DE69738539T2

DE69738539T2 - Vollkommen humane Antikörper die EGFR binden

Info

Publication number: DE69738539T2
Application number: DE69738539T
Authority: DE
Inventors: Aya Menlo Park JAKOBOVITS; Raju Darien KUCHERLAPATI; Sue Stanford KLAPHOLZ; Michael El Granada MENDEZ; Larry San Francisco GREEN
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Current assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 1996-12-03
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2017-12-04
Also published as: HK1074348A1; EP2314625A3; US7820877B2; KR100942002B1; EP1972194A1; KR20080059467A; EP2314625A1; US8809051B2; CA2273194C; JP2011212019A; CA2722378A1; PT942968E; US7064244B2; JP2005224242A; AU5702298A; CA2722378C; EP2305027A2; EP0942968A2; ATE387495T1; ATE549918T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen isolierten, vollständig humanen Antikörper, der an den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (epidermal growth factor receptor, EGFR) bindet und die Bindung von EGF an EGFR inhibiert, wobei die schwere Kette durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die ein humanes V_H 4-61-Gen verwendet; ein Nukleinsäuremolekül, das für denselben kodiert; ein Verfahren zur Herstellung desselben; und dessen Verwendungen; ebenso wie auf Verfahren zum Inhibieren des EGF-abhängigen Zellwachstums und der EGF-Bindung an EGFR.
HINTERGRUND DER TECHNOLOGIE
Die Fähigkeit, Megabasen-große humane Loci in YACs zu klonieren und zu rekonstruieren und diese in die Keimbahn der Maus einzuführen, stellt einen leistungsfähigen Ansatz zur Aufklärung der funktionellen Komponenten sehr großer oder grob kartierter Loci ebenso wie zur Erzeugung nützlicher Modelle humaner Erkrankungen zur Verfügung. Darüber hinaus könnte die Verwendung einer derartigen Methode zum Substituieren von Loci der Maus durch deren humane Äquivalente einzigartige Einsichten in die Expression und Regulation humaner Genprodukte während der Entwicklung, ihrer Kommunikation mit anderen Systemen und ihrer Beteiligung an der Auslösung und dem Fortschreiten von Krankheiten zur Verfügung stellen.
Eine wichtige praktische Anwendung einer solchen Strategie ist die "Humanisierung" des humoralen Immunsystems der Maus. Das Einbringen humaner Immunglobulin (Ig)-Loci in Mäuse, in denen die endogenen Ig-Gene inaktiviert worden sind, bietet die Möglichkeit, die Mechanismen zu untersuchen, die der programmierten Expression und dem Aufbau von Antikörpern zugrunde liegen, ebenso wie deren Rolle in der B-Zell-Entwicklung. Darüber hinaus könnte eine derartige Strategie eine ideale Quelle zur Produktion vollständig humaner monoklonaler Antikörper (Mabs) zur Verfügung stellen – ein wichtiger Meilenstein auf dem Weg zur Erfüllung des Versprechens der Antikörpertherapie bei humanen Erkrankungen. Es wird erwartet, dass vollständig humane Antikörper die immunogenen und allergischen Reaktionen, die den Maus-Mabs oder Maus-derivatisierten Mabs immanent sind, minimieren und folglich die Wirksamkeit und Sicherheit der verabreichten Antikörper erhöhen.
Es kann erwartet werden, dass die Verwendung vollständig humaner Antikörper einen wesentlichen Vorteil bei der Behandlung chronischer und rezidivierender humaner Erkrankungen, wie z. B. Entzündung, Autoimmunität und Krebs, die eine wiederholte Verabreichungen von Antikörpern erfordern, bietet.
Ein Ansatz auf dem Weg zu diesem Ziel war, Mausstämme, denen eine Antikörperproduktion fehlt, mit großen Fragmenten humaner Loci zu konstruieren, in der Erwartung, dass solche Mäuse ein großes Repertoire humaner Antikörper in Abwesenheit von Maus-Antikörpern bilden würden. Große humane Ig-Fragmente würden die große Diversität variabler Gene ebenso wie die korrekte Regulation der Antikörperproduktion und -expression bewahren. Durch Ausnutzen der Maus-Maschinerie für die Antikörperdiversifizierung und Selektion sowie des Fehlens einer immunologischen Toleranz gegenüber humanen Proteinen, sollte das in diesen Mausstämmen reproduzierte Repertoire humaner Antikörper hochaffine Antikörper gegen jedwedes Antigen von Interesse, einschließlich humaner Antigene, hervorbringen. Unter Verwendung der Hybridom-Technologie könnten Antigen-spezifische humane Mabs mit der gewünschten Spezifität einfach erzeugt und selektiert werden.
Diese allgemeine Strategie wurde im Zusammenhang mit unserer Erzeugung der ersten XenoMouse^TM-Stämme dargelegt, wie 1994 publiziert. Siehe Green et al., Nature Genetics 7:13–21 (1994). Die XenoMouse^TM-Stämme wurden mit 245 kb bzw. 190 kb großen Fragmenten der humanen Loci für die schwere Kette und die Kappa leichte Kette in Keimbahnkonfiguration konstruiert, die Kernsequenzen (core sequences) der variablen und konstanten Region enthielten. Id. Die künstlichen Hefechromosomen (yeast artficial chromosomes, YACs), die humanes Ig enthielten, erwiesen sich als verträglich mit dem Maus-System, sowohl was das Rearrangement als auch die Expression von Antikörpern angeht, und waren fähig, die inaktivierten Maus-Ig-Gene zu ersetzen. Dies wurde durch deren Fähigkeit nachgewiesen, die B-Zell-Entwicklung zu induzieren und ein Erwachsenen-ähnliches humanes Repertoire an vollständig humanen Antikörpern zu produzieren und Antigen-spezifische humane Mabs zu erzeugen. Diese Ergebnisse legten ferner nahe, dass die Einführung größerer Teile der humanen Ig-Loci, die eine größere Anzahl V-Gene, zusätzliche regulatorische Elemente und konstante Regionen von humanem Ig enthielten, das vollständige Repertoire im Wesentlichen rekapitulieren könnten, das für die humane humorale Antwort auf Infektion und Immunisierung charakteristisch ist.
Ein derartiger Ansatz wird ferner in den US-Patentanmeldungen mit den Nrn. 07/466,008, eingereicht am 12. Januar 1990, 07/610,515, eingereicht am 08. November 1990, 07/919,297, eingereicht am 24. Juli 1992, 07/922,649, eingereicht am 30. Juli 1992, 08/031,801, eingereicht am 15. März 1993, 08/112,848, eingereicht am 27. August 1993, 08/234,145, eingereicht am 28. April 1994, 08/376,279, eingereicht am 20. Januar 1995, 08/430,938, eingereicht am 27. April 1995, 08/464,584, eingereicht am 05. Juni 1995, 08/464,582, eingereicht am 05. Juni 1995, 08/463,191, eingereicht am 05. Juni 1995, 08/462,837, eingereicht am 05. Juni 1995, 08/486,853, eingereicht am 05. Juni 1995, 08/486,857, eingereicht am 05. Juni 1995, 08/486,859, eingereicht am 05. Juni 1995, 08/462,513, eingereicht am 05. Juni 1995 und 08/724,752, eingereicht am 02. Oktober 1996, erörtert und beschrieben. Siehe auch europäisches Patent Nr. EP 0 463 151 B1 , Erteilung veröffentlicht am 12. Juni 1996, internationale Patentanmeldung Nr. WO 94/02602 , veröffentlicht am 03. Februar 1994, internationale Patentanmeldung Nr. WO 96/34096 , veröffentlicht am 31. Oktober 1996 und PCT-Anmeldung Nr. PCT/US96/05928, eingereicht am 29. April 1996.
In einem alternativen Ansatz haben andere, einschließlich GenPharm International, Inc., einen "Minilocus"-Ansatz verwendet. In dem Minilocus-Ansatz wird durch das Einbeziehen von Teilen (individuellen Genen) des Ig-Locus ein exogener Ig-Locus nachgeahmt. Folglich werden ein oder mehrere V_H-Gene, ein oder mehrere D_H-Gene, ein oder mehrere J_H-Gene, eine Mu konstante Region und eine zweite konstante Region (vorzugsweise eine Gamma konstante Region) in einem Konstrukt für die Insertion in einen Säuger zusammengefügt. Dieser Ansatz wird im US-Patent Nr. 5,545,807 von Surani et al. und in den US-Patenten Nr. 5,545,806 und 5,625,825 , beide von Lonberg und Kay sowie in den US-Patentanmeldungen von GenPharm International mit den Seriennummern 07/574,748, eingereicht am 29. August 1990, 07/575,962, eingereicht am 31. August 1990, 07/810,279, eingereicht am 17. Dezember 1991, 07/853,408, eingereicht am 18. März 1992, 07/904,068, eingereicht am 23. Juni 1992, 07/990,860, eingereicht am 16. Dezember 1992, 08/053,131, eingereicht am 26. April 1993, 08/096,762, eingereicht am 22. Juli 1993, 08/155,301, eingereicht am 18. November 1993, 08/161,739, eingereicht am 03. Dezember 1993, 08/165,699, eingereicht am 10. Dezember 1993, 08/209,741, eingereicht am 09. März 1994, beschrieben. Siehe auch internationale Patentanmeldungen Nr. WO 94/25585 , veröffentlicht am 10. November 1994, WO 93/12227 , veröffentlicht am 24. Juni 1993, WO 92/22645 , veröffentlicht am 23. Dezember 1992, WO 92/03918 , veröffentlicht am 19. März 1992. Siehe wei terhin Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) und Tuaillon et al., (1995).
Die Erfinder des oben genannten und dem Medical Research Counsel ("MRC") übertragenen Patents von Surani et al. haben unter Verwendung des Minilocus-Ansatzes eine transgene Maus hergestellt, die einen Ig-Locus besitzt. Die Erfinder der oben zitierten Arbeit von GenPharm International, Lonberg und Kay, haben dem Beispiel der Erfinder der vorliegenden Erfindung folgend eine Inaktivierung des endogenen Ig-Locus der Maus vorgeschlagen, verbunden mit einer beträchtlichen Duplikation der Arbeit von Surani et al.
Ein Vorteil des Minilocus-Ansatzes ist die Geschwindigkeit, mit der Konstrukte, die Teile des Ig-Locus umfassen, erzeugt und in Tiere eingefügt werden können. In gleichem Ausmaß jedoch ist ein signifikanter Nachteil des Minilocus-Ansatzes, dass durch das Einbeziehen geringer Anzahlen von V-, D- und J-Genen theoretisch eine ungenügende Diversität eingeführt wird. Tatsächlich scheinen die veröffentlichten Arbeiten diese Bedenken zu bestätigen. Die B-Zell-Entwicklung und die Antikörperproduktion von Tieren, die mittels Verwendung des Minilocus-Ansatzes hergestellt wurden, scheint gehemmt. Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung beständig auf das Einbringen großer Teile des Ig-Locus gedrängt, um eine höhere Diversität zu erreichen und in dem Bemühen, das Immunrepertoire der Tiere zu rekonstituieren.
Folglich wäre es wünschenswert, transgene Tiere zur Verfügung zu stellen, die vollständigere Keimbahn-Sequenzen und -Konfiguration des humanen Ig-Locus enthalten. Es wäre zusätzlich wünschenswert, einen solchen Locus auf einem Knockout-Hintergrund eines endogenen Ig bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird zur Verfügung gestellt:

1. Ein isolierter vollständig humaner Antikörper, der an den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) bindet und die Bindung von EGF an EGFR inhibiert, wobei die schwere Kette durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die ein humanes V_H 4-61 Gen verwendet.
2. Der Antikörper gemäß 1., wobei die leichte Kette durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die ein humanes V_K 018 Gen verwendet.
3. Der Antikörper gemäß 1. oder 2., wobei die Aminosauresequenz der schweren Kette eine oder mehre Mutationen an einer oder mehreren Positionen umfasst, die in der Aminosauresequenz von V_H 4-61 mutiert sind, die in 30 angegeben ist.
4. Der Antikörper gemäß einem der Punkte 1. bis 3., wobei die Aminosäuresequenz der schweren Kette eine oder mehrere Aminosäuresequenzen umfasst, die in 30 angegeben sind.
5. Der Antikörper gemäß 1. oder 2., wobei die Aminosäuresequenz der leichten Kette eine oder mehre Mutationen an einer oder mehreren Positionen umfasst, die in den Aminosäuresequenzen der 6 mutiert sind.
6. Der Antikörper gemäß 5., wobei die Aminosäuresequenz der leichten Kette eine der Aminosäuresequenzen umfasst, die in 6 angegeben sind.
7. Ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen vollständig humanen Antikörper gemäß einem der Punkte 1. bis 6. kodiert.
8. Eine Wirtszelle, die das Nukleinsäuremolekül gemäß 7. umfasst.
9. Die Wirtszelle gemäß 8., wobei die Wirtszelle eine Hybridomzelle oder eine Mauszelle ist.
10. Ein Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers gemäß einem der Punkte 1. bis 6., das den Schritt des Kultivierens einer Wirtszelle umfasst, die eine Nukleinsäure gemäß 7. umfasst.
11. Das Verfahren gemäß 10., wobei die Wirtszelle eine Hybridomzelle ist.
12. Verwendung des Antikörpers gemäß einem der Punkte 1. bis 6. zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs.
13. Verwendung des Antikörpers gemäß einem der Punkte 1. bis 6. zur Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren des Wachstums von Tumorzellen.
14. Die Verwendung gemäß 12. oder 13., wobei das Medikament die EGF-vermittelte Wachstumsstimulation von Krebszellen inhibiert.
15. Ein Verfahren zum Inhibieren des EGF-vermittelten Zellwachstums oder Tumorwachstums, das den Schritt des Inkontaktbringens der Zelle oder des Tumors mit einem Antikörper gemäß einem der Punkte 1. bis 6. in vitro umfasst.
16. Ein Verfahren zum Inhibieren der Bindung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) an den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), das den Schritt des Inkontaktbringens des EGFR mit einem Antikörper gemäß einem der Punkte 1. bis 6. in vitro umfasst, wobei der Antikörper in der Lage ist, die Bindung von EGF an EGFR zu inhibieren.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1A bis 1B sind eine schematische Darstellung der YACs mit den rekonstruierten Loci der humanen schweren Kette und der humanen Kappa leichten Kette, die in bevorzugte Mäuse in Übereinstimmung mit der Erfindung eingebracht wurden. YACs, welche die Loci nahe der humanen schweren Kette (1H, 2H, 3H und 4H) und der humanen Kappa leichten Kette (1K, 2K und 3K) umfassen, wurden aus humanen YAC-Bibliotheken kloniert. Die Positionen der verschiedenen YACs in Bezug auf die humanen Ig-Loci (übernommen aus Cook und Tomlinson, 1995 und Cox et al., (1994), ihre Größen und Nicht-Ig-Sequenzen sind angegeben (nicht maßstabsgetreu gezeigt). Die YACs wurden in einem zweistufigen Verfahren in Hefen rekombiniert (siehe Material und Methoden), um die YACS mit humaner schwerer und Kappa leichten Kette zu rekonstruieren. yH2, der YAC, der die humane schwere Kette enthielt, wurde weiterhin mit einer humanen γ₂-Gensequenz ausgestattet. yK2 war der YAC, der die humane Kappa leichte Kette enthielt. Die Elemente des YAC-Vektors: Telomer
, Centromer •, selektierbare Marker für Säuger (HPRT, Neo) und Hefe (TRP1, ADE2, LYS2, LEU2, URA3, HIS3) auf den Armen des YAC-Vektors sind angegeben. V_H-Segmente sind klassifiziert als Gene mit offenem Leserahmen •, Pseudogene ☐ und nicht-sequenzierte Gene O. V_K-Segmente sind klassifiziert als Ge ne mit offenen Leserahmen • und Pseudogene ☐. Die V-Gene, von denen festgestellt wurde, dass sie von der XenoMouse II verwendet werden, sind markiert (*). Die V_H-Genregion, die auf dem yH2 enthalten ist, ist durch Pfeile markiert.
Die 2A bis 2I zeigen eine Reihe von Southern Blot-Analysen und Charakterisierungen des YAC mit der humanen schweren Kette, yH2, integriert in ES-Zellen und in XenoMouse-Stämme. Die 2A bis 2E zeigen eine Reihe von Southern Blot-Analysen einer mit EcoRI (2A, 2C) und mit BamHI (2B, 2D, 2E) verdauten DNA (2 μg), die von der CGM1 immortalisierten B-Lymphoblasten-Zelllinie hergestellt wurde, die aus der Washington University YAC-Bibliothek stammt (Brownstein et al., 1989), von yH2 YAC (0,5 μg YAC, zugegeben zu 2 μg 261 DNA), nicht-modifizierten E14TG.3B1 (3B1) und yH2-enthaltenden ES-Zelllinien: L10, J9.2, L18, L17 und J17. Die für das Blotten verwendeten Sonden waren humanes V_H1 (2A), D_H (2B) [das 18 kb-Fragment in der CGM1-Spur repräsentiert die D-Segmente auf Chromosom 16], V_H3 (2C), Cμ (2D) und J_H (2E). Die 2F bis 2G zeigen eine Reihe von Southern Blot-Analysen einer mit EcoRI (2F, 2G) und BamHI (2H, 2I) verdauten DNA (10 μg), die aus den Schwänzen von Wildtyp-Mäusen (WT, 12 × B57BL/6J), XM2A-1 und XM2A-2 (2 individuelle Nachkommen) oder aus den parenteralen yH2-enthaltenden ES-Zelllinien L10 (leicht unbeladen im Vergleich zu den anderen Proben), J9.2 und der yK2-enthaltenden ES-Zelllinie J23.1 hergestellt wurde. Die verwendeten Sonden waren humanes V_H1 (2F), V_H4 (2G), humanes γ-2 (2H) und Maus 3'-Enhancer (2I, die 5 kb-Bande repräsentiert das endogene 3'-Enhancerfragment der Maus). Die Fragmentgrößen der Molekulargewichtsmarker sind angegeben (in kb).
Die 3A–I zeigen eine Reihe von Southern Blot-Analysen, welche den YAC mit humaner Kappa leichter Kette, yK2, integriert in ES-Zellen und in Xeno-Mouse 2A-Stämme, charaktierisieren. Die 3A–E zeigen eine Reihe von Southern Blot-Analysen einer mit EcoRI (3A, 3C, 3D) und BamHI (3B, 3E) verdauten DNA (2 μg), die aus der CGM1-Zelllinie (Brownstein et al., 1989, siehe oben), dem yK2-YAC (0,5 μg YAC DNA, zugegeben zu 2 μg 3B1 DNA), unmodifizierten E14TG.3B1 (3B1) und yK2-enthaltenden ES-Zelllinien: J23.1 und J23.7, hergestellt wurde. Die verwendeten Sonden waren humanes Va (3A), Kde (3B), V_KII (3C), V_KIII (3D) und C_K (3E). Die 3F-I zeigen eine Reihe von Southern Blot-Analysen einer mit EcoRI-verdauten DNA (2 μg), die aus den Schwänzen von Wildtyp-Mäusen (WT, 129 × B6), XM2A-1 und XM2A-2 (2 individuelle Nachfahren) oder aus den parenteralen yH2-enthaltenden ES-Zelllinien L10 (im Vergleich zu den anderen Proben leicht unterbeladen), J9.2 und der yK2-enthaltenden ES-Zelllinie J23.1 hergestellt wurde. Die verwendeten Sonden waren humanes V_KI (3F), V_KIV (3G), V_KVI (3H) und der 3'-Enhancer (3I). Die Fragmentgrößen der Molekulargewichtsmarker sind angegeben (in kb).
Die 4A bis 4T zeigen die B-Zell-Rekonstitution und Oberflächenexpression der humanen μ-, δ- und κ-Ketten aus von XenoMouse stammenden B-Zellen und zeigen die durchflusszytometrische Analyse von Lymphozyten des peripheren Blutes (4A bis 4H) sowie der Milz (4I bis 4T) aus Wildtyp-Mäusen (WT), doppelt-inaktivierten Mäusen (double inactivated, DI) und den XenoMouse-Stämmen 2A-1 und 2A-2 (XM2A-1, XM2A-2). Eine vierfarbige durchflusszytometrische Analyse wurde unter Verwendung von Antikörpern gegen den B-Zell-spezifischen Marker 8220 in Kombination mit anti-humanem μ, δ, κ oder Maus μ, δ, κ oder λ durchgeführt. Der prozentuale Anteil der positiv gefärbten Zellen ist in jedem Quadranten gezeigt. Die Isolation und Färbung der Zellen wurde wie in Material und Methoden beschrieben durchgeführt. Die Populationen der humanen K⁺- und der Maus λ⁺-Zellen wurden bestimmt, nachdem zunächst in dem angegebenen Bereich 6220⁺μ⁺-Populationen ausgewählt (gegated) wurden. Die Populationen der μ⁺- und δ⁺-Zellen wurden bestimmt, nachdem zunächst B220⁺-Zellen ausgewählt (gegated) wurden. Der prozentuale Anteil positiver Zellen innerhalb einer Region oder eines Quadranten ist angegeben. Die gezeigten FACS-Profile sind reprä sentativ für mehrere Experimente, die mit jedem der Stämme durchgeführt wurden.
Die 5A bis 5C zeigen, dass von der XenoMouse abgeleitete humane Antikörper die Bindung ihres spezifischen Antigens an Zellen blockieren. 5A zeigt die Inhibition der Bindung von markiertem [I¹²⁵]IL-8 an humane Neutrophile durch den Maus-anti-humanen IL-8-Antikörper (R&D Systems) (☐) sowie die vollständig humanen Antikörper D1.1 (♦), K2.2 (•), K4.2
und K4.3
. Die Hintergrund-Bindung des markierten [I¹²⁵]IL-8 in Abwesenheit eines Antikörpers betrug 2657 cpm. 5B zeigt die Inhibition der Bindung von markiertem [I¹²⁵]EGF an dessen Rezeptoren auf A431-Zellen durch die Maus-anti-humanen EGFR-Antikörper 225 und 528 (☐ bzw. ∇; Calbiochem) sowie die vollständig humanen Antikörper E1.1 (•), E2.4
, E2.5
und E2.11 (♦). Die Hintergrundbindung von [I¹²⁵]EGF in der Abwesenheit von Antikörpern betrug 1060 cpm. 5C zeigt die Inhibition der Bindung von markiertem [1¹²⁵]-TNF-α an dessen Rezeptoren auf U937-Zellen durch den Maus-anti-humanen TNF-α-Antikörper (R&D Systems) (☐) sowie die vollständig humanen Antikörper T22.1 (♦), T22.4 (•), T22.8
und T22.9 (∎). Die Hintergrundbindung von [1¹²⁵] TNF-α in der Abwesenheit des Antikörpers betrug 4010 cpm. Humaner IgG₂-Myelom-Kontrollantikörper (⊗).
Die 6A bis 6D zeigen das Repertoire und die somatische Hypermutation in vollständig humanen Mabs, die von XenoMouse stammen. Vorhergesagte Aminosäuresequenzen von vier anti-IL-8 (6A, 6B) und vier anti-EGFR (6C, 6D) humanen IgG₂κ-Mabs, unterteilt in CDR1, CDR2 und CDR3 sowie die konstanten Regionen, Cγ2 und C. Die D- und J-Gene von jedem Antikörper sind angegeben. Die Aminosäuresubstitutionen aus den Keimbahnsequenzen sind in fettgedruckten Buchstaben angegeben.
7 ist ein schematisches Diagramm des Genoms der humanen schweren Kette und des Genoms der humanen Kappa leichten Kette.
8 ist ein weiteres schematisches Diagramm, das die Konstruktion des yH2 (humane schwere Kette) YAC zeigt.
9 ist ein weiteres schematisches Diagramm, das die Konstruktion des yK2 (humane Kappa leichte Kette) YAC zeigt.
10 ist ein weiteres schematisches Diagramm, das die Konstruktion des yK2 (humane Kappa leichte Kette) YAC zeigt.
Die 11A bis 11I zeigen eine Reihe von Southern Blot-Analysen, welche die intakte Integration des yH2 (humane schwere Kette) YAC in ES-Zellen und in das Mausgenom nachweisen. Eine detaillierte Erörterung wird im Zusammenhang mit 2 zur Verfügung gestellt.
Die 12A bis 12I zeigen eine Reihe von Southern Blot-Analysen, welche die intakte Integration des yK2 (humane Kappa leichte Kette) YAC in ES-Zellen und in das Mausgenom nachweisen. Eine detaillierte Diskussion wird im Zusammenhang mit der 3 zur Verfügung gestellt.
Die 13A bis 13F zeigen die B-Zell-Rekonstitution und Oberflächenexpression der humanen μ-, δ- und κ-Ketten sowie der Maus-λ-Ketten auf von XenoMouse stammenden B-Zellen und zeigen die durchflusszytometrische Analyse des peripheren Blutes. Weitere Details stehen im Zusammenhang mit 4 zur Verfügung.
14 zeigt die Produktionsmengen der humanen Antikörper durch XenoMouse II-Stamme im Vergleich zur Produktion des murinen Antikörpers durch Wildtyp-Mäuse.
15 ist eine Analyse des Repertoires der Transkripte für die humane schwere Kette, die in XenoMouse II-Stämmen exprimiert werden.
16 ist eine Analyse des Repertoires der Transkripte für die humane Kappa leichte Kette, die in XenoMouse II-Stämmen exprimiert werden.
17 ist eine weitere Darstellung der verschiedenen Verwendungen der V_H- und V_κ-Gene, die in XenoMouse II-Stämmen beobachtet wurden.
18 zeigt die Titer der Produktion humaner Antikörper in XenoMouse II-Stämmen.
19 ist eine Darstellung der Gen-Verwendung von Anti-IL-8-Antikörpern, die aus XenoMouse II-Stammen stammen.
20 zeigt die Aminosäuresequenzen der schweren Kette der anti-IL-8-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
21 zeigt die Aminosäuresequenzen der Kappa leichten Kette von anti-IL-8-Antikörpern, die aus XenoMouse II-Stammen stammen.
22 zeigt die Blockierung der Bindung von II-8 an humane Neutrophile durch humane anti-IL-8-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
23 zeigt die Inhibition der CD11 b-Expression auf humanen Neutrophilen durch humane anti-IL-8-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
24 zeigt die Inhibition des IL-8-induzierten Calcium-Influx durch humane anti-IL-8-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
25 zeigt die Inhibition der IL-8 RB/293-Chemotaxen durch humane anti-IL-8-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
26 ist ein schematisches Diagramm eines Kaninchenmodells für durch humanes IL-8 induzierte Hautentzündung.
27 zeigt die Inhibition der durch humanes IL-8 induzierten Hautentzündung in dem Kaninchenmodell der 26 mit humanen anti-IL-8-Antikörpern, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
28 zeigt die Inhibition der Angiogenese von Endothelzellen in einem Rattenmodell der Kornea-Tasche durch humane anti-IL-8-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
29 ist eine Darstellung der Gen-Verwendung humaner anti-EGFR-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
30 zeigt die Aminosäuresequenzen der schweren Kette der humanen anti-EGFR-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
31 zeigt die Blockierung der EGF-Bindung an A431-Zellen durch humane anti-EGFR-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stammen stammen.
32 zeigt die Inhibition der EGF-Bindung an SW94B-Zellen durch humane anti-EGFR-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
33 zeigt, dass die aus den XenoMouse II-Stämmen stammenden humanen anti-EGFR Antikörper das Wachstum von SW94B-Zellen in vitro inhibieren.
34 zeigt die Inhibition der Bindung von TNF-α an U937-Zellen durch die Verwendung humaner anti-TNF-α-Antikörper, die aus XenoMouse II-Stämmen stammen.
35 zeigt die Aminosäuresequenzen der Kappa leichten Kette von humanen anti-EGFR-Antikörpern, die aus XenoMouse II-Stammen stammen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Hierin beschreiben wir die Herstellung und Charakterisierung mehrerer Mausstämme, die Megabasen-große humane Ig-Loci enthalten, die im Wesentlichen in der Keimbahnlinien-Konfiguration vorliegen. Die vorliegende Erfindung beschreibt folglich den ersten Nachweis einer Rekonstruktion der großen und komplexen humanen Ig-Loci auf YACs und das erfolgreiche Einbringen der Megabasen-großen YACs in Mäuse, um die entsprechenden Maus-Loci funktionell zu ersetzen.
Mausstämme
Die folgenden Mausstämme werden hierin beschrieben und/oder verwendet.
Doppelt inaktivierter (DI)-Stamm: Die DI-Mäusestämme sind Mäuse, die kein funktionelles endogenes Maus-Ig produzieren. In bevorzugten Ausführungsformen besitzen die DI-Mäuse eine inaktivierte Maus-J_H-Region und eine inaktivierte Maus-C_κ-Region. Die Herstellung dieses Stammes wird anderswo ausführlich diskutiert. Zum Beispiel werden die Methoden, die zur Erzeugung der DI-Stämme verwendet werden, im Detail in den US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 07/466,008, eingereicht am 12. Januar 1990, 07/610,515, eingereicht am 08. November 1990, 07/919,297, eingereicht am 24. Juli 1992, 08/031,801, eingereicht am 15. März 1993, 08/112,848, eingereicht am 27. August 1993, 08/234,145, eingereicht am 28. April 1994, 08/724,752, eingereicht am 02. Oktober 1996, detailliert beschrieben. Siehe auch europäisches Patent Nr. EP 0 463 151 81 , Erteilung veröffentlicht am 12. Juni 1996, internationale Patentanmeldung Nr. WO 94/02602 , veröffentlicht am 03. Februar 1994, internationale Patentanmeldung Nr. WO 96/34096 , veröffentlicht am 31. Oktober 1996 und PCT-Anmeldung Nr. PCT/US96/05928, eingereicht am 29. April 1996. Die Offenbarungen eines jeden der oben zitierten Patente und Patentanmeldungen sind hiermit durch Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen. Es wurde beobachtet und berichtet, dass DI-Mäuse eine sehr unreife B-Zellentwicklung haben. Die Mäuse produzieren keine reifen B-Zellen, sondern nur pro-B-Zellen.
XenoMouse I-Stamm: Die Konstruktion, Herstellung und Analyse des XenoMouse I-Stammes wurde im Detail in Green et al., Nature Genetics, 7: 13–21 (1994) diskutiert. Derartige Mäuse produzierten IgM Antikörper auf einem DI-Hintergrund. Die Mäuse zeigten eine verbesserte B-Zell-Funktion im Vergleich zu den DI-Mäusestämmen, die eine geringe bis keine B-Zell-Entwicklung aufweisen. Während XenoMouse I-Mäusestämme in der Lage waren, eine messbare Immunantwort gegen eine Antigen-Challenge aufzubauen, schienen sie nur eine ineffiziente Produkt von B-Zellen aufzuweisen und zeigten eine beschränkte Antwort auf verschiedene Antigene, was offensichtlich mit ihrem beschränkten V-Gen-Repertoire zusammenhängt.
L6-Stamm: Der L6-Stamm ist eine Maus, die IgM Antikörper auf einem DI-Hintergrund mit endogenem Maus-Ig produzieren. L6-Mäuse enthalten eine insertierte humane schwere Kette und eine insertierte humane leichte Kette. Der L6-Stamm wird durch Verpaaren einer Maus, die ein Insert für eine schwere Kette auf einem doppelt inaktivierten Hintergrund enthält (L6H) und einer Maus, die ein Insert für eine Kappa leichte Kette auf einem doppelt inaktivierten Hintergrund (L6L) enthält, erzeugt. Das Insert der schweren Kette umfasst ein intaktes, etwa 970 kb großes humanes DNA-Insert aus einem YAC, enthaltend etwa 66 V_H-Segmente, beginnend bei V_H6-1 und endend bei V_H3-65 und enthaltend die Haupt-D-Gen-Cluster (etwa 32), J_H-Gene (6), den intronischen Enhancer (Em), Cμ und bis etwa 25 kb hinter Cδ, in Keimbahnkonfiguration. Das Insert der leichten Kette umfasst ein intaktes, etwa 800 kb großes humanes DNA-Insert aus einem YAC, enthaltend etwa 32 V_κ-Gene, beginnend bei V_κ-B3 und endend bei V_κ-Op11. Das 800 kb Insert enthält eine Deletion von etwa 100 kb, beginnend bei V_κ-Lp-13 und V_κ-Lp-5. Jedoch liegt die DNA von V_κ-Lp-13 bis 100 kb nach V_κ-Op-1 in Keimbahnkonfiguration vor und enthält außerdem die J_κ-Gene, die intronischen und 3'-Enhancer, das konstante C_κ-Gen und Kde. Es wurde gezeigt, dass die L6H- und L6L-Mäuse auf das volle Spektrum der variablen Gene, die in ihr Genom eingebaut sind, zurückgreifen. Es wird erwartet, dass die L6-Mäuse in ähnlicher Weise auf das volle Spektrum der variablen Gene in ihrem Genom zurückgreifen. Darüber hinaus werden L6-Mäuse eine überwiegende Expression der humanen κ-leichten Kette, eine große Population reifer B-Zellen und normale Konzentrationen an IgM humanen Antikörpern zeigen. Solche Mäuse werden eine heftige humane Antikörperantwort auf verschiedene Immunogene entwickeln, was schließlich zu Antigen-spezifischen, vollständig humanen Mabs mit subnanomolaren Affinitäten führen wird.
XenoMouse IIa-Stamm: Die XenoMouse IIa-Mäuse stellen unsere zweite Generation Xeno-Mouse^TM-Stämme dar, ausgestattet mit Megabasen-großen humanen Ig-Loci in Keimbahnkonfigurationen, auf einem DI-Hintergrund, so dass die Mäuse kein funktionelles endogenes Ig produzieren. Die Mäuse sind in ihrem Aufbau im Wesentlichen vergleichbar mit dem L6-Stamm, beinhalten jedoch zusätzlich das humane γ2-Gen mit seinen gesamten Switch- und regulatorischen Sequenzen sowie den 3'-Enhancer der Maus in cis. Die Mäuse enthalten einen etwa 1020 kb großen Loci der schweren Ketten und einen etwa 800 kb großen Loci der Kappa leichten Kette, rekonstruiert auf YACs, welche die Mehrzahl der Gene der humanen variablen Region enthalten, einschließlich der Gene der schweren Kette (etwa 66 V_H) und der Gene der Kappa leichten Kette (etwa 32 V_κ), der Gene der humanen schweren konstanten Region (μ, δ und γ) und der Gene der Kappa konstanten Region (C_κ) sowie sämtliche der identifizierten regulatorischen Hauptelemente. Es wurde gezeigt, dass diese Mäuse auf das gesamte Spektrum der variablen Gene, die in ihr Genom eingebaut sind, zurückgreifen. Darüber hinaus zeigen sie einen effizienten Klassenwechsel und somatische Hypermutation, eine überwiegende Expression der humanen Kappa leichten Kette, eine große Population reifer B-Zellen und normale Konzentrationen an IgM_κ und IgG_κ humanen Antikörpern. Solche Mäuse entwickeln eine heftige humane Antikörperantwort auf verschiedene Immunogene, einschließlich humanem IL-8, humanem EGF-Rezeptor (EGFR) und humanem Tumornekrosefaktor-α, (TNF-α), was schließlich zu Antigen-spezifischen, vollständig humanen Mabs mit subnanomolaren Affinitäten führt. Das letzte Ergebnis weist überzeugend nach, dass die XenoMouse eine ausgezeichnete Quelle für die rasche Isolation vollständig humaner therapeutischer Mabs mit hoher Affinität gegen ein breites Spektrum an Antigenen mit jeglicher gewünschter Spezifität ist.
Wie aus der obigen Einführung zu erkennen ist, scheint der XenoMouse II-Stamm eine Entwicklung reifer B-Zellen durchzumachen und wirksame Immunantworten gegen eine Antigen-Challenge, ähnlich der humaner Erwachsener, zu entwickeln. Wie aus den Daten im Zusammenhang mit L6L- und L6H-Mäusen vorhergesagt, scheint auch der L6-Stamm eine Entwicklung reifer B-Zellen durchzumachen und wirksame Immunantworten, ähnlich denen des erwachsenen Menschen, gegen eine Antigen-Challenge zu entwickeln. Werden DI-Mäuse mit XenoMouse I-Stämmen verglichen und DI- und XenoMouse I-Stämme mit L6- und XenoMouse II-Stämmen, wird ein deutlich anderes Profil der B-Zellentwicklung beobachtet. Wegen dieses Unterschiedes scheint es, dass die Quantität und/oder Qualität der Sequenzen der variablen Region, die in die Tiere eingeführt wurden, wesentlich für die Induktion der B-Zell-Reifung und -Entwicklung sowie für die Erzeugung einer Immunantwort ähnlich der humaner Erwachsener sind. Folglich stellen die Stämme zusätzlich zu der offensichtlichen Verwendung bei der Erzeugung humaner Antikörper ein wertvolles Mittel zum Untersuchen der Art der humanen Antikörper in einer normalen Immunantwort, ebenso wie der anormalen Antworteigenschaften einer Autoimmunerkrankung und anderer Störungen dar.
Variable Region – Quantitative Diversität
Es wird vorausgesagt, dass die Spezifität von Antikörpern (d. h. die Fähigkeit zur Erzeugung von Antikörpern gegen ein breites Spektrum von Antigenen und tatsächlich gegen ein weites Spektrum unabhängiger Epitope darauf) abhängig ist von den Genen der variablen Region im Genom der schweren Kette (V_H) und der Kappa leichten Kette (V_κ). Das Genom der hu manen schweren Kette umfasst etwa 95 funktionelle Gene, die für die variablen Regionen der humane schweren Kette von Immunglobulinmolekülen kodieren. Zusätzlich enthält das Genom der humanen leichten Kette etwa 40 Gene an dessen proximalem Ende, die für variable Regionen der humanen Kappa leichten Kette von Immunglobulinmolekülen kodieren. Wir haben gezeigt, dass die Spezifität von Antikörpern durch Einbeziehen einer Vielzahl von Genen, die für die variablen leichten und schweren Ketten kodieren, verstärkt werden kann.
In der vorliegenden Erfindung werden transgene Mäuse beschrieben, die einen wesentlichen Teil des humanen Ig-Locus haben, vorzugsweise einschließlich sowohl eines humanen schwere Kette Locus und eines humanen Kappa leichte Kette Locus. In einer bevorzugten Ausführungsform werden daher mehr als 10% der humanen V_H- und V_κ-Gene verwendet. Bevorzugter werden mehr als 20%, 30%, 40%, 50%, 60% oder sogar 70% oder mehr der V_H- und V_κ-Gene verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Konstrukte verwendet, die 32 Gene in der proximalen Region des Genoms der V_κ leichten Kette und 66 Gene in dem V_H-Teil des Genoms enthalten. Wie verstanden werden wird, können die Gene entweder sequenziell angeordnet sein, d. h. in der Reihenfolge, wie sie in humanem Genom vorliegt, oder außerhalb der Reihenfolge, d. h. in einer anderen Anordnung als der im humanen Genom, oder einer Kombination daraus. Folglich kann beispielsweise ein vollständig sequenzieller Teil entweder des V_H-Genoms oder des V_κ-Genoms verwendet werden, oder es können verschiedene V-Gene entweder in dem V_H-Genom oder dem V_κ-Genom ausgelassen werden, während insgesamt eine sequenzielle Anordnung beibehalten wird, oder V-Gene innerhalb entweder des V_H-Genoms oder des V_κ-Genoms können neu geordnet werden, und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der gesamte insertierte Locus im Wesentlichen in Keimbahnkonfiguration bereitgestellt, wie sie in Menschen vorhanden ist. In jedem Fall wird erwartet, und die hierin beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass das Einbeziehen verschiedenartiger Gene aus dem V_H- und V_κ-Genom zu einer erhöhten Antikörperspezifität und letztlich zu erhöhten Antikörperaffinitäten führt.
Darüber hinaus beinhalten solche Mäuse vorzugsweise die gesamte D_H-Region, die gesamte J_H-Region, die humane Mu konstante Region und können zusätzlich mit weiteren humanen konstanten Regionen für die Kodierung und Erzeugung zusätzlicher Antikörper-Isotypen ausgestattet sein. Solche Isotypen können Gene umfassen, die für γ₁, γ₂, γ₃, γ₄, α, ε und δ kodieren sowie weitere für konstante Regionen kodierende Gene mit geeigneten Switch- und regulatorischen Sequenzen. Wie verstanden werden wird und wie unten detail lierter erörtert wird, kann eine Vielzahl von Switch- und regulatorischen Sequenzen in geeigneter Weise zusammen mit jeder einzelnen ausgewählten konstanten Region verwendet werden.

Die folgende Tabelle zeigt die Diversität von Antikörperkombinationen, die in Menschen möglich ist, streng basierend auf einer zufälligen V-D-J-Verbindung und Kombination mit Kappa leichten Ketten, ohne Berücksichtigung der N-Addition oder somatischer Mutationsereignisse. Auf Grundlage dieser Betrachtungen gibt es mehr als 3,8 Millionen mögliche Antikörperkombinationen in Menschen von jedem einzelnen Isotyp. Tabelle I

Region	Schwere Kette (SK)	Kappa leichte Kette (LK)
Variabel "V"	–95	40
Diversität "D"	≥ 32	-
Joining "J"	6	5
Kombinationen (V × D × J)	18.240	200
Gesamt-Kombinationen SK-Kombinationen × LK-Kombinationen	3,65 × 10⁶

Im Zusammenhang mit einer bevorzugten Ausführungsform liegt die mögliche Diversität der Antikörperproduktion durch den Einschluss von etwa 66 V_H-Genen und 32 V_κ/Genen in einer Maus mit einer vollen Anzahl von D_H-, J_H- und J_κ-Genen im Bereich von 2,03 × 10⁶ verschiedenen Antikörpern. Wie zuvor, berücksichtigt diese Berechnung nicht die N-Addition oder somatische Mutationsereignisse. Folglich wird verstanden werden, dass die Mäuse in Übereinstimmung mit der Erfindung, wie z. B. die L6- und die XenoMouse II-Stämme, eine hohe Antikörperdiversität bieten. In bevorzugten Ausführungsformen werden Mäuse so konstruiert, dass sie die Fähigkeit besitzen, mehr als 1 × 10⁶ verschiedene schwere Kette V-D-J-Kombinationen und Kappa leichte Kette V-J-Kombinationen zu produzieren, ohne N-Additionen oder somatische Mutationsereignisse zu berücksichtigen.
Variable Region – Qualitative Diversität
Zusätzlich zu der quantitativen Diversität scheint die quantitative Selektion von V-Genen (d. h. die Auswahl großer und verschiedener Anzahlen von V-Genen) und/oder die qualitative Selektion von V-Genen (d. h. die Auswahl bestimmter V-Gene) eine Rolle zu spielen bei dem, was wir hierin als "qualitative Diversität" bezeichnen. Die qualitative Diversität, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Diversität bei den V-D-J-Rearrangements, wobei die Verknüpfungsdiversität (junctional diversity) und/oder somatische Mutationsereignisse eingeführt werden. Während des Rearrangements der schweren Kette sind bestimmte Enzyme (RAG-1, RAG-2 und möglicherweise weitere) verantwortlich für das Schneiden der DNA, welche die kodierenden Bereiche von Antikörpergenen darstellt. Die Aktivität der terminalen Deoxynukleotidyltransferase (Tdt), die verantwortlich ist für N-terminale Additionen von Nukleotiden zwischen den V-D- und D-J-Gensegmenten, wird hochreguliert. Ähnliche Enzyme sowie weitere (SCID und andere DNA-Reparaturenzyme) sind verantwortlich für die Deletion, die an den Verknüpfungspunkten dieser kodierenden Segmente auftritt. Was die Verknüpfungsdiversität anbetrifft, sind sowohl N-Additionsereignisse als auch die Bildung der Komplementarität-bestimmenden Region 3 (complementarity determining region 3, CDR3) von diesem Begriff umfasst. Wie verstanden werden wird, erstreckt sich die CDR3 über die D-Region und schließt die V-D- und die D-J-Verknüpfungsereignisse ein. Folglich sind N-Additionen und Deletionen sowohl während des D-J-Rearrangements als auch während des V-D-Rearrangements für die CDR3-Diversität verantwortlich.
Es wurde gezeigt, dass es bestimmte Unterschiede zwischen den murinen und humanen Veknüpfungsdiversitäten gibt. Insbesondere haben einige Forscher berichtet, dass die Längen der N-Addition und die Längen der CDR3 in der Maus im Allgemeinen kürzer sind als übliche Längen der N-Addition und der CDR3 in Menschen. Diese Gruppen haben berichtet, dass in Menschen üblicherweise N-Additionen mit einer Länge von etwa 7,7 Basen im Durchschnitt beobachtet werden. Yamada et al. (1991). Maus-ähnliche N-Additionen liegen häufiger im Bereich von durchschnittlich etwa 3 Basen Länge. Feeney et al. (1990). Ebenso sind Menschen-ähnliche CDR3-Längen länger als Maus-ähnliche CDR3s. Bei Menschen sind CDR3-Längen zwischen 2 und 25 Resten, bei einem Durchschnitt von 14 Resten, häufig. In Mäusen wurden von einigen Gruppen kürzere durchschnittliche CDR3-Längen beobachtet.
Die Verknüpfungsdiversität, die durch N-Additionen und CDR3-Additionen erzeugt wird, spielt ohne Zweifel eine Rolle bei der Entwicklung der Antikörperspezifität.
Rearrangierte V-D-J-Gensequenzen weisen N-Additionslängen auf, die vergleichbar sind mit den erwarteten N-Additionslängen erwachsener Menschen. Darüber hinaus zeigen Aminosäuresequenzen über den offenen Leserahmen (ORF), entsprechend den CDR3-Sequenzen, CDR3-Längen, die vergleichbar sind mit den erwarteten CDR3-Längen erwachsener Menschen. Diese Daten weisen darauf hin, dass die quantitative Diversität der variablen Region und/oder die qualitative Diversität der variablen Region zu einer Verknüpfungsdiversität ähnlich dem Menschen führt. Es wird erwartet, dass eine derartige Verknüpfungsdiversität zu einer Mensch-ähnlicheren Antikörperspezifität führt.
Variable Region – Affinitäten
Während wir nicht endgültig einen direkten kausalen Zusammenhang zwischen einem verstärkten Einbeziehen der variablen Region und der Antikörperspezifität nachgewiesen haben, scheint es und ist zu erwarten, dass durch Bereitstellen einer solchen Diversität die Fähigkeit der Maus zur Erzeugung einer Immunantwort gegen eine Vielzahl von Antigenen möglich ist und verstärkt wird. Darüber hinaus scheinen solche Mäuse besser ausgestattet zu sein, um Immunantworten gegen eine große Anzahl von Epitopen auf individuellen Antigenen oder Immunogenen zu erzeugen. Ausgehend von unseren Daten scheint es außerdem, dass die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellten Antikörper erhöhte Affinitäten aufweisen. Diese Daten beinhalten Vergleiche zwischen Mäusen in Übereinstimmung mit der Erfindung und den XenoMouse I-Stämmen, ebenso wie die Berücksichtigung der veröffentlichten Ergebnisse von GenPharm International und MRC. Mit Bezug auf die XenoMouse I-Stämme, wie oben erwähnt, wiesen solche Mäuse eine ineffiziente B-Zell-Produktion und eine beschränkte Antwort auf verschiedene Antigene auf. Dieses Ergebnis schien teilweise mit dem limitierten V-Gen-Repertoire zusammenzuhängen. In ähnlicher Weise weisen die von GenPharm International und MRC berichteten Ergebnisse auf eine beschränkte Antwort auf verschiedene Antigene hin.
Ohne auf irgendeine bestimmte Theorie oder Funktionsweise der Erfindung festgelegt sein zu wollen, scheint es so, dass sich erhöhte Affinitäten scheinbar aus der Bereitstellung der großen Anzahl von V-Regionen ergeben. Gemäß unseren Daten verstärkt die Bereitstellung größerer Zahlen und/oder die Auswahl von Qualitäten/Eigenschaften von V-Gen-Sequenzen die Verknüpfungsdiversität (N-Additionsdiversität und die Diversität durch Bildung der Komplementarität-bestimmenden Region 3 ("CDR3")), die typisch ist für eine Immunantwort ähnlich der eines erwachsenen Menschen, und die eine wichtige Rolle bei der Affinitätsreifung der Antikörper spielt. Es könnte außerdem sein, dass derartige Antikörper wirksamer und effizienter bei somatischen Mutationsereignissen sind, die zu verstärkten Affinitäten führen. Sowohl die Verknüpfungsdiversität als auch die somatischen Mutationsereignisse werden detaillierter unten erörtert.
Was die Affinitäten anbetrifft, führen die Antikörper-Affinitätsgrade und -Konstanten, die durch Verwendung mehrerer V_H- und V_κ-Gene erzielt werden (d. h. die Verwendung von 32 Genen in der proximalen Region des Genoms der V_κ leichten Kette und 66 Genen in dem V_H-Teil des Genoms) zu Assoziationsraten (ka in M^–1S^–1) von größer als etwa 0,50 × 10^–6, vorzugsweise größer als 2,00 × 10^–6 und am bevorzugtesten größer als etwa 4,00 × 10^–6; Dissoziationsraten (kd in S^–1) von größer als etwa 1,00 × 10^–4, vorzugsweise größer als etwa 2,00 × 10^–4 und am bevorzugtesten größer als etwa 4,00 × 10^–4; und Dissoziationskonstanten (in M) von größer als etwa 1,00 × 10^–10, vorzugsweise größer als etwa 2,00 × 10^–10 und am bevorzugtesten größer als etwa 4,00 × 10^–10.
Vorzugsweise produzieren solche Mäuse darüber hinaus keine funktionellen endogenen Immunglobuline. Dies wird in einer bevorzugten Ausführungsform durch die Inaktivierung (oder knocking out) der Loci der endogenen schweren und leichten Kette erreicht. Zum Beispiel wird in einer bevorzugten Ausführungsform die J-Region der schweren Kette der Maus und die J-Region der Kappa leichten Kette der Maus sowie die C_κ-Region durch Verwendung von Vektoren zur homologen Rekombination inaktiviert, welche die Region ersetzen oder deletieren.
Variable Region – B-Zell-Entwicklung
Zur B-Zell-Entwicklung wird in Klaus B Lymphocyies (IRL Press (1990)) und in den Kapiteln 1–3 von Immunoglobulin Genes (Academic Press Ltd. (1989)) ein Überblick gegeben. Im Allgemeinen stammt in Säugern die Blutzellentwicklung, einschließlich der B- und T-Zell-Lymphozyten, von einer gemeinsamen pluripotenten Stammzelle ab. Die Lymphozyten entwickeln sich dann aus einer gemeinsamen lymphoiden Vorläuferzelle. Nach einer frühen Gestationsphase verlegt sich die B-Zell-Initiierung von der Leber ins Knochenmark, wo sie während des gesamten Lebens des Saugers bleibt.
In dem Lebenszyklus einer B-Zelle ist die erste allgemein erkennbare Zelle eine pro-prä-B- Zelle, die in dem Knochenmark zu finden ist. Eine solche Zelle hat das V-D-J-Rearrangement der schweren Kette begonnen, stellt jedoch noch kein Protein her. Die Zelle entwickelt sich anschließend in eine große, sich schnell teilende prä-B-Zelle I, die eine zytoplasmatische μ⁺-Zelle ist. Diese prä-B-Zelle I hört dann auf sich zu teilen, schrumpft und unterzieht sich einem V-J-Rearrangement der leichten Kette und wird so eine prä-B-Zelle II, die Oberflächen-IgM exprimiert und die das Knochenmark als unreife B-Zelle verlässt. Die meisten der entstehenden unreifen B-Zellen fahren fort, sich zu entwickeln und Oberflächen-IgD zu produzieren, was auf den Abschluss ihrer Differenzierung und Entwicklung als vollständig reife, immunkompetente, pheriphere B-Zellen hinweist, die primär in der Milz vorhanden sind. Jedoch ist es möglich, die Delta konstante Region zu eliminieren und dennoch immunkompetente Zellen zu erhalten.

Die B-Zell-Differenzierung und -Entwicklung kann durch die Verwendung von Oberflächen markern beobachtet und/oder verfolgt werden. Zum Beispiel wird das B220-Antigen auf reifen B-Zellen im Vergleich zu prä-B-Zellen I oder II in relativ großen Mengen exprimiert. Folglich können Zellen, die B220⁺ und Oberflächen-IgM⁺ (μ⁺) sind, verwendet werden, um das Vorhandensein reifer B-Zellen zu bestimmen. Darüber hinaus können die Zellen auf die Expression von Oberflächen-IgD (δ⁺) untersucht werden. Ein weiteres Antigen, das hitzestabile Antigen, wird von prä-B-Zellen II exprimiert, wenn sie sich im Übergang zur Peripherie befinden (d. h. wenn sie zu μ⁺ und/oder μ⁺, δ⁺ werden). Tabelle II

	Knochenmark			Milz
Marker	Pro-präB-Zelle	prä-B-Zelle Ι	prä-B-Zelle II entstehende B-Zelle	Unreife B-Zelle	Reife B-Zelle
B220	–	–	±	+	++
HSA	–	–	+	±	–
μ	–	–	+	+	+
δ*	–	–	–	–	+

* Das Vorhandensein einer funktionellen Kopie des Cδ-Gens in dem Transgen wird angenommen.

Durch die Verwendung von B-Zell-Markern, wie den oben erwähnten, kann die Entwicklung und Differenzierung von B-Zellen beobachtet und bestimmt werden.
Wir haben zuvor gezeigt, dass DI-Mäuse (Mäuse, die kein V-D-J-Rearrangement der schwerer Kette oder V-J-Rearrangement der leichten Kette durchmachen) keine reifen B-Zellen produzieren. Tatsächlich bleiben solche Mäuse bei der Produktion von pro-prä-B-Zellen stehen, und B-Zellen wandern nie aus dem Knochenmark in die peripheren Gewebe, einschließlich der Milz. Folglich sind sowohl die B-Zell-Entwicklung als auch die Antikörperproduktion vollständig zum Stillstand gebracht. Dasselbe Ergebnis wird in Mäusen beobachtet, die lediglich eine Inaktivierung der schweren Kette aufweisen; die B-Zell-Entwicklung und -Differenzierung wird im Knochenmark angehalten.
Unser XenoMouse I-Stamm produzierte funktionelle, einigermaßen reife B-Zellen. Jedoch war die Anzahl von B-Zellen sowohl im Knochenmark als auch in den peripheren Geweben im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen signifikant reduziert.
Dagegen besitzen unsere XenoMouse II-Stäme und L6-Stämme unerwarteterweise eine fast vollständige B-Zell-Rekonstitution. Folglich haben wir nachgewiesen, dass durch das quantitative oder qualitative Einbeziehen von Genen der variablen Region die B-Zell-Differenzierung und -Entwicklung größtenteils wiederhergestellt werden kann. Die Rekonstitution der B-Zell-Differenzierung und -Entwicklung ist ein Hinweis auf die Rekonstitution des Immunsystems. Im Allgemeinen ist die B-Zell-Rekonstitution vergleichbar mit Wildtyp-Kontrollen. Folglich weisen in bevorzugten Ausführungsformen Mäusepopulationen mit insertierten humanen variablen Regionen mehr als etwa 50% der B-Zell-Funktion im Vergleich zu Populationen von Wildtyp-Mäusen auf.
Ferner ist es interessant anzumerken, dass die bevorzugte Bildung humaner Antikörper im Vergleich zu Maus-Antikörpern wesentlich erhöht ist in Mäusen, die einen Knock-Out-Hintergrund für endogenes Ig haben. Das heißt, dass Mäuse, die einen humanen Ig-Locus haben und einen funktionell inaktivierten endogenen Ig-Locus der schweren Kette aufweisen, humane Antikörper 100- bis 1000-fach effizienter produzieren als Mäuse, die nur einen humanen Ig-Locus enthalten und deren endogener Locus nicht aktiviert ist.
Isotyp-Wechsel
Wie hierin im Detail erörtert wird, erfahren die XenoMouse II-Mäuse, wie erwartet, einen effizienten und erfolgreichen Isotyp-Wechsel von dem durch das humane Transgen kodierten Mu-Isotyp zu dem Transgen-kodierten Gamma-2-Isotyp. Wir haben außerdem XenoMouse II-Stamme entwickelt, die die humane Gamma-4 konstante Region enthalten und für diese kodieren. Wie oben erwähnt, können die Mäuse in Übereinstimmung mit der Erfindung zusätzlich mit weiteren humanen konstanten Regionen zur Erzeugung zusätzlicher Isotypen ausgestattet sein. Solche Isotypen können Gene einschließen, die für γ₁, γ₂, γ₃, γ₄, α, ε, δ kodieren, und weitere für konstante Regionen kodierende Gene enthalten. Alternative konstante Regionen können in demselben Transgen enthalten sein, d. h. stromabwärts der humanen Mu konstanten Region, oder alternativ können derartige weitere konstante Regionen auf anderen Chromosomen vorhanden sein. Es wird verstanden werden, dass dort, wo derartige weitere konstante Regionen auf demselben Chromosom wie dem Chromosom enthalten sind, das das für die humane Mu konstante Region kodierende Transgen enthält, ein cis-Wechsel zu einem anderen Isotyp oder anderen Isotypen erreicht werden kann. Andererseits kann dort, wo eine derartige weitere konstante Region auf einem anderen Chromosom enthalten ist als dem Chromosom, das das für die Mu konstante Region kodierende Transgen enthält, ein trans-Wechsel zu einem anderen Isotyp oder anderen Isotypen erreicht werden. Derartige Anordnungen ermöglichen eine enorme Flexibilität bei der Entwicklung und Konstruktion von Mäusen zur Erzeugung von Antikörpern gegen eine Vielzahl von Antigenen.
Es wird verstanden werden, dass die konstanten Regionen bekannte Switch-Sequenzen und regulatorische Sequenzen aufweisen, mit denen sie assoziiert sind. Sämtliche Gene der murinen und humanen konstanten Region waren bis 1989 sequenziert und publiziert. Siehe Honjo et al., "Constant Region Genes of the Immunoglobulin Heavy Chain and the Molecular Mechanism of Class Switching" in Immunglobulin Genes (Honjo et al. Hrsg., Academic Press (1989)). In der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/574,748 wurde z. B. die Klonierung der humanen Gamma-1 konstanten Region auf Grundlage der bekannten Sequenzinformationen aus dem Stand der Technik vorhergesagt. Es wurde dargelegt, dass in dem nicht rearrangierten, nicht geswitchten Gen die gesamte Switch-Region von einer Sequenz umfasst war, die weniger als 5 kb von dem 5'-Ende des ersten γ-1 konstanten Exons beginnt. Daher war die Switch-Region auch in dem 5' 5,3 kb HindIII-Fragment enthalten, das in Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10:4071–4079 (1982) offenbart war. Gleichermaßen berichteten auch Takashashi et al., Cell 29:671–679 (1982), dass das in Ellison offenbarte Fragment die Switch-Sequenz enthielt und dass dieses Fragment zusammen mit dem 7,7 kb HindIII bis BamHI-Fragment sämtliche der für die Konstruktion des schwere Kette-Isotyp-Wechsel-Transgens notwendigen Sequenzen enthalten muss.
Folglich wird verstanden werden, dass eine jegliche humane konstante Region nach Wahl einfach in Mäuse in Übereinstimmung mit der Erfindung ohne unzumutbares Experimentieren eingebaut werden kann. Derartige konstante Regionen können mit ihren nativen Switch-Sequenzen assoziiert sein (d. h. eine humane γ_1,2,3oder4 konstante Region mit einer humanen γ_1,2,3oder4 Switch-Region) oder sie können mit anderen Switch-Sequenzen assoziiert sein (d. h. eine γ₄ konstante Region mit einer humanen γ₂ Switch-Region). Verschiedene 3'-Enhancer-Sequenzen können ferner verwendet werden, wie z. B. die der Maus, des Menschen oder der Ratte, um einige wenige zu nennen. In ähnlicher Weise können weitere regulatorische Sequenzen ebenfalls umfasst sein.
Alternativ oder zusätzlich zu einem in vivo-Isotyp-Wechsel können B-Zellen auf eine Sekretion "chimärer" Antikörper hin untersucht werden. Zum Beispiel bilden die L6-Mäuse zusätzlich zu vollständig humanen IgM-Antikörpern Antikörper, die vollständig humane schwere Kette V-, D-, J-Regionen, gekoppelt an konstante Regionen der Maus, wie verschiedene γ-Regionen (d. h. Maus-IgG1, 2, 3, 4) und dergleichen, aufweisen. Derartige Antikörper sind selber höchst nützlich. Zum Beispiel können mittels in vitro-Isotyp-Wechsel-Methoden, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, humane konstante Regionen in die Antikörper eingefügt werden. Alternativ und/oder zusätzlich können Fragmente (d. h. F(ab) und F(ab')₂-Fragmente) derartiger Antikörper hergestellt werden, die weniger oder keine konstanten Regionen der Maus enthalten.
Wie oben erörtert, ist der entscheidenste Faktor bei der Antikörperproduktion die Spezifität für ein gewünschtes Antigen oder ein Epitop auf einem Antigen. Danach wird die Klasse des Antikörpers wichtig, entsprechend dem therapeutischen Bedarf. In anderen Worten – wird der therapeutische Index eines Antikörpers durch Bereitstellen eines be stimmten Isotyps oder einer bestimmten Klasse erhöht? Die Betrachtung dieser Frage bringt die Themen der Komplementfixierung und dergleichen zur Sprache, die dann die Auswahl der bestimmten Antikörperklasse oder des Antikörper-Isotyps steuern. Gamma konstante Regionen unterstützen die Affinitätsreifung von Antikörpern. Jedoch ist das Einbeziehen einer humanen Gamma konstanten Region in einem Transgen nicht erforderlich, um eine solche Reifung zu erreichen. Im Gegenteil scheint der Vorgang ebenso gut in Verbindung mit Maus Gamma konstanten Regionen abzulaufen, die auf dem Mu-kodierenden Transgen trans-geswitched vorliegen.
MATERIAL UND METHODEN
Die folgenden Materialien und Methoden wurden im Zusammenhang mit der Erzeugung und Charakterisierung von Mäusen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Diese Materialien und Methoden sind als veranschaulichend gedacht und schränken die vorliegende Erfindung nicht ein.
Klonierung von YACs, die von humanem Ig abgeleitet sind: Humane YAC-Bibliotheken der Washington University (Brownstein et al., 1989) und des CEPH (Abertsen et al., 1990) wurden nach YACs gescreent, die Sequenzen der Loci der humanen schweren und der Kappa leichten Kette enthalten, wie zuvor beschrieben (Mendez et al., 1995). Die Klonierung und Charakterisierung von 1H- und 1K-YACs wurde von Mendez et al., (1995) beschrieben. 3H- und 4H-YACs wurden unter Verwendung einer V_H3-Sonde (0,55 kb PstI/NcoI, Berman et al., 1988) in der Bibliothek der Washington University identifiziert. Der 17H-YAC wurde aus der GM1416 YAC-Bibliothek kloniert und es wurde bestimmt, dass er 130 kb der Sequenzen für die schwere variable Kette sowie eine 150 kb chimäre Region an dessen 3'-Ende enthält, Matsuda et al., 1993. 2K- und 3K-YACs wurden aus der CHEF-Bibliothek unter Verwendung eines V_κII-spezifischen Primers (Albertsen et al., 1990) gewonnen.
YAC-Targeting und Rekombination: Es wurden Standardverfahren für das Hefewachstum, die Hefekreuzung (mating), die Sporulation und die Überprüfung des Phänotyps verwendet (Sherman et al., 1986). Das Targeting von YACs und YAC-Vektorarmen mit selektierbaren Hefe- und Säuger-Mackern, um das Screening nach YAC-Rekombinanten in Hefe oder die YAC-Integration in Zellen zu erleichtern, wurde mittels Lithiumacetat-Transformation (Scheistl und Geitz (1989)) erreicht. Nach jedem Targeting- oder Rekombinationsschritt wurde der/die modifizierte(n) YAC(s) mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese und Standard-Southern Blots analysiert, um die Intaktheit sämtlicher Sequenzen zu untersuchen.
YAC-Targeting-Vektoren wurden für die Interkonversion zentrischer und azentrischer Arme verwendet, um 17H neu zu ordnen und dessen 5'-Arm mit den LEU2- und URA3-Genen und dessen 3'-Arm mit dem HIS3-Gen zu ergänzen. Siehe 1a und Mendez et al., 1993. Der 4H-zentrische Arm wurde mit dem ADE2-Gen der Hefe und den humanen selektierbaren HPRT-Markern ergänzt. Für den ersten Rekombinationsschritt wurde ein diploider Hefestamm erzeugt und selektiert, in dem alle drei YACs 17H, 3H und 4H vorhanden, intakt und stabil enthalten waren. Eine dreifache homologe Rekombination zwischen den überlappenden Bereichen des YAC wurde durch Sporulation induziert, und der gewünschte Rekombinant wurde durch die Selektion der äußeren selektierbaren Hefemarker (ADE2 und HIS3) sowie die negative Selektion (Verlust) des internen Markers URA3 ermittelt. Die erfolgreiche Rekombination erzeugte einen 880 kb YAC, enthaltend 80% der IgH-variablen Region, die bei V_H2-5 beginnt und sich bis 320 kb 5' des V_H3-65-Gens erstreckt. Für die Rekombination des 880 kb YAC mit 1H wurde 1H mit pICL ergänzt, der das LYS2-Gen an den zentrischen Arm anfügt (Hermanson et al., 1991). Unter Verwendung einer Standard-Hefekreuzung wurde ein diploider Stamm selektiert, der sowohl 1H als auch den 880 kb YAC enthielt. Nach der Sporulation und durch Verwendung einer überlappenden Homologie wurde die YAC-Hefe-Rekombination durchgeführt. Mit Hilfe einer positiven Selektion für die äußeren Hefemarker (ADE2 und URA3) und eines Screenings auf Verlust der internen Marker (TRP1, LYS2, HIS3) wurde ein intakter 970 kb YAC gefunden, der aus etwa 66 V_H-Segmenten, beginnend bei V_H6-1 und endend bei V_H3-65, besteht. Der YAC enthielt ferner die Haupt-D-Gen-Cluster, die J_H-Gene, den intronischen Enhancer (Eμ), Cμ, bis zu 25 kb nach Cδ, in Keimbahn-Konfiguration. Dieser 970 kb YAC wurde anschließend mit einem Targeting-Vektor ergänzt, der ein 23 kb EcoRI genomisches Fragment des humanen γ-2-Gens enthält, einschließlich dessen Switch- und regulatorischen Elemente, ein 7 kb XbaI-Fragment des murinen 3'-Enhancers der schweren Kette, ein Neomycingen, gesteuert von dem Metallothioninpromotor (MMTNeo) und das LYS2-Gen der Hefe. Dieser Vektor zerstört das URA3-Gen, indem er diese Sequenzen in den 3'-YAC-Arm einbringt.
Als erster Schritt zur Erzeugung des γK2 YAC wurde durch Standard-Hefekreuzung ein diploider Hefestamm selektiert, in dem die ergänzten 1K- und 3K-YACs beide vorhanden, intakt und stabil aufrechterhalten waren. Unter Verwendung derselben Methode wie im Zusammenhang mit der IgH-Konstruktion beschrieben, wurde die YAC-Hefe-Rekombination ausgeführt. Durch die Verwendung einer positiven Selektion der äußeren Hefemarker (LYS2, TRP1) und das Screening auf den Verlust der internen Marker (URA3, TRP1) wurde ein intaktes 800 kb Rekombinationsprodukt gefunden, das 32 V_κ enthielt, beginnend bei V_κ-B3 und endend bei V_κ-Op11. Der 800 kb YAC enthält eine Deletion von etwa 100 kb, beginnend bei V_κ-Lp-13 und endend bei V_κ-Lp-5. Jedoch liegt der YAC von V_κ-Lp-13 bis 100 kb nach V_κ-Op-1 in Keimbahnkonfiguration vor. Der YAC enthält außerdem J_κ, die intronischen und 3'-Enhancer, die konstante C_κ und Kde.
YAC-Einbringung in ES-Zellen und Mäuse: YAC-enthaltende Hefe-Spheroplasten wurden mit E14.TG3B1 ES-Zellen wie beschrieben (Jakobovits et al., 1993a; Green et al., 1994) fusioniert. HAT-resistente Kolonien wurden für die Analyse vermehrt. Die Intaktheit des YAC wurde mittels Southern Blot-Analyse unter Verwendung von Protokollen und Sonden, die in Berman et al., (1988) und Mendez et al., (1994) beschrieben sind, sowie Hybridisierungsbedingungen, die in Gemmil et al., (1991) beschrieben sind, bestimmt. Chimäre Mäuse wurden durch Mikroinjektion von ES-Zellen in C57BL/6-Blastozysten erzeugt. YAC-enthaltende Nachkommen wurden mittels PCR-Analyse der Schwanz-DNA wie beschrieben (Green et al., 1994) identifiziert. Die Intaktheit des YAC wurde mittels Southern Blot-Analyse unter Verwendung von Sonden und Bedingungen wie zuvor beschrieben beurteilt, außer dass der mit der humanen V_H3-Sonde behandelte Blot bei 50°C gewaschen wurde.
Durchflusszytometrische Analyse: Lymphozyten des peripheren Blutes und der Milz, die von 8 bis 10 Wochen alten XenoMäusen (XenoMice) und Kontrollmäusen gewonnen wurden, wurden auf Lympholyte M (Accurate) gereinigt und mit gereinigtem anti-Maus CD32/CD16 Fc-Rezeptor (Pharmingen, 01241D) gereinigt, um die nicht-spezifische Bindung an Fc-Rezeptoren zu verhindern, mit Antikörpern gefärbt und mit Hilfe eines FACStar^PLUS (Becton Dickinson, CELLQuest Software) analysiert. Verwendete Antikörper: Allophycocyanin (APC), anti-B220 (Pharmingen, 01129A); Biotin-anti-humanes IgM (Pharmingen, 08072D), Biotin-anti-Maus-IgM (Pharmingen, 02202D), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Ziege-(F(ab')₂-anti-humanes IgD (Southern Biotechnology, 2032-02); FITC-anti-Maus IgD^a (Pharmingen, 05064D); FITC-anti-mIgD^b (Pharmingen, 05074D), FITC-anti-Maus λ (Pharmingen, 02174D); PE-anti-humanes κ (Pharmingen, 08175A); PE-anti-Maus κ (Pharmingen, 02155A). RED613^TM-Streptavidin (GibcoBRL, 19541-010) wurde verwendet, um die biotinylierten Antikörper nachzuweisen.
Immunisierung und Erzeuqung von Hybridomen: XenoMäuse (XenoMice, 8 bis 10 Wochen alt) wurden intraperitoneal mit 25 μg rekombinantem humanem IL-8 oder mit 5 μg TNF-α (Biosource International), emulgiert in vollständigem Freunds Adjuvans für die primäre Immunisierung und in unvollständigen Freunds Adjuvans für die in Zwei-Wochen-Intervallen zusätzlich ausgeführten Immunisierungen, immunisiert. Für die EGFR-Immunisierung wurden XenoMäuse (XenoMice) intraperitoneal mit 2 × 10⁷ A431-Zellen (ATCC CRL-7907), resuspendiert in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), immunisiert. Diese Dosis wurde dreimal wiederholt. Vier Tage vor der Fusion erhielten die Mäuse eine letzte Injektion des Antigens oder der Zellen in PBS. Lymphozyten der Milz und der Lymphknoten aus immunisierten Mäusen wurden mit der nicht-sekretorischen Myelomlinie NSO-bcl2 (Ray und Diamond, 1994) fusioniert und einer HAT-Selektion, wie zuvor beschrieben (Galfre und Milstein, 1981), unterzogen.
ELISA-Assay: ELISA zur Bestimmung der Antigen-spezifischen Antikörper im Serum der Maus und in Überständen der Hybridome wurden wie zuvor beschrieben (Coligan et al., 1994) durchgeführt, unter Verwendung von rekombinantem, humanem IL-8 und TNF-α sowie affinitätsgereinigtem EGFR aus A431-Zellen (Sigma, E-3641), um die Antikörper abzufangen. Die Konzentration der humanen und Maus-Immunglobuline wurde unter Verwendung der folgenden Capture-Antikörper bestimmt: Kaninchen-anti-humaner IgG (Southern Biotechnology, 6145-01), Ziege-anti-humaner Igκ (Vector Laborstories, AI-3060), Maus-anti-humaner IgM (CGI/ATCC, HB-57) für humanes γ-, κ- bzw. μ-Ig, sowie Ziege-anti-Maus-IgG (Caltag, M 30100), Ziege-anti-Maus-Igκ (Southern Biotechnology, 1050-01), Ziege-anti-Maus IgM (Southern Biotechnology, 1020-01) und Ziege-anti-Maus λ (Southern Biotechnology, 1060-01), um Maus γ-, κ-, μ- bzw. λ-Ig zu binden. Die Detektions-Antikörper, die in den ELISA-Experimenten verwendet wurden, waren Ziege-anti-Maus IgG-HRP (Caltag, M-30107), Ziege-anti-Maus Igκ-HRP (Caltag, M 33007), Maus-anti-humaner IgG2-HRP (Southern Biotechnology, 9070-05), Maus-anti-humaner IgM-HRP (Southern Biotechnology, 9020-05) und Ziege-anti-humaner κ-Biotin (Vektor, BA-3060). Die für die Quantifizierung des humanen und Maus-Ig verwendeten Standards waren: humaner IgG₂ (Calbiochem, 400122), humaner IgMκ (Cappel, 13000), humaner IgG₂κ (Calbiochem, 400122), Maus IgGκ (Cappel 55939), Maus IgMκ (Sigma, M-3795) und Maus IgG₃λ (Sigma, M-9019).
Bestimmung der Affinitätskonstanten der vollständig humanen Mabs mittels BIAcore: Die Affinitätsmessung der gereinigten humanen monoklonalen Antikörper, Fab-Fragmente oder Hybridomüberstände durch Plasmonresonanz wurde unter Verwendung des BIAcore 2000-Gerätes durchgeführt, unter Verwendung der von den Herstellern angegebenen allgemeinen Vorgehensweise.
Die kinetische Analyse der Antikörper wurde unter Verwendung von Antigenen durchgeführt, die auf der Sensoroberfläche in geringer Dichte immobilisiert wurden: humanes IL-8-81 RU, löslicher EGFR, gereinigt aus A431-Zellmembranen (Sigma, E-3641)-303 RU und TNF-α-107 RU (1000 RU entsprechen etwa 1 ng/mm² immobilisiertem Protein). Die Dissoziationsraten (kd) und Assoziationsraten (ka) wurden unter Verwendung der von den Herstellern zur Verfügung gestellten Software, BIAevaluation 2.1, bestimmt.
Affinitätsmessung mittels Radioimmunassay: Mit ¹²⁵I-markiertes humanes IL-8 (1,5 × 10^–11 M oder 3 × 10^–11 M) wurde mit gereinigten anti-IL-8 humanen Antikörpern in verschiedenen Konzentrationen (5 × 10¹³ M bis 4 × 10^–9 M) in 200 μl PBS mit 0,5% BSA inkubiert. Nach 15-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 20 μl Protein A Sepharose CL-4B in PBS (1/1, V/V) dazugegeben, um den Antikörper-Antigen-Komplex zu präzipitieren. Nach 2-stündiger Inkubation bei 4°C wurde der an Protein A-Sepharose gebundene Antikörper-¹²⁵I-IL-8-Komplex von freiem ¹²⁵I-IL-8 durch Filtration unter Verwendung von Filtrationsplatten mit 96 Vertiefungen (Millipore, Kat. Nr. MADVN65) getrennt, in Szintillationsgefäßen gesammelt und gezählt. Die Konzentration gebundener und freier Antikörper wurde berechnet, und die Bindungsaffinität der Antikörper an das spezifische Antigen wurde unter Verwendung der Scatchart-Analyse (2) erhalten.
Rezeptor-Bindungsessays: Das IL-8-Rezeptor-Bindungsessay wurde mit humanen Neutrophilen durchgeführt, die entweder aus frisch entnommenem Blut oder aus Buffy-Coats gewonnen wurden, wie beschrieben (Lusti-Marasimhan et al., 1995). Verschiedene Konzentrationen der Antikörper wurden mit 0,23 nM [¹²⁵I]IL-8 (Amersham, IM-249) 30 Minuten bei 4°C in Multiscreen-Filterplatten mit 96 Vertiefungen (Millipore, MADV N6550), die mit PBS-Bindungspuffer, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin und 0,02% NaN₃ vorbehandelt wurden, bei 25°C 2 Stunden inkubiert. 4 × 10⁵ Neutrophile wurden zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 90 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden 5-mal mit 200 μl eiskaltem PBS gewaschen, das mittels Absaugen entfernt wurde. Die Filter wurden luftgetrocknet, zu Szintillationsflüssigkeit gegeben und in einem Szintillationszähler ausgezählt.
Der Prozentsatz des spezifisch gebundenen [¹²⁵I]IL-8 wurde als mittlere cpm berechnet, die in Gegenwart eines Antikörpers nachgewiesen wurde, geteilt durch die cpm, die in Gegenwart von Puffer allein nachgewiesen wurde.
Bindungsassays für den TNF-Rezeptor wurden in ähnlicher Weise wie die oben beschriebenen IL-8-Assays durchgeführt. Jedoch wurde die humane Monozytenlinie U937 anstelle der neutrophilen Linie, die im Zusammenhang mit den IL-8-Assays verwendet wurde, verwendet. Die Antikörper wurden mit 0,25 nM [¹²⁵I]TNF (Amersham, IM-206) präinkubiert. 6 × 10⁵ U937-Zellen wurden in jede Vertiefung gegeben.
Das EGF-Rezeptor-Bindungsassay wurde mit A431-Zellen (0,4 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung) durchgeführt, die mit verschiedenen Konzentrationen der Antikörper in PBS-Bindungspuffer 30 Minuten bei 4°C inkubiert wurden. 0,1 nM [¹²⁵I]EGF (Amersham, IM-196) wurde zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 90 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden 5-mal gewaschen, luftgetrocknet und in einem Szintillationszähler ausgezählt. Die anti-EGFR Maus-Antikörper 225 und 528 (Calbiochem) wurden als Kontrollen verwendet.
Analyse des Repertoires der in XenoMäusen (XenoMice) exprimierten humanen Ig-Transkripte und der davon abgeleiteten humanen Mabs: Poly(A)⁺ mRNA wurde aus Milz und Lymphknoten nicht-immunisierter und immunisierter XenoMäuse (XenoMice) unter Verwendung eines Fast Track Kits (Invitrogen) isoliert. Die Erzeugung von zufällig geprimten cDNAs wurde gefolgt von einer PCR. Für die humane V_H- oder humane V_K-Familie spezifische Primer für die variable Region (Marks et. al., 1991) oder ein universeller humaner V_H-Primer, MG-30 (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) wurden zusammen mit Primern verwendet, die spezifisch für die humanen Cμ (hμP2) oder Cκ (hκP2) konstanten Regionen sind, wie zuvor beschrieben (Green et al., 1994), oder für die humane γ2 konstante Region MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3' verwendet. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung eines TA-Klonierungs-Kits (Invitrogen) in pCRII kloniert, und beide Stränge wurden unter Verwendung eines Prism dye-terminator Sequenzierungskits sowie einer ABI 377-Sequenzierungsmaschine sequenziert. Die Sequenzen der Transkripte für die von humanen Mabs abgeleitete schwere und leichte Kette wurden durch direkte Sequenzierung der PCR-Produkte, die unter Verwendung der oben beschriebenen Primer von der Poly(A⁺)-RNA erzeugt wurden, erhalten. Alle Sequenzen wurden durch Alignments mit dem "V BASE sequence directory" (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) unter Verwendung der Softwareprogramme MacVector und Geneworks analysiert.
Herstellung und Aufreinigung von Antikörper-Fab-Fragmenten: Antikörper-Fab-Fragmente wurden unter Verwendung von immobilisiertem Papain (Pierce) hergestellt. Die Fab-Fragmente wurden mit Hilfe eines zweistufigen Chromatografieschemas aufgereinigt: einer HiTrap (Bio-Rad) Protein A-Säule, um die Fc-Fragmente abzufangen sowie jeglichen unverdauten Antikörper, gefolgt von einer Elution der auf einer starken Kationaustauschsäule (PerSeptive Biosystems) aus dem Durchfluss zurückgehaltenen Fab-Fragmente mit einem linearen Salzgradienten bis 0,5 M NaCl. Die Fab-Fragmente wurden mittels SDS-PAGE und MALDI-TOF MS unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen charakterisiert, wodurch das erwartete ~50 kD nicht reduzierte Fragment und das ~25 kDa reduzierte Doublet nachgewiesen wurde. Dieses Ergebnis weist die intakte leichte Kette und die gespaltene schwere Kette nach. MS unter reduzierenden Bedingungen erlaubte die unzweideutige Identifikation sowohl der leichten als auch der gespaltenen schweren Ketten, da die Masse der leichten Kette durch Reduzieren des kompletten unverdauten Antikörpers präzise bestimmt werden kann.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele, einschließlich der durchgeführten Experimente und der erzielten Ergebnisse, dienen dem Zwecke der Veranschaulichung.
Beispiel 1: Rekonstruktion der Loci der humanen schweren Kette auf YACs
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung war die Strategie, die wir zum Rekonstruieren der Regionen der humanen schweren Kette und der humanen Kappa leichten Kette verwendeten, zunächst humane YAC-Bibliotheken nach YACs zu screenen, welche die großen (Megabasen-großen) humanen Ig-Loci umfassten und zweitens die YACs, welche derartige Regionen umfassten, zu einzelnen YACs zu rekombinieren, die die gewünschten Loci überwiegend in Keimbahnkonfigurationen enthalten.
Das obige, schrittweise YAC-Rekombinationsschema nutzte die hohe Frequenz der meiotisch-induzierten homologen Rekombination in Hefe sowie die Fähigkeit, die gewünschten Rekombinanten durch die auf den Vektorarmen der rekombinierten YACs vorhandenen Hefemarker zu selektieren, aus (siehe 1 und Green et al., siehe oben; siehe auch Silverman et al., 1990 und den Dunnen et al., 1992).
Im Zusammenhang mit unserer Strategie haben wir vier YACs identifiziert, 1H (240 kb), 2H (270 kb), 3H (300 kb) und 4H (340 kb), die sich über etwa 830 kb der etwa 1000 kb der variablen Region der humanen schweren Kette auf Chromosom 14q erstreckten. Die YACs 1H, 2H, 3H und 4H wunden für die Rekonstruktion des Locus verwendet (siehe 1A). Eine Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) und eine Southern Blot-Analyse bestätigten, dass die YACs intakt und in Keimbahnkonfiguration waren, mit Ausnahme von 150 kb an dem 3'-Ende des YAC 2H, das bestimmte Nicht-IgH-Sequenzen enthielt (siehe 1; Matsuda et al., 1990). YAC 1H, der YAC, der zuvor in unsere erste Generation der XenoMouse eingeführt wurde (Green et al., siehe oben, Mendez et al., 1995), ist zusammengesetzt aus den humanen C_δ-, C_μ, J_H- und D_H-Regionen und den ersten 5 V_H-Genen in Keimbahnkonfiguration. Die anderen drei YACs decken den Hauptteil der V_H-Region, von V_H2-5 bis V_H3-65 ab, und steuern folglich etwa 61 zusätzliche verschiedene V_H-Gene bei. Vor der Rekombination wurde der YAC 4H mit einem HPRT selektierbaren Marker ausgestattet. Durch Verwendung der in den YACs enthaltenen überlappenden Sequenzen wurden die vier YACs (1H, 2H, 3H und 4H) durch eine schrittweise Rekombinationsstrategie (siehe 1A) in Hefe rekombiniert. Diese Rekombinationsstrategie erzeugte einen 980 kb rekombinanten YAC (siehe 1). Die Analyse des YAC durch PFGE und Southern Blot-Analyse bestätigte das Vorhandensein des Locus der humanen schweren Kette von der Cδ-Region bis 20 kb 5' des V_H3-65-Gens in Keimbahnkonfiguration. Keine offensichtlichen Deletionen oder Rearrangements wurden beobachtet.
Der YAC-azentrische Arm wurde mit einem Vektor getargeted, der die vollständige humane γ2 konstante Region, den Maus-3'-Enhancer und das Neomycin-Resistenzgen enthielt, um letztlich den 1020 kb schwere Kette-YAC, γH2, zu erzeugen. YAC-γH2 enthielt die Mehrheit der humanen variablen Region, d. h. 66 von 82 V_H-Genen, vollständige D_H (32 Gene) und J_H (6 Gene)-Regionen und drei verschiedene konstante Regionen (Cμ, Cδ und Cγ) mit deren dazugehörigen regulatorischen Sequenzen (siehe 1A). Dieses war das schwere Kette Konstrukt, das für die Herstellung unserer XenoMouse II-Stämme verwendet wurde.
Beispiel 2: Rekonstruktion der Loci der humanen Kappa leichten Kette auf YACs
Eine ähnliche schrittweise Kombinationsstrategie wurde für die Rekonstruktion des Locus der humanen Kappa leichten Kette verwendet. Drei YACs wurden identifiziert, welche die humanen Kappa Loci umfassten. Die YACs wurden 1K, 2K und 3K genannt. YAC 1K, der eine Länge von etwa 180 kb hatte, wurde zuvor in unsere erste Generation der XenoMou se^TM eingebracht. Dieser YAC enthielt das Kappa deletierende Element (Kde), die Kappa S- und intronischen Enhancer, C_κ, J_κ und die drei V_κ-Gene in dem B-Cluster (Green et al., 1994; Mendez et al., 1995). YAC 2K (etwa 480 kb) und 3K (etwa 380 kb) umfassen zusammen den Großteil der Kappa Kette-proximalen variablen Region auf Chromosom 2p. Eine Deletion von etwa 100 kb umfasst die L13-L5-Region (1B; Huber et al., 1993). Weil die Kappa-distale Region die proximale Region dupliziert und da die proximalen V_κ-Gene die üblicherweise am häufigsten verwendeten humanen sind (Weichold et al., 1993; Cox et al., 1994), stand die proximale Region im Fokus unserer Rekonstruktionsstrategie (1B). Durch homologe Rekombination der drei YACS wurde ein 800 kb rekombinanter YAC, γK2, gewonnen. Die Größe und die Intaktheit des rekombinanten YAC wurde mittels PFGE und Southern Blot-Analyse bestätigt. Die Analyse zeigte, das es den proximalen Teil des Locus der humanen Kappa-Kette abdeckte, wobei 32 V_κ-Gene in Keimbahnkonfiguration vorlagen, bis auf die beschriebene Deletion in der Lp-Region (1B). Die zentrischen und azentrischen Arme von γK2 wurden derart modifiziert, dass sie die selektierbaren HPRT- bzw. Neomycin-Marker enthielten, wie beschrieben (Materialien und Methoden). Dieses war das Kappa leichte Kette-Konstrukt, das für die Herstellung unserer XenoMouse II-Stämme verwendet wurde.
Die hierin beschriebenen YACs, γH2 und γK2, stellen die ersten Megabasen-großen rekonstruierten humanen Ig-Loci dar, welche die Mehrheit des humanen Antikörperrepertoires hauptsächlich in Keimbahnkonfiguration enthalten. Diese Errungenschaft bestätigte ferner, dass die homologe Rekombination in Hefe ein leistungsfähiger Ansatz zur erfolgreichen Rekonstruktion großer, komplexer und instabiler Loci ist. Die Selektion stabiler YAC-Rekombinanten, die große Teile des Ig-Loci in Hefe enthielten, stellte uns die humanen Ig-Fragmente zur Verfügung, die benötigt werden, um die Mäuse mit dem humanen Antikörperrepertoire, konstanten Regionen und regulatorischen Elementen auszustatten, die zum Reproduzieren einer humanen Antikörperantwort in Mäusen benötigt werden.
Beispiel 3: Einbringen der γH2 und γK2 YACs in ES-Zellen
In Übereinstimmung mit unserer Strategie haben wir die YACs γH2 und γK2 in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) der Maus eingebracht. Sobald ES-Zellen isoliert werden konnten, die die YAC-DNA enthielten, wurden diese ES-Zellen für die Herstellung von Mäusen durch geeignete Zucht verwendet.
In diesem Experiment wurden daher die YACs γH2 und γK2 durch Fusion von YAC-enthaltenden Hefe-Spheroplasten mit HPRT-defizienten E14.TG3B1 ES-Zellen der Maus, wie zuvor beschrieben, in ES-Zellen eingebracht (Jakobovits et al., 1993a; Green et al., 1994). HPRT-positive ES-Zellklone wurden mit einer Häufigkeit von 1 Klon/15–20 × 10⁶ fusionierten Zellen selektiert und mittels Southern- und CHEF-Blot-Analysen auf einen vollständigen und intakten YAC hin analysiert (2A–2E).
Es wurde festgestellt, dass sieben von fünfunddreißig ES-Zellklonen (bezeichnet als L10, J9.2, L17, L18, J17, L22, L23), die aus der ES-Zellfusion mit γH2-enthaltenden Hefen abgeleitet wurden, sämtliche erwarteten EcoRI- und BamHI γH2-Fragmente enthielten, die mittels Proben detektiert wurden, welche das gesamte Insert umfassen: Maus-3-Enhancer, humaner intronischer Enhancer, humane C_γ2, C_δ und C_μ konstante Regionen, D_H, J_H und sämtliche verschiedenen V_H-Familien: V_H1, V_H2, V_H3, V_H4, V_H5 und V_H6 (Daten für 5 Klone sind in 2A–2E gezeigt). Die CHEF-Analyse bestätigte ferner, dass diese Klone, die 20% sämtlicher analysierten Klone darstellen, den gesamten intakten γH2 YAC ohne offensichtliche Deletionen oder Rearrangements enthalten (Daten nicht gezeigt).
Die aus der Fusion von γK2-enthaltenden Hefen stammenden ES-Zellklone wurden auf ähnliche Weise auf Intaktheit des YAC analysiert, unter Verwendung von Sonden, die spezifisch für das humane Kde, die Kappa 3 und intronischen Enhancer, C_κ, J_H und sämtliche der verschiedenen V_κ-Familien: V_κI, V_κII, V_κIII, V_κIV, V_κVI sind. Zwanzig Klone der sechzig Klone wiesen einen intakten und unveränderten YAC auf, was 30% der gesamten analysierten Klone darstellt (Daten für zwei ES-Klone sind in 3A–3E gezeigt). In γH2- und γK2-ES-Zellklonen wurden unterschiedliche Mengen genomischer Hefesequenzen detektiert (Daten nicht gezeigt).
Diese Ergebnisse stellen den ersten Nachweis für das Einbringen Megabasen-großer Konstrukte in Säugerzellen dar, die rekonstruierte humane Loci, überwiegend in Keimbahnkonfiguration, umfassen. Die relativ hohe Frequenz intakter YACs, die in das Mausgenom integrierten, bestätigte ferner die Methode der ES-Zell-Hefe-Spheroplasten-Fusion als wirksame Herangehensweise zum zuverlässigen Einbringen großer humaner genomischer Fragmente in ES-Zellen.
Beispiel 4: Erzeugen der XenoMouse II-Stämme
Um Mäuse aus den YAC-DNA-enthaltenden ES-Zellen zu erzeugen, wurde eine Mikroinjektion von Blastozysten durchgeführt, gefolgt von einer Aufzucht. Folglich wurden γH2- und γK2-enthaltende ES-Zellklone vermehrt und in Blastozysten der C57BL/6J-Maus mikroinjiziert (Green et al., 1994), und die hergestellten chimären Männchen wurden auf Keimbahn-Transmission überprüft. Nachkommen mit transmittiertem YAC wurden mittels PCR-Analyse identifiziert, und die Intaktheit des YAC wurde mittels Southern Blot-Analyse bestätigt. In sämtlichen analysierten transgenen Mäusen wurde gezeigt, dass das YAC in intakter Form vorlag (2F-2I, 3F-3I). Alle sieben mikroinjizierten γH2-ES-Klone und zwei von acht γK2-ES-Klonen wurden über die Keimbahn der Maus übertragen.
Um Mäuse herzustellen, die humane Antikörper unter Ausschluss von endogenen Antikörpern produzieren, wurden γH2- oder γK2-transgene Mäuse mit doppelt inaktivierten (DI)-Mausstämmen gekreuzt. Die DI-Mausstämme sind homozygot für die über Gentargeting inaktivierten Loci der schweren und Kappa-Kette der Maus, und ihnen fehlt folglich eine Antikörperproduktion (Jakobovits et al., 1993b; Green et al., 1994). Zwei der γH2-transgenen Mausstämme, L10 und J9.2 und einer der γK2-transgenen Mausstämme, J23.1, wurden mit DI-Mäusen gekreuzt, um Mäuse herzustellen, die YACs auf einem homozygot inaktivierten Maus schwere und Kappa Kette-Hintergrund zu erzeugen (γH2;DI und γK2;DI). Jeder der γH2;DI-transgenen Stämme wurde mit dem γK2;DI-transgenen Stamm gekreuzt, um zwei XenoMouse II-Stämme zu erzeugen, 2A-1 (L10; J23.1;DI) bzw. 2A-2 (J9.2; J23.1;DI), die sowohl die YACs mit der schweren Kette als auch mit der leichten Kette auf homozygotem DI-Hintergrund enthielten. L10 ist vollständig homozygot, und J9.2 und J23.1 sind auf dem Weg der erfolgreichen Züchtung zur Homozygotie.
Die Intaktheit der YACs der humanen schweren und Kappa-Kette in den XenoMouse II-Stämmen wurde mittels Southern Blot-Analyse bestätigt. Wie in 2 und 3 gezeigt, wurden γH2 und γK2 in beiden analysierten XenoMouse-Stämmen unverändert über mehrere Generationen ohne offensichtliche Deletionen oder Rearrangements übertragen/transmittiert.
Beispiel 5: B-Zell-Entwicklung und Produktion humaner Antikörper durch XenoMouse II- Mäuse
Um die XenoMouse II-Stämme weiter zu charakterisieren, haben wir ihre B-Zell-Entwicklung und ihre Produktion humaner Antikörper untersucht. Die Rekonstitution der B-Zell-Entwicklung und der Antikörperproduktion in XenoMouse II-Stämmen durch γH2 und γK2 YACs wurde mittels Durchflusszytometrie und ELISA untersucht. Im Gegensatz zu DI-Mäusen, denen reife B-Zellen vollständig fehlen, zeigte die XenoMouse II eine im Wesentlichen normale B-Zell-Entwicklung, wobei die Population reiner B-Zellen im Blut insgesamt mehr als 50% der in Wildtyp-Ratten beobachteten Menge ausmachte (4A–4H). Es wurde gezeigt, dass sämtliche B-Zellen humanes IgM und hohe Konzentrationen an B220 exprimieren (humanes IgM⁺/B220^hi), wobei 60% dieser Population außerdem humanes IgD exprimiert. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Analyse von Milz und Lymphknoten der XenoMouse erhalten (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse stimmen gut mit den Eigenschaften reifer B-Zellen in Wildtyp-Mäusen überein, was auf eine korrekte B-Zell-Reifung in der XenoMouse hinweist.
Die Mehrheit der B-Zellen der XenoMouse (75–80%) exprimierten ausschließlich die humane Kappa (κ) leichte Kette, während nur etwa 15% die Maus-Lambda (λ) leichte Kette exprimierten (4). Dieses Verhältnis der Verteilung der leichten Kette (hκ/mλ: 75 : 15) ist vergleichbar mit dem in Wildtyp-Mäusen beobachteten, was auf eine Maus-ähnliche Regulation bei der Verwendung der leichten Kette hinweist. Dagegen zeigte die XenoMouse I, wie in Green et al., 1994 beschrieben, ein Verhältnis von hκ/mλ von 55:45 (Daten nicht gezeigt). Ähnliche Beobachtungen wurden bei B-Zellen aus der Milz (4I–4T) und aus den Lymphknoten (nicht gezeigt) gemacht, was darauf hinweist, dass die meisten B-Zellen der Xeno-Mouse II ausschließlich vollständig humane Antikörper produzierten. Der Anteil an mλ-exprimierenden B-Zellen wurde in XenoMouse II-Stammen, die homozygot für γK2 sind, von 15% auf 7% reduziert (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 6: Erzeugen des L6-Stamms
Die L6-Mäusestämme wurden identisch zu dem für das oben im Zusammenhang mit der Herstellung der XenoMouse II-Stamme beschriebenen Verfahren hergestellt. Jedoch entwickelte sich infolge eines Deletionsereignisses während der Herstellung der 16 ES-Zelllinie die ES-Zelllinie und anschließend die L6-Maus ohne einen Teil der distal von Cδ liegenden Sequenz, was folglich die Cγ-konstante Region und deren regulatorische Sequenzen eliminierte. Nach Abschluss der Züchtung wird die L6-Maus das vollständige γK2-Konstrukt und das vollständige γH2-Konstrukt enthalten, bis auf die fehlende Cγ-konstante Region.
Beispiel 7: Herstellung humaner Antikörper
Die Expression der humanen Cμ, Cγ2 und κ leichten Ketten wurde in den Seren nicht-immunisierter XenoMouse II mit maximalen Konzentrationen von 700, 600 bzw. 800 μg/ml nachgewiesen. Um festzustellen, wie sich diese Werte im Vergleich zum Wildtyp verhielten, haben wir die maximalen Konzentrationen von Cμ, Cγ2 und κ leichte Ketten in C57BL/6J × 129 Mäusen gemessen, die unter ähnlichen Pathogen-freien Bedingungen gehalten wurden. Die Werte für Cμ, Cγ2 und die κ leichte Kette in Wildtyp-Mäusen betrugen 400, 2000 bzw. 2000 μg/ml. Nach Immunisierung erhöhten sich die Konzentrationen der humanen γ-Kette auf etwa 2,5 mg/ml. Die Konzentration von Maus-γ betrug nur 70 μg/ml, was weiter die bevorzugte Verwendung der humanen κ-Kette bestätigt.
Diese Ergebnisse bestätigten die Fähigkeit der eingebrachten humanen Ig-YACs, ein korrektes Ig-Gen-Rearrangement und einen Klassenwechsel zu induzieren und signifikante Konzentrationen an vollständig humanen IgM- und IgG-Antikörpern vor und nach der Immunisierung zu erzeugen.
Beispiel 8: Repertoire diverser humaner Antikörper in XenoMouse II
Um die Rekonstitution des Antikörperrepertoires in XenoMouse II-Stämmen weiter nachzuvollziehen, haben wir Mäuse in einer Challenge-Infektion mit verschiedenen Antigenen infiziert und Hybridomzelllinien hergestellt, die solche Antikörper sezernieren. Wie verstanden werden wird, erfordert die Rekapitulation der humanen Antikörperantwort in Mäusen die unterschiedliche Verwendung der verschiedenen humanen variablen Gene, die in den γH2-und γK2-YACs enthalten sind. Die Diversität der von XenoMouse II-Stämmen erzeugten humanen Antikörper wurde bestimmt, indem die Transkripte der humanen schweren Kette (μ und γ) und Kappa leichten Kette aus Lymphknoten der XenoMouse kloniert und sequenziert wurden. Auf Grundlage unserer Daten bis heute zeigt die Sequenzanalyse, dass die XenoMouse II wenigstens 11 der 37 auf γH2 vorhandenen funktionellen V_H-Gene verwendet, acht verschiedene D_H-Segmente und drei J_H-Gene (J_H3, J_H4, J_H6) (Tabelle III; J_H5 wurde ebenfalls im Zusammenhang mit unserer Sequenzierung von Antikörpern aus Hybridomen nachgewiesen). V-D-J-Sequenzen waren mit humanen μ- oder γ2-konstanten Regionen verbunden (nicht gezeigt).
Die verwendeten V_H-Gene sind weit verstreut über die gesamte variable Region und repräsentieren vier von sieben V_H-Familien (Tabelle III). Die überwiegende Verwendung von V-Genen der V_H3- und V_H4-Familien ähnelt dem V_H-Verwendungsmuster in erwachsenen Menschen, das proportional zur Größe der Familie ist (Yamada et al. 1991; Brezinshek et al., 1995). Die überwiegende Verwendung von J_H4 erinnert ebenfalls an die in humanen B-Zellen nachgewiesene (Brezinshek et al., 1995). Additionen von Nicht-Keimbahn-Nukleotiden (N-Additionen) sowohl an den V-D- als auch den D-J-Verbindungen im Bereich von 1–12 bp wurden ebenfalls beobachtet. Derartige N-Additionen ergaben Komplementaritäts-bestimmende Regionen 3 (CDR3s) mit Längen von 8 bis etwa 19 Aminosäureresten, die sehr gut vergleichbar sind mit den in adulten humanen B-Zellen beobachteten (Yamada et al. 1991, Brezinshek et al., 1995). Diese in der XenoMouse II beobachteten CDR3-Längen sind viel länger als gewöhnlich in Mäusen beobachtete CDR3-Längen (Feeny, 1990).
Ein höchst diverses Repertoire wurde ferner in den zehn sequenzierten Transkripten der Kappa-Kette festgestellt. Zusätzlich dazu, dass sie 8 von 25 funktionelle offene Leserahmen (ORFs) von Vκ, die in γK2 vorhanden sind, zeigten, waren sämtliche Jκ-Gene nachweisbar (Tabelle IV). Die verschiedenen verwendeten Vκ-Gene waren über γK2 weit verteilt und repräsentierten alle vier Hauptfamilien von Vκ-Genen. Sämtliche VκJκ-Rekombinationsprodukte waren korrekt mit Cκ-Sequenzen verbunden. Der Mangel an N-Additionen in unseren Transkripten steht in Übereinstimmung mit der stark reduzierten Aktivität der terminalen Deoxynukleotidtransferase zum Zeitpunkt des Rearrangement der κ-Kette. Die durchschnittlichen CDR3-Längen von 9 bis 10 Aminosäuren, die in den Transkripten der κ-Kette beobachtet wurden, stimmen mit den in humanen B-Zellen beobachteten überein (Marks et al., 1991).
In den Tabellen III und IV unten sind die Repertoireanalysen der in XenoMouse II-Stämmen exprimierten Transkripte der humanen schweren und κ-leichten Kette gezeigt. Humane μ-, γ- und κ-spezifische mRNAs wurden mittels PCR amplifiziert, kloniert und durch Sequenzierung analysiert, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Tabelle III zeigt eine Reihe von Nukleotidsequenzen von 12 einzelnen humanen Klonen der schweren Kette, unterteilt in V_H-, D-, J_H- und N-Segmente, wie mittels Homologie mit veröffentlichten Keimbahnsequen zen bestimmt wurde (Material und Methoden). Jede D-Segment-Zuordnung basiert auf wenigstens 8 Basen Homologie. Tabelle IV zeigt eine Reihe von Nukleotidsequenzen der V-J-Verknüpfungen von 8 unabhängigen humanen κ-Klonen. Die Sequenzen sind unterteilt in V_κ-, J_κ- und N-Segmente und wurden auf der Grundlage von Homologie mit veröffentlichten V_κ und J_κ-Sequenzen bestimmt. In jeder der Tabellen wurden N-Additionen und -Deletionen (angegeben durch) aufgrund ihrer mangelnden Sequenzhomologie zu V-, D- oder J-Sequenzen bestimmt.
Tabelle IV Analyse des Repertoires der Transkripte der humanen Kappa leichten Kette
Diese Ergebnisse zeigen, zusammen mit den später beschriebenen Sequenzen der von der XenoMouse abgeleiteten Hybridome, eine hoch diverse Verwendung von V-, D- und J-Genen, ähnlich der des erwachsenen Menschen, was ein Nachweis dafür zu sein scheint, dass die auf den γH2- und γK2-YACs vorhandenen vollständigen variablen Regionen der humanen schweren und Kappa Kette dem Maus-System für das Rearrangement zugänglich sind und in unvoreingenommener Weise in Bezug auf die Position verwendet werden. Darüber hinaus ähnelt die durchschnittliche Länge von N-Additionen und CDR3s sowohl für die Transkripte der schweren als auch der Kappa-Kette der in adulten humanen B-Zellen sehr, was darauf hindeutet, dass die in den Mäusen vorhandene YAC-DNA die Mausmaschinerie dazu veranlasst, ein Immunrepertoire ähnlich dem eines erwachsenen Menschen in Mäusen zu produzieren.
Im Zusammenhang mit den folgenden Beispielen haben wir hochaffine Antikörper gegen verschiedene Antigene hergestellt. Insbesondere wurden Antikörper gegen humanes IL-8 und humanes EGFR hergestellt. Die Gründe für die Auswahl von IL-8 und EGFR sind wie folgt.
IL-8 ist ein Mitglied der Familie der C-X-C-Chemokine. IL-8 wirkt als primäres Lockmittel (chemoattractant) für Neutrophile, das an zahlreichen Erkrankungen beteiligt ist, einschließlich ARDS, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmerkrankung, Glomerulonephritis, Psoriasis, Alkohol-Hepatitis, Reperfusionsverletzungen, um einige wenige zu nennen. Darüber hinaus ist IL-8 ein wirksamer angiogener Faktor für Endothelzellen. In den 22–28 zeigen wir, dass aus XenoMouse II-Stämmen stammende humane anti-IL-8-Antikörper wirksam bei der Inhibierung der Wirkungen von IL-8 in zahlreichen Stoffwechselwegen sind. Zum Beispiel zeigt 22 die Blockierung der IL-8-Bindung an humane Neutrophile durch den humanen anti-IL-8. 23 zeigt die Inhibition der CD11b-Expression auf humanen Neutrophilen durch den humanen anti-IL-8. 24 zeigt die Inhibition des von IL-8 induzierten Calcium-Influxes durch humane anti-IL-8-Antikörper. 25 zeigt die Inhibition der IL-8 RB/293-Chemotaxe durch humane anti-IL-8-Antikörper. 26 ist eine schematische Darstellung eines Kaninchenmodells der durch human IL-8 induzierten Hautentzündung. 27 zeigt die Inhibition der durch humanes IL-8 induzierten Hautentzündung in dem Kaninchenmodell aus 26 mit humanen anti-IL-8-Antikörpern. 28 zeigt die Inhibition der Angiogenese von Endothelzellen in dem Kornes-Tasche-Rattenmodell durch humane anti-IL-8-Antikörper.
EGFR wird als Antikrebstarget betrachtet. Zum Beispiel wird EGFR bis zu 100-fach auf verschiedenen Krebszellen überexprimiert. Die Liganden(EGF und TNF)-vermittelte Wachstumsstimulation spielt eine wichtige Rolle bei dem Beginn und dem Fortschreiten bestimmter Tumore. In diesem Zusammenhang inhibieren EGFR-Antikörper die Ligandenbindung und führen zum Stopp des Tumorzellwachstums und induzieren, in Verbindung mit chemotherapeutischen Agenzien, Apoptose. In der Tat wurde nachgewiesen, dass eine Kombination aus EGFR-Mabs zur Tumorbeseitigung in murinen, xenogenen Tumormodellen führte. Imclone hat eine klinische Phase I Studie unter Verwendung eines chimären Mab (C225) durchgeführt, der sich als sicher herausstellte. In den 31–33 zeigen wir Daten im Zusammenhang mit unseren humanen anti-EGFR Antikörpern. 30 zeigt die Aminosäuresequenzen der schweren Kette der von XenoMouse II-Stämmen stammenden humanen anti-EGFR-Antikörper. 31 zeigt die Blockierung der EGF-Bindung an A431-Zellen durch humane anti-EGFR-Antikörper. 32 zeigt die Inhibition der EGF-Bindung an SW948-Zellen durch humane anti-EGFR Antikörper. 33 zeigt, dass von XenoMouse II-Stämmen stammende humane anti-EGFR-Antikörper das Wachstum von SW948-Zellen in vitro inhibieren.
Beispiel 9: Hochaffine, Antigen-spezifische humane Mabs, die von XenoMouse II gebildet wurden
Wir haben als nächstes die Frage gestellt, ob die nachgewiesene Verwendung des großen humanen Repertoires in XenoMouse II nutzbar gemacht werden könnte, um humane Antikörper gegen mehrere Antigene, insbesondere humane Antigene von erheblichem klinischem Interesse, zu erzeugen.
Entsprechend wurden einzelne XenoMouse II-Jungtiere jeweils mit einer Challenge mit einem der drei verschiedenen Antigen-Targets, humanem IL-8, humanem EGFR und humanem TNF-α, immunisiert. Die Antigene wurden in zwei verschiedenen Formen verabreicht, entweder als lösliches Protein, im Falle von IL-8 und TNF-α, oder auf der Oberfläche von Zellen (A431-Zellen) exprimiert, wie im Falle von EGFR. Für alle drei Antigene zeigten die mit den Seren der immunisierten Mäuse durchgeführten ELISA eine starke Antigen-spezifische humane Antikörper (IgG, IgK)-Antwort mit so hohen Titern wie 1,3 × 10⁶. Eine vernachlässigbare Maus-λ-Antwort wurde detektiert.
Hybridome wurden durch Standard-Hybridommethoden von Milz- oder Lymphknoten-Gewebe abgeleitet und mittels ELISA auf die Sezernierung Antigen-spezifischer, humaner Mabs untersucht.
Eine mit IL-8 immunisierte XenoMouse II ergab eine Reihe von 12 Hybridomen, die alle vollständig humane (hIgG₂κ)-Mabs sezernierten, die spezifisch für humanes IL-8 sind. Antikörper von vier dieser Hybridome, D1.1, K2.2, K4.2 und K4.3, wurden aus Aszitesflüssigkeit gereinigt und auf ihre Affinität für humanes IL-8 und ihre Wirksamkeit bei der Blockierung der Bindung von IL-8 an seinen Rezeptor auf Neutrophilen untersucht.
Affinitätsmessungen wurden mittels Feste-Phase-Messungen sowohl des gesamten Antikörpers als auch der Fab-Fragmente unter Verwendung der Oberflächen-Plasmonresonanz in einem BIAcore sowie in Lösung mittels Radioimmunoassay durchgeführt (Material und Methoden). Wie in Tabelle V gezeigt, lagen die für die vier Mabs gemessenen Affinitätswerte im Bereich von 1,1 × 10⁹ bis 4,8 × 10¹⁰ M^–1. Während es einige Abweichungen bei den verwendeten Methoden gab, lagen die Affinitätswerte für alle vier Antikörper konsistent höher als 10⁹ M^–1.
Die ELISA-Analyse bestätigte, dass diese vier Antikörper spezifisch für humanes IL-8 waren und nicht mit den eng verwandten Chemokinen MIP-Iα, GROα, β und γ, E-NA-78, MCP-1 oder RANTES kreuzreagierten (Daten nicht gezeigt). Ferner zeigte die Kompetitionsanalyse auf dem BIAcore, dass die Antikörper wenigstens zwei verschiedene Epitope erkennen (Daten nicht gezeigt). Sämtliche Antikörper inhibieren die IL-8-Bindung an humane Neutrophile genauso wirksam wie der murine anti-humanes IL-8 neutralisierende Antikörper, während ein humaner IgG₂κ-Kontrollantikörper dies nicht tat (5A).
Fusionsexperimente mit EGFR-immunisierter XenoMouse II ergaben eine Reihe von 25 Hybridomen, die alle EGFR-spezifische humane IgG₂κ Mabs sezernierten. Von den dreizehn analysierten humanen Mabs wurden vier (E2.1, E2.4, E2.5, E2.11) aufgrund ihrer Fähigkeit, mit EGFR-spezifischem Maus-Antikörper 225 zu kompetitieren, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er die EGF-vermittelte Zellproliferation und Tumorbildung in Mäusen inhibiert (Sato et al., 1983), ausgewählt. Diese humanen Antikörper, die aus Aszitesflüssigkeit aufgereinigt wurden, wurden auf ihre Affinität für EGFR und die Neutralisierung der EGF-Bindung an Zellen untersucht. Die Affinitäten dieser Antikörper für EGFR, wie sie mittels BIAcore-Messungen bestimmt wurden, lagen im Bereich von 2,9 × 10⁹ bis 2,9 × 10¹⁰ M^–1 (Tabelle V).
Alle vier anti-EGFR-Antikörper blockierten die EGF-Bindung an A431-Zellen vollständig (5B), was ihre Fähigkeit zum Neutralisieren dessen Bindung sowohl an hochaffine als auch niedrigaffine Rezeptoren auf diesen Zellen zeigte (Kawamoto et al., 1983). Eine vollständige Inhibition der EGF-Bindung an auf humanen SW948-Lungenkarzinomzellen exprimierten EGFR durch alle vier anti-EGFR humane Antikörper wurde ebenfalls beobachtet (Daten nicht gezeigt). In beiden Fällen waren die vollständig humanen Antikörper bei der Inhibition der EGF-Bindung genauso wirksam wie der anti-EGFR Maus-Antikörper 225 und wirksamer als der 528-Antikörper (Gill et al., 1983). In beiden Zellassays beeinflusste ein humaner IgG₂κ-Kontrollantikörper die EGF-Bindung nicht (5B und Daten nicht gezeigt).
Fusionsexperimente mit TNF-α-immunisierter XenoMouse II ergab eine Reihe von 12 humanen IgG₂κ-Antikörpern. Vier der 12 wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, die Bindung von TNF-α an dessen Rezeptor auf U937-Zellen zu inhibieren, ausgewählt (5C). Es wurde festgestellt, dass die Affinitäten dieser Antikörper im Bereich von 1,2 bis 3,9 × 10⁹ M^–1 liegen (Tabelle V).
Die beschriebenen, von XenoMouse stammenden Hybridome produzierten Antikörper mit Konzentrationen im Bereich von 2 bis 19 μg/ml unter statischen Kultivierungsbedingungen. Die Charakterisierung der gereinigten Antikörper auf Proteingelen unter nicht-reduzierenden Bedingungen ergab das erwartete scheinbare Molekulargewicht von 150 kD für den IgG₂κ-Antikörper. Unter reduzierenden Bedingungen wurden die erwarteten scheinbaren Molekulargewichte von 50 kD für die schwere und 25 kD für die leichte Kette ermittelt (Daten nicht gezeigt).
Tabelle V unten zeigt die Affinitätskonstanten der von der XenoMouse stammenden

Antigen-spezifischen vollständig humanen Mabs. Die Affinitätskonstanten der von der XenoMouse stammenden humanen IgG₂κ-Mabs, die spezifisch für IL-8, EGFR und TNF-α sind, wurden mittels BIAcore oder mittels Radioimmunassay, wie in Material und Methoden beschrieben, bestimmt. Die für IL-8 und EGFR gezeigten Werte sind repräsentativ für verschiedene Experimente, die mit gereinigten Antikörpern durchgeführt wurden, während die für TNF-α gezeigten Werte aus Experimenten stammen, die mit Hybridom-Überständen durchgeführt wurden. Tabelle V

Humaner Mab IgG₂κ	Antigen	ka(M^–1S^–1)	kd (S^–1)	KA (M^–1)	KD(M)	Oberflächendichte [RU]	Radioimmunassay (M^–1)
		Feste Phase-Messungen					Lösung
D1.1	IL-8	2,7 × 10⁶	9,9 × 10^–4	2,7 × 10⁹	3,7 × 10^–10	81	2,0 × 10^–10
D1.1 Fab	IL-8	2,1 × 10⁶	2,1 × 10^–3	1,1 × 10⁹	8,8 × 10^–10	81	4,9 × 10^–11
K2.2	IL-8	0,9 × 10⁶	2,3 × 10^–4	4,0 × 10⁹	2,5 × 10^–10	81	1,0 × 10¹⁰
K4.2	IL-8	2,5 × 10⁶	4,1 × 10^–4	6,3 × 10⁹	1,6 × 10^–10	81	ND
K4.3	IL-8	4,3 × 10⁶	9,4 × 10^–4	4,5 × 10⁹	2,2 × 10^–10	81	2,1 × 10¹¹
K4.3 Fab	IL-8	6,0 × 10⁶	2,1 × 10^–3	2,9 × 10⁹	3,4 × 10^–10	81
							ELISA (M)
E11	EGFR	1,9 × 10⁶	6,5 × 10^–4	2,9 × 10⁹	3,46 × 10^–10	303	1,1 × 10^–10
E2.5	EGFR	2,1 × 10⁶	1,8 × 10^–4	1,2 × 10¹⁰	8,44 × 10^–11	303	3,6 × 10^–10
E2.11	EGFR	1,7 × 10⁶	4,7 × 10^–4	3,7 × 10⁹	2,68 × 10^–10	303	1,1 × 10^–10
E2.4	EGFR	2,8 × 10⁶	9,78 × 10^–5	2,9 × 10¹⁰	3,5 × 10^–11	818	1,1 × 10^–10

T22.1	TNF-α	1,6 × 10⁶	1,3 × 10^–3	1,2 × 10⁹	8,06 × 10^–10	107
T22.4	TNF-α	2,4 × 10⁶	4,6 × 10^–4	5,3 × 10⁹	1,89 × 10^–10	107
T22.8	TNF-α	1,7 × 10⁶	7,5 × 10^–4	2,3 × 10⁹	4,3 × 10^–10	107
T22.9	TNF-α	2,3 × 10⁶	4,9 × 10^–4	4,8 × 10⁹	2,11 × 10^–10	107
T22.11	TNF-α	2,9 × 10⁶	7,9 × 10^–4	N/A	2,76 × 10^–10	107

Beispiel 10: Genverwendung und somatische Hypermutation in monoklonalen Antikörpern
Die Sequenzen der Transkripte der schweren und Kappa leichten Kette der beschriebenen humanen IL-8- und EGFR-Mabs wurden bestimmt; 6 und [[ ]]. Die vier IL-8-spezifischen Antikörper waren zusammengesetzt aus wenigstens drei verschiedenen V_H-Genen (V_H4-34/V_H4-21, V_H3-30 und V_H5-51), vier verschiedenen D_H-Segmenten (A1/A4, K1, ir3rc und 21-10rc) und zwei J_H-Gensegmenten (J_H3 und J_H4). Drei verschiedene Vκ-Gene (012, 018 und B3) waren mit Jκ3- und Jκ4-Genen verknüpft. Eine derartige diverse Verwendung zeigt, dass die XenoMouse II in der Lage ist, eine Reihe von anti-IL-8 neutralisierenden Antikörpern mit verschiedenen variablen Regionen zu produzieren.
Im Gegensatz zu den IL-8-Antikörper-Transkripten zeigten die Sequenzen der Antikörper, die aufgrund ihrer Fähigkeit zur Kompetition mit Mab 225 ausgewählt wurden, eine relativ beschränkte Verwendung der V_H- und Vκ-Gene, wobei drei Antikörper, E1.1, E2.4 und E2.5, dasselbe V_H-Gen (4-31) teilten und E2.11 V_H4-61 enthielt, der hochgradig homolog zu V_H4-31 ist. Verschiedene D-Segmente (2, A1/A4, XP1) und J_H-Segmente (J_H3, J_H4, J_H5) wurden nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass alle vier Antikörper dasselbe Vκ (018)-Gen teilen. Drei von ihnen enthielten Jκ4 und einer, E2.5, enthielt Jκ2.
Die meisten V_H und Vκ-Hybridom-Transkripte wiesen umfangreiche Nukleotidaustausche (7-19) der entsprechenden Keimbahnsegmente auf, während in den konstanten Regionen keine Mutationen nachgewiesen wurden. Die meisten der Mutationen in V-Segmenten führten zu Aminosäuresubstitutionen in den vorhergesagten Aminosäuresequenzen des Antikörpers (0 bis 12 pro V-Gen), zahlreiche in den CDR1- und CDR2-Regionen (Figur_). Von Interesse sind die Mutationen, die von den Sequenzen der schweren Kette der EGFR-Antikörper geteilt werden, wie z. B. die Gly-Asp-Substitution in CDR1, die allen Antikörpern gemeinsam ist, oder die Ser-Asn-Substitution in CDR2 und die Val-Leu-Substitution in der Gerüstregion (framework region) 3, die von allen drei Antikörpern geteilt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass in der XenoMouse II ein umfangreicher Vorgang der somatischen Hypermutation stattfindet, der zu einer Antikörperreifung und -selektion führt.
Diskussion
Die vorliegende Erfindung beschreibt die erste funktionelle Substitution komplexer, Megabasen-großer Maus-Loci durch humane DNA-Fragmente entsprechender Größe und Inhalt, rekonstruiert auf YACs. Mit Hilfe dieses Ansatzes wurde das humorale Immunsystem der Maus mit Megabasen-großen humanen Ig-Loci "humanisiert", um die humane Antikörperantwort in Mäusen, denen eine endogene Antikörperproduktion fehlt, im Wesentlichen zu reproduzieren.
Unser Erfolg bei der getreuen Rekonstruktion eines großen Teils der Loci der humanen schweren und Kappa leichten Kette, nahezu in Keimbahnkonfiguration, etabliert die YAC-Rekombination in Hefe als leistungsfähige Technologie zur Rekonstruktion großer, komplexer und instabiler Fragmente, wie z. B. den Ig-Loci (Mendez et al., 1995) und zu ihrer Manipulation zwecks Einbringung in Säugerzellen. Darüber hinaus bestätigt das erfolgreiche Einbringen der beiden großen Segmente der schweren und leichten Kette in die Keimbahn der Maus in intakter Form die Methodik der ES-Zell-Hefe-Spheroblasten-Fusion als zuverlässigen und effizienten Ansatz zur Einbringung xenogener Loci in die Keimbahnlinie der Maus.
Die Charakterisierung der XenoMouse II-Stämme hat gezeigt, dass die großen Ig-Loci in der Lage waren, das Antikörpersystem wiederherzustellen, vergleichbar in seiner Diversität und Funktionalität mit dem von Wildtyp-Mäusen und deutlich besser im Vergleich zu der humoralen Antwort, die in Mäusen mit humanen Ig-Minigen-Konstrukten (Lonberg et al., 1994) oder kleinen humanen Ig-YACs (Green et al., 1994) erzeugt wird. Dieser Unterschied äußerte sich in den Konzentrationen reifer B-Zellen, der humanen Ig-Produktion, der Klassenwechsel-Effizienz, der Diversität, dem Vorherrschen der Produktion von humanem Igκ gegenüber murinem Igλ und dem Ausmaß der humanen Antikörperantwort sowie dem Erfolg bei der Bildung hochaffiner, Antigen-spezifischer monoklonaler Antikörper gegen verschiedene Antigene.
Die Konzentrationen reifer B-Zellen und humaner Antikörper in XenoMouse II sind die höchsten bisher für Ig-transgene Mäuse berichteten, und stellen einen mehrfachen Anstieg gegenüber den für frühere Mäuse gezeigten Konzentrationen dar und nähern sich denen von Wildtyp-Mäusen an. Insbesondere waren die Konzentrationen an humanem IgG mehr als 100-fach höher als die für Mäuse mit Minilocus-Ig-Transgenen mit dem humanen γ1-Gen berichteten (Lonberg et al., 1994). Der effizientere Klassenwechsel in XenoMouse II war vermutlich die Folge des Einschlusses der vollständigen Switchregionen, mit sämtlichen ihrer regulatorischen Elemente, ebenso wie der zusätzlichen Kontrollelemente auf γH2, die wichtig sein könnten, um einen korrekten Klassenwechsel zu unterstützen und aufrecht zu erhalten. Die erhöhten Konzentrationen an reifen B-Zellen in XenoMouse II-Stämmen ergeben sich vermutlich aus der höheren Rearrangement-Frequenz und folglich verbesserten B-Zell-Entwicklung im Knochenmark aufgrund des erhöhten V-Gen-Repertoires. Es wird erwartet, dass die B-Zell-Rekonstitution in XenoMouse II-Stämmen, die homozygot für den Locus der humanen schweren Kette sind, noch ausgeprägter ist.
Das Verhältnis der Expression von humaner κ zu Maus γ leichter Kette durch zirkulierende B-Zellen stellt ein nützliches internes Maß für die Verwendung des transgenen κ-Ketten-Locus dar. Während in Mäusen, die ein Allel der kleineren Ig-YACs enthalten, eine etwa gleiche Verteilung von humanem κ und Maus λ beobachtet wurde, wurde in XenoMouse II-Stämmen ein signifikantes Vorherrschen von humanem κ nachgewiesen. Darüber hinaus besaßen Tiere, die homozygot für γK2 sind, ein κ:λ-Verhältnis, das identisch mit Wildtyp-Mäusen ist. Diese Beobachtungen, zusammen mit der breiten Vκ-Gen-Verwendung, deuten stark darauf hin, dass die humanen proximalen Vκ-Gene in der XenoMouse II ausreichen, um eine diverse leichte Kette-Antwort zu unterstützen und stehen in Übereinstimmung mit der in Menschen beobachteten Verzerrung zugunsten einer Verwendung der proximalen Vκ-Gene (Cox et al., 1994).
XenoMouse II-Stämme zeigten eine stark erhöhte Antikörperdiversität bei den V-, D- und J-Genen über den gesamten Bereich der Loci, die durch Rekombinationsmechanismen angesteuert und in reife Antikörper eingebaut wurden. Sobald diese durch Antigen-Bindung ausgelöst wird, findet eine umfangreiche somatische Hypermutation statt, die zur Affinitätsreifung der Antikörper führt.
Das Verwendungsmuster von V-, D-, J-Genen in der XenoMouse II zeigte ferner, dass diese zur Verfügung stehen und in einer Weise verwendet werden, die an ihre Verwendung in Menschen erinnert, was zu einem humanen Antikörper-Repertoire ähnlich dem eines Erwachsenen führt, das sich von der in Mäusen mit dem Ig-Minigen beobachteten Positions-verzerrten, Fötus-ähnlichen Verwendung unterscheidet (Taylor et al., 1992, Taylor et al., 1994, Tuaillon et al., 1993). Die breite Verwendung vieler der funktionellen V_H- und Vκ-Gene zusammen mit der Vielzahl der von den Mäusen erkannten Antigene unterstreicht die Bedeutung des großen V-Gen-Repertoires für die erfolgreiche Rekonstitution einer funktionellen Antikörperantwort.
Der ultimative Test für das Ausmaß der Rekonstitution der humanen Immunantwort in Mäusen ist das Spektrum an Antigenen, gegen welche die Mäuse eine Antikörperantwort auslösen werden und die Leichtigkeit, mit der Antigen-spezifische hochaffine Mabs gegen verschiedene Antigene erzeugt werden können. Anders als bei Mäusen, die durch kleinere humane Ig-YACs oder Minigene manipuliert sind, die bis zum heu tigen Tag nur eine beschränkte Anzahl Antigen-spezifischer humaner Mabs hervorbrachten (Lonberg et al., 1994; Green et al., 1994; Fishwild et al., 1996), erzeugte die XenoMouse II Mabs gegen sämtliche bisher getesteten humanen Antigene. Die XenoMouse II-Stamme entwickelten eine starke humane Antikörperantwort gegen verschiedene humane Antigene, die entweder als lösliche Proteine oder exprimiert auf der Oberfläche von Zellen präsentiert wurden. Die Immunisierung mit jedem der drei getesteten humanen Antigene ergab eine Reihe von 10 bis 25 Antigen-spezifischen humanen IgG₂κ Mabs. Für jedes Antigen wurde ein Satz Antikörper mit Affinitäten im Bereich von 10⁹ bis 10¹⁰ M^–1 erhalten. Mehrere Maßnahmen wurden ergriffen, um zu bestätigen, dass die Affinitätswerte univalente Bindungskinetiken und nicht die Avidität repräsentieren: BIAcore-Assays mit intakten Antikörpern wurden unter Verwendung von Sensorchips durchgeführt, die mit einer geringen Antigendichte beschichtet sind, um die Wahrscheinlichkeit der bivalenten Bindung zu minimieren; für zwei Antikörper wurde der Assay mit monovalenten Fab-Fragmenten wiederholt; einige der Antikörper wurden außerdem mittels Radioimmunassay in Lösung getestet. Aus den Ergebnissen dieser Messungen schließen wir, dass mit der XenoMouse Antikörper mit Affinitäten im Bereich von 10¹⁰ M^–1 leicht erreichbar sind. Die für die von der XenoMouse stammenden Antikörper erhaltenen Affinitätswerte sind die höchsten für humane Antikörper gegen humane Antigene berichteten, die entweder von genmanipulierten Mäusen (Lonberg et al., Fishwild et al., 1996) oder aus einer kombinatorischen Bibliothek (Vaughan et al., 1996) produziert wurden. Diese hohen Affinitäten, zusammen mit den umfangreichen Aminosäuresubstitutionen als Ergebnis der somatischen Mutation in den V-Genen, bestätigen, dass der Mechanismus der Affinitätsreifung in XenoMouse II intakt ist und mit der in Wildtyp-Mäusen vergleichbar ist.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das große Antikörper-Repertoire auf den humanen Ig-YACs von der Maus-Maschinerie für die Antikörper-Diversifizierung und -Selektion in geeigneter Weise ausgeschöpft wird und aufgrund des Fehlens einer immunologischen Toleranz gegen humane Proteine zu hochaffinen Antikörpern gegen ein jegliches Antigen von Interesse, einschließlich humaner Antigene, führen kann. Die Leichtigkeit, mit der Antikörper gegen humane Antigene durch die humanen Immunglobulingene in diesen Mäusen erzeugt werden können, liefert eine weitere Bestätigung, dass die Selbsttoleranz auf B-Zell-Ebene erworben und nicht vererbt ist.
Die Fähigkeit, hochaffine vollständig humane Antikörper gegen Antigene zu erzeugen, hat offensichtliche praktische Folgen. Es wird erwartet, dass vollständig humane Antikörper die immunogenen und allergischen Reaktionen, die den Maus-Mabs oder Maus-derivatisierten Mabs inhärent sind, minimieren und folglich die Wirksamkeit und Sicherheit der verabreichten Antikörper erhöhen. Die XenoMouse II bietet die Möglichkeit, einen wesentlichen Vorteil bei der Behandlung chronischer und wieder auftretender Erkrankungen bereitzustellen, wie z. B. Entzündung, Autoimmunität und Krebs, die eine wiederholte Antikörperverabreichung erfordern. Die Schnelligkeit und Reproduzierbarkeit, mit der XenoMouse II eine Reihe vollständig humaner hochaffiner Antikörper hervorbringt, zeigt den möglichen Fortschritt, den sie gegenüber anderen Methoden zur Herstellung humaner Antikörper bietet. Zum Beispiel sind die Antikörper der XenoMouse II im Gegensatz zum Phagendisplay, das intensive Bemühungen zum Verstärken der Affinität vieler daraus stammender Antikörper erfordert und Einzelketten Fvs oder Fabs hervorbringt, hochaffine vollständig intakte Immunglobuline, die ohne weitere Manipulation aus Hybridomen hergestellt werden können.
Die hier für die Erzeugung eines authentischen humanen humoralen Immunsystems in Mäusen beschriebene Strategie kann zur Humanisierung weiterer Multigen-Loci angewendet werden, wie z. B. dem T-Zell-Rezeptor und dem Haupt-Histokompatibilitätskomplex, die andere Kompartimente des Immunsystems der Maus steuern (Jakobovits, 1994). Derartige Mäuse wären nützlich zur Aufklärung der Struktur-Funktions-Beziehungen der humanen Loci und deren Beteiligung an der Evolution des Immunsystems.
Referenzen:

Abertsen et al., "Constiuction and characterization of a yeast artificial chromosome library containing seven haploid human genome equivalents. "Proc. Natl. Acad. Sci. 87,.4256 (1990).
Anand et al., "Construction of yeast artificial chromosome libraries with large inserts using fractionation by pulsed-field gel electrophoresis." Nucl. Acids Res. 17: 3425–3433 (1989).
Berman et al. "Content and organization of the human Ig VH locus: definition of three new V_H families and linkage to the Ig C_H locus." EMBO J. 7: 727–738 (1988).
Brezinschek et al., "Analysis of the heavy chain repertoire of human peripheral B-cells using single-cell polymerase chain reaction.' J. Immunol. 155: 190–202 (1995).
Brownstein et al, "Isolation of single-copy human genes from a library of yeast artificial chromosome clones" Science 244: 1348–1351 (1989).
Bruggemann et al. PNAS USA 86: 6709–6713 (1989).
Bruggemann et al, "Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus " Eur. J. Immunol. 21: 1323–1326 (1991).
Bruggeman, M. and Neuberger, M. S. in Methods: A compamon to Methods in Enzymology 2: 159–165 (Lerner et al., eds. Academic Press (1991)).
Bruggemann, M. and Neuberger, M. S. "Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice." Immunology Today 17 391–397 (1996.)
Chen et al. "Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the J_H locus" International Immunology 5: 647–656 (1993).
Choi et al. "Transgenic mice containing a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artificial chromosome" Nature Genetics 4: 117–123 (1993).
Coligan et al., Unit 2.1, "Enzyme-linked immunosorbent assays," in Current protocols in immunology (1994).
Cook, G. P. and Tomlinson, I. M., "The human immunoglobulin V_H repertoire." Immunology Today 16: 237–242 (1995).
Cox et al., "A directory of human germ-line Vx segments reveals a strong bias in their usage." Eur. J. Immunol. 24: 827–836 (1994).
Dariavach et al., "The mouse IgH 3'-enhancer." Eur. J. Immunol. 21: 1499–1504 (1991).
Den Dunnen et al., "Reconstruction of the 2.4 Mb human DMD-gene by homologous YAC recombination." Human MolecularGenetics 1: 19–28 (1992).
Feeney, A. J. "Lack of N regions in fetal and neonatal mouse immunoglobulin V-D-J junctional sequences." J. Exp. Med. 172. 137–1390 (1990).
Fishwild et al., "High-avidity human IgGK monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice." Nature Biotech. 14: 845–851 (1996).
Flanagan, J. G. and Rabbitts, T. H., "Arrangement of human immunoglobulin heavy chain constant region genes implies evolutionary duplication of a segment containing γ, ε and α genes." Nature 300: 709–713 (1982).
Galfre, G. and Milstein, C., "Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures." Methods Enzymol. 73. 3–46 (1981).
Gemmill et al., "Protocols for pulsed field gel electrophoresis: Separation and detection of large DNA molecules." Advances in Genome Biology 1: 217–251 (1991).
Gill et al., "Monoclonal anti-epidermal growth factor receptor antibodies which are inhibitors of epidermal growth factor binding and antagonists of epidermal growth factorstimulated tyrosine protein kinase activity." 1 Biol. Chem. 259: 7755 (1984).
Green et al., "Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs." Nature Genetics 7: 13–21 (1994).
Hermanson et al., "Rescue of end fragments of yeast artificial chromosomes by homologous recombination in yeast" Nucleic Acids Res. 19: 4943–4948 (1991).
Huber et al., "The human immunoglobulin κ locus. Characterization of the partially duplicated L regions" Eur. J. Immunol 23: 2860–2967 (1993).
Jakobovits, A., "Humanizing the mouse genome." Current Biology 4: 761–763 (1994).
Jakobovits, A., "Production of fully human antibodies by transgenic mice" Current Opinion in Biotechnology 6: 561–566 (1995).
Jakobovits et al., "Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial-chromosome." Nature 362: 255–258 (1993).
Jakobovits, A. et al., "Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks B-cell development and antibody production" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551–2555 (1993).
Kawamoto et al., "Growth Stimulation of A431 cells by epidermal growth factor: Identification of high affinity receptors for EGF by an anti-receptor monoclonal antibody." Proc. Nat. Acad. Sei., USA 80: 1337–1341 (1983).
Lonberg et al., "Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications." Nature 368: 856–859 (1994).
Lusti-Marasimhan et al., "Mutation of Leu25 and Val27 introduces CC chemokine activity into interleukin-8." J. Biol. Chem. 270: 2716–2721 (1995).
Marks et al., "Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes" Eur. J. Immunol. 21: 985–991 (1991).
Matsuda et al., "Structure and physical map of 64 variable segments in the 3' 0.8-megabase region of the human immunoglobulin heavy-chain locus." Nature Genetics 3: 88–94 (1993).
Max, E. Molecular genetics of immunoglobulins. Fundamental Immunology. 315–382 (Paul, WE, ed., New York: Raven Press (1993)).
Mendez et al., "A set of YAC targeting vectors for the interconversion of centric and acentric arms." Cold Spring Harbor Laboratory Press. Genome Mapping and Sequencing meeting, 163 (1993).
Mendez et al., "Analysis of the structural integrity of YACs comprising human immunoglobulin genes in yeast and in embryonic stem cells." Genomics 26: 294–307 (1995).
Ray, S. and Diamond, B., "Generation of a fusion partner to sample the repertoire of Splenic B-cells destined for apoptosis." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5548–5551 (1994).
Sato et al., "Biological effects in vitro of monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors" Mol. Biol. Med. 1: 511–529 (1983).
Schiestl, R. H. and Gietz, R. D., "High efficiency transformation of intact yeast cells using stranded nucleic acids as a carrier." Curr: Genet. 16: 339–346 (1989).
Sherman et al., "Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics." (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1986)).
Silverman et al., "Meiotic recombination between yeast artificial chromosomes yields a single clone containing the entire BCL2 protooncogene" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9 913–9917 (19_).
Srivastava, A. and Schlessinger, D., "Vectors for inserting selectable markers in vector arms and human DNA inserts of yeast artificial chromosomes (YACs)" Gene 103: 53–59 (1991).
Taylor et al., "A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins" Nucleic Acids Research 20: 6287–6295 (1992).
Taylor et al., "Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM." International Immunology 6: 579–591 (1994).
Tuaillon et al., "Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in μ and γ transcripts." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720–3724 (1993).
Tuaiilon et al. "Analysis of direct and inverted DJ_H rearrangements in a human Ig heavy chain transgenic minilocus" J. Immunol. 154: 6453–6465 (1995).
Vaughan et al., "Human antibodies with subnanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library." Nature Biotech. 14: 309–314 (1996).
Wagner et al., "The diversity of antigen-specific monoclonal antibodies from transgenic mice bearing human immunoglobulin gene miniloci." Eur. J. Immunol. 24: 2672–2681 (1994).
Weichhold et al., "The human immunoglobulin κ locus consists of two copies that are organized in opposite polarity." Genomics 16: 503–511 (1993).
Yamada, M. et al., "Preferential utilization of specific immunoglobulin heavy chain diversity and "joining segments in adult human peripheral blood B lymphocytes." J. Exp. Med. 173: 395–407 (1991).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein isolierter vollständig humaner Antikörper, der an den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (epidermal growth factor receptor, EGFR) bindet und die Verbindung von EGF an EGFR inhibiert, worin die schwere Kette durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die ein humanes V_H 4-61 Gen verwendet.
Der Antikörper gemäß Anspruch 1, worin die leichte Kette durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die ein humanes V_K 018 Gen verwendet.
Der Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Aminosäuresequenz der schweren Kette eine oder mehre Mutationen an einer oder mehreren Positionen umfasst, die in der Aminosäuresequenz von V_H 4-61 mutiert sind, die in 30 angegeben ist.
Der Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–3, worin die Aminosäuresequenz der schweren Kette eine oder mehrere Aminosäuresequenzen umfasst, die in 30 angegeben sind.
Der Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Aminosäuresequenz der leichten Kette eine oder mehre Mutationen an einer oder mehreren Positionen umfasst, die in den Aminosäuresequenzen der 6 mutiert sind.
Der Antikörper gemäß Anspruch 5, worin die Aminosäuresequenz der leichten Kette eine der Aminosäuresequenzen umfasst, die in 6 angegeben sind.
Ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen vollständig humanen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–6 kodiert.
Eine Wirtszelle, die das Nukelinsäuremolekül gemäß Anspruch 7 umfasst.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 8, worin die Wirtszelle eine Hybridomzelle oder eine Mauszelle ist.
Ein Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1–6, das den Schritt des Kultivierens einer Wirtszelle umfasst, die eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 7 umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die Wirtszelle eine Hybridomzelle ist.
Verwendung des Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1–6 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs.
Verwendung des Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1–6 zur Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren des Wachstums von Tumorzellen.
Die Verwendung gemäß Anspruch 12 oder 13, worin das Medikament die EGF-vermittelte Wachstumsstimulation von Krebszellen inhibiert.
Ein Verfahren zum Inhibieren des EGF-vermittelten Wachstums oder Tumorwachstums, das den Schritt des Inkontaktbringens der Zelle oder des Tumors mit einem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–6 in vitro umfasst.
Ein Verfahren zum Inhibieren der Bindung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) an den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), das den Schritt des Inkontaktbringens des EGFR mit einem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–6 in vitro umfasst, worin der Antikörper in der Lage ist, die Bindung von EGF an EGFR zu inhibieren.