DE69334195T2 - Bildung von xenogenen antikörpern - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Das Gebiet dieser Erfindung ist die Herstellung von xenogenen spezifischen Bindungsproteinen in einem lebensfähigen nicht menschlichen säugerstämmigen Wirtsorganismus.
  • Hintergrund
  • Die Fähigkeit, transgene Tiere herzustellen, ist mit dem Beginn der Fähigkeit, murine embryonale Stammzellen zu produzieren und genetische Modifikationen zur anschließenden Übertragung in die Keimbahn der Maus in diese Zellen einzufügen, revolutioniert worden. Auf diese Weise hat man die Möglichkeit, endogene Gene zu modifizieren, um Tierstämme zu erzeugen, die in der Lage sind, neue Produkte herzustellen, indem fremde Gene in den Wirtsorganismus, besonders menschliche Gene, zur Herstellung von xenogenen Bindungsproteinen eingeführt werden. Die Expression solcher Gene in vivo in einem Tiermodell kann zur Erforschung der Funktion des Gens, der Regulierung von Genexpression, seiner Prozessierung, der Reaktion auf verschiedene Agenzien und dergleichen beitragen. Zusätzlich können Tiere mit neuen Phänotypen, einschließlich solcher, die eine Reihe von Krankheiten nachahmen, erzeugt werden. Zum Beispiel besteht Interesse an der Einführung einer dominanten Mutation oder an der Komplementierung einer rezessiven Mutation. In Abhängigkeit von einem bestimmten Gen wird die Schwierigkeit, die gewünschte Mutation zu erreichen, stark variieren. Während einige Genziele sich als relativ zugänglich gegenüber einer Modifikation erwiesen haben, zeigten sich andere Ziele als extrem resistent gegenüber einer Modifikation.
  • Auf Grund der Möglichkeit zur Erzeugung von transgenen Tieren besteht ein wesentliches Interesse an der Erstellung neuer Verfahren, die den Erfolg für die Erzeugung transgener Tiere erhöhen. Besonders dort, wo der Wunsch besteht, große DNA-Fragmente einzufügen, die Hunderte von Kilobasen umfassen, besteht ein wesentliches Interesse an der Fähigkeit, große Fragmente in intakter Form in Säugerzellen einzuführen, der Wirksamkeit der Integration, der funktionalen Fähigkeit der Gene (des Gens), die in dem Fragment vorliegen, und der Übertragung auf die Nachkommenschaft über die Keimbahn. Zusätzlich tragen solche Verfahren zur Einführung großer DNA-Fragmente zur Bestimmung der Funktion großer DNA-Fragmente bei, die in dem zur Zeit laufenden menschlichen Genomprojekt identifiziert worden sind.
  • Besonderes Interesse besteht an der Produktion von xenogenen spezifischen Bindungsproteinen, zum Beispiel menschlichen monoclonalen Antikörpern, in kleinen Labortieren wie etwa Mäusen. Monoclonale Antikörper finden sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie Anwendung. Auf Grund ihrer Fähigkeit an ein spezifisches Epitop zu binden, können nur sie zur Identifizierung von Molekülen verwendet werden, die jenes Epitop tragen, oder sie können durch sich selbst oder in Verbindung mit einer anderen Einheit für Diagnose oder Therapie an eine spezifische Stelle gelenkt werden.
  • Monoclonale Antikörper umfassen schwere und leichte Ketten, die sich miteinander verbinden, um eine Bindungsregion für das Epitop zu definieren. Jede dieser Ketten ist aus einer variablen Region und einer konstanten Region zusammengesetzt. Die Aminosäuresequenz der konstanten Region ist sowohl für einen bestimmten Isotyp des Antikörpers als auch für den Wirtsorganismus, der den Antikörper produziert, spezifisch.
  • Auf Grund der Beziehung zwischen der Sequenz der konstanten Region und der Tierart, von der der Antikörper produziert wird, kann das Einführen eines xenogenen Antikörpers in das Vaskularsystem des Wirtsorganismus eine Immunantwort hervorrufen. Wenn der xenogene Antikörper im Fall einer chronischen Krankheit wiederholt eingeführt wird, wird es undurchführbar, den Antikörper zu verabreichen, da er sofort zerstört wird und eine unerwünschte Wirkung haben kann. Es hat daher viele Ansätze gegeben, eine Quelle für syngene oder allogene Antikörper bereitzustellen. Bei einem Verfahren ist die Verwendung von rekombinanter DNA-Technik eingeschlossen, bei der die Gene für die schweren und die leichten Ketten eines Wirtsorganismus identifiziert und die Regionen, die die konstante Region codieren, isoliert worden sind. Diese Regionen sind dann mit der variablen Region verbunden worden, die einen Abschnitt von anderen Immunoglobulin-Genen einer anderen Tierart, die auf ein spezifisches Epitop gerichtet waren, codierte.
  • Obwohl der entstandene chimäre, zum Teil xenogene Antikörper wesentlich nützlicher ist als die Verwendung eines vollständig xenogenen Antikörpers, besitzt er immer noch eine Reihe von Nachteilen. Die Identifizierung, Isolierung und Verbindung der variablen und konstanten Regionen erfordert sehr viel Arbeit. Zusätzlich kann das Verbinden einer konstanten Region einer Tierart mit der variablen Region einer anderen Tierart die Spezifität und Affinität der variablen Regionen verändern, so dass die gewünschten Eigenschaften der variablen Region verloren gehen. Es gibt in der variablen Region auch Rahmen- und hypervariable Sequenzen, die für einen Tierart spezifisch sind. Diese Rahmen- und hypervariablen Sequenzen können zu unerwünschten antigenen Antworten führen.
  • Es wäre daher wünschenswerter, allogene Antikörper zur Verabreichung an einen Wirtsorganismus zu produzieren, indem der Wirtsorganismus mit einem interessierenden Immunogen immunisiert wird. Für Primaten, besonders für Menschen, ist dieser Ansatz nicht durchführbar. Die menschlichen Antikörper, die produziert worden sind, beruhten auf der zufälligen Anwesenheit einer verfügbaren Milz eines Wirtsorganismus, der zuvor gegen das interessierende Epitop immunisiert worden ist. Während Lymphocyten aus dem peripheren Blut des Menschen für die Produktion von monoclonalen Antikörpern verwendet werden können, sind diese bei Fusionen nicht besonders erfolgreich gewesen und haben gewöhnlich nur zu IgM geführt. Darüber hinaus ist es besonders schwierig, eine menschliche Antikörperantwort gegen ein menschliches Protein, ein gewünschtes Ziel in vielen therapeutischen und diagnostischen Anwendungen, zu erzeugen. Es besteht daher ein wesentliches Interesse am Finden von alternativen Wegen für die Produktion von allogenen Antikörpern für den Menschen.
  • Relevante Literatur
  • Thomas und Capecchi (1987), Cell, 51: 503–512 und Koller und Smithies (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8932–8935 beschreiben die Inaktivierung des β2-Mikroglobulin-Lokus durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen. Berman et al. (1988), EMBO J. 7: 727–738 beschreiben den menschlichen Ig-VH-Lokus. Burke et al. (1987), Science, 236: 806–812 beschreiben Vektoren für künstliche Chromosomen von Hefe. Vgl. auch Garza et al. (1989), Science, 246: 641–646 und Brownstein et al. (1989), Science, 244: 1348–1351. Sakano et al., beschreiben in Sakano et al. (1981), Nature. 290: 562–565, ein Diversitätssegment der Gene für die schwere Kette des Immunoglobulins. Tucker et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7684–7688 beschreiben die Gensequenz der schweren Kette des IgA der Maus. Blankenstein und Kruwinkel (1987), Eur. J. Immunol., 17: 1351–1357, beschreiben die variable Region der schweren Kette der Maus. Vgl. auch Joyner et al. (1989), Nature, 338: 153–155, Trauer et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 5898–5902, Pachnis et al. (1990), Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 87: 5109–5113 und PCT-Patentanmeldung PCT/US91/00245. Bruggemann et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA; 86: 6709–6713 (1989); Behring Inst. Mitt. 87: 21–24 (1990); Eur. J. Immunol. 21: 1323–1326 (1991) beschreiben monoclonale Antikörper mit schweren Ketten vom Menschen. Albertsen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 4256–4260 (1990) beschreiben die Konstruktion einer Bibliothek für künstliche Chromosomen der Hefe, die DNA-Fragmente des Menschen enthalten. Vektoren für künstliche Chromosomen der Hefe werden von Burke et al., Science 236: 806–812 (1987) beschrieben. Pavan et al., Mol. and Cell. Biol. 10(8): 4163–4169 (1990), beschreiben die Einführung einer Kassette für Neomycin-Resistenz in die vom Menschen stammende Insertion eines künstlichen Chromosoms der Hefe unter Verwendung von homologer Rekombination und Übertragung in eine embryonale Karzinom-Zellline unter Verwendung von durch Polyethylenglycol vermittelte Sphäroplasten-Fusion. Pachnis et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 5109–5113 (1990), und Gnirke et al., EMBO Journal 10(7): 1629–1634 (1991), beschreiben die Übertragung eines künstlichen Chromosoms der Hefe, welches menschliche DNA trägt, in Säugerzellen. Eliceiri et al., Proc. Nat. Acad. USA 88: 2179–2183 (1991), beschreiben die Expression von künstlichen Chromosomen der Hefe, die menschliche Gene enthielten, in Mauszellen. Huxley et al., Genomics 9: 742–750 (1991), beschreiben die Expression von künstlichen Chromosomen der Hefe, die das menschliche HPRT-Gen enthalten, in Mauszellen. Mortensen et al., Mol. and Cell. Biol. 12(5): 2391–2395 (1992), beschreiben die Verwendung von hohen Konzentrationen an G418, um heterozygote embryonale Stammzellen zur Selektion von homozygoten, durch Mutation veränderte Zellen zu züchten. Die Fusion von Protoplasten der Hefe mit Fibroblasten der Maus wird von Trauer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 5898–5902 (1989), und Pachnis et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 5109–5113 (1990), beschrieben. Davies et al., Nucl. Acids Res. 20: 2693–2698 (1992), beschreiben gezielte Veränderungen in YACs. Zachau, Biol. Chem. 371: 1–6 (1990), beschreibt den Lokus für leichtes (kappa) menschliches Immunglobulin (IgK); Matsuda et al., Nature Genetics 3: 88–94 (1993), und Shin et al., EMBO 10: 3641–3645 (1991), beschreiben die Clonierung des Lokus für schweres Immunoglobulin (IgH) in YACs.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Xenogene spezifische Bindungsproteine werden in einem nicht menschlichen, lebensfähigen Wirtsorganismus produziert, indem der Wirtsorganismus mit einem geeigneten Immunogen immunisiert wird.
  • Ein bevorzugter nicht menschlicher Wirtsorganismus ist dadurch charakterisiert, dass er: (1) nicht in der Lage ist, die schwere Kette von endogenem Immunglobulin zu produzieren; (2) im Wesentlichen nicht in der Lage ist, die leichten Ketten von endogenem Immunglobulin zu produzieren; und (3) in der Lage ist, die leichten und schweren Ketten von xenogenem Immunglobulin zu produzieren, um ein xenogenes Immunglobulin oder Immunglobulin-Analog herzustellen. Daher kann der Wirtsorganismus einen vollständigen endogenen Immunglobulin-Lokus besitzen, der durch einen Abschnitt von einem oder einen vollständigen xenogenen Immunglobulin-Lokus substituiert ist, oder kann einen xenogenen Immunglobulin-Lokus, der in ein Chromosom der Wirtszelle inseriert ist, und eine inaktivierte endogene Immunglobulin-Region aufweisen. Diese verschiedenen Alternativen werden, wenigstens zum Teil, dadurch erreicht, dass homologe Rekombination für Inaktivierung oder Ersatz an den Immunglobulin-Loci für die schweren und leichten Ketten verwendet wird.
  • Zusätzlich werden neue Verfahren zur Einführung von großen Segmenten an xenogener DNA mit mindestens 100 kB, besonders menschlicher DNA, in nicht menschliche Wirtstiere, besonders Mäuse, bereitgestellt, indem ein künstliches Chromosom der Hefe (YAC), das ein xenogenes DNA-Segment mit mindestens 100 kB umfasst, in eine nicht menschliche embryonale Stammzelle eingeführt wird, um in das Genom der Stammzelle integriert zu werden, die Stammzellen, die das integrierte YAC umfassen, mit Hilfe einer Markierung, die in dem YAC vorliegt, selektiert werden, die YAC enthaltenden ES-Zellen in nicht menschliche Embryos eingeführt werden und chimäre Mäuse aus den Embryos erzeugt werden. Die chimären Tiere können gekreuzt werden, um Tiere zu erhalten, die heterozygot für das YAC sind. Die heterozygoten Tiere können gekreuzt werden, um Nachkommen zu erzeugen, die homozygot für das integrierte YAC sind.
  • BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 ist ein Diagramm des Inaktivierungsvektors für die J-Region der schweren Kette der Maus, wie in Beispiel I, nachstehend, beschrieben wird.
  • 2 ist ein Diagramm der DNA-Restriktionskarte für das Plasmid pmHδJ und die angezielten J-Gene der schweren Kette der Maus, wie in Beispiel II, nachstehend, beschrieben wird.
  • 3 ist eine durchflusscytometrische Aufzeichnung der Antikörper-Anfärbung für IgM-Allotypen in Mausstämmen, wie in Beispiel II, nachstehend, beschrieben wird.
  • 4 ist ein durchflusscytometrisches Histogramm der Antikörper-Anfärbung für IgM-Allotypen in Mausstämmen, wie in Beispiel II, nachstehend, beschrieben wird.
  • 5 ist ein Diagramm des Inaktivierungsvektors für die Gene der konstanten kappa-Region des Immunglobulins der Maus, wie in Beispiel III, nachstehend, beschrieben wird.
  • 6 ist ein Diagramm des Derivats von Plasmid pK.TK/Neo, wie in Beispiel III, nachstehend, beschrieben wird.
  • 7 ist ein Diagramm der Restriktionskarte des angezielten Locus für die leichte Kette, wie in Beispiel III, nachstehend, beschrieben wird.
  • 8 ist ein Diagramm des anzielenden Vektors für die Inaktivierung der J- und konstanten Regionen der leichten kappa-Kette und der Entwurf für das Experiment zum Anzielen, wie in Beispiel IV, nachstehend, beschrieben wird.
  • 9 ist ein Diagramm der Konstruktion von Vektoren für die Inaktivierung der J- und konstanten Regionen der leichten kappa-Kette, wie in Beispiel IV, nachstehend, beschrieben wird.
  • 10 ist ein Diagramm der endgültigen Deletionsvektoren für die Inaktivierung der J- und konstanten Regionen der leichten kappa-Kette, wie in Beispiel IV, nachstehend, beschrieben wird.
  • 11 ist eine Darstellung der Southern-Blot-Analyse der Zellen, bei denen die J- und konstante Region der leichten Kette deletiert sind, wie in Beispiel IV, nachstehend, beschrieben wird.
  • 12A–E sind Fotografien der Ergebnissen aus der Southern-Blot-Analyse zur Charakterisierung von yHPRT- und genomischer Hefe-DNA, die in ES-Clonen integriert sind, wie in Beispiel IV, nachstehend, beschrieben wird. (A = repetitive Alu-Sequenz des Menschen; B, C = für pBR322 spezifische Sequenzen für den rechten (B) und linken (C) YAC-Arm; D = repetitive Ty-Sequenz der Hefe; E = in Einzelkopie vorliegendes Gen LYS2 der Hefe. Kürzere Expositionszeiten (12 h für II im Vergleich zu 48 h für I) von yHPRT, mit Alu- und Ty-Sequenzen als Sonden, werden ebenfalls dargestellt. Die Positionen der Molekulargewichtsmarkierungen sind gekennzeichnet.
  • Schemata des rechten (a) und linken (b) Vektorarms und die Lagen der von pBR322 stamenden YAC-Vektorfragmente werden dargestellt (= Telomer; = von Hefe stammende Sequenzen; 0 = Hefe-Zentromer; = von pBR322 stammende Sequenzen; = vom Menschen stammende Insertion; = EcoRI-Clonierungsstelle; H = HindIII-Stellen).
  • 13A–D sind Mikrofotografien von den Ergebnissen der in situ-Hybridisierung, um die Integration von yHPRT- und genomischen Hefe-Sequenzen in ES-Zell-Chromosomen nachzuweisen, wie in Beispiel VI, nachstehend, beschrieben wird. (A, B = Metaphase-Aufspreitungen von ESY 8-7-Zellen, die an biotinylierte genomische Sequenzen des Menschen hybridisiert waren, und C = Metaphase-Aufspreitungen oder D = Interphase-Kerne von ESY 8-6-Zellen, die an biotinylierte wiederholte DNA-Sequenzen der Hefe hybridisiert waren).
  • 14A, B, C zeigt den stabilen Erhalt von yHPRT während der ES-Zelldifferenzierung in vitro und Übertragung durch die Keimbahn der Maus, wie in Beispiel VI, nachstehend, beschrieben wird. (A: a, b = embryonale Körper; und differenzierte Zelltypen: c = Blutinseln; d = kontrahierender Muskel; e = Nervenzellen; f = neurale Tubuli, gebildet durch ESY-Clone; B: Southern-Blot-Analyse von DNA, extrahiert aus differenzierten ESY 5-2, 3-6, 8-5 und 8-6 (20 pg) und yHPRT in AB1380 (40 ng) unter Verwendung von a = menschlicher Alu-Sonde; b = Ty-Sequenzen der Hefe; C: Southern-Blot-Analyse von Schwanz-DNA (20 μg) von 2 Agouti-Nachkommen (4-2 und 4-3), die vom ESY-chimären Männchen 394/95-2 abstammen, unter Verwendung von a = menschlicher Alu- und b = Ty-Sequenzen; kürzere Expositionen (12 h) von 8-6 und yHPRT mit Ty als Sonde werden dargestellt (II).
  • 15A und B sind eine Fotografie eines Elektrophorese-Gels, welches die Expression des menschlichen HPRT-Gens in verschiedenen Mausgeweben zeigt, wie in Beispiel VI, nachstehend, beschrieben wird. (15 A = Nachweis von mRNA für menschliche HPRT unter Verwendung von reverser Transkriptions-PCR bei ES-, ESY 3-1- und Hut-78-Zellen, Milz und Leber von Kontrollmäusen oder ESY 4-3-Agouti-Nachkommen; 15 B = Nachweis der mRNA für den γ-Interferon-Rezeptor der Maus durch RT-PCR in Proben von 15 A; M = Größenmarkierung).
  • 16 ist ein Diagramm des Locus der schweren Kette des menschlichen Immunoglobulins und eines YAC-Vektors zum Ersetzen der schweren Kette des Menschen, wie in Beispiel VII, nachstehend, beschrieben wird.
  • 17 ist ein Diagramm eines Maus-Zuchtplans, wie in Beispiel VIII, nachstehend, beschrieben wird.
  • 18 stellt die Genotypen von einigen der Wirtstiere dar, die durch die Verfahren der Erfindung produziert wurden.
  • BESCHREIBUNG VON SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Neuartige transgene nicht menschliche Wirtsorganismen, besonders säugerstämmige, gewöhnlich murine Wirtsorganismen werden bereitgestellt, bei denen der Wirtsorganismus in der Lage ist, eine Immunantwort auf ein Immunogen aufzubauen, wobei die Antwort Antikörper produziert, die menschliche, konstante und variable Regionen aufweisen. Mit "transgen" ist ein nicht menschliches Tier gemeint, das eine auf gentechnischem Weg hervorgerufene Modifikation, besonders im Rahmen dieser Erfindung die Einführung eines menschlichen Immunglobulin-Gens in alle seine Zellen umfasst. Die Wirtsorganismen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Lage sind, xenogene Immunglobuline oder Analoga hiervon als ein Ergebnis der Inaktivierung der die endogene Immunglobulin-Untereinheit codierenden Loci und der Einführung von menschlicher DNA, zum Beispiel DNA, die menschliches Immunglobulin codiert, zu produzieren. Die Modifikationen können zumindest einen Teil der menschlichen konstanten Regionen beibehalten, die das Zusammensetzen der Bindungsstelle der variablen Region, die am C-Terminus an ein funktionales Peptid gebunden ist, gewährleisten. Die Antikörper können jedes beliebige Isotop sein, z. B. IgA, -D, -E, -G oder -M oder Subtypen innerhalb des Isotyps.
  • In einer ersten Strategie werden als individuelle Schritte die xenogenen, d. h. vom Menschen stammenden, Gene für die schwere und leichte Kette des Immunglobulins in die Keimbahn des nicht menschlichen Wirtsorganismus (z. B. Spermien oder Eizellen) eingeführt und in getrennten Schritten die zugehörigen Gene des Wirtsorganismus durch Inaktivierung unter Verwendung von homologer Rekombination funktionsunfähig gemacht. Die Gene für die schwere und leichte Kette des menschlichen Immunglobulins werden in einem geeigneten eukaryontischen oder prokaryontischen Mikroorganismus rekonstruiert, und die entstandenen DNA-Fragmente können in den geeigneten nicht menschlichen Wirtsorganismus eingeführt werden, z. B. in die Vorkerne von befruchteten Maus-Eizellen oder in embryonale Stammzellen.
  • Die Inaktivierung der endogenen Immunglobulin-Loci des Wirtsorganismus wird durch gezielte Zerstörung der entsprechenden Loci durch homologe Rekombination in den nicht menschlichen Wirtszellen, besonders nicht menschlichen embryonalen Stammzellen oder Vorkernen befruchteter Eizellen der Maus erreicht. Die gezielte Zerstörung kann die Einführung einer Läsion oder Deletion in den Ziel-Locus oder Deletion innerhalb des Ziel-Locus, begleitet durch Insertion in den Locus, umfassen, zum Beispiel die Insertion einer selektierbaren Markierung. Im Fall nicht menschlicher embryonaler Stammzellen werden chimäre nicht menschliche Tiere erzeugt, die zum Teil von den modifizierten, nicht menschlichen embryonalen Stammzellen abstammen und in der Lage sind, die genetischen Modifikationen durch die Keimbahn weiterzugeben. Das Kreuzen von Wirtsorganismen mit eingefügten menschlichen Immunglobulin-Loci mit Stämmen mit inaktivierten endogenen Loci wird Tiere ergeben, deren Antikörper-Produktion rein xenogen, d. h. menschlich, sein wird.
  • In einer zweiten, alternativen Strategie werden zumindest Teile der Immunoglobulin-Loci der menschlichen schweren und leichten Kette verwendet, um die entsprechenden endogenen Immunglobulin-Loci durch homologe Rekombination in nicht menschlichen embryonalen Stammzellen direkt zu ersetzen. Dies führt zu gleichzeitiger Inaktivierung und Ersetzung des endogenen Immunglobulins. Anschließend folgt die Erzeugung von chimären nicht menschlichen Tieren, bei denen sich die von nicht menschlichen embryonalen Stammzellen abstammenden Zellen in der Keimbahn befinden.
  • Diese Strategien beruhen auf der bekannten Organisation der Loci für die Immunglobulin-Ketten bei einer Reihe von Tieren, da die Organisation, die relative Lage der Exons, die individuelle Domänen codieren, und die Lage von Spleiß-Stellen und Transkriptions-Elementen in unterschiedlichen Maßen verstanden sind. Beim Menschen liegt der Locus für die schwere Immunglobulin-Kette (IgHhu) auf Chromosom 14. In der 5'-3'-Richtung der Transkription umfasst der Locus ein großes Cluster an Genen für die variable Region (VH), die Gene für die Diversitätsregion (D), gefolgt von den Genen für die Verbindungsregion (JH) und dem konstanten (CH) Gen-Cluster. Die Größe des Lokus wurde als etwa 1.500 bis etwa 2.500 Kilobasen (kb) geschätzt. Während der B-Zell-Entwicklung werden diskontinuierliche Gensegmente aus dem IgH-Locus der Keimbahn mit Hilfe einer physikalischen Neuordnung bzw. Umlagerung der DNA nebeneinander gestellt. Damit eine funktionelle schwere Ig-Polypeptid-Kette produziert wird, müssen drei diskontinuierliche DNA-Segmente aus den VH-, D- und JH-Regionen auf eine spezifische, sequentielle Weise miteinander verbunden werden; zuerst D an JH, dann VH an DJH, wodurch die funktionelle Einheit VHDJH erzeugt wird. Sobald ein VHDJH gebildet worden ist, werden nach der Transkription des Ig-Locus spezifische schwere Ketten produziert, wobei als eine Matrize die spezifische VHDJHCH-Einheit, die Exons und Introns umfasst, verwendet wird.
  • Es gibt zwei Loci für die leichten Immunglobulin-Ketten (IgL), den kappa-Locus auf dem Chromosom 2 des Menschen und den lambda-Locus auf Chromosom 22 des Menschen. Die Organisation der IgL-Loci ist ähnlich der des IgH-Locus, mit dem Unterschied, dass die D-Region nicht vorkommt. Nach der IgH-Neuordnung wird die Neuordnung eines Locus für die leichten Ketten in ähnlicher Weise durch VL-Bindung an JL der kappa- oder lambda-Kette durchgeführt. Die Größen der lambda- und kappa-Loci betragen jeweils etwa 1.000 kb bis 2000 kb. Die Expression der neugeordneten IgH- und einer leichten Igκ- oder lgλ-Kette in einer bestimmten B-Zelle ermöglicht die Erzeugung von Antikörpermolekülen.
  • Um den IgHhu-Locus zu isolieren, zu clonieren und zu transferieren, kann ein künstliches Chromosom der Hefe oder "YAC" („yeast artificial chromosome") verwendet werden. Ein YAC, welches die menschliche DNA trägt, kann in nicht menschliche ES-Zellen oder nicht menschliche Eizellen durch eine Reihe von Verfahren, die Hefe-Sphäroblasten: ES-Zellfusion, Mikroinjektion und Lipofektion einschließen, eingeführt werden. Das YAC wird sich nach dem Zufallsprinzip (d. h. nicht homolog) in das Genom des nicht menschlichen Wirtsorganismus einfügen. Wenn Hefe-Sphäroplasten: ES-Zellfusion verwendet wird, um ein YAC, das menschliche DNA trägt, in nicht menschliche ES-Wirtszellen einzuführen, können zwei oder mehr YACs in einer einzelnen Hefe-Wirtszelle gleichzeitig in dieselbe nicht menschliche Wirts-ES-Zelle eingeführt werden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass multipe YACs, die jeweils menschliche DNA enthalten, zum Beispiel die Immunglobulin-Loci für die schwere und leichten Ketten des Menschen, in ein einzelnes Chromosom in einer nicht menschlichen Wirtszelle eingeführt werden können. Dies eliminiert die Notwendigkeit, Tiere zu züchten, die individuelle menschliche Ig-Gene enthalten, um einen Wirtsorganismus zu erzeugen, der in der Lage ist, vollständige menschliche Immunglobuline zu produzieren. Zum Beispiel wird ein Hefestamm, der ein einzelnes YAC enthält, mit einem Vektor wie etwa pLUTO (nachstehend beschrieben) angezielt, um eine selektierbare Markierung von einem Säuger wie etwa HPRT und eine hefestämmige selektierbare Markierung wie etwa LYS2 in einen Arm des YAC einzuführen. Chromosomale DNA des angezielten Stammes wird dann verwendet, um einen zweiten, gewöhnlich haploiden, lys2-mutierten Hefestamm, der ein zweites, unterschiedliches YAC enthält, zu transformieren. Lys+-Kolonien werden dann durch Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) analysiert, um Clone zu identifizieren, die die beiden YACs beherbergen, und um zu bestätigen, dass sie in der Größe unverändert sind. Zusätzliche YACs mit unterschiedlichen selektierbaren Markierungen, zum Beispiel ADE2 (wenn der Wirtsorganismus eine ade2-Mutante ist), können anschließend durch Transformation addiert werden. Alternativ wird ein YAC enthaltender Hefestamm mit einem Vektor wie etwa pLUTO angezielt, um eine säugerstämmige selektierbare Markierung (z. B. HPRT), wie vorstehend beschrieben, einzuführen, und dann mit einem zweiten, YAC enthaltenden Stamm des entgegengesetzten Kreuzungstyps gekreuzt. Die Anwesenheit der beiden YACs wird dann in den diploiden Hefezellen, wie vorstehend beschrieben, bestätigt. Der diploide Hefestamm wird direkt für die Fusion verwendet, oder man lässt ihn Meiose und Ascosporogenese (Sporulation) unter Verwendung von Standardverfahren durchlaufen. Die Meiose-Produkte werden dann durchmustert, um einen haploiden Clon zu identifizieren, der die beiden YACs enthält. Mit jedem der vorstehend beschriebenen Ansätze kann das zweite YAC vor der Einführung des ersten YAC mit HPRT oder einer anderen selektierbaren Markierung angezielt werden. Wenn jedes YAC eine unterschiedliche, in Hefe selektierbare Markierung enthält, kann die Erhaltung beider YACs während der Fortpflanzung des Stammes auch genetisch selektiert werden. Die Fusion mit nicht menschlichen ES-Zellen wird dann in der gleichen Weise durchgeführt wie mit Hefezellen, die ein einzelnes YAC enthalten. Weil sich viele Hefe-Chromosomen zusammen mit dem YAC integrieren können, wird erwartet, dass ein wesentlicher Teil der ES-Clone, die die sängerstämmige selektierbare Markierung, die auf einem YAC liegt, exprimiert, (z. B. HATR-Clone, wenn die YAC-Markierung HPRT ist und die nicht menschlichen ES-Zellen HPRT- sind), beide YACs integriert haben wird. Verfahren wie etwa Southern-Analyse und/oder PCR können verwendet werden, um solche Clone zu identifizieren, und Southern-Analyse, die Pulsfeldgelelektrophorese verwendet, wird eingesetzt, um das Ausmaß der YAC-Integration zu bestimmen.
  • Der gesamte IgHhu-Locus kann innerhalb eines oder einiger YAC-Clone zusammen mit einer sängerstämmigen Markierung wie etwa Neo, HPRT, GPT, β-Gal etc. enthalten sein. Das Gleiche gilt für die Loci für die leichten Ig-Ketten. Die Wiederherstellung von intakten Ig-Loci der Keimbahn durch homologe Rekombination zwischen YACs mit überlappenden Homologie-Regionen kann bei Hefe erreicht werden. Auf diese Weise wird die Isolierung von DNA-Fragmenten, die die menschliche Ig-Kette codieren, erreicht. Alternativ kann man einen intakten Keimbahn-Locus direkt in ein einzelnes YAC clonieren.
  • Um ein breites Spektrum an Antikörpern mit hoher Affinität zu erhalten, ist es nicht notwendig, dass man die gesamte V-Region einschließt. Verschiedene Genfamilien für die V-Region sind beim Menschen innerhalb des V-Region-Clusters verteilt. Daher kann durch Erhalten einer Untergruppe der bekannten Gene der V-Region für die Ig-Loci der schweren und leichten Ketten des Menschen (Berman et al., EMBO J. (1988) 7: 727–738) anstatt des gesamten Komplements an V-Regionen der nicht menschliche transgene Wirtsorganismus immunisiert und in die Lage versetzt werden, eine starke Immunantwort aufzubauen und Antikörper mit hoher Affinität zu liefern. Auf diese Weise können relativ kleine DNA-Fragmente des Chromosoms verwendet werden. Zum Beispiel ist ein nachgewiesenes Fragment des Ighu-Locus mit einer Größe von 670 kb auf einem NotI-NotI-Restriktionsfragment enthalten, das dazu dienen könnte, eine Reihe von V-Regionen zu liefern (Berman et al., vorstehend). Erhöhte Diversität wird auch durch Rekombination mit den verschiedenen D- und J-Regionen und durch somatische Mutation erreicht.
  • Um die Immunglobulin-Loci des nicht menschlichen Wirtsorganismus nicht-funktional zu machen, kann homologe Rekombination verwendet werden, wobei DNA an den endogenen Loci des Wirtsorganismus für die schweren und leichten Immunglobulin-Ketten eingeführt wird, was die Produktion von endogenem Immunglobulin verhindert. Weil es zwei Allele für die schwere Kette und zwei Loci für die leichte Kette, kappa und lambda, jeweils mit zwei Allelen, gibt, obgleich man dazu neigen kann, die lambda-Loci zu ignorieren, werden zahlreiche Transformationen notwendig sein, die zur Inaktivierung jedes der Allele führen. Homologe Rekombination kann verwendet werden, um jeden der Loci funktional zu inaktivieren, indem die homologe DNA über eine Konstruktion, die den Ziel-Locus zerstören oder deletieren kann, in die nicht menschlichen embryonalen Stammzellen eingeführt wird, gefolgt von der Einführung von modifizierten Zellen in die empfangenden, nicht menschlichen Blastocyten. Anschließende Züchtung ermöglicht Keimbahn-Übertragung des inaktivierten Locus. Man hat daher die Wahl, heterozygote Nachkommen zu züchten und homozygote Nachkommen der heterozygoten Eltern zu selektieren.
  • In der zweiten, alternativen, vorstehend beschriebenen Strategie kann die Anzahl der Schritte reduziert werden, indem wenigstens ein Fragment des menschlichen Immunglobulin-Locus innerhalb der Konstruktion, die für die homologe Rekombination mit dem analogen endogenen Immunglobulin verwendet wird, bereitgestellt wird, so dass der menschliche Locus wenigstens zu einem Teil den Immunglobulin-Locus des Wirtsorganismus ersetzen wird, woraus die Inaktivierung der Untereinheit des Immunglobulin-Locus des Wirtsorganismus resultiert. Von besonderem Interesse ist die Verwendung einer Transformation für eine einzelne Inaktivierung, mit anschließender Züchtung der heterozygoten Nachkommenschaft, um eine homozygote Nachkommenschaft zu erzeugen. Wo der menschliche Locus zur Substitution oder Insertion in den Locus des nicht menschlichen Wirtsorganismus zur Inaktivierung verwendet wird, kann die Anzahl der Transformationen auf drei Transformationen begrenzt sein, und, wie bereits beschrieben, man kann erwägen, den weniger verwendeten Locus zu ignorieren und die Transformationen auf zwei Transformationen zu begrenzen. Alternativ kann man erwägen, die Inaktivierung als einen getrennten Schritt für jeden einzelnen Locus vorzunehmen, wobei nicht menschliche embryonale Stammzellen von Nachkommen verwendet werden, bei denen zuvor ein oder mehrere Loci inaktiviert worden sind. In dem Fall, dass nur Transformation verwendet wird, und der menschliche Locus in das Genom des nicht menschlichen Wirtsorganismus nach dem Zufallsprinzip integriert wird, können insgesamt acht oder mehr Transformationen notwendig sein.
  • Zur Inaktivierung kann jede beliebige Läsion im Ziel-Locus verwendet werden, die zur Verhinderung der Expression einer Immunglobulin-Untereinheit von diesem Locus führt. Daher kann die Läsion in einer Region liegen, die Enhancer, z. B. einen 5'- oder 3'-Enhancer, oder ein Intron in den V-, J- oder C-Regionen, wobei bei der schweren Kette eine Gelegenheit in der D-Region existiert, oder Kombinationen davon umfasst. Der wichtige Faktor ist, dass die Neuordnung der Ig-Keimbahn-Gene verhindert wird oder eine funktionale Botschaft, die das enodgene Immunglobulin codiert, nicht produziert werden kann, entweder auf Grund von fehlerhafter Transkription, fehlerhafter Prozessierung der Botschaft oder dergleichen. Eine solche Läsion kann die Form einer Deletion in dem Ziel-Gen, einer Insertion eines fremden Gens, einer Kombination aus Insertion und Deletion oder einer Ersetzung unter Verwendung xenogener Sequenzen mit oder ohne Einführung einer Deletion in das endogene Gen annehmen.
  • Wenn man daran interessiert ist, den Locus der Immunglobulin-Untereinheit zu inaktivieren, wird die Läsion in eines oder mehrere der Exons eingeführt, die in dem Locus der Immunglobulin-Untereinheit enthalten sind, zum Beispiel in die konstante oder J-Region des Locus. Auf diese Weise produziert man eine anzielende Konstruktion, der funktionale Exons in dieser Region fehlen und die Sequenzen, die benachbart und stromaufwärts und/oder stromabwärts der J- und/oder C-Region liegen, umfassen kann, oder sie umfasst die gesamte oder einen Teil der Region mit einer inaktivierenden Insertion in den J- oder C-Exons. Die Insertion kann 50 bp oder mehr umfassen, wobei eine solche Insertion zur Unterbrechung der Bildung einer funktionalen mRNA führt. Es ist wünschenswert, dass gewöhnlich mindestens etwa 75% der Exonsequenz, bevorzugt mindestens etwa 90% der Exonsequenz deletiert werden.
  • Es ist wünschenswert, dass ein Gen zur Markierung in der anzielenden Konstruktion verwendet wird, um die deletierten Sequenzen zu ersetzen. Zahlreiche Markierungen können verwendet werden, besonders jene, die eine positive Selektion gestatten. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von G418-Resistenz, die aus der Expression des Gens für Neomycin-Phosphotransferase ("neo") resultiert.
  • In der anzielenden Konstruktion kann sich stromaufwärts und/oder stromabwärts vom Ziel-Gen ein Gen befinden, das dazu dient, zu identifizieren, ob ein homologes Doppel-Crossover stattgefunden hat (negative Selektion). Zu diesem Zweck kann das Thymidinkinase-Gen des Herpes simplex-Virus verwendet werden, da Zellen, die das Thymidinkinase-Gen exprimieren, durch die Verwendung von Nucleosid-Analoga wie etwa Acyclovir oder Gancyclovir durch ihre zytotoxischen Wirkungen auf Zellen, die ein funktionales HSV-tk enthalten, getötet werden können (Mansour et al., Nature 336: 348–352 (1988)). Das Fehlen einer Empfindlichkeit gegenüber diesen Nucleosid-Analoga zeigt das Fehlen des HSV-Thymidinkinase-Gens an und damit dass dort, wo homologe Rekombination stattgefunden hat, auch ein Doppel-Crossover stattgefunden hat.
  • Während die Anwesenheit der Markierungsgene in dem Genom anzeigen wird, dass Integration stattgefunden hat, wird es immer noch notwendig sein zu bestimmen, ob homologe Integration stattgefunden hat. Dies kann auf eine Reihe von Wegen erreicht werden. In den meisten Fällen wird eine DNA-Analyse durch Southern-Blot-Hybridisierung verwendet werden, um die Lage der Integration zu bestimmen. Durch die Verwendung von Sonden für die Insertion und die Sequenzen der 5'- und 3'-Regionen, die die Region flankieren, in der die homologe Integration auftreten würde, kann man zeigen, dass homologes Anzielen stattgefunden hat.
  • PCR kann ebenfalls vorteilhaft für den Nachweis des Auftretens von homologer Rekombination verwendet werden. Es können PCR-Primer verwendet werden, die komplementär zu einer Sequenz innerhalb der anzielenden Konstruktion und komplementär zu einer Sequenz außerhalb der Konstruktion und des Ziel-Locus sind. Auf diese Weise kann man ausschließlich DNA-Moleküle erhalten, bei denen beide Primer in den komplementären Strängen vorliegen, wenn homologe Rekombination stattgefunden hat. Durch den Nachweis von Fragmenten mit der erwarteten Größe, z. B. unter Verwendung der Southern-Blot-Analyse, wird das Auftreten von homologer Rekombination unterstützt.
  • Die anzielende Konstruktion kann darüber hinaus ein Replikationssystem umfassen, das in einer nicht menschlichen Wirtszelle funktioniert. In den meisten Fällen wird dieses Replikationssystem virale Replikationssysteme verwenden, wie etwa das Affenvirus 40, Epstein-Barr-Virus, Polyom-Virus, Papillom-Virus und dergleichen. Verschiedene Systeme zum Start der Transkription können verwendet werden, die entweder von Viren- oder Säuger-Genen stammen, wie etwa SV40, Metallothionein-I- und II-Gene, β-Aktin-Gen, frühe und späte Gene des Adenovirus, Phosphoglyceratkinase-Gen, RNA-Polymerase II-Gen oder dergleichen. Zusätzlich zu den Promotoren können Wildtyp-Enhancer verwendet werden, um die Expression des Markierungsgens noch weiter zu steigern.
  • Bei der Herstellung der anzielenden Konstruktionen für die homologe Rekombination kann ein Replikationssystem für Prokaryonten, besonders E. coli, für die Herstellung der anzielenden Konstruktion, Subclonierung nach jeder Manipulation, Analyse wie etwa Restriktionskartierung oder Sequenzierung, Expansion und Isolierung der gewünschten Sequenz eingeschlossen werden. Im Fall der Ersetzungsstrategie, bei der die xenogene DNA-Insertion groß ist, allgemein etwa 50 kbp überschreitet, gewöhnlich 100 kbp überschreitet und gewöhnlich nicht mehr als etwa 1.000 kbp, kann ein künstliches Chromosom der Hefe (YAC) für die Clonierung der anzielenden Konstruktion verwendet werden.
  • Sobald eine anzielende Konstruktion hergestellt und alle unerwünschten Sequenzen, z. B. prokaryontische Sequenzen, entfernt worden sind, kann die Konstruktion nun in die Zielzelle, z. B. eine nicht menschliche ES-Zelle, eingeführt werden. Für die Einführung der DNA in die Zielzellen kann jede gebräuchliche Technik verwendet werden. Die Techniken umschließen Protoplastenfusion, z. B. Hefe-Sphäroplast:Zellfusion, Lipofektion, Elektroporation, durch Calciumphosphat vermittelten DNA-Transfer oder direkte Mikroinjektion.
  • Nach der Transformation oder Transfizierung der Zielzellen können die Zielzellen mit Hilfe von positiven und/oder negativen Markierungen, wie vorstehend genannt, Neomycin-Resistenz und Acyclovir- oder Gancyclovir-Resistenz selektiert werden. Jene Zellen, die den gewünschten Phänotyp zeigen, können dann durch Restriktionsanalyse, Elektrophorese, Southern-Analyse, PCR oder dergleichen weiter analysiert werden. Durch das Identifizieren von Fragmenten, die die Anwesenheit der Läsion(en) am Ziel-Locus aufweisen, kann man Zellen identifizieren, in denen homologe Rekombination aufgetreten ist, um eine Kopie des Ziel-Locus zu inaktivieren.
  • Der vorstehend beschriebene Prozess kann zuerst durchgeführt werden, um einen Locus für die schwere Kette in einer nicht menschlichen embryonalen Stammzelle zu inaktivieren, wobei die Zellen in Blastocysten eines nicht menschlichen Wirtsorganismus mikroinjiziert werden, die sich zu einem chimären Tier entwickeln. Die chimären Tiere werden gekreuzt, um heterozygote Wirtsorganismen zu erhalten. Dann kann durch Kreuzen der heterozygoten Wirtsorganismen ein homozygoter Wirtsorganismus erhalten werden, oder nicht menschliche embryonale Stammzellen können isoliert und transformiert werden, um den zweiten IgH-Locus zu inaktivieren, und der Prozess kann wiederholt werden, bis alle gewünschten Loci inaktiviert worden sind. Alternativ kann der Locus für die leichte Kette zuerst inaktiviert werden. Für die vollständige Eliminierung der Fähigkeit, Immunglobulin der leichten Kette zu produzieren, ist es wünschenswert, sowohl die Loci für das Immunglobulin der leichten lambda- als auch der kappa-Kette zu inaktivieren. Die xenogenen Loci können in jedem Stadium eingeführt werden.
  • Wie bereits dargestellt, kann der Ziel-Locus durch den analogen xenogenen, d. h. menschlichen Locus ersetzt werden. Auf diese Weise wird der xenogene Locus im Wesentlichen in der selben Region platziert, in der der analoge Locus des Wirtsorganismus liegt, so dass jede Regulation, die mit der Position des Locus verbunden ist, für den xenogenen Immunglobulin-Locus im Wesentlichen die selbe sein wird. Zum Beispiel kann man durch Isolieren der variablen Region des menschlichen IgH-Locus (einschließlich der V-, D- und J-Sequenzen) oder Abschnitten hiervon und Flankieren des menschlichen Locus mit Sequenzen des murinen Locus, bevorzugt Sequenzen, die durch mindestens etwa 5 kbp im Locus des Wirtsorganismus getrennt sind, bevorzugt durch mindestens etwa 10 kbp im Locus des Wirtsorganismus getrennt sind, das menschliche Fragment durch einen oder mehrere Rekombinationsvorgänge in diese Region inserieren, so dass der Locus für das menschliche Immunglobulin die endogene variable Region des Immunglobulin-Locus des Wirtsorganismus ersetzt. Auf diese Weise kann man die Fähigkeit des Wirtsogranismus, eine endogene Immunglobulin-Untereinheit zu produzieren, zerstören, während dem Promotor des menschlichen Immunglobulin-Locus ermöglicht wird, durch den Enhancer des Wirtsorganismus aktiviert und durch das Regulationssystem des Wirtsorganismus reguliert zu werden.
  • Um die Produktion von xenogenen Bindungsproteinen in einem nicht menschlichen Wirtsorganismus sicherzustellen, ist es notwendig, dass der Wirtsorganismus in der Lage ist, die notwendigen Enzyme und anderen Faktoren, die an der Produktion von Antikörpern beteiligt sind, zu liefern, während ihm entscheidende endogene Gene für die Expression der schweren und leichten Untereinheiten der Immunglobuline fehlen. Daher werden jene Enzyme und andere Faktoren, die an der Neuordnung der Keimbahn, an Spleißen, an somatischer Mutation und dergleichen beteiligt sind, im Wirtsorganismus funktional sein. Was fehlen wird, ist eine funktionale natürliche Region, die die verschiedenen Exons umfasst, die mit der Produktion von endogenem Immunglobulin verbunden sind.
  • Die Integration von eingeführter xenogener, d. h. menschlicher, DNA kann in Abhängigkeit von der bestimmten Strategie, die verwendet wird, nach dem Zufallsprinzip oder homolog erfolgen. Auf diese Weise können durch die Verwendung von Transformation unter Verwendung wiederholter Schritte oder der Kombination mit Kreuzungen, nicht menschliche, transgene Tiere erhalten werden, die in der Lage sind, bei wesentlichem Fehlen von leichtem oder schwerem endogenen Immunglobulin xenogene Bindungsproteine zu produzieren. Mit Transformation ist jede Technik zur Einführung von DNA in eine lebensfähige Zelle gemeint, wie etwa Konjugation, durch PEG vermittelte Zellfusion, Transformation, Transfizierung, Transduktion, Elektroporation, Lipofektion, Biolistik oder dergleichen.
  • Sobald die xenogenen Loci in das Genom des nicht menschlichen Wirtsorganismus eingefügt worden sind, entweder durch homologe Rekombination oder durch Integration nach dem Zufallsprinzip, und nicht menschliche Wirtsorganismen produziert worden sind, bei denen die endogenen Immunglobulin-Loci durch geeignete Kreuzungen von den verschiedenen nicht menschlichen transgenen Tieren oder Tieren, die von chimären nicht menschlichen Tieren abstammen, inaktiviert worden sind, kann man einen Wirtsorganismus produzieren, dem die native Fähigkeit zur Produktion von endogenem Immunglobulin fehlt, der aber die Fähigkeit besitzt, xenogene Immunglobuline mit mindestens einem signifikanten Abschnitt aus dem Repertoire der xenogenen Quelle zu produzieren.
  • Die funktionale Inaktivierung der beiden Kopien jedes der drei Ig-Loci des Wirtsorganismus (schwer, kappa und lambda), wobei der Wirtsorganismus den menschlichen IgH- und die menschlichen Ig-kappa- und/oder lambda-Loci enthält, würde die Produktion von rein menschlichen Antikörper-Molekülen ohne die Produktion von Wirtsorganismus- oder Wirtsorganismus/menschlichen chimären Antikörpern erlauben. Ein solcher Wirtsorganismus-Stamm würde durch Immunisierung mit spezifischen Antigenen mit der Produktion von murinen B-Zellen, die spezifische menschliche Antikörper herstellen, antworten, wobei diese B-Zellen mit murinen Myelom-Zellen fusioniert werden könnten oder auf eine andere Weise für eine kontinuierliche, stabile Produktion von menschlichen monoclonalen Antikörpern unsterblich gemacht werden könnten. Verfahren zum Erhalt einer kontinuierlichen, stabilen Produktion von monoclonalen Antikörpern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Die vorliegenden Verfahrensweisen und Strategien müssen nicht auf das Produzieren von vollständigen Immunglobulinen beschränkt sein, sondern bieten die Möglichkeit, Regionen zu liefern, die mit einem Abschnitt der konstanten Region verbunden sind, z. B. CH1, CH2, CH3 oder CH4 oder einer Kombination hieraus. Alternativ können ein oder mehrere der Exons der CH- und Ck- oder Cλ-Regionen ersetzt oder mit einer Sequenz verbunden werden, die ein anderes Protein codiert, wie etwa ein Enzym, z. B. den Plasminogen-Aktivator, Superoxid-Dismutase etc.; ein Toxin, z. B. Rizin, Abrin, Diphtherie-Toxin etc.; einen Wachstumsfaktor; ein cytotoxisches Agenz, z. B. TNF; einen Rezeptorliganden oder dergleichen. Vgl. zum Beispiel WO 89/07142 ; WO 89/09344 ; und WO 88/03559 . Durch Inserieren des interessierenden Proteins in ein Exon einer konstanten Region und Ermöglichen des Spleißens der variablen Region zum modifizierten Exon der konstanten Region kann das resultierende Bindungsprotein eine unterschiedliche C-terminale Region des Immunglobulins besitzen. Durch Lieferung einer Stopp-Sequenz mit dem inserierten Gen wird das Proteinprodukt das inserierte Protein als die C-terminale Region besitzen. Falls gewünscht kann die konstante Region vollständig durch das andere Protein ersetzt werden, indem eine Konstruktion mit den geeigneten Spleißstellen für die Verbindung der variablen Region mit dem anderen Protein bereitgestellt wird.
  • Die B-Zellen des nicht menschlichen transgenen Wirtsorganismus, die Immunglobulin oder Immunglobulin-Analog produzieren, können zur Fusion mit einer murinen Myeloid-Zelle verwendet werden, um Hybridome zu erzeugen oder können durch andere herkömmliche Prozesse, z. B. Transfizierung mit Onkogenen, unsterblich gemacht werden. Diese unsterblichen Zellen können dann in kontinuierlichen Kulturen gezüchtet werden oder zur Produktion von Asciten in das Peritoneum eines passenden Wirtsorganismus eingeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Produktion von polyclonalem menschlichen Antiserum oder monoclonalen menschlichen Antikörpern oder Antikörper-Analoga. Wenn der nicht menschliche Säugerwirtsorganismus mit einem Immunogen immunisiert worden ist, können die entstandenen menschlichen Antikörper unter Verwendung einer Affinitätssäule, die eine FC-Bindungseinheit aufweist, wie etwa Protein A oder dergleichen, von anderen Proteinen isoliert werden.
  • Nicht menschliche Wirtsorganismen können sein (vgl. auch 18):
    • I. Tiere, die heterozygot für ein inaktives, endogenes Immunoglobulin-Gen für die leichte Kette sind (homozygote Tiere erhält man durch Kreuzungen);
    • II. Tiere, die heterozygot für ein inaktives, endogenes Immunglobulin-Gen für die schwere Kette sind (homozygote Tiere erhält man durch Kreuzungen);
    • III. Tiere, die homozygot für funktionale endogene Immunglobulin-Gene für die leichte und schwere Kette sind und hemizygot (d. h. sie haben nur eine Kopie) für fremde, bevorzugt menschliche, Immunglobulin-Gene für die schwere Kette sind (homozygote Tiere erhält man durch Kreuzungen);
    • IV. Tiere, die homozygot für funktionale endogene Immunglobulin-Gene für die leichte und die schwere Kette sind und hemizygot für fremde, bevorzugt menschliche, Immunglobulin-Gene für die leichte Kette sind (homozygote Tiere erhält man durch Kreuzungen);
    • V. Tiere, die heterozygot für inaktive endogene Immunglobulin-Gene für die schwere und leichte Kette sind, die man durch Kreuzung von Tieren aus Kategorie I mit Tieren aus Kategorie II erhält (homozygote Tiere erhält man durch Kreuzungen);
    • VI. Tiere, die heterozygot für inaktive endogene Immunglobulin-Gene für die schwere und leichte Kette sind und hemizygot für fremde, bevorzugt menschliche, Immunglobulin-Gene für die schwere Kette sind, die man durch Kreuzung von Tieren aus Kategorie III mit Tieren aus Kategorie V erhält (Tiere, die homozygot für die inaktiven endogenen Loci und homo- oder hemizygot für die fremden Gene sind, erhält man durch Kreuzungen);
    • VII. Tiere, die heterozygot für inaktive endogene Immunglobulin-Gene für die schwere und leichte Kette sind und hemizygot für fremde, bevorzugt menschliche, Immunglobulin-Gene für die leichte Kette sind, die man durch Kreuzung von Tieren aus Kategorie IV mit Tieren aus Kategorie V erhält (Tiere, die homozygot für die inaktiven endogenen Loci und homo- oder hemizygot für die fremden Gene sind, erhält man durch Kreuzungen);
    • VIII. Tiere, die homozygot oder heterozygot für inaktive endogene Immunglobulin-Gene für die schwere und leichte Kette sind und hemizygot für fremde, bevorzugt menschliche Immunglobulin-Gene für die leichten und schwere Kette sind, die man durch Kreuzung von Tieren aus Kategorie VI und VII erhält (Tiere, die homozygot für die inaktiven endogenen Loci und homo- oder hemizygot für die fremden Gene sind, erhält man durch Kreuzungen); Die homozygoten Tiere der Kategorie VIII kann man zur Produktion menschlicher Antikörper verwenden.
    • IX. Tiere, die homozygot für funktionale endogene Immunglobulin-Gene für die schwere und leichte Kette sind und hemizygot für fremde, bevorzugt menschliche, Immunglobulin-Gene für schwere und leichte Ketten sind, die man durch Kreuzung von Tieren aus Kategorie III und IV erhält (homozygote Tiere erhält man durch Kreuzungen);
    • X. Tiere, die heterozygot für eine inaktives endogenes Immunglobulin-Gen für die schwere Kette sind und hemizygot für fremde, bevorzugt menschliche, Immunglobulin-Gene für die schwere und leichte Kette sind, die man durch Kreuzung von Tieren aus Kategorie II und IX erhält (Tiere, die homozygot für die inaktiven endogenen Loci und homo- oder hemizygot für die fremden Gene sind, erhält man durch Kreuzungen);
    • XI. Tiere, die heterozygot für ein inaktives endogenes Immunglobulin-Gen für die leichte Kette sind und hemizygot für fremde, bevorzugt menschliche, Immunglobulin-Gene für die schwere und leichte Kette sind, die man durch Kreuzung von Tieren aus Kategorie I und IX erhält (Tiere, die homozygot für die inaktiven endogenen Loci und homo- oder hemizygot für die fremden Gene sind, erhält man durch Kreuzungen);
  • Zum Einführen von großen, kontinuierlichen menschlichen DNA-Sequenzen in einen nicht menschlichen säugerstämmigen Wirtsorganismus werden die Sequenzen gewöhnlich mindestens 100 kb, noch häufiger mindestens etwa 200 kb umfassen, allgemein zwischen etwa 200 bis 1000 kb liegen. Auf diese Weise möchte man einen interessierenden Locus übertragen, wie etwa den Immunglobulin-Locus; Regionen des xenogenen, d. h. menschlichen, Chromosoms, welche ein oder mehrere interessierende Gene einschließen können, die charakterisiert oder nicht charakterisiert worden sein können, wie etwa der Rezeptor für Lipoprotein geringer Dichte (LDL-Rezeptor), Apolipoprotein (Apo) B, Apo E, der Cystic Fibrosis Transmembrane Conduktor Regulator, Dystrophin oder Regionen von xenogenen Chromosomen, die an der abschnittsweisen Chromosom-Trisomy (z. B. Chromosom 21, 7 und 10) beteiligt sind; und Viren.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung einer nicht menschlichen, säugerstämmigen embryonalen Stamm(ES)-Zelle, die mindestens einen Abschnitt eines Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kette und mindestens einen Abschnitt eines Locus für die leichte menschliche Immunglobulin-Kette stabil in das Genom der nicht menschlichen, säugerstämmigen ES-Zelle eingefügt besitzt, wobei der Abschnitt eines Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kette ausreichend ist, eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, und der Abschnitt einer leichten menschlichen Immunglobulin-Kette ausreichend ist, um eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) Das Kombinieren unter Fusionsbedingungen von ES-Zellen eines nicht menschlichen Säugers und Hefe-Sphäroplasten, die einen oder mehrere künstliche Hefe-Chromosomen (YACs) enthalten, welche den Abschnitt eines Locus für die schwere Kette eines menschlichen Immunglobulins und den Abschnitt eines Locus für eine leichte Kette eines menschlichen Immunglobulins umfassen, wobei die YACs ein Gen einschließen, das eine selektierbare Markierung codiert, wobei die Abschnitte der menschlichen Immunglobulin-Loci stabil in das Genom der embryonalen Stammzellen integriert werden; und
    • (b) das Selektieren von ES-Zellen, die die menschlichen Immunglobulin-Loci tragen, mit Hilfe der Markierung oder der Markierungen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch eine nicht menschliche, säugerstämmige embryonale Stammzellen (ES-Zellen), die mindestens einen Abschnitt eines Locus für eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette und mindestens einen Abschnitt eines Locus für eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette stabil in das Genom der nicht menschlichen, säugerstämmigen ES-Zelle integriert besitzt, wobei der Abschnitt eines Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kette ausreichend ist, eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, und der Abschnitt einer leichten menschlichen Immunglobulin-Kette ausreichend ist, um eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, und worin die nicht menschliche ES-Zelle durch das Verfahren der Erfindung zum Produzieren einer nicht menschlichen, säugerstämmigen embryonalen Stammzelle (ES-Zelle) produziert wird.
  • Die xenogene, d. h. menschliche DNA, die unter Verwendung eines YAC eingeführt werden soll, ist menschlichen Ursprungs. Man kann auf diese Weise zahlreiche neue Fähigkeiten auf den Wirtsorganismus übertragen, genetische Antworten in Bezug auf die xenogene, d. h. menschliche, Quelle der DNA erzeugen, die Produktion von Antikörpern bereitstellen, dominante Mutationen einführen oder rezessive Mutationen komplementieren. Die xenogene, d. h. menschliche DNA kann modifiziert werden, wenn sie in einem YAC vorliegt. Weil homologe Rekombination in Hefe erfolgreich ist, wobei sie einen hohen Prozentsatz an stellenspezifischer Integration an homologer DNA gestattet, wobei die homologe DNA andere DNA von Interesse flankiert, ist man in der Lage, die xenogene, d. h. menschliche, DNA zu modifizieren, bevor sie in eine nicht menschliche ES-Zelle eingeführt wird. Auf diese Weise kann man defekte Gene in den nicht menschlichen Wirtsorganismus einführen, die defekte Proteine exprimieren, um kranke Zustände des xenogenen Wirtsorganismus nachzuahmen, um zahlreiche Mechanismen der Wechselwirkung von defekten Proteinen mit anderen xenogenen Proteinen oder endogenen Proteinen zu studieren oder um Gene oder Gensysteme zu studieren.
  • Um große DNA-Segmente zu übertragen, wie hierin genau beschrieben, werden allgemein YACs verwendet, die ein Hefe-Zentromer, einen Replikationsursprung und Telomere, die die interessierende DNA binden, umfassen. Verschiedene Zentromere oder Telomere können verwendet werden, besonders die Zentromere der Hefe-Chromosomen 4 und 5. Das YAC besitzt eine Markierung, die Selektion oder Durchmusterung von Zellen gestattet, in die das YAC integriert wird. Nicht alle Markierungen gestatten wirksame Selektion. Es stellte sich heraus, dass besonders das HPRT-Gen, genauer das menschliche HPRT, wirksame Selektion von HPRT-negativen, nicht menschlichen ES-Zellen, die das YAC tragen, verbietet. Andere bekannte selektierbare oder durchmusterbare Markierungen sind Hygromycin, Neomycin, β-Gal und GPT. Die ES-Zelle kann von jedem nicht menschlichen Wirtsorganismus abstammen, von dem ES-Zellen verfügbar sind, und kann in Kultur vermehrt werden, die lebensfähig und funktional bleibt, wofür eine Markierung zur Selektion existiert, wobei die ES-Zelle in einen nicht menschlichen Embryo eingeführt werden und den nicht menschlichen Wirtsorganismus einschließlich der Keimbahn wiederbesiedeln kann. In den meisten Fällen ist diese Fähigkeit bei Nagetieren, z. B. Mäusen und Ratten, etabliert worden, und in geringerem Umfang bei Meerschweinchen. Mäuse sind zur Produktion von Antikörpern oder B-Lymphocyten zur Immortalisierung für die Produktion von Antikörpern verwendet worden. Weil der Umgang mit Mäusen einfach ist, sie in großen Mengen produziert werden können und bekannt ist, dass sie ein weites Immun-Repertoire haben, werden Mäuse gewöhnlich die Tiere der Wahl sein. Wenn andere Arten von nicht menschlichen ES-Zellen verfügbar werden, können diese ebenfalls im Einklang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Von besonderem Interesse werden kleine Labortiere oder Haustiere, besonders Nagetiere, sein, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Kühe, Schweine, Hamster, Pferde, Hunde, Schafe und Meerschweinchen oder Vögel wie Küken, Truthähne usw. eingeschlossen. Die nicht menschlichen ES-Zellen können eine oder mehrere Mutationen aufweisen, zum Beispiel das Fehlen einer bestimmten Aktivität. Von besonderem Interesse in dieser Erfindung sind ES-Zellen, die einen HPRT-Defekt aufweisen. Zusätzlich können befruchtete, nicht menschliche Eier von bestimmten Tierarten Verwendung im Einklang mit der vorliegenden Erfindung finden.
  • Das YAC kann durch Durchmustern von existierenden menschlichen YAC-Bibliotheken wie jener, die vom Centre d'Etude du Polymorphisme Human (C. E. P. H.), Paris, Frankreich, und der Washington University, St. Louis, MO, verfügbar sind, unter Verwendung von Standardverfahren erhalten werden. Alternativ wird das YAC direkt hergestellt, wie hierin genau beschrieben wird, indem die flankierenden Segmente der Hefe, die einen Arm mit einem Zentromer und Telomer und einen anderen mit einem Telomer umfassen, mit der interessierenden DNA verbunden werden. Gewöhnlich werden auch ein oder mehrere Markierungen anwesend sein, die Selektion in den Hefe-Wirtszellen gestatten. Von besonderem Interesse für die Selektion der Hefe sind Markierungen, die Mutationen des Hefe-Wirtsorganismus komplementieren, wie etwa Gene, die an der Produktion von Aminosäuren, Purinen oder Pyrimidinen, URA3, TRP1, LYS2, ADE2 beteiligt sind, um die Mutationen ura3, trp1, lys2 und ade2 in dem Wirtsorganismus zu komplementieren. Im Rahmen der Komplementierung werden in den meisten Fällen nur Hefezellen, die das vollständige YAC tragen, in der Lage sein, in einem selektiven Kulturmedium zu überleben. Zusätzlich zu der genetischen Verifizierung, dass beide Arme erhalten geblieben sind, ist es wünschenswert, die Unversehrtheit des YAC unter Verwendung von Verfahren wie etwa der Pulsfeldgelelektrophorese zu bestätigen.
  • Jene Hefe-Wirtsorganismen, die das YAC tragen, können dann als eine Quelle für das YAC zur Einführung in die nicht menschliche ES-Zelle verwendet werden. Die wirksame Übertragung des YAC wird erreicht, wenn Hefe-Sphäroplasten im Einklang mit herkömmlichen Verfahren präpariert werden. Durch Abbau der äußeren Zellwand unter milden Bedingungen in einem isotonischen Kulturmedium werden Sphäroplasten mit hohem Ertrag produziert. Exponentiell wachsende nicht menschliche ES-Zellen werden mit Protease behandelt, z. B. mit Trypsin, und mit den Sphäroplasten kombiniert. Auf herkömmliche Weise kann ein fester Niederschlag aus Hefe-Sphäroplasten hergestellt werden, und die nicht menschlichen ES-Zellen werden mit dem festen Niederschlag zentrifugiert und über 1–2 Minuten einem fusogenen Agens wie etwa PEG ausgesetzt. Die Zellen werden dann resuspendiert und in einem geeigneten serumfreien Kulturmedium inkubiert. Die Zellen werden dann auf Nährzellen plattiert, anschließend erfolgt Selektion im Einklang mit der selektiven Markierung. Beim HPRT-Gen kann HAT-Kulturmedium zur Selektion verwendet werden. Überlebende Fusionskolonien werden dann aufgenommen, expandiert und analysiert. Die Analyse kann durch Restriktionsenzym-Analyse, kombiniert mit Southern-Blot-Verfahren oder Pulsfeldgelelektrophorese oder durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung geeigneter Primer, von denen mindestens einer komplementär zu der DNA-Insertion ist, und die Verwendung von Sonden mit sich wiederholenden Sequenzen durchgeführt werden, die in der xenogenen DNA vorkommen, wie etwa Alu, zum Nachweis von menschlichen DNA-Sequenzen. Ty, Y', rDNA, delta-Sequenzen werden verwendet, um Hefe-Sequenzen zu sondieren. Sonden für YAC-Enden werden verwendet, um die Unversehrtheit des YAC zu bestätigen. Jene Zellen, die die intakte oder im Wesentlichen intakte YAC-DNA in das Genom des Wirtsorganismus integriert aufweisen, werden dann für die nächsten Schritte verwendet. In einigen Clonen wird nur ein Teil oder wenig oder gar keine Hefe-DNA in das Maus-Genom integriert. Die integrierte Hefe-DNA reicht von mehr als etwa 90% des ursprünglichen Hefe-Genoms bis zu weniger als etwa 10%.
  • Wirksame Produktion von transgenen, nicht menschlichen Wirtsorganismen kann erreicht werden, indem ein Prozess verwendet wird, der große, xenogene DNA-Fragmente mit mindestens 100 kb in im Wesentlichen intakter Form in eine nicht menschliche embryonale Wirts-Stammzelle (ES-Zelle) oder ein nicht menschliches, befruchtetes Ei (Zygote) integriert. Die Einführung der xenogenen DNA wird wirksam durch die Fusion der nicht menschlichen ES-Zelle mit Hefe-Sphäroplasten, welche die YACs enthalten, die die 100 kb große DNA und eine selektierbare Markierung tragen, unter Bedingungen, die die Integration der YAC-DNA, die die Markierung enthält, in das Genom der nicht menschlichen ES-Zelle erlauben, oder durch Transfizierung eines gereinigten YAC in nicht menschliche ES-Zellen erreicht. Nicht menschliche ES-Zellen, die das YAC in das Genom integriert umfassen, werden dann mit Hilfe der Markierung selektiert, die in den nicht menschlichen ES-Zellen funktional ist. Zum Beispiel kann das Gen für Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) als eine Markierung in HPRT-defekten (HPRT-)ES-Zellen verwendet werden. Zur Produktion von Tieren aus nicht menschlichen embryonalen Stammzellen werden die Zellen nach der Transformation auf eine Nahrschicht in einem geeignetem Kulturmedium, z. B. mit fötalem Rinderserum ergänztem DMEM, plattiert. Die nicht menschliche ES-Zelle kann einen einzelnen angezielten Locus (heterozygot) haben oder kann durch den Prozess der Homogenisierung so verändert worden sein, dass beide Loci angezielt werden (homozygot). Der Prozess der Homogenisierung (Bildung von Homozygoten) verwendet selektiven Druck, um jene Zellen herauszuzüchten, die das Gen-anzielende Ereignis auf beiden Chromosomen aufweisen. Zellen, die die beiden angezielten Allele besitzen, können durch die Verwendung eines selektiven Kulturmediums nachgewiesen werden, und nach einem ausreichenden Zeitraum, in dem die Kolonien wachsen können, können die Kolonien aufgenommen und auf das Auftreten der Integration oder auf homologe Rekombination analysiert werden. Wie vorstehend beschrieben, kann die PCR mit Primern innerhalb oder außerhalb der konstruierten Sequenz, aber am Ziel-Locus verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Produktion eines chimären nicht menschlichen Säugers, welcher mindestens einen Teil eines Locus für eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette und mindestens einen Teil eines Locus für eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette stabil in das Genom von mindestens einigen seiner Zellen aufweist, wobei der Teil eines Locus für eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette ausreicht, um eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, und der Teil eines Locus für eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette ausreichend ist, um eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • (a) Herstellen einer nicht menschlichen, säugerstämmigen ES-Zelle der vorliegenden Erfindung, und
    • (b) Übertragen der selektierten embryonalen Zelle in eine nicht menschliche Wirts-Blastozyste, Implantieren der Blastozyste in einen pseudoträchtigen nicht menschlichen Empfänger und Zulassen, dass die Blastozyste ausgetragen wird, für die Produktion des chimären nicht menschlichen Säugers.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch einen chimären nicht menschlichen Säuger, der mindestens einen Teil eines Locus für eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette und mindestens einen Teil eines Locus für eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette stabil in das Genom von mindestens einigen seiner Zellen integriert aufweist, wobei der Teil eines Locus für eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette ausreicht, um eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, und der Teil eines Locus für eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette ausreichend ist, um eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, und wobei der chimäre nicht menschliche Säuger durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Produktion eines chimären nicht menschlichen Säugers produziert wird.
  • Jene Kolonien, die homologe Rekombination aufweisen, könnnen für die Manipulation von nicht menschlichen Embryos und nicht menschliche Blastozysten-Injektion verwendet werden. Die selektierten nicht menschlichen ES-Zellen werden dann in nicht menschliche Embryos durch Mikroinjektion oder andere Mittel in den geeigneten nicht menschlichen Wirtsorganismus eingeführt. Zum Beispiel können murine Blastozysten von weiblichen Tieren durch Spülen des Uterus 3,5 Tage nach der Ovulation erhalten werden. Die nicht menschlichen modifizierten ES-Zellen werden dann mit Trypsin behandelt und mindestens 1 bis zu 15 Zellen können in das Blastozoel der nicht menschlichen Blastozyste injiziert werden. Nach der Injektion werden mindestens 1 und nicht mehr als etwa 10 Blastozysten in jedes Uterus-Horn von pseudoträchtigen weiblichen Tieren zurückgesetzt. Die weiblichen Tiere gelangen zur Geburt, und die entstandenen chimären nicht menschlichen Tiere können auf die Anwesenheit von YAC in ihren somatischen Zellen untersucht werden. Mit dem Ausdruck „chimär" ist ein nicht menschliches Tier gemeint, welches Zellen trägt, die aus mehr als einer Zelle stammen, z. B. von dem Wirtsorganismus und einem anderen Tier. Zum Beispiel enthält in der vorliegenden Erfindung ein chimäres murines Tier eine auf gentechnischem Weg herbeigeführte Modifikation, besonders ein menschliches Gen, in einigen seiner Zellen, z. B. in Zellen, die sich aus den modifizierten embryonalen Stammzellen entwickeln. Die Anwesenheit des integrierten YAC in chimären Wirtsorganismen, die erzeugt werden, wird dann analysiert. Die chimären Wirtsorganismen werden durch Paaren auf Übertragung des Genoms der ES-Zellen über die Keimbahn untersucht, zum Beispiel werden chimäre Mäuse mit C57BL/6J-Mäusen gepaart. Chimäre Wirtsorganismen können mit nicht chimären Wirtsorganismen gekreuzt werden, entweder syngen oder allogen, um auf Chimären zu durchmustern, die das YAC in ihren Keimzellen tragen. Nachkommen, die heterozygot für die genetische Modifikation sind, werden dann miteinander gekreuzt, um Nachkommenschaft zu erzeugen, die homozygot für die Modifikation ist und die funktionierende YAC-Konstruktion stabil auf ihre Nachkommenschaft überträgt.
  • Das Verfahren der Erfindung zur Produktion eines chimären nicht menschlichen Säugers, besonders eines Nagetiers und gewöhnlich eines murinen Tiers, liefert stabile Integration der DNA. Es stellte sich heraus, dass Gene in der inserierten DNA funktional waren, und die chimären nicht menschlichen Wirtsorganismen waren in der Lage, die integrierte DNA über die Keimbahn zu übertragen. Nach Kreuzen des chimären Wirtsorganismus wurden transgene heterozygote nicht menschliche Wirtsorganismen produziert und gepaart, um ein homozygotes nicht menschliches Tier zu erzeugen, das für ein breites Spektrum an Zwecken verwendet werden kann, einschließlich der Herstellung von Produkten wie etwa Bindungsproteinen, zum Beispiel Immunglobulinen, zur Durchmusterung auf verschiedene Arzneistoffe, für die Gentherapie, zum Beispiel um rezessive genetische Störungen zu komplementieren, um zahlreiche Krankheiten zu studieren, um die Funktion und Regulation von wenig kartierten, großen DNA-Fragmenten zu studieren.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Produzieren eines transgenen, nicht menschlichen Säugetiers und seiner Nachkommenschaft, welche mindestens einen Teil eines Locus für eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette und mindestens einen Teil eines Locus für eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette stabil in das Genom seiner Soma- und Keimzellen integriert besitzt, wobei der Abschnitt eines Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kette ausreichend ist, eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, und der Abschnitt einer leichten menschlichen Immunglobulin-Kette ausreichend ist, um eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) Produzieren eines chimären, nicht menschlichen Säugers der vorliegenden Erfindung; und
    • (b) Züchten des chimären, nicht menschlichen Säugers wie erforderlich für die Produktion des transgenen nicht menschlichen Säuger und seiner Nachkommen.
  • Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung einen transgenen nicht menschlichen Säuger und seine Nachkommenschaft, welche mindestens einen Teil eines Locus für eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette und mindestens einen Teil eines Locus für eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette stabil in das Genom seiner Soma- und Keimzellen integriert besitzt, wobei der Abschnitt eines Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kette ausreichend ist, eine schwere menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, und der Abschnitt einer leichten menschlichen Immunglobulin-Kette ausreichend ist, um eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette zu codieren, und wobei der nicht menschliche Säuger durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Produktion eines transgenen, nicht menschlichen Säugers und seiner Nachkommenschaft produziert wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist der Teil des Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kette eine DNA-Sequenz, die identisch mit der Keimbahn-DNA-Sequenz des menschlichen Chromosoms 14 von den D-Segment-Genen des Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kette ist, sich durch die J-Segment-Gene und die Gene der konstanten Region durch lμ dieses Locus fortsetzt, wobei die genannte DNA-Sequenz eine konstante gamma-Region nicht einschließt und wobei das genannte DNA-Fragment funktionell mit mindestens einem menschlichen V-Segment-Gen verbunden ist.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst das Genom der nicht menschlichen säugerstämmigen ES-Zelle mindestens einen inaktivierten endogenen Locus für die schwere Immunglobulin-Kette, wobei der Locus inaktiviert ist, um eine Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkriptes von einem neugeordneten Locus für die schwere Immunglobulin-Kette zu verhindern.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst das Genom der nicht menschlichen säugerstämmigen ES-Zelle darüber hinaus mindestens einen inaktivierten endogenen Locus für die leichte Immunglobulin-Kette, wobei der Locus inaktiviert ist, um eine Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkriptes von einem neugeordneten Locus für die leichte Immunglobulin-Kette zu verhindern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Teil des Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kettte der nicht menschlichen ES-Zelle oder des nicht menschlichen Säugetiers eine DNA-Sequenz, die identisch mit der Keimbahn-DNA-Sequenz des menschlichen Chromosoms 14 von den D-Segment-Genen des menschlichen Locus für die schwere Immunglobulin-Kettte ist, sich durch die J-Segment-Gene und die Gene der konstanten Region durch cμ dieses Locus fortsetzt, wobei die genannte DNA-Sequenz eine konstante gamma-Region nicht einschließt und wobei das genannte DNA-Fragment funktionell mit mindestens einem menschlichen V-Segment-Gen verbunden ist.
  • Darüber hinaus umfasst das Genom der nicht menschlichen, säugerstämmigen ES-Zelle in einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mindestens einen inaktivierten endogenen Locus für die schwere Immunglobulin-Kette, wobei der Locus inaktiviert ist, um eine Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkriptes von einem neugeordneten Locus für die schwere Immunglobulin-Kette zu verhindern.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Genom der nicht menschlichen säugerstämmigen ES-Zelle darüberhinaus mindestens einen inaktivierten endogenen Locus für die leichte Immunglobulin-Kette, wobei der Locus inaktiviert ist, um eine Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkriptes von einem neugeordneten Locus für die leichte Immunglobulin-Kette zu verhindern.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Genom der Zellen des chimären nicht menschlichen Säugetiers mit einem Teil des Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kette und mit einem Teil eines Locus für eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette mindestens einen inaktivierten endogenen Locus für die schwere Immunglobulin-Kette, wobei der Locus inaktiviert ist, um eine Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkriptes von einem neugeordneten Locus für die schwere Immunglobulin-Kette zu verhindern.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Genom der Zellen des chimären nicht menschlichen Säugers mit einem Teil des Locus für die schwere menschliche Immunglobulin-Kette und mit einem Teil eines Locus für eine leichte menschliche Immunglobulin-Kette mindestens einen inaktivierten endogenen Locus für die leichte Immunglobulin-Kette, wobei der Locus inaktiviert ist, um eine Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkriptes von einem neugeordneten Locus für die leichte Immunglobulin-Kette zu verhindern.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Genom der Soma- und Keimbahn-Zellen des transgenen nicht menschlichen Säugetiers mindestens einen inaktivierten endogenen Locus für die schwere Immunglobulin-Kette, wobei der Locus inaktiviert ist, um eine Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkriptes von einem neugeordneten Locus für die schwere Immunglobulin-Kette zu verhindern.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Genom der Soma- und Keimbahn-Zellen des transgenen nicht menschlichen Säugers darüber hinaus mindestens einen inaktivierten endogenen Locus für die leichte Immunglobulin-Kette, wobei der Locus inaktiviert ist, um eine Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkriptes von einem neugeordneten Locus für die leichte Immunglobulin-Kette zu verhindern.
  • In einer anderen, stärker bevorzugten Ausführungsform der Verfahren der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein endogener Locus für die schwere Immunglobulin-Kette durch Deletion aller Gene für das J-Segment inaktiviert.
  • Darüber hinaus ist in einer stärker bevorzugten Ausführungsform mindestens ein endogener Locus für die schwere Immunglobulin-Kette der nicht menschlichen ES-Zelle oder des nicht menschlichen Säugers der vorliegenden Erfindung durch Deletion aller Gene für das J-Segment inaktiviert.
  • In einer anderen, stärker bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein endogener Locus für die leichte Immunglobulin-kappa-Kette durch Deletion der Cκ-Gene inaktiviert.
  • Schließlich ist in einer stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mindestens ein endogener Locus für die leichte Immunglobulin-kappa-Kette der nicht menschlichen ES-Zelle oder des nicht menschlichen Säugers durch Deletion der Cκ-Gene inaktiviert.
  • Die nachstehenden Beispiele sollen der Erläuterung und nicht der Begrenzung dienen.
  • EXPERIMENTELLES
  • BEISPIEL I
  • I. Inaktivierung der J (JH)-Gene der schweren Kette der Maus
  • A. Konstruktion des anzielenden Vektors zur Inaktivierung
  • Ein 6,4 kb großes EcoRI-Fragment, das die J-Gene der schweren Kette der Maus und flankierende Sequenzen enthält, wird unter Verwendung der in Sakano et al., (1981), Nature 290: 562–565 beschriebenen Sonden aus der genomischen Bibliothek eines Balb/c-Mausembryos cloniert. Dieses Fragment (mDJ) wird in das mit EcoRI gespaltene Plasmid pUC19 (pmDJ) inseriert. Ein 2,9 kb großes Fragment, das die 4 J-Gene enthält, wird durch Spaltung mit XhoI-Scal deletiert (pmDδJNeo, vlg. 1). Ein 1150 bp großes XhoI-BamHI-Fragment, das ein Gen für Neomycin-Resistenz enthält, welches durch den Promotor des Thymidinkinase-Gens des Herpes simplex-Virus (HSV-tk) und einen Polyom-Enhancer gesteuert wird, wird aus pMC1Neo isoliert (Thomas und Capecchi (1987), Cell, 51, 503–512). Zu diesem Fragment wird ein synthetischer Adapter hinzugefügt, um das BamHI-Ende in ein ScaI-Ende umzuwandeln, und das entstandene Fragment wird mit dem XhoI-ScaI-pmDδJ verbunden, um den Vektor für die Inaktivierung (pmDδJ.Neo) zu bilden, bei dem die 5'- nach 3'-Orientierung der Promotoren für Neomycin und die schwere Kette identisch ist. Dieses Plasmid wird vor der Transfizierung in ES-Zellen durch Spaltung mit NdeI linearisiert. Die Sequenzen, die den Vorgang der homologen Rekombination steuern, sind 3 kb und 0,5 kb große Fragmente, die 5'- beziehungsweise 3' des Neomycin-Gens liegen.
  • B. Kultivierung, Elektroporation und Selektion von ES-Zellen
  • Die ES-Zelllinie E14TG2a (Hooper et al., (1987), Nature, 326: 292–295) wird auf einer Nährschicht von mit Mitomycin behandelten primären embryonalen Fibroblasten im wesentlichen, wie beschrieben, kultiviert (Doetschman et al., (1985), J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27–45). Die embryonalen Fibroblasten werden aus Embryos von weiblichen C57BL/6-Mäusen gewonnen, die 14 bis 17 Tage zuvor mit einer männlichen Maus, die homozygot für ein Neomycin-Transgen war, gepaart worden waren (Gossler et al., (1986), PNAS 83: 9065–9069). Diese Zellen sind in der Lage, in Kulturmedien zu wachsen, die G418 enthalten. Die Elektroporationsbedingungen werden von Boggs et al. (1986), Ex. Hematol. (NY) 149: 988–994) beschrieben. Die ES-Zellen werden mit Trypsin behandelt, in Kulturmedien mit einer Konzentration von 4 × 107/ml resuspendiert, und Elektroporation wird in Anwesenheit der anzielenden DNA-Konstruktion in einer Konzentration von 12 nM im ersten Experiment und 5 nM DNA im zweiten durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass eine Spannung von 300 V mit einer Kapazität von 150–250 μF optimal für eine Elektroporationszelle von 5 mm Länge und 100 mm2 Querschnitt ist. 5 × 106 durch Elektroporation behandelte Zellen werden auf mit Mitomycin behandelte Fibroblasten in 100 mm-Schalen in Anwesenheit von Dulbecco modifiziertem Eagle-Kulturmedim (DMEM), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, plattiert. Das Kulturmedium wird 24 Stunden nach der Elektroporation durch ein Kulturmedium ersetzt, das 200 μg/ml G418 enthält.
  • ES-Kolonien, die 10–14 Tage nach der Elektroporation entstanden sind, werden mit ausgezogenen Kapillarpipetten zur Analyse unter Verwendung von PCR aufgenommen. Die Hälfte von jeder aufgenommenen Kolonie wird auf Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen, auf denen bereits mit Mitomycin behandelte Nährzellen ausgesät worden waren, gerettet. Die anderen Hälften, jeweils 3–4 zusammengegeben, werden in etwa 0,5 ml PBS enthaltende Eppendorf-Röhrchen übertragen und unter Verwendung von PCR auf homologe Rekombination analysiert. Die Bedingungen für die PCR-Reaktionen sind im Wesentlichen, wie beschrieben (Kim und Smithies (1988), Nucleic Acids Res. 16: 8887–8893). Nach Fällung werden die ES-Zellen in 5 μl PBS resuspensiert und durch die Zugabe von 55 μl H2O zu jedem Röhrchen lysiert. DNAsen werden durch Erhitzung jedes Röhrchens auf 95°C über 10 min inaktiviert. Nach der Behandlung mit Proteinase K bei 55°C über 30 min werden 30 μl von jedem Lysat in ein Röhrchen übertragen, das 20 μl eines Reaktionsgemisches einschließlich PCR-Pufferlösung enthält: 1,5 μg von jedem Primer, 3E Taq-Polymerase, 10% DMSO und dNTPs, jeweils 0,2 mM. Die PCR-Expansion umfasst 55 Zyklen unter Verwendung eines Thermocyclers mit 65 Sekunden Schmelzvorgang bei 92°C und einer Anheftungs- und Extensionszeit von 10 min bei 65°C. Die beiden Primer-Oligonucleotide sind
    Figure 00370001
    die einer Region die 650 Basen 3' des Startcodons des Neomycin-Gens liegt, bzw. Sequenzen entsprechen, die im Gen für die schwere Kette der Maus, 1100 Basen 3' der Insertionsstelle liegen. 20 μl des Reaktionsgemisches werden der Elektrophorese auf Agarose-Gelen unterworfen und auf Nylon-Membranen übertragen (Zeta Bind). Die Filter werden mit einem mit 32P markierten Fragment des 991 bp großen XbaI-Fragments der J-C-Region sondiert.
  • BEISPIEL II
  • II. Deletion der J (JH)-Gene der schweren Ig-Kette der Maus in ES-Zellen
  • A. Konstruktion des anzielenden Vektors für die Ersetzung
  • Ein 6,1 kb großes EcoRI-Fragment, das die Gene der J-Region der schweren Immunglobulin-Kette der Maus und flankierende Sequenzen enthält, cloniert aus der genomischen Bibliothek eines BALG/c-Maus-Embryos und inseriert in pUC18 (pJH), wurde mit XhoI und NaeI gespalten, um ein etwa 2,3 kb großes Fragment, das die vier J-Gene enthält, zu deletieren (vgl. 2A). Ein etwa 1,1 kb großes XhoI-BamHI-Fragment, an der BamHI-Stelle mit glatten Enden versehen, das ein Gen für Neomycin-Resistenz enthält, gesteuert durch den Promotor für das Thymidinkinase-Gen des Herpes simplex-Virus (HSV-tk) und den Polyom-Enhancer, wurde aus pMC1Neo isoliert (Thomas und Capecchi (1987), Cell, 51, 503–512). Dieses Fragment wurde in das mit XhoI-NaeI deletierte pJH inseriert, um den Deletionsvektor (pmHδJ, vgl. 2B) zu bilden, in welchem die Transkriptionsorientierung der Gene für Neomycin und für die schwere Kette dieselbe ist. Das Plasmid wurde vor der Transfizierung in ES-Zellen durch NdeI-Spaltung linearisiert. Die Sequenzen, die den Vorgang der homologen Rekombination steuern, sind etwa 2,8 kb und etwa 1,1 kb große Fragmente, die 5' beziehungsweise 3' des Neomycin-Gens liegen.
  • B. Kultivierung, Elektroporation und Selektion von ES-Zellen
  • Die ES-Zelllinie E14TG2a (Koller und Smithies (1989), PNAS USA, 86: 8932–8935) wurde auf mit Mitomycin C behandelten embryonalen Fibroblasten-Nährschichten kultiviert, wie beschrieben (Koller und Smithies (1989), PNAS USA, 86: 8932–8935). Die ES-Zellen wurden mit Trypsin behandelt, in HBS-Pufferlösung (pH-Wert 7,05; 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 0,7 mM Na2HPO4, 21 mM HEPES, pH-Wert 7,1) mit einer Konzentration von 2 × 107/ml resuspendiert und in Anwesenheit von 50 μg/ml des linearisierten Inaktivierungsvektors der Elektroporation unterworfen. Die Elektroporation wurde mit einem BioRad-Gen-Pulser unter Verwendung von 240 Volt und 500 μF Kapazität durchgeführt. 5 × 106 durch Elektroporation behandelte Zellen wurden auf mit Mitomycin-C behandelte Fibroblasten in 100 mm-Schalen in Anwesenheit von Dulbecco modifiziertem Eagle-Kulturmedim (DMEM), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, plattiert. Das Kulturmedium wurde 24 Stunden nach der Elektroporation durch ein Kulturmedium ersetzt, das 200 μg/ml G418 enthielt. Gegen 0418 resistente ES-Kolonien, die 12–14 Tage nach der Elektroporation entstanden waren, wurden mit ausgezogenen Kapillarpipetten zur Analyse mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aufgenommen. Die Hälfte von jeder aufgenommenen Kolonie wurde in eine eigene Vertiefung auf einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen, auf denen bereits mit Mitomycin C behandelte Nährzellen ausgesät worden waren, übertragen. Die anderen Hälften, jeweils 4 zusammengegeben, wurden in 0,3 ml PBS enthaltende Eppendorf-Röhrchen übertragen, und es wurden Zell-Lysate für die PCR-Analyse hergestellt, wie von Joyner et al. (1989) Nature, 338: 153–155, beschrieben. Die PCR-Reaktion umschloss 5–20 μl Zell-Lysat, 1 μM jedes Primers, 1,5 E Taq-Polymerase und 200 μM dNTPs. Die PCR-Amplifikation verwendete 45 Zyklen in einem Thermo-Cycler (Perkin-Elmer Cetus) mit einem Schmelzvorgang über 1 min bei 94°C, 2 min Anheftung bei 55°C und 3 min Extension bei 72°C. Die beiden Primer-Oligonucleotide sind
    Figure 00380001
    die etwa 120 Basen 5' der BamHI-Stelle des Neomycin-Gens bzw. den Sequenzen entsprechen, die im Gen für die schwere Kette der Maus etwa 160 Basen 3' der Insertionsstelle liegen. Erfolgreiche homologe Rekombination lässt ein etwa 1,4 kb großes Fragment entstehen. 20 μl des Reaktionsgemisches werden der Elektrophorese auf 1% Agarose-Gelen unterworfen, mit Ethidiumbromid angefärbt und auf Nylon-Membranen übertragen (Gene Screen). Die Filter werden mit einem mit 32P markierten, etwa 1,4 kb großen EcoRI-PstI-Fragment, das in der schweren Kette der Maus 3' der Insertionsstelle liegt, sondiert (vgl. 2). Zur weiteren Analyse wurde genomische DNA aus ES-Zellen präpariert, mit Restriktionsenzymen nach Empfehlung der Hersteller gespalten, und die Fragmente wurden auf 1%-Agarose-Gelen aufgetrennt. Die DNA wurde auf Nylon-Membranen (Gene Screen) übertragen und mit dem vorstehend beschriebenen, mit 32P markierten Fragment sondiert.
  • C. Analyse von G418-resistenten ES-Kolonien
  • Im ersten Experiment ergab die PCR-Analyse der zusammengegebenen Kolonien in 34 Pools, die die 136 Kolonien vertraten, die gegenüber G418 resistent waren, 1 positives PCR-Signal mit der erwarteten Größe (etwa 1,4 kb). Die vier individuellen Kolonien, die zu diesem positiven Pool beigetragen hatten, wurden individuell durch PCR analysiert, und ein positiver Clon, ES33D5, wurde identifiziert. Eine ähnliche Analyse von 540 gegenüber G418 resistenten Kolonien, die im zweiten Experiment erhalten worden waren, ergab 4 weitere positive Clone (ES41-1, ES61-1, ES65-1, ES110-1).
  • Um die angezielte Zerstörung von einer der Kopien der J-Gene (das Gen ist autosomal und liegt daher in zwei Kopien vor) zu bestätigen, wurden die PCR-positiven Clone expandiert, und es wurde genomische DNA präpariert, mit HindIII oder mit SacI gespalten und durch Southern-Analyse, wie beschrieben, unter Verwendung der EcoRI-PstI-Sonde analysiert.
  • Die Ersetzung der J-Gene durch Insertion des Neomycin-Gens durch einen homologen Rekombinationsvorgang ergab ein mit der EcoRI-PstI-Sonde nachweisbares HindIII-Fragment, welches auf Grund des Verlustes von zwei HindIII-Stellen, die in der deletierten J-Gen-Region liegen, etwa 1,9 kb größer als das äquivalene Fragment des natürlichen Locus ist (vgl. 2C). Southern-Analyse von jedem der 5 positiven Clone durch HindIII-Spaltung ergab ein Muster, das anzeigte, dass eine der beiden Kopien der J-Gene der schweren Kette zerstört worden ist. Drei markierte Fragmente wurden nachgewiesen: ein Fragment (etwa 760 bp), das in der Größe mit jenem identisch ist, das in unbehandelten Zellen mit der gleichen Intensität vorkommt, ein Fragment (etwa 2,3 kb) das in der Größe mit jenem identisch ist, das in unbehandelten Zellen vorkommt, aber mit verringerter Intensität im PCR-Clon vorliegt, und ein zusätzliches Fragment, etwa 4,2 kb groß, der Größe, die für einen homologen Rekombinationsvorgang vorausgesagt worden war, welches nur in den positiven PCR-Clonen vorliegt. In ähnlicher Weise führt die Ersetzung der J-Gene durch das Neomycin-Gen durch einen homologen Rekombinationsvorgang zu einem Verlust einer SacI-Stelle und dem Auftreten eines mit der EcoRI-PstI-Sonde nachweisbaren Fragmentes, welches etwa 570 bp kleiner als das äquivalene Fragment in dem natürlichen Locus ist (vgl. 2C). Southern-Analyse der Clone durch SacI-Spaltung ergab das erwartete Muster von einem natürlichen und einem angezielten Allel: ein etwa 4,0 kb großes Fragment, in der Größe identisch mit jenem, das in unbehandelten Zellen nachgewiesen wird, aber von verminderter Intensität in den 5 positiven Clonen, und ein weiteres Fragment mit einer Größe von etwa 3,4 kb, der Größe, die für einen angezielten homologen Rekombinationsvorgang vorausgesagt worden ist, das nur in den identifizierten Clonen vorkommt. Rehybridisierung der Southern-Blots mit einer Sonde für das Neomycin-Gen zeigte, dass nur die 4,2 kb und 3,4 kb großen Fragmente, die aus der Spaltung mit HindIII beziehunsweise SacI entstanden sind, mit der Sonde hybridisierten, wie für den Vorgang des Anzielens vorausgesagt worden ist.
  • D. Erzeugung von chimären Mäusen mit JH-Deletionen
  • Drei und einen halben Tag alte Blastocysten von C57BL/6J-Mäusen (Jackson Laborstories, Bar Harbor, ME) wurden aus 4–5 Wochen alten superovulierten weiblichen Mäusen gewonnen, wie von Koller, et al. 1989 (vorstehend), beschrieben. Die ES-Zellen wurden mit Trypsin behandelt, einmal mit frischem DMEM-Kulturmedium gewaschen und auf etwa 1 × 106/ml in DMEM-Kulturmedium, das 10% fötales Rinderserum und 20 mM HEPES, pH-Wert 7,5 enthielt, verdünnt. 10 bis 15 Zellen wurden in das Blastozoel jeder Blastozyste injiziert. ES-Zellen, die Blastozysten enthielten, wurden dann operativ in ein Uterushorn von pseudoträchtigen weiblichen C57BU6J X DBA/2- oder C57BU6J X CBA F1-Mäusen übertragen.
  • Der Beitrag der ES-Zellen zum Nachwuchs wurde visuell abgeschätzt, indem die Fellfarbe der Jungen untersucht wurde. C57BU6J-Mäuse sind vollkommen schwarz. Die Elternlinie der ES-Zellen, E14TG2a, wurde aus 129/Ola-Embryos isoliert, die drei Gene für die Fellfarbe besitzen, das dominante AW-Allel am Agouti-Locus, das rezessive pink-eyes-dilute-Allel am p-Locus und das rezessive Cch am c-Locus. Chimäre Nachkommen, bei denen die ES-Zellen Anteil an der Bildung des Tieres haben, haben Felle, die agouti- und cremefarbene Haare aufweisen.
  • Die Fähigkeit zur Übertragung über die Keimbahn bei den chimären Mäusen wurde durch Paarung mit einer C57BU6J-Maus und Suchen von agouti-farbenen F1-Nachkommen untersucht. Es wurde erwartet, dass 50% dieser Agouti-Mäuse das mutierte Allel für die schwere Kette in sich tragen, welches durch Southern-Blot-Analyse von DNA, die aus Schwänzen isoliert wird, identifiziert werden können.
  • Die JH-angezielte ES-Zelllinie ES65-1, die ein angezieltes Allel für die schwere Kette trägt, wurde in Blastozysten von C57BU6J-Mäusen injiziert. Etwa 45% der überlebenden Jungen waren Chimären. Zwei weibliche Chimären, 238-2 und 244-3, zeigten bei Paarung mit männlichen C57BL/6J-Mäusen Übertragung über die Keimbahn mit einer Häufigkeit von 100% und 15%, bestimmt durch den Prozentsatz an Agouti-Nachkommen. Southern-Blot-Analyse von DNA von heterozygoten Nachkommen zeigte die Anwesenheit der angezielten schweren Kette in Ergänzung zu einem natürlich vorkommenden Allel in 2 von 5 getesteten Agouti-Nachkommen.
  • Mäuse, die homozygot für die Mutation waren, wurden durch Kreuzen von männlichen und weiblichen Mäusen erhalten, die als JH-deletierte (δJH) Heterozygote identifiziert worden waren. Nachkommen dieser Paarungen wurden mit Hilfe der Southern-Blot-Analyse auf die Anwesenheit der beiden angezielten Allele für die schwere Kette untersucht.
  • E. Analyse von B-Zellen von chimären Mäusen
  • Wenn die Deletion der JH-Region ausreicht, um den Locus für die schwere Kette zu inaktivieren, sollte daraus eine vollständige Blockade der Entwicklung von IgM exprimierenden B-Zellen und der Produktion von Antikörpern resultieren. Mäuse, die für den JH-Locus heterozygot sind, tragen ein intaktes und funktionales Allel für die schwere Kette, das von dem C57BL/6J-Elternteil stammt, und ein JH-deletiertes Allel für die schwere Kette, das von den ES-Zellen stammt (129/Ola-Stamm). Die 129- und B6-Stämme unterscheiden sich in den Allotypen der schweren Ig-Kette. Die von ES stammenden B-Zellen (IgMa-Allotyp) können von den von B6 stammenden B-Zellen (IgMb-Allotyp) mit Allotyp-spezifischen monoclonalen Antikörpern unter Verwendung von durchflusszytometrischer Analyse von Antikörper exprimierendem B unterschieden werden.
  • Die Spezifität dieser Antikörper wird in 3(A–C) dargestellt. Lymphocyten aus dem peripheren Blut wurden mit Antikörpern gegen die B-Zell-spezifische Markierung, B220, und mit Antikörpern gegen den IgM-Allotyp angefärbt. B-Zellen von C57BL/6J-Mäusen wurden mit Antikörpern angefärbt, die gegen den IgMb-Allotyp, aber nicht gegen den IgMa-Allotyp gerichtet waren (3B). B-Zellen, die von 129/Ola-Mäusen stammten, wurden mit Antikörpern gegen den IgMa-Allotyp, aber nicht den IgMb-Allotyp angefärbt (3A). In heterozygoten (a/b F1) Mäusen, die ein intaktes, von ES stammendes Allel für die schwere Kette und ein intaktes, von C57BL/6J stammendes Allel trugen, waren beide Allotypen in gleichen Mengen vorhanden (3C).
  • Wenn B-Zellen von Mäusen, die heterozygot für die JH-Deletion waren, analysiert wurden, bei denen das JH-deletierte Allel für die schwere Kette vom 129/Ola-Elternteil stammte, gab es keine Zellen, die positiv für den IgMa-Allotyp waren. Alle B-Zellen waren positiv für IgMb, vom intakten C57BU6J-Alle) für die schwere Kette (3D). Diese Ergebnisse zeigten, dass der JH-deletierte Locus für die schwere Kette inaktiviert ist und keinen funktionalen IgM-Antikörper codieren kann.
  • Mäuse, die homozygot für die JH-Deletion waren, wurden ebenfalls auf die Fähigkeit analysiert, funktionale Antikörper zu produzieren. Lymphocyten aus dem peripheren Blut von homozygot mutierten Mäusen wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert, indem Antikörper gegen die B-Zell-spezifische Markierung B220 und die für den Allotyp spezifischen Markierungen verwendet wurden (vgl. 4). Im Gegensatz zu den Kontrollmäusen (4D–F) konnten in den mutierten Mäusen keine B220+-Zellen oder IgM produzierende Zellen nachgewiesen werden (4A–C). Zusätzlich befand sich bei den mutierten Mäusen kein nachweisbares IgM im Serum. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Deletion der JH-Region von beiden Allelen für die schwere Kette zu vollständiger Hemmung der Entwicklung der B-Zellen zu reifen B-Zellen und der Produktion von Antikörpern führt.
  • F. Bildung von homozygoten ES-Zellen
  • Die Wirkung einer JH-Deletion auf B-Zellen kann auch analysiert werden, indem ES-Zellen erzeugt werden, bei denen beide Allele für die schwere Kette angezielt werden, welche dann zur Produktion von chimären Mäusen verwendet werden, die eine Population an lymphoiden Zellen beinhalten, die homozygot für die Mutation ist.
  • Homozygote, δJH-mutierte ES-Zellen wurden erzeugt, indem einer der heterozygot mutierten ES-Clone, ES110-1, erhöhten Spiegeln an G418 ausgesetzt wurde (1,4 mg/ml), wodurch die Homogenisierung der angezielten Allele selektiert wird. Sieben der überlebenden Kolonien wurden mit Hilfe der Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von Spaltung mit SacI auf den Verlust des Wildtyp-Alleles für die schwere Kette und die Akquisition eines zweiten angezielten Allels durchmustert. Es zeigte sich, dass einer dieser Clone, ESDK207, das natürlich vorkommende Allel für die schwere Kette verloren hatte, was sich dadurch zeigte, dass Sonden nicht in der Lage waren, das 4,0 kb große Fragment des Wildtyps nachzuweisen, und dass die Intensität des 3,4 kb großen angezielten Fragmentes erhöht war. Karyotypische Analyse von ESDK207 zeigte, dass wie bei der Elternlinie ES110-1 etwa 80% der Zellen 40 Chromosomen aufwiesen, was nahe legte, dass es zwei angezielte Allele gab. Die homozygot mutierten ES-Zellen wurden in C57BL/6J-Blastozysten mikroinjiziert, und chimäre Mäuse wurden erzeugt.
  • G. Analyse von B-Zellen aus homozygoten Chimären
  • B-Zellen von chimären Mäusen wurden analysiert, um die Wirkung der JH-Deletion auf die Entwicklung von B-Zellen und die Produktion von Antikörpern zu untersuchen. Lymphocyten aus der ES-Zelllinie (129/Ola) können von Blastozystenstämmigen(C57BL/6J-)Lymphocyten durch einen monoclonalen Antikörper gegen die Ly-9.1-Markierung, die auf Lymphozyten mit 129-Abstammung, aber nicht auf jenen mit B6-Abstammung angetroffen wird, unterschieden werden. Zusätzlich unterscheiden sich die beiden Stämme in ihrem IgM-Allotyp, wie vorstehend beschrieben wurde.
  • Die analysierten Chimären stammten von E14TG2a-ES-Zellen des Wildtyps (WT) oder von ES-Zellen, die heterozygot (ES110-1, ES65-1) oder homozygot (ESDK207) für die angezielte JH-Region waren. Mononukleare Zellen aus dem peripheren Blut wurden mit Antikörpern gegen die B-Zell-spezifische Markierung 6220 und mit Antikörpern entweder gegen Ly-9.1- oder gegen IgM-Allotypen angefärbt und dann mit Hilfe der Zweifarben-Durchflusszytometrie analysiert. Um das Vorkommen von Chimären in den T-Zelllinien zu untersuchen, wurden die Zellen mit Antikörpern gegen die T-Zell-Markierung Thy 1.2 und mit anti-Ly-9.1-Antikörpern angefärbt. Das Anfärben von Zellen der elterlichen Mäusestämme lieferte die Kontrollen für die Spezifität und Sensitivität der Untersuchung.
  • Mäuse mit einem ähnlichen Grad an Chimärismus, bewertet nach der Farbe des Fells, wurden miteinander verglichen. ES-stämmige B- und T-Zellen wurden im peripheren Blut von chimären Mäusen, die aus den E14TG2a-ES-Zellen des Wildtyps erzeugt worden waren, nachgewiesen, was die Fähigkeit dieser Zelllinie bestätigte, lymphoide Zellen in vivo zu bilden. Die Analyse der Chimären, die aus einmalig JH-angezielten ES65-1- und ES110-1-Zellen erzeugt worden waren, ergab die Anwesenheit von 6220+/IgMa+/Ly-9.1+-B-Zellen, die einen einzelnen, intakten, ES-Zell-stämmigen Locus für die schwere Ig-Kette enthielten.
  • Im Gegensatz zu den Chimären mit WT- und Einzel-Deletion fehlten den Mäusen, die aus der homozygoten, mutierten ESDK207-Zelllinie erzeugt worden waren, Ly-9.1+/6220+- oder IgMa +/B220+1-B-Zellen im peripheren Blut. Das beobachtete Fehlen von ESDK207-stämmigen B-Zellen war nicht auf ein Fehlen der Lymphopoiese zurückzuführen, da ES-stämmige Ly-9,1+/B220+-Zellen 12% des gesamten Pools an mononuklearen Zellen im peripheren Blut ausmachten. Von diesen waren etwa die Hälfte Thy-1.2+-T-Zellen. Daher blockiert die Deletion der JH-Region auf beiden Allelen die Entwicklung von reifen IgMa produzierenden B-Zellen. Ähnliche Beobachtungen wurden bei chimären Milzzellen gemacht.
  • Die Chimären wurden auch auf die Anwesenheit von Serum-IgM, das von den ES-Zellen stammt, untersucht. IgMa-Spiegel waren bei Chimären von ES-Zellen des Wildtyps und bei Zellen mit einer angezielten Einzelmutation hoch, bei Mäusen aber, die von der ESDK207-Zelllinie abstammten, nicht nachzuweisen.
  • Weitere Analyse ergab, dass das Knochenmark von ESDK207-Mäusen normale IgMb +-B-Zellen enthielt, die von dem Wirtsorganismus der Blastozyste stammten, dass aber ES-stämmige IgMa +-B-Zellen fehlten. DK207-stämmiges Knochenmark enthielt jedoch eine Population an Zellen, die B220dull/Ly-9.1+ waren und von den ES-Zellen stammten. Vermutlich enthält das Knochenmark daher eine Subpopulation an von den ES-Zellen stammende B-Zell-Vorläuferzellen, deren Reifung durch die homozygote Deletion der JH-Region blockiert wird.
  • Die Knochenmarkzellen wurden auch mit Hilfe der Dreifarben-Durchflusszytometrie unter Verwendung der Antikörper gegen Ly-9.1, B220 und entweder CD43 oder Thy-1.2 analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Mehrheit der ES-stämmigen Zellen CD43-positiv war, was mit einer frühen Blockierung der Reifung übereinstimmt. Viele der Zellen waren auch positiv für Thy-1.2, wie für sehr frühe B-Zell-Vorläuferzellen erwartet werden würde. Diese Daten zeigen, dass das Deletieren der JH-Region dazu führt, dass der Locus für die schwere Kette nicht in der Lage ist, sich neu zu ordnen und funktionales IgM zu produzieren. Das Fehlen einer IgH-Neuordnung führt zu einer Blockierung der Reifung von B-Zellen, wodurch die B-Zell-Vorläufer auf einem frühen Entwicklungsstand zurückgehalten werden.
  • BEISPIEL III
  • Deletion der konstanten Region (Ca) der leichten Ig-kappa-Kette der Maus
  • A. Konstruktion des anzielenden Vektors zur Ersetzung
  • Die kappa-Region wurde mit einem Vektor des Ersetzungstyps inaktiviert, der entworfen wurde, um die konstante Region des kappa-Locus zu deletieren und sie durch homologe Rekombination mit der G418-Wirkstoff-Resistenzmarkierung zu ersetzen. Die homologe Rekombination wurde durch Homologie-Regionen gesteuert, die die konstante Region flankieren (vgl. 5).
  • Eine genomische Bibliothek einer fötalen Leber-DNA einer 129/Ola-Maus (Stratagene), die in einen lambda-Phagen cloniert worden war, wurde auf die Anwesenheit des Ck-Gens der Maus mit einem 1,6 kb großen HpaI/BamHI-Fragment (Steinmetz und Zachau (1980) Nucleic Acids Research 8: 1693–1706), das die konstante kappa-Region der Maus umspannt, durchmustert. Ein lambda-Phagen-Clon, der mit dieser Sonde hybridisierte, wurde identifiziert, dann gereinigt und als Quelle für Ck-DNA verwendet. Die Analyse der Phagen-DNA zeigte, dass die Sonde für die konstante kappa-Region mit einem 5,6 kb großen SphI/BamHI-Fragment hybridisierte. Dieses Fragment enthielt die Gene der kappa-J-Region, ein Intron-Enhancer-Element und die konstante kappa-Region. Es wurde dann isoliert und in die SphI- und BamHI-Stellen des Plasmids pUC218 subcloniert, um das Plasmid pUC218/5,6kappa zu ergeben.
  • Um den Deletionsvektor zu konstruieren, wurden Fragmente, die die 5'-Region der konstanten kappa-Region, ein Thymidinkinase-Gen zur negativen Selektion, ein Gen für Neomycin-Resistenz und eine 3'-Homologieregion zur konstanten kappa-Region enthielten, miteinander ligiert (vgl. 6).
  • Ein 4,0 kb großes SphI/Bsu361-Fragment vom Plasmid pUC218/5.6kappa wurde in die SphI- und Bsu361-Stellen des Vektors pSK.A cloniert, um das Plasmid pSK.A/5'K zu ergeben. Der Vektor pSK.A ist eine Modifikation von pBluescript SK-, welcher einen synthetischen Polylinker besitzt:
    Figure 00470001
    welcher zwischen die KpnI- und SacI-Stellen von pBluescript inseriert ist.
  • Ein 2,7 kb großes EcoRI/HindIII-Fragment, das das Gen für die Herpes-Thymidinkinase (TK), gesteuert durch den Promotor für das Phosphoglyceratkinase-Gen (PGK) der Maus von Plasmid pKJtk (Tybulewicz, et al. (1991), Cell 65: 1153–1163) enthielt, wurden in die EcoRI- und NotI-Stellen von pSK.A/5'K inseriert, indem ein HindIII/NotI-Adapter mit der Sequenz verwendet wurde:
    Figure 00470002
    In dem entstandenen Plasmid, pSK.A/5'K/TK sind das 5'-Ende des TK-Gens und das Gen für die konstante kappa-Region einander in gegenläufiger transkriptionaler Orientierung benachbart.
  • Ein 1,1 kb großes XhoI/BamHI-Fragment von pMC1Neo, welches den selektierbaren Markierungswirkstoff bei Säugern für Resistenz gegen Neomycin enthielt, wurde in die XhoI- und BamHI-Stellen des Plasmids pSK.B cloniert, um das Plasmid pSK.B/Neo zu ergeben. Der Vektor pSK.B ist eine Modifikation von pBluescript SK-, der einen synthetischen Polylinker besitzt:
    Figure 00470003
    welcher zwischen den KpnI- und SacI-Stellen von pBluescript inseriert ist.
  • Ein 1,1 kb großes BglII/BamHI-Fragment von pUC218/5.6kappa, das Homologie zum 3'-Ende der kappa-Region beinhaltet, wurde in den mit BamHI gespaltenen, mit alkalischer Phosphatase behandelten pSK.C-Vektor cloniert. Der Vektor pSK.C ist eine Modifikation von pBluescript SK-, welcher einen synthetischen Polylinker besitzt:
    Figure 00470004
    welcher zwischen den KpnI- und SacI-Stellen von pBluescript inseriert ist. Das entstandene Plasmid, pSK.0/3'K ist in der Weise ausgerichtet, dass sich die Transkription von der SacI-Stelle in dem Plasmid-Polylinker in Richtung der KpnI-Stelle fortsetzt.
  • Das endgültige anzielende Plasmid wurde durch eine Ligierung von drei Teilen konstruiert, indem (A) das 6,1 kb große NotI/NdeI-Fragment von pSK.A/5'KTTK, (B) das 1,2 kb große NdeI/SacI-Fragment von pSK.B/Neo und (C) das 4,0 kb-SacI/NotI-Fragment von pSK.C/3'K ligiert wurden, um das Plasmid pK.TK/neo zu erzeugen.
  • B. Elektroporation des kappa-Deletionsvektors in ES-Zellen
  • Gereinigte Plasmid-DNA von pK.TK/Neo wurde mit PvuI geschnitten, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde nach der Fällung mit einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA resuspendiert.
  • Die embryonalen Stammzelllinie E14-1, ein Subclon von E14 (Hooper, et al. (1987), Nature 326: 292–295) wurde in DMEM 4,5 g/l Glucose (J. R. H. Biosciences), ergänzt mit 15% Hitze-inaktiviertem fötalen Kälberserum, rekombinantem murinem Leukämie-Inhibitionsfaktor (ESGRO von Gibco BRL, 1000 E/ml), 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin und 100 E/ml Penicillin, bei 37°C in 5% CO2 kultiviert.
  • Die Zellen wurden auf mit Mitomycin behandelten, primären embryonalen Fibroblasten-Nährschichten im Wesentlichen, wie beschrieben (Koller und Smithies (1989), vorstehend), kultiviert. Die embryonalen Fibroblasten wurden aus Embryos vom Tag 14, die die homozygot angezielte β2-Mikroglobulin-Mutation trugen, hergestellt (Koller und Smithies (1990), Science 248: 1227–1230). Diese Nährzellen sind in der Lage, in Kulturmedien zu wachsen, die G418 enthalten.
  • Bei 80% Konfluenz wurden die ES-Zellen durch Behandlung mit Trypsin, Konzentration durch kurzes Zentrifugieren und Resuspension in mit HEPES gepufferter Kochsalzlösung zu 2 × 107 Zellen/ml auf die Elektroporation vorbereitet. Die Zellen werden bei Zimmertemperatur äquilibriert, und linearisierte DNA des anzielenden Vektors (20 μg) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde bei 960 μF und 250 V mit einem BioRad-Gene-Pulser der Elektroporation unterzogen. Man ließ die Zellen bei Zimmertemperatur über 10 Minuten stehen, bevor sie auf 4 × 10 cm-Schalen über mit Mitomycin behandelte Fibroblasten-Nährzellen (3 × 106 Nährzellen/Schale) plattiert wurden. Nach der Inkubation bei 37°C über 48 Stunden wurde den Zellen ein Kulturmedium zugesetzt, das 150 μg/ml G418 enthielt, um auf Neomycin-Resistenz zu selektieren. Nach weiteren 48 Stunden wurde den Zellen Kulturmedium zugesetzt, das 150 μg/ml G418 und 2 μM Gancyclovir (Syntex) enthielt, um auf Verlust des Gens für Thymidinkinase zu selektieren.
  • C. Analyse von angezielten ES-Zellen
  • Nach Wirkstoff-Selektion über zehn Tage, sowohl mit G418 als auch mit Gancyclovir, wurden die individellen überlebenden Kolonien aufgenommen und mit einem Tropfen Trypsin auf einer Platte mit 96 Vertiefungen dissoziiert, dann bei 37°C über 2 Minuten inkubiert. Die Zellen aus jeder einzelnen Kolonie wurden in eine Vertiefung auf einer Platte mit 24 Vertiefungen übertragen, die mit Mitomycin-C behandelte Nährzellen und selektive Kulturmedien mit G418, aber ohne Gancyclovir enthielten. Nach weiteren 5–8 Tagen wurden 20% der Zellen aus jeder Vertiefung tiefgefroren, und die restlichen wurden zur Herstellung von genomischer DNA verwendet. Die Zellen wurden mit 0,4 ml 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS und Proteinase K (1 mg/ml) durch Inkubation bei 50°C über nacht lysiert. Die DNA wurde durch Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung gereinigt, dann mit 70% Ethanol gewaschen und in 20 μl 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA resuspendiert.
  • Southern-Analyse wurde unter Verwendung von mit BglII gespaltener genomischer DNA aus jeder Probe durchgeführt. Ein etwa 1,2 kb großes BamHI/BglII-Fragment, das die Region enthält, die sich an das 3'-Homologie-Fragment in dem anzielenden Vektor anschließt, wurde als Sonde verwendet. Der natürlich vorkommende ES-Zell-Locus ergab ein etwa 2,3 kb großes Fragment, während der angezielte ES-Zell-Locus ein etwa 5, 7 kb großes Fragment ergab. Der Größenzuwachs ist auf den Verlust einer BglII-Stelle während der Konstruktion des Deletionsvektors zurückzuführen.
  • Eine Southern-Analyse von 166 Clonen zeigte zwei Zelllinien, die die beabsichtigte Mutation besaßen. Diese Clone wurden weiter analysiert, indem die Filter erneut mit einem etwa 1,1 kb großen Fragment sondiert wurden, welches das neo-Gen umspannte. Wie erwartet, hybridisierte die Sonde lediglich mit dem angezielten Allel.
  • Weitere Analyse der genomischen DNA aus den beiden positiven Clonen, 1L2-850 und 1L2-972, bestätigte, nachdem sie aufgetaut und expandiert worden waren, wiederum die anfänglichen Beobachtungen. Eine dritte Sonde, ein etwa 1,7 kb großes HindIII/BglII-Fragment, welches den Locus der kappa-J-Region umspannte, wurde verwendet, um das korrekte Integrationsmuster vom 5'-Ende des anzielenden Vektors zu überprüfen. Unter Verwendung dieser Sonde bei genomischer DNA, die mit EcoRI gespalten worden war, ist ein etwa 15 kb großes Fragment in dem natürlich vorkommenden Allel und ein etwa 5 kb großes Fragment von dem angezielten Locus nachgewiesen worden. Die zusätzliche EcoRI-Stelle wird durch das neo-Gen während der anzielenden homologen Rekombination eingeführt (vgl. 7).
  • D. Erzeugung von Keimbahn-Chimären
  • Es ist herausgefunden worden, dass die nicht modifizierten E14-1-Zellen nach Injektion in C57BL/6J-Blastozysten mit einer hohen Häufigkeit zur Keimbahn beitragen. Um Keimbahn-Chimären zu erzeugen, die die angezielte kappa-Region enthalten, wurden die angezielten Zelllinen 1L2-850 und 1L2-972 auf primären Nährzellen gezüchtet, dann mit Trypsin behandelt und in Injektionsmedium resuspendiert, welches aus DMEM, ergänzt mit 15% fötalem Kälberserum, 20 mM HEPES (pH-Wert 7,3), Antibiotika und β-Mercaptoethanol, bestand. Die ES-Zellen wurden in jede Blastozyste injiziert, und die injizierten Blastozysten wurden dann in ein Uterushorn einer pseudoträchtigen weiblichen Maus übertragen. Chimäre Junge wurden durch chimäre Fellfärbung identifiziert. Chimäre männliche Mäuse wurden mit weiblichen C57BL/6J-Mäusen gekreuzt, und Übertragung der von 129/Ola stammenden ES-Zellen über die Keimbahn wurde durch die Agouti-Fellfärbung des Nachwuchses identifiziert.
  • Eine chimäre männliche Maus aus der Zelllinie 1L2-972 (zu etwa 40% von ES-Zellen abstammend, auf Grund seiner Fellfärbung abgeschätzt) ergab bei Paarung mit weiblichen C57B1/6J-Mäusen eine Keimbahn-Übertragung mit einer Häufigkeit von 25%, wie durch den Prozentsatz an Agouti-Nachkommen bestimmt wurde. Chimäre männliche Mäuse von der Zelllinie 1L2-850, die zu etwa 40%, 70% und 90% chimär waren, ergaben Keimbahn-Übertragungen mit Häufigkeiten von 90%, 63% bzw. 33%. Es stellte sich durch Southern-Analyse (BglII-Verdau unter Verwendung des vorstehend beschriebenen 1,2 kb großen BamHI/BglII-Fragmentes als eine Sonde) unter Verwendung von genomischer DMA, die aus Schwanz-Proben stammte, heraus, dass unter den Agouti-Nachkommen, die von den 70% chimären männlichen Mäusen von 1L2–850 erzeugt wurden, acht F1-Tiere von 12 getesteten heterozygot am kappa-Locus für die angezielte CK-Mutation waren. Weitere Kreuzung einer männlichen mit einer weiblichen Maus aus dieser Gruppe von 8 F1-Tieren, die beide heterozygot für die CK-Mutation waren, ergab einen männlichen Nachkommen, der sich als homozygot für diese Mutation herausstellte, was durch Southern-Analyse bestätigt wurde.
  • E. Analyse von B-Zellen aus Mäusen, deren kappa-Locus angezielt worden war
  • Wenn der Locus der leichten kappa(κ)-Kette durch Deletion der konstanten Region der leichten Kette (Cκ), der verbindenden Region (Jκ) oder beider, Cκ und Jκ, inaktiviert ist, sollte daraus eine vollständige Blockierung der Entwicklung der κ exprimierenden B-Zellen resultieren. Embryonale Stammzellen der Maus, die eine einzelne Kopie der vollständigen Cκ-Deletion (ΔCκ) enthielten, wurden in Blastozysten der Maus eingeführt, wie vorstehend beschrieben, um chimäre Mäuse hervorzubringen. Diese chimären Mäuse wurden dann mit C57BL/6(B6)-Mäusen des Wildtyps gekreuzt, und die F1-Nachkommenschaft wurde durch Southern-Blot-Analyse von Schwanz-DNA auf Anwesenheit der ΔCκ-Mutation untersucht. F1-Mäuse, die die ΔCκ-Mutation trugen, wurden gekreuzt, und der F2-Nachwuchs wurde auf ähnliche Weise auf ΔCκ untersucht. Es zeigte sich, dass einer der 5 F2- Nachkommen eine homozygote Cκ-Deletion trug, und ein anderer war heterozygot, sowohl ΔCκ als auch ein Cκ-Allel des Wildtyps tragend. Die drei anderen Nachkommen waren vom Wildtyp. Das Vorhandensein oder Fehlen von κ-positiven B-Zellen wurde durch durchflusszytometrische Analyse von B-Zellen aus dem peripheren Blut untersucht, die mit fluoreszierenden Antikörpern, die mit einer pan-B-Zell-Markierung (8220) oder mit der leichten κ-Kette reagierten, angefärbt worden waren. Bei den homozygoten ΔCκ-F2-Mäusen wurden keine κ-positiven B-Zellen nachgewiesen, und bei den heterozygoten gab es eine Reduktion in der Häufigkeit von κ-positiven B-Zellen, übereinstimmend mit der Anwesenheit von einem Wildtyp-Allel und einem nicht funktionalen ΔCκ-Allel. Diese Ergbnisse zeigen, dass die Deletion von Cκ vom Chromosom die κ-Expression durch B-Zellen der Maus verhindert.
  • BEISPIEL IV
  • Inaktivierung der J- und konstanten Region der leichten Immunglobulin-kappa-Kette der Maus
  • A. Entwurf des Experimentes zur Anzielung
  • Der anzielende Vektor wurde anfänglich als ein Vektor des Ersetzungstyps entworfen, um sowohl die konstante Region als auch die J-Region des kappa-Locus zu deletieren und sie unter Verwendung von Homologie-Regionen, die die konstante Region flankierten, durch homologe Rekombination durch drei Elemente zu ersetzen (8). Ein Gen für das Diphtherie-Toxin (A-Kette), das eine oder beide Homologie-Regionen flankierte, wurde in einigen Fällen als eine negative selektierbare Markierung eingeführt. Die drei Elemente bestanden aus der G418-Resistenz-Wirkstoffmarkierung und einer zusätzlichen DNA-Homologie (ADH)-Sequenz aus Maus-DNA, die homolog zu einer Region des kappa-Locus ist, die stromaufwärts der J-Region liegt, und einem Gen für Thymidinkinase. Als ein Ergebnis des Einschlusses der ADH-Sequenz in den Vektor brachte dieses anfängliche Anzielen eine zweite Kopie der ADH in den Locus ein. Diese Duplizierung wurde dann verwendet, um durch Anwendung von selektivem Druck eine definierte Deletion der Sequenzen zwischen den Segmenten vorzunehmen. In diesem Fall deletiert die Zelle das Gen für Thymidinkinase, das zwischen den beiden Segmenten liegt, um die Selektion mit Gancyclovir zu überleben.
  • B. Konstruktion des anzielenden Vektors
  • Die Homologie-Regionen wurden aus einer genomischen Bibliothek einer fötalen Leber aus einer 129-Maus (Stratagene) abgeleitet, die unter der Verwendung von zwei Sonden durchmustert wurde, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben wurde. Dieser Subclon enthielt die J-Region, ein Enhancer-Element als Intron und die konstante Region des Locus für die leichte κ-Kette. Die zweite Sonde war ein 0,8 kb großes EcoRI-Fragment (Van Ness et al. (1981), Cell 27: 593–602), das 2,8 kb stromaufwärts der J-Region liegt. Phagen-DNA von einem lambda-Clon, der positiv für diese Sonde ist, zeigte, dass die Sonde mit einem 5,5 kb großem SacI-Fragment hybridisierte, das in die SacI-Stelle von pBluescript SK- (Stratagene) subcloniert wurde, um das Plasmid pSK.5'kappa zu ergeben (8).
  • Die Inaktivierungsvektoren, die eine 5'-Homologie-Region, ein Gen für Thymidinkinase, eine ADH, ein Gen für Neomycin-Resistenz und eine 3'-Homologie-Region (9) enthielten, in einigen Fällen von Genen für Diphtherie-Toxin flankiert, wurden aus drei Plasmiden konstruiert (8), die enthielten: (a) das 5'-Homologie-Fragment mit dem oder ohne das Gen für Diphtherie-Toxin (DT), gesteuert durch den Promotor des Gens für Phosphoglyceratkinase (PGK) der Maus als eine negative selektierbare Markierung, (b) das Herpes-Gen für Thymidinkinase (tk), gesteuert durch den Promotor des Gens für Phosphoglyceratkinase (PGK) der Maus als eine negative selektierbare Markierung zusammen mit dem DSH- und dem selektierbaren G418-Neomycin(neo)-Gen von pMC1Neo (Thomas und Capecchi (1987), Cell 51: 503–12) und (c) das 3'-Homologie-Fragment mit oder ohne die PGK-gesteuerten DT-Gene. Diese drei Plasmide (8) wurden aus pSK.A, pSK.B beziehungsweise pSK.C konstruiert, die alle durch Modifikation des Polylinkers vom Plasmid pBluescript SK- abstammten.
  • Der Polylinker des Plasmids pBluescript SK- wurde modifiziert, indem zwischen die KpnI- und SacI-Stellen ein synthetischer Polylinker cloniert wurde, definiert durch die Oligonucleotide
    Figure 00540001
    um das Plasmid pSK.A zu erzeugen,
    Figure 00540002
    um Plasmid pSK.8 zu erzeugen,
    Figure 00540003
    um Plasmid psK.B zu erzeugen und
    Figure 00540004
    um das Plasmid pSK.C zu erzeugen.
  • Eine Kassette mit dem Gen für Diphtherie-Toxin wurde erzeugt, in der das Gen durch den PGK-Promotor und das Polyadenylierungssignal für das Rinder-Wachstumshormon flankiert wurde (Woychik et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3944–3948; Pfarr et al. (1986), DNA 5: 115–122). Ein 2,3 kb großes XbaI/EcoRI-Fragment von pTH-1 (Maxwell et al. (1986), Cancer Res. 46: 4660–4664), das die A-Kette des Diphtherie-Toxins, gesteuert durch den menschlichen Metallothionein(hMTII)-Promotor, enthielt, wurde in pBluescript SK–, das mit XbaI und EcoRI geschnitten worden war, cloniert, um das Plasmid pSK.DT zu ergeben. Der hMTII-Promotor von pSK.DT wurde durch den PGK-Promotor von pKJ1 ersetzt (Tybulewicz et al. (1991), Cell 65: 1153–1163). Ein 0,5 kb großes XbaI/PstI-Fragment von pKJ1 wurde mit einem 3,1 kb großen XbaI/NcoI-Fragment von pSK.DT verbunden, wobei ein PstI/NcoI-Adapter verwendet wurde, der aus den Oligonucleotiden
    Figure 00540005
    gebildet wurde, um das Plasmid pSK.pqkDT zu ergeben. Ein 248 bp großes Fragment, das das Polyadenylierungssignal für das Rinder-Wachstumshormon enthielt, das durch PCR-Amplifizierung von genomischer Rinder-DNA unter Verwendung der Oligonucleotid-Primer
    Figure 00550001
    erhalten worden war, wurde in pCR1000 (Invitron Corp., San Diego, Ka.) cloniert. Die Polyadenylierungssequenz wurde dann hinter das DT-Gen als ein HindIII/PvuII-Fragment in pSK.pgkDT, das mit HindIII und HpaI geschnitten worden war, cloniert, um das Plasmid pSK.pgkDTbovGH zu ergeben. Die DT-Gen-Kassette von pSK.pgkDTbovGH wurde als ein 2,1 kb großes EcoRI/HindIII-Fragment in pSK.A, das mit EcoRI und NotI geschnitten worden war, verschoben, wobei ein HindIII/NotI-Adapter verwendet wurde, der aus den Oligonucleotiden
    Figure 00550002
    gebildet worden war, um das Plasmid pSK.A/DT zu ergeben. Zwischen die SphI- und Bsu361-Stellen von sowohl pSK.A als auch pSK.A/DT wurde die 5'-Homologie-Region für den kappa-Locus cloniert. Für diesen Zweck wurde ein 4,0 kb großes SphI/Bsu361-Fragment, das aus einer partiellen Bsu361-Spaltung gefolgt von einer vollständigen SphI-Spaltung des Plasmid-Subclons pUC218/5.6kappa entstanden war, in pSK.A oder pSK.A/DT ligiert, um die Plasmide pSK.A/5'K beziehungsweise pSK.A/DT/5'K zu ergeben. In dem Plasmid pSK.A/DT/5'K waren die 5'-Enden des DT-Gens und des kappa-Fragmentes aneinander mit gegenläufigen transkriptionalen Orientierungen benachbart.
  • Das PGKtk-Gen vom Plasmid pKJtk (Tybulewicz et al. (1991), Cell 65: 1153–1163) wurde als ein 2,7 kb großes EcoRI/HindIII zwischen die einzigen EcoRI- und HindIII-Stellen von pSK.B cloniert, um pSK.B/TK zu ergeben. Ein 0,8 kb großes EcoRI-Fragment, das für die ADH verwendet wurde, wurde von pSK.5'kappa cloniert und in die EcoRI-Stelle von pSK.B/TK ligiert, um pSK.B/(TK/0,8K) zu ergeben, so dass das 5'-Ende des tk-Gens und des kappa-Fragmentes einander mit gegenläufigen transkriptionalen Orientierungen benachbart waren. Das 1,1 kb große neo-Gen von pMC1Neo wurde als ein XhoI/BamHI-Fragment zwischen die gleichen Stellen von pSK.B/(TK/0,8K) cloniert, um pSK.B/(TK/0,8K/Neo) zu ergeben. Das Plasmid pSK.0/3'K, das das 3'-Homologie-Fragment enthielt, wurde konstruiert, indem pSK.C, gespalten mit BamHI und mit alkalischer Phosphatase behandelt, an das 1,1 kb große BglIII/BamHI-Fragment ligiert wurde, das aus 1UC218/5.6kappa isoliert worden war. In pSK.0/3'K war das kappa-Fragment in der Weise ausgerichtet, dass die Transkription vom SacI im Plasmid-Polylinker in Richtung der KpnI-Stelle fortschritt. Die 2,1 kb große DT-Kassette von pSK.pgkDTbovGH wurde als ein EcoRI/HindIII-Fragment in die gleichen Stellen von pSK.0 cloniert, um pSK.0/3'K/DT zu ergeben.
  • Die Ligierungen der drei Teile wurde durchgeführt, um die endgültigen anzielenden Plasmide zu konstruieren (9). Das 4,0 kb große NotI/NdeI-Fragment von pSK.A/5'K, das 4,8 kb große NdeI/SacI-Fragment von pSK.B/(TK/0,8K/Neo) (erhalten durch eine partielle SacI-Spaltung, gefolgt von einer NdeI-Spaltung des Plasmids) und das 4,0 kb große SacI/NotI-Fragment von pSK.0/3'K wurden isoliert und zusammenligiert, um pK.(TK/0,8K/Neo) zu konstruieren. Das 6,1 kb große NotI/NdeI-Fragment von pSk.A/DT/5'K, das 4,8 kb große NdeI/SacI-Fragment von pSK.B/(TK/0,8K/Neo) und das 4,0 kb große SacI/NotI-Fragment von pSK.0/3'K wurden isoliert und zusammenligiert, um pK.DT/(TK/0,8K/Neo) zu erzeugen. Das 6,1 kb große NotI/NdeI-Fragment von pSK.A/DT/5/K, das 4,8 kb große NdeI/SacI-Fragment von pSK.B/(TK/0,8K/Neo) und das 6,1 kb große SacI/NotI-Fragment von pSK.0/3'K/DT (erhalten durch eine partielle SacI-Spaltung, gefolgt von einer NotI-Spaltung des Plasmids) wurden isoliert und zusammenligiert, um pK.DT/(TK/0,8K/Neo)/DT zu erzeugen. Für die Elektroporation wurden die gereinigten Plasmid-DNAs zunächst mit PvuI oder ApaLI geschnitten, dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch die Zugabe von Ethanol vor der Zentrifugation ausgefällt. Die entstandenen DNA-Pellets wurden mit einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (TE) resuspendiert.
  • C. Einführung von DNA in Zellen
  • Die embryonalen Stammzelllinie E14-1 wurde, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben, kultiviert. Die Zellen wurden bei Zimmertemperatur äquilibriert, und DNA (20 μg), linearisiert mit PvuI (wie vorstehend beschrieben), wurde zugegeben.
  • Das Gemisch wurde einer Elektroporation unterworfen, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben.
  • D. Analyse von ES-Zellen mit angezielter konstanter Region
  • Nach 7–10 Tagen unter Wirkstoff-Selektion mit G418 wurden die individuellen überlebenden Kolonien jeweils einzeln aufgenommen und in einem Tropfen Trypsin dissoziiert, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben.
  • Southern-Analyse wurde unter Verwendung von mit BglII gespaltener genomischer DNA bei jeder Probe durchgeführt. Ein 2,3 kb großes Fragment wurde bei dem natürlich vorkommenden ES-Zell-Locus nachgewiesen, während ein größeres 4,9 kb großes Fragment bei einem angezielten ES-Zell-Locus nachgewiesen wurde (11), indem als eine Sonde das 1,2 kb große BamHI/BglII-Fragment verwendet wurde, das aus der ursprünglichen Phagen-DNA zusammen mit dem Fragment, das für die 3'-Homologie in dem anzielenden Vektor verwendet worden ist, isoliert wurde. Das Fragment gewann an Größe, weil die BglII-Stelle in dem BglII/BamHI-Fragment im anzielenden Plasmid auf Grund der Bindung von einer BglII-Stelle an eine BamHI-Stelle in der Ligierung verloren ging, und eine neue BglII-Stelle, die in dem Gen für Thymidinkinase liegt, wird in den angezielten Locus eingeführt.
  • Aus einer Durchmusterung mit Hilfe der Southern-Analyse, wie vorstehend beschrieben, wurden aus einer Gesamtmenge von 103 Clonen, die aus Experimenten unter Verwendung der drei unterschiedlichen anzielenden Plasmide stammten, 5 Zelllinien identifiziert, die die beabsichtigte Mutation trugen (Tabelle 1). Tabelle 1 Ergebnis des Anzielens der leichten CK-Kette E14-1
    Konstruktion Anzahl, mit Southern-Analyse durchmustert Anzahl der bestätigten angezielten Clone Kennzeichnung der Clone Häufigkeit des Anzielens
    pK.(TK/0,8K/Neo) 44 2 625.691 1/22
    pK.DT(TK/0,8/Neo) 42 2 604.611 1/21
    pK.DT(TK0,8K/Neo)DT 17 1 653 1/17
  • Weitere Analyse der genomischen DNA, die von 4 der positiven Clone (Clone 625, 604, 611 und 653) produziert worden ist, nachdem sie aufgetaut und expandiert worden waren, bestätigte wiederum die anfänglichen Beobachtungen. Unter Verwendung einer zweiten Sonde, eines 1,7 kb großen HindIII/BglII-Fragmentes, das die J-Region des kappa-Locus umspannte, wurde das korrekte Integrationsmuster für homologes Anzielen am 5'-Ende des anzielenden Vektors überprüft. Auf diese Weise wurde unter Verwendung dieser Sonde mit einer EcoRI-Spaltung der genomischen DNA ein 15 kb großes Fragment von dem nicht modifizierten Allel nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde ein 7,8 kb großes Fragment von dem angezielten Allel als ein Ergebnis der Einführung einer neuen EcoRI-Stelle in das Gen für Thymidinkinase während der homologen Integration beobachtet (11).
  • E. In vitro-Ausschnitt der DNA der J-Region von angezielten Clonen
  • Um die gewünschte Deletion des homolog angezielten kappa-Locus zu bewirken, wurden Zellen vom Clon 653 in einer Dichte von 0,5–1 × 106 Zellen/10 cm-Schalen in Anwesenheit von sowohl Gancyclovir (2 μM) als auch G418 (150 μg/ml) auf Nährzellen plattiert. Nach Wachstum über 5 Tage in Anwesenheit von beiden Wirkstoffen wurden die Clone in Platten mit 24 Vertiefungen aufgenommen, wie vorstehend beschrieben, und unter Selektion mit G418 allein gezüchtet. Nach weiteren 5–8 Tagen wurden 20% der Zellen aus jeder Vertiefung tiefgefroren und die übrigen verwendet, um genomische DNA herzustellen, wie vorstehend beschrieben wurde.
  • F. Analyse von von J/konstanter Region deletierten ES-Zellen
  • Southern-Analyse wurde unter Verwendung von mit BamHI gespaltener genomischer DNA aus jeder Probe durchgeführt. Bei Verwendung des 0,8 kb großen EcoRI-Fragmentes, das als das ADH in den anzielenden Vektoren verwendet wurde, als eine Sonde, wurde ein 12,7 kb großes Fragment vom natürlich vorkommenden ES-Zell-Locus nachgewiesen, während ein größeres 15,8 kb großes Fragment von dem angezielten ES-Zell-Locus der konstanten Region bei Verwendung von DNA von Clon 653 nachgewiesen wurde. Das Fragment hatte auf Grund der Insertion des tk-Gens, des ADH und des neo-Gens in das 12,7 kb große BamHI-Fragment an Größe gewonnen. Es war auch eine neue BamHI-Stelle am 3'-Ende des neo-Gens eingeführt worden. Unter Verwendung der DNA von den von der J/konstanten Region deletierten Zellen wurde ein 5,5 kb großes Fragment von dem modifizierten Locus zusätzlich zu dem 12,7 kb großen Fragment von dem nicht angezielten Allel nachgewiesen, wie aus der Analyse der Restriktionskarte vorhergesagt worden war. Aus dieser Durchmusterung mit Hilfe der Southern-Analyse von 2 Clonen, hergestellt aus 1,5 × 106 plattierten ES-Zellen (Clon 653), wurde eine Zelllinie (Clon 653B) identifiziert, die die beabsichtigte Deletion in der J- und der konstanten Region trug.
  • Weitere Analyse von genomischer DNA, die vom Clon 653B produziert worden ist, nachdem er aufgetaut und expandiert worden war, bestätigte wiederum die anfänglichen Beobachtungen. Unter Verwendung des 0,8 kb großen EcoRI-Fragmentes wurde die Deletion mit zwei anderen Restriktionsspaltungen, die außerhalb der ausgeschnittenene Region an den 5'- und 3'-Enden des anzielenden Vektors schneiden sollten, überprüft. Auf diese Weise wurde unter Verwendung dieser Sonde bei einem BglII-Verdau der genomischen DNA des nicht ausgeschnittenen Clons 653 ein 2,6 kb großes Fragment von sowohl, dem nicht modifizierten als auch dem modifizierten Allel nachgewiesen, während ein weiteres, 4,9 kb großes Fragment allein von dem angezielten Allel beobachtet wurde (11). Dieses 4,9 kb große Fragment war das gleiche, das mit dem zuvor verwendeten 1,2 kb großen BamHI/BglII-Fragment nachgewiesen worden war. Unter Verwendung von DNA vom Clon 653B ergab eine BglII-Spaltung ein 5,8 kb großes Fragment zusätzlich zu dem 2,6 kb großen Fragment von dem nicht modifizierten Allel. Eine SacI-Spaltung der DNA von Clon 653, sondiert mit dem 0,8 kb großen EcoRI-Fragment, zeigte ein 5,5 kb großes Fragment sowohl von dem nicht modifizierten als auch dem modifizierten Allel und ein 3,1 kb großes Fragment von dem angezielten Allel allein (11). Das 5,5 kb große Fragment und ein weiteres 2,0 kb großes Fragment wurden auch in DNA von Clon 653B nachgewiesen. Das 5,8 kb große BglII-Fragment und das 2,0 kb große ScaI-Fragment stimmten mit einer Analyse der vorausgesagten Restriktionskarte für einen präzisen Ausschneidungsschritt überein, bei dem 10,3 kb DNA einschließlich J-Region, des tk-Gens und einer Kopie der ADH deletiert wurden.
  • G. Erzeugung der Keimbahn-Chimären
  • Die nicht modifizierten E14-1-Zellen trugen nach Injektion in C57BL/6J-Blastozysten mit einer hohen Häufigkeit zur Keimbahn bei. Die Zellen der angezielten ES-Zelllinie 691, in welcher nur die konstante kappa-Region durch homologe Rekombination ohne eine negative Selektion deletiert worden war, wurden mikroinjiziert, und chimäre Tiere wurden produziert, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben wurde. Zellen von der angezielten ES-Zelllinie 653B, in welcher sowohl die konstante kappa- als auch die J-Region deletiert worden waren, werden ebenfalls mikroinjiziert, und chimäre Tiere werden produziert, wie vorstehend beschrieben. Chimäre Junge werden durch chimäre Fellfärbung identifiziert. Übertragung der modifizierten ES-Zelle über die Keimbahn wird durch die Agouti-Fellfärbung der F1-Nachkommen nachgewiesen.
  • BEISPIEL V
  • Clonierung des menschlichen Locus für die schwere Kette unter Verwendung von künstlichen Chromosomen der Hefe
  • A. Produktion eines künstlichen Chromosoms der Hefe (YAC), das die schwere Kette des Menschen enthält
  • Ein SpeI-Fragment, das die VH6-D-J-Cμ-Cδ-Region der schweren Kette des Menschen umspannt (Berman et al. (1988), EMBO J. 7: 727–738; vgl. 15) wird aus einer YAC-Bibliothek des Menschen (Burke, et al., Science, 236: 806–812) unter Verwendung der von Berman et al. (1988), EMBO J. 7: 727–738, beschriebenen DNA-Sonden isoliert. Es wird ein Clon erhalten, dessen Größe auf etwa 100 kb bestimmt wird. Der isolierte YAC-Clon wird durch Pulsfeldgelelektrophorese charakterisiert (Burke et al., vorstehend; Brownstein et al., Science, 244: 1348–1351), wobei radiomarkierte Sonden für die schwere Kette des Menschen verwendet werden (Berman et al., vorstehend).
  • B. Einführung von YAC-Clonen in Embryos oder ES-Zellen
  • DNA mit hohem Molekulargewicht wird in Agarosepfropfen aus Hefezellen hergestellt, die den interessierenden YAC enthalten (d. h., einen YAC, der das vorstehend genannte SpeI-Fragment vom IgH-Locus enthält). Die DNA wird in einem CHEF-Gel-Apparat größenfraktioniert, und die YAC-Bande wird aus dem Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt ausgeschnitten. Das Gel-Fragment wird mit Polyaminen äquilibriert und dann geschmolzen und mit Agarase behandelt, um die Agarose zu spalten. Die mit Polyamin überzogene DNA wird dann in den männlichen Pronukleus von befruchteten Maus-Embryos injiziert, die dann operativ in den Uterus einer psueudoträchtigen weiblichen Maus eingeführt werden, wie vorstehend beschrieben. Die transgene Natur der Neugeborenen wird durch einen Slot-Blot mit DNA, die aus den Schwänzen isoliert wurde, analysiert, und die Produktion der schweren menschlichen Kette wird analysiert, indem eine kleine Menge Serum gewonnen und mit anti-Mensch-Antikörpern vom Kaninchen auf die Anwesenheit von Ig-Ketten untersucht wird.
  • Als eine Alternative zur Mikroinjektion wird die YAC-DNA durch ES-Zellen:Hefe-Protoplastenfusion (Trauer et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 5898–5902; Pachnis et al. (1990), ebenda 87: 5109–5113) in murine ES-Zellen übertragen. Zuerst werden das Gen für Neomycin-Resistenz von pMC1Neo oder HPRT oder eine andere säugerstämmige selektierbare Markierung und eine Hefe-stämmige selektierbare Markierung in nicht essentielle YAC-Vektor-Sequenzen in ein Plasmid eingeführt. Diese Konstruktion wird verwendet, um einen Hefestamm, der den IgH-YAC enthält, zu transformieren, und pMC1Neo (oder eine andere selektierbare Markierung) wird durch homologe Rekombination in die Vektor-Sequenzen des IgH-YAC eingeführt. Der modifizierte YAC wird dann durch Protoplastenfusion in eine ES-Zelle überführt (Trauer et al. (1989); Pachnis et al., 1990), und die entstandenen, gegenüber G418 resistenten (oder einen anderen selektierbaren Phänotyp ausprägenden) ES-Zellen, die die intakten IgH-Sequenzen des Menschen enthalten, werden verwendet, um chimäre Mäuse zu erzeugen. Alternativ wird ein gereinigtes YAC in ES-Zellen transfiziert, zum Beispiel durch Lipofektion oder durch Calcium-Phosphat vermittelten DNA-Transfer.
  • BEISPIEL VI Einführung von Ig-Genen des Menschen in Mäuse
  • A. Clonierung von Ig-Genen des Menschen in Hefe
  • 1. Identifizierung und Charakterisierung eines menschlichen IgH-YAC-Clons, der VH-, D-, JH-, mu- und delta-Sequenzen enthält:
  • PCR-Primer für das menschliche VH6-Gen (V6A = 5' GCA GAG CCT GCT GAA TTC TGG CTG 3' und V6B = 5' GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTG G 3') wurden verwendet, um DNA-Pools der menschlichen YAC-Bibliothek der Universität von Washington (Washington University, St. Louis, MO) zu durchmustern. Positive Pools wurden anschließend durch Kolonie-Hybridisierung durchmustert, und eine positive Vertiefung auf einer Mikrotiterplatte, A287-C10, wurde identifiziert. Zwei VH6 enthaltende YACs mit unterschiedlichen Größen (205 kb und 215 kb) wurden aus der Mikrotiterplattenvertiefung isoliert. Zusätzlich zu VH6 hybridisierte das kleinere der beiden IgH-YACs, A287-C10 (205 kb), mit Sonden für die nachstehenden Sequenzen: delta, mu, JH, D, VH1, VH2 und VH4. Das größere der beiden IgH- YACs, A287-C10 (215 kb), hybridisierte mit den nachstehenden Sonden: delta, JH, D, VH1, VH2 und VH4, aber nicht mit mu. Die YACs enthielten Sequenzen von mindestens 5 VH-Genen, einschließlich zweier VH1-Gene, eines VH2-, eines VH4-und eines VH6-Gens. Die Analyse von Restriktionsspaltungen zeigte, dass das 205 kb große YAC eine Deletion enthielt (etwa 20 kb groß), die einige Gene, aber nicht alle aus dem D-Gen-Cluster entfernt, wobei der übrige Teil des YAC intakt und in Keimbahn-Konfiguration zu sein schien. Die Analyse des 205 kb großen YAC durch PCR und genaue Restriktionsspaltung zeigten die Anwesenheit von mehreren verschiedenen Mitgliedern aus der Familie der D-Gene. Das 215 kb große YAC schien das vollständige größere D-Gen-Cluster zu enthalten, wies aber eine Deletion auf (etwa 10 kb), die das mu-Gen entfernte. Diese Deletion scheint das JH-Cluster oder den Enhancer, der zwischen den JH- und mu-Genen liegt, nicht zu beeinträchtigen.
  • Der mutmaßliche Vorläufer der beiden vorstehenden, miteinander verwandten IgH-YACs, ein YAC mit einer Größe von etwa 225–230 kb, der die gesamte genomische Region zwischen dem VH2-Gen und dem delta-Gen enthielt (Shin et al., 1991, vorstehend) (vgl. 15), war nicht in der A287-C10-Mikrotiterplatten-Vertiefung identifiziert worden. Daher wurde ein früheres Aliquot der A287-C10-Mikrotiterplattenvertiefung untersucht, um das Vorläufer-YAC zu suchen, wobei angenommen wurde, dass es während der Passage durch die Bibliothek verloren gegangen ist. Die A287-C10-Mikrotiterplatten-Vertiefung wurde ausgestrichen (Washington University, St. Louis, MO), und 2 von 10 analysierten Clonen enthielten ein 230 kb großes IgH-YAC mit einem anderen, offensichtlich nicht verwandten YAC. Clon 1 enthielt zusätzlich zu dem IgH-YAC ein etwa 220 kb großes YAC und Clon 3 enthielt zusätzlich ein etwa 400 kb großes YAC. Das IgH-YAC enthielt mu, das vollständige D-Profil (basierend auf einer BamHI-Spaltung, vgl. nachstehend) und JH. Das IgH-YAC von Clon 1 wurde auf physikalische Weise vom nicht verwandten YAC durch meiotische Segregation in einer Überkreuzung zwischen A287-C10/AB1380 und YPH857 abgetrennt (Genotyp = MATα ade2 lys2 ura3 trp1 HIS5 CAN1 his3 leu2 cvh2, um A287-C10 (230 kb)/MP 313 zu erhalten (Genotyp des Wirtsorganismus = MATα ade2 leu2 lys2 his3 ura3 trp1 can1 cyh2).
  • 2. Anzielen des A287-C10 kb -YAC mit einer säugerstämmigen, selektierbaren Markierung, HPRT:
  • Ein den rechten Arm des YAC anzielender Vektor, genannt pLUTO (15,6 kb), wurde durch Subclonierung eines menschlichen HPRT-Minigens, das in einem 6,1 kb großen BamHI-Fragment enthalten war (Reid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4299–4303 (1990)), in die BamHI-Stelle in dem Polylinker von PLUS erzeugt (Hermanson et al., Nucleic Acids Research 19: 4943–4938 (1991)). Eine Kultur von A287-C10/AB1380, die sowohl das 230 kb große IgH-YAC als auch ein nicht verwandtes YAC enthielt, wurde mit linearisiertem pLUTO transformiert, und Lys+-Transformanten wurden selektiert. Die Lys+-Clone wurden durch Kolonie-Hybridisierung auf die Anwesenheit von mu durchmustert. Ein Clon wurde identifiziert, der ein einzelnes YAC mit etwa 245 kb enthielt, das mit Sonden für mu, HPRT und LYS2 hybridisierte.
  • Southern-Analyse des 230 kb großen A287-C10-YAC, das von pLUTO angezielt wurde, wurde unter Verwendung einer Reihe von Sonden durchgeführt, um die intakte, nicht neu geordnete Natur der clonierten menschlichen IgH-Sequenzen zu zeigen. In den meisten Fällen wurden die Ergebnisse der Spaltungen mit BamHI, HindIII und EcoRI mit Restriktionsdaten für WI38 (einer menschlichen embryonalen, fötalen Lungen-stämmigen Zelllinie), mit den 205 kb und 215 kb großen Deletions-Derivaten von A287-C10 und mit veröffentlichten Werten verglichen. Das Diversitäts(D)-Genprofil, bestimmt durch Hybridisierung mit einer D-Region-Sonde (0,45 NcoI/PstI-Fragment; Berman et al., (1988)) zeigte die erwarteten vier D-Gen-Segmente (D1–D4) (Siebenlist et al., 1981; Nature 294: 631–635). Zum Beispiel wurden mit BamHI vier Restriktionsfragmente mit Größen von 3,8 kb, 4,5 kb, 6,9 kb und 7,8 kb in A287-C10 und WI38 beobachtet. WI38 wies eine zusätzliche größere Bande auf, von der vermutet wurde, dass sie aus der D5-Region von Chromosom 16 herstammt (Matsuda et al., 1988, EMBO 7: 1047–1051). PCR- und Southern-Analyse mit für die D-Familie spezifischen Primern und Sonden zeigten für das 215 kb große Deletion-YAC-Derivat (welches eine intakte D-Region mit den gleichen Restriktionmustern wie das 230 kb große YAC zu haben schien) die Anwesenheit von 2 bis 4 Mitgliedern aus jeder der nachstehenden D-Gen-Familien: DM, DN, DK, DA, DXP und DIR. Der J-mu-Intron-Enhancer, der aus clonierten PCR-Produkten des 230 kb großen A287-C10-YAC sequenziert worden war
    Figure 00650001
    und als intakt angesehen wurde, erzeugte mit BamHI, EcoRI und HindIII ebenfalls einzelne Restriktionsfragmente mit etwa den vorhergesagten Größen, wenn das 480 bp große PCR-Produkt als Sonde diente. Die JH-Region wurde mit einem etwa 6 kb großen BamHI/HindIII-Fragment als Sonde, welches die DHQ52- und die gesamte JH-Region umspannte, untersucht (Ravetch et al., (1981), Cell 27: 583–591). A287-C10 erzeugte Restriktionsfragmente in etwa den erwarteten Größen. Darüber hinaus wurden die Restriktionsfragmente mit gleicher Größe mit dem Enhancer und den JH-Sonden nachgewiesen (Ravetch et al., vorstehend; Shin et al., 1991, vorstehend). Das etwa 18 kb große BamHI-JH-Fragment, das in A287-C10 und WI38 nachgewiesen wurde, hybridisierte auch mit einer 0,9 kb großen mu-Sondensequenz (Ravetch et al., vorstehend). Die Hybridisierung mit der 0,9 kb großen EcoRI-Fragment-mu-Sonde (Ravetch et al., vorstehend) ergab Restriktionsfragmente in etwa den erwarteten Größen (Ravetch et al., vorstehend; Shin et al., vorstehend): > 12 kb großes BamHI (etwa 17 kb erwartet); 0,9 kb großes EcoRI (0,9 kb erwartet) und ein etwa 12 kb großes HindIII (etwa 11 kb erwartet). WI38 ergab das BamHI-Fragment in gleicher Größe wie A287-C10. Die JH- und DHQ52-Regionen wurden von beiden Deletion-YAC-Derivaten sequenziert, und beide lagen in Keimbahn-Konfiguration vor. Delta wurde mit einem Exon 1-PCR-Produkt analysiert (welches die etwa 160 bp große Region zwischen den Primern
    Figure 00650002
    enthielt); die Restriktionsfragmente für A287-C10 lagen nahe bei denen, die aus der Literatur (Shin et al., vorstehend) erwartet worden waren, und jenen, die für WI38 bestimmt worden waren. Die 3'-Clonierungsstelle des YAC kann die erste EcoRI-Stelle 3' von delta sein (Shin et al., vorstehend) oder eine andere EcoRI-Stelle noch weiter 3' davon. VH-Gen-Sonden für VH1, VH4 und VH6 (Berman et al., vorstehend), und für VH2 (Takahashi et al. (1984), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 5194–5198) wurden verwendet, um den Gehalt an variablen Genen des YAC zu bestimmen. A287-C10 enthält zwei VH1-Gene, die etwa den vorausgesagten Größen entsprechen (Shin et al., vorstehend; Matsuda et al., 1993, vorstehend); die Restriktionsanalyse mit den drei Enzymen ergab Werte, die nahe an den erwarteten Fragmentgrößen lagen; z. B. haben die mit EcoRI beobachteten Banden Größen von 3,4 und 7,8 kb (erwartet wurden 3,4 und 7,2 kb). Die vorausgesagten Größen der EcoRI-Fragmente für VH4 (5,3 kb beobachtet, 5,1 kb erwartet) und für VH6 (0,8 kb beobachtet, 0,9 kb erwartet) (Shin et al., vorstehend; Matsuda et al., vorstehend) lagen in A287-C10 vor. Das EcoRI-Fragment in der erwarteten Größe wurde für VH2 (5,5 kb beobachtet, 5,4 kb erwartet) beobachtet, aber die BamHI- und HindIII-Fragmente unterschieden sich von den Vorhergesagten. Übereinstimmende Hybridisierung der BamHI- und HindIII-Fragmente mit einer pBR322-Sonde legten nahe, dass die EcoRI-Stelle, die am 5'-Ende des VH2-Gens liegt (Shin et al., vorstehend), die 5'-Clonierungsstelle ist und auf diese Weise die natürlich vorkommenden 5'-HindIII-Stelle und BamHI-Stellen eliminiert. Die Geamtgröße der YAC-Insertion (geschätzt auf etwa 220 kb) passt gut zu der vorausgesagten Größe für ein intaktes, nicht neu geordnetes Segment, das am 5'-Ende der am weitesten 3' gelegenen VH2-Gens beginnt und sich bis zu einer EcoRI-Stelle 3' des delta-Locus erstreckt (Shin et al., vorstehend).
  • 3. Identifizierung und Charakterisierung von IgK-YACs, die CK- und VK-Sequenzen enthalten
  • Zwei YACs wurden bei einer Durchmusterung von Pools von Pulsfeldgelen (PFG) aus der menschlichen YAC-Bibliothek der Universität von Washington (St. Louis, MO) mit einer Sonde des Gens für die konstante kappa-Region (CK) des Menschen (2,5 kb großes EcoRI-Fragment, ATCC No. 59173, Parklaven Dr., Rockville, MD) identifiziert. Die YACs, mit A80-C7 (170 kb) und A276-F2 (320 kb) bezeichnet, enthielten das kappa deletierende Element kde, CK, JK und den C-J-Intron-Enhancer und erstreckten sich 3' über kde hinaus. Die YACs enthielten auch die B1-, B2 und B3-VK-Gene, die sich 5' von JK erstreckten, bestimmt durch Hybridisierung und/oder PCR, und möglicherweise andere VK-Sequenzen. Der Stamm A80-C7/AB1380 beherbergte zusätzlich zu dem IgK-YAC ein nicht verwandtes YAC von ähnlicher Größe. Daher wurde die meiotische Segregation verwendet, um diese YACs voneinander zu trennen; A80-C7 wurde mit YPH857 gegreuzt, und es wurde ein meiotisches Produkt erhalten, das nur das IgK- YAC enthielt (MP8-2; Genotyp des Wirtsorganismus = α ade2 leu2 his3 his5 lys2 ura3 trp1 can1 cyh2). Die YACs von A80-C7 und A276-F2 sind mit pLUTO angezielt worden, um das menschliche HPRT-Minigen in den rechten Vektor-Arm des YAC einzufügen.
  • Die Restriktionsanalyse der IgK-YACs A80-C7 und A276-F2 unter Verwendung einer Reihe von Enzymen unterstützt die Schlussfolgerung, dass beide YACs nicht neu geordnet wurden (d. h. in Keimbahn-Konfiguration vorlagen). Zum Beispiel ergibt eine BamHI-Spaltung gefolgt von Hybridisierung mit der CK-Sonde das erwartete 13 kb große Restriktionsfragment (Klobeck et al., Biol. Chem. Hoppe-Segler 370: 1007–1012 (1989)). Die Bande gleicher Größe hybridisiert mit einer JK-Sonde (ein 1,2 kb großes PCR-Produkt, das einen Primer-Satz verwendet, um die JK1-5-Region zu amplifizieren), wie aus der genomischen Karte vorhergesagt worden ist (Klobeck et al. vorstehend). Das Gen der B3-Klasse IV (Sonde ist ein 123 bp großes PCR-Produkt des B3-Gens) ergibt ein 4,9 kb großes BamHI- und ein 2,2 kb großes BglII-Fragment, was nahe an den veröffentlichten Werten von 4,6 kb beziehungsweise 2,3 kb ist (Lorenz et al., Molec. Immunol. 25: 479–484 (1988)). Die PCR-Analyse von beiden IgK-YACs wie auch von genomischer DNA des Menschen für die nachstehenden Sequenzen des kappa-Locus ergaben die vorausgesagten Bandengrößen: Kde (120 bp), CK (304 bp), C-J-Intron-Enhancer (455 bp), JK1-5 (1204 bp), B3-VK (123 bp) und B1-VK-Pseudogen (214 bp). Die Sequenzen, die verwendet wurden, um PCR-Primer für die CK-, JK- und C-J-Enhancer-Regionen zu entwerfen, stammen von Whitehurst et al., Nucl. Acids. Res. 20: 4929–4930 (1992); Kde stammt von Klobeck und Zachau, Nucl. Acids. Res. 14: 4591–4603 (1986); B3 ist von Klobeck et al., Nucl. Acids. Res. 13: 6515–6529 (1985); und B1 ist from Lorenz et al., vorstehend.
  • B. Einführung des 680 kb großen yHPRT-YAC in ES-Zellen
  • 1. Kultur des yHPRT-Hefestammes und Herstellung der Hefe-Sphäroplasten
  • Das 680 kb große yHPRT ist ein YAC, das eine funktionale Kopie des menschlichen Gens für Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) enthält, das aus einer YAC-Bibliothek cloniert wurde, wie von Huxley, et al. (1991) Genomics 9: 742–750 beschrieben wurde. Der Hefe-Stamm, der das yHPRT enthielt, wurde in Uracil- und Tryptophan-freiem flüssigem Kulturmedium gezüchtet, wie von Huxley, et al. (1991) vorstehend, beschrieben.
  • Um die Hefe-Sphäroplasten herzustellen, wurde eine 400 ml-Kultur der Hefe, die yHPRT enthielt, abzentrifugiert, und der Hefe-Niederschlag wurde einmal mit Wasser und einmal mit 1 M Sorbit gewaschen. Der Hefe-Niederschlag wurde in SPEM (1 M Sorbit, 10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, 10 mM EDTA, pH-Wert 8,0, 30 mM β-Mercaptoethanol) mit einer Konzentration von 5 × 108 Hefezellen/ml resuspendiert. Zymolase 20T wurde in einer Konzentration von 150 μg/ml Hefezellen zugegeben, und die Kultur wurde bei 30°C inkubiert, bis 90% der Zellen Sphäroplasten waren (gewöhnlich über 15–20 Minuten). Die Zellen wurden zweimal in STC (1 M Sorbit, 10 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM CaCl2) gewaschen und in STC mit einer Konzentration von 2,5 × 108/ml resuspendiert.
  • 2. Kultur von E14TG2a-ES-Zellen
  • Die HPRT-negative ES-Zelllinie E14TG2a wurde kultiviert, wie vorstehend beschrieben.
  • 3. Fusion von ES-Zellen und Hefe-Sphäroplasten
  • Exponentiell wachsende E14TG2a-ES-Zellen, die in Gelatine-überzogenen Schälchen wuchsen, wurden mit Trypsin behandelt und dreimal mit serumfreiem DMEM gewaschen. Ein Pellet von 2,5 × 108 Hefe-Sphäroplasten wurde vorsichtig mit 5 × 106 ES-Zellen überschichtet, die auf das Hefe-Pellet herunterzentrifugiert wurden. Das kombinierte Pellet wurde entweder in 0,5 ml 50% Polyethylenglycol (PEG) 1500 oder 0,5 ml 50% PEG 4000 (Boehringer Mannheim), das 10 mM CaCl2 enthielt, resuspendiert. Nach Inkubation über 1,5 Minuten bei Zimmertemperatur oder bei 37°C wurden 5 ml serumfreies DMEM langsam zugegeben, und man ließ die Zellen bei Zimmertemperatur über 30 Minuten stehen. Die Zellen wurden dann pelettiert und in 10 ml vollständigem ES-Zell-Kulturmedium (wie vorstehend beschrieben) resuspendiert und auf eine 100 mm-Schale plattiert, die mit Nährzellen überzogen war. Nach 24 Stunden wurde das Kulturmedium durch frisches Kulturmedium ersetzt. 48 Stunden nach der Fusion wurde die HAT(ES-Kulturmedium, das 1 × 10–4 M Hypoxanthin, 4 × 10–7 M Aminopterin, 1,6 × 10–5 Thymidin enthielt)-Selektion begonnen. HAT-resistente ES-Kolonien wurden 7–10 Tage nach der Fusion in den Schalen, bei denen die beiden verschiedenen Fusionsbedingungen angewendet wurden, beobachtet. yHPRT-ES ("ESY")-Fusionskolonien wurden aufgenommen und auf mit Nährzellen ausgekleideten Vertiefungen plattiert und für die weitere Analyse expandiert.
  • 4. Analyse von YAC-DNA, die in die yHPRT-ES-Fusionsclone integriert ist
  • DNA, die aus 23 yHPRT-ES-Fusionskolonien extrahiert worden war, wurde mit HindIII gespalten und der Southern-Blot-Analyse unterworfen (12), indem folgende Sonden verwendet wurden: eine repetitive Alu-Sequez des Menschen (A); pBR322-spezifische Sequenzen für den rechten (B) und linken (C) YAC-Vektor-Arm; repetitive Ty-Sequenz der Hefe (D); das in einzelner Kopie vorliegende Gen LYS2 (E). Die menschliche HPRT-Sonde, eine 1,6 kb große cDNA in voller Länge (Jolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 477–481 (1983)) wurde verwendet, um die Anwesenheit des menschlichen HPRT-Gens in ESY-Clonen zu bestätigen. Die Alu-Sonde war ein 300 bp großes BamHI-Fragment aus dem BLUR8-Alu-Element in pBP63A (Pavan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1300–1304 (1990)). Die Sonden für den rechten und linken Vektor-Arm waren von pBR322 stammende BamHI-PvuII-Fragmente mit 1,7 bezeihungsweise 2,7 kb Größe, die den Vektor-Sequenzen in pYAC4 entsprachen (Schema a, b (Burke et al., in: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Guthrie und Fink, Hrsg., Academic Press, 194: 251–270 (1991)). Das 4,5 kb große Fragment, nachgewiesen durch die Sonde für den rechten Arm, umspannt die Region zwischen der HindIII-Stelle am 51 Ende des Telomers und der ersten HindIII-Stelle innerhalb der Insertion vom Menschen (Schema a). Die 3 kb und 4,1 kb großen Fragmente, nachgewiesen durch die Sonde für das linke Ende, entsprachen der Region zwischen der HindIII-Stelle am Telomer-Ende und der HindIII-Stelle 5' der Hefe-Sequenzen bezeihungsweise der Region, die sich von der HindIII-Stelle 3' des Zentromers in die menschliche Insertion erstreckt (Schema b). Der Unterschied in der Intensität der Hybridisierung dieser beiden Banden beruht auf dem Unterschied in dem Ausmaß an Homologie zwischen diesen Fragmenten und der Sonde. Die repetitive Hefe-Ty-Sonde (Philippsen et al., in Gene Expression in Yeast, Proceedings of the Alko Yeast Symposium, Helsinki, Korhola und Vaisanen, Hrsg., Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, 1: 189–200 (1983)) war ein 5,6 kb großes XhoI-Fragment, das aus dem Ty1 enthaltenden pJEF742 isoliert worden war, das auf Grund der Homologie zwischen den beiden Elementen auch das 3'-HindIII-Fragment von Ty2 nachweisen konnte. Die LYS2-Gen-Sonde war ein 1,7-BamHI-Fragment von PLUS (Hermanson et al., Nuc. Acids. Res. 19: 4943–4948 (1991)).
  • Hybridisierung mit einer menschlichen HPRT-Sonde (1,6 kb große cDNA-Sonde in voller Länge) zeigte, dass alle analysierten Clone die gleichen 15, 7 und 5 kb großen Exon enthaltenden Fragmente des menschlichen HPRT-Gens als den yHPRT-YAC enthielten. Wiederholte Sondierung der selben Blots mit einer repetitiven menschlichen Alu-Sequenz-Sonde von 300 bp zeigte, dass alle analysierten Clone den größten Teil, wenn nicht alle der Alu-enthaltenden Fragmente, die in yHPRT vorkommen, enthielten (12A). Diese Daten zeigen, dass in den meisten der analysierten Clone die 680 kb große menschliche Insertion bei der Integration in das ES-Zell-Genom nicht nachweisbar neugeordnet oder deletiert worden ist. Die Integration von YAC-Vektor-Sequenzen wurde untersucht, indem Sonden verwendet wurden, die für die Vektor-Arme spezifisch waren. Rehybridisierung der selben Blots mit einer Sonde für den rechten YAC-Vektor-Arm, welche ein 4,5 kb großes HindIII-Fragment nachwies, zeigte, dass in 10 der 23 analysierten Clone der rechte YAC-Arm bis hinauf zum Telomere immer noch intakt und nicht neugeordnet war und mit der menschlichen Insertion verbunden war (12B), was somit einen weiteren Nachweis für die Integrität des YAC in diesen Clonen liefert. Die Sonde für den linken Arm wies die 3 kb und 4,1 kb großen HindIII-yHPRT-Fragmente in 18 der analysierten 20 Clone nach (12C), was eine hohe Häufigkeit des Beibehaltens des linken Arms anzeigt.
  • Die strukturelle Integrität von yHPRT in ESY-Clonen wurde weiter für zwei Clone untersucht (ESY 5-2 and 8-7), indem eine Pulsfeldgel-Restriktionsanalyse verwendet wurde. In Hefe, die yHPRT trägt, wurden fünf Sfi-Fragmente mit den folgenden annähernden Größen durch unterschiedliche Sonden definiert: 315 kb (Alu, linker Arm), 145 kb (Alu, HPRT); 95 kb (Alu, rechter Arm), 70 und 50 kb (Alu allein). In beiden ES-Clonen hatten das interne HPRT und die Alu-spezifischen Fragments eine ähnliche Größe wie die yHPRT-Fragmente. Die End-Fragmente, die für beide Clone nachgewiesen wurden, waren größer als jene in yHPRT, was für YACs, die innerhalb eines Maus-Chromosoms integriert wurden, erwartet worden ist: 185 beziehungsweise 200 kb für das Fragment des rechten Endes und über 800 kb für das Fragment des linken Endes in beiden Clonen. Diese Daten liefern zusammen mit dem Alu-Profil weiteren Nachweis für die Beibehaltung der strukturellen Integrität des YAC in diesen Clonen. Diese Studien wurden durch eine in-situ-Fluoreszenz-Hybridisierung vervollständigt, die an Metaphasen-Chromosom-Aufspreitungen von ESY 8-7 (13A, B) und ESY 8-6 durchgeführt wurden, wobei eine einzelne Integrationsstelle für die menschlichen Sequenzen nachgewiesen wurde. Mikrofotografien von repräsentativen Metaphase-Aufspreitungen (13A, B, C) oder Interphase-Nuklei (13D) von ESY 8-7-Zellen (13A, B), die mit biotinylierten genomischen Sequenzen des Menschen hybridisiert wurden, und ESY 8-6-Zellen (13C, D), die mit biotinylierten wiederholten DNA-Sequenzen der Hefe hybridisiert wurden. Die menschliche Sonde wurde aus genomischer plazentaler DNA des Menschen (Clontech, Palo Alto, Ka.) erzeugt. Die Hefe-Sonde bestand aus einem Gemisch aus DNA-Fragmenten, die die wiederholten Elements der Hefe codierten; delta (ein 1,08 kb großes Sau3A-Fragment von pdeltaδ (Gafner et al., EMBO J. 2: 583–591 (1983)) und Ty (ein 1,35 kb großes EcoRI-SalI-Fragment von p29 (Hermanson et al., Nuc. Acids. Res. 12: 4943–4948 (1991)), die rDNAs (ein 4,6 kb großes BglIIk-A-L90- und ein 4,4 kb großes BglII-B-L92-Fragment (Keil und Roeder, Cell 39: 377–386 (1984)) und die Y'-Telomer-Elemente (2,0 und 1,5 kb große BglII-HindIII-Fragmente von p198 (Chan und Tye, Cell 33: 563–573 (1983)). Hybridisierung der Sequenzen auf den Metaphase-Chromosomen-Aufspreitungen mit biotinylierten Sonden und Nachweis durch Avidin-FITC, gefolgt von Biotin-anti-Avidin- und Avidin-FITC-Amplifizierung wurde, wie von Trask und Pinkel, Methods Cell Biol. 30: 383–400 (1990) beschrieben, unter Verwendung eines Zeiss-Axiophot-Mikroskopes durchgeführt. Die Chromosomen wurden mit Propidiumjodid gegengefärbt. Die gezeigten Mikrofotografien sind repräsentativ für 95% der Metaphase-Aufspreitungen oder Interphase-Nuclei, die in drei voneinander unabhängigen Experimenten gescannt worden waren, die mit der menschlichen oder der Hefe-Sonde durchgeführt worden waren. Eine einzige Integrationsstelle wurde für die menschlichen Sequenzen nachgewiesen.
  • Die selben Blots wurden auch mit der repetitiven Ty-Element-Sequenz der Hefe als Sonde untersucht, um die Anwesenheit von genomischen DNA-Sequenzen der Hefe in den ESY-Clonen nachzuweisen (12D). Es wurde herausgefunden, dass während einige Clone die meisten der Ty enthaltenden Fragmente, die im elterlichen Hefe-Stamm vorkamen, enthielten, einige der Clone nur eine sehr kleine Fraktion, falls überhaupt, der Ty enthaltenden Fragmente aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigen an, dass in einigen ES-Clonen wenig oder keine genomische DNA von Hefe integriert worden war, obwohl die YAC-DNA intakt integriert war.
  • Um zu bestimmen, ob die chromosomale DNA der Hefe an einer einzigen oder an mehrenen Stellen innerhalb des ES-Zell-Genoms integriert war, wurde eine in-situ Fluoreszenz-Hybridisierung beim ESY-Clone 8-6, der ein vollständiges Ty-Profil aufwies, durchgeführt. Unter Verwendung einer kombinierten repetitiven Hefe-Sonde (13C, D) wurde eine einzelne Integrationsstelle nachgewiesen, was anzeigt, dass innerhalb der Auflösungsgrenzen alle DNA-Fragmente der Hefe in einem Block integriert werden.
  • Durch Nutzung der Fähigkeit von ES-Zellen, in vitro eine ordnungsgemäße Differenzierung zu durchlaufen, wurde die YAC-Stabilität und die Auswirkung von integrierter DNA auf die Pluripotenz von ES-Zellen erforscht. Vier ES-Clone, die unterschiedliche Mengen an Hefe-DNA enthielten (ESY 5-2, 3-6, 8-6 und 8-7), zeigten ein Differenzierungsmuster, das von dem nicht fusionierter ES-Zellen nicht zu unterscheiden war: die Bildung von embryoiden Körpern ließ eine Reihe von differenzierten Zelltypen entstehen (14A). Eine Southern-Blot-Analyse wurde mit DNA durchgeführt, die aus differenzierten ESY 5-2, 3-6, 8-5 und 8-6 (20 μg) und yHPRT in AB1380 (40 μg) extrahiert worden ist, indem (a) eine menschliche Alu-Sonde; (b) Ty-Sequenzen der Hefe verwendet wurden. ES-Clone wurden induziert, embryoide Körper zu bilden, indem sie als Aggregate in Suspension über 10–14 Tage kultiviert wurden, wie von Martin und Evans, Cell 6: 467–474 (1975) beschrieben wurde. Nach ihrer Wiederanheftung an Gewebekultursubstrat bildeten die ESY- stämmigen embryoiden Körper differenzierte Zelltypen. YAC- und Hefe-DNA-Sequenzen wurden in Kultur in nicht selektivem Kulturmedium über 40 Tage von den differenzierten ES-Clonen stabil beibehalten, was zeigt, dass die stabil integrierte fremde DNA die Pluripotenz der ES-Zellen nicht beeinträchtigte (14B). Die differenzierten Kulturen behielten ein funktionales menschliches HPRT-Gen, was durch ihr normales Wachstum und ihre normale Differenzierung deutliche wurde, wenn sie in HAT-selektives Kulturmedium übertragen wurden.
  • 5. Erzeugung von chimären Mäusen aus vHPRT-ES-Zelllinien
  • Die Fähigkeit von ESY-Zellen, Mäuse einschließlich der Keimbahn wiederzubesiedeln, wurde durch Mikroinjektion von ES-Zellen in Maus-Blastozysten und Erzeugung von chimären Mäusen gezeigt. ESY-Zellen wurden in C57BU6J-Maus-Blastozysten mikroinjiziert, und chimäre Mäuse wurden erzeugt, wie vorstehend beschrieben. Chimäre männliche Mäuse wurden mit weiblichen C57BU6J-Mäusen gepaart, und Übertragung in die Keimbahn wurde durch die Anwesenheit von Agouti-Nachkommen bestimmt. Genomische DNA, die aus den Schwänzen der chimären Mäuse präpariert worden war, wurde auf die Anwesenheit von yHPRT-DNA in dem Maus-Genom durch PCR-Analyse analysiert. Die Anwesenheit von linkem YAC-Arm wurde analysiert, indem die beiden Primer-Oligonucleotide,
    Figure 00730001
    verwendet wurden, die von den pBR322-Sequenzen bzw. dem SUP4-Gen innerhalb des linken YAC-Vektor-Arms abstammten. Ein 259 bp großes PCR-Produkt wurde aus der Analyse der Hefe enthaltenden yHPRT- und den ESY-Zelllinien erhalten. Die PCR-Analyse von Schwanz-DNA, hergestellt von 18 chimären Mäusen, die aus den ESY-Zelllinien ESY3-1, ESY3-6 und ESY5-2 erzeugt worden waren, ergab das erwartete PCR-Produkt, wodurch die Anwesenheit des linken YAC-Vektor-Armes in dem Genom der chimären Mäuse gezeigt wurde.
  • 6. Übertragung von yHPRT über die Keimbahn
  • Chimäre männliche Mäuse mit Farbchimärismus des Fells von 30–60%, die von den ESY-Zelllinien ESY3-1 und ESY5-2 abstammten, wurden zur Paarung für die Untersuchung der Übertragung über die Keimbahn bereitgestellt, d. h. um zu bestimmen, ob die genetische Modifikation über die Keimzellen (Spermien oder Eizellen) an die Nachkommen der Tiere weitergereicht wird. Drei der chimären, von ESY3-1 abstammenden männlichen Mäuse, 394/95-1, 394/95-2 und 411-1, übertrugen das ES-Zell-Genom mit einer Häufigkeit von 20%, 30% beziehungsweise 30% auf ihre Nachkommen. Southern-Blot-Analyse der Schwanz-DNA von den Agouti-Jungen zeigte die Anwesenheit von yHPRT in dem Genom der drei Mäuse 4-2, 4-3 und 5-1 an, die von der 394/395-2-Chimäre abstammten. Das aus einer solchen Analyse erhaltene Alu-Profil war von dem der elterlichen ES3-1-Zelllinie nicht zu unterscheiden (14C), was zeigt, dass die 680 kb große menschliche Insertion zuverlässig durch die Maus-Keimbahn übertragen worden war.
  • Bei der Verwendung einer für menschliche HPRT spezifischen PCR-Untersuchung von von mRNA abgeleiteter cDNAs von einem yHPRT enthaltenen Nachkommen wurde die Expression des menschlichen HPRT-Gens in allen untersuchten Geweben nachgewiesen (15A und B), wodurch gezeigt wurde, dass das übertragene YAC seine Funktion mit Zuverlässigkeit beibehielt. In diesem Experiment wurde menschliche HPRT-mRNA durch reverse Transkription(RT)-PCR in ES-, ESY 3-1- und Hut-78-(menschlichen) Zellen, Milz und Leber von einer Kontrollmaus (C) oder dem 4-3-Agouti-Nachwuchs (von der 394/95-2-Chimäre abstammend) und einer Probe, die keine Matrizen-DNA enthielt (in 15A als „–" gekennzeichnet), nachgewiesen. Reverse Transkription von poly(A+)RNA und PCR-Amplifizierung von spezifischen cDNA-Sequenzen wurden unter Verwendung des cDNA Cycle Kit (Invitrogen) durchgeführt. Spezifische Amplifizierung eines 626 bp großen Fragmentes von menschlicher HPRT-cDNA in Anwesenheit von muriner HPRT-cDNA wurde durchgeführt, wie von Huxley et al., vorstehend, beschrieben. Die Integrität von allen RNA-Proben wurde durch PCR-Amplifizierung von cDNAs für den γ-lnterferon-Rezeptor der Maus gezeigt. Die Primer, die verwendet wurden, um ein 359 bp großes Fragment zu amplifizieren, waren:
    Figure 00750001
  • Die Primer für das menschliche HPRT und den γ-Interferon-Rezeptor wurden so entworfen, dass die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, PCR-Produkte von genomischen DNA-Verunreinigungen zu erhalten. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese analysiert und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Größenmarkierungen sind 1 kb-Stufen (BRL). Die Ergebnisse des vorstehend beschriebenen Nachweises von mRNA für den γ-Interferon-Rezeptor der Maus durch RT-PCR in den Proben werden in 15B dargestellt. Die spezifische mRNA für menschliches HPRT wurde auch in den anderen untersuchten Geweben (Gehirn, Niere und Herz), die von der Maus 4-3 stammten, nachgewiesen. Vergleichbare stabile Spiegel an mRNA für HPRT von Mensch und Maus wurden in der Leber von yHPRT enthaltenden Nachkommen gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aufnahme von so viel wie 13 Megabasen an genomischer Hefe-DNA für eine normale Entwicklung, Übertragung über die Keimbahn oder Gen-Expression nicht nachteilig war.
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass Hefe-Sphäroplasten ein wirksames Transportmittel für die Abgabe eines DNA-Fragmentes mit großem Molekulargewicht, das als einzelne Kopie vorliegt, in ES-Zellen sind und dass solche Moleküle stabil und funktional durch die Keimbahn der Maus übertragen werden. Die Alu-Profile, für einige der ES-Clone durch PFGE-Analyse und in situ-Hybridisierung komplementiert, sind ein starkes Argument dafür, dass die Mehrheit der Clone praktisch die gesamte menschliche Insertion in nicht neugeordneter Form (d. h. in „Keimbahn-Konfiguration") enthielt, wobei die Clone mit großer Häufigkeit (40%) auch beide YAC-Arme bewahrten. Die beträchtliche Aufnahme von genomischer Hefe-DNA war für eine normale Differenzierung von ES-Zellen in vitro und in vivo nicht nachteilig und verhinderte eine Übertragung über die Keimbahn oder Gen-Expression nicht. Durch diese Verfahren kann man große Fragmente an genomischer DNA als Insertionen in nicht menschliche Tier-Genome übertragen, in denen die Insertionen intakt über die Keimbahn-Übertragung weitergegeben werden können. Daher kann eine breite Vielzahl an xenogener DNA in nicht menschliche Wirtsorganismen wie etwa Säuger, besonders kleine Labortiere eingeführt werden, die neue Phänotypen oder neue Genotypen verleihen können. Zum Beispiel kann man in kleinen Labortieren Gene eines Säugers wie etwa eines Menschen bereitstellen, um die Ätiologie einer Krankheit, die Reaktion von menschlichen Genen auf eine breite Vielzahl von Agenzien zu studieren. Alternativ kann man umfangreiche Loci in einen säugerstämmigen Wirtsorgansimus einführen, um Produkte anderer Arten, zum Beispiel des Menschen, zu produzieren, um menschliche Proteinsquenzen von Proteinen wie etwa Immunglobulinen, T-Zell-Rezeptoren, Antigenen des Haupthistokompatibilitätskomplexes usw. zu liefern.
  • Einführung von YAC A287-C10 für die schwere Kette und YAC A80-C für die kappa-Kette in ES-Zellen und Embryos
  • Von Hefe, die die menschliche schwere Kette YAC A287-C10 enthielt, die mit pLUTO angezielt worden war (yA287-C10), wurden Sphäroplasten erzeugt und mit der HPRT-defizienten ES-Zelllinie E14.1TG3B1 fusioniert, wie vorstehend beschrieben. Zehn HAT-resistente ES(ESY)-Clone (2B, 2C, 2D, 3A, 3B, 5C, 1125A, 1125E, 100/1500 und 100/4000) wurden für die DNA-Analyse aufgenommen und expandiert. Die Untersuchung des integrierten YAC wurde durch Southern-Blot-Analyse von mit HindIII gespaltener DNA von diesen Clonen durchgeführt, wobei die vorstehend beschriebenen Sonden von menschlichen schweren Ketten für die D-, JH-, μ- und VH2-Regionen verwendet wurden. Es wurde herausgefunden, dass alle ESY-Clone die erwarteten > 10 kb-JH- und μ-Fragmente enthielten. Es stellte sich heraus, dass alle ESY-Clone, mit Ausnahme der 2D- und 5C-Clone, das 4,8 kb große VH2-Fragment enthielten. Es stellte sich heraus, dass alle ESY-Clone, mit Ausnahme von 2D und 3B, die erwarteten 10 und 7,6 kb großen D-Gen-Fragmente enthielten. Die genomischen Hefe-Sequenzen wurden durch Hybridisierung mit dem repetitiven Ty-Element von Hefe in allen ESY-Clonen, mit Ausnahme von 2B, 2D, 100/1500 und 5C nachgewiesen. Die ESY-Clone 2B, 3A und 5C wurden in C57B/6-Blastozysten mikroinjiziert, wie vorstehend beschrieben, und chimäre Mäuse (10 vom 2B-Clon, 1 vom 3A-Clon und 1 vom 5C-Clon) wurden erzeugt. Southern-Blot-Analyse von Schwanz-DNA von 10 dieser chimären Tiere zeigte sowohl die Anwesenheit der meisten, wenn nicht aller der apparenten 10 Alu-Fragmente, die in yA287-C10 in Hefe nachgewiesen worden waren, als auch die Anwesenheit von VH2- und D-Gen-Fragmenten an. Die erzeugten chimären Mäuse wurden für eine Untersuchung der Übertragung über die Keimbahn mit C57BL16J-Mäusen gekreuzt. Eine chimäre männliche Maus, 78K-3, die von dem 2B-Clon abstammte, übertrug das ES-Zell-Genom mit einer Häufigkeit von 100% auf ihre Nachkommen. Southern-Blot-Analyse der Schwanz-DNA von 4 der 6 Agouti-Mäusejungen zeigte die Anwesenheit von Sequenzen für die schwere Kette des Menschen.
  • Fusionsexperimente mit Hefe, die den menschlichen kappa-Ketten-YAC A80-C7, angezielt mit pLUTO (yA80-C7) enthielten, mit E14.1TG3B1-ES-Zellen erzeugten 2 HAT-resistente ESY-Clone: M4.4.1 und M5.2.1. Southern-Blot-Analyse von mit HindIII gespaltenen DNAs aus diesen Clonen ergab die Anwesenheit von allen apparenten 10 Alu-Fragmenten, die in yA80-C7 in Hefe nachgewiesen wurden. In beiden Clonen waren die genomischen Hefe-Sequenzen integriert. ESY-Clone wurden in C57B1/6J-Blastozysten mikroinjiziert, und chimäre Mäuse wurden erzeugt.
  • BEISPIEL VII
  • Produktion von menschlichem Ig durch chimäre Mäuse durch Einführung von menschlichem Ig unter Verwendung von homologer Rekombination
  • Als ein alternativer Ansatz zu dem, der in den Beispielen I–VI dargestellt wird, werden menschliche Ig-Gene in den Ig-Locus der Maus eingeführt, indem die Immunglobulin-Loci für die schwere und die leichte Kette der Maus direkt durch Fragmente der menschlichen Loci für die schwere und die leichte Kette unter Verwendung von homologer Rekombination ersetzt werden. Anschließend erfolgt die Erzeugung von chimären transgenen Tieren, in denen die von embryonalen Stammzellen abstammenden Zellen zur Keimbahn beitragen.
  • A. Konstruktion des Ersetzungs-Vektors für die schwere Kette des Menschen
  • Die ersetzenden menschlichen Sequenzen umschließen das 100 kb große SpeI-Fragment aus genomischer DNA, welches die menschliche VH6-D-J-Cμ-Cδ-Region der schweren Kette umfasst, die aus einer menschlichen YAC-Bibliothek, wie vorstehend beschrieben, isoliert worden war. Die flankierenden Sequenzen für die schwere Kette der Maus, die den Ersetzungsvorgang durch homologe Rekombination steuern, enthalten ein 10 kb großes BamHI-Fragment der Cε-Cα-schweren Kette der Maus und ein 5'-J558-Fragment, welches die 5'-Hälfte des J558-Fragmentes der variablen Region der schweren Kette der Maus umfasst, an den 3'- beziehungsweise 5'-Enden der menschlichen Sequenzen (16). Diese Maus-Sequenzen werden aus einer genomischen Maus-Embryo-Bibliothek unter Verwendung der von Tucker et al. (1981), PNAS USA, 78: 7684–7688 beziehugsweise Blankenstein und Krawinkel (1987, vorstehend) beschriebenen Sonden isoliert. Das 1150 bp große XhoI bis BamHI-Fragment, welches ein Gen für Neomycin-Resistenz, gesteuert durch den Promotor des Thymidinkinase-Gens des Herpes simplex-Virus (HSV-tk) und einen Polyom-Enhancer, beinhaltet, wird aus pMC1Neo isoliert (Koller und Smithies, 1989, vorstehend). Ein synthetischer Adapter wird diesem Fragment angefügt, um das XhoI-Ende in ein BamHI-Ende umzuwandeln, und das entstandene Fragment wird in einem Plasmid mit dem Maus-BamHI-FragmentI-Cε-Cα verbunden.
  • Von dem YAC-Clon, der den menschlichen Locus für die schwere Kette enthält, werden entweder durch inverse PCR (Silverman et al. (1989), PNAS, 86: 7485–7489), oder durch Plasmid-Rettung in E. coli (Burke et al., (1987); Garza et al. (1989) Science, 246: 641–646; Trauer et al., 1989) DNA-Sequenzen von jedem Ende der Insertion gewonnen (vgl. 8). Die isolierte menschliche Sequenz vom 5'-V6-Ende des YAC wird in einem Plasmid an die J558-Sequence der Maus ligiert, und auf gleiche Weise wird die menschliche Sequenz, die vom 3'-Cd-Ende des YAC stammt, in dem Plasmid, das Neo- und vorstehend beschriebenes Maus-Cε-Cα enthält, an das Neo-Gen ligiert. Das Segment Mensch-V6-Maus-J558 wird nun in einen Halb-YAC-Clonierungsvektor subcloniert, welcher eine selektierbare Hefe-Markierung (HIS3), die in dem ursprünglichen IgH-YAC nicht vorhanden ist, ein Zentromer (CEN) und ein einzelnes Telomere (TEL) einschließt. Die Mensch-Cδ-Neo-Maus-Cε-Cα wird in gleicher Weise in einen separaten Halb-YAC-Vektor mit einer anderen selektierbaren Hefe-Markierung (LEU2) und einem einzelnen TEL subcloniert. Der Halb-YAC-Vektor, der die menschliche V6-DNA enthält, wird linearisiert und verwendet, um einen Hefe-Stamm, bei dem die chromosomalen HIS3- und LEU2-Loci deletiert worden sind und der den IgH-YAC trägt, zu transformieren. Selektion auf Histidin-Prototrophie lässt Hefe-Kolonien entstehen, bei denen homologe Rekombination zwischen den menschlichen V6-DNA-Sequenzen stattgefunden hat und die einen rekombinanten YAC enthalten. Der Halb-YAC-Vektor, der die menschliche Cd-DNA enthält, wird dann linearisiert und verwendet, um den Hefe-Stamm, der im vorherigen Schritt erzeugt worden war, zu transformieren. Selektion auf Leucin-Prototrophie führt zu einem Hefe-Stamm, der den gesamten IgH-Ersetzungs-YAC enthält (vgl. 16). Bevorzugt werden beide Anzielungsvorgänge in einem einzigen Transformationsschritt durchgeführt, der gleichzeitig auf Leucin- und Histidin-Prototrophie selektiert. Dies ist besonders nützlich, wenn die ursprünglichen zentrischen und azentrischen YAC-Arme eine gegenläufige Ausrichtung zu der in 16 gezeigten aufweisen. Dieser YAC wird isoliert und durch Mikroinjektion in ES-Zellen eingeführt, wie vorstehend für Embryos beschrieben.
  • BEISPIEL VIII
  • Kreuzen von transgenen Mäusen
  • A. Erzeugung von menschliche monoclonale Antikörper produzierenden Mäusen
  • Mäuse, die den menschlichen Immunglobulin-Locus enthalten, werden mit Mäusen mit inaktivierten murinen Immunglobulin-Genen gepaart, um Mäuse zu erzeugen, die ausschließlich menschliche Antikörper produzieren. Ausgehend von vier heterozygoten Stämmen sind drei Generationen an Kreuzungen erforderlich, um eine Maus zu erzeugen, die homozygot für inaktive murine Immunglobuline der kappa- und schweren Kette und heterozygot für die menschlichen Immunglobulin-Loci für die schwere und kappa-Kette ist. Das Zuchtschema wird in 17 dargestellt.
  • BEISPIEL IX
  • Produktion von menschlichen monoclonalen Antikörpern
  • A. Immunisierung von Mäusen
  • Chimäre Keimbahn-Mäuse, die integrierte menschliche DNA der Immunglobulin-Loci enthalten, werden durch Injektion eines Antigens in Adjuvans immunisiert. Den Mäusen wird 14 Tage nach der ersten Immunisierung eine Auffrischung mit Antigen verabreicht, die nach 35 und 56 Tagen wiederholt wird. Eine Blutabnahme wird bei den immunisierten Tieren vorgenommen, um den Serumtiter für Antikörper gegen das immunisierende Antigen zu untersuchen. Die Maus mit dem höchsten Titer wird getötet, und die Milz wird entnommen.
  • B. Fusion von Milzzellen
  • Myelom-Zellen, die als Fusionspartner für die Milzzellen verwendet werden, werden 6 Tage vor der Fusion aufgetaut und in Gewebekultur gezüchtet. Einen Tag vor der Fusion werden die Zellen in frisches Kulturmedium, das 10% fötales Kälberserum enthält, in einer Konzentration von 5 × 105 Zellen/ml aufgeteilt. Am Morgen der Fusion werden die Zellen mit einem gleichen Volumen an Kulturmedium verdünnt, das mit 20% fötalem Kälberserum und 2X OPI(3 mg/ml Oxalacetat, 0,1 mg/ml Natriumpyruvat und 0,4 lE/ml Insulin)-Lösung ergänzt war.
  • Nach Tötung der Maus wird die Milz unter aseptischen Bedingungen entnommen und in eine Schale mit Kulturmedium platziert. Die Zellen werden auseinandergerissen, bis die Milz in feine Stücke zerrissen ist und die meisten Zellen entfernt worden sind. Die Zellen werden in frischem, sterilem Kulturmedium gewaschen, und die Klumpen können sich abwaschen.
  • Die Milzzellen werden dann zweimal durch Zentrifugation in Kulturmedium ohne Serum gewaschen. Während des zweiten Waschganges werden die Myelom-Zellen ebenfalls in einem separaten Röhrchen gewaschen. Nach dem letzten Waschgang werden die beiden Zell-Pellets kombiniert und einmal zusammen zentrifugiert.
  • Eine Lösung aus 50% Polyethylenglycol (PEG) wird langsam zu dem Zell-Pellet zugegeben, während die Zellen resuspendiert werden; dies erfolgt über einen Gesamtzeitraum von zwei Minuten. 10 ml vorgewärmtes Kulturmedium werden zu der Zelllösung zugegeben, wobei langsam über 3 Minuten gerührt wird. Die Zellen werden zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die Zellen werden in 10 ml Kulturmedium, das mit 20% fötalem Kälberserum, 1X OPI-Lösung und 1 × AH-Lösung (58 μM Azaserin, 0,1 mM Hypoxanthin) ergänzt ist, resuspendiert. Die fusionierten Zellen werden in Aliqots in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen ausgebracht und bei 37°C über eine Woche kultiviert.
  • Der Überstand wird unter aseptischen Bedingungen jeder Vertiefung entnommen und in Pools zusammengegeben. Diese Pools werden auf Reaktivität gegenüber dem immunisierenden Antigen untersucht. Bei positiven Pools werden die einzelnen Vertiefungen weiter untersucht. Wenn eine positive Vertiefung identifiziert worden ist, werden die Zellen von der Platte mit 96 Vertiefungen in 0,5 ml Kulturmedium, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, 1X OPI und 1X AH, auf eine Platte mit 24 Vertiefungen überführt. Sobald diese Kultur dicht wird, werden die Zellen in 5 ml expandiert, und dann in 10 ml. In diesem Stadium werden die Zellen subcloniert, so dass sich eine einen einzelnen Antikörper produzierende Zelle in der Kultur befindet.
  • Im Einklang mit den vorstehenden Verfahrensweisen kann ein chimärer nicht menschlicher Wirtsorganismus, besonders ein muriner Wirtsorganismus, produziert werden, der immunisiert werden kann, um menschliche Antikörper oder Analoga, die für ein Immunogen spezifisch sind, zu produzieren. Auf diese Weise werden die Probleme, die mit der Gewinnung von menschlichen monoclonalen Antikörpern verbunden sind, vermieden, weil der transgene Wirtsorganismus mit Immunogenen immunisiert werden kann, die bei einem menschlichen Wirtsorganismus nicht verwendet werden könnten. Darüber hinaus kann man Auffrischungsinjektionen und Adjuvantien verwenden, die bei einem menschlichen Wirtsorganismus nicht gestattet sein würden. Die entstandenen B-Zellen können dann zur kontinuierlichen Produktion des gewünschten Antikörpers unsterblich gemacht werden. Die unsterblich gemachten Zellen können zur Isolierung der Gene, die das Immunglobulin oder Analog codieren, verwendet werden, und sie können einer molekularen Modifikation durch Verfahren wie etwa in vitro-Mutagenese oder andere Techniken unterworfen werden, um die Eigenschaften der Antikörper zu modifizieren. Diese modifizierten Gene können dann durch Transfizierung in die unsterblich gemachten Zellen zurückgebracht werden, um eine kontinuierliche sängerstämmige zelluläre Quelle für die gewünschten Antikörper bereitzustellen. Die vorliegende Erfindung liefert eine zweckmäßige Quelle für menschliche Antikörper, bei der die menschlichen Antikörper in analoger Weise zur Produktion der Antikörper in einem menschlichen Wirtsorganismus hergestellt werden. Die Wirtstierzellen erlauben auf zweckmäßige Weise die Aktivierung und Neuordnung von menschlicher DNA in den Wirtszellen zur Produktion von menschlichen Antikörpern.
  • Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung können menschliche Antikörper gegen menschliche Immunogene, z. B. Proteine, produziert werden, indem der sängerstämmige Zielwirtsorganismus mit menschlichen Immunogenen immunisiert wird. Die entstandenen Antisera werden für das menschliche Immunogen spezifisch sein und können aus dem Serum des Wirtsorganismus geerntet werden. Die immunisierten B-Zellen des Wirtsorganismus können zur Immortalisierung verwendet werden, z. B. durch Myelom-Zellfusion, Transfizierung usw., um unsterbliche Zellen, z. B. Hybridome, für die Produktion von monoclonalen Antikörper zu erhalten. Antikörper, Antiserum und monoclonale Antikörper werden in Übereinstimmung mit der Zellart, die die Antikörper produziert, glycosyliert werden. Seltene variable Regionen des Ig-Locus können zur Produktion der Antikörper herangezogen werden, so dass Antikörper, die eine seltene variable Region aufweisen, erhalten werden können.
  • Obgleich die vorstehende Erfindung recht genau zum Zweck des klaren Verständnisses durch Illustration und Beispiel beschrieben worden ist, wird Fachleuten auf dem Gebiet im Licht der Lehren aus dieser Erfindung klar sein, dass bestimmte Veränderungen und Modifikationen hierbei vorgenommen werden können, ohne den Rahmen der anhängenden Patentansprüche zu verlassen.

Claims (20)

  1. Verfahren zur Herstellung einer embryonalen Stamm(ES)-Zelle eines nicht-menschlichen Säugers, die zumindest einen Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins und zumindest einen Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins stabil in das Genom der ES-Zelle des nicht-menschlichen Säugers integriert hat, wobei der Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die schwere Kette des menschlichen Immuglobulins zu codieren, und wobei der Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die leichte Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Kombinieren unter Fusionsbedingungen der ES-Zellen eines nicht-menschlichen Säugers und von Hefe-Sphäroplasten, die eine oder mehrere künstliche Hefechromosomen (YACs) enthalten, umfassend den Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins und den Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins, wobei die YACs ein Gen enthalten, welches einen selektierbaren Marker codiert, wobei die Teile der Loci des menschlichen Immunglobulins stabil in das Genom der embryonalen Stammzellen integriert werden; und (b) Auswählen der ES-Zellen, die die Loci des menschlichen Immunglobulins tragen, anhand des Markers oder der Marker.
  2. Embryonale Stamm(ES)-Zelle eines nicht-menschlichen Säugers, die zumindest einen Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins und zumindest einen Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins stabil in das Genom der ES-Zelle eines nicht-menschlichen Säugers integriert hat, wobei der Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die schwere Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, und wobei der Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die leichte Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, und wobei die ES-Zelle eines nicht-menschlichen Säugers mittels des Verfahrens nach Anspruch 1 hergestellt wird.
  3. Verfahren zur Produktion eines chimären nicht-menschlichen Säugers, der zumindest einen Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins und zumindest einen Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins stabil in das Genom von zumindest einigen seiner Zellen integriert hat, wobei der Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die schwere Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, und wobei der Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die leichte Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Herstellen einer ES-Zelle eines nicht-menschlichen Säugers nach Anspruch 2; und (b) Transferieren der ausgewählten embryonalen Zellen in eine nicht-menschliche Wirts-Blastozyste, Implantieren der Blastozyste in eine pseudoschwangere nicht-menschliche Sauger-Empfängerin und Zulassen, dass die Blastozyste ausgetragen wird für die Produktion des chimären nicht-menschlichen Säugers.
  4. Chimärer nicht-menschlicher Säuger, der zumindest einen Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins und zumindest einen Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins stabil in das Genom von zumindest einigen seiner Zellen integriert hat, wobei der Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die schwere Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, und wobei der Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die leichte Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, und wobei der chimäre nicht-menschliche Säuger mittels des Verfahrens nach Anspruch 3 produziert wird.
  5. Verfahren zur Produktion eines transgenen nicht-menschlichen Säugers und seiner Nachkommen, die zumindest einen Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins und zumindest einen Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins stabil in das Genom ihrer somatischen und Keimzellen integriert haben, wobei der Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die schwere Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, und wobei der Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die leichte Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, umfassend die Schritte: (a) Produzieren eines chimären nicht-menschlichen Säugers nach Anspruch 4; und (b) Züchten des chimären nicht-menschlichen Säugers wie erforderlich für die Produktion des transgenen nicht-menschlichen Säugers und seiner Nachkommen.
  6. Transgener nicht-menschlicher Säuger und seine Nachkommen, die zumindest einen Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins und zumindest. einen Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins stabil in das Genom ihrer somatischen und Keimbahnzellen integriert haben, wobei der Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die schwere Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, und wobei der Teil des Locus einer leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins ausreichend ist, die leichte Kette des menschlichen Immunglobulins zu codieren, und wobei der nicht-menschliche Säuger mittels des Verfahrens nach Anspruch 5 produziert wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3 oder 5, wobei der Teil des Locus einer schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins eine DNA-Sequenz ist, die identisch ist mit der Keimbahn-DNA-Sequenz des menschlichen Chromosoms 14 von den D-Segment-Genen des Locus einer schweren Kette des menschlichen Immunglobulins, sich fortsetzend durch die J-Segment-Gene und die Gene der konstanten Region durch Cμ dieses Locus, wobei die DNA-Sequenz keine gamma-konstante Region enthält, und wobei das DNA-Fragment mit zumindest einem menschlichen V-Segment-Gen funktionell verbunden ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3, 5 oder 7, wobei das Genom der ES-Zelle eines nicht-menschlichen Säugers zumindest einen inaktivierten endogenen Locus einer schweren Kette eines Immunglobulins umfasst, wobei der Locus inaktiviert ist, um eine Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkripts des neugeordneten Locus einer schweren Kette des Immunglobulins zu verhindern.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Genom der ES-Zelle des nicht-menschlichen Säugers ferner zumindest einen inaktivierten endogenen Locus einer leichten Kette des Immunglobulins umfasst, wobei der Locus inaktiviert ist, um die Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkripts des neugeordneten Locus einer leichten Kette des Immunglobulins zu verhindern.
  10. ES-Zelle nach Anspruch 2 oder nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 4 oder 6, wobei der Teil des Locus einer schweren Kette des menschlichen Immunglobulins eine DNA-Sequenz ist, die identisch ist mit der Keimbahn-DNA-Sequenz des menschlichen Chromosoms 14 der D-Segment-Gene des Locus einer schweren Kette des menschlichen Immunglobulins, sich fortsetzend durch die J-Segment-Gene und die Gene der konstanten Region durch Cμ dieses Locus, wobei diese DNA-Sequenz keine gamma-konstante Region enthält, und wobei das DNA-Fragment mit zumindest einem menschlichen Gen des V-Segments funktionell verbunden ist.
  11. ES-Zelle nach Anspruch 2 oder 7, wobei das Genom der ES-Zelle des nicht-menschlichen Säugers zumindest einen inaktivierten endogenen Locus einer schweren Kette des Immunglobulins umfasst, wobei der Locus inaktiviert ist, um die Neuordnung des Locus zu verhindern, und um die Bildung eines Transkripts des neugeordneten Locus einer schweren Kette des Immunglobulins zu verhindern.
  12. ES-Zelle nach Anspruch 11, wobei das Genom der ES-Zelle des nicht-menschlichen Säugers ferner zumindest einen inaktivierten endogenen Locus einer leichten Kette des Immunglobulins umfasst, wobei der Locus inaktiviert ist, um die Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkripts des neugeordneten Locus einer leichten Kette des Immunglobulins zu verhindern.
  13. Chimärer nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 4 oder 10, wobei das Genom der Zellen mit einem Teil des Locus einer schweren Kette des menschlichen Immunglobulins und einem Teil des Locus einer leichten Kette des menschlichen Immunglobulins zumindest einen inaktivierten endogenen Locus einer schweren Kette des Immunglobulins umfasst, wobei der Locus inaktiviert ist, um die Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkripts des neugeordneten Locus einer schweren Kette des Immunglobulins zu verhindern.
  14. Chimärer nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 13, wobei das Genom der Zellen mit einem Teil des Locus einer schweren Kette des menschlichen Immunglobulins und einem Teil des Locus einer leichten Kette des menschlichen Immunglobulins ferner zumindest einen inaktivierten endogenen Locus einer leichten Kette des Immunglobulins umfasst, wobei der Locus inaktiviert ist, um die Neuordnung des Locus zu verhindern, und um die Bildung eines Transkripts des neugeordneten Locus einer leichten Kette des Immunglobulins zu verhindern.
  15. Transgener nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 6 oder 10, wobei das Genom der somatischen und Keimbahnzellen zumindest einen inaktivierten Locus einer schweren Kette des Immunglobulins umfasst, wobei der Locus inaktiviert ist, um die Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkripts des neugeordneten Locus einer schweren Kette des Immunglobulins zu verhindern.
  16. Transgener nicht-menschlicher Säuger nach Anspruch 15, wobei das Genom der somatischen und Keimbahnzellen ferner zumindest einen inaktivierten endogenen Locus einer leichten Kette des Immunglobulins umfasst, wobei der Locus inaktiviert ist, um die Neuordnung des Locus zu verhindern und um die Bildung eines Transkripts des neugeordneten Locus einer leichten Kette des Immunglobulins zu verhindern.
  17. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei zumindest ein endogener Locus einer schweren Kette des Immunglobulins mittels Deletion aller J-Segment-Gene inaktiviert wird.
  18. ES-Zelle oder nicht-menschlicher Säuger nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei zumindest ein endogener Locus einer schweren Kette des Immunglobulins mittels Deletion aller J-Segment-Gene inaktiviert wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei zumindest ein endogener Immunglobulin-Locus der kappa-leichten Kette mittels Deletion des Cκ-Gens inaktiviert wird.
  20. ES-Zelle oder nicht-menschlicher Säuger nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei zumindest ein endogener Immunglobulin-Locus der kappa-leichten Kette mittels Deletion des Cκ-Gens inaktiviert ist.
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