zielproduktes zu erreichen und die entsprechenden Klone können dann gestreckt und für die Produktion in Kulturen kommerziell genutzt werden. Auf diese Weise kann ein hoher Ertrag eines Produktes erzielt werden, ohne dass es notwendig ist, die Botschaft zu isolieren und die verschiedenen Manipulationen vorzunehmen, die mit der Gentechnik oder Isolierung des Gens aus dem Genom verbunden sind, wo sehr große Gene umfangreiche Forschungs- und Entwicklungsbemühungen erfordern können.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, und sie bedeuten keine Einschränkung.
EXPERIMENTELLER TEIL
Aktivierung der FSH-β-Genexpression
Konstruktion eines Zielvektors für ein FSH-β-Gen: Zur Aktivierung der Expression des FSH-β-Gens wird ein Zielvektor (pγFT1) für das künstliche Hefechromosom erstellt, der die folgenden Elemente (5' bis 3') enthält: einen Zielbereich 5', der aus den Nukleotiden –452 bis –36 des FSH-β-Gens besteht (Jameson et al., Mol. Endocrinology (1988) 2: 806–815), eine FSH-α cDNA-Expressionskassette, eine Dihydrofolatreductase (DHFR) Expressionskassette, den selektierbaren Hefemarker LEU2, die Verstärker/Promoter/Spleiß-Donorsequenzen des Cytomegalovirus des Menschen (CMV IE) im unmittelbaren frühen Bereich und einen Zielbereich 3', der aus den Nukleotiden +100 bis +850 des FSH-β-Gens besteht. Dieses Plasmid wird aus den Plasmiden pTD-F und pMF-F abgeleitet. pTD-F wird durch das Einfügen von drei aufeinanderfolgenden Fragmenten im pDT aufgebaut mit der Einfügung des synthetischen Polylinkers 5'-Bsu36I-KpnI-MluI-XhoI-Bsu36I-3' in pSKII (Stratagene) zwischen den Stellen KpnI und SacI, wobei diese Stellen verloren gehen. Zuerst wird das Fragment 1,95 kb PvuII/BamHI von SV2DHFR (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. (1981) 1: 854–864), das den früh reagierenden Promoter SV40 codiert, das DHFR-Gen, das SV40 t Antigen Intron und die Stelle für die frühe Polyadenylierung den Linkern MluI angefügt und an der Stelle MluI geklont. Als Zweites wird das Fragment 2,0 kb BssHII von pIKFSH-α (nachstehend beschrieben), das eine FSH-α cDNA-Expressionskassette codiert, den KpnI-Linkern zugefügt und an der Stelle KpnI geklont. Schließlich wird das Fragment 2,4 kb BglII/SalI von γEp13 (ATCC 37115), das den selektierbaren Hefemarker LEU2 codiert, zwischen der Stelle BamHI am 3'-Ende von SV2 DHFR und der Stelle XhoI geklont. Die Reihenfolge der drei Elemente innerhalb der Kassette Bsu36I ist 5'-pIKFSHα-SVDHFR-LEU2-3', jeweils mit der gleichen Transkriptionsorientierung.
pIKFSH-α wurde erzeugt durch Einsetzen einer FSH-α cDNA zwischen den Stellen BglII und ApaI von pIK (nachstehend beschrieben). Die cDNA wurde geklont durch Umkehrtranskription von 0,2 μg der gesamten RNA aus der mit pdN₆ (Pharmacia/LKB) gestarteten Zell-Linie CHA/GO K-1 (ATCC HTB 168), gefolgt von der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den Startern 1 und 2. Ein cDNA-Klon wurde erzielt, der die gesamte codierende Sequenz FSH-α codiert (Fiddes und Goodman 1981, J. Mol. Appl. Gen. 1, 3–18). pIK ist ein durch vier aufeinanderfolgende Kassetteninsertionen in pMF2 aufgebauter Säuger-Expressionsvektor, der durch Einfügung des synthetischen Polylinkers 5'-HindIII-SphI-EcoRI-AatII-BgII-XhoI-3' an den Stellen KpnI und SacI von pSKII geschaffen wurde, wobei die Stellen KpnI und SacI verloren gingen. Zuerst wurde ein BamHI-XbaI-Fragment, das die Stelle SV40 T Antigen Polyadenylierung enthielt (Nukleotide 2770 bis 2533 von SV40, Reddy et al., 1978, Science 200, 494–502) und ein NheI-SalI Fragment, das den Replikationsursprung von SV40 enthielt (Nukleotide 5725 bis 5578 von SV40) durch dreiteilige Ligation zwischen den Stellen BglII und XhoI eingefügt, mit dem Verlust der Stellen BglII, BamHI, XbaI, NheI, SalI und XhoI. Diese BamHI, XbaI und NheI, SalI Fragmente wurden durch Polymerase-Kettenreaktion mit pSV2Neo (Southern und Berg 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1, 327–341) als Matrize synthetisiert, unter Verwendung der Oligonukleotid-Starterpaare 3 und 4, sowie 5 und 6, zur Aufnahme der Stellen BamHI, XbaI, NheI und SalI an ihren Enden. Zweitens wurde ein SphI-EcoRI Fragment, das den Spleißakzeptor des menschlichen al Globin-Gens als zweites Exon enthielt (Nukleotide +143 bis +251), zwischen den Stellen SphI und EcoRI eingefügt. Dieses Fragment EcoRI wurde durch Polymease-Kettenreaktion mit ppSVaHP (Treisman et al., 1983, PNAS 80, 7428–7432) als Matrize synthetisiert, unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 7 und 8, die an ihren Enden die Stellen SphI und EcoRI aufnahmen. Drittens wurde der synthetische Polylinker 5'-EcoRI-BglII-ApaI-AatII-3' zwischen den Stellen EcoRI und AatII eingefügt. Viertens wurde ein HindIII-XbaI Fragment, das den Verstärker/Promoter CMV IE enthielt (Nukleotide –674 bis –1, Boshart et al., 1985, Cell 41, 521–530) und ein XbaI-SphI Fragment, das den Spleißdonor CMV IE, erstes Exon, enthielt (Nukleotide +7 bis +170) durch dreiteilige Ligation zwischen den Stellen HindIII und SphI eingefügt. Das Fragment HindIII-XbaI wird zubereitet durch Polymerase-Kettenreaktion mit pUCH.CMV (M. Calos, Stanford University) als Matrize unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 9 und 10, die an ihren Enden die Stellen HindIII und XbaI aufnahmen. Das Fragment XbaI-SphI wird chemisch synthetisiert.
pMF-F wird durch drei aufeinander folgende Fragmenteinfügungen in pXF aufgebaut, das durch Einfügung der synthetischen Polylinker 5'-NheI-Bsu36I-HindIII-SphI-NotI-3' in pSKII zwischen den Stellen KpnI und SacI geschaffen wird, dabei gehen diese Stellen als Ansatzmöglichkeiten verloren. Zuerst wird ein NheI-Bsu36I Fragment, das die Nukleotide –452 bis –36 des FSH-β Gens (Zielbereich 5') durch die Polymerase-Kettenreaktion synthetisiert, mit einer DNA aus der dipoiden Fibroblasten-Linie WI38 des Menschen (ATCC CCL 75) als Substrat und den Oligonukleotid-Startern 11 und 12, mit Klonung zwischen den Stellen NheI und Bsu36I. Zweitens wird ein SphI-NotI Fragment, das die Nukleotide +100 bis +850 des FSH-β Gens (Zielbereich 3') enthält, mit den Startern 13 und 14 synthetisiert, wie vorstehend beschrieben und zwischen den Stellen SphI und NotI geklont. Schließlich wird eine aus pIK isolierte Kassette 840 bp HindIII-XbaI, die den Verstärker CMV IE, Promoter, das erste Exon und den Spleißdonor enthält, zwischen den Stellen HindIII und SphI geklont.
pγFT1 wird aufgebaut durch Einfügung des Fragmentes 6,2 kb Bsu36I von pTD-F an der einzigen Stelle Bsu36I von pMF-F, wobei die Transkriptionsorientierung der Elemente innerhalb des Fragmentes Bsu36I mit dem CMV IE Verstärker/Promotor in pMF-F identisch ist.
Ein zweiter Zielvektor (pYFT2) des künstlichen Hefechromosoms für die Aktivierung des FSH-β Gens wird aufgebaut durch Einfügung des Fragmentes 6,2 kb Bsu361 von pTD-F an der einzigen Bsu361-Stelle von pMF-F2. pMF-F2 wird aufgebaut durch zwei aufeinander folgende Einfügungen von Fragmenten in pMF. Zuerst wird das Fragment NheI-Bsu361, das die Nukleotide –452 bis –36 des FSH-β Gens enthält, zwischen den Stellen NheI und Bsu361 geklont. Zweitens wird eine von pIK isolierte HindIII-XbaI Kassette mit 680 bp, die den Verstärker und Promoter CMV IE enthält, und ein Xba-NotI Fragment, das die Nukleotide +7 bis +850 des FSH-β Gens enthält, (Zielbereich 3') durch dreiteilige Ligation zwischen den Stellen HindIII und NotI eingefügt. Das Fragment Xba-NotI wird durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 13a und 14, die an ihren Enden die Stellen Xba und NotI aufweisen, synthetisiert.
Oligonukleotid-Starter

Starter 1: 5'-GAATTCAGATCTGCAGTTACTGAGAACTCATAAG-3'
Starter 2: 5'-GAATTCGGGCCCTGCAGTGGAACAAGCTTAATG-3'
Starter 3: 5'-GGTCGACCTGGATCCGCCATACCACATTTGTAG-3'
Starter 4: 5'-GCCGCGGCTCTAGAGCCAGACATGATAAGATAC-3'
Starter 5: 5'-AAGCTTGTGCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCG-3'
Starter 6: 5'-CGAATTCGGTCGACCGCAAAAGCCTAGGCCTCC-3'
Starter 7: 5'-GTCTATAGCATGCTCCCCTGCTCCGACCCG-3'
Starter 8: 5'-GGTACCGAATTCTCCTGCGGGGAGAAGCAG-3'
Starter 9: 5'-CGCCAAGCTTGGCCATTGCATACGGT-3'
Starter 10: 5'-GAGGTCTAGACGGTTCACTAAACGAGCTCT-3'
Starter 11: 5'-GAATTCGCTAGCGACAGGAGCCAGATCATGAAATG-3'
Starter 12: 5'-CCATGGCCTGAGGTCATGTGCAACTAACACCTTGT-3'
Starter 13: 5'-GAATTCGCATGCGGCATGGAGGACAAAACTAGAG-3'
Starter 13a: 5'-GAATTCTCTAGAACAGCTCTTGCCAGGCAAGGCA-3'
Starter 14: 5'-GGATCCGCGGCCGCGCCCACTAGAAACTGAGAAACC-3'
Starter 15: 5'-GAATTCAGATCTGGTACCATGTTTTGCTGGAAGC-3'
Starter 16: 5'-GGATCCGAGCTCTTGAGGAGTTTAAGAAGAGAGTT-3'

Screening-Test für das künstliche Hefechromosom: Zwei Banken für das künstliche Hefechromosom werden durchsucht, um diejenigen künstlichen Hefechromosome zu identifizieren, die den Ort für das FSH-β Gen des Menschen enthalten. Jede dieser Banken wird im haploiden Wirtsstamm AB1380 des Sacharomyces Cerevisi erzeugt [MAT Ade2-1 (Ocker) Lys2-1 (Ocker) TRPL URA3 HIS5 CANL-100 (Ocker)] unter Verwendung von pγAC4 (Burke et al., Science (1987) 236: 806–812). Das künstliche Hefechromosom enthält zwei selektionsfähige Marker, TRP1 und URA3. Damit wird das Vorhandensein eines künstlichen Hefechromosoms im Stamm AB1380 genetisch überprüft durch Untersuchung auf das Vorhandensein des "wilden" Standardtyps TRP1 und der Allelen URA. Die CEPH YAC-Bibliothek (Albertsen et al., 1990, PNAS 87: 4256–4260), die aus –50 000 Kolonien mit einer durchschnittlichen Größe von 430 kb an Einfügungen von künstlichen Hefechromosomen besteht (–7 haploide Genom-Äquivalente) wird einem Screening-Test unter Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion unterzogen. Insgesamt 113 DNA-Pools, jeweils aus –386 Hefekolonien gebildet, werden mit den Startern 11 und 12 (wie vorstehend beschrieben) durchsucht, die ein Fragment von 416 bp erzeugen. Die YAC-Bibliothek der Washington University (Brownstein et al., Science (1989) 244: 1348–1351), die aus –60 000 Kolonien mit einer einer durchschnittlichen Größe von 250 kb an Einfügungen von künstlichen Hefechromosomen besteht (–5 haploide Genom-Äquivalente) wird einem Screening-Test unter Einsatz der Hybridisierung auf Filtern mit der gepulsten Feld-Gel-Elektroporese unterzogen. Die Kolonien des künstlichen Hefechromosoms sind in Pools von je –386 Kolonien angeordnet, aus jedem Pool wird Chromosomen-DNA präpariert und die DNA wird mit der gepulsten Feldgel-Elektroporese getrennt. Das mit den Startern 11 und 12 in der Polymerase-Kettenreaktion hergestellte Produkt 416 bp FSH-β dient als Sonde für die Hybridisierung (als Sonde FSH 5' bezeichnet).
Die Hybridisierung der Hefekolonie auf Filtern aus einzelnen Kolonien des künstlichen Hefechromosoms (Traver, Klapholz, Hyman und Davies 1989; PNAS 86: 5898–5902) wird verwendet, um jeden positiven Pool auf das künstliche Hefechromosom, das FSH-β enthält, zu durchmustern. Mehrere positive Kolonien, die das künstliche Hefechromosom enthalten, werden mit der Southern Blot Analyse identifiziert und analysiert, um unter Einsatz der Sonde FSH 5' das Vorhandensein der charakteristischen Hybridisierungsfragmente EcoRI, BglII, BamHI und NsiI festzustellen. Ein als YAC-FSH-β1 bezeichnetes Element mit dem erwarteten Muster wird für die nachfolgenden Versuche verwendet.
Übertragung von YAC-FSH-β1 auf einen neuen Wirt: Für alle genetischen Manipulationen der Hefe werden Standardverfahren verwendet, wie von Sherman, Fink und Hicks (1986, Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics) beschrieben. Für eine effiziente homologe Zielführung mit YAC-FSH-β1 wird das künstliche Hefechromosom auf einen neuen haploiden Hefe-Wirtsstamm übertragen: YPH252 (MATα Ade2-101 (Ocker) Lys2-801 (bernsteinfarben) Ura3-52 TRPLΔI HIS3Δ200 LEU2Δ1) (Sikorski und Hieter 1989, Genetics 122: 19–27) oder YPH274 (MATa/MATα Ade2-101/Ade2-101 Lys2-801/Lys2-801 URA3-52/URA3-52 TRP1Δ1/TRP1Δ1 HIS3Δ200/HIS3Δ200 LEU2Δ1/LEU2Δ1) (Sikorski und Hieter, wie oben) Der Wirt YPH252 enthält nichtumkehrbare Allele von URA3, TRPL, LEU2 und HIS3; wobei die letzteren drei Deletionsallele sind. Der Letztere Wirt enthält nichtumkehrbare Allele von URA3, TRP1, LEU2 und HIS3, wobei die letzteren drei Deletionsallele sind. Die gesamte Hefechromosomen-DNA wird nach Standardverfahren (McCormick et al., Technique (1990) 2: 65–71) in Agaroseproben präpariert. Bei den Agaroseproben wird das Gleichgewicht eingestellt in 50 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,75 mM Spermidin-Trihydrochlorid; 0,3 mM Spermin-Tetrahydrochlorid geschmolzen bei 65°C und zur Transformation von Hefe-Sphäroplasten des Stammes YPH252 oder YPH274 verwendet (Burgers und Percival, Anal. Biochem. (1987) 163: 321–397; McCormick et al., J. Methods in Cell and Mol. Biol. (1990) 2: 65–71). Die Transformanten werden auf Medien plattiert, denen Uracil fehlt, zur Auswahl hinsichtlich des Vorhandenseins des im künstlichen Hefechromosom enthaltenen Markers vom wilden Standardtyp URA3. Das Vorhandensein des künstlichen Hefechromosoms wird durch die zusätzliche Gegenwart des Wildtyps TRP1 Allel bestätigt. Alternativ wird das YAC-FSHβ1 in AB1380 mit dem Hefestamm YPH252 gepaart. Auf diploiden Kreuzhybriden, die auf Media mit einem Mangel an Histidin ausgewählt werden, erfolgt eine Sporenbildung, Patch-Einbringung in ein selektives Medium, das haploide Meioseprodukte enthält, die Canavanin anreichern und den rezessiven Chemikalienresistenz-Marker CAN1-100 ausprägen. Canavanin-resistente Kolonien werden einem genetischen Screening-Test auf das Vorhandensein des LEU2Δ1 und des künstlichen Hefechromosoms unterzogen.
Gen-Targeting an der Stelle FSH-β: Die Zielvektoren pYFT1 und pYFT2 werden mit NheI und NotI aufgeschlossen, um –7,3 kb Fragmente freizusetzen. Diese Fragmente werden verwendet, um Hefesphäroplasten des Stammes YPH252/YAC-FSH-β1 oder YPH274/YAC-FSH-β1 unter Anwendung des Verfahrens mit Lithiumacetat zu transformieren (Schießtl und Gretz, 1989, Current Genetics 16: 339–346). Die gesamte DNA des Hefegenoms aus den LEU⁺ Transformanten wird der Southern Blot Analyse unterzogen und mit der DNA aus nichttransformierten Zellen verglichen, um die Zielorientierung des Ortes FSH-β festzustellen. Die DNA wird mit NheI, SacI, EcoRI, BglII, BamHI oder NsiI aufgeschlossen und mit einem –700 bp Fragment aus dem zweiten Intron des FSH-β Gens, das außerhalb des Zielvektors liegt (als FSH 3' Sonde bezeichnet) sondiert. Diese Sonde wird durch Polymerase-Kettenreaktion synthetisiert, mit der DNA aus WI38-Zellen als Matrize unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 15 und 16. Das resultierende Fragment von –1,4 kb wird mit PstI und SacI aufgeschlossen, um das Fragment mit –700 bp zu erhalten. Die Kolonien mit der richtigen Zielorientierung zeigen Hybridisierungsfragmente im Einklang mit der Einfügung der –7,0 kb entsprechend der Sequenz mit pIKFSHα, SVDHFR, LEU2 und CMV sowie Verstärker und Promoter.
Übertragung der zielorientierten Stelle FSH-β in CHO-Zellen
Die gesamte Hefe-DNA wird für die Transfektion von CHO DHFR-DUKX-B1-Zellen (Urlaub und Chasin, 1990, PNAS/:4216–4220) verwendet, im Wesentlichen wie von Eliceiri et al., für die Übertragung von künstlichen Hefezellen in Mäuse-L/tk-Zellen beschrieben (Eliceiri et al., 1991, PNAS 88: 2179–2183), aber optimiert für die Transfektion von CHO-Zellen. Genomische DNA wird aus den Zielzellen extrahiert durch Sphäroplastbildung aus 5 × 10¹⁰ Hefezellen, wie von Phillipsen et al., beschrieben in 1991, Methods in Enzymology 194: 169–174, mit anschließender Auflösung in 20 ml SDS 0,5%, 10 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA und 0,5 mg/ml Proteinase K und Inkubation für eine Dauer von 2–3 Stunden bei 50°C. Nach Extraktion in Phenol und Chloroform wird das Lysat auf 100 mM NaCl eingestellt, die genomische DNA mit Isopropanol ausgefällt, wieder in Suspension gebracht, auf 20 μg/ml RNAse A eingestellt und 30 Minuten lang bei 37°C digeriert. Die DNA wird mit Phenol und Chloroform extrahiert, auf 100 mM NaCl eingestellt, mit gleichem Volumen Isopropanol ausgefällt, in 5 ml 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA wieder in Suspension gebracht, dann 48 Stunden lang dialysiert (13 Wechsel, 4 L 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA), mit nachfolgender Konzentration durch Ausfällung in Isopropanol, wie vorstehend beschrieben und bei einer Endkonzentration von 0,5 μg/μl wieder in Suspension gebracht. 2 × 10⁵ CHO DHFR-Zellen werden 12 Stunden vor der Transfektion auf Schalen von 10 cm in Medien DME/F12, ergänzt mit 10% Serum von Rinderföten, Glycin, Hypoxanthin und Thymidin (nichtselektive Medien), plattiert. Für die Transfektion werden 150 μl 2 × HeBS (280 mM NaCl, 50 mM Hepes pH 7,1, 1,5 Na₂HPO₄) zu 15 μg genomische Hefe-DNA in 150 μl 0,27 M CaCl₂ gegeben. Das Präzipitat lässt man 25 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen, fügt es den Zellen ohne Medium zu und lässt es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, füllt auf mit 3 ml des Mediums und lässt bei 37°C inkubieren.
Alternativ werden 30–50 μg genomische Hefe-DNA, die das künstliche Hefechromosom enthält, mit sterilem Wasser auf 0,5 ml verdünnt, 0,5 ml 0,5 M CaCl₂ zugefügt, unmittelbar gefolgt von der Zugabe von 1,0 ml HNP (49 mM Hepes hP 7,1, 274 mM NaCl, 1,4 mM Na₂ HPO₄). 2 ml des Gemisches wird jeweils auf eine 10 cm Schale gegeben.
Vier Stunden später werden die Zellen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen, mit 15% Glycerin in HeBS 4 Minuten lang bei 37°C inkubiert, wieder in serumfreiem Medium gewaschen, mit nachfolgendem Wachstum über eine Dauer von 48 Stunden in nichtselektivem Medium. Die transfektierten Zellen werden dann in selektives Medium 1 : 20 aufgeteilt (DME/F12 ergänzt mit 10% dialysiertem Serum von Rinderföten) und für eine Dauer von 3 Tagen genährt. Die Transfektierte DNA in CHO DHFR+ Transformanten wird amplifiziert durch Auswahl in zunehmenden Konzentrationen von Methotrexat. Künstliche Hefechromosome, die CHO DHFR+ Klone enthalten, werden in selektiven Medien mit 5 × 10⁵ Zellen pro Schale von 10 cm plattiert und mit 0,01 μm Methotrexat selektiert (Kaufman und Sharp, 1982. J. Mol. Biol. 159: 601–621). Überlebende Kolonien werden gepoolt und dann mit der Southern Blot Analyse auf eine erhöhte Anzahl DNA-Kopien und mit der Immunfällungsanalyse auf eine erhöhte Proteinproduktion getestet. Das Amplifizierungsprotokoll wird wiederholt, wobei die Konzentration von Methotrexat von 0,01 μm auf 50 μm erhöht wird, mit einer in jedem Schritt um das drei- bis fünffache erhöhten Methotrexatkonzentration.
Analyse der CHO-Transfektanten: Transfektierte Kolonien werden expandiert und für die Produktion von FSH-α und -β mRNA und biologisch aktive heterodimere FSH gekennzeichnet. Die gesamte RNA wird präpariert und das Niveau der richtig initiierten FSH-α und -β mRNA wird durch Starter-Extensionsanalyse bestimmt (Finer et al., 1987), unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide:
FSH-α: 5'-AGCTGCATATTTTCTGTAGTAATCC
FSH-β: 5'-CCTGGTGTAGCAGTAGCCAGCACAC
Die RNA-Ausprägung wird durch den Nachweis der Starter-Extensionsprodukte angezeigt, im Einklang mit der Zugabe des ersten Exon in CMV und der Polylinker-Sequenz von pIK für FSH-α, sowie dem Austausch des ersten Exon von FSH-β durch den Bereich CMV IE.
Die heterodimere FSH wird nachgewiesen durch Impulsmarkierung transfektierter Klone mit ³⁵S-Methionin, gefolgt von der Immunfällung des aus dem konditionierten Medium und aus Zell-Lysaten aufgenommenen Proteins (Keene et al., 1989, JBC 264, 4769–4775). Die Analyse von nativem und denaturierendem Polyacrylamid-Gel zeigt ein Proteinprodukt ähnlich dem hochreinen Follikelreifungshormon des Menschen. Die biologische Aktivität des ausgeprägten Produktes wird bestätigt unter Verwendung des Granulosazellen-Aromatase-Biotests (Jia et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. (1986) 62: 1243–1249; Jia et al., Endocrinology (1986) 119: 1570–1577).
Aktivierung der G-CSF-Analogexpression
Aufbau von G-CSF-Zielvektoren: Zur Aktivierung der Ausprägung des G-CSF-Gens wird ein Zielvektor für das künstliche Hefechromosom aufgebaut, (pYGTI), der die folgenden Elemente (5' bis 3') enthält: einen 5'-Zielbereich, der aus den Nukleotiden –361 bis –69 des G-CSF-Gens besteht (Nagata et al., EMBO J. (1986) 5: 575–581), eine DHFR-Expressionskassette, den für Hefe selektionsfähigen Marker LEU2, den Verstärker/Promoter/Spleißdonor für das CMV IE des Menschen, einen Spleißakzeptor für das α-1 Globin-Gen des Menschen und einen 3'-Zielbereich, der aus den Nukleotiden –60 bis +167 des G-CSF-Gens besteht. Dieses Plasmid wird aus den Plasmiden pTD-G und pMF-G abgeleitet. Das Plasmid pTD-G ist aus zwei aufeinander folgenden Fragmenteinfügungen in pTD aufgebaut. Zuerst wird das 1,95 kb Fragment PvuII-BamHI von SV2DHFR, das den früh reagierenden Promoter SV40 codiert, das DHFR-Gen, das SV40 t Antigen-Intron und die Stelle für die früh einsetzende Polyadenylierung mit den MluI-Verbindungselementen verbunden und an der Stelle MluI geklont. Zweitens wird das 2,2 kb Fragment SalI-XhoI von Yepl3, das den für Hefe selektionsfähigen Marker LEU2 codiert, an der Stelle XhoI geklont. Die Reihenfolge dieser Elemente innerhalb der Kassette Bsu36I war 5'-SV2DHFR-LEU2-3', wobei beide die gleiche Transkriptionsorientierung haben.
pMF-G wird durch Einfügung von drei Fragmenten in pMF in zwei Schritten aufgebaut. Zuerst wird ein Fragment NheI-Bsu36I, das die Nukleotide –361 bis 69 des menschlichen Gens G-CSF (Zielgebiet 5') enthält, durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 17 und 18 erzeugt und zwischen den Stellen NheI und Bsu36I geklont. Zweitens wird ein Fragment EcoRI-NotI, das die Nukleotide –60 bis +167 des G-CSF-Gens enthält, durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 19 und 20 erzeugt. Dieses Fragment EcoRI-NotI und ein Fragment HindIII-EcoRI aus pIK, das den Verstärker/Promoter/Spleißdonor für das CMV IE des Menschen und einen Spleißakzeptor für das α-1 Globin-Gen enthält, werden in einer dreiteiligen Verbindung zwischen den Stellen HindIII und NotI eingefügt.
pYGTI wird aufgebaut durch Einfügung des 4,2 kb Fragmentes Bsu36I von pTD-G an der einzigen Bsu36I Stelle von pMF-G, wobei die Transkriptionsorientierung der Elemente innerhalb des Fragmentes Bsu36I mit dem CMV Verstärker/Promoter in pMF-G identisch ist.
Zur Erzeugung von Sequenzen, die fähig sind, die Modifizierung des G-CSF-Polypeptids zu leiten, wird ein Zielvektor (pYGT2) für das künstliche Hefechromosom aufgebaut, der die folgenden Elemente (5' bis 3') enthält: einen 5'- Zielbereich, der aus den Nukleotiden +1180 bis +1480 des G-CSF-Gens besteht, eine cDNA der schweren Kette des Immunglobulins IgG2, welche die Gelenkregion codiert, CH2 und CH3 Bereiche (Aminosäuren 216–478, Kabat et al., 1983, Sequences of Proteins of Immunological Interest), eine SV40 Stelle für die frühzeitig einsetzende Polyadenylierung, den für Hefe selektionsfähigen Marker HIS3 und einen 3' Zielbereich, der aus den Nukleotiden +1496 bis +2599 des G-CSF-Gens besteht. Die 5' Zielsequenzen und IgG2-cDNA-Sequenzen sind so konfiguriert, dass nach erfolgreicher Zieler fassung eine Sequenz erzeugt wird, die ein Hybrid-G-CSF-IgG2-Protein codiert, worin Gln-176 von G-CSF mit Glu-216 der Gelenkregion IgG2 vereinigt wird. pYGT2 wird aufgebaut durch vier aufeinander folgende Einfügungen von Fragmenten in pDS, das erzeugt wird durch Einfügung des synthetischen Polylinkers 5'-XbaI-MluI-BamHI-SphI-SalI-3' in pSKII zwischen den Stellen KpnI und SacI, wobei diese Stellen verloren gehen. Zuerst wird ein Fragment MluI-BamHI, das die Stelle SV40 für eine früh einsetzende Polyadenylierung enthält (Nukleotide 2270 bis 2533) erzeugt durch Polymerase-Kettenreaktion mit pSV2DHFR als Matrize unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 21 und 22 und eingefügt zwischen den Stellen MluI und BamHI. Zweitens wird das 1,7 kb Fragment BamHI von pNN414, das den für Hefe selektionsfähigen Marker HIS3 (Traver et al., wie oben) codiert, an der Stelle BamHI geklont. Drittens wird ein XbaI an einem Fragment mit glattem Ende, das die Nukleotide +1180 bis +1480 des G-CSF-Gens enthält und ein Fragment mit glattem Ende an MluI, das die Aminosäuren 216–478 der schweren Kette des Immunglobulins IgG2 codiert, in einer dreiteiligen Verbindung zwischen den Stellen XbaI und MluI eingefügt. Das Fragment des G-CSF-Gens wird durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 23 und 24 erzeugt und das IgG2 Fragment wird durch Polymerase-Kettenreaktion mit einem cDNA-Klon, der aus einer von der menschlichen Leber gewonnenen cDNA-Bibliothek (Clontech) stammt, als Matrize, unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 25 und 26 erzeugt. Schließlich wird ein 1,1 kb Fragment SphI-SalI, das +1496 bis +2599 des G-CFS-Gens enthält, durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 27 und 28 erzeugt und zwischen den Stellen SphI und SalI eingefügt.
Starter 17: 5'-GAATTCGCTAGCCTGCCGCTTCCAGGCGTC-3'
Starter 18: 5'-GAATTCCCTAAGGCATAACCCCATGGAGGCC-3'
Starter 19: 5'-GATGATGAATTCGCCCCCTAGAGCTGGGCC-3'
Starter 20: 5'-ATGATGGCGGCCGCCCCTCTCGGGGACACTGG-3'
Starter 21: 5'-AGAGAGACGCGTGCCATACCACATTTGTAG-3'
Starter 22: 5'-GCAGCAGGATCCAGACATGATAAGATAC-3'
Starter 23: 5'-GAATTCTCTAGAAAGGTCGTGCTGGCATTC-3'
Starter 24: 5'-CTGGGCAAGGTGGCGTAG-3'
Starter 25: 5'-GAGCGCAAATGTTGTGTC-3'
Starter 26: 5'-GAATTCACGCGTCACGCGACCCCGAGAGCC-3'
Starter 27: 5'-AGAGAGGCATGCTCCCCATCCCATGTATTT-3'
Starter 28: 5'-GAATTCGTCGACCGAGTGCAGATTCCATGT-3'
Gen-Targeting des Ortes G-CSF: Die Identifizierung einer Kolonie des künstlichen Hefechromosoms, die den Ort des menschlichen granulozytenkoloniestimulierenden Faktors G-CFS (YAC-CSF-1) enthält, unter Verwendung des 1,1 kb Fragmentes SphI-SalI als Sonde und Übertragung des künstlichen Hefechromosoms auf den Hefestamm YPH252 erfolgt wie vorstehend für den Ort FSH-β beschrieben. Zur Aktivierung der Expression eines Hybrid-Polypeptids GCS-F-IgG2 werden zwei aufeinander folgende Gen-Targeting Vorgänge unter Verwendung der Zielvektoren pYGT1 und pYGT2 durchgeführt. Zuerst wird der Zielvektor pYGT1 mit NheI und NotI aufgeschlossen, um ein 4,7 kb Fragment freizusetzen. Dieses Fragment wird verwendet, um Hefe-Sphäroplasten des Stammes YPH252/YAC-G-CSF-1 zu transformieren. Die gesamte genomische Hefe-DNA der LEU+ Transformanten wird einer Southern Blot-Analyse unterzogen und mit der DNA aus nicht transformierten Zellen verglichen, um die Zielorientierung des Ortes G-CSF nachzuweisen. Die DNA wird mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen und mit einem –1,1 kb-Fragment des nichttranslatierten Bereichs 3' des G-CSF-Gens, das außerhalb des Zielbereichs liegt, sondiert. Diese Sonde wird durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 27 und 28 erzeugt. Richtig zielorientierte Kolonien weisen hybridisierende Fragmente auf, die mit der Einfügung der ~4,7 kb den Sequenzen SVDHFR, LEU2 und CMV IE entsprechend im Einklang stehen. Als nächstes wird der Zielvektor pYGT2 mit XbaI und SalI aufgeschlossen, um ein ~4,1 kb Fragment freizusetzen. Dieses Fragment wird zur Transformation der Hefe-Sphäroplasten des mit dem vorstehend beschriebenen Zielvorgang erzeugten Stammes verwendet. Die gesamte genomische DNA der Hefe aus den Transformanten His+ wird der Southern Blot Analyse unterzogen und mit der DNA aus nichttransformierten Zellen verglichen, um die Zielorientierung des Ortes G-CSF nachzuweisen. Die DNA wird mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen und mit einem 300 bp Fragment aus dem nichttranslatierten 5' Bereich des G-CSF-Gens, der außerhalb des neuen Zielbereichs liegt, sondiert. Diese Sonde wird durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter 17 und 18 erzeugt. Richtig zielorientierte Kolonien weisen hybridisierende Fragmente auf, die mit der Einfügung der ~4,1 kb den Sequenzen IgG2, SV40 und HIS3 entsprechend im Einklang stehen. Die gesamte DNA wird aus dem Hefestamm mit dem doppelten Zielbereich präpariert und zur Transfektion von CHO DHFR-Zellen verwendet, wie vorstehend für das FSH-β Gen beschrieben. Nach der Gen-Amplifizierung der transfektierten G-CSF-IgG2 Sequenzen werden die CHO-Kolonien einer Analyse zur Feststellung der Ausprägung des G-CSF-Analogs unterzogen.
Analyse von CHO-Klonen, die mit dem künstlichen Hefechromosom transfektiert wurden: Das abgesonderte G-CSF-IgG2 wird gekennzeichnet durch Markierung der transfektierten Klone mit ³⁵S-Methionin und nachfolgende Immunfällung des Überstandes der Kultur und der Zell-Lysate wie beschrieben (Capon et al., Nature (1989) 337: 525–531). Die ausgewaschenen Immunpräzipitate werden eluiert, der Elektrophorese auf Polyacrylamid-Gel unter Reduktionsbedingungen unterzogen und durch autoradiographische Aufnahmen, die das Hybrid-Polypeptid zeigen, sichtbar gemacht.
Das Vorhandensein des G-CSF-Anteils wird durch die Western Blot-Analyse bestätigt. Der nicht markierte Überstand wird in ähnlicher Weise der Im munfällung und der Elektrophorese unterzogen und die Proteine werden auf Nitrozellulose-Filter übertragen (Burnette, Anal. Biochem (1981) 112: 195). Die Filter werden mit polyklonem Antiserum des Kaninchens für die G-CSF des Menschen (Genzym) behandelt und die Banden werden sichtbar gemacht durch Behandlung mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Antikörper des Kaninchen-Immunoglobins (Boehringer Mannheim) und nachfolgender Einfärbung mit 3,3'-Diaminobenzidin und H₂O₂.
Das folgende Beispiel beschreibt die Verwendung einer primären Säuger-Wirtszelle für die Ziel-DNA.
Aktivierung des Faktor IX Gens
Aufbau eines Zielvektors für den Faktor IX: Zwei Zielplasmide des künstlichen Hefechromosoms, pRSN303.A/F9HR/340 und pRSN303.A/F9HR/34, wurden zur Aktivierung der Expression des Faktor IX Gens konstruiert, die folgende Elemente 5' bis 3' enthielten: einen 5'-Zielbereich, der aus den Nukleotiden –328 bis +17 (pRSN303.A/F9HR/340) oder –18 bis –17 (pRSN303.A/F9HR/34) des menschlichen Faktor IX Gens bestand (Yoshitake et al., 1985, Biochemistry 24: 3736–3750), den für Hefe selektionsfähigen Marker His3 (Campbell et al., wie nachstehend beschrieben), den für Säugergene selektionsfähigen Marker MC1 Neo (Thomas und Campecchi, 1987, Cell 51: 503–512), die Plasmid-Hauptkette von pRS303 (Campbell et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 5744–5748), eine für Säugergene selektionsfähige und amplifizierbare Dihydrofolat-Reductase (DHFR)-Expressionskassette aus SV2 DHFR (Subramani et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1: 854–864), den unmittelbar früh wirkenden Verstärker/Promoter/erstes Exon und Spleißdonor von HCMV (Boshart et al., 1985, Cell 41: 521–530), den Spleißakzeptor vom Intron 1 des menschlichen al Globin-Gens (Treisman et al., 1983, PNAS 80: 7428–7432) und einen 3' Zielbereich, der aus den Nukleotiden +17 bis +3996 des menschlichen Faktor IX Gens bestand.
pRSN303.A/F9HR/340 wurde aus den Plasmiden pRSN303.A/340 und pSK.9/F9HR abgeleitet und pRSN303.A/F9HR/34 wurde aus den Plasmiden pRSN303.A/34 und pSK.9/F9HR abgeleitet. pRSN303.A/340 wurde aufgebaut durch Einfügung des synthetischen 71-mers, definiert durch die Oligonukleotide 1 und 2, zwischen den Stellen Sac I und Apa I von pRSN303 (Campbell et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5744–5748), mit dem Verlust der Stelle Sac I, um pRSN303.A zu erzeugen. Dieses Nukleotid enthielt die Restriktionsstellen 5'-ApaI-ClaI-EcoRI-BclI-EspI-NotI-BstEII-NheI-3'. pRSN303 enthält den für Hefe selektionsfähigen Marker HIS3 und den im Plasmid pRS geklonten für Säuger-Gen selektionsfähigen Marker MCl Neo (Campbell et al.,). Die Nukleotide –322 bis +17 des menschlichen Faktor IX Gens zur Codierung der 5' Homologie wurden durch Polymerase-Kettenreaktion synthetisiert unter Verwendung von pFIX-18 (Yoshitake et al., 1985, Biochemistry 24: 3736–3750) als Matrize und mit den Startern a und b. Das Produkt wurde zwischen den Stellen BstEII und Nhe I von pRSN303.A geklont, um pRSN303.A/340 zu erzeugen. pRSN303.A/34 wurde durch Ligation eines synthetischen 35-mers aufgebaut, definiert durch die Oligonukleotide 7 und 8, zwischen den Stellen Bst EII und Nhe I von pRSN303.A.
Der Aufbau von pSK.9/F9HR erfolgte unter Verwendung der zwei Zwischenstufen pSK.9 und pCG.1. pSK.9 wurde aufgebaut durch Einfügung des vorstehend beschriebenen 71-mers in die Stellen Sac I und Apa I von Bluescript pSK- (Stratagene). pCG.1 wurde aufgebaut durch Einfügung des durch die Oligonukleotide 3 und 4 definierten synthetischen 72-mers zwischen den Stellen Sac I und Kpn I von pSK- (Stratagene), mit dem Verlust der Stellen SacI und KpnI. Dieses Oligonukleotid codierte die Restriktions-Stellen 5'-NotI-SacII-ClaI-MluI-XhoI-HindIII-XbaI-BstEII-SacII-NotI-3'. Ein HindIII-XbaI Fragment, das den Verstärker/Promoter CMV IE enthielt (Nukleotide –674 bis –1, Boshart et al., 1985, Cell 41: 521–530) wurde durch Polymerase-Kettenreaktion zubereitet, mit pUCH.CMV (M. Calos, Stanford University) als Matrize unter Verwendung der Oligonukleotid-Starter c und d, die an ihren jeweiligen Enden die Stellen HindIII und XbaI aufnahmen. Dieses Fragment wurde in pCG.1 eingeklont, um pCG.CMV zu erzeugen. Als nächstes wurde eine 1.94 kb SV2DHFR-Kassette mit dem Linker Mlu I verbunden durch Polymerase-Kettenreaktion synthetisiert, unter Verwendung der SV2 DHFR DNA als Matrize (Subramani et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1: 854–864) und der Starter e und f. Dieses Fragment wurde an der Stelle MluI von pCG.CMV eingeklont, um pCG.CMV/DHFR zu erzeugen. Das 2,6 kb Fragment ClaI-SacI von pCG.CMV/DHFR und das 0,3 kb Fragment SacI/EcoRI von pIK wurde dann durch Ligation mit den Stellen ClaI und Eco RI von pSK.9 verbunden, um pSK.9/DHFR/CMV zu erzeugen. Schließlich wurde ein 4,0 kb Fragment NheI-BglII des menschlichen Faktor IX Gens von pFIX-18 isoliert (Yoshitake et al., 1985, Biochemistry 24: 3736–3750) und zusammen mit einem Eco RI-XbaI-Adaptor durch Ligation verbunden, definiert durch die Oligonukleotide 5 und 6, an den Stellen BclI und EcoRI von pSK.9/DHFR/CMV aufgenommen, um pSK.9/F9HR zu erzeugen.
Die endgültigen Zielplasmide wurden aufgebaut durch Ligation einer 6,94 kb ClaI/NotI-Kassette von pSK.9/F9HR in ClaI/NotI zur Aufnahme in pRSN-303.A/340 oder pRSN303.A/34, um die Plasmide pRSN303.A/F9HR/340 und pRSN303.A/F9HR/34 zu erhalten, die 340 bp, beziehungsweise 34 bp Faktor IX-Homologie am 5'-Ende und 4 kb Homologie am 3'-Ende des Vektors aufweisen, getrennt durch die Aktivierungs-/Amplifizierungskassette.
Oligonukleotide

1. 5'-GTC GAC TGC TAG CAA TGG TGA CCT GCG GCC GCA GCT GAG CGT GAT CAC ATG AAT TCC ATA TCG ATT GGG CC-3'
2. 5'-CAA TCG ATA TGG AAT TCA TGTGAT CAC GCT CAG CTG CGG CCG CAG GTC ACC ATT GCT AGC AGT CGA CAG CT-3'
3. 5'-TGC GGC CGC GGT TAT CGA TGA CGC GTC CTC GAG CAA GCT TCT CTA GAC GGT CAC CTT CCG CGG CCG CTG TAC-3'
4. 5'-AGC GGC CGC GGA AGG TGA CCG TCT AGA GAA GCT TGC TCG AGG ACG CGT CAT CGA TAA CCG CGG CCG CAA GCT-3'
5. 5'-CTA GAG ATT GTG AAA G-3'
6. 5'-AAT TCT TTC ACA ATC T-3'
7. 5'-GTC ACG TAC AAC TAA TCG ACC TTA CCA CTT TCA CAA TCT G-3'
8. 5'-CTA GCA GAT TGT GAA AGT GGT AAG GTC GAT TAG TTG TAC-3'

Starter für die Polymerase-Kettenreaktion

a. 5'-CAG GT ACC GTA CAG CCA TTT TGG TAA ACA TCA T-3'
b. 5'-TTT GCT AGC AGA TTG TGA AAG TGG-3'
c. 5'-CGC CAA GCT TGG CCA TTG CAT ACG TT-3'
d. 5'-GAG GTC TAG ACG GTT CAC TAA ACG AGC TCT-3'
e. 5'-GGA CGC GTG GAT CCA GAC ATG ATA AGA TA-3'
f. 5'-GGA CGC GTC AGC TGT GGA ATG TGT GTC AG-3'
g. 5'-ACC ACT CAT ACA TTG CTG ATG G-3'
h. 5'-GGC CAG TGA ATT GTA ATA CG-3'

Targeting des Ortes für Faktor IX: Das Targeting von Faktor IX YAC erfolgte durch Transformation von 5 μg NotI, linearisiertem pRSN303.A/F9HR/340 oder pRSN303.A/F9HR/34 mit Lithiumacetat (Schiestl und Gietz, 1989, Current Genetics 16: 339–346) zum haploiden Stamm Saccharomyces cerevisiae YPH599/HYA32G5. Dieser Hefeklon enthält 650 kb künstliches Hefechromosom, welche das Gen für den Humanfaktor IX codiert (Campbell et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5744–5748). Die Transformanten wurdeb auf Miniplatten ausgewählt, ohne Histidin und mit gereinigter Kolonie, auf die Fähigkeit zum Wachstum in Abwesenheit von Uracil getestet.
His+ Transformanten wurden auf Miniplatten ohne Uracil repliziert und nur his+/ura+ Kolonien wurden dem Screening durch Polymerase-Kettenreaktion unterzogen, um die homologe Rekombination am Ort für den Faktor IX zu überprüfen. Zwei Starter wurden synthetisiert: Starter g, der innerhalb der genomischen Sequenz 5' der 340 bp 5' Homologie für den Faktor IX gelegen war und Starter h, entsprechend eines Bereiches im Zielplasmid zwischen der 340 bp 5' Homologie für den Faktor IX und dem Gen HIS3. Ein Ereignis der homologen Rekombination würde ein neues Amplifikationsprodukt von 422 bp erzeugen. Die Transformanten wurden in Dreiergruppen gepoolt, nach dem Wachstum einzelner Kolonien über Nacht in dem Medium YPDA. Die in die Pools aufgenommenen Zellen wurden mit Zymolyase einer Sphäroplastenbildung ausgesetzt (Philippsen et al., 1991, Methods in Enzymology 194: 169–174), durch Sieden für eine Dauer von 10 Minuten einem Lösungsvorgang unterzogen und ein aliquoter Teil von 10 μl aus jeder Probe wurde für die PCR-Analyse verwendet. Die PCR-Reaktionen von 50 μl enthielten 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25°C), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, 0,1% Triton X-100, 200 mM dNTPs, je 1 mM der vorstehend beschriebenen Starter und 1,5 U der Taq-DNA-Polymerase (Promega). Nach einer Anfangs-Inkubation von 3 Minuten Dauer bei 94°C wurden die Proben eine Minute lang 40 Zyklen eines Denaturierungsvorgangs bei 94°C unterzogen, gefolgt von 2 Minuten Annealing bei 55°C und 3 Minuten Extension bei 72°C. Am Ende der 40 Zyklen wurden die Proben einer weiteren Inkubation von 5 Minuten Dauer bei 72°C unterzogen. 5 μl von jeder Probe wurden auf 1% Agarose-Gel analysiert und mit Äthidium-Bromid gefärbt. Fast das gesamte analysierte Lysat enthielt das Fragment in der richtigen Größe. Eine PCR-Analyse, in der die gereinigte genomische DNA verwendet wurde, die aus den von den positiven Pools gewonnenen einzelnen Kolonien isoliert worden war, zeigte, dass alle geprüften Proben die richtigen 422 bp des für die Ziel-YAC charakteristischen Amplifikationsproduktes produzierten.
Southern Analyse der Zielhefen-DNA
Eine Southern Analyse von einigen der positiven Klone aus der PCR wurde zur näheren Charakterisierung der Zielereignisse benützt. Die richtige Ziel orientierung des Ortes für den Faktor IX würde zu einer Mobilitätsverschiebung von einem im nichtmodifizierten künstlichen Hefechromosom gefundenen 1,4 kb Fragment XbaI wegen der Einfügung von 8,3 kb inerhalb des ersten Exon von Faktor IX, His3, pRS, MCl Neo, SV2DHFR und CMV IE zu 9,7 kb führen. Das erwartete Fragment von 9,7 kb wurde bei den meisten positiven Transformanten der PCR unter Verwendung des End-markierten PCR-Starters g als Sonde nachgewiesen, im Vergleich zu dem 1,4 kb Fragment, das bei der nicht modifizierten Hefe YPH599/HYA32G5 nachgewiesen wurde.
Die Southern-Analyse wurde auch unter Verwendung der mit EcoRI aufgeschlossenen genomischen DNA mit zwei verschiedenen Sonden durchgeführt. Bei Verwendung als Sonde wird von dem 340 bp Fragment 5' Faktor IX aus dem Zielplasmid im nicht modifizierten künstlichen Hefechromosom ein 12,8 kb EcoRI-Fragment nachgewiesen. Dieses Fragment war in den Zielklonen nicht vorhanden und war wegen der Zieleinfügung einer zusätzlichen EcoRI-Stelle am 5'-Ende von MC1 Neo durch ein 9,0 kb Fragment ersetzt. Das 9,0 kb EcoRI-Fragment wurde auch in der Ziel-DNA des künstlichen Hefechromosoms nachgewiesen, ebenso wie bei einer Sonde, die das gesamte Neo-Gen umfasst, ein 6,1 kb EcoRI-Fragment innerhalb des Zielplasmids nachgewiesen wurde.
Übertragung des aktivierten Faktor IX Gens auf CHO und Analyse der Expression: Die genomische Hefe-DNA wurde aus dem künstlichen Hefechromosom mit dem zielaktivierten Faktor IX gewonnen und für die Transfektion von CHO-DHFR-DUKX B1 Zellen verwendet (Urlaub und Chasin, 1980, PNAS 7: 4216–4220). Die genomische DNA wurde aus den zielaktivierten Klonen YAC-pRSN303.A/F9HR/34 durch Sphäroplastenbehandlung von 5 × 10¹⁰ Hefezellen extrahiert, wie von Philippsen et al., 1991, Methods in Enzymology, 194: 169–174), beschrieben, gefolgt von einer Auflösung in 20 ml 0,5% SDS, 10 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA und 0,5 mg/ml Proteinase K und Inkubation von 2–3 Stunden Dauer bei 50°C. Das Lysat wurde mit Phenol extrahiert, mir Chloroform extrahiert, auf 100 mM NaCl eingestellt und die genomische DNA mit dem gleichen Volumen Isopropanol ausgefällt. Die DNA wurde dann wieder in Suspension gebracht mit 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, auf 20 μg/ml RNAse A eingestellt und 30 Minuten lang bei 37°C digeriert. Nach der RNAse-Behandlung wurde die DNA mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert, auf 100 mM NaCl eingestellt und mit dem gleichen Volumen Isopropanol ausgefällt. Die genomische DNA wurde wieder in 5 ml 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA in Suspension gebracht, 48 Stunden lang einer Dialyse mit dreimaligem Wechsel von 4 Liter 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA unterzogen, gefolgt von der Konzentration durch Ausfällung mit Isopropanol, wie vorstehend beschrieben und bei einer Endkonzentration von 0,5 μg/μl in 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA wieder in Suspension gebracht.
Zur Transfektion wurden 1,5 × 10⁶ CHO DHFR-Zellen 12 Stunden vor der Verwendung auf Schalen von 10 cm plattiert in Medien DME/F12, ergänzt durch 10% Serum aus Rinderföten, Glycin, Hypoxanthin und Thymidin (nichtselektive Medien). Die Medien wurden 2 Stunden vor der Transfektion ersetzt durch DME, 4,5 g/l Glucose, 10% Serum aus Rinderföten. 30 μg genomische Hefe-DNA wurden in einem 4 ml Röhrchen aus Polystyrol mit sterilem Wasser auf 0,5 ml verdünnt. Der genomischen DNA wurden 0,5 ml 0,5 M CaCl₂ zugefügt, leicht gemischt, unmittelbar gefolgt von der Zugabe von 1,0 ml HNP (49 mM Hepes, pH 7,10, 274 mM NaCl, 1,4 mM Na₂HPO₄). 2 ml der Mischung wurden in eine Schale von 10 cm gegeben und die Zellen bei 37°C inkubiert. 4 Stunden später wurde das Calciumphosphat-Präzipitat entfernt und die Zellen wurden 2,5 Minuten lang bei 37°C mit 15% Glyzerin in HeBS (140 mM NaCl, 25 mM Hepes pH 7,1, 0,75 mM Na₂HPO₄) inkubiert, zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen, mit nachfolgendem Wachstum in nichtselektivem Medium für eine Dauer von 48 Stunden. 50% der Zellen aus jeder Transfektion wurden 1 : 10 aufgeteilt in DME/F12, 10% dFBS (dialysiertes Rinderfötenserum), Glycin, Thymidin und Hypoxanthin, sowie 400 μg/ml G418. Die restlichen Zellen wurden aufgeteilt in DME (4,5 g/l Glucose), 10% dFBS und nichtessentielle Aminosäuren zur Selektion von DHFR-positiven Kolonien. Das Medium wurde alle 3 Tage ausgetauscht und die überlebenden Klone wurden im Zeitraum zwischen den Tagen 10 bis 16 herausgepickt und auf Böden mit 24 Probenaufnahmen gebracht. Klone wurden auf 6 cm Platten für den Enzymimmuntest ELISA expandiert, und für die Gefrierkonservierung und DNA-Präparation auf 10 cm Schalen gebracht.
Sieben Transfektionen ergaben insgesamt 24 G418-resistente Kolonien und 86 DHFR-positive Kolonien. Diese wurden einem Screening-Test auf Absonderungen des Faktors IX unterzogen, unter Anwendung eines handelsüblichen ELISA-Kit (Asserachrom IX:Ag, #0410) und 45% erwiesen sich als positiv bezüglich des ausgeschiedenen immunoreaktiven Proteins. Das durchschnittliche Expressions-Niveau lag zwar bei einer Absonderung von 2,35 ng Faktor IX pro ml pro 10⁶ Zellen in 24 Stunden, aber in 2 von 51 positiven Kolonien erreichte die Absonderung von Faktor IX ein Niveau von 6 ng/ml/106 Zellen/24 Stunden (Tabelle 1).
Die Analyse von Faktor IX durch Immunfällung und Elektrophorese mit Polyacrylamid-Gel bestätigte, dass Polypeptide der richtigen Größe synthetisiert und ausgeschieden wurden. Zusammenfließende Schalen von 6 cm mit den ELISA-positiven Klonen und ein nicht-exprimierender Klon wurden der Impulsmarkierung mit ³⁵S Cystein für eine Dauer von 6 Stunden unterzogen, der Überstand wurde abgenommen und Zell-Lysate zubereitet. Die markierten Lysate oder Überstände wurden über Nacht mit normalen Kaninchenserum oder polyklonalem Faktor IX Antiserum inkubiert, mit Pansorbin geerntet, in einem Detergent-Puffer gewaschen, zum Sieden gebracht und unter reduzierenden Bedingungen auf 10% SDS Polyacrylamid-Gel behandelt, wie von Smith et al., (Smith et al., 1987) beschrieben. Zwei Polypeptide wurden der Immunfällung nur in Zell-Lysaten aus Klonen, die den immunoreaktiven Faktor IX ausgeprägt hatten, unterzogen. Die größere Spezies, ein 56 kd Polypeptid, entspricht dem primären Translationsprodukt der Faktor IX mRNA. Das kleinere 67 kd Polypeptid entspricht wahrscheinlich einer teilweise glycosylierten oder γ-carboxylierten Form von Faktor IX. Mit den Faktor IX Antiseren wurde ein einziges 72 kd Polypeptid aus konditionierten Medien mit diesen Klonen ausgefällt und diese Spezies wird für die biologisch aktive Form von Faktor IX gehalten (Miletich et al., 1980, Anal. Biochem. 304–310).
Eine Southern Blot Analyse wurde an 21 Faktor IX ELISA-positiven Klonen (sowohl Neo- als auch DHFR-positiv) und an einem DHFR-positiven, Faktor IX ELISA-negativen Klon durchgeführt, um zu bestätigen, dass das gesamte Faktor IX Gen übertragen wurde. EcoRI-Auszüge der genomischen DNA wurden mit dem aus der 3' nicht-codierenden Region von Exon 8 gewonnenen 865 bp Fragment ApaI/EcoRI sondiert. Das 3'-Ende dieses EcoRI-Fragments befindet sich im Abstand von 32,5 kb von der Transkriptions-Einleitungsstelle des Faktor IX-Gens. Alle positiven Klone enthielten das erwartete 5,5 kb Band, das identisch mit der DNA HT1080 war und keine nicht-transfektierten CHO-Zellen enthielt. Somit haben DHFR-positive CHO-Klone, die den Faktor IX ausprägen, mindestens 35,5 kb genomische DNA erfolgreich übertragen und G418-resistente Klone haben mindestens 39 kb genomische DNA übertragen.
Tabelle I
Aus vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, dass ein einfaches, genaues Verfahren entwickelt wurde, das eine bequeme, hochwirksame Manipulation von Genen, die Einführung amplifizierbarer Marker zur Markierung eines Zielgens, Genmodifikationen und die Übertragung der resultierenden modifizierten Chromosomen-DNA auf einen Säugerwirt zur Expression, eine wirksame Ausprägung des gewünschtes Produktes mit der gleichen, im Wesentlichen gleichen oder einer verschiedenen Zusammensetzung im Vergleich zum Naturprodukt ermöglicht. Im Vergleich zu anderen Verfahren der Proteinproduktion, wie zum Beispiel der Verwendung von cDNA-Expressionsvektoren, ist ein hoher Proteinertrag erzielbar. So ist eine Verarbeitung und Kombination von Produkten durch Variationen im Spleissen, in der Bearbeitung, wie Glycosilierung, Acetilierung, Methylierung oder dergleichen ebenso möglich, wie eine stabile Produktion des erwünschten Produktes auf einem hohen und effizienten Niveau. So wird eine rasche, effiziente Methodik zur Schaffung von Expressionskonstrukten für die Transformation in Säugerwirte für die Expression vorgesehen, ohne dass es notwendig ist, das Ziel-Gen oder die cDNA zu isolieren und zu reinigen und wobei eine Modifizierung des Ziel-Gens mit hoher Wirksamkeit möglich ist.

Claims

Künstliches Hefechromosom mit einem ausprägungsfähigen Zielgen, darin inbegriffen ein Zielbereich, der ein Zielgen eines Säugers und im operativen Zusammenwirken mit dem Zielgen ein Regulationselement für die Transkription beinhaltet, wobei das Regulationselement für die Transkription heterolog zum Zielgen und fähig zu einer gerichteten Ausprägung des Zielgens in einer Wirtszelle eines Säugers ist.
Künstliches Hefechromosom nach Anspruch 1, wobei das Zielgen mindestens eine Mutation enthält.
Künstliches Hefechromosom nach Anspruch 1 oder 2, das ferner ein amplifizierbares Gen im Wirkungszusammenhang mit dem Zielbereich aufweist, wobei der Zielbereich in der Ausprägungs-Wirtszelle des Säugers amplifizierbar ist, wenn das amplifizierbare Gen durch den geeigneten Selektionswirkstoff amplifiziert wird.
Künstliches Hefechromosom nach Anspruch 3, wobei das amplifizierbare Gen aus der Gruppe gewählt wird, die aus Dihydrofolatreductase, Metallothionein-I, Metallothionein-II, Adenosindesaminase, Ornithin-Decarboxylase und Glutaminsynthetase besteht.
Künstliches Hefechromosom nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Säugergen ein Gen des Menschen ist.
Künstliches Hefechromosom nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Regulationselement für die Transkription ein Promotor und/oder Verstärker ist.
Künstliches Hefechromosom nach Anspruch 6, wobei der Promotor und/oder Verstärker von der Art ist, die beim Zytomegalie-Virus des Menschen im unmittelbaren frühen Bereich wirkt.
Hefezelle, die ein künstliches Hefechromosom nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Mit künstlichem Hefechromosom nach Anspruch 1 transformierte ausprägungsfähige Säuger-Wirtszelle oder nichtmenschliches, tierisches Nachkommengenom der transformierten Wirtszelle, welches das vom Regulationselement für die Transkription gesteuerte Zielgen ausprägt.
Mit künstlichem Hefechromosom nach Anspruch 3 oder 4 transformierte ausprägungsfähige Säuger-Wirtszelle oder Nachkommengenom der transformierten Wirtszelle, welches das vom Regulationselement für die Transkription gesteuerte Zielgen ausprägt, wobei der Zielbereich unter Bedingungen amplifiziert wird, die das amplifizierbare Gen amplifizieren.
Ausprägungsfähige Säuger-Wirtszelle nach Anspruch 9 oder 10, wobei die ausprägungsfähige Säuger-Wirtszelle eine Eierstockzelle eines chinesischen Hamsters, eine Affennierenzelle, eine Fibroblastenzelle der Maus C127, eine Zelle der Maus 3T3 oder eine Verozelle ist.
Ausprägungsfähige Säuger-Wirtszelle nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Zielgen ein Gen des Menschen ist.
Ausprägungsfähige Säuger-Wirtszelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Regulationselement für die Transkription ein Promotor und/oder Verstärker ist.
Kontinuierliche Säuger-Zell-Linie nach Anspruch 13, wobei der Promotor und/oder Verstärker von der Art ist, die beim Zytomegalie-Virus des Menschen im unmittelbaren frühen Bereich wirkt.
Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Hefechromosoms mit einem ausprägungsfähigen Zielgen, beinhaltend (a) den Einbau einer Nucleinsäure durch homologe Rekombination in einem künstlichen Hefechromosom, das ein Zielgen enthält, wobei die Nucleinsäure ein heterologes Regulationselement für die Transkription und einen Nucleotidbereich enthält, der homolog zu einem Bereich von mindestens 50 Nucleotiden des künstlichen Hefechromosoms ist und (b) die Wahl eines künstlichen Hefechromosoms, in welchem die Ausprägung des Zielgens in einer Säuger-Wirtszelle durch das heterologe Regulationselement für die Transkription regulierbar ist.
Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Hefechromosoms, das ein amplifizierbares Zielgen aufweist, beinhaltend (a) den Einbau einer Nucleinsäure durch homologe Rekombination in einem künstlichen Hefechromosom, das ein Zielgen enthält, wobei die Nucleinsäure ein Regulationselement für die Transkription, ein amplifizierbares Gen und einen Nucleotidbereich enthält, der homolog zu einem Bereich von mindestens 50 Nucleotiden des künstlichen Hefechromosoms ist und (b) die Wahl eines künstlichen Hefechromosoms, in welchem das Zielgen sowohl durch das integrierte Regulationselement für die Transkription regulierbar, als auch in der Säuger-Wirtszelle amplifizierbar ist, wenn das amplifizierbare Gen durch den geeigneten Selektionswirkstoff amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das amplifizierbare Gen aus der Gruppe gewählt wird, die aus Dihydrofolatreductase, Metallothionein-I, Metallothionein-II, Adenosindesaminase, Ornithin-Decarboxylase und Glutaminsynthetase besteht.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Einbau der Nucleinsäure mindestens eine Mutation in das Zielgen einführt.
Verfahren zur Herstellung einer ausprägungsfähigen Säuger-Wirtszelle zur Verwendung bei der Proteinherstellung in Kulturen, beinhaltend (a) die Integration durch gezielte homologe Rekombination eines heterologen Regulationselementes für die Transkription, in das Zielgen eines Säugers, das in dem in einer Hefe-Wirtszelle gehaltenen künstlichen Hefechromosom enthalten ist, so dass das integrierte Regulationselement für die Transkription im Wirkungszusammenhang mit dem Säuger-Zielgen ein rekombiniertes Säuger-Zielgen bilden kann und (b) die Übertragung des rekombinierten Säuger-Zielgens in eine Säuger-Wirtszelle, die in der Lage ist, das Zielgen-Produkt vom Regulationselement für die Transkription gesteuert so auszuprägen, dass das Produkt des Säuger-Zielgens durch die Säuger-Wirtszelle in der Kultur ausgeprägt ist.
Verfahren zur Herstellung einer Säuger-Wirtszelle nach Anspruch 19, ferner beinhaltend die Integration durch gezielte homologe Rekombination, eines amplifizierbaren Gens proximal zum Säuger-Zielgen, das in dem in einer Hefe-Wirtszelle gehaltenen künstlichen Hefechromosom enthalten ist, so, dass die Codierungssequenz des Säuger-Zielgenproduktes nicht abgebrochen wird und so, dass bei Übertragung des rekombinierten Säuger-Zielgens in die Säuger-Wirtszelle das vom heterologen Regulationselement für die Transkription gesteuerte Säu ger-Zielgen amplifiziert wird, wenn die Säuger-Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die das amplifizierbare Gen amplifizieren.
Verfahren zur Herstellung eines Säugergenproduktes in Zellkultur, beinhaltend die Kultivierung einer Säuger-Wirtszelle, die ein exogenes Säuger-Zielgen ausprägt, das von einem für das Säuger-Zielgen heterologen Regulationselement für die Transkription gesteuert wird und Rückgewinnung des Säuger-Zielgenproduktes aus der Zellkultur, in der die Säuger-Wirtszelle gewonnen wurde, durch (a) Integration durch gezielte homologe Rekombination eines heterologen Regulationselementes für die Transkription, in das Zielgen eines Säugers, das in dem in einer Hefe-Wirtszelle gehaltenen künstlichen Hefechromosom enthalten ist, so dass das integrierte Regulationselement für die Transkription im Wirkungszusammenhang mit dem Säuger-Zielgen, das im künstlichen Hefechromosom enthalten ist, ein rekombiniertes Säuger-Zielgen in der Hefe-Wirtszelle bilden kann und (b) die Übertragung des rekombinierten Säuger-Zielgens in eine Säuger-Wirtszelle, die in der Lage ist, das Zielgen-Produkt vom Regulationselement für die Transkription gesteuert so auszuprägen, dass das Produkt des Säuger-Zielgens durch die Säuger-Wirtszelle in der Kultur ausgeprägt ist.
Verfahren nach Anspruch 21, ferner beinhaltend die Integration durch gezielte homologe Rekombination, eines amplifizierbaren Gens proximal zum Säuger-Zielgen, das in dem in einer Hefe-Wirtszelle gehaltenen künstlichen Hefechromosom enthalten ist, so, dass die Codierungssequenz des Säuger-Zielgenproduktes nicht abgebrochen wird und so, dass bei Übertragung des rekombinierten Säuger-Zielgens in die Säuger-Wirtszelle das vom heterologen Regulationselement für die Transkription gesteuerte Säuger-Zielgen amplifiziert wird, wenn die Säuger-Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die das amplifizierbare Gen amplifizieren.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das amplifizierbare Gen Dihydrofolatreductase, Metallothionein-I, Metallothionein-II, Adenosindesaminase, Ornithin-Decarboxylase und Glutaminsynthetase ist.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei das Säuger-Zielgen ein Gen des Menschen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei das Regulationselement für die Transkription ein Promotor und/oder Verstärker ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Promotor und/oder Verstärker von der Art ist, die beim Zytomegalie-Virus des Menschen im unmittelbaren frühen Bereich wirkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei die Säuger-Wirtszelle eine Eierstockzelle eines chinesischen Hamsters, eine Affennierenzelle, eine Fibroblastenzelle der Maus C127, eine Zelle der Maus 3T3 oder eine Verozelle ist.
Verfahren zur Aktivierung eines Zielgens, beinhaltend die Integration eines Regulationselementes für die Transkription in ein künstliches Hefechromosom, welches das Gen enthält, so, dass das Regulationselement für die Transkription heterolog ist und im Wirkungszusammenhang mit dem Gen steht und das Gen in einer geeigneten Wirtszelle aktiviert.