JP2000516911A - オプソニン強化細胞、および抗原に対する免疫応答を調節する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 患者に投与したとき、オプソニン強化細胞、すなわち、1)組換え核酸からオプソニンを発現するように改変されているか、2）内生的なオプソニンが、より高いレベルで発現されるように改変されているか、または、3）外来性のオプソニンと混合されている細胞が、その細胞に含まれるか、もしくは接着している選択された抗原に対して、受容者の免疫反応を調節する方法と組成物とを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 オプソニン強化細胞、 および抗原に対する免疫応答を調節する方法 発明の分野 本発明は、一般に、免疫系に関し、特に、抗原に対する免疫応答を調節する組 成物と方法に関する。 発明の背景 オプソニンは、抗原と抗原提示細胞（APC）の両方に、同時に結合ないし接着 することによって、抗原の結合、包含、およびインターナリゼーションがAPCに よってより効率的に行われるように、抗原とAPCとの間の結合因子として作用す ることのできる分子である。このことは、APCがT細胞に抗原を提示するため、免 疫応答の発生を促進するものと考えられている。天然のオプソニンは、外来抗原 に対する第一線の防御と、個々の個体発生の過程で多様化することのない抗原認 識レパートリーとを提供する先天性免疫系（先天性オプソニン）に属するものと 、または、例えば、免疫グロブリンなど、個々の個体発生にわたって多様化する 、抗原特異的な分子のレパートリーに基づいた後期防御機構を提供する後天性免 疫系に属するものに分類する ことができる。 オプソニンファミリーには、補体成分C3およびC4の断片、コレクチン、および 免疫グロブリンが含まれる。別のオプソニンには、フィブロネクチン、アルファ -2-マクログロブリン（a2m）、およびC反応性蛋白質（CRP）が含まれる。 抗原提示細胞による、抗原の取り込みを向上させ、改良されたワクチンを得る ための組成物と方法とを提供することが、本発明の目的である。 発明の概要 本発明は、オプソニン強化細胞、すなわち、1)組換え核酸からオプソニンを発 現するように改変され、2)内生的なオプソニンが、より高いレベルで発現される ように改変され、または、3)外来性のオプソニンと混合されている細胞が、患者 に投与されたとき、その細胞に含まれるかもしくは接着している選択された抗原 に対する、受容者での免疫反応を調節できるという発見に、少なくとも、一部は 、基づいている。 したがって、本発明は、選択された抗原を、哺乳動物にワクチン接種する方法 を包含し、この方法は、オプソニン強化細胞を含むワクチン組成物を哺乳動物に 投与することを備え、このオプソニン強化細胞は、選択された抗原と、オプソニ ンをコードする核酸を含み、 オプソニンをコードする核酸を発現させるものである。 また、本発明は、選択された抗原を、哺乳動物にワクチン接種する方法を包含 するが、この方法は、オプソニン強化細胞を含むワクチン組成物を、哺乳動物に 投与することを含むが、このオプソニン強化細胞は、選択された抗原を含み、外 来性のオプソニンと混合されている。 好ましくは、外来性のオプソニンは、人工的なオプソニンである。 また、本発明は選択された抗原を、哺乳動物にワクチン接種する方法を包含す るが、この方法は、選択された抗原がAPCによるインターナリゼーションに十分 な時間、選択された抗原とオプソニンとを含むオプソニン強化細胞にインビトロ でAPCを接触させることと、接触させたAPCを哺乳動物に投与することを含む。 好ましくは、このオプソニン強化細胞は、選択された抗原と、オプソニンをコ ードする核酸とを含む。このオプソニンは、外来性のオプソニン、および/また は人工的なオプソニンであることが好ましい。 好ましくは、本発明の方法と組成物において、オプソニン強化細胞は、実質的 に、インビトロでは分裂できない。「実質的に、インビトロでは分裂できない」 とは、オプソニン強化細胞が、細胞分裂が抑制されるような処理を受けていない 同一の細胞と較べて、約50 ％よりも低い速度で分裂することを意味する。 また、ワクチン組成物は、弱毒化されていて、そのために、細胞が病原性をも つ形態で惹き起こす病気の原因とならないようになっていることが好ましい。 好ましくは、オプソニンは、C3bのアルファ鎖の一つであるか、または、マン ノース結合蛋白質である。 好ましくは、抗原は、悪性の腫瘍細胞などの病原性細胞である。 本発明は、また、選択された抗原、および、オプソニンをコードしている組換 え核酸を含む病原性細胞を包含するが、この細胞は、コードされているオプソニ ンを発現し、このオプソニンは、フィブロネクチン、補体成分C1q、C1qA鎖、C1q B鎖、C1qC鎖、補体断片C3b、C3bi、C3d、C3dg、およびC4b、マンノース結合蛋白 質、コングルチニン、界面活性蛋白質AおよびD、アルファ-2-マクログロブリン 、および免疫グロブリン、および人工的なオプソニンからなるグループより選択 される。 好ましくは、病原性細胞は、悪性の腫瘍細胞である。 病原性細胞は、病原性細菌、病原性真菌、病原性ウイルス、病原性寄生生物の 細胞からなるグループより選択されることが好ましい。本発明が、オプソニン強 化された細菌性の病原体を含む場合には、投与される細胞は、細胞に結合したオ プソニンを含むことが好ま しい。 本発明は、また、オプソニンをコードする組換え核酸、および抗原をコードす る組換え核酸を含み、発現する宿主細胞も包含する。 好ましくは、この宿主細胞は、オプソニン、および抗原に対する担体として作 用することのできる宿主細胞であるため、有核細胞でも原核細胞でもよい。本発 明のこの局面においては、宿主細胞は、病原性を持たなくてもよいが、核酸が、 その中に人工的に導入されている細胞であろう。このような細胞には、滑液細胞 などの分化した間葉細胞を含む線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細 胞、白血球、腫瘍細胞、細菌細胞、真菌細胞、寄生生物細胞が含まれるが、これ らに限定はされない。 本発明は、また、人工的なオプソニンと混合された細胞を含む組成物を包含す る。 好ましくは、この細胞は、病原性細胞である。 本発明は、また、オプソニンと混合された細胞を含む組成物を包含するが、こ の細胞は、実質的に、インビトロでは分裂できない。 好ましくは、この細胞は、病原性細胞である。 好ましくは、この組成物は、実質的に、培養培地を含まない。本明細書で用い られるとき、「培養培地」とは、細胞培養に用いられる、ウシ胎児血清などの動 物血清を、少なくとも2％含む培地をいう。 本発明は、また、先天性オプソニンと混合された異種抗原を含む細胞を含む組 成物を包含するが、この細胞は、実質的に、インビトロでは分裂できない。 好ましくは、この組成物は、実質的に培養培地を含まない。 本発明は、また外来の人工的なオプソニンで、例えば、コレクチンオプソニン のレクチン部位と、抗原を含む細胞の表面にある糖質との間に起こる相互作用の ように、共有結合によるか、または、レセプター−リガンド結合反応によって細 胞に結合することができる人工オプソニンと混合された異種抗原を含む細胞を含 む組成物を包含する。 好ましくは、この細胞は、哺乳動物宿主の中では分裂できない。 本発明は、また、本質的に細胞とオプソニンからなる組成物を包含する。 好ましくは、この組成物は、さらに、生理学的に適合性のある緩衝液を含み、 そして、さらに、細胞によって発現されるサイトカインを含む。 本発明は、また、本質的に細胞とオプソニンからなる組成物を包含するが、こ の細胞は、実質的に、インビトロでは分裂できない。 好ましくは、この組成物は、さらに、生理学的に適 合性のある緩衝液を含む。 本発明の組成物は、また、細胞によって、好ましく発現されるサイトカインを 含む。 本発明は、また、オプソニン強化細胞と、薬学的に許容される担体とを含むワ クチン組成物を包含する。 本発明は、また、第一と第二の末端とを含むキメラ蛋白質をコードする核酸を 包含するが、ここで、このキメラ蛋白質は、オプソニンに由来するAPC結合配列 （部分または領域）を含む第一の末端によって、APCである第一の細胞に結合し 、第二の末端によって、選択された抗原を含む第二の細胞に結合する。 好ましくは、この核酸はGPI修飾シグナル配列である。 また、融合蛋白質は、膜貫通配列を含んでいることが好ましい。 本発明は、また、天然のオプソニンのAPC結合部分と、細胞表面に結合する異 種由来の部分とを含む、人工的なオプソニンを包含する。 好ましくは、この細胞表面に結合する異種由来部分は、GPI部分に含まれてい る脂質である。脂質を含むオプソニンは、脂質部分を細胞膜への脂質部分のイン ターカレーションによって、細胞に接着することができる。 本明細書で用いられるとき、「ワクチン接種する」 という語は、選択された抗原に対する免疫応答を、この応答が、オプソニン強化 細胞でないという以外はあらゆる面で同一である対応する細胞を投与して得られ る応答に較べて、より効率的に、より迅速に、より高度に、および/または、よ り容易に誘導されるように調節することを意味する。 「免疫応答を調節する」という語は、選択された抗原に対する免疫応答の刺激 /活性化を意味するか、または、選択された抗原に対する免疫応答の抑制、除去 、または減衰を意味する。 「病原性」細胞とは、例えば、腫瘍細胞、自己反応性T細胞、病原性細菌、病 原性真菌、または病原性寄生体などの、オプソニンを発現せず、病気の原因とな りうる細胞である。本発明の目的にとって、病原性ウイルスは病原性細胞である 。病原性細胞は、病原性細菌、真菌、寄生体、またはウイルスの弱毒化、不活性 化、または殺菌によって改変することができる。 「外来性オプソニン」または「抗原」とは、細胞から導入されるか、または、 細胞の外側に生成されるオプソニンを意味する。 「内生オプソニン」または「抗原」とは、細胞の中で、自然に発現するか、も しくは存在するオプソニンまたは抗原を意味する。 「異種オプソニン」または「抗原」とは、細胞の中 で、自然には発現もしくは存在しないオプソニンまたは抗原を意味する。 オプソニン強化細胞のオプソニンは、細胞質の、表面の、または分泌される分 子として発現される。しかし、オプソニンは、表面の、または分泌される分子と して発現されるのが好ましい。 オプソニンと抗原とは同じでないことが好ましい。 もう一つの好ましい態様において、オプソニンは、膜貫通セグメントをもつ組 換えオプソニンである。 もう一つの好ましい態様において、オプソニンは、人工的なオプソニンで、脂 質を含む。さらに、別の好ましい態様において、この脂質は、グリコシルホスフ ァチジルイノシトール部分によって、オプソニンと連結する。さらに、好ましい 態様において、例えば、コレクチンなどのオプソニンは、非共有的に細胞に結合 することができる。このような結合を促進するために、例えば、グリコシルトラ ンスフェラーゼまたはグリコシダーゼで処理することによって、細胞を加工する ことができる。 例えば、C3bが、CD46によって不活性化されるように、細胞に含まれている分 子によって、オプソニンを不活性化することができるときには、例えば、抗体な どの不活性化因子の阻害因子も組成物に含まれる。 好ましくは、オプソニン強化細胞は、GM-CSF、IL12、 IL10、IL14、またはケモカインなどのサイトカインと混合されているか、または 、サイトカインをコードする遺伝子で形質転換されている。 本明細書で用いられるとき、「オプソニン」という語は、抗原を含む細胞と抗 原提示細胞（APC）との両方に、同時に結合ないし接着することによって、APCに よる、抗原を含む細胞の、より効率的な結合、包含、およびインターナリゼーシ ョンが行われるようにするために、抗原とAPCとの間の連結ないし結合因子（ア ダプター）として作用することができる、天然および非天然の分子を意味する。 本発明に記載された、有用なオプソニンの定義に含まれるのは、非天然のオプソ ニンでは、天然のオプソニンに結合できるレセプターによって、APCに結合する ものである。 本明細書で用いられるとき、「オプソニン」という語は、処理ステップのいく つかにおける、少なくとも一つの産物が、抗原を含む細胞とAPCとの両方に、同 時に結合ないし接着していることによって、APCによる、他の抗原を含む細胞の 、より効率的な結合、包含、およびインターナリゼーションが行われるようにす るための連結ないし結合因子として作用することができるように処理することが できる分子も意味する。オプソニンは、多鎖オプソニンのどのようなポリペプチ ド鎖であってもよい。 本発明の方法および組成物において有用なオプソニンの例には、以下のものが 含まれる。すなわち、フィブロネクチン、補体成分C1q（これの成分のポリペプ チド鎖A、BおよびCのいずれかを含む）、C3bやC4bなどの補体断片、マンノース 結合蛋白質、コングルチニン、界面活性蛋白質AおよびD、C-反応性蛋白質（CRP ）、アルファ-2-マクログロブリン、および、例えば、免疫グロブリンのFc部位 などの免疫グロブリン。 「先天性オプソニン」とは、先天性免疫系のオプソニンであり、当技術分野に おいては、先天性免疫系の分泌ポリペプチド分子として知られており、また、抗 原とAPCの表面とに同時に結合するものと考えられている。したがって、これら は、「架橋」として作用することができ、また、この特性によって、APCによる 抗原のインターナリゼーションを促進すると考えられている。オプソニンが抗原 に結合する様式はオプソニンによって異なり、共有的であったり、非共有的であ ったりする。一般的に、先天性オプソニンの抗原結合部分は、同じ種の構成メン バー間では比較的変異がなく、個体の発生過程において多様化を行なわないとい う点で、免疫グロブリンの抗原結合部分とは異なっている。 天然のAPC結合部分を含む分子は、APC結合部分が細胞外空間に存在するように 、細胞に安定的に結合ない し接着させることのできる部分を含んでいれば、そのオプソニンが天然の抗原結 合部位を含んでいてもいなくても、オプソニンと見做されるであろう。 「人工のオプソニン」には、本明細書において説明されるとき、細胞膜結合部 分が、オプソニンの天然の抗原結合部位に置換されている分子、または、オプソ ニンの天然の抗原結合部位を修飾したり除去することなしに、細胞膜結合部分が オプソニンに結合している分子が含まれる。 人工オプソニンの「細胞膜結合部分」、すなわち、そこを介して、分子が細胞 に安定的に結合することができる部分には、クロスリンク部分、膜貫通配列、お よび脂質部分が含まれるが、これらに限定はされない。好ましい態様において、 脂質部分は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）部分によって、人 工オプソニンに結合している。本発明の別の好ましい態様において、細胞膜結合 部分は、オプソニンの抗原結合末端で、オプソニン、または、抗原結合部位がト ランケートされたオプソニンに結合している。別の好ましい態様においては、人 工オプソニンは、APCに結合することのできる免疫グロブリンのイディオタイプ 部位を含む。 オプソニンは、貪食作用を開始するレセプターに結合すること、および、非ク ロノタイプ的であって、例 えば、クロノタイプレセプターのように、細胞による変化がないことが好ましい 。非クロノタイプレセプタ一は、先天性免疫に関与する細胞の上に存在し、例え ば、非−イディオタイプレセプターが含まれる。このようなレセプターの例には 、CRI，CR2、CR3、CR4、およびC1qレセプター、C1qレセプターの成分を含むレセ プター、コレクチンレセプター、a2mに対するレセプター、CRPに対するレセプタ ー、および、免疫グロブリンに対するFcレセプターが含まれる。 本明細書で用いられるとき、「抗原」という語は、抗原の受容者の中で、液性 および/または細胞性免疫応答を開始することのできる分子を意味する。抗原は 、例えば、単純な中間代謝物、糖、脂質、およびホルモン、また、複合糖質、リ ン脂質、核酸および蛋白質のような高分子など、どのようなタイプの生物学的分 子でもよい。抗原の一般的な分類には、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗 原、原生動物ならびにその他の寄生生物性抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患に関係 する抗原、アレルギーならびに移植拒絶、およびその他の抗原などが含まれるが 、これらに限定はされない。 本発明のオプソニン強化細胞は、例えば、ヒトにおいて、細胞の中に含まれて いる抗原に対する免疫応答を調節するために用いることができる。この細胞は、 哺乳動物、好ましくはヒトに投与され、抗原提示細胞 によって取り込まれる（すなわち、摂取されるか、貪食される）。または、細胞 を、貪食が可能な条件下で、インビトロで、抗原提示細胞と接触させる。 本明細書で用いられるとき、「抗原提示細胞」または「APC」とは、抗原を摂 取して、T細胞に提示する細胞を意味する。これらの細胞には、貪食白血球、マ クロファージ、および樹状細胞、Bリンパ細胞、および内皮細胞が含まれる。 本発明のワクチン組成物は、例えば、ヒトなどの哺乳動物における免疫応答を 調節するために用いることができる。 本発明の細胞は、また、免疫応答を調節できることが分かっている、サイトカ インや細胞表面分子などの非オプソニン分子と組み合わせて投与することができ る。 本発明は、また、その細胞が、インビボで、一つ以上のオプソニンを発現する ようにされているトランスジェニック動物に関する。 説明 本発明は、細胞がオプソニンを発現させることができる、または、オプソニン をより高いレベルで発現させることができるという発見に、少なくとも、部分的 には基づいている。オプソニンの発現をもたらしてい るか、または、オプソニンと混合されている細胞（本明細書において、「オプソ ニン強化細胞」と呼ばれる）は、被験者に投与されると、受容者における、抗原 、または細胞に含まれるか接着している抗原に対する免疫応答を調節することが できる。 本発明による、有用なオプソニン 上記で定義されているように、「オプソニン」は、抗原と、例えば、貪食白血 球（単球およびマクロファージを含む）、樹状細胞（例えば、皮膚のランゲルハ ンス細胞）、Bリンパ球、および、ヒトにおいては、内皮細胞などの抗原提示細 胞（APC）との両方に結合する、天然および非天然の分子、または、いくつかの 処理ステップにおける少なくとも一つの産物が、抗原と、例えば貪食白血球、樹 状細胞、Bリンパ球、およびヒトにおいては、内皮細胞などの抗原提示細胞（APC ）との両方に結合できるように処理されうる分子を意味する。 作用のメカニズムのいずれとも結合することなく、オプソニン部位は、抗原の 、より効率的な結合、包含、およびインターナリゼーションを行なわせるための 、抗原とAPCとの間の連結ないし結合因子として作用するため、オプソニン強化 細胞は、本発明によって有利な効果を提供すると考えられる。さらに、オプソニ ン 自体は、抗原とともにインターナリゼーションされる。「インターナリゼーショ ン」とは、分子が、細胞の細胞質、または、細胞質の中にある分画の中に運ばれ るように、細胞が、その分子を取り込むことを意味する。 好ましいオプソニンは、齧歯類のものではないオプソニンで、例えば、霊長類 、例えば、ヒトのオプソニンである。本発明によって有用なオプソニンは、本明 細書で説明されているような、先天性免疫に関与する細胞上のレセプターなどの APC（例えば、貪食白血球、例えば、マクロファージ、その他貪食作用系の細胞 ）上のレセプターに結合する。 オプソニンのセットの中には、構造的にも、機能的にも似ていると見做すこと ができるものがある。例えば、あるファミリーは、補体成分C3とC4の断片を含む 。これら2つの成分は、高度に構造的に相同的であり、各々が分子内に、ペプチ ド（それぞれ、C3aまたはC4a）が本来の分子から蛋白分解的に切断されると破壊 されるチオエステル結合をもっている。チオエステルの破壊によって、抗原とエ ステル結合を形成することができる化学的構造を利用することが可能になる。こ のエステル結合が存在するC3部分、すなわち、非C3a部分は、C3bと名付けられて おり、また、C4bは、C4の切断の類似産物である。C3bは、さらに、第Ｉ因子など の蛋白質によって蛋白質分解され、これもエステル結合 によって抗原に結合したままになっているC3biおよびC3dなどの断片が得られる 。 4つの構造的に独特な蛋白質が、C3および/またはC4の生物学的に活性で、膜に 結合した断片に対する、高親和性レセプターとして機能することが知られている 。CR1は、C3のC3b断片と、C4のC4b断片にとって、主要なレセプターである。こ れは、他の細胞型の中でもとりわけ、単球上、および、単球由来のAPC上で発現 されている。CR2は、C3dとして知られる、C3の断片に対する主要レセプターであ り、例えば、単球系譜の細胞上ではなく、例えば、成熟Bリンパ球上で発現され ている。Bリンパ球上でのCR2の主な役割は、それらに連結した抗原と協働して、 B細胞を直接に同時刺激することだと考えられている。 CR3は、主に、好中球と単球によって発現されており、FDC、クッパー細胞、お よびNK細胞上でも発現されている。CR3は、C3biに対して主要な特異性をもつ、C 3断片のレセプターである。CR3は、貪食作用などの作用過程での、接着相互作用 と膜の再編成とに必要とされる細胞骨格形成の重要なオーガナイザーであると提 案されている。 CR4は、ベータ2インテグリンファミリーの一員で、そのアルファ鎖は、CR3お よびLFA-1のアルファ鎖に構造的に類似している。それの主要な生理学的なリガ ン ドはC3d、およびC3dgであると考えられているが、その生物学的活性については 、CR3ほどには、よく分かってはいない。 先天性オプソニンファミリーのこの他の例は、補体成分C1q、マンノース結合 蛋白質、界面活性蛋白質AおよびD、およびコングルチニンを含む、コラーゲンの C型レクチンのグループであるコレクチンである。各分子は、抗原に結合するこ とができるレクチン部位、および、貪食単球細胞上のレセプターで、全部、また は一部が、C1qレセプターに一致するレセプターを含むレセプターに結合するこ とができるコラーゲン部位を含む（Neponucenoら、Immunity 6:119-29;Tennerら 、Immunity 3:485-93;Guanら、J Immunol 152:4005-16;Geertsmaら、 Am J Physi ol 267:L578-84;Miyamuraら、 Biochem J 300:237-42;Malhotraら、J Exp Med 17 2:955-9;Malhotraら、 Biochem J 293:15-19）。最もよく知られているコレクチ ンは、翻訳後に、一部は、ヒドロキシプロリン残基とヒドロキシリジン残基の共 有的クロスリンクによって集合させられて、ある場合にはホモメリックであり、 またある場合にはヘテロメリックである複数のポリペプチド鎖を含む。コレクチ ンは、例えば、Pikaarら、J Infect Dis 172:481-9;Alvarez-Dominguezら、Infe ction & Immunity 61:3664-72;Kuhlmanら、J Exp Med 169:1733-45; およびGreertsmaら、前掲、において、オプソニンであることが明らかにされて いる。 本発明によって有用な、その他の先天性オプソニンには、C-反応性蛋白質（CR P）、アルファ-2マクログロブリン、およびフィブロネクチンがある。CRPは、ペ ントラキシン（pentraxin）分子ファミリーの一員で、単球系譜の細胞上のレセ プターに結合するため、オプソニンであることが分かった（TeboとMortenson，1 J Immunol 144:231-8;Holzerら、J Immunol 133:1424-30）。C3およびC4のよう に、アルファ-2マクログロブリンは、この分子が蛋白質分解を受けると破壊され る内部チオエステル結合を含んでいる。このような破壊によって、この分子が抗 原に結合できるようになり、アルファ-2マクログロブリンのAPCへの結合は、抱 合体の吸収を促進する。フィブロネクチンは、アルファ5ベータ1インテグリンに 結合し、また、さまざまな抗原に結合することができ、それがオプソニンとして 機能できるようにしている（Cosio,J Lab Clin Med 103:613-9;Czop and Austen J Immunol 129:2678-81）。 免疫グロブリン（抗体）は、可変部領域によって、抗原に結合し、定常部領域 によって、APCに結合することによって、オプソニンとして機能することができ る。典型的には、免疫グロブリンは、互いに共有結合 していて、それぞれが、1本の軽鎖に結合している2本の重鎖を含む。これらのヘ テロ四量体は、さらに、IgMの五量体のような、より高次の構造に組み立てられ ることができる。重鎖および軽鎖の両方の可変部領域が、抗原結合部位の構造に 寄与するが、一方、APC結合部位は、重鎖の定常部領域に位置している。免疫グ ロブリンに対するAPCレセプターには、IgA、IgG、IgE、およびIgMのそれぞれに 対する、Fcα、Fcγ、Fcε、およびFcμが含まれる。 多細胞の真核生物によって自然に発現されるオプソニンは分泌される。この特 徴によって、オプソニンは、接着分子とは区別される。天然のAPC結合部分を含 む非天然の分子は、APC結合部分が細胞外空間に位置するように、細胞に安定的 に結合ないし接着させることのできる部分を含んでいれば、その分子が天然の抗 原の抗原結合部分を含んでいてもいなくても、オプソニンと見做されるであろう 。細胞に安定的に結合させることのできる部分には、クロスリンク部分、膜貫通 配列、および脂質部分が含まれる。これらの配列、または部分を含む蛋白質の調 製は、当業者によってよく知られている。 「オプソニンのAPC結合部分」とは、キメラ分子に含まれたとき、そのキメラ 分子が生理学的条件下でAPC上に発現されているレセプターに、少なくとも、ナ ノモル程度の親和性をもって結合できるようにさせるオプソニンの配列、または 部位である。 APC結合部分を含む、オプソニンの断片の例は多数ある。このような断片は、A PC結合機能を保持する限り、どのような長さでもよく、例えば、約40アミノ酸、 100アミノ酸、150アミノ酸、500アミノ酸、800アミノ酸、または3000アミノ酸の 長さであってもよい。例えば、Las Holtetらは、1994，FEBS Lett 344:242で、高 い親和性をもって、a2mレセプターに結合する、ヒトa2mのカルボキシ末端側断片 （val 1299-ala 1451）を説明している。ヒトa2mのアミノ酸1314-1451を含む断 片とラットのa2mの相当部位とは、本来のa2mの1-2％aの親和性ではあるが、a2m レセプターに結合する（Van Leuvenら、1986，J Blol Chem 261:11369;Enghild ら、1989，Biochemistry 28:1406;Salbesenら、1992，FEBS Lett 313:198;Sottr up-Jensenら、1986，FEBS Lett 205:20）。 BechererとLambris，1988，J Biol Chem 263:14586は、CR1に結合するC3bの断 片、例えば、C3c、エステラーゼ処理によって生成されC3bアルファ鎖のN末端を 含むC3の断片、および、C3bアルファ鎖のN末端の42アミノ酸を含む合成ペプチド について説明している。C3における、CR3に対する結合配列についても説明され ている（Wrightら、1987，PNAS 84:4235）。 ペプシン分解によって得られたN-末端断片である、Ciqの「コラーゲン軸（col lagene stalk）」は、C1qレセプターに結合する（Reid，1981，Methods Enzymol 80:16;Malhortaら、1993，Blochem J 293:15）。 また、Malhortaら、同上、は、コングルチニンのAPC結合部分が、それのN末端の 55アミノ酸に含まれていることの証拠を提供している。Ezekowitz（米国特許第5 ,270,199号）は、'199特許の図2の塩基配列370-438からなる、ヒトのマンノース 結合蛋白質の推定APC結合部位を提供している。さらに、コングルチニンとの相 同性によって、’199特許で開示されているエクソン1は、APC1部分を含むかもし れない。 IgGのAPC結合部分は、CanfieldとMorrison，1991,J Exp Med 173:1483-91;Lun dら、1991，J Immunol147:2657-62;およびSarmayら、1992，Mol Immunol，29:633 -9で説明されているように、234−237残基を含む、CH2部位、および、ヒンジ領 域下部を含む。 本発明の組成物および方法で用いることのできるオプソニンの例には、フィブ ロネクチン（例えば、GenBank登録番号X02761、K00799、K02273、X82402、X0030 7、X00739）、CRP（例えば、GenBank登録番号X17496、M11880、M11881、M11882 ）、C1qなどの補体成分（例えば、GenBank登録番号X66295、M22531、X03084、X5 8861、およびSwiss-Prot登録番号P02747、P02745）、C 3bやC4bなどの補体断片（例えば、GenBank登録番号KO2782、K02765）、マンノー ス結合蛋白質（例えば、GenBank登録番号S42292、S42294、X15422）、コングル チニン（例えば、GenBank登録番号X71774）、アルファ-2-マクログロブリン（例 えば、GenBank登録番号M93246、M11313）、および、界面活性蛋白質A(例えば、G enBank登録番号M68519、S48768)ならびにD(例えば、GenBank登録番号L40156、X6 5018、S38981)、免疫グロブリン、および、生物種間における、それらの相同体 が含まれる。 表１ 本発明によって有用なオプソニン、APC結合部分/APCレセプターの組合せの例。 本発明によるオプソニン性の判定 ある天然のオプソニンが、以下のアッセイ法の一つ以上にしたがって、オプソ ニン性をもつと判定され、また、それが分泌性の分子であれば、その天然のオプ ソニンは、本発明にしたがって有用であると見做される。 アッセイ法１ O'RearとRossが、免疫学の最新プロトコール（Current Protocols in Immunol ogy，1994，John Wiley & Sons，pp．13.4.5-9）で説明しているように、オプソ ニン性のアッセイ法の一つにおいて、生理学的な条件下で起きる結合によって、 候補オプソニン分子に結合したSRBCが得られる。候補オプソニンが天然のもので ある生物から採ったAPCを、1％（w/v）BSAのコーン（Cohn）画分入りの氷冷HBSS 中に4×10⁶／ｍｌになるよう懸濁する。候補オプソニンが、Ｃ３の断片のときに は、ＡＰＣは直前に採血した、培養していないの末梢血単球である。候補オプソ ニンに結合したSRBC、または対照用SRBC（前者と同じであるが、候補オプソニン に結合していないもの）を、同じ溶液に、2×10⁸／mlで懸濁する。100μｌのSRB C懸濁液と、100μｌのAPC懸濁液を、10×75mmのプラスチック製試験管の中で混 合する。この試験管を、40rpm、37℃で、2〜20分間 回転させる。この懸濁液の小滴をスライドに載せ、カバーガラスを掛けて、5〜1 0分間放置する。カバーガラスの圧力で、余分な溶液を取り除くことができて、 そして、例えば、透明のマニュキア液などで、カバーグラスをスライドにシール することができる。顕微鏡でこのスライドを調べ、４個以上のSRBCに接着してい るように見えるAPCの割合を決定する。もし、この割合が50％以上で、4×10⁴ま での候補オプソニン分子/SRBCがあるときには、この候補オプソニンは、オプソ ニンでありうる。 アッセイ法２（プロテアーゼによって活性化される候補オプソニン） 候補オプソニンまたは放射性標識された候補オプソニンを、1.5〜3倍モル過剰 のプロテアーゼ（0.05Mのトリエタノールアミン-0.1M NaCl，pH8，室温で一晩） で処理する。このアッセイ法においては、プロテアーゼを抗原として使うことが できるし、別の抗原を過剰量加えることもできる。結合実験の前に、候補オプソ ニンと抗原の複合体を、HBSSに対して透析する（4℃）。 候補オプソニン-抗原複合体の単球への結合は、1.0Mまでの濃度の標識リガン ドを、（1.5-4.0）×10⁶単球とともに、200μｌ容量で氷上でインキュベートし て測定される。放射性標識されたリガンドの非特異的な結 合を、100倍モル過剰の標識した候補オプソニン-抗原複合体存在下で測定する。 結合していないリガンドを、細胞と細胞に結合したリガンドとから、ガラス繊維 フィルター上で急速に真空濾過して分離する。実験は、エンドサイトーシスによ って混乱が起こる可能性を避けるために、氷上で行なう。解析と、非線形曲線適 合（non-linear curve fit）によって、細胞当りの結合定数と部位数を決定する 。候補オプソニン-抗原複合体の単球の結合部位に対する親和性が、少なくとも 、ナノモルの範囲にあれば、この候補オプソニンにはオプソニンである。 アッセイ法３ 第I部 候補オプソニンが、P.カリニ（P．carinii）の表面に結合するか否かを直接評 価するために、免疫電子顕微鏡法を行なう。表面に結合した候補オプソニンを保 護するために、１mMカルシウム入りのTBSを用いて、瀕死の感染ラットの気管支 肺胞洗浄液（BAL）から、P.カリニを分離する。分離された生物を、過ヨウ素酸 −リジン−パラホルムアルデヒド緩衝液中で固定化し、ローアクリル（Lowacryl ）マウンティング媒材（カリフォルニア州レディングのテッド・ペラ社（Ted Pe lla，Inc.，Redding CA））に包埋する。超薄片が得ら れたら、通常のヤギ血清（2％）で１時間ブロックしてから、ウサギの抗候補オ プソニンまたは非免疫ウサギIgG（25μｇ/ml）のどちらかと一晩インキュベート する。洗浄した後、この切片を、さらに、15nMの金コロイドを結合したヤギおよ びウサギのIgGとインキュベートする（イリノイ州アーリントンハイツのアマー シャム社（Amersham Corp.，Arlington Heights，IL））。切片を再び洗浄して 、透過式電子顕微鏡（モデル6400:マサチューセッツ州ピーボディのJEOL USA社 （JEOL USA，Inc.，Peabody，MA）上で調べる。 第II部 SP-Dに対する抗体の存在下もしくは不在下で、または、精製したSP-Dを加えて 、培養した肺胞マクロファージへのP.カリニの接着を、以下のようにして定量す る。肺胞マクロファージへのP.カリニの接着を、⁵¹Cr標識した生物によって測定 する。表面に結合した候補オプソニンが失われるのを防ぐため、１mMカルシウム 入りのTBSを用いて、感染ラットからP.カリニを分離する。この生物を、20％FCS と200μCiの⁵¹Cr-クロム酸ナトリウム（ニューイングランドニュクリア社（New England Nuclear)）を含む、2mlのDMEの中で、37℃で８時間インキュベートして 放射性標識する。健康なラットから正常な肺胞マクロファージを洗い出して、マ クロファージを確実に付着するために、予め、正常 なラットIgGでコート（100μｇ/ml×60分）されている組織培養皿（1×10⁵細胞 数/ウエル）の中にプレートする。1時間後、マクロファージを、HBSSで穏やかに 洗浄し、非付着細胞を除去する。この洗浄の後、>95％のマクロファージが付着 している。表面に結合した候補オプソニンを含む⁵¹Cr-P.カリニ（1×10⁶）を、 マクロファージに加え、37℃で、さらに1時間インキュベートする。続いて、非 付着のP.カリニを洗浄によって除去する。付着したP.カリニを含むマクロファー ジの単層を、1N NaOHで可溶化して、定量する。P.カリニの付着は、付着率＝(A/ A+B)×100で定義されるが、ここで、A＝単層に結合している⁵¹Cr-P.カリニ、お よびB＝付着していない⁵¹Cr-P.カリニである。培養液中で、肺胞マクロファージ 肺細胞へのP.カリニの付着に対する、候補オプソニンの効果を評価するために、 候補オプソニンに対して作製したウサギのポリクローナル抗体（100μｇ/ml）を 存在させるか、または存在させないで、P.カリニの付着アッセイを行なう。 候補オプソニンのP.カリニへの結合が、第１部で明らかであるか、また、第II 部で、付着％が、抗-候補オプソニンの存在下で、統計的な有意性P<0.05をもっ て減少すれば、この候補オプソニンは、オプソニンである。 アッセイ法４ 細菌と付着単球との結合を、以下のようにして測定する。修正PBS中、および 用いられた全ての緩衝液中の内毒素レベルを、リムルス法（Limulus assay）に よって測定して、50pg/mlより低くする。37℃に2時間かけて、修正PBS中の、5× 10³の単球が、テラサキ（Terasaki）プレートのウエルに付着するようにさせる 。PBSで３回洗浄して、非付着細胞を除去してから、10〜50マイクログラム/mlの 候補オプソニンが入っているか、入っていない0.5mlの緩衝液に、5×10⁴のFITC- 標識した細菌を加える。細菌対単球の比は、10:1から50:1が用いられる。遮光下 、37℃で30分間インキュベートした後、温かいPBSで５回洗浄して、付着してい ない細菌を除去する。アッセイは、４回反復して行われ、各ウエル毎に、≧100 単球と結合している細菌の数を、×400の倍率を用いて、蛍光顕微鏡下で数える 。結果は、100個の単球に結合した細菌の数で表す。候補オプソニン入りのとき の数が、候補オプソニン入りでないときの数の、少なくとも2倍であるとき、候 補オプソニンはオプソニンである。 アッセイ法５ 第I部 1ml当り、約1×10⁷から6×10⁷個の細菌を、10mcg /mlの¹²⁵I-候補オプソニンとともに、全量0.7mlのPBSアリコート中でインキュベ ートし（0℃で、20分間）、反応混合液の100μｌを、150μｌのオイルクッショ ン（60％ジブチルフタル酸、40％ジオクチルフタル酸［ニューヨーク州ロチェス ターのイーストマンコダック社（Eastman Kodak Co.，Rochester，N.Y.］）の上 に重ね、この混合液を遠心分離する（10,000×g、60秒間、４℃）。チューブの 先端の細胞沈殿物を含む部分を、モーツアルト剃刀の刃で切り、放射活性を計測 する。 第II部 96ウエルの組織培養プレート（マサチューセッツ州ケンブリッジのコスター社 （Costar，Cambrldge，Mass.）に、1ml当り、2×10⁵細胞で、使用する前の晩に 、APCをプレートする。各ウエル当り２×10⁶細菌を、100mcg/mlの候補オプソニ ンを入れた、または、入れていない培養プレートに加える。次に、このプレート を、1,000×gで7分間遠心分離する。37℃で15分間、細菌を取り込ませた後、冷 やしたPBSで数回洗浄して、取り込まれなかった細菌を除去する。次に、45分間 で細胞外の細菌を殺す量の抗生物質を加えたRPMI 1640中で、それらをインキュ ベートする（37℃で45分間）。このインキュベート時問が終了した時を時間0と 考える。ハンクス（Hank's）の平衡化生理食塩溶液で、単 層を3回洗浄し、同量のRPMI 1640（R0）を加える。凍結融解を何度か繰り返して 細胞を破砕する。各ウエル毎に、24時間培養した後、血液寒天培地（コロンビア 血液寒天（Columbia blood agar）：カリフォルニア州サンノゼにあるベクトン ・ディキンソン社（Becton Dickinson，San Jose，Calif.）上で、生き残った細 菌の数（CFU）を定量的プレート計数により決定する。それぞれの結果を、3回の 決定値の平均として出す。 第I部で、候補オプソニンで処理した細菌の沈殿物が>75KCPMで、この取り込み が、非標識の候補オプソニンによって阻害することができ、また、第II部で、候 補オプソニンを入れたCFUが、入れてないCFUよりも大きかったら（P<0.05）、候 補オプソニンは、オプソニンであるかもしれない。 アッセイ法６ 10⁷の細菌を含む、200μｌのGHBSS（ハンクスの平衡化塩類溶液）＋10mmolのC aCl₂を含む0.1％のゼラチンを調製する。そして、この細菌を、20-100μｇ/mlの 候補オプソニンとともに、4℃でインキュベートする。競合阻害因子の存在下、 または不存在下で、結合アッセイを行なう。30分間インキュベートした後、GHBS S+10mmol CaCl₂中で、1,300ｇで3分間微量遠心することにより、室温で５回洗浄 する。その後、1:1,000の ウサギ抗-候補オプソニン抗血清を、細菌とともに、1時間、PBS+5％FCSと10mmol CaCl₂の中でインキュベートする。それからGHBSS+10mmol CaCl₂と0.05％トゥー ン（Tween）20の中で３回洗浄する。抗血清の細菌への結合を、ローダミンを結 合したヤギ抗-ウサギIgGの1:1,000希釈液によって検出する（ニューヨーク州オ レンジバーグにあるフィッシャー製薬会社（Fisher Pharmaceuticals，Orangebu rg，NY）。インキュベートした後、GHBSS+10mmol CaCl₂と0.05％トゥーン（Twee n）20で5回洗浄し、スライドガラスに塗抹し、風乾させる。その後、100％の氷 冷メタノールで5分間固定する。陰性対照には、候補オプソニンなしと、第一段 階の抗体なしというものが含まれる。アッセイを3回反復して、蛍光顕微鏡で広 範囲に調べる。 第II部 放射性標識細菌の細胞との結合 10⁷個の放射性標識した細菌を、200μｌのGHBSS+10mmol CaCl₂で再懸濁して、 ２μｇ/mlから40μｇ/mlの範囲の候補オプソニンとともに、または候補オプソニ ンを入れずに、30分間インキュベートする。そして、この細菌を、室温で、３回 、GHBSS+10mmol CaCl₂で、1,300gで微量遠心して3分間洗浄し、、50μｌのGHBSS に再懸濁して、10⁶オーダーのAPCを含む１−mlの懸濁液（GHBSS）に加える。こ の細菌とAPCを、37℃で20分間、 ゆっくり振とうした後、微量遠心機中、82gで、示差（differential）遠心分離 を用いて、5回洗浄して、付着していない細菌を除去する。最後の洗浄の前に、 各サンプルからアリコートを採って、ラブテク（Labtek）スライド上でプレート し、細胞を10分間付着させ、メタノールで固定して、ギムザで染色し、光学顕微 鏡でスコアをとる。ラブテク（Labtek）スライド上にプレートした細胞のスコア をとるためには、少なくとも400個の細胞を数える。食食指数は、100PMN当りの 接着、または摂取された粒子の数を表している。次に、上記のものを含む細胞沈 殿物と、放射性標識された細胞とを、100μｌのPBS+0.5％トリトンX-100に溶解 して、シンチレーション・カウンターで放射活性を測定する。第I部で、候補オ プソニンの、細菌への特異的な結合が明らかであり、また、第II部で、細菌の特 異的な取り込みが、cpmで、候補オプソニン入りのときに、候補オプソニンなし のときよりも3倍以上大きければ、候補オプソニンは、オプソニンであるかもし れない。 アッセイ法７ 第I部 L.ドノバニ・プロマスティゴーテス（L．donovani promastigotes）への結合 を調べるために、5×10⁵個の寄生体/mlで培養を始める。9日目までの定期的な時 点で、寄生体画分の数を数え、洗浄して、1％BSA、0.5mM Ca²⁺，0.05％NaN₃，ト リス緩衝生理食塩溶液（TBS）（10mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0）（希釈剤 ）に、2×10⁵/mlになるよう再懸濁する。そして、EDTAを抜いた希釈剤中に、70 μｌの５μｇ/ml放射標識化Ｃ反応性蛋白質（CRP）（0.12μCi/μｇ）が含まれ 、150μｌのジノニルフタル酸/ジブチルフタル酸（40:60v/v）オイル混合液の層 の上層になって入っている試験管にこの懸濁液50μｌを加える。寄生体を、1時 間インキュベートしてから、遠心分離で油層を介して分離し、細胞沈殿物を取り 出し、ガンマ計測によって、結合したCRPを検出する。各アッセイを3回反復する 。プロマスティゴーテスへのCRP結合の濃度依存性も、0.045μCi/μｇの活性と 、60μｇ/mｌから0.015μｇ/mlまでの2倍連続希釈を用いて、上述のようにして 測定する。 第II部 APCをプレートから取り出して、24穴組織培養皿に入れたカバーグラス上に、1 ×10⁶細胞/ウエルになるようにプレートする。加湿インキュベーター中、37℃で 、10％PCS、１mMグルタミン、200U/mlペニシリン、および、200μｇ/mlのストレ プトマイシンを添加したRPMI 1640（ライフ・テクノロジー社（Life Technologi es））中で、細胞をインキュベートする。24時間後、非付着細胞を除去して、残 った細胞を6日後に使用す る。プロマスティゴーテスを、RPMI 1640中30μｇ/mlのCRPとともに、またはCRP なしで、1時間インキュベートしてから、10⁶/ウエルのAPC培養液を加える前に3 回洗浄する。プロマスティゴーテスを、１時間APCに感染させてから、細胞を洗 浄し、メタノールで固定して、計測する前にギムザで染色する（英国ドーセット 州プールにあるBDH社）。感染したAPCの割合と、寄生体の数/100個のマクロファ ージを、4回反復培養したものから決定する。 第I部で、候補オプソニンの寄生体に対する親和性が、少なくともナノモルの 範囲にあり、また、第II部で、取り込まれた寄生体数/100個のAPCが、候補オプ ソニン入りのときに、候補オプソニンなしのときよりも、少なくとも2倍である ときには、候補オプソニンはオプソニンでありうる。 アッセイ法８ 第I部 5％ウシ胎児血清と、候補オプソニンとを含む、［³⁵S］メチオニン標識した 培地の一部（0.5ml）を、0.1mlまたは0.2mlの10％微生物懸濁液とともに、室温 で30分間インキュベートする。調べられる微生物には、例えば、ネズミチフス菌 （Salmonella typhimurium）、枯草菌（Bacillus subtilis）、黄色ブドウ球 菌（Staphyrococcus aureus）、大腸菌（Escherichiacoli）、およびパン酵母（ Saccharomyces cerevisiae）が含まれよう。結合した蛋白質を、2％SDSと0.1Mジ チオスレイトールを含む緩衝液中で煮沸して分離し、5％SDSゲル上で解析する。 第II部 固定した細菌（0.1ml；容量にして10％；１ミリリットル当り10¹⁰）を、［³H ］チミジンで標識して、候補オプソニンを欠乏しているか、欠乏していない0.1m lの血清とともにインキュベートする。PBSで洗浄した後、細菌を、1×10⁷のオー ダーのAPCとともに、二価の陽イオンを含むPBS中に、最終濃度0.9mlでインキュ ベートする。さらにエンドサイトーシスが起こるのを防ぐために、N-エチルマレ イミド（2mM）を含む氷冷PBSに、間隔をおいて、0.2mlづつ移して、細胞を洗浄 する（10秒間で約100g）。 第I部において、候補オプソニンに一致するバンドが見え、また、第II部で、6 -10分間インキュベートした後のCPMが、血清を抜いていないサンプルの方が、血 清を抜いたサンプルよりも、少なくとも3倍高いときには、候補オプソニンはオ プソニンでありうる。 アッセイ法3、5、6、7、8の第I部の結果よりも、そのアッセイ法の抗原に、ナ ノモルの範囲内の親和性をもって結合できるのであれば、アッセイ法の第II部を 満足させる候補オプソニンの方がオプソニンでありうる。 アッセイ法９ 少なくとも1.2×10⁴分子/細胞のC3断片でコートされたSRBCを、O'RearとRoss が、免疫学の最新プロトコール（Current Protocols in Immunology，1994，Jo hnWiley & Sons，pp．13.4.5-9）で説明しているところに従って調製する。10％ ウシ胎児血清を含むRPMI中、2×10⁵細胞/mlの単球250μｌを、ガラス製の8穴の 組織培養皿の各ウエルに加え、37℃、5％CO₂で3時間インキュベートする。単球 を、HBSSで2回洗浄し、1.5×10⁸/mlのDVBS²⁺で、50μｌのSRBCを各ウエルに加え る。このプレートを、50gで5分間遠心分離してから、37℃、5％CO₂で3時間イン キュベートする。ウェルを、HBSSで2回洗浄し、0.5％グルタルアルデヒドで固定 して、ギムザ染色液で染色する。光学顕微鏡で判定して、少なくとも一つのSRBC によって、>40％の単球がロゼット形成していたら、その候補は、オプソニンで ありうる。 脂質を含む人工オプソニン 例えば、長鎖脂肪酸などの脂質が、例えば、ポリペプチドなどの分子に付着す ると、この複合体は、細胞 と混合されると、原形質膜と安定的に結合するようになる（Nagarajanら、1995 ，J Immnol Methods 184：241-51；McHughら、1995，PNAS 92：8059-63；van de rBergら、1995，ＪCell Biol，131:669-77）。これは、脂質が、膜にインターカ レートすることによって起こると考えられている。脂質結合ポリペプチドを産生 する便利な方法は、GPI部分の翻訳後付加を指令するシグナル配列を一部でコー ドしている塩基配列を、適当な宿主細胞の中で発現させることを含んでいる。組 換えDNA技術を用いて、異種性のGPIシグナル配列に結合した蛋白質をコードする 核酸を構築することによって、本来はGPIに結合していない蛋白質を、GPIに結合 している蛋白質として発現させることができる。この目的にとって有用なGPIシ グナル配列をコードする塩基配列には、例えば、崩壊促進因子（decay accelera ting factor）（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 12 92:223-32の表1のアミノ酸配列「22」をコードする配列；Carasら、米国特許第5 ,109,113号で開示されているシグナル配列をコードする配列）；ブレビカン（br evican）（例えば、Genbank登録番号X86406の1982-2047番目の塩基）、メソテリ ン（mesothelin)（例えば、Genbank登録番号U40434の1858-1983番目の塩基）、 コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）抗原2（例えば、NCBI En trez蛋白質データベース登録番号1256444の172-294番目のアミノ酸をコードして いる配列、Zhuら、1996，Gene 181:121-5）、アセチルコリンエステラーゼ（Duv alら、1992，EMBO J 11:3255-61で説明されている「HC」ペプチドををコードし ている配列；（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 129 2:223-32の表1のアミノ酸配列「19」をコードする配列））、ヒト葉酸レセプタ ーアルファ、およびベータ（例えば、NCBI Entrez蛋白質データベース登録番号1 82416の230-257番目のアミノ酸、または、NCBI Entrez蛋白質データベース登録 番号1655592の228-255番目のアミノ酸をコードしている配列、YanとRatnam、199 5，Biochemstry 34:14594-600）、5'ヌクレオチダーゼ（例えば、NCBI Entrez蛋 白質データベース登録番号404502の547-570番目、または547-574番目のアミノ酸 をコードしている配列、Furukawaら、1994,Biochem Biophys Acta 1190:273-8； （例えば、BuchtとHJalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表 1のアミノ酸配列「５」または「６」をコードする配列）、CD59（例えば、Genba nk登録番号U48255の393-473番目によってコードされる；BuchtとHjalmarsson，1 996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「20」をコードす る配列；Powellら、1997，J Immunol 158:1692-1702の図2の74-101番目のアミノ 酸を コードしている配列）、T-カドヘリン（例えば、KollerとRansht、1996，Ｊ Bio l Chem 271:30061-7によって説明されている、ニワトリのTカドヘリンのC末端の 76アミノ酸をコードしている配列）、アミノペプチダーゼP（例えば、NCBI Entr ez蛋白質データベース登録番号1517942の649-673番目のアミノ酸をコードしてい る配列、Hydeら、1996，Biochem J 319:197-201）、カルボキシペプチダーゼM、 CD16B、Thy 1、カルボニックアンヒドラーゼIV（例えば、NCBI Entrez蛋白質デ ータベース登録番号179791の284-312番目のアミノ酸をコードしている配列、Oku yamaら、1995，Arch Biochem Biophys 320:315-22）、胎盤アルカリホスファタ ーゼ（例えば、NCBI Entrez蛋白質データベース登録番号178464の498-529番目の アミノ酸をコードしている配列、Odaら、1994，Biochem J 301:577-83）、ニュ ーロン糖蛋白質F3、癌胎児性抗原（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Bioche m Biophys Acta 1292:223-32の表１のアミノ酸配列「28」をコードする配列）、 MRC-OX45（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:22 3-32の表１のアミノ酸配列「2」をコードする配列）、RT 6.2（例えば、Buchtと Hjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「 3」をコードする配列）、D．ディスコイデウム（discoideum）のプレスポア特異 的 抗原（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32 の表1のアミノ酸配列「4」をコードする配列）、ミクロソーマルジペプチダーゼ （例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表 1のアミノ酸配列「8」をコードする配列）、CAMPATH-1（例えば、BuchtとHjalma rsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「9」を コードする配列）、T.ブルース（T．brucei）PARP（例えば、BuchtとHjalmarsso n，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表１のアミノ酸配列「10」をコ ードする配列）、T.ブルース（T．brucei）VSG Mit 118a（例えば、BuchtとHjal marsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「11」 をコードする配列）、T.ブルース（T．brucei）VSG Mit 117a（例えば、Buchtと Hjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「 12」をコードする配列）、T.ブルース（T．brucei）VSG MITat 1.1000BC（例え ば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のア ミノ酸配列「13」をコードする配列）、T.ブルース（T．brucei）VSG MITat 1.5 b（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の 表1のアミノ酸配列「14」をコードする配列）、T.ブルース(T．brucei）VSG ILT at 1.1（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223- 32の表1のアミノ酸配列「15」をコードする配列）、T.ブルース（T．brucei）VS G TxTat 1（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996,Biochem Biophys Acta 1292:22 3-32の表1のアミノ酸配列「16」をコードする配列）、T.ブルース（T．brucei） VSG Mit 221（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292 :223-32の表1のアミノ酸配列「17」をコードする配列）、プリオン蛋白質（例え ば、BuchtとHjalmarsson，1996，BiochemBiophys Acta 1292:223-32の表1のアミ ノ酸配列「18」をコードする配列）、ウロキナーゼレセプター（例えば、Bucht とHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列 「21」をコードする配列）、T．コンゴレンス（T．congolense）VSG YNat 1.1（ 例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1 のアミノ酸配列「23」をコードする配列）、S．セレビシアエ（S．cerevisiae） GAS-1（例えば、BuchtとHjalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-3 2の表1のアミノ酸配列「24」をコードする配列）、Thy-1（例えば、BuchtとHjal marsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「25」 または「26」をコードする配列）、L.メジャー（major）PSP（例えば、BuchtとH jalmarsson，1996，Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「2 9」をコードする配列）、D．ディスコイデウム（discoideum）接触部位A糖蛋白 質（例えば、Barthら，1996，Biochem J 317:533-40で説明されているC末端25ア ミノ酸配列をコードしている配列）、CD24、および合成配列（例えば、Coyneら ， 1993，J Biol Chem 268:6689-93で説明されている）によって含まれるシグ ナル配列が含まれる。本発明によるGPI結合オプソニンの結合の判定 本発明の一つの態様において、オプソニンは、脂質をもち、それにより、脂質 基が細胞の原形質膜の中にインターカレートすることによって、オプソニンが細 胞に結合できるようにするGPI、またはGPIの一部を含むように作られている。ほ ぼ従来からのGPIからなる、これらのGPI部分について、当業者は、このような部 分が、オプソニンを細胞膜に結合させるか否かを容易に判定することができる。 以下のアッセイ法は、GPI結合オプソニンが、細胞に結合することができるか否 かを判定するのに有用である。 取り込みを定量するために、まず、GPI結合オプソニンを、¹²⁵Iで標識する。 セファデックスG-25（Sephadex G-25）カラムに、1mlのPBS中の、0.1mgの適当な 蛋白質を入れて、さらに、20-30mlのPBSを入れる。 2mCiのNa[¹²⁵I]と、PBS中0μＭのラクトペルオキシダーゼ20μｌとを、2mlの、P BS中1mg/mlの適当な蛋白質に加える。0.025Mリン酸緩衝液、pH7.4中、0.03％過 酸化水素４μｌを撹拌しながら、蛋白質溶液に加える。過酸化水素の添加を、1 分間隔で、さらに3回繰り返す。PBS中15nMのNaIを、1ml加える。この溶液を、セ ファデックスカラムに入れて、20mlのPBSで溶出する。ガイガーカウンターで、 溶出液をモニターし、標識蛋白質を含む、放射活性の最初のピークを集める。ガ ンマ計測によって、比活性を決定する（100％回収されると仮定する）。蛋白質 溶液を、40μｇ/mlになるように希釈して、上述の原形質膜への取り込み実験に 用いる。洗浄した後、1μｌの細胞アリコートのガンマ計測を行なう。結合が、G PI部分によるか否かを判定するために、細胞を、B.チューリンゲニエンシス（B ．thuringiensis）のホスファチジルイノシトール特異的なホスフォリパーゼC（ シグマ社（Sigma））とともに、37℃で、3時間インキュベートし、遠心分離して 、計測する前に洗浄する。これによって、GPI結合蛋白質が、細胞表面から分離 する。 本発明により有用な抗原 1．ウイルス抗原 ウイルス抗原の例には、gag、pol、およびenv遺伝 子の遺伝子産物、Nef蛋白質、逆転写酵素、および、その他のHIV構成成分などの 、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原に由来するレトロウイルス抗原などのレト ロウイルス抗原；B型肝炎ウイルスのS、M、およびL蛋白質、B型肝炎ウイルスの プレS抗原、および、その他の肝炎（例えば、A、BおよびC型肝炎）の、C型肝炎 ウイルスRNAのようなウイルス構成成分などの肝炎ウイルス抗原；ヘマグルチニ ン、ノイラミニダーゼ、および、その他のインフルエンザウィルス構成成分など のインフルエンザウィルス抗原；麻疹ウイルスの融合蛋白質やその他の麻疹ウイ ルス構成成分などの麻疹ウイル抗原；E1およびE2蛋白質、および、その他の風疹 ウイルス構成成分などの風疹ウイルス抗原；VP7sc、および、その他のロタウイ ルス構成成分などのロタウイルス抗原；エンベロープ糖蛋白質B、および、その 他のサイトメガロウイルス抗原構成成分などのサイトメガロウイルス抗原；呼吸 器多核質（respiratory syncytical）ウイルス融合蛋白質、ＲＳＶ融合蛋白質、 M2蛋白質、および、その他の呼吸器多核質ウイルス構成成分などの呼吸器多核質 ウイルス抗原；極早期蛋白質、糖蛋白質D、および、その他の単純ヘルペスウイ ルス抗原構成成分などの単純ヘルペスウイルス抗原；gpI、gpII、および、その 他の水痘帯状庖疹ウイルス抗原構成成分などの水痘帯状庖疹ウイルス抗原；E、M -E、M-E-NS 1、NS 1、NS 1-NS2A、80％E蛋白質、および、その他の日本脳炎 ウイルス抗原構成成分などの日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖蛋白質、狂犬病核 蛋白質、および、その他の狂犬病ウイルス抗原構成成分などの狂犬病ウイルス抗 原が含まれるが、これらに限定はされない。ウイルス抗原のさらに別の例に関し ては、基礎ウイルス学（Fundamental Virology）第二版、Fields，B.N.およびKn ipe，D.M．（Raven Press，New York，1991）を参照のこと。 2．細菌抗原 本発明の組成物および方法で用いることのできる細菌抗原には、百日咳毒素、 繊維状ヘマグルチニン、ペルタクチン（pertactin）、FIM2、FIM3、アデニル酸 シクラーゼ、および、その他の百日咳菌抗原構成成分などの百日咳菌抗原；ジフ テリア毒素、またはトキソイド、および、その他のジフテリア菌抗原構成成分な どのジフテリア菌抗原；破傷風毒素またはトキソイド、および、その他の破傷風 菌抗原構成成分などの破傷風菌抗原；M蛋白質、および、その他の連鎖球菌抗原 構成成分などの連鎖球菌抗原；リポ多糖および、その他のグラム陰性菌抗原構成 成分などのグラム陰性杆菌抗原；ミコール酸、ヒートショック蛋白質65（HSP65 ）、30kDa主要分泌蛋白質、85A抗原、および、その他の結核菌抗原構成成分など の結核菌抗原；ヘリコバクタ ー・ピロリ菌抗原構成成分；ニューモリシン（pneumolysin）、肺炎球菌の莢膜 多糖、および、その他の肺炎球菌抗原構成成分などの肺炎球菌抗原；莢膜多糖、 および、その他のインフルエンザ菌抗原構成成分などのインフルエンザ菌抗原； 炭痘病防御抗原、および、その他の炭痘病抗原構成成分などの炭痘病抗原；ロン プス（romps）、および、その他のリケッチア菌抗原構成成分などのリケッチア 菌抗原が含まれるが、これらに限定はされない。また、本明細書で説明されてい る細菌抗原に含まれるのは、この他の細菌性、マイコバクテリア性、マイコプラ ズマ性、リケッチア性、またはクラミジア性抗原である。 3．真菌抗原 本発明の組成物および方法で用いることのできる真菌性抗原には、カンジダ 菌抗原構成成分；ヒートショック蛋白質60（HSP60）、およびその他のヒストプ ラスマ菌抗原構成成分などのヒストプラスマ菌抗原；莢膜多糖、および、その他 のクリプトコックス菌抗原構成成分などのクリプトコックス菌抗原；球状体抗原 、および、その他のコクシジオイデス菌抗原構成成分などのコクシジオイデス菌 抗原；および、トリコフィチン、および、その他のコクシジオイデス菌抗原構成 成分などの白癖菌抗原が含まれるが、これらに限定はされない。 4．寄生生物抗原 原生生物、およびその他の寄生生物抗原には、メロゾイト表面抗原、スポロゾ イト表面抗原、サーカムスポロゾイト抗原、生殖母細胞/配偶子表面抗原、血液 期抗原pf155/RESA、およびその他のマラリア原虫抗原構成成分などの、熱帯熱マ ラリア原虫抗原；SAG-1、p30、およびその他のトキソプラズマ抗原構成成分など のトキソプラズマ抗原；グルタチオン-S-トランスフエラーゼ、パラミオシン、 およびその他の住血吸虫抗原構成成分などの住血吸虫抗原；gp63、リポホスフォ グリカン、ならびに、その関連蛋白質、およびその他のリーシュマニア抗原構成 成分などの、リーシュマニア主要抗原、およびその他のリーシュマニア主要抗原 、および、；および、75−77kDa抗原、56kDa抗原、およびその他のトリパノゾー マ抗原構成成分などの、トリパノゾーマクルーズ抗原が含まれるが、これらに限 定はされない。 5．腫瘍抗原 本発明の組成物および方法で用いることのできる腫瘍抗原には、テロメラーゼ 、P-糖蛋白質などの多剤耐性蛋白質；MAGE-1、アルファーフェトプロテイン、癌 胎児性抗原、変異p53、パピローマウイルス抗原、ガングリオシド、または、そ の他、メラノーマ、もしくはその他の腫瘍細胞の糖質含有成分が含まれるが、こ れらに限定はされない。本発明では、あらゆる型の腫瘍細胞に由来する抗原を、 本明細書で説明している組成物および方法に用いることができる。 6．自己免疫に関係する抗原 自己免疫疾患、アレルギー、および移植片拒絶に関する抗原を、本発明の組成 物および方法で用いることができる。例えば、以下の自己免疫疾患ないし障害の 一つ以上に関係する抗原を、本発明において用いることができる。すなわち、糖 尿病、関節炎（慢性関節リューマチ、若年性関節炎、変形性関節症、乾癖性関節 炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫 性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、 シェーグレン症候群、シェーグレン症候群の二期症である乾性角結膜炎、円形脱 毛症、節足動物に噛まれたことに反応したアレルギー反応、クローン病、アフタ 性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、乾性角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘 息、皮膚性エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応（Ie prosy reversal reaction）、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレ ルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴力 喪失、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェ ーゲナー肉芽腫症、慢性活 性肝炎、スティーヴェンズ-ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癖、ク ローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎 、および間隙性肺線維症。自己免疫疾患に関係する抗原の例には、グルタミン酸 デカルボキシラーゼ65（GAD65）、本来のDNA、ミエリン塩基性蛋白質、ミエリン プロテオリピド蛋白質、アセチルコリンレセプター成分、チログロブリン、およ び甲状腺刺激ホルモン（TSH）レセプターが含まれる。アレルギーに関係する抗 原の例には、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ライグラス花粉抗原などの花粉 抗原、ダストのもとであるダニ抗原、およびネコ抗原などの動物由来の抗原、組 織適合性抗原、および、ペニシリンや、その他の治療薬が含まれる。移植片拒絶 に関係する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、および神経移植片成分 などの、移植片受容者に移植される移植片の抗原成分が含まれる。抗原は、自己 免疫疾患を治療する上で有用な、改変ペプチドリガンドでもよい。 本発明の組成物および方法で用いることのできる、その他の抗原の例には、黄 体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラク チン、およびその他のホルモン、コカインおよびヘロインのような嗜癖性薬剤、 抗レプチンレセプター抗体の、Fabを含む部位などの、抗原レセプターのイディ オタイプ断片が含まれる。本発明による、組換え核酸を含む細胞の調整 本明細書に教示されているように、当技術分野において周知の従来からの方法 を用いて、細胞を形質転換する。宿主細胞の形質転換に適した方法は、Sambrook ら、 分子クローニング：実験マニュアル、第二版、Cold Spring Harbour Labo ratory Press(1989)）および、その他の実験マニュアルから見つけることができ る。オプソニンをコードしている核酸分子を導入する方法の、別の例は、下に説 明されている。本発明の方法にしたがって、例えば、オプソニンおよび/または 抗原をコードしている、導入された核酸分子を含む細胞を、そのまま、例えば、 ワクチン組成物の形で、被験者に（抗原として）投与することができる。A ．細胞への裸の核酸の導入 1．DEAE-デキストラン媒介による形質転換：核酸とDEAE-デキストランの混合 液を作り、この混合液を細胞とインキュベートすることによって、裸の核酸を細 胞の中に導入することができる。核酸の取り込み量を増加させるために、ジメチ ルスルフォキシドまたはクロロキンによるショックステップを加えることができ る。DEAE-デキストラン形質転換法は、インビトロで の細胞の改変にしか応用することができないため、細胞の中に、一過的に核酸を 導入するために用いることはできるが、安定して形質転換された細胞を作出する のには適当ではない。したがって、この方法は、短期的に遺伝子産物を産生させ るために用いることができるが、長期にわたる遺伝子産物の産生には勧められな い方法である。DEAE-デキストラン媒介による形質転換に関するプロトコルは、 分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、Au subel F.M．ら（編）、グリーン・バプリッシング・アソシエイツ（Greene Publ ising Associates）、(1989)、9.2節、および、分子クローニング：実験マニュ アル、第２版（Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd Edition）、Samb rookら、コールドスプリングハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laborat ory Press）、(1989)、16.41-16.46節、または、この他の一般的な実験マニュア ルに書かれている。 2．エレクトロポレーション：適当な緩衝液中で細胞と核酸を一緒にインキュ ベートし、細胞に高電圧の電気パルスを与えることによって、裸の核酸を細胞の 中に導入することもできる。エレクトロポレーションによって、核酸が細胞の中 に導入される効率は、用いられる電場、電気パルスの強さ、温度、核酸の立体的 配位と濃度、および培地のイオン組成によって影響を 受ける。エレクトロポレーションを用いて、非常にさまざまなタイプの細胞を安 定的に（または、一過的に）形質転換することができ、インビトロでの細胞の改 変にのみ用いることができる。細胞のエレクトロポレーションに関するプロトコ ルは、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology ）、Ausubel F.M．ら（編）、グリーン・バプリッシング・アソシエイツ（Green e Publising Associates）、(1989)、9.3節、および、分子クローニング：実験 マニュアル、第２版（Molecular Cloning:A Laboratory Manual．2nd Edition） 、Sambrookら、コールドスプリングハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor L aboratory Press）、(1989)、16.54-16.55節、または、この他の一般的な実験マ ニュアルに書かれている。 3．リポソーム媒介による形質転換（「リポフェクション」）：核酸と、陽イ オン性脂質を含むリポソームとを混合することによって、裸の核酸を細胞の中に 導入することができる。そして、核酸/リポソーム複合体を、細胞とともにイン キュベートする。リポソーム媒介による形質転換を用いて、培養液中の細胞を、 インビトロで、安定的に（一過的に）形質転換することができる。プロトコルは 、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、 Ausube lF.M．ら（編）、グリーン・バプリッシング・ アソシエイツ（Greene Publising Associates）、(1989)、9.4節、および、その 他の一般的な実験マニュアルに書かれている。さらに、リポソームを用いて、イ ンビボでの遺伝子輸送を行なうことができる。例えば、Nicolauら、(1987)Meth ．Enz．149:157-176;WangとHuang（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA84:7851- 7855;Brighamら、（1989）Am．J．Med．Sci．298:278;および、Gould-Fogerite ら、（1989）Gene 84:429-438。 4．直接注入：核酸を直接、細胞に注入することによって、核酸を細胞の中に 導入することができる。細胞をインビトロで培養したものに対し、マイクロイン ジェクションによって導入することができる。細胞の一個一個にマイクロインジ ェクションを行なうため、この方法は、非常に多数の細胞を改変するときには、 非常に手がかかる。しかし、マイクロインジェクションが特別の方法となるのは 、遺伝子導入動物を作製するときである（下で詳細に考察する）。この場合には 、核酸が、受精卵の中に安定して導入され、その後、動物までに育てることがで きる。この結果作出された動物は、卵母細胞に導入された核酸をもっている。直 接注入法は、また、インビボで、裸の核酸を細胞の中に導入するためにも用いら れている（例えば、Acsadiら、（1991）Nature 332：815-818; Wolffら、（1990 ）Scien ce 247:1465-1468を参照のこと）。インビボで、細胞の中にDNAを注入するため の輸送装置（例えば、「ジーン・ガン」）を用いることができる。このような装 置は購入可能である（例えば、バイオラド（BioRad）社から）。 5．レセプターが媒介するDNAの取り込み：核酸を、細胞表面レセプターに対す るリガンドに結合している、ポリリジンなどの陽イオンと複合化させることによ って、細胞の中に、裸の核酸を導入することもできる（例えば、Wu，G．とWu，C .H．（1988）J．Biol．Chem．263:14621;Wlisonら、（1992）J．Biol．Chem．26 7:963-967;および米国特許第5,166,320号を参照のこと）。核酸-リガンド複合体 のレセプターへの結合は、レセプターが媒介するエンドサイトーシスによる核酸 の取り込みを促進する。核酸-リガンド複合体の標的となるレセプターには、ト ランスフェリンレセプターとアシアロ糖蛋白質レセプターが含まれる。自然にエ ンドソームを破壊し、それによって、細胞質の中に物質を放出することのできる 、アデノウイルスのカプシドに結合した核酸-リガンド複合体を、細胞内のリソ ソームによる複合体の分解を避けるために用いることができる（例えば、Curiel ら、（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8850;Crisitianoら、（1993）Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 90:2122-2126を参照のこと）。 レセプターが媒介する核酸の取り込みは、インビボでも、インビトロでも、細胞 の中に核酸を導入するために用いることができるということに加えて、目的の標 的細胞上で選択的に発現されているレセプターに結合するリガンドを用いること によって、核酸に特定の細胞型を狙わせることができるという特徴をもつ。 一般的に、（例えば、上記の形質転換技術の一つによって）培養中の細胞の中 に、裸の核酸を導入すると、ほんの僅かな細胞画分のみ（10⁵個のうち約1個）が 、典型的には、ゲノムの中に、形質転換された核酸を組み込む（すなわち、核酸 は、細胞の中で、エピソーム的に保持される）。したがって、外来の核酸を取り 込んだ細胞を同定するためには、選抜マーカーをコードする核酸を、目的の核酸 とともに、細胞の中に形質転換させるのが便利である。好ましい選抜マーカーに は、G418、ヒグロマイシン、およびメトトレキセートなどの薬剤に対する抵抗性 を付与するものが含まれる。選抜マーカーは、目的の遺伝子と同じプラスミドに 導入してもよいし、別のプラスミドに導入してもよい。 B ．ウイルスが媒介する遺伝子移行 遺伝子産物をコードする核酸を細胞の中に導入するための好ましい方法は、遺 伝子産物をコードする、例えば、cDNAなどの核酸をもつウイルスベクターの利用 によるものである。ウイルスベクターによる細胞の感染には、細胞の大部分が核 酸を受容するという利点があり、これによって、核酸を受容した細胞の選抜を行 なう必要を回避することができる。さらに、ウイルスベクターの中にコードされ ている分子、例えば、ウイルスベクターに含まれるcDNAは、ウイルスベクターの 核酸を取り込んだ細胞の中で効率的に発現されるため、ウイルスベクターシステ ムは、インビトロでも、インビボでも用いることができる。 1．レトロウイルス：欠損レトロウイルスは、遺伝子治療を目的とした遺伝子 導入に用いるために、充分に特徴が分かっている（総説としては、Miller，A.D ．（1990）Blood 76:271を参照のこと）。目的の遺伝子産物をコードする核酸を 、レトロウイルスのゲノムに挿入させた組換えレトロウイルスを構築することが できる。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去して、レトロウイルスの複 製を欠損させることができる。そして、複製欠損レトロウイルスを、標準的な技 術により、ヘルパーウイルスを使用して、標的細胞の感染に用いることのできる ウイルス粒子にパッケージする。組換えレトロウイルスを作出し、インビトロ、 またはインビボで、そのようなウイルスによって、細胞を感染させるためのプロ トコルは、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Bio logy）、 Ausubel F.M．ら（編）、グリーン・バプリッシング．アソシエイツ（Greene Pu blising Associates）、(1989)、9.10-9.14節、および、その他の一般的な実験 マニュアルに書かれている。適当なレトロウィルスには当業者似よく知られてい るＰＬＪ、ＰＺＩＰ、ＰＷＥおよびＰＥＭが含まれる。適当なパッケージングウ イルス系統には、_Crip、_Cre、_2、および_Amが含まれる。レトロウイルスを用 いて、上皮細胞、内皮細胞、リンパ細胞、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞などの多 くの異なった細胞型の中に、インビトロ、および/またはインビボで、さまざま な遺伝子が導入されている（例えば、Eglitisら、Science（1985）Science 230: 1395-1398;DanosとMulligan、（1998）Proc．Natl．Acad． Sci．USA 85:6460-6 464;Wlisonら、（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:3014-3018；Armentano ら、（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6141-6145;Huberら、（1991）Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 88:8039-8043;Ferryら、（1991）Proc．Natl．Acad． Sci．USA 88:8377-8381;Chowdhuryら、（1991） Science 254:1802-1805;van Be usechemら、（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7640-7644;Kayら、（1992 ）Human Gene Therapy 3:641-647;Dalら、（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10892-10895;Hwuら、（1993）J．Immunol．150:4104-115;米国特許第4,868, 11 ６号；米国特許第4,980,286号；PCT出願国際公開公報第89/07136号；PCT出願国 際公開公報第89/02468号；PCT出願国際公開公報第89/05345号；およびPCT出願国 際公開公報第92/07573号を参照のこと）。レトロウイルスのゲノム（および、そ れに挿入された外来の核酸）が、宿主ゲノムの中に組み込まれ、細胞の中に核酸 を安定して導入するためには、標的細胞が分裂することが必要である。したがっ て、標的細胞の複製を刺激する必要がある。 2．アデノウイルス：目的の遺伝子産物をコードし、発現させるが、正常な溶 菌ウイルス生活環における複製能力に関しては不活性化されているように、アデ ノウイルスのゲノムを操作することができる。例えば、Berknerら、（1988） B io Techniques6:616;Rosenfeldら、（1991）Science 252:431-434;およびRosenf eldら、(1992)Cell 68:143-155を参照のこと。アデノウイルス株Ad型5 dl324、 または、その他のアデノウイルス株（例えば、Adz、Ad3、Ad7など）に由来する 、適当なアデノウイルスベクターが、当業者によく知られている。効率的な遺伝 子輸送手段となるために、細胞分裂を必要とせず、気道上皮（Rosenfeldら、（1 992）前記）、内皮細胞（Lemarchandら、（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6482-6386）、肝細胞（HerzとGerard、（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:2 812-2816）、および筋細胞（Quantinら、（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:2581-2584）を含む、広い範囲の多様な細胞型に用いることができるという点 で、組換えアデノウイルスが好都合である。さらに、導入されたアデノウイルス の核酸（および、そこに含まれる外来DNA）は、宿主細胞のゲノムの中には組み 込まれず、エピソーマルに留まり、それによって、導入された核酸が宿主ゲノム の中に組み込まれた場合（例えば、レトロウイルスDNA）に、挿入突然変異の結 果として起こる可能性のある問題が回避される。さらに、他の遺伝子輸送ベクタ ーに較べて、外来DNAに対する、アデノウイルスゲノムの搭載能力は大きい（8キ ロベースまで）（Berknerら、前掲；Haj-AhmandとGraham（1986）J．Virol．57: 267）。現在用いられている複製欠損アデノウイルスベクターのほとんどは、ウ イルスのE1およびE3遺伝子の全部または一部を欠失してるが、アデノウイルスの 遺伝物質のほぼ80％を保持している。 3．アデノ関連ウイルス：アデノ関連ウイルス（AAV）は、効率的な複製と生産 的な生活環を行なうためにヘルパーウイルスとして、アデノウイルスやヘルペス ウイルスなど、別のウイルスを必要とする、天然の欠損ウイルスである。（総説 として、Muzyczkaら、（1992）Curr．Topics in Micro．and Immunol．（1992） 158： 97-129）。また、それは、そのDNAを非分裂細胞の中に組み込んで、高い頻度で 安定した組み込みを示すウイルスの一つでもある（例えば、Flotteら、（1992） Am．J．Respir．Cell．Mol．Biol．7:349-356;Samulskiら、（1989）J．Virol． 63:3822-3828;および、McLaughlinら、（1989）J．Virol．62:1963-1973を参照 のこと）。300塩基対までのAAVを含むベクターが、パッケージされて、組み込む ことができる。外来核酸が入り込めるの余裕は、約4.5kbまでに制限されている 。Tratschinら、（1985）Mol．Cell．Biol．5:3251-3260で説明されているよう なAVVベクターを用いて、細胞の中に、核酸を導入することができる。AAVベクタ ーを用いて、さまざまな核酸が、異なった細胞型の中に導入されている（例えば 、Hermonatら、（1984）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:6466-6470;Tratschin ら、（1985）Mol．Cell．Biol．4:2072-2081；Wondisfordら、（1988）Mol．Endo crinol．2:32-39;Tratschinら、（1984）J．Virol．51:611-619;およびFlotteら 、（1993）J．Biol．Chem．268:3781-3790）。 当技術分野において、日常的に用いられる標準的な方法によって、特定の発現 ベクター系と、細胞の中に核酸を導入する方法の有効性を評価することができる 。例えば、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロッティ ング）によって、細胞の中に 導入された核酸を検出することができ、例えば、ノザンブロッティング、RNase プロテクション、または逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（RI-PCR）によって 、導入された核酸の転写によって産生されるRNAを検出することができる。適当 なアッセイ法、例えば、特異的抗体などによる、産生された蛋白質の免疫学的検 出法、または、酵素アッセイ法などの、遺伝子産物の機能活性を検出するための 機能アッセイ法によって、遺伝子産物を検出することができる。細胞によって発 現される、目的の遺伝子産物を容易に測定できない場合には、まず、調節因子に 結合させたレポーター遺伝子と、使用すべきベクターとを用いて、発現系を最適 化させることができる。レポーター遺伝子は、容易に検出できる遺伝子産物をコ ードしているため、系の有効性を評価するために利用することができる。当技術 分野において使用される、標準的なレポーター遺伝子には、ガラクトシダーゼ、 クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、およびヒ ト成長ホルモンが含まれる。本発明による、オプソニンと混合された細胞の調製 本発明は、また、オプソニンと混合された細胞の調製も意図している。したが って、細胞が、すでに、例えば、腫瘍細胞抗原（内生的に発現される抗原でも、 異種抗原でもよい）などの抗原を発現していて、上記で定義されたようにして、 オプソニンと混合されていれば、この調製物は、本発明による「オプソニン強化 細胞」と見做される。この混合液において、調製物は、従来の生理的塩類緩衝液 の中に、１μｇ-100μｇ/mlの蛋白質（オプソニン）と混合した約10⁴-10⁸個の細 胞からなる。 発明が、オプソニンと混合した細胞の調製物を含むときには、まず、常法にし たがって、オプソニンを調製してから、細胞と混合する。オプソニンは、宿主細 胞系統、または菌株の形質転換による組換えDNA技術と、組換え蛋白質の分離に よって、オプソニンを調製することができる。 培養中の真核生物の宿主細胞などのような、本発明の宿主細胞を用いて、本発 明のポリペプチドを産生（すなわち発現）することができる。例えば、形質転換 された宿主細胞（その中には、本発明のポリペプチドをコードしている組換え発 現ベクターが導入されている）を、適当な培地の中で培養して、ポリペプチドを 産生させ、培地または宿主細胞から単離することができる。 CaPO4によって媒介される形質転換：核酸とリン酸カルシウムを含む沈殿物を 形成させることによって、細胞の中に、裸の核酸を導入することができる。例え ば、HEPESで緩衝化した生理食塩溶液を、塩化カルシウムと核酸とを含む溶液と 混合しｍ沈殿を形成し、次いで、沈殿と細胞とをインキュベートする。一定の細 胞による核酸の取り込み量を増加させるために、グリセロールまたはジメチルス ルホキシドによるショックステップを加えることができる。CaPO4が媒介する形 質転換法を用いて、細胞を安定的に（または、一過的に）形質転換することがで き、インビトロでの細胞の改変にのみ応用することができる。CaPO4媒介による 形質転換に関するプロトコルは、分子生物学の最新プロトコル（Current Protoc ols in Molecular Biology）、Ausubel F.M．ら（編）、グリーン・バプリッシ ング・アソシエイツ（Greene Publising Associates）、(1989)、9.1節、および 、分子クローニング：実験マニュアル、第２版（Molecular Cloning：A Laborat ory Manual．2nd Edition）、Sambrookら、コールドスプリングハーバー研究所 出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、(1989)、16.32-16.40節、また は、この他の一般的な実験マニュアルに書かれている。 本発明によって、免疫応答が調節されるか否かの判定 本発明によるオプソニン強化細胞は、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける、 抗原、または細胞に含まれ る抗原に対する免疫を調節するのに有用である。細胞が投与されると、抗原提示 細胞によって取り込まれる（すなわち、摂取または貪食される）。あるいは、細 胞を、貪食作用が起きる条件下で、抗原提示細胞に接触させる。 「免疫応答」とは、免疫系を含む、選択された応答を刺激/活性化すること、 または、選択された応答を、抑制、除去、もしくは減衰させることを意味する。 したがって、免疫応答を調節することは、所望の応答が、オプソニン強化細胞で ない以外、あらゆる点で同一の細胞に、同じ方法で投与されたときよりも、より 効率的に、より迅速に、より大きな程度、および/または、より簡単に誘導され ることを意味する。被験者における免疫応答が異なれば、異なった方法で調節さ れるかもしれない。例えば、液性免疫が選択的に減衰される一方で、細胞性免疫 が選択的に促進されるかもしれない、逆もまた同じである。 以下の、インビトロとインビボのアッセイ法は、本発明によって、免疫応答が 調節されるか否かを決定するために有用である。下で詳細に説明されている、こ のアッセイ法は、抗原に対する細胞性または液性免疫応答の刺激、または抑制を 測定するものである。以下のアッセイ法で言及されている抗原は代表的なもので ある。以下のアッセイ法の一つ以上を、そのアッセイ 法を抗原に適応させて用いて、本発明によって有用な選択された抗原に対する免 疫応答を測定することができる。 I．貪食作用の上昇の検出 以下のアッセイ法は、オプソニン強化細胞が、抗原提示細胞による貪食作用を 刺激するか否かを判定するために用いることができる。 添加FCSなしのRPIM中、37℃で30分間付着させた単球を用いて、貪食作用を調 べる。羊の赤血球を、候補オプソニン、または、その前駆体とともに、このよう な分子が平均して300個以上は、各赤血球に付着しないような条件の下でインキ ュベートする。前駆体が用いられるときには、付着させた赤血球をさらに処理し て、全ての前駆体を実際の候補分子に変換させる（例えば、Carloら、Ｊ．Immun ol．123:523-８（1979）を参照のこと）。新鮮な単球を、被験者から分離し、こ れらの細胞５×10⁴-１×10⁵個を、１％BSA入りのRPMI培地、0.25-0.5mlに懸濁す る。このアリコートを、組織培養用ウェルに入れ、37℃で30分間インキュベート する。過剰量の付着赤血球でこの単球が覆われ、1.2×10⁸細胞/mlに懸濁されて いるこのプレートを、50ｇで５分間遠心分離し、37℃で30分間インキュベートす る。付着細胞を固定、染色して、光学顕微鏡下で調べる前に、氷冷した溶解用緩 衝液を用いて、低張の溶解ステップ を２回行なって、摂取されなかった材料を取り除く。１個以上の標的細胞を摂取 している単球100個の百分率を決定して、貪食作用を定量し、摂取されたEの全数 量/単球100個（PI）を記録する。本発明による、貪食作用の刺激は、食食指数が 40か、それ以上あるときに示される。 II．免疫応答の増幅には、通常、正常なときは静止状態にあるリンパ細胞の、 特定の亜集団の増殖が含まれる。 増殖アッセイ法は、臨床試験において、以下のように応用される：（1）マイ トジェンまたは抗-CD3抗体のようなポリクローナル増殖シグナルに応答する能力 として表される、Ｔ細胞またはＢ細胞の免疫学的なコンピテンスの全体的な評価 。増殖に問題があるのは、基本的な細胞性免疫欠損を示していよう。低い増殖は 、慢性疾患の非特異的な二次的効果として、よく見られる。（2）特異的な抗原 に対する各人の応答の評価。ここで、応答が低いのは、一般または特異的な免疫 学的欠陥があることを示している。（3）混合リンパ球反応（MLR）によるMHC適 合性の判定。 さらに、増殖アッセイ法は、リンホカイン産生を評価し、シグナル誘導を調べ 、TまたはB細胞に関する、増殖因子要求性を評価するために有用である。ここで 概略する方法は、DNAへの[³H]チミジンの取り込みを 測定するものであるが、これは、細胞数の変化で測定すると、大抵、細胞増殖に よく相関している。イオノマイシンにホルボールミリステートアセテート（PMA ）を加えたものなどの化学的活性剤によるときのように、活性化刺激が毒性のと き、活性化後に新しいDNA合成が一斉に起きても、生存細胞の正味の増加を伴わ ず、実際、細胞数の減少が見られるであろう。この例において、DNAへの[³H]チ ミジンの取り込みは、細胞数の評価というよりは、最初の細胞刺激を示すもので ある。さらに、[³H]チミジンの取り込みは、個々の細胞ではなく、細胞集団につ いての情報を提供する。この種の情報を必要とする実験のために、フローサイト メトリーなど、別の方法を用いることができる。 抗原誘導されたT細胞増殖のためのアッセイ法 このプロトコルは、特異的な抗原、破傷風トキソイドに応答したT細胞の増殖 を調べるために設計されたものである。これを修正して、どのような蛋白質、ま たは多糖類の抗原に応答したT細胞の増殖を調べることができる。材料：（T細胞 懸濁液、自己抗原提示細胞懸濁液（非Ｔ細胞）、破傷風トキソイド溶液（コンノ ート社（Connaght）、または、マサチューセッツ州立研究所））。（1）Ｔ細胞 を数え、完全RPIM-10 ABで、１×10⁶細胞/mlに調整する。（2）一方向MLRプロト コルの第二ステップとして、抗原提示細胞を、マイトマ イシンCで処理する（または、2500radで照射する）。抗原提示細胞の濃度を2×1 0⁵細胞/mlに調整する。抗原提示細胞は自己非Ｔ細胞または自己単球／マクロフ ァージである。（3）ウエルに100μｌのT細胞懸濁液と、50μｌの抗原提示細胞 集団を加え、分注する直前に混合する。（4）最終濃度が、0、1、5、10および20 μｇ/mlになるように、50μｌの破傷風トキソイド溶液を加える。各希釈液につ いて、３個のウエルを用意する。（5）加湿した37℃、５％CO₂インキュベーター の中で６日間インキュベートする。（6）[³H]チミジンで標識し、補助プロトコ ルに述べられているようにして回収する。 リンホカインに依存した細胞増殖のためのアッセイ法 このプロトコルは、リンパ球集団の、リンホカインに依存した増殖、この場合 は、IL-4に依存したB細胞の増殖を測定するものである。材料：（扁桃B細胞懸濁 液、セファロースビーズ（バイオラド社）にクロスリンクした抗IgM、完全RPIM- 10中の10,000U/mlのヒトｒIL-4（ジンザイム（Genzyme）社）)。（1）扁桃B細胞 の数を数え、完全RPIM-10で、１×10⁶細胞/mlに調整する。（2）各ウエルの中に 、100μｌの扁桃B細胞を分注する。各実験条件に対して３つのウェルを準備する 。（3）10，000U/mlのｒIL-４溶液を、1:10、1: 100、および1:1000に希釈する。適当なウエルに、20μｌの保存液、または希釈 液を加えて、1000U/ml、100U/ml、10U/mlになるようにする。ｒＩＬ−４を加え ない対照ウエルを含める。（4）適当なウエルの中に、抗IgMビーズをピペットで 分注する。 パイロット実験で最適なビーズ濃度を決める。各実験では、最適な用量に「括 弧」を付けて、いくつかのビーズ濃度を含ませるのが最善である。扁桃B細胞とI L-4希釈液だけを入れたウエル、抗IgMビーズのみを入れたウエル、培養培地だけ を入れたウエル、および、IL-4と抗IgMビーズの希釈液のあらゆる組合せを入れ たウエルを用意する。（5）必要ならば、各ウエルの容量を、RPIM-10で200μｌ に増加させる。（6）加湿した37℃、５％CO₂インキュベーターの中で5日間培養 する。（7）[³H]チミジンで標識し、補助プロトコルに述べられているようにし て回収する。 [³H] チミジン標識化、および細胞培養物の回収 このプロトコルは、[³H]チミジン取り込むアッセイ法を完了するために、上記 のプロトコルと関連して用いられる。（1）培養を終了する前の決められた時間 に（大抵は、6時間、または18時間前に）、各培養液に、20μｌの50μCi/mlの[³ H]チミジンを加える（１．０μCi）。（2）取り込まれなかった[³H]チミジンを 洗い流しながら、細胞を吸引し、細胞を溶解し、DNA を濾紙の上に移行させる自動マルチウエル回収器を用いて細胞培養物を回収する 。微量滴定用プレートの各列を、10回ずつ、注入、吸引を繰り返して、細胞の完 全な移行と、取り込まれなかった[³H]チミジンの完全な除去を確実にする。100 ％エタノールで各濾紙片を洗浄して、乾燥しやすくする。シンチレーション用バ イアル瓶に移す。半自動化回収器では、各ウエル当りの濾紙断片を、シンチレー ション用バイアル瓶に移す。手作業による移行では、照明の下で濾紙を乾燥させ 、ピンセットでシンチレーション用バイアル瓶に移す。各バイアルに、シンチレ ーション溶液を加える。（3）標準偏差が2％より小さくなるまで、シンチレーシ ョンカウンターで、サンプルを計測する。バックグランド用培養液と、各実験条 件について、cpmの平均値を計算する。反復培養においては、変動は20％より少 ないはずである。 III．インビトロでの抗体反応の誘導と測定 蛋白質または多糖類抗原によるインビボでの免疫の後、抗体反応を起こす、ヒ トの免疫系の能力は、BおよびT細胞という免疫系の両方の武器の全体的な完全性 を、意味深くも表している。このように、インビボで免疫した後に、抗体反応を 測定することは、さまざまな後天的ならびに先天的免疫疾患における、また、免 疫系に影響する別の症状をもつ宿主における免疫機 能の適切な試験である。以下の手順は、インビボで免疫と、その後の免疫反応を 、ELISA法を用いて測定するためのものである。 NIP-およびHRPO-標識した抗体を用いた、サイトカインに関する免疫酵素アッ セイ法 このプロトコルは、サイトカインが、微量滴定用プレートに結合した被覆抗体 によって固定されている、外来性の非競合的な免疫アッセイ法を用いる、サイト カインに関する免疫酵素アッセイ法を説明している。非結合物を洗い流してから 、ハプテン ニトロヨードフェニル（NIP）で標識した、異なった抗サイトカイ ン抗体を用いて検出を行なう。これは、次に、抗-NIP抗体のホースラディッシュ ペルオキシダーゼ（HRPO）結合体によって検出され、発色基質ABTSによって発色 する。この非競合的な免疫アッセイ法において、免疫アッセイシグナル（A₄₀₅） は、サンプル中に存在するサイトカインの量に正比例する関数である。抗体は、 免疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)、1995、6.20.2-6. 20.10で説明されているところに従って、調製される。 コートアッセイプレート。（1）マルチチャンネルピペッターを用いて、適当 な希釈率の、100μｌ被覆抗体を、使用するアッセイプレートの全てのウエルの 中に移し入れる。（2）微量滴定用プレートシーラー、 またはパラフィルムで、プレートを覆い、37℃で2時間インキュベートする。調 製用プレートの中に、サンプルと標準とを調製する。（3）測定する各サンプル （または、順化培地のアリコート）を、等量の免疫アッセイ用希釈剤で希釈する 。（4）測定する各希釈サンプルを、１mlか、それより少量を、分離型スピン-X （Spin-X）微量濾過装置の上部チャンバーに、ピペットで入れる。10,000rpmで ５分間微量遠心して、下部チャンバーに集められた濾過物を保存する。（5）65 μｌの各希釈サンプルを、調製用プレート（すなわち、分離した96ウェル微量滴 定用プレート）の適当なウエルに加える。（6）サイトカイン標準のアリコート を室温で溶かして、よく混ざっていることを確認する。ピペットで、130μｌを 、標準曲線上で最も高い濃度を表す、調製用プレートのウエルの中に入れる。こ のウエルから65μｌを次のウエルに移して、段階的な１:１の希釈を行ない続け 、標準曲線上に表された各濃度が、調製用プレートの適当なウエルに位置するよ うにする。（7）較正液のアリコートを室温で溶かす（用いる場合）。等量の免 疫アッセイ希釈液で希釈してから、65μｌの希釈した較正液をピペットで、適当 なウエル、または、適当なプレートのウエルに入れる。 被覆抗体とインキュベートする。（8）インキュベーターから、被覆したプレ ートを取り出す。１×洗浄 用緩衝液を満たした２リットルビーカーに浸してから、流しの上で逆さまにして 、液体を振り落とす。さらに2回繰り返してから、ペーパータオルの上で水分を たたき落として乾かす。（9）調製用プレートの各ウエルから、アッセイ用のプ レートの対応するウエルに、マルチチャンネルピペッターで、50μｌの溶液を移 す。（10）微量滴定用プレートシーラー、またはパラフィルムで、プレートを覆 い、室温で2時間インキュベートする。 検出用抗体とインキュベートする。（11）目的のサイトカインに特異的な、NI P-標識した検出抗体を、検出用緩衝液で、１μｇ/mlまで希釈する。（12）ステ ップ8におけるように、アッセイ用プレートを洗浄する。（13）使用しない外壁 も含めて、アッセイ用プレートの全てのウエルに、ステップ11で得られた希釈検 出用抗体を75μｌ加える。（14）微量滴定用プレートシーラー、またはパラフィ ルムで、再びプレートを覆い、室温で1時間インキュベートする。 HRPO結合抗-NIP抗体とインキュベートする。（15）HRPO結合抗-NIP Mabを検出 用緩衝液に１:3000に希釈する。（16）ステップ8におけるように、アッセイ用プ レートを洗浄する。（17）アッセイ用プレートの全てのウエルに、ステップ15で 得られた希釈HRPO結合抗-NIP抗体を75μｌ加える。（18）微量滴定用プレートシ ーラー、またはパラフィルムで、再びプレートを覆い、室温で１時間インキュベ ートする。 発色基質とインキュベートする。（19）ステップ8におけるように、アッセイ 用プレートを洗浄する。（20）アッセイ用プレートの全てのウエルに、100μｌ のABTS基質反応溶液を加える。プレートを覆って、発色が、望ましいレベルに達 するまで（一般的には、標準液の最高濃度を含むウエルのA₄₀₅が、1.5と2の間に なるまで）、室温でインキュベートする。このプロトコルは、普通、30分から60 分後に読み取ることが可能なアッセイを作出している。 プレートの読み取りと解析データ。（21）コンピュータのインターフェイスを もつ微量プレート読み取り器を用いて、単一波長方式では405nmで、二重波長方 式では405と650nmで、全てのウエルの吸光度を測定する。（22）曲線適合ソフト ウエアを用いて、第1度（直線）、第2度（二次曲線）もしくは4パラメータ（非 直線）の数学的な関数によって説明される曲線に、標準データに適合させる。（ 23）未知のサイトカインサンプルから得られた吸光度のデータを、標準曲線に適 合させ、サイトカイン濃度を適合させる。 IV．インビボで抗体反応を誘導すると、免役系の全体的な完全性を評価する方 法が提供される。ここに示すプロトコルにおいて、安全であり、入手可能である ことから、ジフテリアと破傷風のトキソイドは、代表的な蛋白質抗原として用い られており、肺炎球菌の多糖は、代表的な多糖抗原として用いられている。しか し、これらの抗原で誘導される応答は、過去のワクチン接種や自然暴露による、 二次的応答である可能性があることに留意すべきである。一次応答を得るために は、キーホール・リムペットのヘモシアニンのような、普通にはない抗原を用い るべきである。 抗原を、ここにあるような、筋肉内、または皮下経由で投与すると、「全身的 な」免疫応答が誘導されて、血流中の抗体の測定値が最も適正になる。しかし、 ときには、「局所的な」、または、粘膜性の免疫応答に関心のあるときがある。 この場合には、呼吸器のリンパ組織を刺激するには、鼻腔内から、または、胃腸 のリンパ組織を刺激するには、口から抗原を投与し、抗体の内容について、血液 ではなく、気管支洗浄液、または腸液を測定する。さらに、所的/粘膜応答の刺 激に、より適している抗原が用いられる（すなわち、呼吸器応答には、インフル エンザウイルス抗原、および、胃腸の応答には、コレラ毒素）。 インビボの抗体反応を測定するときに、蛋白質と多糖抗原の両方に対する反応 を決定することが重要である。というのは、これらの抗原は、免疫系の異なった 成分を刺激するからである。この点に関して、蛋白質 抗原に対する主要な抗体反応は、IgG1とIgG3のサブクラス抗体を含むが、一方、 多糖に対する主要な抗体反応は、IgG2のサブクラス抗体を含む。 インビボでの免疫後に得られた材料における抗体反応を測定するために、さま ざまな免疫アッセイ法が用いられている。これらの中では、ELISAアッセイ法が 、安定した、容易に測定可能な、再現性のある、安全な結果を出すために、おそ らく、最も有用であろう。 蛋白質/多糖抗原に対する、インビボで抗体反応の誘導 このプロトコルにおいて、抗原は、筋肉内、または皮下経由で投与され、反応 を測定するために、血清が集められる。（1）免疫前の血液サンプルを採り、血 液を凝固させて、遠心分離によって、血塊から血清を分離する。この血清は、適 当にラベルを付けたプラスチックチューブに入れて、-20℃から-70℃に保存する 。（2）0.5mlのトキソイド混合液を、静脈に注射しないよう気をつけて、適当に 準備された筋肉内部位（三角筋または腿）に注射する。（3）0.5mlの多価肺炎球 菌ワクチンを、静脈に注射しないように気をつけて、適当に準備された皮下部位 に注射する。（4）免疫後の血液サンプルを、望ましい間隔、通常は、1、2、お よび3週間の間隔で採る。血清を分離して、-20℃から-70℃に保存する。（5）す べての血清サンプルを集め たら、ELISAを用いて、抗体存在下で、サンプルを測定する。 ELISAは、破傷風、ジフテリアの追加免疫、および多価肺炎球菌の多糖ワクチ ンによって、ワクチン接種された、個人から得た血清中の蛋白質および多糖抗体 を含む、さまざまな抗原に対する、インビボでの抗体反応を測定するための、迅 速で、感度が高く、再現性があり、非放射性の方法を提供する。破傷風、ジフテ リア、および多価肺炎球菌多糖型I、II、およびIIIに特異的なアッセイ法が、免 疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)、1995、第６巻と７ 巻に詳述されている。 腫瘍拒絶を用いたアッセイ法 免疫調節に関する、別のアッセイ法は、10⁴-10⁸個のオーダーの照射されたオ プソニン強化腫瘍細胞を、免疫応答性のある動物にワクチンを接種し、10⁴-10⁸ 個のオーダーの生きた野生型の腫瘍細胞で（いかなる時間的な順序でも）攻撃誘 発する。これらの動物で、それらの生残りと、腫瘍の開始とが、同じパラメータ を用いて、オプソニン強化細胞の代わりに、照射された非オプソニン強化腫瘍細 胞によって、ワクチンを接種された動物のそれと異なっていれば、免疫調節が起 こったのである。例えば、試験グループの少なくとも10％の動物が、対照グルー プの平均生存期間より、10 0％長く生きていたら、この試験結果は陽性である。 別の例としては、試験動物の20％において、腫瘍が開始するのが、対照動物にお ける平均開始時期よりも、50％遅くなるかもしれない。 用途 本発明を適用することができる腫瘍 本発明は、下記：黒色腫、扁平上皮細胞腫、基底細胞癌、星状細胞腫（アスト ロサイトーマ）、神経ごう腫（グリオーマ）、多形性神経ごう芽腫、髄膜腫、脳 室上衣腫、神経鞘腫（シュワン鞘腫）、神経芽細胞腫、網膜芽腫、髄膜腫、グロ ムス腫瘍、例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、骨液膜細胞肉 腫、線維肉腫、紡錘細胞腫瘍、血管肉腫、原始神経外胚葉細胞腫瘍およびカポシ 肉腫を包含する肉肺、リンパ腫、急性および慢性白血病、頭および首の腫瘍、鼻 咽頭癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、上皮小体癌、胸腺腫、食道癌、胃癌、小腸 癌、結腸および直腸癌、中皮腫、例えば、腺癌、扁平上皮細胞癌、気管支肺胞癌 および小細胞腫瘍を包含する肺癌、膵臓癌、島（islet）または非島（non-islet ）細胞腫瘍、乳癌、心臓粘液腫、下垂体腫瘍、カルチノイド腫（類癌腫）、肝腫 瘍、胆管癌、肝芽腫、腎細胞癌、腎芽細胞腫、ウィルム腫瘍、副腎癌、褐色細胞 腫、生殖細胞腫瘍、絨毛癌、卵巣癌、精巣癌、精上皮腫、子宮内膜腫瘍、前立腺 癌、精嚢癌、 膣腫瘍、陰茎癌、胞状奇胎、胆嚢癌および膀胱癌を、非制限的に含む腫瘍の治療 を意図している。本発明によるトランスジェニック動物 本明細書に記載される強化（engineerd）オプソニンをコードする核酸分子を 使用して非ヒトトランスジェニック動物を作出することができ、その様なトラン スジェニック動物の細胞を単離して、動物またはヒトの予防接種において、ワク チン製剤に使用することができる。 例えば、１つの実施態様においては、核酸分子が、受精卵母細胞または胚性幹 細胞に導入される。次に、そのような細胞を用いて、内生核酸分子が変更された ゲノムまたは相同的組換え動物に、本発明のポリペプチドをコードする外来核酸 分子が導入された非ヒトトランスジェニック動物を作出することができる。その ような動物は、本発明の分子の機能および／または活性の研究、並びに本発明の 分子の活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書 に記載される「トランスジェニック動物」とは、動物の細胞の１つまたはそれ以 上がトランスジーンを含む非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より 好ましくはマウスである。トランスジーンは、トランスジェニック動物がそこか ら発生した細胞のゲノムに導入され、成長した動物のゲノムにとどまり、それに よって、トランスジェニック動物の１つまたはそれ以上の細胞種または組織中に 、コードされた遺伝子産物を発現させる外来核酸である。 本発明のトランスジェニック動物は、本明細書に開示されているポリペプチド をコードする核酸分子を、例えばマイクロインジェクションによって、受精卵母 細胞の雄前核に導入し、卵母細胞を偽妊娠雌仮親動物（foster animal）中で成 長させることによって、作出することができる。イントロン配列およびポリアデ ニル化シグナルも、トランスジーンに含んで、トランスジーンの発現効率を高め ることができる。組織特異性調節配列を、機能的にトランスジーンに結合させて 、本発明のポリペプチドの発現を特定細胞に指向させることができる。胚操作お よびマイクロインジェクションによって、トランスジェニック動物、特にマウス のような動物を発生させる方法は、当分野において一般的であり、例えば、Lede rらによる米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、Wag nerらによる米国特許第４，８７３，１９１号、並びにHogan,B.,Manipulation t he Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.,1986)に開示されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作 出に使用されている。トランスジェニック創始者（founder）動物は、本発明の 核 酸分子の存在、例えば、それのゲノム中のトランスジーンおよび/または動物の 組織または細胞中のトランスジーンｍＲＮＡの発現に基づいて、同定することが できる。次に、トランスジェニック創始者動物を、トランスジーンを有する追加 動物を育種するのにも使用することができる。さらに、本発明のポリペプチドを コードするトランスジーンを有するトランスジェニック動物を、他のトランスジ ーンを有する他のトランスジーン動物に育てることができる。 本発明をさらに制限するものであると理解すべきではない下記実施例によって 、本発明をさらに説明する。オプソニン強化、オプソニン発現細胞の製造 実施例１ マウスＣ３ｂのアルファ鎖を発現するマウス腫瘍細胞を含むオプソニン強化細 胞を、下記のようにして得た。 Genbank K02782のヌクレオチド2304-2324に対応する上流プライマーおよびK02 782のnt5027-5050に相補的な下流プライマーを用い、５'ＢｃｌＩエクステンシ ョンを組み込んで、ネズミＣ３ｂのアルファ鎖をコードする配列を、マウス肝臓 ｃＤＮＡからＰＣＲによってクローニングした。産物をＢｃｌＩで消化した。Ｃ ３ｂａ'遺伝子の５'平滑末端がベクターの平滑上流自由末端に付着し、およびＣ ３ｂａ'の３'付着末端が アニーリングされ、ベクターの下流自由末端において相補的な付着ＢｃｌＩオー バーハンドに付着するように、ポリペプチド分泌配列をコードする配列を組み込 むようにして哺乳動物発現プラスミドＳＦＧ（Dranoffら、1993,Proc.Nat.Aca.S ci.90(8)3539）に、遺伝子を連結した。 いくつかの実験に関しては、ＳＦＧ−Ｃ３ｂａ'プラスミドを用いて、塩化カ ルシウム法によって、両栄養性一過性レトロウイルス産生細胞（amphotrophic t ransient retroviral producer cells）(Bing cells,Pearら、1993,Proc.Nat.Ac ad.Sci.90(16)8392))をトランスフェクトした。前記Pearらによる文献に記載の 方法によって、これらの細胞からの上澄みを用いて、Ｃ３ｂ遺伝子をマウスＢ１ ６黒色腫細胞に導入した。これらのＢ１６細胞を、インビボ試験のために充分な 数が得られるまで、培養基中で増殖させた。 実施例２ 他の実験に関しては、ＳＦＧ−Ｃ３ｂａ'プラスミドを、選択マーカーｐＳＶn eoと共に、Ｂ１６黒色腫またはＣＭＳ−５線維肉腫中へ直接的にコエレクトロポ レーションを行った。これらの細胞を、ワクチンとして使用するために選択し、 増殖させた。 実施例３ 他の実験に関しては、Genbank S42292のnt124-138 に対応する上流プライマーおよびS42292のnt817-840に相補的な下流プライマー を用い、５'Ｂｇｌ IIエクステンションを組み込んで、ネズミマンノース結合蛋 白質Ａ遺伝子を、マウス肝臓ｃＤＮＡから増幅した。この産物をＢｇｌ IIで消 化し、平滑上流ＮｃｏＩおよび付着下流ＢａｍＨＩ末端（Ｂｇｌ IIオーバーハ ングと適合性である）で、ＳＦＧプラスミドに連結した。プラスミドを、ｐｓｉ −ＣＲＩＰ両栄養性レトロウイルス産生細胞中へｐＳＶneoと共にコエレクトロ ポレーションを行い、クローンを選別し、増殖させた。これらの細胞からの上澄 みを用いて、ＭＢＰ−Ａ遺伝子をＢ１６細胞に伝達した。オプソニン強化細胞を使用する予防接種およびオプソニン強化細胞の有効性の立 証 実施例４ １つの実験においては、ＧＭ−ＣＳＦを形質導入されたＢ１６細胞の能力、野 生種Ｂ１６黒色腫に対する治療ワクチンとして機能する能力を、これらの細胞お よび前記のＣ３ｂａ'形質導入細胞の混合物の能力と比較した。 ９匹のＣ５７Ｂｌ/６マウスを各々、０.５ｍＬのＨＢＳＳに懸濁した１×10⁶ の生存野生種Ｂ１６細胞で攻撃誘発した（細胞を首部分に皮下注射した）。７日 後、５匹のマウスに、腹部において、０.５ｍＬの ＨＢＢＳ中の５×１０⁵照射ＧＭ−ＣＳＦ形質導入Ｂ１６細胞（Dranoffらの前記 文献）を用いて皮下的にワクチン投与し、４匹に、２.５×１０⁵の照射ＧＭ−Ｃ ＳＦ形質導入細胞と２.５×１０⁵の照射Ｃ３ｂａ'形質導入細胞との混合物を用 いてワクチン投与した。結果は以下の通りであった。ＧＭ−ＣＳＦのみを接種さ れた５匹全部が、攻撃誘発から９日目に腫瘍を発現した。混合ワクチンを接種し たマウスのうち、１匹が９日目、１匹が１２日目、１匹が５１日目に腫瘍を発現 し、１匹が１８０日目までに腫瘍を発現しなかった。ＧＭ−ＣＳＦ群のマウスは １匹も２０日目を過ぎて生存しなかったが、混合群は全て少なくとも３０日目ま で生存した。 これらの実験において、各マウスは、腫瘍が巨大になった場合に、およびそう なった時に、犠牲にされた。このことは幾分、主観的評価にかかわるが、犠牲時 の腫瘍の大きさに関して一貫性があるようにする良心的試みがなされた。例えば 、腫瘍が体重の１５〜２０％を越えると見られたとき、または歩行が冒されてい るときに、マウスが犠牲にされた。 実施例５ 他の実験においては、野生種Ｂ１６細胞の、腫瘍形成に対する予防的ワクチン として機能する能力を、Ｃ３ｂａ'を形質導入されたＢ１６細胞の能力と比較し た。５匹のＣ５７ＢＬ/６マウスに、腹部において、５×１０⁵照射野生種細胞を 用いて皮下的にワクチン投与し、および５匹に５×１０⁵照射Ｃ３ｂａ'形質導入 細胞を用いてワクチン投与した。７日後、全てのマウスを、１×１０⁶の生存野 生種細胞を用いて、首において皮下的に攻撃誘発した。野生種群における腫瘍の 開始は、攻撃後１１日目（２匹）、１２日目、および１５日目（２匹）であった 。Ｃ３ｂａ'群における開始は、１２日目、１５日目、２９日目、３８日目およ び３９日目であった。野生種群のマウスの生存期間は１７日、１９日（２匹）、 ２０日および２２日であり、Ｃ３ｂａ'処置マウスの生存期間は、それよりも顕 著に長く、即ち１９日、２２日、３７日、５４日および６１日であることを結果 が示した。 実施例６ 他の実験においては、Ｃ３ｂａ'形質導入ＣＭＳ−５細胞の治療的有効性を評 価した。Ｂａｌｂ/ｃマウスを、５×１０⁵野生種ＣＭＳ−５細胞を用いて、首に おいて皮下的に攻撃誘発した。６日後、５匹のマウスを、腹部において、１×１ ０⁶野生種ＣＭＳ−５細胞を用いて、皮下的にワクチン投与し、５匹を１×１０⁶ Ｃ３ｂａ'形質導入細胞を用いて、５匹を５×１０⁵野生種細胞と５×１０⁵ＧＭ −ＣＳＦ形質導入細胞（Dranoffらの前記文献）との混合物を用いて、並び に１０匹を５×１０⁵Ｃ３ｂａ'形質導入細胞と５×１０⁵ＧＭ−ＣＳＦ形質導入 細胞との混合物を用いて、ワクチン投与した。全てのワクチン投与細胞が照射さ れた。野生種群は、１１日目、１４日目（３匹）および１５日目に腫瘍を発現し 、２６日目、３９日目（３匹）および４３日目まで生存した。３匹のＣ３ｂａ' 群のマウスは、１１日目に腫瘍を発現し、１９日目および２６日目（２匹）まで 生存した。しかし、４匹目は、有意に進行しない小さい腫瘍を１６日目に発現さ せ、このマウスは実験終了後である６０日経過後でさえも犠牲にする必要がなか った。５匹目は、実験が終了したときに、腫瘍を発現していなかった。野生種/ ＧＭ−ＣＳＦ群のマウスの５匹全部が、１１日目に腫瘍を発現した。この中の２ 匹は１９日目まで生存し、３匹は２６日目まで生存した。Ｃ３ｂａ'/ＧＭ−ＣＳ Ｆ群のマウスは、１１日目（５匹）、１２日目（２匹）、１５日目（２匹）およ び４３日目に腫瘍を発現した。それらは２６日目（５匹）、３９日目（２匹）、 および４８日目（１匹）まで生存し、２匹の腫瘍は有意に進行しなかった。後者 の２匹は、少なくとも６０日目まで犠牲にする必要がなかった。 実施例７ 他の実験においては、Ｃ３ｂａ'トランスフェクトＣＭＳ−５細胞を、予防的 ワクチンとして、ワクチン 投与細胞の数と攻撃誘発細胞の数との間の大きな差について試験した。Ｂａｌｂ /ｃマウスを、腹部において、２×１０⁵照射野生種（５匹）またはＣ３ｂａ'ト ランスフェクト（１０匹）細胞を用いて、皮下的にワクチン投与するか、または ワクチン投与しなかった（５匹）。７日後、全てのマウスを、２×１０⁷の生存 野生種ＣＭＳ−５細胞を用いて、首において皮下的に攻撃誘発した。ワクチンを 投与していない群および野生種群の全てのマウスが、９日目に腫瘍を発現し、１ ５日目まで生存した。Ｃ３ｂａ'群においては、１匹のマウスが少なくとも６０ 日目まで腫瘍を発現せず、一方、８匹が９日目に、および１匹が１７日目に腫瘍 を発現した。腫瘍を発現したマウスは、１５日目（４匹）、１７日目（２匹）、 ２４日目（２匹）および３３日目まで生存した。 実施例８ 他の実験においては、マンノース結合蛋白質Ａ遺伝子を形質導入されたＢ１６ 細胞を、予防的ワクチンとして試験した。Ｃ５７ＢＬ/６マウスを、腹部におい て、５×１０⁵照射野生種Ｂ１６細胞（５匹）または５×１０⁵照射ＭＢＰ−形質 導入細胞を用いて、皮下的にワクチン投与した。７日後、これらのマウスおよび ５匹のワクチンを投与されなかったマウスを、１×１０⁶の生の野生種Ｂ１６細 胞を用いて、首において 皮下的に攻撃誘発した。ワクチン投与しなかった群は、９日目（４匹）および１ ２日目に腫瘍を発現し、１３日目、１６日目（３匹）および１８日目まで生存し た。野生種群においては、９日目、１０日目、１２日目（２匹）および１３日目 に腫瘍が発現し、全てのマウスが１８日目まで生存した。ＭＢＰ群においては、 腫瘍の発現が、１０日目（２匹）、１３日目（３匹）、１６日目（２匹）、１８ 日目、２１日目、および２８日目であり、生存は、１７日目、１８日目（４匹） 、２４日目（２匹）、２８日目（２匹）および４０日目までであった。人工オプソニンの製造 実施例９ １つの実施例においては、Genbank K02782のヌクレオチド2304-2324+５'「Ａ ＴＧ」に対応する上流プライマー、および天然の停止コドンを省略したK02782の nt5027-5050に相補的な下流プライマーを用いて、補体Ｃ３のＣ３ｂ断片のアル ファ鎖を、マウス肝臓ｃＤＮＡから、ＲＣＲ（変性６０秒/９４℃、アニーリン グ６０秒/５７℃、エクステンション２.５分/７２℃）によって増幅する。Genba nk X16863のヌクレオチド621-646に対応し、Ｃ３ｂａ'アンチセンスストランド の５'末端に相補的な１２塩基を５'末端に含有する上流プライマー、およびX168 63のヌクレオチド715-735を 相補的であり、適切な制限部位を有する下流エクステンションを組み込んだ下流 プライマーを用いて、ヒトＣＤ１６ＢのＧＰＩ修飾シグナル配列を、ＰＣＲ（変 性６０秒/９４℃、アニーリング６０秒/５７℃、エクステンション４５秒/７２ ℃）によってクローン化する。両産物を、アガロースゲル電気泳動（Ｃ３ｂａ' に関して０.８％アガロース、ＣＤ１６Ｂ ＧＰＩ−msに関して１.２％）によっ て単離し、ガラスビーズを用いて切り出したアガロースバンドから溶離し、吸光 分光分析によって定量する。２つの増幅配列を、オーバーラップＰＣＲ法を用い て、フレーム内に互いに融合させる。要約すると、等モル量の２つの断片を、過 剰量の上流Ｃ３ｂプライマーおよび下流ＣＤ１６Ｂプライマーと共に、ＰＣＲ反 応に使用する（変性６０秒/９４℃、アニーリング９０秒/５０℃、エクステンシ ョン２.７５分/７２℃）。 実施例１０ 他の実施例においては、Genbank S42292のnt124-148に対応する上流プライマ ー、およびS42292のnt814-837に相補的な下流プライマーを用いて、ネズミマン ノース結合蛋白質Ａ遺伝子を、マウス肝臓ｃＤＮＡから増幅する。Genbank U404 34のヌクレオチド1786-1805に対応し、ＭＢＰのアンチセンスストランドの５'末 端に相補的な１２塩基を５'末端に含有する上流プラ イマー、およびU40434のヌクレオチド1961-1986に相補的で、適切な制限部位を 有する下流エクステンションを組み込んだ下流プライマーを用いて、ヒト・メソ セリン（mesothelin)のＧＰＩ修飾シグナル配列を、ＰＣＲ（変性６０秒/９４℃ 、アニーリング６０秒/５７℃、エクステンション４５秒/７２℃）によって、ヒ ト中皮腫（mesothelioma）ｃＤＮＣからクローン化した。両産物を、アガロース ゲル電気泳動（ＭＢＰに関して１％アガロース、メソセリンＧＰＩ−ｍｓに関し て１.２％）によって単離し、ガラスビーズを用いて切り出したアガロースバン ドから溶離し、吸光分光分析によって定量する。２つの増幅配列を、オーバーラ ップＰＣＲ法を用いて、フレーム内に互いに融合させる。要約すると、等モル量 の２つの断片を、過剰量の上流ＭＢＰプライマーおよび下流メソセリンプライマ ーと共に、ＰＣＲ反応に使用する。 実施例１１ 他の実施例においては、Ｃ３ｂのＡＰＣ結合成分を含む膜貫通人工オプソニン を製造する。Genbank K02782のヌクレオチド2304-2324+５'「ＡＴＧ」に対応す る上流プライマー、およびK02782のnt2429-2453に相補的な下流プライマーを用 いて、ネズミ補体Ｃ３のＣ３ｂ断片の部分を、マウス肝臓ｃＤＮＡから、ＰＣＲ によって増幅する。Genbank V01526のヌクレオチド10 0-125に対応し、Ｃ３ｂ断片のアンチセンスストランドの５'末端に相補的な１２ 塩基を５'末端に含有する上流プライマー、およびV001526のヌクレオチド823-84 6に相補的で、下流停止コドンと適切な制限部位を有するエクステンションを組 み込んだ下流プライマーを用いて、マウス牌臓ｃＤＮＡから、マウスＩｇＧ３の 膜貫通領域を増幅する。両産物を、アガロースゲル電気泳動（両方に関して１. ２％アガロース）によって単離し、ガラスビーズを用いて切り出したアガロース バンドから溶離し、吸光分光分析によって定量する。２つの増幅配列を、オーバ ーラップＰＣＲ法を用いて、フレーム内に互いに融合させる。要約すると、等モ ル量の２つの断片を、過剰量の上流Ｃ３ｂプライマーおよび下流ＩｇＧ３プライ マーと共に、ＰＣＲ反応に使用する。 前記産物を、適切な発現ベクター中にクローン化し、必要であれば上流分泌シ グナルを組み込み、適切な細胞、例えば昆虫細胞中に発現させることができる。オプソニン強化細胞の製造のための人工オプソニンの使用 実施例１２ 人工オプソニンをコードする核酸を前記のようにして細胞中に導入することに よって、オプソニン強化細胞を製造することができる。ＧＰＩ結合人工オプソニ ンを使用して、下記手順（McHughらの前記文献）によって、オプソニン強化細胞 を製造することもできる。細胞を適切な緩衝液、例えばＨＢＳＳまたは燐酸緩衝 塩水に、１×１０⁵〜１×１０⁸細胞/ｍＬのオーダーの濃度において懸濁させる 。ＧＰＩ結合オプソニンを１０〜２００μｇ/ｍＬのオーダーで加え、混合物を ３７℃で２時間インキュベートする。使用前に、細胞を緩衝液中で３回洗浄する 。投与量、投与方法、および医薬製剤 本発明は、哺乳動物における選択された抗原に対する免疫応答を調節する方法 を包含し、該方法は、治療量のオプソニン強化細胞を哺乳動物に投与するか、ま たは、治療量の細胞、例えば、オプソニン強化細胞をインターナリゼーションし た抗原提示細胞に単離Ｔリンパ球を接触させることによって、抗原に対してエク スビボで感受性にされたＴリンパ球を投与する、ことを含んで成る方法である。 本明細書に記載される細胞は、溶液または懸濁液のどちらかの注射可能な物質 として製造することができ；感染前に、液状の溶液中または懸濁液中に好適な固 体形態で製造することもできる。製剤を乳化することもでき、または細胞をリポ ソーム封入することもできる。免疫原有効成分が、医薬的に許容されかつ有効成 分と適合性である担体と、混合されることも多い。 「医薬的に許容される担体」という語は、それを投与される対象に、アレルギー 反応を起こさないか、または他の悪い影響を与えない担体を意味する。好適な医 薬的に許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、燐酸緩衝塩水、デキストロ ース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せのうちの、１種ま たはそれ以上を包含する。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤または乳 化剤、ｐＨ緩衝剤、および/またはワクチンの有効性を高めるアジュバントのよ うな補助物質を少量で含有することができる。有効なアジュバントの例は、水酸 化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミ ン（thr-ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグ ルタミン（ＣＧＰ１１６３７、nor−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミ ル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１'−２'−ジ パルミトイル−sn−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン （ＣＯＰ）１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）、および、２％スクアレン /ツィーン８０エマルジョン中のバクテリアから抽出される３成分、モノホスホ リル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩを包含するが、それらに限定されるわけではない。 ア ジュバントの他の例は、ＤＤＡ(ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド) 、フロインド完全および不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡを包含する。さ らに、リンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）のよう な免疫調節剤、またはポリＩ：Ｃのような合成ＩＦＮ−γ誘導剤を、本明細書に 記載のアジュバントと組み合わせて使用することもできる。 本発明の細胞は、例えば、皮下または筋肉内に、注射によって非経口投与する ことができる。他の投与形態に好適な追加的製剤は、坐薬、ある場合には、経口 製剤またはエアゾールとして用いるのに好適な製剤を包含する。経口製剤の場合 には、アジュバントを使用するＴ細胞サブセットの操作、抗原パッケージング、 または個々のサイトカインの種々の製剤への添加は、最適化された免疫応答を有 する向上した経口ワクチンを生じることができる。坐薬に関しては、従来の結合 剤および担体を含むことができ、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリ グリセリドを含むことができ、そのような坐薬は、有効成分を０.５％〜１０％ 、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成することができる。経 口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ス テアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム塩、セ ルロース、炭酸マグネシウムなどの、通常使用される賦形剤を含有する。これら の組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤または散剤の 形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分含有する。 本発明のオプソニン強化細胞は、中性または塩形態のワクチン組成物に製剤化 することができる。医薬的に許容される塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ 基から形成される）を含み、塩酸または燐酸のような無機酸を用いて、または酢 酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキ シル基を用いて形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム 、カルシウム、または水酸化第２鉄（ferric hydroides）のような無機塩基から 、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール 、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から、誘導することもできる。 そのようなワクチン組成物のどのような細胞成分も、このような組成物に含有 するために、ワクチンの細胞の弱毒化または不活性化を含む処置にかけることが でき、そのような処置は、例えば、細胞分裂を阻害することができるイオン化放 射線への曝露、またはシクロホスファミド、サイトカラシンＤ、またはコルヒチ ンのような抗増殖剤、あるいは固定を伴うかまたは伴わ ない死滅を包含する。 オプソニン強化細胞は、投与製剤に適合する方法において、並びに、予防的お よび/または治療的に有効な量において、投与される。投与される量は、治療さ れる対象に依存し、例えば、抗体を合成する対象の免疫系の能力、および所望さ れる保護の程度に依存する。好適な用量範囲は、数百マイクログラム有効成分／ ワクチンのオーダーであり、好ましい範囲は約０.１μｇ〜１０００μｇ、例え ば約１μｇ〜３００μｇ、好ましくは１０μｇ〜５０μｇの範囲である。初期投 与および追加抗原の好適な投与計画も変化しうるが、初期投与、それに引き続く 接種または他の投与を特徴とする。投与に必要とされる有効成分の厳密な量は、 医師の判断に依存し、対象ごとに特定される。本発明のオプソニン強化細胞の治 療的有効量が特に、投与計画、投与される抗原の単位用量、細胞が他の治療剤と の組み合せて投与されるか否か、患者の免疫状態および健康状態、並びに特定の 核酸分子またはオプソニン/抗原複合体の治療的活性に依存することは、当業者 に明らかである。 細胞は、単一投与計画において、好ましくは多投与計画において投与すること ができる。多投与計画は、予防接種の初期過程が１〜１０の分離投与を含み、続 いて、免疫応答を維持または強化するために必要な時 間間隔を開けて他の投与が行われ、例えば第二回目の用量のために１〜４ヶ月開 け、必要であれば数ヶ月後に次の投与が行われる。１〜５年、通常は３年の間隔 を開けた定期的追加免疫は、予防的免疫の所望の水準を維持するのに望ましい。 免疫化過程に続いて、ＥＳＡＴ６またはＳＴ−ＣＦと共に培養される末梢血液リ ンパ球（ＰＢＬ）の生体外増殖アッセイを行うことができ、および感作リンパ球 から放出されるＩＦＮ−γのレベルを測定することができる。アッセイは、ラジ オヌクレオチド、酵素、蛍光標識などの通常の標識を用いて行うことができる。 これらの方法は当業者に既知であり、参照として本明細書に組み込まれる米国特 許第３，７９１，９３２号、第４，１７４，３８４号、および第３，９４９，０ ６４号に開示されている。他の実施態様 前記実施例は、本発明の構成および実施において、本願発明者によって実施さ れ、考案された実験を例示している。これらの実験は、本発明の実施分野を知ら せ、およびその有用性を立証するという両方の役割を果たす技術の開示を含むと 考えられる。本明細書に開示されている技術および実施態様は、一般に多くの同 等の方法および技術を用いて同様の結果が得られるいう点において、単に好まし い具体例に過ぎないということが、当業者に理解されるであろう。 前記に記載されている全ての文献は、前記に記載されている程度に、１つまた はそれ以上の実施態様の実施に重要な組成物および/または方法に対する基礎を 与える程度に、あるいはそれらを可能にする程度に、特に参照として本明細書に 組み込まれている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｙ 39/395 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/10 31/10 31/12 31/12 33/00 33/00 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ， ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＲ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＲ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＴＲ，ＵＡ ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 選択された抗原に対して、哺乳動物にワクチンを接種する方法において、 前記選択された抗原と、オプソニンをコードする核酸とを含み、前記オプソニン をコードする前記核酸を発現させるオプソニン強化細胞を含むワクチン組成物を 哺乳動物に投与することを備える方法。 ２． 選択された抗原に対して、哺乳動物にワクチンを接種する方法において、 前記選択された抗原を含み、外来のオプソニンと混合されたオプソニン強化細胞 を含むワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む方法。 ３． 前記外来オプソニンが人工的に作出されたものである、請求項２に記載の 方法。 ４． 選択された抗原に対して、哺乳動物にワクチンを接種する方法において、 選択された抗原とオプソニンとを含むオプソニン強化細胞に、APCを、インビト ロで、前記APCが前記選択された抗原のインターナリゼーションを行なうのに充 分な時間接触させること、および、このように接触させたAPCを哺乳動物に投与 することを含む方法。 ５． 前記オプソニン強化細胞が、前記選択された抗原と、前記オプソニンをコ ードする核酸とを含む、請 求項４に記載の方法。 ６． 前記オプソニンが、外来性のオプソニンである、請求項４に記載の方法。 ７． 前記オプソニンが、人工的なオプソニンである、請求項４に記載の方法。 ８． 前記オプソニン強化細胞が、実質的に、インビトロで分裂することができ ない、請求項１、２、または４に記載の方法。 ９． 前記ワクチン組成物が弱毒化されている、請求項１および２に記載の方法 。 10． 前記オプソニンが、マンノース結合蛋白質、またはC3bのアルファ鎖であ る、請求項１、２、または４に記載の方法。 11． 前記抗原が、病原性細胞である、請求項１、２、または４に記載の方法。 12． 前記病原性細胞が、悪性腫瘍細胞である、請求項11に記載の方法。 13． 選択された抗原と、オプソニンをコードする組換え核酸とを含む病原性細 胞において、前記細胞が、コードされたオプソニンを発現し、前記オプソニンが 、フィブロネクチン、補体成分C1q、C1qA鎖、C1qB鎖、C1qC鎖、補体断片C3b、C3 bi、C3d、C3dg、およびC4b、マンノース結合蛋白質、コングルチニン、界面活性 蛋白質AおよびD、アルファ-2-マクログロブリン、およ び免疫グロブリン、および人工的なオプソニンからなるグループより選択される 病原性細胞。 14． 前記細胞が悪性腫瘍細胞である、請求項13に記載の病原性細胞。 15． 前記細胞が、病原性細菌、病原性真菌、病原性ウイルス、病原性寄生生物 の細胞からなるグループより選択される、請求項13に記載の病原性細胞。 16． オプソニンをコードする組換え核酸と、抗原をコードする組換え核酸とを 含み、発現する宿主細胞。 17． 前記細胞が、核をもつ真核生物か、または原核生物である、請求項16に記 載の宿主細胞。 18． 前記細胞が、線維芽細胞か、またはケラチノサイトである、請求項17に記 載の宿主細胞。 19． 人工オプソニンと混合された細胞を含む組成物。 20． オプソニンと混合された細胞を含む組成物において、前記細胞が、実質的 に、インビトロで分裂できない組成物。 21． 前記細胞が病原性細胞である、請求項19または20に記載の組成物。 22． 先天性のオプソニンと混合された、異種抗原を含む細胞を含む組成物にお いて、前記細胞が、実質的に、インビトロで分裂できない組成物。 23． 外来の人工オプソニンと混合された、異種抗原を含む細胞を含む組成物。 24． 前記細胞が哺乳動物宿主の中で分裂することができない、請求項23に記載 の組成物。 25． 細胞とオプソニンとから、本質的になる組成物において、細胞が、実質的 に、インビトロで分裂できない組成物。 26． さらに、生理学的に適合性のある緩衝液を含む、請求項25に記載の組成物 。 27． さらに、サイトカインを含む、請求項19、20、22、23、または25に記載の 組成物。 28． 前記組成物は、実質的に培養培地を含まない、請求項19、20、22、23、ま たは25に記載の組成物。 29． 前記サイトカインが、前記細胞によって発現される、請求項27に記載の組 成物。 30． オプソニン強化細胞と薬学的に許容される担体とを含むワクチン組成物。 31． 天然のオプソニンのAPC結合部分と、細胞表面に結合する異種性部分とを 含む、人工オプソニンをコードする核酸。 32． 前記核酸が、GPI修飾シグナル配列をコードしている、請求項31に記載の 核酸。 33． 前記人工オプソニンが、膜貫通配列を含む、請求項31に記載の核酸。 34． 天然のオプソニンのAPC結合部分と、細胞表面に結合する異種性部分とを 含む、人工オプソニン。 35． 細胞表面に結合する前記異種性部分が脂質を含む、請求項34の人工オプソ ニン。 36． 前記異種性部分がGPI部分を含む、請求項34に記載の人工オプソニン。 37． 前記異種性部分が膜貫通ドメインを含む、請求項34の人工オプソニン。