JP5764290B2 - ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体およびその使用法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容物が全ての目的に関して参照により本明細書に組み入れられる、2006年6月26日に提出された米国特許仮出願第60/816,688号の恩典を主張する。
1．発明の分野
本発明は、FcγRIIB、特にヒトFcγRIIBに、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIAに結合するより大きな親和性で特異的に結合する、抗体またはその断片に関する。本発明はまた、癌、好ましくはB細胞悪性疾患、特にB細胞慢性リンパ性白血病または非ホジキンリンパ腫、自己免疫障害、炎症性障害、IgE媒介アレルギー障害、または一つもしくは複数のその症状の処置、予防、管理、または改善のための単剤治療として、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合断片を用いることを包含する。本発明はまた、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合断片を他の癌治療と併用して用いることも包含する。本発明は、B細胞悪性疾患などの癌、自己免疫障害、炎症性障害、IgE媒介アレルギー障害、または一つもしくは複数のその症状を予防、処置、管理、または改善するために有効な量の抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、治療抗体のエフェクター機能を増強するために本発明の抗体を投与することによって治療抗体の治療効果を増強する方法を提供する。本発明はまた、本発明の抗体をワクチン組成物と共に投与することによって、ワクチン組成物の効能を増強する方法も提供する。
2．発明の背景
2.1 Fc受容体と免疫系におけるその役割
抗体-抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用によって、抗体依存的細胞媒介性細胞障害性、肥満細胞の脱顆粒、および貪食などのエフェクター機能から、リンパ球増殖および抗体分泌の調節などの免疫調節シグナルに及ぶ、幅広い反応が起こる。これらの相互作用は全て、造血細胞上の特殊な細胞表面受容体と抗体または免疫複合体のFcドメインとの結合を通して開始される。抗体または免疫複合体によって誘発される細胞反応の多様性は、Fc受容体の構造的不均一性に起因する。Fc受容体は、おそらく細胞内シグナル伝達を媒介する、構造的に関連するリガンド結合ドメインを共有する。
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリータンパク質のメンバーであるFc受容体は、免疫グロブリン分子のFc部分に結合することができる表面糖タンパク質である。このファミリーのそれぞれのメンバーは、Fc受容体の鎖上の認識ドメインを通して一つまたは複数のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Fc受容体は、免疫グロブリンサブタイプに関するその特異性によって規定される。IgGに関するFc受容体は、FcγRと呼ばれ、IgEに関するFc受容体はFcεRと呼ばれ、IgAに関するFc受容体はFcαRと呼ばれる。異なるアクセサリー細胞が異なるアイソタイプの抗体に関するFc受容体を有し、抗体のアイソタイプは、どのアクセサリー細胞が所定の反応に関係するかを決定する（Ravetch J.V. et al. 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92；Gerber J.S. et al. 2001 Microbes and Infection, 3: 131-139；Billadeau D.D. et al. 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-1681；Ravetch J.V. et al. 2000, Science, 290: 84-89；Ravetch J.V. et al., 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90；Ravetch J.V. 1994, Cell, 78(4): 553-60による概説）。種々のFc受容体、それらを発現する細胞、およびそのアイソタイプ特異性を表1に要約する（Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New Yorkから改作）。
Fcγ受容体
このファミリーのそれぞれのメンバーは、C2セットの免疫グロブリン関連ドメインに関連する細胞外ドメイン、一つの膜通過ドメイン、および様々な長さの細胞質内ドメインを保有する内在性膜糖タンパク質である。FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）と呼ばれる三つの公知のFcγRが存在する。三つの受容体は、異なる遺伝子によってコードされる；しかし、三つのファミリーメンバーのあいだの広範囲の相同性は、それらがおそらく遺伝子複製によって共通の前駆体から生じたことを示唆している。本発明は、FcγRII（CD32）に特に焦点を当てる。
FcγRII（CD32）
FcγRIIタンパク質は、単量体Igに対する親和性が低い（106 M-1）ために複合体を形成しているIgGのみに結合する40 kDaの内在性膜糖タンパク質である。この受容体は、単球、マクロファージ、B細胞、NK細胞、好中球、肥満細胞、および血小板が含まれる全ての造血細胞上に存在する、最も広く発現しているFcγRである。FcγRIIはその免疫グロブリン結合鎖において免疫グロブリン様領域を二つしか有さず、したがって、FcγRIよりIgGに対する親和性がかなり低い。三つのヒトFcγRII遺伝子（FcγRII-A、FcγRII-B、FcγRII-C）が存在し、その全てが凝集体または免疫複合体においてIgGに結合する。
FcγRII-A（CD32A）およびFcγRII-B（CD32B）の細胞質ドメイン内での明確な差により、受容体のライゲーションに対する二つの機能的に異質な反応が作製される。根本的な差は、Aイソ型が貪食および呼吸バーストなどの細胞活性化に至る細胞内シグナル伝達を開始するのに対し、Bイソ型は阻害シグナル、たとえばB細胞活性化の阻害を開始する点である。
FcγRを通してのシグナル伝達
活性化シグナルおよび阻害シグナルはいずれも、ライゲーション後のFcγRを通して伝達される。これらの正反対に対立する機能は、異なる受容体イソ型における構造の差に起因する。免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ITAM）または免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ITIM）と呼ばれる細胞質シグナル伝達ドメイン内の二つの異なるドメインが、異なる反応の原因となる。異なる細胞質酵素のこれらの構造へのリクルートメントは、FcγR媒介細胞反応の転帰を指図する。ITAM-含有FcγR複合体には、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIAが含まれるが、ITIM含有複合体には、FcγRIIBのみが含まれる。
ヒト好中球は、FcγRIIA遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的抗体のクロスリンクによるFcγRIIAクラスタ形成は、ITAMリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと共にITAMを凝集させるために役立つ。ITAMリン酸化は、Sykキナーゼの結合部位として役立ち、その活性化によって、下流の基質（たとえば、PI3K）の活性化が起こる。細胞の活性化によって、炎症誘発メディエータの放出が起こる。
FcγRIIB遺伝子は、Bリンパ球において発現し、その細胞外ドメインは、FcγRIIAと96％同一であって、区別できない様式でIgG複合体に結合する。FcγRIIBの細胞質ドメインにおけるITIMの存在は、FcγRのこの阻害性サブクラスを規定する。最近、この阻害の分子的基礎が確立された。活性化FcγRと結合すると、FcγRIIBにおけるITIMは、リン酸化されてイノシトールポリホスフェート5'-ホスファターゼ（SHIP）のSH2ドメインを誘引して、ITAM含有FcγR媒介チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解して、その結果、細胞内へのCa++の流入を防止する。このように、FcγRIIBのクロスリンクは、FcγRライゲーションに対する活性化反応を低下させて、細胞の応答性を阻害する。このように、B細胞活性化、B細胞増殖、および抗体分泌が頓挫する。
（表１）免疫グロブリンアイソタイプのFc領域の受容体
Figure 0005764290
2.2 関連疾患
2.2.1 癌
新生物または腫瘍は、良性または悪性でありうる、異常な制御されない細胞成長に起因する新生物塊である。良性腫瘍は一般的に局所に留まっている。悪性腫瘍は集合的に癌と呼ばれる。「悪性」という用語は、一般的に腫瘍が浸潤して隣接する体構造を破壊し、遠隔部位に広がって死を引き起こしうることを意味する（概説に関しては、Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122を参照されたい）。癌は、体の多くの部位に発生して、その起源に応じて異なる挙動を示しうる。癌様細胞は、それが起源とする体の部分を破壊した後、体の他の部分に広がって、そこで新たな成長を開始してより多くの破壊を引き起こす。
120万人を超えるアメリカ人が毎年癌を発症する。癌は、米国における死因の第二位であり、現在の傾向が持続すれば、癌は2010年までに死因の第一位になると予想される。肺癌および前立腺癌が米国における男性の癌による死因の第一位である。肺癌および乳癌が米国における女性の癌による死因の第一位である。米国における男性2人に1人が人生の何らかの時点で癌と診断されると考えられる。米国における女性の3人に1人が、人生の何らかの時点で癌と診断されると考えられる。癌の解決法はなお見いだされていない。手術、化学療法、および放射線処置などといった現在の処置の選択肢は、しばしば無効であるか、重篤な副作用を示す。
2.2.1.1 B細胞悪性疾患
B細胞リンパ腫および白血病が含まれるがこれらに限定されるわけではないB細胞悪性疾患は、米国において有意な発生率を有する新生物疾患である。およそ55,000例の新規のリンパ腫症例が米国において毎年存在し（1998年データ）、推定で毎年25,000人が死亡している。これは癌発生率の4％を表し、米国人集団における全ての癌関連死の4％を表す。リンパ様新生物に関する改訂欧州-米国分類（1994 REAL分類、1999年改変）は、リンパ腫をその起源に基づいて、B細胞系列のリンパ腫、T細胞系列のリンパ腫、またはホジキンリンパ腫のいずれかとして分類した。B細胞系列のリンパ腫は、米国において診断される非ホジキンリンパ腫（NHL）の最も一般的な型である（Williams, Hematology 6th ed. (Beutler et al. Ed.), McGraw Hill 2001）。慢性リンパ球性白血病（CLL）は、血液、骨髄、およびリンパ様組織において小型の成熟したように見えるリンパ球の蓄積を特徴とする新生物疾患である。CLLは、米国において100,000人あたり2.7人の発生率を有する。リスクは、特に男性では年齢と共に漸進的に増加する。これは全ての癌の0.8％を占め、成人における最も一般的な白血病であり、全ての白血病の30％の原因となる。ほぼ全ての症例（＞98％）において、疾患細胞は、Bリンパ球系列に属する。非白血病変種である小リンパ球性リンパ腫は、全てのリンパ腫の5〜10％を構成し、B-CLLを有する患者における罹患リンパ節と区別できない組織学的、形態学的、および免疫学的特色を有する（Williams, 2001）。
慢性リンパ球性白血病の自然経過は、いくつかの相に分類される。初期相では、慢性リンパ球性白血病は、長い寿命を有する小型で成熟した、機能的に無能力の悪性B細胞の蓄積を特徴とする不活性な疾患である。最終的に、悪性B細胞の細胞倍加時間は減少し、患者は次第に症候性となる。化学療法剤による処置により症状の軽減をもたらすことができるが、患者の全体的な生存は、ごくわずか延長されるに過ぎない。慢性リンパ球性白血病の末期は、有意な貧血および／または血小板減少症を特徴とする。この時点で、生存期間の中央値は2年未満である（Foon et al., 1990, Annals Int. Medicine 113:525）。細胞増殖速度が非常に低いことから、慢性リンパ球性白血病は、化学療法剤による処置に対して抵抗性である。
最近、遺伝子発現研究により、リンパ増殖障害においてアップレギュレートされる可能性があるいくつかの遺伝子が同定されている。B細胞慢性リンパ球性白血病（B-CLL）を有する患者、および非ホジキンリンパ腫患者の大きな画分において過剰発現すると考えられる一つの分子は、CD32Bである（Alizadeh et al., 2000, Nature 403:503-511；Rosenwald et al., 2001, J. Exp. Med. 184:1639-1647）。しかし、一つの報告が、CD32BがB-CLL細胞の低い割合において低密度で発現することを報告していることから（Damle et al., 2002, Blood 99:4087-4093）、B-CLLにおけるCD32Bの役割は不明である。CD32BはB細胞系列の表面抗原であり、B細胞新生物におけるその過剰発現によって、CD32Bは治療抗体にとって適した標的となる。さらに、CD32Bはそのライゲーションが陰性シグナルを送達する阻害受容体の範疇に属する。したがって、CD32Bに対する抗体は、補体依存的細胞障害性（CDC）、抗体依存的細胞媒介性細胞障害性（ADCC）が含まれるが、同様にアポトーシスシグナルを誘発するメカニズムによって腫瘍細胞を排除するように機能しうると考えられる。このように、CD32Bとその対応物である活性化Fcγ受容体CD32Aとの高い相同性は、これまで分子の1つの型を選択的に認識するが、他の型を認識しない抗体の産生を妨害してきた。
2.2.1.2 癌治療
現在、癌治療は、患者における新生物細胞を撲滅するために、手術、化学療法、ホルモン療法、および／または放射線処置を伴う可能性がある（たとえば、Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", in Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Chapter 12, Section IVを参照されたい）。最近、癌治療はまた、生物療法または免疫療法を伴いうる。これらのアプローチは全て、患者にとって有意な欠点を提起する。たとえば、手術は、患者の健康により禁忌となる可能性があり、または患者に許容されない可能性がある。さらに、手術は新生物組織を完全に除去しない可能性がある。放射線療法は、新生物組織が正常組織より放射線に対して高い感度を示す場合に限って有効であり、放射線療法はまたしばしば重篤な副作用を誘発しうる。ホルモン療法は、まれに単剤として投与され、有効となりうるが、しばしば他の治療によって癌細胞の大部分が除去された後に癌の再発を予防または遅らせるために用いられる。生物療法／免疫療法は、数が限られ、発疹もしくは腫脹、発熱、悪寒、および倦怠感が含まれる風邪様症状、消化管障害、またはアレルギー反応などの副作用を生じる可能性がある。
化学療法に関して、癌の処置のために利用可能な多様な化学療法剤がある。癌化学療法の有意な大多数は、DNA複製および付随する細胞分裂を防止するために、デオキシリボヌクレオチド三リン酸前駆体の生合成を阻害することによって、DNA合成を直接または間接的に阻害することによって作用する（たとえば、Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Ed. (Pergamom Press, New York, 1990)を参照されたい）。ニトロソウレアなどのアルキル化剤、メソトレキセートおよびヒドロキシウレアなどの抗代謝剤、およびエトポシド、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン等などの他の物質が含まれるこれらの物質は、必ずしも細胞周期特異的ではないが、DNA複製に及ぼすその効果のゆえにS期のあいだに細胞を殺す。他の物質、特にコルヒチンならびにビンブラスチンおよびビンクリスチンなどのビンカアルカロイドは、微小管重合を妨害して、それによって分裂の停止に至る。化学療法プロトコールは一般的に、処置の有効性を増加させるために化学療法剤の併用投与を伴う。
多様な化学療法剤を利用できるにもかかわらず、化学療法は多くの欠点を有する（たとえば、Stockdale, 1998, "Principles Of Cancer Patient Management" in Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., ch. 12, sect. 10を参照されたい）。ほぼ全ての化学療法剤が毒性であり、化学療法は、重度の悪心、骨髄抑制、免疫抑制等が含まれる有意な、そしてしばしば危険な副作用を引き起こす。さらに、化学療法剤の併用を投与しても、多くの腫瘍細胞は、化学療法剤に対して耐性であるか、または耐性を生じる。実際、処置プロトコールにおいて用いられる特定の化学療法剤に対して耐性の細胞は、しばしば他の薬物に対して、特異的処置において用いられる薬物の作用機序とは異なる機構で作用する物質に対しても、耐性であることが証明されており；この現象は、多面発現薬（pleiotropic drug）耐性または多剤耐性と呼ばれる。このように、薬物耐性のために、多くの癌は、標準的な化学療法処置プロトコールに対して不応性であることがわかる。
B細胞悪性疾患は、一般的に単剤化学療法、併用化学療法、および／または放射線療法によって処置される。これらの処置は、有意な副作用を引き起こすにもかかわらず、罹患率を低減させ、かつ／または生存率を改善させることができる。様々な型の処置に対するB細胞悪性疾患の反応は雑多である。たとえば、非ホジキンリンパ腫の適切な臨床的進行期分類が可能である場合、照射野放射線療法（field radiation therapy）は満足できる処置を提供することができる。しかし、一定の患者は反応することができず、処置に対する耐性を伴う疾患の再発がいずれ起こり、特に最も攻撃的な疾患の変種が起こる。患者の約半数が疾患のために死亡する（Devesa et al., 1987, J. Nat'l Cancer Inst. 79:701）。
難治性B細胞新生物の処置のための治験的療法には、自己由来および同種異系の骨髄または幹細胞の移植および遺伝子療法が含まれる。最近、B細胞特異抗原を標的とするモノクローナル抗体を用いる免疫療法がB細胞新生物の処置に導入されている。放射性核種、毒素、または他の治療物質を導くためにモノクローナル抗体を用いることは、そのような物質が腫瘍部位に選択的に送達され、それにより正常組織に対する毒性を制限しうる可能性を提供する。
特に手術、放射線療法、化学療法、およびホルモン療法などの標準的な癌の処置に対して不応性であることが証明された癌の処置のために、癌の代替的な処置に対する重大な必要性が存在する。有望な代替療法は、癌細胞が癌抗原特異的抗体によって特異的に標的とされる免疫療法である。免疫応答の特異性を活用することに主要な努力が向けられており、特にハイブリドーマ技術によって、腫瘍選択的モノクローナル抗体の開発が可能となり（Green M. C. et al., 2000 Cancer Treat Rev., 26: 269- 286；Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26(suppl. 14):43-51を参照されたい）、過去数年のあいだに、米国食品医薬品局は、癌治療のための最初のMAb：非ホジキンリンパ腫のためのリツキシン（Rituxin）（抗CD20）、B細胞慢性リンパ球性白血病（B-CLL）のためのCampath（抗CD52）、および転移性乳癌のためのHerceptin[抗(c-erb-2/HER-2)]（Suzanne A. Eccles, 2001, Breast Cancer Res., 3: 86-90）を承認した。NHLおよびB-CLLは最も一般的な型のB細胞新生物の二つである。これらの抗体は臨床での有効性が証明されているが、その使用は副作用を有しないわけではない。抗体エフェクター機能の抗力、たとえば抗体依存的細胞媒介性細胞障害性（「ADCC」）を媒介する抗力は、そのような処置に対する障壁である。さらに、RituxanおよびCampathでは、少なくとも半数の患者が反応せず、反応者の画分もその後の処置に対して不応性となる可能性がある。
癌、特にB細胞悪性疾患のために、特に標準的な癌の処置およびRituxanなどの新しい免疫療法に対して不応性である患者のために、代替療法が必要である。
2.2.2 炎症性疾患および自己免疫疾患
炎症は、体の白血球および化学物質が、細菌およびウイルスなどの外来物質による感染症から我々の体を保護するプロセスである。これは通常、罹患領域の疼痛、腫脹、熱感、および発赤を特徴とする。サイトカインおよびプロスタグランジンとして知られる化学物質がこのプロセスを制御し、それらは、秩序だった自己制御されたカスケードにおいて血液または罹患組織に放出される。この化学物質の放出は、損傷または感染領域に対する血流を増加させて、その結果発赤および熱感が起こる可能性がある。化学物質のいくつかは組織への体液の漏出を引き起こし、それによって腫脹が起こる。この保護的プロセスは神経を刺激して疼痛を引き起こす可能性がある。これらの変化は、関連する領域において限定された期間起こる場合、体の利益となるように作用する。
自己免疫および／または炎症性障害では、免疫系は、闘うべき外来物質が存在しない時に炎症反応を誘発し、体の正常な保護免疫系が自己を誤って攻撃することによって自身の組織に対する損傷を引き起こす。異なる形で体に影響を及ぼす多くの異なる自己免疫障害が存在する。たとえば、多発性硬化症を有する個体においては脳で発症しており、クローン病を有する個体においては腸管で発症しており、関節リウマチの個体においては様々な関節の滑膜、骨、および軟骨で発症している。自己免疫障害は一つまたは複数のタイプの体組織の破壊を進行させることから、臓器の異常な成長、または臓器機能の変化が起こる可能性がある。自己免疫障害は、一つのみの臓器もしくは組織タイプに罹患する可能性があり、または多数の臓器および組織に罹患する可能性がある。自己免疫障害に一般的に罹患する臓器および組織には、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺（たとえば、甲状腺または膵臓）、筋肉、関節、および皮膚が含まれる。自己免疫障害の例には、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、1型糖尿病、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、自己免疫性内耳疾患、重症筋無力症、ライター症候群、グレーヴス病、自己免疫性肝炎、家族性線腫性ポリポーシス、および潰瘍性大腸炎が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
関節リウマチ（RA）および若年性関節リウマチは、炎症性関節炎のタイプである。関節炎は、関節における炎症を記述する一般的用語である。全てではないがいくつかのタイプの関節炎は誤った炎症の結果である。関節リウマチのほかに、炎症に関連する他のタイプの関節炎には以下が含まれる：乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎関節炎、および痛風性関節炎。関節リウマチは、体の両側の関節（両手、腰、または膝など）に起こるタイプの慢性関節炎である。この対称性は、関節リウマチを他のタイプの関節炎と区別するために役立つ。関節での発症のほかに、関節リウマチは時に、皮膚、眼、肺、心臓、血液、または神経に発症する可能性がある。
世界の人口の約1％が関節リウマチに罹患し、肢体不自由となる可能性がある。米国において関節リウマチは290万人に発生している。男性より2〜3倍多くの女性が罹患している。関節リウマチが起こる典型的な年齢は25〜50歳のあいだである。若年のアメリカ人（年齢18歳およびそれ未満）71,000人が若年性関節リウマチに罹患しており、少女では少年より6倍多く罹患している。
関節リウマチは、体の免疫系が関節において潤滑液を分泌する滑膜を異物であると不適切に同定する自己免疫障害である。炎症の結果、関節内およびその周囲の軟骨および組織が損傷を受けるか、または破壊される。重度の症例では、この炎症は、他の関節組織および周辺の軟骨に及び、そこで骨および軟骨を侵食または破壊して、関節の変形に至る可能性がある。体は、損傷した組織を瘢痕組織に置換し、それにより関節内の正常な空間は狭くなり骨が癒合する。関節リウマチは、硬直、腫脹、倦怠感、貧血、体重減少、発熱、およびしばしば肢体不自由となる疼痛を引き起こす。関節リウマチのいくつかの共通の症状には、1時間またはそれより長く持続する起床時の関節の硬直；特定の指または手首関節の腫脹；関節周辺の軟組織の腫脹；および関節の両側の腫脹が含まれる。腫脹は疼痛と共に、または疼痛を伴わずに起こりえて、進行性に悪化しうるか、または何年も同じ状態を保った後に進行しうる。
関節リウマチの診断は、以下が含まれる要因の組み合わせに基づく：特定の位置および対称性（symmetry）で関節に痛みが伴うこと、朝に関節の硬直が存在すること、皮膚の下に瘤および結節が存在すること（リウマチ小結節）、関節リウマチを示唆するX線検査結果、および／またはリウマチ因子と呼ばれる血液検査の陽性結果。全てではないが、関節リウマチを有する多くの人々は、その血液中にリウマチ因子抗体を有する。リウマチ因子は関節リウマチを有しない人々に存在する可能性がある。他の疾患も同様に、血液中にリウマチ因子の産生を引き起こしうる。関節リウマチの診断がいくつかの要因の組み合わせに基づき、単に血液中のリウマチ因子の存在に基づくのではない理由はこのためである。
疾患の典型的な経過は、持続的なしかし変動する関節症状の経過と、約10年後に、罹患者の90％が骨および軟骨に対して構造的損傷を示すことである。完全に寛解する短期間の疾患を有する人の割合は小さく、多数の関節変形および時に他の疾患の発現を伴う非常に重度の疾患を有する人の割合も小さい。炎症プロセスは関節における骨および軟骨の侵食または破壊を引き起こす。関節リウマチでは、持続的な抗原提示、T細胞刺激、サイトカイン分泌、滑膜細胞の活性化、および関節破壊という自己免疫サイクルが存在する。疾患は、個体および社会の双方に対して主要な影響を及ぼし、有意な疼痛、機能障害、および肢体不自由を引き起こし、かつ医療費の出費および賃金の損失において何百万ドルもの費用がかかる（たとえば、NIHのウェブサイトおよびNIAIDウェブサイトを参照されたい）。
現在利用できる関節炎の治療は、抗炎症、または免疫抑制剤の投薬による関節の炎症を低減することに重点が置かれている。任意の関節炎を処置する第一選択薬は、通常、アスピリン、イブプロフェン、ならびにセレコキシブおよびロフェコキシブなどのCox-2阻害剤などの抗炎症薬である。「第二選択薬」には、金製剤、メソトレキセート、およびステロイドが含まれる。これらは関節炎の十分に確立された処置法であるが、これらの系列の処置単独によって軽減される患者はごく少数である。関節リウマチの病因の理解における最近の進歩によって、サイトカインまたは組換え可溶性受容体に対する抗体と併用してメソトレキセートが用いられるようになった。たとえば、腫瘍壊死因子（TNF）-αの組換え可溶性受容体は、関節炎の処置においてメソトレキセートと併用して用いられている。しかし、臨床的に有意な改善を示すのは、メソトレキセートとTNF-αに対する組換え可溶性受容体などの抗TNF-α剤の併用によって処置した患者の約50％に過ぎない。多くの患者が処置にもかかわらず不応性のままである。難しい処置の問題はなおも、関節リウマチ患者に関して残っている。現在の処置の多くは、高い発生率の副作用を有するか、または疾患の進行を完全に予防することができない。これまでのところ、いかなる処置も完全ではなく、解決法はない。関節リウマチおよび他の自己免疫障害をより有効に処置する新規の治療法が必要である。
2.2.3 アレルギー
免疫媒介アレルギー（過敏）反応は、アレルギー症状の発現に至る基礎となる機構に従って四つのタイプ（I〜IV）に分類される。I型アレルギー反応は、肥満細胞および好塩基球からの、ヒスタミンなどの血管作用性の物質のIgE媒介放出を特徴とする。これらの物質の放出およびその後のアレルギー症状の発現は、肥満細胞および好塩基球上のその受容体に対するアレルゲン結合IgEのクロスリンクによって開始される。I型アレルギー反応を発症した個体では、アレルゲンに対する二回目の曝露によって、IgE産生にとって必要な3-細胞相互作用におけるメモリーBおよびT細胞の関与の結果として、アレルゲンに対して特異的なIgE抗体の高レベルで産生される。産生された高レベルのIgE抗体は、アレルゲン結合IgEによる肥満細胞および好塩基球上のIgE受容体のクロスリンクの増加を引き起こし、次にこれはこれらの細胞の活性化およびI型アレルギー疾患の臨床発現の原因である薬理学的メディエータの放出に至る。
IgEに対して異なる親和性を有する二つの受容体が同定され、特徴付けされている。高親和性の受容体（FcεRI）は、肥満細胞および好塩基球の表面において発現する。低親和性受容体（FcεRII/CD23）は、B細胞、T細胞、マクロファージ、好酸球、およびランゲルハンス細胞が含まれる多くの細胞タイプにおいて発現する。高親和性IgE受容体は、三つのサブユニット（α、β、およびγ鎖）からなる。いくつかの試験から、α鎖のみがIgEの結合に関係おり、一方βおよびγ鎖（膜貫通または細胞質タンパク質のいずれかである）はシグナル伝達事象にとって必要であることが証明されている。肥満細胞および好塩基球における、FcεRIにIgEが結合するために必要なIgE構造の同定は、IgE媒介アレルギーの処置または予防のための戦略を考案するために最も重要である。たとえば、IgE受容体結合部位が解明されれば、受容体を有する細胞に対するIgEの結合をインビボで遮断するペプチドまたは低分子を同定することができるであろう。
現在、IgE媒介アレルギー反応は、肥満細胞および好塩基球から放出された血管作用物質の効果を中和することによって、アレルギー反応に関連する症状を緩和しようとする抗ヒスタミン剤およびコルチコステロイドなどの薬物によって処置される。高用量の抗ヒスタミン剤およびコルチコステロイドは有害な副作用を有する（たとえば、中枢神経障害、便秘等）。このように、I型アレルギー反応を処置する他の方法が必要である。
I型アレルギー障害を処置するための一つのアプローチは、血清中の可溶性の（遊離の）IgEと反応し、IgEが肥満細胞および好塩基球上のその受容体と結合することを遮断し、かつ受容体結合IgEに結合しない（すなわち、それらは非アナフィラキシー誘発性である）、モノクローナル抗体の産生である。そのような二つのモノクローナル抗体が、IgE媒介アレルギー反応の処置のための臨床開発の進行段階にある（たとえば、Chang, T.W., 2000, Nature Biotechnology 18:157-62を参照されたい）。
IgE媒介アレルギー反応に関する最も有望な処置の一つは、内因性のIgE上の適当な非アナフィラキシー誘発性のエピトープに対する能動的免疫である。Stanworth et al.（米国特許第5,601,821号）は、異種担体タンパク質にカップリングさせたヒトIgEのCεH4ドメインに由来するペプチドをアレルギーワクチンとして用いることを伴う戦略を記述した。しかし、このペプチドは、ネイティブな可溶性IgEと反応する抗体の産生を誘導しないことが示されている。さらに、Hellman（米国特許第5,653,980号）は、完全長のCεH2-CεH3ドメイン（長さアミノ酸およそ220個）と外来担体タンパク質との融合に基づく抗IgEワクチン組成物を提示した。しかし、Hellmanにおいて提示された抗IgEワクチン組成物によって誘発された抗体は、IgE分子のCεH2およびCεH3ドメインのいくつかの部分に対する抗体が、肥満細胞および好塩基球の表面上のIgE受容体とクロスリンクして、アナフィラキシーのメディエータの産生に至ることが示されていることから、アナフィラキシーが起こる可能性が最も高いであろう（たとえば、Stadler et al., 1993, Int. Arch. Allergy and Immunology 102: 121-126を参照されたい）。したがって、アナフィラキシー抗体を誘導しないIgE媒介アレルギー反応の処置がなおも必要である。
アナフィラキシーの誘導に対する重大な懸念によって、動物に投与した場合に抗IgEポリクローナル抗体の産生を誘導するミモトープからなる、I型アレルギー障害の処置に対するもう一つのアプローチが開発された（たとえば、Rudolf, et al., 1998, Journal of Immunology 160:3315-3321を参照されたい）。Kricek et al.（国際公開番号WO 97/31948）は、IgE受容体結合のコンフォメーションを模倣することができるであろうペプチドミモトープを同定するために、モノクローナル抗体BSWI7によってファージディスプレイペプチドライブラリをスクリーニングした。これらのミモトープは、遊離したネイティブなIgEと反応するが受容体結合IgEとは反応しないポリクローナル抗体を誘導するため、およびその受容体に対する結合からIgEを遮断するために、おそらく用いられるであろう。Kriek et al.は、IgE分子のいかなる部分とも相同ではなく、このように本発明において開示されるペプチドとは異なるペプチドミモトープを開示した。
当技術分野の調査によって証明されるように、癌、自己免疫疾患、炎症性障害、またはアレルギーなどの障害を処置または予防する現在の方法の治療効能を増強することが必要である。特に、エフェクター機能、特に癌の処置において用いられる治療抗体の細胞障害効果を増強することが必要である。当技術分野の現状はまた、（たとえば、抗体療法またはワクチン療法のいずれかによる）アレルギー障害の処置または予防が不足している。
3．発明の概要
FcγRIIAおよびFcγRIIBの細胞外ドメインは95％同一であり、したがってそれらは多数のエピトープを共有する。しかし、FcγRIIAおよびFcγRIIBは、非常に異なる活性を示す。根本的な違いは、FcγRIIAが貪食および呼吸バーストなどの細胞活性化に至る細胞内シグナル伝達を開始するのに対し、FcγRIIBは、阻害性シグナル伝達を開始する点である。そのそれぞれの活性および免疫応答の調節における役割を考慮すると、ネイティブなFcγRIIBを認識するがネイティブなFcγRIIAを認識しない抗体が必要である。本発明は、部分的にそのようなFcγRIIB特異的抗体の発見に基づく。
本発明は、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIA、より詳しくはネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、FcγRIIB、特にヒトFcγRIIB、より詳しくはネイティブなヒトFcγRIIBに特異的に結合する、単離抗体またはその断片に関する。好ましくは、本発明の抗体は、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに結合する。本発明の一定の態様において、抗体またはその断片は、FcγRIIAに結合するより少なくとも2倍大きな親和性で、FcγRIIBに結合する。本発明の他の態様において、抗体またはその断片は、FcγRIIAに結合するより少なくとも4倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍、少なくとも106倍、少なくとも107倍、または少なくとも108倍大きな親和性で、FcγRIIBに結合する。好ましい態様において、抗体またはその断片は、FcγRIIAに結合するより100倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍、または108倍大きな親和性で、FcγRIIBに結合する。好ましくはこれらの結合親和性は、凝集体IgGではなくて、単量体IgGについて決定され、結合は、可変ドメインを通して起こる（たとえば、抗体のFab断片は完全な免疫グロブリン分子と類似の結合特徴を有する）。
一つの態様において、本発明に従うFcγRIIB特異的抗体は、Pulford et al., 1986（Immunology, 57:71-76）において開示されるKB61と呼ばれるモノクローナル抗体ではなく、またはWeinrich et al., 1996,（Hybridoma, 15(2): 109-6）において開示されるMAbII8D2と呼ばれるモノクローナル抗体でもない。特定の態様において、本発明のFcγRIIB特異的抗体は、モノクローナル抗体KB61もしくはモノクローナル抗体MAbII8D2と同じエピトープに結合せず、かつ／またはモノクローナル抗体KB61もしくはモノクローナル抗体MAbII8D2と結合に関して競合しない。好ましくは、本発明のFcγRIIB特異的抗体は、FcγRIIb2イソ型のアミノ酸135〜141位に対応するアミノ酸配列Ser-Asp-Pro-Asn-Phe-Ser-Ileに結合しない。
本発明は、特異性を評価するために当技術分野において公知の任意の標準的な方法によって決定した場合に、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する、単離抗体またはその断片に関する。本発明は、たとえばウェスタンブロット、BIAcore、またはラジオイムノアッセイによって決定した場合に、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する、単離抗体またはその断片に関する。本発明は、ELISAアッセイにおいてFcγRIIB結合の直線範囲（linear range）内で決定した場合に、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する、単離抗体またはその断片に関する。本発明の一つの態様において、本発明は、ELISAアッセイにおいて決定した場合に、FcγRIIAに結合するより大きな親和性で、哺乳動物系において産生されたFcγRIIBに特異的に結合する、単離抗体またはその断片に関する。
特定の態様において、本発明は、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する単離抗体またはその断片に関し、該抗体の定常ドメインはさらに、少なくとも一つまたは複数のFc活性化受容体に対して増強された親和性を有する。なおもう一つの特定の態様において、Fc活性化受容体はFcγRIIIである。
本発明の一つの態様において、抗体またはその断片は、FcγRIIBのIgG結合部位を遮断して、たとえばブロッキングELISAアッセイにおいてFcγRIIBに対する凝集した標識IgGの結合を遮断する。一つの特定の態様において、抗体またはその断片は、ELISAブロッキングアッセイにおいて凝集した標識IgGの結合を少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、または99.9％遮断する。なおもう一つの特定の態様において、抗体またはその断片は、ELISAアッセイにおいて凝集した標識IgGの結合を完全に遮断する。
本発明のもう一つの態様において、抗体またはその断片は、二重染色FACSアッセイによって決定した場合に、FcγRIIBのIgG結合部位を遮断して、FcγrIIBに対する凝集した標識IgGの結合を遮断する。
本発明は、FcγRIIBの活性を調節する（すなわち、アゴニストとして作用する、または拮抗する）抗体を用いることを包含する。本発明の一つの態様において、本発明の抗体は、FcγRIIBの少なくとも一つの活性にアゴニストとして作用する、すなわちシグナル伝達を誘発する。いかなる作用機序にも拘束されることを意図しないが、本発明のアゴニスト抗体は、FcγRIIBのクラスタ形成を模倣して、それによってFcγRライゲーションに対する活性化反応を低下させ、かつ細胞反応性を阻害する可能性がある。
本発明のもう一つの態様において、本発明の抗体は、FcγRIIBの少なくとも一つの活性に拮抗する、すなわちシグナル伝達を遮断する。たとえば、本発明の抗体は、FcγRIIBに対する凝集IgGの結合を遮断する。
本発明は、FcεRI誘発肥満細胞活性化を阻害する抗体を提供する。本発明はさらに、単球細胞におけるFcγRIIA媒介マクロファージ活性化を阻害する抗FcγRIIB抗体を提供する。本発明はまた、B細胞受容体媒介シグナル伝達を阻害する抗FcγRIIB抗体を提供する。
一つの特定の態様において、抗FcγRIIB抗体は、FcγRIIBのリガンド結合部位を遮断する。さらに特定の態様において、遮断活性は、免疫複合体誘発活性化の負の調節を遮断して、その後免疫応答を増強することができる。さらに特定の態様において、増強された免疫応答は、抗体依存的細胞反応の増加である。もう一つの特定の態様において、本発明の抗FcγRIIB抗体は、B細胞および／またはFc受容体に対するFcγRIIB受容体のクロスリンクを遮断して、それによってB細胞、肥満細胞、樹状細胞、またはマクロファージの活性化に至る。
本発明は、本発明の抗体またはその断片を産生するための、特にFcγRIIAと比較してFcγRIIBに対してより高い特異性を有する新規のモノクローナル抗体（「MAb」）を産生するための方法を包含する。本発明の抗体またはその断片は、抗体を産生するために当技術分野において公知の任意の方法によって、特に、培養ハイブリドーマ細胞からの分泌、化学合成、または当技術分野において公知の組換え発現技術によって産生されうる。一つの特定の態様において、本発明は、以下の段階を含む、FcγRIIB特異的抗体を組換えによって産生するための方法に関する：（i）異種プロモーターに機能的に連結した第一の核酸分子と、同じまたは異なる異種プロモーターに機能的に連結した第二の核酸とを含有する宿主細胞を、培地において抗体の発現にとって適した条件で培養する段階であって、第一の核酸および第二の核酸が、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片の重鎖および軽鎖をそれぞれコードする、段階；ならびに（ii）培地から抗体を回収する段階。もう一つの態様において、本発明は、以下の段階を含む、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIB、特にヒトFcγRIIBに特異的に結合するFcγRIIBモノクローナル抗体を産生するための方法を提供する：（a）1匹または複数のFcγRIIAトランスジェニックマウスを精製FcγRIIBまたはその免疫原性断片によって免疫する段階；（b）該1匹または複数のマウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞株を産生する段階；（c）FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体を産生する一つまたは複数のハイブリドーマ細胞株に関して、該ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする段階。本発明は、方法によって産生された任意の抗体を包含する。一つの特定の態様において、本発明は、以下の段階を含む、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIB、特にヒトFcγRIIBに特異的に結合するFcγRIIBモノクローナル抗体を産生する方法を提供する：（a）1匹または複数のFcγRIIAトランスジェニックマウスを精製FcγRIIBまたはその免疫原性断片によって免疫する段階；（b）免疫応答を誘発するために十分な期間、マウスを追加免疫する段階；（c）1匹または複数のマウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞株を産生する段階；（d）FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体を産生する一つまたは複数のハイブリドーマ細胞株に関して、該ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする段階。好ましい態様において、マウスは4ヶ月間のあいだ少なくとも4回追加免疫される。本発明の一つの態様において、マウスは、マウスにおける免疫応答を増強するために、当技術分野において公知のアジュバントと共に混合されている精製FcγRIIBによって免疫される。本発明の一つの特定の態様において、免疫原性断片は、FcγRIIBの可溶性細胞外ドメインである。ハイブリドーマ細胞株は、当技術分野において公知の標準的な技術（たとえば、ELISA）を用いてスクリーニングすることができる。
本発明の一定の態様において、抗FcγRIIB抗体は、モノクローナル抗体、合成抗体、組換えによって産生された抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Fvs（scFv）、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド連結Fvs（sdFv）、細胞内抗体、または上記の任意のエピトープ結合断片である。
好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、より好ましくはヒト化またはヒト抗体である。一つの特定の好ましい態様において、本発明の抗体は、ヒトFcγRIIB、特にネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに結合する。もう一つの特定の態様において、本発明の抗体は、FcγRIIB、特にネイティブなヒトFcγRIIBの一つまたは複数のエピトープを特異的または選択的に認識する。本発明のもう一つの態様は、FcγRIIBに関する本発明の抗体の親和性を増加させるためにファージディスプレイ技術を用いることを包含する。当技術分野において公知の任意のスクリーニング技術（たとえば、ELISA）を用いて、FcγRIIBに関するアビディティが増加した変異体抗体を同定することができる。もう一つの特定の態様において、本発明の抗体は、3×10-3 s-1未満のKoff率を有する抗体を同定するために、当技術分野において周知の抗体スクリーニングアッセイ（たとえば、BIACOREアッセイ）を用いてスクリーニングされる。
好ましい態様において、本発明は、ATCCアクセッション番号PTA-7610を有するハイブリドーマクローン8B5.3.4によって産生されたモノクローナル抗体、またはそのキメラ、ヒト化、もしくは他の操作型を提供する。もう一つの態様において、本発明は、ATCCアクセッション番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA- 5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、および1F2によって産生されるモノクローナル抗体、またはそのキメラ、ヒト化、もしくは他の操作型を提供する。もう一つの態様において、本発明は、クローン8B5.3.4によって産生されたモノクローナル抗体と結合に関して競合し、FcγRIIA、好ましくはネイティブなFcγRIIAに結合するより大きな親和性で、FcγRIIB、好ましくはネイティブなヒトFcγRIIBに結合し、かつ／またはクローン8B5.3.4によって産生されたモノクローナル抗体と同じFcγRIIBのエピトープに結合し、かつFcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに結合する、単離抗体またはその断片を提供する。さらに、本発明は、ATCCアクセッション番号PTA-7610、PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有する、ハイブリドーマ細胞株8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2を提供する。一つの特定の態様において、本発明は、B細胞悪性疾患、またはその一つもしくは複数の症状を予防、処置、管理、または改善するために、8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、もしくは1F2抗体またはそのキメラ、ヒト化、もしくは他の操作型を用いることを提供する。一つの特定の態様において、操作型はFc領域において一つまたは複数の変異を含む。Fc領域における一つまたは複数の変異によって、抗体媒介性エフェクター機能が変化した、他のFc受容体（たとえば、Fc活性化受容体）に対する結合が変化した、ADCC活性が変化した、C1q結合活性が変化した、補体依存的細胞障害活性が変化した、またはその任意の組み合わせである抗体が得られる可能性がある。好ましい態様において、ヒト化8B5.3.4抗体は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインとSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む。もう一つの好ましい態様において、ヒト化8B5.3.4抗体の重鎖のFcドメインは、240、243、247、255、270、292、300、316、370、392、396、416、419、または421位でその位置でのもう一つのアミノ酸への少なくとも一つのアミノ酸置換を含むように操作されている。より好ましい態様において、ヒト化8B5.3.4抗体の重鎖のFcドメインは、247位でロイシン、421位でリジン、および270位でグルタミン酸を有し；392位でトレオニン、396位でロイシン、および270位でグルタミン酸を有し；または270位でグルタミン酸、316位でアスパラギン酸、おび416位でグリシンを有する。本発明の一定の態様において、抗体は、ハイブリドーマクローン8B5.3.4によって産生されたモノクローナル抗体、またはそのキメラ、ヒト化、もしくは他の操作型ではない。
本発明の一定の態様において、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含むヒト化8B5.3.4抗体が提供され、ヒト化8B5.3.4抗体の重鎖のFcドメインは、247位でロイシン、421位でリジン、および270位でグルタミン酸を有し；または270位でグルタミン酸、316位でアスパラギン酸、および416位でグリシンを有する。
本発明はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを包含する。一つの態様において、本発明は、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片の重鎖または軽鎖をコードする単離核酸配列を提供する。本発明はまた、核酸を含むベクターにも関する。本発明はさらに、重鎖をコードする第一の核酸分子および軽鎖をコードする第二の核酸分子を含むベクターを提供し、重鎖および軽鎖は、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片の重鎖または軽鎖である。一つの特定の態様において、ベクターは発現ベクターである。本発明はさらに、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドのベクターまたはポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明は、ATCCアクセッション番号PTA-7610、PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA- 5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有する寄託されたハイブリドーマクローン8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2によって産生された抗体の重鎖および軽鎖、またはその一部、たとえばCDR、可変ドメイン等およびそのヒト化型をコードするポリヌクレオチドを含む。
活性化および阻害性Fc受容体、たとえばFcγRIIAおよびFcγRIIBは、これらの受容体のバランスのとれた機能および適当な細胞性免疫応答にとって極めて重要である。本発明は、Fc受容体シグナル伝達経路におけるそのようなバランスおよび調節された制御の喪失に関連する任意の疾患の処置のために本発明の抗体を用いることを包含する。このように、本発明のFcγRIIB抗体は、免疫応答を調節する場合に、たとえば自己免疫もしくは炎症性疾患、またはアレルギー反応に関連して免疫応答を阻害する場合に、用途を有する。本発明のFcγRIIB抗体はまた、たとえば治療抗体媒介性細胞障害性を増強するために一定のエフェクター機能を変更するのにも用いることができる。
本発明の抗体は、癌の予防または処置にとって、たとえば一つの態様において単剤療法として有用である。好ましい態様において、本発明の抗体は、黒色腫の処置および／または予防のために用いられる。もう一つの態様において、該抗体は、癌の予防または処置のために、特に殺腫瘍細胞を増強するために細胞障害活性を有する癌抗原特異的治療抗体の細胞障害活性を強化するために、および／または治療抗体の抗体依存的細胞媒介性細胞障害性（「ADCC」）、補体依存的細胞障害性（「CDC」）、または貪食を増強するために有用である。本発明は、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する第一の抗体またはその断片、および癌に特異的に結合しかつ細胞障害性である第二の抗体の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、癌抗原を特徴とする癌を有する患者において癌を処置する方法を提供する。本発明はまた、FcγRIIA、好ましくはネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、FcγRIIB、特にネイティブなヒトFcγRIIBに特異的に結合し、かつ抗体が単量体である場合に、その定常ドメインがFcγRIIIAなどの一つまたは複数のFc活性化受容体に対して増加した親和性をさらに有し、かつ癌抗原に対して特異的に結合しかつ細胞障害性である抗体の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、癌抗原を特徴とする癌を有する患者における癌を処置する方法を提供する。一つの特定の態様において、Fc活性化受容体は、FcγRIIAである。特定の態様において、本発明の抗体は、抗体が好中球に検出可能に結合しないような用量で投与される。
本発明のもう一つの好ましい態様において、本発明の抗体は、B細胞悪性疾患、特に非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ球性白血病を予防または処置するために有用である。したがって、本発明は、FcγRIIBに特異的に結合するが、FcγRIIAには特異的に結合しない抗体、ならびにその誘導体、類似体、および抗原結合断片を、単独でまたは一つもしくは複数の他の治療物質と併用して投与することによって、B細胞悪性疾患を処置、管理、予防、または改善する方法を提供する。特定の態様において、被験者の癌は、一つまたは複数の標準的または実験治療、特にRituxan処置に対して不応性である。本発明の方法は、B細胞慢性リンパ球性白血病（B-CLL）、非ホジキンリンパ腫、びまん性大B細胞リンパ腫、びまん性大B細胞リンパ腫の領域を有する濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、およびびまん性核切れ込み小細胞型リンパ腫のなどのB細胞疾患の処置、管理、予防、または改善のために用いられてもよい。
もう一つの態様において、本発明は、治療物質または薬物に結合したFcγRIIB特異的抗体を用いることを提供する。抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合断片に結合させることができる治療物質の例には、サイトカイン、毒素、放射活性元素、および抗代謝剤が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
一つの態様において、本発明は、B細胞悪性疾患の標準的または実験的処置レジメン（たとえば、化学療法、放射免疫療法、または放射線療法）と併用してFcγRIIB特異的抗体を用いることを提供する。そのような併用療法は、標準的または実験的処置の効能を増強する可能性がある。B細胞悪性疾患の予防、処置、管理、または改善のために、FcγRIIB特異的抗体またはその抗原結合断片との併用において特に有用である治療物質の例には、Rituxan、インターフェロン-α、および抗癌剤が含まれるがこれらに限定されるわけではない。FcγRIIB特異的抗体またはその抗原結合断片と併用して用いることができる化学療法剤には、アルキル化剤、抗代謝剤、天然物、およびホルモンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明の併用治療は、治療もしくは予防効果を達成するために、B細胞悪性疾患を有する被験者に対する、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合断片のより低用量、および／または抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合断片のより少ない投与回数を可能にする。
もう一つの態様において、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合部分を用いることは、B細胞悪性疾患と診断された被験者の生存を延長する。
もう一つの態様において、本発明は、本発明の抗体またはその断片を、細胞障害性抗体の細胞障害効果を増強するために十分な量で投与する段階を含む、細胞障害性抗体によって処置される被験者において抗体媒介性細胞障害効果を増強する方法を提供する。なおもう一つの態様において、本発明は、単量体である場合にFc活性化受容体に対して増強された親和性をさらに有する本発明の抗体またはその断片を、細胞障害性抗体の細胞障害効果を増強するために十分な量で、患者に投与する段階を含む、細胞障害性抗体によって処置される被験者における抗体媒介性細胞障害効果を増強する方法を提供する。なおもう一つの態様において、本発明は、一つまたは複数のさらなる癌治療を投与する段階をさらに含む方法を提供する。
本発明は、抗体の治療活性を強化するために殺細胞を通してその治療効果を媒介する任意の治療抗体と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。一つの特定の態様において、本発明の抗体は、抗体媒介性エフェクター機能を増強することによって、抗体の治療活性を強化する。本発明のもう一つの態様において、本発明の抗体は、標的となる腫瘍細胞の貪食およびオプソニン化を増強することによって、細胞障害性抗体の治療活性を強化する。本発明のなおもう一つの態様において、本発明の抗体は、標的となる腫瘍細胞の破壊における抗体依存的細胞媒介性細胞障害（「ADCC」）を増強することによって抗体の治療活性を強化する。一定の態様において、本発明の抗体は、ADCCを増強するためにFc融合タンパク質と併用して用いられる。
いくつかの態様において、本発明は、抗体の治療活性を強化するために殺細胞を通してその治療効果を媒介しない治療抗体と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。特定の態様において、本発明は、アゴニスト活性を有する治療的アポトーシス誘発抗体、たとえば抗Fas抗体と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。治療的アポトーシス誘発抗体は、アポトーシス経路の調節に関して当技術分野において公知の任意の細胞死受容体、たとえばTNFR受容体ファミリーメンバー、またはTRAILファミリーメンバーに対して特異的であってもよい。
本発明は、マクロファージ媒介性の腫瘍細胞の進行および転移を遮断するために本発明の抗体を用いることを包含する。本発明の抗体は、マクロファージの浸潤が起こる固形腫瘍の処置において特に有用である。本発明のアンタゴニスト抗体は、腫瘍部位に局在するマクロファージの集団を低減または排除することによって、腫瘍細胞の転移を制御するために、たとえば低減または排除するために、特に有用である。本発明はさらに、FcγRIIBを発現するマクロファージ、たとえば樹状細胞以外の免疫エフェクター細胞を有効に枯渇または排除する抗体を包含する。本発明の抗体を用いた免疫エフェクター細胞の有効な枯渇または排除は、エフェクター細胞集団の50％、60％、70％、80％、好ましくは90％、および最も好ましくは99％の低減の範囲であってもよい。特定の態様において、本発明の抗体は、抗体が好中球に検出可能に結合しないような用量で投与される。
いくつかの態様において、本発明のアゴニスト抗体は、黒色腫細胞の腫瘍が含まれる、非造血起源の腫瘍の処置にとって特に有用である。
いくつかの態様において、本発明は、腫瘍細胞自体には発現していないが、周辺の反応性でかつ腫瘍を支持する、腫瘍間質を含む非悪性細胞において発現している、腫瘍抗原に対して免疫特異的に結合する治療抗体と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。好ましい態様において、本発明の抗体は、線維芽細胞上の腫瘍抗原、たとえば線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）に免疫特異的に結合する抗体と併用して用いられる。
本発明は、本発明の一つまたは複数の抗体の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、それを必要とする患者における自己免疫障害を処置する方法を提供する。本発明はまた、一つまたは複数の抗炎症剤、および／または一つまたは複数の免疫調節剤の治療的有効量を患者に投与する段階をさらに含む、それを必要とする患者における自己免疫障害を処置する方法を提供する。
本発明はまた、本発明の一つまたは複数の抗体の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、それを必要とする患者における炎症性障害を処置する方法を提供する。本発明はまた、一つまたは複数の抗炎症剤および／または一つまたは複数の免疫調節剤の治療的有効量を患者に投与する段階をさらに含む、それを必要とする患者における炎症性障害を処置する方法を提供する。
本発明は、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と、ワクチン組成物とを、抗体またはその断片が、被験者におけるワクチン組成物に対する免疫応答を増強するために有効な量で投与されるように、被験者に投与する段階を含む、被験者におけるワクチン組成物に対する免疫応答を増強させる方法を提供する。本発明の抗体は、ワクチン組成物の抗原に対して液性および／または細胞性反応を増強するために用いてもよい。本発明の抗体は、当技術分野において公知の任意のワクチンと併用して用いてもよい。本発明は、特定の抗原または複数の抗原に対する増強された免疫応答が疾患または障害を処置または予防するために有効である、特定の障害を予防または処置するために本発明の抗体を用いることを包含する。
本発明はさらに、本発明のアゴニスト抗体の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、それを必要とする患者におけるIgE媒介アレルギー障害を処置または予防するための方法を提供する。本発明はまた、IgE媒介アレルギー障害を処置または予防するために用いられる他の治療抗体またはワクチン組成物と併用して、本発明の抗体を患者に投与する段階を含む、それを必要とする患者におけるIgE媒介アレルギー障害を処置または予防するための方法を提供する。
本発明はまた、感染した細胞のオプソニン化および貪食を増強するために、HIV、HCV、またはHSVなどの病原体に既に感染している患者に本発明の抗体を投与する、感染物質に対する免疫療法を増強するための方法を提供する。
本発明は、アポトーシス媒介シグナル伝達が損傷された疾患、たとえば癌、自己免疫疾患を処置する方法を提供する。特定の態様において、本発明は、抗Fas抗体と併用して本発明の抗体を投与する段階を含む、Fas媒介アポトーシスが欠損している疾患を処置する方法を包含する。
本発明は、生体試料においてFcγRIIB（すなわち、FcγRIIBであって、FcγRIIAではない）の存在を特異的に検出するために本発明の抗体を用いることを包含する。
もう一つの態様において、本発明は、以下の段階を含む、被験者における自己免疫疾患の診断法を提供する：（i）被験者由来の生体試料を本発明の抗体の有効量に接触させる段階；および（ii）抗体またはその断片の結合を検出する段階であって、検出マーカーがバックグラウンドレベルまたは標準レベルを超えて検出されれば、被験者が自己免疫疾患を有することが示される、段階。
本発明はさらに、以下を含む薬学的組成物を提供する：（i）FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片の治療的有効量；および（ii）薬学的に許容される担体。加えて、本発明は、以下を含む薬学的組成物を提供する：（i）FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片の治療的有効量；（ii）癌抗原に特異的に結合する細胞障害性抗体；および（iii）薬学的に許容される担体。
本発明の一定の態様において、B細胞悪性疾患またはその一つもしくは複数の症状を予防、処置、管理、または改善するために有効な量の、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が、本発明の方法に従って用いられるために提供される。本発明はまた、抗FcγRIIB抗体またはその抗原結合断片、FcγRIIBアンタゴニスト以外の予防もしくは治療物質、および薬学的に許容される担体を含む、本発明の方法に従って用いられるための薬学的組成物を提供する。
3.1 定義
本明細書において用いられるように、「FcγRIIBに特異的に結合する」という用語は、FcγRIIBまたはその断片に特異的に結合するが、他のFc受容体、特にFcγRIIAに特異的に結合しない抗体またはその断片（または他の任意のFcγRIIB結合分子）を指す。さらに、FcγRIIBに特異的に結合する抗体は、抗体の可変ドメインまたは定常ドメインを通して結合してもよいと当業者に理解される。FcγRIIBに特異的に結合する抗体が、その可変ドメインを通して結合する場合、それは凝集せず、すなわち単量体であると当業者に理解される。FcγRIIBに特異的に結合する抗体は、たとえばイムノアッセイ、BIAcore、または当技術分野において公知の他のアッセイによって決定した場合に、低い親和性を有する他のペプチドまたはポリペプチドに結合してもよい。好ましくは、FcγRIIBまたはその断片に特異的に結合する抗体または断片は、他の抗原と交叉反応しない。FcγRIIBに特異的に結合する抗体または断片は、たとえばイムノアッセイ、BIAcore、または当業者に公知の他の技術によって同定されうる。抗体またはその断片は、それが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（RIA）、および酵素免疫測定法（ELISA）などの実験技術を用いて決定した場合に、任意の交叉反応性の抗原に対するより高い親和性でFcγRIIBに結合する場合に、FcγRIIBに対して特異的に結合する。たとえば、抗体の特異性に関する考察に関しては、Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336を参照されたい。
本明細書において用いられるように、「ネイティブなFcγRIIB」という用語は、細胞の表面上で内因性に発現して存在するFcγRIIBを指す。いくつかの態様において、「ネイティブなFcγRIIB」は、哺乳動物細胞において組換えによって発現するタンパク質を包含する。好ましくは、ネイティブなFcγRIIBは、細菌細胞、すなわち大腸菌（E. coli）において発現しない。最も好ましくは、ネイティブなFcγRIIBは、変性されていない、すなわちそれらはその生物学的に活性なコンフォメーションで存在する。
本明細書において用いられるように、「ネイティブなFcγRIIA」という用語は、細胞の表面上で内因性に発現して存在するFcγRIIAを指す。いくつかの態様において、「ネイティブなFcγRIIA」とは、哺乳動物細胞において組換えによって発現するタンパク質を包含する。好ましくは、ネイティブなFcγRIIAは、細菌細胞、すなわち大腸菌（E. coli）において発現しない。最も好ましくは、ネイティブなFcγRIIAは、変性されていない、すなわちそれらはその生物学的に活性なコンフォメーションで存在する。
本明細書において用いられるように、細胞タンパク質の状況において、「内因性」という用語は、天然に存在するおよび／または組換え操作の非存在下で細胞によって発現するタンパク質を指し；したがって、「内因性に発現したタンパク質」または「内因性のタンパク質」という用語は、組換え技術によって発現した細胞タンパク質を除外する。
本明細書において用いられるように、タンパク質様物質（たとえば、タンパク質、ポリペプチド、および抗体）の状況における「類似体」という用語は、第二のタンパク質様物質と類似または同一の機能を保有するが、第二のタンパク質様物質と類似もしくは同一のアミノ酸配列を必ずしも含まない、または第二のタンパク質様物質と類似もしくは同一の構造を保有しないタンパク質様物質を指す。類似のアミノ酸配列を有するタンパク質様物質は、以下の少なくとも一つを満足する第二のタンパク質様物質を指す：（a）第二のタンパク質様物質のアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも 99％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質様物質、（b）少なくとも5隣接アミノ酸残基、少なくとも10隣接アミノ酸残基、少なくとも15隣接アミノ酸残基、少なくとも20隣接アミノ酸残基、少なくとも25隣接アミノ酸残基、少なくとも40隣接アミノ酸残基、少なくとも50隣接アミノ酸残基、少なくとも60隣接アミノ酸残基、少なくとも70隣接アミノ酸残基、少なくとも80隣接アミノ酸残基、少なくとも90隣接アミノ酸残基、少なくとも100隣接アミノ酸残基、少なくとも125隣接アミノ酸残基、または少なくとも150隣接アミノ酸残基の第二のタンパク質様物質をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質様物質；および（c）第二のタンパク質様物質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質様物質。第二のタンパク質様物質と類似の構造を有するタンパク質様物質は、第二のタンパク質様物質に対して類似の二次、三次、または四次構造を有するタンパク質様物質を指す。ポリペプチドの構造は、ペプチドシークエンシング、X線結晶学、核磁気共鳴、円偏光二色性、および結晶学電子顕微鏡が含まれるがこれらに限定されるわけではない当業者に公知の方法によって決定されうる。
二つのアミノ酸配列または二つの核酸配列の％同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（たとえば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第一のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が、第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である。二つの配列間の％同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の重なり合う位置の数／位置の総数×100％）。一つの態様において、二つの配列は同じ長さである。
二つの配列間の％同一性の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。二つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877において改変された、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み入れられている。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、たとえば以下のように設定されたNBLASTヌクレオチドプログラムパラメータによって実行することができる：スコア＝100、ワード長＝12。BLASTタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためにたとえばスコア−50、ワード長＝3と設定されたXBLASTプログラムパラメータによって実行することができる。比較目的のためにギャップありのアラインメントを得るために、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402において記述されるように、ギャップありBLASTを利用することができる。または、PSI-BLASTを用いて,分子間の遠位関係を検出する繰り返し検索を行うことができる（同書）。BLAST、ギャップありBLAST、およびPSI-Blastプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（たとえば、XBLASTおよびNBLASTの）のデフォルトパラメータを用いることができる（たとえば、NCBIのウェブサイトを参照されたい）。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムのもう一つの好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4: 11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM 120重み付け残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いることができる。
二つの配列間の％同一性は、ギャップを認めるまたは認めずに、先に記述した技術と類似の技術を用いて決定することができる。％同一性を計算する場合、典型的に正確なマッチのみを計数する。
本明細書において用いられるように、非タンパク質様物質の状況における「類似体」という用語は、第一の有機または無機分子と類似または同一の機能を保持し、第一の有機または無機分子と構造的に類似である第二の有機または無機分子を指す。
本明細書において用いられるように、「アンタゴニスト」および「複数のアンタゴニスト」という用語は、FcγRIIBなどのもう一つの分子の機能、活性、および／または発現を遮断する、阻害する、低減する、または中和する任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、高分子、または低分子（10 kD未満）を指す。様々な態様において、アンタゴニストは、もう一つの分子の機能、活性、および／または発現を、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）などの対照と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％低減させる。
本明細書において用いられるように、「抗体」および「複数の抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Fvs（scFv）、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab)'断片、ジスルフィド連結Fvs（sdFv）、細胞内抗体、および抗イディオタイプ（抗Id）抗体（たとえば、抗Idおよび本発明の抗体に対する抗抗Id抗体が含まれる）、および上記の任意のエピトープ結合断片を指す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、すなわち抗原結合部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（たとえば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY）、クラス（たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）、またはサブクラスの分子でありうる。
本明細書において用いられるように、「複数のB細胞悪性疾患」および「B細胞悪性疾患」という用語は、任意のB細胞リンパ増殖障害を指す。B細胞悪性疾患には、B細胞起源の腫瘍が含まれる。B細胞悪性疾患には、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、ホジキンおよび非ホジキン病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Bリンパ腫領域を伴う濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、およびびまん性核切れ込み小細胞型リンパ腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
特に明記していなければ、抗体（本明細書において広く定義される）を参照する場合、抗体またはその断片内の抗体ドメインおよび／またはアミノ酸位置に対する言及は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service（National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991）におけるそれぞれのドメインに対するアミノ酸の定義および割付に従う。免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域からのアミノ酸は、鎖におけるアミノ酸の位置によって示される。Kabatは、抗体に関して多数のアミノ酸配列を記述して、それぞれのサブグループに関してアミノ酸コンセンサス配列を同定して、各アミノ酸に残基番号を割付した。Kabatの番号付けスキームは、保存されたアミノ酸を参照することによって、Kabatのコンセンサス配列の一つと問い合わせ抗体とを整列させることによって、彼の概論に含まれない抗体に拡大可能である。残基番号を割付するこの方法は、当技術分野において標準となり、キメラまたはヒト化変種が含まれる異なる抗体における同等の位置でのアミノ酸を容易に同定する。たとえば、ヒト抗体軽鎖の50位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の50位のアミノ酸と同等の位置を占有する。このように、本明細書において用いられるように、ヒト化抗体の状況において、「Fc領域の297位」などの言及は、対応するヒト免疫グロブリンの297位に対応する、免疫グロブリン鎖、免疫グロブリン鎖における領域、または免疫グロブリン鎖に由来するポリペプチドの領域におけるアミノ酸の位置を指す。
本明細書において用いられるように、「癌」という用語は、異常な制御されない細胞の成長に起因する新生物または腫瘍を指す。本明細書において用いられるように、癌には、明確に白血病およびリンパ腫が含まれる。「癌」という用語は、遠隔部位への転移能を有し、非癌細胞の形質とは異なる表現型形質、たとえば軟寒天などの三次元基質におけるコロニー形成または三次元基底膜もしくは細胞外マトリクス調製物における細管状ネットワークまたは網様マトリクスの形成を示す細胞を伴う疾患を指す。非癌細胞は、軟寒天においてコロニーを形成せず、三次元基底膜または細胞外マトリクス調製物において明確な球状構造を形成しない。癌細胞は、その発達の際に、様々なメカニズムを通してであるが、特徴的な組の機能的能力を獲得する。そのような能力には、アポトーシスの回避、成長シグナルにおける自足、抗成長シグナルに対する非感受性、組織の浸潤／転移、無限の展開能、および持続的な血管新生が含まれる。「癌細胞」という用語は、前悪性および悪性の癌細胞の双方を包含することを意味する。いくつかの態様において、癌は、局所に留まっている良性腫瘍を指す。他の態様において、癌は、隣接する体構造に浸潤して破壊し、遠隔部位に広がる悪性腫瘍を指す。なお他の態様において、癌は特異的癌抗原に関連する。
本明細書において用いられるように、抗体が含まれるポリペプチドまたはタンパク質の状況における「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失、または付加の導入によって変更されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。本明細書において用いられる「誘導体」という用語はまた、すなわちポリペプチドまたはタンパク質に任意のタイプの分子を共有的に付着させることによって改変されているポリペプチドまたはタンパク質を指す。たとえば、しかし限定するためではないが、抗体は、たとえばグリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結等によって改変されてもよい。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質は、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、チュニカマイシンの代謝的合成等が含まれるがこれらに限定されるわけではない当業者に公知の技術を用いる化学改変によって産生されてもよい。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが由来するポリペプチドまたはタンパク質と類似または同一の機能を保有する。
本明細書においてFcγRIIBに関連して用いられる「誘導体」という用語は、アミノ酸残基置換、欠失、または付加の導入（すなわち、変異）によって改変されている、FcγRIIBポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、FcγRIIBポリペプチドの断片、FcγRIIBポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、またはFcγRIIBポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体断片を指す。いくつかの態様において、抗体誘導体またはその断片は、一つまたは複数のCDRにおいてアミノ酸残基の置換、欠失、または付加を含む。抗体誘導体は、非誘導体抗体と比較して実質的に同じ結合、よりよい結合、またはより悪い結合を有してもよい。特定の態様において、CDRのアミノ酸残基1、2、3、4、または5個が置換、欠失、または付加（すなわち変異）されている。本明細書においてFcγRIIBに関連して用いられる「誘導体」という用語はまた、FcγRIIBポリペプチド、FcγRIIBポリペプチドの断片、FcγRIIBポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、またはすなわちポリペプチドに対する任意のタイプの分子の共有的付着によって改変されているFcγRIIBポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体断片を指す。たとえば、しかし限定するためではないが、FcγRIIBポリペプチド、FcγRIIBポリペプチドの断片、抗体、または抗体断片は、たとえばグリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結等によって改変されてもよい。FcγRIIBポリペプチド、FcγRIIBポリペプチドの断片、抗体、または抗体断片は、特異的化学切断、アセチル化、製剤化、チュニカマイシンの代謝的合成等が含まれるがこれらに限定されるわけではない、当業者に公知の技術を用いる化学改変によって改変されてもよい。さらに、FcγRIIBポリペプチドの誘導体、FcγRIIBポリペプチドの断片、抗体、または抗体断片は、一つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。一つの態様において、抗体誘導体は、親抗体と類似または同一の機能を保有する。もう一つの態様において、抗体または抗体断片の誘導体は、変更されていない抗体と比較して変更され活性を有する。たとえば、誘導体抗体またはその断片は、そのエピトープにより堅固に結合することができ、またはタンパク質分解に対してより耐性でありうる。
本明細書において用いられるように、「障害」および「疾患」という用語は、被験者における状態を指すために互換的に用いられる。特に、「自己免疫疾患」という用語は、自身の細胞、組織、および／または臓器に対する被験者の免疫反応によって引き起こされた細胞、組織、および／または臓器の損傷を特徴とする被験者における病態を指すために、「自己免疫障害」という用語と互換的に用いられる。「炎症性疾患」という用語は、炎症、好ましくは慢性炎症を特徴とする被験者における状態を指すために、「炎症性障害」という用語と互換的に用いられる。自己免疫障害は、炎症に関連しても関連しなくてもよい。その上、炎症は、自己免疫障害によって引き起こされる、または引き起こされなくてもよい。このように、一定の障害は自己免疫および炎症性障害の双方を特徴としてもよい。
本明細書において用いられるように、「エピトープ」という用語は、それに対して抗体が特異的に結合する抗原分子における領域を指す。
本明細書において用いられるように、「断片」という用語は、もう一つのポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも5隣接アミノ酸残基、少なくとも10隣接アミノ酸残基、少なくとも15隣接アミノ酸残基、少なくとも20隣接アミノ酸残基、少なくとも25隣接アミノ酸残基、少なくとも40隣接アミノ酸残基、少なくとも50隣接アミノ酸残基、少なくとも60隣接アミノ酸残基、少なくとも70隣接アミノ酸残基、少なくとも80隣接アミノ酸残基、少なくとも90隣接アミノ酸残基、少なくとも100隣接アミノ酸残基、少なくとも125隣接アミノ酸残基、少なくとも150隣接アミノ酸残基、少なくとも175隣接アミノ酸残基、少なくとも200隣接アミノ酸残基、少なくとも250隣接アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。特定の態様において、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの少なくとも一つの機能を保持する。好ましくは、抗体断片はエピトープ結合断片である。
本明細書において用いられるように、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（通常、マウスまたはラット）免疫グロブリンからの一つまたは複数のCDRとを含む免疫グロブリンを指す。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はなく、もし存在すれば、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち少なくとも約85〜90％好ましくは約95％またはそれより多く同一でなければならない。したがって、おそらくCDRを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖とヒト化重鎖免疫グロブリンとを含む抗体である。たとえば、ヒト化抗体は、たとえばキメラ抗体の全可変領域が非ヒトであることから、典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。得られたヒト化抗体が、CDRを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予想されることから、ドナー抗体は、「ヒト化」プロセスによって「ヒト化」されているという人もいる。たいていの場合、ヒト化抗体は、その中でレシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基に置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、またはドナー抗体において見いだされない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに精密化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のFRである、少なくとも一つ、典型的に二つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は、任意でまた、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、典型的にアミノ酸残基の置換、欠失、または付加の導入（すなわち変異）によって変更されているFcγRIIBポリペプチドに免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリンの一部を含むであろう。いくつかの態様において、ヒト化抗体は誘導体である。そのようなヒト化抗体は、一つまたは複数の非ヒトCDRにおいてアミノ酸残基の置換、欠失、または付加を含む。ヒト化抗体誘導体は、非誘導体ヒト化抗体と比較して、実質的に同じ結合、よりよい結合、またはより悪い結合を有してもよい。特定の態様において、CDRのアミノ酸残基1、2、3、4、または5個が置換、欠失、または付加（すなわち変異）されている。抗体をヒト化するためのさらなる詳細に関しては、欧州特許番号EP 239,400、EP 592,106、およびEP 519,596；国際公開番号WO 91/09967およびWO 93/17105；米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、第5,565,332号、第5,585,089号、第5,766,886号、および第6,407,213号；ならびに
Figure 0005764290
を参照されたい。
本明細書において用いられるように、「超可変領域」という用語は、抗原結合に責任を有する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基24〜34位（L1）、50〜56位（L2）および89〜97位（L3）、ならびに重鎖可変ドメインにおける31〜35位（H1）、50〜65位（H2）、および95〜102位（H3）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）からのアミノ酸配列、および／または「超可変ループ」（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基26〜32位（L1）、50〜52位（L2）、および91〜96位（L3）ならびに重鎖可変ドメインにおける26〜32位（H1）、53〜55位（H2）、および96〜101位（H3）；Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917）からのアミノ酸配列を含む。Eph099B-208.261およびEph099B-233.152に関するCDR残基を表1に記載する。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書において用いられるように、「免疫調節物質」という用語および免疫調節物質が含まれるがこれらに限定されるわけではないその変種は、宿主の免疫系を調節する物質を指す。一定の態様において、免疫調節物質は免疫抑制剤である。一定の他の態様において、免疫調節物質は、免疫刺激剤である。免疫調節物質には、低分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、模倣物質、および有機分子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本明細書において用いられるように、「管理する」、「管理している」、および「管理」という用語は、被験者が予防または治療物質の投与から得るが、それによって疾患の治癒が起こらない有益な効果を指す。一定の態様において、被験者は、疾患の進行または悪化を予防するために、疾患を「管理」するための一つまたは複数の予防または治療物質を投与される。
本明細書において用いられるように、「核酸」および「ヌクレオチド配列」という用語には、DNA分子（たとえば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（たとえば、mRNA）、DNAとRNA分子の組み合わせ、またはハイブリッドDNA/RNA分子、およびDNAまたはRNA分子の類似体が含まれる。そのような類似体は、たとえば、イノシンまたはトリチウム化塩基が含まれるがこれらに限定されるわけではないヌクレオチド類似体を用いて生成することができる。そのような類似体はまた、たとえばヌクレアーゼ抵抗性または細胞膜の通過能の増加などの有益な属性を分子に与える改変骨格を含むDNAまたはRNA分子を含みうる。核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖となりえて、一本鎖または二本鎖部分の双方を含んでもよく、三本鎖部分を含んでもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
本明細書において用いられるように、「予防する」、「予防している」、および「予防」という用語は、予防物質または治療物質の投与に起因する被験者における障害の一つまたは複数の症状の発生および／または再発または発生の予防を指す。
本明細書において用いられるように、「予防物質」および「複数の予防物質」という用語は、障害を予防するため、または障害の再発もしくは広がりを予防するために用いられうる任意の物質を指す。予防的有効量は、過増殖疾患に対する素因を有する患者、たとえば癌に対する遺伝的素因を有するまたは発癌物質に既に曝露された患者が含まれるがこれらに限定されるわけではない患者における過増殖疾患、特に癌の再発もしくは広がり、またはそのような疾患の発生を予防するために十分な予防物質の量を指してもよい。予防的有効量は、疾患の予防において予防的恩典を提供する予防物質の量を指してもよい。さらに、本発明の予防物質に関する予防的有効量は、疾患の予防において予防的恩典を提供する、単独または他の物質と併用した予防物質の量を意味する。本発明のFcγRIIB抗体の量に関連して用いる場合、この用語は、全体的な予防を改善する、または治療抗体などの、しかしこれに限定されないもう一つの予防物質の予防効能を増強する、もしくはもう一つの予防物質との相乗効果を示す量を包含しうる。一定の態様において、「予防物質」という用語は、アゴニスト性のFcγRIIB特異的抗体を指す。他の態様において、「予防物質」という用語は、アンタゴニストFcγRIIB特異的抗体を指す。一定の他の態様において、「予防物質」という用語は、癌化学療法、放射線療法、ホルモン療法、生物療法（たとえば、免疫療法）、および／または本発明のFcγRIIB抗体を指す。他の態様において、一つより多い予防物質を併用して投与してもよい。
本明細書において用いられるように、「副作用」という句は、予防または治療物質の望ましくない有害作用を包含する。有害作用は常に望ましくないが、望ましくない作用は必ずしも有害ではない。予防または治療物質による有害作用は、害を与える、不快である、または危険が大きい可能性がある。化学療法による副作用には、初期および後期下痢および膨満、悪心、嘔吐、食欲不振などの、しかしこれらに限定されない消化管毒性、白血球減少症、貧血、好中球減少症、無力、腹部痙攣、発熱、疼痛、体重減少、脱水、脱毛、呼吸困難、不眠、めまい、粘膜炎、口内乾燥、および腎不全、ならびに便秘、神経および筋作用、腎臓および膀胱に対する一時的または永続的損傷、風邪様症状、体液貯留、および一時的または永続的不妊症が含まれるがこれらに限定されるわけではない。放射線療法による副作用には、倦怠感、口の渇き、および食欲喪失が含まれるがこれらに限定されるわけではない。生物療法／免疫療法による副作用には、投与部位での発疹または腫脹、発熱、悪心、および倦怠感などの風邪様症状、消化管障害、ならびにアレルギー反応が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ホルモン療法による副作用には、悪心、受精能の問題、抑うつ、食欲喪失、眼の問題、頭痛、および体重変動が含まれるがこれらに限定されるわけではない。典型的に患者が経験するさらに望ましくない作用は、多数あり、当技術分野において公知であり、たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Physicians' Desk Reference（56th ed., 2002）を参照されたい。
本明細書において用いられるように、「一本鎖Fv」または「scFv」という用語は、これらのドメインが一つのポリペプチド鎖に存在する、抗体のVHおよびVLドメインを含む。一般的に、Fvポリペプチドはさらに、VHおよびVLドメインのあいだに、それによってscFvが抗原結合にとって所望の構造を形成することができるポリペプチドリンカーを含む。sFvに関する概説に関しては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。特定の態様において、scFvには二重特異性scFvおよびヒト化scFvが含まれる。
本明細書において用いられるように、「被験者」および「患者」という用語は互換的に用いられる。本明細書において用いられるように、被験者は好ましくは、非霊長類（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）および霊長類（たとえば、サルおよびヒト）などの哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
本明細書において用いられるように、「治療的有効量」は、FcγRIIBに関連する疾患もしくは障害、およびFc受容体シグナル伝達経路における調節の喪失に関連する任意の疾患を処置もしくは管理するために十分な、またはもう一つの治療、たとえば治療抗体、ワクチン療法、または予防物質等の治療効能を増強するために十分な治療物質の量を指す。治療的有効量は、疾患の発生を遅らせるまたは最小限にするために、たとえば癌の広がりを遅らせるまたは最小限にするために十分な治療物質の量を指してもよい。治療的有効量はまた、疾患の処置または管理において治療的恩典を提供する治療物質の量を指してもよい。さらに、本発明の治療物質に関連する治療的有効量は、疾患の処置または管理において治療的恩典を提供する、たとえば疾患を処置または管理するために十分な治療抗体の治療効能を増強するために十分な、単独または他の療法と併用した治療物質の量を意味する。本発明のFcγRIIB抗体の量に関連して用いられる場合、この用語は、全体的な治療を改善する、望ましくない作用を低減もしくは回避する、またはもう一つの治療物質の治療効能を増強するもしくはもう一つの治療物質と相乗効果を示す量を包含しうる。
本明細書において用いられるように、「処置する」、「処置している」および「処置」という用語は、Fc受容体シグナル伝達経路における調節の喪失に関連する疾患もしくは障害の症状の撲滅、低減、もしくは改善を指し、またはもう一つの治療、たとえば治療抗体、ワクチン治療、または予防の治療効能を増強することを指す。いくつかの態様において、処置は、一つまたは複数の治療物質の投与に起因する原発性、局所性、または転移性癌組織の撲滅、除去、改変、または制御を指す。一定の態様において、そのような用語は、そのような疾患を有する被験者に一つまたは複数の治療物質を投与することに起因する、癌の広がりを最小限にするまたは遅らせることを指す。他の態様において、そのような用語は、疾患を引き起こす細胞の排除を指す。
本明細書において用いられるように、「併用して」という用語は、一つより多い予防および／または治療物質を用いることを指す。「併用して」という用語を用いることは、予防および／または治療物質が障害、たとえば過増殖細胞障害、特に癌を有する被験者に投与される順序を限定しない。第一の予防または治療物質は、第二の予防または治療物質を、障害を有した、有する、または感受性がある被験者に投与する前に（たとえば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間前）、第二の物質の投与と同時に、または第二の物質の投与後に（たとえば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間後）投与することができる。予防または治療物質は、そうでないように投与した場合より恩典の増加を提供するように、本発明の物質が他の物質と共に作用することができるような順序および期間内に被験者に投与される。任意のさらなる予防または治療物質を他のさらなる予防または治療物質と共に任意の順序で投与することができる。
[請求項101]
ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに特異的に結合する単離抗体であって、ATCCアクセッション番号PTA-7610を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される8B5.3.4抗体であるか、または8B5.3.4抗体と結合に関して競合する、抗体。
[請求項102]
ATCCアクセッション番号PTA-7610を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される8B5.3.4抗体である、請求項101記載の抗体。
[請求項103]
8B5.3.4抗体のヒト化型である、請求項101記載の抗体。
[請求項104]
ヒト抗体である、請求項101記載の抗体。
[請求項105]
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項101記載の抗体。
[請求項106]
重鎖のFcドメインにおいて少なくとも一つの改変をさらに含む、Fcドメインを有する請求項101記載の抗体。
[請求項107]
抗体の重鎖のFcドメインが、240、243、247、255、270、292、300、305、316、370、392、396、416、419、または421位でその位置のもう一つのアミノ酸との少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項106記載の抗体。
[請求項108]
抗体の重鎖のFcドメインが243位でロイシン、292位でプロリン、300位でロイシン、305位でイソロイシン、および396位でロイシンを有する、請求項106記載の抗体。
[請求項109]
F(ab')2断片またはF(ab)断片である、請求項101記載の抗体。
[請求項110]
一本鎖抗体である、請求項101記載の抗体。
[請求項111]
異種ポリペプチドに機能的に連結している、請求項101記載の抗体。
[請求項112]
治療物質に結合している、請求項101記載の抗体。
[請求項113]
治療物質が細胞毒である、請求項112記載の抗体。
[請求項114]
FcγRIIBに対するIg-Fcの結合を遮断する、請求項101記載の抗体。
[請求項115]
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する可変重鎖(VH)ドメインを含む単離抗体であって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、抗体。
[請求項116]
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する可変軽鎖(VL)ドメインを含む単離抗体であって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、抗体。
[請求項117]
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有するVH相補性決定領域(CDR)1を含む単離抗体であって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、抗体。
[請求項118]
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有するVH CDR2を含む単離抗体であって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、抗体。
[請求項119]
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む単離抗体であって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、抗体。
[請求項120]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む単離抗体であって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、抗体。
[請求項121]
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む単離抗体であって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、抗体。
[請求項122]
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む単離抗体であって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、抗体。
[請求項123]
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有するVH CDR2をさらに含む、請求項117記載の抗体。
[請求項124]
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVH CDR3をさらに含む、請求項117記載の抗体。
[請求項125]
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVH CDR3とをさらに含む、請求項117記載の抗体。
[請求項126]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1をさらに含む、請求項117記載の抗体。
[請求項127]
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含む、請求項117記載の抗体。
[請求項128]
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項117記載の抗体。
[請求項129]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項117記載の抗体。
[請求項130]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1をさらに含む、請求項123、124、または125のいずれか一項記載の抗体。
[請求項131]
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含む、請求項123、124、または125のいずれか一項記載の抗体。
[請求項132]
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項123、124、または125のいずれか一項記載の抗体。
[請求項133]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項123または124記載の抗体。
[請求項134]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項125記載の抗体。
[請求項135]
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するVH CDR3をさらに含む、請求項118記載の抗体。
[請求項136]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1をさらに含む、請求項118記載の抗体。
[請求項137]
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含む、請求項118記載の抗体。
[請求項138]
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項118記載の抗体。
[請求項139]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項118または135記載の抗体。
[請求項140]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1をさらに含む、請求項119記載の抗体。
[請求項141]
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含む、請求項119記載の抗体。
[請求項142]
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項119記載の抗体。
[請求項143]
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項119または135記載の抗体。
[請求項144]
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2をさらに含む、請求項120記載の抗体。
[請求項145]
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項120記載の抗体。
[請求項146]
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3とをさらに含む、請求項120記載の抗体。
[請求項147]
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有するVL CDR3をさらに含む、請求項120記載の抗体。
[請求項148]
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列またはその任意の組み合わせを含むポリペプチドであって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに特異的に結合する、ポリペプチド。
[請求項149]
請求項101記載の抗体もしくはその断片の重鎖もしくは軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、またはSEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:2のヌクレオチド配列を有する、単離核酸。
[請求項150]
請求項149記載の核酸を含むベクター。
[請求項151]
重鎖をコードする第一のヌクレオチド配列と、軽鎖をコードする第二のヌクレオチド配列とを含むベクターであって、該重鎖および該軽鎖が請求項101記載の抗体の重鎖および軽鎖である、ベクター。
[請求項152]
発現ベクターである、請求項150記載のベクター。
[請求項153]
請求項150記載のベクターを含有する宿主細胞。
[請求項154]
異種プロモーターに機能的に連結した第一の核酸と、同じまたは異なる異種プロモーターに機能的に連結した第二の核酸とを含有する宿主細胞であって、第一の核酸および第二の核酸がそれぞれ、請求項101記載の抗体の重鎖および軽鎖をコードする、宿主細胞。
[請求項155]
以下の段階を含む、FcγRIIB特異的抗体を組換え的に産生するための方法:(i)該抗体の発現にとって適した条件下で、請求項153記載の宿主細胞を培地において培養する段階;および(ii)培地から該抗体を回収する段階。
[請求項156]
FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する第一の重鎖-軽鎖対と、腫瘍抗原に特異的に結合する第二の重鎖-軽鎖対とを含む二重特異性抗体。
[請求項157]
ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに特異的に結合する単離抗体の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者における癌を処置する方法であって、該抗体が、ATCCアクセッション番号PTA-7610を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される8B5.3.4抗体であるか、または8B5.3.4抗体と結合に関して競合する、方法。
[請求項158]
抗体がモノクローナル抗体である、請求項157記載の方法。
[請求項159]
抗体が8B5.3.4抗体のヒト化型である、請求項157記載の方法。
[請求項160]
抗体が、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインとSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項157記載の方法。
[請求項161]
Fcドメインを有する8B5.3.4抗体の重鎖のFcドメインが、240、243、247、255、270、292、300、305、316、370、392、396、416、419、または421位でその位置のもう一つのアミノ酸との少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項159または160記載の方法。
[請求項162]
Fcドメインを有する8B5.3.4抗体の重鎖のFcドメインが、243位でロイシン、292位でプロリン、300位でロイシン、305位でイソロイシン、および396位でロイシンを有する、請求項161記載の方法。
[請求項163]
癌が乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頚癌、または膵臓癌である、請求項157記載の方法。
[請求項164]
一つまたは複数のさらなる癌治療の投与をさらに含む、請求項157記載の方法。
[請求項165]
さらなる癌治療が化学療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、または手術からなる群より選択される、請求項164記載の方法。
[請求項166]
患者がヒトである、請求項157記載の方法。
[請求項167]
抗体が好中球に検出可能に結合しない用量で投与される、請求項157記載の方法。
[請求項168]
ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに特異的に結合する単離抗体の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与する段階を含む、被験者におけるB細胞悪性疾患またはその一つもしくは複数の症状を処置または改善するための方法であって、該抗体が、ATCCアクセッション番号PTA-7610を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される8B5.3.4抗体であるか、または8B5.3.4抗体と結合に関して競合する、方法。
[請求項169]
FcγRIIB特異的抗体の治療的有効量の投与が、被験者の生存を延長する、請求項168記載の方法。
[請求項170]
被験者がヒトである、請求項168記載の方法。
[請求項171]
抗体が8B5.3.4抗体のヒト化型である、請求項168記載の方法。
[請求項172]
B細胞悪性疾患が、B細胞リンパ球性白血病または非ホジキンリンパ腫である、請求項168記載の方法。
[請求項173]
抗体が治療物質または薬物に結合する、請求項168記載の方法。
[請求項174]
治療物質が異種ポリペプチドである、請求項173記載の方法。
[請求項175]
治療物質が、FcγRIIB以外の細胞表面受容体に免疫特異的に結合する抗体である、請求項173記載の方法。
[請求項176]
治療物質が、腫瘍関連抗原に免疫特異的に結合する抗体である、請求項173記載の方法。
[請求項177]
B細胞悪性疾患に対する一つまたは複数の標準的または実験的治療の治療的有効量を被験者に投与する段階をさらに含む、請求項168記載の方法。
[請求項178]
治療の少なくとも一つが、抗体療法、サイトカイン療法、化学療法、造血幹細胞移植、B細胞媒介療法、生物療法、放射線療法、ホルモン療法、または手術である、請求項177記載の方法。
[請求項179]
標準的または実験的治療が、抗体またはその断片の投与の前、同時、または後に投与される、請求項177記載の方法。
[請求項180]
被験者が、B細胞悪性疾患に対する一つまたは複数の標準的または実験的治療の投与によって既に処置されているが、FcγRIIBアンタゴニストまたはその抗原結合断片の投与によって処置されていない、請求項168記載の方法。
[請求項181]
抗体が静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、または鼻腔内投与される、請求項168記載の方法。
[請求項182]
(i)ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに特異的に結合する単離抗体の治療的有効量であって、該抗体が、ATCCアクセッション番号PTA-7610を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される8B5.3.4抗体であるか、または8B5.3.4抗体と結合に関して競合する、治療的有効量;および
(ii)薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
[請求項183]
抗体がモノクローナル抗体である、請求項182記載の薬学的組成物。
[請求項184]
抗体が8B5.3.4抗体のヒト化型である、請求項182記載の薬学的組成物。
[請求項185]
抗体が、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項182記載の薬学的組成物。
[請求項186]
Fcドメインを有する8B5.3.4抗体の重鎖のFcドメインが、240、243、247、255、270、292、300、305、316、370、392、396、416、419、または421位でその位置のもう一つのアミノ酸との少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項182または185記載の薬学的組成物。
[請求項187]
8B5.3.4抗体の重鎖のFcドメインが、243位でロイシン、292位でプロリン、300位でロイシン、305位でイソロイシン、および396位でロイシンを有する、請求項186記載の薬学的組成物。
[請求項188]
一つまたは複数のさらなる抗癌剤をさらに含む、請求項182記載の薬学的組成物。
[請求項189]
抗癌剤が、化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、または免疫療法剤である、請求項188記載の薬学的組成物。
[請求項190]
B細胞悪性疾患を予防、処置、管理、または改善するために有効な量の一つまたは複数のFcγRIIB特異的抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[請求項191]
一つまたは複数の化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、または生物療法剤をさらに含む、請求項190記載の組成物。
4．図面の簡単な説明
FcγRIIAおよびFcγRIIBに対する8B5.3.4抗体の免疫反応性。8B5.3.4ハイブリドーマ細胞株クローン（MAb 8B5.3.4）によって産生された抗体の、FcγRIIBおよびFcγRIIAに対する直接結合を、受容体FcγRIIAおよびFcγRIIBをコーティングしたプレートを用いるELISAアッセイにおいて試験した（1試料あたり2個ずつ）。結合した抗体をヤギ抗マウスHRP結合抗体によって検出して、吸光度を650 nmでモニターした。 MAb 8B5.3.4のアイソタイプ特徴付け。ハイブリドーマクローン8B5.3.4によって産生されたMAb 8B5.3.4のアイソタイプをELISAアッセイによって決定した。様々なアイソタイプに対する抗体をアッセイして、吸光度の値を報告する。 クローン8B5.3.4によって産生されたモノクローナル抗体の可変軽鎖に関するヌクレオチド（SEQ ID NO:1）およびアミノ酸（SEQ ID NO:3）配列を表す。 クローン8B5.3.4によって産生されたモノクローナル抗体の可変重鎖に関するヌクレオチド（SEQ ID NO:2）およびアミノ酸（SEQ ID NO:4）配列を表す。
5．好ましい態様の説明
5.1 FcγRIIB特異的抗体
本発明は、FcγRIIA、好ましくはヒトFRcγRIIA、より好ましくはネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、FcγRIIB、好ましくはヒトFcγRIIBに、より好ましくはネイティブなヒトFcγRIIBに特異的に結合する、抗体（好ましくはモノクローナル抗体）またはその断片を包含する。代表的な抗体は、その全内容物が明白に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第2004/0185045号、米国特許仮出願第60/569,882号、および米国特許出願第11/126,978号において開示されている。本発明は、癌、特にB細胞悪性疾患などの疾患、またはその一つもしくは複数の症状の予防、処置、管理、または改善において、FcγRIIB特異的抗体、その類似体、誘導体、または抗原結合断片（たとえば、FcγRIIB特異的抗体の一つまたは複数の相補性決定領域（「CDR」））を用いることを包含する。好ましくは、本発明の抗体は、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに結合する。一定の態様において、抗体またはその断片は、FcγRIIAに結合する場合より2倍、4倍、6倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍または108倍より大きな親和性で、FcγRIIBに結合する。なお他の態様において、本発明は、当技術分野において公知の、および本明細書において開示される標準的な方法を用いた場合に、FcγRIIBのみに結合して、FcγRIIAに対して親和性を有しないFcγRIIB抗体を用いることを包含する。好ましい態様において、抗体はヒト抗体またはヒト化型抗体である。
なおもう一つの好ましい態様において、本発明の抗体はさらに、Fc活性化受容体、たとえばFcγRIIA、FcγRIIIB等に結合しない。一つの態様において、本発明に従うFcγRIIB特異的抗体は、Pulford et al., 1986（Immunology, 57: 71-76）において開示されるKB61と呼ばれるモノクローナル抗体ではなく、またはWeinrich et al., 1996,（Hybridoma, 15(2): 109-6）において開示されるMAbII8D2と呼ばれるモノクローナル抗体ではない。特定の態様において、本発明のFcγRIIB特異的抗体は、同じエピトープに結合せず、かつ／またはモノクローナル抗体KB61またはII8D2と結合において競合しない。好ましくは、本発明のFcγRIIB特異的抗体は、FcγRIIb2イソ型の135〜141位に対応するアミノ酸配列SDPNFSIに結合しない。
特定の態様において、本発明の抗体またはその断片は、FcγRIIBの少なくとも一つの活性にアゴニストとして作用する。本発明の一つの態様において、活性は、B細胞受容体媒介シグナル伝達の阻害である。もう一つの態様において、本発明のアゴニスト抗体は、B細胞活性化、B細胞増殖、抗体産生、B細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における一つもしくは複数の下流のシグナル伝達分子の活性を阻害する。なおもう一つの態様において、本発明のアゴニスト抗体は、FcγRIIBのリン酸化またはSHIPリクルートメントを増強する。本発明のさらなる態様において、アゴニスト抗体は、B細胞受容体媒介シグナル伝達経路においてMAPキナーゼ活性またはAktリクルートメントを阻害する。もう一つの態様において、本発明のアゴニスト抗体は、FcεRIシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害にアゴニストとして作用する。特定の態様において、抗体は、FcεRI誘発肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を阻害する。もう一つの態様において、本発明のアゴニスト抗体は、FcγRIIBのリン酸化を刺激して、SHIPのリクルートメントを刺激し、SHIPリン酸化およびShcとの会合を刺激する、またはMAPキナーゼファミリーメンバー（たとえば、Erkl、Erk2、JNK、p38等）の活性化を阻害する。なおもう一つの態様において、本発明のアゴニスト抗体は、p62dokのチロシンリン酸化、ならびにSHIPおよびrasGAPとのその関連を増強する。もう一つの態様において、本発明のアゴニスト抗体は、単球またはマクロファージにおけるFcγR媒介貪食を阻害する。
もう一つの態様において、本発明の抗体またはその断片は、FcγRIIBの少なくとも一つの活性に拮抗する。一つの態様において、該活性は、B細胞受容体媒介シグナル伝達の活性化である。特定の態様において、本発明のアンタゴニスト抗体は、B細胞活性、B細胞増殖、抗体産生、細胞内カルシウム流入、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における一つもしくは複数の下流のシグナル伝達分子の活性を増強する。なおもう一つの特定の態様において、本発明のアンタゴニスト抗体は、FcγRIIBのリン酸化またはSHIPリクルートメントを減少させる。本発明のさらなる態様において、アンタゴニスト抗体は、B細胞受容体媒介シグナル伝達経路におけるMAPキナーゼ活性、またはAktリクルートメントを増強する。もう一つの態様において、本発明のアンタゴニスト抗体は、FcεRIシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に拮抗する。特定の態様において、本発明のアンタゴニスト抗体は、FcεRI誘発肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を増強する。もう一つの態様において、本発明のアンタゴニスト抗体は、FcγRIIBのリン酸化を阻害し、SHIPのリクルートメントを阻害し、SHIPリン酸化およびShcとのその会合を阻害し、MAPキナーゼファミリーメンバー（たとえば、Erkl、Erk2、JNK、p38等）の活性化を増強する。なおもう一つの態様において、本発明のアンタゴニスト抗体は、p62dokのチロシンリン酸化ならびにSHIPおよびrasGAPとのその会合を阻害する。もう一つの態様において、本発明のアンタゴニスト抗体は、単球またはマクロファージにおけるFcγR媒介貪食を増強する。もう一つの態様において、本発明のアンタゴニスト抗体は、脾臓のマクロファージによるオプソニン化粒子の貪食、クリアランスを防止する。
他の態様において、本発明の抗体またはその断片は、細胞の一つの集団を標的とするが、他の集団を標的としないように用いることができる。いかなる理論にも拘束されることなく、本発明者らは、これまでに考えられているように、FcγRIIBが好中球において高度に発現しないことを発見した。高濃度の抗FcγRIIB抗体は、好中球と反応する。しかし、抗FcγRIIBの濃度の減少と共に、好中球の反応性は急速に排除される。低濃度の抗FcγRIIB抗体では、CD20+ B細胞との反応性が保存された。このように、本発明の抗体の好中球との反応性は、好中球または血小板などの無関係な集団に影響を及ぼさないように低減させることができる。したがって、本発明の一定の態様において、本発明の抗体は、その標的集団を十分に認識するが他の細胞を認識しないレベルで使用される。
本発明の抗体には、モノクローナル抗体、合成抗体、組換えによって産生された抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Fvs（scFv）、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド連結Fvs（scFv）、細胞内抗体、および上記の任意のエピトープ結合断片が含まれるがこれらに限定されるわけではない。特に、本発明の方法において用いられる抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、免疫グロブリンがFcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子が含まれる。抗体類似体にはまた、FcγRIIB特異的T細胞受容体、たとえばキメラT細胞受容体（たとえば、米国特許出願公開第2004/0043401号を参照されたい）、一本鎖抗体に連結した一本鎖T細胞受容体（たとえば、米国特許第6,534,633号を参照されたい）、およびタンパク質足場（たとえば、米国特許第6,818,418号を参照されたい）が含まれてもよい。一定の態様において、本発明の抗体類似体はモノクローナル抗体ではない。
本発明の方法において用いられる抗体は、鳥類および哺乳動物（たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）が含まれる任意の動物起源に由来してもよい。好ましくは、抗体はヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書において用いられるように、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、かつヒト免疫グロブリンライブラリもしくは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリから、またはヒト遺伝子からの抗体を発現するマウスから単離された抗体が含まれる。
本発明の方法において用いられる抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性であってもよく、またはより多い多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、FcγRIIBの異なるエピトープに免疫特異的に結合するか、またはFcγRIIBのエピトープと異種ポリペプチドなどの異種エピトープもしくは固相支持体材料との双方に免疫特異的に結合してもよい。たとえば国際公開番号WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、およびWO 92/05793；Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69；米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、および第5,601,819号；ならびにKostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553；Todorovska et al., 2001 Journal of Immunological Methods, 248:47-66を参照されたい。
特定の態様において、本発明の抗体は、FcγRIIB、および癌抗原、またはたとえば特定の疾患もしくは障害を処置もしくは予防するために殺されるように設計される細胞（たとえば、T細胞またはB細胞などの免疫細胞）に対して特異的な他の任意の細胞表面マーカー、または他のFc受容体、たとえばFcγRIIIA、FcγRIIIBに対して特異性を有する多重特異性である。
一つの特定の態様において、抗体は、ATCC寄託番号PTA-7610を有するハイブリドーマクローンによって産生されたマウスモノクローナル抗体に由来する。抗体8B5.3.4を産生するハイブリドーマは、2006年5月23日に、特許手続上の微生物の寄託に関する国際承認に関するブダペスト条約の規定に基づいて米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209））に寄託されて、アクセッション番号PTA-7610（8B5.3.4抗体を産生するハイブリドーマに関して）を割付され、参照により本明細書に組み入れられる。特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体を包含する。好ましい態様において、本発明の抗体はヒト抗体であるか、またはヒト化されており、好ましくはハイブリドーマクローン8B5.3.4によって産生された抗体のヒト化型である。
本発明はまた、他の抗体、好ましくはFcγRIIB、好ましくはヒトFcγRIIB、より好ましくはネイティブなヒトFcγRIIBに特異的に結合し、ATCCアクセッション番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有する2B6および3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、および1F2が含まれるがこれらに限定されるわけではないクローンに由来するモノクローナル抗体またはその断片を用いることを包含する。2B6および3H7クローンを産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて2002年8月13日に米国培養細胞系統保存機関（10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209）に寄託されており、参照により本明細書に組み入れられる。1D5、2El、2H9、2Dl1、および1F2クローンを産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に基づいて2004年5月7日に米国培養細胞系統保存機関（10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209）に寄託されており、参照により本明細書に組み入れられる。好ましい態様において、上記の抗体はキメラ抗体またはヒト化型抗体である。
特定の態様において、本発明の方法において用いられる抗体は、ATCCアクセッション番号PTA-7610のクローン8B5.3.4によって産生された抗体または抗体の抗原結合断片（たとえば、一つまたは複数の相補性決定領域（CDR）、好ましくは6個全てのCDR）（たとえば、重鎖CDR3）である。特定の態様において、本発明の方法において用いられる抗体は、ATCCアクセッション番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、および1F2によって産生された抗体または抗体の抗原結合断片（たとえば、一つまたは複数の相補性決定領域（CDR）、好ましくは6個全てのCDR）（たとえば、重鎖CDR3）である。特定の抗原に対して高い親和性および特異性を有するCDR 6個未満を含む抗体またはその抗原結合断片、およびそのような抗体を産生および同定する方法は、当技術分野において一般的に公知である（たとえば、その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Ward et al., 1989, Nature 341:544-546；Dumoulin et al., 2002, Protein Sci. 11:500-515；Davies et al., 1995, Bio/Technol. 13:475-479；Van den Beucken et al., 2001, J. Mol. Biol. 310:591-601；およびPereira et al., 1998, Biochem. 37:1430-1437を参照されたい）。抗原に特異的に結合することが知られている抗体からの一つまたは二つのCDRを他のCDRと組み合わせることによって生成された特定の抗原に対して特異的な抗体は記述されており、当技術分野において一般的に公知である（たとえば、その全てのその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Marks et al., 1992, Bio/Technol. 10:779-783；Klimka et al., 2000, Brit. J. Cancer 83(2):252-260；およびRader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910- 8915を参照されたい）。このように、本発明は、FcγRIIBに特異的に結合するクローン8B5.3.4の1、2、3、4、または5個のCDRを有し、本明細書において開示されるスクリーニング法を用いて同定される可能性がある抗体を企図する。
一つの態様において、本発明の抗体断片は、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合するより大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに特異的に結合する、ATCCアクセッション番号PTA-7610のクローン8B5.3.4によって産生された抗体の一つより多いCDR（たとえば、重鎖CDR3）を含む、ポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列、またはその任意の組み合わせを含んでもよい（たとえば、その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Davies et al., 1995, Bio/Technol. 13:475-479；Pereira et al., 1998, Biochemistry 37: 1430-1437；Tsumoto et al., 2002, FEBS Letters 525:77-82；van den Beucken et al., 2001, J. Mol. Biol. 310:591-601；Ward et al., 1989, Nature 341:544-546；およびDumoulin et al., 2002, Protein Sci. 11:500-515を参照されたい）。
もう一つの態様において、本発明の方法において用いられる抗体は、たとえばELISAアッセイまたは他の適切な競合的イムノアッセイにおいてそれぞれ決定した場合に、ATCCアクセッション番号PTA-7610のクローン8B5.3.4によって産生されたマウスモノクローナル抗体と同じエピトープに結合し、かつ／またはATCCアクセッション番号PTA-7610のクローン8B5.3.4によって産生されたマウスモノクローナル抗体と競合し、しかも該抗体またはその断片がFcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに結合する。もう一つの態様において、本発明の方法において用いられる抗体は、ELISAアッセイまたは他の適当な競合的イムノアッセイにおいて決定した場合に、ATCCアクセッション番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するハイブリドーマクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、および1F2によって産生されたマウスモノクローナル抗体と同じエピトープに結合し、かつ／またはATCCアクセッション番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するハイブリドーマクローン2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、および1F2によって産生されたマウスモノクローナル抗体と競合し、しかも該抗体またはその断片がFcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに結合する。
本発明はまた、ATCCアクセッション番号PTA-7610、PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するクローン8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2によって産生されたマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体またはその断片を包含する。本発明はさらに、ATCCアクセッション番号PTA-7610、PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するクローン8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2によって産生されたマウスモノクローナル抗体の一つまたは複数のCDRのアミノ酸配列と少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である一つまたは複数のCDRのアミノ酸配列を含む、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片を包含する。二つのアミノ酸配列のあいだの％同一性の決定は、BLASTタンパク質検索が含まれる、当業者に公知の任意の方法によって決定することができる。
本発明はまた、ATCCアクセッション番号PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するクローン8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2によって産生されたマウスモノクローナル抗体のヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片を用いることを包含する。好ましい態様において、本発明は、ATCCアクセッション番号PTA-7610、PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するクローン8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2によって産生されたマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる可変軽鎖および／または可変重鎖を含む、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片を提供する。もう一つの好ましい態様において、本発明は、ATCCアクセッション番号PTA-7610、PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するクローン8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2によって産生されたマウスモノクローナル抗体の一つまたは複数のCDRのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる一つまたは複数のCDRを含む、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片を提供する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）において約45℃でフィルターに結合したDNAに対するハイブリダイゼーションの後に、0.2×SSC/0.1％SDSにおいて約50〜65℃での1回または複数回の洗浄、6×SSCにおいて約45℃でフィルターに結合したDNAに対するハイブリダイゼーションの後に0.1×SSC/0.2％SDSにおいて約60℃での1回または複数回の洗浄などの高ストリンジェント条件、または当業者に公知の他の任意のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が含まれるがこれらに限定されるわけではない（たとえば、参照により本明細書に組み入れられる、Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY at pages 6.3.1 to 6.3.6 and 2.10.3を参照されたい）。
抗体の定常ドメインは、特に、必要となる可能性があるエフェクター機能に関して抗体の提示される機能に関して選択してもよい。いくつかの態様において、抗体の定常ドメインは、ヒトIgA、IgE、IgG、またはIgMドメインである。
本発明の方法において用いられる抗体には、改変された誘導体、すなわち抗体に任意のタイプの分子を共有的に付着させることによって改変された誘導体が含まれる。たとえば、限定するためではないが、抗体誘導体には、たとえばグリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質に対する連結等によって改変されている抗体が含まれる。多数の任意の化学改変を、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、チュニカマイシンの代謝的合成等が含まれるがこれらに限定されるわけではない公知の技術によって行ってもよい。さらに、誘導体は一つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
さらに、本発明の抗体は、当業者に周知の技術を用いて抗イディオタイプ抗体を生成するために利用することができる（たとえば、Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7:437-444；およびNissinoff, 1991, J. Immunol. 147:2429-2438を参照されたい）。本発明は、本発明の抗体、またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。
本発明は、ラクダ化単一ドメイン抗体が含まれる単一ドメイン抗体を包含する（たとえば、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられるMuyldermans et al., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230；Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253；Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25；国際公開番号WO 94/04678およびWO 94/25591；米国特許第6,005,079号を参照されたい）。一つの態様において、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように改変された二つのVHドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
本発明の方法はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、15日より長い、好ましくは20日より長い、25日より長い、30日より長い、35日より長い、40日より長い、45日より長い、2ヶ月より長い、3ヶ月より長い、4ヶ月より長い、または5ヶ月より長い半減期（たとえば、血清半減期）を有する抗体またはその断片を用いることを包含する。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明の抗体またはその断片の半減期の増加によって、哺乳動物における該抗体または抗体断片のより高い血清力価が得られ、このように、抗体または抗体断片の投与回数が低減して、および／または投与される抗体または抗体断片の濃度が低減する。インビボ半減期が増加した抗体またはその断片は、当業者に公知の技術によって生成することができる。たとえば、インビボ半減期が増加した抗体またはその断片は、FcドメインとFcRn受容体とのあいだの相互作用に関係すると同定されたアミノ酸残基を改変（たとえば、置換、欠失、または付加）することによって生成されうる。本発明の抗体は、Ward et al.において記述される方法（米国特許第6,277,375号 B1を参照されたい）によって操作されてもよい。たとえば、本発明の抗体は、インビボまたは血清半減期が増加するようにFcヒンジドメインにおいて操作されてもよい。
インビボ半減期が増加した抗体またはその断片は、高分子量ポリエチレングリコール（PEG）などのポリマー分子を該抗体または抗体断片に付着させることによって生成されうる。PEGは、抗体または抗体断片のN末端もしくはC末端に対するPEGの部位特異的結合を通して、またはリジン残基上に存在するεアミノ基を通して、多機能リンカーによってまたはリンカーを用いずに抗体または抗体断片に付着させることができる。生物活性の損失が最少である直鎖状または分岐状ポリマー誘導体が用いられるであろう。結合の程度は、抗体にPEG分子が確実に適切に結合するように、SDS-PAGEおよび質量分析によって厳密にモニターされるであろう。非反応PEGは、抗体-PEG複合体からたとえばサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって分離することができる。
本発明の抗体は、実質的に免疫原性反応を引き起こすことなく哺乳動物の循環系に注入することができる組成物を提供するために、Davis et al.（米国特許第4,179,337号を参照されたい）によって記述される方法およびカップリング剤によって改変されてもよい。
本発明はまた、フレームワーク領域またはCDR領域において変異（たとえば、一つまたは複数のアミノ酸置換）を有する本発明の抗体の任意のアミノ酸配列を含む抗体または抗体断片を用いることを包含する。好ましくは、これらの抗体における変異は、免疫特異的に結合するFcγRIIBに対する抗体のアビディティおよび／または親和性を維持または増強する。当業者に公知の標準的な技術（たとえばイムノアッセイ）を用いて、特定の抗原に関する抗体の親和性をアッセイすることができる。
本発明はさらに、本明細書において開示される方法、または当技術分野において公知の方法を用いて抗体の糖質含有量を改変する段階を含む、本発明の抗体のエフェクター機能を改変する方法を包含する。
たとえば、アミノ酸置換を起こす、部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発が含まれる、当業者に公知の標準的な技術を用いて、抗体または抗体断片をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。好ましくは、誘導体には、当初の抗体またはその断片と比較してアミノ酸15個未満の置換、アミノ酸10個未満の置換、アミノ酸5個未満の置換、アミノ酸4個未満の置換、アミノ酸3個未満の置換、またはアミノ酸2個未満の置換が含まれる。好ましい態様において、誘導体は、一つまたは複数の予想される非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換を有する。
ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイが含まれる何らかの用途に関して、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体を用いることが好ましいであろう。完全なヒト抗体は、ヒト被験者の治療的処置にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを用いて先に記述したファージディスプレイ法が含まれる当技術分野において公知の多様な方法によって作製することができる。同様に、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；ならびに国際公開番号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741を参照されたい。
5.1.1 ヒト化抗体
好ましい態様において、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、既定の抗原に結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と、非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRとを含む、抗体、変種、またはその断片である。ヒト化FcγRIIB特異的抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）の領域に対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である、少なくとも一つ、典型的に二つの可変ドメインの実質的に全てを含んでもよい。好ましくは、本発明のヒト化抗体はまた、典型的にヒト免疫グロブリンの一部である免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部を含む。本発明のヒト化抗体の定常ドメインは、抗体の提示される機能、特に、必要とされる可能性があるエフェクター機能に関して、選択してもよい。いくつかの態様において、本発明のヒト化抗体の定常ドメインは、ヒトIgA、IgE、IgG、またはIgMドメインである。特定の態様において、本発明のヒト化抗体が治療的使用のために意図され、かつ抗体エフェクター機能が必要である場合、ヒトIgG定常ドメイン、特にIgG1およびIgG3アイソタイプの定常ドメインが用いられる。別の態様において、IgG2およびIgG4アイソタイプは、本発明のヒト化抗体が治療目的であることを意図されるが、抗体エフェクター機能が必要ではない場合に用いられる。ヒト化FcγRIIB特異的抗体は、2004年5月10日および2004年6月21日にそれぞれ提出された米国特許仮出願第60/569,882号および第60/582,043号において、ならびに2005年5月10日に提出された米国特許出願第11/126,978号において開示されている。
いくつかの態様において、抗体は、軽鎖および重鎖の少なくとも可変ドメインの双方を含有する。他の態様において、抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCD4領域の一つまたは複数をさらに含んでもよい。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEが含まれる免疫グロブリンの任意のクラス、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4が含まれる任意のアイソタイプから選択されうる。いくつかの態様において、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞障害活性を示すことが望ましい場合には補体結合性定常ドメインであり、クラスは典型的にIgG1である。他の態様において、そのような細胞障害性が望ましくない場合、定常ドメインはIgG2クラスのドメインであってもよい。ヒト化抗体は、一つより多いクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含んでもよく、所望のエフェクター機能を最適にするために特定の定常ドメインを選択することは、当技術分野の通常の技能の範囲内である。
ヒト化抗体のフレームワーク領域およびCDR領域は、親配列に対して正確に対応する必要はなく、たとえばドナーCDRまたはコンセンサスフレームワークは、その部位でのCDRまたはフレームワーク残基がコンセンサス抗体またはドナー抗体のいずれかに対応しないように、少なくとも1残基の置換、挿入、または欠失によって変異してもよい。しかし、そのような変異は好ましくは広範囲ではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75％、よりしばしば90％、最も好ましくは95％より多くが親フレームワーク領域（FR）およびCDR配列のそれに対応する。ヒト化抗体は、以下が含まれるがこれらに限定されるわけではない当技術分野において公知の多様な技術を用いて産生することができる：CDRグラフティング（欧州特許番号EP 239,400；国際公開番号WO 91/09967；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号）、ベニヤリング（veneering）または表面再形成（欧州特許番号EP 592,106およびEP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814；およびRoguska et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973）、チェーンシャッフリング（chain shuffling）（米国特許第5,565,332号）、ならびにたとえば米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、第5,585,089号、国際公開番号WO 9317105、
Figure 0005764290
において開示される技術。しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変更させるため、好ましくは改善するために、CDRドナー抗体からの対応する残基によって置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法によって、たとえば抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためにCDRとフレームワーク残基との相互作用をモデリングすることによって、および特定の位置で異常なフレームワーク残基を同定するために配列比較によって同定される（たとえば、その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Queen et al., 米国特許第5,585,089号；米国特許出願第2004/0049014号および第2003/0229208号；米国特許第6,350,861号；第6,180,370号；第5,693,762号；第5,693,761号；第5,585,089号；および第5,530,101号、ならびにRiechmann et al., 1988, Nature 332:323を参照されたい）。
本発明は、ヒト抗体（レシピエント抗体）の重鎖および／または軽鎖可変領域の一つまたは複数のCDRの一つまたは複数の領域が、FcγRIIAより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合するドナーモノクローナル抗体、たとえばATCCアクセッション番号PTA-7610をそれぞれ有するクローン8B5.3.4によって産生されたモノクローナル抗体の一つまたは複数のCDRの類似の部分によって置換されている、FcγRIIBに対して特異的なヒト化抗体分子を用いることを提供する。他の態様において、ヒト化抗体は、8B5.3.4と同じエピトープに結合する。最も好ましい態様において、ヒト化抗体は、ドナーマウス抗体と同じエピトープに特異的に結合する。本発明が抗体のCDRグラフティング全般を包含することは、当業者によって認識されるであろう。このように、ドナー抗体およびアクセプター抗体は、同じ種の動物、同じ抗体クラスまたはサブクラスにさえ由来してもよい。しかし、より通常には、ドナー抗体およびアクセプター抗体は、異なる種の動物に由来する。典型的に、ドナー抗体は齧歯類MAbなどの非ヒト抗体であり、アクセプター抗体はヒト抗体である。
いくつかの態様において、ドナー抗体からの少なくとも一つのCDRがヒト抗体に移植される。他の態様において、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のそれぞれの少なくとも二つ、好ましくは三つ全てのCDRがヒト抗体に移植される。CDRはKabat CDR、構造ループCDR、またはその組み合わせを含んでもよい。いくつかの態様において、本発明は、少なくとも一つのCDR移植重鎖および少なくとも一つのCDR移植軽鎖を含むヒト化FcγRIIB抗体を包含する。
好ましい態様において、ヒト化FcγRIIB特異的抗体のCDR領域は、FcγRIIBに対して特異的なマウス抗体に由来する。いくつかの態様において、本明細書において記述されるヒト化抗体は、アクセプター抗体、すなわちドナーモノクローナル抗体の結合特異性を保持するために必要であるヒトの重鎖および／または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域の、アミノ酸欠失、挿入、改変が含まれるがこれらに限定されるわけではない変更を含む。いくつかの態様において、本明細書において記述されるヒト化抗体のフレームワーク領域は、必ずしも天然に存在するヒト抗体可変領域のフレームワーク領域の正確なアミノ酸配列からなる必要はなく、ヒト化抗体の特性を変更させる、たとえばマウスFcγRIIB特異的抗体と同じ標的に対して特異的であるヒト化抗体の結合特性を改善するアミノ酸欠失、挿入、改変が含まれるがこれらに限定されるわけではない様々な変更を含有する。最も好ましい態様において、非ヒトフレームワーク残基の大規模導入を回避するために、およびヒトにおけるヒト化抗体の最小の免疫原性を確保するために、フレームワーク領域に少数の変更を行う。ドナーモノクローナル抗体は、好ましくは、FcγRIIBに結合するクローン8B5.3.4（ATCCアクセッション番号PTA-7610を有する）によって産生されたモノクローナル抗体である。
特定の態様において、本発明は、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合するCDR移植抗体を用いることを包含し、ここで、CDR移植抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合するドナーモノクローナル抗体、たとえばクローン8B5.3.4から産生されたモノクローナル抗体からの残基とを含む重鎖可変領域ドメインを含む。もう一つの特定の態様において、本発明は、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合するCDR移植抗体を用いることを包含し、ここで、CDR移植抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、FcγRIIAに結合するより大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合するドナーモノクローナル抗体、たとえばクローン8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11、または1F2から産生されたモノクローナル抗体からの残基とを含む軽鎖可変領域ドメインを含む。
好ましくは、ヒト化抗体は、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに結合する。本発明のヒト化抗FcγRIIB抗体は、CDRl（SEQ ID NO: 8）および／もしくはCDR2（SEQ ID NO: 9）および／もしくはCDR3（SEQ ID NO: 10）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに／またはCDRl（SEQ ID NO: 5）および／もしくはCDR2（SEQ ID NO: 6）および／もしくはCDR3（SEQ ID NO: 7）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有してもよい。
特定の態様において、本発明は、B細胞悪性疾患、または一つもしくは複数のその症状の予防、処置、管理、または改善において8B5.3.4抗体のCDRを含むヒト化抗体を用いることを包含する。特に、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する抗体が、B細胞悪性疾患、または一つもしくは複数のその症状の予防、処置、管理、または改善において用いられる。なおもう一つの好ましい態様において、ヒト化抗体はさらに、Fc活性化受容体、たとえばFcγIIIA、FcγIIIB等に結合しない。
一つの特定の態様において、VH領域が、ヒト生殖系列VHセグメントVH1-18（Matsuda et al., 1998, J. Exp. Med. 188:2151062）およびJH6（Ravetch et al., 1981, Cell 27(3 Pt. 2): 583-91）由来のFRセグメント、ならびにSED ID NO: 8、SED ID NO: 9、またはSED ID NO: 10のアミノ酸配列を有する8B5.3.4抗体の一つまたは複数のVH CDR領域からなる、ヒト化8B5.3.4抗体が提供される。もう一つの特定の態様において、ヒト化8B5.3.4抗体はさらに、ヒト生殖系列VLセグメントVK-A26（Lautner-Rieske et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 1023-1029）およびJK4（Hieter et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-22）のFRセグメント、ならびにSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、またはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する8B5.3.4抗体の一つまたは複数のVL CDR領域からなるVL領域を含む。
特に、以下の組み合わせのいずれかである、8B5.3.4抗体のCDR配列を含む（または以下からなる）、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに免疫特異的に結合するヒト化抗体が提供される：VH CDRlおよびVL CDRl；VH CDRlおよびVL CDR2；VH CDRlおよびVL CDR3；VH CDR2およびVL CDRl；VH CDR2およびVL CDR2；VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR3およびVH CDRl；VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR3およびVL CDR3；VHl CDRl、VH CDR2およびVL CDRl；VH CDRl、VH CDR2およびVL CDR2；VH CDRl、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3およびVL CDRl、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDRl、VL CDRlおよびVL CDR2；VH CDRl、VL CDRlおよびVL CDR3；VH CDR2、VL CDRlおよびVL CDR2；VH CDR2、VL CDRlおよびVL CDR3；VH CDR3、VL CDRlおよびVL CDR2；VH CDR3、VL CDRlおよびVL CDR3；VH CDRl、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDRl；VH CDRl、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2；VH CDRl、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3；VH CDRl、VH CDR2、VL CDRlおよびVL CDR2；VH CDRl、VH CDR2、VL CDRlおよびVL CDR3；VH CDRl、VH CDR3、VL CDRlおよびVL CDR2；VH CDRl、VH CDR3、VL CDRlおよびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDRlおよびVL CDR2；VH CDR2、VH CDR3、VL CDRlおよびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3；VH CDRl、VH CDR2、VH CDR3、VL CDRlおよびVL CDR2；VH CDRl、VH CDR2、VH CDR3、VL CDRlおよびVL CDR3；VH CDRl、VH CDR2、VL CDRl、VL CDR2、およびVL CDR3；VH CDRl、VH CDR3、VL CDRl、VL CDR2、およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDRl、VL CDR2、およびVL CDR3；または本明細書において開示されるVH CDRおよびVL CDRのその任意の組み合わせ。
5.1.2 ヒト抗体
ヒト抗体はまた、機能的な内因性の免疫グロブリンを発現することができないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて、産生することができる。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、マウス胚幹細胞に、無作為にまたは相同的組換えによって導入してもよい。または、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子のほかにマウス胚幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同的組換えによるヒト免疫グロブリンの導入によって、個々にまたは同時に非機能的にしてもよい。特に、JH領域のホモ接合欠失は、内因性の抗体産生を防止する。改変された胚幹細胞を増殖させて、胚盤胞にマイクロインジェクションしてキメラマウスを産生する。次に、該キメラマウスを成長させて、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を産生する。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、たとえば本発明のポリペプチドの全てまたは一部により従来の方法を用いて免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の際に再配列して、その後クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。このように、こうした技術を用いて、治療的に有用なIgG、IgA、IgM、およびIgE抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術に関する総論に関しては、Lonberg and Huszar（1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術の詳細な考察、およびそのような抗体を産生するためのプロトコールに関しては、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開番号WO 98/24893、WO 96/34096、およびWO 96/33735；ならびに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、および第5,939,598号を参照されたい。さらに、Abgenix, Inc.（Freemont, CA）およびMedarex（Princeton, NJ）などの企業が、先に記述した技術と類似の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事している。
5.1.3 キメラ抗体
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、非ヒト抗体およびヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有する抗体などの、異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。本発明は、ATCCアクセッション番号PTA-7610、PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959をそれぞれ有するハイブリドーマクローン8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2から産生された抗体に由来するキメラ抗体を提供する。キメラ抗体を産生する方法は、当技術分野において公知である。たとえば、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Morrison, 1985, Science 229: 1202；Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214；Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202；および米国特許第6,311,415号、第5,807,715号、第4,816,567号、および第4,816,397号を参照されたい。非ヒト種からの一つまたは複数のCDRと、ヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域とを含むキメラ抗体は、たとえば、CDRグラフティング（EP 239,400；国際公開番号WO 91/09967；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号）、ベニヤリングまたは表面再形成（EP 592,106；EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805；およびRoguska et al., 1994, PNAS 91:969）、ならびにチェーンシャッフリング（米国特許第5,565,332号）が含まれる当技術分野において公知の多様な技術を用いて産生することができる。上記の参考文献のそれぞれは、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる。
しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変更させる、好ましくは改善するために、CDRドナー抗体からの対応する残基に置換されると考えられる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法によって、たとえば、抗原結合にとって重要であるフレームワーク残基を同定するために、CDRとフレームワーク残基との相互作用をモデリングすることによって、および特定の位置で通常でないフレームワーク残基を同定するために配列比較によって同定される（たとえば、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,585,089号；およびRiechmann et al., 1988, Nature 332:323を参照されたい）。
5.1.4 Fc領域の改変
本発明は、その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第2005/0037000号および第2005/0064514号；米国特許第5,624,821号および第5,648,260号、ならびに欧州特許番号EP 0 307 434において開示されるような抗体エフェクター機能を変更する一つまたは複数のアミノ酸改変を含むFc定常ドメインを有する抗体を包含する。これらの抗体は、アミノ酸改変を有しない比較可能な抗体と比較して、改善されたADCC活性（すなわち、2倍、10倍、100倍、500倍等）を示してもよい。
本発明は、一つまたは複数のFcγRに対する抗体の結合親和性を改変する、好ましくはFc領域における改変を含む抗体を包含する。一つまたは複数のFcγRに対する結合が改変された抗体を改変するための方法は、当技術分野において公知であり、たとえば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開番号WO 04/029207、WO 04/029092、WO 04/028564、WO 99/58572、WO 99/51642、WO 98/23289、WO 89/07142、WO 88/07089、ならびに米国特許第5,843,597号および第5,642,821号を参照されたい。いくつかの態様において、本発明は、活性化FcγR、たとえばFcγRIIIAに対して変更された親和性を有する抗体を包含する。好ましくは、そのような改変はまた、変更されたFc媒介エフェクター機能を有する。Fc媒介エフェクター機能に影響を及ぼす改変は当技術分野において公知である（その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,194,551号を参照されたい）。本発明の方法に従って改変することができるアミノ酸には、プロリン329、プロリン331、およびリジン322が含まれるがこれらに限定されるわけではない。プロリン329、プロリン331、およびリジン322は、好ましくはアラニンに置換されるが、他の任意のアミノ酸との置換が企図される。その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開番号WO 00/42072および米国特許第6,194,551号を参照されたい。
一つの特定の態様において、Fc領域の改変は、Fc領域における一つまたは複数の変異を含む。Fc領域における一つまたは複数の変異によって、変更された抗体媒介性エフェクター機能、他のFc受容体（たとえば、Fc活性化受容体）に対して変更された結合、変更されたADCC活性、または変更されたC1q結合活性、変更された補体依存的細胞障害活性、またはその任意の組み合わせを有する抗体が得られる可能性がある。
いくつかの態様において、本発明は、以下の位置の一つまたは複数でアミノ酸改変を有する変種Fc領域を含む分子を包含する：
Figure 0005764290
。
好ましくは、Fc部分の操作によって、腫瘍細胞の細胞媒介性殺細胞および／または補体媒介性殺細胞の増加が起こる。
本発明は、以下の表2において記載される変異からなる、または変異のいずれかを含む変種Fc領域を含む分子を包含する。
（表２）例示的な変異
Figure 0005764290
Figure 0005764290
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なお他の態様において、本発明は、二つより多いアミノ酸改変を有する変種Fc領域を含む分子を包含する。そのような変種の非限定的な例を以下の表（表3）に記載する。本発明は、本明細書において開示されるような一つまたは複数のアミノ酸改変をさらに含む、表3において記載される変異を包含する。
（表３）例示的な組み合わせ変種
Figure 0005764290
Figure 0005764290
Figure 0005764290
最も好ましい態様において、本発明の抗FcγRIIB抗体は、活性化受容体および／または阻害性受容体に対して変更された親和性を有する改変Fc領域を有し、Fcドメインは一つまたは複数のアミノ酸改変を有し、一つまたは複数のアミノ酸改変は、288位でアスパラギンへの置換、330位でセリンへのおよび396位でロイシンへの置換（MgFc10）（表2および3を参照されたい）；334位でグルタミン酸への置換、359位でアスパラギンへの置換、および366位でセリンへの置換（MgFc13）；316位でアスパラギン酸への置換、378位でバリンへの置換、および399位でグルタミン酸への置換（MgFc27）；392位でトレオニンへの置換、および396位でロイシンへの置換（MgFc38）；221位でグルタミン酸への置換、270位でグルタミン酸への置換、308位でアラニンへの置換、311位でヒスチジンへの置換、396位でロイシンへの置換、および402位でアスパラギン酸への置換（MgFc42）；240位でアラニンへの置換、および396位でロイシンへの置換（MgFc52）；410位でヒスチジンへの置換、および396位でロイシンへの置換（MgFc53）；243位でロイシンへの置換、305位でイソロイシンへの置換、378位でアスパラギン酸への置換、404位でセリンへの置換、および396位でロイシンへの置換（MgFc54）；255位でロイシンへの置換、および396位でロイシンへの置換（MgFc55）；370位でグルタミン酸への置換および396位でロイシンへの置換（MgFc59）；243位でロイシンへの置換、292位でプロリンへの置換、300位でロイシンへの置換、305位でイソロイシンへの置換、および396位でロイシンへの置換（MgFc88）；243位でロイシンへの置換、292位でプロリンへの置換、300位でロイシンへの置換、および396位でロイシンへの置換（MgFc88A）；または243位でロイシンへの置換、292位でプロリンへの置換、および300位でロイシンへの置換（MgFcl55）を有する。（同様に、参照により本明細書に組み入れられる、2004年7月28日に提出されたStavenhagen et al.に対する米国特許出願第2005/0064514 Al号の表2、3A、および3Bを参照されたい）。
好ましい態様において、8B5.3.4抗体などの抗FcγRIIB抗体は243位でロイシン、292位でプロリン、300位でロイシン、305位でイソロイシン、および396位でロイシンを有する改変Fc領域を有する。
特定の態様において、変種Fc領域は、247位でロイシン、421位でリジン、および270位でグルタミン酸（MgFc31/60）；392位でトレオニン、396位でロイシン、および270位でグルタミン酸（MgFc38/60）；392位でトレオニン、396位でロイシン、270位でグルタミン酸、および243位でロイシン（MgFc38/60/F243L）；419位でヒスチジン、396位でロイシン、および270位でグルタミン酸（MGFc51/60）；419位でヒスチジン、396位でロイシン、270位でグルタミン酸、および243位でロイシン（MGFc51/60/F243L）；255位でリジン、396位でロイシン、および270位でグルタミン酸（MGFc55/60）；255位でリジン、396位でロイシン、270位でグルタミン酸、および300位でリジン（MGFc55/60/Y300L）；255位でリジン、396位でロイシン、270位でグルタミン酸、および243位でロイシン（MgFc55/60/F243L）；370位でグルタミン酸、396位でロイシン、および270位でグルタミン酸（MGFc59/60）；270位でグルタミン酸、316位でアスパラギン酸、および416位でグリシン（MgFc71）；243位でロイシン、292位でプロリン、305位でイソロイシン、および396位でロイシン（MGFc74/P396L）；297位でグルタミン、または個々の置換の任意の組み合わせを有する。
5.1.5 糖質の改変
本発明はまた、変更されたオリゴ糖含有量を有する抗体を提供する。本明細書において用いられるオリゴ糖は、二つまたはそれより多い単純な糖を含有する糖質であり、二つの用語は本明細書において互換的に用いられる可能性がある。本発明の糖質部分は、当技術分野において一般的に用いられる命名法を参照して記述されるであろう。糖質化学の概説に関しては、たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Hubbard et al., 1981 Ann. Rev. Biochem., 50:555-583を参照されたい。この命名法には、たとえばマンノースを表すMan；2-N-アセチルグルコサミンを表すGlcNAc；ガラクトースを表すGal；フコースを表すFuc；およびグルコースを表すGlcが含まれる。シアル酸は、5-N-アセチルノイラミン酸に関して簡易表記NeuNAcによって、および5-グリコールノイラミン酸に関してNeuNGcによって記述される。
一般的に、抗体は、重鎖の定常領域における保存された位置で糖質部分を含有し、ヒトIgGの30％までがグリコシル化Fab領域を有する。IgGはCH2ドメインに存在するAsn 297において一つのN-連結二分岐糖質構造を有する（Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163: 59-76；Wright et al., 1997, Trends Biotech 15: 26-32）。ヒトIgGは典型的に、以下の構造；GlcNAc(フコース)-GlcNAc-Man-(ManGlcNAc)2の糖質を有する。しかし、機能の変更に至る、IgGにおける糖質含有量の変動は実際に起こる。たとえば
Figure 0005764290
を参照されたい。本発明は、Asn 297に付着する糖質部分において変動を含む抗体を含有する。一つの態様において、糖質部分は、末端のGlcNAcおよび／または第三のGlcNacアーム（二分しているGlcNAc）の一つまたは双方でガラクトースおよび／またはガラクトース-シアル酸を有する。
いくつかの態様において、本発明の抗体は、一つまたは複数の選択された糖基、たとえば一つまたは複数のシアル酸残基、一つまたは複数のガラクトース残基、一つまたは複数のフコース残基を実質的に含まない。一つまたは複数の選択された糖基を実質的に含まない抗体は、たとえば、組成物における抗体の約90〜100％が糖質部分に付着した選択糖基を欠損するように、抗体の糖質部分に対する選択糖基の付加が欠損している宿主細胞において、本発明の抗体を組換えによって産生する段階が含まれる、当業者に公知の一般的な方法を用いて調製してもよい。そのような抗体を調製するためのもう一つの方法には、たとえば一つもしくは複数の選択糖基の付加を防止もしくは低減させる条件で細胞を培養する段階、または一つもしくは複数の選択糖基の翻訳後除去が含まれる。
特定の態様において、本発明は、組成物における抗体の約80〜100％がその糖質部分、たとえばAsn 297における糖質付着物においてフコースを欠損する、実質的に均一な抗体調製物を産生する方法を包含する。抗体は、たとえば（a）細胞内で発現するタンパク質のフコシル化能が低減するように、フコース代謝が欠損している操作された宿主細胞を用いる段階；（b）フコシル化を防止または低減させる条件で細胞を培養する段階；（c）たとえばフコシダーゼ酵素によるフコースの翻訳後除去；または（d）フコシル化されていない産物を選択するための抗体の精製、によって調製されてもよい。最も好ましくは、所望の抗体をコードする核酸は、その中で発現する抗体のフコシル化能が低減されている宿主細胞において発現する。好ましくは、宿主細胞は、抗体が実質的にフコシル化されないように改変されている、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、たとえばLec 13 CHO細胞（レクチン耐性CHO変異体細胞株；Ribka & Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12(1): 51-62；Ripka et al., 1986 Arch. Biochem. Biophys. 249(2): 533-45）、CHO-K1、DUX-B11、CHO-DP12、またはCHO-DG44である。このように、細胞は、酵素が細胞において減少した活性および／または低減された発現レベルを有するように、フコシルトランスフェラーゼ酵素、またはN-連結オリゴ糖へのフコースの付加に関係するもう一つの酵素もしくは物質に関して、変更された発現および／または活性を示してもよい。変更されたフコース含有量を有する抗体を産生する方法に関しては、その双方の全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、WO 03/035835およびShields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(30): 26733-40を参照されたい。
いくつかの態様において、変更された糖質改変は、以下の一つまたは複数を調節する：抗体の溶解性、細胞内輸送の促進および抗体の分泌、抗体アセンブリの促進、コンフォメーションの完全性、ならびに抗体媒介性エフェクター機能。特定の態様において、変更された糖質改変は、糖質改変を欠損する抗体と比較して抗体媒介性エフェクター機能を増強する。抗体媒介性エフェクター機能の変更に至る糖質改変は、当技術分野において周知である（たとえば、Shields R.L. et al., 2001, J. Biol. Chem. 277(30): 26733-40；Davies J. et al., 2001, Biotechnology & Bioengineering, 74(4): 288-294を参照されたい）。もう一つの特定の態様において、変更された糖質改変は、FcγRIIB受容体に対する本発明の抗体の結合を増強する。本発明の方法に従う糖質改変の変更には、たとえば抗体の糖質含有量を増加させる段階、または抗体の糖質含有量を減少させる段階が含まれる。糖質含有量を変更させる方法は、当業者に公知である。たとえばその全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、
Figure 0005764290
を参照されたい。
いくつかの態様において、本発明は、一つまたは複数の糖質部分が抗体に共有的に付着するように、一つまたは複数のグリコシル化部位を含む抗体を包含する。他の態様において、本発明は、前記で開示された改変および当業者に公知の改変などの、Fc領域において一つまたは複数のグリコシル化部位および一つまたは複数の改変を含む抗体を包含する。好ましい態様において、Fc領域における一つまたは複数の改変は、野生型Fc領域を含む抗体と比較して、活性化FcγR、たとえばFcγRIIIAに対する抗体の親和性を増強する。Fc領域において一つまたは複数のグリコシル化部位および／または一つまたは複数の改変を有する本発明の抗体は、増強された抗体媒介性エフェクター機能、たとえば増強されたADCC活性を有する。いくつかの態様において、本発明はさらに、241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299、および301位のアミノ酸が含まれるがこれらに限定されるわけではない、抗体の糖質部分と相互作用することが直接または間接的に知られているアミノ酸の一つまたは複数の改変を含む抗体を含む。抗体の糖質部分と直接または間接的に相互作用する抗体は、当技術分野において公知であり、たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44: 111-7を参照されたい。
本発明は、好ましくは、抗体の機能性、たとえばFcγRIIBに対する結合活性を変更させることなく、抗体の一つまたは複数の部位に一つまたは複数のグリコシル化部位を導入することによって改変されている抗体を包含する。グリコシル化部位を、本発明の抗体の可変および／または定常領域に導入してもよい。本明細書において用いられるように、「グリコシル化部位」には、それに対してオリゴ糖（すなわち、互いに連結した二つまたはそれより多い単純な糖を含有する糖質）が特異的かつ共有的に付着する抗体における任意の特異的アミノ酸配列が含まれる。オリゴ糖側鎖は典型的に、N-またはO-連結のいずれかによって抗体の骨格に連結する。N-連結グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖に対するオリゴ糖の付着を指す。O-連結グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、たとえばセリン、トレオニンに対するオリゴ糖部分の付着を指す。本発明の抗体は、N-連結およびO-連結グリコシル化部位が含まれる一つまたは複数のグリコシル化部位を含んでもよい。当技術分野において公知のN-連結またはO-連結グリコシル化のための任意のグリコシル化部位を、本発明に従って用いてもよい。本発明の方法に従って有用である例示的なN-連結グリコシル化部位は、Xが任意のアミノ酸であってもよく、Thr/Serがトレオニンまたはセリンを示す、アミノ酸配列Asn-X-Thr/Serである。そのような部位または複数の部位を、本発明が属する当技術分野において周知の方法を用いて本発明の抗体に導入してもよい。たとえば、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、"In vitro Mutagenesis," Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116を参照されたい。本発明の抗体にグリコシル化部位を導入するための例示的な方法は、以下の段階を含んでもよい：所望のAsn-X-The/Ser配列が得られるように、抗体のアミノ酸配列を改変または変異させる段階。
いくつかの態様において、本発明は、グリコシル化部位を付加または欠失させることによって、本発明の抗体の糖質部分を改変する方法を包含する。抗体の糖質含有量を改変する方法は、当技術分野において周知であり、本発明内に包含される。たとえばその全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,218,149号；EP 0 359 096 Bl；米国特許出願第2002/0028486号；WO 03/035835；米国特許出願第2003/0115614号；米国特許第6,218,149号；米国特許第6,472,511号を参照されたい。他の態様において、本発明は、抗体の一つまたは複数の内因性の糖質部分を欠失させることによって、本発明の抗体の糖質部分を改変する方法を包含する。
いくつかの特定の態様において、本発明は、50位でのグリコシル化部位が排除されるように、CDR2領域のN-グリコシル化コンセンサス部位であるAsn50-Val-Serが改変されている、改変FvγRIIB抗体を用いることを包含する。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、グリコシル化部位の除去は、抗体の産生における起こりうる変動および薬学的応用における起こりうる免疫原性を制限する可能性がある。特定の態様において、本発明は、50位のアミノ酸が改変されている、たとえば欠失または置換されている、ヒト化FcγRIIB抗体の使用を包含する。もう一つの特定の態様において、本発明はさらに、51位でアミノ酸改変、たとえば欠失または置換を有する抗体の使用を包含する。一つの特定の態様において、本発明は、50位のアミノ酸がチロシンに置換されているヒト化FcγRIIB抗体の使用を包含する。もう一つのより特定の態様において、本発明は、50位のアミノ酸がチロシンに置換され、51位のアミノ酸がアラニンに置換されているFcγRIIB抗体の使用を包含する。
5.1.6 FcγRIIBアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明の方法および組成物においてFcγRIIB特異的抗体、その類似体、誘導体、または抗原結合断片を用いることのほかに、他のFcγRIIBアゴニストおよびアンタゴニストを本発明の方法に従って用いてもよい。FcγRIIBアゴニストおよびアンタゴニストには、免疫細胞、好ましくはB細胞によって発現するFcγRIIBポリペプチドの機能、活性、および／または発現を遮断、阻害、低減、または中和する、タンパク質様物質（たとえば、タンパク質、ポリペプチド（たとえば、可溶性FcγRIIBポリペプチド）、ペプチド、融合タンパク質（たとえば、治療部分に結合した可溶性FcγRIIBポリペプチド）、核酸分子（たとえば、FcγRIIBアンチセンス核酸分子、三重らせん、RNAiを媒介するdsRNA、タンパク質様分子をコードする核酸分子））、有機分子、無機分子、有機低分子、薬物、および無機低分子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の方法に従って用いられるFcγRIIBアゴニストまたはアンタゴニストは、有機低分子、薬物、またはアンチセンス分子ではない。FcγRIIBアゴニストおよびアンタゴニストは、当技術分野において周知の技術、または本明細書において記述される技術を用いて同定することができる。
本発明の予防および治療化合物には、ペプチド、ポリペプチド、翻訳後改変タンパク質が含まれるタンパク質、抗体等が含まれるがこれらに限定されるわけではないタンパク質様分子；低分子（1000ダルトン未満）、無機または有機化合物；二本鎖または一本鎖DNA、二本鎖または一本鎖RNAおよび三本鎖核酸分子が含まれるがこれらに限定されるわけではない核酸分子、が含まれるがこれらに限定されるわけではない。予防および治療化合物は、任意の公知の生物（動物、植物、細菌、真菌、および原生生物またはウイルスが含まれるがこれらに限定されるわけではない）または合成分子のライブラリに由来しうる。
一定の態様において、FcγRIIBアンタゴニストは、B細胞悪性疾患を有する被験者においてFcγRIIBポリペプチドの機能、活性、および／または発現を低減させる。他の態様において、FcγRIIBアンタゴニストは、FcγRIIBポリペプチドに直接結合して、Bリンパ球の活性および／または機能を直接または間接的に調節する。特定の態様において、FcγRIIBアンタゴニストは、本明細書において記述される、または当業者に周知である標準的なインビボおよび／またはインビトロアッセイによって決定した場合に、B細胞悪性疾患を有する被験者においてB細胞増殖を阻害または低減する。特定の態様において、FcγRIIBアンタゴニストは、本明細書において記述される、または当業者に周知である標準的なインビボおよび／またはインビトロアッセイによって決定した場合に、B細胞悪性疾患を有する被験者におけるリンパ球、特に末梢血B細胞の枯渇を媒介する。もう一つの態様において、FcγRIIBアンタゴニストは、抗体依存的細胞媒介性細胞障害性（ADCC）を利用することによってBリンパ球の活性および／または機能を直接または間接的に調節する。
好ましい態様において、FcγRIIBアンタゴニストとして利用されるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（抗体および融合タンパク質が含まれる）は、それらのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに対する免疫応答の可能性を低減させるために、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのレシピエントと同じ種に由来する。もう一つの好ましい態様において、被験者がヒトである場合、FcγRIIBアンタゴニストとして利用されるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、ヒトのものまたはヒト化したものである。
FcγRIIBアンタゴニストとして機能するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする核酸分子を、本発明の方法に従ってB細胞悪性疾患を有する被験者に投与することができる。さらに、FcγRIIBアンタゴニストとして機能するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの誘導体、類似体、断片、または変種をコードする核酸分子を、本発明の方法に従ってB細胞悪性疾患を有する被験者に投与することができる。好ましくは、そのような誘導体、類似体、変種、および断片は、完全長の野生型タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのFcγRIIBアンタゴニスト活性を保持する。
5.2 抗体複合体
本発明は、融合タンパク質を生成するために、異種ポリペプチド（すなわち、無関係なポリペプチド；またはその断片、好ましくはポリペプチドのアミノ酸少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100個）に組換えによって融合させた、または化学的に結合させた（共有結合または非共有結合の双方が含まれる）抗体を包含する。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を通して起こってもよい。抗体は、たとえば特定の細胞表面受容体に対して特異的な抗体に、抗体を融合または結合させることによって、インビトロまたはインビボのいずれかで、特定の細胞タイプに異種ポリペプチドを標的化するために用いられてもよい。異種ポリペプチドに融合または結合した抗体はまた、当技術分野において公知の方法を用いるインビトロイムノアッセイおよび精製法において用いられてもよい。たとえば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開番号WO 93/21232；EP 439,095；Naramura et al., 1994, Immunol. Lett., 39:91-99；米国特許第5,474,981号；Gillies et al., 1992, Proc Natl Acad Sci, 89:1428-1432；およびFell et al., 1991, J. Immunol., 146:2446-2452を参照されたい。
さらに抗体を、所定の生物学的反応を改変する治療物質または薬物部分に結合させてもよい。治療物質または薬物部分はまた、古典的な化学的治療物質に限定されると解釈されない。たとえば、薬物部分は、所望の生物活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質には、たとえばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素（すなわち、PE-40）、またはジフテリア毒素、リシン、ゲロニン、およびアメリカヤマゴボウの抗ウイルスタンパク質などの毒素、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン（IFN-α）、β-インターフェロン（IFN-β）が含まれるがこれらに限定されるわけではないインターフェロン、神経生長因子（NGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、アポトーシス物質（たとえばTNF-α、TNF-β、PCT公開番号WO 97/33899において開示されているAIM I）、AIM II（たとえば、PCT公開番号WO 97/34911を参照されたい）、Fasリガンド（Takahashi et al., 1994 J. Immunol, 6: 1567-1574）、およびVEGI（PCT公開番号WO 99/23105）、血栓剤もしくは抗血栓剤（たとえば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン）、またはたとえばリンフォカイン（たとえば、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、および顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」））、マクロファージコロニー刺激因子（「M-CSF」）、または増殖因子（たとえば成長ホルモン（「GH」）；プロテアーゼ、またはリボヌクレアーゼ）などの生物学的反応修飾剤などのタンパク質、が含まれてもよい。
抗体は、精製を促進するために、ペプチドなどのマーカー配列に融合させることができる。好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列は、その多くが市販されている、中でもpQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）において提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentz et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824において記述されるように、たとえば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製にとって有用な他のペプチドタグには、インフルエンザヘムアグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘムアグルチニン「HA」タグ（Wilson et al., 1984 Cell, 37:767）、および「flag」タグ（Knappik et al., 1994 Biotechniques, 17(4):754-761）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本発明にはさらに、抗体断片に融合または結合した異種ポリペプチドを含む組成物を用いることが含まれる。たとえば、異種ポリペプチドは、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、またはその一部に融合または結合させてもよい。抗体部分にポリペプチドを融合または結合させるための方法は当技術分野において公知である。たとえば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,112,946号；EP 307,434；EP 367,166；国際公開番号WO 96/04388およびWO 91/06570；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい（該参考文献は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。
さらなる融合タンパク質を、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソン-シャッフリング、および／またはコドン-シャッフリングの技術（集合的に「DNAシャッフリング」と呼ばれる）を通して生成してもよい。DNAシャッフリングは、本発明の抗体またはその断片の活性を変更させるために使用してもよい（たとえば、より高い親和性およびより低い解離定数を有する抗体またはその断片）。一般的に、米国特許第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,252号；および第5,837,458号、ならびに
Figure 0005764290
を参照されたい（これらの特許および刊行物はその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）。抗体もしくはその断片、またはコードされる抗体もしくはその断片は、組換えの前に、誤りがちなPCR、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダム変異誘発に供することによって変更させてもよい。その一部がFcγRIIBに特異的に結合する、抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドの一つまたは複数の部分を、一つまたは複数の異種分子の一つまたは複数の成分、モチーフ、区分、部分、ドメイン、断片等と組換えしてもよい。
本発明はまた、それに関する血清半減期を増加させることが望ましい、診断物質、治療物質、または他の任意の分子に結合させた抗体を包含する。抗体は、たとえば、所定の治療レジメンの効能を決定するために、臨床検査技法の一部として、たとえば疾患、障害、または感染症の発生または進行をモニターするために診断的に用いることができる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングさせることによって促進することができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射活性材料、陽電子射出金属、および非放射活性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質を、抗体に直接、または当技術分野において公知の技術を用いて中間体（たとえば当技術分野において公知のリンカーなど）を通して間接的にカップリングまたは結合させてもよい。たとえば、本発明に従う診断物質として用いるために抗体に結合させることができる金属イオンに関しては、米国特許第4,741,900号を参照されたい。そのような診断および検出は、様々な酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれるがこれらに限定されるわけではない酵素；ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンなどの、しかしこれらに限定されない補欠分子団複合体；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンなどの、しかしこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどの、しかしこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの、しかしこれらに限定されない生物発光材料；ビスマス（213Bi）、炭素（14C）、クロム（51Cr）、コバルト（57Co）、 フッ素（18F）、ガドリニウム（153Gd、159Gd）、ガリウム（68Ga、67Ga）、ゲルマニウム（68Ge）、ホルミウム（166Ho）、インジウム（115In、113In、112In、111In）、ヨウ素（131I、125I、123I、121I）、ランタニウム（140La）、ルテニウム（177Lu）、マンガン（54Mn）、モリブデン（99Mo）、パラジウム（103Pd）、リン（32P）、プラセオジミウム（142Pr）、プロメチウム（149Pm）、レニウム（186Re、188Re）、ロジウム（105Rh）、ルテニウム（97Ru）、サマリウム（153Sm）、スカンジウム（47Sc）、セレン（75Se）、ストロンチウム（85Sr）、イオウ（35S）、テクネチウム（99Tc）、タリウム（201Ti）、スズ（113Sn、117Sn）、トリチウム（3H）、キセノン（133Xe）、イッテルビウム（169Yb、175Yb）、イットリウム（90Y）、亜鉛（65Zn）などの、しかしこれらに限定されない放射活性材料；様々なポジトロンエミッショントモグラフィーを用いる陽電子射出金属、および非放射活性常磁性金属イオンが含まれるがこれらに限定されるわけではない検出可能な物質に、抗体をカップリングさせることによって、達成することができる。
抗体は、細胞毒（たとえば、細胞抑制または殺細胞物質）、治療物質、または放射活性元素（たとえば、αエミッター、γエミッター等）などの治療部分に結合させてもよい。細胞毒または細胞障害剤には、細胞に対して有害である任意の物質が含まれる。例には、パクリタキソール（paclitaxol）、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が含まれる。治療物質には、抗代謝剤（たとえば、メソトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（たとえば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、およびロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金（II）（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（たとえば、ダウノルビシン（これまでのダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（たとえば、ダクチノマイシン（これまでのアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアントラマイシン（AMC））、および抗分裂剤（たとえば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
その上、抗体は、放射金属イオン（放射活性材料の例に関しては上記を参照されたい）を結合させるために有用な放射活性材料または大環状キレート剤などの治療部分に結合させることができる。一定の態様において、大環状キレート剤は、リンカー分子によって抗体に付着させることができる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N''-四酢酸（DOTA）である。そのようなリンカー分子は、当技術分野において一般的に公知であり、それぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90；Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553；およびZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50において記述されている。
そのような治療部分を抗体に結合させるための技術は周知であり；たとえば
Figure 0005764290
を参照されたい。
治療部分を結合したまたは結合していない、単独でまたは細胞障害因子および／またはサイトカインと併用して投与される抗体またはその断片は、治療物質として用いることができる。
または、抗体は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,676,980号においてSegalによって記述されるように、抗体ヘテロ複合体を形成するために第二抗体に結合させることができる。
抗体はまた、固相支持体に付着してもよく、これはイムノアッセイまたは標的抗原の精製にとって特に有用である。そのような固相支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
5.3 本発明のモノクローナル抗体の調製および特徴付け
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術、またはその組み合わせを用いることが含まれる、当技術分野において公知の広範な技術を用いて調製することができる。たとえば、モノクローナル抗体は、当技術分野において公知であり、たとえばHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563- 681 (Elsevier, N. Y., 1981)（その双方の全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）において教示される技術が含まれるハイブリドーマ技術を用いて産生することができる。本明細書において用いられるように「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して産生された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンが含まれる単一クローンに由来する抗体を指し、それを産生する方法ではない。
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生する方法および該抗体に関してスクリーニングする方法は、慣例的であり当技術分野において周知である。非限定的な例において、関心対象の抗原、またはそのような抗原を発現する細胞によってマウスを免疫することができる。免疫応答が検出された後、たとえば抗原に対して特異的な抗体がマウス血清において検出された後、マウスの脾臓を採取して脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周知の技術によって、任意の適した骨髄腫細胞と融合させる。限界希釈によってハイブリドーマを選択してクローニングする。次に、ハイブリドーマクローンを、抗原に結合することができる抗体を分泌する細胞に関して、当技術分野において公知の方法によってアッセイする。陽性のハイブリドーマクローンをマウスの腹腔に接種することによって、一般的に高レベルの抗体を含有する腹水を生成することができる。
一つの特定の態様において、本発明は、以下の段階を含む、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するための方法を提供する：1匹または複数のFcγRIIAトランスジェニックマウス（U.S. 5,877,396およびU.S. 5,824,487を参照されたい）を、ヒトFcγRIIBの精製細胞外ドメイン、アミノ酸1〜180位によって免疫する段階；マウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞株を産生する段階；FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体を産生する一つまたは複数のハイブリドーマ細胞株に関してハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする段階。もう一つの特定の態様において、本発明は、さらに以下の段階を含む、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIB、特にヒトFcγRIIBに特異的に結合するFcγRIIBモノクローナル抗体を産生するための方法を提供する：1匹または複数のFcγRIIAトランスジェニックマウスを精製FcγRIIBまたはその免疫原性断片によって免疫する段階；免疫応答を誘発するために十分な回数、マウスを追加免疫する段階；1匹または複数のマウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞株を産生する段階；FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体を産生する一つまたは複数のハイブリドーマ細胞株に関してハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする段階。本発明の一つの態様において、マウスは、免疫応答を増強するために当技術分野において公知のアジュバントと混合されている精製FcγRIIBによって免疫される。本発明の方法において用いることができるアジュバントには、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、たとえば全細菌（BCG、コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota））および細胞壁骨格、ジミコール酸トレハロース、モノホスホリルリピッドA、結核菌のメタノール抽出可能な残渣（MER）、フロイントの完全または不完全アジュバントが含まれる細菌成分；ウイルスアジュバント；化学アジュバント、たとえば水酸化アルミニウム、ヨードアセテート、およびコレステリルヘミスクシネーター（hemisuccinateor）；裸のDNAアジュバントが含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明の方法において用いることができる他のアジュバントには以下が含まれる：コレラ毒素、パロポックス（paropox）タンパク質、MF-59（Chiron Corporation；同様に参照により本明細書に組み入れられる、Bieg et al., 1999, Autoimmunity, 31(1): 15-24を参照されたい）、MPL（登録商標）（Corixa Corporation；同様に、その全てが参照により本明細書に組み入れられるLodmell D.I. et al., 2000 Vaccine, 18: 1059-1066；Ulrich et al., 2000, Methods in Molecular Medicine, 273-282；Johnson et al., 1999, Journal of Medicinal Chemistry, 42: 4640-4649；Baldridge et al., 1999 Methods, 19: 103-107も参照されたい）、RC-529アジュバント（Corixa Corporation；Corixaのアミノアルキルグルコサミニド 4-ホスフェート（AGP）化学ライブラリのリード化合物；同様にwww.corixa.comを参照されたい）、およびDETOX（商標）アジュバント（Corixa Corporation；DETOX（商標）アジュバントには、MPL（登録商標）アジュバント（モノホスホリルリピッドA）およびミコバクテリア細胞壁骨格が含まれる；同様にその双方が参照により本明細書に組み入れられる、Eton et al., 1998, Clin. Cancer Res, 4(3):619-27；およびGubta R. et al., 1995, Vaccine, 13(14): 1263-76も参照されたい）。
特異的エピトープを認識する抗体断片を、公知の技術によって生成してもよい。たとえば、FabおよびF(ab')2断片を、パパイン（Fab断片を産生するため）、またはペプシン（F(ab')2断片を産生するため）などの酵素を用いた免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって産生してもよい。F(ab')2断片は、完全な軽鎖、および可変領域、CH1領域、および重鎖のヒンジ領域の少なくとも一部を含有する。
たとえば、抗体は、当技術分野において公知の様々なファージディスプレイ法を用いて生成することができる。ファージディスプレイ法において、機能的な抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面に表示される。特定の態様において、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（たとえば、ヒトまたはマウス）から発現したFabおよびFvまたはジスルフィド結合安定化Fvなどの抗原結合ドメインを表示するために利用することができる。関心対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原によって、たとえば標識抗原、または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕獲された抗原を用いて、選択または同定することができる。これらの方法において用いられるファージは典型的に、fdおよびM13が含まれる繊維状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに対する組換え融合タンパク質として発現する。本発明の免疫グロブリンまたはその断片を作製するために用いることができるファージディスプレイ法の例には、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、
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PCT出願PCT/GB91/01134；PCT公開番号WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；および米国特許第5,698,426号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5,750,753号；第5,821,047号；第5,571,698号；第5,427,908号；第5,516,637号；第5,780,225号；第5,658,727号；第5,733,743号；および第5,969,108号において開示される方法が含まれる。
上記の参考文献において記述されるように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離して、これを用いてヒト抗体が含まれる抗体全体、または他の任意の所望の断片を生成して、たとえば以下に詳細に記述されるように哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌が含まれる任意の所望の宿主において発現させることができる。たとえば、Fab、Fab'、およびF(ab')2断片を組換えによって産生する技術も同様に、PCT公開番号WO 92/22324；Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869, 1992；およびSawai et al., AJRI, 34:26-34, 1995；およびBetter et al., Science, 240:1041-1043, 1988（そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）において開示される方法など、当技術分野において公知の方法を用いて使用することができる。一本鎖Fvおよび抗体を産生するために用いることができる技術の例には、米国特許第4,946,778号および第5,258,498号；Huston et al., Methods in Enzymology, 203:46-88, 1991；Shu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90:7995-7999, 1993；およびSkerra et al., Science, 240: 1038-1040, 1988において記述される技術が含まれる。
ファージディスプレイ技術を用いて、FcγRIIBに対する本発明の抗体の親和性を増加させることができる。この技術は、本発明のコンビナトリアル法において用いられうる高親和性抗体を得るために有用であろう。アフィニティ成熟と呼ばれるこの技術は、初期抗体または親抗体と比較した場合に、抗原に対してより高い親和性で結合する抗体を同定するために、FcγRIIBまたはその抗原性断片を用いて変異誘発またはCDRウォーキング（CDR walking）、および再選択を使用する（たとえば、Glaser et al., 1992, J. Immunology 149:3903を参照されたい）。一つのヌクレオチドよりむしろコドン全体を変異誘発することによって、アミノ酸変異の半ランダムレパートリーが得られる。そのそれぞれが一つのCDRにおける1アミノ酸変更によって異なり、それぞれのCDR残基に関してそれぞれの起こりうるアミノ酸置換を表す変種を含有する、変種クローンのプールからなるライブラリを構築することができる。抗原に対する結合親和性が増加した変異体は、固定した変異体を標識抗原に接触させることによってスクリーニングすることができる。当技術分野において公知の任意のスクリーニング法（たとえば、ELISA）を用いて、抗原に対するアビディティが増加した変異体抗体を同定することができる（Wu et al., 1998, Proc Natl. Acad Sci. USA 95:6037；Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994を参照されたい）。軽鎖を無作為化するCDRウォーキングも同様に可能である（Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551を参照されたい）。
本発明の抗体はさらに、FcγRIIAと比較してFcγRIIBに対して最大の特異性を有する抗体が選択されるように、エピトープマッピングによって特徴を調べてもよい。抗体のエピトープマッピング法は、当技術分野において周知であり、本発明の方法に包含される。一定の態様において、FcγRIIBの一つまたは複数の領域を含む融合タンパク質を、本発明の抗体のエピトープをマッピングするために用いてもよい。特定の態様において、融合タンパク質は、ヒトIgG2のFc部分に融合したFcγRIIBの領域のアミノ酸配列を含有する。それぞれの融合タンパク質は、以下の表4において示されるように、受容体の中心領域と、相同受容体、たとえばFcγRIIAからの対応する領域とのアミノ酸置換および／または交換を含んでもよい。pMGX125およびpMGX132は、FcγRIIB受容体のIgG結合部位を含有し、前者はFcγRIIBのC末端を有し、後者はFcγRIIAのC末端を有し、したがってC末端結合を区別するために用いることができる。他方は、IgG結合部位またはFcγRIIAもしくはFcγIIB N末端のいずれかにおいてFcγIIA置換を有する。これらの分子は、抗体が結合する受容体分子の一部を決定するために役立ちうる。
（表４）モノクローナル抗FcγRIIB抗体のエピトープを調べるために用いられてもよい融合タンパク質のリスト。残基172〜180位はFcγRIIAおよびBのIgG結合部位に属する。FcγRIIA配列からの特異的アミノ酸を太字で示す。C末端配列APSSSはSEQ ID NO:11であり、C末端配列VPSMGSSSは、SEQ ID NO:12である。
Figure 0005764290
融合タンパク質は、本発明の抗FcγRIIB抗体に対する結合を決定するための任意の生化学アッセイ、たとえばELISAにおいて用いてもよい。他の態様において、特異的残基がFcγRIIA配列からの残基に交換されているペプチドを用いることによって、エピトープ特異性のさらなる確認を行ってもよい。
本発明の抗体は、FcγRIIBに対する抗体の相互作用を定量することが含まれる、FcγRIIBに対する抗体の相互作用を特徴付けするための当技術分野において公知の任意の免疫学的または生化学的に基づく方法を用いて、FcγRIIBに対する特異的結合に関して特徴を調べてもよい。FcγRIIBに対する本発明の抗体の特異的結合は、たとえばELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティクロマトグラフィー、および平衡透析が含まれるがこれらに限定されるわけではない免疫学または生化学に基づく方法を用いて決定してもよい。本発明の抗体の免疫特異的結合および交叉反応性を分析するために用いることができるイムノアッセイには、いくつかの例を挙げれば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体-固定アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの競合的および非競合的アッセイ系が含まれるがこれらに限定されるわけではない。そのようなアッセイは慣例的であり、当技術分野において周知である（たとえば、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい）。
本発明の抗体はまた、FcγRIIBと抗体との相互作用の反応速度パラメータを特徴付けするために当技術分野において公知の任意の表面プラズモン共鳴に基づくアッセイを用いてアッセイしてもよい。Biacore AB（Uppsala, Sweden）から入手可能なBIAcore機器；Affinity Sensors（Franklin, MA.）から入手可能なIAsys機器；Windsor Scientific Limited（Berks, UK）から入手可能なIBISシステム、Nippon Laser and Electronics Lab（Hokkaido, Japan）から入手可能なSPR-CELLIAシステム、およびTexas Instruments（Dallas, TX）から入手可能なSPR Detector Spreetaが含まれるがこれらに限定されるわけではない市販の任意のSPR機器を本発明において用いることができる。SPRに基づく技術の概説に関しては、その全てのその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91；Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23；Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101；Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61を参照されたい。さらに、米国特許第6,373,577号；第6,289,286号；第5,322,798号；第5,341,215号；第6,268,125号において記述されるタンパク質-タンパク質相互作用を測定するためのSPR機器およびSPRに基づく任意の方法が、本発明の方法において企図され、その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる。
簡単に説明すると、SPRに基づくアッセイは、表面上に結合対のメンバーを固定する段階、およびリアルタイムで溶液中の結合対の他のメンバーとのその相互作用をモニターする段階を伴う。SPRは、複合体形成または解離の際に起こる表面近傍での溶媒の屈折指数の変化を測定することに基づく。固定がその上に起こる表面はセンサーチップであり、これはSPR技術の心臓部であり；これは、金の薄層でコーティングされたガラス表面からなり、表面に対する分子の結合を最適にするように設計された広範囲の特殊な表面に関する基礎を形成する。多様なセンサーチップが、特に前記の企業から市販されており、その全てを本発明の方法において用いてもよい。センサーチップの例には、BIAcore AB, Incから入手可能なチップ、たとえばセンサーチップCM5、SA、NTA、およびHPAが含まれる。本発明の分子を、アミン基による直接共有カップリング、スルフヒドリル基による直接共有カップリング、アビジンコーティング表面に対するビオチンの付着、糖質基に対するアルデヒドカップリング、およびNTAチップによるヒスチジンタグを通しての付着が含まれるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の任意の固定法および化学を用いて、センサーチップの表面上に固定してもよい。
本発明の抗体の結合特異性は、ELISA、ウェスタンブロット、表面プラズモン共鳴（たとえば、BIAcore）、およびラジオイムノアッセイが含まれるがこれらに限定されるわけではない結合対相互作用を決定するために、当技術分野において公知の任意の方法によって評価してもよい。結合特異性を評価するために当技術分野において公知の任意の方法を用いて、BIAcoreアッセイによって決定した場合に、0.001 nMより大きいが5 nMより大きくない、10 nMより大きくない、15 nMより大きくない、20 nMより大きくない、25 nMより大きくない、30 nMより大きくない、35 nMより大きくない、40 nMより大きくない、45 nMより大きくない、または50 nMより大きくないKdを示す本発明の抗体を同定してもよい。
本発明はまた、関心対象の抗原に対して高い結合親和性を有する本発明の抗体またはその断片を提供する。特定の態様において、本発明の免疫特異的ポリペプチドまたはその断片は、解離定数またはkon率（抗体（Ab）＋抗原（Ag）Ab-Ag）が少なくとも105 M-1s-1、少なくとも5×105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5×106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5×107 M-1s-1、少なくとも108 M-1s-1を有する。好ましい態様において、本発明の抗体またはその断片は、少なくとも2×105 M-1s-1、少なくとも5×105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5×106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5×107 M-1s-1、少なくとも108 M-1s-1のkonを有する。
もう一つの態様において、本発明の抗体またはその断片は、親和性定数または、koff率（抗体（Ab）＋抗原（Ag）Ab-Ag）10-1 s-1未満、5×10-1 s-1未満、10-2 s-1未満、5×10-2 s-1未満、10-3 s-1未満、5×10-3 s-1未満、10-4 s-1未満、5×10-4 s-1未満、10-5 s-1未満、5×10-5 s-1未満、10-6 s-1未満、5×10-6 s-1未満、10-7 s-1未満、5×10-7 s-1未満、10-8 s-1未満、5×10-8 s-1未満、10-9 s-1未満、5×10-9 s-1未満、または10-10 s-1未満を有する。好ましい態様において、本発明の抗体またはその断片は、5×10-4 s-1未満、10-5 s-1未満、5×10-5 s-1未満、10-6 s-1未満、5×10-6 s-1未満、10-7 s-1未満、5×10-7 s-1未満、10-8 s-1未満、5×10-8 s-1未満、10-9 s-1未満、5×10-9 s-1未満、または10-10 s-1未満のkoffを有する。
なお他の態様において、本発明の抗体またはその断片は、親和性定数またはKa（kon/koff）少なくとも102 M-1、少なくとも5×102 M-1、少なくとも103 M-1、少なくとも5×103 M-1、少なくとも104 M-1、少なくとも5×104 M-1、少なくとも105 M-1、少なくとも5×105 M-1、少なくとも106 M-1、少なくとも5×106 M-1、少なくとも107 M-1、少なくとも5×107 M-1、少なくとも108 M-1、少なくとも5×108 M-1、少なくとも109 M-1、少なくとも5×109 M-1、少なくとも1010 M-1、少なくとも5×1010 M-1、少なくとも1011 M-1、少なくとも5×1011 M-1、少なくとも1012 M-1、少なくとも5×1012 M-1、少なくとも1013 M-1、少なくとも5×1013 M-1、少なくとも1014 M-1、少なくとも5×1014 M-1、少なくとも1015 M-1、少なくとも5×1015 M-1を有する。なおもう一つの態様において、本発明の抗体またはその断片は、解離定数またはKd（koff/kon）10-2 M未満、5×10-2 M未満、10-3 M未満、5×10-3 M未満、10-4 M未満、5×10-4 M未満、10-5 M未満、5×10-5 M未満、10-6 M未満、5×10-6 M未満、10-7 M未満、5×10-7 M未満、10-8 M未満、5×10-8 M未満、10-9 M未満、5×10-9 M未満、10-10 M未満、5×10-10 M未満、10-11 M未満、5×10-11 M未満、10-12 M未満、5×10-12 M未満、10-13 M未満、5×10-13 M未満、10-14 M未満、5×10-14 M未満、10-15 M未満、5×10-15 M未満を有する。
本発明は、本発明の抗体の機能、特にFcγRIIBシグナル伝達の調節能を同定するために、一定の特徴付けアッセイを用いた、本発明の方法によって産生された抗体の特徴付けを含む。たとえば、本発明の特徴付けアッセイは、FcγRIIBのITIMモチーフにおけるチロシン残基のリン酸化を測定することができる、またはB細胞受容体生成カルシウム動員の阻害を測定することができる。本発明の特徴付けアッセイは、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイでありうる。
肥満細胞においてFcγRIIBと高親和性IgE受容体、FcεRIとの共凝集によって抗原誘発脱顆粒、カルシウム動員、およびサイトカイン産生の阻害が起こることは十分に確立されている（Metcalfe D.D. et al. 1997, Physiol. Rev. 77:1033；Long E.O. 1999 Annu Rev. Immunol. 17: 875）。このシグナル伝達経路の分子詳細は最近解明されている（Ott V. L., 2002, J. Immunol. 162(9):4430-9）。FcεRIと共凝集すると、FcγRIIBは、そのITIMモチーフにおいてチロシン上で急速にリン酸化された後、SH2ドメイン含有イノシトールポリリン酸 5-ホスファターゼであるSrc Homology-2含有イノシトール-5-ホスファターゼ（SHIP）をリクルートし、次にこれがリン酸化されてShcおよびp62dok（p62dokは、アダプター分子ファミリーのプロトタイプであり、これにはアミノ末端プレックストリン相同性ドメイン（PHドメイン）、PTBドメイン、ならびにPXXPモチーフおよび多数のリン酸化部位を含有するカルボキシ末端領域などのシグナル伝達ドメインが含まれる（Carpino et al., 1997 Cell, 88: 197；Yamanshi et al., 1997, Cell, 88:205））と会合する。
本発明は、一つまたは複数のIgE媒介反応を調節するために本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けする段階を包含する。好ましくは、IgEに対する高親和性受容体と、FcγRIIBの低親和性受容体とを同時発現する細胞株は、IgE媒介反応の調節における本発明の抗FcγRIIB抗体の特徴付けのために用いられるであろう。特定の態様において、完全長のヒトFcγRIIBをトランスフェクトしたラット好塩基球白血病細胞株（RBL-H23；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられるBarsumian E.L. et al 1981 Eur. J. Immunol. 11:317）由来の細胞が、本発明の方法において用いられるであろう。RBL-2H3は、IgE媒介細胞活性化後のシグナル伝達機構を調べるために広く用いられている十分に特徴付けのなされたラット細胞株である。RBL-2H3細胞において発現してFcεRIと共凝集すると、FcγRIIBは、FcεRI誘導カルシウム動員、脱顆粒、およびサイトカイン産生を阻害する（Malbec et al., 1998, J. Immunol. 160: 1647；Daeron et al., 1995 J. Clin. Invest. 95:577；Ott et al., 2002 J. of Immunol. 168:4430-4439）。
いくつかの態様において、本発明は、FcεRI誘導肥満細胞活性化を阻害するために本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けする段階を包含する。たとえば、FcγRIIBをトランスフェクトしたラット好塩基球白血病細胞株（RBL-H23；Barsumian E.L. et al. 1981 Eur. J. Immunol. 11:317）をIgEによって感作して、FcεRIのみを凝集させるためにウサギ抗マウスIgGのF(ab')2断片、またはFcγRIIBとFcεRIを共凝集させるために全ウサギ抗マウスIgGのいずれかによって刺激する。このシステムにおいて、感作および刺激細胞に本発明の抗体を付加することによって、下流のシグナル伝達分子の間接的な調節をアッセイすることができる。たとえば、FcγRIIBのチロシンリン酸化ならびにSHIPのリクルートメントおよびリン酸化、Erk1、Erk2、JNK、またはp38が含まれるがこれらに限定されるわけではないMAPキナーゼファミリーメンバーの活性化、p62dokのチロシンリン酸化、ならびにそのSHIPおよびRasGAPとの会合をアッセイすることができる。
本発明の抗体によるFcεRI誘発肥満細胞活性化の阻害を決定する一つの例示的なアッセイは、以下の段階を含みうる：RBL-H23細胞にヒトFcγRIIBをトランスフェクトさせる段階；RBL-H23細胞をIgEによって感作する段階；RBL-H23細胞を、ウサギ抗マウスIgGのいずれかのF(ab')2によって刺激する段階（FcεRIのみを凝集させ、かつ対照としてFcεRI媒介シグナル伝達を誘発するため）、またはRBL-H23細胞を全ウサギ抗マウスIgGによって刺激する段階（FcγRIIBおよびFcεRIを共凝集させて、それによってFcεRI媒介シグナル伝達の阻害が得られる）。全ウサギ抗マウスIgG抗体によって刺激されている細胞をさらに、本発明の抗体と共にプレインキュベートすることができる。本発明の抗体と共にプレインキュベートされている細胞および本発明の抗体と共にプレインキュベートされていない細胞のFcεRI-依存的活性を測定する段階、ならびにこれらの細胞におけるFcεRI-依存的活性レベルを比較する段階により、本発明の抗体によるFcεRI-依存的活性の調節が示されると考えられる。
先に記述した例示的なアッセイは、たとえば、FcγRIIBおよびFcεRIの同時凝集を防止することによって、FcγRIIB受容体に対するリガンド（IgG）結合を遮断して、FcεRIシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に拮抗する抗体を同定するために用いることができる。このアッセイは同様に、FcγRIIBおよびFcεRIの同時凝集を促進することによって、FcγRIIBおよびFcεRIの同時凝集を増強し、かつFcεRIシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に拮抗する抗体を同定する。
好ましい態様において、FcεRI依存的活性は、以下の少なくとも一つまたは複数である：下流のシグナル伝達分子の調節（たとえばFcγRIIBのリン酸化状態の調節、SHIPリクルートメントの調節、MAPキナーゼ活性の調節、SHIPのリン酸化状態の調節、SHIPおよびShc会合SHIPおよびShcの調節、p62dokのリン酸化状態の調節、p62dokおよびSHIP会合の調節、p62dokおよびRasGAP会合の調節、カルシウム動員の調節、脱顆粒の調節、およびサイトカイン産生の調節）。なおもう一つの好ましい態様において、FcεRI-依存的活性は、セロトニン放出および／または細胞外Ca++流入および／またはIgE依存的肥満細胞活性化である。FcγRIIBとFcεRIの同時凝集が、FcγRIIBチロシンリン酸化を刺激して、SHIPのリクルートメントを刺激し、SHIPチロシンリン酸化およびShcとの会合を刺激し、Erk1、Erk2、JNK、p38が含まれるがこれらに限定されるわけではないMAPキナーゼファミリーメンバーの活性化を阻害することは当業者に公知である。FcγRIIBとFcεRIの同時凝集が、p62dokのチロシンリン酸化ならびにSHIPおよびRasGAPの会合を刺激することも同様に当業者に公知である。
いくつかの態様において、本発明の抗FcγRIIB抗体は、好ましくは細胞に基づくアッセイにおいて、肥満細胞または好塩基球の脱顆粒をモニターおよび／または測定することによって、IgE媒介反応の調節能を特徴とする。好ましくは、そのようなアッセイにおいて用いるための肥満細胞または好塩基球は、当業者に公知の標準的な組換え法を用いて、ヒトFcγRIIBを含有するように操作されている。特定の態様において、本発明の抗FcγRIIB抗体は、細胞に基づくβ-ヘキソサミニダーゼ（顆粒に含まれる酵素）放出アッセイにおいてIgE媒介反応の調節能を特徴とする。肥満細胞および好塩基球からのβ-ヘキソサミニダーゼの放出は、急性アレルギーおよび炎症状態における一次事象である（Aketani et al., 2001 Immunol. Lett. 75: 185-9；Aketani et al., 2000 Anal. Chem. 72: 2653-8）。セロトニンおよびヒスタミンが含まれるがこれらに限定されるわけではない他の炎症メディエータの放出を、本発明の方法に従ってIgE媒介反応を測定するためにアッセイしてもよい。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、肥満細胞および好塩基球からのβ-ヘキソサミニダーゼ含有顆粒などの顆粒の放出は、FcγRIと多価抗原とのクロスリンクによって開始される細胞内カルシウム濃度依存的プロセスである。
IgE媒介反応の媒介における本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けするための一つの例示的アッセイは、以下の段階を含むβ-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイである：RBL-H23細胞をヒトFcγRIIBにトランスフェクトさせる段階；細胞をマウスIgE単独またはマウスIgEおよび本発明の抗FcγRIIB抗体によって感作する段階；細胞を様々な濃度、好ましくは0.03μg/mL〜30 μg/mLの範囲のヤギ抗マウスF(ab)2によって約1時間刺激する段階；上清を採取する段階；細胞を溶解する段階；および比色アッセイ、たとえばp-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニドを用いて上清において放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定する段階。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性は、総活性に対する放出された活性の百分率として表記される。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性は、抗原単独；IgE単独；IgEおよび本発明の抗FcγRIIB抗体によって処置した細胞において測定および比較されるであろう。特定の作用機序によって拘束されることを意図しないが、細胞をマウスIgE単独によって感作して、ポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab)2断片を投与すると、ポリクローナル抗体がFcεRIに結合したマウスIgEの軽鎖を認識することから、FcγRIの凝集およびクロスリンクが起こり、次にこれが肥満細胞の活性化および脱顆粒に至る。一方、細胞をマウスIgEおよび本発明の抗FcγRIIB抗体によって感作して、ポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab)2断片を投与すると、FcγRIとFcγRIIBとのクロスリンクが起こり、それによってFcγRI誘発脱顆粒の阻害が起こる。いずれの場合においても、ヤギ抗マウスF(ab)2は、用量依存的なβ-ヘキソサミニダーゼ放出を誘導する。いくつかの態様において、FcγRIIB受容体に結合して、FcγRIにクロスリンクした抗FcγRIIB抗体は、阻害経路の活性化に影響を及ぼさず、すなわち抗FcγRIIB抗体の存在下で脱顆粒レベルに変更はない。他の態様において、抗FcγRIIB抗体は、抗FcγRIIB抗体に結合した場合、阻害性受容体であるFcγRIIBのより強い活性化を媒介して、FcγRIに対する有効なクロスリンクおよびホモ凝集FcγRIIBの阻害経路の活性化を許容する。
本発明はまた、当業者に公知の方法を用いるカルシウム動員アッセイを用いて、IgE媒介細胞反応に及ぼす本発明の抗FcγRIIB抗体の効果を特徴付けする段階を包含する。カルシウム動員アッセイの例は、以下の段階を含んでもよい：好塩基球または肥満細胞をIgEによってプライミングする段階；細胞をカルシウム指標、たとえばFura2と共にインキュベートする段階；前記のように細胞を刺激する段階；およびたとえばフローサイトメトリーを用いることによって、細胞内カルシウム濃度をモニターおよび／または定量する段階。本発明は、当業者に公知の任意の方法によって細胞内カルシウム濃度をモニターおよび／または定量する段階を包含する。たとえばその全てが参照により本明細書に組み入れられる、Immunology Letters, 2001, 75:185-9；British J. of Pharm, 2002, 136:837-45；J. of Immunology, 168:4430-9およびJ. of Cell Biol., 153(2):339-49を参照されたい。
好ましい態様において、本発明の抗FcγRIIB抗体は、IgE媒介細胞活性化を阻害する。他の態様において、本発明の抗FcγRIIB抗体は、FcγRIIBによって調節される阻害経路を遮断する、またはFcγRIIBにおけるリガンド結合部位を遮断して、このように免疫応答を増強する。
ヒト肥満細胞を調べることは、長期間培養した適切なヒト肥満細胞培養物が存在しないために限界がある。最近、LAD1およびLAD2と呼ばれる二つの新規幹細胞因子依存的ヒト肥満細胞株が、肥満細胞肉腫／白血病を有する患者からの骨髄吸引液から確立された（その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Kirshenbaum et al., 2003, Leukemia research, 27:677-82）。いずれの細胞株もFcεRIおよびいくつかのヒト肥満細胞マーカーを発現することが記述されている。本発明は、IgE媒介反応に及ぼす本発明の抗体の効果を評価するために、本発明の方法においてLAD1およびLAD2細胞を用いることを包含する。特定の態様において、前記のアッセイなどの、細胞に基づくβ-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイをLAD細胞において用いて、本発明の抗FcγRIIB抗体によるIgE媒介反応の任意の調節を決定してもよい。例示的なアッセイにおいて、ヒト肥満細胞、たとえばLAD1をキメラヒトIgE抗ニトロフェノール（NP）によってプライミングして、多価抗原であるBSA-NPを投与して、上清に放出されたβ-ヘキソサミニダーゼを測定することによって、細胞の脱顆粒をモニターする（その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Kirshenbaum et al., 2003, Leukemia research, 27:677-682）。
いくつかの態様において、当技術分野において公知の標準的な方法、たとえばFACS染色を用いて決定した場合に、ヒト肥満細胞の内因性のFcγRIIBの発現が低い場合、本発明の抗FcγRIIB抗体によって媒介される阻害経路の活性化の差をモニターおよび／または検出することは難しい可能性がある。このように、本発明は、それによってFcγRIIB発現がサイトカインおよび特定の成長条件を用いてアップレギュレートされる可能性がある別の方法を包含する。FcγRIIBは、ヒト単球細胞株、たとえばTHP1およびU937（Tridandapani et al., 2002, J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089）、ならびに初代培養ヒト単球（Pricop et al., 2001, J. of Immunol., 166: 531-537）においてIL4によって高度にアップレギュレートされることが記述されている。ジブチリル環状AMPによるU937細胞の分化は、FcγRIIの発現を増加させることが記述されている（Cameron et al., 2002 Immunology Letters 83, 171-179）。このように、検出感度を増強するために、本発明の方法において用いるためのヒト肥満細胞における内因性のFcγRIIB発現を、サイトカイン、たとえばIL-4、IL-13を用いてアップレギュレートしてもよい。
本発明はまた、B細胞受容体（BCR）媒介シグナル伝達を阻害するために本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けする段階を包含する。BCR媒介シグナル伝達には、B細胞の活性化および増殖、抗体産生等の、少なくとも一つまたは複数の下流の生物学的反応が含まれうる。FcγRIIBおよびBCRの同時凝集は、細胞周期進行および細胞生存の阻害に至る。さらに、FcγRIIBおよびBCRの同時凝集は、BCR媒介シグナル伝達の阻害に至る。
具体的に、BCR媒介シグナル伝達は、以下の少なくとも一つまたは複数を含む：下流のシグナル伝達分子の調節（たとえば、FcγRIIBのリン酸化状態、SHIPリクルートメント、Btkおよび／またはPLCγの局在、MAPキナーゼ活性、Akt（抗アポトーシスシグナル）のリクルートメント、カルシウム動員、細胞周期進行、および細胞増殖）。
BCRシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害の多数のエフェクター機能は、SHIPを通して媒介されるが、最近、SHIP欠損マウスからのリポ多糖類（LPS）活性化B細胞が、カルシウム動員、Ins(1,4,5)P3産生、ならびにErkおよびAktリン酸化の有意なFcγRIIB媒介阻害を示すことが証明されている（Brauweiler A. et al., 2001, Journal of Immunology, 167(1): 204-211）。したがって、SHIP欠損マウスからのエクスビボB細胞を用いて、本発明の抗体の特徴付けを行うことができる。本発明の抗体によるBCRシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害を決定するための一つの例示的なアッセイは、以下を含みうる：SHIP欠損マウスからの脾臓B細胞を単離する段階、細胞をリポ多糖類によって活性化する段階、および細胞を、BCRを凝集させるためにF(ab')2抗IgMによって、またはBCRをFcγRIIBと同時凝集させるためにIgMによって刺激する段階。BCRをFcγRIIBと同時凝集させるために、無傷の抗IgMによって刺激されている細胞を、本発明の抗体と共にさらにプレインキュベートすることができる。細胞のFcγRIIB依存的活性は、当技術分野において公知の標準的な技術によって測定することができる。本発明の抗体によってプレインキュベートされている細胞およびプレインキュベートされていない細胞におけるFcγRIIB依存的活性のレベルを比較する段階は、本発明の抗体によるFcγRIIB依存的活性の調節を示すと考えられる。
FcγRIIB依存的活性の測定には、たとえばフローサイトメトリーによって細胞内カルシウム動員を測定する段階、Aktおよび／またはErkのリン酸化を測定する段階、PI(3,4,5)P3のBCR媒介蓄積を測定する段階、またはB細胞のFcγRIIB媒介増殖を測定する段階が含まれうる。
アッセイは、たとえばFcγRIIB受容体に対するリガンド（IgG）結合部位を遮断する段階、およびFcγRIIBとBCRの同時凝集を防止することによってBCRシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に拮抗する段階によって、BCRシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害を調節する抗体を同定するために用いることができる。アッセイはまた、FcγRIIBとBCRの同時凝集を増強して、BCRシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害にアゴニストとして作用する抗体を同定するためにも用いることができる。
本発明は、ヒト単球／マクロファージにおけるFcγRII媒介シグナル伝達に関して本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けする段階に関する。免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ITAM）を有する受容体とFcγRIIBとの同時凝集は、SHIPをエフェクターとして用いてFcγR媒介貪食をダウンレギュレートするように作用する（Tridandapani et al. 2002, J. Biol. Chem. 277(7):5082-9）。FcγRIIAとFcγRIIBとの同時凝集によって、FcγRIIBのITIMモチーフにおけるチロシン残基の急速なリン酸化が起こり、それによってSHIPのリン酸化の増強、SHIPとShcの会合、分子量120および60〜65 kDaを有するタンパク質のリン酸化が起こる。さらに、FcγRIIAとFcγRIIBの同時凝集によって、細胞の調節に関係し、かつアポトーシスを抑制するように作用するセリン-トレオニンキナーゼであるAktのリン酸化のダウンレギュレーションが起こる。
本発明はさらに、ヒト単球／マクロファージにおけるFcγR媒介貪食の阻害に関して本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けする段階をさらに包含する。たとえば、ヒト単球細胞株THP-1の細胞を、FcγRIIに対するマウスモノクローナル抗体IV.3およびヤギ抗マウス抗体のFab断片によって（FcγRIIAのみを凝集させるために）、または全IV.3マウスモノクローナル抗体およびヤギ抗マウス抗体（FcγRIIAおよびFcγRIIBを同時凝集させるため）のいずれかによって刺激することができる。この系において、FcγRIIBのチロシンリン酸化、SHIPのリン酸化、SHIPとShcとの会合、Aktのリン酸化、ならびに分子量120および60〜65 kDaを有するタンパク質のリン酸化を、本発明のタンパク質を刺激細胞に付加することによってアッセイすることができる。さらに、単球細胞株のFcγRIIB依存的貪食効能を、本発明の抗体の存在下および非存在下で直接測定することができる。
本発明の抗体による、ヒト単球／マクロファージにおけるFcγR媒介貪食の阻害を決定するためのもう一つの例示的なアッセイは、以下を含みうる：IV.3マウス抗FcγRII抗体およびヤギ抗マウス抗体のFab（FcγRIIAのみを凝集して、FcγRIIA媒介シグナル伝達を誘発するため）、またはマウス抗FcγRII抗体およびヤギ抗マウス抗体（FcγRIIAおよびFcγRIIBを同時凝集するため）のいずれかによってTHP-1細胞を刺激する段階、ならびにFcγRIIA媒介シグナル伝達を阻害する段階。マウス抗FcγRII抗体およびヤギ抗マウス抗体によって刺激されている細胞をさらに、本発明の抗体と共にプレインキュベートすることができる。本発明の抗体と共にプレインキュベートされている刺激細胞および本発明の抗体と共にプレインキュベートされていない細胞のFcγRIIA依存的活性を測定する段階、およびこれらの細胞におけるFcγRIIA依存的活性のレベルを比較する段階は、本発明の抗体によるFcγRIIA依存的活性の調節を示すと考えられる。
記述される例示的なアッセイは、たとえばFcγRIIBとFcγRIIAの同時凝集を防止することによって、FcγRIIB受容体のリガンド結合を遮断して、FcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害に拮抗する抗体を同定するために用いることができる。同様に、このアッセイは、FcγRIIBおよびFcγRIIAの同時凝集を増強して、FcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害にアゴニストとして作用する抗体を同定する。
本発明のもう一つの態様において、本発明は、これまでに記述された方法（Tridandapani et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 20480-7）によって、THP-1細胞がフルオレセイン化IgG-オプソニン化ヒツジ赤血球（SRBC）を貪食する能力を測定することによって、本発明の抗体の機能を特徴付けする段階に関する。たとえば、貪食を測定するための例示的なアッセイは以下を含む：THP-1細胞を本発明の抗体またはFcγRIIに結合しない対照抗体によって処置する段階、細胞の活性レベルを比較する段階、ここで、細胞の活性（たとえば、ロゼット形成活性（IgGコーティングSRBCに結合するTHP-1細胞の数）、接着活性（THP-1細胞に結合したSRBCの総数）、および貪食率）の差は、本発明の抗体によるFcγRIIA依存的活性の調節を示す。このアッセイは、たとえばFcγRIIB受容体のリガンド結合を遮断して、貪食のFcγRIIB媒介阻害に拮抗する抗体を同定するために用いることができる。このアッセイはまた、FcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB媒介阻害を増強する抗体を同定することができる。
好ましい態様において、本発明の抗体は、以下の方法の少なくとも一つまたは複数においてヒト単球／マクロファージにおけるFcγRIIB依存的活性を調節する：下流のシグナル伝達分子の調節（たとえば、FcγRIIBのリン酸化状態の調節、SHIPリン酸化の調節、SHIPおよびShc会合の調節、Aktのリン酸化の調節、約120 kDaおよび60〜65 kDa付近のさらなるタンパク質のリン酸化の調節）、および貪食の調節。
本発明は、治療抗体のエフェクター細胞機能に及ぼす抗体の効果、たとえば治療抗体の腫瘍特異的ADCC活性の増強能を同定するために、当業者に公知のアッセイを用いて本発明の抗体を特徴付けする段階を包含する。本発明の方法に従って用いてもよい治療抗体には、抗腫瘍抗体、抗ウイルス抗体、抗微生物抗体（たとえば、細菌および単細胞寄生虫）が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、その例は、本明細書において開示される（5.4.6章）。特に、本発明は、治療抗体、たとえば腫瘍特異的モノクローナル抗体のFcγR媒介エフェクター細胞機能に及ぼすその効果に関して本発明の抗体を特徴付けする段階を包含する。本発明に従ってアッセイすることができるエフェクター細胞機能の例には、抗体依存的細胞媒介性細胞障害性、貪食、オプソニン化、オプソニン貪食、C1q結合、および補体依存的細胞媒介性細胞障害性が含まれるがこれらに限定されるわけではない。エフェクター細胞機能活性を決定するために当業者に公知の任意の細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイを用いることができる（エフェクター細胞アッセイに関しては、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、
Figure 0005764290
を参照されたい）。
本発明の抗体は、当業者に公知の標準的な任意の方法を用いて、エフェクター細胞、たとえばナチュラルキラー細胞において治療抗体がFcγR媒介ADCC活性に及ぼすその効果に関してアッセイすることができる（たとえば、Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92を参照されたい）。本明細書において用いられる「抗体依存的細胞媒介細胞障害性」および「ADCC」は、当技術分野においてその通常の慣例的な意味を有し、FcγRsを発現する非特異的細胞障害細胞（たとえば、ナチュラルキラー（NK）細胞およびマクロファージなどの単球細胞）が、標的細胞上で結合抗体を認識して、その後標的細胞の溶解を引き起こすインビトロ細胞媒介反応を指す。原則的に、活性化FcγRを有するいかなるエフェクター細胞もADCCを媒介するように誘発されうる。ADCCを媒介する主な培養細胞は、FcγRIIIのみを発現するNK細胞であるが、単球はその活性化、局在、または分化の状態に応じて、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現することができる。造血細胞におけるFcγR発現に関する概説に関しては、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92を参照されたい。
エフェクター細胞は、一つまたは複数のFcγRsを発現して、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともFcγRIIIを発現して、ADCCエフェクター機能を実行する。本発明の方法において用いてもよいエフェクター細胞には、末梢血単核球細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球、および好中球が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、PBMCおよびNK細胞が好ましい。エフェクター細胞は、そのネイティブな起源から、たとえば本明細書において記述されるように血液またはPBMCから単離してもよい。好ましくは、本発明のADCCアッセイにおいて用いられるエフェクター細胞は、当業者に公知の標準的な方法、たとえばFicoll-Paque密度勾配遠心法を用いて、好ましくは健常なヒト血液から精製された末梢血単核球（PBMC）である。たとえば、PBMCは、全血をFicoll-Hypaqueに重層して細胞を500 gで室温で30分間遠心することによって単離してもよい。白血球層をエフェクター細胞として採取することができる。本発明のADCCアッセイにおいて用いてもよい他のエフェクター細胞には、単球由来マクロファージ（MDM）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明の方法においてエフェクター細胞として用いられるMDMは、好ましくは凍結保存物として得られるか、または新鮮なまま用いられる（たとえば、Advanced Biotechnologies, MDから）。最も好ましい態様において、溶出したヒト単球を本発明の方法におけるエフェクター細胞として用いる。溶出したヒト単球は、活性化受容体FcγRIIIAおよびFcγRIIAならびに阻害性受容体FcγRIIBを発現する。ヒト単球は市販されており、凍結保存物として得てもよく、10％ヒトAB血清を含有する基本培地、またはサイトカインを含有するヒト血清を有する基本培地において融解してもよい。細胞におけるFcγRの発現レベルは、たとえばFACS分析を用いて直接決定してもよい。または、細胞を培養においてマクロファージまで成熟させてもよい。FcγRIIB発現レベルは、マクロファージにおいて増加してもよい。FcγRの発現レベルの決定において用いてもよい抗体には、抗ヒトFcγRIIA抗体、たとえばIV.3-FITC；抗FcγRI抗体、たとえば32.2 FITC；および抗FcγRIIIA抗体、たとえば3G8-PEが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本発明のADCCアッセイにおいて用いられる標的細胞には、乳癌細胞株、たとえばATCCアクセッション番号HTB-30を有するSK-BR-3（たとえば、Tremp et al., 1976, Cancer Res. 33-41を参照されたい）；Bリンパ球；バーキットリンパ腫に由来する細胞、たとえばATCCアクセッション番号CCL-86を有するRaji細胞（たとえば、Epstein et al., 1965, J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240を参照されたい）、ATCCアクセッション番号CCL-213を有するDaudi細胞（たとえばKlein et al., 1968, Cancer Res. 28:1300-10を参照されたい）；卵巣癌細胞株、たとえばATCCアクセッション番号HTB-161を有するOVCAR-3（たとえば、Hamilton, Young et al., 1983を参照されたい）、SK-OV-3、PA-1、CAOV3、OV-90、およびIGROV-I（NCI repositoryから入手可能、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられるBenard et al., 1985, Cancer Research, 45:4970-9）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。標的細胞は、アッセイされる抗体の抗原結合部位によって認識されなければならない。本発明の方法において用いられる標的細胞は、癌抗原の低い、中等度の、または高い発現レベルを有してもよい。癌抗原の発現レベルは、当業者に公知の一般的な方法、たとえばFACS分析を用いて決定してもよい。たとえば、本発明は、Her2/neuが異なるレベルで発現するIGROV-1、またはOV-CAR-3（ATCCアクセッション番号HTB-161；乳癌細胞株であるSK-BR-3よりHer2/neuの低い発現を特徴とする）などの卵巣癌細胞を用いることを包含する。本発明の方法において標的細胞として用いてもよい他の卵巣癌細胞株には、OVCAR-8（その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Hamilton et al., 1983, Cancer Res. 43:5379-89）；SK-OV-3（ATCCアクセッション番号HTB-77）；Caov-3（ATCCアクセッション番号HTB-75）；PA-1（ATCCアクセッション番号CRL-1572）；OV-90（ATCCアクセッション番号CRL-11732）；およびOVCAR-4が含まれる。本発明の方法において用いてもよい他の乳癌細胞株には、BT-549（ATCCアクセッション番号HTB-122）、MCF7（ATCCアクセッション番号HTB-22）、およびHs578T（ATCCアクセッション番号HTB-126）が含まれ、その全てがNCI貯蔵所およびATCCから入手可能であり、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の方法において用いてもよい他の細胞株には、その全てがNC1から入手可能であり参照により本明細書に組み入れられる、CCRF-CEM（白血病）；HL-60（TB、白血病）；MOLT-4（白血病）；RPMI-8226（白血病）；SR（白血病）；A549（非小細胞肺癌）；EKVX（非小細胞肺癌）；HOP-62（非小細胞肺癌）；HOP-92（非小細胞肺癌）；NCl-H226（非小細胞肺癌）；NCl-H23（非小細胞肺癌）；NCl-H322M（非小細胞肺癌）；NCl-H460（非小細胞肺癌）；NCl- H522（非小細胞肺癌）；COLO 205（結腸）；HCC-2998（結腸）；HCT-116（結腸）；HCT-15（結腸）；HT29（結腸）；KM12（結腸）；SW-620（結腸）；SF-268（CNS）；SF-295（CNS）；SF-539（CNS）；SNB-19（CNS）；SNB-75（CNS）；U251（CNS）；LOX 1MV1（黒色腫）；MALME-3M（黒色腫）；M14（黒色腫）；SK-MEL-2（黒色腫）；SK-MEL-28（黒色腫）；SK-MEL-5（黒色腫）；UACC-257（黒色腫）；UACC-62（黒色腫）；IGR-OVl（卵巣）；OVCAR-3, 4, 5, 8（卵巣）；SK-OV-3（卵巣）；786-0（腎臓）；A498（腎臓）ACHN（腎臓）；CAKl-1（腎臓）；SN12C（腎臓）；TK-10（腎臓）；UO-31（腎臓）；PC-3C（前立腺）；DU-145（前立腺）；NCl/ADR-RES（乳腺）；MDA-MB-231/ATCC（乳腺）；MDA-MB-435（乳腺）；DMS 114（小細胞肺癌）；およびSHP-77（小細胞肺癌）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
治療抗体のADCC活性に関する本発明の抗体の効果を決定するための例示的なアッセイは、以下を含む51Cr放出アッセイに基づく：標的細胞を[51Cr]Na2CrO4（この細胞膜透過性分子は、細胞質タンパク質に結合し、遅い反応速度で細胞から自然に放出されるが、標的細胞の溶解後は大量に放出されることから、標識のために一般的に用いられる）によって標識する段階；好ましくは標的細胞は一つまたは複数の腫瘍抗原を発現し、本発明の抗体、たとえば8B5.3.4の存在下および非存在下で標的細胞の細胞表面上に発現した腫瘍抗原に免疫特異的に結合する一つまたは複数の抗体によって、標的細胞をオプソニン化する段階、マイクロタイタープレートにおいてオプソニン化放射標識標的細胞をエフェクター細胞と共に適切な標的細胞対エフェクター細胞比で混合する段階；細胞の混合物を好ましくは16〜18時間、好ましくは37℃でインキュベートする段階；上清を採取する段階；および、上清試料における放射活性を分析する段階。次に、本発明の抗体の存在下および非存在下における治療抗体の細胞障害性を、たとえば以下の式を用いて決定することができる：特異的溶解（％）＝（実験的溶解−抗体非依存的溶解／最大溶解−抗体非依存的溶解）×100％。標的：エフェクター細胞比または抗体濃度のいずれかを変化させることによってグラフを生成することができる。
なおもう一つの態様において、本発明の抗体は、先に記述した方法に従う抗体依存的細胞媒介性細胞障害性（ADCC）を特徴とし、たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Ding et al., Immunity, 1998, 8:403-11を参照されたい。
いくつかの態様において、本発明は、インビトロに基づくアッセイおよび／または動物モデルにおいて治療抗体のADCC活性を増強するために本発明の抗体の機能を特徴付けする段階を包含する。
特定の態様において、本発明は、卵巣癌モデルおよび／または乳癌モデルを用いて腫瘍特異的ADCCを増強するために本発明の抗体の機能を決定する段階を包含する。
好ましくは、本発明のADCCアッセイは、少なくとも一つの癌抗原の発現を特徴とする、一つより多い癌細胞株を用いて行われ、ここで、癌抗原の発現レベルは、用いた癌細胞株において変化している。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、癌抗原の発現レベルが変化している一つより多い細胞株においてADCCアッセイを行うことによって、本発明の抗体の腫瘍除去の厳密さを決定することができると考えられる。一つの態様において、本発明のADCCアッセイは、癌抗原の発現レベルが異なる癌細胞株を用いて行われる。
例示的なアッセイにおいて、OVCAR3、卵巣癌細胞株は、腫瘍抗原Her2/neuおよびTAG-72を発現する腫瘍標的として作用することができ；活性化FcγRIIIAおよびFcγRIIAならびに阻害性FcγRIIBを発現するヒト単球をエフェクターとして用いることができ；かつ腫瘍特異的マウス抗体、ch4D5およびchCC49を、腫瘍特異的抗体として用いることができる。OVCAR-3細胞は、ATCC（アクセッション番号HTB-161）から入手可能である。好ましくは、OVCAR-3細胞を、0.01 mg/mlウシインスリンを添加した培地において成長させる。生存OVCAR-3細胞5×106個を、年齢および体重をマッチさせたヌード無胸腺マウスにMatrigel（Becton Dickinson）と共に皮下注射(s.c.)してもよい。腫瘍の推定重量は、以下の式：長さ−（幅)2/2によって計算することができ、好ましくは、3グラムを超えない。接着依存性の腫瘍を6〜8週間後に単離して、腫瘍1 gあたりコラゲナーゼ(Sigma)1μgおよび5 mg/mL RNアーゼを加えることによって、細胞を解離させて、細胞濾過器およびナイロンメッシュに通過させて細胞を単離することができる。次に、細胞を、皮下注射して異種移植片モデルの確立するために長期間保存するために凍結することができる。
CC49および4D5抗体を分泌するハイブリドーマは、ATCCアクセッション番号HB-9459およびCRL-3D463によって入手可能であり、重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列は、パブリックドメインにおいて認められる（その双方の全内容物が、参照により本明細書に組み入れられるMurray et al., 1994 Cancer 73 (35): 1057-66, Yamamoto et al., 1986 Nature, 319:230-4）。好ましくは4D5およびCC49抗体は、エフェクター機能を提供するために、ヒトFc配列、たとえばIgG1のヒト定常領域がマウス抗体の可変領域に移植されるように、当業者に公知の標準的な方法を用いてキメラ化されている。キメラ4D5およびCC49抗体は、その可変領域を通して標的細胞株に結合し、そのFc領域を通してヒトエフェクター細胞上に発現するFcγRに結合する。CC49は、多くの腺癌細胞および卵巣癌において高度に発現する高分子量ムチンであるTAG-72に向けられる（その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Lottich et al., 1985 Breast Cancer Res. Treat. 6(l):49-56；Mansi et al., 1989 Int. J. Rad. Appl. Instrum B. 16(2):127-35；Colcher et al., 1991 Int. J. Rad. Appl. Instrum B. 18:395-41）。4D5抗体は、ヒト上皮細胞増殖因子受容体2に向けられる（参照により本明細書に組み入れられる、Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-9）。次に、本発明の抗体は、阻害性FcγRIIBを遮断することによって、腫瘍特異性抗体のADCC活性の増強を調べるために利用することができる。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、少なくとも一つの活性化FcγR、たとえばFcγRIIAを発現するエフェクター細胞が活性化されると、阻害性受容体（FcγRIIB）の発現は増強され、FcγRIIAのADCC活性が抑制されることから、これは腫瘍の除去を制限する。しかし、本発明の抗体は、遮断抗体として、すなわち阻害性シグナルが活性化されることを防止し、それにより活性化シグナル、たとえばADCC活性が長期間持続して強力な腫瘍の除去が起こる可能性がある抗体として、役立ちうる。
好ましくは、ADCC活性を増強するために用いられる本発明の抗体は、FcγRに対する結合が減少するように、最も好ましくは消失するように、アミノ酸少なくとも1個の改変を含むように改変されている。いくつかの態様において、本発明の抗体は、最大のFcγRIIB遮断活性を保持しながら、活性化FcγR、たとえばFcγRIIIA、FcγRIIAに対する定常ドメインの結合を、本発明の野生型抗体と比較して低減させる少なくとも一つのアミノ酸改変を含むように改変されている。本発明の抗体は、当業者に公知の、または本明細書において開示される任意の方法に従って改変されてもよい。その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許仮出願第60/439,498号（2003年1月9日に提出）および第60/456,041号（2003年3月19日に提出）、ならびに米国特許出願第10/754,922号（2004年1月9日に提出）および第10/902,588号（2004年7月28日に提出）において開示される改変などの、エフェクター機能を破壊することが知られている任意のアミノ酸改変を、本発明の方法に従って用いてもよい。いくつかの態様において、本発明の抗体は、265位が改変されるように、たとえば265位がアラニンに置換されるように改変される。好ましい態様において、本発明の抗体のマウス定常領域は、FcγRIIB遮断活性を維持しながらエフェクター機能が消失するように、265位でアミノ酸のアラニンによる置換を含む、対応するヒト定常領域に交換されている。IgG1重鎖の265位での一つのアミノ酸変化は、ELISAアッセイに基づいてFcγRに対する結合を有意に低減させることが示されており、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Sheilds et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591-604、それによって腫瘍塊の低減が起こる。他の態様において、本発明の抗体は、297位が改変されるように、たとえば297位がグルタミンに置換され、それによってN-連結グリコシル化部位が排除されるように改変される（たとえば、その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Jefferies et al., 1995, Immunol., lett 44: 111-7；Lund et al., 1996, J. Immunol., 157:4963-69；Wright et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 1087-96；White et al., 1997; J. Immunol. 158:426-35を参照されたい）。この部位での改変は、FcγRの全ての相互作用を消失させることが報告されている。好ましい態様において、本発明の抗体のマウス定常領域は、FcγRIIB遮断活性を維持しながらエフェクター機能が消失するように、265位および／または297位でアミノ酸置換を含む対応するヒト定常領域に交換されている。
本発明の抗体の存在下および非存在下で腫瘍特異的抗体のADCC活性を決定するための例示的なアッセイは、非放射活性ユーロピウムに基づく蛍光アッセイ（BATDA, Perkin Elmer）であり、以下を含んでもよい：エステルの加水分解によって、細胞膜と親水性のリガンド（TDA）を形成する蛍光増強エステルのアセトキシメチルエステルによって標的細胞を標識する段階；この複合体は、細胞から離れることができず、エフェクターによる細胞の溶解時に限って放出される；抗腫瘍抗体および本発明の抗体の存在下で標識標的をエフェクター細胞に加える段階；標的およびエフェクター細胞の混合物を6〜16時間、好ましくは37℃でインキュベートする段階。ADCC活性の程度は、放出されて、ユーロピウム（DELFIA reagent; PerkinElmer）と相互作用するリガンドの量を測定することによってアッセイすることができる。リガンドおよびユーロピウムは、非常に安定で大いに蛍光を発するキレート（EuTDA）を形成し、測定された蛍光は、溶解された細胞数に直接比例する。特異的溶解（％）を以下の式を用いて計算することができる：（実験的溶解−抗体非依存的溶解／最大溶解抗体非依存的溶解×100％）。
いくつかの態様において、蛍光に基づくADCCアッセイの感度が低すぎて治療抗体のADCC活性を検出できない場合、本発明は、51Cr放出アッセイなどの、放射活性に基づくADCCアッセイを包含する。放射活性に基づくアッセイは、蛍光に基づくADCCアッセイの代わりに、またはそれと併用して行ってもよい。
本発明の抗体の特徴を調べるための例示的な51Crアッセイは、以下を含みうる：OVCAR-3細胞などの標的細胞1〜2×106個を51Crによって標識する段階、本発明の抗体の存在下および非存在下で標的細胞を抗体4D5およびCC49によってオプソニン化する段階、ならびに細胞5×103個を96ウェルプレートに加える段階。好ましくは、4D5およびCC49は、1〜15μg/mLの範囲の濃度であり；オプソニン化標的細胞を、好ましくは10：1〜100：1まで変化する比率で単球由来マクロファージ（MDM）（エフェクター細胞）に加える段階；細胞の混合物を37℃で16〜18時間インキュベートする段階；上清を採取する段階；および上清における放射活性を分析する段階。本発明の抗体の存在下および非存在下における4D5およびCC49の細胞障害性を、たとえば以下の式を用いて決定することができる：特異的溶解（％）＝（実験的溶解−抗体非依存的溶解／最大溶解−抗体非依存的溶解）×100％。
いくつかの態様において、本発明のFcγRIIB抗体のインビボ活性を、異種移植片ヒト腫瘍モデルにおいて決定する。腫瘍は、前記の任意の癌細胞株を用いて確立してもよい。いくつかの態様において、腫瘍は、二つの癌細胞株について確立され、癌抗原の低い発現を特徴とする第一の癌細胞株、および同じ癌抗原の高い発現を特徴とする第二の癌細胞株によって確立されるであろう。腫瘍の除去は、第一および第二の癌細胞株上の癌抗原に免疫特異的に結合する抗腫瘍抗体および適切なマウスモデル、たとえばBalb/cヌードマウスモデル（たとえば、Jackson Laboratories, Taconic）を用いて、当業者に公知の方法を用いて、移入されたヒト単球およびエフェクター細胞としてのMDMによって決定してもよい。腫瘍の除去における本発明の抗FcγRIIB抗体の役割を評価するために、前記の任意の抗体を、この動物モデルにおいて試験してもよい。本発明において用いてもよいマウスには、たとえばFcγRIII-/-（FcγRIIIAがノックアウトされている）；Fcγ-/-ヌードマウス（FcγRIおよびFcγRIIIAがノックアウトされている）；または第1染色体におけるマウスfcgr2およびfcgr3座が不活化され、ヒトFcγRIIA、ヒトFcγRIIA、ヒトFcγRIIB、ヒトFcγRIIC、ヒトFcγRIIIA、およびヒトFcγRIIIBを発現する、ヒトFcγRIIBノックインマウスまたはトランスジェニックノックインマウスが含まれる。
本発明の抗体のインビボ活性を試験するための例示的な方法は、以下の段階を含んでもよい：癌抗原の発現を特徴とする癌細胞株を用いて異種移植片マウスモデルを確立する段階、および腫瘍の除去の媒介における、癌細胞株において発現した癌抗原に対して特異的な抗体に及ぼす本発明の抗体の効果を決定する段階。好ましくはインビボ活性は、二つの癌細胞株を用いて同時に試験され、低レベルで発現する第一の癌抗原を特徴とする第一の癌細胞株、および第一の癌細胞株と比較してより高レベルで発現する同じ癌抗原を特徴とする第二の癌細胞株を用いて試験される。これらの実験は、このように腫瘍の除去における本発明の抗体の役割の評価の厳密度を増加させるであろう。たとえば、腫瘍を、IGROV-1細胞株について確立して、Her2/neu特異的抗体の腫瘍除去における本発明の抗FcγRIIB抗体の効果を評価してもよい。異種移植片腫瘍モデルを確立するために、生存細胞、たとえばIGROV-1、SKBR3 5×106個を、マウス、たとえば年齢と体重をマッチさせた雌性ヌード無胸腺マウス8匹に、たとえばMatrigel（Becton Dickinson）を用いて皮下注射してもよい。推定腫瘍重量を、以下の式：長さ×(幅)2/2によって決定してもよく、好ましくは3グラムを超えない。IGROV-1細胞の皮下注射は急速に成長する腫瘍を生じ、一方、腹腔内経路は、2ヶ月以内にマウスを殺す腹腔癌腫症を誘発する（Benard et al., 1985, Cancer Res. 45:4970-9）。IGROV-1細胞は5週間以内に腫瘍を形成することから、腫瘍細胞注射後1日目に、エフェクターとしての単球を、Her2/neuに対して特異的な治療抗体、たとえばCh4D5および本発明の抗体、たとえば前記のキメラ8B5.3.4抗体（「ch8B5.3.4」）と共に同時に腹腔内注射する。好ましくは、抗体は、マウス体重（mbw）1 gあたり4μgで注射される。初回注射の後に抗体の毎週注射を4〜6週間行った後2μg/週を注射する。ヒトエフェクター細胞を2週間に1回補給する。一群のマウスには、治療抗体を投与しないが、抗腫瘍および抗FcγRIIB抗体に関するアイソタイプ対照抗体としてそれぞれ、N297A変異およびヒトIgG1を含むキメラ4D5を注射する。マウスを4つの群に配置して、毎週3回モニターしてもよい。
以下の表5は、本発明に従う腫瘍除去試験に関する例示的な設定である。表5において示されるように、腫瘍の除去における本発明の抗体の役割を調べるためには、一つの標的およびエフェクター細胞の組み合わせを用いて、抗体濃度の異なる二つの組み合わせを用いる、各群マウス8匹の6群が必要であろう。A群には、腫瘍細胞のみを注射し、B群では腫瘍細胞と単球を注射し、C群では腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体（ch4D5）を注射し、D群では腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体、および抗FcγRII抗体を注射し、E群では、腫瘍細胞、単球、および抗FcγRIIB抗体を注射し、F群では、腫瘍細胞、単球、Ch4D5（N297Q）およびヒトIgG1を注射する。様々な抗体の組み合わせの様々な抗体濃度を記述の腫瘍モデルにおいて試験してもよいことは当業者によって認識されるであろう。好ましくは、乳癌細胞株、たとえばSKBR3を用いる試験を上記の実験と平行して行う。
（表５）マウスにおける例示的な実験設定
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異種移植片腫瘍モデルのエンドポイントは、当業者に公知の方法を用いて、腫瘍の大きさ、マウスの体重、生存期間、ならびに癌の組織化学および組織病理学的検査に基づいて決定される。表5におけるマウスの群のそれぞれを評価する。マウスは好ましくは週に3回モニターする。腫瘍の成長の基準は、腹部膨満、腹腔における触診可能な塊の存在であってもよい。好ましくは、腫瘍重量の推定値対接種後日数を計算する。D群におけるマウスの上記の基準を他の群と比較すると、腫瘍の除去の増強における本発明の抗体の役割が規定されるであろう。好ましくは、抗体処置動物を、対照群後さらに2ヶ月間観察する。
別の態様において、エフェクター細胞を移入するよりむしろ、マウスエフェクター細胞においてヒトFcγRIIBを発現するヒトFcγRIIB「ノックイン」マウスを、本発明の抗体のインビボ活性を確立するために用いてもよい。ヒトFcγRIIBを発現する創始マウスは、マウスFcγRIIB座にヒトFcγRIIBを「ノックイン」することによって生成してもよい。次に、初代動物をヌードバックグラウンドに戻し交配することができ、これはヒトFcγRIIB受容体を発現しうる。得られたマウスエフェクター細胞は、内因性の活性化FcγRIおよびFcγRIIIA、ならびに阻害性のヒトFcγRIIB受容体を発現するであろう。
本発明の抗体のインビボ活性はさらに、ヒト原発性卵巣癌および乳癌由来細胞などのヒト原発性腫瘍由来細胞による異種移植片マウスモデルにおいて試験してもよい。癌患者からの腹水および胸膜浸出液試料を、当業者に公知の方法を用いて、Her2/neuの発現に関して試験してもよい。卵巣癌患者からの試料を、腹水を6370 gで4℃で20分間遠心する段階、赤血球を溶解する段階、および細胞をPBSによって洗浄する段階によって処理してもよい。腫瘍細胞におけるHer2/neuの発現を決定した後、異種移植片腫瘍モデルを確立するための皮下接種のために、二つの試料、中等度の発現体（expressor）および高発現体を選択してもよい。次に、単離された腫瘍細胞をマウスに腹腔内注射して、細胞を増殖させる。マウス約10匹に腹腔内注射して、それぞれのマウス腹水をさらにマウス2匹に継代して、合計20匹のマウスから腹水を得、これを用いてマウス80匹の群に注射することができる。胸膜滲出液試料を腹水と類似の方法を用いて処理してもよい。胸膜滲出液試料からのHer2/neu+腫瘍細胞を、マウスの左右乳房に注入してもよい。
いくつかの態様において、腹水または胸膜浸出液試料における新生物細胞の百分率が他の細胞サブセットと比較して低い場合、新生物細胞をインビトロで増殖させてもよい。他の態様において、既に記述されるように、CC49抗体（抗TAG-72）でコーティングされた磁気ビーズを用いて、腫瘍細胞を精製してもよい。たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Barker et al, 2001, Gynecol. Oncol. 82:57, 63を参照されたい。簡単に説明すると、CC49抗体でコーティングした磁気ビーズを用いて、卵巣腫瘍細胞を分離することができ、これを37℃で終夜インキュベートすることによってビーズから脱離させる。いくつかの態様において、腫瘍細胞がTAG-72抗原を欠損する場合、Stem Cell Technologies, Inc., Canadaによって提供されるような抗体カクテルを用いる負の枯渇（negative depletion）を用いて腫瘍細胞を濃縮してもよい。
他の態様において、Her2/neu以外の他の腫瘍マーカーを用いて、腹水および胸膜滲出液試料から得られた腫瘍細胞を非腫瘍細胞から分離してもよい。胸膜浸出液または乳腺組織の場合、CD44（接着分子）、B38.1（乳癌／卵巣癌特異的マーカー）、CD24（接着分子）をマーカーとして用いてもよいことが最近報告されている。たとえば、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Al Hajj, et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3983, 8を参照されたい。腫瘍細胞を精製した後、増殖のために該細胞をマウスに皮下注射してもよい。
好ましくは、新生物の構造特徴を分析するために、免疫組織化学および組織化学を患者の腹水および胸膜浸出液について行う。そのような方法は、当業者に公知であり、本発明に包含される。モニターしてもよいマーカーには、たとえばサイトケラチン（炎症および間葉細胞からの卵巣の新生物および中皮細胞を同定するため）；カルレチニン（Her2neu陽性新生物細胞からの中皮を分離するため）；およびCD45（試料における細胞集団の残りからの炎症細胞を分離するため）が含まれる。追跡してもよいさらなるマーカーには、CD3（T細胞）、CD20（B細胞）、CD56（NK細胞）、およびCD14（単球）が含まれる。前記の免疫組織化学および組織化学法が、本発明の方法において用いられる任意の腫瘍細胞に同時に応用されることは当業者によって認識されるであろう。腫瘍細胞の皮下接種後、マウスを臨床および解剖学的変化に関して追跡する。必要であれば、総腫瘍負荷を特異的臓器局在に相関させるためにマウスを剖検してもよい。
特定の態様において、腫瘍は、IGROV-1、OVCAR-8、SK-B、およびOVCAR-3細胞のなどの癌細胞株、ならびにヒト卵巣癌腹水および乳癌患者からの胸膜浸出液を用いて確立される。腹水は好ましくは、エフェクターと、試験される抗体に関する腫瘍標的との双方を含有する。ヒト単球は、エフェクターとして移入される。
本発明の抗体のインビボ活性はまた、ATCCアクセッション番号HTB-30を有するSK-BR-3（たとえば、Tremp et al., 1976, Cancer Res. 33-41を参照されたい）；Bリンパ球；バーキットリンパ腫に由来する細胞、たとえばATCCアクセッション番号CCL-86を有するRaji細胞（たとえば、Epstein et al., 1965, J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240を参照されたい）、ATCCアクセッション番号CCL-213を有するDaudi細胞（たとえば、Klein et al., 1968, Cancer Res. 28: 1300-10）；卵巣癌細胞株、たとえばATCCアクセッション番号HTB-161を有するOVCAR-3（たとえば、Hamilton, Young et al., 1983を参照されたい）、SK-OV-3、PA-1、CAOV3、OV-90、およびIGROV-1（NCI repositoryから入手可能、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Benard et al., 1985, Cancer Research, 45:4970-9を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されるわけではないFcγRIIBを発現する細胞を注射した動物モデル、たとえばBalb/cヌードマウスにおいて試験してもよい。
本発明の抗体のインビボ活性を測定するための例示的なアッセイは、以下を含んでもよい：Balb/cヌード雌性マウス（Taconic, MD）に、Daudi細胞などのFcγRIIBを発現する細胞5×106個をたとえば皮下経路によって0日目に注射する。マウス（たとえば、1群5匹）にはまた、PBS（陰性対照）、陰性対照としてch 4.4.20（抗FITC抗体）、および陽性対照として本明細書において開示される抗体などのもう一つの治療癌抗体、たとえばRituxan（たとえば、10μg/g）、または10μg/g ch8B5.3.4を、0日目に開始して週に1回、腹腔内注射を行う。マウスを注射後1週間に2回観察して、腫瘍の大きさ（長さおよび幅）を、たとえばキャリパーを用いて測定する。mgでの腫瘍の重量を以下の式を用いて推定する：(長さ×幅2)/2。
好ましくは、本発明の抗体は、同じ用量、たとえば10μg/gを少なくとも14日間、少なくとも21日間、少なくとも28日間、または少なくとも35日間の期間にわたって投与した場合に、癌治療抗体と比較して腫瘍を減少させる効能の増強を有する。最も好ましい態様において、本発明の抗体は、腫瘍の大きさを、同じ用量の癌治療抗体の投与と比較して、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍低減させる。なおもう一つの好ましい態様において、本発明の抗体は腫瘍を完全に消失する。
5.3.1 抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明にはまた、本発明の抗体（たとえば、ATCCアクセッション番号PTA-7610、PTA-4591、PTA-4592、PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960、およびPTA-5959を有するハイブリドーマクローン8B5.3.4、2B6、3H7、1D5、2El、2H9、2Dl1、または1F2によって産生されたマウスモノクローナル抗体）、または本発明の免疫法によって産生された他のモノクローナル抗体、およびそのヒト化型をコードするポリヌクレオチド、ならびにそれを産生する方法が含まれる。
本発明は、SEQ ID NO:2において開示されるATCCアクセッション番号PTA-7610を有する8B5.3.4抗体の可変重鎖をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、SEQ ID NO:1において開示されるATCCアクセッション番号PTA-7610を有する8B5.3.4抗体の可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドを包含する。
本発明の方法はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに対して様々なストリンジェンシーで、たとえば高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、または低ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。ハイブリダイゼーションは、様々なストリンジェンシー条件で行うことができる。限定としてではなく例として、低ストリンジェンシー条件を用いる技法は以下の通りである（同様にShilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792を参照されたい）。DNAを含有するフィルターを35％ホルムアミド、5×SSC、50 mMトリス-HCl（pH 7.5）、5 mM EDTA、0.1％PVP、0.1％フィコール、1％BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAを含有する溶液において40℃で6時間前処置する。ハイブリダイゼーションは、以下の改変を加えて同じ溶液において行う：0.02％PVP、0.02％フィコール、0.2％BSA、100μg/mlサケ精子DNA、10％（wt/vol）硫酸デキストラン、および5〜20×106 cpmの32P-標識プローブを用いる。フィルターをハイブリダイゼーション混合物において40℃で18〜20時間インキュベートした後、2×SSC、25 mMトリス-HCl（pH 7.4）、5 mM EDTA、および0.1％SDSを含有する溶液において55℃で1.5時間洗浄する。洗浄液を新しい溶液に交換して、60℃でさらに1.5時間インキュベートする。フィルターの水分を吸い取って、オートラジオグラフィーに曝露する。必要であれば、フィルターを65〜68℃で3回洗浄して、フィルムに再度曝露する。用いてもよい他の低ストリンジェンシー条件は、当技術分野において周知である（たとえば、種間ハイブリダイゼーションのために使用される場合など）。限定的ではない例として、高ストリンジェンシー条件を用いる技法は以下の通りである。DNAを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、6×SSC、50 mMトリス-HCl（pH 7.5）、1 mM EDTA、0.02％PVP、0.02％フィコール、0.02％BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAからなる緩衝液において65℃で8時間から終夜行う。フィルターを、100μg/ml変性サケ精子DNA、および32P標識プローブ5〜20×106 cpmを含有するプレハイブリダイゼーション混合物において65℃で48時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄は、2X SSC、0.01％PVP、0.01％フィコール、および0.01％BSAを含有する溶液において37℃で1時間行う。この後、0.1×SSCにおいて50℃で45分間洗浄を行った後、オートラジオグラフィーを行う。用いてもよい他の高ストリンジェンシー条件は、当技術分野において周知である。そのような適当なストリンジェンシー条件の選択は、当技術分野において周知である（たとえば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい；同様に、Ausubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, (著作権) 1987-1997, Current Protocols, (著作権) 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.も参照されたい；特に、Dyson, 1991, "Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis," In: Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Vol. 2, T.A. Brown, ed., pp. 111-156, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UKを参照されたい）。
当技術分野において公知の任意の方法によって、ポリヌクレオチドを得て、得られたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。
抗体をコードするポリヌクレオチドは、Ig特異的プローブとのハイブリダイゼーションおよび／または配列の3'および5'末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるPCR増幅によって、またはたとえば抗体をコードするcDNAライブラリからのcDNAクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングによって、適切な供給源由来の核酸（たとえば、本発明の抗体、たとえば8B5.3.4を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する任意の組織または細胞から生成されたcDNAライブラリ、またはそれらから単離された核酸、好ましくはポリA+ RNA）から生成されてもよい。次に、PCRによって生成された増幅された核酸を、当技術分野において周知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローニングしてもよい。
抗体のヌクレオチド配列を決定した後、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成するために、たとえばアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を作製するために、ヌクレオチド配列を操作するために当技術分野において周知の方法、たとえば組換えDNA技術、部位特異的変異誘発、PCR等（たとえば、その全内容物がいずれも参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYにおいて記述されている技術を参照されたい）を用いて抗体のヌクレオチド配列を操作してもよい。
特定の態様において、CDRの一つまたは複数を慣例的な組換えDNA技術を用いてフレームワーク領域に挿入する。フレームワーク領域は、天然に存在するフレームワーク領域、またはコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域であってもよい（たとえば、ヒトフレームワーク領域の一覧に関してChothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479を参照されたい）。好ましくはフレームワーク領域およびCDRの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、前記で考察したように、一つまたは複数のアミノ酸置換をフレームワーク領域内で行ってもよく、好ましくはアミノ酸置換は、FcγRIIBに対する本発明の抗体の結合を改善する。
もう一つの態様において、当技術分野において利用可能なヒトライブラリまたは任意の他のライブラリを、本発明の抗体をコードする核酸をクローニングするために、当技術分野において公知の標準的な技術によってスクリーニングすることができる。
5.3.2 抗体の組換え発現
本発明の抗体をコードする核酸配列が得られた後、抗体の産生のためのベクターを当技術分野において周知の技術を用いて組換えDNA技術によって産生してもよい。当業者に周知である方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、たとえばインビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる（たとえば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYにおいて記述される技術を参照されたい）。
抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、通常の技術（たとえば、電気穿孔、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈殿）によって宿主細胞に移入させることができ、トランスフェクトされた細胞を本発明の抗体を産生するために通常の技術によって培養する。特定の態様において、抗体の発現は、構成的、誘導型、または組織特異的プロモーターによって調節される。
本発明の組換え抗体を発現するために用いられる宿主細胞は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌細胞であってもよく、または好ましくは、特に組換え免疫グロブリン分子全体を発現させるために真核細胞であってもよい。特に、ヒトサイトメガロウイルスの前初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）などの哺乳動物は、免疫グロブリンの有効な発現系である（Foecking et al., 1998, Gene 45:101；Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2）。
多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明の抗体を発現させてもよい。そのような宿主発現系は、それによって抗体のコード配列が産生され、その後精製されてもよい媒体を表すが、同様に、適切なヌクレオチド配列コード配列によって形質転換またはトランスフェクトされた場合に本発明の抗体をインサイチューで発現してもよい細胞を表す。これらには、免疫グロブリンコード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換された細菌（たとえば、大腸菌および枯草菌（B. subtilis））などの微生物；免疫グロブリンコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母（たとえば、サッカロミセス・ピチア（Saccharomyces Pichia））；免疫グロブリンコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；免疫グロブリンコード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）およびタバコモザイクウイルス（TMV））に感染させた、または免疫グロブリンコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（たとえばTiプラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（たとえば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（たとえば、COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞、リンパ様細胞（U.S. 5,807,715を参照されたい）、Per C.6細胞（Crucellによって開発されたラット網膜細胞））が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
細菌系において、発現する抗体に関して意図される用途に応じて、多数の発現ベクターを都合よく選択してもよい。たとえば、抗体の薬学的組成物を生成するためにそのようなタンパク質を大量に産生する場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を指示するベクターが望ましい可能性がある。そのようなベクターには、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列がlacZコード領域にインフレームでベクターに個々にライゲーションされてもよい大腸菌発現ベクターpUR278（Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。pGEXベクターも同様にグルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために用いてもよい。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオンアガロースビーズに対して吸着および結合させた後に、遊離したグルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出されうるように、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含めるように設計される。
昆虫系において、外来遺伝子を発現させるためにオートグラファ・カルフォルニカ（Autographa californica）核多角体ウイルス（AcNPV）をベクターとして用いる。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞において成長する。抗体コード配列を、ウイルスの非必須領域（たとえば、多角体遺伝子）において個々にクローニングして、AcNPVプロモーター（たとえば、多角体プロモーター）の制御下に置いてもよい。
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスに基づく発現系を利用してもよい。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、関心対象の抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三連リーダー配列にライゲーションしてもよい。次に、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば、領域E1またはE3）における挿入によって、生存可能で感染宿主において免疫グロブリン分子を発現することができる組換えウイルスが得られるであろう（たとえば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359を参照されたい）。特異的な開始シグナルもまた、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要である可能性がある。これらのシグナルには、ATG開始コロンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入物全体を確実に翻訳するために所望のコード配列の読み取り枠と相が一致していなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、多様な起源、すなわち天然および合成起源の双方でありうる。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含めることによって、発現効率を増強してもよい（Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照されたい）。
さらに、挿入された配列の発現を調節する、または所望の特異的方法で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のそのような改変（たとえば、グリコシル化）およびプロセシング（たとえば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要となる可能性がある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的で特異的な機構を有する。発現する外来タンパク質が確実に正確に改変およびプロセシングされるように、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適当なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を用いてもよい。そのような哺乳動物宿主細胞には、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL7030、ならびにHs578Bstが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
組換えタンパク質を長期に高収率で産生するためには、安定な発現が好ましい。たとえば、本発明の抗体を安定に発現する細胞株を操作してもよい。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを用いるよりむしろ、適切な発現制御エレメント（たとえば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）および選択マーカーによって制御されるDNAによって、宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後、操作された細胞を濃縮培地において1〜2日間成長させた後、選択培地に切り換える。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与して、それによって細胞はその染色体にプラスミドを安定に組み入れ、増殖して細胞増殖巣（foci）を形成することができ、次にこれをクローニングして細胞株に発展させることができる。この方法は、本発明の抗体を発現する細胞株を操作するために都合よく用いられる可能性がある。そのような操作された細胞株は、本発明の抗体と直接または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用となる可能性がある。
単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22:817）遺伝子が含まれるがこれらに限定されるわけではない多数の選択系を用いてもよく、これらはtk-、hgprt-、またはaprt-細胞においてそれぞれ使用することができる。同様に、抗代謝剤耐性を、以下の遺伝子の選択の基礎として用いることができる：メソトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo（Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu, 1991, 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215）。用いることができる組換えDNA技術分野において一般的に公知の方法は、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；およびin Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre- Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerre et al., 1984, Gene 30:147）において記述されている。
本発明の抗体の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（概説に関しては、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)を参照されたい）。抗体を発現するベクターシステムにおけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルが増加すれば、マーカー遺伝子のコピー数が増加すると考えられる。増幅した領域が抗体のヌクレオチド配列に関連することから、抗体の産生も同様に増加すると考えられる（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
宿主細胞を、本発明の二つの発現ベクター、すなわち重鎖由来ポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二のベクターによって同時トランスフェクトしてもよい。二つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの双方をコードする単一のベクターを用いてもよい。そのような状況では遊離した毒性の重鎖の過剰を回避するために、軽鎖を重鎖の前に置くべきである（Proudfoot, 1986, Nature 322:52；Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197）。重鎖および軽鎖のコード配列はcDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
本発明の抗体が組換えによって発現した後、抗体を精製するために当技術分野において公知の任意の方法、たとえばクロマトグラフィー（たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインAに関する特異的抗原に対する親和性によるアフィニティクロマトグラフィー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心法、溶解度の差によって、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準的な技術によって、抗体を精製してもよい。
5.4 予防および治療の方法
本発明は、FcγRIIBの異常なレベルまたは活性に関連する、および／またはFcγRIIB活性に関連する免疫機能を変更させること、第二の治療抗体の細胞障害活性を増強すること、またはワクチン組成物の効能を増強することによって処置可能な、疾患、障害、または感染症に関連する症状を予防、処置、または改善するための、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトに本発明の抗体の一つまたは複数を投与する段階を伴う、抗体に基づく治療を包含する。いくつかの態様において、本発明の一つまたは複数の抗体の投与による治療は、化学療法、放射線療法、ホルモン治療、および／または生物治療／免疫療法などの、しかしこれらに限定されない一つまたは複数の治療の投与と併用される。
抗体は、当技術分野において公知の、または本明細書において記述される、薬学的に許容される組成物において提供されてもよい。以下に詳細に記述されるように、本発明の抗体は、癌（特に、受動免疫療法を増強する、または癌ワクチンの効能を増強するため）、自己免疫疾患、炎症性障害、またはアレルギー（たとえば、アレルギーを処置するためのワクチンの抗力を増強するため）を処置する方法において用いることができる。
FcγRIIB（CD32B）は、以下の組織において発現することが見いだされている：脂肪、b-細胞、骨、脳、軟骨、結腸、内分泌、眼、胎児、消化管、尿生殖器、生殖細胞、頭頚部、腎臓、肺、リンパ節、リンパ網内系、乳腺、筋肉、神経、卵巣、膵臓、膵島、下垂体、胎盤、網膜、皮膚、軟組織、滑膜、および子宮（the Cancer Genome Anatomy Project of the National Cancer Instituteから収集したデータ）。このように、本発明の抗体は、これらの任意の組織におけるFcγRIIBの活性にアゴニストとして作用する、または拮抗するために用いることができる。たとえば、FcγRIIBは胎盤において発現し、胎児へのIgGの輸送において、同様に免疫複合体の清掃において役割を果たす可能性がある（Lyden et al., 2001, J. Immunol. 166:3882- 3889）。本発明の一定の態様において、抗FcγRIIB抗体は流産促進物質として用いることができる。
本発明者らは、意外にも好中球が有意なレベルのFcγRIIBを発現しないことを見いだした。したがって、本発明は、腫瘍細胞、またはマクロファージなどの非好中球細胞タイプに結合して活性を有するが、好中球に対して検出可能に結合せず、または検出可能な活性を有しないCD32特異的抗体の量を含む方法、およびこれらの方法において用いる薬学的組成物を提供する。一定の態様において、本発明の抗体は、マクロファージまたはCD32B発現腫瘍細胞などのCD32B+細胞を枯渇させるために用いることができる。
疾患、障害、または感染症の予防および／または治療物質として機能する本発明の抗体は、疾患、障害、または感染症に関連する一つまたは複数の症状を処置、予防、または改善するために動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトに投与することができる。本発明の抗体は、FcγRIIBの異常なレベルまたは活性に関連する、および／またはFcγRIIB活性に関連する免疫機能を変更させることによって処置可能な、疾患、障害、または感染症の処置、予防、または管理において有用な一つまたは複数の他の予防および／または治療物質と併用して投与することができる。一定の態様において、本発明の一つまたは複数の抗体は、癌の処置にとって有用な一つまたは複数の他の治療物質と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。「同時に」という用語は、正確に同じ時間での予防または治療物質の投与に限定されるのではなく、「同時」ではなく投与された場合より大きな利益を提供するように本発明の抗体が他の物質と共に作用することができるように、本発明の抗体と他の物質とが順に、および一定期間内に被験者に投与されることを意味する。たとえば、それぞれの予防または治療物質は、同じ時点で、または異なる時点で任意の順序で連続的に投与してもよい；しかし同時に投与しない場合、それらは所望の治療または予防効果を提供するために十分に近い時間で投与すべきである。それぞれの治療物質は、任意の適切な剤形で、および任意の適当な経路によって、個々に投与することができる。
様々な態様において、予防または治療物質は、1時間未満の間隔で、約1時間の間隔で、約1時間〜約2時間の間隔で、約2時間〜約3時間の間隔で、約3時間〜約4時間の間隔で、約4時間〜約5時間の間隔で、約5時間〜約6時間の間隔で、約6時間〜約7時間の間隔で、約7時間〜約8時間の間隔で、約8時間〜約9時間の間隔で、約9時間〜約10時間の間隔で、約10時間〜約11時間の間隔で、約11時間〜約12時間の間隔で、わずか24時間の間隔で、または48時間を超えないの間隔で投与される。好ましい態様において、二つまたはそれより多い成分が同じ患者の受診時に投与される。
本明細書において提供される投与量および投与回数は、治療的有効および予防的有効という用語に包含される。用量および回数はさらに典型的に、投与される特定の治療または予防物質、癌の重症度およびタイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、反応、および過去の既往に応じて、各患者に対して特異的な要因に従って変化する。当業者は、そのような要因を考慮することによって、たとえば文献において報告され、Physician's Desk Reference（56th ed., 2002）において推奨される用量に従うことによって適切なレジメンを選択することができる。
本発明の抗体はまた、FcγRIIBを増強する、たとえば抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させるように、および免疫応答を増加させるように作用する、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体、Fc融合タンパク質、またはリンフォカイン、サイトカイン、もしくは造血増殖因子（たとえば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-10およびTGF-βなど）と併用して都合よく利用されてもよい。一定の態様において、サイトカインは、抗FcγRIIB抗体に結合する。
本発明の抗体はまた、たとえば以下の5.4.6および5.4.5章において記述される、たとえば抗癌剤、抗炎症剤、または抗ウイルス剤などの、疾患、障害、または感染症を処置するために用いられる一つまたは複数の薬物と併用して都合よく利用されてもよい。
5.4.1 癌
本発明の抗体は、原発性腫瘍の成長または癌様細胞の転移を予防、阻害、または低減させるために、単独で、または当技術分野において公知の他の治療抗体と併用して用いることができる。一つの態様において、本発明の抗体は、癌免疫療法において用いられる抗体と併用して用いることができる。本発明は、治療抗体のエフェクター機能、たとえばADCC、CDC、貪食、オプソニン化等の抗力を増加させることによって、そのような免疫療法の効能を増強するためにもう一つの治療抗体と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、本発明の抗体は、好ましくは単球およびマクロファージ上のFcγRIIBを遮断して、それにより、たとえば活性化FcγRによって媒介される腫瘍の除去を増強することによって、腫瘍特異的抗体の治療的利益、臨床効能を増強する。したがって、本発明は、癌抗原に特異的に結合して細胞障害性であるもう一つの抗体と併用して投与した場合に、癌抗原を特徴とする癌を予防または処置する方法を提供する。本発明の抗体は、癌の予防または処置にとって、特に本発明の抗体による殺腫瘍細胞を増強するために細胞障害活性を有する癌抗原特異的治療抗体の細胞障害活性を強化するために、および／またはたとえば治療抗体のADCC活性またはCDC活性を増強するために、有用である。本発明の一定の態様において、本発明の抗体は、Fc融合タンパク質と共に投与される。特定の態様において、本発明の抗体は、単独でまたは細胞障害性の治療抗体と併用して投与した場合に、原発性腫瘍の成長または癌様細胞の転移を、本発明の抗体の非存在下での原発性腫瘍の成長または転移と比較して少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％、または少なくとも10％阻害または低減させる。好ましい態様において、細胞障害性治療抗体と併用した本発明の抗体は、原発性腫瘍の成長または転移を、抗体の非存在下での成長または転移と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％、または少なくとも10％阻害または低減させる。
正常から悪性状態への移行は、遺伝的および後成的変化を伴う多段階プロセスである。実際、組織の恒常性を通常調節する最終分化および静止への関与から腫瘍細胞を回避させることができるこの進行を促進する多数の変更が、細胞調節回路において起こる。一定の遺伝子がCSF-1（コロニー刺激因子1またはマクロファージコロニー刺激因子）のように癌細胞の浸潤性および転移能に関係している。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、CSF-1は、腫瘍の進行を促進する腫瘍部位にマクロファージをリクルートすることによって、腫瘍の進行および転移を媒介する可能性がある。マクロファージは、おそらく血管新生因子の分泌によって、たとえばチミジンホスホリラーゼ、血管内皮由来増殖因子の分泌によって、腫瘍細胞に対してパラクライン因子として作用することができる上皮細胞増殖因子などの増殖因子の分泌によって、腫瘍の進行および転移を媒介するために栄養的役割を果たし、このように腫瘍細胞の遊走および血管への浸潤を促進すると考えられる（たとえば、Lin et al., 2001, J. Exp. Med. 193(6): 727-739；Lin et al., 2002, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasam 7(2): 147-162；Scholl et al., 1993, Molecular Carcinogenesis, 7: 207-11；Clynes et al., 2000, Nature Medicine, 6(4): 443-446；Fidler et al., 1985, Cancer Research, 45: 4714-26を参照されたい）。
本発明は、マクロファージ媒介腫瘍細胞進行および転移を遮断するために本発明の抗体を用いることを包含する。本発明の抗体は、マクロファージの浸潤が起こる固形腫瘍の処置において特に有用である。本発明のアンタゴニスト抗体は、腫瘍部位に局在するマクロファージ集団を低減または排除することによって、腫瘍細胞の転移を制御する、たとえば低減または排除するために、特に有用である。いくつかの態様において、本発明の抗体は、腫瘍細胞の転移を制御するために単独で用いられる。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、本発明のアンタゴニスト抗体は、単独で投与した場合に、マクロファージ上の阻害性のFcγRIIBに結合して、マクロファージ集団を有効に低減させ、それにより腫瘍細胞の進行を制限する。本発明のアンタゴニスト抗体は、FcγRIIBが腫瘍浸潤性マクロファージが含まれる活性化単球およびマクロファージ上で選択的に発現することから、腫瘍部位に局在するマクロファージを低減する、好ましくは排除する。いくつかの態様において、本発明の抗体は、乳腺、子宮および卵巣癌が含まれるがこれらに限定されるわけではないCSF-1の過剰発現を特徴とする癌の処置において用いられる。
本発明はさらに、FcγRIIBを発現するマクロファージ以外の免疫細胞、たとえば樹状細胞およびB細胞を有効に枯渇または排除する抗体を包含する。本発明の抗体を用いる免疫細胞の有効な枯渇または排除は、免疫細胞集団の50％、60％、70％、80％、好ましくは90％、および最も好ましくは99％低減の範囲であってもよい。このように、本発明の抗体は、単独または第二抗体、たとえば抗腫瘍抗体、抗ウイルス抗体、および抗微生物抗体と併用した場合に増強された治療効能を有する。いくつかの態様において、治療抗体は、癌細胞または炎症細胞に対して特異性を有する。他の態様において、第二抗体は、正常細胞に結合する。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、FcγRIIB発現免疫細胞を枯渇するために本発明の抗体を単独で用いる場合、細胞集団は、残っている細胞が活性化Fc受容体を効率よく有し、それによりFcγRIIBによる抑制が緩和されるように、再分布される。第二抗体、たとえば治療抗体と併用して用いる場合、第二抗体の効能は、抗体のFc媒介エフェクター機能を増加させることによって増強される。
本発明の方法および組成物によって処置または予防することができる癌および関連障害には、以下が含まれるがこれらに限定されるわけではない：急性白血病、急性リンパ球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、および骨髄異形成症候群などの急性骨髄性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病などの慢性白血病が含まれるがこれらに限定されるわけではない白血病；真性赤血球増加；ホジキン病、非ホジキン病などの、しかしこれらに限定されないリンパ腫；黒化多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、プラスマ細胞白血病、孤立性プラスマ細胞腫、および髄外プラスマ細胞種などの、しかしこれらに限定されない多発性骨髄腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；有意性不明の単一クローン性高ガンマグロブリン血症；良性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症；重鎖病；骨の肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫などのしかしこれらに限定されない骨および結合組織肉腫；神経膠腫、星状細胞種、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍、前庭神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない脳腫瘍；腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、髄質性乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭乳癌、ページェット病、および炎症性乳癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない乳癌；褐色細胞腫、および副腎皮質癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない副腎癌；乳頭または濾胞甲状腺癌、髄様甲状腺癌、および未分化甲状腺癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない甲状腺癌；インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍およびカルチノイドまたは島細胞腫瘍が含まれるがこれらに限定されるわけではない膵臓癌；クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端肥大症、および尿崩症が含まれるがこれらに限定されるわけではない下垂体癌；虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫などの眼の黒色腫、ならびに網膜芽腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない眼の癌；扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない膣癌；扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびページェット病が含まれるがこれらに限定されるわけではない外陰部の癌；扁平上皮癌および腺癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない子宮頚癌；子宮内膜癌および子宮肉腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない子宮癌；卵巣上皮癌、境界悪性卵巣腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質腫瘍が含まれるがこれらに限定されるわけではない卵巣癌；扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、プラスマ細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない食道癌；腺癌、カビ状（ポリープ状）、潰瘍性、表層部に広がる、広範に広がる、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない胃癌；結腸癌；直腸癌；肝細胞癌および肝芽腫、腺癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない胆嚢癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない肝臓癌；乳頭、結節性、およびびまん性が含まれるがこれらに限定されるわけではない胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮癌（上皮様癌）、腺癌、大細胞癌、および小細胞肺癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない肺癌；胚腫瘍、セミノーマ、未分化、古典的（典型的）、精母細胞、非セミノーマ、胎芽癌、奇形腫癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない前立腺癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない精巣癌；陰茎癌；扁平上皮癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない口腔癌；基底癌；腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない唾液腺癌；扁平上皮癌およびいぼ状が含まれるがこれらに限定されるわけではない咽頭癌；基底細胞癌、扁平上皮癌、および黒色腫、表層部に広がる黒色腫、結節性黒色腫、黒子悪性黒色腫、末端部黒子黒色腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない皮膚癌；腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞癌（腎盂および／または尿管）が含まれるがこれらに限定されるわけではない腎臓癌；ウィルムス腫瘍；移行細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない膀胱癌。さらに、癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、および乳頭腺癌が含まれる（そのような障害の概説に関しては、Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., PhiladelphiaおよびMurphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照されたい）。
したがって、本発明の方法および組成物はまた、以下が含まれる（がこれらに限定されるわけではない）多様な癌または他の異常な増殖疾患の処置または予防において有用である：膀胱、乳腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺および皮膚の癌が含まれる癌；扁平上皮癌が含まれる；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーケット（Berketts）リンパ腫が含まれるリンパ球系列の造血腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病が含まれる骨髄系列の造血腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫が含まれる間葉起源の腫瘍；黒色腫、セミノーマ、奇形癌、神経芽腫および神経膠腫が含まれる他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、および神経鞘腫が含まれる中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫が含まれる間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、セミノーマ、甲状腺濾胞癌、および奇形癌が含まれる他の腫瘍。アポトーシスの異常によって引き起こされる癌もまた、本発明の方法および組成物によって処置される。そのような癌には、濾胞性リンパ腫、p53変異を有する癌、乳腺、前立腺および卵巣のホルモン依存的腫瘍、家族性線腫性ポリポーシスなどの前癌様病変、および骨髄異形成症候群が含まれてもよいがこれらに限定されるわけではない。特定の態様において、悪性または増殖異常変化（化生および異形成など）、または過増殖障害は、卵巣、膀胱、乳腺、結腸、肺、皮膚、膵臓、または子宮において、本発明の方法および組成物によって処置または予防される。他の特定の態様において、肉腫、黒色腫、または白血病は、本発明の方法および組成物によって処置または予防される。
癌抗原に関連する癌は、癌抗原に結合して細胞障害性である抗体と併用して本発明の抗体を投与することによって処置または予防される可能性がある。一つの特定の態様において、本発明の抗体は、特定の癌抗原に向けられる抗体の抗体媒介性細胞障害効果を増強する。たとえば、限定的ではないが、以下の癌抗原に関連する癌は、本発明の方法および組成物によって処置または予防される可能性がある。KS 1/4汎癌腫抗原（Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142:32-37；Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415）、卵巣癌抗原（CA125）（Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2):48-475）、前立腺酸ホスフェート（Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(1):4928）、前立腺特異抗原（Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910；Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53:227-230）、黒色腫関連抗原p97（Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-44）、黒色腫抗原gp75（Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380）、高分子量黒色腫抗原（HMW-MAA）（Natali et al., 1987, Cancer 59:55-3；Mittelman et al., 1990, J. Clin. Invest. 86:2136-2144）、前立腺特異的膜抗原、癌胎児抗原（CEA）（Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294）、多形上皮ムチン抗原、ヒト乳脂乳球抗原、CEA、TAG-72（Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52:3402-3408）、CO17-1A（Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Cancer 53:751-758）、GICA 19-9（Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135）、CTA-1、およびLEAなどの結腸直腸腫瘍関連抗原、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19（Ghetie et al., 1994, Blood 83:1329-1336）、ヒトBリンパ腫抗原-CD20（Reff et al., 1994, Blood 83:435-445）、CD33（Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430）、ガングリオシドGD2（Saleh et al., 1993, J. Immunol., 151, 3390-3398）、ガングリオシドGD3（Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380）、ガングリオシドGM2（Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044）、ガングリオシドGM3（Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53:5244-5250）などの黒色腫特異抗原、T抗原DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原が含まれるウイルス誘発性の腫瘍抗原などの腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（TSTA）、結腸のCEAなどの癌胎児抗原-α-フェトプロテイン、膀胱腫瘍癌胎児抗原（Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188）、ヒト肺癌抗原L6、L20（Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3923）などの分化抗原、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原-Gp37（Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141:1398-1403）、ネオ糖タンパク質、スフィンゴリピッド、EGFR（上皮細胞増殖因子受容体）などの乳癌抗原、HER2抗原（pl85HER2）、多形上皮ムチン（PEM）（Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359）、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1（Bernhard et al., 1989, Science 245:301-304）、胎児赤血球および始原内胚葉において見いだされるI抗原などの分化抗原（Feizi, 1985, Nature 314:53-57）、胃腺癌において見いだされるI(Ma)、乳腺上皮において見いだされるM18およびM39、骨髄細胞において見いだされるSSEA-1、結腸直腸癌において見いだされるVEP8、VEP9、My1、VIM-D5、およびD156-22、TRA-1-85（血液群H）、結腸腺癌において見いだされるC14、肺腺癌において見いだされるF3、胃癌において見いだされるAH6、Yハプテン、胎児癌細胞において見いだされるLey、TL5（血液群A）、A431細胞において見いだされるEGF受容体、膵臓癌において見いだされるE1シリーズ（血液群B）、胎児癌細胞において見いだされるFC 10.2、胃腺癌、腺癌において見いだされるCO-514（血液群Lea）、腺癌において見いだされるNS-10、CO-43（血液群Leb）、G49、結腸腺癌において見いだされるEGF受容体（血液群ALeb/Ley）、結腸癌において見いだされる19.9、胃癌ムチン、骨髄細胞において見いだされるT5A7、黒色腫において見いだされるR24、胎生期癌細胞において見いだされる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8、ならびに4〜8細胞期胚において見いだされるSSEA-3、SSEA-4。もう一つの態様において、抗原は、皮膚T細胞リンパ腫に由来するT細胞受容体由来ペプチドである（Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62を参照されたい）。
本発明の抗体は、処置の効能を増強するために当技術分野において公知の任意の治療的癌抗体と併用して用いることができる。たとえば、本発明の抗体は、癌の処置において治療的有用性が証明されている、表7における任意の抗体と共に用いることができる。本発明の抗体は、治療的癌抗体の少なくとも一つの抗体媒介性エフェクター機能を増強することによって、治療的癌抗体の処置の効能を増強する。一つの特定の態様において、該抗体は、治療的癌抗体の補体依存的カスケードを増強することによって、処置の効能を増強する。本発明のもう一つの態様において、本発明の抗体は、標的腫瘍細胞の貪食およびオプソニン化を増強することによって、処置の効能を増強する。本発明のもう一つの態様において、本発明の抗体は、標的となる腫瘍細胞の破壊における抗体依存的細胞媒介性細胞障害性（「ADCC」）を増強することによって、処置の効能を増強する。
本発明の抗体はまた、生得的なおよび後天性の免疫応答の活性化物質として開発されている（Coley Pharmaceuticals）、または現在開発中であるシトシン-グアニンジヌクレオチド（「CpG」）に基づく産物と併用して用いることができる。たとえば、本発明は、癌の処置および／または予防のために本発明の方法および組成物においてCpG 7909、CpG 8916、CpG 8954（Coley Pharmaceuticals）を用いることを包含する（同様に、参照により本明細書に組み入れられる、Warren et al., 2002, Semin Oncol., 29(1 Suppl 2):93-7；Warren et al., 2000, Clin Lymphoma, 1(1):57-61を参照されたい）。
本発明の抗体は、抗体の治療活性を強化するために殺細胞を通してその治療効果を媒介しない治療抗体と併用して用いることができる。特定の態様において、本発明は、アゴニスト活性を有する治療的アポトーシス誘導抗体、たとえば抗Fas-抗体と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。抗Fas抗体は当技術分野において公知であり、これにはたとえばJo2（Ogasawara et al., 1993, Nature 364: 806）、およびHFE7（Ichikawa et al., 2000, Int. Immunol. 12: 555）が含まれる。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、FcγRIIBは、抗Fas媒介アポトーシスの促進に関係している。たとえばXu et al., 2003, Journal of Immunology, 171: 562-568を参照されたい。実際、FcγRIIBの細胞外ドメインは、Fas受容体のクロスリンク剤として作用してもよく、それによって機能的複合体およびFas依存的アポトーシスの促進に至る。いくつかの態様において、本発明の抗体は、抗Fas抗体とFcγRIIBとの相互作用を遮断し、それによってFas媒介アポトーシス活性の低減に至る。それによってFas媒介アポトーシス活性の低減が起こる本発明の抗体は、望ましくない副作用、たとえば肝毒性を有する抗Fas抗体と併用した場合に特に有用である。他の態様において、本発明の抗体は、抗Fas抗体とFcγRIIB抗体との相互作用を増強し、それによってFas媒介アポトーシス活性の増強に至る。本発明の抗体と、アゴニスト活性を有する治療的アポトーシス誘導抗体との併用は、増強された治療効能を有する。
本発明の方法において用いられる治療的アポトーシス誘導抗体は、アポトーシス経路の調節のために当技術分野において公知の任意の細胞死受容体、たとえばTNFR受容体ファミリーに対して特異的であってもよい。
本発明は、アポトーシス媒介シグナル伝達が損傷された疾患、たとえば癌、自己免疫疾患を処置する方法を提供する。特定の態様において、本発明は、抗Fas抗体と併用して本発明の抗体を投与する段階を含む、Fas媒介アポトーシスが欠損している疾患を処置する方法を包含する。
いくつかの態様において、本発明のアゴニスト抗体は、黒色腫細胞の腫瘍が含まれる非造血起源の腫瘍の処置にとって特に有用である。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、黒色腫細胞の腫瘍が含まれる非造血起源の腫瘍はFcγRIIBを発現することから、本発明のアゴニスト抗体の効能は部分的にFcγRIIB阻害経路の活性化による。実際、最近の実験により、黒色腫細胞におけるFcγRIIBの発現は、抗腫瘍抗体との直接相互作用（たとえば、抗腫瘍抗体のFc領域に結合することによって）によって、細胞質内依存的に腫瘍の成長を調節することが示されている（Cassard et al., 2002, Journal of Clinical Investigation, 110(10): 1549-1557）。
いくつかの態様において、本発明は、腫瘍細胞自身には発現していないが、周辺の反応性で腫瘍を支持する腫瘍間質を含む非悪性細胞において発現する腫瘍抗原に免疫特異的に結合する治療抗体と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。腫瘍の間質は、新しい血管を形成する内皮細胞と、腫瘍血管周囲の間質の線維芽細胞とを含む。特定の態様において、本発明の抗体は、内皮細胞において腫瘍抗原に免疫特異的に結合する抗体と併用して用いられる。好ましい態様において、本発明の抗体は、線維芽細胞上で腫瘍抗原、たとえば線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）に免疫特異的に結合する抗体と併用して用いられる。FAPは、肺、乳腺、および結腸直腸癌が含まれるがこれらに限定されるわけではない多くの固形腫瘍の間質の線維芽細胞において高度に発現している95 KDaのホモ二量体II型糖タンパク質である（たとえば、Scanlan et al., 1994; Proc. Natl. Acad. USA, 91: 5657-61；Park et al., 1999, J. Biol. Chem., 274: 36505-12；Rettig et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3110-3114；Garin-Chesea et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7235-7239を参照されたい）。FAPと免疫特異的に結合する抗体は当技術分野において公知であり、本発明に包含され、たとえばその全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Wuest et al., 2001, Journal of Biotechnology, 159-168；Mersmann et al., 2001, Int. J. Cancer, 92: 240-248；米国特許第6,455,677号を参照されたい。
最近、IgEは、腫瘍の成長の媒介物質として関係しており、実際にIgE標的化即時型過敏症およびアレルギー炎症反応は、抗腫瘍反応に関係する起こりうる天然の機構として提示されている（概説に関しては、Mills et al., 1992, Am. Journal of Epidemiol. 122: 66-74；Eriksson et al., 1995, Allergy 50: 718-722を参照されたい）。実際に、最近の研究により、腫瘍細胞にIgEを負荷すると、腫瘍の成長を低減させ、いくつかの場合において腫瘍拒絶に至ることが示されている。試験によれば、IgEを負荷された腫瘍細胞は、治療能を有するのみならず、生得の免疫エフェクター機構の活性化およびT細胞媒介適応免疫応答が含まれる、長期間の抗腫瘍免疫を付与する。その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Reali et al., 2001, Cancer Res. 61: 5516-22を参照されたい。本発明のアンタゴニスト抗体は、IgE媒介癌治療の効能を増強するために、IgEの投与と併用して癌の処置および／または予防において用いてもよい。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、本発明の抗体は、阻害経路を遮断することによって、腫瘍のIgE処置の治療効能を増強する。本発明のアンタゴニスト抗体は、（i）腫瘍の成長の遅延を増強すること；（ii）腫瘍の進行速度の減少を増強すること；（iii）腫瘍拒絶を増強すること；または（iv）IgE単独による癌の処置と比較して保護免疫を増強すること、によってIgE媒介癌治療の治療効能を増強する可能性がある。
癌治療およびその用量、投与経路および推奨用途は、当技術分野において公知であって、文献において記述されている。たとえばPhysician's Desk Reference（56th ed., 2002、参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
5.4.1.1 B細胞悪性疾患
本発明は、B細胞悪性疾患、またはその一つもしくは複数の症状を予防、処置、管理、または改善するために、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトに抗FcγRIIB抗体を投与する段階を必要とする治療を包含する。これらの治療は、現行の治療に対する増強である。一定の場合において、現行の治療に対して不応性である患者を、本発明の方法によって処置することができる。いくつかの態様において、本発明の一つまたは複数の抗体の投与による治療を、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物療法／免疫療法などの、しかしこれらに限定されない一つまたは複数の治療の投与と併用する。
本発明は、B細胞悪性疾患、またはその一つもしくは複数の症状に関する現行の単剤治療または併用治療よりよい予防および治療プロフィールを提供する処置プロトコールを包含する。本発明は、B細胞悪性疾患またはその一つもしくは複数の症状の予防、処置、管理、または改善のためにFcγRIIB抗体に基づく治療を提供する。特に、本発明は、FcγRIIB特異的抗体、その類似体、誘導体、または抗原結合断片を、それを必要とする被験者に投与する段階を含む、B細胞悪性疾患またはその一つもしくは複数の症状を予防、処置、管理、または改善するための予防および治療プロトコールを提供する。
本発明のアゴニスト抗体は、任意のB細胞悪性疾患、特に非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病を処置または予防するために有用である。他のB細胞悪性疾患には、小リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性核切れ込み小細胞型リンパ腫、大半の濾胞性リンパ腫、およびいくつかのびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）が含まれる。FcγRIIBは、悪性リンパ腫、特にB細胞非ホジキンリンパ腫における染色体転座による調節異常の標的である（Callanan M.B. et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(l):309-314を参照されたい）。このように、本発明の抗体は、B細胞系列の任意の慢性リンパ球性白血病を処置または予防するために有用である。B細胞系列の慢性リンパ球性白血病は、Freedman（Freedman, 1990, Hemtaol. Oncol. Clin. North Am. 4:405による概説を参照されたい）によって概説されている。任意の作用機序に拘束されることを意図しないが、本発明のアゴニスト抗体は、B細胞の増殖および／または活性化を阻害して、B細胞悪性疾患を阻害または予防する。本発明はまた、B細胞悪性疾患の予防および／または処置のために当技術分野において公知の他の治療（たとえば、化学療法および放射線療法）と併用して本発明のアゴニスト抗体を用いることを包含する。本発明はまた、B細胞悪性疾患の予防および／または処置のために当技術分野において公知の他の抗体と併用して本発明のアゴニスト抗体を用いることを包含する。たとえば本発明のアゴニスト抗体は、Goldenberg et al.（米国特許第6,306,393号）によって開示される抗C22もしくは抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD33抗体、または抗CD52抗体と併用して用いることができる。
本発明の抗体はまた、たとえば、ただし非限定的に、Oncoscint（標的：CEA）、Verluma（標的：GP40）、Prostascint（標的：PSMA）、CEA-SCAN（標的：CEA）、Rituxin（標的CD20）、Herceptin（標的：HER-2）、Campath（標的：CD52）、Mylotarge（標的：CD33）、LymphoCide（CD22）、Lymphocide Y-90（CD22）、およびZevalin（標的：CD20）との併用において用いることができる。
5.4.2 自己免疫疾患および炎症性疾患
本発明のアゴニスト抗体は、自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防するために用いてもよい。本発明は、本発明の抗体またはその断片の治療的有効量を被験者に投与する段階を含む、被験者における自己免疫または炎症性障害に関連する一つまたは複数の症状を予防、処置、または管理する方法を提供する。本発明はまた、一つまたは複数の抗炎症剤の治療的有効量を被験者に投与する段階をさらに含む、被験者における炎症性障害に関連する一つまたは複数の症状を予防、処置、または管理する方法も提供する。本発明はまた、一つまたは複数の免疫調節物質の治療的有効量を被験者に投与する段階をさらに含む、自己免疫疾患に関連する一つまたは複数の症状を予防、処置、または管理するための方法も提供する。5.4.5章は、抗炎症剤および免疫調節剤の非限定的な例を提供する。
本発明の抗体はまた、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置および／または予防のために、当技術分野において公知の任意の抗体と併用して用いることができる。炎症性障害の処置または予防のために用いられる抗体またはFc融合タンパク質の非限定的な例を、表6Aに示し、自己免疫障害の処置または予防のために用いられる抗体またはFc融合タンパク質の非限定的な例を表6Bに示す。本発明の抗体は、たとえば表6Aおよび6Bにおいて示される治療抗体またはFc融合タンパク質の処置の効能を増強することができる。たとえば、決して限定的ではなく、本発明の抗体は、表6Aまたは6Bにおける任意の抗体またはFc融合タンパク質によって処置される被験者における免疫応答を増強することができる。
本発明の抗体はまた、たとえば非限定的に、Orthoclone OKT3、ReoPro、Zenapax、Simulec、リツキシマブ、シナジス、およびRemicadeと併用して用いることができる。
本発明の抗体はまた、生得のおよび後天性の免疫応答の活性化剤として開発されている（Coley Pharmaceuticals）、または現在開発中であるシトシン-グアニンジヌクレオチド（「CpG」）に基づく産物と併用して用いることができる。たとえば、本発明は、自己免疫障害または炎症性障害の処置および／または予防のために本発明の方法および組成物においてCpG 7909、CpG 8916、CpG 8954（Coley Pharmaceuticals）を用いることを包含する（参照により本明細書に組み入れられる、Weeratna et al., 2001, FEMS Immunol Med Microbiol., 32(1):65-71）。
本発明の抗体を投与することによって処置される可能性がある自己免疫障害の例には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック・スプルー皮膚炎、慢性疲労性免疫機能障害症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギヤン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgAニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、1型または免疫媒介性真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎などの血管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫が含まれるがこれらに限定されるわけではない。炎症性障害の例には、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節症、未分化型関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的なウイルスまたは細菌感染症に起因する慢性炎症が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において3.1章において記述されるように、いくつかの自己免疫疾患は、炎症状態に関連する。このように、自己免疫障害と炎症性障害であると見なされる疾患とのあいだには重複が存在する。したがって、いくつかの自己免疫障害は、炎症性障害と特徴付けられることがある。本発明の方法に従って予防、処置、または管理することができる炎症性障害の例には、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節症、未分化型関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的なウイルスまたは細菌感染症に起因する慢性炎症が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本発明の一定の態様において、一つの性においてより優勢である自己免疫疾患を処置するために、本発明の抗体を用いてもよい。たとえば、女性におけるグレーヴス病の発生率は、FcγRIIB2の発現に関連している（Estienne et al., 2002, FASEB J. 16:1087-1092を参照されたい）。
本発明の抗体は、炎症性障害を有する動物、特に哺乳動物が経験する炎症を低減させるために用いることができる。特定の態様において、抗体は、該抗体を投与していない動物における炎症と比較して、該動物における炎症を、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％、または少なくとも10％低減させる。もう一つの態様において、抗体の併用は、該抗体を投与していない動物における炎症と比較して、該動物における炎症を少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％、または少なくとも10％低減させる。
（表６Ａ）：本発明の抗体と併用して用いることができる炎症性疾患および自己免疫疾患のための抗体
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（表６Ｂ）：自己免疫障害のための抗体およびFc融合タンパク質
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5.4.3 アレルギー
本発明は、本発明のアゴニスト抗体またはその断片の治療的有効量を被験者に投与する段階を含む、それを必要とする被験者におけるIgE媒介および／またはFcγRI媒介アレルギー障害を処置または予防するための方法を提供する。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、本発明の抗体は、急性期および遅延型アレルギー反応（Metcalfe D. et al. 1997, Physiol. Rev. 77: 1033）に寄与するFcεRI誘発肥満細胞活性化を阻害するために有用である。好ましくは、本発明のアゴニスト抗体は、IgE媒介アレルギー障害の処置および／または予防のために、当技術分野において用いられる通常の方法と比較して増強された治療効能および／または低減された副作用を有する。IgE媒介アレルギー障害の処置および／または予防のための従来の方法には、抗炎症剤（たとえば、喘息のための経口および吸入コルチコステロイド）、抗ヒスタミン剤（たとえば、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎のため）、システイニルロイコトリエン（たとえば、喘息の処置のため）；抗IgE抗体；および特異的免疫療法または脱感作が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
IgE媒介アレルギー反応の例には、喘息、アレルギー性鼻炎、消化管アレルギー、好酸球増加症、結膜炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、または糸球体腎炎が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本発明は、FcγRIおよびヒトFcγRIIBと複合体を形成する、すなわちFcγRIおよびヒトFcγRIIBに特異的に結合するように操作された分子、たとえば免疫グロブリンを包含する。好ましくは、そのような分子は、IgEおよびFcγRI媒介障害において治療効能を有する。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、これらの操作された分子の治療効能は、部分的にその肥満細胞および好塩基球機能の阻害能による。
特定の態様において、FcγRIおよびヒトFcγRIIBに特異的に結合する分子は、FcγRIに対する結合部位とFcγRIIBに対する結合部位とを含むキメラ融合タンパク質である。そのような分子は、当業者に公知の標準的な組換えDNA法に従って操作してもよい。好ましい特定の態様において、本発明の方法において用いるためのキメラ融合タンパク質は、抗FcγRIIBモノクローナル抗体のF(ab')一本鎖のC末端領域にhuFcγを連結させるための架橋として用いられる領域に融合した本発明の抗FcγRIIBモノクローナル抗体のF(ab')一本鎖を含む。本発明の方法において用いるための一つの例示的なキメラ融合タンパク質は、以下を含む：VL/CH(FcγRIIB)−ヒンジ−VH/CH(FcγRIIB)−リンカー−CHε2−CHε3−CHε4。キメラ分子のリンカーは、長さがアミノ酸5個、10個、好ましくは15個であってもよい。リンカーの長さは、FcγRIIBとFcγRIの双方に対する分子の最適な結合を提供するように変化してもよい。特定の態様において、リンカーは、配列(Gly4Ser)3からなるアミノ酸15個のリンカーである。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、柔軟なペプチドリンカーは、鎖の対形成を促進して、起こりうるリフォールディングを最小限にし、同様にキメラ分子を二つの受容体、すなわち細胞上のFcγRIIBおよびFcγRIに到達させて、それらをクロスリンクさせると考えられる。好ましくは、キメラ分子を、適合性のプロモーター、たとえばサイトメガロウイルスプロモーターと共に、哺乳動物発現ベクター、たとえばpCI-neoにクローニングする。本発明の方法に従って調製された融合タンパク質は、FcεRI（CHε2CHε3）に対する結合部位とFcγRIIB（VL/CL−ヒンジ−VH/CH）に対する結合部位を含有すると考えられる。本発明の方法に従って調製された融合タンパク質をコードする核酸を、好ましくは293細胞にトランスフェクトし、分泌されたタンパク質を当技術分野において公知の一般的な方法を用いて精製する。
ヒトFcεRIおよびFcγRIIBの双方に対するキメラ分子の結合は、FcγRに対する結合を決定するために当業者に公知の一般的な方法を用いて評価してもよい。好ましくは、本発明のキメラ分子は、たとえば抗原促進性の脱顆粒の阻害および細胞活性化の阻害によって、IgE媒介障害を処置するために治療効能を有する。IgE促進FcεRI媒介肥満細胞脱顆粒の遮断における本発明のキメラ分子の効能を、ヒトにおいて使用する前に、ヒトFcεRαおよびヒトFcγRIIBを発現するように操作されているトランスジェニックマウスにおいて決定してもよい。
本発明は、IgE媒介および／またはFcγRI媒介アレルギー障害の処置および／または予防のために二重特異性抗体を用いることを提供する。二重特異性抗体（BsAb）は、通常別個の抗原上の異なる二つのエピトープに結合する。BsAbは、潜在的な臨床有用性を有し、それらはウイルス、ウイルス感染細胞、および細菌病原体を標的とするため、ならびに血餅に血栓溶解剤を送達するために用いられている（Cao Y., 1998 Bioconj. Chem 9: 635-644；Koelemij et al., 1999, J. Immunother., 22, 514-524；Segal et al., Curr. Opin. Immunol., 11, 558-562）。BsIgGおよび他の関連する二重特異性分子を産生するための技術が利用可能である（たとえば、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Carter et al., 2001 J. of Immunol. Methods, 248, 7-15；Segal et al., 2001, J. of Immunol. Methods, 248, 7-15を参照されたい）。本発明は、同じ細胞の表面上で二つの受容体、すなわちFcγRIIBとFcεRIとを凝集させる、抗FcγRIIB抗体の一つのF(ab')と利用可能なモノクローナル抗huIgE抗体の一つのF(ab')とを含有する二重特異性抗体を提供する。当技術分野において公知のおよび本明細書において開示される任意の方法を用いて、本発明の方法において用いるための二重特異性抗体を生成してもよい。特定の態様において、BsAbは、既に記述されているように抗FcγRIIB抗体および抗huIgE抗体のF(ab')断片を化学的にクロスリンクさせることによって産生される（たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Glennie et al., 1995, Tumor Immunobiology, Oxford University press, Oxford, p. 225を参照されたい）。F(ab')断片を、ペプシンによる限定的なタンパク質溶解によって産生して、メルカプトエタノールアミンによって還元して遊離したヒンジ領域スルフヒドリル（SH）基を有するFab'断片を提供してもよい。Fab'(SH)断片の一つにおけるSH基を、過剰量のO-フェニレンジマレイミド（O-PDM）によってアルキル化して、遊離したマレイミド基（mal）を提供してもよい。二つの調製物Fab'（mal）およびFab'（SH）を適切な比で、好ましくは1：1で混合して、ヘテロ二量体構築物を生成してもよい。BsAbを、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製して、当業者に公知の方法を用いてHPLCによって特徴付けを行うことができる。
特に、本発明は、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに結合する第一の重鎖-軽鎖対と、IgE受容体に結合する第二の重鎖-軽鎖対とを含む二重特異性抗体であって、ただし第一の重鎖-軽鎖対がFcγRIIBに先に結合する、二重特異性抗体を包含する。本発明の二重特異性抗体は、FcγRIIBに対する結合がIgE受容体に対する結合より確実に先に起こるように当技術分野において公知の標準的な技術を用いて操作することができる。たとえば、IgE受容体に結合する場合より大きな親和性で二重特異性抗体がFcγRIIBに結合するように、二重特異性抗体を操作することが当業者に理解されるであろう。さらに、二重特異性抗体は、たとえばリンカーを加えることによって、抗体のヒンジサイズの長さを増加させることができるように当技術分野において公知の技術によって操作し、同じ細胞上のIgE受容体およびFcγRIIB受容体に結合する柔軟性を、二重特異性抗体に提供する。
本発明の抗体はまた、IgE媒介アレルギー障害の処置または予防のために当技術分野において公知の他の治療抗体または薬物と併用して用いることができる。たとえば、本発明の抗体は、以下のいずれかと併用して用いることができる：アゼラスチン、Astelin、プロピオン酸ベクロメタゾン吸入器、Vanceril、プロピオン酸ベクロメタゾン点鼻用吸入器／スプレー、Vancenase、Beconaseブデソニド点鼻用吸入器／スプレー、Rhinocortセチリジン、Zyrtecクロルフェニラミン、シュードエフェドリン、Deconamine、Sudafed、クロモリン、Nasalcrom、Intal、Opticrom、デスロラタジン、Clarinex、フェキソフェナジンおよびシュードエフェドリン、Allegra-D、フェキソフェナジン、Allegraフルニソリド点鼻スプレー、Nasalideプロピオン酸フルチカゾン点鼻用吸入器／スプレー、Flonaseプロピオン酸フルチカゾン口腔用吸入器、 Flovent、ヒドロキシジン、Vistaril、Ataraxロラタジン、シュードエフェドリン、Claritin-D、ロラタジン、Claritin、プレドニゾロン、Prednisolone、Pediapred口腔液、Medrolプレドニゾン、Deltasone、液体Predsalmeterol、Sereventトリアムシノロンアセトニド吸入器、Azmacortトリアムシノロンアセトニド点鼻用吸入器／スプレー、Nasacort、またはNasacortAQ。本発明の抗体は、生得のおよび後天性の免疫応答の活性化物質として開発されている（Coley Pharmaceuticals）か、または現在開発中である、シトシン-グアニンジヌクレオチド（「CpG」）に基づく産物と併用して用いることができる。たとえば、本発明は、IgE媒介アレルギー障害の処置および／または予防のために本発明の方法および組成物においてCpG 7909、CpG 8916、CpG 8954（Coley Pharmaceuticals）を用いることを包含する（同様に、参照により本明細書に組み入れられる、Weeratna et al., 2001, FEMS Immunol Med Microbiol., 32(1):65-71を参照されたい）。
本発明は、アレルギー障害を処置するために、当技術分野において公知の任意の治療抗体、たとえばXolair（商標）（オマリズマブ；Genentech）；rhuMAB-E25（BioWorld Today, Nov. 10, 1998, p. 1; Genentech）；CGP-51901（ヒト化抗IgE抗体）等と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。
さらに、本発明は、アレルギー障害を処置するために、当技術分野において公知の他の組成物と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。特に、Carson et al.（US 6,426,336；米国特許出願第2002/0035109 Al号；第2002/0010343号）において開示されている方法および組成物は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる。
5.4.4 免疫調節物質および抗炎症剤
本発明の方法は、他の処置物質と併用した本発明の抗体の投与を含む、自己免疫疾患および炎症性疾患を処置するための方法を提供する。免疫調節物質の例には、メソトレキセート、ENBREL、REMICADE（商標）、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、およびマクロライド系抗生物質（たとえば、FK506（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（MP）、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノレートモフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルガリン、ブレキナル（brequinar）、マロノニトリルアミド（malononitriloamindes、（たとえばレフルナミド（leflunamide））、T細胞受容体調節剤、およびサイトカイン受容体調節剤が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
抗炎症剤は、炎症および自己免疫障害の処置において成功を示し、現在、そのような障害の一般的かつ標準的な処置である。当業者に周知であるいかなる抗炎症剤も本発明の方法において用いることができる。抗炎症剤の非限定的な例には、非ステロイド性抗炎症剤（NSAID）、ステロイド性抗炎症剤、β-アゴニスト、抗コリン作動物質、およびメチルキサンチンが含まれる。NSAIDの例には、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（CELEBREX（商標））、ジクロフェナク（VOLTAREN（商標））、エトドラク（LODINE（商標））、フェノプロフェン（NALFON（商標））、インドメタシン（INDOCIN（商標））、ケトララク（TORADOL（商標））、オキサプロジン（DAYPRO（商標））、ナブメントン（RELAFEN（商標））、スリンダク（CLINORIL（商標））、トルメンチン（TOLECTIN（商標））、ロフェコキシブ（VIOXX（商標））、ナプロキセン（ALEVE（商標）、NAPROSYN（商標））、ケトプロフェン（ACTRON（商標））、およびナブメトン（RELAFEN（商標））が含まれる。そのようなNSAIDは、シクロオキシゲナーゼ酵素（たとえば、COX-1および／またはCOX-2）を阻害することによって機能する。ステロイド性抗炎症剤の例には、グルココルチコイド、デキサメタゾン（DECADRON（商標））、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（DELTASONE（商標））、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アズルフィジン、ならびにプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンなどのエイコサノイドが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
5.4.5 抗癌剤および治療抗体
特定の態様において、本発明の方法は、アンジオスタチン（プラスミノーゲン断片）；抗血管新生アンチトロンビンIII；アンジオザイム；ABT-627；Bay 12-9566；ベネフィン；ベバシズマブ；BMS-275291；軟骨由来阻害剤（CDI）；CAI；CD59補体断片；CEP-7055；Col 3；コンブレタスタチンA-4；エンドスタチン（コラーゲンXVIII断片）；EGFr遮断剤／阻害剤（Iressa（登録商標）、Tarceva（登録商標）、Erbitux（登録商標）、およびABX-EGF）；フィブロネクチン断片；Gro-β；ハロフギノン；へパリナーゼ；ヘパリン六糖断片；HMV833；ヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG）；IM-862；インターフェロンα／β／γ；インターフェロン誘導タンパク質（IP-10）；インターロイキン-12；クリングル5（プラスミノーゲン断片）；マリマスタット；メタロプロテナーゼ阻害剤（TIMPs）；2-メトキシエストラジオール；MMI 270（CGS 27023A）；MoAb IMC-1Cl1；ノバスタット；NM-3；パンゼム；PI-88；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；血小板因子-4（PF4）；プリノマスタット；プロラクチン16kD断片；プロリフェリン関連タンパク質（PRP）；PTK 787/ZK 222594；レチノイド；ソリマスタット；スクアラミン；SS 3304；SU 5416；SU6668；SUl1248；テトラヒドロコルチゾル-S；テトラチオモリブデート；サリドマイド；トロンボスポンジン-1（TSP-1）；TNP-470；トランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）；バスキュロスタチン；バソスタチン（カルレチキュリン断片）；ZD6126；ZD 6474；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）；およびビスホスホネートなどの、しかしこれらに限定されない一つまたは複数の血管新生阻害剤の投与を包含する。
本発明の薬学的組成物、投与剤形、およびキットが含まれる本発明の様々な態様において、本発明の抗体と併用して用いることができる抗癌剤には、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；メシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチメル；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキセート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エノプロメート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスリジン；リン酸フルタラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲンシタビン；塩酸ゲンシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イフォスファミド；イルモフォシン；インターロイキンII（組換えインターロイキンII、またはrIL2が含まれる）、インターフェロンα-2a；インターフェロンα-2b；インターフェロンα-nl；インターフェロンα-n3；インターフェロンβ-Ia；インターフェロンγ-Ib；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸リュープロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレクソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メソトレキセート；メソトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトジリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスパー；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；pegアスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌール（sulofenur）；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキセート；グルクロン酸トリメトレキセート；トリプトレリン；塩酸チュブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンレウロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。他の抗癌剤には、20-エピ-1,25 ジヒドロキシビタミンD3；5-エチルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ALL-TKアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストD；アンタゴニストG；アンタレリクス；アンチドーサライジング（anti-dorsalizing）形態形成タンパク質-1；抗アンドロゲン剤、前立腺癌；抗エストロゲン剤；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子調節剤；アポトーシス調節剤；アプリン酸；ara-CDP-DL-PTBA；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン1；アキシナスタチン2；アキシナスタチン3；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンIII誘導体；バラノール；バチマスタット；BCR/ABLアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β-アレチン；ベタクラマイシンB；ベツリン酸；bFGF阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンA；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルフォキシミン；カルシポトリオール；カルフォスチンC；カンプトテシン誘導体；カナリア痘IL-2；カペシタビン；カルボキサミド-アミノ-トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ICOS）；カスタノスペルミン；セクロピンB；セトロレリクス；クロリン（chlorln）類；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シスポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンA；コリスマイシンB；コンブレタスタチンA4；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クラムベスシジン816；クリスナトール；クリプトフィシン8；クリプトフィシンA誘導体；クラシンA；シクロペントアントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン（cypemycin）；シタラビンオクフォスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンB；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシフォスファミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミール；ジアジコン；ジデムニンB；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ-5-アザシチジン；ジヒドロタキソール、9-；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンSA；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフール；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エクセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン；フォルフェニメクス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲンシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセタミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様増殖因子-1受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、4-；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンB；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドF；ラメラリン-Nトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球αインターフェロン；リュープロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖状ポリアミン類似体；脂肪親和性二糖ペプチド；脂肪親和性白金化合物；リソクリナミド7；ロバプラチン；ロムブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンA；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリクスメタロプロテナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；MIF阻害剤；ミフェプリストン；ミルテフォシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖RNA；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子-サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛ゴナドトロフィン；モノホスホリルリピッドA＋マイオバクテリウム細胞壁骨格；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多腫瘍抑制因子1に基づく治療；マスタード抗癌剤；ミカペロキシドB；マイコバクテリウム細胞壁抽出物；ミリアポロン；N-アセチルジナリン；N-置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビリン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；酸化窒素調節剤；窒素酸化物抗酸化剤；ニトルリン；O6-ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘発剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；pegアスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリスルフェートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルフォスファミド；ペリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセテート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンA；プラセチンB；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金-トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス-アクリドン；プロスタグランジンJ2；プロテアソーム阻害剤；プロテインAに基づく免疫調節剤；プロテインキナーゼC阻害剤；プロテインキナーゼC阻害剤、微小藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン複合体；rafアンタゴニスト；ラルチトレクスド；ラモセトロン；rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ras阻害剤；ras-GAP阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムRe 186エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；RIIレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビジノンB1；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；SarCNU；サルコフィトールA；サルグラモスチム；Sdi 1模倣体；セムスチン；老化由来阻害剤1；センス
オリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節剤；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルフォス酸；スピカマイシンD；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン1；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スウェインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；サリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；サイマルファシン；サイモポエチン受容体アゴニスト；サイモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルスズエチオプルプリン；チラパザミン；塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルフォスチン；UBC阻害剤；ウベニメクス；尿生殖器洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンB；ベクター系、赤血球遺伝子治療；ベラレソル；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーが含まれるがこれらに限定されるわけではない。好ましいさらなる抗癌剤は、5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。
本発明の方法において用いることができる治療抗体の例には、転移性乳癌を有する患者の処置のためのヒト抗HER2モノクローナル抗体であるHERCEPTIN（登録商標）（トラスツズマブ）（Genentech, CA）；凝血形成予防のための血小板上の抗糖タンパク質IIb/IIIa受容体であるREOPRO（登録商標）（アブシキシマブ）（Centocor）；急性の腎同種移植片拒絶を予防するための免疫抑制性のヒト化抗CD25モノクローナル抗体であるZENAPAX（登録商標）（ダクリズマブ）（Roche Pharmaceuticals, Switzerland）；マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体であるPANOREX（商標）（エドレコロマブ）（Glaxo Wellcome/Centocor）；マウス抗イディオタイプ（GD3エピトープ）IgG抗体（ImClone System）であるBEC2；キメラ抗EGFR IgG抗体であるErbitux（登録商標）（セツキシマブ）（ImClone System）；ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体であるVITAXIN（商標）（Applied Molecular Evolution/MedImmune）；ヒト化抗CD52 IgG1抗体であるCampath 1H/LDP-03（Leukosite）；ヒト化抗CD33 IgG抗体であるSmart M195（Protein Design Lab/Kanebo）；キメラ抗CD20 IgG1抗体であるRITUXAN（商標）（リツキシマブ）（IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku）；ヒト化抗CD22 IgG抗体であるLYMPHOCIDE（商標）（エプラツズマブ）（Immunomedics）；ヒト化抗ICAM3抗体であるICM3（ICOS Pharm）；霊長類化抗CD80抗体であるIDEC-114（IDEC Pharm/Mitsubishi）；放射標識マウス抗CD20抗体であるZEVALIN（商標）（IDEC/Schering AG）；ヒト化抗CD40L抗体であるIDEC-131（IDEC/Eisai）；霊長類化抗CD4抗体であるIDEC-151（IDEC）；霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152（IDEC/Seikagaku）；ヒト化抗CD3 IgGであるSMART抗-CD3（Protein Design Lab）；ヒト化抗補体因子5（C5）抗体である5Gl.1（Alexion Pharm）；ヒト抗TNF-α抗体であるHumira（登録商標）（Abbott Laboratories）；ヒト化抗TNF-αFab断片であるCDP870（Celltech）；霊長類化抗CD4 IgG1抗体であるIDEC-151（IDEC Pharm/SmithKline Beecham）；ヒト抗CD4 IgG抗体であるMDX-CD4（Medarex/Eisai/Genmab）；ヒト化抗TNF-αIgG4抗体であるCDP571（Celltech）；ヒト化抗α4β7抗体であるLDP-02（LeukoSite/Genentech）；ヒト化抗CD4 IgG抗体であるOrthoClone OKT4A（Ortho Biotech）；ヒト化抗CD40L IgG抗体であるANTOVA（商標）（Biogen）；ヒト化抗VLA-4 IgG抗体であるANTEGREN（商標）（Elan）；およびヒト抗TGF-β2抗体であるCAT-152（Cambridge Ab Tech）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本発明の抗体と併用して用いることができる治療抗体の他の例を表7に示す。
（表７）本発明の抗体と併用して用いることができる、癌治療のためのモノクローナル抗体
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5.4.6 ワクチン治療
本発明は、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体またはその断片、およびワクチン組成物を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるワクチン組成物に対する免疫応答を増強するための方法であって、抗体またはその断片がワクチン組成物に対する免疫応答を増強する、方法を提供する。一つの特定の態様において、抗体またはその断片は、ワクチンが向けられる抗原の抗原提示および／または抗原プロセシングを増強することによって、ワクチン組成物に対する免疫応答を増強する。当技術分野において公知の任意のワクチン組成物が、本発明の抗体またはその断片との併用において有用である。
一つの態様において、本発明は、当技術分野において公知の任意の癌ワクチン、たとえばCanvaxin（商標）（Cancer Vax, Corporation、黒色腫および結腸癌）；Oncophage（HSPPC-96；Antigenics；転移性黒色腫）；HER-2/neu癌ワクチン等と併用して本発明の抗体を用いることを包含する。本発明の方法および組成物において用いられる癌ワクチンは、たとえば抗原特異的ワクチン、抗イディオタイプワクチン、樹状細胞ワクチン、またはDNAワクチンでありうる。本発明は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられるSegal et al.（米国特許第6,403,080号）によって記述される、細胞に基づくワクチンと共に、本発明の抗体を用いることを包含する。本発明の抗体と併用して用いられる、細胞に基づくワクチンは、自己由来または同種異系のいずれかでありうる。簡単に説明すると、Segalらによって記述される、癌に基づくワクチンは、Genitrix, LLCによるOpsonokine（商標）産物に基づく。Opsonokines（商標）は、腫瘍細胞と混合した場合に細胞表面に自動的に付着する、遺伝子操作されたサイトカインである。「装飾された」細胞をワクチンとして投与する場合、細胞上のサイトカインは、レシピエントにおける重要な抗原提示細胞を活性化するが、同様に抗原提示細胞に腫瘍細胞を摂取させる。次に、抗原提示細胞は、体中の類似の腫瘍細胞を発見して破壊するように「キラー」T細胞に指示することができる。このように、Opsonokine（商標）産物は、腫瘍細胞を強力な抗腫瘍免疫治療物質に変換する。
一つの態様において、本発明は、当技術分野において公知の任意のアレルギーワクチンと併用して本発明の抗体を用いることを包含する。本発明の抗体は、たとえばLinhart et al.（2000, FASEB Journal, 16(10): 1301-3、参照により本明細書に組み入れられる）によって記述されるように、花粉アレルギーに対するワクチン接種のために用いられるオオアワガエリ花粉アレルゲンをコードする組換えハイブリッド分子と併用して用いることができる。さらに、本発明の抗体は、Horner et al.（2002, Allergy, 57 Suppl, 72:24-9、参照により本明細書に組み入れられる）によって記述されるDNAに基づくワクチン接種と併用して用いることができる。本発明の抗体は、その双方の全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Choi et al.（2002, Ann. Allergy Asthma Immunology, 88(6): 584-91）およびBarlan et al.（2002, Journal Asthma, 39(3):239-46）によって記述されるように、IgE分泌をダウンレギュレートするために、カルメット・ゲラン菌（「BCG」）ワクチン接種と併用して用いることができる。本発明の抗体は、食品アレルギーを処置するために有用である。特に、本発明の抗体は、ピーナッツアレルギーを処置するために当技術分野において公知のワクチンまたは他の免疫療法と併用して用いることができる（Hourihane et al., 2002, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2(3):227-31を参照されたい）。
本発明の方法および組成物は、抗原に対する免疫が望まれるワクチンと併用して用いることができる。そのような抗原は、当技術分野において公知の任意の抗原であってもよい。本発明の抗体は、たとえば、細菌（たとえば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性菌、スピロヘータ、ミコバクテリア、リケッチア、クラミジア等）、寄生虫、真菌（たとえば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス（Aspergillus）等）、ウイルス（たとえば、DNAウイルス、RNAウイルス等）、または腫瘍などの、しかしこれらに限定されない感染物質、疾患を有する細胞、または異常な細胞に対する免疫応答を増強するために用いることができる。ウイルス感染症には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）；A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、または他の肝炎ウイルス；サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス-1（-2、-3、-4、-5、-6）、ヒト乳頭腫ウイルス；RSウイルス（RSV）、パラインフルエンザウイルス（PIV）、エプスタインバーウイルス、ヒトメタニューモウイルス（HMPV）、インフルエンザウイルス、重症急性呼吸器症候群（SARS）、または他の任意のウイルス感染症が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本発明は、本発明の抗体、抗原、およびサイトカインの組み合わせを含む方法およびワクチン組成物を包含する。好ましくは、サイトカインは、IL-4、IL-10、またはTGF-βである。
本発明はまた、ワクチン組成物の抗原に対する液性および／または細胞性応答を増強するために本発明の抗体を用いることを包含する。本発明はさらに、特定の抗原または複数の抗原に対する増強された免疫応答が、疾患または障害を処置または予防するために有効である場合に、特定の障害を予防または処置するために本発明の抗体を用いることを包含する。そのような疾患および障害には、HIV、CMV、肝炎、ヘルペスウイルス、麻疹等などのウイルス感染症、細菌感染症、真菌および寄生虫感染症、癌、ならびに特定の抗原または複数の抗原に対する免疫応答を増強することによって処置または予防が適用できる任意の他の疾患または障害が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
5.5 組成物および投与法
本発明は、本発明の抗体を含む方法および薬学的組成物を提供する。本発明はまた、本発明の融合タンパク質もしくは結合分子、または本発明の融合タンパク質もしくは結合分子を含む薬学的組成物の有効量を被験者に投与することによって、疾患、障害、または感染症に関連する一つまたは複数の症状を処置、予防、および改善する方法を提供する。好ましい局面において、抗体、融合タンパク質、または結合分子は、実質的に精製されている（すなわち、その効果を制限する物質、または望ましくない副作用を産生する物質を実質的に含まない）。特定の態様において、被験者は動物、好ましくは非霊長類（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）および霊長類（たとえば、カニクイザルなどのサルおよびヒト）などの哺乳動物である。好ましい態様において、被験者はヒトである。
様々な送達系、たとえばリポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、抗体または融合タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（たとえば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築等が公知であり、本発明の抗体を含む組成物を投与するために用いることができる。
いくつかの態様において、本発明の抗体は、本発明の抗体の標的送達のためにリポソームへと製剤化される。リポソームは、水相を封入する同心円に整えられたリン脂質二重層を含む小胞である。リポソームは典型的に、様々なタイプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤を含む。リポソームの成分は、生体膜の脂質配置と類似の二重層構造で配置される。リポソームは、一つには、その生体適合性、低い免疫原性、および低い毒性のゆえに、特に好ましい送達媒体である。リポソームの調製法は、当技術分野において公知であり、本発明に包含される。たとえばその全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688；Hwang et al., 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4；米国特許第4,485,045号および第4,544,545号を参照されたい。
本発明はまた、米国特許第5,013,556号において開示される方法などの、持続的な血清半減期、すなわち増強された循環時間を有するリポソームを調製する方法も包含する。本発明の方法において用いられる好ましいリポソームは、循環中から急速に排除されない、すなわち単核球貪食系（MPS）に取り込まれない。本発明は、当業者に公知の一般的な方法を用いて調製される立体的に安定化されたリポソームを包含する。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、立体的に安定化されたリポソームは、血清タンパク質とのリポソームの望ましくない反応を低減させ、血清成分によるオプソニン化を低減させ、かつMPSによる認識を低減させる、かさの高い高度に柔軟な親水性部分を有する脂質成分を含有する。立体的に安定化されたリポソームは、好ましくはポリエチレングリコールを用いて調製される。リポソームおよび立体的に安定化されたリポソームの調製に関しては、その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、
Figure 0005764290
を参照されたい。本発明はまた、特定の臓器の標的化のために適合させたリポソームを包含する（たとえば米国特許第4,544,545号を参照されたい）。または特定の細胞の標的化のために適合させたリポソームを包含する（たとえば米国特許出願公開第2005/0074403号を参照されたい）。本発明の組成物および方法において用いるために特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物による逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生じるために、既定の孔径のフィルターの中に押し出される。いくつかの態様において、本発明の抗体の断片、たとえばF(ab')を既に記述された方法を用いてリポソームに結合させてもよい。たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288を参照されたい。
本発明の抗体はまた、イムノリポソームとして製剤化されてもよい。イムノリポソームは、本発明の抗体またはその断片がリポソーム表面に共有的にまたは非共有的に連結されているリポソーム組成物を指す。抗体をリポソーム表面に連結させる化学は当技術分野において公知であり、本発明の範囲に包含される。たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,787,153号；Allen et al., 1995, Stealth Liposomes, Boca Rotan: CRC Press, 233-44；Hansen et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1239: 133-44を参照されたい。最も好ましい態様において、本発明の方法および組成物において用いるためのイムノリポソームは、さらに立体的に安定化される。好ましくは、本発明の抗体を、リポソームの脂質二重層の中に安定に定着している疎水性のアンカーに共有的または非共有的に連結する。疎水性のアンカーの例には、リン脂質、たとえばホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルイノシトール（PI）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。抗体と疎水性のアンカーとのあいだの共有的連結を達成するために、当技術分野において公知の任意の生化学的戦略を用いてもよい。たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、J. Thomas August, ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA., p. 399-435を参照されたい。たとえば、抗体分子上の官能基は、リポソーム会合疎水性アンカー上の活性基と反応してもよく、たとえば抗体のリジン側鎖のアミノ基を、水溶性のカルボジイミドによって活性化されるリポソーム会合N-グルタリル-ホスファチジルエタノールアミンにカップリングさせてもよく、または還元抗体のチオール基をピリジルチオプロピオニル-ホスファチジルエタノールアミンなどのチオール反応性アンカーによってリポソームにカップリングさせることができる。たとえば、その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Dietrich et al., 1996, Biochemistry, 35: 1100-1105；Loughrey et al., 1987, Biochim. Biophys. Acta, 901: 157-160；Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288；Martin et al., 1981, Biochemistry, 20: 4429-38を参照されたい。特定の作用機序に拘束されることを意図しないが、本発明の抗体を含むイムノリポソーム製剤は、それらが標的細胞、すなわち抗体が結合するFcγRIIB受容体を含む細胞の細胞質に抗体を送達することから、治療物質として特に有効である。イムノリポソームは、好ましくは血液中、具体的に標的細胞内での半減期を増加させ、標的細胞の細胞質に内部移行することができ、それによって治療物質の喪失またはリソソーム内経路による分解を回避することができる。
本発明は、本発明の抗体またはその断片を含むイムノリポソームを包含する。いくつかの態様において、イムノリポソームはさらに、たとえば本明細書において記述される、一つまたは複数のさらなる治療物質を含む。
本発明のイムノリポソームは、一つまたは複数の小胞形成脂質、本発明の抗体、またはその断片もしくは誘導体、および任意で親水性ポリマーを含む。小胞形成脂質は、好ましくは、アシル鎖と極性頭部などの、二つの炭化水素鎖を有する脂質である。小胞形成脂質の例には、リン脂質、たとえばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、および糖脂質、たとえばセレブロシド、ガングリオシドが含まれる。本発明の製剤において有用なさらなる脂質は当業者に公知であり、本発明に包含される。いくつかの態様において、イムノリポソーム組成物はさらに、リポソームの血清半減期を増加させる親水性ポリマー、たとえばポリエチレングリコールおよびガングリオシドGM1を含む。親水性ポリマーをリポソームに結合させる方法は当技術分野において周知であり、本発明に包含される。イムノリポソームおよびそれらを調製する方法の概説に関しては、その全ての全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2003/0044407号；PCT国際公開番号WO 97/38731、
Figure 0005764290
を参照されたい。
本発明の抗体を投与する方法には、非経口投与（たとえば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下）、硬膜外、および粘膜（たとえば、鼻腔内および口腔経路）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。特定の態様において、本発明の抗体は、筋肉内、静脈内、または皮下投与される。組成物は、任意の簡便な経路、たとえば注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（たとえば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜等）を通しての吸収によって投与してもよく、他の生物活性物質と共に投与してもよい。投与は全身または局所でありうる。さらに、肺内投与も同様に、たとえば吸入器または噴霧器を用いることによって、およびエアロゾル化物質との製剤によって使用することができる。たとえば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,019,968号；第5,985, 20号；第5,985,309号；第5,934,272号；第5,874,064号；第5,855,913号；第5,290,540号；および第4,880,078号；ならびにPCT公開番号WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；およびWO 99/66903を参照されたい。
本発明はまた、抗体の量を示すアンプルまたは小袋（sachette）などの気密性の密封容器に包装される本発明の抗体を提供する。一つの態様において、本発明の抗体は、気密性の密封容器において乾燥滅菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給されて、たとえば水または生理食塩液によって、被験者に投与するために適切な濃度に溶解することができる。好ましくは、本発明の抗体は、気密性の密封容器において乾燥滅菌凍結乾燥粉末として、少なくとも5 mg、より好ましくは少なくとも10 mg、少なくとも15 mg、少なくとも25 mg、少なくとも35 mg、少なくとも45 mg、少なくとも50 mg、または少なくとも75 mgの単位用量で供給される。本発明の凍結乾燥抗体は、その当初の容器において2〜8℃で保存すべきであり、抗体は、溶解後12時間以内、好ましくは6時間以内、5時間以内、3時間以内、または1時間以内に投与すべきである。別の態様において、本発明の抗体は、抗体、融合タンパク質、または結合分子の量および濃度を示す気密性の密封容器において液体剤形で供給される。好ましくは、抗体の液体剤形は、気密性の密封容器において少なくとも1 mg/ml、より好ましくは少なくとも2.5 mg/ml、少なくとも5 mg/ml、少なくとも8 mg/ml、少なくとも10 mg/ml、少なくとも15 mg/kg、少なくとも25 mg/ml、少なくとも50 mg/ml、少なくとも100 mg/ml、少なくとも150 mg/ml、少なくとも200 mg/mlの抗体で供給される。
障害に関連する一つまたは複数の症状の処置、予防、または改善において有効であろう本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。製剤において用いられる正確な用量も同様に、投与経路および状態の重症度に依存して、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。インビトロ試験系または動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から有効量を外挿してもよい。
本発明に包含される抗体に関して、患者に投与される用量は、典型的に患者の体重あたり0.0001 mg/kg〜100 mg/kgである。好ましくは、患者に投与される用量は、患者の体重あたり0.0001 mg/kg〜20 mg/kg、0.0001 mg/kg〜10 mg/kg、0.0001 mg/kg〜5 mg/kg、0.0001〜2 mg/kg、0.0001〜1 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.75 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.5 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.25 mg/kg、0.0001〜0.15 mg/kg、0.0001〜0.10 mg/kg、0.001〜0.5 mg/kg、0.01〜0.25 mg/kg、または0.01〜0.10 mg/kgのあいだである。一般的に、ヒト抗体は、異物ポリペプチドに対する免疫応答により、他の種由来の抗体よりヒトの体内でより長い半減期を有する。このように、ヒト抗体のより低い用量およびより少ない投与回数がしばしば可能である。さらに、本発明の抗体またはその断片の用量および投与回数は、たとえば脂質付加などの改変によって抗体の取り込みおよび組織浸透を増強することによって、低減させてもよい。
一つの態様において、患者に投与される本発明の抗体の用量は、単剤治療として用いる場合0.01 mg〜1000 mg/日である。もう一つの態様において、本発明の抗体は、他の治療組成物と併用して用いられ、患者に投与される用量は、単剤治療として抗体を用いる場合より低い。
特定の態様において、処置を必要とする領域に本発明の薬学的組成物を局所的に投与することが望ましい可能性がある；これはたとえば、非限定的に、局所注入、注射、または多孔性、非多孔性、もしくはシアル酸膜などの膜もしくは線維が含まれるゼラチン様材料のインプラントによって達成されてもよい。好ましくは、本発明の抗体を投与する場合、抗体または融合タンパク質が吸収しない材料を用いるように注意しなければならない。
もう一つの態様において、組成物は媒体において、特にリポソームにおいて送達することができる（Langer, Science 249:1527-1533 (1990)；Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989)；Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327を参照されたい；全体的に同書を参照されたい）。
なおもう一つの態様において、組成物は、制御された放出または徐放性システムにおいて送達することができる。当業者に公知の任意の技術を用いて、本発明の一つまたは複数の抗体を含む徐放性製剤を産生することができる。たとえば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,526,938号；PCT公開番号WO 91/05548；PCT公開番号WO 96/20698；Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39: 179-189、Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；およびLam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい。一つの態様において、制御された放出系においてポンプを用いてもよい（Langer、前記；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；およびSaudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい）。もう一つの態様において、ポリマー材料を用いて抗体の制御された放出を達成することができる（たとえば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい；同様にLevy et al., 1985, Science 228: 190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1: 105)；米国特許第5,679,377号；米国特許第5,916,597号；米国特許第5,912,015号；米国特許第5,989,463号；米国特許第5,128,326号；PCT公開番号WO 99/15154；およびPCT公開番号WO 99/20253も参照されたい）。徐放性製剤において用いられるポリマーの例には、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド（PLG）、ポリアンヒドリド、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド（PLA）、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）、およびポリオルトエステルが含まれるがこれらに限定されるわけではない。なおもう一つの態様において、徐放性システムを、治療標的（たとえば、肺）の近位に配置して、それにより全身用量のごく一画分のみを必要とすることができる（たとえば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい）。もう一つの態様において、徐放性インプラントとして有用なポリマー組成物が、Dunn et al（U.S. 5,945,155を参照されたい）に従って用いられる。この特定の方法は、ポリマーシステムからの生体活性材料のインサイチューでの制御された放出の治療効果に基づいている。埋め込みは一般的に治療的処置を必要とする患者の体内のどこにでも行われうる。もう一つの態様において、それによって被験者の体内の非ポリマーインプラントが薬物送達系として用いられる、非ポリマーの徐放性送達系が用いられる。体内に埋め込まれた後、インプラントの有機溶媒は組成物から周辺組織液へと消散、分散、または浸出して、非ポリマー材料は徐々に凝固するかまたは沈殿して、固体の微孔性マトリクスを形成するであろう（U.S. 5,888,533を参照されたい）。
制御された放出系は、Langer（1990, Science 249: 1527-1533）による概説において考察されている。当業者に公知の任意の技術を用いて、本発明の一つまたは複数の治療物質を含む徐放性製剤を産生することができる。たとえば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,526,938号；国際公開番号WO 91/05548およびWO 96/20698；
Figure 0005764290
を参照されたい。
本発明の組成物が抗体をコードする核酸である特定の態様において、該核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、かつたとえばレトロウイルスベクター（米国特許第4,980,286号を参照されたい）の使用によって、または直接注入によって、微粒子衝突（たとえば遺伝子銃；バイオリスティック、Dupont）、脂質によるコーティング、細胞表面受容体、もしくはトランスフェクト剤の使用によって、細胞内となるように該核酸を投与する段階によって、または核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して該核酸を投与する段階等によって、その核酸がコードする抗体の発現を促進するためにインビボで投与することができる（たとえば、Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868を参照されたい）。あるいは、相同的組換えによって発現させるために、核酸を細胞内に導入して宿主細胞DNAに組み入れることができる。
抗体に関して、被験者に投与される治療的または予防的有効量は、典型的に被験者の体重あたり0.1 mg/kg〜200 mg/kgである。好ましくは被験者に投与される用量は、被験者の体重あたり0.1 mg/kg〜20 mg/kgの範囲であり、より好ましくは被験者に投与される用量は被験者の体重あたり1 mg/kg〜10 mg/kgの範囲である。本発明の抗体の用量および投与回数はまた、たとえば脂質付加などの改変によって抗体または融合タンパク質の取り込みおよび組織浸透（たとえば、肺への）を増強することによって低減する可能性がある。
本発明の抗体の治療的または予防的有効量による被験者の処置には、単回処置が含まれ、または好ましくは一連の複数回の処置が含まれうる。好ましい例において、被験者は約0.1〜30 mg/kg体重の範囲の本発明の抗体によって、約1〜10週間のあいだ、好ましくは2〜8週間、より好ましくは約3〜7週間、およびさらにより好ましくは約4、5、または6週間のあいだ週に1回処置される。他の態様において、本発明の薬学的組成物は、1日1回、1日2回、または1日3回投与される。他の態様において、薬学的組成物は、1週間に1回、1週間に2回、2週間に1回、1ヶ月に1回、6週間に1回、2ヶ月に1回、1年に2回、または1年に1回投与される。同様に、処置のために用いられる抗体の有効量は、個々の処置の経過において増加または減少してもよいと認識されるであろう。
5.5.1 薬学的組成物
本発明の組成物には、薬学的組成物の製造において有用なバルク薬物組成物（たとえば、純粋でない、または非滅菌組成物）および単位投与剤形の調製に用いることができる薬学的組成物（すなわち、被験者または患者に投与するために適した組成物）が含まれる。そのような組成物は、本明細書に開示される予防および／または治療物質の予防的または治療的有効量、またはそれらの物質と薬学的に許容される担体との併用を含む。好ましくは、本発明の組成物は、本発明の抗体の予防的または治療的有効量と薬学的に許容される担体とを含む。
一つの特定の態様において、薬学的組成物は、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに結合する抗体またはその断片の治療的有効量と、薬学的に許容される担体とを含む。もう一つの態様において、薬学的組成物はさらに、一つまたは複数の抗癌剤を含む。
特定の態様において、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より詳しくはヒトにおいて使用するために、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されること、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識される薬局方において記載されることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント（たとえば、フロイントアジュバント（完全および不完全）、賦形剤、または治療物質がそれにより投与される媒体を指す。そのような薬学的担体は、水、および落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等などの、石油、動物、植物、または合成起源の油が含まれる油などの滅菌液体でありうる。水は、薬学的組成物を静脈内投与する場合に好ましい担体である。生理食塩液、水性デキストロース、およびグリセロール溶液も同様に、液体担体、特に注射用溶液として用いることができる。適した薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、乳糖、蔗糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。必要に応じて、組成物はまた、微量の湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤を含みうる。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放性製剤等の剤形でありうる。
一般的に、本発明の組成物の成分は、たとえば活性物質の量を示すアンプルまたは小袋などの気密性の密封容器において、乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として単位投与剤形で個々にまたは共に混合して供給される。組成物を注入によって投与する場合、これを滅菌した薬学等級の水または生理食塩液を含有する注入容器によって分配することができる。組成物を注射によって投与する場合、投与の前に成分が混合されるように、滅菌注射用水または生理食塩液のアンプルを提供することができる。
本発明の組成物は、中性または塩の形状で製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸塩、リン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩に由来する塩などの、陰イオンと共に形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来する塩などの、陽イオンと共に形成される塩が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本発明はまた、B細胞悪性疾患またはその一つもしくは複数の症状の予防、処置、管理、または改善において用いるための、FcγRIIBアンタゴニストを含む薬学的組成物およびキットを提供する。特に、本発明は、FcγRIIBアンタゴニスト、類似体、誘導体、または抗FcγRIIB抗体もしくはその抗原結合断片を含む薬学的組成物およびキットを提供する。
5.5.2 遺伝子治療
特定の態様において、抗体または融合タンパク質をコードする配列を含む核酸を、遺伝子治療によって疾患、障害、または感染症に関連する一つまたは複数の症状を処置、予防、または改善するために、投与する。遺伝子治療は、発現したまたは発現可能な核酸を被験者に投与することによって行われる治療を指す。本発明のこの態様において、核酸は、治療または予防効果を媒介する、該核酸によりコードされる抗体または融合タンパク質を産生する。
当技術分野において入手可能な任意の遺伝子治療法を、本発明に従って用いることができる。例示的な方法を以下に記述する。
遺伝子治療法の一般的概説に関しては、Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5): 155-215；およびScholl, 2003, J. Biomed Biotechnol 2003:35-47を参照されたい。用いることができる組換えDNA技術に関する当技術分野において一般的に公知の方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)において記述されている。
好ましい局面において、本発明の組成物は、核酸が適した宿主において抗体を発現する発現ベクターの一部である、該抗体をコードする核酸を含む。特に、そのような核酸は、抗体コード領域に機能的に連結したプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、該プロモーターは誘導性または構成的であり、任意で組織特異的である。もう一つの特定の態様において、ゲノムにおける所望の部位で相同的組換えを促進する領域が抗体コード配列および任意の他の所望の配列に隣接し、それにより抗体コード核酸の染色体内発現が提供される、核酸分子が用いられる（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932- 8935；およびZijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438）。
もう一つの好ましい局面において、本発明の組成物は、核酸が適した宿主において融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部である、融合タンパク質をコードする核酸を含む。特に、そのような核酸は、融合タンパク質のコード領域に機能的に連結したプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、該プロモーターは誘導性または構成的であり、任意で組織特異的である。もう一つの特定の態様において、ゲノムにおける所望の部位で相同的組換えを促進する領域が融合タンパク質のコード配列および任意の他の所望の配列に隣接し、それにより融合タンパク質をコードする核酸の染色体内発現が提供される、核酸分子が用いられる。
被験者への核酸の送達は、被験者が核酸もしくは核酸を有するベクターに直接曝露される直接的送達、または細胞がインビトロで核酸によってまず形質転換された後、被験者に移植される間接的送達であってよい。これらの二つのアプローチはそれぞれ、インビボまたはエクスビボ遺伝子治療として公知である。
特定の態様において、核酸配列は、インビボで直接投与され、そこで核酸は発現し、コードする産物を産生する。これは、当技術分野において公知の任意の多数の方法によって、たとえば適切な核酸発現ベクターの一部として該核酸を構築し、かつたとえば欠損もしくは弱毒化レトロウイルスもしくは他のウイルスベクターを用いる感染（米国特許第4,980,286号を参照されたい）によって、裸DNAの直接注射によって、微粒子衝突（たとえば遺伝子銃；バイオリスティック、Dupont）の使用によって、脂質によるコーティングによって、細胞表面受容体、トランスフェクト剤、リポソームへの封入、微粒子、もしくはマイクロカプセルを用いることによって、細胞内となるように該核酸を投与する段階によって、または核に入ることが公知であるペプチドに連結して該核酸を投与する段階によって、受容体媒介エンドサイトーシス（たとえば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照されたい）（これは、受容体を特異的に発現する細胞タイプを標的とするために用いることができる）に供するリガンドに連結して該核酸を投与する段階等によって、行うことができる。もう一つの態様において、エンドソームを破壊するためにリガンドが膜融合ウイルスペプチドを含み、それによって核酸がリソソーム分解を回避することができる、核酸リガンド複合体を形成することができる。なおもう一つの態様において、特異的受容体を標的とすることによって、細胞特異的取り込みおよび発現のために、核酸をインビボで標的とすることができる（たとえば、米国特許出願公開第2005/0002903号；PCT公開番号WO 92/06180；WO 92/22635；WO92/20316；WO93/14188；WO 93/20221を参照されたい）。または、核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによる発現のために宿主DNA内に組み入れることができる（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；およびZijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438）。
特定の態様において、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを用いる。たとえば、レトロウイルスを用いることができる（Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主DNAへの組み込みにとって必要な成分を含有する。遺伝子治療において用いられる抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を、被験者へのヌクレオチド配列の送達を促進する一つまたは複数のベクターにクローニングする。レトロウイルスベクターに関するより詳しい内容は、幹細胞を化学療法に対してより抵抗性にするために、mdr 1遺伝子を造血幹細胞に送達するためにレトロウイルスベクターを用いることを記述するBoesen et al.,（1994, Biotherapy 6:291-302）において見いだされうる。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を図示する他の参考文献は、Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Klein et al., 1994, Blood 83: 1467-1473；Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141；およびGrossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114である。
アデノウイルスは、遺伝子治療において用いることができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸上皮に遺伝子を送達するために特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは、天然で呼吸上皮に感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができる長所を有する。Kozarsky and Wilson（Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503, 1993）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を示している。Bout et al（Human Gene Therapy, 5:3-10, 1994）は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を移入するためにアデノウイルスを用いることを示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用に関する他の例は、Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434；Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155；Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234；PCT公開番号WO94/12649；およびWang et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783において見いだされうる。好ましい態様において、アデノウイルスベクターを用いる。
アデノ随伴ウイルス（AAV）はまた、遺伝子治療において用いるために提示されている（たとえば、Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300および米国特許第5,436,146号を参照されたい）。
遺伝子治療に対するもう一つのアプローチは、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法によって、遺伝子を組織培養における細胞に移入する段階を伴う。通常、移入方法には、細胞に選択マーカーを移入することをが含まれる。次に細胞を選択下に置いて、移入された遺伝子を取り込んで発現するそれらの細胞を単離する。次に、それらの細胞を被験者に送達する。
この態様において、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸を細胞に導入する。そのような導入は、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、微小細胞媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合等が含まれるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の任意の方法によって行うことができる。外来遺伝子を細胞に導入するために、多数の技術が当技術分野において公知であり（たとえば、Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618、Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；およびClin. Pharma. Ther. 29:69-92, 1985を参照されたい）、レシピエント細胞の必要な発達的および生理的機能が破壊されない限り、本発明に従って用いてもよい。この技術は、核酸が細胞によって発現可能であり、好ましくはその細胞子孫によって遺伝可能かつ発現可能であるように、細胞への核酸の安定な移入を提供すべきである。
得られた組換え細胞は、当技術分野において公知の様々な方法によって被験者に送達することができる。組換え血液細胞（たとえば、造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは静脈内投与される。使用が想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態等に依存して、当業者によって決定されうる。
遺伝子治療目的のために核酸を導入することができる細胞は、任意の望ましい利用可能な細胞タイプを包含し、これには、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞または前駆細胞、特にたとえば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝等から得られた造血幹細胞または前駆細胞が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
好ましい態様において、遺伝子治療のために用いられる細胞は、被験者に対して自己由来である。
組換え細胞が遺伝子治療において用いられる態様において、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を、それらが細胞またはその子孫によって発現可能となるように、細胞に導入して、次に組換え細胞を治療効果のためにインビボで投与する。特定の態様において、幹細胞または前駆細胞を用いる。単離してインビトロで維持することができる任意の幹細胞および／または前駆細胞を、本発明のこの態様に従っておそらく用いることができる（たとえば、PCT公開番号WO 94/08598；Stemple and Anderson, 1992, Cell 7 1:973-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229；およびPittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771を参照されたい）。
特定の態様において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、適切な転写誘導物質の有無を制御することによって核酸の発現が制御可能となるように、コード領域に機能的に連結した誘導型プロモーターを含む。
5.5.3 キット
本発明は、本発明の抗体を満たした一つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の処置にとって有用な一つまたは複数の他の予防または治療物質も同様に、薬学的パックまたはキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の成分の一つまたは複数を充填した一つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。任意で、そのような容器に関連して、薬剤または生物産物の製造、使用、または販売を規制する政府の当局によって指示された様式での注意書が存在しえて、該注意書はヒトにおける投与のための製造、使用、または販売に関する当局による承認を反映する。
本発明は、上記の方法において用いることができるキットを提供する。一つの態様において、キットは、本発明の一つまたは複数の抗体を含む。もう一つの態様において、キットはさらに、一つまたは複数の容器において、癌の処置にとって有用な一つまたは複数の他の予防または治療物質を含む。もう一つの態様において、キットはさらに、癌に関連する一つまたは複数の癌抗原に結合する一つまたは複数の細胞障害性抗体を含む。特定の態様において、他の予防または治療物質は化学療法剤である。他の態様において、予防または治療物質は、生物またはホルモン治療物質である。
5.6 治療的有用性の特徴付けおよび証明
本発明の薬学的組成物または予防もしくは治療物質のいくつかの局面は、好ましくはヒトにおいて用いる前に所望の治療活性に関して、インビトロ、たとえば細胞培養系において試験され、その後インビボ、たとえば齧歯類動物モデル系などの動物モデル生物において試験される。たとえば、特定の薬学的組成物の投与が適応されるか否かを決定するために用いることができるアッセイには、患者の組織試料を培養において成長させて、薬学的組成物に曝露するかまたはそうでなければ接触させて、組織試料に及ぼすそのような組成物の効果、たとえば軟寒天における成長および／またはコロニー形成、または三次元基底膜もしくは細胞外マトリクス調製物における管状ネットワーク形成の阻害または減少を観察する細胞培養アッセイが含まれる。組織試料は患者の生検によって得ることができる。この試験によって、それぞれの個々の患者に関して治療的に最も有効な予防または治療分子を同定することができる。または、患者からの細胞を培養する代わりに、治療物質および方法を、腫瘍または悪性細胞株の細胞を用いてスクリーニングしてもよい。様々な特定の態様において、インビトロアッセイは、本発明の薬学的組成物がそのような細胞タイプに対して所望の効果を有するか否かを判定するために、自己免疫障害または炎症性障害に関係する細胞タイプの代表的な細胞（たとえば、T細胞）について行うことができる。そのような生存および／または成長を評価するために、当技術分野において標準である多くのアッセイを用いることができる；たとえば細胞増殖は、3H-チミジン取り込みを測定することによって、直接細胞計数によって、癌原遺伝子（たとえば、fos、myc）などの公知の遺伝子の転写活性の変化、または細胞周期マーカーを検出することによってアッセイすることができ；細胞生存率は、トリパンブルー染色によって評価することができ、分化は、形態の変化、軟寒天での成長および／またはコロニー形成の減少、または三次元基底膜もしくは細胞外マトリクス調製物における管状ネットワーク形成の減少等に基づいて肉眼で評価することができる。さらなるアッセイには、当技術分野において公知であり、実施例において記述されるラフト会合、CDC、ADCC、およびアポトーシスアッセイが含まれる。
予防物質および／または治療物質の併用は、ヒトにおいて用いる前に適した動物モデル系において試験することができる。そのような動物モデル系には、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギ等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。当技術分野において周知の任意の動物モデル系を用いてもよい。本発明の特定の態様において、予防および／または治療物質の併用を、マウスモデル系において試験する。そのようなモデル系は広く用いられ、当業者に周知である。予防および／または治療物質は反復投与することができる。この技法のいくつかの局面は、予防物質および／または治療物質の投与に関する時間的レジメン、およびそのような物質を個々にまたは混合して投与するか否かのように、変化してもよい。
本発明の方法において用いられる好ましい動物モデルは、たとえばマウスエフェクター細胞においてFcγRを発現するトランスジェニックマウス、たとえば米国特許第5,877,396号において記述される任意のマウスモデル（その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる）である。本発明の方法において用いるためのトランスジェニックマウスには、ヒトFcγRIIIAを有するマウス、ヒトFcγRIIAを有するマウス、ヒトFcγRIIBとヒトFcγRIIIAとを有するマウス、ヒトFcγRIIBとヒトFcγRIIAとを有するマウスが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本発明の予防および／または治療物質を動物モデルにおいて試験した後、その有効性を確立するためにそれらを臨床試験において試験することができる。臨床試験の確立は、当業者に公知の一般的な方法に従って行われ、本発明の組成物の最適な用量および投与経路、ならびに毒性プロフィールを、慣例的な実験を用いて確立することができる。
本発明の併用治療の抗炎症活性は、当技術分野において公知の、およびCrofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)において記述される炎症性関節炎の様々な実験動物モデルを用いることによって、決定することができる。炎症性関節炎および自己免疫性リウマチ疾患に関する実験的および自然発生動物モデルも同様に用いて、本発明の併用治療の抗炎症活性を評価することができる。以下は、例として提供され、限定的でない、いくつかのアッセイである。
当技術分野において公知であって広く用いられている関節炎または炎症性疾患の主な動物モデルには、アジュバント誘発関節炎ラットモデル、コラーゲン誘発関節炎ラットおよびマウスモデル、ならびに抗原誘発性関節炎のラット、ウサギ、およびハムスターモデルが含まれ、それらは全て、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)において記述される。
本発明の併用治療の抗炎症活性は、カラゲニン誘発関節炎ラットモデルを用いて評価することができる。カラゲニン誘発関節炎はまた、慢性関節炎または炎症の研究において、ウサギ、イヌ、およびブタにおいても用いられている。定量的組織形態計測評価を用いて、治療効能を決定する。そのようなカラゲニン誘発関節炎モデルを用いる方法は、Hansra P. et al., "Carrageenan-Induced Arthritis in the Rat," Inflammation, 24(2): 141-155, (2000)において記述されている。同様に、当技術分野において公知であり記述されるザイモサン誘発炎症動物モデルも一般的に用いられる。
本発明の併用治療の抗炎症活性はまた、Winter C. A. et al., "Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs" Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547, (1962)において記述される方法の改変を用いてラットにおけるカラゲニン誘発足浮腫の阻害を測定することによっても評価することができる。このアッセイは、大半のNSAIDの抗炎症活性に関する一次インビボスクリーニングとして用いられており、ヒトにおける効能を予測すると考えられている。試験される予防物質または治療物質の抗炎症活性は、媒体を投与した対照群と比較して試験群の後肢重量の増加の阻害（％）として表記される。
さらに、炎症性腸疾患に関する動物モデルも同様に、本発明の併用治療の効能を評価するために用いることができる（Kim et al., 1992, Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537；Strober, 1985, Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S）。潰瘍性大腸炎およびクローン病は、動物において誘発することができるヒト炎症性腸疾患である。アミロペクチン、カラゲニン、硫酸アミロペクチンおよび硫酸デキストランが含まれるがこれらに限定されるわけではない硫酸化多糖類、またはトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）および酢酸が含まれるがこれらに限定されるわけではない化学刺激剤を動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘発することができる。
喘息の動物モデルも同様に、本発明の併用治療の効能を評価するために用いることができる。一つのそのようなモデルの例はマウスの移入モデルであり、このモデルでは、TH1またはTH2レシピエントマウスを空中アレルゲン刺激することによって、THエフェクター細胞の気道への遊走が起こり、強い好中球（TH1）および好酸球（TH2）肺粘膜炎症反応を伴う（Cohn et al., 1997, J. Exp. Med. 1861737-1747）。
自己免疫障害の動物モデルはまた、本発明の併用治療の効能を評価するためにも用いられうる。1型糖尿病、甲状腺自己免疫病、全身性紅斑性狼瘡、および糸球体腎炎などの自己免疫障害の動物モデルが開発されている（Flanders et al., 1999, Autoimmunity 29:235-246；Krogh et al., 1999, Biochimie 81:511-515；Foster, 1999, Semin. Nephrol. 19: 12-24）。
さらに、当業者に公知の任意のアッセイを用いて、自己免疫および／または炎症性疾患に関して本明細書において開示される併用治療の予防的および／または治療的有用性を評価することができる。
本発明の予防および／または治療プロトコールの毒性および有効性は、たとえばLD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的技法によって決定することができる。毒性効果と治療効果のあいだの用量比は治療指数であり、これはLD50/ED50として表記することができる。高い治療指数を示す予防および／または治療物質が好ましい。毒性の副作用を示す予防および／または治療物質を用いてもよいが、非感染細胞に対する起こりうる損傷を最小限にし、それによって副作用を低減させるように、罹患組織部位にそのような物質を標的化する送達系を設計するように注意すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおいて用いるための予防および／または治療物質の用量範囲を処方するために用いることができる。そのような物質の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を示さないED50が含まれる循環中の濃度範囲内に存在する。該用量は、使用される投与剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。本発明の方法において用いられる任意の物質に関して、治療的有効量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。該用量は、細胞培養において決定されるIC50（症状の半最大（half-maximal）阻害を達成する試験化合物の濃度）が含まれる循環中の血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方してもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
本発明の方法に従って用いられる治療の抗癌活性はまた、当技術分野において公知であって、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger)；Contributions to Oncology (1999, Karger)；The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd)；およびAnticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher)において記述される、SCIDマウスモデル、トランスジェニックマウス、またはヒト異種移植片を有するヌードマウス、ハムスター、ウサギ等の動物モデルなどの、癌の研究のために用いられる様々な実験動物モデルを用いることによって決定することができる。
本発明のプロトコールおよび組成物は、ヒトにおいて用いる前に所望の治療または予防活性に関して、好ましくはインビトロで試験された後、インビボで試験される。治療物質および方法は、腫瘍または悪性細胞株の細胞を用いてスクリーニングしてもよい。当技術分野において標準の多くのアッセイを用いてそのような生存および／または成長を評価することができ；たとえば、細胞増殖は、3H-チミジン取り込みを測定することによって、直接細胞計数によって、癌原遺伝子（たとえば、fos、myc）などの公知の遺伝子の転写活性の変化または細胞周期マーカーを検出することによって、アッセイすることができ；細胞生存率は、トリパンブルー染色によって評価することができ、分化は、形態の変化、軟寒天での成長および／またはコロニー形成、または三次元基底膜もしくは細胞外マトリクス調製物における管状ネットワーク形成等の減少に基づいて肉眼で評価することができる。
治療において用いられる化合物は、ヒトにおける試験の前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスター等が含まれるがこれらに限定されるわけではない適した動物モデル系、たとえば先に記述した動物モデルにおいて試験することができる。次に、該化合物を適切な臨床試験において用いることができる。
さらに、当業者に公知である任意のアッセイを用いて、癌、炎症性障害、または自己免疫疾患の処置または予防のために本明細書において開示される併用治療の予防および／または治療的有用性を評価することができる。
5.7 診断法
本発明の標識抗体は、疾患、障害、または感染症を検出、診断、またはモニターするための診断目的のために用いることができる。本発明は、以下を含む、疾患、障害、または感染症、特に自己免疫疾患の検出または診断を提供する：（a）FcγRIIBに免疫特異的に結合する一つまたは複数の抗体を用いて被験者の細胞または組織試料におけるFcγRIIBの発現をアッセイする段階；および（b）抗原のレベルを対照レベル、たとえば正常な組織試料におけるレベルと比較する段階であって、対照抗原レベルと比較してアッセイされた抗原レベルが増加すれば、疾患、障害、または感染症が示される、段階。
本発明の抗体は、本明細書において記述されるようにまたは当業者に公知のように、古典的な免疫組織学的方法を用いて、生体試料におけるFcγRIIBレベルをアッセイするために用いることができる（たとえば、Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985；Jalkanen et al., 1987, J. Cell . Biol. 105:3087-3096を参照されたい）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体に基づく方法には、酵素免疫測定法（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）などのイムノアッセイが含まれる。適した抗体アッセイ標識が当技術分野において公知であり、これにはアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素（125I、131I）、炭素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（121In）、およびテクネチウム（99mTc）などの放射性同位元素；ルミノールなどの発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識が含まれる。
本発明の一つの局面は、ヒトにおける疾患、障害、または感染症の検出および診断である。一つの態様において、診断は、（a）FcγRIIBに免疫特異的に結合する標識抗体の有効量を被験者に投与する段階（たとえば、非経口、皮下、または腹腔内で）；（b）FcγRIIBが発現する被験者内の部位で標識抗体を選択的に濃縮させるために（および非結合標識分子をバックグラウンドレベルまで排除するために）、投与後一定期間待つ段階；（c）バックグラウンドレベルを決定する段階；および（d）バックグラウンドレベルより上で標識抗体が検出されれば、被験者が疾患、障害、または感染症を有することが示されるように、被験者における標識抗体を検出する段階、を含む。この態様に従って、抗体は、当業者に公知の撮像システムを用いて検出可能である撮像部分によって標識される。バックグラウンドレベルは、検出された標識分子の量を、特定の系についてこれまでに決定された標準値と比較する段階が含まれる、様々な方法によって決定することができる。
被験者の体格および用いる撮像システムが、診断画像を生成するために必要な撮像部分の量を決定することは理解されるであろう。ヒト被験者に関する放射性同位元素部分の場合、注入される放射活性の量は通常、99mTc約5〜20 mCiの範囲であろう。次に、標識抗体は、特異的タンパク質を含有する細胞の位置で選択的に蓄積するであろう。インビボでの腫瘍の撮像は、S. W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)において記述されている。
用いられる標識のタイプおよび投与様式が含まれるいくつかの変数に応じて、標識分子を被験者内の部位で選択的に濃縮させて、非結合標識分子をバックグラウンドレベルまで排除するための投与後の期間は、6〜48時間、6〜24時間、または6〜12時間である。もう一つの態様において、投与後の期間は5〜20日または5〜10日である。
一つの態様において、疾患、障害、または感染症のモニタリングは、初回診断後1ヶ月間、初回診断後6ヶ月間、初回診断後1年間等のあいだ疾患、障害、または感染症の診断法を繰り返すことによって行われる。
標識分子の存在は、インビボでの走査のために当技術分野において公知の方法を用いて、被験者において検出することができる。これらの方法は、用いる標識のタイプに依存する。当業者は、特定の標識を検出するために適切な方法を決定することができるであろう。本発明の診断法において用いてもよい方法および装置には、コンピューター断層撮影（CT）、ポジトロンエミッショントモグラフィー（PET）などの全身走査、磁気共鳴画像（MRI）、および超音波検査が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
特定の態様において、分子は放射性同位元素によって標識され、放射線反応性の外科機器を用いて患者において検出される（Thurston et al., 米国特許第5,441,050号）。もう一つの態様において、分子は蛍光化合物によって標識され、蛍光反応性の走査機器を用いて患者において検出される。もう一つの態様において、分子は陽電子射出金属によって標識され、ポジトロンエミッショントモグラフィーを用いて患者において検出される。なおもう一つの態様において、分子は、常磁性標識によって標識され、磁気共鳴画像（MRI）を用いて患者において検出される。
6．実施例
6.1 モノクローナル抗体の調製
マウスモノクローナル抗体は、ATCCアクセッション番号PTA-7610を有するクローン8B5.3.4から産生された。FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を生成した。トランスジェニックFcγRIIAマウス（Dr. Ravetch Laboratory, Rockefeller Universityにおいて生成）を、ヒトFcγRIIB受容体の細胞外ドメイン、残基1〜180位をコードするcDNAをトランスフェクトした293細胞の上清から精製したFcγRIIBによって免疫した。これらのマウスの脾細胞からのハイブリドーマ細胞株を産生して、FcγRIIAに結合する場合より大きな親和性でFcγRIIBに特異的に結合する抗体に関してスクリーニングした。
6.2 抗体のスクリーニングおよび特徴付け
6.2.1 材料および方法
ハイブリドーマ培養からの上清をELISAアッセイを用いて、FcγRIIAまたはFcγRIIBに対する免疫反応性に関してスクリーニングする。それぞれの場合において、プレートを100 ng/ウェルのFcγRIIAまたはFcγRIIBによってコーティングする。特異的受容体に対する抗体の結合を、650 nmでの吸光度をモニターすることによって、ヤギ抗マウスHRP結合抗体によって検出する。
ブロッキングELISA実験において、ハイブリドーマ上清からの抗体が凝集したIgGのFcγRIIBに対する結合を遮断できるか否かをモニターする。プレートを適切な「ブロッキング剤」によってブロックして、洗浄緩衝液（PBS＋0.1％Tween）によって3回洗浄する（200μl/ウェル）。プレートをハイブリドーマ上清と共に37℃で1時間プレインキュベートする。ブロッキング後、凝集したビオチン化ヒトIgGの固定量（1μg/ウェル）をウェルに加えて、FcγRIIB受容体に凝集体を結合させる。この反応を37℃で2時間行う。次に、さらに洗浄後、結合した凝集IgGを検出するストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体によって、検出をモニターする。650 nmでの吸光度は、結合した凝集IgGに比例する。
β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイにおいて、ハイブリドーマ上清からの抗体がβ-ヘキソサミニダーゼのFcγ誘発放出を阻害できるか否かをモニターする。RBL-2H3細胞細胞にヒトFcγRIIBをトランスフェクトする；細胞を、0.03μg/mL〜30μg/mLの範囲の様々な濃度のヤギ抗マウスF(ab)2断片によって刺激して、マウスIgE単独（0.01 μg/mL）または抗FcγRIIB抗体のいずれかによって感作する。温度37℃で1時間インキュベート後、細胞を遠心して、上清を採取し、細胞を溶解する。上清に放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を、p-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニドを用いる比色アッセイにおいて決定する。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を、総活性に対して放出された活性の百分率として表記する。
BIAcore分析
CD32A-H131、CD32A-R131、またはCD32Bに対する抗体結合を、293H細胞において発現した受容体の可溶性細胞外ドメインを用いることによって、BIAcore 3000バイオセンサー（Biacore AB, Uppsala, Sweden）における表面プラズモン共鳴によって分析した。捕獲抗体であるヤギ抗マウスFc特異的抗体のF(ab')2断片（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）を、製造元によって推奨される技法に従ってCM-5センサーチップ上に固定した。簡単に説明すると、センサーチップ表面上のカルボキシル基を0.2 M N-エチル-N-(3ジエチルアミノ-プロピル)カルボジイミドおよび0.05 M N-ヒドロキシ-スクシニミドを含有する溶液の注入によって活性化した。次に、F(ab')2断片を、10 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0において活性化CM-5表面上に流速5μl/分で420秒間注入した後、不活化のために1 Mエタノールアミンを注入した。結合実験を、10 mM Hepes、pH 7.4、150 mM NaCl、および0.005％P20界面活性剤を含有するHBS-P緩衝液において行った。300 nM抗体溶液を流速5μl/分で240秒間注入した後に、濃度100 nMで単量体の可溶性受容体を流速50μl/分で解離時間180秒で120秒間注入することによって、各モノクローナル抗体を、CM-5チップ上で捕獲した。F(ab')2 GAM表面の再生は、50 mMグリシンpH 1.5および50 mM NaOHのパルス注入によって行った。捕獲抗体を有しない固定されたF(ab')2 GAM表面上にそれぞれの可溶性受容体を注入することによって参照曲線を得た。参照曲線を差し引いて、反応を同じレベルの捕獲抗体に対して標準化した。捕獲抗体に対する可溶性受容体の結合の反応速度パラメータを得るために、対応する濃度での対応するIgGに対する結合曲線を差し引いた。得られた曲線を異なるka/kd適合によって分析した。KD値は、異なる二つの濃度での四つの曲線の平均値として計算した。
FACS分析
FcγRIIBを発現するCHO細胞を様々な抗体によって染色して、FACSによって分析した。一つのシリーズの実験において、モノクローナル抗体が受容体を認識するか否かを決定するために、細胞を直接標識する。
ブロッキングFACS実験において、凝集IgGのFcγRIIBに対する結合をハイブリドーマ上清からの抗体が遮断するか否かをモニターする。各試料に関して細胞（FcγRIIBを発現するCHO細胞）約100万個を、氷中でアイソタイプ対照（マウスIgG1）または8B5.3.4抗体2 μgと共に30分間インキュベートする。細胞をPBS＋1％BSAによって1回洗浄して、凝集したビオチン化ヒトIgG 1 μgと共に氷中で30分間インキュベートする。細胞を洗浄して、二次抗体を加え、結合した抗体を検出するためのヤギ抗マウスFITC、および結合した凝集ビオチン化ヒトIgGを検出するためにストレプトアビジン-PEを結合させて、氷中で30分間インキュベートする。細胞を洗浄してFACSによって分析する。
Bリンパ球を染色してFcγRIIBおよびCD20の存在を検出する。それぞれの試料に関して「バフィーコート」200μlを氷中でアイソタイプ対照またはモノクローナル抗体8B5.3.4 2μgと共にインキュベートする。細胞をPBS＋1％BSAによって1回洗浄して、ヤギ抗マウス-PE抗体1μlと共に氷中で30分間インキュベートする。細胞を1回洗浄して、CD20-FITC抗体（2μg）を試料に加えて、氷中で30分間インキュベートする。全ての試料をPBS＋1％BSAによって1回洗浄して細胞をFACSによって分析する。
ヒトPBMCを8B5.3.4およびIV.3抗体によって染色した後、ヤギ抗マウスシアニン（Cy5）結合抗体（Bリンパ球に結合した抗CD20-FITC、単球に結合した抗CD14-PE、NK細胞に関して結合した抗CD56-PE、および顆粒球に関して結合した抗CD16-PEを用いる二色染色）によって染色する。
ADCCアッセイ
Her2/neu抗原を発現する標的細胞（IGROV-1またはSKBR-3細胞）4〜5×106個をビス(アセトキシメチル)2,2':6',2''-terピリジン-t-6''-ジカルボキシレート（DELFIA BATDA Reagent, Perkin Elmer/Wallac）によって標識する。BATDA試薬を細胞に加えて、混合物を37℃で好ましくは5％CO2下で少なくとも30分間インキュベートする。次に細胞を生理的緩衝液、たとえば0.125 mMスルフィンピラゾールを有するPBSおよび0.125 mMスフリンピラゾールを含有する培地によって洗浄する。標識された標的細胞をエフェクター細胞、たとえばPBMCに、エフェクター対標的比およそ50：1、75：1、または100：1を産生するように加える。PBMCは、Ficoll-Hypaque (Sigma）上に全血を載せて、500 gで室温で30分間遠心することによって単離する。白血球層をユーロピウムに基づくADCCアッセイに関するエフェクターとして採取する。凍結または新たに単離した溶出単球（Advanced Biotechnologies, MD）を、腫瘍標的細胞株と共にエフェクター細胞として様々なエフェクター対標的比100：1〜10：1で用い、抗体の濃度を1〜15μg/mlから滴定する。サイトカインによって刺激された凍結保存液として得られた単球をADCCアッセイにおけるエフェクター細胞として用いる。凍結単球が最適に実行する場合、それらを慣例として用いてそうでなければ新鮮な細胞を用いるであろう。MDMは、培養における単球の生存率および分化を増強することが知られているサイトカインGM-CSFまたはM-CSFによる処置によって調製されるであろう。MDMはサイトカインによって刺激され、様々なFcγR（I、IIA、IIB、およびIIIA）の発現がFACS分析によって決定されるであろう。
エフェクターおよび標的細胞を少なくとも2時間、16時間まで37℃で5％CO2下で、標的細胞上で発現する抗原に対して特異的な抗腫瘍抗体、Her2/neuの存在下で、および抗FcγRIIB抗体の存在下または非存在下でインキュベートする。N297A変異を含有するように操作されているキメラ4D5抗体は、その可変領域を通して腫瘍標的細胞に結合することから、この抗体を陰性対照として用いる。この部位でのグリコシル化の喪失は、FcγRに対する抗体のFc領域の結合を消失させる。市販のヒトIgG1/kは、抗FcγRIIB抗体に関するアイソタイプ対照として作用する。細胞上清を採取して、酸性ユーロピウム溶液（たとえば、DELFIA Europium Solution, Perkin Elmer/Wallac）に加える。形成されたユーロピウム-TDAキレートの蛍光を、時間分解型蛍光計（たとえば、Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac）において定量する。最大放出（MR）および自然放出（SR）は、標的細胞を1％TX-100および培地単独と共にそれぞれインキュベートすることによって決定される。抗体非依存的細胞障害性（AICC）を、抗体の非存在下で標的およびエフェクター細胞をインキュベートすることによって測定する。それぞれのアッセイは、好ましくは1試料あたり3個ずつ行う。平均特異的溶解（％）は、実験放出（ADCC）−AICC）／（MR−SR）×100として計算する。
6.2.2 8B5.3.4クローンから産生されたモノクローナル抗体の特徴付け
8B5.3.4クローンから産生された抗体のFcγRIIAおよびFcγRIIBに対する直接結合
8B5.3.4クローンから産生された抗体のFcγRIIAおよびFcγRIIBに対する直接結合を、FcγRIIAおよびFcγRIIBでコーティングしたプレートによるELISAアッセイによって比較した（表8および図1）。MAb 8B5.3.4を含有する8B5.3.4ハイブリドーマクローンからの培養上清を、FcγRIIAおよびFcγRIIBに対する特異的結合に関して試験した（1試料あたり2個ずつ）。ハイブリドーマクローン8B5.3.4からの上清は、表8における陽性および陰性対照と比較してより高い吸光度値によって示されるように、FcγRIIAよりFcγRIIBに対して有意により高い親和性を有する（図1）。
（表８）：ハイブリドーマクローン8B5.3.4によって産生されたMAb 8B5.3.4のFcγRIIAおよびFcγRIIBに対する結合を特徴付けするためのELISAアッセイの結果。650 nmでの吸光度の値（1試料あたり2個ずつ）を各試料に関して報告する。
Figure 0005764290
8B5.3.4クローンから産生されたMAb 8B5.3.4のアイソタイピング
MAb 8B5.3.4のアイソタイプをELISAアッセイによって決定した（表9および図2）。表記の様々なアイソタイプに対する抗体をアッセイした。図2における吸光度値は、抗IgG、抗IgG1、および抗κ抗体がMAb 8B5.3.4と最高の反応性を有することを示し、このことはMAb 8B5.3.4がIgG1／κアイソタイプを有することを示している。
（表９）：ハイブリドーマクローン8B5.3.4によって産生されたMAb 8B5.3.4のアイソタイプを特徴付けするためのELISAアッセイの結果。650 nmでの吸光度値を表記の抗体アイソタイプに関して報告する。
Figure 0005764290
6.2.3 インビボADCCアッセイ
6.2.3.1 ヒト腫瘍細胞株を用いた異種移植マウスモデルにおけるFcγRIIB抗体の活性
異種移植片卵巣および乳癌モデルを確立するために、6〜8週齢の雌性Balb/cヌードマウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME; Taconic）を利用する。マウスを、腹水由来卵巣細胞および胸膜浸出液由来乳癌細胞を腫瘍源として用いる異種移植片モデルのために、生物安全性レベル-2施設に収容する。これらの実験に関してマウスを4つの群に分けて、週に3日モニターする。マウスの体重および生存期間を記録して、腫瘍の成長に関する基準は、腹部膨満および触診可能な腫瘍である。目に見える不快感の徴候を示すマウス、または腫瘍の重量が5 グラムに達するマウスを二酸化炭素によって安楽死させて、剖検する。抗体処置マウスを対照群の後さらに2ヶ月間観察下に置く。
腫瘍細胞株による異種移植片腫瘍モデルの確立
異種移植片腫瘍モデルを確立するために、生存IGROV-1またはSKBR-3細胞5×106個を年齢および体重をマッチさせた雌性ヌード無胸腺マウス3匹にMatrigel（Becton Dickinson）と共に皮下注射する。腫瘍の推定重量は、以下の式：長さ×（幅）2/2によって計算し、この値は3 gを超えない。増殖させるための細胞のインビボ継代において、接着依存性の腫瘍を単離して、腫瘍1 グラムに対してコラゲナーゼ（Sigma）1μgを加えることによって細胞を37℃で終夜解離する。
IGROV-1細胞の注射は、急速に成長する腫瘍を自然発生的に生じるが、腹腔内経路は、腹腔癌腫症を誘発し、これによってマウスは2ヶ月間で死亡する。IGROV-1細胞は5週間以内に腫瘍を形成することから、腫瘍細胞の注射後1日目に、エフェクターとしての単球を各4μg/gマウス体重（mbw）の治療抗体ch4D5およびch8B5.3.4と共に腹腔内に同時注射する（表10）。初回注射の後に、抗体の毎週注射をその後4〜6週間行う。ヒトエフェクター細胞を2週間に1回補給する。一群のマウスには治療抗体を与えないが、抗腫瘍抗体およびch8B5.3.4抗体に関するアイソタイプ抗体としてそれぞれ、ch4D5 N297AおよびヒトIgG1を注射する。
（表１０）：ADCCエフェクターとして移入されたヒト単球を有するヌードマウスにおける異種移植片腫瘍モデルにおけるキメラ抗Her2neu抗体ch4D5およびキメラ抗FcγRIIB抗体ch8B5.3.4（またはヒト化抗FcγRIIB抗体（h8B5.3.4））による腫瘍除去試験の概要
Figure 0005764290
表10において示されるように、一つの標的とエフェクターの組み合わせで、抗体濃度の異なる二つの組み合わせによる腫瘍除去における抗FcγRIIB抗体の役割を調べるためには、各群マウス8匹の6群が必要である。これらの群はA）腫瘍細胞、B）腫瘍細胞と単球、C）腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体ch4D5、D）腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体ch4D5、および抗FcγRIIB抗体、たとえばch8B5.3.4、E）腫瘍細胞、単球、および抗FcγRIIB抗体、たとえばch8B5.3.4、ならびにF）腫瘍細胞、単球、ch4D5 N297A、およびヒトIgG1である。抗体濃度の様々な組み合わせを類似のスキームにおいて試験することができる。
乳癌細胞株SKBR-3細胞はHer2/neuを過剰発現することから、SKBR-3を用いる試験をIGROV-1モデルと同時に行う。これは腫瘍の除去における抗FcγRIIB抗体の役割の評価の厳密さを増加させるであろう。IGROV-1細胞による腫瘍除去試験の結果に基づいて、他の標的によるさらなる実験の実験デザインに改変を加える。
腫瘍の大きさ（マウスの体重）、生存時間、および表10における各群に関する組織学報告に基づいて、異種移植片腫瘍モデルのエンドポイントを決定する。マウスを週に3回モニターする；腫瘍成長の基準は、腹部膨満および腹腔における触診可能な塊の存在である。腫瘍重量の推定値対接種後日数を計算する。表10におけるD群のマウス対他の群のマウスからのこれらの三つの基準に基づいて、腫瘍の除去の増強における抗FcγRIIB抗体の役割を規定する。目に見える疼痛の徴候を示すマウスまたは腫瘍重量が5グラムに達したマウスを二酸化炭素によって安楽死させて剖検する。抗体処置動物をこの時点の後2ヶ月間追跡する。
6.2.3.2 ヒト初代培養卵巣癌および乳癌由来細胞による異種移植片マウスモデルにおけるFcγRIIB抗体のインビボ活性
癌腫症を有する患者の浸出液から単離した腫瘍細胞を移入することによって、原発性卵巣癌および乳癌から初代腫瘍を確立する。これらの試験を臨床に変換するために、異種移植片モデルを、卵巣癌患者2人および乳癌患者2人からのそれぞれ、腹水および胸膜滲出液由来腫瘍細胞によって評価する。乳癌細胞源としての胸膜滲出液および悪性乳腺組織の移植は、異種移植片マウスモデルを確立するために用いられて成功している。たとえばその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Sakakibara et al., 1996, Cancer J. Sci. Am. 2: 291を参照されたい。これらの試験は、初代細胞の腫瘍除去における抗FcγRIIB抗体の広範囲の応用を決定するであろう。移入したヒト単球を有するBalb/cヌードマウスモデルにおいて、抗腫瘍抗体ch4D5および抗FcγRIIB抗体、たとえばch8B5.3.4を用いて、腫瘍の除去を試験する。
ヒト腹水および胸膜滲出液由来初代腫瘍細胞
卵巣癌患者からの腹水および乳癌患者からの胸膜滲出液を用いる。患者からの腹水および胸膜滲出液は、40〜50％の腫瘍細胞を含有し、Her2neuの高い発現を有する腫瘍細胞を有する試料が異種移植片モデルを確立するするために用いられるであろう。
異種移植片腫瘍モデルを確立する前に、新生物細胞におけるHer2/neuの発現に関して、腹水および胸膜滲出液試料を試験する。腫瘍モデルの確立に影響を及ぼす可能性がある、新生物細胞対他の細胞サブセットの百分率を決定する。卵巣癌および乳癌患者からのそれぞれ、腹水および胸膜滲出液を、新生物細胞におけるHer2/neu+の発現レベルを決定するために慣例によって分析する。FACS分析を用いて、臨床試料におけるHer2/neu+新生物細胞の百分率を決定する。Her2/neu+新生物細胞の百分率が高い試料をBalb/cマウスにおける腫瘍の開始のために選択する。
組織化学および免疫化学
新生物の構造特徴を分析するために、卵巣癌患者の腹水および胸膜滲出液について、組織化学および免疫化学を行う。モニターされるマーカーは、サイトケラチン（炎症および間葉細胞からの卵巣新生物および中皮細胞を同定するため）；カルレチニン（Her2/neu陽性新生物細胞から中皮を分離するため）；およびCD45（試料における細胞集団の残りから炎症細胞を分離するため）である。追跡されるさらなるマーカーには、CD3（T細胞）、CD20（B細胞）、CD56（NK細胞）、およびCD14（単球）が含まれるであろう。
免疫組織化学染色に関して、凍結切片およびパラフィン化組織を標準的な技術によって調製する。凍結切片および脱パラフィン化切片を類似の染色プロトコールにおいて染色する。スライドガラスを3％過酸化水素に液浸して、PBSによって5分間洗浄することによって、組織の内因性のペルオキシダーゼを失活させる。切片をブロックして、一次抗体ch4D5をブロック血清に30分間加えた後、PBSによって試料を3回洗浄する。ビオチンに結合した二次抗ヒト抗体を30分間加えて、スライドガラスをPBSにおいて5分間洗浄する。アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Vector Labs）を30分間加えた後、洗浄する。新鮮な基質DAB溶液においてスライドガラスをインキュベートすることによって発色させ、水道水において洗浄することによって、反応を停止させる。H＆E染色の場合、スライドガラスをパラフィンを除去した後、異なるアルコール濃度において水和させる。スライドガラスを水道水において洗浄して、ヘマトキシリンに5分間入れる。過剰量の染色を酸-アルコールの後、アンモニアおよび水によって除去する。スライドガラスをエオジンに入れて脱水のために90〜100％アルコールによって洗浄する。最後に、スライドガラスをキシレンに入れて長期間保存するために固定剤と共に封入する。全ての場合について、腫瘍細胞の百分率をパパニコラウ染色によって決定する。
組織化学染色
卵巣癌を有する異なる患者2人からの腹水を、腫瘍細胞および他の細胞タイプの存在を分析するために、ヘマトキシリンおよびエオジン（H＆E）およびギムザによって染色する。
マウスモデル
腹水を6370 gで4℃で20分間遠心して、赤血球を溶解させた後細胞をPBSによって洗浄することによって、卵巣癌患者からの試料を処理する。各試料におけるHer2/neu+腫瘍細胞の百分率に基づいて、中央値および高い発現を示す二つの試料を、腫瘍の除去における抗FcγRIIB抗体の役割を評価するために異種移植片モデルを確立するために皮下接種のために選択する。腫瘍細胞は非処理腹水の細胞サブセットの40〜50％を構成し、精製後、腫瘍細胞10〜50×106個が腹水2 Lから得られたことが報告されている（Barker et al., 2001, Gynecol. Oncol. 82: 57-63）。単離された腹水細胞をマウスに腹腔内注射して、腫瘍細胞を増殖させる。マウスおよそ10匹に腹腔内注射して、各マウス腹水をさらにマウス2匹に継代して、全体でマウス20匹からの腹水を得て、これを用いてマウス80匹の群に注射する。胸膜滲出液を腹水と同様に処理して、Her2/neu+腫瘍細胞をマトリゲルにおいて上部左右乳房に注射する。腫瘍細胞の皮下接種後、マウスを臨床および解剖学的変化に関して追跡する。必要であれば、マウスを剖検して総腫瘍負荷を特異的臓器局在と相関させてもよい。
6.3 CD32B特異的モノクローナル抗体のスクリーニング
CD32B特異的抗体を、B細胞リンパ腫細胞株およびB細胞悪性疾患を有する患者からの細胞において、反応性、ラフト会合、CDC、およびアポトーシスの誘導に関してスクリーニングする。患者からの細胞の単離および反応性スクリーニングは上記のとおりである。
ラフト会合
抗体が特殊な膜ミクロドメインへの抗原の再分布を誘発する能力の測定である、脂質ラフト会合は、0.5％TX-100による4℃での溶解後に洗浄剤-不溶性の細胞画分に回収される抗体量を測定することによって簡便に行われる（Veri et al., 2001, Mol Cell Bio 21:6939-6950；Cragg et al., 2004, Blood 103:2738-43）。典型的な実験において、細胞を氷中で関心対象の抗体によってコーティングして洗浄する。アリコートを、適切な二次抗体とのさらなるクロスリンクに供する。沈降した細胞をTX-100洗浄剤分画に供する。同等の試料を、脂質ラフトを破壊することが知られているグルコピラノシドによって可溶化するか、またはSDSに基づくLaemmli試料緩衝液によって直接可溶化して細胞会合抗体の全量を得る。不溶性画分をSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって分析する。さらなるクロスリンクを行うまたは行わない脂質ラフトへの再分布を、密度測定比較によって記録する。
CDC
CDCは、FACS分析におけるヨウ化プロピジウム（PI）排除（Cragg et al., 2004, Blood 103:2738-43）または従来の放射標識放出（たとえば、51Crおよび111In放出）などの、当技術分野において公知のいくつかの方法の一つによって評価される。簡単に説明すると、細胞を関心対象の抗体の滴定量と共に37℃で15分間インキュベートした後、補体源として血清（20％最終濃度）を加えた後さらにインキュベーションを5分間継続した後分析する。ヒト血清の高い変動により、Pel凍結ウサギ血清を標準補体源として用いる。プールした正常ヒトAB血清も同様に調製する。血清の各バッチを、品質保証のためにウサギ血清に対する赤血球溶解において試験する。
アポトーシス
可溶性またはプレート固定抗CD32B抗体によって誘導されるアポトーシスを、多色分析においてアネキシンV膜トランスロケーションおよびPI染色（Cragg et al., 2004, Blood 103:2738-43）を用いて標準的なFACSに基づく方法によって調べて、関心対象の集団（たとえばCy5-CD19）を同定する。簡単に説明すると、細胞を遊離した溶液または96ウェルプレートに固定した関心対象の抗体の滴定量によって異なる期間（2〜18時間）処置する。次に、細胞を軽く剥離させるおよび／または遠心によって回収して、1μg/ml FITC-アネキシンVプラス10μg/ml PIによって染色して、初期アポトーシス細胞と二次アポトーシス細胞とを識別する。
6.4 マウス腫瘍異種移植片リンパ腫モデルにおけるインビボ腫瘍除去試験
マウスリンパ腫モデルにおいて腫瘍を予防する能力は、抗体が臨床試験に進む可能性を決定するために重要な基準である。
多数の十分に特徴付けのなされたバーキットリンパ腫細胞株がNHLモデルとして用いるために入手可能である（Epstein et al., 1966, J Natl Cancer Inst 37:547-559；Klein et al., 1968, Cancer Res 28: 1300-1310；Klein et al., 1975, Intervirology 5:319-334；Nilsson et al., 1977, Intl J Cancer 19:337-344；Ohsugi et al., 1980, J Natl Cancer Inst 65:715-718）。リンパ腫形成の異種移植片モデルは、既に報告されたモデルと類似のようにヌードマウスにおいて確立されている（Vallera et al., 2003, Cancer Biother Radiopharm 18: 133-145；Vuist et al., 1989, Cancer Res 49:3783-3788）。
簡単に説明すると、バーキットリンパ腫細胞株であるDaudi（5〜10×106個）を免疫欠損nu/nuマウス系統に皮下移植する。BALB/c nu/nuマウス株を、エフェクター細胞として健康なドナーから精製された移入したヒトPBMCと共に用いる。ヒトPBMCにおける優勢なエフェクター細胞集団は、そのCD16A（FcγRIIIa）を通してADCCを発揮するNK細胞によって代表される。マウスCD16A遺伝子がノックアウトされており、ヒトCD16Aを発現するように遺伝子操作されているnu/nuマウス系統も同様に用いられる。このCD16A -/- huCD16Atg、nu/nuマウスは、ヒト細胞の移入を必要とすることなく、ヒトFc受容体の状況において抗腫瘍活性の試験を可能にする。
マウスを、選択されたキメラ抗体の1、4、7および15日での腹腔内注射によって処置する。開始用量4μg/g体重を用いるが、このモデルにおける抗体の相対的効能を確立するためにさらなる用量が試験されるであろう。RituxanおよびCampathを比較のために用いる。さらに、RituxanまたはCampathとの併用治療の起こりうる相乗効果も同様に調べる。これらの試験において、抗体処置および対照群を比較するために、腫瘍の成長および罹患率をモニターする。瀕死状態の場合または試験終了時には直ちにマウスを屠殺する。次に、腫瘍を切除して、肉眼的および顕微鏡的剖検を行う。次に、腫瘍および細胞浸潤物の形態学的および免疫学的評価のために、パラフィン抱埋切片における細胞病理学および凍結切片における免疫組織化学を行う。
本発明は、本発明の個々の局面の単なる実例であると意図される記述の特異的な態様によって範囲を限定されず、機能的に同等な方法および成分は本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書において示され、記述された改変のほかに、前述の説明および添付の図面から本発明の様々な改変が当業者に明らかとなるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲に入ると意図される。
様々な参考文献が本明細書において引用され、その開示はその全内容物が参照により本明細書に組み入れられる。
Figure 0005764290
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Claims (12)

  1. ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片であって、ATCCアクセッション番号PTA-7610を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される8B5.3.4抗体の軽鎖からの三つの相補性決定領域および重鎖からの三つの相補性決定領域を含む、抗体またはその断片。
  2. ATCCアクセッション番号PTA-7610を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される8B5.3.4抗体である、請求項１記載の抗体またはその断片。
  3. モノクローナル抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体であるか、または8B5.3.4抗体のヒト化型である、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
  4. SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体またはその断片。
  5. 重鎖のFcドメインにおいて少なくとも一つの改変を含む、Fcドメインを有する請求項１ないし４の何れか１項に記載の抗体またはその断片。
  6. 抗体の重鎖のFcドメインが、240、243、247、255、270、292、300、305、316、370、392、396、416、419、または421位で少なくとも一つのアミノ酸置換を含むことにより野生型Fcドメインと異なる、請求項５記載の抗体またはその断片。
  7. 抗体の重鎖のFcドメインが243位でロイシン、292位でプロリン、300位でロイシン、305位でイソロイシン、および396位でロイシンを有する、請求項６記載の抗体またはその断片。
  8. F(ab´)2断片またはF(ab)断片である、請求項１ないし４の何れか１項に記載の抗体断片。
  9. 以下を含む、請求項１記載の抗体またはその断片：
    (A) SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する可変重鎖（VH）ドメイン；または
    (B) SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（VL）ドメイン。
  10. SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、およびSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ネイティブなヒトFcγRIIAに結合する場合より大きな親和性で、ネイティブなヒトFcγRIIBの細胞外ドメインに特異的に結合する、ポリペプチド。
  11. 治療物質となる異種ポリペプチドに機能的に連結しているか、又は検出可能なマーカー、治療物質となる毒素若しくは治療物質に結合している、請求項１ないし９の何れか１項に記載の抗体若しくはその断片、又は請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. （i）請求項１１に記載の抗体若しくはその断片又はポリペプチド；および
    （ii）薬学的に許容される担体
    を含む、薬学的組成物。
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