JPH10512449A

JPH10512449A - 融合細胞のスクリーニング効率を改良する方法

Info

Publication number: JPH10512449A
Application number: JP8522458A
Authority: JP
Inventors: ジャコボヴィッツ，アヤ; シー．ハーディー，マーガレット; グリーン，ラリー
Original assignee: セルジェネシス，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-01-20
Filing date: 1996-01-19
Publication date: 1998-12-02
Also published as: WO1996022380A2; WO1996022380A3; AU4906696A; KR19980701536A; CA2210986A1; EP0804604A2

Abstract

(57)【要約】所望の遺伝子の存在に関して融合細胞をスクリーニングする効率を改良する方法を開示する。この方法は、不死化細胞融合相手のある種の培地条件に対する感受性を克服するマーカーを有する所望の遺伝子を提供することを含む。この方法は、Ｂ細胞中に存在するイムノグロブリン遺伝子上にマーカーが含まれることで例示される。

Description

【発明の詳細な説明】融合細胞のスクリーニング効率を改良する方法本出願は、1990年１月12日に出願された米国特許出願第07/466,008号の一部継続出願である1990年11月８日に出願された米国特許出願第07/610,515号の一部継続出願である1992年７月24日に出願された米国特許出願第07/919,297号の一部継続出願である1993年３月15日に出願された米国特許出願第08/031,801号の一部継続出願である1993年８月27日に出願された米国特許出願第08/112,848号の一部継続出願である1994年４月28日に出願された米国特許出願第08/234,145号の一部継続出願である。これら出願の内容はここで引用したことにより本明細書に含まれているものとする。技術分野本発明は、所望のゲノムの特徴を含有する融合細胞コロニーの割合を増加させる方法に関する。特に本発明は、所望のゲノムの特徴の近接マーカーであって、不死化細胞が、他の場合には感受性であるはずの条件下で生育できるようにするマーカーの提供に関する。背景技術パイオニアとしてのKohlerとMilsteinの研究以来、形質転換されてないＢ細胞を、たとえばポリエチレングリコールの存在下で、不死化細胞系に融合することによって不死化させることができることは公知である。この不死化細胞系は、典型的な場合、「形質転換された」細胞系または腫瘍細胞系である。融合した細胞において、形質転換された細胞に不死性を授けたものが何であってもそれは融合産物中で保持される。この融合手順は、一般に、融合した細胞のみが培地中で生存することができ、そのためうまく融合した産物のコロニーのみを自動的に選択することができるようにして行なわれる。典型的な場合、このためには、一定の培地条件に対して感受性となる表現型特性を有する腫瘍細胞系の細胞を不死化細胞として使用する。融合していない非形質転換細胞は不死性でないので生育することができない。しかし、融合していない形質転換細胞のコロニーの生育を妨げることに関連する条件に対する形質転換細胞系の感受性を利用して培地を選択しなければならない。極めて一般的に使われている感受性は、ヒポキサンチン−アミノプテリン‐チミジン（HAT ）培地、すなわち、細胞が生育するにはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）という酵素の存在を必要とする培地上で生育できないという性質である。不死化細胞系はそれ自身の遺伝特性のために、この酵素を生産することができない。ついで、融合混合物をHAT 培地上で培養すると、不死化細胞はHPRTを欠くため生育できない。融合細胞は、不死であり、非形質転換細胞の能力に基づいてHPRTを産生もするので生育することができる。 KohlerとMilsteinの融合技術を細胞融合手順に適合させると、所望の特性を有するモノクローナル抗体を分泌することができる不死化Ｂ細胞が得られる。この技術では、抗体が望まれる抗原で動物を免疫する工程と、脾臓または抹消血リンパ球（PBL ）からＢ細胞を収集する工程と、そのＢ細胞を不死化細胞系と融合させる工程と、融合細胞を選抜する工程と、そして融合細胞の個々のコロニーを所望の抗体の分泌に関してスクリーニングする工程とが採用される。この古典的な手順では、以下のふたつの理由により、所望の特徴をもつ抗体を実際に分泌する融合細胞の割合は小さいものに過ぎない。すなわち、第一に、すべてのＢ細胞が所望の抗体を第一の場所で分泌できるわけではなく、第二に、たとえそうであったとしても、抗体をコードしている遺伝子はもとの融合細胞の子孫に伝達されるほど安定な様式で融合細胞のゲノム中に入らないことが多いためである。もちろん、細胞が生存するためには、関連するイムノグロブリン遺伝子座が子孫に伝達される必要はないであろう。というのは、HPRTはＢ細胞の全てにおいてＸ染色体バックグラウンド上にコードされているからである。本発明は、所望の抗体のための遺伝子またはその他の遺伝子成分を含有してはいないが、成功したコロニーを多数得るために上記第二の理由を最小にする方法を提供するものである。発明の開示本発明は、所望の遺伝子成分を含有する融合の成功割合を高くする、Kohler/M ilsteinの融合技術を改変した技術を提供する。これは、特に、遺伝子成分がイムノグロブリンを産生するのに必要とされる遺伝子座のセットである場合に有用である。所望のゲノム成分が存在するＤＮＡ自身を改変して、融合相手として使用しようとする不死化細胞の感受性を克服することができるマーカーを含ませる。このようにすると、不死化細胞系が感受性である培地条件で成育できるようにするのに、所望のゲノム成分を含有している非形質転換細胞が生来有するHPRTのような「バックグラウンド」マーカーは必要とされない。理想的な場合、このマーカーは、非形質転換細胞のバックグラウンドゲノム相補体中に存在しなくてもよい。すなわち、本発明は、ひとつの局面において、所望のゲノム成分を含有する融合細胞のコロニーの割合を高めるための方法であって、この融合細胞は非形質転換動物（特に哺乳類または鳥類）細胞と所定の培地条件に対して感受性の形質転換細胞系の細胞とを融合させて得られるられ、以下の工程を有する。すなわち、形質転換細胞系の細胞の培地条件に対する感受性を克服するマーカーを有する上記所望のゲノム成分を提供する工程と、上記非形質転換動物細胞と上記形質転換細胞系の細胞とを融合を促進する条件下で混合して融合混合物を得る工程と、この融合混合物を上記所定の培地条件下で培養することによって融合細胞コロニーを選択する工程と、上記所望のゲノム成分に関して成功したコロニーをスクリーニングする工程とを有する。他の局面において本発明は、本発明の方法によって作製される不死化細胞系およびこれらの細胞を培養することによって所望の産物を産生する方法である。図面の簡単な説明図１Ａ〜Ｅは、実施例２に記載したＥＳクローンに組込まれたｙHPRTおよび酵母ゲノムＤＮＡを特徴付けるためのサザンブロット分析の結果を示す写真である。Ａはヒト反復Alu 配列である。ＢとＣとはそれぞれ右側および左側のYAC アームのpBR 特異的配列である。Ｄは酵母のＴｙ反復配列である。Ｅは酵母の単一コピー遺伝子LYS2である。図２Ａ〜Ｄは、実施例２に記載したＥＳ細胞染色体中のｙHPRTおよび酵母ゲノム配列の組込みを検出するためのin situハイブリダイゼーションの結果を示す光学顕微鏡写真である。ＡとＢとはビオチン化ヒトゲノム配列にハイブリダイズしたESY8-7細胞からの中期展開(metaphase spread)である。ＣとＤとはビオチン化酵母反復ＤＮＡ配列にハイブリダイズしたESY8-6細胞からの中期展開または間期核を示す。図３Ａ〜Ｃは、実施例２に記載したin vitroのＥＳ細胞の分化の間およびマウス生殖細胞系を介した伝達の間のｙHPRTの安定な保持を証明する。図４ＡおよびＢは、実施例２に記載した種々のマウスの組織におけるヒトHPRT 遺伝子の発現を示す電気泳動ゲルの写真である。図５は、実施例３に記載したマウスの交配を示すダイヤグラムである。発明の実施の形態本発明の方法は、一般的に、ゲノム成分を別にして、抗体を分泌することができる不死化した細胞を得るために一般に使われている方法と類似している。たとえば、抗体のＨ鎖とＬ鎖とをコードしている遺伝子座は、ＤＮＡ配列上でHPRT遺伝子やネオマイシン遺伝子のようなマーカーをコードしている遺伝子に近接している。この明らかに無害な改変により、選択したゲノム成分の産物を生産する不死化融合細胞のコロニーの割合が非常に高くなる。本明細書で使用する「非形質転換」細胞とは、培養において無限に増殖することができない、すなわち不死でない細胞を意味している。これらの細胞は「細胞系」ではない。すなわち、これらは繰り返し継代することができない。非形質転換細胞の例には、すでに分化しており悪性でないほとんどの動物細胞、好ましくは哺乳類または鳥類の細胞が包含される。最も一般的に使われるものはＢ細胞であるが、所望のタンパク質を産生し得る限りにおいて、他の非形質転換細胞も使用することができる。すなわち、適切な非形質転換細胞には、Ｔ−リンパ球、筋肉細胞、下垂体細胞、膵臓細胞なども包含されよう。本明細書で使用する「形質転換」細胞とは、無限に継代する能力を獲得しており、したがって細胞系として樹立することができる細胞を意味している。当業界では、HeLa細胞、CHO 細胞、COS 細胞および多数のマウス骨髄腫細胞系を始めとして、多数の細胞系が知られている。本発明の方法において有用であるためには、この形質転換細胞は、特定の増殖条件に対する感受性を付与する特性をも有していなければならない。この感受性は非形質転換融合相手から得ることができるひとつ以上の遺伝子産物の生産によって覆すことができるものである。「融合細胞系」とは、成功した融合、すなわち、不死化または形質転換された細胞が、所望のゲノム化合物を含有する非形質転換細胞とのうまく融合したという融合の産物を意味している。細胞融合を起こすのに最も一般的に使われている技術は、ポリエチレングリコールによる処理である。しかし、当業界では、たとえばエレクトロポレーションや融合誘導(fusogenic)ウィルス処理を始めとする他の技術もまた、利用可能である。「所望のゲノム成分」とは、非形質転換細胞のゲノム相補体のＤＮＡのうち、融合細胞系の子孫に伝達させたい部分を意味している。このゲノム成分は、たとえば、成長因子または成長ホルモンをコードしている遺伝子のような単一の遺伝子に対する発現系であってもよい。本発明のひとつの重要な態様では、この「ゲノム成分」が１つ以上の遺伝子に対する１以上の発現系を含んでいる。本発明の技術の特に重要な応用の場合、関連するゲノム成分はイムノグロブリンのＨ鎖に対する発現系とイムノグロブリンのＬ鎖（またはそれらの適当な一部分）に対する発現系とで構成される。この結果得られる抗体は、特定の標的抗原に対して免疫反応性である。「発現系」が、必ずしも異種プロモーターに機能を発揮するように結合されるべく操作されたクローニングされたタンパク質をコードしているＤＮＡを指すものではない（そのような構築物も包含されるが）ことは明らかであろう。また、「発現系」の範囲内には、たとえば、発現制御配列とタンパク質コード配列の両方を含むゲノムＤＮＡの断片もある。特に、本発明で考えられるイムノグロブリンに対する発現系は、特定のイムノグロブリンに対する再配列されたコード配列と再配列されていないゲノム遺伝子座の両方を含む。本発明の方法の利点を評価するためには、非形質転換細胞と形質転換細胞との融合がうまくいった結果得られるコロニーが必ずしも相手の完全なゲノム内容物を有している必要はないということを理解することが重要である。すなわち、たとえば、Ｂ細胞と不死化細胞とをうまく融合させて、イムノグロブリン遺伝子座の一方または両方を有してはいない、うまく融合した融合を得ることも完全に可能である。本願の親出願には、抗原の投与に応答してヒト抗体を生成することができるトランスジェニックマウスを得る方法が記載されている。このマウスを得るには、ヒトの再配列されてないＨ鎖およびＬ鎖イムノグロブリンの遺伝子座を、ベクターや酵母のスフェロプラストを用いてマウスの胚幹細胞（embryo stem cell，ＥＳ細胞）に挿入した。ここで、ヒトの遺伝子座は酵母の人工染色体（YAC ）に含有されており、選択マーカーで標識した。ネオマイシン耐性遺伝子（「neo 」遺伝子）とHPRT遺伝子の両方がマーカーとして記載されている。得られたＥＳ細胞を使用したマーカーによって適当なYAC の取込みについて選択する。キメラマウスを得るためにYAC 含有ＥＳ細胞を使用し、次いで交配育種することによって、再配列されてないヒトＨ鎖とＬ鎖遺の伝子座をゲノム相補体中に含有するマウスが得られた。これらのマウスでは、マーカーがイムノグロブリン遺伝子座に近接して含有されている。このトランスジェニックマウスを所望の抗原で免疫した後、Ｂ細胞を収集し、不死化細胞と融合させると所望の抗体を産生するコロニーが得られる。このプロセスの場合、所望のゲノム成分（すなわち、イムノグロブリンの重鎖と軽鎖の遺伝子座）はすでに同じＤＮＡ配列上で関連する成分に近接してマーカーを含有している。以上の融合を行なうとき、選択培地としてHAT を用いる標準的な方法を使用する場合は、HPRTをマーカーとして使用しているか、またはHPRTがイムノグロブリン遺伝子と関連する他のものであると、所望のゲノム成分を含有するうまく融合したコロニーを得る効率が向上する。その理由は以下の通りである。すなわち、得られるコロニーの全数のうちには、所望のゲノム成分のみを含有するが「バックグラウンド」のHPRT遺伝子を有するＢ細胞のＸ染色体は含有しない子孫が含まれている。一方、ＥＳ細胞の形質転換のための選択に別のマーカー（たとえばne o ）が使用されているが、Ｂ細胞と形質転換細胞との融合体のための選択には標準的なHAT 培地を用いると、成功したコロニーにはその子孫のＸ染色体上にバックグラウンドのHPRTを含有する融合体のみが含まれる。したがって、一方または両方のイムノグロブリンの遺伝子座を含有していないがバックグラウンドHPRT遺伝子のみを含有する融合体はプールから除かれない。そして、そのプールはＸ連鎖性HPRTを有するがＩｇ遺伝子座をまったくもたないかまたはそれらのうちの１つだけを有する融合物を含むことになる。また、形質転換細胞もまたネオマイシン抗生物質（またはG418含有培地）に対して感受性であるので、ＥＳ細胞改変のための挿入遺伝子上にマーカーその他としてneo 遺伝子が用いられたのであれば、Ｂ細胞／骨髄腫融合体の選択培地としてG418を含有する培地を使用することができるはずである。イムノグロブリン遺伝子座に近接したマーカーの提供では、成功した形質転換体の選択においてＥＳ細胞を形質転換におけるマーカーの使用に付随する結果を必要としないことは明らかであろう。このマーカーは、たとえば、ＥＳ細胞の形質転換に関して他のマーカーに加えて所望の遺伝子座に隣接させるか、またはマイクロインジェクションによって遺伝子座を受精卵に挿入するときに単に含ませることができる。この手順においては選択は必要ない。子孫を試験するには単に、所望の特性がゲノム中にうまく含まれているかどうかを適宜みればよい。それでも、標準的な組換え技術を用いて、所望の特性を示す遺伝子座に所望のマーカーを容易に具備させることができる。この方法は、多数の遺伝子が融合細胞の子孫に伝達されるべき所望のゲノム成分を含む場合に、多数のマーカーを使用することによってさらに改良することができる。たとえば、イムノグロブリン遺伝子の伝達に関して、Ｌ鎖にneo マーカーを具備させ、Ｈ鎖にHPRTマーカーを具備させてもよいであろう。融合においては、G418含有HAT 培地が選択に使用されるはずであるし、生存子孫は少なくともイムノグロブリンのＬ鎖、およびイムノグロブリンのＨ鎖またはＸ染色体をベースとするHPRTマーカーのいずれかを含有していなければならない。あるいは、これに加えて、ハイグロマイシン耐性のための遺伝子を本発明の方法においてマーカーとして使用することができる。本発明の方法のより直接的な具体例として、うまくいった相同組換えについて選択することができるように、十分な生存特性を有する非形質転換細胞を使用することができる。Ｂ細胞は、培養におけるその生存時間が許容できない程短いと思われるので、この具体例で使用するには好ましくない。しかし、有用な特性を示すかまたは有用な産物を産生し、かつ不死でないある種のＴ細胞クローンその他の細胞は、継代培養において充分に生存することができるので、マーカーを挿入する相同組換えの有用な候補である。非形質転換初代細胞を、ＤＮＡを取込ませる条件下で、たとえば、所望のゲノム成分のすぐ上流または下流にある配列と相同の配列によってブラケットをつけた（bracket）neo 耐性遺伝子を含有するベクターで処理する。相同組換えによって、ゲノム成分を含むＤＮＡ配列中にne o 遺伝子を組込んでいる成功した形質転換体を、次に、G418含有培地で増殖させることによって選択することができる。この場合、得られる非形質転換初代細胞は、所望のゲノム成分を含有する領域に近接してコードされているG418耐性を有する。標準的な融合プロトコルにおいて、G418に感受性の不死化細胞系がG418含有培地で生存するためには、成功した融合が必要である。G418を含有する培地で生存することができる、うまく融合した細胞は、この能力を非形質転換細胞から獲得しているはずである。neo 耐性遺伝子は、所望のゲノム成分と共に移行するので、この成分が子孫に伝えられることが確保される。融合産物のためにより伝統的な選択培地が有用である、より典型的な例においては、所望のゲノム成分に近接させてHPRTを導入する。この場合、多くの初代細胞では相同組換え後の直接選択を便利に使用することができない。なぜなら、このような細胞は、一般的に、すでにＸ染色体上にHPRT遺伝子を含有しているためである。しかし、上述のように、トランスジェニック動物は受精卵またはＥＳ細胞中にイムノグロブリン遺伝子を挿入することによって作製されている。このような方式で、HPRTは所望の遺伝子と共に直接導入することができる。この実施態様ではＨ鎖とＬ鎖をコードする両方の遺伝子がHPRTコード領域に近接していることを確実なものとすることができる。以下の実施例は本発明を例示するためのものであって本発明を限定するものではない。実施例１酵母の人工染色体を使用するヒト重鎖（Ｈ鎖）遺伝子座のクローニングＡ．ヒトＨ鎖を有する酵母人工染色体（YAC ）の作製ヒトＨ鎖のＶＨ６−Ｄ−Ｊ−Ｃμ−Ｃδ領域［Bermanら（1988年）EMBO J ．7: 727-738、図４参照］にまたがるSpeI断片を、Bermanら［（1988年）EMBO J ．7:7 27-738］に記載されているＤＮＡプローブを用いて、ヒトYAC ライブラリー［Bu rkeら、Science，236:806-812］から単離した。約100kbと概算されるひとつのクローンが得られた。単離されたYAC クローンを、ヒトＨ鎖に対する放射標識プローブ［Bermanら、上掲］を用い、パルスフィールドゲル電気泳動［Burkeら、上掲、Brownsteinら、Science,244:1348-1351］によって特徴付けした。Ｂ．YAC クローンの胚またはＥＳ細胞中への導入アガロースプラグ中で、目的とするYAC （すなわち、IgH 遺伝子座に由来する上述のSpeI断片を含むYAC ）を含有する酵母細胞から、高分子量のＤＮＡを調製した。ＣＨＥＦゲル装置上でＤＮＡをサイズ分画し、YAC バンドを低融点アガロースゲルから切り出した。このゲル断片をポリアミンで平衡化した後融解させ、アガラーゼ(agarase)で処理してアガロースを消化した。次に、このポリアミンでコートしたＤＮＡを受精したマウス胚の雄性前核に注入した後、上述のように偽妊娠雌の子宮に外科的に導入した。新生仔のトランスジェニックの性質を尾から単離したＤＮＡのスロットブロットによって分析し、少量の血清を得てウサギ抗ヒト抗体でＩｇ鎖の存在に関して試験することによってヒトＨ鎖の産生を分析した。マイクロインジェクションに代わるものとして、ＥＳ細胞：酵母プロトプラスト融合［Traverら（1989年）Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA，86:5898-5902、Pac hnisら（1990年）同87:5109-5113］によってYAC のＤＮＡをマウスＥＳ細胞に移した。まず、ｐＭＣ１Ｎｅｏ由来のネオマイシン耐性遺伝子またはHPRTその他の哺乳類の選択可能なマーカーと酵母の選択可能なマーカーとを、プラスミド中の非必須YAC ベクター配列中に挿入した。この構築物を使用してIgHYACを含有する酵母株を形質転換し、pMC1Neo （または他の選択可能なマーカー）を相同組換えによってIgH YAC のベクター配列中に組込んだ。次に、こうして改変したYAC をプロトプラスト融合［Traverら（1989年）、Pachnisら（1990年）］によってＥＳ細胞に移し、得られた完全なヒトIgH 配列を含むG418耐性ＥＳ細胞（または他の選択可能な表現型を示すもの）を用いてキメラマウスを作製した。あるいは、精製したYAC を、たとえばリポフェクションまたはリン酸カルシウム媒介ＤＮＡ移行によってＥＳ細胞に移した。実施例２ヒトＩｇ遺伝子のマウス中への導入Ａ．酵母におけるヒトＩｇ遺伝子のクローニング１．ＶＨ配列、Ｄ配列、ＪＨ配列、ｍｕ配列およびデルタ配列を含むヒトIgH Y ACクローンの同定と特徴付けヒトＶＨ６遺伝子のためのＰＣＲプライマー（Ｖ６Ａ＝5' GCA GAG CCT GCT G AA TTC TGG CTG 3'およびＶ６Ｂ＝5' GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTG G 3'）を用いてワシントン大学ヒトYAC ライブラリー［Washington University，St．Louis ，MO］から得たＤＮＡプールをスクリーニングした。次いで陽性のプールをコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、陽性のマイクロタイタープレートウェルをひとつ（A287-C10）同定した。サイズの異なるふたつのＶＨ６含有YAC （205kbおよび215kb）をマイクロタイターウェルから単離した。これらふたつのIgH YACすなわちA287-C10の小さい方（205kb）は、ＶＨ６に加えて、デルタ、ｍｕ、ＪＨ、Ｄ、ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ４の配列のためのプローブとハイブリダイズした。またふたつのIgH YACすなわちA287-C10の大きい方（ 215kb）は、デルタ、ＪＨ、Ｄ、ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ４のプローブとハイブリダイズしたがｍｕとはハイブリダイズしなかった。これらYAC は、ふたつのＶＨ１遺伝子、ひとつのＶＨ２、ひとつのＶＨ４およびひとつのＶＨ６遺伝子を含む少なくとも５個のＶＨ遺伝子由来の配列を含有していた。制限消化物の分析によって、205kbのYAC がＤ遺伝子クラスターの全部ではないがかなりの部分が除去された欠失（約20kbサイズ）を有しており、YAC の残りは完全であって生殖系の配置にあることが示された。この205kbのYAC のＰＣＲと詳細な制限消化分析によっていくつかの異なるＤ遺伝子ファミリーのメンバーの存在が証明された。215kbのYAC は完全な主要Ｄ遺伝子クラスターを含有しているように思われたが、ｍｕ遺伝子を除去した欠失（約10kb）を有していた。この欠失はＪＨクラスターまたはＪＨ遺伝子とｍｕ遺伝子との間に位置するエンハンサーに影響を与えないようにみえる。上記関連するふたつのIgH YACの推定される先祖、ＶＨ２遺伝子とデルタ遺伝子の間の全ゲノム領域を有する約225〜230kbのYAC ［Shinら、1991年、上掲］（図４参照）はA287-C10マイクロタイターウェル中では同定されなかった。そこで、先祖のYAC がライブラリーの継代中に失われたとの仮定の下に先祖YAC を探索するために、A287-C10マイクロタイタープレートウェルの初期のアリコートを検査した。A287-C10マイクロタイターウェルをストリークした［Washington Unive rsity，St．Louis，MO］。分析した10個のクローンのうち２個が明らかに関連のない他のYAC と共に230kbのIgH YACを含有していた。クローン１はさらにIgH YAC（約220kbのYAC ）を含有しており、クローン３はさらに約400kbのYAC を含有していた。IgH YACはｍｕ、完全なＤプロファイル［BamHI消化物に基づく。下記参照］およびＪＨを含有していた。クローン１からのIgH YACをA287-C10/A B1380とYPH857［遺伝子型＝MATα ade2 lys2 ura3 trp1 HIS5 CAN1 his3 leu2 c yh2 ］との間の交配における減数分裂分離によって関連してないYAC から物理的に分離してA287-C10(230kb)/MP313［宿主遺伝子型＝MATα ade2 leu2 lys2 his3 ura3 trp1 can1 cyh2］を得た。２．哺乳類の選択可能なマーカーであるHPRTによるA287-C10kb YACのターゲティング 6.1kbのBamHI断片上に含有されるヒトHPRTのミニ遺伝子［Reidら、Proc ．Natl .Acad.Sci. ，USA 87:4299-4303 (1990)］をｐＬＵＳ［Hermansonら、Nucleic Ac ids Research19 :4943-4938 (1991)］のポリリンカーのBamHI部位にサブクローニングすることによって、pLUTOとよばれるYAC 右アームターゲティングベクター（15.6kb）を作成した。230kbのIgH YACと関連のないYAC との両方を含有するA 287-C10/AB1380の培養物を直線化したpLUTO で形質転換し、Lys ＋形質転換体を選抜した。このLys+クローンをコロニーハイブリダイゼーションによってｍｕの存在についてスクリーニングした。ｍｕ、HPRTおよびLYS2に対するプローブとハイブリダイズした約245kbの単一のYAC を含有するひとつのクローンを同定した。クローニングしたヒトIgH 配列の完全な、未再配列の状態を証明するために、各種プローブを用いて、pLUTO でターゲティングされた230kbのA287-C10 YAC のサザン分析を実施した。ほとんどの場合、BamHI消化、HindIII消化およびEcoR I消化の結果物を、WI38（ヒト胎児肺由来細胞系）、A287-C10の205kbおよび215k bの欠失誘導体に対する制限データ、ならびに公表されている値と比較した。Ｄ（diversity、多様性）領域プローブ（0.45NcoI/PstI断片。Bermanら、1988年）とのハイブリダイゼーションによって決定された多様性（Ｄ）遺伝子プロフィールによって、期待された４つのＤ遺伝子セグメントＤ１〜Ｄ４［Siebenlistら、 1981年、Nature294:631-635］が証明された。たとえば、BamHIの場合、3.8kb、4 .5kb、6.9kbおよび7.8kbの４つの制限断片がA287-C10およびWI38で観察された。 WI38はさらに、染色体16D5領域［Matsudaら、1988年、EMBO7:1047-1051］に由来すると推定されるより大きいバンドもひとつ有していた。Ｄファミリー特異的プライマーおよびプローブを用いたＰＣＲとサザン分析によって、215kb の欠失誘導体YAC （これは230kb のYAC と同じ制限パターンをもつ完全なＤ領域をもっていると思われた）には、ＤＭ、ＤＮ、ＤＫ、ＤＡ、ＤＸＰおよびＤＬＲの各Ｄ遺伝子ファミリーの２〜４個のメンバーが存在することが証明された。Ｊ−ｍｕイントロンエンハンサーは、A287-C10の230kb YAC に由来するクローン化されたＰＣＲ産物（プライマーEnA＝5' TTC CGG CCC CGA TGC GGG ACT GC 3'、EnG1＝5' CCT CTC CCT AAG ACT 3' ）から配列決定され完全であることが決定されたが、これもまた、480bpのＰＣＲ産物をプローブとするとBamHI 、EcoRI およびHindI IIでほぼ予想されたサイズを有する単一の制限断片を生成した。このＪＨ領域を、DHG52と全ＪＨ領域にまたがる約６KBのBamHI ／HindIII 断片プローブ［Ra vetchら、1981年、Cell27:583-591］を用いて評価した。A287-C10はほぼ期待されたサイズの制限断片を生成した。また、同じサイズの制限断片がエンハンサーおよびＪＨプローブで検出された［Ravetchら、上掲、Shinら、1991年、上掲］。A287-C10およびWI38で検出された約18kbのBamHI JH断片は、0.9kbのｍｕプローブ配列ともハイブリダイズした［Ravetchら、上掲］。0.9kbのEcoRI 断片ｍｕプローブ［Ravetchら、上掲］とのハイブリダイゼーションでは、ほぼ期待されたサイズの制限断片が示された［Ravetchら、上掲、Shinら、上掲］。すなわち、BamHI で＞12kb（約17kbが期待された）、EcoRI で0.9kb（0.9kbが期待された）、そしてHindIII で約12kb（約11kbが期待された）である。WI38もA287-C10と同じサイズのBamHI 断片を生成した。ＪＨ領域とDHQ52 領域を欠失誘導体YAC の両方から配列決定したところ、両方とも生殖系の配置にあった。エキソン１のＰＣＲ産物（プライマーＤＩＢ＝5' CAA AGG ATA ACA GCC CTG 3'とＤ１Ｄ＝5' AG C TGG CTG CTT GTC ATG 3'との間の約160bpの領域を含む）を用いてデルタを分析した。A287-C10に対する制限断片は文献［Shinら、上掲］から期待されるものおよびWI38に対して決定されたものに近かった。YAC の3'側のクローニング部位はデルタの3'側の第一のEcoRI 部位［Shinら、上掲］またはさらに3'側の別のEc oRI 部位であり得る。ＶＨ１、ＶＨ４およびＶＨ６に対するＶＨ遺伝子プローブ［Bermanら、上掲］ならびにＶＨ２に対するＶＨ遺伝子プローブ［Takahashiら、1984年、Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA81:5194-5198］を用いてYAC の可変遺伝子含量を評価した。A287-C10はほぼ予想されたサイズを有するふたつのＶＨ１遺伝子を含有しており［Shinら、上掲、Matsudaら、1993年、上掲］、３つの酵素による制限分析では期待された断片サイズに近く、たとえばEcoRI で観察されたバンドは3.4kbおよび7.8kbである（予想されるのは3.4kbおよび7.2kb）。ＶＨ４（実測値5.3kb、予想値5.1kb）およびＶＨ６（実測値0.8kb、予想値0.9kb）に対して予想されたサイズのEcoRI 断片［Shinら、上掲、Matsudaら、1993年、上掲］がA287-C10に存在していた。予想されたサイズのEcoRI 断片がＶＨ２に対してみられた（実測値5.5kb、予想値5.4kb）が、BamHI 断片とHindIII 断片は予想されたものと異なっていた。BamHI 断片とHindIII 断片とpBR322プローブとの同時ハイブリダイゼーションによって、ＶＨ２遺伝子の5'端にあるEcoRI 部位［Sh inら、上掲］は5'側のクローニング部位であり、したがって天然の5'側のHindIII 部位とBamHI 部位が除去されていることが示唆された。YAC 挿入物の全体サイズ（約 220kbと推定される）は、最も3'側のＶＨ２遺伝子の5'端から始まってデルタ遺伝子座の3'側のEcoRI 部位まで伸びる完全な未再配列セグメントに対して予想されたサイズとよく一致している。３．ＣＫ配列およびＶＫ配列を含有するIgＫ YAC の同定および特徴付けワシントン大学［St．Louis，MO］ヒトYAC ライブラリーから得たパルス場ゲル（PFG ）プールの、ヒトκ定常領域（CK）遺伝子［2.5kb EcoRI 断片、ATCC第 59173号、Parklawn Dr.，Rockville，MD］由来のプローブを用いたスクリーニングでふたつのYAC を同定した。A80-C7(170kb)およびＡ276-F2(320kb)と指称されるこれらYAC はκ欠失性要素ｋｄｅ、ＣＫ、ＪＫおよびＣ−Ｊイントロン性エンハンサーを含有しており、かつｋｄｅを越えて3'に伸びている。ＪＫから5'に伸びるYAC はまた、ハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲによって決定されるＢ１、Ｂ２およびＢ３ＶＫ遺伝子、そして恐らくはその他のＶＫ配列も含有している。A80.C7/AB1380株は、IgＫ YACに加えて、関連のない同様なサイズのY AC を収容していた。したがって、減数分裂分離を使用してこれらのYAC を分離した。A80.C7をYPH857と交配し、IgＫ YAC（MP8-2、宿主遺伝子型＝α ade2 leu 2 his3 his5 lys2 ura3 trpl canl cyh2）のみを含有する減数分裂産物を得た。 A80-C7およびA276-F2のYAC をpLUTO でターゲティングしてヒトHPRTミニ遺伝子をYAC の右ベクターアームに組み込んだ。多数の酵素を用いたＩｇＫ YAC のA80-C7とA276-F2の制限分析は、両方のYAC が再配列されてない（すなわち、生殖系の配置にある）という結論を支持している。たとえば、BamHI 消化の後にＣＫプローブとハイブリダイゼーションさせたところ、期待された13kbの制限断片［Klobeckら、Biol ．Chem．Hoppe-Seyler3 70 :1007-1012(1989)］が証明された。同じサイズのバンドは、ゲノム地図［Klob eckら、上掲］から予想されるように、ＪＫプローブ［JK1-5領域を増幅するためにプライマーセットを使用する1.2kbのＰＣＲ産物］にハイブリダイズする。Ｂ３クラスＩＶ遺伝子［プローブはＢ３遺伝子由来の123bpのＰＣＲ産物である］は、発表された値4.6kbおよび2.3kbに近いそれぞれ4.9kbのBamHI断片および 2.2kbのBgIII断片を生成する［Lorenzら、Molec．Immunol．25:479-484 (1988) ］。ＩｇＫ YAC およびヒトゲノムＤＮＡの両方をＫｄｅ(120bp)、ＣＫ(304bp) 、Ｃ−Ｊイントロン性エンハンサー(455bp)、JK1-5(1204bp)、B3VK(123bp)およびＢＩＶＫ偽遺伝子(214bp)のκ遺伝子座配列についてＰＣＲ分析したところ予想されたバンドサイズを示した。ＣＫ、ＪＫおよびＣ−Ｊエンハンサー領域に対するＰＣＲを設計するのに使用する配列はWhitehurstら、Nucl．Acids Res．20: 4929-4930(1992)から、KdeはKlobeckとZachau，Nucl．Acids Res．14:4591-4603 (1986)から、Ｂ３はKlobeckら、Nucl．Acids．Res．13:6515-6529(1985)から、Ｂ１はLorenzら、上掲からのものである。Ｂ．680kb のyHPRT YAC のＥＳ細胞への導入１．yHPRT 酵母株の培養と酵母スフェロプラストの調製 680kbのyHPRTは、Huxleyら（1991年）Genomics2:742-750に記載されているように、YAC ライブラリーからクローニングしたヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子の機能性コピーを含有するYAC である。このｙHPRTを含有する酵母株を、Huxleyら（1991年、上掲）に記載されているように、ウラシルとトリプトファンを含まない液体培地で増殖させた。酵母のスフェロプラストを調製するために、ｙHPRTを含有する酵母の培養物40 0mL を遠沈し、酵母のペレットを水で一回、１Ｍソルビトールで一回洗浄した。この酵母ペレットをSPEM（１Ｍソルビトール、10mMリン酸ナトリウム(pH7.5)、1 0mM EDTA(pH8.0)、30mM β−メルカプトエタノール）に酵母細胞５×10⁸個/mL の濃度で再懸濁させた。酵母細胞１mL当たり150μｇの濃度でザイモラーゼ(zymo lase)20Ｔを加え、培養物を細胞の90％がスフェロプラストになるまで（通常15 〜20分）30℃でインキュベートした。細胞を STC（１Ｍソルビトール、10mM Tri s(pH7.5)、10mM CaCl₂）で二回洗浄し、2.5×10⁸/mlの濃度でＳＴＣに再懸濁させた。２．E14TG2a ＥＳ細胞の培養 HPRTに陰性のＥＳ細胞系E14TG2aを、Kollerら、PNAS（1989）86:8932-8935に記載されているようにして、マイトマイシンＣで処理した胚繊維芽細胞フィーダー層上で培養した。３．ＥＳ細胞と酵母スフェロプラストの融合ゼラチンをコートしたシャーレ上で生育している対数増殖期のE14TG2a ＥＳ細胞をトリプシン処理し、無血清ＤＭＥＭで三回洗浄した。2.8×10⁸個のスフェロプラストのペレットを、この酵母ペレット上に遠沈させた5×10⁶個のＥＳ細胞で注意深く重層した。この組み合わせたペレットを、10mMのCaCl₂を含有する50％ポリエチレングリコール(PEG)1500または50％のPEG4000(Boeringer Manheim)のいずれか0.5mLに再懸濁させた。室温または37℃で1.5分間インキュベーションした後、無血清DMEM５mLをゆっくり加え、30分間細胞を室温に放置した。次いで、細胞をペレット化し、（すでに記載した）ＥＳ細胞完全培地10mLに再懸濁させ、フィーダー細胞でコートした100mmのプレート上で平板培養した。２４時間後培地を新しい培地と交換した。融合後48時間で、HAT （１×10^-4Ｍヒポキサンチン、４×10^-7Ｍアミノプテリン、1.6×10^-5チミジンを含有するＥＳ培地）選抜を行なった。融合から７〜10日後、使用した異なる融合条件のもの両方でHAT 耐性のＥＳコロニーが観察された。yHPRT-ES（「ESY 」）融合コロニーを取り、フィーダーをコートしたウェル上で平板培養し、さらに分析するために増殖させた。４．yHPRT-ES 融合コロニーに組込まれたYAC ＤＮＡの分析２３個のyHPRT-ES融合コロニーから抽出したＤＮＡをHindIII で消化し、プローブとしてヒト反復Alu 配列（Ａ）、右（Ｂ）と左（Ｃ）のYAC ベクターアームに対するpBR322特異的配列、酵母Ｔｙ反復配列（Ｄ）、酵母単一コピー遺伝子LY S2（Ｅ）を用いてサザンブロット分析にかけた（図１）。ヒトHPRTプローブ、すなわち1.6kbの完全長cDNA ［Jolly ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA80:477-481 (1983)］を用いてＥＳＹクローン中のヒトHPRTの存在を確認した。Alu プローブはpBP63A中のBLUR8 Alu要素に由来する300bpのBamHI断片である［Pavanら、Pro c ．Natl．Acad．Sci． USA 78:1300-1304(1990)］。右と左のベクターアームプローブは、ｐYAC ４中のベクター配列に対応するpBR322由来BamHI-PvuIIの1.7 kbおよび2.7kbのそれぞれの断片である（スキームａ、ｂ）［Burkeら、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，GuthrieとF ink編、Adademic Press，194:251-270(1991)］。この右アームプローブで検出された4.5kbの断片は、テロメア5'端にあるHindIII 部位とヒト挿入物内の最初のH indIII 部位との間の領域を含んでいる（スキームａ）。左端プローブによって検出された３kbと4.1kbの断片は、それぞれ、テロメア端にあるHindIII 部位と酵母配列の5'側にあるHindIII 部位との間の領域、および動原体の3側にあるHin dIII 部位からヒト挿入物内にわたる領域に相当する（スキームｂ）。これらふたつのバンドのハイブリダイゼーション強度の違いはこれらの断片とプローブとの間の相同性の程度の違いに関連している。酵母のＴｙ反復プローブ［Philipps enら、Gene Expression in Yeast，Proceedings of the Alko Yeast Symposium ，Helsinki，KorholaとVaisanen編、Foundation for Biotechnical and Industr ial Fermentation Research，1:189-200(1983)］は、ふたつの要素間の相同性によりＴｙ２の3のHindIII 断片も検出できるＴｙ１を含有するpJEF742から単離された5.6kbのXhoI断片である。LYS2遺伝子プローブはｐＬＵＳに由来する1.7のBa mHI断片である［Hermansonら、Nuc ．Acids．Res．19:4943±4948(1991)］。ヒトHPRTプローブ（完全長1.6kbのcDNAプローブ）とのハイブリダイゼーションによって、分析した全てのクローンが、ヒトHPRT遺伝子の、yHPRT YACと同じ 15kb、７kbおよび５kbのエキソン含有断片を含有していることが証明された。同じブロットをヒト反復Alu 配列の300bpプローブを用いて再度プローブ検査したところ、分析したクローンの全てが、ｙHPRT中に存在するAlu 含有断片の全部ではないとしてもほとんどを含有していることが示された（図１Ａ）。これらのデータにより、分析したクローンのほとんどで、680kbのヒト挿入物はＥＳ細胞ゲノムに組込まれる際に検出できる程には再配列されていないかまたは削除されているということが示された。ベクターアームに特異的なプローブを用いてYAC ベクター配列の組込みを試験した。4.5kbのHindIII 断片を検出する右YAC ベクターアームに対するプローブを用いて同じブロットを再度ハイブリダイゼーションにかけたところ、分析した23個のクローンのうち10個で、テロメアまでの右YAC アームは依然として完全であって再配列されておらずヒト挿入物に結合していることが示され（図１Ｂ）、これらのクローンでYAC が組込まれていることがさらに証明された。左アームプローブでは、分析した20個のクローンのうち18個で３kb と4.1kbのHindIII yHPRT断片が検出され（図１Ｃ）、左アーム保持の頻度が高いことが示された。パルス場ゲル制限分析を用いて、ＥＳＹクローンにおけるｙHPRTの構造的組込みをふたつのクローン（ESY5-2および8-7 ）についてさらに評価した。ｙHPRTを担持する酵母において、315kb（Alu 、左アーム）、145kb（Alu 、HPRT）、95kb （Alu 、右アーム）、70kbおよび50kb（Alu のみ）の概そのサイズを有する５個のSfi断片が異なるプローブによって規定されていた。ＥＳクローンの両方で、内部のHPRTおよびAlu 特異的断片はｙHPRT断片にサイズが似ていた。両方のクローンで検出された末端断片は、マウス染色体内に組込まれたYAC に対して期待された通り、ｙHPRT中のものより大きかった（両方のクローンに対して、右端断片でそれぞれ185kbと200kb、左端断片で800kb以上）。これらのデータは、Alu プロフィールと共に、これらのクローンにおけるYAC の構造的組込みの保持に関する追加の証拠を提供する。これらの研究は、ESY8-7（図２Ａ、Ｂ）およびESY 8-6 中期染色体の展開に対して行なった螢光in situハイブリダイゼーション（ヒト配列に対して単一の組込み部位が検出された）によって補足された。代表的な中期展開の顕微鏡写真（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）または間期核の顕微鏡写真（図２Ｄ）は、ビオチン化したヒトゲノム配列とハイブリダイズしたＥＳＹ８−７細胞（図２Ａ、Ｂ）と、ビオチニル化した酵母反復ＤＮＡ配列とハイブリダイズしたESY 8- 6細胞（図２Ｃ、Ｄ）である。ヒトプローブはヒトゲノム胎盤ＤＮＡ（Clontech ，Palo Alto，CA）から作成した。酵母プローブは、酵母の反復要素、delta［pd elta6の1.08kb Sau3A断片（Gafnerら、EMBO J ．2:583-591(1983)）］およびＴｙ［ｐ２９の1.35kb EcoRI-SaII断片（Hermansonら、Nuc ．Acids．Res．19:494 3-4948(1991)）］、ｒＤＮＡ［4.6kbのBgIIIk-A L90と4.4kbのBgIII-B L92断片（KeilとRoeder、Cell 39:377-386(1984)）］ならびにYテロメア要素［ｐ１９８の2.0kbと1.5kbのBgIII-HindIII断片（ChanとTye、Cell 33:563-573(1983)）］をコードしているＤＮＡ断片の混合物から生成した。染色体中期展開上の配列とビオチン化したプローブとのハイブリダイゼーションおよびアビジン−FITC による検出とその後のビオチン‐抗アビジンおよびアビジン−FITC増幅は、Zeis s axiophot顕微鏡を用いて、TraskとPinkel、Methods Cell Biol ．30:383-400(1 990)に記載されているようにして行なった。染色体はヨウ化プロピジウムで対比染色した。示した顕微鏡写真は、ヒトまたは酵母のプローブを用いて実施した３つの別個の実験で走査した95％の中期展開または間期核の代表例である。ヒト配列に対して単一の組込み部位が検出された。 ESY クローン中の酵母ゲノムＤＮＡ配列の存在を検出するために、同じブロットを酵母のＴｙ反復要素配列でもプローブ検査した（図１Ｄ）。いくつかのクローンは親の酵母株に存在するＴｙ含有断片のほとんどを含有していることが見出されたが、いくつかのクローンはＴｙ含有断片を全く含まないわけではないが、非常に小さい断片のみを有することが見出された。これらの結果は、いくつかのＥＳクローンでYAC のＤＮＡはそのまま組込まれるが、酵母のゲノムＤＮＡがほとんど組込まれなかったか、またはまったく組込まれなかったことを示している。この酵母染色体ＤＮＡがＥＳ細胞ゲノム内の単一部位または複数部位に組込まれたか否かを決定するために、完全なＴｙプロファイルを有するESY クローン8- 6について螢光in situハイブリダイゼーションを実施した。組合わせた酵母反復プローブを用いて単一の組込み部位が検出された（図２Ｃ、Ｄ）が、これは分解能の限界内で全ての酵母ＤＮＡ断片がひとつのブロックに組込まれることを示している。ＥＳ細胞のin vitroで整然と分化する能力を利用して、YAC の安定性と組込まれたＤＮＡがＥＳ細胞の多分化能に及ぼす影響を検討した。異なる量の酵母ＤＮＡを含有する４つのＥＳクローン（ESY5-2、3-6、8-6および8-7）は、融合してないＥＳ細胞の分化パターンと区別できない分化パターン、すなわち各種分化細胞タイプを生成する組織胚様体の形成を示した（図３Ａ）。分化したESY5-2、3- 6、8-5および8-6から抽出したＤＮＡ（20μｇ）およびAB1380中のｙHPRT（40ｎｇ）に対して、（ａ）ヒトAlu プローブ、（ｂ）酵母Ｔｙ配列を用いてサザンブロット分析を行なった。ＥＳクローンをMartinとEvans、Cell 6:467-474(1975) に記載されているようにして10〜14日間懸濁液中の凝集体として培養することによって誘導して組織胚様体を形成させた。ESY に由来する組織胚様体は、組織培養基層に再付着した後、分化した細胞タイプを生成した。YAC と酵母ＤＮＡ配列は非選択培地における４０日間の培養中分化したＥＳクローンによって安定に保持されていた。このことは、安定に組込まれた外来ＤＮＡがＥＳ細胞の多分化能を損なわないということを立証している（図３Ｂ）。HAT 選択培地に移したときの正常な増殖と分化によって示されるようにこの分化した培養物は機能性のヒトHPRT遺伝子を維持していた。５．ｙHPRT−ＥＳ細胞系からのキメラマウスの作成マウスの胚盤胞中にＥＳ細胞をマイクロインジェクションしキメラマウスを作製することによって、生殖系を含めてESY 細胞のマウスを再増殖する能力を立証した。ESY 細胞をC57BL/6Jマウス胚盤胞中にマイクロインジェクションによって微量注入し、すでに記載されているようにしてキメラマウスを作成した。雄のキメラをC57BL/6J雌と交尾させ、アグーチ（agouti、縞模様）の子の存在によって生殖系列伝達を確認した。このキメラマウスの尾から調製したゲノムＤＮＡを、マウスゲノム中のｙHPRT ＤＮＡの存在に関してＰＣＲ分析によって分析した。 YAC 左アームの存在は２つのプライマーオリゴヌクレオチドおよびを用いて分析した。これらのプライマーはそれぞれpBR322配列およびYAC 左ベクターアーム内のＳＵＰ４遺伝子から誘導されたものである。ｙHPRTを含有する酵母とESY 細胞系の分析によって259bp のＰＣＲ産物を得た。ESY 細胞系ESY3-1、 ESY3-6およびESY5-2から発生した18匹のキメラマウスから調製した尾のＤＮＡのＰＣＲ分析では期待されたＰＣＲ産物が生じた。すなわち、キメラマウスのゲノム内にYAC 左ベクターアームが存在していることが示された。６．ｙHPRTの生殖系伝達生殖系の伝達の評価のため、すなわち遺伝子改変が生殖細胞（精子または卵母細胞）を介して動物の子孫に伝えられるか否かを決定するために、ESY 細胞系ES Y3-1およびESY5-2から誘導した30〜60％の混合表皮色(coat color chimerism)を有する雄のキメラを交尾用にセットアップした。ESY3-1に由来する雄のキメラのうちの３匹394/95-1、394/95-2および411-1 がそれぞれ20％、30％および30％の頻度でＥＳ細胞ゲノムをその子に伝達した。アグーチ（縞模様）の子から得た尾ＤＮＡのサザンブロット分析によって、394/395-2 キメラに由来する３匹のマウス4-2 、4-3 および5-1 のゲノムにｙHPRTが存在することが示された。このような分析で得られたAlu プロファイルは親のＥＳ３−１細胞系と区別できなかった（図３Ｃ）。これは680kb のヒト挿入物がマウスの生殖系を介して正確に伝達されたことを示している。ｙHPRTを含有する子に由来するｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡに対するヒト HPRT特異的ＰＣＲアッセイを用いて試験した全ての組織でヒトHPRT遺伝子の発現が検出された（図４ＡおよびＢ）。すなわち伝達されたYAC が忠実にその機能を保持していることが立証された。この実験では、ＥＳ細胞、ESY3-1細胞およびHu t78 （ヒト）細胞において、対照マウス（Ｃ）からの脾臓および肝臓、または4- 3 アグーチの子（394/395-2 キメラに由来）において、および鋳型ＤＮＡを含有しないサンプルにおいて、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによってヒトHPRT mRNAが検出された（図４Ａで「−」として示されている）。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡの逆転写と特異的ｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅はｃＤＮＡサイクルキット（Invitrogen）を用いて実施した。ヒトHPRT ｃＤＮＡに由来する626bp 断片のマウスHPRTｃＤＮＡの存在下における特異的増幅はHuxleyら、上掲に概略が記載されているようにして実施した。すべてのＲＮＡサンプルの組込みはマウスγ−インターフェロンレセプターに対するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって立証された。359bp 断片を増幅するのに使用したプライマーは5'GTATGTGGAGCATAACCGGAGおよび5'CAGGTTTTGTC TCTAACGTGGである。このヒトHPRTおよびγ−インターフェロンレセプタープライマーはゲノムＤＮＡの混入によるＰＣＲ産物が得られる確率がなくなるように設計した。ＰＣＲ産物を電気泳動によって分析し、臭化エチジウムで可視化した。サイズマーカーは１kbのラダー(ladder)(BRL)である。上記したＲＴ−ＰＣＲによるマウスγ−インターフェロンレセプターｍＲＮＡの検出の結果を図４Ｂに示す。この特異的ヒトHPRT mRNAは4-3 マウスから誘導された試験した他の組織（脳、腎臓および心臓）でも検出された。ｙHPRTを含有する子孫の肝臓で同等な定常状態レベルのマウスおよびヒトHPRT ｍＲＮＡが検出された。これらの結果は、13メガ塩基もの酵母ゲノムＤＮＡの取込みが、適正な発生、生殖系の伝達または遺伝子発現に対して害にならないということを示している。以上の結果は、酵母スフェロプラストが単一コピーの高分子量ＤＮＡ断片をＥＳ細胞に送達するのに有効なベヒクルであること、およびそのような分子がマウス生殖系を介して安定かつ機能的に伝達されることを証明している。いくつかのＥＳクローンに関してＰＦＧＥ分析およびin situハイブリダイゼーションによって補足されたAlu プロファイルは、大部分のクローンがヒト挿入物のほとんど全てを未再配列形態で（すなわち「生殖系の配置」で）含有しており、しかも高い頻度（40％）のクローンがYAC アームを両方とも保持していることを強く示唆している。酵母ゲノムＤＮＡを実質的に取込むことは、in vitroおよびin vivo においてＥＳ細胞の適正な分化に有害ではなく、生殖系の伝達または遺伝子の発現を妨げなかった。これらの方法を用いてゲノムＤＮＡの大きい断片を挿入物としてヒトでない動物のゲノムに伝達することが可能である。この場合、その挿入物は生殖系の伝達によって完全なまま伝達することができる。したがって、各種の異種ＤＮＡを、新規な表現型または新規な遺伝子型を付与し得る哺乳類などのヒトでない宿主、特に小さい実験動物に導入することができる。たとえば、小さい実験動物にヒトなどの哺乳類の遺伝子を導入して病気の原因、広範な各種薬剤に対するヒト遺伝子の応答を研究することができる。あるいは、大きい遺伝子座を哺乳類宿主に導入して他の種（たとえばヒト）の産物を産生させ、イムノグロブリン、Ｔ細胞レセプター、主要組織適合遺伝子複合体抗原などを提供することができる。重鎖YAC A287-C10およびκ鎖YAC A80-C のＥＳ細胞および胚への導入前述のようにして、pLUTO （ｙA287-C10）でターゲティングしたヒト重鎖YAC A287-C10 を含有する酵母をスフェロプラストにし、HPRTを欠くＥＳ細胞系Ｅ14. 1TG3B1 と融合させた。HAT 耐性ＥＳ（ESY ）クローンを10個（2B、2C、2D、3A 、 3B、5C、1125A、1125E、100/1500および100/4000）取り、ＤＮＡ分析のため増殖させた。前述したＥ、ＪＨ、μおよびＶＨ２領域に対するヒト重鎖プローブを用いて、前記のクローンからHindIII 消化したＤＮＡのサザンブロット分析を実施することによって、組込まれたYAC を評価した。全てのESY クローンが期待された＞10 kbのＪＨ断片とμ断片を含有していることが見出された。２Ｄと５Ｃクローンを除く全てのESY クローンが、4.8kb のＶＨの２kb断片を含有していることが見出された。２Ｄと３Ｂを除く全てのESY クローンが期待された10kbと7.6kb のＤ遺伝子断片を含有していることが見出された。2B、2D、100/1500および5Cを除く全てのESYクローンで酵母反復Ｔｙ要素に対するハイブリダイゼーションによって酵母ゲノム配列が検出された。ESY クローン2B、3Aおよび5Cを前述のようにして C57BL/6 胚盤胞に微量注入し、キメラマウス（2Bクローンから10匹、3Aクローンから１匹、そして5Cクローンから１匹）を作製した。これらのキメラ動物の10匹から得た尾のＤＮＡのサザンブロット分析により、酵母中のｙA287-C10において 10個のAlu 断片の全部ではないがほとんどで存在することがはっきりと検出され、ＶＨ2 およびＤ遺伝子断片の存在が示された。生成したキメラマウスを生殖系列伝達の評価のためにC57BL16Jマウスと交尾させた。２Ｂクローンから誘導された雄のキメラ78Ｋ-3は100 ％の頻度でＥＳ細胞ゲノムをその子に伝達した。アグーチのマウスの子６匹のうちの４匹から得た尾ＤＮＡのサザンブロット分析によりヒト重鎖配列の存在が示された。 pLUTO （ｙA80-C7）でターゲティングしたヒトκ鎖YAC A80-C7を含有する酵母とＥ14.1TG3B1 ＥＳ細胞との融合実験によって、２つのHAT 耐性ESY クローンＭ 4.4.1 およびＭ5.2.1 が生成した。これらのクローンからHindIII 消化したＤＮＡのサザンブロット分析により、酵母中のｙA80-C7において、検出される明白に 10個のAlu 断片の全てが存在していることが示された。どちらのクローンにも酵母のゲノム配列が組込まれていた。ESY クローンをC57BL/6J胚盤胞に微量注入しキメラマウスを作成した。実施例３トランスジェニックマウスの交配育種Ａ．ヒトモノクローナル抗体を産生するマウスの作成ヒトイムノグロブリン遺伝子座を含有するマウスを、不活化されたマウスイムノグロブリン遺伝子をもつマウスと交配してヒト抗体のみを産生するマウスを作製した。不活性なマウスのκ鎖およびＨ鎖イムノグロブリンに対しては同形接合体であってヒトのＨ鎖およびκ鎖イムノグロブリン遺伝子座に対しては異形接合体であるマウスを作製するには、４つの異形株から出発して３世代の育種が必要である。交配のスキームを図５に示す。実施例４ヒトモノクローナル抗体の産生Ａ．マウスの免疫イムノグロブリン遺伝子座に由来するヒトＤＮＡが組込まれた生殖系キメラマウスを、アジュバント中の抗原を注射することによって免疫する。一次免疫の１４日後マウスを抗原で追加免疫し、35日後と56日後に追加免疫を繰り返した。免疫した動物から採血して、免疫抗原に対する血清抗体の力価を試験した。最も高い力価をもつマウスを屠殺し脾臓を取出した。Ｂ．脾臓細胞の融合脾臓細胞の融合相手として使用する骨髄腫細胞は融合の６日前に解凍し、組織培養で増殖させる。融合の１日前５×10⁵個/mL の濃度で10％牛胎児血清を含有する新鮮な培地中で細胞を分離する。融合の朝、細胞を20％牛胎児血清と２×ＯＰＩ（３mg/mL オキサロ酢酸、0.1mg/mLピルビン酸ナトリウムおよび0.4 IU/mL インシュリン）溶液を添加した等容量の培地で希釈する。マウスを屠殺した後脾臓を無菌抽出し、培地の入ったシャーレに入れた。脾臓が細かい破片に分かれ、ほとんどの細胞が除かれるまで細胞を細かく裂いた。細胞を新鮮な無菌培地で洗浄し、塊を沈殿させた。脾臓細胞を無血清培地中で遠心分離することによってさらに二回洗浄した。二回目の洗浄の間に、別のチューブで骨髄腫細胞も洗浄した。最終洗浄後２つの細胞ペレットを合わせ、一緒に一回遠心分離した。 50％ポリエチレングリコール（PEG ）の溶液を、合計で２分かけて細胞ペレットにゆっくり加えつつ細胞を再懸濁させる。ゆっくり掻き混ぜながら３分かけて細胞溶液にあらかじめ暖めた培地を10mL加えた。細胞を遠心分離し、上清を除いた。20％の牛胎児血清、１×ＯＰＩ溶液および１×ＡＨ溶液（58μＭアザセリン、0.1 mMヒポキサンチン）を添加した培地10mLに細胞を再懸濁させた。融合した細胞を96ウェルのプレートに分け取り、37°で１週間培養した。各ウェルから上清を無菌的に採取し、プールした。これらのプールを免疫抗原に対する反応性に関して試験する。陽性のプールを個々のウェルに対してさらに試験する。陽性のウェルを同定したら、細胞を96ウェルプレートから、20％牛胎児血清、１×ＯＰＩおよび１×ＡＨを添加した培地0.5mL を入れた24ウェルプレート中に移した。培養物が密になったら細胞を５mLに拡散させ、次いで10mLに拡散させた。この段階で、単一の抗体産生細胞が培養されるように、細胞をサブクローニングした。上記手順に従って免疫して、免疫原に対して特異的なヒト抗体または類似体を産生することができるキメラ非ヒト宿主、特にマウス宿主を作製することができる。このようにして、ヒトモノクローナル抗体を得る際に伴なう問題が回避される。すなわち、トランスジェニック宿主は、ヒト宿主では使用できなかった免疫原で免疫することができるからである。さらに、ヒト宿主では許容できなかったブースター注射およびアジュバントも許容されるはずである。得られたＢ細胞はその後、所望の抗体を連続的に生産するように不死化するのに使用してもよい。不死化した細胞は、イムノグロブリンまたは類似体をコードする遺伝子の単離に使用することができ、抗体の性質を改良するためのin vitro突然変異誘発その他の技術のような方法によってさらに分子改変することができる。これらの改変した遺伝子は、次いで、トランスフェクションによって不死化細胞に戻して所望の抗体の連続哺乳細胞源を提供することができる。本発明は、ヒト宿主中で抗体が産生されるのと類似の機構で産生されるヒト抗体の便利なソースを提供する。この動物宿主細胞は便利なことに、ヒト抗体産生用に宿主細胞におけるヒトＤＮＡの活性化と再配列とを提供する。本発明によると、ヒト免疫原で宿主哺乳類を免疫することによって、ヒト免疫原、たとえばタンパク質に対するヒト抗体を生産することができる。得られる抗血清はヒト免疫原に対して特異的であり、宿主の血清から採集することができる。免疫された宿主Ｂ細胞は不死化、たとえば骨髄腫細胞融合、トランスフェクションなどに使用して不死細胞、たとえばハイブリドーマを製造してモノクローナル抗体を生産することができる。抗体、抗血清およびモノクローナル抗体はその抗体を産生する細胞の種に応じてグリコシル化される。Ｉｇ遺伝子座の変化の少ない領域は抗体を産生するのに再び補充して、変化の少ない可変領域を有する抗体を得ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グリーン，ラリーアメリカ合衆国 94131 カリフォルニア州サンフランシスコ，クレストラインドライブ＃12 70

Claims

【特許請求の範囲】１．所望のゲノム成分を含有する非形質転換動物細胞を所定の培地条件に対して感受性の形質転換細胞系の細胞と融合させて得られる所望のゲノム成分を含有する融合細胞のコロニーの割合を増加させる方法であって、形質転換細胞系の細胞の培地条件に対する感受性を克服するマーカーを有する前記所望のゲノム成分を提供する工程と融合を促進する条件下で前記非形質転換動物細胞を前記形質転換細胞系の細胞と混合して融合混合物を得る工程と、この融合混合物を前記所定の培地条件下で培養することによって融合細胞コロニーを選択する工程と、前記所望のゲノム成分の存在に関してうまく融合したコロニーをスクリーニングする工程とを有する方法。２．前記マーカーがHPRTであり、前記培地条件がHAT 培地からなる、請求項１記載の方法。３．前記マーカーがネオマイシン耐性遺伝子であり、前記培地条件がG418の存在を含むことからなる、請求項１記載の方法。４．前記所望のゲノム成分が、一方が重鎖で他方が軽鎖である一対のイムノグロブリン遺伝子座であり、非形質転換細胞がＢ細胞である、請求項１記載の方法。５．前記一対のイムノグロブリン遺伝子座を発現させて標的抗原と免疫反応性である抗体を産生する、請求項４記載の方法。６．前記形質転換細胞系が骨髄腫細胞系である、請求項１記載の方法。７．前記融合を促進する条件がポリエチレングリコールの存在からなる、請求項１記載の方法。８．所望のゲノム成分を含有する非形質転換動物細胞を所定の培地条件に対して感受性の形質転換細胞系の細胞と融合させて得られる所望のゲノム成分を含有する融合細胞のコロニーを得る改良された方法であって、前記方法は融合を促進する条件下で前記非形質転換動物細胞を前記形質転換細胞系の細胞と混合して融合混合物を得る工程と、この融合混合物を前記所定の培地条件下で培養することによって融合細胞コロニーを選択する工程と、前記所望のゲノム成分の存在に関して上首尾なコロニーをスクリーニングする工程とからなり、前記改良された方法が、形質転換細胞系の細胞の培地条件に対する感受性を克服するマーカーを有する前記所望のゲノム成分を提供する工程からなる改良された方法。９．前記マーカーがHPRTであり、前記培地条件がHAT 培地からなる、請求項８記載の改良された方法。１０．前記マーカーがネオマイシン耐性遺伝子であり、前記培地条件がG418 の存在を含むことからなる、請求項８記載の改良された方法。１１．前記所望のゲノム成分が、一方が重鎖で他方が軽鎖である一対のイムノグロブリン遺伝子座であり、非形質転換細胞がＢ細胞である、請求項８記載の改良された方法。１２．一対のイムノグロブリン遺伝子座を発現させて標的抗原と免疫反応性である抗体を産生する、請求項１１記載の改良された方法。１３．形質転換細胞系が骨髄腫細胞系である、請求項８記載の改良された方法。１４．前記融合を促進する条件がポリエチレングリコールの存在からなる、請求項８記載の改良された方法。