MX2013000667A - Metodo para identificar pacientes con probabilidad incrementada de responder a una terapia anticancer. - Google Patents

Metodo para identificar pacientes con probabilidad incrementada de responder a una terapia anticancer.

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Abstract

La invención provee métodos para identificar pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con una terapia anticáncer que comprende un antagonista de VEGF. La invención también provee métodos para monitorear la respuesta del paciente a la terapia anticáncer. La invención también provee kits y artículos de manufactura para uso en los métodos.

Description

MÉTODO PARA IDENTIFICAR PACIENTES CON PROBABILIDAD INCREMENTADA DE RESPONDER A UNA TERAPIA ANTICÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con métodos para identificar cuales pacientes se beneficiaran en su mayoría del tratamiento con agentes anti-cáncer y el monitoreo de pacientes en cuanto a su sensibilidad y responsividad al tratamiento con agentes anti-cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es una de las amenazas más mortales a la salud humana. En los Estados Unidos de América solamente, el cáncer afecta a casi 1.3 millones de nuevos pacientes cada año y es la segunda causa principal de muerta después de enfermedad cardiovascular, contando aproximadamente uno de cuatro muertes. Los tumores sólidos son responsables por la mayoría de aquellas muertas. Aunque ha habido avances significativos en el tratamiento médico de ciertos canceres, la proporción de supervivencia global de 5 años para todos los canceres ha mejorado solo por alrededor del 10% en los pasados 20 años. Los canceres o tumores malignos se metastasizan y crecen rápidamente de manera incontrolada, haciendo la detección oportuna y el tratamiento extremadamente difíciles.
Dependiendo del tipo de cáncer, los pacientes comúnmente tienen varias opciones de tratamiento disponibles a ellos incluyendo quimioterapia, radiación y fármacos a base de anticuerpo. Métodos de diagnóstico útiles para producir el resultado clínico de los diferentes regímenes de tratamiento seria beneficiaría excelsamente el manejo clínico de estos pacientes.
Así, hay necesidad de medios más efectivos para determinar cuáles pacientes responderán a cual tratamiento y para incorporar tales determinaciones a regímenes de tratamiento más efectivos para pacientes con terapias anti-cáncer, ya sea usados como agentes individuales o combinados con otros agentes .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para identificar pacientes que responderán al tratamiento con agentes anti-cáncer, por ejemplo antagonistas de VEGF-A tales, como por ejemplo bevacizumab.
Una modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGFm en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGFm en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) , cáncer pancreático (incluyendo por ejemplo, cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de VEGF1:L1 es un nivel de proteína. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGFm es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGFm . En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGFm que está en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente. En algunas . modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la responsividad de un paciente que sufre de cáncer a tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGFm en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGFm en la muestra obtenida del paciente o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente es más probable de ser responsivo al tratamiento con la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) , cáncer pancreático (incluyendo por ejemplo, cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel dé proteína de VEGFm es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGFm. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGFm que está en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficios de la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGFm en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGFm en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) , cáncer pancreático (incluyendo por ejemplo, cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel proteína de VEGFm es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGFm. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGFm que está en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia . anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, Un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anticáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente. En . algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Aun otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGFm en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGFm en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) , cáncer pancreático (incluyendo por ejemplo, cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGFm es determinado al medir en nivel de proteína en el plasma de VEGFm. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGFnx que está en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del- grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quitnioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente. En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de - pecho HER-2 negativo metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades/ el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para tratamiento de cáncer un paciente, los métodos comprende determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) de VEGFm y administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente mediante lo cual el cáncer es tratado. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) , cáncer pancreático (incluyendo por ejemplo, cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteína VEGFm es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGFm. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGFm que está en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéu ico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente . En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente. En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab . En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático), la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia , anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Otra modalidad de la invención provee kits para determinar si un paciente se puede beneficiar, del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los kits comprenden un conjunto de compuestos aptos de enlazarse específicamente a VEGFm para determinar el nivel de este biomarcador para predecir la responsividad de un paciente a tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, en donde un nivel incrementado de VEGFm en comparación con el nivel de VEGFm en una muestra de referencia en o por encima de un nivel de referencia predeterminado, indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A. En algunas modalidades, los compuestos son proteínas. En algunas modalidades, las proteínas son anticuerpos.
Una modalidad adicional de la invención provee un conjunto de compuestos para detectar el nivel de VEGFm, el conjunto comprende por lo menos un compuesto apto de enlazarse específicamente VEGFm · Preferiblemente, el conjunto de ¦ compuestos es usado para predecir la responsividad de un paciente a tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A. En algunas modalidades, los compuestos son proteínas. En algunas modalidades, las proteínas son anticuerpos.
Estas y otras modalidades son descritas adicionalmente por la descripción detallada que sigue .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Curva de Kaplan Meier para la Supervivencia Libre de Avance para la población de biomarcador global para la terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o HER-2 negativo metastático. La línea discontinua corta representa placebo más docetaxel. La línea continua representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua larga representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel.
Figura 2: Gráfica de Forest de la proporción de peligro de supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente por biomarcador (Placebo más Baja Dosis de Bevacizumab) , un análisis dicotomizado para terapia de bevacizumab (baja dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático.
Figura 3 : Gráfica de Forest de la proporción de peligro de supervivencia libre de avance antes del inicio de. la terapia anti-neoplásica subsecuente por biomarcador (Placebo y Alta Dosis de Bevacizumab), un análisis dicotomizado, para terapia de bevacizumab (alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo . metastático .
Figura 4 (que comprende las figuras 4A Y 4B) : Curva de Kaplan Meier para la Supervivencia Libre de Avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente para terapia de bajo nivel de expresión (<125 pg/ml) de VEGF-A (Figura 4A) y alto nivel de expresión (= 125 pg/ml) de VEGF-A, (Figura 4B) para bevacizumab (baja o alta dosis) , mas docetaxel versus terapia placebo más docetaxel para, pacientes que son tratados por cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático. Las líneas discontinuas cortas representan placebo más docetaxel. La línea discontinua representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua larga representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel.
Figura 5 (que comprende las figuras 5A y 5B) : Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente para la terapia de bajo nivel de expresión (< 11 pg/ml) de VEGF-A (Figura 5A) y alto nivel de expresión (= 11 pg/ml) de VEGF-A, (Figura 5B) para bevacizumab (baja o alta dosis), mas docetaxel versus terapia placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático. Las líneas discontinuas cortas representan placebo más docetaxel. La línea discontinua representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua larga representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel.
Figura 6: Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente para la terapia de bajo nivel de expresión combinado (Formula 1 < 0.132) y alto nivel de expresión combinado (Formula 1 = 0.132) de VEGF-A y VEGFR2 para bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático. La linea continua representa placebo más docetaxel. La linea discontinua larga representa bajá dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel. La línea discontinua corta representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel .
Figura 7 : Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente para la terapia de bajo nivel de expresión combinado (Formula 2 < -0.132) y alto nivel de expresión combinado (Formula 2 = -0.132) de VEGF-A y PLGF para bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático. La línea continua representa placebo más docetaxel. La línea discontinua larga representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua corta representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel .
Figura 8: SEQ ID NO: 1, Secuencia de aminoácidos ejemplar de VEGF-A.
Figura 9: SEQ ID NO: 2, Secuencia de aminoácidos ejemplar de VEGFR2.
Figura 10: SEQ ID NO: 3, Secuencia de aminoácidos ejemplar de PLGF.
Figura 11 : Se muestran los conteos medidos cuando concentraciones incrementados de VEGFm, VEGF121 , VEGF165 y VEGF189, respectivamente, fueron medidos sobre un chip IMPACT .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I . Introducción La invención provee métodos para identificar pacientes que tienen probabilidad incrementada de responder una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF.
II. Definiciones En ciertas modalidades, el término "incremento" se refiere a un nivel que incluye el nivel de referencia o nivel de corte o a un incremento global de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en nivel de VEGF11 detectado por los métodos descritos en la presente en comparación con el nivel de VEGFm de una muestra de referencia.
En ciertas modalidades, el término "disminución" en la presente se refiere a un nivel debajo del nivel de referencia o valor de corte o a una" reducción global de 5%, 10%, 20%/ 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en el nivel de VEGFm detectado por los métodos descritos en la presente, en comparación con el nivel de VEGFm de una muestra de referencia. En ciertas modalidades, el termino disminuir se refiere a la disminución en el nivel de VEGF111, en donde el nivel disminuido es a lo más alrededor de 0.9-,-, 0.8-, 0.7-, 0.6-, 0.5-, 0.4-, 0.3-, 0.2-, 0.1-, 0.05- o 0.01- veces menor en comparación con el nivel de VEGF111 de la muestra de referencia.
En ciertas modalidades, el término "á un nivel de referencia" se refiere al nivel de VEGFm que es el mismo como el nivel de VEGFm, detectado por los métodos descritos en la presente, de una muestra de referencia.
En ciertas modalidades, el término "nivel de referencia" en la presente se refiere a un valor predeterminado. Como el experimentado en el arte apreciara, el nivel de referencia es predeterminado y establecido para satisfacer los requerimientos en términos de, por ejemplo especificidad y/o sensibilidad. Estos requerimientos pueden variar, por ejemplo de un cuerpo regulatorio a otro cuerpo regulatorio . Puede por ejemplo ser que la sensibilidad o especificidad de análisis, respectivamente, tenga que ser establecida a ciertos límites, por ejemplo 80%, 90% o 95%. Estos requerimientos pueden también ser definidos en términos de valores predictivos positivos y negativos. No obstante, en base a las enseñanzas dadas en la presente invención, siempre será posible llegar al nivel de referencia que satisface aquellos requerimientos. En una modalidad, el nivel de referencia es determinado en individuos saludables. El valor de referencia en una modalidad ha sido predeterminado en la entidad de enfermedad a la cual el paciente pertenece. En ciertas modalidades, el nivel de referencia puede por ejemplo ser establecido a cualquier porcentaje entre 25% y 75% de la distribución global de los valores en una entidad de enfermedad investigada. En otras modalidades, el nivel de referencia puede por ejemplo ser establecido a la mediana, terciles o cuartiles, tal como es determinado de la distribución global de los valores en una entidad de enfermedad investigada. En una modalidad) el nivel de referencia es establecido al valor mediano tal como se determina de la distribución global de los valores en una entidad de una enfermedad investigada. En el contexto de la presente invención, "VEGF-A" , "VEGFA" o "VEGF" se refiere a proteína A de factor de crecimiento endotelial vascular ejemplificada por SEQ ID NO: 1, mostrando en la Figura 8 (Swiss Prot Accession Number P15692, Gene ID (NCBI) : 7422) . EL término "VEGFA" abarca la proteína que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 también como homólogos e isoformas de los mismos. El término "VEGF-A" también abarcar las isoformas conocidas, por ejemplo isoformas de empalme de VEGF-A, por ejemplo, VEGF121, VEGF145 , VEGF165, VEGF189 y VEGF206 , junto con las formas alélicas que se presentan en la naturaleza y formas procesadas de las mismas, incluyendo el factor de crecimiento celular endotelial humano de 110 aminoácidos generados mediante la escisión por plasmina de VEGF165 como se describe en Ferrara, N. , Mol. Biol. Cell 21 (2010) 687-690 y Leung, D.W. et al., Science 246 (1989) 1306-1309 y Houck, K.A. et al., Mol. Endocrin. 5 (1991) 1806-1814. En el contexto de la invención, el término "VEGF-A" también abarca variantes y/u homólogos de los mismos, también como fragmentos VEGF-A, a condición de que las proteínas variantes (incluyendo isoformas) , proteínas homologas y/o fragmentos sean reconocidos por uno o más anticuerpos específicos de VEGF-A, tal como el clon de anticuerpo 3C5 y 26503, que están disponibles de Bender Relia Tech and R&D Systems, respectivamente. En el contexto de la invención, el término "isoforma" de VEGF, VEGFA o VEGF-A se refiere tanto a isoformas de empalme como a formas generadas mediante escisión enzimática (por ejemplo, plasmina) .
En el contexto de la presente invención, "VEGFR2" se refiere al receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular, ejemplificado por SEQ ID No: 2, mostrado en la Figura 9 (Swiss Prot Accession Number P35968, Gene ID (NCBI) : 3791) . EL término "VEGFR2" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, también como homólogos e isoformas de la misma. En el contexto de la invención, el término "VEGFR2" también abarca proteínas que tienen por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de homología a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o con la secuencia de aminoácidos de las variantes y/u homólogos de los mismos, también como fragmentos de las secuencias, a condición de que las proteínas variantes (incluyendo isoformas) , proteínas homologas y/o fragmentos sean reconocidos por uno o más anticuerpos específicos de VEGFR2, tal como el clon de anticuerpo 89115 y 89109, que están disponibles de R&D Systems.
En el contexto de la presente invención, "PLGF" se refiere a factor de crecimiento placental ejemplificado por SEQ ID NO: 3, mostrado en la Figura 10 (Swiss Prot Accession Number P49763, Gene ID (NCBI): 5228). El término "PLGF" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, también como homólogos e isoformas de la misma. En el contexto de la invención, el término "PLGF" también abarca proteínas que tienen por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de homología a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o las secuencias de aminoácidos de las variantes y/u homólogos de la misma, también como fragmentos de la secuencia a condición de que las variantes de proteínas (incluyendo isoformas) proteínas homologas y/o fragmentos sean reconocidos por uno o más anticuerpos específicos de PLGF, tales como el clon de anticuerpo 2D6D5 y 6A11D2, que están disponibles de Roche Diagnostics GmbH.
El término "VEGF" también se refiere a VEGF de especies no humanas tales como ratón, rata o primates. Algunas veces, el VEGF de una especie especifica son indicados por términos tales como hVEGF para VEGF humanos, mVEGF para VEGF murino, etc. El término "VEGF" es también usado para referirse a formas truncadas del polipéptido que comprende los aminoácidos 8 a 109 o l a 109 del factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 165 aminoácidos. La referencia a cualesquiera de tales formas de VEGF puede ser identificada en la presente solicitud, por ejemplo por "VEGF" (8-109)," "VEGF (1-109)" o "VEGFi65. " Las posiciones de amino acido para un VEGF natural "truncado" son numeradas como se indica en la secuencia de VEGF natural. Por ejemplo, la posición de aminoácidos 17 (metionina) en- VEGF natural truncado es también la posición 17 (metionina) en VEGF natural. El VEGF natural truncado tiene afinidad de enlace por los receptores de KDR y Flt-1 comparable a VEGF natural. De acuerdo con una modalidad preferida, el VEGF es un VEGF humano .
"Actividad biológica de VEGF" incluye enlace a cualquier receptor de VEGF o cualquier actividad de señalización de VEGF tal como regulación tanto de la angiogénesis y vasculogenésis normal como anormal (Ferrara, N. and Davis-Smyth, T. , Endocrine Rev. 18 (1997) 4-25; Ferrara, N. , J. Mol. Med. 77 (1999) 527-543); promover la vasculogenésis embriónica y angiogénesis (Carmeliet, P. et al., Nature 380 (1996) 435-439; Ferrara, N. et al., Nature 380 (1996) 439-442) y modular la proliferación de vasos sanguíneos cíclico en el sistema reproductor femenino y para crecimiento de hueso y formación de cartílago (Ferrara, N. et al., Nature Med. 4 (1998) 336-340; Gerber, H.P. et al., Nature Med. 5 (1999) 623-628) . Además de ser un factor angiogénico en angiogénesis y vasculogenésis, VEGF es un factor de crecimiento pleiotropico, exhibe múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, tales como supervivencia de célula endotelial, permeabilidad de vaso y vasodilatación, quimiotaxis de monocito y afluencia de calcio (Ferrara and Davis-Smyth (1997), supra y Cebe-Suarez, S. et al., Cell. Mol. Life Sci. 63 (2006) 601-615) . Además, estudios recientes han reportado efectos mitogénicos de VEGF sobre unos pocos tipos de células no endoteliales , tales como células epiteliales de pigmento retinal, células de conducto pancreático y células de Scwann (Guerrin, M. et al., J. Cell Physiol. 164 (1995) 385-394; Oberg- elsh, C. et al., Mol.
Cell. Endocrinol. 126 (1997) 125-132; Sondell,. M. et al., J. Neurosci. 19 (1999) 5731-5740).
Un "antagonista de VEGF" o "antagonista VEGF-especifico" se refiere a una molécula apta de enlace a VEGF, reducir los niveles de expresión de VEGF o neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades biológicas de VEGF incluyendo pero no limitado a enlace de VEGF a uno o más receptores de VEGF y angiogénesis VEGF moderada y supervivencia o proliferación de célula endotelial. Incluidos como antagonistas VEGF-específicos útiles en los métodos de la invención están polipéptidos que se enlazan específicamente a VEGF, polipéptidos que se enlazan específicamente a receptores de VEGF, anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos. Moléculas receptoras y derivados que se . enlazan específicamente a VEGF, secuestrando mediante esto su enlace a uno o más receptores, proteínas de fusión (por ejemplo, VEGF-Trap (Regeneron) ) y VEGFi2i-gelonina (Peregrina) . Los antagonistas VEGF-específicos también incluyen variantes antagonistas de polipéptido de VEGF, olígomeros de nucleobase anti sentido dirigidos a VEGF, moléculas de ARN pequeñas dirigidas a VEGF, aptamero de ARN, pepticuerpos y ribozimas contra VEGF, ácidos nucleicos que se hibridizan bajo condiciones severas a secuencias de ácido nucleico que codifican VEGF o receptor de VEGF (por ejemplo, ARNi) , inmunoadhesinas, anticuerpos de receptor anti-VEGF y antagonistas de receptor de VEGF, tales como inhibidores de molécula pequeña de cinasas de tirosina de VEGFR. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF e inhibe la proliferación celular endotelial VEGF-inducida in vitro. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF o un receptor de VEGF con mayor afinidad que un receptor sin VEGF o sin VEGF. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF o un receptor de VEGF con un Kd de entre 1 µ? a 1 pM. De acuerdo con otra modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF o un receptor de VEGF entre 500 n y 1 pM. Antagonistas VEGF-especificos también incluyen moléculas pequeñas sin péptido que se enlazan a VEGF y que son aptos de bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades biológicas de VEGF. Así, el término "actividades de VEGF" incluye específicamente actividades biológicas moderadas por VEGF de VEGF. En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF reduce o inhibe, por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, el nivel de expresión o actividad biológica de VEGF.
De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF es seleccionado de un polipéptido tal como un anticuerpo, un pepticuerpo, una inmunoadhesina, una molécula pequeña o un aptamero. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGF tal como bevacizuraab (AVASTIN®) o un anticuerpo receptor anti-VEGF tal como un anticuerpo anti-VEGFR2 o anti-VEGFR3. Otros ejemplos de antagonistas de VEGF incluyen: VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (sorafenib) , ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, G -786034, RWJ-417975/CT6758 y KRN-633.
Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se enlaza a VEGF con suficiente afinidad y especificidad. En ciertas modalidades, el anticuerpo seleccionado tendrá normalmente una afinidad de enlace suficiente por VEGF, por ejemplo el anticuerpo se puede enlazar a hVEGF con un valor de Kd de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades de anticuerpo pueden ser determinadas mediante un análisis a base de resonancia de plasmón superficial (tal como el análisis de BIAcore como se describe en la Publicación de Solicitud PCT No. WO2005/012359) ; análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) y análisis de competencia (por ejemplo, RIA) ,por ejemplo. Preferiblemente, el anticuerpo anti-VEGF de la invención puede ser usado como agente terapéutico en el apuntamiento e interferencia con enfermedades o condiciones en donde la actividad de VEGF está involucrada. Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no se . enlazara a otros homólogos de VEGF, tal como VEGF-B o VEGF-C, ni otros factores de crecimiento tales como P1GF, PDGF o bFGF. Un anticuerpo anti-VEGF preferido es un anticuerpo monoclonal que se enlaza al mismo epítope como el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. Mas preferiblemente, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta, L.G. et al., Cáncer Res. 57 (1997) 4593-4599, incluyendo pero no anticuerpo limitado al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; Avastin®) . De acuerdo con otra modalidad, los anticuerpos anti-VEGF que pueden ser usados incluyen pero no están limitados a los anticuerpos revelados en WO 2005/012359. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF comprende la región pesada variable y ligera variable de cualquiera de los anticuerpos revelados en las Figuras 24, 25, 26, 27 y 29 de WO 2005/012359 (por ejemplo, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 y B20.4.1). En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-VEGF conocido como ranibizumab es el antagonista de VEGF administrado para enfermedad ocular tal como neuropatía diabética y AMD.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF puede ser usado como agente terapéutico en el apuntamiento e interferencia con enfermedades o condiciones en donde la actividad de VEGF está involucrada. También, el anticuerpo puede ser sometido a otros análisis de actividad biológica, por ejemplo con el fin de evaluar su efectividad como agente terapéutico. Tales análisis son conocidos en el arte y dependen del antígeno testigo y uso propuesto para el anticuerpo. Ejemplos incluyen el análisis de inhibición HUVEC; análisis de inhibición de crecimiento de célula de tumor (como se describe en WO 89/06692, por ejemplo); citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente (ACC) y análisis de citotoxicidad complemento-moderada (CDC) (Patente Estadounidense 5,500,362) y actividad agonista o análisis de hematopoyesis (véase WO 95/27062) . Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no se enlazara a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C y otros factores de crecimiento tales como P1GF, PDGF o bFGF. En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo . monoclonal que se enlaza al mismo epitope como el anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. En otra modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta, L.G. et al., Cáncer Res. 57 (1997) 4593-4599, incluyendo pero no limitado al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; AVASTIN®) .
El anticuerpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV) " también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®" es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta, L.G. et al., Cáncer Res. 57 (1997) 4593-4599. Comprende regiones de estructura de IgGl humana mutada y regiones determinantes dé complementariedad de enlace de antígeno del anticuerpo monoclonal anti-VEGF murino A.4.6.1 que bloquea el enlace de VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente el 93% de la secuencia de aminoácidos de bevacizumab incluyendo la mayor parte de las regiones de estructura fue derivada de IgGl humana y alrededor de 7% de la secuencia es derivada del anticuerpo murino A4.6.1. Bevacizumab tiene una masa muscular de alrededor de 149,000 Dalton y es glicosilado. Bevacizumab y otros anticuerpos anti-VEGF humanizados son descritos adicionalmente en la Patente Estadounidense 6,884,879 y WO 2005/044853.
El anticuerpo anti-VEGF Ranibizumab o el anticuerpo de LUCENTIS® o rhuFab V2 es un fragmento de Fab de VEGF antihumano madurado por afinidad humanizado. Ranibizumab es producido mediante métodos de tecnología recombinante estándar en el vector de expresión de Escherichia coli y fermentación bacteriana. Ranibizumab no es glicosilado y tiene una masa molecular de -48,000 Dalton (véase, WO 98/45331 y Patente Estadounidense 2003/0190317) .
Los dos receptores de VEGF mejor caracterizados son VEGFRl (también conocido como Flt-1) y VEGFR2 (también conocido como KDR y FLK-1 por el homologo murino) . La especificidad de cada receptor por cada miembro de la familia de VEGF varia pero VEGF-A se enlaza tanto a Flt-1 como KDR. El receptor de Flt-1 de plena longitud incluye un dominio extra celular que tiene siete dominios Ig, un dominio de transmembrana y un dominio intracelular con actividad de cinasa de tirosina. El dominio extracelular está involucrado en el enlace de VEGF y el dominio intracelular está involucrado en la transducción de señal .
Moléculas de receptor de VEGF o fragmentos de las mimas , que se enlazan específicamente a VEGF pueden ser usados como inhibidores de VEGF que se enlazan a y secuestran la proteína de VEGF, impidiendo mediante esto su señalización. En ciertas modalidades, la molécula de receptor de VEGF o fragmentos de enlace de VEGF del mismo es una forma soluble, tal como Flt-1. Una forma soluble del receptor ejerce un efecto inhibidor sobre la actividad biológica de la proteína de VEGF mediante enlace a VEGF, impidiendo mediante esto su enlace a sus receptores naturales presentes sobre la superficie de células objetivo. También incluidas están proteínas de fusión de receptor de VEGF, ejemplos de los cuales son descritos posteriormente en la presente.
Una proteína ¦ de receptor de VEGF quimérica es una molécula receptora que tiene secuencias de aminoácido derivadas de por lo menos dos proteínas diferentes, por lo menos una de las cuales es una proteína de receptor de VEGF (por ejemplo, el receptor Flt-1 o KDR) , que es apto de enlazarse a e inhibir la actividad biológica de VEGF. En ciertas modalidades, las proteínas de receptor de VEGF quimérico de la presente invención consisten de secuencias de aminoácidos derivadas de solamente dos moléculas de receptor de VEGF diferentes; sin embargo, secuencias de aminoácidos que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o todos los siete dominios semejantes a Ig de la región de enlace de ligando extracelular del receptor de Flt-1 y/o KDR pueden ser enlazadas a secuencias de aminoácidos de otras proteínas no relacionadas, por ejemplo secuencias de inmunoglobulina . Otras secuencias de aminoácidos a las cuales los dominios semejantes a Ig son combinados serán fácilmente evidentes para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Ejemplos de proteínas de receptor de VEGF quiméricas incluyen pero no están limitadas a Flt-l/Fc, KDR/Fe o Flt-l/KDR/Fc (también conocido como Trampa de VEGF) (véase, por ejemplo Publicación de Solicitud PCT No. WO 97/44453) .
Una proteína de receptor de VEGF soluble o proteína de receptor de VEGF quiméricas incluyen proteínas de receptor de VEGF que no se fijan a la superficie de células via un dominio de transmembrana. Como tal, las formas solubles del receptor de VEGF, incluyendo proteínas de receptor quiméricas en tanto que son aptas de enlace ha y de desactivar VEGF, no comprende un dominio de transmembrana y así en general no se asocian con la membrana celular de células en las cuales la molecular es expresada.
Inhibidores de VEGF adicionales son descritos, en por ejemplo O 99/24440, Solicitud Internacional de PCT PCT/IB99/00797, en WO 95/21613, WO .99/61422, Patente Estadounidense 6,534,524, Patente Estadounidense 5,834,504, WO 98/50356, Patente Estadounidense 5,883,113, Patente Estadounidense 5,886,020, Patente Estadounidense 5,792,783, Patente Estadounidense 6,653,308, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755 y WO 98/02437, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
El término "polipéptido series B20", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido, incluyendo un anticuerpo que se enlaza a VEGF. Los polipéptidos series B20 incluyen pero no están limitados a anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo B20 o un anticuerpo B20-derivado descrito en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación de Patente Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación de Patente Estadounidense 2007/0020267, el contenido de estas solicitudes de patente es incorporado expresamente en la presente por referencia. En una modalidad, el polipéptido serie B20 es B20-4.1 cómo- se describe en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación de Patente Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación de Patente Estadounidense 2007/0020267. En otra modalidad, el polipéptido serie B20 es B20-4.1 descrito en la Publicación de Patente Estadounidense 60/991,302, toda la revelación de la cual es incorporada expresamente en la presente por referencia.
El término "polipéptido serie G6" como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido incluyendo un anticuerpo que se enlaza a VEGF. Los polipéptidos serie G6 incluyen pero no están limitados a anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo G6 o un anticuerpo G6-derivado descrito en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación de Patente Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación de Patente Estadounidense 2007/0020267. Polipéptidos series G6 , como se describen en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación de Patente Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación de Patente Estadounidense 2007/0020267 incluyen, pero no están limitados a G6-8, G6-23 y G6-31.
Una "respuesta efectiva" de un paciente o una "responsividad" o "sensibilidad" del paciente al tratamiento con un agente anti-cáncer se refiere al beneficio clínico o terapéutico impartido a un paciente en riesgo de o que sufre de cáncer de o como resultado del tratamiento con un agente anti-cáncer, tal como por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF-A. Tal beneficio incluye respuestas celulares o biológicas, una respuesta completa, una respuesta parcial, una enfermedad estable (sin avance o recaída) o una respuesta con una recaída más tarde paciente de o como resultado del tratamiento con el antagonista. Por ejemplo, una respuesta efectiva puede ser tamaño de tumor reducido, supervivencia libre de avance o supervivencia global.
"Antagonistas" como se usa en la presente se refiere a compuestos o agentes que inhiben o reducen la actividad biológica de la molécula a la cual se enlazan. Los antagonistas incluyen anticuerpos, péptidos sintéticos o péptidos de secuencia natural, inmunoadhesina y antagonistas de molécula pequeña que se enlazan a VEGF, opcionalmente conjugados con o fusionados a otra molécula. Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es un o que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se enlaza.
Un "anticuerpo agonista" como se usa en la presente, es un anticuerpo que imita parcial o plenamente por lo menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.
El término "anticuerpo" en la presente es usado en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos bis específicos) , formados de por lo menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada.
En ciertas modalidades, un anticuerpo usado como un antagonista de VEGF en un método provisto en la presente es un anticuerpo multiespecíficos, por ejemplo un anticuerpo bis específico. Anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de enlace por al menos dos sitios diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de enlace es por VEGF y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos bis específicos se pueden enlazar a dos epítopes diferentes de VEGF. Anticuerpos bis específicos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expresan VEGF. Anticuerpos bis específicos pueden ser preparados como, anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo.
Técnicas para fabricación de anticuerpos multiespecíficos incluyen pero no están limitadas a co-expresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véase, Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540; WO 93/08829; and Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659) y diseño de "perilla en agujero" (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 5,731,168). Anticuerpos multiespecíficos pueden también ser fabricados al diseñar efectos de direccionamiento electrostático para fabricar moléculas de Fc-heterodimericas de anticuerpo (WO 2009/089004) ; gesticulación de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, Patente Estadounidense 4,676,980 y Brennan, M. et al . , Science 229 (1985) 81-83); utilizando cremallera de leucina para producir anticuerpos bis específicos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; utilizando tecnología de "diacuerpo" para fabricar fragmentos de anticuerpo bis específicos (véase, por ejemplo Holliger, P. et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448) y uso de dímeros de Fv (sFv) de una sola 'cadena (véase, por ejemplo Gruber, M et 'al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374) y preparación de anticuerpo tris específicos como se describe por ejemplo en Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
Los anticuerpos diseñados con tres o más sitios de enlace de antígeno funcionales incluyendo "anticuerpos pulpo" son también incluidos en la presente (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 2006/0025576) .
El anticuerpo o fragmento en la presente también incluye un "Fab de acción doble" o "DAF" que comprende un sitio de enlace de antígeno que se enlaza a VEGF, también como otro antígeno diferente (véase, Patente Estadounidense 2008/0069820, por ejemplo) .
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo usado como antagonista de VEGF en un método provisto en la presente también incluye anticuerpos multiespecíficos como se describe en O 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y O 2010/145793. Ejemplos de anticuerpos de VEGF bis específicos son descritos por ejemplo en WO 2010/040508 (VEGF-ANG2 ) , PCT/EP2011/054504 (VEGF-A G2) , WO 2005/087812 (VEGF-PDGF) , WO 2009120922 (VEGF-PDGFR beta), WO 2011/039370 (VEGF-DII4).
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural . Componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de investigación, diagnostico o terapéutico para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros grupos proteinaceos o no proteinaceos . En algunas modalidades, un anticuerpo es purificado (1) a mayor de 95% en peso del anticuerpo tal como se determina por ejemplo mediante el método Lowry y en algunas modalidades, a mayor de 99% en peso; (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácido N-terminal o interna mediante el uso por ejemplo de un secuenciador de copa de centrifugación o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando por ejemplo azul de Coomassie o teñido de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes puesto que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no está presente. Ordinariamente/ sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado mediante por lo menos una etapa de purificación.
"Anticuerpos naturales" son usualraente glicoproteínas heterotetramericas de alrededor de 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera esta enlazada a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlace de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y cadena ligera también tiene puentes de disulfuro de intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tienen un extremo variable (VH) seguido por un número de dominios constante. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera es alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera es alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interface entre los dominios de cadena ligera y cadena pesada.
La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede ser denominado como "VH" . El dominio variable de la cadena ligera puede ser denominado como "VL" . Estos dominios son en general las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de enlace antígeno.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los. dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son usadas en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida igualmente en todos los dominios variables de anticuerpos. Está concentrada entre segmentos . llamados regiones hipervariables (HVR) tanto en los dominios variables de cadena ligera como en los dominios variables de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables son llamadas las variables de estructura (FR) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras naturales cada una comprende cuatro regiones de FR, que adoptan extensamente una configuración de hoja beta, unidas mediante tres HVR, que forman bucles que unen y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja beta. Las HVR en cada dominio son mantenidas conjuntamente en proximidad estrecha por las regiones de FR y con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación de sitio del enlace de antígeno de anticuerpos (véase, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en toxicidad celular anticuerpo-dependiente.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa ( ) y lambda (?) , en base a la secuencia de aminoácido de su dominio constante .
Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden ser asignados a clases diferentes. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM y varias de estas pueden ser divididas adicionalmente en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3; IgG4í IgAi e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamados , d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulina son bien conocidas y descritas en general, por ejemplo Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed., W.B. Saunders, Co. (2000) . Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada . mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos.
Los términos "anticuerpos de plena longitud" , "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" son usados intercambiablemente en la presente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no fragmentos de anticuerpo como se definen posteriormente en la presente. Los términos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región de Fe.
Un "anticuerpo descubierto" para los propósitos de la presente es un anticuerpo que no está conjugado a una porción citotóxica o radio marcador.
"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente las regiones de enlace de antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab' )2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo.
La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" cada uno con un solo sitio de enlace de antígeno y un fragmento de "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento de pepsina produce un fragmento de F(ab' )2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es apto de gesticulación de antígeno.
«Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace de antígeno completo. En una modalidad, una especie de Fv de dos cadenas consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera en fuerte asociación no covalente. En una especie de Fv de una sola cadena (scFv) , un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena aligera pueden ser enlazados covalentemente mediante un enlazador de péptido flexible, de tal manera que las cadenas ligeras y pesadas se pueden asociar en una estructura "dimerica" análoga a aquella en una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres HVR de cada . dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de .antígeno sobre la superficie del dinero de VH-VL.. Colectivamente, las seis HVR confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aun un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente HVR específicas para un antígeno) tienen la habilidad para reconocer y enlazarse al antígeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de enlace.
El fragmento de Fab contiene los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera y también contiene el domino constante de la cadena ligera y el primer domino constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de Fab' difieren de los fragmentos de Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio de CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de anticuerpo-bisagra. Fab' -SH es la designación en la presente para Fab' en el cual el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo de F(ab' )2 originalmente fueron producidos como pares de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo son también conocidos.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "scFv" comprenden los dominios de VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. En general, el polipéptido scFv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios de VH.y VL que permite que el scFv forme la estructura desea para el enlace de antigeno. Para una revisión de scFv, véase por ejemplo Plueckthun, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antígeno, tales fragmentos comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) unido a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios entre la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o bis específicos. Los diacuerpos son descritos más plenamente en, por ejemplo EP 404097; WO 1993/01161; Hudson., P.J. and Souriau, C, Nat. Med. 9 (2003) 129-134; and Holliger, P. et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448. Los triacuerpos y tetracuerpos son también descritos en Hudson, P.J. and Souriau, C. , Nat. Med. 9 (2003) 129-134.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posiblés mutaciones, por ejemplo mutaciones que se presentan naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos discretos. En ciertas modalidades, al anticuerpo monoclonal incluye comúnmente un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que se enlaza a un objetivo, en donde la secuencia de polipéptido de enlace objetivo fue obtenida mediante un proceso que incluye la selección de una secuencia de polipéptido de un solo objetivo de una pluralidad de secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un fondo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinantes . Se debe entender que una secuencia de enlace de objetivo seleccionada puede ser alterada adicionalmente, por ejemplo para mejorar la afinidad por el objetivo, para humanizar la secuencia de enlace objetivo, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear anticuerpo multiespecíficos , etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de enlace objetivo alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con preparaciones de anticuerpo policlonales , que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante sobre un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas en que están comúnmente sin contaminar por otras inmunoglobulinas .
El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se interpretara que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden ser fabricados mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo el método de hibridoma (por ejemplo, Kohler, G. and Milstein, C, Nature 256 (1975) 495-497; Hongo, . J.A. et al., Hybridoma 14 (1995) 253-260; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, second ed. (1988) ; Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. (1981), pp. 563-681), métodos de ADN recombinantes (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 4,816,567), tecnologías de despliegue de fago (véase, por ejemplo Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks et al., J. Mol. Biol . 222 (1992) 581-597; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073 -1093 ;¦ Fellouse , F.A., PNAS USA 101 (2004) 12467-12472; and Lee,. C.V. et al., J. Immunol . Methods 284 (2004) 119-132) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o semejantes a humanos en animales que tienen partes o todos los sitios de inmunoglobulina humanos o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits, A. et al., PNAS USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A. et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M. et al., Year Immunol. 7 '(1993) 33-40; Patente Estadounidense 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016; Marks, J.D. et al., Bio/Technology 10 (1992) 779-783; Lonberg, N. et al., Nature 368 (1994) 856-859; Morrison, S.L., Nature 368 (1994) 812-813; Fishwild, D.M. et al., Nature Biotechnol . 14 (1996) 845-851; Neuberger, M . , Nature . Biotechnol . 14 (1996) 826; and Lonberg, N. and Huszar, D . , Intern. Rev. Immunol . 13 (1995) 65-93).
Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la (s) cadena (s) es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (por ejemplo, Patente Estadounidense 4,816,567 y Morrison, S.L. et al., PNAS USA 81 (1984) 6851-6855). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED®, en donde la región de enlace de antígeno del anticuerpo es derivada de un anticuerpo producido mediante por ejemplo inmunización de monos macaco con el antígeno de interés .
Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en el cual residuos de una HVR de receptor son reemplazados por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad , afinidad y/o capacidad deseadas. En algunas instancias, residuos de HVR de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en anticuerpo donador. Estas modificaciones se pueden hacer para reasignar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase por ejemplo ., Jones, P.T. et al., Nature 321 (1986) 522-525; Riechmann, L. et al., Nature 332 (1988) 323-329; and Presta, L.G., Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992) 593-596. Véase también, por ejemplo, Vas ani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 (1998) 105-115; Harris, W.J., Biochem. Soc. Transactions 23 (1995) 1035-1038; Hurle, M.R. y Gross, M. , Curr. Opin. Biotechnol . 5 (1994) 428-433; y Patentes Estadounidenses 6,982,321 y 7,087,409.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o ha sido elaborada utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos como se revela en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no humanos. Los anticuerpos pueden ser producidos utilizando varias técnicas conocidas en el arte, incluyendo bibliotecas de despliegue de fago (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol . 227 (1991) 381; Marks et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597) . También disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos están los métodos descritos en Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss (1985), p. 77; Boerner, P. et al., J. Immunol . 147 (1991) 86-95. Véase también van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374. Los anticuerpos humanos pueden ser preparados al administrar el antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir tales anticuerpos en respuesta al ataque de antígeno, pero cuyos sitios endógenos han sido deshabilitados, por ejemplo xenomice (xenoratones) inmunizados (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 6,075,181 y 6,150,584 con respecto a la tecnología de XENOMOUSETM) . · Véase también, por ejemplo, Li, J. et al., PNAS USA 103 (2006) 3557-3562, con respecto a anticuerpos humanos generados via una tecnología de hibridoma de célula B humana.
El término "región hipervariable" , "HVR" o "HV" , cuando ' ° es usado en la presente, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente . En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2 , L3) . En anticuerpos naturales, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de la seis HVR y se cree que H3 en particular juega un papel único en conferir especificidad fina a anticuerpos. Véase, por ejemplo Xu, J.L. et al., Immunity 13 (2000) 37-45; Johnson and Wu, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo (ed.), Human Press, Totowa, NJ (2003) pp. 1-25. Por supuesto, anticuerpos de camélido que se presentan naturalmente que consisten de una cadena pesada solamente son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman, C. et al., Nature 363 (1993) 446-448, and Sheriff, S. and Constantine, K.L., Nat . Struct . Biol . 3 (1996) 733-736.
Un número de delineaciones de HVR están en uso y son abarcadas en la presente . Las HVR que son regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat están basadas en variabilidad de secuencia y son las más comúnmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) . Chothia se refiere en lugar de esto a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia, C. and Lesk, A.M. , J. Mol. Biol . 196 (1987) 901-917). Las HVR de AbM representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y son usados por los elementos de programación de modelado de anticuerpo de AbM Oxford Molecular. Las HVR de "contacto" están basadas en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR son indicados a continuación.
Bucle Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (Ll) , 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en la VL, and 26-35 (Hl) , 50-65 o 49-65 (H2), and 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en la VH. Los residuos de dominio variable son numerados de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones de HVR extendidas.
Los residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de HVR como se definen en la presente.
La expresión "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos como en Kabat" y variaciones de las mismas se refieren al sistema de numeración usado para los dominios de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la combinación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o más aminoácidos correspondientes a un acortamiento de o inserción a una FR o HVR de domino variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un solo de inserto de aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c de acuerdo con Kabat) después del residuo de FR.de cadena pesada 82. La numeración de residuos de Kabat puede ser determinada para un dado mediante alineación en regímenes de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada por Kabat "estándar" .
Un anticuerpo "afinidad-madurado" es uno con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo, que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo padre que no posee aquella (s) alteración (es) . En una modalidad, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o aun pico molares por el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en el arte, por ejemplo Marks, J.D. et al., Bio/Technology 10 (1992) 779-783 describe la maduración por afinidad mediante entremezcla de VH y VL. La muta génesis aleatoria de HVR y/o residuos de estructura es descrita por ejemplo, Barbas, C.F. et al., Proc Nat . Acad. Sci. USA 91 (1994) 3809-3813; Schier et al., Gene 169. (1995) 147-155; Yelton, D.E. et al., J. Immunol. 155 (1995) 1994-2004; Jackson, J.R. et al., J. Immunol. 154 (1995) 3310-3319 y Hawkins, R.E. et al., J. Mol. Biol. 226 (1992) 889-896.
Los anticuerpos "inhibidores de crecimiento" son aquellos que impiden o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual el anticuerpo se enlaza.
Los anticuerpos que ""inducen apoptosis" son aquellos que inducen la muerte celular ' programada,¦ tal como se determina mediante análisis de apoptosis estándar, tal como enlace de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación retículo endoplasmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamados cuerpos apoptopicos) .
"Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región de Fe (una región de Fe de secuencia natural o región de Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectores de anticuerpo, incluyen: enlace de Clq y citotoxicidad complemento-dependiente (CDC) ; enlace de Fe-receptor; citotoxicidad célula-moderada anticuerpo-dependiente (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) y activación de célula B.
El término "región de Fe" en la presente es usado para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones de Fe de secuencia natural y regiones de Fe variantes . Aunque las fronteras de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región de Fe de cadena pesada de IgG humana es usualmente definida para estirarse de un residuo de aminoácidos en posición Cys226 o de Pro 230 a término carboxilo · del mismo. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de EU) de la región de Fe puede ser removida, por ejemplo durante la producción o purificación del anticuerpo o al diseñar recombinantemente el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Así, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpo con todos los residuos K447 removidos, poblaciones de anticuerpo sin residuos K447 removidos y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo de K447.
A no ser que se indique de otra manera en la presente, la numeración de residuos en una cadena pesada de inmunoglob lina es aquella del índice . EU como en Kabat et al., supra. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo de EU de IgGl humano.
Una "región de Fe funcional" posee una "función efectora" de una región de Fe de secuencia natural. "Funciones efectoras" ejemplares incluyen enlace de Clq; CDC; enlace de Fc-receptor; ADCC; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; BCR) , etc. Tales funciones efectoras requieren en genéral, la región de Fe sea combinada con un dominio de enlace (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden ser determinadas utilizando varios análisis como se revela por ejemplo en las definiciones en la presente.
Una "región de Fe de secuencia natural" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región de Fe encontrada en la naturaleza. Regiones de Fe de secuencia natural incluyen una región de F de Igl humana de secuencia natural (alotipos sin A y alotipos A) ; regiones de Fe de IgG2 humana de secuencia natural; región de Fe de IgG3 humana de secuencia natural y región de Fe de IgG4 humana de secuencia natural, también como variantes que se presentan naturalmente de las mismas.
Una "región de Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que' difiere de aquella de una región de Fe de secuencia natural en virtud de por lo menos una modificación de aminoácido, preferiblemente una o más sustitución (es) de aminoácido (s) . Preferiblemente, la región de Fe variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región de Fe de secuencia natural o a la región de Fe de un polipéptido padre, o de alrededor de una alrededor de 10 sustituciones de aminoácido y preferiblemente de alrededor de 1 a alrededor de 5 sustituciones de aminoácido en una región de Fe de secuencia natural en región de Fe del polipéptido padre. La región de Fe variante en la presente poseerá preferiblemente . por lo menos el 80% de homología con una región de Fe de secuencia natural y/o con una región de una Fe de un polipéptido padre y más preferiblemente por lo menos alrededor del 90% de homología con el mismos, mas preferiblemente por lo menos alrededor de 95% de homología con el mismo.
El término "anticuerpo que comprende una región de Fe" se refiere a un anticuerpo que comprende una región de Fe. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de Eü) de la región de Fe puede ser removida, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o mediante diseño recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Así, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región de Fe de acuerdo con esta invención puede comprender un anticuerpo con K447, con todo el K447 removido o una mezcla de anticuerpos con o sin el residuo K447.
"Receptor de Fe" o "FcR" describe un receptor que se enlaza a la región de Fe de un anticuerpo. En algunas modalidades un FcR es un FcR natural-humano . En algunas modalidades, un FcR es uno que se enlaza a un anticuerpo de IgF (un receptor gama) e incluye receptores de la subclase de FCYRI, FCYRII y FCYRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente embaladas de aquellos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcylIA (un "receptor activador") y FcylIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmicos de los mismos. N receptor activador FcylIA contiene una porción de activación a base de tirosina de inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmico . El receptor inhibidor FcyllB contiene una porción de inhibición a base de tirosina de inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmico (véase, por ejemplo Daeron, M., Annu. Rev. Immunol . 15 (1997) 203-234). Los FcR son revisados, por ejemplo en Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) y de Haas, M. et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341). Otros FcR incluyendo aquellos ser identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente.
El término "receptor de Fe" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia IgG maternas al feto Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593; and Kim et al., J. Immunol. 24 (1994) 249) y regulación de homeostasis de inmunoglobulina . Métodos para medir el enlace de FcRn son conocidos (véase, por ejemplo Ghetie, V. and Ward, E.S., Immunol. Today 18 (1997) 592-598; Ghetie, V. et al., Nat . Biotechnol . 15 (1997) 637-640; Hinton, P.R. et al., J. Biol . Chem. 279 (2004) 6213-6216; WO 2004/92219) .
El enlace a FcRn humano in vivo y la vida media en el suero de polipéptidos de enlace de alta afinidad de FcRn humanos pueden ser analizados, por ejemplo en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano o en primates a los cuales los polipéptidos con una región de Fe variantes son administrados. O 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con enlace mejorado o disminuido a FcR. Véase, también, por ejemplo Shields et al., J. Biol . Chem. 9 (2001) 6591-6604.
"Afinidad de enlace" se refiere en general a la fuerza de la suma de total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de enlace de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su socio de enlace (un antígeno) . A no ser que se indique de otra manera, como se usa en la presente, "afinidad de enlace" se refiere a afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción de 1:1 entre miembros de un par de enlace (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su socio Y puede ser en general representada por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede ser medida mediante métodos comunes conocidos en el arte, incluyendo aquellos descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad se enlazan en general al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mediante los anticuerpos de alta afinidad en general se enlazan al antígeno más rápido y tienden a permanecer enlazados más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad de enlace son conocidos en el arte, cualquiera de los cuales puede ser usado para los propósitos de la presente invención. Modalidades ilustrativas y ejemplares específicas para medir la afinidad de enlace son descritas en lo siguiente.
En una modalidad, la "Kd" o "valor de Kd" de acuerdo con esta invención es medido mediante un análisis de enlace de antígeno radio marcado (RIA) efectuado con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente análisis. La afinidad de enlace en solución de Fab por antígeno es medida al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno (125I) -marcado en presencia de una serie de titulación de antígeno sin marcar, luego capturar el antígeno enlazado con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Para establecer condiciones para el análisis, placas de micro título (DY EX Technologies, Inc . ) son recubiertas de la noche a la mañana son 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6) y subsecuentemente bloqueado con albúmina de suero bovino al 2% (peso/volumen) en PBS por 2 a 5 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no absorbente (Nunc #269620) , [125I] -antígeno 100 pM o 26 pM son mezclados con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la asignación de anticuerpo anti-VEGF, Fab-12 en Presta, L.G. et al., Cáncer Res. 57 (1997) 4593-4599) . El Fab de interés es luego incubado de la noche a la mañana; sin embargo, la incubación puede proseguir por un periodo más largo (por ejemplo, alrededor de 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Después de esto, las mezclas son transferidas a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, por una hora) . La solución es luego removida y la placa es lavada ocho veces con surfactante TWEEN-20™ al 0.1% en PBS . Cuando las placas han secado, se agregan 150 µ?/cavidad de agente de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas son contadas en un contador gama TOPCOUNT™ (Packard) por 10 minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menor o igual a 20% de enlace máximo son escogidas para uso en análisis competitivos.
De acuerdo con otra modalidad, la Kd o valor de Kd es medido utilizando análisis de resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIAcore ®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizados a -10 unidades de repuesta (RU) . Brevemente, chips de biosensor de dextrana carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) son activados con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de - acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno es diluido con acetato de sodio 10 mM, pH 4.8 a 5 g/ml (-0.2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteina acoplada. Enseguida de la inyección de antígeno, etanolamina 1 M es inyectada para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones de cinética, diluciones seriales dos veces de Fab (0.78 n a 500 nM) son inyectadas en PBS con surfactante T EEN 20™ (PBST) al 0.05% a 25 °C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/minuto. Las velocidades de asociación (kencendido) y velocidades de disociación (kapagado) son calculadas utilizando un modelo de enlace de Langmuir de uno a uno simple (BIAcore® Evaluation Software versión 3.2) mediante ajuste simultaneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación al equilibrio calculada como la proporción kapagado/kencendido · Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol . 293 (1999) 865-881). Si la velocidad de encendido excede de 106 M-1s"1 por el análisis de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de encendido puede ser determinada al utilizar una técnica de apagado fluorescente que inhibe el incremento con disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión - 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones incrementadas de antígeno, tal como es medido en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo detenido (Aviv Instruments) o una espectrofotómetro 8000-series SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Una "velocidad de encendido" , "velocidad de asociación" , "proporción de asociación" o "kencendido" de acuerdo con esta invención, . es también determinada como se describe anteriormente utilizando un dispositivo BIACORE®-2000 o un sistema BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) .
El término "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo", como se usa en la presente, denotan un grado de similaridad suficientemente alto entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador) , de tal manera que el experimentado en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores de poco o ningún significado biológico y/o estadístico dentro del contexto- de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es por ejemplo, menor de alrededor de 50%, menor de alrededor de 40%, menor de alrededor de 30%, menor de alrededor de 20% y/o menor de 'alrededor de 10% como funcional el valor de referencia/comparador.
La frase "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente", como se usa en la presente, denotan un grado de diferencia suficientemente alto entre dos valores numéricos (en general todo asociado con una molécula y otro asociado con una molécula de referencia/comparador) de tal manera que el experimentado en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores de significado estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo mayor de alrededor de 10%, mayor de alrededor de 20%, mayor de alrededor de 30%, mayor de alrededor de 40% y/o mayor de alrededor de 50% como función del valor para la molécula de referencia/comparador.
En ciertas modalidades, el anticuerpo humanizado útil en la presente comprende además alteraciones de amino acido en el Fe de IgG y exhibe afinidad de enlace incrementada por FcRn humano con respecto a un anticuerpo que tiene Fe de IgG tipo silvestre, por al menos 60 veces, por lo menos 70 veces, por lo menos 60 veces, mas preferiblemente por lo menos 100 veces, preferiblemente por lo menos 125 veces, aun mas preferiblemente por lo menos. 150 veces a alrededor de. 170 veces .
Una "alteración" o "enfermedad" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Esto incluye alteraciones o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen el mamífero a la alteración en cuestión. Ejemplos no limitantes de alteraciones a ser tratadas en la presente incluyen cáncer (por ejemplo, tumores malignos y benignos; malignidades sin leucemia y malignidades linfoides) ; alteraciones neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicas y otras alteraciones glandulares, macrofagales , epiteliales, estromales y blastocolicas y alteraciones inflamatorias inmunológicas y otras alteraciones angiogénesis-relacionadas .
Los términos "alteración proliferativa celular" y "alteración proliferativa" se refieren a alteraciones que están asociadas con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, la alteración proliferativa celular es cáncer. En una modalidad, la . alteración proliferativa celular es angiogénesis .
"Tumor" como se usa en la presente, se refiere a toda la proliferación y crecimiento celular neoplásico, ya sea maligno o benigno y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "alteración proliferativa celular" , "alteración proliferativa" y "tumor" no son mutuamente exclusivos como se refiere en la presente.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que es caracterizada comúnmente por proliferación celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales canceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón) , cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago (incluyendo, por ejemplo, cáncer gastrointestinal) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo, cáncer de pancreático metastático) , glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho (incluyendo localmente cáncer de pecho avanzado recurrente localmente, o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, también como linfoma de célula B (incluyendo linfoma de no de Hodgkin de bajo grado/folicular (LNH) , linfocítico pequeño NHL (SL) , NHL grado intermedio/folicular; NHL difuso grado intermedio; NHL inmunoblastico de alto grado; NHL linfoblastico de alto grado; NHL de célula no escindida pequeña de alto grado; NHL de enfermedad global; linfoma de célula de manto; linfoma SlDA-asociado y Macroglobulinemia de Waldenstrom) ; leucemia linfocítica crónica (CLL) ; leucemia linfoblastica aguda (ALL) : leucemia de célula vellosa; leucemia mieloblastica crónica y alteración linfoproliferativa post-trasplante (PTLD) , también como proliferación vascular anormal asociado con pakomatoses, edema (tal como aquel asociado con tumores de cerebro) y síndrome de Meigs .
El término "composición anti-neoplásica" o "composición anti-cáncer" o "agente anti-cáncer" se refieren a una composición útil en el tratamiento de cáncer que comprende por lo menos un agente terapéutico activo, por ejemplo "agente anti-cáncer" . Ejemplos de agentes terapéuticos (agentes anti-cáncer) incluye pero no están limitados a, por ejemplo agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores de crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis, agentes anti-linfangiogénesis, agentes apoptoticos, agentes anti-tubulina y otros agentes para tratar cáncer, tales como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20 Y un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de cinasa de tirosina) , inhibidor de HERI/EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™) ) , inhibidores del factor de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (Imatinib Mesylate) , un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferones, citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se enlazan a uno o más de los siguientes objetivos: ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA VEGF o receptor (es) de VEGF, TRAIL/Apo2 y otros agentes bioactivos inorgánicos químicos, etc. Combinaciones de los mismos también están incluidas en la invención.
Como se usa en la presente, "tratamiento" se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que es tratado y puede ser efectuado ya sea por profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos deseables de tratamiento incluyen impedir la presencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquier consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, impedir metástasis, disminuir la proporción de avance de enfermedad, mejora y paliación del estado de enfermedad y remisión o prognosis mejorada. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son usados para retardar el desarrollo de una enfermedad o alteración.
Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios para obtener el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista' puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad y sexo del individuo y la habilidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual, cualesquier efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula agonista o antagonista son superados por los efectos terapéuticamente benéficos. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido o antagonista de esta invención efectiva para "tratar" una enfermedad o alteración en un mamífero (aka paciente). En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células de cáncer; reducir el peso o tamaño del tumor; inhibir (esto es, frenar alguna extensión y preferiblemente detener) la infiltración de células de cáncer a órganos periféricos; inhibir (esto es, frenar alguna extensión y preferiblemente detener) la metástasis del tumor; inhibir alguna extensión, el crecimiento del tumor y/o aliviar alguna extensión uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. A la . extensión que el fármaco puede impedir el crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, puede ser citostatico y/o citotóxico. En una modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad inhibidora del crecimiento. En otra modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que extiende la supervivencia de un paciente. En otra modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que mejora la supervivencia libre de avance del paciente. "Supervivencia libre de avance" como se usa en la presente, se refiere a la duración de tiempo durante y después del tratamiento durante el cual, de acuerdo con la determinación del médico que atiende o investigador, la enfermedad del paciente no empeora, esto es, no avanza.
Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios para obtener el resultado profiláctico deseado. Comúnmente, pero no de manera necesaria, puesto que una dosis profiláctica es usada en sujetos antes de o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva es menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de células y/o provoca destrucción de células, el término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, por ejemplo metrotexato, adriamicina, vina alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposide) , doxorubicina, melfalana, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las 'mismas tales como enzimas nucleoliticas , antibióticos y toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos y los varios agentes anti-tumor o anti-cáncer revelados posteriormente en la presente. Otros agentes citotóxicos son descritos a continuación. Un agente tumoricida provoca destrucción de células de tumor.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y pipósulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa,-etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenetio-fosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulltacinona) , delta- 9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL5®) ; beta-lapacona; lapacol; colcicinas, ácido betulínico, una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, scopolectina, y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipóside; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trifosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma II y caliqueamicina omega II (véase, por ejemplo, Angew Chem. Intl. Ed. Engl 33 (1994) 183-186) ; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina, también como cromóforo neocarzinostatina y cromóforos de antibiótico de enedina de cromoproteína relacionado), aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, chromomicinisas , dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina de ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desosidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido icofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ,-análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina ; diaziquona; elfornitina, acetato de eliptinio y una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona, 2 -etilhidrazida; procarbazina complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio, ácido tenuazónico; triaziquona, 2 , 2 ', 2" -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, Roridina A y anguidina) ; uretan; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinóside ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) , ABRAXA E™ libre de Cremofor, formulación de nano partículas albúmina-diseñada de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , docetaxel TAXOTERE® (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR®) ; 6 -tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino,- vinblastina (VELBA ®) ; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatino; leucovovina; vinorelbina ( NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometlilornitina (DMFO) ; retinoides tal como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®) ; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; también como combinaciones de dos o más de los anteriores,, tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, y FOLFOX, una. abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) en combinación con 5-FU y leucovovina. Agentes quimioterapéuticos adicionales incluyen los agentes qitotóxicos útiles como conjugados de anticuerpo-fármaco, tales como maitansinoides (DM1, por ejemplo) y la auristatinas MMAE y MMAF, por ejemplo.
"Agentes quimioterapéuticos" también' incluyen "agentes anti-hormonales" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer y están frecuentemente en forma de tratamiento sistémico o de cuerpo entero. Pueden ser hormonas en si mismos. Ejemplos incluyen anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógenos selectivos (SE ) incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo tamoxifen NOLVADEX®) , raloxifen EVISTA®, droloxifeno, 4 -hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno FARESTON®; anti-progesteronas ; reguladores descendentes de receptores de estrógeno (ERD) , agentes que funcionan para suprimir o cerrar los ovarios, por ejemplo, hormona de liberación de hormona luteinizante (LHRH) , agonistas tales como LUPRON® y ELIGARD® acetato de leuprolato, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida e inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la .producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, (5) -imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol Femara®y anastrozol ARIMIDEX®. Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bifosfonatos, tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato A EDIA®, tiludronato SKELID® o risedronato ACTONEL® ; también como troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido 1, 3-dioxolan) ; oligonucleótidos anti sentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como vacunas THERATOPE® y vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 LUTORTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de cinasa de tirosina doble ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016) , y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores .
Un "agente inhibidor de crecimiento", cuando es usado en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento o proliferación de una célula. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente de ía fas S) , tales como agentes que inducen la detención de Gl y detención de fase . Bloqueadores fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblistinas) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II, tales como el antibiótico de antraciclina doxorubicina (8S-cis)- 10- [ (3-amino-2 , 3 , 6-tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil) oxi] -7,8,9, 10-tetrahidro-6,8, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -l-metoxi-5, 12-nafhacenediona) , epirubicina, daunorubicina, etoposide y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se derraman sobre detención de fase S, por ejemplo alquilantes de ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mechloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Información adicional se puede encontrar en: Murakami et al., The Molecular Basis of C ncer, Mendelsohn and Israel (eds.), Capitulo 1, "Cell cycle regulation, oncogenes, and anti-neoplastic drugs", W.B. Saunders, Philadelphia (1995), especialmente página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anti-cáncer ambos derivados del árbol de yew. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del yew europeo, es un análogo semisintetico de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de micro túbulos de dímeros de tubulina y estabilizan micro túbulos al impedir la despolimerización, que da como resultado la inhibición de mitosis en células.
Como se usa en la presente, el término "paciente" se refiere a cualquier animal individual, mas preferiblemente un mamífero (incluyendo tales animales no humanos como por ejemplo, perros, gatos, caballos, conejos, animales de zoológicos, vacas, puercos, ovejas y primates no humanos) para los cuales se desea tratamiento. Más preferiblemente, el paciente en la presente es un humano.
Un "sujeto" en la presente es cualquier sujeto humano individual, incluyendo un paciente, elegible para tratamiento que está experimentando o ha experimentado uno o más signos, síntomas u otros indicadores de una alteración angiogénica. Pretendidos para ser incluidos como sujetos son cualesquier sujetos involucrados en pruebas de investigación clínica que no muestran ningún signo clínico de enfermedad o sujetos involucrados en estudios epidemiológicos o sujetos una vez usados como testigos. El sujeto pude haber sido tratado previamente con un agente anti-cáncer o no tratado de esta manera. El sujeto puede ser naive a un (os) agente (s) adicional (es) que es (son) usado (s) cuando el tratamiento en la presente es iniciado, esto es, el sujeto puede no haber sido tratado previamente . con, por ejemplo un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico en la "referencia" (esto es, en un punto establecido en el tiempo antes de la administración de una primera dosis de un anti-cáncer en el método de tratamiento en la presente, tal como el día de selección de un sujeto antes de que el tratamiento sea comenzado) . Tales sujetos "naive" son en general considerados candidatos para tratamiento con tal (es) agente (s) adicional (es) .
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación estéril que está en tal forma para permitir que la actividad biológica del medicamento sea efectiva y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual la formulación seria administrada.
Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todos los microorganismos vivientes y sus esporas .
Un "inserto de empaque" es usado para referirse a instrucciones incluidas acostumbradamente en empaques comerciales de productos terapéuticos o medicamentos, que contiene información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos a ser combinados con el producto empacado y/o advertencias concernientes con el uso de tales productos terapéuticos o medicamentos, etc.
Un "kit" es cualquier manufactura (por ejemplo, un empaque o recipiente) que comprende por lo menos, un reactivo, por lo menos un medicamento para tratamiento de una alteración angiogénica o una sonda para detectar específicamente un gen o proteíná biomarcador de la invención. La manufactura es preferiblemente promovida, distribuida o vendida como una unidad para efectuar los métodos de la presente invención. Por propósitos de no respuesta a medicamento (s) un sujeto que experimenta "un nivel de toxicidad inaceptablemente alto" de tratamiento previo o actual con uno o más medicamentos experimenta uno o más efectos secundarios negativos o eventos adversos asociados con el mismo que son considerados por un médico experimentado ser significativo, tales como por ejemplo infecciones serias, insuficiencia cardiaca congestiva, desmielinacion (conduciendo a esclerosis múltiples) , hipersensibilidad significativa, eventos neuropatológicos , alto grado de autoinmunidad, un cáncer tal como cáncer endometrial, linfoma no de Hodking, cáncer de pecho, 'cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o melanoma, tuberculosis (TB) , etc.
"Reducir el riesgo de un efecto secundario negativo" significa reducir el riesgo de un efecto secundario resultante del tratamiento con el antagonista en la presente a una extensión menor que el riesgo observado resultante del tratamiento del mismo paciente u otro paciente con un tratamiento administrado previamente. Tales efectos secundarios incluyen aquellos resumidos anteriormente con respecto a toxicidad y preferiblemente infección, cáncer, insuficiencia cardiaca o desmielinacion.
"Correlacionar" o "que correlaciona" significa comparar de alguna manera el desempeño y/o resultado de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultado de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo un segundo protocolo y/o se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si un segundo análisis o protocolo debe ser efectuado. Con respecto a varias modalidades en la presente, se pueden usar resultados de un análisis analítico para determinar si un régimen terapéutico específico que usa un agente anti-cáncer, tal como un anticuerpo anti-VEGF, debe ser efectuado.
III. Métodos La presente invención provee métodos para identificar pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, métodos para predecir la responsividad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, métodos para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficios de terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A y métodos para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A.
Los métodos comprenden determinar el nivel de expresión de VEGFm en una muestra obtenida del paciente, en donde le nivel de VEGFm de la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica' que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse con la terapia anti-cáncer o que el paciente es más probable de ser responsivo al tratamiento con la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF al paciente.
La invención provee además métodos para tratamiento de cáncer en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tienen un . nivel de VEGFm en o por encima de un nivel de referencia y administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF al paciente, mediante lo cual el cáncer es tratado. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar agente (s) adicional (es) (por ejemplo, un segundo, tercero o cuarto agente) al paciente.
A. Métodos de detección Los métodos y análisis revelados proveen medios convenientes, eficientes y potencialmente efectivos en el costo para obtener datos e información útil para determinar terapias apropiadas o efectivas para tratar pacientes. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la invención, un paciente podría proveer una muestra de sangre antes de tratamiento con terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF y el nivel de VEGFm en la muestra podría ser determinado y comparado con el nivel de VEGFm en una muestra de referencia o con un valor de referencia predeterminado. Los pacientes con un nivel de VEGFm en o por encima de un nivel de referencia son identificados como pacientes probables de responder a la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo VEGF. Los métodos se pueden llevar a cabo en una variedad de formato de análisis incluyendo análisis que detectan expresión de proteína (tales como inmunoanálisis de enzima) y análisis bioquímicos que detectan la actividad apropiada. La determinación de la expresión o la presencia de tales biomarcadores en las muestras es predictiva de que el paciente que provee la muestra será sensible a los efectos biológicos de un antagonista de VEGF. Comúnmente, un nivel de expresión de VEGFm en una muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que un paciente responderá a o será sensible al tratamiento con un antagonista de VEGF.
El experimentado en las artes médicas, particularmente perteneciente a la aplicación de pruebas de diagnóstico y tratamiento terapéutico, reconocerá que los sistemas biológicos son un tanto variables y no siempre completamente predecibles y así, muchas pruebas de diagnóstico buenas o terapéuticos buenos son ocasionalmente inefectivos. Así, depende finalmente ¦¦ del juicio del médico que . atiende determinar el curso del tratamiento más apropiado para un paciente individual, en base a resultados de prueba, condición e historia en paciente y su propia experiencia. Pueden aun haber ocasiones, por ejemplo cuando un medico escogerá tratar un paciente con un antagonista de VEGF aun cuando un paciente no es predicho ser particularmente sensible a los antagonistas de VEGF, en base a datos de pruebas de diagnóstico o de otros criterios, particularmente si todas o la mayoría de todas las opciones de tratamiento obvias han fallado o si se anticipa algo de sinergia cuando es dado con otros tratamientos .
En modalidades expresadas adicionales, la presente invención provee un método para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF o predecir si un paciente responderá efectivamente a tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, que comprende determinar el nivel de VEGFm en la muestra y predecir la sensibilidad del paciente a inhibición por un antagonista de VEGF, en donde un nivel de expresión de VEGFm en o por encima de un nivel de referencia se correlaciona con alta sensibilidad del paciente a la respuesta efectiva al tratamiento con un antagonista de VEGF.
La muestra puede ser tomada de un paciente que se sospecha de tener o es diagnosticado por tener un cáncer incluyendo, por ejemplo cáncer coló rectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer · gástrico y cáncer de pulmón y de aquí esta probablemente en necesidad de tratamiento o de un individuo normal que no es sospechoso de tener alguna alteración. Para la determinación de expresión de marcador, muestras del paciente, tales como aquellas que contienen células o proteínas o ácidos nucleicos producidos por estas células, pueden ser usadas en los métodos de la presente invención. En los métodos de esta invención, el nivel de un biomarcador puede ser determinado al determinar la cantidad (por ejemplo, cantidad o concentración absoluta) de los marcadores en una muestra, preferiblemente determinada en fluidos corporales o extensiones que contienen niveles detectable.s de biomarcadores . -Los fluidos corporales o secreciones como muestras útiles en la presente invención por ejemplo, sangre, fluido linfático, esputo, ascites u otra secreción corporal o derivado de la misma. La palabra sangre pretende incluir sangre entera, plasma, suero o cualquier derivado de sangre. La determinación de un biomarcador en tales fluidos corporales o excreciones puede algunas veces ser preferida en circunstancias en donde un método de toma de muestras invasivo es inapropiado o inconveniente. Sin embargo, la muestra a ser probada en la presente es preferiblemente sangre, mas preferiblemente plasma sanguíneo.
La muestra puede ser congelada, nueva, fijada (por ejemplo, fijada con formalina) , centrifugada y/o embebida (por ejemplo, .embebida en parafina) , etc. La muestra celular puede por supuesto ser sometida a una variedad de técnicas preparativas de post-colección y almacenamiento bien conocidas (por ejemplo, extracción de ácido nucleico y/o proteína, fijación, almacenamiento, congelación, ultrafiltración, concentración, evaporación, centrifugación, etc . ) antes de determinar la cantidad del marcador en la muestra. Así mismo, biopsias pueden ser también sometidas a técnicas preparativas y tratamiento pos-colección, por ejemplo fijación.
Detección de VEGFm Proteína o ácido nucleico de VEGFm puede ser detectado utilizando cualquier método conocido en el arte. Por ejemplo, muestras de tejido o muestras celulares de mamíferos pueden ser analizadas convenientemente, por ejemplo proteínas utilizando Westerns, ELISA, mARN o ADN de un biomarcador genético de interés utilizando análisis de Northern, inmunoabsorción o análisis de acción en cadena de polimerasa (PCR) , hibridización de arreglo, análisis de protección de RNasa o utilizando micro arreglos de chip de SNP de ADN, que están disponibles comercialmente, incluyendo instantáneas de micro arreglo de ADN. Por ejemplo, análisis de PCR en tiempo real (RT-PCR) tales como análisis de PCR cuantitativos son bien conocidos en el arte. En una modalidad ilustrativa de la invención, un método para detectar mARN de un biomarcador genético dé interés en una muestra biológica comprende producir can de la muestra mediante transcripción inversa utilizando por lo menos un cebador; amplificar el can así producirlo y detectar la presencia del cADN amplificado. Además, tales métodos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de mARN en una muestra biológica (por ejemplo, al examinar simultáneamente los niveles de una secuencia de mARN de control comparativa de un gen de "mantenimiento" tal como un miembro de la familia de actina) . Opcionalmente , la secuencia de cADN amplificado puede ser determinada.
Muchas referencias están disponibles para proveer guía en la aplicación de las técnicas anteriores Kohler et al., Hybridoma Techniques, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1980) ; Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays , Elsevier, Amsterdam (1985) ; Campbell, Monoclonal Antibody Technology, Elsevier, Amsterdam (1984) ; Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications, CRC Press, Boca Ratón, FL (1982); and Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158.
En cuanto a la detección de* proteína de VEGFm, varios análisis están disponibles. Por ejemplo, la muestra se puede poner en contacto con un anticuerpo o una combinación de anticuerpo (en un análisis de emparedado) que se enlaza preferencial o específicamente a VEGFm en comparación con las isoformas de VEGF-A que se presentan en la naturaleza más larga, como VEGF16s y VEGF189, respectivamente. En una modalidad, la isoforma corta VEGFm es preferencial enlazada, esto es, es detectada con una sensibilidad por lo menos tres veces más alta en comparación con las isoformas más largas, especialmente en comparación con VEGF165. En una modalidad, se usa un anticuerpo que contiene una sensibilidad por lo menos tres veces más alta por VEGFm en comparación con VEGF165. Tal sensibilidad por lo menos tres veces más alta para VEGFm es determinada al comparar la isoforma de VEGFi6s (pureza de por lo menos 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante OD 280 nm) y la isoforma de VEGFm (pureza de por lo menos 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante OD 280 nm) utilizando los mismos reactivos. Sin en esta comparación, la señal obtenida para VEGF165 es solamente un cesio o menos de la señal obtenida con VEGFm, entonces VEGFm es detectado con una sensibilidad por lo menos tres veces más alta. Como el experimentado en el arte apreciara la señal es preferiblemente leída alrededor de 50% de la señal máxima. También preferida la sensibilidad para la isoforma corta de VEGFm es por lo menos 4 veces, 5 veces, 7 veces, 8 veces o 9 veces más alta en comparación con la isoforma larga VEGF165.
En una modalidad, la isoforma VEGFm es específicamente detectada. Tal detección específica es por ejemplo posible si los anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales son usados y empleados que se enlazan a la secuencia única para VEGFm, generada mediante unión de exón entre los aminoácidos 105 y 106 de VEGFm. Tal anticuerpo no se enlaza a otra forma de VEGF-A . o productos de escisión de la misma que no comprenden la secuencia específica generada por esta unión de exón específica. El enlace específico a VEGFm en el sentido anterior es reconocido, si el anticuerpo usado exhibe menos de 10% de reactividad cruzada con otras isoformas de VEGF-A, como VEGF165 que no tiene esta unión de exón única. También preferido, la reactividad cruzada a por ejemplo VEGFi6s será menor de 5%, 4%, 3%, 2% y 1%, respectivamente.
La especificidad por VEGFm en una modalidad es determinada al comparar VEGFm (pureza de por lo menos 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante OD 280 nm) y VEGFi65 (pureza de por lo menos 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante OD 280 nm) utilizando los mismos reactivos. Si en esta comparación, la señal obtenida para el material de VEGF165 es solamente un décimo o menos de la señal tal como es obtenida con el material de VEGFm, entonces la reactividad cruzada hacia VEGF165 es menor de 10%. Como el experimentado en el arte apreciara, la señal de VEGF16s es preferiblemente leída a una concentración que produce alrededor del 50% de la señal máxima de VEGFm .
Anticuerpos específicos apropiados que se enlazan solamente a la isoforma corta de VEGFm pueden ser obtenidos de acuerdo con procedimientos estándar. Usualmente, un péptido que representa o comprende aminoácidos C-terminal y N-terminal al aminoácido 105 de VEGFm serán sintetizados, opcionalmente acoplados a un portador y usados para inmunización. Preferiblemente, tal péptido será de por lo menos 6 aminoácidos de largo y comprenderá por lo menos los aminoácidos 105 y 106 de VEGFm . También preferido comprenderá por lo menos los aminoácidos 104, 105, 106, 107 de VEGF1U · Como el experimentado en el arte apreciara, péptidos más largos que comprenden por ejemplo 3, 4 o más aminoácidos N- y C-terminales a la unión de exón entre los aminoácidos 105 y 106 de VEGFm pueden también ser usados para obtener anticuerpos que se enlazan específicamente a VEGFm · Anticuerpos policlonales específicos pueden ser obtenidos mediante etapas de inmunoabsorción apropiadas. Los anticuerpos monoclonales pueden ser seleccionados fácilmente en cuanto a reactividad con VEGFm y baja reactividad cruzada apropiada. Baja reactividad cruzada en términos del anticuerpo VEGFxll-especifico puede ser determinada utilizando isoformas de VEGF que no contienen la secuencia única para VEGFm .
Varios métodos de medición están disponibles si por ejemplo, la muestra se puede poner en contacto con un anticuerpo para VEGF11X bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo de anticuerpo-VEGFm y luego detectar dicho complejo. La presencia de proteína de VEGFm puede ser detectada en una diversidad de maneras, tal como Western blotting (con o sin imunoprecipitación) , SDS-PAGE bi dimensional, imunoprecipitación, clasificación de la célula activada por fluorescencia (FACS) , citometría de flujo y procedimientos de ELISA para analizar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Un amplio intervalo de técnicas de inmunoanálisis que utilizan tal formato de análisis están disponibles, véase, por ejemplo Patentes Estadounidenses 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estas incluyen tanto análisis de un solo sitio y análisis de los sitios o de "emparedado" de los tipos no competitivos, también como en los análisis de enlace competitivos tradicionales. Estos análisis también incluyen enlace directo de un anticuerpo marcado a un biomarcador objetivo.
Los análisis de emparedado están entre los análisis más útiles y comúnmente usados. Existe una diversidad de variaciones de la técnica de análisis de emparedado y se pretende que todas sean abarcadas por la presente invención. Brevemente, en un análisis directo o hacia adelante típico, un anticuerpo sin marcar es inmovilizado sobre un sustrato sólido y la muestra a ser probada es traída en contacto con la molécula enlazada. La inmovilización de este anticuerpo de captura puede ser mediante absorción directa a una fase solida o indirectamente, por ejemplo vía un par de enlace especifico, por ejemplo vía el par de enlace de estreptavidina-biotina . Preferiblemente, el anticuerpo inmovilizado se enlazara a VEGFm . Después de un periodo de incubación apropiado por un periodo en el tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, un segundo anticuerpo especifico al antígeno (esto es, VEGFm) marcado con una molécula de reportero apta de producir una señal detectable es luego agregado e incubado, permitiendo tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo anticuerpo-antígeno-marcado . Cualquier material sin reaccionar es lavado y la presencia de VEGFm es determinada mediante observación de una señal producida por la molécula de reportero. Los resultados pueden ser ya sea cuantitativos mediante simple observación de la señal visible o pueden ser cuantificados al comparar con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de biomarcador. En un montaje alternativo, el anticuerpo específico para VEGFm es inmovilizado y un anticuerpo que se enlaza a un epítopo no traslapante de VEGFm que porta una molécula de reportero puede ser usado para detectar la molécula objetivo.
Variaciones en el análisis directo o delantero incluyen un análisis simultáneo, en el cual tanto en la muestra como el anticuerpo marcado son agregados simultáneamente al anticuerpo enlazado. Estas técnicas son bien conocidas para aquellos experimentados en el arte, incluyendo cualesquier variaciones menores como serán fácilmente evidentes. En un análisis de emparedado directo o acelerante típico, un primer anticuerpo es ya sea enlazado covalente o pasivamente a una superficie sólida. La superficie solida es comúnmente vidrio o un polímero, los polímeros más comúnmente usados son celulosa, poliacrimida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes solidos pueden estar formas de tubos, perlas, discos de micro placas o cualquier otra superficie apropiada para llevar a cabo un inmunoanálisis . Los procesos de enlace son bien conocidos en el arte y consisten en general de enlace de reticulación covalentemente o absorción física, el complejo polímero-anticuerpo es lavado en preparación por la muestra de prueba. Una alícuota de la muestra a ser probada es luego agregada al complejo en fase solida e incubada por un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 2-40 minutos o de la noche a la mañana si es más conveniente) y bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, de temperatura ambiente a 40°C tal como entre 25 °C y 32 °C inclusive) para permitir el enlace entre el primer anticuerpo o anticuerpo de captura y el antígeno correspondiente. Enseguida del periodo de incubación, la fase sólida que comprende el primer anticuerpo o el anticuerpo de captura y enlazado al mismo el antígeno es lavado e incubado con un anticuerpo secundario o anticuerpo marcado que se enlaza a otro epítope sobre el antígeno . El segundo anticuerpo es enlazado a una molécula de reportero que es usada para indicar el enlace del segundo anticuerpo al complejo del primer anticuerpo y el antígeno de interés.
Un método competitivo alternativo involucra inmovilizar VEGFm sobre una fase sólida y luego exponer el objetivo inmovilizado junto con la muestra a un anticuerpo especifico a VEGF111 que puede o no puede ser marcado con una molécula de reportero. Dependiendo de la cantidad de objetivo en la intensidad de la señal de la molécula de reportero', una competencia por la molécula objetivo puede ser detectable directamente vía el anticuerpo marcado. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, específico al primer anticuerpo es expuesto al complejo de objetivo-primer anticuerpo para formar un complejo terciario de objetivo-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo es detectado por la señal emitida por la molécula de reportero. "Molécula de reportero" como se usa en la presente especificación, significa una molécula que, por su naturaleza química, provee una señal identificable analíticamente que permite la detección del anticuerpo antígeno-enlazado. Las moléculas de reportero más comúnmente usadas en este tipo de análisis son ya sea enzimas, fluoróforos, moléculas que contienen radionúclido (esto es, radioisótopos) y moléculas quimio luminiscentes.
En el caso de un análisis de enzima, una enzima es conjugada al segundo anticuerpo, en general por medio de glutaraldehído o peryodato. Como se reconocerá fácilmente, sin embargo una amplia variedad de diferentes técnicas de conjugación existen que están fácilmente disponibles para el experimentado en el arte. Enzimas usadas comúnmente incluyen peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa, beta-galactosidasas y fosfatasa alcalina entre otros. Los datos a ser usados con las enzimas específicas son en general escogidos para la producción después de hidrólisis por la enzima correspondiente de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas apropiadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogenicos , que producen un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogénicos usados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo-enzima-marcado es agregado al complejo de primer anticuerpo-marcador molecular, se permite que se enlacen y luego el reactivo en exceso es lavado. Una solución que contiene el sustrato apropiado es luego agregada al complejo de anticuerpo-antígeno- anticuerpo. El sustrato reaccionara con la enzima enlazada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede ser cuantificada adicionalmente , usualmente de manera espectrofotometrica, para dar una indicación de la cantidad de EGFxn que está presente en la muestra. Alternativamente, compuestos fluorescentes, tal como fluoresceína y rodamina pueden ser acoplados químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de enlace. Cuando son activados mediante iluminación con luz de longitud de onda particular, el anticuerpo fluorocromo-marcado absorbe la energía de luz, iniciando un estado a excitabilidad en la molécula, seguido por emisión de la luz a un color característico detectable visualmente con un microscopio de luz. Como en el EIA, se permite el anticuerpo marcado fluorescente se enlace al complejo de primer anticuerpo-marcador molecular. Después de lavado del reactivo sin enlazar, el complejo terciario restante es luego expuesto a la luz. de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia de VEGFm. La inmunofluorescencia y técnicas de EIA, son ambas bien establecidas en el arte. Sin embargo, otras moléculas de reportero, tales como moléculas de radio isótopo, moléculas quimio luminiscentes o bioluminiscentes pueden también ser empleadas. Inmunoanálisis para detectar VEGF son descritos en, por ejemplo Patentes Estadounidenses 6,855,508 y 7,541,160 y Publicación de Patente Estadounidense 2010/0255515.. Plataformas apropiadas para detectar VEGF son descritas, por ejemplo en EP 0939319 y EP 1610129.
En ciertas modalidades, mARN o ADN de una isoforma de VEGF de interés es detectado utilizando análisis de Northern, inmunoabsorción o análisis de reacción en cadena de polimerasa (PCR) , hibridización de arreglo, análisis de protección de RNasa, utilizando micro arreglos de ADN que están disponibles comercialmente incluyendo tomas instantáneas de micro arreglo de ADN. Por ejemplo, análisis de PCR en tiempo real (RT-PCR) , tales como análisis de PCR cuantitativos son bien conocidos en el arte. En una modalidad ilustrativa de la invención, un método para detectar mARN de una isoforma de VEGF de interés en una muestra biológica comprende producir cADN de la muestra mediante transcripción inversa utilizando por lo menos un cebador; amplificar el cADN así producido y detectar la presencia de cADN amplificado. Además, tales métodos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de mARN en una muestra biológica (por ejemplo, al examinar simultáneamente los niveles de una secuencia de mARN de control comparativa · de un gen de "mantenimiento" tal como un miembro de la familia de actina) . Opcionalmente, una secuencia de cADN amplificado puede ser determinada. El análisis de Northern blot es una técnica convencional bien conocidas en el arte y es descrito, por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Press, NY (1989) 11803-2500. Protocolos para evaluar el estatus de genes y productos genéticos se encuentran por ejemplo en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols In Molecular Biology (1995) , Units 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 ( Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis) .
Kits Para uso en la detección de VEGFm, kits o artículos de manufactura son también provistos por la invención. Tales kits pueden ser usados para determinar si un sujeto será efectivamente responsivo a una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF.. Estos kits pueden comprender medios de portador que son divididos en compartimientos para recibir en confinación estrecha uno o más medios de recipiente, tales como frascos, tubos y los semejantes, cada uno de los medios de recipiente comprende uno de los elementos separados a ser usados en el método. Por ejemplo, uno de los medios de recipiente puede comprender una sola T 1 o puede ser marcada detectablemente . Tal prueba puede ser un anticuerpo o poli nucleótido específico para proteína de VEGFm o mensaje, respectivamente. En donde el kit utiliza hibridización de ácido nucleico para detectar el ácido nucleico objetivo, el kit puede también tener recipiente que contienen nucleótido (s) para la amplificación de ácido nucleico objetivo y/o un recipiente que comprende medios de reportero tal como una proteína de enlace- de biotina, por ejemplo avidina o estreptavidina enlazada a una molécula de reportero, tal como un marcador enzimática, fluorescente o de radio isótopo.
Tal kit comprenderá comúnmente el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde, el punto de vista comercial y visual, incluyendo soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para uso. Una etiqueta puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición es usada para una aplicación específica y puede también indicar instrucciones ya sea para uso in vivo o in vitro, tales como aquellos descritos anteriormente.
' Los kits de la invención tienen un número de modalidades. Una modalidad típica es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre dicha recipiente y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición incluye un anticuerpo que se enlaza preferencialmente a VEGFlll o un anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGFU1 y la etiqueta sobre el recipiente indica que la composición puede ser usada para evaluar la presencia de VEGFm en una muestra y en donde el kit incluye instrucciones para usar el anticuerpo para evaluar la presencia de VEGFm en un tipo de muestra particular. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra y aplicar anticuerpo a la muestra. El kit puede incluir tanto un anticuerpo primario como un anticuerpo secundario, en donde el anticuerpo secundario es conjugado a un marcador, por ejemplo un marcador enzimático.
Otra modalidad es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre el recipiente y una composición contenida dentro del recipiente. En donde la composición incluye uno o más poli nucleótidos que sensibilizan a un complemento de VEGF111 bajo condiciones severas y etiqueta sobre el recipiente indica que la composición puede ser usada para evaluar la presencia de VEGFm en una muestra y en donde el kit incluye instrucciones para usar el (los) poli nucleótido (s) para evaluar la presencia del ARN o ADN biomarcador en un tipo de muestra particular.
Otros componentes opcionales del kit incluyen o más soluciones reguladoras del pH (por ejemplo, solución reguladora del pH de bloqueo, solución reguladora del pH de lavado, solución reguladora del pH de sustrato, etc.), otros reactivos tales como un sustrato (por ejemplo, cromogen) que es apilado químicamente por un marcador enzimático, solución de recuperación de epítope, muestras de control o testigo (testigo positivo(s) y/o negativo (s)), portaobjeto (s) testigo (s) , etc. Los kits pueden también incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el kit.
En una modalidad especifica adicional, los para kits a base de anticuerpo, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo que se enlaza preferencial o específicamente a VEGFlll y (2) un segundo anticuerpo (por ejemplo, anexado a un soporte solido o apto de enlazarse a un soporte solido) que se enlaza a VEGFlll en un epítope que no traslape con el epítope del primer anticuerpo. Preferiblemente, el primer anticuerpo es marcado con una molécula de reportero. Por supuesto, es también posible intercambiar el primero por el segundo anticuerpo y viceversa cuando se diseña tal análisis.
Para kits a base de oligonucleótido, el kit puede comprender por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ejemplo un oligonucleótido marcado detectablemente que se hibridiza a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de biomarcador o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico de biomarcador. El kit ? ß?? también comprender, por ejemplo un agente regulador del pH, un conservador o un agente estabilizante de proteína. El kit puede comprender además componentes necesarios para detectar el marcador detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato) . El kit puede también contener una muestra testigo o una serie de muestras testigo que pueden ser analizadas y comparadas con la muestra de prueba. Cada componente del kit puede estar encerrado dentro de un recipiente individual y todos los varios recipientes pueden estar dentro de un solo empaque, junto con instrucciones para interpretar los resultados de los análisis efectuados utilizando el kit.
B . Mé odos de tratamiento Algunos métodos de la invención comprenden además administrar un antagonista de VEGF a un paciente con un nivel incrementado de VEGFm en comparación con una muestra de referencia. Otras modalidades de la invención proveen métodos de tratamiento de un paciente con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, una dosis puede ser administrada, varias dosis divididas pueden ser administradas en el tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada proporcionalmente como se indica por las deficiencias de la situación terapéutica.
El médico que tiene habilidad ordinaria en el arte puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida, dependiendo de factores tal como el tipo particular del agente anti-cáncer. Por ejemplo, el medico . podría iniciar con dosis de cada agente anti-cáncer, tal como un anticuerpo anti-VEGF-A, empleado en la composición farmacéutica a niveles más bajos que aquel requerido con el fin de obtener el efecto terapéutico deseado y gradualmente incrementar la dosificación hasta que se obtiene el efecto deseado. La efectividad de una dosis dad o régimen de¦ tratamiento dado del antagonista puede ser determinada, por ejemplo al determinar signos y síntomas en el paciente utilizando medidas de eficacia estándar.
En todavía otra modalidad, el sujeto es tratado con el mismo agente anti-cáncer tal como un anticuerpo anti-VEGF-A por lo menos dos veces. Así, las exposiciones del antagonista inicial y el segundo antagonista son preferiblemente con el mismo antagonista y más preferiblemente todas las exposiciones antagonistas son con el mismo antagonista, esto es tratamiento para las dos primeras exposiciones y preferiblemente todas las exposiciones, es con un tipo de agente anti-cáncer, por ejemplo un antagonista que se enlaza a VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo todo con bevacizumab.
En todos los métodos de la invención resumidos en la presente, el agente anti-cáncer (tal como un anticuerpo que se enlaza a VEGF) puede estar sin conjugar, tal como un anticuerpo descubierto o puede estar conjugado con otra molécula para efectividad adicional, por ejemplo para mejorar la vida media.
Un agente anti-cáncer preferido en la presente es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF y preferiblemente bevacizumab.
. En otra modalidad, el antagonista de VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) es el único medicamento administrado al sujeto.
En una modalidad, el antagonista en un anticuerpo anti-VEGF es administrado a una dosis de alrededor de 100 o 400 mg cada 1, 2, 3 o 4 semanas o es administrado a una dosis de alrededor de 1, 3, 5, 7.5, 10 o 15 mg/kg cada 1, 2, 3 o 4 semanas. La dosis puede ser administrada como una sola dosis o como múltiples dosis (por ejemplo, 2 o 3 dosis) tales como infusiones .
En todavía otro aspecto, la invención provee, después de la etapa de diagnosis, un método para determinar si se continua administrando un agente anti-cáncer (por ejemplo, un anticuerpo VEGF) a un sujeto diagnosticado con cáncer que comprende medir la reducción en tamaño del tumor, utilizando técnicas de representación de imagen tal como radiografía y/o MRI después de la administración del antagonista una primera vez, medir la reducción del tamaño del tumor en el sujeto utilizando técnicas de representación de imagen tal como radiografía y/o MRI después de la administración del antagonista de una segunda vez, comparar los hallazgos de representación de imagen en el sujeto en la primera vez y la segunda vez y si la puntuación es menor en la segunda vez que en la primera vez, continuar la administración del antagonista.
En todavía una modalidad adicional, se incluye una etapa en el método de tratamiento para probar la respuesta del sujeto al tratamiento después de la etapa de administración para determinar que el nivel de respuesta es efectivo para tratar la alteración angiogénica. Por ejemplo, una etapa es incluida para probar la puntuación de representación de imagen (radiográfica y/o MRI) después de la administración y compararla con resultados de representación de imagen de referencia obtenidos antes de la administración para determinar si el tratamiento es efectivo al medir si y por cómo ha cambiado. Esta prueba puede ser repetida a varios intervalos de tiempo programado o sin programar después de la administración para determinar el mantenimiento de cualquier remisión parcial o completa.
En una modalidad de la invención, ninguno otro medicamento que el antagonista de VEGF tal como anticuerpo anti-VEGF es administrado al sujeto para tratar cáncer.
En cualquiera de los métodos en la presente, el agente anti-cáncer puede ser administrado en combinación con una cantidad efectiva de un (os) agente (s) ¾ adicional (es) . Agente (s) adicional (es) apropiado (s) incluye (n) , por ejemplo un agente anti-linfangiogenico, un agente anti-angiogénico, un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico o combinaciones de los mismos .
Todos estos agentes adicionales pueden ser usados en combinación entre sí o por si mismos con el primer medicamento, de tal manera que la expresión "agente adicional" como se usa en la presente no significa que es el único medicamento además del antagonista de VEGF. Así, el agente adicional no necesita ser un solo agente, sino que puede constituir o comprender más de uno de tales f rmacos .
Estos agentes adicionales como se resume en la presente son en general usados en las mismas dosificaciones y con rutas de administración como se usan anteriormente en la presente o alrededor de 1 a 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora. Si tales agentes adicionales son usados, preferiblemente, son usados en cantidades más bajas que si el primer medicamento no estuviera presente, esencialmente en dosificaciones subsecuentes más allá de la dosificación inicial con el primer medicamento, para eliminar o reducir efectos secundarios provocados por el mismo.
Para los métodos de re-tratamiento descritos en la presente, en donde un (os) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) en una cantidad efectiva con una exposición de antagonista, puede ser administrado con cualquier exposición, por ejemplo solo con una exposición o más de una exposición. En una modalidad, el (los) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) con las exposiciones iniciales y segundas exposiciones. En todavía una modalidad adicional, el (los) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) con todas las exposiciones, es preferido que después de la exposición inicial, tal como de esteroide, la cantidad de tal (es) agente (s) adicional (es) sea reducida o eliminada para reducir la exposición del sujeto a un agente con efectos secundarios tales como prednisona, prednisolona, metilprednisolona y ciclofosfamida.
La administración combinada de un (os) agente (s) adicional -' (es) incluye co-administración (administración concurrente) , utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva de un órgano u otro, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos (medicamentos) ejercen simultáneamente actividades biológicas.
La terapia anti-cáncer es administrada mediante medios apropiados, incluyendo administración parenteral, tópica, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar, intranasal y/o intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa (i.v.), intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La administración intratecal es también contemplada. Además, el agente anti-cáncer puede apropiadamente ser administrada mediante infusión pulsada, por ejemplo con dosis declinantes del agente anti-cáncer. Preferiblemente, la dosificación es dada intravenosa o subcutáneamente y más preferiblemente mediante infusión (es) intravenosa (s) .
Se proveen múltiples exposiciones de agentes anti-cáncer, cada exposición puede ser provista utilizando los mismos o diferentes medios de administración. En una modalidad, cada exposición es mediante administración intravenosa. En otra modalidad, cada exposición es dada mediante administración subcutánea. En todavía otra modalidad, las exposiciones son dadas mediante administración intravenosa y administración subcutánea.
En una modalidad, el agente anti-cáncer tal como un anticuerpo anti-VEGF es administrado como una infusión intravenosa lenta en lugar de un empuje intravenoso o bolo. Por ejemplo, un esteroide tal como prednisolona o metilprednisolona (por ejemplo, alrededor de 80-120 mg i.v., más específicamente alrededor de 100 mg i.v.) es administrado alrededor de 30 minutos antes de cualquier infusión de un anticuerpo anti-VEGF. El anticuerpo anti-VEGF es por ejemplo aplicado por infusión por medio de una línea dedicada.
Para la dosis inicial de una exposición de multidosis al anticuerpo anti-VEGF o para la única dosis si la exposición involucra una sola dosis, tal infusión es preferiblemente comenzada a una velocidad de alrededor de 50 mg/h. esta puede ser escalada, por ejemplo a una velocidad de incremento alrededor de 50 mg/h cada alrededor de 30 minutos a un máxima de alrededor de 400 mg/h. sin embargo, si el sujeto está experimentando una reacción relacionada con la infusión, la velocidad de infusión es preferiblemente reducida, por ejemplo a la mitad de la velocidad actual, por ejemplo de 100 mg/h a 50 mg/h. preferiblemente, la infusión de tal dosis de anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, una dosis total de alrededor de 1000 mg) es consumada en alrededor de 255 minutos (4 horas 15 minutos) . Opcionalmente, los sujetos reciben un tratamiento profiláctico de acetaminofén/paracetamol (por ejemplo, alrededor de 1 g) y difenhidramina HC1 (por ejemplo, alrededor de 50 mg o dosis equivalente de agente similar) por la boca alrededor de 30 a 60 minutos antes del inicio de una infusión.
Si más de una infusión (dosis) de anticuerpo anti-VEGF es dad para obtener la exposición total, la segunda infusión o infusiones del anticuerpo anti-VEGF subsecuentes en esta modalidad de infusión son preferiblemente comenzadas a una velocidad más alta que la infusión inicial, por ejemplo alrededor de 100 mg/h. esta velocidad puede ser escalada, por ejemplo a una velocidad de incremento de alrededor de 100 mg/h cada alrededor de 30 minutos a un máximo de alrededor de 400 mg/h. los sujetos que experimentan una reacción relacionada con la infusión preferiblemente tienen la velocidad de infusión reducida a la mitad de aquella velocidad, por ejemplo de 100 mg/h a 50 mg/h. preferiblemente, la infusión de tal segunda dosis o dosis subsecuente del anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, una dosis total de alrededor de 1000 mg es consumada por alrededor de 195 minutos (3 horas 15 minutos) ) .
En una modalidad preferida, el agente anti-cáncer es un anticuerpo anti-VEGF y es administrado en una dosis de alrededor de 0.4 a 4 gramos y más preferiblemente, el anticuerpo es administrado en . una dosis de alrededor de 0.4 a 1.3 gramos a una frecuencia de una a cuatro dosis en un periodo de alrededor de un mes. Todavía más preferiblemente, la dosis es de alrededor de 500 mg a 1.2 gramos y en otra modalidad es de alrededor de 750 mg a 1.1 gramos. En tales aspectos, el antagonista es preferiblemente en dos a tres dosis y/o es administrado dentro de un periodo de alrededor de dos a tres semanas .
En una modalidad, el sujeto nunca ha sido administrado previamente con fármaco (s) para tratar el cáncer. En otra modalidad, el sujeto o paciente ha sido administrado previamente con uno o más medicamentos para tratar el cáncer. En una modalidad adicional, el sujeto o paciente no fue responsivo a uno o más de los medicamentos que han sido administrados previamente. Tales fármacos a los cuales el sujeto puede ser no responsivo incluyen, por ejemplo agentes anti-neoplásicos, agentes' quimioterapéuticos , agentes citotóxicos y/o agentes inhibidores de crecimiento. Mas particularmente, los fármacos a los cuales el sujeto puede no ser responsivo incluyen, antagonistas de VEGF, tales como anticuerpos anti-VEGF. En un aspecto adicional, tal agente anti-cáncer incluye un anticuerpo o inmunoadhesina, de tal manera que el re-tratamiento es contemplado con uno o más anticuerpos o inmunoadhesinas de esta invención a los cuales el sujeto fue anteriormente no responsivo.
IV. Tratamiento con el agente anti-cáncer Una vez que la población de pacientes más responsiva o sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF ha sido identificada, el tratamiento con el antagonista de VEGF solo en combinación con otros medicamentos, da como resultado un beneficio terapéutico al paciente con cáncer. Por ejemplo, tal tratamiento puede dar como resultado una reducción en el tamaño del tumor o supervivencia libre de avance. Además, el tratamiento con la combinación de un agente anti-cáncer y por lo menos un (os) agente (s) adicional (es) da como resultado pre eriblemente en un beneficio terapéutico aditivo más preferiblemente sinergista (o mayor que aditivo) al paciente. Preferiblemente, en este método combinado, la sincronización entre por lo menos una administración del (los) agente (s) adicional (es) en por lo menos una administración del agente anti-cáncer es de alrededor de 1 mes o menos, mas preferiblemente alrededor de dos semanas o menos.
Se apreciara por aquel de habilidad en las artes médicas que la manera exacta de administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente anti-cáncer enseguida de la diagnosis de la probable responsividad en paciente al agente anti-cáncer será a discreción del medio que atiende. El modo de administración, incluyendo dosificación, combinación con otros agentes, sincronización y frecuencia de administración y semejantes, pueden ser afectados por la diagnosis de la responsividad probable del paciente a tal agente anti-cáncer, también como la condición e historia del paciente. Así, aun pacientes diagnosticados con una alteración que son predictivos a ser relativamente insensibles al agente anti-cáncer se pueden todavía beneficiar del tratamiento con el mismo, particularmente en combinación con otros agentes, incluyendo agentes que pueden alterar la responsividad del paciente al agente anti-cáncer.
La composición que comprende un agente anti-cáncer puede ser formulada, dosificada y' administrara de manera consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración con este contexto incluyen el tipo de alteración particular que es tratada, el mamífero particular que es tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la alteración angiogénica, el sitio de administración del agente, efectos secundarios posibles, el tipo de antagonista, el método de administración, el horario de administración y otros factores conocidos de los prácticos médicos. La cantidad efectiva del agente anti-cáncer a ser administrado será determinada por tales consideraciones.
Como una propuesta general, la cantidad efectiva del agente anti-cáncer administrado parenteralmente por dosis estará en el intervalo de alrededor de 20 mg a alrededor de 5000 mg por una ó más dosificaciones. Regímenes de dosificación ejemplares para anticuerpos tales como anticuerpos anti-VEGF incluyen 100 a 400 mg cada 1, 2, 3 o 4 semanas o es- administrado a una dosis de alrededor de 1, 3, 7.5, 10, 15 o 20 mg/h cada 1, 2, 3 o 4 semanas. La dosis puede ser administrada como una sola dosis o como múltiples dosis (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tales como infusiones.
Como se indica anteriormente, sin embargo, esta cantidad es sugerida de agente anti-cáncer son sometidas a mucho de la discreción terapéutica. El factor clave en la selección de una dosis apropiada y horario es el resultado obtenido, como se indica anteriormente. En algunas modalidades, los agentes anti-cáncer administrados tan cercanos al primer signo, diagnosis, apariencia o presencia de alteraciones posibles.
El agente anti-cáncer es administrado mediante cualquier medio apropiado, incluyendo administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal y/o intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. La administración intratecal es también contemplada. Además, el antagonista puede apropiadamente ser administrado mediante infusión pulsada, por ejemplo con dosis declinantes del antagonista. Más preferiblemente, la dosificación es dada mediante inyecciones intravenosas .
Se puede administrar un (os) agente (s) adicional (es) , como se indica anteriormente con los agentes anti-cáncer de la presente. La administración combinada incluye coadministración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva, ya sea en un orden u otro, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en tanto que ambos (o todos) agentes . activos simultáneamente pierden sus actividades biológicas .
Además de la administración agentes anti-cáncer al paciente por rutas tradicionales tales como se indica anteriormente, la presente invención incluye administración mediante terapia genética. Tal administración de ácidos nucleicos que codifican el agente anti-cáncer es abarcada en la expresión "administración de una cantidad efectiva de un agente anti-cáncer". Véase, por ejemplo WO 1996/07321 concerniente con el uso de terapia genética para generar anticuerpos intracelulares .
Hay dos procedimientos principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) a las células del paciente: in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo el ácido nucleico es inyectado directamente al paciente usualmente en el sitio en donde el antagonista es requerido. Para el tratamiento extendido, las células del pacientes son removidas, el ácido nucleico es dirigido a esta células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente ya sea directamente o, por ejemplo encapsuladas dentro las membranas porosas que son implantadas al paciente (véase Patente Estadounidense 4,892, 538 y 5,283,187). Hay una variedad de técnicas para introducir ácido nucleico a células viablés. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped propuestos. Técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico a células mamíferas in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, micro inyección, fusión celular, DEAE-dextrana, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector usado comúnmente para administración ex vivo del gen es un retrovirus .
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de herpes simplex I o virus-asociados) y sistemas a base de lípido (lípidos útiles para transferencia lípido-moderada del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones, es deseable proveer la fuente de ácido nucleico con un agente especifico por las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular sobre la célula objetivo, un ligando para un receptor sobre la célula objetivo, etc. En donde se emplean liposomas, las proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis puede ser usada para apuntamiento y/o para facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de cápsido o fragmentos de los mismos trópicos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en los ciclos y proteínas que apuntan a localización intracelular y mejoran la vida media intracelular . La técnica de endocitosis receptor-mediada es descrita, por ejemplo por Wu, G.Y. and Wu, C.H., J. Biol . Chem. 262 (1987) 4429-4432; and Wagner, E. et al., PNAS USA 87 (1990) 3410-3414. Protocolos de marcación genética y de terapia genética son descritos por ejemplo, en Anderson, W.F., Science 256 (1992) 808-813 y WO 1993/25673.
Un agente anti-cáncer puede ser combinado en una formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación como terapia combinada, con por lo menos un compuesto adicional que tiene propiedades anti-cáncer. El por lo menos un compuesto adicional de la formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación tiene preferiblemente actividades complementarias a la composición de antagonista de VEGF de tal manera que no se afectan adversamente entre sí.
El por lo menos un compuesto adicional puede ser un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, una citoquina, un agente inhibidor de crecimiento, un agente anti-hormonal, un agente anti-angiogénico, un agente anti-linfangiogenico y combinaciones de los mismos . Tales moléculas están apropiadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado. Una composición farmacéutica que contiene un antagonista de VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) puede también comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico o combinaciones dé los mismos.
En un aspecto, el primer compuesto es un anticuerpo anti-VEGF y por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo terapéutico diferente del anticuerpo anti-VEGF. En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo que se enlaza a un marcador de superficie de célula de cáncer. En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo anti-HER2, trastuzumab (por ejemplo, Herceptin®, Genentech, Inc., Sur de San Francisco, CA) . En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo anti-HER2, pertuzumab Omnitarg™, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, véase Patente Estadounidense 6,949,245). En una modalidad, en por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo (ya sea un anticuerpo descubierto o un ADC) y el anticuerpo adicional es un segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto anticuerpo o más, de tal manera que una combinación de tal segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto o más anticuerpos (ya sea descubiertos o como un ADC) es eficaz en el tratamiento de una alteración angiogénica.
Otros regímenes terapéuticos de acuerdo con esta invención pueden incluir la administración de un agente anti-cáncer VEGF-antagonista. e incluyendo sin limitación terapia de radiación y/o trasplante de medula ósea y trasplante de sangre periférica y/o un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor de crecimiento. En una de tales modalidades, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes, tales como por ejemplo ciclofosfoamida, hidroxidaunorubicina, adriamicina, doxorubicina, vincristina (ONCOVIN™) , prednisolona, CHOP, CVP o COP o inmunoterapeuticos tales como anti-PSCA, anti-HER2 (por ejemplo, HERCEPTIN®, OMNITARG™) . La terapia combinada puede ser administrada como un régimen simultáneo o secuencial. Cuando es administrada secuencialmente , la combinación puede ser administrada en dos o más administraciones. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en uno u otro orden, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo (en tanto que ambos o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.
En una modalidad, el tratamiento con anticuerpo anti- VEGF involucra la administración combinada de un agente anti-cáncer identificado en la presente y uno, dos o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, incluyendo co-administración de cocteles de agentes quimioterapéuticos diferentes. Agentes quimioterapéuticos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina . Los horarios de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden ser usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por aquel experimentado en el arte. Los horarios de preparación y dosificación para tal quimioterapia son también descritos en Perry, M.D. (ed. ) , "Chemotherapy Service", Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) .
Dosificaciones apropiadas para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores son aquellos usados actualmente y pueden ser disminuidos debido a la acción combinada (sinergia) del agente recién identificado y otros agentes quimioterapéuticos .
La terapia combinada puede proveer "sinergia" o probar ser "sinergista", esto es, el efecto obtenido cuando los ingredientes activos usados conjuntamente es mayor que la suma de los efectos que resultan de usar los compuestos separadamente. Un efecto sinergista puede ser obtenido cuando los ingredientes activos son: (1) co- formulados y administrados o alimentados simultáneamente en una formulación de dosificación unitaria combinada (2) administrados mediante alternación o en paralelo como formulaciones separadas o (3) por algún otro régimen. Cuando son administrados en terapia de alteración, un efecto sinergista puede ser obtenido cuando los compuestos son administrados o alimentados secuencialmente, por ejemplo mediante inyecciones diferentes en jeringas separadas. En general, durante la terapia alternante, una dosificación efectiva de cada ingrediente activo es administrada secuencialmente, esto es serialmente, mientras que en la terapia combinada, dosificaciones efectivas de dos o más ingredientes activos son administradas conjuntamente.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada del agente terapéutico adicional dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, el tipo de anticuerpo, la severidad y curso de la enfermedad, si el antagonista de VEGF y agente adicional son administrados por propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al antagonista de VEGF y agente adicional y la discreción del médico que atiende. El antagonista de VEGF y agente adicional son administrados apropiadamente al paciente en una vez o en una serie de tratamiento. El antagonista de VEGF es administrado comúnmente como se resume anteriormente. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, alrededor de 20 mg/m2 a 600 mg/m2 del agente adicional es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea por ejemplo por una o más alimentaciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de alrededor de 20 mg/m2, 85 mg/m2, 90 mg/m2, 125 mg/m2, 200 mg/m2, 400 mg/m2, 500 mg/m2 o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas en varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es t sostenido hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Así, una o más dosis de alrededor de 20 mg/m2, 85 mg/m2, 90 mg/m2, 125 mg/m2, 200 mg/m2, 400 mg/m2, 500 mg/m2 (o cualquier combinación de las mismas) pueden ser administrados al paciente. Tales dosis pueden ser administradas intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada dos, tres, cuatro, cinco o seis (por ejemplo, de tal manera que el paciente recibe de alrededor de dos a alrededor de veinte, por ejemplo, de alrededor de seis dosis del agente adicional) . Una dosis de carga más alta inicial, seria por una o más dosis más bajas puede ser administrada. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El avance de esta terapia es monitoreado fácilmente mediante técnicas y análisis convencionales .
V. Formulaciones farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los antagonistas usados de acuerdo . con la presente invención son preparadas para almacenamiento al mezclar el antagonista que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente opcionales en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Para información general concerniente con formulaciones, véase, por ejemplo Gilman et al. (eds.), The Pharmacologicál Bases of- Therapeutics, 8th ed. , Pergamon Press (1990); Gennaro, A. (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylyania (1990); Avis et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY (1993); Lieberman et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms : Tablets , Dekker, NY (1990); and Lieberman et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY (1990); Walters, K.A. (ed.), Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), vol 119, Marcel Dekker (2002).
Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de benctonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol, resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tale como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra iones formadores de sal, tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos tal como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) .
Formulaciones de anticuerpo anti-VEGF ejemplares son descritas en la Patente Estadounidense 6,884,879. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-VEGF son formulados a 25 mg/ml en frascos de un solo uso. En ciertas modalidades, 100 mg de los anticuerpos anti-VEGF son formulados en 240 mg de alfa, alfa-trehalosa dihidratada, 23.2 mg de fosfato de sodio (monobásico, monohidratado) , 4.8 mg de fosfato de sodio (dibasico anhidro), 1.6 mg de polysorbate 20 y agua para inyección, USP. En ciertas modalidades, 400 mg de los anticuerpos anti-VEGF son formulados en 960 mg, de , a-trehalosa dihidratada, 92.8 mg de fosfato de sodio (monobásico, monohidrataddo) , 19.2 mg de fosfato de sodio (dibasico anhidro), 6.4 mg de polysorbate 20 y agua para inyección, USP.
Formulaciones liofilizadas aptas para administración subcutánea son descritos por ejemplo en la Patente Estadounidense 6,267,958. Tales formulaciones liofilizadas pueden ser reconstituidas con un diluyente apropiado a una alta concentración de proteína y la formulación reconstituida puede ser administrada subcutáneamente al mamífero a ser tratado en la presente .
Formas cristalizadas del antagonista son también contempladas. Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 2002/0136719A1.
La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo (un (os) agente (s) adicional (es) como se indica anteriormente) , preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre si. El tipo y las cantidades efectivas de tales medicamentos dependen, por ejemplo de la cantidad y tipo del antagonista de VEGF presente en la formulación y parámetros clínicos de los sujetos. Los preferidos de tal (es) agente (s) adicional (es) son indicados anteriormente.
Los ingredientes activos pueden también estar ' atrapados en micro cápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, Por ejemplo, micro cápsulas hidroximetilcelulosa o micro cápsulas de gelatina y micro cápsulas de poli- (metilmetacrilatos) , respectivamente en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, micro esferas de albúmina, micro emulsiones, nano partículas y nano capsulas) o en macro emulsiones. Tales técnicas son reveladas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. , Osol, A. (ed. ) (1980) .
Preparaciones de liberación sostenida pueden ser preparadas. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o micro cápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (vinil alcohol) , polilacturos (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y Y etil-L-glutamato, copolímero de etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicolico degradables tales como LUPORN DEPO™ (micro esferas inyectable compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicolico y acetato de leuproluro) y acido poli-D- ( - ) -3 -hidroxibutirico .
Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo deben . ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membrana de filtración estéril .
VI. Kits Para uso en la detección de VEGFm, kits o artículos de manufactura son también provistos por la invención. Tales kits pueden ser usados para determinar si un sujeto con cáncer será efectivamente responsivo a una terapia de agente anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF (incluyendo, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF tal como bevacizumab) . Estos kits pueden comprender un medio de portador que es dividido en compartimientos para recibir en confinación estrecha uno o más medios de recipiente tales como frascos, tubos y los semejantes. Cada uno de los medios de recipiente comprende uno de los elementos separados a ser usados en el método. Por ejemplo, uno. de los medios de recipiente puede comprender un compuesto que se enlaza específicamente a VEGFm .
Tal kit comprenderá comúnmente el recipiente descrito anteriormente y uno u otro más de otros recipientes que comprende materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para uso. Una etiqueta puede estar presente sobre el recipiente para indicar que la composición es usada para una aplicación específica y puede también indicar instrucción ya sea para uso in vivo o in vitro, tales como aquellos descritos anteriormente.
Los kits de la invención tienen un número de modalidades. Una modalidad típica es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre dicho recipiente y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición incluye un compuesto que se enlaza específicamente a VEGFm y la etiqueta sobre el recipiente indica que la composición puede ser usada para detectar VEGFm y en donde el kit incluye instrucciones para usar el (los) compuesto (s) para detectar VEGFm · El k t puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar y usar el (los) compuesto (s) .
Otros componentes opcionales del kit incluyen una o más soluciones reguladoras del pH (por ejemplo, solución reguladora del pH de dilución, etc.), otros reactivos tales como portador (por ejemplo, dextrana, albúmina) . Los ki s pueden también incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos usando el kit .
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son provistos para ilustrar pero no limitar la invención reivindicada, actualmente .
Ejemplo 1 En la prueba AVADO (BO17708) , pacientes con cáncer de pecho recurrente avanzado localmente o cáncer de pecho HER-2 negativo metastático fueron aleatorizados a docetaxel 100 mg/m2 mas bevacizumab 7.5 mg/kg cada 3 semanas (n=248),. bevacizumab 15 mg/kg (n=247) cada 3 semanas o placebo (n=241) , véase, Miles, J. Clin. Oncol . 24, May 2010 (e-published) ) .
Las muestras de referencia en el plasma sanguíneo estuvieron disponibles de 396 pacientes en esta prueba.
Una investigación del estatus de biomarcadores relacionados con angiogénesis y tumorigenesis revelo que los niveles de expresión de tres biomarcadores en relación con niveles de control determinados en la toda la población de pacientes de biomarcador se correlacionaron con un parámetro de tratamiento mejorado. En particular, los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGF-A en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador, demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel. Los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFR2 en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de ' biomarcador, demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel. También, los pacientes que exhiben un nivel de expresión combinado más alto de VEGF-A y VGFR2 en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador. Demostró una •supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel. Además, los pacientes que exhiben un nivel de expresión combinado más alto de VEGF-A y PLGF en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes, demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel.
Pacientes y métodos inmuno químicos Un total de 736 pacientes participaron en el estudio BO17708 y muestras de plasma sanguíneo de 396 de los participantes estuvieron disponibles para análisis de biomarcador. Las características de referencia de los 396 pacientes en el análisis de biomarcador y los pacientes restantes para los cuales ningún análisis de biomarcador fue posible son provistos en la Tabla 1A y Tabla IB.
Tabla 1A. Características de referencia Tabla IB. Características de referencia Análisis de plasma sanguíneo Muestras de plasma fueron recolectadas después de la aleatorización y antes de que cualquier tratamiento de estudio fuera administrado. Todas las muestras fueron obtenidas de pacientes que fueron después de esto tratados con docetaxel 100 mg/m2 mas ya sea bevacizumab 7 . 5 mg/kg cada tres semanas. Bevacizumab 15 mg/kg cada tres semanas o placebo hasta el avance de la enfermedad.
Un total de 4.9 mi de sangre fueron extraídas a un tubo S-monovette® (y un tubo de plasma filtrado para los 16 pacientes en terapia de anticoagulantes) . Fueron mezclados inmediatamente después de esto mediante inversión suave del tubo y fueron centrifugados a 30 minutos a aproximadamente 1500 g en centrifuga (temperatura ambiente por 10 minutos) . Inmediatamente después de esto, el plasma del sobrenadante fue sometido a alícuotas en un tubo de transferencia de 5 mi de polipropileno claro. Después de esto, el plasma fue tomado en alícuotas en dos tubos de almacenamiento de plástico (aproximadamente 1.25 mi cada uno). Las muestras fueron almacenadas en posición vertical a -70 °C. En algunos casos, las muestras fueron almacenadas a -20°C por hasta un mes y luego transferidos a -70 °C.
Las muestras fueron usadas para la medición de niveles de VEGF-A, VEGF receptor-1 (VEGFR1) , VEGFR2 , PLGF and E-SELECTIN utilizando un dispositivo Immunological MultiParameter Chip Technology (IMPACT) de Roche Diagnostics GmbH .
Tecnología de análisis Multiplex IMPACT Roche Professional Diagnostics (Roche Diagnostics GmbH) ha desarrollado una plataforma de muítimarcador bajo el nombre de trabajo IMPACT (Immunological MultiParameter Chip Technology) . Esta tecnología fue usada para la medición de los marcadores de proteína mencionados anteriormente en ' la sección de "análisis de plasma sanguíneo" . La tecnología está basada en un chip de poliestireno pequeño manufacturado mediante procedimientos como se revela en EP 0939319 y EP 1610129. La superficie del chip fue recubierta con una capa de estreptavidina, sobre la cual los anticuerpos biotinilados fueron luego manchados para cada análisis. Para cada marcador, puntos de anticuerpo fueron cargados en una línea vertical sobre el chip. Durante el análisis, el arreglo fue sondeado con muestras de espécimen que contienen los analitos específicos.
El volumen de plasma requerido por espécimen para medir todos los marcadores en un chip fue de 8 µ?, que fue aplicado junto con 32 µ? de una solución reguladora del pH de incubación (HEPES 50 mM, pH 7.2, NaCl 150 mM, Thesit al 0.1%, albúmina de suero bovina al 0.5% y Oxipirion al 0.1% como agente conservador) . Después de la incubación por 12 minutos y lavado del chip utilizando una solución reguladora del pH de lavado (Tris 5 mM, pH 7.9, Thesit al 0.01% y Oxipirion al 0.001%) la mezcla de anticuerpo monoclonal digoxigenilada fue agregada (40 µ? de solución reguladora del pH de incubación que incluye una mezcla de los anticuerpos analitos-específicos marcados con Digoxigenina) y fue incubado por 6 minutos adicionales para enlazarse sobre los analitos capturados. El segundo anticuerpo fue finalmente detectado con 40 µ? de una solución reguladora del pH de reactivo (TAPS 62.5 mM, pH 8.7, NaCl 1.25 M, albúmina de suero bovino al 0.5%, Tween 20 al 0.063% y Oxipirion al 0.1%) incluyendo un conjugado de anticuerpo anti-digoxigenina acoplado con látex fluorescente. Utilizando este marcador, 10 eventos de enlace individuales en un solo punto podrían ser detectados, dando como resultado una sensibilidad muy alta hasta la concentración de fmol/L. los chips fueron transportados a la unidad de detección y una cámara de dispositivo de carga acoplado (CCD) genero una imagen que fue transformada en intensidades de señal utilizando elementos de programación especializados. Los puntos individuales fueron localizados automáticamente a posiciones predefinidas y cuantificados mediante análisis de imagen. Para cada marcador líneas de 10112 puntos fueron cargados sobre los chips y un mínimo de 5 puntos fueron requeridos para determinar la concentración media de muestras. Las ventajas de la tecnología son la habilidad de multiplexión de hasta 10 parámetros en un formato de emparedado o formato competitivo. Los calibradores y muestras de paciente fueron medidas por duplicado. Una corrida fue designada para contener un total de 100 determinaciones, incluyendo dos multi controles como control de corrida. Puesto que algunos de los analitos seleccionados reaccionan entre sí (esto es, VEGF-A y PGLF con VEGFRl o VEGFR2 o VEGF-A forma heterodímeros con PLGF) , los 5 analitos fueron divididos en tres diferentes chips como sigue : Chip 1: VEGF-A Chip 2: VEGFR1 , VEGFR2 , E-Selectin Chip 3 : PLGF Los siguientes anticuerpos fueron usados para los diferentes análisis: Análisis estadístico La mediana de la muestra fue usada para dicotomizar valores de biomarcador como bajos (debajo de la mediana) o alto (en o por encima de la mediana) .
La proporción de peligro del efecto de tratamiento en el subgrupo de pacientes con niveles altos o bajos de biomarcador fue estimada con análisis de regresión de cox de peligro proporcional.
Además, regresiones de cox de peligro proporcional fueron usadas para evaluar la asociación entre el nivel de biomarcador y el efecto de tratamiento. El modelo incluyo los siguientes co-variados: tratamiento de prueba, nivel de biomarcador, factores de estratificación binarios (estatus de ER/PgR, enfermedad medible en la referencia, terapia de taxano de adyuvante previa) , termino de interacción de tratamiento por nivel de biomarcador. La prueba de Wald para el término de interacción fue usada para determinar la asociación entre el nivel de biomarcador y el texto de tratamiento. El valor de P menor de 0.05 fue considerado significativo .
Resultados Marcadores de plasma sanguíneo La estadísticas descriptivas de referencia de los biomarcadores son presentados en la Tabla 2.
Tabla 2 : Estadística descriptiva de valores de biomarcador (referencia) La Tabla 3 presenta los resultados del análisis de la asociación de VEGF-A o VEGFR2 con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance.
Tabla 3: En este análisis, para VEGF-A, bajo VEGF-A (<125 pg/ml) y alto VEGF-A (> 125 pg/ml) y para VEGFR2 , bajo VEGFR2 (<11 ng/ml) y alto VEGFR2 (= 11 ng/ml) fueron usados.
Estos resultados muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGF-A en comparación con pacientes con VEGF-A. Estos resultados también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFR2 en comparación con pacientes con bajo VEGFR2. La misma tendencia es observada cuando se compara alta y baja dosis de bevacizumab con placebo, la evidencia estadística de diferencia entre el subgrupo de marcador alto y bajo es más fuerte en los pacientes tratados con baja dosis de bevacizumab. Por consiguiente, VEGF-2 y VEGFR2 son cada uno biomarcadores predictivos independientes para el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance .
La Tabla 4 presente el análisis de combinación de biomarcador en asociación con el efecto de tratamiento con la supervivencia libre de avance para baja dosis (7.5 mg/kg cada 3 semanas) bevacizumab y para alta dosis (15 mg/kg cada 3 semanas) de bevacizumab.
Para este análisis Formula 1: norm (VEGF-A) +1.3 *norm (VEGFR2 ) Formula Equivalente: 0.71*log2 (VEGF-A) +3.16*log2 (VEGFR2 ) -15.6 y Formula 2: 0.25*norm (VEGF-A) +0.21*norm (PLGF) formula Equivalente: 0.18*log2 (VEGF-A) +0.42*log2 (PLGF) -3.1 en donde se usó la transformación log2 y _ log 2 ( x , ) - median (log 2 ( x )) mad (log 2 ( x )) En donde mad es la desviación absoluta mediana ajustada por un valor de 1.4826.
Tabla 4 : Asociación con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance (análisis de bi-marcador) para baja dosis (7.5 mg/kg cada 3 semanas) de bevacizumab y para alta dosis (15 mg/kg cada 3 semanas) de bevacizumab En este análisis, un nivel de expresión combinado alto de VEGF-A y VEGFR2 es Formula 1 > 0.132 y un nivel de expresión combinado bajo de VEGF-A y VEGFR2 es Formula 1 < 0.132 y un nivel de expresión combinado alto VEGF-A y PLGF es Formula 2 = 0.006 y un nivel de expresión combinado bajo de VEGF-A y PLGF es Formula 2 < 0.006.
Estos resultados muestran que la proporción de peligro por el efecto del tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con una combinación alta de VEGF-A y VEGFR2 en comparación con la combinación baja de VEGF-A y VEGFR2. Estos resultados también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con una combinación alta de VEGF-A y PLGF en comparación con pacientes con una combinación baja de VEGF-A y PLGF. La misma tendencia es observada cuando se compara una baja y alta dosis de bevacizumab con placebo, la evidencia estadística de diferencia entre el subgrupo de biomarcador alto y bajo es más fuerte en pacientes tratados con baja dosis de bevacizumab. Por consiguiente, la combinación de VEGF-A y VEGFR2 y la combinación de VEGF-A y PLGF son cada una biomarcadores predictivos independientes para el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance .
El valor predictivo de VEGF-A en el brazo de bevacizumab de 15 mg/kg fue explorado adicionalmente al subdividir el cohorte en cuartiles de acuerdo con los niveles de VEGF-A. los intervalos de confianza a 95% para todos los cuartiles se traslaparon. En el primer cuartil (< 64 pg/ml) , se observó un efecto de tratamiento muy limitado (proporción de peligro 0.86). en el cuartil más alto (>240 pg/ml), la proporción de peligro de PFS fue de 0.39 (95% CI : 0.19-0.77) y la diferencia en PFS mediana fue más pronunciada que en los otros grupos. En general, los valores estimativos puntuales de los cuartiles muestran una mejora consistente en la proporción de peligro con niveles incrementados de VEGF-A. Estos resultados son mostrados en la Tabla 5 a continuación.
Tabla 5 : PFS de acuerdo con cuartil de VEGF-A Ejemplo 2 Este ejemplo demuestra que, en base a los anticuerpos usados para detección de VEGF-A sobre la plataforma de IMPACT, las isoformas más cortas de VEGF-A son preferencialmente medidas en comparación con las isoformas más largas de VEGF-A.
El análisis fue efectuado como se describe anteriormente bajo la sección concerniente con la tecnología de IMPACT utilizando los anticuerpos enlistados en la tabla antes de la sección de "análisis estadístico" .
Cuatro diferentes formas de VEGF-A, esto es VEGFm, VEGF121 , VEGF165 y VEGF189 estuvieron disponibles y usadas en el análisis. VEGFm, VEGF121 y VEGF165 fueron comprados de R&D Systems, Minneapolis, Estados Unidos de América y VEGF189 fue obtenido de RELIATech, olfenbüttel , Alemania. Como es obvio de la Figura 11, las isoformas de VEGF-A que tienen once aminoácidos son detectadas mejor en comparación con las isoformas más largas de 165 y 189 aminoácidos, respectivamente .
Sin desear estar limitados a esta teoría, se supone que el enlace preferencial de isoformas de VEGF , cortas como VEGFm y VEGF121 , respectivamente, en este análisis podría explicar por qué en este estudio se observó un valor predictivo estadísticamente significativo, mientras que mediciones previas de VEGF-A en general habían conducido a resultados en conflicto en aquel respecto.
Ejemplo 3: Estudio aleatorizado fase III en cáncer gástrico metastático avanzado localmente no receptable de primera línea de bevacizumab en combinación con quimioterapias Este ejemplo es concerniente con el análisis de resultados obtenidos de pacientes con cáncer gástrico metastático de primera línea tratado en la prueba clínica de AVAGAST. El objetivo primario del estudio fue determinar el beneficio clínico de agregar bevacizumab a quimioterapia para tratamiento de cáncer gástrico, tal como es medido por supervivencia global (OS) . Los puntos finales secundarios incluyeron supervivencia libre de avance (PFS) , proporción de respuesta global y duración de respuesta. La quimioterapia usada en esta prueba fue una combinación de capecitabina o 5-fluorouracilo (5-FU) y cisplatino.
Diseño de . estudio 774 pacientes fueron reclutados en la prueba AVAGAST y fueron aleatorizados 1:1 a los dos siguientes brazos: Brazo A: Capecitabina oral 1,000 mg/m2 dos veces al día por 2 semanas, seguida por una semana de reposo, cada tres semanas hasta el avance de enfermedad o toxicidad no manejable o para pacientes que no se consideran apropiados para tomar capecitabina oral (debido por ejemplo a dificultad para ingerir, mala absorción u otras condiciones que podrían afectar la ingestión de medicación de capecitabina oral) , 5-fluorouracilo fue administrado en. lugar de esto a una dosis de 800 mg/m2/día como una infusión iv continua durante 5 días (días 1 a 5 de cada ciclo) cada 3 semanas y Cisplatino 80 mg/m2 como una infusión iv de 2 horas con hiperhidratacion y pre-medicación (esteroides y anti-eméticos) , cada 3 semanas por un máximo de 6 ciclos, hasta el avance de enfermedad o toxicidad no manejable.
Brazo B: Capecitabina oral 1,000 mg/m2 dos veces al día por 2 semanas, seguida por una semana de reposo, cada tres semanas hasta el avance de enfermedad o toxicidad no manejable o para pacientes que no se consideran apropiados para tomar capecitabina oral (debido por ejemplo a dificultad para ingerir, mala absorción u otras condiciones que podrían afectar la ingestión de medicación de capecitabina oral) , 5-fluorouracilo fue administrado en lugar de esto a una dosis de 800 mg/m2/día como una infusión iv continua durante 5 días (días 1 a 5 de cada ciclo) cada 3 semanas y Cisplatino 80 mg/m2 como una infusión iv de 2 horas con hiperhidratacion y pre-medicación (esteroides y antieméticos) , cada 3 semanas por un máximo de 6 ciclos, hasta el avance de enfermedad o toxicidad no manejable.
Bevacizumab (7.5 mg/kg) cada 3 semanas hasta el avance de la enfermedad o toxicidad no manejable Los brazos de tratamiento fueron equilibrados n cuanto a variables de estratificación con la excepción de enfermedad avanzada (2% vs 5%) . Aproximadamente 95% de los pacientes fueron metastáticos, dos tercios varones, 49% de Asia/pacifico, 32% de Europa y 19% de América. Las características del paciente son resumidas en la Figura 2 y 3.
Bevacizumab (AVASTIN®) fue suministrado como un líquido estéril ligeramente opalescente, para administración parenteral en dos tamaños de frasco: cada frasco de vidrio de 100 mg(25 mg/ml-4 mi llenos) contenía bevacizumab con fosfato, trehalosa, polisorbate 20 y agua estéril para inyección, USP y cada frasco de vidrio de 400 mg (25 mg/ml-16 mi llenos) contenía bevacizumab con fosfato, trehalosa, polisorbate 20 para inyección, USP. AVASTIN® fue administrado al extraer la cantidad necesaria para una dosis de 5 mg/kg y diluido en un volumen total de 100 mi de inyección de cloruro de sodio al 0.9%, USP antes de la administración intravenosa.
Métodos Los sujetos/pacientes elegibles tuvieron los siguientes criterios de elegibilidad clave: edad > 18 años, ECOG 0,1 o 2 (Escala de Estatus de Desempeño ECOG). todos los sujetos tenían adenocarcinoma confirmado histológicamente del estómago o unión gastro-esofagal con enfermedad inoperable avanzada localmente o metastática, no propensa a terapia curativa. Los sujetos pueden tener ya sea enfermedad mensurable o no mensurable pero evaluable (según los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) ) . Los sujetos que no reciben medicación anti coagulante tienen un INR menor a 1.5 y un PTT menor o igual a 1.5 x ULN con 7 días antes de la aleatorización.
Los criterios de exclusión incluyeron los siguientes : quimioterapia previa por cáncer gástrico avanzado localmente o metastático (los pacientes pueden haber recibido terapia de neo adyuvante o adyuvante previa en tanto que fuera consumada por lo menos 6 meses antes de la aleatorización) ; terapia de platino o anti-angiogénica previa (esto es, anti-VEGF o inhibidor de cinasa de tirosina de VEGFR, etc.); agentes con enfermedad avanzada localmente que fueron candidatos para terapia curativa (incluyendo operación y/o quimioterapia y/o radioterapia) , radioterapia en el transcurso de 28 días de aleatorización; procedimiento quirúrgico mayor, biopsia abierta o lesión traumática significativa dentro de 28 días antes de la aleatorización o anticipación de la necesidad de cirugía mayor durante el curso de tratamiento de estudio (cirugía electiva planeada) ; procedimientos quirúrgicos menores en el transcurso de dos días antes de la aleatorización; evidencia de metástasis de CNS en la referencia; historia o evidencia después de examen físico/neurológico de enfermedad de CNS no relacionada con cáncer a no ser que sea tratada apropiadamente con terapia medica estándar, por ejemplo ataques incontrolados; función de medula ósea inapropiada, función de hígado o función renal; hipertensión incontrolada o clínicamente significativa (esto es, activa) , enfermedad cardiovascular; infección activa que requiere antibióticos intravenosos en la aleatorización; historia o evidencia de diátesis de sangrado alargado o coagulopatia con el riesgo de sangrado; herida seria o que no cicatriza, ulcera péptica o fractura de hueso (incompletamente cicatrizada) , sangrado gastrointestinal activo; historia de fístula abdominal; perforación gastrointestinal o absceso intra-abdominal en seis meses de aleatorización; neuropatía (por ejemplo, . deterioro de la audición y equilibrio)= grado II de acuerdo con CTCAE v3.0; tratamiento diario crónico con aspirina o clopidogrel ; tratamiento diario crónico con corticosteroides orales (esteroides inhalados y cursos cortos de esteroides orales • por anti-emesis o como un estimulante de apetito fueron permitidos) ; deficiencia de dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) conocida e infección aguda o crónica-activa conocida con HBV o HCV.
El punto final primario del estudio fue la supervivencia global (OS) definida como el tiempo desde la aleatorización hasta la muerte de cualquier causa. Los datos de tiempo al evento son comparados entre los brazos de tratamiento utilizando una prueba de log-rango estratificada. El método de Kaplan-Meier fue usado para estimar la duración de los datos al tiempo del evento. Los intervalos de confianza al 95% para el tiempo al evento mediano fueron calculados utilizando el método de Brookmeyer-Crowley. El HR para los datos de tiempo al evento fue estimado utilizando un modelo de regresión de Cox estratificado.
Los puntos finales secundarios incluían supervivencia libre de avance (PFS) , proporción de respuesta objetivo (RR) , duración de respuesta y seguridad. La supervivencia libre de avance (PFS) es definida como el tiempo de la aleatorización al avance de enfermedad o a' muerte, en base a la determinación del investigador. La metodología de Kaplan-Meier fue usada para estimar la PFS mediana para cada brazo de tratamiento. En ciertas modalidades, la proporción de peligro para PFS fue estimada utilizando un modelo de regresión de Cox estratificado con los mismos factores de estratificación usados en la prueba de log-rango estratificado. Los análisis de PFS en cada cohorte fueron efectuados al nivel de =0.05 de dos lados. Los datos de tiempo al evento fueron comparados entre brazos de tratamiento utilizando una prueba de log-rango estratificada. El método de Kaplan-Meier fue usado para estimar la duración de los datos al tiempo del evento. Los intervalos de confianza de 95% para el tiempo al evento mediano fueron calculados utilizando el método de Brookmeer-Crowley. El HR para los datos del tiempo al evento fueron estimados un modelo de regresión de Cox estratificado. RR es definido como el porcentaje de pacientes que obtuvieron una respuesta completa o parcial confirmada = 28 días después de documentación inicial de respuesta. R en pacientes con enfermedad mensurable en la referencia fue comparado utilizando la prueba ?2 de Mantel-Haenszel estratificada. Los factores de estratificación de aleatorización fueron incluidos en todos los análisis estratificados.
Muestras de referencia de plasma sanguíneo disponibles de pacientes pueden ser usadas para ver si un paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF (por ejemplo, bevacizumab) . Una muestra de sangre es obtenida con consentimiento por escrito, de un paciente antes del tratamiento con terapia que comprende bevacizumab. Las muestras fueron acumuladas o mantenidas como muestras individuales .
La expresión de isoformas de VEGF-A (incluyendo, preferiblemente VEGFm) en la muestra es determinada al medir los niveles de proteína en el plasma. Los pacientes con un nivel de VEGFm en o por encima de un nivel de referencia son identificados como pacientes que se pueden beneficiar de la terapia anti-cáncer, son más probables de ser responsivos a la terapia anti-cáncer o tienen probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF (por ejemplo, bevacizumab) .
Aunque la invención anterior ha sido descrita en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo por propósitos de claridad y entendimiento, la descripción de ejemplos no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invención. Las revelaciones de todas las patentes, solicitudes de patentes, referencias científicas y numero de acceso de Genbank citados en la presente son incorporados expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos como si cada patentes, solicitudes de patentes, referencias científicas y numero de acceso de Genbank fueron incorporados especifica e individualmente por referencia.

Claims (38)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGFm en una muestra del paciente, en donde un nivel de VEGFm en la muestra en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se- puede beneficiar del tratamiento con terapia anti-cáncer.
2. Un método para predecir la responsividad del paciente que sufre de cáncer a tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGFm en una muestra del paciente, en donde un nivel de VEGFm en la muestra en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente puede ser más responsivo al tratamiento con terapia anti-cáncer.
3. Un método para determinar la probabilidad de que paciente con cáncer exhibirá beneficio de la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGFm en una muestra del paciente, en donde el nivel de VEGFm en la muestra en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer.
4. Un método optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGFm en una muestra del paciente, en donde el nivel de VEGFm en la muestra en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el cáncefr es seleccionado de un grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho, cáncer pancreático, cáncer gástrico y cáncer de pulmón.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la muestra del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el nivel de VEGFm es un nivel de proteína.
8. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque el nivel de proteína es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma.
9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el nivel en plasma de VEGFm en la muestra del paciente que esta por lo menos b por encima del nivel de referencia de VEGFm, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende además usar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A.
11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo.
12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo es bevacizumab.
13. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque comprende además usar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos.
14. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrables concurrentemente.
15. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrables secuencialmente.
16. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque comprende además usar una cantidad efectiva de un tercera terapia anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos.
17. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrables concurrentemente .
18. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque la tercera terapia contra el cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrables secuencialmente.
19. El uso de una cantidad efectiva de antagonista de VEGF-A para la manufactura de un medicamento para tratamiento de cáncer en una terapia anti-cáncer, caracterizado porque previo a la terapia anti-cáncer, se determinó en una muestra del paciente que el nivel de VEGFm tan alta o más alta en comparación con el nivel de VEGFm en una muestra de referencia.
20. El uso de la reivindicación 19, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que' consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho, cáncer pancreático, cáncer gástrico y cáncer de pulmón.
21. El uso de la reivindicación 19, caracterizado porque la muestra del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos.
22. El uso de la reivindicación 19, caracterizado porque el nivel de VEGFm es un nivel de proteina.
23. El uso de la reivindicación.22 , caracterizado porque el nivel de proteína es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma.
24. El uso de la reivindicación 23, caracterizado porque el nivel en plasma de VEGFm en la muestra del paciente que esta por lo menos o por encima del nivel de referencia de VEGFm, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer ? tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer.
25. El uso de la reivindicación 19, caracterizado porque el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo.
26. El uso de la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo es bevacizumab.
27. El uso de la reivindicación 19, caracterizado porque comprende además comprende además usar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos.
28. El uso de la reivindicación 27, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrables concurrentemente.
29. El uso de la reivindicación 27, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrables secuencialmente .
30. El uso de la reivindicación 27, caracterizado porque comprende además usar una cantidad efectiva de un tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos.
31. El uso de la reivindicación 30, caracterizado porque la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrables concurrentemente .
32. El uso de la reivindicación 30, caracterizado porque la tercera terapia contra el cáncer, la segunda terapia anticáncer y el antagonista de VEGF-A son administrables secuencialmente.
33. Un kit para determinar si un paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el kit está caracterizado porque comprende: un conjunto de compuestos aptos de enlazarse específicamente a VEGFm y instrucciones para usar dichos compuestos para determinar el nivel de por lo menos un biomarcador para predecir la responsividad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, en donde el nivel de VEGFm en o por encima del nivel de VEGFm en una muestra de referencia indica que el paciente se. puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A.
34. El kit de la reivindicación 33, caracterizado porque los compuestos son proteínas.
35. El kit de la reivindicación 34, caracterizado porque las proteínas son anticuerpos .
36. Un conjunto de compuestos para detectar el nivel de VEGF111, el conjunto está caracterizado porque comprende: Por lo menos un compuesto apto de enlazarse específicamente a VEGFiii.
37. El conjunto de compuestos de la reivindicación 36, caracterizado porque los compuestos son proteínas.
38. El conjunto de compuestos de la reivindicación 37, caracterizado porque las proteínas son anticuerpos.
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