ES2256066T3 - Elisa para vegf. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para detectar el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas: (a) poner en contacto e incubar la muestra biológica con reactivos de captura premezclados inmovilizados en un soporte sólido, caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura son anticuerpos policlonal y monoclonal contra VEGF humano, y uniéndose dicho anticuerpo monoclonal específicamente al extremo C- terminal (residuos 111-165) del VEGF humano; (b) separar la muestra biológica de los reactivos de captura inmovilizados; (c) poner en contacto los reactivos de captura inmovilizados con un anticuerpo detectable que se une a los dominios de unión KDR y FLT1 del receptor de VEGF; y (d) medir el nivel de VEGF unido a los reactivos de captura utilizando un medio de detección del anticuerpo detectable.
Description
ELISA para VEGF.
La invención se refiere a inmunoensayos para la
detección de VEGF que pueden utilizarse como procedimientos de
diagnóstico y pronóstico y pacientes con cáncer, enfermedades
cardiovasculares u otras patologías.
Actualmente se encuentra bien establecido que la
angiogénesis está implicada en la patogénesis de una diversidad de
enfermedades. Éstas incluyen tumores sólidos, síndromes
neovasculares intraoculares como por ejemplo las retinopatías
proliferativas o la degeneración macular relacionada con la edad
(AMD), la artritis reumatoide y la psoriasis (Folkman et al.,
J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992);
Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53:
217-239 (1991); y Garner A., Vascular diseases.
In: Pathobiology of ocular disease (Enfermedades vasculares.
En: Patobiología de la enfermedad ocular). A dynamic approach. Gamer
A. Klintworth G.K. Eds. 2ª Edición (Marcel Dekker, NY, 1994), pp
1625-1710). En el caso de tumores sólidos, la
neovascularización permite que las células tumorales adquieran una
ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con
las células normales. De acuerdo con lo anterior, se ha observado
una correlación entre la densidad de los microvasos en las secciones
de tumor y en la supervivencia del paciente en cáncer de pulmón así
como en varios otros tumores (Weidner et al., N. Engl. J.
Med., 324: 1-6 (1991); Horak et al.,
Lancet, 340: 1120-1124 (1992); y Macchiarini
et al., Lancet, 340: 145-146
(1992)).
La búsqueda de reguladores positivos de la
angiogénesis ha proporcionado muchos candidatos, incluyendo aFGF,
bFGF, TGF-\alpha, TGF-\beta,
HGF, TNF-\alpha, angiogenina,
IL-8, etc. (Folkman et al., supra y
Klagsbrun et al., supra). Los reguladores negativos
identificados hasta el momento incluyen la tromboespondina (Good
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:
6624-6628 (1990)), el fragmento
N-terminal de 16 kilodaltons de la prolactina (Clapp
et al., Endocrinology, 133: 1292-1299
(1993)), angiostatina (O'Reilly et al., Cell, 79:
315-328 (1994)) y endostatina (O'Reilly et
al., Cell, 88: 277-285 (1996)).
El trabajo realizado últimamente a lo largo de
varios años ha establecido el papel clave del factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) en la regulación de la angiogénesis
normal y anormal (Ferrara et al., Endocr. Rev., 18:
4-25 (1997)). El descubrimiento de que la pérdida
incluso de un sólo alelo VEGF da como resultado letalidad embriónica
apunta que dicho factor juega un papel irreemplazable en el
desarrollo y diferenciación del sistema vascular (Ferrara et al,
supra).
Además, se ha mostrado que VEGF es un mediador
clave de la neovascularización asociado con tumores y enfermedades
intraoculares (Ferrara et al., supra). El ARNm de VEGF
se sobreexpresa en la mayoría de los tumores humanos examinados
(Berkman et al., J. Clin. Invest., 91:
153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol.,
26: 86-91 (1995); Brown et al., Cancer
Res., 53: 4727-4735 (1993); Mattern et
al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996);
y Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146:
1029-1039 (1995)): Así pues, la concentración de
VEGF en los fluidos oculares esta altamente relacionada con la
presencia de una proliferación activa de vasos sanguíneos en los
pacientes con retinopatías diabéticas y a retinopatías relacionadas
con otras isquemias (Aiello et al., N. Engl. J. Med.,
331: 1480-1487 (1994)). Además, algunos estudios
han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares
coroidales en pacientes afectados por degeneración macular aguda
(AMD) (López et al., Invest. Ophralmo. Vis. Sci., 37:
855-868 (1996)).
VEGF es un factor de crecimiento que se une a la
heparina con un peso molecular de 45 kD (Plouet et al.,
EMBO J., 8: 3801 (1989); Neufeld et al., Prog.
Growth Factor Res., 5: 89 (1994)). Es una glicoproteína dimérica
que consiste en dos subunidades idénticas. Aunque VEGF está
codificado por un único gen, existen como mínimo cinco isoformas
in vivo debido a un corte y empalme de ARNm alternativo.
Estas isoformas, VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 y VEGF206
contienen 121, 145, 165, 189 y 206 aminoácidos, respectivamente.
(Leung et al., Science, 246: 1306 (1989); Houck et
al., Mol. Endicrinol., 5: 1806 (1991); Tischer et
al., J. Biol. Chem., 266; 11947 (1991); Neufeld et
al., The FASEB Journal, 13: 9-22 (1999)).
Las isoformas VEGF muestran diferentes afinidades para la heparina;
VEGF121 se une a la heparina de forma débil, mientras que VEGF165,
VEGF189 y VEGF206 se unen a la heparina con afinidad creciente.
VEGF121 y VEGF165 se secretan y ambas isoformas se encuentran en la
circulación. En contraste con lo anterior, VEGF189 y VEGF206 se
encuentran mayoritariamente asociados con proteoglicanos que
contienen sulfato de heparina en la matriz extracelular (Houck et
al., J. Biol. Chem., 267: 26031 (1992); Park et
al., Mol. Biol. Cell, 4: 1317 (1993)). De las cinco
isoformas, VEGF165 es la variante expresada más abundantemente en la
mayoría de células y tejidos.
Se han identificado cinco receptores de VEGF:
VEGFR-1 (FLT-1),
VEGFR-2 (KDR/FLK-1) y
VEGFR-3, todos los cuales son tirosinquinasas
señalizadoras y Neurofilina-1 y
Neurofilina-2, ambas receptores específicos de la
isoforma accesoria que se unen selectivamente a VEGF165 (de Vries
et al., Science, 255: 989 (1992); Terman et
al., Biochem. Biphys. Res. Común., 187: 1579 (1992);
Millauer et al., Cell, 72: 835 (1993); Neufeld et
al., supra). Los diferentes papeles de estos receptores
en la biología de VEGF están siendo investigados activamente por
numerosos grupos.
VEGF es producido por tejidos y no tiene que
entrar en la circulación para ejercer su efecto biológico, sino que
más bien actúa localmente como regulador paracrino. Esto plantea la
cuestión del significado del VEGF circulante y qué papel juega en la
biología normal o en una patología. Un estudio reciente de Yang
et al. J. Pharm. Exp. Ther., 284: 103 (1998) descubrió que la
eliminación de rhVEGF165 de la circulación es muy rápida, sugiriendo
que VEGF endógeno en la circulación es más probablemente el
resultado de la síntesis continua de VEGF. Adicionalmente, varios
estudios han intentado correlacionar los niveles de VEGF circulante
con la carga de tumor y han sugerido que los niveles de VEGF son un
potencial marcador de pronóstico (Ferrai y Scagliotti, Euro. J.
Cancer, 32A: 2368 (1996); Gasparini et al., J. Natl. Cancer
Inst., 89: 139 (1997); Kohn, Cancer, 80: 2219 (1997); Baccala et
al., Urology, 51: 327 (1998); Fujisaki et al., Am. J.
Gastroenterol., 93: 249 (1998)). Claramente, la capacidad de medir
con precisión el VEGF será importante para entender su(s)
papel(es) potencial(es) en muchos procesos biológicos,
como por ejemplo el mantenimiento de la permeabilidad vascular, el
ciclo menstrual, la isquemia, la diabetes y el
cáncer.
cáncer.
La literatura describe ampliamente que en
pacientes normales y enfermos existen concentraciones de VEGF
endógeno ampliamente variables, desde niveles indetectables hasta
niveles altos. Se ha descrito que VEGF 165/165 puede romperse
proteolíticamente para dar otras tres formas: un heterodímero
165/110, un homodímero 110/110 y un fragmento
C-terinal de 55 aminoácidos (Keyt et al.,
J. Biol. Chem., 271: 7788-7795 (1996); Keck
et al., Arch. Biochem. Biophys., 344:
103-113 (1997)).
La capacidad de medir los niveles de VEGF
endógeno depende de la disponibilidad de sensibles y específicos.
Se han descrito ensayos de inmunoabsorción enzimática basados en
colorimetría, quimioluminiscencia y fluorescencia (ELISAs) para
VEGF. Houck et al., supra (1992); Yeo et al.,
Clin. Chem., 38: 71 (1992); Kondo et al., Biochim.
Biophys. Acta, 1221: 211 (1994) ; Baker et al.,
Obstet. Gynecol., 86: 815 (1995); Hanatani et al.,
Biosci. Biotechnol. Biochem., 59: 1958 (1995); Leith y
Michelson, Cell Prolif., 28: 415 (1995); Shifren et
al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 81: 3112 (1996); Takano
et al., Cancer Res., 56: 2185 (1996); Toi et
al., Cancer, 77: 110 (1996) ; Brekken et al.,
Cancer Res., 58: 1952 (1998) ; Obermair et al., Br.
J. Cancer, 77: 1870-1874 (1998) ; Webb et
al., Clin. Sci., 94: 395-404 (1998). Se
han aplicado con éxito ensayos ELISAs similares en la determinación
de pequeñas cantidades de fármacos y otros componentes antigénicos
en muestras de plasma y de orina, no implican etapas de extracción y
son sencillos de llevar a cabo.
Houck et al., supra (1992) describe
un ensayo ELISA colorimétrico que parece tener sensibilidad ng/ml,
aunque claramente no es suficientemente sensible para detectar
niveles de VEGF endógenos. Yeo et al., supra (1992)
describe un ensayo inmunofluorimétrico resuelto en el tiempo de dos
sitios, sin embargo no se detectó VEGF en suero normal (Yeo et
al., Cancer Res., 53: 2912 (1993)). Baker et al.,
supra (1995), utilizando una versión modificada de este
ensayo inmunofluorimétrico, describieron niveles detectables de VEGF
en el plasma de mujeres embarazadas, con niveles mayores observados
en mujeres con preeclampsia. Anthony et al., Ann. Clin.
Biochem., 34: 276 (1997) han descrito datos similares en mujeres
embarazadas utilizando un radioinmunoensayo. Hanatani et al.,
supra (1995) desarrollaron un ensayo ELISA quimioluminiscente
capaz de medir VEGF circulante y describieron los niveles de VEGF en
suero de 30 individuos normales (machos y hembras) a partir de
8-36 pg/ml. Brekken et al., supra
(1998) describieron ensayos ELISA utilizando anticuerpos que tenían
preferencia de unión a VEGF distinto de VEGF aislado o del complejo
VEGF:Flk-1.
Se encuentra disponible comercialmente un kit
ELISA para la detección de VEGF en R&D Systems (Abingdon,
U.K.). El kit R&D VEGF ELISA se ha utilizado en ensayos sándwich
donde se utiliza un anticuerpo monoclonal para capturar el antígeno
VEGF diana y se utiliza un anticuerpo policlonal para detectar VEGF.
Webb et al., supra (1998). No está claro si la
presencia de procesos proteolíticos o la degradación de VEGF o la
interferencia con otras proteínas del suero influencian los
resultados de detección utilizando el kit R&D ELISA. Obermair
et al., supra
(1998).
(1998).
Keyt et al., J. Biol. Chem., 271:
7788-7795 (1996); Keyit et al. J. Biol.
Chem., 271: 5638 (1996) ; y Shifren et al., supra
(1996) también desarrollaron un ensayo ELISA colorimétrico basado en
un par anticuerpo monoclonal dual. Aunque este ensayo ELISA era
capaz de detectar niveles de VEGF elevados en pacientes de cáncer,
carecía de la sensibilidad necesaria para medir niveles endógenos de
VEGF en individuos normales. Rodríguez et al., J. Immunol.
Methods, 219: 45 (1998) describió un ELISA fluorimétrico de dos
sitios para VEGF que proporciona una sensibilidad de 10 pg/ml de
VEGF en plasma o suero aislados. Sin embargo, este ensayo
fluorimétrico solamente puede detectar especies de VEGF
completamente intactas 165/165 y 165/110.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar
un ensayo de diagnóstico y pronóstico que detecte niveles mesurables
de VEGF en una muestra biológica o en un modelo animal o en un
paciente mayores que los mesurables por ELISAs existentes y que
pueda medir todas las isoformas de VEGF.
Se ha desarrollado un procedimiento ELISA
sándwich de anticuerpo de sitio múltiple y kits para VEGF y para
antígeno para detectar VEGF en muestras biológicas y se ha utilizado
como índice de diagnóstico/pronóstico. En comparación con los
ensayos ELISAs para VEGF utilizados actualmente, el presente ensayo
tiene mayor sensibilidad y es capaz de detectar la mayor parte de
las isoformas del VEGF endógeno en circulación.
Más específicamente, la invención proporciona un
procedimiento para la detección de VEGF en una muestra biológica,
preferentemente extraída de pacientes con enfermedades vasculares,
diabéticos o con cáncer, que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto e incubar la muestra biológica con reactivos de captura premezclados inmovilizados en un soporte sólido, siendo los reactivos de captura anticuerpos policlonales y monoclonales contra VEGF humano, y uniéndose dicho anticuerpo monoclonal específicamente al extremo C-terminal (residuos 111-165) de VEGF humano;
- (b)
- separar la muestra biológica de los reactivos de captura inmovilizados;
- (c)
- poner en contacto los reactivos de captura inmovilizados con un anticuerpo detectable que se une a los dominios de unión KDR y FLT1 del receptor de VEGF; y
- (d)
- medir el nivel de VEGF unido a los reactivos de captura utilizando un medio de detección del anticuerpo detectable.
Preferentemente, los reactivos de captura se
inmovilizan en una fracción en peso de aproximadamente 0,8:1 a
1,2:1 de anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal.
Más preferentemente, la fracción en peso es aproximadamente 1:1 de
anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal.
Según otro aspecto, la invención proporciona un
kit de inmunoensayo para detectar VEGF en una muestra biológica,
comprendiendo dicho kit:
- (a)
- reactivos de captura, anticuerpos policlonales y monoclonales contra VEGF humano premezclados en una relación en peso de aproximadamente 0,8:1 a 1,2:1 de anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal, uniéndose específicamente el anticuerpo monoclonal a los extremo C-terminal (residuos 111-165) de VEGF humano; y
- (b)
- un reactivo de detección, un anticuerpo detectable que se une a los dominios de unión KDR y FLT1 del receptor de VEGF.
El ensayo según la invención es único en el
sentido que utiliza una mezcla de anticuerpos policlonal/monoclonal
como reactivos de captura y que el anticuerpo monoclonal de captura
se une a la porción C-terminal de VEGF. La mayoría
de los ensayos ELISAs para VEGF descritos se basan bien en un par de
anticuerpos monoclonales dual para la captura/detección, o bien en
un anticuerpo monoclonal como reactivo de captura y en un anticuerpo
policlonal para la detección. Si se utiliza solamente un anticuerpo
policlonal como el anticuerpo de captura, se pierde toda la
sensibilidad del ensayo. La capacidad del anticuerpo de captura
monoclonal de unirse al extremo C-terminal de VEGF
asegura que todas las moléculas de VEGF endógeno, incluyendo
165/165, 165/110 Y 110/110 pueden detectarse mediante el ensayo
descrito en la presente invención. Además, el anticuerpo de
detección de la invención se une a las regiones biológicamente
activas de VEGF, es decir, los dominios de unión para los
receptores KDR y FLT1 de VEGF, lo cual asegura que las moléculas de
VEGF detectadas no son susceptibles de estar bloqueadas, por
ejemplo, por receptores de VEGF solubles en la circulación. De esta
manera, el ensayo descrito en la presente invención proporciona una
medida más precisa de las molécula de VEGF que lo más probable es
que sean biológicamente activas.
La Fig. 1 muestra una comparación de dos
preparaciones diferentes de anticuerpo policlonal de conejo
purificado por afinidad contra rhVEGF, los cuadrados indicando el
anticuerpo preferido y los círculos representando el mismo
anticuerpo de un sangrado diferente.
La Fig. 2 muestra una comparación de ELISAs según
la invención utilizando elución con guanidina frente a glicina del
anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad contra
VEGF.
La Fig. 3 muestra una comparación de curvas
estándar típicas y de posibles efectos hook, de tres diferentes
ELISAs para VEGF, donde los círculos muestran el ensayo de sitio
único con MAb 3,5F8 como agente de detección, los cuadrados muestran
en ensayo de dos sitios con MAb 3.5F8 como recubrimiento y MAb
A4.6.1 como agente de detección y los diamantes muestran en ensayo
de sitio múltiple según la invención con MAb 3.5F8 y un anticuerpo
policlonal purificado por afinidad como recubrimiento y MAb A4.6.1
como agente de detección.
La Fig. 4 muestra una maximización de la
recubrimiento del anticuerpo monoclonal MAb 3.5F8 donde el ensayo
ELISA utiliza 0.4 (círculos), 1 (cuadrados), 2 (diamantes) o 4
(triángulos) \mug/ml de anticuerpo monoclonal y 1 \mug/ml de
anticuerpo policlonal purificado por afinidad.
La Fig. 5 muestra una maximización de
recubrimiento de anticuerpo policlonal de conejo donde el ensayo
ELISA utiliza 0 (círculos), 0,1 (cuadrados), 0,4 (diamantes), 1
(triángulos), 2 (triángulos inversos con líneas discontinuas) o 4
(triángulos inversos con líneas sólidas) \mug/ml de anticuerpo
policlonal purificado por afinidad y 0,4 \mug/ml de MAb 3.5F8.
La Fig. 6 muestra el efecto del pH sobre el
ensayo ELISA para VEGF de sitio múltiple según la invención, donde
los círculos representan el ensayo ELISA a pH 4, los cuadrados, pH
5, los diamantes, pH 6, los triángulos, pH 7, los diamantes de media
línea, pH 8 y los diamantes inversos, pH 9.
La Fig. 7 muestra la linealidad de dilución de
seis muestras de plasta EDTA humano en las que se ha pulsado rhVEGF
en el ensayo ELISA para VEGF de sitio múltiple.
Las Figs. 8A-8C muestran
linealidad de muestras de plasma EDTA de rata normales pulsadas con
rhVEGF, donde la FIg. 8A muestra un gran pulso, la Fig. 8B muestra
un pulso medio y la Fig. 8C muestra un pulso bajo y donde los
círculos son muestra combinada de rata 1, los cuadradas muestra
combinada de rata 2 y los diamantes son rata 1.
Las Figs. 9A-9B muestran
linealidad de muestras de plasma EDTA de cuatro hembras y cuatro
machos de cerdo de Yorkshire, respectivamente, pulsadas con
rhVEGF.
Las Figs. 10A-10C muestran la
especificidad de tres ensayos ELISA diferentes para las formas de
VEGF 165/165 (círculos), 165/110 (cuadrados), 121/121 (diamantes) y
110/110 (triángulos). La Fig. 10A muestra la especificidad del
ensayo ELISA de sitio único utilizando MAb 3,5F8 como recubrimiento
y anticuerpo de detección (Fig. 10A): La Fig. 10B muestra la
especificidad del ensayo ELISA para VEGF fluorimétrico de dos sitios
utilizando MAb 3,5F8 como recubrimiento y MAb A 4.6.1 como
anticuerpo de detección y la Fig. 10C muestra la especificidad del
ensayo ELISA para VEGF de sitio múltiple según la invención
utilizando MAb 3,5F8 y PAb como anticuerpos de recubrimiento y MAb
A4.6.1 como anticuerpo de detección.
Las Figs. 11A y 11B muestran, respectivamente,
VEGF de plasma humano normal y VEGF de suero humano normal detectado
mediante un ensayo ELISA de dos sitios utilizando sólo MAb 3,5F8
como reactivo de recubrimiento y mediante el ensayo ELISA de sitio
múltiple según la invención utilizando tanto el PAb como el MAb
3,5F8 como reactivos de recubrimiento.
La Fig. 12 muestra las cantidades de VEGF en
plasma en pacientes cardíacos utilizando los tres tipos de ensayos
descritos en la leyenda de la Fig. 10, donde los círculos
representan el ensayo de sitio único, los cuadrados representan el
ensayo de dos sitios y los triángulos representan el ensayo de sitio
múltiple.
La Fig. 13 muestra los niveles de VEGF en plasma
en donantes normales y en paciente cardiovasculares utilizando el
ensayo de dos sitios con MAb 3.5F8 como recubrimiento y MAb A4.6.1
como anticuerpo de detección o el ensayo de sitio múltiple según la
invención utilizando MAb 3.5F8 y un anticuerpo policlonal purificado
por afinidad como recubrimiento y MAb A4.6.1 como anticuerpo de
detección, donde N es el número de pacientes.
La Fig. 14 muestra los niveles de VEGF en suero
extraído de pacientes con cáncer de pulmón detectado mediante un
ensayo ELISA de dos sitios utilizando sólo MAb 3.5F8 como reactivo
de recubrimiento y mediante el ensayo ELISA de sitio múltiple según
la invención utilizando tanto PAb como MAb 3.5F8 como reactivos de
recubri-
miento.
miento.
La Fig. 15 muestra los niveles de VEGF donantes
normales y en pacientes diabéticos (diabetes mellitas no dependiente
de insulina (NIDDM) y en diabetes mellitas dependiente de insulina
(IDDM)) utilizando el ensayo ELISA de dos sitios con MAb 3.5F8 como
recubrimiento y MAb A4.6.1 como anticuerpo de detección.
Las Figs. 16A y 16B muestran gráficos
comparativos de un anticuerpo policlonal anti ADNasa purificado por
afinidad y un anticuerpo policlonal anti VEGF purificado por
afinidad como uno de los reactivos de recubrimiento en el ensayo de
sitio múltiple según la invención, en comparación con el ensayo de
dos sitios utilizando MAb 3.5F8 como reactivo de recubrimiento para
plasma humano. La Fig. 16A muestra la correlación de VEGF en plasma
medido mediante el ensayo ELISA de dos sitios utilizando MAb 3.5F8
como el reactivo de recubrimiento (eje x) con VEGF en plasma medido
mediante el ensayo de sitio múltiple con MAb 3.5F8 y un anticuerpo
policlonal anti ADNasa como reactivos de recubrimiento (círculos
sólidos) y con VEGF en plasma medido mediante un ensayo de sitio
múltiple tal y como se describe en la presente invención, utilizando
MAb 3.5F8 y el PAb anti VEGF como reactivos de recubrimiento
(círculos vacíos). La Fig. 16 B muestra las curvas estándar del
ensayo ELISA de dos sitios (círculos sólidos), el ensayo ELISA de
sitio múltiple con MAb 3.5F8 y un anticuerpo policlonal anti ADNasa
como reactivos de recubrimiento (diamantes sólidos) y un ensayo de
sitio múltiple tal y como se describe en la presente invención
utilizando MAb 3.5F8 y el PAb anti VEGF como reactivos de
recubrimiento (cuadrados sólidos).
El término "VEGF" tal y como se utiliza en
la presente invención se refiere al factor de crecimiento celular
endotelial vascular de 165 aminoácidos y a los factores de
crecimiento celular endotelial vascular relacionados de 121-, 145-,
189- y 206 aminoácidos, tal y como describen Leung et al.,
Science, 246: 1306 (1989), Houck et al., Mol. Endocrin., 5:
1806 (1991) y Neufeld et al., supra, junto a las
formas alélicas y procesadas de dichos factores de crecimiento,
existentes en la naturaleza.
El término "detectar" se utiliza en su
sentido más amplio, incluyendo tanto las medidas cualitativas como
cuantitativas de una molécula diana. Según un aspecto de la
invención, el procedimiento de detección descrito en la presente
invención se utiliza para identificar la mera presencia de VEGF en
una muestra biológica. Según otro aspecto, el procedimiento se
utiliza para analizar si VEGF en una muestra se encuentra en un
nivel detectable. Según otro aspecto, el procedimiento puede
utilizarse para cuantificar la cantidad de VEGF en una muestra y
además para comparar los niveles de VEGF de diferentes muestras.
El término "muestra biológica" se refiere a
una muestra del cuerpo de cualquier animal, pero preferentemente es
de mamífero, más preferentemente de humano. Más preferentemente,
dicha muestra biológica es de pacientes de enfermedades vasculares,
diabéticos o con cáncer. Dichas muestran incluyen los fluidos
biológicos como por ejemplo el suero, el plasma, el fluido vítreo,
el fluido linfático, el fluido sinovial, el fluido folicular, el
fluido seminal, el fluido amniótico, la lecha, la sangre entera, la
orina, el fluido cerebroespinal, la saliva, el esputo, tcars, la
transpiración, el mucus y medio de cultivo de tejido, así como
extractos de tejido como por ejemplo el tejido homogeneizado y los
extractos celulares. La muestra biológica preferida según la
invención es suero, plasma u orina.
El término "reactivo de captura" se refiere
a un reactivo capaz de unir y capturar una molécula diana en una
muestra de manera que bajo condiciones adecuadas, el complejo
reactivo-molécula diana puede separarse del resto
de la muestra. Típicamente, el reactivo de captura se inmoviliza o
puede inmovilizarse. En un inmunoensayo sándwich, el reactivo de
captura es preferentemente un anticuerpo o una mezcla de diferentes
anticuerpos contra un antígeno diana.
El término "anticuerpo detectable" se
refiere a un anticuerpo que es capaz de ser detectado bien
directamente mediante una marca amplificada por un medio de
detección, o bien indirectamente mediante, por ejemplo, otro
anticuerpo que está marcado. Para el marcaje directo, el anticuerpo
se conjuga típicamente a una estructura que es detectable de alguna
manera. El anticuerpo detectable preferido es un anticuerpo
biotinilado.
El término "medio de detección" se refiere a
una estructura o técnica que se utiliza para detectar la presencia
del anticuerpo detectable en el ensayo ELISA según la invención e
incluye agentes de detección que amplifican la marca inmovilizada,
por ejemplo una marca capturada sobre una placa de microvaloración.
Preferentemente, el medio de detección es un agente de detección
fluorimétrica, por ejemplo avidita o estreptavidina.
El término "anticuerpo" se utiliza en su
sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo
anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizadores), anticuerpos
policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos
multiespecíficos y fragmentos de anticuerpo, mientras exhiban la
especificidad de unión deseada.
El término "anticuerpo monoclonal" tal y
como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo
obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la
población son idénticos excepto por posibles mutaciones existentes
en la naturaleza, que pueden estar presentes en cantidades menores.
Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos
contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las
preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que
incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se
dirige contra un único determinante sobre el antígeno. El
modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como
obtenido a partir de una población substancialmente homogénea de
anticuerpos y no debe interpretarse que requiere la producción del
anticuerpo mediante un procedimiento particular. Por ejemplo, los
anticuerpos monoclonales a utilizar según la presente invención
pueden estar hechos mediante procedimientos de ADN recombinante
(véase, por ejemplo, la patente U.S. 4,816,567). Los "anticuerpos
monoclonales" pueden aislarse también a partir de bibliotecas de
anticuerpos en fago utilizando las técnicas descritas en Clackson
et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks
et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991),
por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales según la invención
incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas)
"quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en
anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a
una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto
de la(s) cadena(s) es idéntica(s) u
homóloga(s) a las secuencias correspondientes en anticuerpos
derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase
de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, mientras
muestren la actividad biológica deseada (patente U.S. 4,816,567; y
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:
6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas" de los anticuerpos
no humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quiméricos que
contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no
humana. Para la mayoría, los anticuerpos humanizados son
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales se ha
reemplazado los residuos de la región hipervariable del recipiente
por residuos de la región hipervariable de una especie no humana
(anticuerpo donante) como por ejemplo ratón, rata, conejo o un
primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad
deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de entramado
(FR) de la inmunoglobulina humana se han reemplazado por los
residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos
humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el
anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Dichas
modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del
anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá
substancialmente como mínimo uno, y típicamente dos, dominios
variables, en los cuales todas o substancialmente todas las
regiones hipervariables corresponderán a las de una inmunoglobulina
no humano y todas o substancialmente todas las FRs son las de la
secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede
comprender también opcionalmente como mínimo una porción de una
región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de la
inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et
al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann
et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y
Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596
(1992).
El término "mamífero" para objetivos de
tratamiento se refiere a un animal clasificado como mamífero,
incluyendo humanos, animales domésticos, y animales de granja y
animales de zoo, animales para deporte o animales de compañía, como
por ejemplo perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc.
Preferentemente, el mamífero es humano.
Los términos "cáncer", "cancerígeno" y
"maligno" se refieren o describen el estado fisiológico en
mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular
no regulado. Algunos ejemplos de cáncer incluyen, pero no se
limitan a, carcinoma, incluyendo el adenocarcinoma, linfoma,
blastoma, melanoma, sarcoma y leucemia. Algunos ejemplos más
particulares de dichos cánceres incluyen el cáncer de células
escamosas, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de
pulmón de células no pequeñas, el cáncer gastrointestinal, el
linfoma de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin, el cáncer pancreático,
el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de ovarios, el
cáncer de hígado como por ejemplo el carcinoma hepático y el
heepatoma, el cáncer de vejiga, el cáncer de pecho, el cáncer de
colón, el cáncer colorectal, el carcinoma de endometrio, el
carcinoma de la glándula salivar, el cáncer de riñones, por ejemplo
el carcinoma de células renales y el tumor de Wilm, el carcinoma de
células basales, el melanoma, el cáncer de próstata, el cáncer
vulvar, el cáncer tiroideo, el cáncer testicular, el cáncer de
esófago y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Los cánceres
preferidos para el tratamiento según la invención son el de pecho,
colon, pulmones y el melanoma.
Las frases "vascular" y
"cardiovascular" se utilizan de forma intercambiable y
describen pacientes con indicaciones que estimulan la angiogénesis
y/o la cardiovascularización y aquellas que inhiben la angiogénesis
y/o la cardiovascularización. Dichas enfermedades incluyen, por
ejemplo, la enfermedad arterial, por ejemplo la aterosclerosis, la
hipertensión, la vasculitis inflamatoria, la enfermedad de Reynaud y
el fenómeno de Reynaud, aneurismas y reestenosis aricrial;
enfermedades venosas y linfáticas como por ejemplo la
tromboflebitis, la limfangitis y el linfedema; y otras enfermedades
vasculares como por ejemplo la enfermedad vascular periférica, el
cáncer del tipo tumores vasculares, por ejemplo el hemangioma
(capilar y cavernoso), los tumores glomus, la telangiectasia, la
angiomatosis bacilar, el hemangioendotelioma, el angiosarcoma, el
hemangiopericitoma, el sarcoma de Kaposi, el linfangioma y el
linfangiosarcoma, la angiogénesis de tumor, los traumatismos como
por ejemplo las heridas, las quemaduras y otro tejido herido, la
fijación de implante, las cicatrices, la lesión de repercusión
isquémica, la artritis reumatoide, la enfermedad cerebrovascular,
las enfermedades renales como por ejemplo el fallo renal agudo y la
osteoporosis. Esto incluiría también la angina, los infartos de
miocardio como por ejemplo los infartos de miocardio agudos, la
hipertrofia cardiaca y el fallo cardíaco, como por ejemplo el fallo
cardíaco congestivo (CHF).
El término "diabetes" se refiere a una
enfermedad progresiva del metabolismo de carbohidratos que implica
una producción inadecuada o una utilización de insulina y se
caracteriza por hiperglicemia y glicosuria. Este término incluye
todas las formas de diabetes, por ejemplo la diabetes tipo I y tipo
II y las diabetes resistente a la insulina, por ejemplo el Síndrome
de Mendenhall, el síndrome de Werner, el leprecaunismo, la diabetes
lipoatrófica y otras lipoatrofias.
El término "purificado por afinidad" se
refiere a la purificación de una sustancia mediante su elución a
través de una columna de cromatografía de afinidad.
El ensayo descrito en la presente invención es un
inmunoensayo de sitio múltiple que utiliza las siguientes
etapas:
Primera
etapa
En una primera etapa del ensayo según la
invención, la muestra biológica se pone en contacto y se incuba con
los reactivos de captura (o recubrimiento) inmovilizados, que son un
anticuerpo monoclonal anti-VEGF y un anticuerpo
policlonal dirigido contra VEGF. Estos anticuerpos pueden provenir
de cualquier especie, pero preferentemente el anticuerpo monoclonal
es un anticuerpo monoclonal murino o de rata, más preferentemtente
murino, y más preferentemente MAb 3.5F8 (Rodríguez et al.,
supra (1998)) y el anticuerpo policlonal es un anticuerpo
anti-conejo o anti-cabra, más
preferentemente anti-conejo. Además, preferentemente
el anticuerpo policlonal se ha purificado por afinidad, para
disminuir el ruido de fondo. Así, en una realización específica
preferida, el anticuerpo monoclonal inmovilizado es un anticuerpo
monoclonal murino, más preferentemente MAb 3.5F8 y el anticuerpo
policlonal inmovilizado es un anticuerpo de conejo purificado por
afinidad. Los reactivos de captura inmovilizados se mezclan antes de
inmovilizarse. Convencionalmente, la inmovilización se lleva a cabo
insolubilizando los reactivos de captura antes del procedimiento de
ensayo, mediante adsorción a una matriz o superficie insoluble en
agua (patente U.S. No. 3.720.760) o mediante un acoplamiento
covalente o no-covalente (por ejemplo, utilizando
un entrecruzamiento con glutaraldehido o carbodiimida, con o sin
activación previa del soporte, por ejemplo, con ácido nítrico y con
un agente reductor tal y como se describe en la patente U.S. No.
3.645.852 o en Rotmans et al., J. Immunol. Methods,
57:87-98 (1983)), o después, por ejemplo
mediante inmunoprecipitación.
La fase sólida utilizada para la inmovilización
puede ser un soporte o transportador inerte que es esencialmente
insoluble en agua y útil en los ensayos inmunométricos, incluyendo
soportes en forma, por ejemplo, de superficies, partículas,
matrices porosas, etc. Algunos ejemplos de soportes utilizados
comúnmente incluyen pequeñas láminas, Sephadex, cloruro de
polivinilo, tamices plásticos, y placas de ensayo o tubos de ensayo
fabricados a partir de polietileno, polipropileno, poliestireno y
similares, incluyendo placas de microvaloración de 96 pozos, así
como materiales particulados como por ejemplo papel de filtro,
azarosa, dextrano entrecruzado y otros polisacáridos.
Alternativamente, matrices insolubles en agua reactivas como por
ejemplo carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y
substratos reactivos descritos en las patentes U.S. Nos. 3,969,287;
3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 y 4,330,440 se emplean de
forma adecuada para la inmovilización de los reactivos de captura.
En una realización preferida, los reactivos de captura inmovilizados
se recubren sobre una placa de microvaloación y en particular la
fase sólida preferida utilizada es una placa de microvaloración
multi-pozo que puede utilizarse para analizar
diferentes muestras de una vez. La más preferida es una placa ELISA
de 96 pozos de microensayo, como por ejemplo la que vende Nune
Maxisorb o Immulon.
La fase sólida se recubre con los reactivos de
captura premezclados tal y como se ha definido más arriba, que
pueden estar unidos mediante una interacción
no-covalente o covalente o mediante una unión
física, según se desee. Algunas técnicas de acoplamiento incluyen
las descritas en la patente U.S. No. 4,376,110 y las referencias
citadas en la misma. Si es una interacción covalente, la placa u
otra fase sólida se incuba con un agente de entrecruzamiento junto
con el reactivo de captura en condiciones bien conocidas en el
estado de la técnica, por ejemplo 1 hora a temperatura
ambiente.
Algunos agentes utilizados comúnmente para
acoplar los reactivos de captura premezclados al substrato de fase
sólida incluyen, por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo, ésteres con el ácido 4-azidosalicílico,
imidoésteres homobifuncioanles, incluyendo los ésteres de
disuccinimidilo como por ejemplo
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y
maleimidas bifuncionales como por ejemplo
bis-N-maleimido-1,8-octano.
Algunos agentes de derivatización como por ejemplo
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato
rinden intermedios fotoactivables capaces de formar
entrecruzamientos en la presencia de luz.
Si se utilizan placas de 96 pozos, se recubren
preferentemente con la mezcla de reactivos de captura (diluidos
típicamente en un tampón, por ejemplo carbonato sódico 0.05 M
mediante incubación durante como mínimo 10 horas, más
preferentemente como mínimo durante una noche, a temperaturas de
aproximadamente 4-20ºC, más preferentemente
aproximadamente 4-8ºC y a un pH de aproximadamente
8-12, más preferentemente aproximadamente
9-10, y más preferentemente aproximadamente 9.6. Si
se desean tiempos de recubrimiento más cortos (1-2
horas), pueden utilizarse placas de 96 pozos con fondos de filtro
de nitrocelulosa (Millipore MULTISCREEN^{TM}) o recubrir a 37ºC.
Las placas pueden almacenarse y recubrirse con mucha antelación al
propio ensayo y entonces puede llevarse a cabo en ensayo
simultáneamente sobre diferentes muestras de manera manual,
semiautomática o automática, por ejemplo utilizando robots.
Entonces, las placas recubiertas se tratan
típicamente con un agente de bloqueo que se une no específicamente
y satura los sitios de unión para impedir la unión no deseada del
ligando libre a los sitios sobrantes sobre los pozos de la placa.
Algunos ejemplos de agentes bloqueantes apropiados para este fin
incluyen, por ejemplo, gelatina, albúmina del suero bovina,
albúmina de huevo, caseína y leche no grasa. El tratamiento
bloqueante se lleva a cabo típicamente en condiciones de temperatura
ambiente durante aproximadamente 1-4 horas,
preferentemente aproximadamente de 1,5 a 3 horas.
Después del recubrimiento y bloqueo, el estándar
de VEGF (VEGF purificado) o la muestra biológica a analizar,
diluida apropiadamente, se añade a la fase inmovilizada. La
velocidad de dilución preferida es de aproximadamente
5-15%, preferentemente aproximadamente 10% en
volumen. Algunos tampones que pueden utilizarse para la dilución
con esta finalidad incluyen (a) PBS conteniendo un 0,5% de BASA, un
0,05% de detergente TWEEN 20^{TM} (P20), un 0,05% de antibiótico
PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM, un 0,25% de surfactante Chaps, un
0,2% de beta-gamma globulina y NaCl 0,35 M; (b) PBS
conteniendo un 0,5% de BSA, un 0,05% de P20 y un 0,05% de
PROCLIN^{TM} 300, pH 7; (c) PBS conteniendo un 0,5% de BSA, un
0,05% de P20 y un 0,05% de PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM y NaCl
0,35 M, pH 6,35; (d) PBS conteniendo un 0,5% de BSA, un 0,05% de P20
y un 0,05% de PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM, un 0,2% de
beta-gamma globulina y NaCl 0,35 M; y (e) PBS
conteniendo un 0,5% de BSA, un 0,05% de P20 y un 0,05% de
PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM, un 0,25% de Chaps y NaCl 0,35 M. El
tampón (c) es el tampón preferido para el ensayo según la
invención, dado que tiene la mejor diferenciación entre cada
estándar así como la mayor relación señal-ruido.
PROCLIN^{TM} 300 actúa como un preservativo y TWEEN 20^{TM}
actúa como detergente para eliminar la unión no específica. El EDTA
y la sal o el tampón (c) añadido actúa para disminuir el ruido de
fondo sobre los otros tampones, incluyendo el tampón (b).
La relación en peso de los reactivos de captura
(anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal) es
preferentemente aproximadamente 0,8:1 a aproximadamente 1,2:1, más
preferentemente aproximadamente 1:1. La cantidad de reactivos de
captura utilizada es suficientemente grande para dar una buena señal
en comparación con los estándares de VEGF, pero no en exceso molar
en comparación con el nivel de VEGF endogéno esperado máximo en la
muestra. Para alcanzar una sensibilidad suficiente, se prefiere que
la cantidad de muestra biológica añadida sea tal que los reactivos
de captura inmovilizados estén en exceso molar respecto a la
concentración molar máxima de VEGF libre anticipado en la muestra
biológica después de una dilución apropiada de la muestra. Dicho
nivel anticipado depende principalmente de cualquier correlación
conocida entre los niveles de concentración del VEGF libre en la
muestra biológica particular analizada con el estado clínico del
paciente. Así, por ejemplo, los pacientes de cáncer pueden tener
una concentración máxima esperada de VEGF libre en su suero que es
bastante elevada, mientras que se esperará que un niño o adulto
normal tenga un nivel mucho menor de VEGF libre en su suero
basándose en lo que se ha descrito en la literatura.
Sin embargo, si se encuentra presente una
cantidad demasiado elevada de los reactivos de captura, los
reactivos de captura competirán con los reactivos de captura
anti-VEGF presentes en la muestra biológica en la
unión de VEGF, proporcionando resultados inexactos. Así, mientras
que la concentración de los reactivos de captura se determinará en
general mediante el rango de concentración de interés del VEGF,
teniendo en cuenta cualquier dilución necesaria de la muestra
biológica, la concentración final de los reactivos de captura se
determinará normalmente empíricamente para maximizar la sensibilidad
del ensayo a lo largo del rango de interés. Sin embargo, como una
guía general, el exceso molar es adecuadamente menor que
aproximadamente diez veces la concentración molar esperada del VEGF
libre en la muestra biológica después de cualquier dilución
apropiada de la muestra. Más preferentemente, la cantidad de
anticuerpos monoclonales inmovilizados es aproximadamente 0,4
\mug/ml y la cantidad de anticuerpos policlonales inmovilizados es
aproximadamente 0,4 \mug/ml.
Las condiciones de incubación de la muestra y los
reactivos de captura inmovilizados se seleccionan de manera que se
maximice la sensibilidad del ensayo y que se minimice la
disociación. Preferentemente, la incubación se lleva a cabo a
temperaturas bastante constantes, desde aproximadamente 0ºC hasta
aproximadamente 40ºC, preferentemente desde aproximadamente 36ºC
hasta aproximadamente 38ºC, para obtener un coeficiente de variante
(CV) menor y menos variable que por ejemplo a temperatura ambiente.
El tiempo de incubación depende en primer lugar de la temperatura,
siendo generalmente no mayor que aproximadamente 10 horas, para
evitar un ensayo insensible. Preferentemente, el tiempo de
incubación es desde aproximadamente 0,5 a 3 horas, y más
preferentemente 1,5-3 horas a
36-38ºC, para maximizar la unión de VEGF libre a los
reactivos de captura. La duración de la incubación puede ser mayor
si se añade un inhibidor de proteasas para impedir que las proteasas
presentes en el fluido biológico degraden el VEGF.
En este estadio, el pH de la mezcla de incubación
se encontrará habitualmente en el rango de aproximadamente
6-9,5, preferentemente en el rango de
aproximadamente 6-7 y más preferentemente
aproximadamente de 6,0 a 6,5 y más preferentemente, el pH del
diluyente del ensayo (ELISA) es 6,35 \pm 0,1. Un pH acídico, por
ejemplo pH 4-5, disminuyó la recuperación de VEGF.
El pH del tampón de incubación se escoge de manera que mantenga un
nivel significativo de unión específica de los reactivos de captura
al VEGF a capturar. Pueden emplearse diferentes tampones para
alcanzar y mantener el pH deseado durante esta etapa, incluyendo el
borato, fosfato, carbonato, tris-HCl o
tris-fosfato, acetato, barbital y similares. El
tampón particular empleado no es crítico para la invención, pero en
ensayos individuales puede preferirse un tampón sobre otro.
Segunda
etapa
En la segunda etapa del procedimiento de ensayo
según la presente invención, la muestra biológica se separa
(preferentemente mediante lavado) de los reactivos de captura
inmovilizados para separar el VEGF no capturado. La solución
utilizada para el lavado es generalmente un tampón ("tampón de
lavado") con un pH determinado utilizando las consideraciones y
tampones descritos más arriba para la etapa de incubación, con un
rango de pH preferentemente de aproximadamente 6-9.
El lavado puede realizarse en tres o más veces. La temperatura de
lavado es generalmente desde temperaturas refrigeradas a
temperaturas moderadas, manteniendo una temperatura constante
durante el período de ensayo, típicamente desde aproximadamente
0-40ºC, más preferentemente aproximadamente
4-30ºC. Por ejemplo, el tampón de lavado puede
colocarse en hielo a 4ºC en un recipiente antes del lavado y puede
utilizarse un lavador de placa para esta etapa. Un agente de
entrecruzamiento o u otro agente adecuado puede añadirse también en
este estadio para permitir que el VEGF no unido se una
covalentemente a los reactivos de captura si hay cualquier indicio
de que el VEGF disociado puede disociarse en cierto grado en las
etapas posteriores.
Tercera
etapa
En la siguiente etapa, los reactivos de captura
inmovilizados se ponen en contacto con anticuerpos detectables,
preferentemente a una temperatura de aproximadamente
20-40ºC, más preferentemente aproximadamente
36-38ºC, a la temperatura y tiempo exactos para
poner en contacto ambos, que depende primariamente del medio de
detección empleado. Por ejemplo, cuando se utiliza
4-metilumbeliferil-\beta-galactosidasa
(MUG) y
estreptavidina-\beta-galactosidasa
como medio de detección, preferentemente el contacto se lleva a
cabo a lo largo de una noche (por ejemplo aproximadamente
15-17 horas o más) para ampliar la señal al máximo.
Aunque el anticuerpo detectable puede ser un anticuerpo policlonal
o monoclonal, preferentemente es un anticuerpo monoclonal, más
preferentemente murino y más preferentemente MAb A4.6.1. Así pues,
el anticuerpo detectable preferido es detectable directamente y
preferentemente tiene una marca fluorimétrica. La marca
fluorimétrica tiene una mayor sensibilidad de ensayo en comparación
con la marca colorimétrica convencional. Más preferentemente, el
anticuerpo detectable está biotinilado y el medio de detección es
avidita o
estreptavidina-\beta-galactosidasa
y MUG.
Preferentemente, se añade a la placa un exceso
molar de un anticuerpo respecto a la concentración máxima de VEGF
libre esperado (tal y como se ha descrito más arriba) después de
lavar la placa. Dicho anticuerpo (que es detectable directa o
indirectamente) es preferentemente un anticuerpo policlonal, aunque
puede emplearse cualquier anticuerpo. La afinidad del anticuerpo
debe ser suficientemente elevada para poder detectar pequeñas
cantidades de VEGF libre, pero no tan elevada para provocar que el
VEGF sea arrastrado por los reactivos de captura.
Cuarta
etapa
En la última etapa del procedimiento de ensayo,
el nivel de VEGF libre que se encuentra unido ahora a los reactivos
de captura se mide utilizando un medio de detección de un anticuerpo
detectable. Si la muestra biológica es de un paciente con
enfermedad vascular, diabético o con cáncer, la etapa de medición
comprende preferentemente comparar la reacción que tiene lugar como
resultado de las tres etapas anteriores con una curva estándar para
determinar el nivel de VEGF en comparación con un individuo
normal.
Los anticuerpos policlonales anti VEGF se
producen generalmente en animales mediante inyecciones múltiples
subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de VEGF y un adyuvante.
Puede ser útil conjugar el VEGF o un fragmento que contenga la
secuencia de aminoácidos diana a una proteína que sea inmunogénica
en la especie a inmunidar, por ejemplo, hemocianina de la lapa
californiana, albúmina del suero, tiroglobulina bovina o inhibidor
de tripsina de semillas de soja utilizando un agente bifuncional o
derivatizante, por ejemplo éster de la maleimidobenzoil
sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisterna),
N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de
lisina), glutaraldehido, anhídrido succínico, SOCl_{2} o R_{1}N
= C = NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los anticuerpos utilizados como recubrimiento o
como anticuerpos detectables pueden obtenerse a partir de cualquier
fuente vertebrada, por ejemplo murina, primate, lagomorpha, cabra,
conejo, rata, pollo, bovina, ovina, equina, canina, felina o
porcina. Los anticuerpos quiméricos o humanizados pueden emplearse
también, tal y como se ha descrito, por ejemplo, en la patente US
Num. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature,
312: 604 (1984); Takeda et al., Nature, 314: 452
(1985); y la patente WO 98/45331 publicada el 15 de octubre de 1998,
así como en las referencias adicionales indicadas más arriba.
Los animales pueden inmunizarse contra los
conjugados o derivados inmunogénicos combinando 1 mg o 1 \mug de
conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres
volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución
intradérmicamente en diferentes sitios. Un mes después, los animales
se estimularon con 1/5 a 1/10 la cantidad original de conjugado en
adyuvante incompleto de Freund mediante inyección subcutánea en
diferentes sitios. De 7 a 14 días después, los animales se sangraron
y se ensaya el suero en una valoración anti-VEGF.
Los animales se estimularon hasta la meseta de valoración.
Preferentemente, el animal se estimularon con el conjugado de VEGF,
pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un agente
de entrecruzamiento diferente. También pueden realizarse los
conjugados en un cultivo celular recombinante como fusiones de
proteína. Así, algunos agentes agregantes como alúmina se utilizan
para aumentar la respuesta inmune. Algunos procedimientos para la
producción de anticuerpos monoclonales se han descrito en numerosos
libros de texto de inmunología, por ejemplo de Davis et al.,
Microbiology, 3ª edición (Harper & Row, New York, New York
1980).
Los anticuerpos monoclonales se preparan
recuperando células de bazo a partir de animales inmunizados e
inmortalizando las células de manera conveniente, por ejemplo
mediante fusión con células de mieloma o mediante transformación con
el virus Epstein-Barr, y analizando los clones que
expresan el anticuerpo deseado. Véase, por ejemplo, Kohler y
Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976). Los anticuerpos
monoclonales o la región de unión a antígeno de un anticuerpo
monoclonal, por ejemplo Fab o fragmentos (Fab), pueden producirse
alternativamente mediante procedimientos recombinantes.
Algunos ejemplos de anticuerpos adecuados
incluyen aquellos ya utilizados en RIAs conocidos para la proteína
en cuestión, por ejemplo, aquellos anticuerpos dirigidos contra VEGF
tal y como se ha descrito en las referencias indicadas en la
introducción de la presente invención.
El anticuerpo añadido a los reactivos de captura
inmovilizados se marcan directamente o bien se detectan
indirectamente mediante la adición, después de separar por lavado el
exceso del primer anticuerpo, de un exceso molar de un segundo
anticuerpo marcado dirigido contra la IgG de la especie animal del
primer anticuerpo. En el último ensayo indirecto, se añade a la
muestra un antisuero marcado contra el primer anticuerpo para
producir el anticuerpo marcado in situ.
La marca utilizada para el primer o segundo
anticuerpo es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera
con la unión de VEGF libre al anticuerpo. Algunos ejemplos de marcas
adecuadas son las numerosas marcas descritas para su utilización en
inmunoensayo, incluyendo estructuras que pueden detectarse
directamente, por ejemplo fluorocromo, quimioluminiscente y marcas
radioactivas, así como estructuras como por ejemplo enzimas, que
deben reaccionar o derivarse para ser detectadas. Algunos ejemplos
de dichas marcas incluyen los radioisótopos ^{32}P, ^{14}C,
^{125}I, ^{3}H y ^{131}I, fluoróforos como por ejemplo
quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina
y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo
la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana (patente US
Num. 4,737,456), luciferina,
2,3-dihidroftalazinedionas, la peroxidasa de rábano
rusticano (HRP), la fosfatasa alcalina, la
\beta-galactosidasa, la glucoamilasa, la
lisozima, la sacarida, las oxidasas, por ejemplo la glucosa oxidasa,
la galactosa oxidasa y la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
las oxidasas heterocíclicas como por ejemplo la uricasa y la xantina
oxidasa, acoplada con una enzima que utiliza peróxido de hidrógeno
para oxidar un precursor de un tinte como por ejemplo HRP, la
lactoperoxidasa o la microperoxidasa, biotina/avidina,
biotina/espreptavidina,
biotina/estreptavidina-\beta-galactosidasa
con MUG, marcas de spin, marcas con bacteriófagos, radicales libres
estables y similares. Tal y como se ha indicado más arriba, se
prefiere la detección fluorimétrica.
Se encuentran disponibles algunos procedimientos
convencionales para unir dichas marcas covalentemente a proteínas o
polipéptidos. Por ejemplo, algunos agentes de acoplamiento como por
ejemplo dialdehidos, carbodiimidas, dimaleimidas,
bis-imidatos, bis-diazo benzidina y
similares pueden utilizarse para tag los ancituerpos con las marcas
fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticas descritas más
arriba. Véase, por ejemplo, las patentes U.S. Num. 3,940,475
(fluorimetría) y 3,645,090 (enzimas); Hunter et al.,
Nature, 144: 945 (1962); David et al.,
Biochemistry, 13: 1014 - 1021 (1974); Pain et al.,
J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); y
Nygren, J. Histochem. y Cytochem., 30:
407-412 (1982). Las marcas preferidas en la presente
invención son fluorescentes, para aumentar la amplificación y la
sensibilidad a 8 pg/ml, más preferentemente biotina con
estreptavidina-\beta-galactosidasa
y MUG para amplificar la señal.
La conjugación de dicha marca, incluyendo las
enzimas, al anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar
para un experto técnico medio en las técnicas de inmunoensayo.
Véase, por ejemplo, O'Sullivan et al., "Procedimientos
para la preparación de conjugados enzima-anticuerpo
para su utilización en inmunoensayos enzimáticos" en
Procedimientos en Enzimología, ed. J.J. Langone y H. Van Vunakis,
vol. 73 (Academic Press, New York, New Cork, 1981), pág.
147-166.
Después de la adición del ultimo anticuerpo
marcado, la cantidad de anticuerpo unido se determina eliminando el
exceso de anticuerpo marcado no unido mediante lavado y después
midiendo la cantidad de marca unida utilizando un procedimiento de
detección apropiado para la marca, y correlacionando la cantidad
medida con la cantidad de VEGF libre en la muestra biológica. Por
ejemplo, en el caso de enzimas, la cantidad de color desarrollada y
medida será una medida directa de la cantidad de VEGF presente.
Específicamente, si HRP es la marca, el color se detecta utilizando
el substrato OPD a 490 nm de absorbancia.
En un ejemplo, después de lavar de la fase
inmovilizada un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente dirigido
contra el primer anticuerpo no marcado, se desarrolla color o
quimioluminiscencia y se mide incubando el reactivo de captura
inmovilizado con un substrato de la enzima. Entonces se calcula la
cantidad de concentración de VEGF libre comparando con el color o
quimioluminiscencia generada mediante una muestra de estándar de
VEGF analizada en paralelo.
De manera conveniente, el procedimiento de ensayo
de la presente invención puede proporcionarse en forma de kit.
Dicho kit es una combinación empaquetada que incluye los elementos
básicos siguientes:
- (a)
- reactivos de captura que comprenden anticuerpos policlonal y monoclonal contra la molécula de VEGF humana, donde el anticuerpo monoclonal se une específicamente al extremo C-terminal de la molécula de VEGF, en una relación en peso de aproximadamente 0,8:1 a 1,2:1 de anticuerpo monoclonal respecto el anticuerpo policlonal; y
- (b)
- reactivos de detección que comprenden anticuerpos detectables (marcados o no marcados) que se unen a los dominios KDR y FTL1 del receptor de VEGF.
Estos elementos básicos se han definido más
arriba.
Preferentemente, el kit comprende además un
soporte sólido para los reactivos de captura, que puede
proporcionarse como un elemento separado o en el cual ya se han
inmovilizado los reactivos de captura. Así, los anticuerpos de
captura en el kit pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido o
pueden inmovilizarse en un soporte incluido en el kit o
proporcionarse separadamente del kit. Preferentemente, los reactivos
de captura se recubren sobre una placa de microvaloración. El
reactivo de detección puede ser anticuerpos marcados que se
detectan directamente o anticuerpos no marcados que se detectan
mediante anticuerpos marcados dirigidos contra los anticuerpos no
marcados obtenidos en diferentes especies. Si la marca es una
enzima, el kit contendrá habitualmente substratos y cofactores
requeridos por la enzima y si la marca es un fluoróforo, un
precursor de un tinte que proporciona el cromóforo detectable. Si
el reactivo de detección no está marcado, el kit puede comprender
además un medio de detección de los anticuerpos detectables, por
ejemplo los anticuerpos detectables dirigidos a los anticuerpos no
marcados, preferentemente en un formato detectable
fluorimétricamente.
En una realización específica preferida, la
relación en peso de anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo
policlonal en el kit es aproximadamente 1:1, el anticuerpo
detectable es un anticuerpo monoclonal murino biotinilado, el
anticuerpo monoclonal es murino o de rata, más preferentemente
murino, y más preferentemente MAb 3.5F8, el anticuerpo policlonal
se ha purificado por afinidad y más preferentemente a partir de
cabra o conejo, más referentemente de conejo, y la cantidad de
anticuerpos monoclonales murinos es de 0,4 \mug/ml y la cantidad
de anticuerpos policlonales de conejo es de 0,4 \mug/ml.
Preferentemente, los reactivos de captura se inmovilizan en este
kit. Así, preferentemente, el anticuerpo detectables es MAb
A4.6.1.
El kit contiene también típicamente instrucciones
para llevar a cabo el ensayo y/o VEGF como estándar de antígeno
(por ejemplo VEGF purificado, preferentemente VEGF producido de
manera recombinante), así como otros aditivos como por ejemplos
estabilizadores, tampones de lavado o de incubación y similares.
Algunos ejemplos de estándares de VEGF son el
VEGF humano recombinante producido en células de mamífero
disponibles comercialmente en Genentech. Inc., San Francisco Sur,
California.
Los componentes del kit pueden proporcionarse en
relaciones predeterminadas, variando las cantidades relativas de
los diferentes reactivos de la forma adecuada para proporcionar las
concentraciones en solución de los reactivos que maximizan
substancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los
reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente
liofilizados, incluyendo excipientes, que proporcionaran en
solución una disolución del reactivo con la concentración adecuada
para combinar con la muestra a analizar.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar una
realización descrita aquí para practicar la invención, pero la
invención no debe considerarse limitada por dichos ejemplos.
Ejemplo
1
Se utilizó VEGF-165 (rhVEGF)
humana recombinada purificada expresada en Escherichia coli
(Genentech, San Francisco Sur, CA) como estándar y para los
controles (preparados en diluyente ELISA tal y como se define más
abajo y almacenados a -70ºC). La
estreptavidina-\beta-galactosidasa
(Strep-\beta-gal) se compró en
Boehringer Mannheim. W. Alemania; MUG se compró en Sigma, St. Louis,
MO. El dimetilsulfóxido (DMSO) se compró en Sigma.
Los anticuerpos anti rhVEGF165 se prepararon tal
y como se ha descrito en Kim et al., Growth Factors,
7: 53 (1992). Brevemente, se hiperinmunizaron
intraperitonealmente ratones BALB/c con una dosis de 10 mg de
rhVEGF165 conjugado con hemocianina de lapa californiana. Se
fusionaron células bazo con una línea de mieloma de ratón y se
analizó la presencia de MAbs anti rhVEGF en los sobrenadantes de
cultivo de los pozos que contenían hibridomas, mediante ELISA. Los
hibridomas positivos se clonaron dos veces utilizando la técnica de
dilución limitante. Los anticuerpos monoclonales utilizados en este
ELISA se han caracterizado en Kim et al., supra (1992). Se
cree que uno de los anticuerpos de captura, MAb 3.5F8, se une cerca
del dominio de unión a heparina, a los residuos de aminoácido
111-165, con una K_{d} de 13 pM. Rodríguez et
al., supra (1998).
El anticuerpo policlonal de conejo (PAb)
utilizado como el otro anticuerpo de recubrimiento, se generó
inyectando VEGF en un conejo utilizando un protocolo estándar y se
purificó pasándolo a través de una columna de afinidad a la cual se
había acoplado VEGF para capturar el anticuerpo policlonal,
separando de esta manera las inmunoglobulinas de la muestra. Las
moléculas que nos eon el anticuerpo deseado se separaron mediante
lavado y el anticuerpo unido se eluyó con glicina 0,2 M, pH 2,
entonces el pH se llevó a pH neutro antes de la diálisis durante
una noche en PBS a 4ºC y el eluyente que contenía el anticuerpo se
utilizó para el ensayo de sitio múltiple.
El anticuerpo de detección, MAb A4.6.1 une
rhVEGF165 con una Kd de 86 pM. Diferentes evidencias sugieren que
dicho MAb une rhVEGF cerca de la región KDR de unión a receptor Kim
et al., supra).
El MAb A4.6.1 se biotiniló con ácido
biotinilamidocapróico - N-hidroxisuccinimida éster
(Biotina-X-NHS) (Research Organics,
Cleveland, OH) según el siguiente protocolo. El MAb A4.6.1 se
dializó contra NaHCO3 100 mM, pH 8,5, durante una noche a
2-8ºC. Un total de 60 \mul de una solución de
Biotina-X-NHS 5 mg/ml en DMSO se
añadió al MAb (ajustado después de la diálisis a una concentración
de 2-10 mg/ml) utilizando una relación 1:10
(peso/peso) de Biotina: MAb. Se incubó esta mezcla durante dos horas
a temperatura ambiente con agitación suave y la reacción se paró
mediante la adición de 5 \mul de etanolamina. Después de la
conjugación, el anticuerpo se dializó extensivamente contra PBS a
2-8ºC con agitación suave y se cambió el PBS cada
dos horas durante un total de tres veces.
Dos MAbs 3.5F8 (recubrimiento) y A4.6.1
biotinilado (detección) y un PAb (recubrimiento) tal y como se ha
descrito más arriba, se utilizaron para desarrollar un ELISA de VEGF
específico y sensible. En dicho ELISA, se mezclaron 100 \mul/pozo
de cada MAh 3.5F8 y el PAb purificado por afinidad y entonces se
añadió a placas de microvaloración de 96 pozos MziSorpTM (Nunc.
Roskilde, Dinamarca) a 0,4 \mug/ml por cada pozo en carbonato
sódico 0,05 M, pH 9.6. Después de una incubación de
24-74 horas a 2-8ºC, las placas
recubiertas se lavaron 3 veces con 400 \mul de tampón de lavado
para ELISA (PBS que contenía un 0,05% de detergente
TWEEN-20^{TM}) utilizando un lavador de placa
BIOTEK EL304^{TM} (Instrumentos Biotek, Winooski, VT) y se
bloqueó con diluyente de bloqueo ELISA a 200 \mul/pozo (PBS que
contenía un 0,5% de BASA, un 0,05% de detergente
TWEEN-20^{TM} y un 0,05% de antibiótico
PROCLIN^{TM} 300, pH 7,2) durante 1-3 horas a
temperatura ambiente con agitación. Después de bloquear, las placas
de lavaron de nuevo 3 veces con 400 \mul de tampón de lavado
ELISA. Entonces, se añadieron 100 \mul/pozo de estándares,
muestras o controles para duplicar los pozos y se incubó durante
1,5-2 horas a 37ºC con agitación. Para la
cuantificación de rhVEGF165 en plasma humano, la curva estándar se
preparó en diluyente ELISA (PBS que contenía un 0,5% de BASA, un
0,05% de TWEEN-20^{TM}, un 0,05% de
PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM y NaCl 0,35M, pH 6,3 \pm 0,1). La
curva estándar era 128 pg/ml diluida serialmente 1:2 hasta 2 pg/ml.
Después de la incubación muestra/estándar, las placas se lavaron
seis veces con 400 \mul de tampón de lavado ELISA y se añadió a
las placas 100 \mul/pozo de MAb A4.6.1 - Biotina, recién diluido
1:200 hasta su concentración óptima en diluyente ELISA. Después de
una incubación de 1,5-2 horas a 37ºC con agitación,
las placas se lavaron seis veces tal y como se ha descrito más
arriba y se añadió a las placas 100 \mul/pozo de
strep-\beta-gal, diluido 1:40K en
diluyente ELISA. Después de una incubación de 45-60
minutos a 37ºC con agitación, las placas se lavaron 6 veces tal y
como se ha descrito más arriba y se añadió a las placas 100
\mul/pozo de MUG/DMSO (1/100), recién diluido a 340 \mug/ml en
una solución de NaPO_{4} 0,1M, que contenía MgCl_{2} 1 mM a pH
\pm 7,3. La reacción de substrato se incubó durante
15-17 horas a 37ºC con agitación en la oscuridad
(la placa estaba envuelta en papel de aluminio). La reacción se
paró por adición de 150 \mul/pozo de glicina 0,15M, pH 10,5 \pm
0,1. La unidad de fluorescencia (FSU) del contenido de los pozos se
leyó en un lector de placa fluorescente CYTOFLUOR 4000^{TM}
(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) utilizando filtros de
excitación y de emisión a 360 nm y a 460 nm, respectivamente. Se
utilizó un programa de ajuste de curva de cuatro parámetros para
generar una curva estándar, a partir de la cual se interpolaron las
concentraciones de muestra y control. Las lecturas FSU fueron
estables durante como mínimo 30 minutos a temperatura ambiente
después de añadir 150 \mul de glicina.
La capacidad de medir VEGF de forma precisa en
plasma humano se confirmó utilizando diferentes aproximaciones. El
efecto del plasma sobre la sensibilidad y rendimiento del ensayo se
evaluó utilizando rhVEGF165. Se añadieron cantidades conocidas de
rhVEGF165 a muestras individuales de plasma humano y se determinó el
porcentaje de recuperación como sigue: (1) la cantidad de VEGF
endógeno en la muestra, determinado a partir de una muestra
paralela, se restó de la cantidad total de VEGF medido en la
muestra; (2) el valor de VEGF "recuperado" se dividió entonces
por la cantidad de VEGF añadido a la muestra y se multiplicó por
100. La linealidad de dilución de rhVEGF165 añadido a plasmas
humanos individuales también se evaluó. En estos estudios, después
de la adición de rhVEGF165, cada muestra de plasma se diluyó 1:10 en
diluyente ELISA seguido por diluciones 1:2 en serie en diluyente
ELISA. Se prepararon controles (estándares) de alta matriz y de baja
matriz en plasma EDTA humano claro (congelado). Se diluyeron 1/10
en diluyente ELISA hasta una concentración final del 10% de
plasma.
Los niveles de VEGF endógeno se midieron en
muestras individuales de plasma humano. Se colocó sangre de
individuos sanos normales en tubos Vacutainer (Becton Dickenson, San
Jose, CA) con un 15% de K3 EDTA. Los tubos se centrifugaron a
2000xg durante 20 minutos y se recogió el plasma. Las muestras de
plasma se diluyeron 1:10 en diluyente ELISA para su utilización en
el ensayo. La linealidad de dilución del VEGF endógeno en muestras
seleccionadas también se evaluó tal y como se ha descrito más
arriba.
La estabilidad de plasma EDTA humano claro se
examinó en tres ciclos de congelación - descongelación. El plasma se
sometió a un tratamiento en hielo seguido de un mezclado suave en
agua caliente para descongelar. Los datos en la Tabla 1 más abajo
demuestran que no hay un efecto significativo sobre la
cuantificación de VEGF después de los tratamientos congelación -
descongelación. Por lo tanto, el plasma EDTA humano es estable
durante tres ciclos de congelación - descongelación.
\vskip1.000000\baselineskip
hu EDTA Plasma | Dos sitios | Sitio múltiple | |
32 | 22.11 | 78.84 | Fresco |
25.4 | 75.16 | 1 congelación-descongelación | |
14.85 | 75.16 | 2 congelaciones-descongelac. | |
18.88 | 72.08 | 3 congelaciones-descongelac. | |
media | 20.31 | 75.31 | |
desv. std | 4.51 | 2.77 | |
% CV | 2.2 | 4 |
hu EDTA Plasma | Dos sitios | Sitio múltiple | |
33 | 35.44 | 100.24 | Fresco |
35.87 | 101.71 | 1 congelación-descongelación | |
35.44 | 101.71 | 2 congelaciones-descongelac. | |
39.19 | 101.71 | 3 congelaciones-descongelac. | |
media | 36.49 | 101.34 | |
desv. std | 1.81 | 0.73 | |
% CV | 5 | 1 | |
34 | 17.51 | 78.18 | Fresco |
25.03 | 94.6 | 1 congelación-descongelación | |
22.11 | 94.6 | 2 congelaciones-descongelac. | |
24.72 | 83.95 | 3 congelaciones-descongelac. | |
media | 22.34 | 87.83 | |
desv. std | 3.48 | 8.16 | |
% CV | 16 | 9 | |
39 | 29.35 | 84.62 | Fresco |
31.11 | 81.39 | 1 congelación-descongelación | |
28.02 | 75.16 | 2 congelaciones-descongelac. | |
31.11 | 71.51 | 3 congelaciones-descongelac. | |
media | 29.90 | 78.17 | |
desv. std | 1.50 | 5.93 | |
% CV | 5 | 8 | |
38 | 23.43 | 83.95 | Fresco |
29.94 | 80.07 | 1 congelación-descongelación | |
21.8 | 83.95 | 2 congelaciones-descongelac. | |
24.72 | 66.84 | 3 congelaciones-descongelac. | |
media | 24.97 | 78.70 | |
desv. std | 3.52 | 8.12 | |
% CV | 14 | 10 | |
12 | 6 | ||
desv. std = desviación estándar | |||
CV = coeficientes de variación |
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 20 réplicas del blanco, 1, 2, 4 y
8 pg/ml de estándar, se ensayaron en el ELISA para VEGF de sitio
múltiple según la invención. El límite de detección se determinó
mediante la concentración de analito (VEGF) a la cual la respuesta
FSU media medida menos dos desviaciones estándar era mayor que la
respuesta FSU media más dos desviaciones estándar de la emisión de
fluorescencia (460 nm) del blanco. Los resultados de la Tabla 2
demuestran que el límite de detección es 8 pg/ml en diluyente ELISA.
Dado que las muestras de plasma se diluyen típicamente 1:10 para
minimizar la interferencia de la matriz, puede medirse una cantidad
tan ínfima como 80 pg/ml o 1,6 pM de VEGF en la muestra
original.
réplicas | std 0 pg/ml | std 1 pg/ml | std 2 pg/ml | std 4 pg/ml | std 8 pg/ml |
FSUs | FSUs | FSUs | FSUs | FSUs | |
1 | 1103 | 1277 | 1351 | 1546 | 2216 |
2 | 1091 | 1382 | 1359 | 1617 | 2292 |
3 | 1103 | 1336 | 1413 | 1745 | 2241 |
4 | 1180 | 1328 | 1986 | 1770 | 2266 |
5 | 1235 | 1321 | 1382 | 1654 | 2216 |
6 | 1135 | 1382 | 1631 | 1735 | 2216 |
7 | 1180 | 1306 | 1328 | 1692 | 2266 |
8 | 1154 | 1125 | 1512 | 1654 | 2241 |
9 | 1079 | 1351 | 1366 | 1682 | 2279 |
10 | 1129 | 1559 | 1529 | 1678 | 2384 |
11 | 1129 | 1314 | 1445 | 1654 | 2266 |
12 | 1263 | 1413 | 1299 | 1617 | 2228 |
13 | 1079 | 1382 | 1336 | 1631 | 2216 |
14 | 1235 | 1284 | 1851 | 1716 | 2565 |
15 | 1135 | - - - | 1711 | 1780 | 2266 |
16 | 1129 | - - - | 1590 | 2077 | 2266 |
17 | 1017 | - - - | 1445 | 1654 | 2279 |
18 | 1351 | - - - | 1445 | 1740 | 2371 |
19 | 1079 | - - - | 1546 | 1599 | 2318 |
20 | 2025 | - - - | 1626 | 1663 | 2228 |
Media | 1192 | 1340 | 1508 | 1695 | 2281 |
desv.std. | 211 | 94 | 183 | 108 | 82 |
+1 SD | 1402 | 1434 | 1690 | 1803 | 2363 |
+2 SD | 1613 | 1528 | 1873 | 1911 | 2445 |
-1 SD | 981 | 1246 | 1325 | 1587 | 2199 |
-2 SD | 770 | 1152 | 1142 | 1479 | 2117 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se compararon en el ensayo dos preparaciones
diferentes de anticuerpo policlonal de conejo contra rhVEGF
purificado del mismo conejo pero de diferente sangrado, utilizando
MAb 3.5F8 como el anticuerpo monoclonal y utilizando 0,4 \mug/ml
de cada tipo de anticuerpo. Los resultados, indicados en la Fig. 1,
muestran que ambos anticuerpos son adecuados para su
utilización.
Le elusión del anticuerpo policlonal de conejo se
llevó a cabo con glicina seguido de guanidina y los anticuerpos
resultantes se utilizaron en el ensayo con las condiciones
preferidas según la invención. Los resultados en la Fig. 2 y en la
Tabla 3 muestran que no hay una diferencia significativa entre los
dos procedimientos de elusión. Sin embargo, la elusión con glicina
parece ser ligeramente más sensible. La comparación de muestras de
plasma EDTA humano normal así como los controles de Alta Matriz y
Baja Matriz muestran una cuantificación similar en ambas
preparaciones. El pico de guanidina se encuentra unido más
estrechamente al VEGF que el pico de glicina.
Plasma EDTA | PAb (glicina) + MAbs 3.5 | PAb (guanidina) + MAbs 3.5 | % recuperación |
humano normal | F8/A4.6.1 (pg/ml) | F8/A4.6.1 (pg/ml) | |
1 | 37 | 48 | 77 |
2 | 41 | 34 | 123 |
3 | 112 | 90 | 124 |
4 | 79 | 62 | 128 |
5 | 49 | 36 | 136 |
6 | 40 | 57 | 71 |
7 | 59 | 45 | 132 |
8 | 35 | 31 | 116 |
Alta Matriz | 99 | 102 | 97 |
Baja Matriz | 9 | 8 | 115 |
% de recuperación media 112 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la precisión
inter-ensayo e intra-ensayo para los
controles de baja y alta matriz mediante un análisis estadístico
ANOVA. Los controles de matriz se prepararon añadiendo rhVEGF en
plasma EDTA humano claro a concentraciones bajas y altas para caer
dentro del rango de ensayo. Los resultados muestran que la
variabilidad inter-ensayo (CV) va de
11-17%, mientras que la variabilidad
intra-ensayo va de 8-14%. Los datos
se resumen en la
Tabla 4.
Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Nombre del Ensayo | Alta (pg/ml) | Baja (pg/ml) |
Kn324p2 | 107.5 | 6.8 |
Kn324p2 | 111.2 | 11.6 |
Kn324p3 | 93.8 | 10.4 |
Kn324p3 | 96.7 | 11.2 |
Kn320p7 | 103.6 | 13.7 |
Kn320p7 | 103.6 | 13.7 |
Kn320p8 | 99.7 | 14.3 |
Kn320p8 | 102.0 | 14.7 |
Kn322p2 | 110.6 | 13.3 |
Kn322p2 | 102.0 | - - - |
Kn322p3 | 97.0 | 14.4 |
Kn322p3 | 103.9 | 13.9 |
Kn322p1 | 99.0 | 12.0 |
Kn322p1 | 95.2 | 12.3 |
Kn320p3 | 101.1 | 15.3 |
Kn320p3 | 98.0 | 14.5 |
Kn320p2 | 105.1 | 14.9 |
Kn320p2 | 100.5 | 14.2 |
Kn320p1 | 106.0 | 14.1 |
Nombre del Ensayo | Alta (pg/ml) | Baja (pg/ml) |
Kn320p1 | 103.4 | 13.9 |
Kn319p2 | 87.1 | 10.2 |
Kn319p2 | 100.2 | 9.3 |
Kn319p1 | 97.6 | 9.4 |
Kn319p1 | 99.6 | 9.1 |
Kn316p1 | 92.4 | 11.7 |
Kn316p1 | 97.9 | 11.3 |
Kn313p1 | 117.8 | 18.8 |
Kn313p1 | 111.4 | 16.2 |
Kn212p2 | 92.4 | 14.6 |
Kn212p2 | 92.4 | 15.7 |
Kn311p1 | 123.9 | 14.2 |
Kn212p1 | 103.8 | 13.9 |
Kn212p1 | 93.2 | 13.7 |
Kn331p1 | 106.2 | 12.9 |
Kn331p1 | 109.2 | 13.3 |
Kn331p2 | 99.8 | 11.9 |
Controles de Matriz | Intra-ensayo (% CV) | Inter-ensayo (% CV) |
Baja | 14.0 | 11.0 |
Alta | 8.0 | 17.0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Diversas muestras han mostrado en el pasado
no-linealidad en el incremento de VEGF medido al
aumentar la dilución de la muestra. Por lo tanto, en el ensayo ELISA
de sitio múltiple según la invención se analizó el efecto Hook
(comparación punto a punto con el ELISA de sitio único y de dos
sitios), rhVEGF se diluyó de 16 ng/ml a 1pg/ml en tampón de ensayo.
Los resultados (mostrados en la figura 3) muestran que no hay una
caída significativa en la cuantificación de VEGF. Sin embargo, puede
observarse una ligera caída y un efecto meseta a partir de 512 pg/ml
en adelante. Dado que las diluciones de muestra utilizadas en el
ensayo ELISA de sitio múltiple según la invención dan lugar a
concentraciones menores de 128 pg/ml, el efecto hook no incumbe.
Los procedimientos para la determinación de la
maximización de recubrimiento fueron los mismos que los descritos
más arriba en la sección Procedimientos, excepto por el hecho de que
se varió la concentración de PAb o de MAb3.5F8. Más específicamente,
para la Fig. 4 la concentración de MAb 3.5F8 se varió de 0,4
\mug/ml a 4 \mug/ml manteniendo constante la concentración del
anticuerpo policlonal (a 1 \mug/ml). Y para la Fig. 5 y la Tabla
5, la concentración del anticuerpo policlonal se varió de 0,4
\mug/ml a 4 \mug/ml manteniendo constante la concentración de
MAb 3.5F8 (a 0,4 \mug/ml).
Mientras que las concentraciones 0,1 \mug/ml y
0,4 \mug/ml de MAb 3.5F8 y del PAb a concentración constante del
otro anticuerpo de recubrimiento eran esencialmente las mismas en la
cuantificación de VEGF para el control bajo y alto, el límite
superior de la concentración de recubrimiento (es decir, 0,4
\mug/ml) se prefiere para tener mejores posibilidades de capturar
VEGF. Mientras que la concentración de 1 \mug/ml de MAb 3.5F8 y
PAb aumentó la cantidad de VEGF medido en cada caso, dicha
concentración también dio un mayor ruido de fondo. Así, los
resultados muestran que las concentraciones preferidas para ambos
reactivos de captura es aproximadamente 0,4 \mug/ml.
MAb 3.5F8 PAb | 0,4 \mug/ml | 0,4 \mug/ml | 0,4 \mug/ml | 0,4 \mug/ml |
1 \mu/ml | 0,4 \mug/ml | 0,1 \mug/ml | 0 | |
Alta Matriz (pg/ml) | 100.4 | 89.3 | 94.0 | 97.3 |
Baja Matriz (pg/ml) | 22.4 | 9.7 | 10.1 | 5.4 |
Ocho donantes de plasma | 97.3 | 33.5 | 42.5 | 10.7 |
humano normal (pg/ml): | 202.5 | 106.5 | 77.0 | 19.7 |
162.3 | 52.9 | 59.0 | 26.8 | |
92.0 | 27.5 | 29.8 | 11.1 | |
115.6 | 41.4 | 42.5 | 11.0 | |
202.5 | 70.8 | 69.7 | 15.8 | |
409.9 | 196.6 | 207.9 | 94.9 | |
512.1 | 25.7 | 275.0 | 113.0 |
Se llevó a cabo un perfil de pH para determinar
si cambiando el pH del tampón de ensayo aumentaría o disminuiría la
recuperación de VEGF en plasma EDTA humano normal. Cambiando el pH,
las proteínas de unión u otros complejos, si los hubieran, podrían
disociarse, lo cual interferiría con la detección del MAb
A4.6.1.
El procedimiento para examinar el perfil de pH
del ensayo fue el mismo que el descrito en la sección
Procedimientos más arriba, excepto por la incubación de la muestra y
la incubación con biotina, el tampón de ensayo se ajustó utilizando
NaOH o HCl, dando como resultado tampones de ensayo que van de pH 4
a 9. Una curva estándar, una matriz baja y alta y cuatro muestras de
plasma EDTA humano normal se evaluaron a partir de diluciones
realizadas utilizando estos tampones de ensayo de pH variable.
Los resultados de la Fig. 6 y la Tabla 6 muestran
que no hubo recuperación de VEGF a pH 4 y 5. Sin embargo, el pH
6-9 reveló una buena recuperación de plasma VEGF con
el control de ensayo dentro de un rango aceptable. No hubo una
diferencia significativa en la cuantificación de VEGF como
consecuencia de variar el pH del tampón de ensayo de 6 a 9. Sin
embargo, el tampón de ensayo preferido tiene un pH de
aproximadamente 6.35 \pm 0,1, lo que da como resultado una unión
máxima de VEGF y es apropiada para todas las etapas de dilución del
ensayo.
pH Plasma EDTA | 4 | 5 | 6 pg/ml | 7 pg/ml | 8 pg/ml | 9 pg/ml |
humano normal | ||||||
1 | - - - | - - - | 198.9 | 122.0 | 173.3 | 204.0 |
2 | - - - | - - - | 141.4 | 81.7 | 138.7 | 138.6 |
3 | - - - | - - - | 240.7 | 150.3 | 220.9 | 243.5 |
4 | - - - | - - - | 112.2 | 113.2 | 176.7 | 190.3 |
Controles | pg/ml | pg/ml | pg/ml | pg/ml | ||
Matriz Alta | - - - | - - - | 104.5 | 105.0 | 93.8 | 124.0 |
Matriz Baja | - - - | - - - | 25.7 | 25.1 | 19.7 | 16.9 |
Aproximadamente 85 pg/ml de rhVEGF se añadió a
plasma EDTA humano normal claro y se diluyó serialmente a 1/10,
1/20, 1/40 y 1/80 y se analizó. Los resultados, en la Tabla 7 y en
la Fig. 7, muestran que el rhVEGF añadido al plasma EDTA mostró una
correlación lineal con la concentración esperada, con un coeficiente
de correlación de 0,996. El porcentaje de diferencia entre los
valores de la concentración corregida por la dilución, determinados
para diluciones en serie sucesivas, no excedieron la media de 19%
\pm 7,5, tal y como se muestra en la Tabla 7.
Plasma EDTA Humano | pg/ml [medidos] | Dilución | Concentración | % de Diferencia |
Normal (muestras) | Corregida | |||
S1 | 103 | 10 | 1026 | - - - |
62 | 20 | 1237 | 21 | |
35 | 40 | 1416 | 14 | |
20 | 80 | 1599 | 13 | |
S2 | 109 | 10 | 1088 | - - - |
59 | 20 | 1176 | 8 | |
35 | 40 | 1416 | 20 | |
22 | 80 | 1788 | 26 | |
S3 | 104 | 10 | 1039 | - - - |
60 | 20 | 1202 | 16 | |
32 | 40 | 1278 | 6 | |
21 | 80 | 1677 | 31 | |
S4 | 88 | 10 | 878 | - - - |
52 | 20 | 1036 | 18 | |
32 | 40 | 1278 | 23 | |
19 | 80 | 1528 | 20 | |
S5 | 93 | 10 | 926 | - - - |
57 | 20 | 1136 | 23 | |
32 | 40 | 1278 | 12 | |
18 | 80 | 1433 | 12 | |
S6 | 119 | 10 | 1192 | - - - |
81 | 20 | 1612 | 35 | |
47 | 40 | 1893 | 17 | |
29 | 80 | 2298 | 21 |
Los niveles de VEGF endógeno se midieron en
plasma recién recogido a partir de diferentes individuos sanos
normales. Las muestras individuales de plasma EDTA humano se
pulsaron con concentraciones muy baja, baja, media y alta de rhVEGF
de manera que cayeran dentro del rango de ensayo de la curva
estándar. Las concentraciones de VEGF endógeno se determinaron y se
restaron de la concentración medida para poder comparar con el pulso
buscado. Los resultados de la Tabla 8 muestran que los % de
recuperación medios fueron 99%, 113%, 106% y 118% para los pulsos
alto, medio, bajo y muy bajo, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Adición Alta | ||||
[Endógeno] | [Medido] | [Medido-Endógeno] | [Buscado] | % recuperación |
18.6 | 100.5 | 81.9 | 85.3 | 96 |
22.5 | 114.8 | 92.3 | 85.3 | 108 |
30.3 | 111.0 | 80.8 | 85.3 | 95 |
22.8 | 96.2 | 73.4 | 85.3 | 86 |
18.4 | 103.2 | 84.9 | 85.3 | 100 |
34.1 | 121.1 | 87.0 | 85.3 | 102 |
% Recuperación medio | 99 |
Adición Media | ||||
[Endógeno] | [Medido] | [Medido-Endógeno] | [Buscado] | % recuperación |
21.0 | 98.3 | 47.1 | 49.3 | 96 |
9.1 | 89.1 | 80.1 | 49.3 | 162 |
10.8 | 66.8 | 55.9 | 49.3 | 113 |
21.0 | 59.5 | 38.5 | 49.3 | 78 |
9.1 | 66.8 | 57.8 | 49.3 | 117 |
% Recuperación medio | 113 |
\vskip1.000000\baselineskip
Adición Baja | ||||
[Endógeno] | [Medido] | [Medido-Endógeno] | [Buscado] | % recuperación |
4.5 | 32.9 | 28.4 | 22.9 | 124 |
10.0 | 32.9 | 22.9 | 22.9 | 100 |
14.9 | 38.3 | 23.4 | 22.9 | 102 |
8.6 | 31.2 | 22.6 | 22.9 | 99 |
9.3 | 33.7 | 24.4 | 22.9 | 107 |
15.9 | 40.9 | 25.0 | 23.5 | 106 |
36.2 | 58.8 | 22.6 | 23.5 | 96 |
38.9 | 66.4 | 27.5 | 23.5 | 117 |
% Recuperación medio | 106 |
\vskip1.000000\baselineskip
Adición Muy Baja | ||||
[Endógeno] | [Medido] | [Medido-Endógeno] | [Buscado] | % recuperación |
4.3 | 24.9 | 20.2 | 17.8 | 114 |
4.6 | 26.1 | 21.5 | 17.8 | 120 |
7.4 | 27.9 | 20.4 | 17.8 | 114 |
6.6 | 26.4 | 19.9 | 17.8 | 111 |
10.8 | 33.1 | 22.2 | 17.8 | 124 |
5.5 | 29.6 | 24.0 | 17.8 | 135 |
3.9 | 22.7 | 18.6 | 17.8 | 105 |
% Recuperación medio | 118 |
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra de plasma EDTA de rata individual y
dos muestras combinadas de plasma EDTA de ratas macho se pulsaron
con una concentración baja, media y alta de rhVEGF de manera que
cayera en el rango de ensayo de la curva estándar. Las
concentraciones de VEGF endógeno se determinaron y restaron de la
concentración medida para poder comparar con la adición buscada
(control de dilución). A continuación, las muestras pulsadas se
diluyeron 1:2 en diluyente ELISA para determinar la linealidad de la
dilución. Los resultados de la Tabla 9 muestran que el porcentaje
medio de recuperación va del 84% al 103% para los pulsos alto, medio
y bajo que eran mayores que 6,25 pg/ml.
[Esperado] | [Medido] | [Medido] | [Medido] | ||||
Control de | Combin. | % de | Combin. | % de | Indiv. rata | % de | % de |
Dilución | 1 de ratas | recupe- | 2 de ratas | recupe- | macho | recupe- | recupe- |
pg/ml | macho | ración | macho | ración | Pg/ml | ración | ración |
pg/ml | pg/ml | media | |||||
Adición Alta | |||||||
151 | 160 | 106 | 155 | 103 | 148 | 98 | 103 |
98 | 106 | 109 | 85 | 87 | 92 | 95 | 97 |
53 | 58 | 109 | 43 | 81 | 43 | 82 | 91 |
24 | 25 | 105 | 15 | 61 | 18 | 76 | 81 |
Adición Media | |||||||
44 | 41 | 94 | 40 | 92 | 39 | 89 | 92 |
22 | 27 | 125 | 20 | 93 | 16 | 71 | 96 |
11 | 13 | 115 | 7 | 66 | 7 | 65 | 82 |
5 | 5 | 104 | 0 | 0 | 1 | 15 | 40 |
Adición Baja | |||||||
20 | 18 | 88 | 19 | 93 | 12 | 62 | 81 |
10 | 14 | 135 | 9 | 86 | 6 | 63 | 95 |
6 | 6 | 102 | 1 | 18 | 0 | 0 | 40 |
3 | 2 | 152 | 0 | 0 | 0 | - - - | 26 |
Adición Muy Baja | |||||||
10 | 10 | 98 | 8 | 76 | 5 | 49 | 74 |
5 | 8 | 149 | 3 | 47 | 2 | 42 | 79 |
4 | 8 | 202 | 0 | 0 | 0 | 0 | 67 |
Endógeno | LTS | 43 | 39 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la linealidad de dilución en plasma
EDTA de rata (2 muestras combinadas de macho, 1 individual). A las
muestras de plasma claras se pulsaron con concentraciones baja (20
pg/ml), media (44 pg/ml) y alta (98 pg/ml) de rhVEGF y se diluyeron
serialmente 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 en diluyente ELISA. Los
resultados de la Tabla 10 y las Figs. 8A-8C muestran
que las muestras de plasma de rata normal diluyen linealmente
después de una dilución mínima 1/20 en el rango de ensayo de
8-128 pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Adición | Comb. Rata 1 | Comb. Rata 2 | Rata 1 | Valor R medio |
Alta | 0.996 | 0.996 | 0.999 | 0.997 |
Media | 1 | 0.999 | 0.994 | 0.998 |
Baja | 0.929 | 0.993 | 0.98 | 0.967 |
\newpage
Ocho muestras de plasma EDTA de cerdo de
Yorkshire (cuatro machos y cuatro hembras) se pulsaron con
concentraciones baja, media y alta de rhVEGF de manera que cayera en
el rango de ensayo de la curva estándar. Las concentraciones de VEGF
endógeno se determinaron y restaron de la concentración medida para
poder comparar con la adición buscada (control de dilución). A
continuación, las muestras pulsadas se diluyeron 1/10, 1/20, 1/40 y
1/80 en diluyente ELISA para determinar la linealidad de la
dilución. Los resultados, mostrados en la Fig. 9A (hembras) y 9B
(machos) y en la Tabla 11 muestran que las muestras de plasma de
rata normal diluyen linealmente después de una dilución mínima 1/20
en el rango de ensayo de 8-128 pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Género | Coeficiente de Correlación (R) |
Hembra | 0.99718 |
Hembra | 0.99917 |
Hembra | 0.99998 |
Hembra | 0.99958 |
Macho | 1 |
Macho | 0.99965 |
Macho | 0.99995 |
Macho | 0.99961 |
Medio | 0.99939 |
desviación estándar | 0.00093491 |
% CV | 0.094 |
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento se diseñó para determinar si el
ELISA de sitio múltiple según la presente invención podía medir
todas las variantes de VEGF. Las Figuras 10A, 10B y 10C muestran una
comparación de ELISA para VEGF de sitio único, de dos sitios y de
sitio múltiple, respectivamente. Comparando estos gráficos puede
observarse que el ensayo de sitio múltiple según la invención es
capaz de capturar más variantes de VEGF.
El ELISA de sitio múltiple según la invención
utilizando PAb y MAb 3.5F8 como anticuerpos de recubrimiento se
comparó con un ELISA utilizando sólo MAb 3.5F8 o PAb como anticuerpo
de recubrimiento para evaluar la cantidad de VEGF en muestras
humanas normales. Los resultados, mostrados en la Tabla 12, muestran
que la cantidad de VEGF detectada en pg/ml era mucho mayor para el
ensayo de sitio múltiple que para el ensayo con PAb sólo o MAb 3.5F8
sólo.
Muestra NHP # | Reactivo de Captura | ||
MAb 3.5F8 | PAb anti VEGF | PAb anti VEGF + MAb 3.5F8 | |
(pg/ml medio) | (pg/ml medio) | (pg/ml medio) | |
1 | 49 | 173 | 225 |
2 | 26 | LTS | 149 |
3 | 39 | 124 | 211 |
4 | 41 | 103 | 189 |
5 | 27 | LTS | 153 |
6 | 29 | LTS | 149 |
7 | 16 | LTS | 159 |
8 | 25 | LTS | 144 |
9 | 21 | LTS | 122 |
10 | 36 | 148 | 185 |
11 | 24 | 72 | 171 |
12 | 23 | LTS | 145 |
13 | 40 | 103 | 200 |
14 | 34 | 83 | 143 |
15 | 42 | LTS | 200 |
16 | 20 | 85 | 152 |
17 | 51 | 196 | 285 |
18 | 25 | LTS | 145 |
19 | 20 | LTS | 154 |
20 | 20 | LTS | 143 |
21 | 23 | LTS | 155 |
22 | 28 | 77 | 163 |
23 | 39 | 180 | 285 |
24 | 24 | 87 | 168 |
25 | 45 | 148 | 261 |
26 | 21 | 131 | 179 |
27 | 34 | LTS | 189 |
28 | 18 | LTS | 131 |
29 | 50 | 159 | 251 |
30 | 73 | LTS | 359 |
31 | 21 | 85 | 149 |
Muestra NHP # | Reactivo de Captura | ||
MAb 3.5F8 | PAb anti VEGF | PAb anti VEGF + MAb 3.5F8 | |
(pg/ml medio) | (pg/ml medio) | (pg/ml medio) | |
32 | 42 | 214 | 237 |
33 | 33 | LTS | 234 |
34 | 30 | 152 | 206 |
35 | 21 | 87 | 154 |
36 | 76 | 307 | 445 |
37 | 28 | 70 | 225 |
38 | 53 | 51 | 304 |
39 | 32 | 84 | 193 |
40 | 28 | LTS | 106 |
41 | 44 | 105 | 275 |
42 | 32 | 44 | 217 |
43 | 28 | 69 | 197 |
44 | 25 | LTS | 69 |
45 | 50 | 114 | 285 |
46 | 28 | 38 | 176 |
47 | 21 | 67 | 125 |
48 | 28 | 27 | 192 |
49 | 29 | LTS | 159 |
50 | 18 | 27 | 107 |
LTS = no detectable |
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de plasma y de suero de donantes
humanos normales se analizaron mediante ELISa de dos sitios con MAb
3.5F8 como anticuerpo de captura y PAb A4.6.1 como anticuerpo de
detección y el ensayo de sitio m múltiple según la invención
utilizando el PAb y MAbs y procedimientos anotados en los
Procedimientos. Los resultados, resumidos en las Figuras 11A y 11B
para plasma y suero, respectivamente, indican que el ensayo de sitio
múltiple según la invención detecta más VEGF en ambos tipos de
muestras que el ensayo de dos sitios.
Algunas muestras de donantes humanos normales y
de donantes con enfermedad cardiaca que se apuntaron a las pruebas
clínicas patrocinadas por Genentech, Inc., para evaluar la eficacia
de TNK, una variante t-PA, se analizaron mediante el
ELISA de Sitio Único con MAb 3.5F8 como agente de recubrimiento y de
detección, con el ELISA de dos sitios con MAb 3.5F8 como anticuerpo
de captura y MAb A4.6.1 como anticuerpo de detección y mediante el
ensayo de sitio múltiple según la invención utilizando el PAb y los
MAbs y los procedimientos indicados en los Procedimientos. La Figura
12 muestra las cantidades de VEGF en plasma en pacientes cardíacos
utilizando los tres tipos de ensayo, y la Figura 13 y la Tabla 13
resumen las cantidades de VEGF en pacientes normales y cardíacos
utilizando los ensayos de dos sitios y de sitio múltiple, la
cantidad media de VEGF, la desviación estándar, el % de CV y s.e.m.
Los resultados indican que el ensayo de sitio múltiple según la
invención detecta más VEGF en ambos tipos de muestras que el ensayo
de dos sitios.
Donantes Normales | Pacientes Cardíacos | |||
Dos Sitios | Sitio Múltiple | Dos Sitios | Sitio Múltiple | |
pg/ml medio | 32.61 | 192.40 | 37.54 | 279.23 |
Desv. Std | 13.05 | 67.66 | 23.89 | 156.69 |
% CV | 40.02 | 35.17 | 63.65 | 56.11 |
s.e.m. (error medio estándar) | 1.84 | 9.56 | 5.34 | 35 |
Muestras del suero de pacientes con carcinoma de
pulmón de células no pequeñas se analizaron mediante ELISA de dos
sitios con MAb 3.5F8 como anticuerpo de captura y MAb A4.6.1 como
anticuerpo de detección y mediante el ensayo de sitio múltiple según
la invención utilizando el PAb y los MAbs y los procedimientos
indicados en los Procedimientos. Los resultados, mostrados en la
Figura 14, indican que el ensayo de sitio múltiple según la
invención detecta más VEGF en pacientes con cáncer de pulmón que el
ensayo de dos sitios.
Los niveles de VEGF en suero en humanos normales
y en pacientes con NIDDM (diabetes Tipo I) y IDDM (Diabetes Tipo
II) se midieron utilizando ELISA de dos sitios (MAb 3.5F8 como
agente de recubrimiento y MAb A4.6.1 como agente de detección)
descrito más arriba. La Figura 15 muestra que los niveles de VEGF en
suero en pacientes NIDDM y en pacientes IDDM era mayor que en
pacientes normales utilizando este ensayo. Dado que el ensayo de
sitio múltiple detecta más VEGF que el ensayo de dos sitios en otros
pacientes enfermos, se esperaría que el ensayo
de sitio múltiple según la invención sería adecuado para detectar niveles elevados de VEGF en pacientes diabéticos.
de sitio múltiple según la invención sería adecuado para detectar niveles elevados de VEGF en pacientes diabéticos.
Se llevó a cabo un ELISA de dos sitios y un ELISA
de sitio múltiple tal y como se ha descrito más arriba, para
muestras de plasma humano normal. Adicionalmente, se llevó a cabo un
ELISA de sitio múltiple utilizando PAb para la ADNasa en vez de PAb
para VEGF como reactivo de recubrimiento. Todas estaban en la
concentración de 0,4 \mug/ml. La Figura 16 y la Tabla 14 muestra
que el VEGF detectado mediante un ensayo VEGF de sitio múltiple es
específico. Los resultados del ELISA utilizando PAb para la ADNasa
más MAb 3.5F8 muestran resultados casi idénticos que el ELISA
utilizando MAb 3.5F8 sólo como reactivo de captura, con una
pendiente de 1.04 (fig. 16A).
Plasma EDTA Humano | MAb 3.5F8 (0.4 \mug/ml) | PAb para VEGF (0.4 \mug/ml) | PAb para ADNasa (0.4 \mug/ml) |
y MAb 3.5F8 (0.4 \mug/ml) | y MAb 3.5F8 (0.4 \mug/ml) | ||
Elevada Matriz (pg/ml) | 147.9 | 147.4 | 119.2 |
Baja Matriz (pg/ml) | 12.8 | 18.3 | 12.5 |
Siete Donantes de | 61.1 | 164.0 | 59.5 |
Plasma Humanos | 33.8 | 120.4 | 48.5 |
Normales (pg/ml): | 34.6 | 174.3 | 64.5 |
47.4 | 104.5 | 102.1 | |
28.3 | 70.4 | 79.6 | |
67.6 | 113.0 | 71.8 | |
61.1 | 105.9 | 65.4 |
Se conoce poco acerca de los niveles de las
formas circulantes de VEGF en individuos normales durante el
crecimiento, el embarazo, la edad anciana o en estados de enfermedad
patofisiológica. En la presente invención se describe el desarrollo
y caracterización de un ensayo de alto rendimiento sensible, capaz
de medir diversas isoformas de VEGF y sus niveles en plasma humano.
Este ensayo representa una importante herramienta para medir
niveles de VEGF tanto en individuos normales como en diversos
estados de enfermedad.
El ELISA para VEGF de sitio múltiple según la
invención puede medir las variantes 165/165, 165/110, 121/121 y
110/110 igualmente bien. Con este ensayo, se detectó una cantidad
mayor de VEGF en plasma en donantes normales (192 \pm 68 pg/ml,
n=50). Para los mismos 18 pacientes cardiovasculares, se detectó una
cantidad significativamente mayor de VEGF en plasma en comparación
con los donantes normales (279 \pm 157 pg/ml, n= 18, p <
0,001). Véase la Fig. 13. De hecho, el anticuerpo monoclonal MAb
3.5F8 más el anticuerpo policlonal purificado por afinidad contra
una proteína irrelevante no generó ninguna señal adicional por
encima de la de MAb 3.5F8 solo. Se concluye que aparte de VEGF
intacto, en la circulación tanto de donantes normales como de
pacientes cardiovasculares, se encuentran presentes otras variantes
e isoformas de VEGF. La capacidad de demostrar que el dominio de
unión a receptor de VEGF es accesible para la unión puede ser una
característica importante para cualquier ensayo que pretenda
comprender la actividad biológica de VEGF en la circulación.
El substrato fluorométrico,
strep-\beta-gal/MUG se prefiere
para su utilización en el sistema de detección, de manera que el
ELISA pueda detectar niveles de VEGF endógeno en individuos
normales. La utilización de este substrato y la determinación del
mejor diluyente ELISA dio como resultado una absorbancia de fondo
mucho menor, que se prefería para conseguir el aumento en la
sensibilidad de ensayo.
EL ensayo ELISA de sitio múltiple descrito en la
invención es altamente específico debido a la elección de los
anticuerpos utilizados para la captura y la detección. Uno de los
anticuerpos de recubrimiento, MAb 3.5F8, se une cerca de la región
de unión a heparina de VEGF (residuos 111-165) y el
otro anticuerpo de recubrimiento, el anticuerpo policlonal de
conejo, une VEGF. El anticuerpo de detección, MAb A4.6.1 se une a
la región de unión KDR del receptor (residuos 1-110)
de la molécula, rindiendo un ELISA específico para VEGF.
La especificidad de este ensayo ELISA de sitio
múltiple será importante, dado que se comprende mejor la biología
del VEGF. Keyt et al., supra (p. 7788) han demostrado
que las diferentes variantes de VEGF examinadas en este estudio
tienen bioactividades variables in Vitro. El conocimiento de
especificidad de ensayo también será extremadamente importante para
la evaluación de datos clínicos y para comparar datos entre
laboratorios.
Algunas publicaciones (Kondo et al.,
supra (1994); Takano et al., supra (1996);
Rodríguez et al., supra) han observado que los niveles de
VEGF en suero se encontraban elevados en pacientes de cáncer.
Considerando que la angiogénesis es un fenómeno general en la
progresión de tumor sólido y que la expresión de VEGF, un factor de
angiogénesis de tumor se observa en un gran variedad de células
tumorales de orígenes diversos, la medida de los niveles de VEGF
circulante tiene potencial como marcador de diagnóstico no invasivo
para un amplio espectro de tumores sólidos.
En conclusión, se ha desarrollado un ELISA
sensible que mide la mayoría de las formas moleculares de VEGF. De
acuerdo con la presente invención, se generan anticuerpos en
animales contra el VEGF humano, siendo el anticuerpo específico
para la región C-terminal un anticuerpo monoclonal y
siendo el anticuerpo específico para el VEGF completo un anticuerpo
policlonal, preferentemente purificado por afinidad. Estos dos
anticuerpos se utilizan como anticuerpos de recubrimiento
(reactivos de captura inmovilizados) sobre un soporte sólido, por
ejemplo placas de microvaloración. El anticuerpo utilizado para la
detección puede ser anticuerpos policlonales o anticuerpos
monoclonales, siempre y cuando sean específicos para las regiones
KDR y FTL1 del dominio de unión del VEGF humano.
Los ensayos ELISAs precisos y sensibles como el
descrito en la presente invención se consideran importantes para
ayudar a comprender los niveles de VEGF en diferentes estados de
enfermedad. Una mejor comprensión de los niveles de VEGF y de las
isoformas dominantes presentes en individuos normales y en estados
de enfermedad patofisiológica aumentará el conocimiento del papel
de VEGF en la angiogénesis normal y patológica.
Aunque la invención se ha descrito en conexión
con realizaciones preferidas de la misma, se entiende que permite
modificaciones adicionales y se pretende que esta aplicación cubra
cualquier variación, uso o adaptación de la invención, siguiendo,
en general, los principios de la invención e incluyendo dichas
modificaciones de la presente invención siempre y cuando entren
dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la
que pertenece la invención y pudiéndose aplicar a las
características esenciales indicadas en la presente invención y tal
como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (26)
1. Procedimiento para detectar el factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF) en una muestra biológica, que
comprende las siguientes etapas:
(a) poner en contacto e incubar la muestra
biológica con reactivos de captura premezclados inmovilizados en un
soporte sólido, caracterizado por el hecho de que los
reactivos de captura son anticuerpos policlonal y monoclonal contra
VEGF humano, y uniéndose dicho anticuerpo monoclonal específicamente
al extremo C-terminal (residuos
111-165) del VEGF humano;
(b) separar la muestra biológica de los reactivos
de captura inmovilizados;
(c) poner en contacto los reactivos de captura
inmovilizados con un anticuerpo detectable que se une a los dominios
de unión KDR y FLT1 del receptor de VEGF; y
(d) medir el nivel de VEGF unido a los reactivos
de captura utilizando un medio de detección del anticuerpo
detectable.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que la muestra biológica se
aísla a partir de un sujeto humano.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado por el hecho de que el sujeto humano es un
paciente con enfermedad vascular, diabético o con cáncer y que la
etapa de medida (c) comprende además una comparación con una curva
estándar para determinar el nivel de VEGF comparado con un individuo
normal.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que la muestra biológica es
plasma, suero u orina.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura se
inmovilizan en una fracción en peso de aproximadamente 0,8:1 a 1,2:1
de anticuerpo monoclonal respecto al policlonal.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado por el hecho de que la fracción en peso es
aproximadamente 1:1 de anticuerpo monoclonal respecto al
policlonal.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que la cantidad de anticuerpos
monoclonales inmovilizados es aproximadamente 0,4 \mug/ml y la
cantidad de anticuerpos policlonales inmovilizados es
aproximadamente 0,4 \mug/ml.
8. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura
inmovilizados se recubren sobre una placa de microvaloración.
9. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable se
detecta directamente.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable se
amplifica mediante un reactivo fluorimétrico.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable
está biotinilado y que el medio de detección es avidina o
estreptavindin-\beta-galactosidasa
y
4-metilumbeliferil-\beta-galactosidasa.
12. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el anticuerpo monoclonal
inmovilizado es murino y el anticuerpo policlonal inmovilizado es de
rata o cabra.
13. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el anticuerpo policlonal
inmovilizado se ha purificado por afinidad.
14. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable es
un anticuerpo monoclonal.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable es
un anticuerpo monoclonal murino.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado por el hecho de que el anticuerpo monoclonal
inmovilizado es MAb 3,5F8 y que el anticuerpo detectable es MAb
A4.6.1.
17. kit de inmunoensayo para detectar el factor
de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en una muestra biológica,
comprendiendo dicho kit:
(a) reactivos de captura, anticuerpos policlonal
y monoclonal contra VEGF humano premezclados en una relación en peso
de aproximadamente 0,8:1 a 1,2:1 de anticuerpo monoclonal respecto
al anticuerpo policlonal, uniéndose específicamente el anticuerpo
monoclonal al extremo C-terminal (residuos
111-165) del VEGF humano; y
(b) un reactivo de detección, un anticuerpo
detectable que se une a los dominios de unión KDR y FLT1 del
receptor de VEGF.
18. Kit según la reivindicación 17, que comprende
además un soporte sólido para los reactivos de captura.
19. Kit según la reivindicación 18,
caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura se
inmovilizan sobre el soporte sólido.
20. Kit según la reivindicación 19,
caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura se
recubren sobre una placa de microvaloración.
21. Kit según la reivindicación 17, que comprende
además un medio de detección de los anticuerpos detectables.
22. Kit según la reivindicación 21,
caracterizado por el hecho de que el medio de detección es
fluorimétrico.
23. Kit según la reivindicación 17, que comprende
además VEGF purificado como antígeno estandar.
24. Kit según la reivindicación 17,
caracterizado por el hecho de que la relación en peso del
anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal es
aproximadamente 1:1, el anticuerpo monoclonal es murino, el
anticuerpo policlonal se ha purificado por afinidad y la cantidad de
anticuerpos monoclonales es de 0,4 \mug/ml y la cantidad de
anticuerpos policlonales es de 0,4 \mug/ml.
25. Kit según la reivindicación 24,
caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura
están inmovilizados y el anticuerpo policlonal es un anticuerpo de
conejo o de cabra.
26. Kit según la reivindicación 25,
caracterizado por el hecho de que al anticuerpo detectable es
un anticuerpo monoclonal murino MAb A4.6.1 y el reactivo de captura
es en anticuerpo monoclonal MAb 3.5F8.
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