KR102653141B1 - 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법 - Google Patents

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질리안 엠. 프렌더개스트
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Abstract

글리칸-상호작용 항체를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법이 제공된다. 바람직한 생체 활성, 생물학적 이용 가능성, 및 독성 수준을 달성하는데 적합한 항-시알릴 Tn 항원 항체와 관련 조성물 및 제제가 포함된다.

Description

글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법이라는 제목으로 2017년 3월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/466,766, 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법이라는 제목으로 2017년 3월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 62/480,126, 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법이라는 제목으로 2017년 4월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 62/486,826, 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법이라는 제목으로 2017년 9월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/563,718, 및 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법이라는 제목으로 2017년 10월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/577,830에 대한 우선권을 주장하며, 이것들의 내용은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
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비정상적인 글리코실화는 암종에서 흔히 관찰되는 다른 돌연변이들 중 일부를 동반한다. 모든 암종의 약 80%에서 절단된 글리칸인 Tn 항원 및 시알릴화된 형태인 시알릴 Tn (STn)이 발현되는 것으로 추정되었다. 일부을 제외하면, Tn 및 STn은 정상적인 건강한 조직에서는 발현되지 않는다. 게다가, 비-인간 면역원성 시알산인 N-글리콜릴뉴라민산 (Neu5Gc)은 유방암과 같은 암종에서 Neu5Gc-STn (GcSTn)의 형태로 달리 발현되는 것으로 보인다.
다수의 비정상적인 글리코실화 형태가 인간 암에서 기술되었으며, 특정 종양 표적화에 적합한 세포 표면 분자의 한 분류로서 특정 글리칸을 확인한다 (Cheever, M.A. et al., Clin Cancer Res. 2009 Sep 1;15(17):5323-37). 예를 들어, 다양한 인간 암의 유형 (예컨대 그 중에서도 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 폐암, 및 난소암)은 정상적인 인간 조직에서는 보기 힘든 STn 항원의 높은 발현을 나타낸다 (Karlen, P. et al., Gastroenterology. 1998 Dec;11 5(6):1395-404; Ohno, S. et al, Anticancer Res. 2006 Nov-Dec;26(6A):4047-53). 이에 더하여, 종양-관련 뮤신 상에서 STn의 존재는 불량한 예후를 가진 암과 관련이 있고 이와 함께 암 검출 및 표적화된 요법에 대해 매력적인 에피토프로 간주된다 (Cao, Y. et al., Virchows Arch. 1997 Sep;431(3):159-66; Julien, S. et al., Br J Cancer. 2009 Jun 2;100(11):1746-54; Itzkowitz, S.H. et al., Cancer. 1990 Nov 1;66(9):1960-6; Motoo, Y. et al., Oncology. 1991;48(4):321-6; Kobayashi, H. et al., J Clin Oncol. 1992 Jan;10(1):95-101). Tn 및 STn 형성은 활성화 T-신타아제의 형성에 필요한 분자 샤페론을 암호화하는 유전자 Cosmc 내에서의 체세포 돌연변이와 연관성이 있다 (Ju, T. et al., Nature. 2005 Oct 27;437(7063):1252; Ju, T. et al., Cancer Res. 2008 Mar 15;68(6):1636-46). 그것은 또한 시알릴 트랜스퍼라아제, ST6GalNAc I의 발현을 증가시킬 수 있다 (Ikehara, Y. et al., Glycobiology. 1999 Nov;9(11):1213-24; Brockhausen, I. et al., Biol Chem. 2001 Feb;382(2):219-32). STn의 데-노보(De-novo) 발현은 암종 세포를 조절하고, 악성 표현형을 변화시키고, 더욱 공격적인 세포 행동을 유도할 수 있다 (Pinho, S. et al., Cancer Lett. 2007 May 8;249(2):157-70). STn은 악성 조직에서 고도로 발현되지만, 건강한 인간 세포에서도 낮은 수준으로 발견된다 (Jass, J.R. et al., J Pathol. 1995 Jun;176(2):143-9; Kirkeby, S. et al., Arch Oral Biol. 2010 Nov;55(11):830-41). STn은 단독으로 암 검출 및 요법에 대한 표적으로서 주의를 끌고 있다 (Cheever, M.A. et al., Clin Cancer Res. 2009 Sep 1;15(17):5323-37). STn은 또한 암 줄기 세포와 관련이 있는 뮤신에도 존재하고 (Engelmann et al., Cancer research, 2008, 68, 2419-2426) STn은 면역 억제와 관련이 있다 (Carrascal, M.A., et al., Molecular Oncology. 2014. 8(3): 753-65).
STn의 존재에 더하여, 다른 글리코실화 변화가 암에서 설명되었다. 그것들 중 한 가지는 Neu5Gc를 수반한다. N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac) 및 Neu5Gc는 포유류 세포 표면상의 두 가지 주요 시알산이다. Neu5Ac 및 Neu5Gc는 단지 Neu5Gc가 탄소 5에 부착된 화학 기와 관련된 추가의 산소 원자를 포함한다는 점에서만 상이하다. 기능적 유전자의 손실로 인해, 인간은 Neu5Gc가 아니라 Neu5Ac의 형태로만 시알산을 합성할 수 있다. 하지만, Neu5Gc는 붉은 고기와 같은 동물-유래 식이 공급원으로부터 대사 작용에 의해 인간에게 혼입될 수 있다 (Tangvoranuntakul, P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Oct 14; 100(21):12045-50; Nguyen, D.H. et al., J Immunol. 2005 Jul 1; 175(1):228-36; US7,682,794, US8,084,219, US2012/0142903, WO2010030666 및 WO2010030666). Neu5Gc는 인간 종양 사이에서는 상당히 풍부하고 (Higashi, H. et al., Cancer Res. 1985 Aug; 45(8):3796-802; Miyoshi I. et al., Mol Immunol. 1986. 23: 631-638; Hirabayashi, Y. et al., Jpn J Cancer Res. 1987. 78: 614-620; Kawachi. S, et al., Int Arch Allergy Appl Immunol. 1988. 85: 381-383; Devine, P.L. et al., Cancer Res. 1991. 51: 5826-5836; Malykh, Y.N. et al, Biochimie. 2001. 83: 623-634 및 Inoue, S. et al., 2010. Glycobiology. 20(6): 752-762) 정상적인 인간 조직에서는 현저히 작은데, 이것은 수십 년간 간과되어 왔다 (Diaz, S.L. et al., PLoS One. 2009. 4: e4241; Tangvoranuntakul, P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003. 100: 12045-12050; Varki, A. et al., Glycoconj J. 2009. 26: 231-245). 건강한 인간 조직과 비교하여 암 조직에서 식이-유래된 Neu5Gc의 대사 축적의 증가는 적어도 세 가지 요인으로 설명될 수 있다: 경쟁하는 내인성 Neu5Ac의 과소 생산으로 인한 빠른 성장, 성장 인자에 의해 유도된 거대음세포작용(macropinocytosis)의 향상 (Dharmawardhane, S. et al., Mol Biol Cell. 2000 Oct;11(10):3341-52; Simonsen, A. et al., Curr Opin Cell Biol. 2001 Aug;13(4):485-92; Johannes, L. et al., Traffic. 2002 Jul;3(7):443-51; Amyere, M. et al., Int J Med Microbiol. 2002 Feb;291(6-7):487-94), 및 저산소증(hypoxia)에 의한 리소좀 시알산 수송체 유전자 시알린의 유전자 발현의 상향 조절 (Yin, J. et al., Cancer Res. 2006 Mar 15;66(6):2937-45). 이에 더하여, 지금까지 테스트된 모든 인간은 비-인간 Neu5Gc에 대한 다클론성 항체 레저버(reservoir)를 포함하며, 이것은 이종-자가항원의 첫 번째 예이다 (Padler-Karavani, V. et al., Glycobiology. 2008 Oct;18(10):818-30; Varki, N.M. et al., Annu Rev Pathol. 2011;6:365-93). 항-Neu5Gc 반응에 직면하여 악성 종양에서 식이 Neu5Gc의 축적은 저등급 만성 염증을 유도함으로써 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다 (Hedlund, M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 2;105(48):18936-41). 따라서, 인간 종양 상의 Neu5Gc 함유 글리칸 에피토프는 약물 표적화에 대한 귀중한 가능성을 나타낸다. 최근 연구는 암 환자에서 Neu5Ac-STn (AcSTn)이 아니라 Neu5Gc-함유 STn (GcSTn)에 대한 항체의 존재를 시사하고 세포 검출에 특이적인 바이오마커로서의 가능성을 탐사한다 (Padler-Karavani, V. et al., Cancer Res. 2011 May 1;71(9):3352-63).
해당 분야에는, 질환 및 병든 세포와 조직에 관한 글리칸을 포함한, 글리칸에 결합할 수 있는 치료 항체가 여전히 필요하다. 또한, 이러한 항체를 개발하기 위해 더 나은 방법 및 병든 세포 및 조직을 표적화하기 위해 이들 항체를 사용하는 방법이 여전히 필요하다. 본 발명은 관련된 화합물과 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.
일부 구체예에서, 본 발명은 항체를 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 항체는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로 투여되고, 항체는 약 50시간 내지 약 200시간의 말단 반감기를 갖고, 항체는 시알릴 Tn 항원 (STn)에 결합한다. 항체는 서열 번호: 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 도메인 (VH); 및 서열 번호: 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함할 수도 있다. 항체는 항체-약물 컨쥬게이트일 수도 있다. 항체는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)와 컨쥬게이션될 수도 있다. 항체는 정맥 내로 투여될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 결장직장암에 걸린 대상체에게 항-STn 항체를 투여하여 결장직장암을 치료하는 방법을 제공하는데, 항-STn 항체는 서열 번호: 7, 9, 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 도메인 (VH); 및 서열 번호: 8, 10, 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 결장직장암은 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시쥬맙, 라무시루맙, 트라스투쥬맙, 포나티닙, 소라페닙, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 도세탁셀, 젬시타빈, 이리노테칸, 파클리탁셀, 및 옥살리플라틴 중 적어도 하나로의 치료에 대하여 저항성일 수도 있다. 항-STn 항체는 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)를 포함할 수도 있다. ADC는 적어도 하나의 컨쥬게이트를 포함할 수도 있으며, 적어도 하나의 컨쥬게이트는 아우리스타틴, 메이탄신, 튜불리신, 빈카 알칼로이드, 피롤로벤조디아제핀 다이머, 캄프토테신, 듀오카르마이신, 아마니틴, 포스포이노시티드 3-키나아제 (PI3K) 억제자, 및 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 키나아제 (MEK) 억제자 중 하나 이상으로부터 선택된다. ADC는 하나 이상의 폴리머를 포함할 수도 있는데, 하나 이상의 폴리머는 \항-STn 항체와 적어도 하나의 컨쥬게이트를 연결한다. 하나 이상의 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드) (폴리HPMA), 폴리(α-아미노산), 탄수화물 폴리머, 당다당류, 당지질, 당컨쥬게이트, 폴리글리세롤, 폴리비닐 알콜, 폴리(아크릴산), 폴리케탈, 및 폴리아세탈 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 하나 이상의 폴리머는 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말) (PHF)을 포함할 수도 있다. 항-STn 항체는 약 0.1 nM 내지 약 50 nM의 반 최대 억제 농도로 STn을 발현하는 세포를 살해할 수 있다.
항-STn 항체를 투여하는 것은 적어도 하나의 다른 치료적 처리와 조합하여 수행될 수도 있다. 다른 치료적 처리는 표준 관리 치료적 처리를 포함할 수도 있다. 다른 치료적 처리는 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시쥬맙, 라무시루맙, 트라스투쥬맙, 포나티닙, 소라페닙, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 도세탁셀, 젬시타빈, 이리노테칸, 파클리탁셀, 및 옥살리플라틴 중 하나 이상으로부터 선택될 수도 있다. 치료적 처리는 또한 적어도 하나의 세포 주기 억제자의 투여를 포함할 수도 있다. 세포 주기 억제자는 사이클린-의존적 키나아제 (CDK) 억제자일 수도 있다. CDK 억제자는 CDK4 및/또는 CDK6을 억제할 수도 있다. CDK 억제자는 팔보시클립, 리보시클립, 및 아베마시클립으로부터 선택될 수도 있다. 항-STn 항체는 다른 치료적 처리와 동시에 처리될 수도 있다. 항-STn 항체는 다른 치료적 처리와 함께 순차적으로 처리될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 방법은 암에 걸린 대상체에게 항-STn 항체를 투여하는 단계를 포함하며, 항-STn 항체는 서열 번호: 7, 9, 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 도메인 (VH); 및 서열 번호: 8, 10, 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 항-STn 항체를 투여하는 것은 적어도 하나의 세포 주기 억제자와 조합하여 수행된다. 세포 주기 억제자는 사이클린-의존적 키나아제 (CDK) 억제자일 수도 있다. CDK 억제자는 CDK4 및/또는 CDK6을 억제할 수도 있다. CDK 억제자는 팔보시클립, 리보시클립, 및 아베마시클립으로부터 선택될 수도 있다. 항-STn 항체는 세포 주기 억제자와 동시에 투여될 수도 있다. 항-STn 항체는 세포 주기 억제자와 함께 순차적으로 투여될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 7, 9, 및 11로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 VH; 서열 번호: 8, 10, 및 12로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 VL을 가진 항-STn 항체; 및 하나 이상의 세포독성제를 포함하는 ADC를 제공한다. 세포독성제는 아우리스타틴, 메이탄신, 튜불리신, 빈카 알칼로이드, 피롤로벤조디아제핀 다이머, 캄프토테신, 듀오카르마이신, 아마니틴, PI3K 억제자, 및 MEK 억제자 중 적어도 하나로부터 선택될 수도 있다. 항-STn 항체는 링커를 통해 하나 이상의 세포독성제에 컨쥬게이션될 수도 있다. ADC는 항-STn 항체 및 하나 이상의 세포독성제를 연결시키는 하나 이상의 폴리머를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 폴리머는 PEG, 폴리HPMA, 폴리(α-아미노산), 탄수화물 폴리머, 당다당류, 당지질, 당컨쥬게이트, 폴리글리세롤, 폴리비닐 알콜, 폴리(아크릴산), 폴리케탈, 및 폴리아세탈 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 하나 이상의 폴리머는 PHF를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 폴리머는 링커를 통해 항-STn 항체에 부착될 수도 있다. 하나 이상의 세포독성제는 링커를 통해 하나 이상의 폴리머에 부착될 수도 있다. 링커는 분열 가능한 링커일 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 STn을 발현하는 적어도 하나의 암 세포를 가진 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 방법은 본원에서 기술된 항-STn 항체 약물 컨쥬게이트를 투여하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 암 세포는 난소암 세포일 수도 있다. 적어도 하나의 암 세포는 적어도 하나의 화학치료제로의 치료에 저항성일 수도 있다. 화학치료제는 시스플라틴일 수도 있다. 항-STn 항체 약물 컨쥬게이트는 약 0.1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg의 용량으로 투여될 수도 있다. 투여는 정맥내 주사에 의해 이루어질 수도 있다. 항-STn 항체 약물 컨쥬게이트는 매일, 매주, 또는 매월 투여될 수도 있다.
본 발명의 일부 방법은 대상체에게 ADC를 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 포함하는데, ADC는 서열 번호: 7을 포함하는 VH; 서열 번호: 8을 포함하는 VL; 적어도 하나의 인간 IgG 불변 영역; 및 세포독성 컨쥬게이트를 포함하며, 세포독성 컨쥬게이트는 링커를 통해 적어도 하나의 인간 IgG 불변 영역에 컨쥬게이션된다. 적어도 하나의 인간 IgG 불변 영역은 서열 번호: 15 및 16 중 하나 이상으로부터 선택될 수도 있다. 세포독성 컨쥬게이트는 MMAE를 포함할 수도 있다. ADC는 약 1 mg/kg 내지 약 6 mg/kg의 용량으로 투여될 수도 있다. ADC는 정맥내 볼루스(bolus) 주사에 의해 투여될 수도 있다. ADC는 조성물의 일부로서 투여될 수도 있으며, 조성물은 적어도 하나의 부형제를 포함한다. 조성물은 약 0.1 ml/kg 내지 약 10 ml/kg의 부피로 투여될 수도 있다. 조성물은 약 1.2 ml/kg의 부피로 투여될 수도 있다. 조성물은 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 ADC 농도를 포함할 수도 있다. ADC는 약 2일 내지 약 8일의 적절한 말단 제거 반감기를 나타낼 수도 있다. ADC는 약 10 ml/kg/일 내지 약 20 ml/kg/일의 적절한 클리어런스 율을 나타낼 수도 있다. ADC는 정지 상태(steady state)에서 약 50 ml/kg 내지 약 100 ml/kg의 적절한 분포 용적을 나타낼 수도 있다. ADC는 약 10 μg/ml 내지 약 200 μg/ml의 최대 관찰 농도를 나타낼 수도 있다. ADC는 투여 시작부터 약 50일*μg/ml 내지 약 500일*μg/ml의 마지막 관찰된 정량화 가능한 농도까지의 농도 대 시간 곡선 (AUC) 아래 면적을 나타낼 수도 있다.
상기 및 기타 목적, 특징 및 이점은 유사 참조 부호가 상이한 도면 전반에 걸쳐 동일한 부분을 지칭하는 첨부된 도면에서 예시된 바와 같이 본 발명의 특정 구체예의 다음 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다. 도면이 반드시 크기 조정되어야 하는 것은 아니며; 대신에 본 발명의 다양한 구체예의 원리를 예시하는데 중점을 둔다.
도 1A는 1군 항체에 의해 인식되는 STn의 특정 영역을 나타내는 가장 큰 타원을 갖는 α2,6-시알릴화된 N-아세틸갈락토사민 (STn)을 도시하는 개략도이다.
도 1B는 2군 항체에 의해 인식되는 STn의 특정 영역을 나타내는 가장 큰 타원을 갖는 α2,6-시알릴화된 N-아세틸갈락토사민 (STn)을 도시하는 개략도이다.
도 1C는 3군 항체에 의해 인식되는 STn의 특정 영역을 나타내는 가장 큰 타원을 갖는 α2,6-시알릴화된 N-아세틸갈락토사민 (STn)을 도시하는 개략도이다.
도 1D는 4군 항체에 의해 인식되는 STn의 특정 영역을 나타내는 가장 큰 타원을 갖는 α2,6-시알릴화된 N-아세틸갈락토사민 (STn)을 도시하는 개략도이다.
도 2는 게먹이 원숭이(Cynomolgus monkey)에서 hSIA101-MMAE의 초기 용량 이후 시간의 흐름에 따른 평균 혈청 항체 농도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 게먹이 원숭이에서 hSIA101-MMAE의 제2 용량 (치료 제22 일) 이후 시간의 흐름에 따른 평균 혈청 항체 농도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 다른 처리와 비교하여 hSIA101-ADC의 처리 과정 동안에 환자-유래된 이종 이식(xenograft) 종양의 부피를 나타내는 일련의 그래프이다. 상부 패널의 종양은 케모-나이브(chemo-naive) 환자의 난소 종양으로 시작되었고 하부 패널의 종양은 이전에 화학치료제로 처리된 환자의 난소 종양으로 시작되었다.
본 발명에 따르면 본원에서 글리칸으로 불리는 탄수화물 기를 포함한 에피토프에 특이적이거나 또는 이것과 상호작용하는 항체가 존재한다. 본원에서 기술된 일부 글리칸-상호작용 항체는 생물치료제로도 사용될 수 있다. 다른 구체예는 이러한 글리칸-상호작용 항체를 생성하는 방법을 제공한다.
자연에서, STn은 N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac) 또는 N-글리콜릴뉴라민산 (Neu5Gc)으로 시알릴화될 수도 있다. 본 발명에 따르는 글리칸-상호작용 항체는 임의의 STn을 가진 글리칸 (팬(pan)-STn 항체), 특이적으로 Neu5Ac를 포함하는 STn (AcSTn)을 갖는 글리칸 또는 특이적으로 Neu5Gc를 포함하는 STn (GcSTn)을 갖는 글리칸에 관한 것일 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 암-관련 글리칸 항원, 예컨대 α2,6-시알릴화된 N-아세틸갈락토사민 (STn)을 표적으로 한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 글리칸-상호작용 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 STn (예를 들어, AcSTn 및/또는 GcSTn)을 포함한 하나 이상의 항원에 대한 면역 반응을 생산하기 위한 마우스의 사용을 포함한다. 본원에서 기술된 바와 같이, 마우스 면역화를 통해 생산된 결과의 항체를 다루기 위해서 많은 방법이 이용될 수도 있다. 이러한 방법은 면역화되는 마우스의 계통 및/또는 성별을 변화시키는 단계, 사용된 항원을 변화시키는 단계, 하이브리도마(hybridoma) 융합의 시작 전 항원 투여 및 면역화의 시간 경과에 포함되는 보조제의 유형 및 용량을 변화시키는 단계를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 글리칸-상호작용 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)의 사용을 포함할 수도 있다. ADC는 글리칸-상호작용 항체에 직접 또는 링커를 통해 부착된 세포독성 컨쥬게이트를 포함할 수도 있다. 글리칸-상호작용 항체는 STn에 결합할 수도 있다. 일부 구체예에서, 암을 치료하는 방법은 암 줄기 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 글리칸-상호작용 항체는 단독으로 사용될 수도 있다. 다른 양태에서, 글리칸-상호작용 항체는 화학치료제와 조합하여 사용된다. 글리칸-상호작용 항체는 대상체로의 투여를 위해 하나 이상의 부형제를 포함하는 조성물로서 제조될 수도 있다. 조성물 및 투여 경로는 생물학적 이용 가능성, 치료 창(therapeutic window), 및/또는 효과적인 처리에 필요한 분포 용적을 달성하는데 적합한 농도 및 용량으로 글리칸-상호작용 항체를 제공할 수도 있다.
본원에서 개시된 글리칸-상호작용 항체의 최적화되고, 인간화되고 컨쥬게이션된 형태가 더 제공된다. 추가적으로, 항체 및/또는 본 발명의 방법을 포함한 키트, 분석 및 시약이 제공된다.
정의
인접한: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인접한"은 주어진 실체물에 접해 있거나, 이웃하거나 또는 옆에 있는 것을 말한다. 일부 구체예에서, "인접한 잔기"는 서로 연결된 글리칸 사슬 내의 당 잔기이다. 일부 구체예에서, "인접한 글리칸"은 직접 접촉하여 옆에 있거나 또는 매우 근접하고 둘 사이에 또 다른 글리칸이 없는 글리칸 사슬이다.
조합하여 투여됨: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조합하여 투여된" 또는 "조합된 투여"는 대상체가 동시에 또는 대상체가 어떤 시점에 두 작용제에 동시에 노출되고 및/또는 환자에 대한 각각의 작용제의 효과가 중첩될 수 있는 시간 간격으로 투여된 둘 이상의 작용제에 동시에 노출된다는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 작용제의 적어도 1회의 용량이 하나 이상의 다른 작용제의 적어도 1회의 용량의 약 24시간, 12시간, 6시간, 3시간, 1시간, 30분, 15분, 10분, 5분, 또는 1분 내에 투여된다. 일부 구체예에서, 투여는 중첩 투약 양생법으로 일어난다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "투약 양생법"은 시간 간격을 둔 복수의 용량을 말한다. 이러한 용량은 주기적인 간격으로 일어날 수도 있거나 또는 투여시 하나 이상의 틈(hiatus)을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 글리칸-상호작용 항체의 개개의 용량의 투여는, 본원에서 기술된 바와 같이, 조합적 (예를 들어, 시너지) 효과가 달성되도록 충분히 가까이 배치된다.
아미노산: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산" 및 "아미노산들"은 모든 자연 발생 L-알파-아미노산, 뿐만 아니라 비-자연 발생 아미노산을 지칭한다. 아미노산은 다음과 같이 1문자 또는 3문자 명칭으로 확인된다: 아스파르트산 (Asp:D), 아이소류신 (Ile:I), 트레오닌 (Thr:T), 류신 (Leu:L), 세린 (Ser:S), 티로신 (Tyr:Y), 글루탐산 (Glu:E), 페닐알라닌 (Phe:F), 프롤린 (Pro:P), 히스티딘 (His:H), 글리신 (Gly:G), 리신 (Lys:K), 알라닌 (Ala:A), 아르기닌 (Arg:R), 시스테인 (Cys:C), 트립토판 (Trp:W), 발린 (Val:V), 글루타민 (Gln:Q), 메티오닌 (Met:M), 아스파라긴 (Asn:N) (아미노산은 먼저 괄호 안에 각각 3문자 및 1문자로 나열된다).
동물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 말한다. 일부 구체예에서, "동물"은 임의의 발달 단계의 인간을 말한다. 일부 구체예에서, "동물"은 임의의 발달 단계의 비-인간 동물을 말한다. 특정 구체예에서, 비-인간 동물은 포유류 (예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 또는 돼지)이다. 일부 구체예에서, 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및 충류를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 동물은 트랜스제닉(transgenic) 동물, 유전적으로 조작된 동물, 또는 클론이다.
항체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되며, 제한되는 것은 아니지만, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 적어도 두 개의 온전한 항체로부터 형성된 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편, 예컨대 디아바디를 포함하는 다양한 구체예를 구체적으로 커버한다. 항체는 주로 아미노산 기반 분자이지만, 또한 예컨대 당 모이어티로의 하나 이상의 변형을 포함할 수도 있다.
항체 단편: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 말한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 두 개의 동일한 항원-결합 단편을 생산하며, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 또한 잔류 "Fc" 단편이 생산되는데, 그 명칭은 쉽게 결정화할 수 있는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 두 개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 교차 연결할 수 있는 F(ab')2 단편을 수득할 수 있다. 글리칸-상호작용 항체는 이들 단편들 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 본원의 목적을 위해서, 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함할 수도 있다.
항원-결합 영역: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원-결합 영역"은 표적 분자 또는 에피토프에 직접적으로 상호작용하는 항체의 일부, 항체 단편, 또는 관련 분자를 말한다. 항원-결합 영역은 전형적으로 항체의 Fab 영역에서와 같이 또는 scFv에서 함께 연결된 바와 같이 가변 도메인 쌍을 포함한다.
대략: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대략" 또는 "약"은 관심있는 하나 이상의 값에 적용되는 경우 언급된 참조 값과 유사한 값을 말한다. 특정 구체예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않거나 또는 문맥상 명백하지 않는 한 (이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외하고) 언급된 참조 값의 어느 방향으로든 (초과 또는 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하 이내에 있는 값의 범위를 말한다.
"~와 회합된": 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "~와 회합된", "컨쥬게이션된", "연결된", "부착된", 및 "테더링된(tethered)"은 둘 이상의 모이어티에 관하여 사용될 때, 구조가 사용되는 조건, 예를 들어, 생리학적 조건 하에서, 모이어티가 물리적으로 회합된 채로 남아있도록 충분히 안정한 구조를 형성하기 위해 모이어티들이 직접적으로 또는 연결 작용제의 역할을 하는 하나 이상의 추가적인 모이어티를 통해 서로 물리적으로 회합되거나 연결된다는 것을 의미한다. "회합"은 엄중하게 직접적인 공유 화학적 결합을 통해 이루어질 필요는 없다. 또한 그것은 "회합된" 실체물이 물리적으로 회합된 채로 남아있도록 충분히 안정한 이온 또는 수소 결합 또는 혼성체화(hybridization) 기반 연결을 시사할 수도 있다.
이기능적 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이기능적"은 적어도 두 개의 기능을 할 수 있거나 또는 적어도 두 개의 기능을 유지하는 임의의 물질, 분자 또는 모이어티를 말한다. 기능은 동일한 결과 또는 상이한 결과에 영향을 줄 수도 있다. 기능을 생성하는 구조는 동일하거나 상이할 수도 있다.
생체 분자: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생체 분자"는 아미노산-기반, 핵산-기반, 탄수화물-기반 또는 지질-기반, 등인 임의의 천연 분자이다.
이중특이적 항체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중특이적 항체"는 두 개의 상이한 항원에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 이러한 항체는 전형적으로 Riethmuller, G. 2012. Cancer Immunity. 12:12-18, Marvin, J.S. et al., 2005. Acta Pharmacologica Sinica. 26(6):649-58 및 Schaefer, W. et al., 2011. PNAS. 108(27):11187-92 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들 중 임의의 것을 포함할 수도 있다.
분지(branch): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분지"는 주요 실체물 또는 공급원에 연결되거나 이것들로부터 확장된 실체물, 모이어티 또는 부속물을 말한다. 일부 구체예에서, "분지 사슬" 또는 "분지형 사슬"은 모체 사슬로부터 확장된 하나 이상의 잔기 (제한되는 것은 아니지만, 당 잔기 포함)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "모체 사슬"은 분지형 사슬이 연결된 잔기 (제한되는 것은 아니지만, 당 잔기 포함)의 사슬을 지칭하는데 사용된다. 다수의 분지를 가진 글리칸의 경우에, 모체 사슬은 모든 이러한 분지가 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 공급원 사슬을 지칭할 수도 있다. 헥소오스 잔기의 사슬을 가진 다당류의 경우에, 모체 사슬 연결은 전형적으로 인접한 잔기의 탄소 1 내지 4 사이에서 발생하는 한편 분지형 사슬은 분지형 잔기의 탄소 1과 분지가 연장되는 모체 잔기의 탄소 3 사이의 연결을 통해 모체 사슬에 부착된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분지형 잔기"는 분지형 사슬로 모체 사슬에 부착된 잔기를 말한다.
암 줄기 세포 : 본원에서 사용된 바와 같이, 암 줄기 세포 (CSC)는 자가-재생의 능력을 가진 종양 세포의 부분 집합을 말한다. CSC는 다양한 세포 유형을 재생시키는 것이 가능할 수도 있다. 어떤 경우에는, 이들 세포는 종양의 수술 또는 화학적 처리를 통해 제거하는 것이 어렵거나 불가능하다.
화합물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "화합물"은 뚜렷한 화학적 실체물을 말한다. 일부 구체예에서, 특정 화합물은 하나 이상의 이성질체 또는 동위원소 (제한되는 것은 아니지만, 입체이성질체, 기하학적 이성질체 및 동위원소 포함)의 형태로 존재할 수도 있다. 일부 구체예에서, 화합물은 이러한 단일 형태로만 제공되거나 이용된다. 일부 구체예에서, 화합물은 둘 이상의 이러한 형태의 혼합물 (제한되는 것은 아니지만, 입체이성질체의 라세미 혼합물 포함)로서 제공되거나 이용된다. 당업자는 일부 화합물이 이러한 상이한 형태로 존재하고, 상이한 성질 및/또는 활성 (제한되는 것은 아니지만, 생물학적 활성 포함)을 나타낸다는 것을 인정한다. 이러한 경우에 본 발명에 따라 사용을 위해 특정 형태의 화합물을 선택하거나 피하는 것은 해당 분야의 기술 범위 내에 있다. 예를 들어, 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 함유하는 화합물은 광학적 활성 또는 라세미 형태로 단리될 수 있다. 예컨대 라세미 혼합물의 분해 또는 입체선택적 합성에 의해 광학적으로 활성인 시작 재료로부터 광학적 활성 형태를 제조하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다.
환형 또는 환화된 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "환형"은 계속되는 루프의 존재를 말한다. 환형 분자는 원형일 필요는 없으며, 단지 서브유닛의 파괴되지 않은 사슬을 형성하도록 결합된다.
시티딘 모노포스페이트 -N- 아세틸뉴라민산 하이드록실라아제: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라아제" 또는 "CMAH"는 N-아세틸뉴라민산으로부터 N-글리콜릴뉴라민산의 형성을 촉진시키는, 인간에는 없지만, 대부분의 다른 포유류 (제한되는 것은 아니지만, 마우스, 돼지 및 침팬지 포함)에 존재하는 효소를 말한다. 인간에서 효소의 부재는 프레임시프트(frameshift) 돌연변이로 인한 것이며 CMAH 전사물의 조기 종료 및 비-기능적 단백질의 생산을 유도한다.
세포독성: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포독성"은 세포 (예를 들어, 포유류 세포 (예를 들어, 인간 세포)), 박테리아, 바이러스, 균류, 원생동물, 기생충, 프리온(prion), 또는 이것들의 조합을 살해하거나 또는 이것들에 대하여 해로운, 독성의, 또는 치명적인 효과를 유발하는 작용제를 지칭하는데 사용된다.
전달: 본원에서 사용된 바와 같이, "전달"은 의도된 목적지로 화합물, 물질, 실체물, 모이어티, 카고(cargo) 또는 페이로드(payload)를 수송하는 행위 또는 방식을 말한다.
전달제: 본원에서 사용된 바와 같이, "전달제"는 화합물, 물질, 실체물, 모이어티, 카고 또는 페이로드의 생체 내(in vivo ) 전달을 적어도 부분적으로 촉진하는 임의의 물질을 말한다.
검출 가능한 라벨: 본원에서 사용된 바와 같이, "검출 가능한 라벨"은 또 다른 실체물과 부착되거나, 혼입되거나 또는 회합되는 하나 이상의 마커, 신호, 또는 모이어티를 말하며, 이 마커, 신호 또는 모이어티는 방사선 촬영, 형광 발광, 화학 발광, 효소 활성, 흡광도 등을 포함한, 해당 분야에 공지된 방법에 의해 쉽게 검출된다. 검출 가능한 라벨은 방사성 동위원소, 형광단, 발색단, 효소, 염료, 금속 이온, 리간드, 예컨대 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 및 합텐, 양자점(quantum dot), 등을 포함한다. 검출 가능한 라벨은 그것들이 부착되거나, 혼입되거나 또는 회합되는 실체물 내에서 어떠한 위치에도 위치할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질에 부착되거나, 혼입되거나 또는 회합될 때, 그것들은 아미노산, 펩타이드, 또는 단백질 내에 있거나, 또는 N- 또는 C-말단에 위치할 수도 있다.
디스플레이 라이브러리: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "디스플레이 라이브러리"는 과학적 발견에서 생체 분자의 상호작용을 확인하는데 사용되는 도구를 말한다. 박테리오파지, 효모 및 리보솜의 이용을 포함한 디스플레이 라이브러리의 상이한 변화가 존재한다. 각각의 경우에, 주어진 라이브러리 내의 단백질 (본원에서 "라이브러리 구성원"으로도 불림)은 단백질을 암호화하는 핵산에 연결된다 (물리적으로 또는 숙주와의 회합을 통해). 표적 분자가 디스플레이 라이브러리의 구성원과 함께 인큐베이션될 때, 표적에 결합하는 임의의 라이브러리 구성원은 단리될 수도 있고 결합된 단백질을 암호화하는 서열은 연결된 핵산의 분석을 통해 결정될 수도 있다. 일부 구체예에서, 디스플레이 라이브러리는 "파지 디스플레이 라이브러리"인데 디스플레이 라이브러리는 박테리오파지 바이러스 입자 (본원에서 "파지 입자"라고도 불림)로 구성되고 핵산은 파지 게놈으로 통합되어, 도입된 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 융합된 바이러스 코팅 단백질을 생산한다. 이러한 융합된 단백질은 주어진 표적과 상호작용할 수 있는 경우 조립된 파지 입자의 외부 표면 상에 "디스플레이"된다.
원위 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "원위"는 중심으로부터 떨어져 있거나 또는 관심있는 지점 또는 영역으로부터 떨어져 있다는 것을 의미한다.
조작된: 본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 구체예는, 구조적으로든 화학적으로든, 시작점, 야생형 또는 고유한 분자와 다른 특징 또는 성질을 갖도록 디자인될 때 "조작된다". 따라서, 조작된 작용제 또는 실체물은 그 디자인 및/또는 생산이 인간의 손의 작용을 포함하는 것들이다.
에피토프 : 본원에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 제한되는 것은 아니지만, 항체를 포함한, 면역 시스템의 구성요소와 상호작용할 수 있는 분자 상의 표면 또는 영역을 말한다. 일부 구체예에서, 에피토프는 표적 부위를 포함할 수도 있다. 에피토프는 상응하는 항체에 의해 특이적으로 인식되거나 결합되는, 하나의 항원 상의 영역 또는 둘 이상의 항원들 사이의 영역을 포함할 수도 있다. 일부 에피토프는 하나 이상의 글리칸을 따라 하나 이상의 당 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 에피토프는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 적어도 10개의 당 잔기를 포함할 수도 있다. 에피토프는 또한 실체물 간의 상호작용의 하나 이상의 영역을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 에피토프는 두 개의 당 잔기 사이에, 분지형 사슬과 모체 사슬 사이에 또는 글리칸과 단백질 사이에 접합(junction)을 포함할 수도 있다.
에테르 결합: 본원에서 사용된 바와 같이, "에테르 결합"은 두 개의 탄소 원자 사이에 결합된 산소 원자를 포함하는 화학 결합을 말한다. 일부 구체예에서, 에테르 결합은 당 잔기를, 제한되는 것은 아니지만, 다른 당 잔기를 포함한 다른 실체물에 결합시켜 글리칸 사슬을 형성한다. 이러한 결합은 또한 "글리코시드 결합(bond)" 또는 "글리코시드 연결(연결)"이라고도 불린다. 적어도 하나의 당 잔기의 맥락에서, 글리코시드 결합을 말할 때 용어 "연결시키다" 및/또는 "연결"이 또한 본원에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 연결은 글리칸을, 제한되는 것은 아니지만, 단백질, 지질, 인지질 및 스핑고지질(sphingolipid)을 포함한 다른 실체물에 연결시킬 수도 있다. 일부 구체예에서, 당 잔기는 단백질에 연결되어, 전형적으로 당 잔기와 아미노산 잔기 사이의 연결을 형성할 수도 있다. 이러한 아미노산 잔기는 세린 및 트레오닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 에테르 결합은 결합 형성에 참여하는 탄수화물 링커를 통해 글리칸을 글리칸 어레이에 연결시킨다. 글리코시드 연결은 입체화학적 성질이 상이할 수도 있다. 일부 구체예에서, 알파 배향된 글리코시드 연결 (본원에서 "알파 연결"이라고도 불림)은 에테르 결합의 결합된 산소와 링 잔기의 사이클로헥산 고리 사이에서 축 방향을 초래한다. 일부 구체예에서, 베타 배향된 글리코시드 연결 (본원에서 "베타 연결"이라고도 불림)은 에테르 결합의 결합된 산소와 당 잔기의 사이클로헥산 고리 사이에서 수평 배향을 초래한다.
발현: 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"은 다음 이벤트 중 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산 (예를 들어, 전사에 의해); (2) RNA 전사물 가공 (예를 들어, 스플라이싱(splicing), 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 단부 가공에 의해); (3) 폴리펩타이드 또는 단백질로의 RNA의 번역; (4) 폴리펩타이드 또는 단백질의 폴딩(folding); 및 (5) 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역 후 변형.
특징: 본원에서 사용된 바와 같이, "특징"은 특성, 성질, 또는 독특한 요소를 말한다.
제제: 본원에서 사용된 바와 같이, "제제"는 화학식에 따라 제조되고 적어도 하나의 항체, 화합물, 물질, 실체물, 모이어티, 카고 또는 페이로드 및 전달제, 담체 또는 부형제를 포함할 수도 있는 재료 또는 혼합물을 말한다.
기능적: 본원에서 사용된 바와 같이, "기능적인" 생물학적 분자는 특성화되는 성질 및/또는 활성을 나타내는 구조 및 형태의 생물학적 실체물이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "작용기" 또는 "화학 기"는 더 큰 분자의 일부인 원자 또는 화학 결합의 특징적인 군을 말한다. 일부 구체예에서, 작용기는 상이한 분자와 회합될 수도 있지만, 일부인 분자에 관계없이 유사한 화학 반응에 참여할 수도 있다. 일반적인 작용기는, 제한되는 것은 아니지만, 카르복실 기 (-COOH), 아세틸 기 (-COH), 아미노 기 (-NH2), 메틸 기 (-CH3), 설페이트 기 (-SO3H) 및 아실 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자로의 하나 이상의 작용기의 추가는 어미 "-화된"을 갖는, 예를 들어, 아세틸화된, 메틸화된 및 황화된 작용기의 명칭을 변형시키는 용어를 사용하여 전달될 수 있다.
글리칸 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글리칸", "올리고당" 및 "다당류"는 교체 가능하게 사용되고 전형적으로 본원에서 연결이라고도 불리는 글리코시드 결합에 의해 결합된 당 모노머로 구성된 폴리머를 말한다. 일부 구체예에서, 용어 "글리칸", "올리고당" 및 "다당류"는 당컨쥬게이트 (예를 들어, 당단백질, 당지질 또는 프로테오글리칸)의 탄수화물 부분을 지칭하는데 사용될 수도 있다.
글리칸 사슬: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글리칸 사슬"은 둘 이상의 당을 포함하는 당 폴리머를 말한다. 일부 구체예에서, 글리칸 사슬은 단백질 상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 통해 단백질에 공유 결합된다.
글리칸 -풍부 조성물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글리칸-풍부 조성물"은 많은 퍼센트의 글리칸을 포함하는 혼합물을 말한다. 일부 구체예에서, 글리칸-풍부 조성물 내 글리칸은 조성물의 총 중량의 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 15%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90% 또는 적어도 100%를 구성할 수도 있다.
글리코시드 결합: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글리코시드 결합"은 탄수화물과 또 다른 화학 기 사이에 형성된 공유 결합을 말한다. 일부 구체예에서, 글리코시드 결합은 하나의 당 분자의 환원성 단부와 제2 당 분자 또는 다당류 사슬의 비-환원성 단부 사이에 형성된다. 이러한 글리코시드 결합은 또한 결합된 당 사이에서 산소로 인한 O-글리코시드 결합 (또는 에테르 결합)으로도 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 두 개의 당 사이 또는 당과 링커 사이의 글리코시드 결합은 "연결"이라고도 불릴 수 있다.
시험관 내(In vitro): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시험관 내"는 유기체 (예를 들어, 동물, 식물, 또는 미생물) 내에서가 아니라 인공적인 환경, 예를 들어, 테스트 튜브 또는 반응 용기, 세포 배양물, 페트리 디쉬(Petri dish), 등에서 일어난 이벤트를 말한다.
생체 내: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생체 내"는 유기체 (예를 들어, 동물, 식물, 또는 미생물 또는 이것들의 세포나 조직) 내에서 일어난 이벤트를 말한다.
단리된 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 "분리된"과 동의어이지만, 그것을 가지고 추론 분리는 인간의 손으로 수행되었다. 한 구체예에서, 단리된 물질 또는 실체물은 이전에 회합된 구성요소 중 적어도 일부로부터 분리된 것이다 (자연에서든 실험 설정에서든). 단리된 물질은 그것들이 회합된 물질에 관하여 다양한 수준의 순도를 가질 수 있다. 단리된 물질 및/또는 실체물은 처음에 회합된 다른 구성요소의 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 이상으로부터 분리될 수도 있다. 일부 구체예에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과의 순도를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 물질은 다른 구성요소가 실질적으로 없는 경우 "순수"하다.
키트 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키트"는 협조 목적에 적합한 하나 이상의 구성요소 및 그것의 사용설명서를 포함하는 세트를 말한다.
넉아웃 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "넉아웃"은 기존의 유전자가 전형적으로 인간의 손을 수반하는 공정을 통해 비활성화된 유기체를 말한다. 넉아웃 유기체에서, 비활성화된 유전자는 "넉아웃"되었다고 한다. 일부 구체예에서, 넉아웃된 유전자는 유전자로의 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 통해 또는 전체적으로 유전자의 대체를 통해 비활성화될 수도 있다.
링커: 본원에서 사용된 바와 같이, "링커"는 둘 이상의 도메인, 모이어티 또는 실체물을 연결하는 모이어티를 말한다. 한 구체예에서, 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 원자를 포함할 수도 있다. 추가의 구체예에서, 링커는 원자의 군, 예를 들어, 10-1,000개의 원자를 포함할 수도 있다. 이러한 원자 또는 이것들의 군은 탄소, 아미노, 알킬아미노, 산소, 황, 설폭사이드, 설포닐, 카르보닐, 및 이민을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 링커는 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 링커에 의해 결합된 모이어티는 원자, 화학 기, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 핵염기, 당, 핵산, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 단백질 복합체, 페이로드 (예를 들어, 치료제) 또는 마커 (제한되는 것은 아니지만, 화학적, 형광, 방사성 또는 생물 발광 마커 포함)를 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 기술된 바와 같이, 링커는 임의의 유용한 목적으로, 예를 들어, 멀티머 또는 컨쥬게이트를 형성하기 위해, 뿐만 아니라 페이로드를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 링커로 혼입될 수 있는 화학 기의 예는, 제한되는 것이 아니라, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아미도, 아미노, 에테르, 티오에테르, 에스터, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 아릴, 또는 헤테로사이클릴을 포함하며, 이것들은 각각 본원에서 기술된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다. 링커의 예는 불포화 알칸, 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜 모노머 유닛, 예를 들어, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 또는 테트라에틸렌 글리콜), 및 덱스트란 폴리머를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예는 환원제 또는 광분해를 사용하여 분열될 수 있는, 링커 내에서 분열 가능한 모이어티, 예를 들어, 이황화 결합 (-S-S-) 또는 아조 결합 (-N=N-)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 선택적으로 분열 가능한 결합의 비-제한적 예는, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 또는 다른 환원제, 및/또는 광분해의 사용에 의해 분열될 수 있는 아미도 결합, 뿐만 아니라, 예를 들어, 산성 또는 염기성 가수분해에 의해 분열될 수 있는 에스터 결합을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 예컨대 글리칸 어레이에서 글리칸을 기질에 연결시키는데 사용된 탄수화물 모이어티이다. 이러한 탄수화물 링커는 -O(CH2)2CH2HN2 및 -O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
mRNA: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "mRNA"는 유전자 전사 및 생성된 전사물의 가공의 결과로 생산된 전령 RNA(messenger RNA)를 말한다. 일부 구체예에서, 세포의 핵에서 빠져나온 mRNA는 세포 또는 세포의 세트로부터 추출될 수 있으며 유전자가 주어진 시간에 또는 주어진 환경 설정 하에서 전사를 겪는지를 결정하기 위해 분석될 수 있다.
뮤신 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뮤신"은 많이 글리코실화된 단백질의 패밀리를 말한다. 일부 구체예에서 뮤신은 턱밑샘에 의해 생산되고 타액 및 점액질에서 발견된다.
음성 선택: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "음성 선택"은 표적 항원을 포함하지 않는 조성물의 구성요소 및/또는 실체물에 결합하는 능력에 기초한 라이브러리 구성원의 선택을 말한다. 일부 구체예에서, 음성 선택은 표적에 비-특이적으로 결합할 수 있는 요소를 제거하기 위한 양성 선택 전에 사용된다.
비-표적(Off-target): 본원에서 사용된 바와 같이, "비표적"은 임의의 하나 이상의 표적, 유전자, 또는 세포 전사물에 대한 임의의 의도하지 않은 효과를 말한다.
환자: 본원에서 사용된 바와 같이, "환자"는 특정 질환 또는 병태에 대하여 치료를 구하거나 필요로 할 수도 있는 대상체, 치료를 요구하는 대상체, 치료를 받고 있는 대상체, 치료를 받을 대상체, 또는 숙련된 (예를 들어, 허가를 받은) 전문가에 의한 관리 하에 있는 대상체를 말한다.
펩타이드 : 본원에서 사용된 바와 같이, "펩타이드"는 50개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이인 단백질 또는 폴리펩타이드이다.
약학적으로 허용 가능한: 구절 "약학적으로 허용 가능한"은, 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하는데 적합한 상기 화합물, 재료, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭하기 위해 본원에서 이용된다.
약학적으로 허용 가능한 부형제: 구절 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 약학적 조성물에 존재하며 환자에서 실질적으로 비독성 및 비-염증성 성질을 가진, 활성제 이외의 임의의 성분 (예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같음)을 말한다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 활성제를 현탁시키거나 용해시킬 수 있는 비히클(vehicle)이다. 부형제는, 예를 들어, 부착방지제, 항산화제, 바인더, 코팅, 압축 보조제, 붕괴제, 염료 (착색제), 연화제, 에멀젼화제, 충전제 (희석제), 막 형성제 또는 코팅, 향료, 착향제, 활택제 (유동성 개선제), 윤활제, 보존제, 인쇄용 잉크, 흡수제, 현탁제 또는 분산제, 감미제, 및 수화수(waters of hydration)를 포함할 수도 있다. 예시의 부형제는 부틸화된 하이드록시톨루엔 (BHT), 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 (2염기), 칼슘 스테아레이트, 크로스카르멜로오스, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로오스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 락토오스, 마그네슘 스테아레이트, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로오스, 메틸 파라벤, 미정질 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전호화분(pregelatinized) 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락(shellac), 이산화규소, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 나트륨 시트레이트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 소르비톨, 전분 (옥수수), 스테아르산, 수크로오스, 탈크(talc), 티타늄 디옥사이드, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 및 자일리톨을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
약학적으로 허용 가능한 염: 본원에서 기술된 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 산 또는 염기 모이어티가 염 형태 (예를 들어, 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시켜 생산됨)로 되어있는 개시된 화합물의 형태이다. 약학적으로 허용 가능한 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 미네랄 또는 유기산 염; 카르복시산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염; 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 산 부가 염(acid addition salt)은 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 비설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 페르설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발러레이트 염, 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 등, 뿐만 아니라 비독성 암모늄, 제4 암모늄, 및 아민 양이온, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민, 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 비-독성 무기산 또는 유기산의 통상적인 비-독성 염을 포함한다. 일부 구체예에서 약학적으로 허용 가능한 염은 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모체 화합물로부터 통상적인 화학적 방법에 의해 제조된다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물이나 유기 용제, 또는 둘의 혼합물 중의 적절한 염기 또는 산의 화학량론적 양과 반응시킴으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로는, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 아이소프로판올, 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, 및 Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977) (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 발견된다.
약학적으로 허용 가능한 용제 화합물: 용어 "약학적으로 허용 가능한 용제 화합물"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 적합한 용제의 분자가 결정 격자에 포함된 결정 형태의 화합물을 말한다. 예를 들어, 용제 화합물은 유기 용제, 물, 또는 이것들의 혼합물을 포함하는 용액으로부터의 결정화, 재결정화, 또는 침전에 의해 제조될 수도 있다. 적합한 용제의 예는 에탄올, 물 (예를 들어, 일수화물, 이수화물, 및 삼수화물), N-메틸피롤리디논 (NMP), 디메틸 설폭사이드 (DMSO), N,N '-디메틸포름아미드 (DMF), N,N '-디메틸아세트아미드 (DMAC), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논 (DMEU), 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2-(1H)-피리미디논 (DMPU), 아세토니트릴 (ACN), 프로필렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 2-피롤리돈, 벤질 벤조에이트, 등이다. 물이 용제일 때, 용제 화합물은 "수화물"이라고 불린다. 일부 구체예에서, 용제 화합물에 포함된 용제는 용제 화합물이 (예를 들어, 약학적 조성물의 단위 투약 형태로) 투여되는 유기체에 대하여 생리학적으로 용인 가능한 유형 또는 수준으로 되어있다.
약물동역학 : 본원에서 사용된 바와 같이, "약물동역학"은 살아있는 유기체에게 투여되는 물질의 운명의 결정에 관련된 분자 또는 화합물의 임의의 하나 이상의 성질을 말한다. 약물동역학은 흡수, 분포, 대사 및 배출의 정도 및 비율을 포함한 여러 영역으로 나누어진다. 이것은 일반적으로 ADME라고 불리며 (A) 흡수는 혈액 순환에 물질이 들어가는 과정이고; (D) 분포는 체액 및 신체 조직 전반에 걸친 물질의 분산 또는 전파(dissemination)이고; (M) 대사 (또는 생체 내 변화(biotransformation))는 딸 대사 산물(daughter metabolite)로의 모체 화합물의 비가역적 변화이고; (E) 배출 (또는 제거)은 신체로부터의 물질의 제거를 말한다. 드물게, 일부 약물은 신체 조직에 비가역적으로 축적된다.
물리화학적: 본원에서 사용된 바와 같이, "물리화학적"은 물리적 및/또는 화학적 성질의 것 또는 이와 관련된 것을 의미한다.
양성 선택: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "양성 선택"은 고유의 실체물의 군으로부터 주어진 실체물의 선택을 말한다. 이러한 실체물 및 이것들의 군은, 예를 들어, 항체일 수도 있다. 어떤 경우에는 그것들은 항체 단편일 수도 있거나 발현된 항체 단편은 이러한 단편을 발현할 수 있는 작용제 (예를 들어, 디스플레이 라이브러리의 라이브러리 구성원)와 연관성이 있다. 선택은 선택된 실체물이 원하는 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력에 기초할 수도 있다. 일부 구체예에서, 양성 선택은 원하는 표적에 결합하는 scFv를 발현하는 파지 입자를 확인하기 위해 파지 디스플레이 라이브러리와 함께 사용될 수도 있다. 다른 구체예에서, 양성 선택은 항체의 풀 중에서 항체 후보의 선택을 지칭할 수도 있다. 다른 경우에, 실체물은 하이브리도마 선택 중의 클론의 선택에서와 같이 세포, 세포주 또는 클론일 수도 있다. 이러한 경우에, 양성 선택은 이러한 클론에 의해 생산된 항체의 하나 이상의 특징 (예를 들어, 하나 이상의 원하는 에피토프에 대한 특이성)에 기초한 클론 선택을 지칭할 수도 있다. 어떤 경우에는, 양성 선택 방법에서 원하는 에피토프는 STn (예를 들어, AcSTn 및/또는 GcSTn)을 포함할 수도 있다.
반대로, "음성 선택"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 양성 선택에 대하여 기술된 동일한 원칙과 예를 포함하지만, 고유의 실체물의 군으로부터의 원치않는 실체물의 제거에 사용된다는 독특한 특성을 갖는다.
예방하는: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는"은 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 시작을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고; 특정 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징, 또는 임상 소견의 시작을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고; 특정 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징, 또는 소견의 시작을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고; 감염, 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고; 및/또는 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태와 관련된 병리상태에 걸릴 위험을 감소시키는 것을 말한다.
프로드러그 ( Prodrug ): 본 발명은 또한 본원에서 기술된 화합물의 프로드러그를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "프로드러그"는 화학적 또는 물리적 변화시 치료제로 작용하기 위한 임의의 물질, 분자 또는 실체물에 대한 형식 술어로 되어 있는 물질, 분자 또는 실체물을 말한다. 프로드러그는 몇 가지 방법으로 공유 결합되거나 격리될 수도 있으며 이것은 포유류 대상체에게 투여되기 전, 투여시 또는 투여된 후 활성 약물 모이어티를 방출하거나 이것으로 전환된다. 프로드러그는 변형이 일상적인 조작으로든 생체 내에서든 모체 화합물로 분열되는 방식으로 화합물에 존재하는 작용기를 변형시킴으로써 제조될 수 있다. 프로드러그는, 포유류 대상체에 투여될 때, 분열하여 각각 유리 하이드록실, 아미노, 설피드릴, 또는 카르복실 기를 형성하는 하이드록실, 아미노, 설피드릴, 또는 카르복실 기가 임의의 기에 결합된 화합물을 포함한다. 프로드러그의 제조 및 사용은 T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, 및 Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987 (둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 논의된다.
근위 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "근위"는 중심이나 관심있는 지점 또는 영역에 더 가까이 위치한 것을 의미한다.
상호작용 영역: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상호작용 영역"은 상호작용하거나 중첩된 둘 이상의 실체물 중 어느 것을 따르는 영역을 말한다. 일부 구체예에서, 상호작용 영역은 제2 글리칸 사슬에 접촉된 글리칸 사슬을 따라 하나 이상의 당 잔기를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 글리칸 사슬은 동일한 모체 사슬의 분지형 사슬이다. 일부 구체예에서, 상호작용 영역은 두 개의 글리칸 사슬 사이에서 일어날 수도 있는데 하나의 사슬은 분지형 사슬이고 두 번째 사슬은 모체 사슬이다. 글리칸 사슬의 경우에, 상호작용 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 적어도 10개의 당 잔기를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 상호작용 영역은 또한 글리칸과 단백질 사이 또는 글리칸과 지질 사이에서도 일어날 수 있다.
잔기 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "잔기"는 폴리머와 회합된 또는 회합될 수 있는 모노머를 말한다. 일부 구체예에서, 잔기는, 제한되는 것은 아니지만, 글루코오스, 갈락토오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산을 포함한 당 분자를 포함한다.
일부 구체예에서, 잔기는 아미노산을 포함한다.
샘플: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "샘플"은 공급원으로부터 채취되고 및/또는 분석 또는 가공을 위해 제공되는 앨리쿼트 또는 일부를 말한다. 일부 구체예에서, 샘플은 생물학적 공급원, 예컨대 조직, 세포 또는 구성요소 (예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 혈액, 혈장, 혈청, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 타액, 양수, 양수 제대 혈액, 소변, 질액 및 정액을 포함한 체액)로부터 유래된다 (본원에서 "생물학적 샘플"이라고도 불림). 일부 구체예에서, 샘플은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부 외측면, 호흡기, 장관, 및 비뇨생식관, 눈물, 타액, 유액, 혈액 세포, 종양, 장기를 포함한, 전체 유기체 또는 그 조직, 세포 또는 구성요소의 부분집합이나, 그것들의 분획 또는 일부로부터 제조된 균질물, 용해물 또는 추출물일 수 있거나 이것들을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 세포 구성요소, 예컨대 단백질 또는 핵산 분자를 함유할 수 있는 배지, 예컨대 영양 브로스(broth) 또는 겔을 포함한다. 일부 구체예에서, "1차" 샘플은 공급원의 앨리쿼트이다. 일부 구체예에서, 1차 샘플은 분석 또는 다른 용도를 위한 샘플을 제조하기 위해 하나 이상의 가공 (예를 들어, 분리, 정제, 등) 단계를 거친다.
시알릴 : 본원에서 사용된 바와 같이, 접두사 "시알릴", 뿐만 아니라 용어 "시알릴화된"은 시알산을 포함한 화합물을 기술한다.
단일 단위 용량: 본원에서 사용된 바와 같이, "단일 단위 용량"은 1회 용량으로/한 번에/단일 경로/단일 접촉점, 즉, 단일 투여 이벤트로 투여되는 임의의 치료제의 용량이다. 일부 구체예에서, 단일 단위 용량은 별도의 투약 형태 (예를 들어, 타블렛, 캡슐, 패치, 로딩된 주사기, 바이알, 등)으로 제공된다.
분할 용량: 본원에서 사용된 바와 같이, "분할 용량"은 단일 단위 용량 또는 총 1일 용량을 2회 이상의 용량으로 나눈 것이다.
안정한: 본원에서 사용된 바와 같이 "안정한"은 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로의 단리를 견디기에 충분히 견고하고, 바람직하게는 효과적인 치료제로 제제화할 수 있는 화합물 또는 실체물을 말한다.
안정화된: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정화하다", "안정화된", "안정화된 영역"은 안정시키거나 안정해지는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 안정성은 절대값에 관하여 측정된다. 일부 구체예에서, 안정성은 참조 화합물 또는 실체물에 관하여 측정된다.
표준 관리: 본원에서 사용된 바와 같이, 구절 "표준 관리"는 치료적 처리를 제공하는데 있어서 대부분의 당업자에 의해 실시되는 방법과 동조되는 치료적 처리 방법을 말한다.
대상체 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "환자"는, 예를 들어, 실험, 진단, 예방, 및/또는 치료적 목적으로 본 발명에 따르는 조성물이 투여될 수도 있는 임의의 유기체를 말한다. 전형적인 대상체는 동물 (예를 들어, 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류, 및 인간) 및/또는 식물을 포함한다.
턱밑샘: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "턱밑샘(submaxillary gland)" 또는 "턱밑샘(submandibular gland)"은 입 바닥 아래에 위치한 샘(gland)을 생산하는 점막을 말한다. 이들 샘은 뮤신을 생산할 수 있으며, 일부 구체예에서는, 뮤신의 공급원으로서 포유류로부터 추출될 수도 있다.
~로 고통받는: 질환, 장애, 및/또는 병태로 "고통받는" 개체는 질환, 장애, 및/또는 병태로 진단되었거나 이것들의 하나 이상의 증상을 나타낸다.
~에 취약한: 질환, 장애, 및/또는 병태에 "취약한" 개체는 질환, 장애, 및/또는 병태로 진단되지 않았고 및/또는 이것들의 증상을 나타내지 않을 수도 있지만 질환 또는 그 증상에 걸릴 성향을 숨기고 있다. 일부 구체예에서, 질환, 장애, 및/또는 병태 (예를 들어, 암)에 취약한 개체는 다음 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다: (1) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발달과 관련된 유전적 돌연변이; (2) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발달과 관련된 유전적 다형성; (3) 질환, 장애, 및/또는 병태와 관련된 단백질 및/또는 핵산의 발현 및/또는 활성의 증가 및/또는 감소; (4) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발달과 관련된 습관 및/또는 생활 방식; (5) 질환, 장애, 및/또는 병태의 가족력; 및 (6) 질환, 장애, 및/또는 병태의 발달과 관련된 미생물에 대한 노출 및/또는 상기 미생물로의 감염. 일부 구체예에서, 질환, 장애, 및/또는 병태에 취약한 개체는 질환, 장애, 및/또는 병태에 걸릴 것이다. 일부 구체예에서, 질환, 장애, 및/또는 병태에 취약한 개체는 질환, 장애, 및/또는 병태에 걸리지 않을 것이다.
합성: 용어 "합성"은 인간의 손으로 생산되고, 제조되고, 및/또는 제작된 것을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 또는 다른 분자의 합성은 화학적 또는 효소적인 것일 수도 있다.
표적: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적"은 작용에 의해 영향을 받는 대상 또는 실체물을 말한다. 일부 구체예에서, 표적은 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 발달에 사용되는 항원을 말한다.
표적 스크리닝: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 스크리닝"은 표적 물질에 대한 결합 파트너를 확인하기 위한 상기 표적 물질의 사용을 말한다.
표적 부위: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 부위"는 결합제 또는 효과기 분자 (예를 들어, 항체)에 의해 인식되는 세포, 세포외 공간, 조직, 장기 및/또는 유기체 상의 또는 그 안에 있는 하나 이상의 글리칸, 당단백질, 생체 분자 및/또는 생물학적 구조 상의 또는 그 안에 있는 영역을 말한다. 일부 구체예에서, 글리칸 표적 부위는 하나의 당 잔기에 배타적으로 존재할 수도 있거나, 둘 이상의 잔기에 의해 형성될 수도 있거나, 또는 글리칸 및 비-글리칸 구성요소 모두를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 표적 부위는 둘 이상의 글리칸 또는 당단백질 사이에서 형성된다. 일부 구체예에서, 표적 부위는 동일한 글리칸의 분지형 사슬들 사이에서 또는 하나 이상의 분지형 사슬과 모체 사슬 사이에서 형성된다.
표적화된 세포: 본원에서 사용된 바와 같이, "표적화된 세포"는 관심있는 하나 이상의 세포 중 임의의 것을 지칭한다. 세포는 시험관 내에서, 생체 내에서, 제자리에서(in situ) 또는 임의의 유기체의 조직 또는 장기에서 발견될 수도 있다. 유기체는 동물, 포유류, 또는 인간 (예를 들어, 인간 환자)일 수도 있다.
말단 잔기: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "말단 잔기"는 폴리머 사슬의 마지막 잔기를 말한다. 일부 구체예에서, 말단 잔기는 다당류 잔기의 비-환원성 단부에 위치한 당 잔기이다.
치료적: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료적"은 질환, 장애, 또는 병태의 치유와 관련된 임의의 물질 또는 절차를 말한다. 예를 들어, 치료적 처리는 질환, 장애, 또는 병태의 치유와 관련된 임의의 처리를 말한다.
치료제: 용어 "치료제"는, 대상체에게 투여될 때, 치료적, 진단적, 및/또는 예방적 효과를 갖고 및/또는 원하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유도하는 임의의 물질을 말한다.
치료적 유효량: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태로 고통받거나 또는 이것들에 취약한 대상체에게 투여될 때 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하고, 이것들의 증상을 개선하고, 이것들을 진단하고, 예방하고, 및/또는 이것들의 시작을 지연시키기에 충분한, 전달되는 작용제 (예를 들어, 핵산, 약물, 치료제, 진단제, 예방제, 등)의 양을 의미한다. 일부 구체예에서, 치료적 유효량은 단일 용량으로 제공된다. 일부 구체예에서, 치료적 유효량은 복수의 용량을 포함한 투약 양생법으로 투여된다. 당업자는, 일부 구체예에서, 단위 투약 형태가 이러한 투약 양생법의 일부로서 투여될 때 효과적인 양을 포함하는 경우 특정 작용제 또는 실체물의 치료적 유효량을 포함하는 것으로 간주될 수도 있다는 것을 인정할 것이다.
치료적으로 유효한 결과: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료적으로 유효한 결과"는 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태로 고통받거나 또는 이것들에 취약한 대상체에서 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하고, 이것들의 증상을 개선하고, 이것들을 진단하고, 예방하고, 및/또는 이것들의 시작을 지연시키기에 충분한 결과를 의미한다.
총 1일 용량: 본원에서 사용된 바와 같이, "총 1일 용량"은 24 hr 기간 내에 제공된 또는 처방되는 양이다. 그것은 단일 단위 용량으로 투여될 수도 있다.
트랜스제닉: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스제닉"은 유기체에서 자연적으로 발견되지 않는 유기체 게놈 내에 혼입된 하나 이상의 유전자를 포함하는 유기체를 말한다.
치료하는: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 특정 감염, 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 경감하고, 치유하고, 향상시키고, 개선하고 완화하고, 이것들의 시작을 지연시키고, 이것들의 진행을 억제하고, 이것들의 심각도를 감소시키고, 및/또는 이것들의 발병률을 감소시키는 것을 말한다. 예를 들어, 암을 "치료하는" 것은 종양의 생존, 성장, 및/또는 확산을 억제하는 것을 지칭할 수도 있다. 치료는 질환, 장애, 및/또는 병태와 관련된 병리상태에 걸릴 위험을 감소시킬 목적으로 질환, 장애, 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체에게 및/또는 질환, 장애, 및/또는 병태의 조기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여될 수도 있다.
가변 영역: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 특이적인 항체 도메인을 말한다.
전체 IgG : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전체 IgG"는 완전한 IgG 분자를 말한다. 일부 구체예에서, 전체 IgG 분자는 둘 이상의 다른 유기체에서 자연적으로 발견되는 영역을 포함한다.
야생형: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "야생형"은 천연 게놈을 포함하는 (다른 유기체로부터 유래된 유전자가 없는) 유기체를 말한다.
I. 화합물 및 조성물
일부 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 글리칸-상호작용 항체를 포함하는 화합물, 뿐만 아니라 조성물을 제공한다. 글리칸 내에서, 단당류 모노머는 모두 동일할 수도 있거나 상이할 수도 있다. 일반적인 모노머는 트리오오스, 테트로오스, 펜토오스, 글루코오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 자일로오스, 아라비노오스, 릭소오스, 알로오스, 알트로오스, 만노오스, 굴로오스, 아이오도오스, 리보오스, 만노헵툴로오스, 세도헵툴로오스 및 탈로오스를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 아미노 당은 또한 글리칸 내에서 모노머일 수도 있다. 이러한 당을 포함한 글리칸은 본원에서 아미노글리칸이라고 불린다. 아미노 당은, 본원에서 사용된 바와 같이, 하이드록실 기 대신에 아민 기를 포함하는 당 분자, 또는 일부 구체예에서는, 이러한 당으로부터 유래된 당이다. 아미노 당의 예는 글루코사민, 갈락토사민, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산 (제한되는 것은 아니지만, N-아세틸뉴라민산 및 N-글리콜릴뉴라민산을 포함함) 및 L-다우노사민을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "글리칸-상호작용 항체"는 글리칸 모이어티와 상호작용할 수 있는 항체를 말한다. 이러한 항체는 글리칸 모이어티에 단독으로, 다수의 글리칸 모이어티에, 또는 글리칸 및 비-글리칸 구성요소 모두를 포함하는 에피토프에 결합할 수도 있다. 비-글리칸 구성요소는 단백질, 단백질-관련된 모이어티 (예컨대 번역 후 변형), 세포, 및 세포-관련된 분자/구조를 포함하지만, 이에 제한되지 않을 수도 있다. 글리칸-상호작용 항체는 글리칸 또는 글리칸-관련된 분자 또는 실체물에 결합하고, 이것을 변화시키고, 활성화시키고, 억제하고, 안정화시키고, 분해하고, 및/또는 조절하는 기능을 할 수도 있다. 그렇게 함으로써, 글리칸-상호작용 항체는 임시방편이든, 예방적이든, 치료제로서 또는 진행 중인 치료 조성물로서 기능할 수도 있다. 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 다른 분자와의 컨쥬게이트 또는 조합을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 하나 이상의 아미노 당을 가진 글리칸에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 하나 이상의 아미노 당은 시알산이다. 추가의 구체예에서, 하나 이상의 시알산은 N-아세틸뉴라민산 및/또는 N-글리콜릴뉴라민산이다.
항체
글리칸-상호작용 항체는 전체 항체 또는 그것의 단편을 포함할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되며, 제한되는 것은 아니지만, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 적어도 두 개의 온전한 항체로부터 형성된 이중특이적 항체), 항체 컨쥬게이트 (제한되는 것은 아니지만, 항체-약물 컨쥬게이트 포함), 항체 변이체 [제한되는 것은 아니지만, 항체 모방체, 키메라 항체 (예를 들어, 하나 이상의 종으로부터 유래된 아미노산 서열을 가진 항체), 및 합성 변이체 포함], 및 원하는 생물학적 활성 (예를 들어, 하나 이상의 표적에 결합하고, 그것을 활성화시키고, 억제하고, 안정화시키고, 분해하고, 및/또는 조절하는 것)을 나타내는 한은 항체 단편을 포함한, 다양한 포맷을 포괄한다. 항체는 주로 아미노산 기반 분자이지만 하나 이상의 번역 후 또는 합성 변형을 포함할 수도 있다. 번역 후 변형은 글리코실화를 포함할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부 또는 이것의 융합-단백질을 말하며, 어떤 경우에는 적어도 하나의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 단일 사슬 가변 단편 (scFv); 디아바디; 트리(아)바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편이라고 불리는 두 개의 동일한 항원-결합 단편을 생산하며, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 또한 잔류 "Fc" 단편이 생산되는데, 그 명칭은 쉽게 결정화할 수 있는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 두 개의 항원-결합 부위를 갖고 가교 항원에 교차-결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 수득한다. 글리칸-상호작용 항체는 이들 단편들 중 하나 이상을 포함할 수도 있으며, 예를 들어, 전체 항체의 효소에 의한 소화를 통해 또는 재조합 발현을 통해 생성될 수도 있다.
"고유한 항체"는 보통 약 150,000 달톤(dalton)의 헤테로테트라머 당단백질이며, 두 개의 동일한 경쇄 (L)와 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된다. 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자가 공지되어 있으며 각각을 구성하는 세그먼트는 잘 특성화되고 기술되어 있다 (Matsuda, F. et al., 1998. The Journal of Experimental Medicine. 188(11); 2151-62 and Li, A. et al., 2004. Blood. 103(12: 4602-9 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 이황화 연결의 개수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬 간 이황화 브릿지(bridge)를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 단부에서 가변 도메인 (VH)에 이어서 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 단부에서 가변 도메인 (VL) 그리고 다른 단부에서 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 함께 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "가변 도메인"은 항체들 사이에서 서열이 광범위하게 상이하고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 항체 중쇄 및 경쇄 모두에서 발견되는 특이적 항체 도메인을 말한다. 가변 도메인은 초가변 영역을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합의 원인이 되는 아미노산 잔기를 포함하는 가변 도메인 내 영역을 말한다. 초가변 영역 내에 존재하는 아미노산은 항체의 항원-결합 부위의 일부가 되는 상보성 결정 영역 (CDR)의 구조를 결정한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CDR"은 표적 항원 또는 에피토프에 대하여 상보적인 구조를 포함하는 항체의 영역을 말한다. 항원과 상호작용하지 않는 가변 도메인의 다른 부분은 프레임워크 (FW) 영역이라고 불린다. 항원-결합 부위 (항원 조합 부위 또는 파라토프로도 알려져 있음)는 특정 항원과 상호작용하는데 필요한 아미노산 잔기를 포함한다. 항원-결합 부위를 구성하는 정확한 잔기는 전형적으로 결합된 항원과의 동시-결정학에 의해 설명되지만, 다른 항체와의 비교에 기초한 컴퓨터를 사용한 평가가 또한 사용될 수 있다 (Strohl, W.R. Therapeutic 항체 Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p47-54 (이것들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). CDR을 구성하는 잔기를 결정하는 것은, 제한되는 것은 아니지만, Kabat [Wu, T.T. et al., 1970, JEM, 132(2):211-50 및 Johnson, G. et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28(1): 214-8 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)], Chothia [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989) 및 Al-Lazikani, B. et al., 1997, J. Mol. Biol. 273(4):927-48 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)], Lefranc (Lefranc, M.P. et al., 2005, Immunome Res. 1:3) 및 Honegger (Honegger, A. and Pluckthun, A. 2001. J. Mol. Biol. 309(3):657-70 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 교시된 것들을 포함한 넘버링 계획의 사용을 포함할 수도 있다.
VH 및 VL 도메인은 각각 세 개의 CDR을 갖는다. VL CDR은 본원에서 가변 도메인 폴리펩타이드를 따라 N-말단에서 C-말단으로 이동할 때의 발생 순서로 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 불린다. VH CDR은 본원에서 가변 도메인 폴리펩타이드를 따라 N-말단에서 C-말단으로 이동할 때의 발생 순서로 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 불린다. 각각의 CDR은 CDR-H3을 제외하고 기본형(canonical) 구조를 선호하며, 이것은 항체들 사이에서 서열 및 길이가 고도로 가변적일 수도 있는 아미노산을 포함하여 항원-결합 도메인에서 다양한 3차원 구조를 발생시킨다 (Nikoloudis, D. et al., 2014. PeerJ. 2:e456). 어떤 경우에는, CDR-H3은 항체 다양성을 평가하기 위해 관련된 항체의 패널 사이에서 분석될 수도 있다. 다양한 CDR 서열 결정 방법이 해당 분야에 공지되어 있으며 공지되어 있는 항체 서열에 적용될 수도 있다 (Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p47-54 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 형성하는데 필요한 항체 상의 최소한의 단편을 포함하는 항체 단편을 말한다. 이들 영역은 단단하게 비-공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 다이머로 이루어진다. Fv 단편은 단백질 가수분해 분열에 의해 생성될 수 있지만, 대부분 불안정하다. 전형적으로는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 플렉시블(flexible) 링커의 삽입을 통해 [단일 사슬 Fv (scFv)를 형성하기 위해] 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 사이에 이황화 브릿지의 도입을 통해 안정한 Fv 단편을 생성하기 위한 재조합 방법은 해당 분야에 공지되어 있다 (Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p46-47 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
임의의 척추동물 종의 항체 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(kappa) 및 람다(lambda)로 불리는 두 개의 명백하게 구분되는 유형 중 하나로 할당될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 분류로 할당될 수 있다. 온전한 항체의 다섯 개의 주요 분류, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하며, 이것들 중 다수는 하위 분류 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 더 나누어질 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 플렉시블 펩타이드 링커에 의해 단일 폴리펩타이드 사슬로 함께 연결된 VH 및 VL 항체 도메인의 융합 단백질을 말한다. 일부 구체예에서, Fv 폴리펩타이드 링커는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있게 한다. 일부 구체예에서, scFv는 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 또는 다른 디스플레이 방법과 함께 이용되는데 표면 구성원 (예를 들어, 파지 코팅 단백질)과 함께 발현될 수도 있고 주어진 항원에 대하여 높은 친화도의 펩타이드의 확인에 사용된다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위를 가진 작은 항체 단편을 말하며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 경쇄 가변 도메인 VL에 연결된 중쇄 가변 도메인 VH를 포함한다. 동일한 사슬 상의 두 개의 도메인 사이에서 쌍 형성(pairing)을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 두 개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 더 충분히 기술된다.
용어 "인트라바디"는 그것이 생산되는 세포로부터 분비되지 않지만, 대신에 하나 이상의 세포 내 단백질을 표적화하는 항체의 형태를 말한다. 인트라바디는, 제한되는 것은 아니지만, 세포 내 교환(trafficking), 전사, 번역, 대사 과정, 증식 신호 및 세포 분열을 포함하는 다수의 세포 과정에 영향을 미치기 위해 사용될 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 인트라바디-기반 요법을 포함할 수도 있다. 일부 이러한 구체예에서, 본원에서 개시된 가변 도메인 서열 및/또는 CDR 서열은 인트라바디-기반 요법을 위해 하나 이상의 구조체로 혼입될 수도 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 인트라바디는 하나 이상의 글리코실화된 세포 내 단백질을 표적화할 수도 있거나 또는 하나 이상의 글리코실화된 세포 내 단백질과 대안의 단백질 간의 상호작용을 조절할 수도 있다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 면역 효과기 세포의 표면 상에서 발현되도록 조작되어 인공적인 수용체에 높은 친화도로 결합하는 실체물을 발현하는 세포로의 이러한 면역 효과기 세포의 특이적 표적화를 유도하는 인공적인 수용체를 말한다. CAR은 이러한 CAR이 면역 효과기 세포 상에서 발현될 때, 면역 효과기 세포가 CAR의 항체 부분에 의해 인식되는 임의의 세포에 결합하여 이것들을 제거하도록 항체, 항체 가변 도메인 및/또는 항체 CDR의 하나 이상의 세그먼트를 포함하도록 디자인될 수도 있다. 어떤 경우에는, CAR은 암 세포에 특이적으로 결합하여, 암 세포의 면역-조절된 클리어런스를 유도하도록 디자인된다.
용어 "단클론성 항체"는 본원에서 사용된 바와 같이 실질적으로 균질한 세포 (또는 클론)의 집단으로부터 얻어진 항체를 말하며, 즉, 단클론성 항체의 생산 중에 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고, 집단을 구성하는 개개의 항체는 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정요인 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 조제물과 달리, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정요인에 대한 것이다.
수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻어지는 것으로서 항체의 특징을 나타내고, 어떤 특정한 방법에 의해서도 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에서 단클론성 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 분류 또는 하위 분류에 속한 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린)를 포함하는 한편, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 분류 또는 하위 분류에 속한 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다.
비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화된 항체는 수령체의 항체의 초가변영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 수용력을 가진, 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류 (공여체 항체)의 항체의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 인간화된 항체는 공여체 항체에서 발견되는 아미노산으로 하나 이상의 아미노산의 복귀를 포함하는 하나 이상의 역돌연변이를 포함할 수도 있다. 반대로, 인간화된 항체에 포함되는 공여체 항체의 잔기는 인간 수령체 항체에 존재하는 잔기와 일치하도록 돌연변이될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 항체 모방체일 수도 있다. 용어 "항체 모방체"는 항체의 기능 또는 효과를 모방하고 분자 표적에 특이적으로 및 높은 친화도로 결합하는 임의의 분자를 말한다. 일부 구체예에서, 항체 모방체는 단백질 스캐폴드(scaffold)로서 피브로넥틴 III형 도메인 (Fn3)을 포함하도록 디자인된 모노바디일 수도 있다 (US 6,673,901; US 6,348,584). 일부 구체예에서, 항체 모방체는 해당 분야에 공지된 것들일 수도 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 아피바디 분자, 아필린, 아피틴, 안티칼린, 아비머, DARPin, 피노머스(Fynomers)와 쿠니츠(Kunitz) 및 도메인 펩타이드를 포함한다. 다른 구체예에서, 항체 모방체는 하나 이상의 비-펩타이드 영역을 포함할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 변이체"는 항체와 구조, 서열 및/또는 기능이 비슷하지만, 또 다른 항체 또는 고유한 항체와 비교하여 아미노산 서열, 조성 또는 구조에서 약간의 차이점을 포함한 생체 분자를 말한다.
항체 개발
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 본원에서 기술된 것들과 같은 항원에 결합하도록 개발된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항원"은 유기체에서 면역 반응을 유도하거나 유발하는 실체물이다. 면역 반응은 외래 실체물의 존재에 대한 유기체의 세포, 조직 및/또는 장기의 반응을 특징으로 한다. 이러한 면역 반응은 전형적으로는 외래 실체물, 예를 들어, 항원 또는 항원의 일부에 대한 하나 이상의 항체의, 유기체에 의한 생산으로 이어진다. 어떤 경우에는, 면역화 방법은 하나 이상의 원하는 면역화 결과에 기초하여 변화될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역화 결과"는 면역화의 하나 이상의 원하는 효과를 말한다. 예는 관심있는 표적에 대한 높은 항체 역가 및/또는 증가된 항체 특이성을 포함한다.
본 발명의 항원은 글리칸, 당컨쥬게이트 (제한되는 것은 아니지만, 당단백질 및 당지질 포함), 펩타이드, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 또는 상기 언급된 것들 중 임의의 것을 포함할 수도 있고 하나 이상의 별도의 보조제 또는 이종성 단백질에 컨쥬게이션되거나 이것들과 복합체를 형성할 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 사용된 항원은 시알릴화된 글리칸, 예컨대 STn을 포함할 수도 있다. STn을 가진 항원은 뮤신을 포함할 수도 있다. 뮤신은 많이 글리코실화된 단백질의 패밀리이다. 그것들은 상피 세포로부터 기원한 다수의 종양의 구성요소이다 (Ishida, A. et al., 2008. Proteomics. 8: 3342-9 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 그것들은 턱밑샘에 의해 고도로 발현되고 타액 및 점액에서 높은 수준으로 발견될 수 있다. 동물-유래된 턱밑샘 뮤신은 면역원성 숙주에서 항-STn 항체를 생성하기 위한 항원으로 사용될 수도 있다. 상이한 종의 턱밑샘 뮤신은 AcSTn 대 GcSTn 형태에 관하여 STn 함유량이 상이하다. 돼지 턱밑샘 뮤신 (PSM)은 특히 GcSTn에서 풍부하며, 이것은 총 STn의 약 90%를 구성한다. 소 턱밑샘 뮤신 (BSM)의 STn은 대략 같은 퍼센트의 GcSTn 및 AcSTn을 포함한다. 양 턱밑샘 뮤신 (OSM)은 특히 AcSTn에서 풍부하며, 이것은 총 STn의 약 90%를 구성한다. 어떤 경우에는, 면역화를 위해 제조된 용액은 이러한 면역화로부터 발생하는 항체의 원하는 표적에 따라 PSM, BSM 및 OSM 중 하나 이상을 포함하도록 변형될 수도 있다. PSM은 면역원성 숙주에서 GcSTn에 특이적일 가능성이 더 큰 항체를 생성하기 위해 면역화에 사용될 수도 있다. PSM은 GcSTn으로 장식된 Neu5Gc-함유 뮤신형 당단백질에서 풍부하다. 현재 공지되어 있는 높은 Neu5Gc 함유량의 공급원 중에는 붉은 고기가 있고; 특히 턱밑샘은 높은 CMAH 효소 발현으로 인해 Neu5Gc의 풍부한 공급원으로 이전에 기술되어 있으며, 이것은 Neu5Gc 전구물질, CMP-Neu5Ac를 생산하기 위한 반응을 촉진한다. 어떤 경우에는, PSM은 팬-항-Neu5Gc 반응을 방지하고 GcSTn에 대하여 더 특이적인 면역 반응을 유도하는데 사용될 수도 있다. OSM은 면역원성 숙주에서 AcSTn에 특이적일 가능성이 항체를 생성하기 위한 면역화에 사용될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 GcSTn-특이적인 글리칸-상호작용 항체를 제공한다. 항체는 Neu5Ac-STn 또는 Tn에 대한 교차-반응성이 거의 없다. 항체는 GcSTn에 결합할 수 있지만 AcSTn에 대한 친화도는 감소된다.
일부 구체예에서, 항원은 면역원성 숙주에서 결과로 생성된 면역 반응을 조절하기 위해 면역화 전에 효소에 의해 소화될 수도 있다. 한 예에서, 턱밑샘 뮤신은 면역화 전에 트립신 또는 프로테이나아제 K 효소로 처리될 수도 있다. 이러한 효소의 활성은 분열하여 비-STn 에피토프의 퍼센트 및 가변성을 감소시키는 것을 도울 수도 있다. 글리칸 모이어티는 펩타이드의 영역을 보호할 수도 있는데 그것들은 효소에 의한 단백질 가수분해로부터 부착되어 온전하게 유지된다.
면역화로부터 초래된 항체 역가는 이러한 면역화에 사용된 항원의 유형 및 양에 따라 상이한 항체 수준을 가질 수도 있다. 어떤 경우에, 특정 항원은 면역화에서 사용을 위해 예상된 역가에 기초하여 선택될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "보조제"는 다른 작용제의 효과를 변형시키는 약리학적 또는 면역학적 작용제이다. 본 발명에 따르면 보조제는 화학적 조성물, 생체 분자, 치료제, 및/또는 치료 양생법을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 보조제는 프로인트 보조제(Freund's adjuvant) (완전 및/또는 불완전), 면역 자극 올리고뉴클레오타이드 [예를 들어 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ODN)], 미네랄-함유 조성물, 박테리아 ADP-리보실화 독소, 생체접착제, 점막접착제, 미세입자, 지질, 리포솜, 무라밀 펩타이드, N-산화된 폴리에틸렌-피페라진 유도체, 사포닌 및/또는 면역 자극 복합체 (ISCO)를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 보조제는 수중유(oil-in-water) 에멀젼 (예를 들어, 1마이크론 미만의 수중유 에멀젼)을 포함할 수도 있다. 본 발명에 따르면 보조제는 또한 미국 특허 공개 번호 US20120027813 및/또는 미국 특허 번호 US8506966 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들 중 어느 것도 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 해당 분야에 공지되어 있거나 본 출원에서 기술된 방법에 의해 생산된 다클론성 또는 단클론성 또는 재조합일 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 당업자에 의해 공지된 검출 가능한 라벨을 이용한 검출의 목적으로 라벨링될 수도 있다. 라벨은 방사성 동위원소, 형광 화합물, 화학 발광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자, 또는 해당 분야에 공지된 임의의 다른 라벨일 수 있다. 일부 양태에서, 원하는 항원에 결합하는 항체는 라벨링되지 않지만, 1차 항체에 특이적으로 결합하는 라벨링된 2차 항체의 결합에 의해 검출될 수도 있다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)는 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화된 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체), 세포 내로 제조된 항체 (즉, 인트라바디), 및 상기 중 어느 것의 에피토프-결합 단편을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 항체 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)는 조류와 포유류를 포함한 임의의 동물 기원일 수도 있다. 바람직하게는, 이러한 항체는 인간, 쥐 (예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말, 또는 닭 기원이다. 본 발명의 항체는 단일특이적 또는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적, 또는 더 큰 다중특이성)일 수도 있다. 다중특이적 항체는 본 발명의 표적 항원의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나, 또는 본 발명의 표적 항원, 및 이종성 에피토프, 예컨대 이종성 글리칸, 펩타이드 또는 고체 지지 재료 모두에 특이적일 수 있다 (예를 들어, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al., Trispecific F(ab')3 derivatives that use cooperative signaling via the TCR /CD3 complex and CD2 to activate and redirect resting cytotoxic T cells. J Immunol. 1991 Jul 1;147(1):60-9; 미국 특허 번호 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; 및 Kostelny, S.A. et al., Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J Immunol. 1992 Mar 1;148(5):1547-53 참조).
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 개발 중인 단클론성 항체에 대하여 해당 분야에 공지된 잘 확립된 방법을 사용하여 제조될 수도 있다. 한 구체예에서, 단클론성 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조된다 (Kohler, G. et al., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7). 하이브리도마 형성을 위해서, 먼저, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해서 전형적으로 면역화제 (예를 들어, 본 발명의 표적 항원)으로 면역화된다. 대안으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수도 있다. 이어서 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화된 세포주와 융합될 수도 있다 (Goding, J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press. 1986; 59-1031). 불멸화된 세포주는 보통 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 토끼, 소 및 인간 기원의 골수종(myeloma) 세포이다. 일반적으로는, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 이용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않고 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수도 있다. 예를 들어, 모체 세포에 효소 하이폭산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없으면, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로는 하이폭산틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 포함할 것이며 ("HAT 배지"), 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정하고 높은 발현 수준을 지지하고, 배지, 예컨대 HAT 배지에 민감한 것들이다. 더 바람직한 불멸화된 세포주는 쥐 골수종 라인이며, 이것은, 예를 들어, Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. 및 American Type Culture Collection, Manassas, Va로부터 얻어질 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종(heteromyeloma) 세포주가 또한 인간 단클론성 항체의 생산에 대하여 기술되어 있다 (Kozbor, D. et al., A human hybrid myeloma for production of human monoclonal antibodies. J Immunol. 1984 Dec;133(6):3001-5; Brodeur, B. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc., New York. 1987; 33:51-63).
일부 구체예에서, 골수종 세포는 유전적으로 조작될 수도 있다. 이러한 조작은 본원에서 기술된 바와 같이 징크-핑거 뉴클레아제 (zinc-finger nuclease: ZFN) 돌연변이 유발을 사용하여 수행될 수도 있다. 대안으로, 해당 분야에 공지된 트랜스펙션 방법이 사용될 수도 있다. NS0 골수종 세포 또는 다른 마우스 골수종 세포주가 사용될 수도 있다. 예를 들어, Sp2/0-Ag14는 하이브리도마 개발을 위한 대안의 세포주일 수 있다.
전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 (Transcription Activator-Like Effector Nuclease: TALEN)-유도된 유전자 편집은 대안의 유전자 넉아웃(knock out) 방법을 제공한다. TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 DNA 분열 도메인에 융합시켜 생성된 인공적인 제한 효소이다. ZFN과 유사하게, TALEN은 파괴 부위에서 삽입/결실을 수득하기 위해 오류가 발생하기 쉬운(error-prone) NHEJ에 의해 복원될 수 있는 원하는 유전자좌에서 이중 가닥 파괴를 유도한다 (Wood, A.J. et al., Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 2011 Jul 15;333(6040):307). Cellectis Bioresearch (Cambridge, MA)는 TALEN 디자인 및 플라스미드 구성의 서비스를 제공한다. 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 단클론성 항체의 존재에 대하여 분석될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론성 항체의 결합 특이성 (즉, 특이적 면역반응성)은 면역침강법에 의해 또는 방사 면역 분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역 흡착 분석 (ELISA)과 같은 시험관 내 결합 분석에 의해 결정된다. 이러한 기술 및 분석은 당업자에게 공지되어 있다. 단클론성 항체의 결합 특이성은, 예를 들어, Scatchard 분석에 의해 결정될 수 있다 (Munson, P.J. et al., Ligand : a versatile computerized approach for characterization of ligand -binding systems. Anal Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39). 어떤 경우에는, 항체 결합에 대하여 분석하기 전에 항원을 화학적으로 변형시킴으로써 주어진 항원의 영역에 대한 항체 특이성이 특성화될 수도 있다. 한 예에서, 페리오데이트 처리는 시알산의 C6 측쇄를 파괴하는데 사용될 수도 있다. 분석은 미처리 샘플에서 결합이 시알산-특이적인지 아닌지를 나타내기 위해 페리오데이트 처리 여부에 관계없이 실행될 수도 있다. 어떤 경우에는, 9-O-아세틸화된 시알산을 가진 항원은 9-O-아세틸 기를 파괴하기 위해 약염기 (예를 들어, 0.1 M NaOH)로 처리될 수도 있다. 분석은 미처리 샘플에서 결합이 시알산의 9-O-아세틸화에 의존하는지 아닌지를 나타내기 위해 약염기 처리 여부에 관계없이 실행될 수도 있다.
원하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장할 수도 있다. 이 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, Dulbecco's Modified Eagle's Medium 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안으로, 하이브리도마 세포는 포유류에서 복수로서 생체 내에서 성장할 수도 있다.
하이브리도마를 클로닝하기 위한 대안의 방법은, 하이브리도마 클론의 선택 및 성장을 지지하기 위해, 메틸셀룰로오스-기반 반고체 배지와 기타 배지 및 시약을 함유하는 STEMCELL Technologies (Vancouver, BC, Canada)의 키트, 예를 들어 ClonaCell™-HY 키트에 의해 제공된 것들을 포함할 수도 있다. 하지만, 이 키트의 배지는 Neu5Gc 혼입을 위한 외인성 공급원을 제공하는 FCS를 함유한다. 내인성 Neu5Gc 합성에 대한 기구는 Cmah -/- 하이브리도마에서 파괴되지만, 어떤 경우에는 배양 배지에 혼입된 Neu5Gc가 또한 문제를 제기할 수도 있다 (Bardor, M. et al., Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 2005. 280: 4228-4237). 이러한 경우에, 배양 배지는 대사 경쟁에 의한 Neu5Gc 혼입을 제거하기 위해 Neu5Ac로 보충될 수도 있다 (Ghaderi, D. et al., Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 2010. 28: 863-867).
서브클론에 의해 분비된 단클론성 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로오스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수 유체로부터 단리되거나 정제될 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 단클론성 항체는 또한 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,816,567 (전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차에 의해 (예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 DNA의 바람직한 공급원의 역할을 한다. 단리되면, DNA는 발현 벡터로 배치될 수 있으며, 이것은 숙주 세포에 트랜스펙션된다. 숙주 세포는 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 획득하기 위해, 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는 HEK293 세포, HEK293T 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 및 골수종 세포를 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. DNA는 또한, 예를 들어, 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호화 서열을 치환함으로써 (미국 특허 번호 4,816,567) 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열 모두 또는 일부를 면역글로불린 암호화 서열에 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 키메라 2가 항체를 생성하기 위해 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대하여 치환될 수 있거나, 또는 본 발명의 항체의 하나의 항원-조합 부위의 가변 도메인에 대하여 치환될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)는 당업자에 의해 공지된 다양한 절차에 의해 생산될 수도 있다. 생체 내에서 다클론성 항체의 생산을 위해서, 숙주 동물, 예컨대 토끼, 래트, 마우스, 젖소, 말, 당나귀, 닭, 원숭이, 양 또는 염소는, 예를 들어, 복강내 및/또는 피부내 주사에 의해 유리 또는 담체-커플링된 항원으로 면역화된다. 일부 구체예에서, 주사 재료는 항원 또는 담체 단백질 약 100 μg을 함유하는 에멀젼일 수도 있다. 일부 구체예에서, 주사 재료는 글리칸-풍부 조성물, 예컨대 용액 중의 비-인간 포유류 턱밑샘 뮤신을 포함할 수도 있다. 숙주 종에 따라 다양한 보조제가 또한 면역학적 반응을 증가시키는데 사용될 수 있다. 보조제는 프로인트 (완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드, 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다음이온, 펩타이드, 유성 에멀젼, TiterMax® (CytRx Corp, Los Angeles, CA), 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 보조제, 예컨대 BCG (바실리 칼메트-게랑(bacille Calmette-Guerin)) 및 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 보조제는 또한 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 고체 표면에 흡착된 글리칸 및/또는 유리 펩타이드를 사용한 ELISA 분석에 의해 검출될 수 있는 항체의 유용한 역가를 제공하기 위해, 여러 부스터(booster) 주사가, 예를 들어, 약 2주의 간격으로 필요할 수도 있다. 면역화된 동물의 혈청에서 항체의 역가는 항체의 선택에 의해, 예를 들어, 고체 지지체로의 항원의 흡착 및 해당 분야에 널리 공지된 방법에 따라 선택된 항체의 용출에 의해 증가될 수 있다.
글리칸-상호작용 항체, 이것의 변이체 및 단편은 고처리량 발견 방법을 사용하여 선택되고 생산될 수도 있다. 한 구체예에서, 합성 항체, 그것의 변이체 및 단편을 포함하는 글리칸-상호작용 항체는 디스플레이 라이브러리의 사용을 통해 생산된다. 용어 "디스플레이"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 주어진 숙주의 표면 상에서 단백질 또는 펩타이드의 발현 또는 "디스플레이"를 말한다. 용어 "라이브러리"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 고유의 cDNA 서열 및/또는 그것들에 의해 암호화되는 단백질의 컬렉션을 말한다. 라이브러리는 최소한 두 개의 고유의 cDNA부터 수천 억 개의 고유의 cDNA를 함유할 수도 있다. 일부 구체예에서, 합성 항체인 글리칸-상호작용 항체는 항체 디스플레이 라이브러리 또는 항체 단편 디스플레이 라이브러리를 사용하여 생산된다. 용어 "항체 단편 디스플레이 라이브러리"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 각각의 구성원이 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 함유하는 항체 단편을 암호화하는 디스플레이 라이브러리를 말한다. 이러한 항체 단편은 바람직하게는 Fab 단편이지만, 다른 항체 단편, 예컨대 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이 또한 고려된다. Fab 항체 단편 라이브러리에서, 암호화된 각각의 Fab는 Fab 단편의 상보성 결정 영역 (CDR)의 가변 루프 내에 함유된 아미노산 서열을 제외하면 동일할 수도 있다. 대안의 또는 추가의 구체예에서, 개개의 VH 및/또는 VL 영역 내의 아미노산 서열이 또한 상이할 수도 있다.
디스플레이 라이브러리는, 제한되는 것은 아니지만, 효모, 박테리오파지, 박테리아 및 레트로바이러스(retrovirus)를 포함한 많은 가능한 숙주에서 발현될 수도 있다. 사용될 수도 있는 추가적인 디스플레이 기술은 리보솜-디스플레이, 마이크로비드-디스플레이 및 단백질-DNA 연결 기술을 포함한다. 바람직한 구체예에서, Fab 디스플레이 라이브러리는 효모 또는 박테리오파지 (본원에서 "파지" 또는 "파지 입자"라고도 불림)에서 발현된다. 발현될 때, Fab는 주어진 항원과 상호작용할 수 있는 파지 또는 효모의 표면을 장식한다. 글리칸을 포함하는 항원 또는 원하는 표적의 다른 항원은 상기 항원에 대하여 가장 높은 친화도로 항체 단편을 발현하는 파지 입자 또는 효모 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 결합된 항체 단편의 CDR을 암호화하는 DNA 서열은 결합된 입자 또는 세포를 사용하는 시퀀싱을 통해 결정될 수 있다. 한 구체예에서, 양성 선택은 항체의 개발에 사용된다. 일부 구체예에서, 음성 선택은 항체의 개발에 이용된다. 일부 구체예에서, 양성 및 음성 선택 방법 모두는 디스플레이 라이브러리를 사용한 항체의 개발시 다수의 선택 라운드 동안에 이용된다.
효모 디스플레이에서, 상이한 항체 단편을 암호화하는 cDNA는 Chao, 등에 의해 기술된 바와 같이 그것들이 발현되고 항체 단편이 세포 표면 상에 "디스플레이"되는 효모 세포로 도입된다 (Chao, G. et al., Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68). 효모 표면 디스플레이에서, 발현된 항체 단편은 효모 아글루티닌 단백질, Aga2p를 포함하는 추가적인 도메인을 함유할 수도 있다. 이 도메인은 항체 단편 융합 단백질을 표면-발현된 Aga1p와 이황화 결합의 형성을 통해 효모 세포의 외표면에 부착시킨다. 결과는 특정 항체 단편으로 코팅된 효모 세포이다. 이들 항체 단편을 암호화하는 cDNA의 디스플레이 라이브러리는 초기에 이용되며 여기서 항체 단편은 각각 고유의 서열을 갖는다. 이들 융합 단백질은 세포와 함께 인큐베이션된 원하는 항원성 표적 항원과 상호작용할 수 있는 수백만 개의 효모 세포의 세포 표면 상에서 발현된다. 적합한 항체 단편과의 성공적인 결합이 일어난 후 효과적인 세포 분류를 허용하는 화학적 또는 자성 기를 가진 표적 항원은 공유적으로 또는 달리 변형될 수도 있다. 회복은 자기-활성화 세포 분류 (MACS), 형광 발광-활성화된 세포 분류 (FACS) 또는 해당 분야에 공지된 다른 세포 분류에 의해 이루어질 수도 있다. 효모 세포의 하위 집단이 선택되면, 상응하는 플라스미드가 분석되어 CDR 서열을 결정할 수도 있다.
박테리오파지 디스플레이 기술은 전형적으로는, 제한되는 것은 아니지만, fd, F1 및 M13 비리온을 포함한 사상 파지를 이용한다. 이러한 계통은 비-용해성이어서, 숙주를 지속적으로 증식시키고 바이러스 역가를 증가시킨다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 Miersch, et al. (Miersch, S. et al., Synthetic antibodies: Concepts, potential and practical considerations. Methods. 2012 Aug; 57(4):486-98), Bradbury et al. (Bradbury, A.R. et al., Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat Biotechnol. 2011 Mar;29(3):245-54), Brinkman et al. (Brinkmann, U. et al., Phage display of disulfide-stabilized Fv fragments. J Immunol Methods. 1995 May 11; 182(1):41-50); Ames et al. (Ames, R.S. et al., Conversion of murine Fabs isolated from a combinatorial phage display library to full length immunoglubulins. J Immunol Methods. 1995 Aug 18;184(2):177-86); Kettleborough et al. (Kettleborough, C.A. et al., Isolation of tumor cell-specific single-chain Fv from immunized mice using phage-antibody libraries and the re-construction of whole antibodies from these antibody fragments. Eur J Immunol. 1994 Apr; 24(4):952-8); Persic et al. (Persic, L. et al., An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries. Gene. 1997 Mar 10; 187(1):9-18); PCT 출원 번호 PCT/GB91/01134; PCT 공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 번호 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108 (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 것들을 포함한다. 박테리오파지 상에서의 항체 단편 발현은 단백질을 암호화하는 cDNA를 바이러스 코팅 단백질을 발현하는 유전자에 삽입함으로써 수행될 수도 있다. 사상 박테리오파지의 바이러스 코팅은 단일 가닥 게놈에 의해 암호화된 다섯 개의 코팅 단백질로 구성된다. 코팅 단백질 pIII는, 전형적으로는 N-말단에서, 항체 단편 발현에 바람직한 단백질이다. 항체 단편 발현이 pIII의 기능을 포함하면, 바이러스 기능은 야생형 pIII의 동시 발현을 통해 복원될 수 있더라도, 이러한 발현은 바이러스 코팅에서 발현된 항체 단편의 개수를 감소시키지만, 표적 항원에 의한 항체 단편으로의 접근을 향상시킬 수도 있다. 바이러스, 뿐만 아니라 항체 단편 단백질의 발현은 대안으로 다수의 플라스미드 상에서 암호화될 수도 있다. 이 방법은 감염성 플라스미드의 전체 크기를 감소시키고 형질전환 효율을 향상시키는데 사용될 수도 있다.
상기 기술된 바와 같이, 고 친화도 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)를 발현하는 숙주의 선택 이후, 항체 또는 항체 단편의 암호화 영역은, 예를 들어, 하기 더 상세히 기술된 바와 같이 인간 항체를 포함한 전체 항체, 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 포함한 전체 항체를 생성하기 위해 단리되고 사용될 수 있으며, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함한 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다.
고 친화도 항체를 암호화하는 DNA 서열은 친화도 성숙화로 알려져 있는 공정에서 추가적인 선택 라운드를 위해 돌연변이될 수 있다. 용어 "친화도 성숙화"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 항체- 또는 항체 단편-암호화 cDNA 서열의 돌연변이 및 선택의 연속적인 라운드를 통해 주어진 항원에 대하여 증가하는 친화도를 가진 항체가 생산되는 방법을 말한다. 어떤 경우에는, 이 공정은 시험관 내에서 수행된다. 이것을 달성하기 위해서, CDR 암호화 서열의 증폭은, 제한되는 것은 아니지만, 점 돌연변이, 국부적 돌연변이, 삽입 돌연변이 및 결실 돌연변이를 포함한 돌연변이를 함유하는 수백만 개의 카피를 생산하기 위해서 오류-유발 PCR을 사용하여 수행될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "점 돌연변이"는 뉴클레오타이드 서열 내에서 하나의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드로 변화된 핵산 돌연변이를 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "국부적 돌연변이"는 둘 이상의 연이은 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드로 변화된 핵산 돌연변이를 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "삽입 돌연변이"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열로 삽입된 핵산 돌연변이를 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결실 돌연변이"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열로부터 제거된 핵산 돌연변이를 말한다. 삽입 또는 결실 돌연변이는 전체 코돈의 완전한 대체 또는 시작 코돈의 한 개 또는 두 개의 뉴클레오타이드의 변화에 의한 한 코돈의 다른 코돈으로의 변화를 포함할 수도 있다.
CDR 중쇄 및 경쇄 영역에서 단일 돌연변이를 가진 수백만 개의 돌연변이를 생성하기 위해 CDR-암호화 cDNA 서열에서 돌연변이 유발이 수행될 수도 있다. 또 다른 접근법에서, 무작위 돌연변이는 친화도를 개선할 가능성이 가장 큰 CDR 잔기에만 도입된다. 이들 새롭게 생성된 돌연변이 유발성 라이브러리는 표적 항원에 대하여 더 높은 친화도로 항체 단편을 암호화하는 클론에 대하여 스크리닝하는 공정을 반복하는데 사용될 수 있다. 연속적인 돌연변이 및 선택 라운드는 점점 더 큰 친화도로 클론의 합성을 촉진한다 (Chao, G. et al., Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68).
항체 및 항체 단편, 예컨대 Fab 및 scFv를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,258, 498; Miersch et al. (Miersch, S. et al., Synthetic antibodies: Concepts, potential and practical considerations. Methods. 2012 Aug;57(4):486-98), Chao et al. (Chao, G. et al., Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68), Huston et al. (Huston, J.S. et al., Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins. Methods Enzymol. 1991;203:46-88); Shu et al. (Shu, L. et al., Secretion of a single-gene-encoded immunoglobulin from myeloma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Sep 1;90(17):7995-9); 및 Skerra et al. (Skerra, A. et al., Assembly of a functional immunoglubulin Fv fragment in Escherichia coli. Science. 1988 May 20;240(4855):1038-41) (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들을 포함한다.
인간에서 항체 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)의 생체 내 사용 및 시험관 내 검출 분석을 포함한 일부 용도에 대해서, 키메라, 인간화된, 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥐 단클론성 면역글로불린 및 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터 유래된 가변 영역을 가진 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다 (Morrison, S.L., Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science. 1985 Sep 20;229(4719):1202-7; Gillies, S.D. et al., High-level expression of chimeric antibodies using adapted cDNA variable region cassettes. J Immunol Methods. 1989 Dec 20;125(1-2):191-202.; 및 미국 특허 번호 5,807, 715; 4,816,567; 및 4,816,397 (이것들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
인간화된 항체는 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종의 항체 분자이고 비인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)과 인간 면역글로불린 분자의 프레임워크 영역을 갖는다. 때때로, 인간 프레임워크 영역 내 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변화시키고, 바람직하게는 이것을 개선하기 위해 공여체 항체의 CDR 및 프레임워크 영역의 상응하는 잔기로 치환된다. 이들 프레임워크 치환은 해당 분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링함으로써, 및 특정 위치에서 이한한 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 서열 비교함으로써 확인된다 (미국 특허 번호 5,693,762 및 5,585, 089; Riechmann, L. et al., Reshaping human antibodies for therapy. Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7 (이것들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 항체는, 예를 들어, CDR-이식 (EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089); 베니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, E.A., A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand -binding properties. Mol Immunol. 1991 Apr-May;28(4-5):489-98; Studnicka, G.M. et al., Human-engineered monoclonal antibodies retain full specific binding activity by preserving non-CDR complementarity-modulating residues. Protein Eng. 1994 Jun;7(6):805-14; Roguska, M.A. et al., Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1;91(3):969-73); 및 사슬 셔플링(shuffling) (미국 특허 번호 5,565,332); (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 포함한, 해당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 원하는 결합 특이성, 보체-의존적 세포독성, 및 항체-의존적 세포-매개된 세포독성, 등을 위해 본 발명의 인간화된 항체가 개발될 수도 있다.
어떤 경우에는, 인간 프레임워크는 높은 수준의 상동성을 가진 인간 프레임워크 후보를 발견하기 위해 인간 프레임워크 서열과 함께 공여체 항체 서열의 정렬에 의해 선택된다. 어떤 경우에는, 프레임워크 영역은 하나 이상의 인간 프레임워크 후보로부터 선택될 수 있다 (예를 들어, 프레임워크 영역 1-3은 하나의 후보로부터 선택될 수도 있고 프레임워크 영역 4는 대안의 후보로부터 선택될 수도 있다). 어떤 경우에는, 프레임워크 영역은 체세포 돌연변이에 의해 생성된 면역원성 에피토프를 포함할 위험을 방지하기 위해 인간 공통 서열로부터 선택될 수도 있다. 많은 서열을 비교하고 각각의 위치에서 가장 흔하게 발생하는 잔기를 채택함으로써 공통 서열이 형성된다. 어떤 경우에는, 인간 프레임워크는 인간 생식계열 서열로부터 선택될 수도 있다. 이것들은 데이터베이스 탐색을 통해 (예를 들어, NCBI 단백질 데이터베이스 또는 기타 데이터베이스를 사용하여) 확인될 수도 있다.
경쇄 및 중쇄 인간 프레임워크는 동일한 또는 상이한 클론으로부터 선택될 수도 있다. 동일한 클론으로부터 유래된 경쇄 및 중쇄는 기능적인 결합 부위를 형성하기 위해 회합할 가능성이 더 크지만; 중쇄 및 경쇄 사이의 계면의 보존된 성질은 전형적으로 상이한 클론의 경쇄 및 중쇄를 회합하게 하고 기능적이게 한다. 인간 경쇄와 중쇄 프레임워크 간의 쌍 형성 빈도는, 예를 들어, Tiller et al., 2013. MAbs. 5(3): 445-70 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 검토될 수 있다.
인간화된 항체 서열의 잔기는 "역돌연변이"가 인간화 동안에 손실된 항체 친화도를 개선하거나 회복시키는 것으로 간주될 수도 있다. 역돌연변이는 인간화 동안에 변화된 잔기를 다시 원래의 비-인간 항체 서열에 존재하는 것으로 변화시키는 것을 수반한다. 역돌연변이에 대한 후보인 잔기는, 예를 들어, 기본형 항체 구조에서 발견되는 표준 입체구조와 비교하여 확인될 수 있다 (Al-Lazikani, et al., 1997. J. Mol. Biol. 273: 927-48 참조 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 비정상적인 기본형 잔기가 확인되고 역돌연변이에 대하여 표적화될 수도 있다. 어떤 경우에는, 역돌연변이에 대한 후보인 잔기는 CDR과 접촉된 잔기를 지칭하는데 사용된 용어인 "버니어(Vernier) 잔기"일 수도 있다. 이들 잔기는 CDR 위치 결정(positioning) 및 입체구조에 영향을 줄 가능성이 더 크며, 그러므로 항체 친화도 및/또는 특이성에 영향을 줄 가능성이 더 크다 (Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 6, p117). 어떤 경우에는, 인간 프레임워크 영역은 불변인 상태로 유지되고 공여체 항체의 CDR은 인간 CDR 영역에 적합하도록 역돌연변이되는 한편 경험적 방법을 통해 결합을 유지한다.
완전한 인간 항체 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)가 외래 단백질에 대한 면역 반응을 방지하거나 경감하기 위해 인간 환자의 치료적 처리에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열으로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하여, 상기 기술된 항체 디스플레이 방법을 포함한, 해당 분야에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741 참조 (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
인간 항체 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 인간 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드 복합체는 무작위로, 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포로 도입될 수 있다. 대안으로, 인간 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오타이드 외에도, 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포로 도입될 수도 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별개로 또는 이와 동시에 비기능적이게 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포는 확장되고 키메라 마우스를 생산하기 위해 배반포에 미량 주사된다. 키메라 마우스가 교배되어 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생산한다. 트랜스제닉 마우스는 일반적인 방식으로 선택된 항원, 예를 들어, 본 발명의 글리칸, 당컨쥬게이트 및/또는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부로 면역화된다.
따라서, 이러한 기술을 사용하여, 유용한 인간 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 기술의 개요를 설명하기 위해서, Lonberg 및 Huszar (Lonberg, N. et al., Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93)를 참조하면 된다. 인간 항체 및 인간 단클론성 항체를 생산하기 위한 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해서, 예를 들어, PCT 공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 번호 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 5,939,598; 6,075,181; 및 6,114,598 참조 (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 이에 더하여, Abgenix, Inc. (Fremont, Calif.), Protein Design Labs, Inc. (Mountain View, Calif.) 및 Genpharm (San Jose, Calif.)과 같은 회사들이 상기 기술된 기술과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하는데 관여될 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 동물, 세포주에 의해 생산되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 재조합으로 발현되면, 그것은 면역글로불린 또는 폴리펩타이드 분자의 정제를 위해 해당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 특이적 항원, 단백질 A에 대한 친화도, 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제 (즉, 단리)될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 항체 또는 그것의 단편은 정제를 용이하게 하도록 본원에서 기술된 또는 그렇지 않으면 해당 분야에 공지된 이종성 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
항체와 표적 또는 리간드 (예컨대 주어진 항체를 생성하는데 사용된 항원) 사이의 친화도는 본원에서 기술된 하나 이상의 결합 분석을 사용하여 KD에 관하여 측정될 수도 있다. 주어진 항체에 대하여 원하는 용처에 따라, 다양한 KD 값이 바람직할 수도 있다. 고 친화도 항체는 전형적으로는 약 10-5 M 이하, 예를 들어 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하 또는 약 10-12 M 이하의 KD로 리간드 결합을 형성한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 반 최대 효과 또는 억제 농도 (각각 EC50 또는 IC50)에 따라 특성화될 수도 있다. 어떤 경우에는, 이 값은 가장 높은 농도의 항체로 관찰된 최대 억제의 절반과 동일한 수준으로 STn을 발현하는 세포를 억제하는데 (예를 들어, 살해하고, 증식을 감소시키고 및/또는 하나 이상의 세포 기능을 감소시키는데) 필요한 항체의 농도를 나타낼 수도 있다. 이러한 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 0.01 nM, 약 0.005 nM 내지 약 0.05 nM, 약 0.01 nM 내지 약 1 nM, 약 0.05 nM 내지 약 5 nM, 약 0.1 nM 내지 약 10 nM, 약 0.5 nM 내지 약 25 nM, 약 1 nM 내지 약 50 nM, 약 5 nM 내지 약 75 nM, 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 25 nM 내지 약 250 nM, 약 200 nM 내지 약 1000 nM 또는 1000 nM 초과일 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 교시된 항체는 환자-유래된 암 세포 및/또는 암 줄기 세포 (CSC)를 표적화할 수 있는 능력에 대하여 테스트될 수도 있다. 이러한 구체예에 따르면, 환자-유래된 암 세포는 시험관 내에서 배양될 수도 있고 본 발명의 항체는 이러한 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 환자-유래된 종양 세포 또는 종양 단편은 환자-유래된 이종 이식 (PDX) 종양을 생산하는데 사용될 수도 있다. 어떤 경우에는, 조직 구조로 유지되는 1차 또는 전이성 고체 종양의 조각은 수술 또는 생검 절차에 의해 수집될 수도 있다. 어떤 경우에는, 악성 복수 또는 흉막 삼출액으로부터 빼낸 유체가 사용될 수도 있다. 종양은 단독으로 또는 MATRIGEL® (Corning Life Sciences, Corning, NY)로 코팅된 일부 연구에서 조각 또는 단일 세포 현탁액으로서 이식될 수도 있거나 또는 인간 섬유아세포 또는 중간엽 줄기 세포와 혼합될 수도 있다. 이식 부위는 마우스의 등 영역을 포함할 수도 있지만 (피하 이식), 원래의 종양과 동일한 기관에서의 이식은 옵션일 수도 있다 (정위 이식, 즉, 췌장, 구강, 난소, 유선 지방 패드, 뇌, 등). 이에 더하여, 종양 기원과 독립적으로, 일부 접근법은 이식 성공률을 증가시키려는 노력으로 신피막에서 1차 종양을 이식하는 것을 포함할 수도 있다. 상이한 정도로 면역 억제되는 다양한 마우스 계통이 이러한 연구에 사용될 수도 있다. 호르몬 민감성 종양에 대해서, 일부 연구는 이식률을 증가시키려는 의도로 호르몬 보충을 사용할 수도 있다. 일부 구체예에서, PDX 종양은 비-비만성 당뇨형/중증 복합형 면역 결핍 (NOD/SCID) 마우스에서 생성될 수도 있다. 항체는 PDX 종양을 가진 마우스에 투여될 수도 있고 종양 부피에 대한 노력이 분석될 수도 있다. 어떤 경우에는, PDX 종양은 절개되고, 세포 해리될 수도 있으며, 결과로 생성된 세포는 배양물에서 키워진다. 이들 세포를 표적화할 수 있는 본 발명의 항체의 능력은 시험관 내에서 평가될 수도 있다.
단클론성이든 다클론성이든, 항체의 제조는 해당 분야에 공지되어 있다. 항체의 생산 기술은 해당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 및 Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기술되어 있다.
표적
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 하나 이상의 글리칸 또는 글리칸-관련된 또는 글리칸-관련된 표적으로의 결합 (가역적 또는 비가역적)을 통해 효과를 발휘할 수도 있다. 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 본원에서 교시된 표적의 임의의 영역으로부터 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 표적은 글리칸을 포함한다. 항체를 생성하는데 사용된 글리칸은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개 잔기를 가진 당의 사슬을 포함할 수도 있다. 항체를 생성하는데 사용된 일부 글리칸은 약 2개의 잔기 내지 약 5개의 잔기를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체 표적 항원은 시알산을 포함한다. N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac) 및 N-글리콜릴뉴라민산 (Neu5Gc)은 포유류 세포 표면 상의 주요 시알산이다. 이것들 중에서, Neu5Ac는 인간에서 자연적으로 생산된다. Neu5Gc는 CMP-Neu5Ac로부터 CMP-Neu5Gc 생산의 원인이 되는 시티딘 모노포스페이트 (CMP)-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라아제 (CMAH) 유전자의 돌연변이로 인해 인간을 제외한 대부분의 포유류에서 자연적으로 생산된다. 인간에서 Neu5Gc는 사실상 면역원성이며 거의 모든 인간은 항-Neu5Gc 항체를 발현한다. 생산 부족에도, 대부분의 인간 시스템은 식이 요법으로 인해 어느 수준의 Neu5Gc를 포함한다. 이들 외래 생성물은 이후에 인간 당단백질에 혼입된다. 이러한 당단백질이 본 발명의 표적으로서 고려된다.
본 발명의 글리칸 표적 항원은 표 1에 나열된 것들을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 사용된 약어는 다음을 포함한다: Glc - 글루코오스, Gal - 갈락토오스, GlcNAc - N-아세틸글루코사민, GalNAc - N-아세틸갈락토사민, GlcNAc6S - 6-설포-N-아세틸글루코사민, KDN - 2-케토-3-데옥시-D-글리세로-D-갈락토노논산, Neu5,9Ac2 - N-아세틸-9-O-아세틸뉴라민산, Fuc - 푸코오스 및 Neu5GcOMe - 2-O-메틸-N-글리콜릴뉴라민산. O-글리코시드 결합은 결합에 의해 결합된 두 개의 잔기 사이의 상대적인 화학량론을 나타내는 α 및 β와 함께 나열된 글리칸에서 각 잔기 사이에 존재하며, α는 축방향 배향을 나타내고 β는 수평 배향을 나타낸다. x,x, 포맷으로 된 α 및/또는 β 다음의 숫자는 결합 형성에 참여하는 각각의 인접한 잔기의 각각의 탄소의 탄소수를 나타낸다. 나열된 글리칸은 고려된 개개의 글리칸 표적 항원을 나타내는 한편, 본 발명은 또한 상기 제공된 글리칸이 제공된 것들과 상이한 α 및 β-배향된 O-글리코시드 결합의 조합을 포함하는 구체예를 포함한다. "R"은 글리칸이 커플링될 수도 있는 실체물을 나타낸다. 일부 구체예에서, R은 글리칸이 전형적으로는 세린 또는 트레오닌 잔기에 연결된 단백질이다. 일부 구체예에서, R은 글리칸 어레이에서와 같이, 글리칸을 기질에 결합시키는데 사용된 링커 분자이다. 일부 구체예에서, R은 -(CH2)2CH2NH2 또는 -(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2의 식을 가진 링커일 수도 있다. 일부 구체예에서, R은 비오틴, 알부민, ProNH2, -CH-, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -H, 하이드리도, 하이드록시, 알콕실, 산소, 탄소, 황, 질소, 폴리아크릴아미드, 인, NH2, ProNH2=O(CH2)2CH2NH2, (OCH2CH2)6NH2, O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2, 형광 라벨 2-아미노벤즈아미드 (AB) 및/또는 2-아미노벤조산 (AA), 알킬 아민 (AEAB)을 함유하는 2-아미노벤즈아미드 유사체, 아미노옥시- 기, 메틸아미노옥시 기, 히드라지드 기, 아미노 지질 1,2-디헥사데실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DHPE), 아미노옥시 (AO) 기능화된 DHPE 및 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI)일 수도 있다. R의 공급원 또는 성질을 제한하려는 의도 없이, 이것은 글리칸 잔기의 물리적 간격에 영향을 주는 구조를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, R 기는 본원에서 제공된 R 기, 예를 들어, 비오티닐화된 폴리아크릴아미드의 조합을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 아래 기질과 조합된 R 기는 글리칸 잔기 간격에 영향을 줄 수도 있다.
글리칸 표적 항원
글리칸
GalNAcα-R
Galα1,3Galβ1,4GlcNAcβ-R
Galβ1,3GalNAcβ-R
Galβ1,3GlcNAcα-R
Galβ1,3GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glcβ-R
Galβ1,3GlcNAcβ-R
Galβ1,4GlcNAc6Sβ-R
Galβ1,4GlcNAcβ-R
Galβ1,4Glcβ-R
KDNα2,8Neu5Acα2,3Galβ1,4Glcβ-R
KDNα2,8Neu5Gcα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5,9Ac2α2,3Galβ1,3GalNAcα-R
Neu5,9Ac2α2,3Galβ1,3GalNAcβ-R
Neu5,9Ac2α2,3Galβ1,3GlcNAcβ-R
Neu5,9Ac2α2,3Galβ1,4GlcNAcβ-R
Neu5,9Ac2α2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5,9Ac2α2,3Galβ-R
Neu5,9Ac2α2,6GalNAcα-R
Neu5,9Ac2α2,6Galβ1,4GlcNAcβ-R
Neu5,9Ac2α2,6Galβ1,4Glcβ-R
Neu5,9Ac2α2,6Galβ-R
Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAcα-R
Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAcβ-R
Neu5Acα2,3Galβ1,3GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,3Galβ1,3GlcNAcβ-R
Neu5Acα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc6Sβ-R
Neu5Acα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ-R
Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAc6Sβ-R
Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAcβ-R
Neu5Acα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,3Galβ-R
Neu5Acα2,6(KDNα2,3)Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,6(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,6(Neu5Gcα2,3)Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,6GalNAcα-R
Neu5Acα2,6Galβ1,4GlcNAcβ-R
Neu5Acα2,6Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,6Galβ-R
Neu5Acα2,8KDNα2,6Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,8Neu5Acα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,8Neu5Acα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,8Neu5Acα2,6Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,8Neu5Acα2,8Neu5Acα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,8Neu5Acα2,8Neu5Acα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,8Neu5Gcα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Acα2,8Neu5Gcα2,6Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Gc9Acα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Gc9Acα2,6Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Gc9Acα2,3Galβ1,3GalNAcα-R
Neu5Gc9Acα2,3Galβ1,3GalNAcβ-R
Neu5Gc9Acα2,3Galβ1,3GlcNAcβ-R
Neu5Gc9Acα2,3Galβ1,4GlcNAcβ-R
Neu5Gc9Acα2,3Galβ-R
Neu5Gc9Acα2,6GalNAcα-R
Neu5Gc9Acα2,6Galβ1,4GlcNAcβ-R
Neu5Gc9Acα2,6Galβ-R
Neu5GcOMeα2,8Neu5Acα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Gcα2,3Galβ1,3GalNAcα-R
Neu5Gcα2,3Galβ1,3GalNAcβ-R
Neu5Gcα2,3Galβ1,3GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Gcα2,3Galβ1,3GlcNAcβ-R
Neu5Gcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc6Sβ-R
Neu5Gcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ-R
Neu5Gcα2,3Galβ1,4GlcNAc6Sβ-R
Neu5Gcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ-R
Neu5Gcα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Gcα2,3Galβ-R
Neu5Gcα2,6GalNAcα-R
Neu5Gcα2,6Galβ1,4GlcNAcβ-R
Neu5Gcα2,6Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Gcα2,6Galβ-R
Neu5Gcα2,8Neu5Acα2,3Galβ1,4Glcβ-R
Neu5Gcα2,8Neu5Gcα2,3Galβ1,4Glcβ-R
본 발명의 글리칸 표적은 하나 이상의 항체 인식 영역을 포함할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 인식 영역"은 분자의 임의의 부분, 부착된 기에 위치한 또는 글리칸과, 제한되는 것은 아니지만, 또 다른 글리칸, 단백질, 막, 세포 표면 구조, 또는 세포 외 매트릭스 구성요소를 포함하는 또 다른 분자 사이의 상호작용 영역에 위치한 세그먼트를 말한다. 일부 구체예에서, 항체 인식 영역은 사슬 간 표적 부위에 위치하며, 용어 "사슬 간"은 폴리머 사슬 내를 의미한다. 사슬 간 표적 부위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 적어도 10개의 잔기, 잔기 사이의 결합 또는 잔기와 결합의 조합을 가진 항체 인식 영역을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 항체 인식 영역은 하나 이상의 글리칸 사슬 사이의 상호작용 영역에 위치한다. 이러한 영역은 2, 3, 4 또는 적어도 5개의 글리칸 사슬 사이에 있을 수도 있다.
일부 구체예에서, 항체 인식 영역은 공통의 모체 사슬에 연결된 글리칸 분지 사슬 사이의 상호작용 영역에 위치한다. 일부 구체예에서, 항체 인식 영역은 글리칸 분지 사슬과 모체 사슬 사이의 상호작용 영역에 위치한다. 일부 구체예에서, 항체 인식 영역은 글리칸과 단백질 사이의 상호작용 영역에 위치한다. 이러한 상호작용 영역은, 제한되는 것은 아니지만, 공여 결합, 이온 결합, 유체 정역학적 결합(hydrostatic bond), 소수성 결합 및 수소 결합을 포함하는, 글리칸과 단백질 사이의 화학 결합을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 항체 인식 영역은 글리칸과, 제한되는 것은 아니지만, 지질 및 핵산을 포함한, 다른 생체 분자 사이의 상호작용 영역에 위치한다. 이러한 상호작용 영역은, 제한되는 것은 아니지만, 공유 결합, 이온 결합, 유체 정역학적 결합, 소수성 결합 및 수소 결합을 포함하는, 글리칸과 생체 분자 사이에서 화학 결합을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸 표적은 당컨쥬게이트의 구성요소이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "당컨쥬게이트"는 글리칸 모이어티와 결합된 임의의 실체물을 말한다. 일부 구체예에서, 당컨쥬게이트는 당지질이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "당지질"은 탄수화물 모이어티가 공유 부착된 지질의 분류를 말한다. 일부 구체예에서, 당지질 상에 존재하는 탄수화물 모이어티는 글리칸일 수도 있다. 일부 구체예에서, 당지질의 지질 구성요소는 세라미드 모이어티를 포함한다. 본 발명의 표적으로서 고려되는 당지질의 예는 글리세로당지질 (제한되는 것은 아니지만, 갈락토지질 및 설포지질 포함), 당스핑고지질 (제한되는 것은 아니지만, 세레브로사이드 (예를 들어, 갈락토세레브로사이드, 글루코세레브로사이드 및 설파티드), 갱글리오사이드, 글로보사이드 및 당포스포스핑고지질) 및 글리코실포스파티딜이노시톨을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포막 내에 위치할 때, 당지질의 글리칸 모이어티는 다른 세포, 뿐만 아니라 세포 신호 전달 리간드와 상호작용할 수도 있는 막의 세포외 측면에 위치한다 (Maccioni, H.J. et al., Organization of the synthesis of glycolipid oligosaccharides in the Golgi complex. FEBS Lett. 2011 Jun 6;585(11):1691-8).
일부 구체예에서, 본 발명의 당컨쥬게이트 표적은 당단백질 및/또는 프로테오글리칸이다. 당단백질은 글리칸과 공유 결합된 임의의 단백질을 말한다. 프로테오글리칸은 때때로 음전하를 가지고 있는 글리칸으로 많이 글리코실화된 단백질의 분류이다. 이 성질은 그것들을 매우 친수성이고 연결 조직의 중요한 구성요소로 만든다.
암-관련 표적
일부 구체예에서, 본 발명의 표적은 암-관련된 항원 또는 에피토프이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "암-관련된"은 암, 암성 세포 및/또는 암성 조직과 어떤 방식으로도 연관성이 있을 수 있는 실체물을 기술하는데 사용된다. 글리칸을 포함하는 많은 암-관련된 항원 또는 에피토프는 종양 세포와 관련하여 발현되는 것으로 확인되었다 (Heimburg-Molinaro, J. et al., Cancer vaccines and carbohydrate epitopes. Vaccine. 2011 Nov 8;29(48):8802-26). 이것들은 본원에서 "종양-관련된 탄수화물 항원" 또는 "TACA"라고 불린다. TACA는 뮤신-관련된 항원 [제한되는 것은 아니지만, Tn, 시알릴 Tn (STn) 및 톰센-프리덴리히(Thomsen-Friedenreich) 항원 포함], 혈액형 루이스 관련 항원(blood group Lewis related antigen) [제한되는 것은 아니지만, LewisY (LeY), LewisX (LeX), 시알릴 LewisX (SLeX) 및 시알릴 LewisA (SLeA) 포함], 당스핑고지질-관련된 항원 [제한되는 것은 아니지만, Globo H, 스테이지-특이적 배아 항원-3 (SSEA-3) 및 시알산을 포함하는 당스핑고지질 포함], 갱글리오사이드-관련된 항원 [제한되는 것은 아니지만, 갱글리오사이드 GD2, GD3, GM2, 푸코실 GM1 및 Neu5GcGM3 포함] 및 폴리시알산-관련된 항원을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 항원 중 다수는 국제 공개 번호 WO2015054600 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술되어 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 TACA 표적은 루이스 혈액형 항원을 포함한다. 루이스 혈액형 항원은 α1-3 연결 또는 α1-4 연결에 의해 GlcNAc에 연결된 푸코오스 잔기를 포함한다. 그것들은 당지질 및 당단백질 모두에서 발견될 수 있다. 루이스 혈액형 항원은 이들 항원의 분비자인 개체의 체액에서 발견될 수도 있다. 적혈구 상에서 그것들의 출현은 적혈구에 의한 혈청으로부터의 루이스 항원의 흡수 때문이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 TACA 표적은 LeY를 포함한다. LeY (CD174로도 알려져 있음)는 Fucα(1,2)Galβ(1,4)Fucα(1,3)GlcNAc 에피토프를 수득하는 α1,2-, 뿐만 아니라 α1,3-연결된 푸코오스 잔기를 가진 Galβ1,4GlcNAC로 구성된다. 그것은 α1,3 푸코오스를 모체 사슬의 GlcNAc 잔기에 부착시키는 α1,3 푸코실트랜스퍼라아제에 의해 H 항원으로부터 합성된다. LeY는, 제한되는 것은 아니지만, 난소, 유방, 전립선, 결장, 폐 및 상피를 포함한 다양한 암에서 발현될 수 있다. 정상 조직에서 그것의 낮은 발현 수준 및 많은 암에서의 높아진 발현 수준으로 인해, LeY 항원은 치료 항체에 대한 매력적인 표적이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 TACA 표적은 LeX를 포함한다. LeX는 에피토프 Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-R을 포함한다. 그것은 또한 CD15 및 스테이지-특이적 배아 항원-1 (SSEA-1)로도 알려져 있다. 이 항원은 먼저 F9 기형 암종(teratocarcinoma) 세포로 면역화된 마우스로부터 채취된 혈청과 면역 반응성인 것으로 인식되었다. LeX는 또한 특정 스테이지에서의 배발생과 연관성이 있는 것으로 발견되었다. 그것은 또한 암의 존재 및 부재 둘 다에서 다양한 조직에서 발현되지만, 암성 세포에 의해서만 발현되는 유방암 및 난소암에서도 발견될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 TACA 표적은 SLeA 및/또는 SLeX를 포함한다. SLeA 및 SLeX는 각각 구조 Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ-R 및 Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-R로 구성된다. 그것들의 발현은 암 세포에서 상향 조절된다. 혈청에서 이들 항원의 존재는 악성 종양 및 불량한 예후와 연관성이 있다. SLeX는 대부분 뮤신 말단 에피토프로서 발견된다. 그것은 유방암, 난소암, 흑색종(melanoma), 결장, 간암, 폐암 및 전립선암을 포함한 많은 상이한 암에서 발현된다. 본 발명의 일부 구체예에서, SLeA 및 SLeX 표적은 Neu5Gc를 포함한다 (본원에서 각각 GcSLeA 및 GcSLeX로 불림).
어떤 경우에는, 본 발명의 암-관련된 표적은 뮤신을 포함할 수도 있다. Ishida 등은 MUC2와 수지상세포의 상호작용 (항-종양 활성을 가짐)이 수지상세포 아폽토시스(apoptosis)로 이어진다는 것을 입증한다 (Ishida, A. et al., 2008. Proteomics. 8: 3342-9 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 일부 양태에서, 본 발명은 수지상세포 아폽토시스를 방지하고 항-종양 활성을 지지하기 위해 항-뮤신 항체를 제공하였다.
일부 구체예에서, 본 발명의 TACA 표적은 당지질 및/또는, 제한되는 것은 아니지만, 당스핑고지질을 포함하는, 당지질에 존재하는 에피토프를 포함한다. 당스핑고지질은 세라미드 하이드록실 기에 의해 글리칸에 연결된 지질 세라미드를 포함한다. 세포막에서, 당스핑고지질은 "지질 뗏목(lipid raft)"이라고 불리는 클러스터(cluster)를 형성한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 TACA 표적은 Globo H를 포함한다. Globo H는 유방암 세포에서 최초로 확인된 암-관련된 당스핑고지질이다. Globo H의 글리칸 부분은 Fucα(1-2)Galβ(1-3)GalNAcβ(1-3)Galα(1-4)Galβ(1-4)Glcβ(1)을 포함한다. 많은 정상 상피 조직에서 발견되지만, Globo H는, 제한되는 것은 아니지만, 소세포 폐, 유방, 전립선, 폐, 췌장, 위, 난소 및 자궁 내막 종양을 포함한 많은 종양 조직과 연관성이 있는 것으로 확인되었다.
일부 구체예에서, 본 발명의 암-관련된 당스핑고지질 표적은 갱글리오사이드를 포함한다. 갱글리오사이드는 하나 이상의 시알산을 가진 당스핑고지질이다. 갱글리오사이드 명명법에 따르면, G는 갱글리오사이드에 대한 약어로 사용된다. 이 약어는 문자 M, D 또는 T로 이어지며 부착된 시알산 잔기의 수 (각각 1, 2 또는 3개)를 말한다. 마지막으로 개수 1, 2 또는 3개는 박막 크로마토그래피에 의해 분석될 때 각각 이동한 거리의 순서를 나타내는데 사용된다 (3이 가장 먼 거리를 이동하며, 이어서 2, 그 다음에 1이다). 갱글리오사이드는 암-관련된 성장 및 전이에 수반되는 것으로 알려져 있고 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현될 수도 있다. 종양 세포 상에서 발현된 갱글리오사이드는 GD2, GD3, GM2 및 푸코실 GM1 (본원에서 Fuc-GM1이라고도 불림)을 포함할 수도지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 GD3에 관한 것이다. GD3은 세포 성장의 조절자이다. 일부 구체예에서, GD3-관련 항체는 세포 성장 및/또는 혈관 신생을 조절하는데 사용된다. 일부 구체예에서, GD3-관련 항체는 세포 부착을 조절하는데 사용된다. 일부 종양 세포와 관련된 GD3은 9-O-아세틸화된 시알산 잔기를 포함할 수도 있다 (Mukherjee, K. et al., 2008. J Cell Biochem. 105: 724-34 and Mukherjee, K. et al., 2009. Biol Chem. 390: 325-35 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 어떤 경우에는, 본 발명의 항체는 9-O-아세틸화된 시알산 잔기에 대하여 선택적이다. 일부 항체는 9-O-아세틸화된 GD3에 특이적일 수도 있다. 이러한 항체는 9-O-아세틸화된 GD3을 발현하는 종양 세포를 표적화하는데 사용될 수도 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 글리칸 상호작용 항체는 GM2에 관한 것이다. 일부 구체예에서, GM2-관련 항체는 세포 대 세포 접촉을 조절하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 갱글리오사이드 표적은 Neu5Gc를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 표적은 Neu5Gc를 가진 GM3 변이체 (본원에서 GcGM3이라고 불림)를 포함할 수도 있다. GcGM3의 글리칸 구성요소는 Neu5Gcα2-3Galβ1-4Glc이다. GcGM3은 종양 세포의 공지된 구성요소이다 (Casadesus, A.V. et al., 2013. Glycoconj J. 30(7):687-99 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
일부 구체예에서, 본 발명의 TACA는 적어도 하나의 Neu5Gc 잔기를 포함한다.
재조합 항체
본 발명의 재조합 항체 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)는 해당 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 생성될 수도 있다. 일부 구체예에서, 재조합 항체는 항-글리칸 항체일 수도 있다. 추가의 항체는 항-STn 항체 (예를 들어, 항-GcSTn 또는 항-AcSTn 항체)일 수도 있다. 본 발명의 재조합 항체는 본원에서 기술된 방법에 따라 생산된 하이브리도마 세포-유래된 항체로부터 얻어진 가변 도메인을 사용하여 생산될 수도 있다. 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA 서열은 표준 생화학적 기술을 사용하여 결정될 수도 있다. 전체 RNA는 항체-생산 하이브리도마 세포로부터 추출되고 역전사 효소 (RT) 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 cDNA로 전환될 수도 있다. 가변 영역 유전자를 증폭시키기 위해 PCR 증폭이 결과로 생성된 cDNA에서 수행될 수도 있다. 이러한 증폭은 중쇄 및 경쇄 서열의 증폭에 특이적인 프라이머의 사용을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, 재조합 항체는 다른 공급원으로부터 얻어진 가변 도메인을 사용하여 생산될 수도 있다. 이것은 하나 이상의 항체 단편 라이브러리, 예컨대 항원 패닝(panning)에 사용된 scFv 라이브러리로부터 선택된 가변 도메인의 사용을 포함한다. 결과로 생성된 PCR 생성물은 서열 분석을 위해 플라스미드로 서브클로닝될 수 있다. 시퀀싱될 때, 항체 암호화 서열은 발현 벡터에 배치될 수도 있다. 인간화를 위해서, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호화 서열은 상동성 쥐 서열을 치환하는데 사용될 수도 있다. 결과로 생성된 구조체는 대규모 번역을 위해 포유류 세포에 트랜스펙션될 수도 있다.
항- Tn 항체
일부 구체예에서, 본 발명의 재조합 항체 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)는 항-Tn 항체일 수도 있다. 이러한 항체는 Tn을 가진 표적에 결합할 수도 있다. 항-Tn 항체는 Tn에 특이적일 수도 있거나 또는 다른 변형된 형태의 Tn, 예컨대, 제한되는 것은 아니지만, 추가적인 탄수화물 잔기를 포함한 다른 모이어티에 연결된 Tn에 결합할 수도 있다. 어떤 경우에 항-Tn 항체는 항-시알릴-Tn 항체일 수도 있다. 이러한 항체는 Neu5Ac를 포함하는 시알릴화된 Tn 및/또는 Neu5Gc를 포함하는 시알릴화된 Tn에 결합할 수도 있다. 일부 항-Tn 항체는 Tn 항원의 클러스터에 특이적으로 결합할 수도 있다.
항- STn 항체
일부 구체예에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체)는 STn에 특이적으로 결합할 수도 있다. 본 발명의 항-STn 항체는 STn 항원의 특이적 부분에 결합하는 것 및/또는 AcSTn 대 GcSTn에 대한 특이성으로 분류될 수도 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 항-STn 항체는 1군 항체이다. 본 발명에 따르는 "1군" 항체는 AcSTn 및 GcSTn에 결합할 수 있는 항체이다. 이러한 항체는 또한 광범위한 STn 구조와 회합할 수 있는 능력으로 인해 본원에서 팬-STn 항체라고 불릴 수도 있다. 일부 구체예에서, 1군 항체는 도 1A에서 가장 큰 타원으로 표시된 STn의 부분과 회합할 수도 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 항-STn 항체는 2군 항체이다. "2군" 항체는, 본 발명에 따르면, STn, 뿐만 아니라 세린 또는 트레오닌으로의 O-연결을 포함하는 일부 관련 구조에 결합할 수 있는 항체이다. 일부 구체예에서, 2군 항체는 시알릴화된 갈락토오스 잔기를 포함하는 글리칸과 회합할 수도 있다. 어떤 경우에는, 2군 항체는 도 1B에서 가장 큰 타원으로 표시된 STn의 부분과 회합할 수도 있다. 일부 2군 항체는 바람직하게는 GcSTn을 가진 구조보다 AcSTn을 가진 구조와 결합한다. 추가의 항-STn 항체는 3군 항체일 수도 있다. 본원에서 언급된 바와 같이, "3군" 항체는 STn에 결합할 수 있는 항체이지만, 또한 더 광범위한 일련의 관련 구조에 결합할 수도 있다. 2군 항체와는 달리, 3군 항체는 이러한 구조가 세린 또는 트레오닌으로의 O-연결을 갖는다는 것을 요구하지 않는다. 일부 구체예에서, 3군 항체는 도 1C에서 가장 큰 타원으로 표시된 STn의 부분과 회합할 수도 있다. 마지막으로, 본 발명의 일부 항-STn 항체는 4군 항체일 수도 있다. 본원에서 언급된 바와 같이, "4군" 항체는 AcSTn 및 GcSTn, 뿐만 아니라 시알릴화되지 않은 Tn 항원에 결합할 수 있으며, 그러므로 더 광범위한 특이성을 갖는다. 일부 구체예에서, 4군 항체는 도 1D에서 가장 큰 타원으로 표시된 STn의 부분과 회합할 수도 있다.
어떤 경우에는, 본 발명의 항-STn 항체는 특정 항원 또는 세포 표면 상의 STndml 클러스터에 특이적으로 결합할 수도 있다. 일부 이러한 항체는 이웃하는 STn 구조 사이의 접촉 영역을 포함하는 에피토프를 포함하여, STn의 클러스터 형성에 의해 형성된 에피토프를 인식할 수도 있다. 이러한 에피토프는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 STn 구조의 클러스터 형성에 의해 형성될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-STn 항체는 STn을 가지고 있는 세포 단백질에 결합하는데 사용될 수도 있다. 이러한 항체는 STn 발현에 의해 비-암성 세포의 유사한 단백질과 구별 가능한 암 세포와 회합된 세포 단백질을 표적화하는데 유용할 수도 있다. 어떤 경우에는, 이러한 단백질은 세포 표면 단백질을 포함할 수도 있다. STn을 가지고 있는 암 세포 표면 단백질은 암 치료 및/또는 진단 동안에 항-STn 항체에 의해 표적화될 수도 있다. STn을 가지고 있는 세포 표면 단백질은 질량 분석법을 사용하여 및/또는 면역학적 방법 (예를 들어, FACS 분석, 면역침강법, 면역블롯팅, ELISA, 등)을 사용하여 확인될 수도 있다. 어떤 경우에는, STn을 가지고 있는 세포 단백질은 암 세포 마커, 암 줄기 세포 마커, 및/또는 암 줄기 세포 신호 전달 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, STn을 가지고 있는 세포 단백질은, 제한되는 것은 아니지만, CD44, CD133, CD117, 인테그린, Notch, 및 헤지호그(Hedgehog)를 포함할 수도 있다.
항체 구성요소
어떤 경우에는, 본 발명의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 본원에서 제공된 가변 도메인 및/또는 CDR 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, 항체는 국제 공개 번호 WO2017083582 (전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 제공된 항체 또는 항체 단편 서열 중 어느 것도 포함할 수 있으며, 다음을 포함한다: 표 2에서 제공된 가변 도메인 서열 중 어느 것; 표 3에서 제공된 CDR 서열 중 어느 것; 표 4에서 제공된 VH CDR 서열 군 중 어느 것; 표 5에서 제공된 VL CDR 서열 군 중 어느 것; 표 6에서 제공된 가변 도메인 뉴클레오타이드 서열 중 어느 것; 또는 표 11에서 제공된 인간화된 가변 도메인 서열 중 어느 것. 일부 항체 또는 항원 결합 단편은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 가진 이러한 서열 또는 변이체의 상이한 조합을 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 표 2에서 나열된 가변 도메인 서열 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 제공된 경쇄 가변 도메인은 C-말단 아르기닌 잔기와 함께 또는 C-말단 아르기닌 잔기 없이 발현될 수도 있다. 이 잔기는 전형적으로는 경쇄 가변 도메인과 경쇄 불변 도메인을 연결하고 경쇄 가변 도메인 대신에 경쇄 불변 도메인의 일부로서 발현될 수도 있다. 어떤 경우에는, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 표 2에서 나열된 가변 도메인 서열 중 하나 이상과 약 50% 내지 약 99.9% 서열 동일성 (예를 들어, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 65%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 99.9%, 약 95% 내지 약 99.9%, 약 97%, 약 97.5%, 약 98%, 약 98.5%, 약 99%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7% 또는 약 99.8%)을 가진 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 나열된 서열 중 어느 것의 하나 이상의 단편을 가진 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
가변 도메인 서열
도메인 서열 서열 번호
mSIA101 VH 도메인 QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGYFSPGNDDIKYNEKFRGKATLTADKSSSTAYMQLNSLSSDDSAVYFCKRSLSTPYWGQGTLVTVSA 1
mSIA101 VL 도메인 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNRGNHKNYLTWYRQKPGLPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFALTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPYTFGGGTKLEIKR 2
mSIA102 VH 도메인 QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGYFSPGNDDIKYNEKFKVKATLTADKSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYFCKRSYYGDWGQGTTLTVSS 3
mSIA102 VL 도메인 DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSHLAWYQQKQGKSPQLLVYGATNLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKIHSLQSEDFGSYYCQHFWGAPFTFGSGTKLEIK 4
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어떤 경우에는, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 표 3에서 제공된 IgG 서열 중 어느 것도 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 항체 또는 이것의 단편은 나열된 불변 도메인 서열 중 하나 이상과 약 50% 내지 약 99.9% 서열 동일성 (예를 들어, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 65%, from 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 99.9%, 약 95% 내지 약 99.9%, 약 97%, 약 97.5%, 약 98%, 약 98.5%, 약 99%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7% 또는 약 99.8%)을 가진 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 항체 또는 이것의 단편은 나열된 서열 중 어느 것의 하나 이상의 단편을 가진 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
IgG 불변 도메인 서열
도메인 서열 서열 번호
쥐 IgG2a 중쇄 불변 도메인 영역 AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 13
쥐 IgG2a 카파 경쇄 불변 영역 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 14
인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
 15
인간 IgG1 경쇄 불변 영역 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 16
일부 구체예에서, 본 발명은 상기 기술된 항체 서열 또는 관련 변이체 중 하나 이상을 사용하여 생산된 항체 단편을 포함한다. 이러한 항체 단편은 본원에서 기술된 것들 중 어느 것을 포함한, scFv, Fab 단편, 또는 임의의 다른 항체 단편을 포함할 수도 있다.
인간화된 항체
비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화된 항체는 수령체의 항체의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 수용력을 가진 비-인간 종 (공여체 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 항체의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다.
인간 불변 영역을 가진 완전 인간화된 항체를 암호화하는 발현 플라스미드의 구성을 위해, 항체 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열은 업스트림(upstream) 프로모터/인핸서, 예를 들어, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 즉각/조기 프로모터/인핸서 (CMV IE), 플러스 면역글로불린 신호 서열과 다운스트림(downstream) 면역글로불린 불변 영역 유전자 사이의 발현 벡터 (예를 들어, 포유류 발현 벡터)에 삽입될 수도 있다. DNA 샘플은 트랜스펙션을 위해 포유류 세포로 제조될 수도 있다.
세포주의 생성 및 완전 인간화된 항체의 선택을 위해, 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA 쌍은 발현을 위해 세포에 트랜스펙션될 수도 있다. 일부 구체예에서, 포유류 NS0 세포가 사용될 수도 있다. 인간화된 항체를 생산하는 세포주는 세포 배양 배지로부터 수확되고 정제될 수도 있는 발현 항체를 위해 확장될 수도 있다.
일부 구체예에서, 인간화된 항체는 비-인간 종과의 교차-반응성을 가질 수도 있다. 종 교차-반응성은 항체가 다양한 목적으로 상이한 동물에서 사용될 수 있게 할 수도 있다. 예를 들어, 교차-반응성 항체는 항체 효능 및/또는 독성에 대한 정보를 제공하기 위해 전임상 동물 연구에 사용될 수도 있다. 비-인간 종은 마우스, 래트, 토끼, 개, 돼지, 염소, 양, 또는 비인간 영장류 예컨대 게먹이 원숭이를 포함할 수도 있다.
IgG 합성
추가의 테스트 및/또는 제품 개발을 위해 본원에서 제공된 하나 이상의 가변 도메인 및/또는 CDR 아미노산 서열 (또는 이것의 단편 또는 변이체)을 포함하는 IgG 항체 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)가 합성될 수도 있다. 이러한 항체는 IgG 생산에 적합한 발현 벡터로 원하는 아미노산 서열을 암호화하는 cDNA의 하나 이상의 세그먼트를 삽입함으로써 생산될 수도 있다. 발현 벡터는 포유류 세포에서 IgG 발현에 적합한 포유류 발현 벡터를 포함할 수도 있다. IgG의 포유동물 발현은 생산된 항체가 포유류 단백질의 변형 (예를 들어, 글리코실화) 특성을 포함한다는 것을 확인하고 및/또는 항체 조제물에 박테리아 발현 시스템의 단백질 조제물에 존재할 수도 있는 내독소 및/또는 다른 오염 물질이 없다는 것을 확인하기 위해 수행될 수도 있다.
면역원성 숙주
일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 본원에서 "면역원성 숙주"라고 불리는, 면역화를 위한 숙주로서 비-인간 동물의 사용을 통해 개발될 수도 있다. 일부 구체예에서, 면역원성 숙주는 포유류이다. 일부 구체예에서, 면역원성 숙주는 트랜스제닉 넉아웃 마우스이다. 글리칸-상호작용 항체의 표적 부위 및/또는 에피토프 표적을 가진 항체는 면역 반응을 자극하기 위해 면역원성 숙주를 접촉시키고 도입된 항원에 존재하는 표적 부위 및/또는 에피토프 표적에 특이적으로 결합하는 면역원성 숙주에서 항체를 생산하는데 사용될 수도 있다.
면역화를 통해 생산된 항체는 면역원성 숙주의 혈청으로부터 단리될 수도 있다. 면역원성 숙주의 항체 생산 세포는 또한 원하는 항체를 생산하는 세포주를 생성하는데 사용될 수도 있다. 일부 구체예에서, 면역원성 숙주로부터 항체 및/또는 항체 생산 세포에 대한 스크리닝이 효소-결합 면역 흡착 분석 (ELISA) 및/또는 글리칸 어레이의 사용을 통해 수행될 수도 있다.
항체 서열과 구조 분석 및 최적화
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 분석 및/또는 구조 분석될 수도 있으며 항체 화학법, 친화도, 특이성, 단백질 폴딩, 안정성, 제작, 발현, 및/또는 면역원성 (즉, 이러한 항체로 처리된 대상체에서의 면역 반응)에 영향을 줄 수도 있는 특성에 대하여 분석된다. 이러한 분석은 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 항체들 간의 비교를 포함할 수도 있다.
동일한 에피토프에 결합하는 항체의 항체 서열은 경쇄 및/또는 중쇄 서열의 변화에 대하여 분석될 수도 있다. 이러한 분석은 생식계열 서열 및/또는 CDR 서열을 포함할 수도 있다. 이러한 분석으로부터 얻어진 정보는 보존된 아미노산 잔기; 아미노산의 보존된 세그먼트; 보존된 측쇄 특성을 가진 아미노산 위치; 보존된 CDR 길이; 및 동일한 에피토프에 결합하는 항체들 사이에서 보존된 특징을 확인하는데 (그리고 선택적으로 변형시키거나, 결실시키거나, 대체하거나 또는 복원시키는데) 사용될 수도 있다. 이 정보는 항체 친화도, 특이성, 단백질 폴딩, 안정성, 제작, 발현 및/또는 면역원성을 개선하기 위해 변이체를 디자인하거나 항체 최적화 절차를 알아내는데 사용될 수도 있다.
서열 분석은 유사성을 확인하기 위해 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 둘 이상의 항체를 정렬하는 것을 포함할 수도 있다. 이러한 분석은 항체 영역 (예를 들어, CDR, 가변 도메인, 생식계열 세그먼트)의 서열 및/또는 길이를 비교할 수도 있다. 아미노산 삽입, 아미노산 결실, 및 치환이 확인되고 평가될 수도 있다. 서열 차이는 항체 친화도 및/또는 특이성에 대하여 비교될 수도 있다.
어떤 경우에는, 서열 분석은 쌍이 형성되지 않은 시스테인 또는 불규칙적인 이황화 중 하나 이상; 글리코실화 부위 (예를 들어, N-연결된 NXS/T 부위); 산 분열 부위, 아미노산 산화 부위, 마우스 생식계열 서열과의 적합성; 아스파라긴 탈아미드화 부위; 아스파르테이트 이성질체화 부위; N-말단 피로글루타메이트 형성 부위; 및 CDR 내 응집-취약 패치 중 하나 이상을 확인하기 위해 (그리고 선택적으로 변형시키거나, 결실시키거나, 대체하거나 또는 복원시키기 위해) 실행된다.
어떤 경우에는, 본 발명은 본원에서 제공된 항체의 서열 분석-알려진 변이체를 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열 분석-알려진 변이체"는 항체 서열 분석으로부터 유래된 하나 이상의 결론에 기초하여 변형된 항체 변이체를 말한다. 어떤 경우에는, 본 발명의 항체는 항체 친화도, 특이성, 단백질 폴딩, 안정성, 제작, 발현 및/또는 면역원성 중 하나 이상에 대한 변형을 포함하는 항체 변이체를 생산하도록 변형될 수도 있다.
일부 서열 분석-알려진 변이체는 하나 이상의 CDR 길이 변형을 포함한다. CDR 길이 변형된 항체는 원래의 항체 서열에 비해 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 추가되거나 결실된 아미노산을 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, 서열 분석-알려진 변이체는 또 다른 항체 (예를 들어, 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 항체)로부터 유래된 하나 이상의 CDR로의 하나 이상의 CDR의 치환을 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 서열 분석-알려진 변이체는 또 다른 항체 (예를 들어, 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 항체)의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 치환을 포함할 수도 있다. 서열 분석-알려진 변이체는 항체가 발현된 하나 이상의 생식계열 유전자에 대한 변형을 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 점 돌연변이, 국부적 돌연변이, 삽입 돌연변이 또는 결실 돌연변이를 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, 하나의 공지된 생식계열 유전자에서 또 다른 공지된 생식계열 유전자로 CDR을 이동시키기 위해 생식계열 유전자 변형이 수행된다. 서열 분석-알려진 변이체는, 제한되는 것은 아니지만, scFv, 모노바디, 디아바디, 인트라바디, CAR, 항체 모방체, 등을 포함하는, 본원에서 기술된 다른 변이체를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 서열 및/또는 구조 분석은 항체 단편 디스플레이 라이브러리 (제한되는 것은 아니지만, scFv 라이브러리, 파지 디스플레이 라이브러리, 및 효모 디스플레이 라이브러리 포함)의 구성을 알아내는데 사용될 수도 있다. 한 예에서, 공통 항원 또는 에피토프를 가진 둘 이상의 항체를 정렬하기 위해 서열 정렬이 수행될 수도 있고 정렬된 항체 사이에서 보존되거나 정렬된 항체 사이에서 가변적인 아미노산 잔기가 확인될 수도 있다. 이러한 경우에, 항체 단편 디스플레이 라이브러리는 라이브러리 구성원들 사이에서의 가변성이 주로 서열 분석에서 확인된 가변 아미노산에 제한되도록 구성될 수도 있다. 어떤 경우에는, 이러한 라이브러리는 표적 항원 (예를 들어, STn) 또는 표적 항원의 특이적 에피토프 (예를 들어, 하기 본원의 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 1, 2, 3 및 4군 항체에 의해 인식되는 에피토프)에 대하여 변화된 친화도 및/또는 특이성을 가진 변이체를 확인하는데 사용될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 쌍이 형성되지 않은 시스테인 잔기를 제거하거나, 대체하거나 또는 그렇지 않으면 없애기 위해 변형될 수도 있다. 어떤 경우에는, 쌍이 형성되지 않은 시스테인 잔기가 반응성일 수도 있고 어떤 경우에는 항체 친화도 및/또는 특이성에 영향을 줄 수도 있다. 따라서, 본 발명의 일부 항체는 쌍이 형성되지 않은 시스테인 잔기를 없애기 위해 변형되었다. 어떤 경우에는, 이러한 변이체는 변형된 에피토프 특이성 및/또는 친화도를 가질 수도 있다. 어떤 경우에는, 쌍이 형성되지 않은 시스테인 잔기의 변형은 항체 폴딩을 변화시킬 수도 있다. 어떤 경우에는, 이들 변이체는 하나 이상의 시스테인 잔기의 치환 또는 결실을 포함한다. 어떤 경우에는, 이들 변이체는 쌍이 형성되지 않은 시스테인 잔기로부터의 원치않는 효과를 방지하거나 감소시키기 위해 하나 이상의 추가적인 아미노산 잔기 (제한되는 것은 아니지만, 하나 이상의 시스테인 잔기의 추가 포함)를 포함한다. 어떤 경우에는, 시스테인 잔기가 소수성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 티로신, 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌 또는 트립토판)으로 대체된다.
항체 테스트 및 특성화
본원에서 기술된 항체는 다양한 방법을 사용하여 테스트되고 특성화될 수도 있다. 이러한 방법은, 제한되는 것은 아지만, 항체 친화도; 특이성; 및 활성 (예를 들어, 세포 신호 전달 경로의 활성화 또는 억제 또는 다른 세포적 또는 생물학적 활성)을 포함하는 다양한 특성을 결정하는데 사용될 수 있다. 항체 테스트는 독성, 치료 효과, 약역학, 약물동역학, 흡수, 침착, 대사, 및 배출 중 하나 이상에 대하여 생체 내에서 (예를 들어, 동물 및/또는 인간 연구에서) 테스트를 더 포함할 수도 있다. 동물에서의 테스트는, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 돼지, 영장류 (예를 들어, 게먹이 원숭이), 양, 염소, 말, 및 소에서의 테스트를 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포-기반 분석
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 세포-기반 분석의 사용을 통해 테스트되거나 특성화될 수 있다. 이러한 세포-기반 분석은 배양 중인 세포로 시험관 내에서 수행될 수 있다. 어떤 경우에, 세포-기반 분석는 생체 내에서 수행될 수도 있다. 세포-기반 생체 내 분석은 종양 세포가 주사되거나 그렇지 않으면 숙주로 도입된 종양 모델을 포함한다.
어떤 경우에는, 세포-기반 분석에 사용된 세포는 본 발명의 하나 이상의 항체에 의해 인식되는 하나 이상의 표적 글리칸을 발현할 수도 있다. 이러한 글리칸은 이러한 세포에 의해 자연적으로 발현될 수 있거나 또는, 대안으로, 세포는 특정한 분석의 목적에 바람직한 하나 이상의 글리칸을 발현하도록 유도될 수도 있다. 유도된 발현은 글리코실화된 단백질 또는 글리코실화를 조절하는 효소의 발현을 상향조절하는 하나 이상의 처리를 통해 이루어질 수도 있다. 다른 경우에, 유도된 발현은 글리코실화의 조절에 수반된 하나 이상의 글리코실화된 단백질 또는 효소의 내인성 발현을 위해 트랜스펙션, 형질 도입, 또는 하나 이상의 유전자 또는 전사물의 다른 도입 형태를 포함할 수도 있다.
어떤 경우에는, 본원에서 사용된 세포-기반 분석은 암 세포의 사용을 포함할 수도 있다. 많은 암 세포주는 본 발명의 항체를 테스트하기 위한 실험에 이용 가능하다. 이러한 세포는 표적 글리칸을 발현할 수도 있거나 표적 글리칸을 발현하도록 유도될 수도 있다. 추가적으로, 암 세포주는 본 발명의 항체를 테스트하는데 사용될 수도 있으며, 암 세포주는 암 줄기 세포를 나타낸다. 암 줄기 세포 (CSC) 세포주는 배양물에서 키워진 암 세포로부터 단리되거나 분화될 수도 있다 (예를 들어, 암 줄기 세포에 특이적인 마커에 기초한 분류를 통해). 세포-기반 분석에 사용된 세포주는, 제한되는 것은 아니지만, 유방, 결장, 난소, 림프구, 골수, 및 피부 세포주를 포함할 수도 있다. 특이적 세포주는, 제한되는 것은 아니지만, SNU-16 세포, LS-174T 세포, MC38 세포, TOV-112D 세포, TOV-21G 세포, Jurkat E6.1 세포, K-562 세포, B16-F0 세포, B16-F10 세포, LS180 세포, COLO205 세포, TB4 세포, HT29 세포, Panc1 세포, HPAC 세포, HPAFII 세포, RKO 세포, SW480 세포, 및 SNU-C2A 세포를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 난소암 세포주가 사용될 수도 있다. 이러한 세포주는, 제한되는 것은 아니지만, SKOV3, OVCAR3, OV90 및 A2870 세포주를 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, CSC 세포는 이들 세포주로부터 CD44 및/또는 CD133 세포 마커를 발현하는 세포를 단리시킴으로써 단리될 수도 있다.
OVCAR3 세포는 처음에 진행형 난소 선암종(adenocarcinoma)으로 고통받는 환자로부터 얻어진 악성 복수를 사용하여 확립되었다 (Hamilton, T.C. et al., 1983. Cancer Res. 43: 5379-89). 암 줄기 세포 집단은 특이적 세포 표면 마커, 예컨대 CD44 (세포 부착 및 이동에 수반됨), CD133 및 CD117 (Liang, D. et al., 2012. BMC Cancer. 12: 201 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨))에 기초한 선택을 통해 OVCAR3 세포 배양으로부터 단리될 수도 있다. OV90 세포는 유사하게 인간 복수로부터 유래된 상피 난소암 세포이다 (미국 특허 번호 5,710,038 참조). OV-90 세포는 또한 활성화될 때 CD44를 발현할 수 있다 (Meunier, L. et al., 2010. Transl Oncol. 3(4): 230-8).
글리칸 어레이
일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 글리칸 어레이의 사용을 통해 개발될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글리칸 어레이"는 어레이 기질에 연결된 많은 상이한 글리칸 중 어느 것과 상호작용하는 작용제를 확인하는데 사용된 도구를 말한다. 일부 구체예에서, 글리칸 어레이는 본원에서 "글리칸 프로브"라고 불리는, 많은 화학적으로 합성된 글리칸을 포함한다. 일부 구체예에서, 글리칸 어레이는 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 350, 적어도 1000 또는 적어도 1500개의 글리칸 프로브를 포함한다. 일부 구체예에서, 글리칸 어레이는 원하는 글리칸 프로브 세트를 제공하도록 주문 제작될 수도 있다. 일부 구체예에서, 글리칸 프로브는 링커 분자에 의해 어레이 기질에 부착될 수도 있다. 이러한 링커는, 제한되는 것은 아니지만, -O(CH2)2CH2)NH2 및 O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2를 포함하는 분자를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 글리칸 어레이는 70개 이상의 화학적으로 합성된 글리칸을 가지며, 이것들 중 대부분은 Neu5Ac 및 Neu5Gc-함유 글리칸 쌍으로 제공된다. 글리칸 프로브의 일부 예는 다음을 포함할 수도 있다: Neu5Ac-α-2-6-GalNAc (AcSTn); Neu5Gc-α-2-6-GalNAc (GcSTn); Neu5,9Ac2-α-2,6-GalNAc; Neu9Ac5Gc-α-2,6-GalNAc, 및 GalNAc (Tn). AcSTn 대 GcSTn에 대한 항체 결합 특이성은 해당 분야에 공지된 특이성을 결정하는 어레이 또는 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이에 더하여, O-아세틸화된 STn에 대한 항체의 결합 프로파일이 결정될 수 있다. 암-관련된 발현이 항체에 의한 STn 인식 증가와 연관성이 있는 것처럼 STn 상에서 O-아세틸화의 손실은 암과 관련이 있다 (Ogata, S. et al., Tumor-associated sialylated antigens are constitutively expressed in normal human colonic mucosa. Cancer Res. 1995 May 1;55(9):1869-74). 어떤 경우에는, 글리칸 어레이는 STn 대 Tn의 인식을 결정하는데 사용될 수도 있다.
항체 단편 디스플레이 라이브러리 스크리닝 기술
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 고처리량 발견 방법을 사용하여 생산되고 및/또는 최적화될 수도 있다. 이러한 방법은 국제 특허 출원 번호 WO2014074532 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 디스플레이 기술 (예를 들어, 디스플레이 라이브러리 스크리닝 기술) 중 어느 것을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 합성 항체는 디스플레이 기술 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술)을 사용하여 표적 항원을 스크리닝함으로써 디자인되거나, 선택되거나 또는 최적화될 수도 있다. 파지 디스플레이 라이브러리는 수백만 개 내지 수십억 개의 파지 입자를 포함할 수 있으며, 각각 바이러스 코팅 상에서 고유의 항체 단편을 발현한다. 이러한 라이브러리는 하나 이상의 관심있는 항원에 대하여 다양한 수준의 친화도를 가진 잠재적으로 수백 개의 항체 단편을 선택하는데 사용될 수 있는 매우 다양한 자원을 제공할 수도 있다 (McCafferty, et al., 1990. Nature. 348:552-4; Edwards, B.M. et al., 2003. JMB. 334: 103-18; Schofield, D. et al., 2007. Genome Biol. 8, R254 및 Pershad, K. et al., 2010. Protein Engineering Design and Selection. 23:279-88 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 때때로, 이러한 라이브러리에 존재하는 항체 단편은 플렉시블 링커에 의해 결합된 VH 및 VL 항체 도메인의 융합 단백질을 포함하는 scFv 항체 단편을 포함한다. 어떤 경우에는, scFv는 상보성 결정 영역 (CDR)의 가변 루프를 암호화하는 고유의 서열을 제외하면 동일한 서열을 함유할 수도 있다. 어떤 경우에는, scFv는 융합 단백질로서 발현되고, 바이러스 코팅 단백질 (예를 들어, 바이러스 pIII 코팅 단백질의 N-말단)에 연결된다. VL 사슬은 바이러스 코팅으로의 복잡한 혼입 전에 주변 세포질에서 VH 사슬과의 조립을 위해 별도로 발현될 수 있다. 침전된 라이브러리 구성원은 원하는 scFv를 암호화하는 cDNA를 얻기 위해 결합된 파지로부터 시퀀싱될 수도 있다. 이러한 서열은 재조합 항체 생산을 위해 항체 서열로 직접적으로 혼입되거나, 또는 시험관 내 친화도 성숙화를 통한 추가의 최적화를 위해 돌연변이되고 이용될 수도 있다.
세포독성 항체의 개발
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 항체-의존적 세포 식균작용 (ADCP)을 유도할 수도 있다. ADCC는 면역 세포 공격의 결과로서 세포가 용해되는 면역 메커니즘이다. 이러한 면역 세포는 CD56+ 세포, CD3-자연 살해 (NK) 세포, 단핵구 및 호중구를 포함할 수도 있다 (Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 8, p186 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
어떤 경우에는, 본 발명의 항체는 항체 결합시 ADCC 또는 ADCP가 필요한지 여부에 따라 주어진 아이소타입을 포함하도록 조작될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 Alderson, K.L. et al., J Biomed Biotechnol. 2011. 2011:379123에 의해 개시된 방법 중 어느 것에 따라서도 조작될 수 있다. 마우스 항체의 경우에, 상이한 아이소타입의 항체가 ADCC를 촉진하는데 더 효과적이다. 예를 들어, IgG2b보다 IgG2a가 ADCC를 유도하는데 더 효과적이다. 마우스 IgG2b 항체를 포함한 본 발명의 일부 항체는 IgG2a 항체가 되도록 재조작될 수도 있다. 이러한 재조작된 항체는 세포-관련된 항원에 결합시 ADCC를 유도하는데 더 효과적일 수도 있다. 일부 구체예에서, 항체는 ADCC 및/또는 보체-의존적 세포독성 (CDC) 생물학적 활성을 개선하기 위해 변형시키거나 하나 이상의 번역 후 변형을 도입함으로써 재조작된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 개발된 항체의 가변 영역을 암호화하는 유전자는 인간 Fc 영역을 암호화하는 포유류 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 이러한 Fc 영역은 인간 IgG1κ의 Fc 영역일 수도 있다. IgG1κ Fc 영역은 Fc-수용체 결합 및 ADCC를 향상시키는 것으로 알려진 아미노산 돌연변이를 포함할 수도 있다.
항체 약물 컨쥬게이트
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC) 치료적 용도로 개발될 수 있다. ADC는 하나 이상의 카고 (예를 들어, 치료제)가 부착된[예를 들어, 직접적으로 또는 링커 (예를 들어, 분열 가능한 링커 또는 비-분열 가능한 링커)를 통해] 항체이다. ADC는 하나 이상의 표적 세포 또는 조직으로의 치료제 (예를 들어, 약물 또는 세포독성제)의 전달에 유용하다 (Panowski, S. et al., 2014. mAbs 6:1, 34-45). 어떤 경우에, ADC는 표적화된 세포 상의 표면 항원에 결합하도록 디자인될 수도 있다. 결합시, 전체 항체-항원 복합체는 세포 리소좀으로 내재화되거나 배향될 수 있다. ADC는 분해되어, 결합된 카고를 방출할 수도 있다. 카고가 세포독성제인 경우, 표적 세포는 살해되거나 그렇지 않으면 비활성화될 것이다. 세포독성제는 세포골격 억제자 [예를 들어, 튜불린 폴리머화 억제자, 및 키네신 방추사(spindle) 단백질 (KSP) 억제자], DNA 손상제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 듀오카르마이신, 및 피롤로벤조디아제핀 다이머, 예컨대 탈리린 및 테시린), 토포이소머라아제 억제자 [예를 들어, 캄프토테신 화합물 또는 유도체, 예컨대 7-에틸-10-하이드록시캄프토테신 (SN-38) 및 엑사테칸 유도체 DXd], 전사 억제자 (예를 들어, RNA 폴리머라아제 억제자, 예컨대 아마니틴), 및 키나아제 억제자 [예를 들어, 포스포이노시티드 3-키나아제 (PI3K) 억제자 또는 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 키나아제 (MEK) 억제자]를 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
튜불린 폴리머화 억제자는 메이탄신 (예를 들어, 엠탄신 [DM1] 및 라브탄신 [DM4]), 아우리스타틴, 튜불리신, 및 빈카 알칼로이드 또는 이것들의 유도체를 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시의 아우리스타틴은 아우리스타틴 E (돌라스타틴-10의 유도체로도 알려져 있음), 아우리스타틴 EB (AEB), 아우리스타틴 EFP (AEFP), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 아우리스타틴 F 및 돌라스타틴을 포함한다. 예시의 튜불리신 화합물은 자연 발생한 튜불리신 A, B, C, D, E, F, G, H, I, U, 및 V, 및 튜불리신 유사체, 예컨대 프리튜불리신 D (PTb-D43) 및 N14-데스아세톡시튜불리신 H (Tb1)를 포함한다. 예시의 빈카 알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 나벨빈 (비노렐빈)을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포독성제는 아우리스타틴 유도체 [예를 들어 1-아미노프로판-2-일-아우리스타틴 F, 아우리스타틴 F-하이드록시프로필아미드, 아우리스타틴 F-프로필아미드, 아우리스타틴 F 페닐렌디아민 (AFP)]; 튜불리신 유도체; 빈카 알칼로이드 유도체 [예를 들어 N-(3-하이드록시프로필)빈데신 (HPV)], 및 미국 특허 번호 8,524,214; 8,685,383; 8,808,679; 및 9,254,339; 미국 특허 출원 공보 US20150314008A1, US20160220696A1 및 US20160022829A1 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들 중 어느 것을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)는 항체와 치료제를 연결하는 하나 이상의 폴리머 담체 (예를 들어, 항체-폴리머-약물 컨쥬게이트)를 더 포함할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리머 담체"는 폴리머 또는 변형된 폴리머를 말하며, 이것들은 하나 이상의 치료제 및/또는 항체에 공유 부착될 수도 있다. 폴리머 담체는 치료제에 대한 추가적인 컨쥬게이션 부위를 제공하여, 약물-대-항체 비율을 증가시키고 ADC의 치료 효과를 향상시킬 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리머 담체는 수용성 및/또는 생분해성일 수도 있다. 이러한 폴리머 담체는, 제한되는 것은 아니지만, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드) (폴리HPMA), 폴리(α-아미노산) [예를 들어, 폴리(L-리신), 폴리(L-글루탐산), 및 폴리((N-하이드록시알킬)글루타민)], 탄수화물 폴리머 [예를 들어, 덱스트린, 하이드록시에틸전분 (HES), 및 폴리시알산], 당다당류 (예를 들어, 호모다당류, 예컨대 셀룰로오스, 아밀로오스, 덱스트란, 레반, 푸코이단, 카라기난, 이눌린, 펙틴, 아밀로펙틴, 글리코겐 및 릭세난; 또는 호모다당류, 예컨대 아가로오스, 힐루로난, 콘드로이틴설페이트, 더마탄설페이트, 케라탄설페이트, 알긴산 및 헤파린), 당지질, 당컨쥬게이트, 폴리글리세롤, 폴리비닐 알콜, 폴리(아크릴산), 폴리케탈 및 폴리아세탈 [예를 들어, 미국 특허 번호 5,811,510; 5,863,990; 및 5,958,398 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는, PHF 또는 FLEXIMER®로도 알려진, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말)], 및 이것들의 유도체, 덴드리머, 코폴리머 및 혼합물을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 폴리머 담체는 폴리아세탈/폴리케탈 (예를 들어, PHF)의 코폴리머 및 친수성 폴리머, 예컨대 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 폴리머, 폴리에스터, 폴리오르쏘에스터, 폴리아미드, 폴리펩타이드, 이것들의 유도체를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 치료제는 본 발명의 항체에 직접적으로 또는 링커를 통해 부착된다 (예를 들어, 공유 결합된다). 일부 구체예에서, 치료제는 폴리머 담체에 직접적으로 또는 링커를 통해 부착되고, 폴리머 담체는 항체에 직접적으로 또는 링커를 통해 부착된다. 일부 구체예에서, 링커는 옥살산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바신산, 프탈산, 아이소프탈산, 테레프탈산, 디글리콜산, 타르타르 모이어티, 글루탐 모이어티, 푸마르 모이어티, 또는 아스파르트 모이어티를 포함하고, 이것들 각각의 아미드, 이미드, 또는 환형-이미드 유도체를 포함하며, 각각 선택적으로 치환된다. 예시의 링커는 미국 특허 번호 8,524,214; 8,685,383; 8,808,679; 9,254,339; 및/또는 9,555,112 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 것들 중 어느 것을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 링커는 분열 가능한 링커일 수도 있다. 분열 가능한 링커는 특정 조건 (예컨대, pH, 온도, 또는 환원의 변화) 하에서 파괴되거나 효소 (예를 들어, 프로테아제 및 글루쿠로니다아제)에 의해 분열되어 ADC로부터 치료제를 방출시킬 수도 있다. 이러한 링커는 에스터 결합, 아미드 결합, 또는 이황화 결합과 같은 불안정한 결합을 포함할 수도 있다. 비-제한적 분열 가능한 링커는 pH-민감성 링커 (예를 들어, 히드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 씨스(cis)-아코니틱 아미드, 티오에테르, 오르쏘에스터, 아세탈, 또는 케탈); 환원-민감성 링커 [예를 들어, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트 (SPDB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트 (SPP), N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트 (SATA) 및 N-숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔 또는 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-(1-(피리딘-2-일디설파닐)에틸)벤조에이트 (SMPT)]; 광민감성 링커; 및 효소적으로 분열 가능한 링커 [예를 들어, 펩타이드 링커, 예컨대 발린-시트룰린, 발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐 (vc-PAB), 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐 (MC-vc-PAB), 글루쿠로니다아제, 예컨대 글루쿠로니드-MABC에 의해 분열 가능한 링커, 또는 에스터라아제에 의해 분열 가능한 링커]를 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서, 링커는 비-분열 가능한 링커일 수도 있다. 비-분열 가능한 링커는 분열 가능한 링커와 비교하여 ADC의 혈장 안정성을 증가시킬 수도 있다. 예시의 비-분열 가능한 링커는 말레이미드 알칸 및 말레이미드 사이클로헥산 (MCC)을 포함한다.
본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)는 해당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수도 있다. 예를 들어, 치료제는 항체 상의 작용기와 반응할 수 dTmss 작용기를 함유하도록 변형될 수도 있다. 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)는 두 개의 작용기를 반응시켜 컨쥬게이트를 형성함으로써 제조될 수 있다. 어떤 경우에, 폴리머 담체는 상이한 화학적 조건 하에서 치료제 상의 작용기 및 항체 상의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유하도록 변형될 수 있다. 항체, 폴리머 담체, 및 치료제는 순차적 화학 반응을 통해 항체-폴리머-약물 컨쥬게이트를 형성하도록 연결될 수도 있다. 항체로의 컨쥬게이션은 컨쥬게이션 부위로서 리신 또는 시스테인 잔기를 이용할 수도 있다. 일부 구체예에서, 항체는 추가적인 리신 또는 시스테인 잔기를 갖도록 조작될 수도 있다. 이러한 접근법은 항체 구조 (예를 들어, 사슬 간 이황화 결합)의 붕괴를 방지하고 항체 안정성 및/또는 활성을 유지할 수도 있다.
본원에서 기술된 바와 같이, 약물-대-항체 비 (DAR)는 항체에 컨쥬게이션된 치료제 (예를 들어, 약물 또는 세포독성제)의 평균 수이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 ADC의 약물-대-항체 비는 적어도 1:1, 적어도 2:1, 적어도 4:1, 적어도 6:1, 적어도 8:1, 적어도 10:1, 적어도 12:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1 또는 적어도 25:1이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 ADC로서 개발될 때 세포사를 촉진할 수 있는 능력에 대하여 테스트될 수도 있다. 세포 생존력 분석은 제2 항체-약물 컨쥬게이트의 존재 및 부재 하에서 수행될 수 있다. 강력하게 세포 성장이 억제된 항체는 직접적인 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 디자인하도록 사용될 수도 있다. 세포-기반 세포독성 분석에서 이러한 제2 항체-약물 컨쥬게이트의 사용은 많은 ADC 후보의 신속한 사전-스크리닝을 허용할 수도 있다. 이러한 분석에 기초하여, 컨쥬게이션되지 않은 항체 후보는 하나 이상의 세포독성제에 컨쥬게이션된 2차 항체 (본원에서 2°ADC라고 불림)의 존재 하에 세포에 직접적으로 추가된다. 고밀도의 표적화된 항원을 발현하는 세포로의 항체/2°ADC 복합체의 내재화는 세포 내에서 용량-의존적 약물 방출을 달성하여, 세포 (예를 들어, 종양 세포)를 살해하기 위한 세포 독성 효과를 유발할 수 있는 한편, 저밀도 표적화된 항원을 발현하는 세포 (예를 들어, 정상 세포)는 영향을 받지 않는다.
본 발명의 ADC는 암 세포를 표적화하도록 디자인될 수 있다. 이러한 ADC는 하나 이상의 종양-관련된 탄수화물 항원 (TACA)에 대한 항체를 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 ADC는 항-STn 항체이다. 일부 구체예에서, ADC는 표 2에서 제공된 가변 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 ADC는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 표 3에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는, 적어도 하나의 인간 IgG 불변 영역을 포함할 수도 있다.
키메라 항원 수용체의 개발
일부 구체예에서, 본 발명의 항체 서열은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 개발하는데 사용될 수도 있다. CAR은 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 인식 및 살해를 촉진하는 면역 세포 상에서 발현되는 막관통 수용체이다. CAR은 전형적으로는 세 개의 염기성 부분을 포함한다. 이것들은 엑토도메인 (인식 도메인으로도 알려져 있음), 막관통 도메인 및 세포 내 (신호 전달) 도메인을 포함한다. 엑토도메인은 표적 세포 상의 세포 항원으로의 결합을 촉진하는 한편, 세포 내 도메인은 전형적으로 결합된 표적 세포의 살해를 촉진하는 세포 신호 전달 기능을 포함한다. 또한, 그것들은 본원에서 기술된 하나 이상의 항체 가변 도메인 또는 이것의 단편을 가진 세포 외 도메인을 가질 수도 있다. 본 발명의 CAR은 또한 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 포함한다. CAR은 항체, 항체 가변 도메인 및/또는 항체 CDR의 하나 이상의 세그먼트를 포함하도록 디자인될 수도 있으며, 이로 인해 이러한 CAR이 면역 효과기 세포 상에서 발현될 때, 면역 효과기 세포는 CAR의 항체 부분에 의해 인식되는 임의의 결합하여 이것들을 제거한다.
CAR의 특성은 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대한 T-세포 특이성 및 반응성을 재지향할 수 있는 능력을 포함하여, 단클론성 항체의 항원-결합 성질을 이용한다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T 세포에 항원 가공에 독립적으로 항원을 인식할 수 있는 능력을 제공하며, 따라서 종양 탈출의 주요 메커니즘을 우회한다. 더욱이, T-세포에서 발현될 때, CAR은 유리하게 내인성 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 사슬과 다이머화하지 않는다.
종양을 표적화하도록 조작된 CAR은 하나 이상의 종양 회합된 탄수화물 항원 (TACA)에 대한 특이성을 가질 수도 있다. 일부 구체예에서, 이들 CAR의 엑토도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인 또는 이것의 단편을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, CAR은 T 세포에서 발현되고, "CAR-조작된 T 세포" 또는 "CAR-T"라고 불릴 수도 있다. CAR-T는 하나 이상의 항체 가변 도메인을 가진 CAR 엑토도메인으로 조작될 수도 있다.
키메라 항원 수용체의 구조적 특징
유전자-전달 기술을 이용하여, T 세포는 표면 상에서 항체를 안정하게 발현하여 원하는 항원 특이성을 부여하도록 조작될 수 있다. 키메라 항원 수용체 (CAR)는 특이적 항체의 항원-인식 도메인과 CD3-제타 사슬또는 단일 키메라 융합 단백질로의 T 세포 활성화 성질을 가진 FcγRI 단백질의 세포 내 도메인을 조합한다. CAR 기술은 T 세포에 의한 표적 세포의 MHC-제한되지 않은 인식을 제공한다. T 세포의 MHC 제한의 제거는 임의의 환자에서, 및, 또한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 둘 다에서, 보통 각각 MHC 분류 I 또는 II 에피토프로 제한된 이들 분자의 사용을 용이하게 한다. Ab-결합 영역의 사용은 T 세포를 단백질, 뿐만 아니라 탄수화물 및 지질에 의해 형성된 에피토프에 반응시킨다. 이 키메라 수용체 접근법은 특히 암의 면역요법에 적합하여, 종양이 면역인식을 방지하고 CD8+ CTL 및 CD4+ T 세포 모두의 사용이 최적의 항종양 효능을 위해 가장 잘 조합되는 메커니즘, 예컨대 MHC 하향조절, 동시자극 분자 발현의 부족, CTL 저항성, 및 T 세포 억제 유도 중 다수를 우회할 수 있다. 이 접근법은 HIV와 같은 바이러스에 더하여, 광범위한 종양 항원에 적용 가능하다는 것이 입증되었다 (Finney, et al., J. Immunology, 2004, 172:104-113).
키메라 항원 수용체는 내인성 T-세포 수용체와 유사한 방식으로 T-세포 활성화를 촉발시킬 수 있지만, 실제로, CAR 기술의 임상적 적용은 키메라 항원 수용체 T 세포의 불충분한 생체 내 확장에 의해 방해되었다. 예를 들어, 1세대 CAR은 신호 전달 도메인으로서 CD3ζ 또는 Fc 수용체 γ 사슬의 세포질 영역을 포함하였다. 이들 1세대 CAR은 단계 I 임상 연구에서 난소암, 신장암, 림프종(lymphoma), 및 신경아세포종(neuroblastoma)에 걸린 환자에서 테스트되었고, 보통의 반응을 유도하여, T 세포의 세포독성을 효과적으로 재지향하지만 반복된 항원 노출시 T 세포 증식 및 생존을 가능하게 하는데 실패한 것으로 발견되었다. 2세대 CAR에 대한 프로토타입(prototype)은 CD28 및 CD3ζ 모두를 포함하는 수용체를 수반하였고, 2세대 CAR은 B 세포 악성 종양 및 다른 암의 치료에 대하여 테스트되었다 (Sadelain, et al., (2009) Current Opinion in Immunology, 21(2):215-223). 따라서, CAR은 상이한 기능적 성질을 가진 수용체의 다양한 어레이로 빠르게 확장되었다.
더 최근에는, 동시자극 도메인의 추가로 CAR-매개된 T-세포 반응이 향상될 수 있다는 것이 발견되었다. 전임상 모델에서, CD137 (4-1BB) 신호 전달 도메인의 포함은 CD3-제타 사슬 단독의 포함과 비교하여 키메라 항원 수용체의 항종양 활성 및 생체 내 지속성을 크기 증가시키는 것으로 발견되었다 (Porter, et al., N. Engl. J. Med. 2011, 365:725-733).
따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명의 항체 서열은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 개발하는데 사용될 수도 있다. 일부 구체예에서, CAR은 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 인식 및 살해를 촉진하는 면역 세포 상에서 발현된 막관통 수용체이다.
다수의 암에서, 표적화를 위한 종양-특이적 항원이 정의되지 않았지만, B-세포 신생물에서는, CD19가 매력적인 표적이다. CD19의 발현은 정상 및 악성 B 세포와 B-세포 전구물질에 제한된다. 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CART19)를 발현하는 자가 T 세포로의 처리의 예비 임상 시험은 진행된 p53-결핍 만성 림프성 백혈병 (chronic lymphoid leukemia: CLL)에 걸린 환자에서 수행되었다. 골수에서 CD19-특이적 면역 반응의 생성은 키메라 항원 수용체 T 세포의 피크 침투와 동시에 일어나는 사이토카인의 일시적 방출 및 백혈병 세포의 절제에 의해 입증되었다 (Porter, et al., N. Engl . J. Med. 2011, 365:725-733).
CAR의 추가의 구조적 특징은 City of Hope에 양도되고 공통 발명자 Michael Jensen를 가진 다수의 PCT 공보에 개시된 것들 중 어느 것도 포함할 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 00/23573은 CD20에 특이적인 수용체를 포함하는 세포 외 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인, 및 막관통 도메인을 가진 세포 표면 단백질을 발현하는 유전적으로 조작된 CD20-특이적 재지향된 T 세포를 기술한다. CD20+ 악성 종양의 세포적 면역요법 및 임의의 바람직하지 못한 B 세포 기능의 폐지를 위한 이러한 세포의 사용. 한 구체예에서, 세포 표면 단백질은 단일 사슬 FvFc:ζ 수용체이며 Fv는 펩타이드에 의해 연결된 CD20에 대한 단일 사슬 단클론성 항체의 VH 및 VL 사슬을 지정하고, Fc는 인간 IgG1의 힌지-CH2-CH3 영역을 나타내고, ζ은 인간 CD3의 제타 사슬의 세포 내 신호 전달 도메인을 나타낸다. 수용체를 암호화하는 네이키드(naked) DNA를 사용한 전기천공법에 의해 키메라 T 세포 수용체를 발현하는 재지향된 T 세포를 제조하는 방법. 유사하게, PCT 공보 WO 02/077029는 CD19에 특이적인 수용체를 포함하는 세포 외 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인, 및 막관통 도메인을 가진 세포 표면 단백질을 발현하는, 유전적으로 조작된 CD19-특이적 재지향된 면역 세포를 기술한다. CD19+ 악성 종양의 세포적 면역요법 및 임의의 바람직하지 못한 B 세포 기능의 폐지를 위한 이러한 세포의 사용. 한 구체예에서, 면역 세포는 T 세포이고 세포 표면 단백질은 scFvFc:ζ 수용체이며 Fv는 CD19에 대한 단일 사슬 단클론성 항체의 VH 및 VL 사슬을 지정하고, Fc는 IgG1의 불변 영역의 적어도 일부를 나타내고, ζ는 T 세포 항원 수용체 복합 제타 사슬 (인간 CD3의 제타 사슬)의 세포 내 신호 전달 도메인을 나타낸다. 세포 외 도메인 scFvFc 및 세포 내 도메인 제타는 막관통 도메인, 예컨대 CD4의 막관통 도메인에 의해 연결된다. 수용체를 암호화하는 네이키드 DNA를 사용한 전기천공법에 의해 키메라 T 세포 수용체를 발현하는 재지향된 T 세포를 제조하는 방법. 이들 키메라 항원 수용체는 T 세포에서 발현될 때, 단클론성 항체의 특이성에 기초하여 항원 인식을 재지향할 수 있는 능력을 갖는다. 종양 세포-표면 에피토프에 대한 표적 특이성을 갖는 scFvFc: 수용체의 디자인은 기존의 항-종양 면역력에 의존하지 않기 때문에 양자 요법(adoptive therapy)을 위해 항종양 면역 효과기 세포를 생성하기 위한 개념적으로 매력적인 전략이다. 이들 수용체는 MHC 독립적인 방식으로 항원에 결합하며, 따라서 하나의 수용체 구조체가 항원 양성 종양에 걸린 환자의 집단을 치료하는데 사용될 수 있다는 점에서 "보편적"이다. City of Hope PCT 공보 WO 02/088334, WO 2007/059298 및 WO 2010/065818은 세포 외 도메인을 세포 표면에 테더링(tethering)할 수 있는 지지 영역에 연결된 가용성 수용체 리간드를 포함하는 세포 외 도메인, 막관통 영역 및 세포 내 신호 전달 도메인으로 구성된 "제타카인"을 기술한다. 제타카인은, T 림프구의 표면 상에서 발현될 때, 가용성 수용체 리간드가 특이적인 수용체를 발현하는 상기 특정 세포에 대한 T 세포 활성을 지시한다.
CAR의 추가적인 특징은 University of Texas에 양도되고 공통 발명자 Lawrence Cooper를 가진 PCT 공보에서 개시된 것들 중 어느 것도 포함할 수 있다. PCT 공개 번호 WO 2009/091826은 세포 내 신호 전달 도메인, 막관통 도메인 및 인간 CD19 결합 영역을 포함한 세포 외 도메인을 포함하는 인간 CD19-특이적 키메라 T 세포 수용체 (또는 키메라 항원 수용체, CAR) 폴리펩타이드 (hCD19CAR로 지정됨)를 포함하는 조성물을 기술한다. 또 다른 양태에서, CD19 결합 영역은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv이다. 세포 내 도메인은 인간 CD3ζ의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함할 수도 있고 인간 CD28 세포 내 세그먼트를 더 포함할 수도 있다. 특정 양태에서 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다. PCT 공개 번호 WO 2013/074916은 T 세포 수용체 및/또는 HLA의 발현을 제거하도록 유전적으로 변형된 CAR+ T 세포를 이용하는 면역요법을 위한 방법 및 조성물을 기술한다. 특정 구체예에서, T 세포 수용체-음성 및/또는 HLA-음성 T 세포는, 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제를 사용하여 생성된다. 동종 이계의 건강한 공여체의 CAR+ T 세포는 이식편대숙주병 (graft versus host disease: GVHD)을 유발하지 않으면서 임의의 환자에게 투여되어, 암, 자가면역력, 및 감염과 같은 의학적 질환의 off-the-shelf 치료를 위한 보편적인 시약으로 작용할 수 있다.
미국 보건 사회 복지부(U.S. Department of Health and Human Services)에 양도된 PCT 공보 WO 2011/041093은 KDR-1121 또는 DC101 항체의 항원 결합 도메인, 세포 외 힌지 도메인, T 세포 수용체 막관통 도메인, 및 세포 내 T 세포 수용체 신호 전달 도메인을 포함하는 항-혈관 내피 성장 인자 수용체-2 키메라 항원 수용체, 및 암 치료시 그것들의 사용을 기술한다.
PCT 공보 WO 2012/079000 및 WO 2013/040557 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 University of Pennsylvania에 양도되고 공통 발명자 Carl H. June을 공유하며; 이들 간행물은 각각 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 동시자극 신호 전달 영역, 및 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함하는 CAR, 및 RNA CAR 트랜스펙션된 T 세포를 생성하는 방법을 기술한다.
또한 University of Pennsylvania에 양도되고 공통 발명자 Carl H. June을 공유하는 PCT 공보 WO2013/126712는 리간드 독립적이고 암 치료에 유용한 외인성 사이토카인 또는 배양 보조 세포(feeder cell)의 추가와 관계없는 배양시 장기적인 지수 확장을 나타내는 지속적인 T 세포의 집단을 생성하기 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 도메인은 항-cMet 결합 도메인이다. 일부 구체예에서, 항원 결합 도메인은 항-메소테린 결합 도메인이다. 일부 구체예에서, 항원 결합 도메인은 항-CD19 결합 도메인이다. 힌지 도메인은 IgG4이고, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다. 일부 구체예에서, 동시자극 신호 전달 영역은 CD28 신호 전달 영역이다. 또한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공되고, CAR은 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 동시자극 신호 전달 영역, 및 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함한다.
University of Pennsylvania에 양도된 PCT 공보 WO 2014/039513은 세포의 세포 용해 활성을 향상시키기 위해 세포에서 하나 이상의 디아실글리세롤 키나아제 (DGK) 아이소폼(isoform)을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 세포는 양자 T 세포 전달에 사용될 수도 있으며, 여기서 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 변형된다. 양자 T 세포 전달에 사용된 T 세포에서 DGK의 억제는 T 세포의 세포 용해 활성을 증가시키며 따라서 암, 감염, 및 면역 장애를 포함한 다양한 병태의 치료에 사용될 수 있다.
University of Pennsylvania에 양도된 PCT 공보 WO 2014/055771은 난소암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 구체적으로, 본 발명은 난소암을 치료하기 위해 알파-폴레이트 수용체 (FR-알파) 결합 도메인 및 CD27 동시자극 도메인을 가진 유전적으로 변형된 T 세포를 투여하는 것과 관련이 있다. 한 구체예에서, FR-알파 결합 도메인은 완전한 인간인 것이라고 하며, 이로써 숙주 면역 반응을 방지한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 CAR은 종양을 표적화하도록 조작될 수도 있다. 이러한 CAR은 하나 이상의 TACA에 대한 특이성을 가질 수도 있다. 어떤 경우에, 이들 CAR의 엑토도메인은 본원에서 제공된 하나 이상의 항체 가변 도메인 또는 이것의 단편을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 CAR은 T 세포에서 발현되며, 본워에서 "CAR-조작된 T 세포" 또는 "CAR-T"라고 불린다. CAR-T는 본원에서 제공된 하나 이상의 항체 가변 도메인을 가진 CAR 엑토도메인으로 조작될 수도 있다.
다중특이적 항체
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 초과의 에피토프에 결합할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "멀티바디" 또는 "다중특이적 항체"는 둘 이상의 가변 영역이 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 말한다. 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에 있을 수도 있다. 특정 구체예에서, 다중-특이적 항체는 "이중특이적 항체"이며, 이것은 동일하거나 상이한 항원 상의 두 개의 상이한 에피토프를 인식한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 두 개의 상이한 항원에 결합할 수 있다. 이러한 항체는 전형적으로는 적어도 두 개의 상이한 항체의 항원-결합 영역을 포함한다. 예를 들어, 이중특이적 단클론성 항체 (BsMAb, BsAb)는 두 개의 상이한 단클론성 항체의 단편으로 구성되며, 따라서 BsAb를 두 개의 상이한 유형의 항원에 결합시키는 인공적인 단백질이다. 이 기술에 대한 하나의 공통적인 용도는 암 면역 요법에서 있으며, BsMAb는 세포독성 세포 (수용체 유사 CD3와 같은 수용체를 사용하여)와 종양 세포와 같이 파괴될 표적에 동시에 결합하도록 조작된다.
이중특이적 항체는 Riethmuller, G., 2012. Cancer Immunity. 12:12-18; Marvin, J.S. et al., 2005. Acta Pharmacologica Sinica. 26(6):649-58; 및 Schaefer, W. et al., 2011. PNAS. 108(27):11187-92 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들 중 어느 것을 포함할 수도 있다.
"삼기능적 이중특이적" 항체라고 불리는 세로운 세대의 BsMAb가 개발되었다. 이것들은 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄로 이루어지는데, 각각 두 개의 상이한 항체의 것이며, 두 개의 Fab 영역 (아암(arm))은 두 개의 항원에 대한 것이고, Fc 영역 (풋(foot))은 두 개의 중쇄를 포함하고 제3 결합 부위를 형성한다.
이중특이적 항체의 가변 도메인의 상부를 형성하는 두 개의 파라토프 중에서, 하나는 표적 항원에 대한 것일 수 있고 다른 것은 CD3과 같은 T-림프구 항원에 대한 것이다. 삼기능적 항체의 경우에, Fc 영역은 거대 세포, 자연 살해 (NK) 세포 또는 수지상세포와 같이, Fc 수용체를 발현하는 세포에 추가적으로 결합할 수도 있다. 요약하면, 표적화된 세포는 면역 시스템의 한 개 또는 두 개의 세포에 연결되며, 이것들은 이후에 표적화된 세포를 파괴한다.
사이토카인 해방에 의해 유발되는 짧은 반감기, 면역원성 및 부작용과 같은 특정 문제점을 극복하기 위해 다른 유형의 이중특이적 항체가 디자인되었다. 그것들은 Fab 영역으로만 이루어진 화학적으로 연결된 Fab, 및 다양한 유형의 2가 및 3가 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 두 개의 항체의 가변 도메인을 모방하는 융합 단백질을 포함한다. 이들 새로운 포맷 중 가장 먼 발전은 이중-특이적 T-세포 인게이져 (BiTE) 및 mAb2, Fc 불변 영역 대신에 Fcab 항원-결합 단편을 함유하도록 조작된 항체이다.
이중특이적, 단일 사슬 항체 Fv 단편 (Bs-scFv)은 암 세포를 살해하기 위해 성공적으로 사용되었다. 일부 인간 암은 p53의 기능적 결함에 의해 유발되며, 이것들은 야생형 p53으로의 유전자 요법에 의해 회복된다. Weisbart, 등은 살아있는 결장암 세포에 침투하고, 세포 내 p53에 결합하여 그것의 야생형 기능을 표적화하고 회복시키는 이중특이적 단일 사슬 항체의 구성 및 발현을 기술한다 (Weisbart, et al., Int . J. Oncol. 2004 Oct;25(4):1113-8; 및 Weisbart, et al., Int . J. Oncol. 2004 Dec;25(6):1867-73). 이들 연구에서, 이중특이적, 단일 사슬 항체 Fv 단편 (Bs-scFv)은 (i) 살아있는 세포에 침투하여 핵에 국소화되는 mAb 3E10의 단일 사슬 Fv 단편, 및 (ii) p53의 C-말단에 결합하는 비-침투 항체, mAb PAb421의 단일 사슬 Fv 단편으로부터 구성되었다. PAb421 결합은 SW480 인간 결장암 세포를 포함한, 일부 p53 돌연변이의 야생형 기능을 회복시킨다. Bs-scFv 침투된 SW480 세포는 세포 독성이었으며, 돌연변이 p53에 대한 활성을 회복시키는 능력을 시사한다. COS-7 세포 (야생형 p53을 가진 원숭이 신장 세포)는 p53으로의 PAb421의 결합을 억제하는 SV40 큰 T 항원의 존재로 인해 PAb421에 대하여 미반응성이기 때문에 대조군의 역할을 한다. Bs-scFv는 COS-7 세포에 침투하였지만, 세포독성은 아니었으며, 이로 인해 p53으로의 결합과 무관한 Bs-scFv의 비-특이적 독성을 제거한다. Fv 단편 단독은 세포독성이 아니었으며, 살해는 p53의 형질 도입 때문임을 나타낸다. PAb421 VH의 CDR1에서의 단일 돌연변이는 p53으로의 Bs-scFv의 결합을 제거하였고 세포 침투를 변화시키지 않으면서 SW480 세포에 대한 세포독성을 폐지하였으며, 세포독성을 위해 p53에 결합하는 PAb421의 필요성을 더 지지한다 (Weisbart, et al., Int . J. Oncol. 2004 Oct;25(4):1113-8; 및 Weisbart, et al., Int. J. Oncol. 2004 Dec;25(6):1867-73).
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 디아바디일 수도 있다. 디아바디는 기능적 이중특이적 단일 사슬 항체 (bscAb)이다. 이들 2가 항원-결합 분자는 scFv의 비-공유 다이머로 구성되고, 재조합 방법을 사용하여 포유류 세포에서 생산될 수 있다 (예를 들어, Mack et al, Proc . Natl . Acad . Sci., 92: 7021-7025, 1995 참조). 몇몇 디아바디는 임상 개발에 들어갔다. 항-CEA 키메라 항체 cT84.66의 아이오딘-123-라벨링된 디아바디 버젼은 Beckman Research Institute of the City of Hope가 후원하는 연구에서 결장직장암의 수술 전 섬광 조영술 검출에 대하여 평가되었다 (Clinicaltrials.gov NCT00647153) (Nelson, A. L., MAbs.2010. Jan-Feb; 2(1):77-83).
분자 유전학을 사용하여, 두 개의 scFv가 "탠덤(tandem) scFv" (tascFv)라고 불리는 링커 도메인에 의해 분리된 단일 폴리펩타이드로 나란히 조작될 수 있다. TascFv는 난용성이고 박테리아에서 생산될 때 리폴딩(refolding)을 필요로 하는 것으로 발견되었거나, 또는 그것들은 리폴딩 요건을 피하지만 불량한 수율을 초래할 수도 있는 포유류 세포 배양 시스템에서 제조될 수 있다. 두 개의 상이한 scFv에 대한 유전자를 가진 tascFv의 구성은 "이중특이적 단일 사슬 가변 단편" (bis-scFv)을 수득한다. 단 두 가지의 tascFv가 영리 회사에 의해 임상적으로 개발되었고; 종양학적 적응증에 대하여 Micromet에 의한 활발한 조기 단계 개발에서 둘 다 이중특이적 작용제이고, "이중특이적 T-세포 인게이져 (BiTE)"라고 기술된다. 블리나투모맙은 단계 2의 B-세포 비-호지킨 림프종에 대한 T-세포 반응을 강화하는 항-CD19/항-CD3 이중특이적 tascFv이다. MT110은 단계 1의 고체 종양에 대한 T-세포 반응을 강화하는 항-EP-CAM/항-CD3 이중특이적 tascFv이다. 이중특이적 4가 "TandAb"는 또한 Affimed에 의해 연구되고 있다 (Nelson, A. L., MAbs.2010. Jan-Feb; 2(1):77-83).
또한 맥시바디 (IgG의 Fc (CH2-CH3 도메인)의 아미노 말단에 융합된 2가 scFV)가 포함된다.
이중특이적 T-세포-인게이져 (BiTE) 항체는 선택된 표적 세포의 용해를 위해 세포독성 T-세포에 일과성으로 관여하도록 디자인된다. 이것들은 전형적으로는 두 개의 scFv (하나는 T 세포 상의 CD3에 결합하고 하나는 파괴를 위해 표적화되는 세포의 표면 상의 표적 항원에 결합함)를 포함한다. 일부 구체예에서, 두 개의 scFv는 링커에 의해 결합된다. 다른 구체예에서, 두 개의 scFv는 항체 상의 상이한 영역이다. BiTE 항체의 임상적 활성은 생체 외에서 확장된, 종양 조직으로부터 유래되거나, 또는 특정 T-세포 수용체로 트랜스펙션된 자가 T-세포가 고체 종양의 치료시 치료적 가능성을 나타냈다는 결과를 제공한다. 이들 맞춤형 접근법은 T-세포 단독이 말기 암에서조차 상당한 치료적 활성을 가질 수 있다는 것을 입증하는 한편, 광범위하게 수행하는 것이 번거롭다. 이것은 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4) 항체에 대해서는 상이하여, 종양-특이적 T-세포 클론의 생성을 촉진하고, 암 세포 용해에 대하여 환자의 대부분의 T-세포에 직접적으로 관여하는 이중- 및 삼중-특이적 항체에 대해서도 상이하다. T-세포-관여 항체에 의한 인간 암 요법에 대한 전체적인 T-세포 관여 가능성은 활발하게 조사 중에 있다 (Baeuerle PA, et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics. 2009, 11(1):22-30 및 Baeuerle PA and Reinhardt C, Cancer Res. 2009, 69(12): 4941-4 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
3세대 분자는 "소형화된(miniaturized)" 항체를 포함한다. mAb 소형화의 가장 좋은 예 중에서는 Trubion Pharmaceuticals의 소형 모듈 면역치료제 (small modular immunopharmaceutical: SMIP)가 있다. 1가 또는 2가일 수 있는 이들 분자는 모두 링커 도메인에 의해 연결된, 한 개의 VL, 한 개의 VH 항원-결합 도메인, 및 한 개 또는 두 개의 불변 "효과기" 도메인을 함유하는 재조합 단일 사슬 분자이다. 아마도, 이러한 분자는 불변 도메인에 의해 부여된 면역 효과기 기능을 가지고 있으면서 단편에 의해 요구되는 증가된 조직 또는 종양 침투의 이점을 제안할 수도 있다. 적어도 세 개의 "소형화된" SMIP가 임상 개발에 들어갔다. Wyeth와 협력하여 개발된 항-CD20 SMIP인 TRU-015는 가장 진전된 프로젝트이며, 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis: RA)에 대하여 단계 2까지 진행되었다. 전신성 홍반성 낭창 (systemic lupus erythrematosus: SLE) 및 B 세포 림프종에서의 초기 시도는 결국 중단되었다. Trubion 및 Facet Biotechnology는 단계 2에 도달한 프로젝트인, CLL 및 다른 림프성 종양 형성의 치료를 위한 TRU-016, 항-CD37 SMIP의 개발에 협력하고 있다. Wyeth는 RA, SLE 및 아마도 다발성 경화증(multiple sclerosis)을 포함하는 자가면역 질환의 치료를 위해 항-CD20 SMIP SBI-087을 허가받았지만, 이들 프로젝트는 임상 테스트의 초기 스테이지에 남아있다 (Nelson, A. L., MAbs.2010. Jan-Feb; 2(1):77-83).
Genmab은 힌지 영역이 IgG4 분자로부터 제거된 "유니바디" 기술의 용도를 연구 중이다. IgG4 분자가 불안정하고 경쇄-중쇄 헤테로다이머를 서로 교환할 수 있지만, 힌지 영역의 결실은 중쇄-중쇄 쌍 형성을 전적으로 방지하여, 고도로 특이적인 1가 경쇄/중쇄 헤테로다이머를 남겨두는 한편, 생체 내에서 안정성 및 연장된 반감기를 보장하기 위해 Fc 영역을 유지한다. 이 구성형태는 IgG4가 Fcr과 불량하게 상호작용하고 1가 유니바디가 세포 내 신호 전달 복합체 형성을 촉진하는데 실패하기 때문에 면역 활성화 또는 종양원 성장의 위험을 최소화할 수도 있다. 하지만, 이들 주장은 대부분 임상적 증거 대신에 실험실 증거에 의해 지지된다. Biotecnol은 또한 전임상 연구에서 "압축된(compacted)" 100 kDa 항-HER2 항체인, "소형화된" mAb, CAB051을 개발 중이다 (Nelson, A. L., MAbs.2010. Jan-Feb; 2(1):77-83).
단일 항원-결합 도메인으로 구성된 재조합 치료제가 또한 개발되었지만, 그것들은 현재 임상 파이프라인의 단지 4%만을 차지한다. 이들 분자는 극도로 작으며, 실제 크기의 mAb에 대하여 관찰된 것의 대략 10분의 1의 분자량을 갖는다. Arana 및 Domantis는 인간 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 항원-결합 도메인으로 구성된 분자를 조작하지만, 단지 Arana만이 건선(psoriasis) 및 류머티스성 관절염의 치료를 위한 단계 2 연구에서 항-TNFα 분자인 임상 테스트의 후보, ART-621을 가지고 있다. Ablynx는 낙타 및 라마에서 발견된 중쇄 항체의 항원-결합 가변 중쇄 영역 (VHH)으로부터 유래된 "나노바디"를 생산하는데, 이것은 경쇄가 없다. 두 개의 Ablynx 항-폰 빌레브란트(anti-von Willebrand) 인자 나노바디는 임상 개발까지 진행되었으며, 급성 관동맥 증후군(acute coronary syndrome)에 대하여 경피적 관상동맥 중재술(percutaneous coronary intervention)을 겪은 환자에서 혈전증(thrombosis)을 방지하기 위한 정맥내 요법으로서 단계 2 개발 중인 ALX-0081, 및 급성 관동맥 증후군 및 혈전성 혈소판 감소성 자반병(thrombotic thrombocytopenic purpura)에 걸린 환자 도무에 대하여 의도된 피하 투여를 위한 단계 1 분자인 ALX-0681을 포함한다 (Nelson, A. L., MAbs.2010. Jan-Feb; 2(1):77-83).
다중특이적 항체의 개발
일부 구체예에서, 본 발명의 항체 서열은 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적, 또는 더 큰 다중특이적)를 개발하는데 사용될 수도 있다. 다중특이적 항체는 본 발명의 표적 항원의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나, 또는 본 발명의 표적 항원, 및 이종성 에피토프, 예컨대 이종성 글리칸, 펩타이드 또는 고체 지지 재료 모두에 대하여 특이적일 수 있다 (예를 들어, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al., Trispecific F(ab')3 derivatives that use cooperative signaling via the TCR/CD3 complex and CD2 to activate and redirect resting cytotoxic T cells. J. Immunol. 1991 Jul 1;147(1):60-9; 미국 특허 번호 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; 및 Kostelny, S.A. et al., Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J. Immunol. 1992 Mar 1;148(5):1547-53; 미국 특허 번호 5,932,448 참조).
다이머화 능력이 없는 다중특이적 결합제보다 개선된 성질을 갖는 다이머 다중특이적 결합제 (예를 들어, 항체 구성요소를 포함하는 융합 단백질)를 제조하기 위한 멀티머화 기술이 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center에 대한 PCT 공보 WO2014144573에서 개시되고 주장된다.
4가 이중특이적 항체 (TetBiAb), 및 암 또는 면역 장애의 진단 및 치료를 위해 TetBiAb를 제조하는 방법 및 이것을 사용하는 방법이 Merck Patent GMBH에 대한 PCT 공보 WO2014144357에서 개시되고 주장된다. TetBiAb는 항체의 C-말단에 부착된 제2 항원 특이성을 가진 Fab 단편의 제2 쌍을 특징으로 하며, 따라서 두 개의 항원 특이성 각각에 대하여 2가인 분자를 제공한다. 4가 항체는 유전자 조작 방법에 의해 동족이고, 동시-발현된 Fab 중쇄와 외합된 Fab 경쇄에 항체 중쇄를 공유 결합에 의해 연결시킴으로써 생산된다.
질환의 치료를 위해, 병 든 세포 또는 병원체 상에서 T-세포 항원에 대한 적어도 하나의 결합 부위 및 항원에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 (bsAb)를 재지향하는 T 세포가 IBC Pharmaceuticals, Inc.에 대한 PCT 공보 WO2014028560에서 개시되고 주장된다. 바람직하게는, 이 bsAb는 항-CD3 x 항-CD19 이중특이적 항체이지만, 다른 T-세포 항원 및/또는 질환-관련된 항원에 대한 항체가 사용될 수도 있다. 복합체는 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환과 같은 질환과 관련된 세포의 T-세포-매개된 세포독성을 유도하기 위해 효과기 T 세포를 표적화할 수 있다. 세포독성 면역 반응은 인터페론-α, 인터페론-bgr; 인터페론-λ1, 인터페론-λ2 또는 인터페론-λ3을 포함하는 인터페론-기반 작용제의 동시-투여에 의해 향상된다.
이중특이적 항체 분자, 뿐만 아니라 그것의 생산 방법, 그 사용 및 이중특이적 항체 분자를 암호화하는 핵산 분자가 Synimmune GMBH에 대한 PCT 공보 WO2013092001에서 개시되고 주장된다. 특히 면역 세포의 표적 세포 제한된 활성화를 매개할 수 있는 항체 분자가 제공된다.
종양 세포의 표면 상에서 erbB 분류의 당에피토프 및 수용체에 특이적으로 결합하며, 이로 인해 당에피토프와 수용체를 교차연결시키는 다중특이적 모듈 항체가 PCT 공보 WO2012007167에서 개시되고 주장되며, 이 항체는 NK 세포와 독립적으로 세포 용해에 영향을 주는 아폽토시스 활성을 갖는다.
메디토프, 메디토프-결합 항체, 메디토프 전달 시스템, 뿐만 아니라 메디토프에 대한 단클론성 항체 프레임워크 결합 계면, 및 그것들의 사용 방법이 PCT 공보 WO2012048332 and WO2013055404에서 개시되고 주장된다. 구체적으로, 두 개의 항체 결합 펩타이드, C-QFDLSTRRLK-C ("cQFD"; 그 안에서 서열 식별 번호 1; 본원에서는 서열 번호: 17) 및 C-QYNLSSRALK-C ("cQYN"; 그 안에서 서열 식별 번호 2; 본원에서는 서열 번호: 18)는 새로운 mAb 결합 성질을 갖는 것으로 나타났다. "메디토프"로도 불리는 cQFD 및 cQYN은 항-EGFR mAb 세툭시맙의 Fab 프레임워크의 영역에 결합하고 항원에 결합하는 상보성 결정 영역 (CDR)에 결합하지 않는 것으로 나타났다. Fab 프레임워크 상의 결합 영역은 다른 프레임워크-결합 항원, 예컨대 초항원 포도상구균(Staphylococcal) 단백질 A (SpA) (Graille et al., 2000) 및 펩토스트렙토코쿠스 마그너스(Peptostreptococcus magnus) 단백질 L (PpL) (Graille et al., 2001)과는 다르다. 따라서, 한 구체예에서 환형 메디토프에 결합하는 고유의 쥐-인간 항체 또는 이것의 기능적 단편의 프레임워크 영역을 포함하는 프레임워크 결합 계면이 개시된다.
관심있는 예시의 특허 및 특허 공보는 모두 1995년 6월 7일에 출원된 미국 특허 번호 5,585,089; 5,693,761; 및 5,693,762 및 모두 Protein Design Labs, Inc.에 양도된 미국 특허 번호 6,180,370이며 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 가진 인간화된 면역글로불린과 공여체 면역글로불린의 가능한 추가의 아미노산 및 수용 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역을 생산하는 방법, 및 이것들의 조성물을 기술한다. 각각의 인간화된 면역글로불린 사슬은 보통 CDR에 더하여, 예를 들어, 결합 친화도에 영향을 주기 위해 CDR과 상호작용할 수 있는 공여체 면역글로불린 프레임워크의 아미노산, 예컨대 공여체 면역글로불린에서 CDR에 바로 인접한 하나 이상의 아미노산 또는 분자 모델링으로 측정된 바와 같이 약 3Å 이내의 것들을 포함한다고 한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 다양한 위치 기준 중 어느 하나 또는 전부를 사용하여 디자인될 수도 있다. 온전한 항체로 조합될 때, 본 발명의 인간화된 면역글로불린은 인간에서 실질적으로 비-면역원성이고 항원, 예컨대 에피토프를 함유하는 단백질 또는 다른 화합물에 대하여 공여체 면역글로불린과 실질적으로 동일한 친화도를 유지한다고 한다.
Universite Catholique De Louvain 및 Bio Transplant, Inc.에 양도된 미국 특허 번호 5,951,983은 T-림프구에 대한 인간화된 항체를 기술한다. HUM5400 (EMBL 기탁 X55400)으로 지정된 인간 V 카파 유전자 및 인간 항체 클론 Amu 5-3 (GenBank 기탁 번호 U00562)의 프레임워크 영역이 그 안에서 제시된다.
Creative Biomolecules, Inc.에 대한 미국 특허 번호 5,091,513은 사전 선택된 항원에 대한 친화도를 가진 합성 단백질의 패밀리를 기술한다. 단백질은 생합성 항체 결합 부위 (BABS)로서 행동하는 영역을 구성하는 아미노산의 하나 이상의 서열을 특징으로 한다. 부위는 1) 비-공유 회합된 또는 이황화 결합된 합성 VH 및 VL 다이머, 2) VH 및 VL이 폴리펩타이드 링커에 의해 부착된 VH-VL 또는 VL-VH 단일 사슬, 또는 3) 개개의 VH 또는 VL 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 연결된 CDR 및 FR 영역을 포함하며, 별도의 면역글로불린으로부터 유래될 수도 있다. 단백질은 또한, 예를 들어, 효소, 독소, 결합 부위, 또는 고정화 매질 또는 방사성 원자에 대한 부착 부위의 기능을 하는 다른 폴리펩타이드 서열을 포함할 수도 있다. 단백질을 생산하고, 항체의 생체 내 생성에 의해 유도될 수 있는 임의의 특이성을 가진 BABS를 디자인하고, 이것의 유사체를 생산하기 위한 방법이 개시되어 있다.
ESBATech, Alcon Biomedical Research Unit, LLC에 대한 미국 특허 번호 8,399,625는 항체 수용자 프레임워크 및 특히 적합한 항체 수용자 프레임워크를 사용하여 비-인간 항체, 예를 들어, 토끼 항체를 이식하는 방법을 기술한다.
인트라바디
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 인트라바디일 수도 있다. 인트라바디는 항체가 생산되는 세포로부터 분비되지 않지만, 대신에 하나 이상의 세포 내 단백질을 표적화하는 항체의 형태이다. 인트라바디는 세포 내로 발현되고 기능하며, 제한되는 것은 아니지만, 세포 내 교환, 전사, 번역, 대사 과정, 증식성 신호 전달 및 세포 분열을 포함하는 다수의 세포 공정에 영향을 주는데 사용될 수도 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 기술된 방법은 인트라바디-기반 요법을 포함한다. 일부 이러한 구체예에서, 본원에서 개시된 가변 도메인 서열 및/또는 CDR 서열은 인트라바디-기반 요법을 위해 하나 이상의 구조체로 혼입된다. 예를 들어, 인트라바디는 하나 이상의 글리코실화된 세포 내 단백질을 표적화할 수도 있거나 또는 하나 이상의 글리코실화된 세포 내 단백질과 대안의 단백질 간의 상호작용을 조절할 수도 있다.
20년 이상 전에, 세포 내 표적에 대한 세포 내 항체가 처음 기술되었다 (Biocca, Neuberger and Cattaneo EMBO J. 9: 101-108, 1990). 포유류 세포의 상이한 구획에서 인트라바디의 세포 내 발현은 내인성 분자의 기능의 차단 또는 조절을 허용한다 (Biocca, et al., EMBO J. 9: 101-108, 1990; Colby et al., Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A. 101: 17616-21, 2004). 인트라바디는 단백질 폴딩, 단백질-단백질, 단백질-DNA, 단백질-RNA 상호작용 및 단백질 변형을 변화시킬 수 있다. 그것들은 표현형 넉아웃을 유도하고 표적 항원으로의 직접적으로 결합함으로써, 세포 내 교환을 전환시킴으로써 또는 결합 파트너와의 회합을 억제함으로써 중성화제로 작용할 수 있다. 그것들은 대부분 연구 도구로서 이용되었고 바이러스성 병리상태, 암 및 미스폴딩(misfolding) 질환과 같은 인간 질환의 치료를 위한 치료적 분자로서 등장하고 있다. 빠르게 성장하고 있는 재조합 항체의 생물학 시장은 요법에서 사용을 위해 더 낮은 면역원성과 함께 향상된 결합 특이성, 안정성 및 가용성을 가진 인트라바디를 제공한다 (Biocca, abstract in Antibody Expression and Production Cell Engineering Volume 7, 2011, pp. 179-195).
일부 구체예에서, 인트라바디는 간섭 RNA (iRNA)보다 이점을 가지며; 예를 들어, iRNA는 다수의 비-특이적 효과를 발휘하는 것으로 나타난 반면, 인트라바디는 표적 항원의 고 특이성 및 친화도를 갖는 것으로 나타났다. 게다가, 단백질로서, 인트라바디는 iRNA보다 훨씬 더 긴 활성 반감기를 보유한다. 따라서, 세포 내 표적 분자의 활성 반감기가 길 때, iRNA를 통한 유전자 침묵은 효과를 얻는 것이 느릴 수도 있는 반면, 인트라바디 발현의 효과는 즉각적일 수 있다. 마지막으로, 특정 표적 분자의 특정 결합 상호작용을 차단하는 한편, 다른 것들을 절약하기 위해 인트라바디를 디자인하는 것이 가능하다.
인트라바디의 개발
인트라바디는 때때로 재조합 핵산 분자로부터 발현된 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이고 세포 내에서 유지되도록 조작된다 (예를 들어, 세포질, 소포체, 또는 주변세포질에서 유지됨). 인트라바디는, 예를 들어, 인트라바디가 결합하는 단백질의 기능을 폐지하는데 사용될 수도 있다. 인트라바디의 발현은 또한 인트라바디를 포함하는 핵산 발현 벡터에서 유도성 프로모터의 사용을 통해 조절될 수도 있다. 인트라바디는 해당 분야에 공지된 방법, 예컨대 다음에서 개시되고 검토된 것들을 사용하여 생산될 수도 있다: (Marasco et al.,　1993 Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90: 7889-7893; Chen et al., 1994, Hum. Gene Ther . 5:595-601; Chen et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5932-5936; Maciejewski et al., 1995, Nature Med., 1: 667-673; Marasco, 1995, Immunotech, 1: 1-19; Mhashilkar, et al., 1995, EMBO J. 14: 1542-51; Chen et al., 1996, Hum. Gene Therap., 7: 1515-1525; Marasco, Gene Ther. 4:11-15, 1997; Rondon and Marasco, 1997, Annu. Rev. Microbiol. 51:257-283; Cohen, et al., 1998, Oncogene 17:2445-56; Proba et al., 1998, J. Mol. Biol. 275:245-253; Cohen et al., 1998, Oncogene 17:2445-2456; Hassanzadeh, et al., 1998, FEBS Lett. 437:81-6; Richardson et al., 1998, Gene Ther. 5:635-44; Ohage and Steipe, 1999, J. Mol. Biol. 291:1119-1128; Ohage et al., 1999, J. Mol. Biol. 291:1129-1134; Wirtz and Steipe, 1999, Protein Sci. 8:2245-2250; Zhu et al., 1999, J. Immunol . Methods 231:207-222; Arafat et al., 2000, Cancer Gene Ther. 7:1250-6; der Maur et al., 2002, J. Biol . Chem. 277:45075-85; Mhashilkar et al., 2002, Gene Ther. 9:307-19; 및 Wheeler et al., 2003, FASEB J. 17: 1733-5; 및 그 안에서 인용된 참고문헌). 특히, CCR5 인트라바디는 Steinberger et al., 2000, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 97:805-810에 의해 생산되었다. 일반적으로는 Marasco, WA, 1998, "Intrabodies: Basic Research and Clinical Gene Therapy Applications" Springer:New York 참조; 및 scFv의 검토를 위해서는, Pluckthun in "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies," 1994, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 참조.
일부 구체예에서, 항체 서열이 인트라바디를 개발하는데 사용된다. 인트라바디는 때때로 단리된 VH 및 VL 도메인과 같은 단일 도메인 단편으로서 또는 세포 내 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 항체로서 재조합에 의해 발현된다. 예를 들어, 인트라바디는 때때로 단일 폴리펩타이드로 발현되어 플렉시블 링커 폴리펩타이드에 의해 결합된 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 단일 사슬 항체를 형성한다. 인트라바디는 전형적으로는 이황화 결합이 부족하고 특이적 결합 활성을 통해 표적 유전자의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다. 단일 사슬 항체는 또한 경쇄 불변 영역에 결합된 단일 사슬 가변 영역 단편으로서 발현될 수 있다.
해당 분야에 공지된 바와 같이, 인트라바디는 N 또는 C 말단에서 세포 이하 교환 신호를 암호화하여 표적 단백질이 위치하는 세포 이하의 구획에서 고동도로 발현을 허용하도록 재조합 폴리뉴클레오타이드 벡터로 조작될 수 있다. 예를 들어, 소포체 (ER)로 표적화된 인트라바디는 선도 펩타이드 및, 선택적으로, C-말단 ER 보유 신호, 예컨대 KDEL (서열 번호: 23) 아미노산 모티프(motif)를 포함하도록 조작된다. 핵에서 활성을 발휘하도록 의도된 인트라바디는 핵 국소화 신호를 포함하도록 조작된다. 인트라바디를 원형질막의 세포의 시토졸 측에 테더링하기 위해 지질 모이어티가 인트라바디에 결합된다. 인트라바디는 또한 시토졸에서 기능을 발휘하도록 표적화될 수 있다. 예를 들어, 시토졸 인트라바디는 시토졸 내 인자들을 격리시켜, 자연적인 세포의 목적지로 이동하는 것을 방지하는데 사용된다.
인트라바디 발현을 이용한 특정 기술적인 시도가 존재한다. 특히, 세포 내에서 새롭게 합성된 인트라바디의 단백질 입체구조적 폴딩 및 구조적 안정성은 세포 내 환경의 환원성 조건에 의해 영향을 받는다. 인간 임상 요법에서, 세포 내에서 인트라바디 발현을 달성하는데 사용되는 트랜스펙션된 재조합 DNA의 적용을 둘러싼 안전성 문제가 존재한다. 유전적 조작에서 흔히 사용되는 다양한 바이러스-기반 벡터가 특히 문제이다. 따라서, 이 문제들을 피하기 위한 한 접근법은 단백질 형질 도입 도메인 (PTD)을 scFv 항체에 융합시켜 '세포-투과성' 항체 또는 '트랜스바디'를 생성하는 것이다. 트랜스바디는 단백질 형질 도입 도메인 (PTD)이 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 항체와 융합된 세포-투과성 항체이다 (Heng and Cao, 2005, Med Hypotheses. 64:1105-8).
표적 유전자와 상호작용시, 인트라바디는 표적 단백질 분해의 가속화 및 비-생리학적 세포 이하의 구획에서 표적 단백질의 격리와 같은 메커니즘에 의해 표적 단백질 기능을 조절하고 및/또는 표현형/기능적 넉아웃을 달성한다. 인트라바디-매개된 유전자 비활성화의 다른 메커니즘은 표적 단백질 상의 촉매 부위 또는 단백질-단백질, 단백질-DNA, 또는 단백질-RNA 상호작용에 수반되는 에피토프로의 결합과 같이 인트라바디가 배향되는 에피토프에 따라 다를 수 있다.
한 구체예에서, 인트라바디는 핵에서 표적을 캡쳐하여, 핵 내에서의 활성을 방지하는데 사용된다. 핵 표적화 신호는 원하는 표적화를 달성하기 위해 이러한 인트라바디로 조작된다. 이러한 인트라바디는 특정 표적 도메인에 특이적으로 결합하도록 디자인된다. 또 다른 구체예에서, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 시토졸 인트라바디는 표적이 핵에 접근하는 것을 방지하여, 핵 내에서 임의의 생물학적 활성을 발휘하는 것을 방지하는데 (예를 들어, 표적이 다른 인자들과 전사 복합체를 형성하는 것을 방지) 사용된다.
특정 세포에 대한 이러한 인트라바디의 발현을 특이적으로 지시하기 위해, 인트라바디의 전사는 적절한 종양-특이적 프로모터 및/또는 인핸서의 제어 하에 배치된다. 인트라바디 발현을 특이적으로 전립선으로 표적화하기 위해서, 예를 들어, PSA 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서가 이용될 수 있다 (예를 들어, 1999년 7월 6일에 발행된 미국 특허 번호 5,919,652 참조).
단백질 형질 도입 도메인 (PTD)은 비전형적인 분비 및 내재화 경로를 통해 단백질이 세포막을 가로질러 전위되고 시토졸 내에 내재화될 수 있게 하는 짧은 펩타이드 서열이다. '트랜스바디'가 세포 내에서 발현된 통상적인 인트라바디를 보유한다는 많은 뚜렷한 이점이 존재한다. 우선, 표적 세포로의 도입 전에 '올바른' 입체구조적 폴딩 및 이황화 결합 형성이 일어날 수 있다. 더 중요하게는, 세포-투과성 항체 또는 '트랜스바디'의 사용이 인간 임상 요법에서 재조합 DNA 기술의 직접적인 적용을 둘러싼 압도적인 안전성 및 윤리적 문제를 피할 것이며, 이것은 세포 내 인트라바디 발현에 필요하다. 세포에 도입된 '트랜스바디'는 임의의 영구적인 유전적 변화를 일으키지 않으면서, 단지 제한된 활성 반감기만을 보유할 것이다. 이것은 인간 임상 요법에서의 적용에 관한 임의의 안전성 문제를 완화할 것이다 (Heng and Cao 2005, Med Hypotheses. 64:1105-8).
인트라바디는 병리학적 아이소폼을 포함한, 단백질의 상이한 입체구조를 특이적으로 인식할 수 있는 사실상 무한한 능력 때문에, 그리고 그것들이 잠재적인 응집 부위에 표적화될 수 있기 때문에 (세포 내 및 세포 외 부위 모두), 알츠하이머 병(Alzheimer's), 파킨슨 병(Parkinson's), 헌팅턴 병(Huntington's) 및 프리온(prion) 질환을 포함한 미스폴딩 질환의 치료를 위한 촉망받는 치료제이다. 이들 분자는 응집을 방지함으로써 아밀로이드 형성성 단백질에 대한 중성화제로서, 및/또는 잠재적 응집 부위로부터 단백질을 리라우팅(rerouting)함으로써 세포 내 교환의 분자적 션터(shunter)로서 작용할 수 있다 (Cardinale, and Biocca, Curr . Mol. Med. 2008, 8:2-11).
세포 내 항체 또는 인트라바디를 기술하는 예시의 특허 공보는 본원에서 하기 제시되어 있으며, 각가 그 전문이 참조로 포함된다.
Cattaneo, et al.에 대하여 등록된 PCT 공보 WO03014960 및 US 특허 7,608,453은 다음 단계를 포함하는, 세포 내 항체 (ICS)에 대하여 적어도 하나의 공통 서열을 확인하는 세포 내 항체 캡쳐 기술 방법을 기술한다: 검증된 세포 내 항체의 서열을 포함하는 데이터베이스 (VIDA 데이터베이스)를 생성하고 Kabat에 따라 검증된 세포 내 항체의 서열을 정렬하는 단계; 특정 아미노산이 정렬된 항체의 각각의 위치에서 발생하는 빈도를 결정하는 단계; 70% 내지 100%의 범위에서 빈도 역가 (LP 또는 공통 역가)를 선택하는 단계; 특정 아미노산의 빈도가 LP 값 이상인 정렬의 위치를 확인하는 단계; 상기 정렬의 위치에서 가장 빈번한 아미노산을 확인하는 단계.
모두 Medical Research Council에 양도되고 발명자 Cattaneo, 등을 포함하는 PCT 공보 WO0054057; WO03077945; WO2004046185; WO2004046186; WO2004046187; WO2004046188; WO2004046189; US 특허 출원 공보 US2005272107; US2005276800; US2005288492; US2010143939; 등록된 US 특허 7,569,390 및 7,897,347 및 등록된 유럽 특허 EP1560853; 및 EP1166121은 세포 내 단일 도메인 면역글로불린, 및 면역글로불린 단일 도메인이 세포 내 환경에서 표적에 결합할 수 있는 능력을 결정하는 방법, 뿐만 아니라 세포 내 항체를 생성하는 방법을 기술한다.
발명자로서 Catteneo를 명명하고 S.I.S.S.A. Scuola Internazionale Superiore에 양도된 PCT 공보 WO0235237; US 특허 출원 공보 2003235850 및 등록된 유럽 특허 EP1328814는 세포 내 항원의 에피토프의 생체 내 확인 방법을 기술한다.
Lay Line Genomics SPA에 양도되고 발명자로서 Catteneo를 명명한 PCT 공보 WO2004046192 및 유럽 특허 EP1565558은 세포 내부에서 단백질 리간드 x와 단백질 리간드 y 간의 상호작용을 방해하고 중화시키는 세포 내 항체를 단리시키는 방법을 기술한다. 또한 x와 y 사이에서 상호작용 가능한 세포 내 항체를 사용하여 공지된 y 리간드에 결합할 수 있는 단백질 리간드 x를 확인하는 방법; 및 주어진 세포의 단백질-단백질 상호작용의 상당한 부분 (인터액톰(interactome))에 대한 또는 세포 내 경로 또는 네트워크를 구성하는 단백질 상호작용에 대한 일련의 항체 단편의 단리 방법이 개시된다.
"면역 반응의 인트라바디-매개된 제어"라는 명칭을 갖고 Dana Farber Cancer Institute Inc.에 양도되고 발명자 Marasco 및 Mhashilkar를 명명한 US 특허 출원 공보 2006034834 및 PCT 공보 WO9914353은, 예를 들어, 세포를 IRM에 대한 세포 내에서 발현되는 항체, 또는 인트라바디로 형질 도입시키는 것을 포함하여, 세포 상의 면역 조절 수용체 분자 (IRM)의 개별 또는 분류를 선택적으로 표적화함으로써 면역 시스템의 조절을 변화시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서 인트라바디는 IRM, 예를 들어, MHC-1 분자에 대한 단일 사슬 항체를 포함한다.
Dana Farber Cancer Institute Inc. 및 Whitehead Biomedical Institute에 양도되고 발명자 Bradner, Rahl 및 Young을 명명한 PCT 공보 WO2013033420은 브로모도메인(bromodomain) 단백질과 면역글로불린 (Ig) 조절 요소 간의 상호작용을 억제하고 Ig 유전자좌와 전위된 종양 유전자의 발현을 하향조절하는 것, 뿐만 아니라 Ig 유전자좌와 전위된 종양 유전자의 증가된 발현을 특징으로 하는 암 (예를 들어, 혈액학적 악성 종양)을 치료하는데 유용한 방법 및 조성물을 기술한다. 인트라바디가 일반적으로 기술된다.
명칭이 "진핵 세포에서 인트라바디를 생산하거나 확인하는 방법"이고, University of Rochester Medical Center에 양도되고 발명자 Zauderer, Wei 및 Smith를 명명한 PCT 공보 WO02086096 및 US 특허 출원 공보 2003104402는 3분자 재조합 방법을 사용하여 진핵 세포에서 세포 내 면역글로불린 분자 및 세포 내 면역글로불린 라이브러리를 발현하는 고효율 방법을 기술한다. 세포 내 면역글로불린 분자 및 이것의 단편을 선택하고 스크리닝하는 방법, 및 세포 내 면역글로불린 분자를 생산하고, 스크리닝하고 선택하기 위한 키트, 뿐만 아니라 이들 방법을 사용하여 생산된 세포 내 면역글로불린 분자 및 단편이 더 제공된다.
Affinity Biosciences PTY LTD에 양도되고 발명자 Beasley, Niven 및 Kiefel을 명명한 PCT 공보 WO2013023251은 폴리펩타이드, 예컨대 항체 분자 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이것들의 라이브러리를 기술하며, 발현된 폴리펩타이드는 높은 안정성 및 가용성을 입증한다. 특히, 환원성 또는 세포 내 환경에서 가용성 발현 및 폴딩을 입증하는 쌍 형성된 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 기술되며, 인간 scFv 라이브러리가 스크리닝되어, 인간 생식계열 서열과 동일한 프레임워크 영역을 가진 가용성 scFv 유전자의 단리, 뿐만 아니라 scFv 스캐폴드로의 CDR3 이식의 현저한 열안정성 및 관용성을 제공한다.
Esbatech AG 및 University of Zuerich에 양도되고 발명자 Ewert, Huber, Honneger 및 Plueckthun을 명명한 유럽 특허 출원 EP2314622와 PCT 공보 WO03008451 및 WO03097697은 인간 가변 도메인의 변형을 기술하고 프레임워크로서 매우 안정하고 가용성인 단일 사슬 Fv (scFv) 항체 단편의 생성에 유용한 조성물을 제공한다. 이들 프레임워크는 세포 내 성능을 위해 선택되었으며 따라서 이상적으로는 안정성 및 가용성이 세포의 환원성 환경에서와 같이 항체 단편의 성능에 대한 제한 인자인 적용을 위한 scFv 항체 단편 또는 scFv 항체 라이브러리의 생성에 적합하다. 이러한 프레임워크는 또한 고도로 보존된 잔기와 공통 서열을 확인하는데 사용될 수 있으며 이것은 향상된 가용성 및 안정성을 입증한다.
명칭이 "치료제의 인트라바디 표적화된 전달 및 리로딩을 위한 시스템 디바이스 및 방법"인 PCT 공보 WO02067849 및 US 특허 출원 공보 2004047891은 본자의 인트라바디 표적화된 전달을 위한 시스템, 디바이스 및 방법을 기술한다. 더 구체적으로, 일부 구체예는 국소화되고 시기 적절한 방식으로 대상체의 조직 영역에 치료제의 표적화된 전달이 가능한 리로딩 가능한 약물 전달 시스템에 관한 것이다,
Amgen Inc.에 양도되고 발명자 Zhou, Shen 및 Martin을 명명한 PCT 공보 WO2005063817 및 US 특허 7,884,054는 인트라바디를 포함한 기능적 항체를 확인하는 방법을 기술한다. 특히, 호모다이머의 각각의 폴리펩타이드 사슬이 Fc 영역, scFv, 및 세포 내 국소화 서열을 포함하는 호모다이머 인트라바디가 기술된다. 세포 내 국소화 서열은 인트라바디가 ER 또는 골지(Golgi)에 국소화되게 할 수도 있다. 선택적으로, 각각의 폴리펩타이드 사슬은 하나 이하의 scFv를 포함한다.
Permeon Biologics Inc.에 양도되고 Vogan, 등에 의한 PCT 공보 WO2013138795는 세포 내 항체 및 항체-유사 모이어티의 전달을 위한 세포 침투 조성물 및 그것들을 (본원에서 "AAM 모이어티들" 또는 "AAM 모이어티"라고 불림) 세포로 전달하는 방법을 기술한다. 어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, 본 발명은, 적어도 부분적으로는, AAM 모이어티를 표면 양전하를 가진 세포 침투 폴리펩타이드 (본원에서 "Surf+ 침투 폴리펩타이드"라고 불림)와 복합체를 형성함으로써 AAM 모이어티가 세포로 전달될 수 있다는 발견을 기초로 한다. 인트라필린 기술의 일부 적용의 예가 또한 제공된다.
Pasteur Institute에 양도된 PCT 공보 WO2010004432는 낙타과 (낙타, 단봉낙타, 라마 및 알파카)의 면역글로불린을 기술하는데, 이것의 약 50%는 경쇄가 없는 항체이다. 이들 중쇄 항체는 VHH(들), VHH 도메인(들) 또는 VHH 항체 (들)라고 불리는 단지 하나의 단일 가변 도메인에 의해 항원과 상호작용한다. 경쇄의 부재에도, 이들 호모다이머 항체는 초가변 영역을 확대함으로써 광범위한 항원-결합 레퍼토리를 나타내고, VHH 도메인이 세포 내 표적에 대한 것일 때, 시험관 내에서, 뿐만 아니라 생체 내에서 트랜스바디 및/또는 인트라바디로서 작용할 수 있다.
PCT 공보 WO2014106639는 세포 표현형을 변형시킬 수 있는 인트라바디를 확인하고 인트라바디의 직접적인 또는 간접적인 세포 표적을 확인함으로써 세포 표현형에 수반된 세포 표적을 확인하는 방법을 기술한다. 특히, 인트라바디 3H2-1, 3H2-VH 및 5H4는 비만 세포에서 알레르기 자극에 의해 촉발된 탈과립 반응을 억제할 수 있으며; 게다가, 인트라바디 3H2-1 및 5H4는 각각 ABCF1 패밀리 및 C120RF4 패밀리의 단백질을 직접적으로 또는 간접적으로 표적화하였다. 이들 ABCF1 및 C120RF4 억제자는 요법에서, 특히 알레르기 및/또는 염증성 병태를 치료하는데 유용한 것들이다.
Urogenesis Inc.에 양도된 PCT 공보 WO0140276은 세포 내 항체 (인트라바디)를 사용하여 STEAP (전립선의 여섯 개의 막관통 상피 항원) 단백질의 억제 가능성을 기술한다.
University of Manchester에 양도된 PCT 공보 WO02086505 및 발명자 Simon 및 Benton을 명명한 US 특허 출원 공보 US2004115740은 표적 분자의 세포 내 분석 방법을 기술하는데, 인트라바디가 바람직한 것이다. 한 구체예에서, CFP에 커플링된 항-MUC1 인트라바디를 발현할 수 있는 벡터 (pScFv-ECFP로 지정됨)가 기술된다.
Gene Therapy Systems Inc.에 양도된 PCT 공보 WO03095641 및 WO0143778은 세포 내 단백질 전달을 위한 조성물 및 방법을 기술하고, 인트라바디가 일반적으로 기술된다.
Selective Genetics Inc.에 양도된 PCT 공보 WO03086276은 플랫폼 기술을 기술한다. 본원에서 기술된 조성물 및 방법은 감염과 관련된 세포 표면 수용체/모이어티를 통해 결합하고 내재화되는 결합된 리간드를 통해 감염 가능한 세포를 표적화하는 비-표적 특이적 벡터를 포함한다. 벡터는 표적 세포로 내재화될 때 발현되는 외인성 핵산 서열을 포함한다. 벡터 회합된 리간드 및 핵산 분자는 상이한 감염원을 표적화하도록 변화될 수도 있다. 이에 더하여, 본 발명은 벡터의 내재화를 지시할 수 있고 바이러스 진입을 차단할 수 있는 에피토프 및 리간드를 확인하는 방법을 제공한다.
Erasmus University에 양도된 PCT 공보 WO03062415는 레트로바이러스 단백질, 예컨대 PERV 입자 단백질에 특이적으로 결합하는 세포 내 항체를 암호화하는 이종 항원 갈락토오스 α1,3 갈락토오스 및/또는 폴리뉴클레오타이드 구조체의 생산에 대한 촉매 작용을 방해하는 세포 내 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 트랜스제닉 유기체를 기술한다. 트랜스제닉 유기체의 세포, 조직 및 장기는 이종 기관 이식에 사용될 수도 있다.
"단백질 입체구조의 검출 방법 및 그것의 적용"이라는 명칭의 PCT 공보 WO2004099775는 입체구조적 단백질 상태를 특이적으로 검출하기 위한 입체구조-특이적 항체로서 scFv 단편의 사용을 기술하며, 이것은 살아있는 세포에서, 세포 내 발현시, 내인성 단백질 행동에 따르는 센서로서의 용도를 갖는다.
Imclone Systems Inc.에 양도된 PCT 공보 WO2008070363은 비-수용체 티로신 키나아제의 Tec 패밀리의 구성원인 Etk, 내피 및 상피 티로신 키나아제와 같은, 세포 내 단백질 또는 세포 내 단백질의 세포 내 도메인에 결합하는 단일 도메인 인트라바디를 기술한다. 또한 세포 내 효소를 억제하고, 인트라바디 또는 인트라바디를 발현하는 핵산을 투여함으로써 환자의 종양을 치료하는 방법이 제공된다.
Cornell Research Foundation Inc.에 양도된 PCT 공보 WO2009018438은 표적 분자에 결합하는 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 구조체를 제공함으로써 표적 분자에 결합하고 세포 내 기능성을 가진 단백질을 확인하는 방법을 기술하며, DNA 분자는 정지(stall) 서열에 커플링된다. 숙주 세포는 구조체로 형질전환된 다음 숙주 세포 내에서, 번역이 정지된 단백질 복합체, 단백질을 암호화하는 mRNA, 및 리보솜을 형성하기에 효과적인 조건 하에 배양된다. 복합체네 단백질은 적절하게 폴딩된 활성 형태로 되어 있고 복합체는 세포로부터 회수된다. 이 방법은 숙주 세포 대신에 리보솜을 함유하는 무세포 추출물 조제물로 수행될 수 있다. 본 발명은 또한 표적 분자에 결합하는 단백질을 암호화하는 DNA 분자 및 DNA 분자에 커플링된 SecM 정지 서열을 포함하는 구조체에 관한 것이다. DNA 분자 및 SecM 정지 서열은 그것들 사이에 충분한 거리를 두고 커플링되어 세포 내에서, 적절하게 폴딩된 활성 형태로 암호화된 단백질의 발현을 허용한다. 인트라바디의 사용이 일반적으로 기술된다.
Mogam Biotech Research Institute에 양도된 PCT 공보 WO2014030780은 표적 단백질과 항생제-저항성 단백질이 Tat 신호 서열에 연결되는 유전자 구조체를 제조한 다음, 대장균(E. coli) 내에서 이것을 발현시킴으로써 더 높은 가용성 및 탁월한 열안정성을 가진 표적 단백질, 특히, 표적 단백질과 항생제-저항성 단배질이 Tat 신호 서열에 연결된 유전자구조체를 제조한 다음, 대장균(E. coli) 내에서, 이것을 발현시킴으로써 인간 생식 세포로부터 유래된 면역글로불린 가변 도메인 (VH 또는 VL)을 스크리닝하기 위해 Tat-관련된 단백질 조작 (TAPE)이라고 명명된 방법을 기술한다. 또한 가용성 및 탁월한 열안정성을 가진 인간 또는 조작된 VH 및 VL 도메인 항체 및 인간 또는 조작된 VH 및 VL 도메인 항체 스캐폴드가 개시되는데, 이것은 TAPE 방법으로 스크리닝된다. 또한 TAPE 방법에 의해 스크리닝된 인간 또는 조작된 VH 또는 VL 도메인 항체 스캐폴드에서 무작위 CDR 서열을 포함하는 라이브러리, 이것의 제조 방법, 라이브러리를 사용하여 스크리닝된 표적 단백질에 결합하는 능력을 가진 VH 또는 VL 도메인 항체, 및 도메인 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
유럽 특허 출원 EP2422811은 세포 내 에피토프에 결합하는 항체를 기술하며; 이러한 인트라바디는 항원에 특이적으로 결합할 수 있고 바람직하게는 분비를 암호화하는 작동 가능한 서열을 함유하지 않으며 따라서 세포 내에서 유지되는 항체의 적어도 일부를 포함한다. 한 구체예에서, 인트라바디는 scFv를 포함한다. scFv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에서 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩타이드 링커를 더 포함한다. 또한 인트라바디가 Eph 수용체의 세포질 도메인에 결합하고 그것의 신호 전달 (예를 들어, 자가인산화)을 방지하는 특정 구체예가 기술된다. 또 다른 특정 구체예에서, 인트라바디는 B형 에프린의 세포질 도메인 (예를 들어, 에프린B1, 에프린B2 또는 에프린B3)에 결합한다.
PCT 공보 WO2011003896 및 유럽 특허 출원 EP2275442는 증식성 세포 핵 항원 (PCNA)에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 사용하여 제조된 세포 내 기능적 PCNA-크롬바디를 기술한다. 한 개 또는 두 개의 프레임워크 영역에서 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환을 포함하는 이러한 폴리펩타이드의 예는 폴리펩타이드의 프레임워크 영역을 포함하여, MANVQLNESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISPSGAVKAYSDSVKGRFTISRDNAKNRLYLQMNSLTPEDTGEYFCTKVQSPRTRIPAPSSQGTQVTVSS (서열 번호: 19) 및 MANVQLNESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISPSGAVKAYSDSVKGRFTISRDNAKNRLYLQMNSLTPEDTGEYFCTKVQSPRTRIPAPSSQGTQVTVSS (서열 번호: 20)을 포함한다. 예에서, PCNA의 결합에 수반된 프레임워크 영역, 뿐만 아니라 CDR 영역이 결정되었다.
유럽 특허 출원 EP2703485는 혈장 세포 또는 형질아세포를 선택하는 방법, 뿐만 아니라 표적 항원 특이적 항체, 및 새로운 단클론성 항체를 생산하는 방법을 기술한다. 한 구체예에서, 세포 내 면역글로불린을 발현하는 세포가 확인되었다.
항체-코팅된 작용제
일부 구체예에서, 본원에서 기술된 항체 또는 항체 단편은 항체-코팅된 작용제를 포함하는 조성물을 제조하는데 사용될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체-코팅된 작용제"는 임의의 입자, 나노입자, 분자, 단백질, 융합-단백질, 지질, 리포솜, 세포막, 세포, 또는 하나 이상의 표면-관련된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 다른 구조를 말한다. 항체-코팅된 작용제는 코팅에 사용된 항체 또는 항체 단편의 특이성에 기초하여 하나 이상의 글리칸, 단백질, 세포, 조직, 및/또는 기관을 표적화할 수도 있다.
항체-코팅된 작용제는 회합된, 밀폐된, 또는 임베딩된(embedding) 카고를 포함할 수도 있다. 카고는 검출 가능한 라벨일 수도 있다. 일부 카고는 하나 이상의 치료제를 포함할 수도 있다. 이러한 치료제는 약물, 화학치료제, 및 세포독성제를 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포독성제는 세포를 살해하거나 그렇지 않으면 비활성화시키는데 사용될 수도 있다. 세포독성제는 세포골격 억제자 [예를 들어, 튜불린 폴리머화 억제자, 예컨대 메이탄신 또는 아우리스타틴 (예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 E [MMAE] 및 모노메틸 아우리스타틴 F [MMAF]), 및 키네신 방추사 단백질 (KSP) 억제자], DNA 손상제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 듀오카르마이신, 및 피롤로벤조디아제핀 다이머, 예컨대 탈리린 및 테시린), 토포이소머라아제 억제자 [예를 들어, 캄프토테신 화합물 또는 유도체, 예컨대 7-에틸-10-하이드록시캄프토테신 (SN-38) 및 엑사테칸 유도체 DXd], 전사 억제자 (예를 들어, RNA 폴리머라아제 억제자, 예컨대 아마니틴), 및 키나아제 억제자 [예를 들어, 포스포이노시티드 3-키나아제 (PI3K) 억제자 또는 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 키나아제 (MEK) 억제자]를 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 항체-코팅된 작용제는 본원에서 기술된 하나 이상의 항체 또는 항체 단편으로 코팅된 나노입자를 포함할 수도 있다. 이러한 항체-코팅된 작용제는, 제한되는 것은 아니지만, 세포-관련된 글리칸을 포함한, 하나 이상의 글리칸을 표적화할 수도 있다. 일부 이러한 항체-코팅된 작용제는 하나 이상의 세포독성제를 포함한다.
단백질 및 변이체
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 전체 폴리펩타이드, 복수의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 단편으로 존재할 수도 있으며, 이것들은 하나 이상의 핵산, 복수의 핵산, 상기 언급된 것들 중 어느 것의 핵산 또는 변이체의 단편에 의해 독립적으로 암호화될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"는 가장 빈번하게는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기 (천연 또는 비천연)의 폴리머를 의미한다. 용어는, 본원에서 사용된 바와 같이, 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 폴리펩타이드, 및 펩타이드를 말한다. 어떤 경우에 암호화된 폴리펩타이드는 약 50개 아미노산보다 더 작고 이때 폴리펩타이드는 펩타이드라고 불린다. 폴리펩타이드가 펩타이드인 경우, 그것은 적어도 약 2, 3, 4, 또는 적어도 5개의 아미노산 잔기 길이일 것이다. 따라서, 폴리펩타이드는 유전자 생성물, 자연 발생 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드, 상동체, 오르쏠로그, 파라로그, 단편 및 다른 동등물, 변이체, 및 상기 언급된 것들의 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단일 분자일 수도 있거나 또는 다이머, 트라이머 또는 테트라머와 같은 다중-분자 복합체일 수도 있다. 그것들은 또한 단일 사슬 또는 다중 사슬 폴리펩타이드를 포함할 수도 있고 회합되거나 연결될 수도 있다. 용어 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 폴리머에 적용될 수도 있다.
용어 "폴리펩타이드 변이체"는 고유한 또는 참조 서열의 아미노산 서열이 상이한 분자를 말한다. 아미노산 서열 변이체는 고유한 또는 참조 서열과 비교하여 아미노산 서열 내 특정 위치에서 치환, 결실, 및/또는 삽입을 가지고 있을 수도 있다. 보통, 변이체는 고유한 또는 참조 서열에 대하여 적어도 약 50% 동일성 (상동성)을 가질 것이고, 바람직하게는, 그것들은 고유한 또는 참조 서열과 적어도 약 80%, 더 바람직하게는 적어도 약 90% 동일할 것이다 (상동성).
일부 구체예에서 "변이체 모방체"가 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변이체 모방체"는 활성화된 서열을 모방하는 하나 이상의 아미노산을 함유하는 것이다. 예를 들어, 글루타메이트는 포스포로-트레오닌 및/또는 포스포로-세린에 대한 모방체의 역할을 할 수도 있다. 대안으로, 변이체 모방체는 탈활성화를 일으키거나 모방체를 함유하는 비활성화된 생성물을 발생시킬 수도 있으며, 예를 들어, 페닐알라닌은 티로신에 대한 비활성화 치환으로 작용할 수 있거나; 또는 알라닌은 세린에 대한 비활성화 치환으로 작용할 수도 있다. 본 발명의 글리칸-상호작용 항체의 아미노산 서열은 자연 발생 아미노산을 포함할 수도 있고 이와 같이 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 이것의 단편으로 간주될 수도 있다.
대안으로, 글리칸-상호작용 항체는 자연 및 비-자연 발생 아미노산 모두를 포함할 수도 있다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 고유한 또는 시작 서열과 비교하여 아미노산 서열에서 약간의 차이가 있는 분자를 말한다. 아미노산 서열 변이체는 아미노산 서열 내 특정 위치에서 치환, 결실, 및/또는 삽입을 가질 수도 있다. "고유한" 또는 "시작" 서열은 야생형 서열과 혼동되어서는 안 된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 고유한 또는 시작 서열은 비교가 이루어질 수 있는 원래의 분자를 지칭하는 상대적인 용어이다. "고유한" 또는 "시작" 서열 또는 분자는 야생형 (자연에서 발견되는 서열)을 나타낼 수도 있지만 야생형 서열이어야 하는 것은 아니다.
보통, 변이체는 고유한 서열과 비교하여 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 가질 것이다. 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 적용되는 "서열 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)과 단편을 고려한 후 후보 서열에서 제2 서열의 잔기와 동일한 잔기의 퍼센트로 정의된다. 예를 들어, 두 개의 폴리머 서열의 퍼센트 동일성의 계산은 최적의 비교 목적으로 두 개의 서열을 정렬하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 갭은 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 폴리머 서열 중 하나 또는 둘 다에서 도입될 수 있고 동일하지 않은 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 특정 구체예에서, 비교 목적으로 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 상응하는 위치에서의 잔기가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 잔기에 의해 차지될 때, 분자는 상기 위치에서 동일하다. 두 개의 서열 간의 퍼센트 동일성은 두 개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 개수, 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 두 서열 간의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 뉴클레오타이드 서열 간의 퍼센트 동일성은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 (각각 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들과 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 뉴클레오타이드 서열 간의 퍼센트 동일성은 Meyers와 Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이것은 PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)으로 통합되었다. 대안으로, 두 개의 뉴클레오타이드 서열 간의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 간 퍼센트 동일성을 결정하는데 흔히 이용되는 방법은, 제한되는 것은 아니지만, Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988) (본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 것들을 포함한다. 동일성을 결정하기 위한 기술은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화되어 있다. 두 서열 간의 상동성을 결정하기 위한 예시의 컴퓨터 소프트웨어는 GCG 프로그램 패키지, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA Altschul, S. F. et al., J. Molec . Biol ., 215, 403 (1990))을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
아미노산 서열에 적용되는 "상동체"는 제2 종의 제2 서열에 대하여 실질적으로 동일한 다른 종의 상응하는 서열을 의미한다.
"유사체"는 하나 이상의 아미노산 변화, 예를 들어, 모체 폴리펩타이드의 성질을 유지하는 아미노산 잔기의 치환, 추가 또는 결실에 의해 상이한 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 변이체 및 유도체를 포함하여 아미노산 기반인 여러 유형의 글리칸-상호작용 항체를 고려한다. 이것들은 치환, 삽입, 결실 및 공유 변이체 및 유도체를 포함한다. 이와 같이, 치환, 삽입 및/또는 추가, 결실 및 공유 결합에 의한 변형을 함유하는 글리칸-상호작용 항체 분자가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 서열 태그 또는 아미노산, 예컨대 하나 이상의 리신이 본 발명의 펩타이드 서열에 추가될 수 있다 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 단부에서). 서열 태그는 펩타이드 정제 또는 국소화에 사용될 수 있다. 리신은 펩타이드 가용성을 증가시키거나 비오티닐화를 허용하기 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열의 카르복시 및 아미노 말단 영역에 위치한 아미노산 잔기는 선택적으로 결실되어 절단된 서열을 제공할 수도 있다. 특정 아미노산 (예를 들어, C-말단 또는 N-말단 잔기)은 대안으로 서열의 사용, 예를 들어, 가용성이거나, 또는 고체 지지체에 연결된 더 큰 서열의 일부로서 서열의 발현에 따라 결실될 수도 있다.
"치환 변이체"는 단백질을 말할 때 고유한 또는 시작 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 동일한 위치에서 그 자리에 상이한 아미노산이 삽입된 것들이다. 치환은 분자에서 단지 하나의 아미노산이 치환된 경우, 단일성일 수도 있거나, 또는 동일한 분자에서 둘 이상의 아미노산이 치환된 경우, 다중성일 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 크기, 전하, 또는 극성의 상이한 아미노산을 가진 서열에 일반적으로 존재하는 아미노산의 치환을 말한다. 보존적 치환의 예는 또 다른 비-극성 잔기에 대한 비-극성 (소수성) 잔기, 예컨대 아이소류신, 발린 및 류신의 치환을 포함한다. 유사하게, 보존적 치환의 예는 아르기닌과 리신, 글루타민과 아스파라긴, 및 글리신과 세린 사이와 같이 하나의 극성 (친수성) 잔기의 다른 극성 잔기로의 치환을 포함한다. 추가적으로, 염기성 잔기, 에컨대 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 또 다른 염기성 잔기로의 치환, 또는 하나의 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산의 또 다른 산성 잔기로의 치환이 보존적 치환의 추가적인 예이다. 비-보존적 치환의 예는 극성 (친수성) 잔기, 예컨대 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신에 대한 비-극성 (소수성) 아미노산 잔기, 예컨대 아이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 메티오닌의 치환 및/또는 비-극성 잔기에 대한 극성 잔기의 치환을 포함한다.
"삽입 변이체"는 단백질을 말할 때 고유한 또는 시작 서열의 특정 위치에서 아미노산에 바로 인접하게 삽입된 하나 이상의 아미노산을 가진 것들을 말한다. 아미노산에 "바로 인접한"은 아미노산의 알파-카르복시 또는 알파-아미노 작용기에 연결된 것을 의미한다.
"결실 변이체"는 단백질을 말할 때 고유한 또는 시작 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것들이다. 보통, 결실 변이체는 분자의 특정 영역에서 하나 이상의 아미노산이 결실될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유도체"는 용어 "변이체"와 동의어로 사용되고 참조 분자 또는 시작 분자에 관하여 어떤 방식으로도 변형되거나 변화된 분자를 말한다. 일부 구체예에서, 유도체는 유기 단백질성 또는 비-단백질성 유도체화제, 및 번역 후 변형으로 변형된 고유한 또는 시작 단백질을 포함한다. 공유 변형은 전통적으로 단백질의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써, 또는 선택된 재조합 숙주 세포에서 기능하는 번역 후 변형의 메커니즘을 활용함으로써 도입된다. 결과로 생성된 공유 유도체는 생물학적 활성, 면역분석, 또는 재조합 당단백질의 면역친화도 정제를 위한 항-단백질 항체의 제조에 중요한 잔기를 확인하는 것에 관한 프로그램에서 유용하다. 이러한 변형은 해당 분야의 기술 범위 내에 있으며 이러한 변형은 과도한 실험 없이 수행된다.
특정 번역 후 변형은 발현된 폴리펩타이드에서 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 빈번하게 번역 후에 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화된다. 대안으로, 이들 잔기는 약산성 조건 하에서 탈아미드화된다. 이들 잔기는 본 발명에 따라 사용된 단백질에 어떠한 형태로도 존재할 수 있다.
다른 번역 후 변형은 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노 기의 메틸화를 포함한다 (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)).
공유 유도체는 본 발명의 단백질이 비-단백질성 폴리머에 공유 결합되는 융합 분자를 특이적으로 포함한다. 비-단백질성 폴리머는 보통 친수성 합성 폴리머, 즉 달리 자연에서 발견되지 않는 폴리머이다. 하지만, 자연에 존재하고 재조합 또는 시험관 내 방법에 의해 생산되는 폴리머는 자연으로부터 단리된 폴리머와 같이 유용하다. 친수성 폴리비닐 폴리머는 본 발명의 범위 내에 있으며, 예를 들어, 폴리비닐알콜 및 폴리비닐피롤리돈이 있다. 폴리비닐알킬렌 에테르, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜이 특히 유용하다. 단백질은 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에서 제시된 방식으로 다양한 비-단백질성 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 연결될 수도 있다.
"특징"은 단백질을 말할 때 분자의 별개의 아미노산 서열-기반 구성요소로 정의된다. 본 발명의 단백질의 특징은 표면 발현, 국소적 입체구조 형상, 폴드, 루프, 하프-루프(half-loop), 도메인, 하프-도메인(half-domain), 부위, 말단 또는 이것들의 임의의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 단백질을 말할 때 용어 "표면 발현"은 가장 바깥쪽 표면에서 나타난 단백질의 폴리펩타이드 기반 구성요소를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이 단백질을 말할 때 용어 "국소적 입체구조 형상"은 단백질의 한정 가능한 공간 내에 위치한 단백질의 폴리펩타이드 기반 구조적 발현을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 단백질을 말할 때 용어 "폴드"는 에너지 최소화시 아미노산 서열의 결과적 입체구조를 의미한다. 폴드는 폴딩 공정의 2차 또는 3차 수준에서 일어날 수 있다. 2차 수준 폴드의 예는 베타 시트(sheet) 및 알파 헬릭스(helix)를 포함한다. 3차 폴드의 예는 정력적인 힘의 응집 또는 분리로 인해 형성된 도메인 및 영역을 포함한다. 이 방법으로 형성된 영역은 소수성 및 친수성 포켓, 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "회전(turn)"은 단백질 입체구조에 관하여 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 백본의 방향을 변화시키는 굽힘(bend)을 의미하고 한 개, 두 개, 세 개 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 수반할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 단백질을 말할 때 용어 "루프"는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 방향을 반전시키고 넷 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 구조적 특징을 말한다. Oliva, 등은 단백질 루프의 적어도 5개의 분류를 확인하였다 (J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997).
본원에서 사용된 바와 같이 단백질을 말할 때 용어 "하프-루프"는 아미노산 잔기가 유래된 루프로서 아미노산 잔기 수의 적어도 절반을 가진 확인된 루프의 일부를 말한다. 루프가 항상 짝수의 아미노산 잔기를 함유하는 것은 아닐 수도 있다. 그러므로, 루프가 홀수의 아미노산을 함유하거나 이것을 포함하는 것으로 확인된 경우, 홀수의 루프의 하프-루프는 루프의 정수 부분 또는 그 다음 정수 부분을 포함할 것이다 (루프의 아미노산의 수/2+/-0.5 아미노산). 예를 들어, 7개의 아미노산 루프로서 확인된 루프는 3개의 아미노산 또는 4개의 아미노산의 하프-루프를 생산할 수 있다 (7/2=3.5+/-0.5는 3 또는 4이다).
본원에서 사용된 바와 같이 단백질을 말할 때 용어 "도메인"은 하나 이상의 확인 가능한 구조적 또는 기능적 특성 또는 성질 (예를 들어, 결합 수용력)을 가지며, 단백질-단백질 상호작용에 대한 부위의 역할을 하는 폴리펩타이드의 모티프를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이 단백질을 말할 때 용어 "하프-도메인"은 아미노산 잔기가 유래된 도메인으로서 아미노산 수의 적어도 절반을 가진 확인된 도메인의 일부를 의미한다. 도메인이 항상 짝수의 아미노산 잔기를 함유하는 것은 아닐 수도 있다. 그러므로, 도메인이 홀수의 아미노산을 함유하거나 이것을 포함하는 것으로 확인된 경우, 홀수의 도메인의 하프-도메인은 도메인의 정수 부분 또는 그 다음 정수 부분을 포함할 것이다 (도메인의 아미노산의 수/2+/-0.5 아미노산). 예를 들어, 7개의 아미노산 도메인으로서 확인된 도메인은 3개의 아미노산 또는 4개의 아미노산의 하프-도메인을 생산할 수 있다 (7/2=3.5+/-0.5는 3 또는 4이다). 또한 서브도메인은 도메인 또는 하프-도메인 내에서 확인될 수 있고, 이들 서브도메인은 그것들이 유래된 도메인 또는 절반 도메인에서 확인된 구조적 또는 기능적 성질 전부보다는 적게 소유한다. 또한 본원의 도메인 유형 중 어느 것의 아미노산은 폴리펩타이드의 백본을 따라 인접할 필요는 없다 (즉, 인접하지 않은 아미노산은 구조적으로 폴딩되어 도메인, 하프-도메인 또는 서브도메인을 생산할 수도 있다).
본원에서 사용된 바와 같이 단백질을 말할 때 용어 "부위"는 아미노산 기반 구체예에 적용될 때 "아미노산 잔기" 및 "아미노산 측쇄"와 동의어로 사용된다. 부위는 본 발명의 폴리펩타이드 기반 분자 내에서 변형되거나, 조작되거나, 변화되거나, 유도체화되거나 또는 달라질 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 내의 위치를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "말단(termini) 또는 말단(terminus)"은 단백질을 말할 때 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 맨 끝을 말한다. 이러한 맨 끝은 단지 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 처음 또는 마지막 부위에만 제한되는 것이 아니라 말단 영역에서 추가적인 아미노산을 포함할 수도 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 기반 분자는 N-말단 (유리 아미노 기 (NH2)를 가진 아미노산으로 종결됨) 및 C-말단 (유리 카르복실 기 (COOH)를 가진 아미노산으로 종결됨) 모두를 가진 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 단백질은 어떤 경우에는 이황화 결합에 의해 또는 비-공유 힘에 의해 합쳐진 다수의 폴리펩타이드 사슬 (멀티머, 올리고머)로 구성된다. 단백질의 이들 부류는 다수의 N- 및 C-말단을 가질 것이다. 대안으로, 폴리펩타이드의 말단은, 경우에 따라, 비-폴리펩타이드 기반 모이어티, 예컨대 유기 컨쥬게이트로 시작하거나 끝나도록 변형될 수도 있다.
특징들 중 어느 것이 본 발명의 분자의 구성요소로서 확인되거나 정의될 때, 이동, 교환, 변환, 결실, 무작위 추출 또는 복제에 의해 이들 특징의 여러 조작 및/또는 변형 중 어느 것이 수행될 수도 있다. 게다가, 특징의 조작은 본 발명의 분자에 대한 변형과 동일한 결과를 초래할 수도 있다. 예를 들어, 도메인의 결실을 수반하는 조작은 전장보다 작은 분자를 암호화하기 위한 핵산의 변형처럼 분자의 길이의 변화를 일으킬 것이다.
변형과 조작은 부위 특이적 돌연변이 유발과 같이 해당 분야에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 결과로 생성된 변형된 분자는 시험관 내 또는 생체 내 분석, 예컨대 본원에서 기술된 것들 또는 해당 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 스크리닝 분석을 사용하여 활성에 대하여 테스트될 수 있다.
동위원소 변화
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 동위원소인 하나 이상의 원자를 함유할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동위원소"는 하나 이상의 추가적인 중성자를 가진 화학적 원소를 말한다. 한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 중수소화될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중수소화된"은 하나 이상의 수소 원자가 중수소 동위원소로 대체된 물질을 말한다. 중수소 동위원소는 수소의 동위원소이다. 수소의 핵은 하나의 양성자를 함유하는 한편 중수소 핵은 중수소 핵은 양성자와 중성자 모두를 함유한다. 글리칸-상호작용 항체는 화합물의 물리적 성질, 예컨대 안정성을 변화시키거나, 또는 화합물이 진단 및 실험 용도로 사용되게 하도록 중수소화될 수도 있다.
컨쥬게이트 및 조합
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 하나 이상의 상동성 또는 이종성 분자와 복합체를 형성하거나, 컨쥬게이션되거나 또는 조합될 수도 있다는 것이 본 발명에서 고려된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "상동성 분자"는 시작 분자에 관하여 구조 또는 기능 중 적어도 하나가 유사한 분자를 의미하는 한편 "이종성 분자"는 시작 분자에 관하여 구조 또는 기능 중 적어도 하나가 상이한 것이다. 그러므로 구조적 상동체는 실질적으로 구조적으로 유사한 분자이다. 그것들은 동일할 수 있다. 기능적 상동체는 실질적으로 기능적으로 유사한 분자이다. 그것들은 동일할 수 있다.
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 컨쥬게이트를 포함할 수도 있다. 본 발명의 이러한 컨쥬게이트는 자연 발생 물질 또는 리간드, 예컨대 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA), 저밀도 지질단백질 (LDL), 고밀도 지질단백질 (HDL), 또는 글로불린); 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질을 포함할 수도 있다. 리간드는 또한 재조합 또는 합성 분자, 예컨대 합성 폴리머, 예를 들어, 합성 폴리아미노산, 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 압타머)일 수도 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리아미노산을 포함하며, 폴리리신 (PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수 코폴리머, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 코폴리머, 디비닐 에테르-말레 무수 코폴리머, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 코폴리머 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리유레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-아이소프로필아크릴아미드 폴리머, 또는 폴리포스파진이다. 폴리아민의 예는 폴리에틸렌이민, 폴리리신 (PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩타이드-폴리아민, 펩티도모방체 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 제4 염, 또는 알파 헬릭스 펩타이드를 포함한다.
컨쥬게이트는 또한 표적화 기, 예를 들어, 세포 또는 조직 표적화 기, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 명시된 세포 유형, 예컨대 신장 세포에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 표적화 기는 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다원자가 락토오스, 다원자가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다원자가 만노오스, 다원자가 푸코오스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다원자가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, RGD 펩타이드, RGD 펩타이드 모방체 또는 압타머일 수 있다.
표적화 기는 단백질, 예를 들어, 당단백질, 또는 펩타이드, 예를 들어, 보조리간드에 특이적인 친화도를 가진 분자, 또는 항체, 예를 들어, 암 세포, 내피 세포, 또는 골 세포와 같은 명시된 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 표적화 기는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수도 있다. 그것들은 또한 비-펩타이드 종, 예컨대 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다원자가 락토오스, 다원자가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다원자가 만노오스, 다원자가 푸코오스, 또는 압타머를 포함할 수 있다.
표적화 기는 특정 수용체를 표적화할 수 있는 임의의 리간드일 수 있다. 예는, 제한 없이, 폴레이트, GalNAc, 갈락토오스, 만노오스, 만노오스-6P, 압타머, 인테그린 수용체 리간드, 케모카인 수용체 리간드, 트랜스페린, 비오틴, 세로토닌 수용체 리간드, PSMA, 엔도텔린, GCPII, 소마토스타틴, LDL, 및 HDL 리간드를 포함한다. 특정 구체예에서, 표적화 기는 압타머이다. 압타머는 변형되지 않거나 본원에서 개시된 변형의 임의의 조합을 가질 수 있다.
다른 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 세포 침투 폴리펩타이드에 공유 결합에 의해 컨쥬게이션된다. 세포-침투 펩타이드는 또한 신호 서열을 포함할 수도 있다. 본 발명의 컨쥬게이트는 증가된 안정성; 증가된 세포 트랜스펙션; 및/또는 변화된 생물 분포 (예를 들어, 특정 조직 또는 세포 유형으로 표적화됨)을 갖도록 디자인될 수 있다.
컨쥬게이팅 모이어티는 클리어런스를 위해 라벨링 또는 플래깅(flagging) 표적을 허용하도록 글리칸-상호작용 항체에 추가될 수 있다. 이러한 태깅/플래깅 분자는, 제한되는 것이 아니라, 유비퀴틴, 형광 분자, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA), c-myc [서열 EQKLISEEDL을 가진 인간 원종양 유전자 myc의 10개 아미노산 세그먼트 (서열 번호: 21)], 히스티딘 (His), 플래그 [서열 DYKDDDDK의 짧은 펩타이드 (서열 번호: 22)], 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (GST), V5 (원숭이 바이러스 5 에피토프의 파라믹소바이러스), 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP) 및 디곡시게닌을 포함한다.
일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 질환 또는 병태의 치료시 서로 또는 다른 분자와 조합될 수 있다.
핵산
본 발명은 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 본 발명의 항체를 암호화한다 (제한되는 것은 아니지만, 항체, 항체 단편, 인트라바디 및 키메라 수용체 항원을 암호화한다). 이러한 핵산 분자는, 제한 없이, DNA 분자, RNA 분자, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, mRNA 분자, 벡터, 플라스미드 및 다른 구조체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "구조체"는, 제한되는 것은 아니지만, 플라스미드, 코스미드, 자가 복제 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 선형 또는 원형 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 임의의 재조합 핵산 분자를 말한다. 본 발명은 또한 글리칸-상호작용 항체를 암호화하는 핵산 분자를 발현하도록 예정되거나 생성된 세포를 포함한다. 이러한 세포는 트랜스펙션, 전기천공법, 바이러스 전달 등의 사용을 통해 생성될 수도 있다. 본 발명의 구조체로 조작된 바이러스는, 제한되는 것은 아니지만, 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-관련된 바이러스 및 파지를 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 핵산은 코돈-최적화된 핵산을 포함한다. 코돈-최적화된 핵산을 생성하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있고, 제한되는 것은 아니지만, US 특허 번호 5,786,464 및 6,114,148 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 핵산 서열은 단백질 발현을 개선하거나 또는 은성(cryptic) 스플라이싱 부위를 제거하기 위해 코돈 최적화된다.
II. 방법 및 사용
치료제
본 발명의 방법은 치료, 진단, 정량, 생물 가공, 실험, 및/또는 조사 목적으로 하나 이상의 글리칸-상호작용 항체를 이용하는 방법을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 글리칸-상호작용 항체는 항-STn 항체를 포함할 수도 있다.
암-관련된 용도
비정상적인 글리코실화는 암 세포 형질전환의 홀마크(hallmark)이다. 다수의 비정상적인 글리코실화 형태가 인간 암에서 기술되었으며, 특정 종양 표적화에 적합한 세포 표면 분자의 분류로서 특정 종양-관련된 탄수화물 항원 (TACA)을 확인하였다 (Cheever, M.A. et al., Clin Cancer Res. 2009 Sep 1;15(17):5323-37). TACA 항원 발현은 제한되는 것은 아니지만, 유방, 결장, 폐, 방광, 자궁경부, 난소, 위, 전립선, 및 간을 포함하는 상피암에서 발견되었다. TACA 항원 발현은, 제한되는 것은 아니지만, 난황낭 종양 및 정상피종(seminoma)을 포함한 배아 암에서 발견되었다. 이에 더하여, TACA 항원 발현은 다양한 조직의 다수의 흑색종, 암종, 및 백혈병에서 발견되었다 (Heimburg-Molinaro et al., Vaccine. 2011 Nov 8: 29(48):8802-8826). 하나 이상의 TACA를 표적화하는 본 발명의 항체는 본원에서 "항-TACA 항체"라고 불린다.
모든 암종의 약 80%가 절단된 글리칸, Tn 항원을 발현하는 것으로 추정된다. 몇 가지 예외로, Tn 및 시알릴화된 형태 시알릴 Tn (STn)은 정상적인 건강한 조직에서 발현되지 않는다. 게다가, 비-인간 면역원성 시알산, N-글리콜릴뉴라민산 (Neu5Gc)은 Neu5Gc-STn (GcSTn)의 형태의 유방암과 같은 암종에서 차별적으로 발현되는 것으로 보인다.
다수의 비정상적인 글리코실화 형태가 인간 암에서 기술되어 있으며, 특이적 종양 표적화에 적합한 세포 표면 분자의 분류로서 특정 글리칸을 확인한다 (Cheever, M.A. et al., Clin Cancer Res. 2009 Sep 1;15(17):5323-37). 예를 들어, 다양한 인간 암 유형 (예컨대 다른 것들 중에서 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 폐, 및 난소암)은 정상 인간 조직에서 드문 STn 항원의 높은 발현을 나타낸다 (Karlen, P. et al., Gastroenterology. 1998 Dec;11 5(6):1395-404; Ohno, S. et al, Anticancer Res. 2006 Nov-Dec;26(6A):4047-53). 이에 더하여, 종양-관련된 뮤신에서 STn의 존재는 불량한 예후를 가진 암에 관한 것이며 암 검출 및 표적화 요법에 대한 매력적인 에피토프로 간주된다 (Cao, Y. et al., Virchows Arch. 1997 Sep;431(3):159-66; Julien, S. et al., Br J Cancer. 2009 Jun 2;100(11):1746-54; Itzkowitz, S.H. et al., Cancer. 1990 Nov 1;66(9):1960-6; Motoo, Y. et al., Oncology. 1991;48(4):321-6; Kobayashi, H. et al., J Clin Oncol. 1992 Jan;10(1):95-101). Tn 및 STn 형성은 활성화된 T-신타아제의 형성에 필요한 분자 샤페론을 암호화하는 유전자 Cosmc에서의 체세포 돌연변이와 연관성이 있다 (Ju, T. et al., Nature. 2005 Oct 27;437(7063):1252; Ju, T. et al., Cancer Res. 2008 Mar 15;68(6):1636-46). 그것은 또한 시알릴 트랜스퍼라아제, ST6GalNAc I의 발현 증가로부터 발생할 수 있다 (Ikehara, Y. et al., Glycobiology. 1999 Nov;9(11):1213-24; Brockhausen, I. et al., Biol Chem. 2001 Feb;382(2):219-32). STn의 데 노보(De novo) 발현은 암종 세포를 조절하고, 악성 표현형을 변화시키고, 더 공격적인 세포 행동을 유도할 수 있다 (Pinho, S. et al., Cancer Lett. 2007 May 8;249(2):157-70). 악성 조직에서 STn이 고도로 발현되지만, 건강한 인간 세포에서도 낮은 수준으로 발견된다 (Jass, J.R. et al., J Pathol. 1995 Jun;176(2):143-9; Kirkeby, S. et al., Arch Oral Biol. 2010 Nov;55(11):830-41). STn는 단독으로 암 검출 및 요법에 대한 표적으로서 주목을 끌었다 (Cheever, M.A. et al., Clin Cancer Res. 2009 Sep 1;15(17):5323-37).
STn의 존재에 더하여, 다른 글리코실화 변화가 암에서 기술되었다. 그것들 중 하나는 Neu5Gc를 수반한다. N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac) 및 Neu5Gc는 포유류 세포 표면 상의 두 개의 주요 시알산이다. Neu5Ac 및 Neu5Gc는 단지 Neu5Gc가 탄소 5에 부착된 화학 기에 회합된 추가적인 산소원자를 포함한다는 점에서만 상이하다. 기능적 유전자의 손실로 인해, 인간은 Neu5Gc가 아니라 단지 Neu5Ac의 형태로만 시알산을 합성할 수 있다. 하지만, Neu5Gc는 붉은 고기과 같은 동물-유래된 식이 공급원으로부터 대사에 의해 인간으로 혼입될 수 있다 (Tangvoranuntakul, P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Oct 14; 100(21):12045-50; Nguyen, D.H. et al., J Immunol. 2005 Jul 1; 175(1):228-36; US7,682,794, US8,084219, US2012/0142903, WO2010030666 and WO2010030666 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). Neu5Gc는 인간 종양 사이에서 매우 풍부하고 (Higashi, H. et al., Cancer Res. 1985 Aug; 45(8):3796-802; Miyoshi I. et al., Mol Immunol. 1986. 23: 631-638; Hirabayashi, Y. et al., Jpn J Cancer Res. 1987. 78: 614-620; Kawachi. S, et al., Int Arch Allergy Appl Immunol. 1988. 85: 381-383; Devine, P.L. et al., Cancer Res. 1991. 51: 5826-5836; Malykh, Y.N. et al, Biochimie. 2001. 83: 623-634 및 Inoue, S. et al., 2010. Glycobiology. 20(6): 752-762) 정상 인간 조직에서 현저히 낮으며, 이는 수십 년 동안 간과되었다 (Diaz, S.L. et al., PLoS One. 2009. 4: e4241; Tangvoranuntakul, P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003. 100: 12045-12050; Varki, A. et al., Glycoconj J. 2009. 26: 231-245). 건강한 인간 조직과 비교하여 암 조직에서 식이-유래된 Neu5Gc의 증가된 대사 축적은 적어도 세 개의 요인으로 설명될 가능성이 크다: 경쟁 내인성 Neu5Ac의 과소 생산과 함께 빠른 성장, 성장 인자에 의해 유도된 거대음세포작용의 향상 (Dharmawardhane, S. et al., Mol Biol Cell. 2000 Oct;11(10):3341-52; Simonsen, A. et al., Curr Opin Cell Biol. 2001 Aug;13(4):485-92; Johannes, L. et al., Traffic. 2002 Jul;3(7):443-51; Amyere, M. et al., Int J Med Microbiol. 2002 Feb;291(6-7):487-94), 및 저산소증에 의한 리소좀 시알산 수송체 유전자 시알린의 유전자 발현의 상향조절 (Yin, J. et al., Cancer Res. 2006 Mar 15;66(6):2937-45). 이에 더하여, 지금까지 테스트된 모든 인간은 이종-자가항원의 첫 번째 예인 비-인간 Neu5Gc에 대한 다클론성 항체 레저버를 포함한다 (Padler-Karavani, V. et al., Glycobiology. 2008 Oct;18(10):818-30; Varki, N.M. et al., Annu Rev Pathol. 2011;6:365-93). 항-Neu5Gc 반응에 직면하여 악성 종양에서 식이 Neu5Gc의 축적은 저등급 만성 염증을 유도함으로써 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다 (Hedlund, M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 2;105(48):18936-41). 따라서, 인간 종양 상의 Neu5Gc 함유 글리칸 에피토프는 약물 표적화에 대한 귀중한 가능성을 나타낸다. 최근 연구는 암 환자에서 Neu5Ac-STn (AcSTn)이 아니라 Neu5Gc-함유 STn (GcSTn)에 대한 항체의 존재를 시사하고 암 검출에 대한 특이적 바이오마커로서 가능성을 탐구한다 (Padler-Karavani, V. et al., Cancer Res. 2011 May 1;71(9):3352-63).
MUC1은 정상적으로는 광범위하게 글리코실화되지만 종양 세포에서는 글리코실화 감소된 핵심 세포 표면 당단백질이다. MUC1의 드문 글리코실화는 면역원성 항원의 노출로 이어진다. 이것들은 MUC1 코어 펩타이드 서열 또는 코어 탄수화물 잔기를 따라 있을 수 있다. 이들 TACA는, 제한되는 것은 아니지만, N-아세틸갈락토사민 (Tn), 시알릴(α2,6)N-아세틸갈락토사민 (STn) 및 갈락토오스(β1-3)N-아세틸갈락토사민 (톰센-프리덴리히 항원 또는 TF로도 알려져 있음)을 포함한다. 모든 암종의 약 80%는 MUC1의 코어 탄수화물 중에서 Tn을 발한하며 STn은 인간 암종 세포에서 강력하게 발현되고 암 진행 및 전이와 관련이 있는 것으로 추정되었다. 몇 가지 예외가 있지만, Tn 및 STn은 정상적인 건강한 조직에서 발현되지 않는다. 시알산은 STn 상에 돌출된 에피토프를 형성한다. 본 발명은 비정상적인 Neu5Gc-STn (GcSTn) 글리칸 발현이 다양한 암종에 고도로 특이적인 것으로 보인다는 사실을 이용한다.
MUC1의 경우에, STn으로의 Neu5Gc 혼입은 종양 조직을 치료하기 위한 항체-기반 용법에 대한 매력적인 표적인 부위인 종양-특이적 표적을 수득한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 Neu5Gc를 포함하는 MUC1 발현 암 세포를 표적화한다. 지금까지, Neu5Gc는, 제한되는 것은 아니지만, 결장암, 망막아종(retinoblastoma) 조직, 흑색종, 유방암 및 난황낭 종양 조직을 포함한 많은 인간 암 조직의 당컨쥬게이트에서 검출되었다. 본 발명의 일부 구체예에서, 방법은 이러한 형태의 암, 뿐만 아니라 본원에서 구체적으로 나열되지 않지만, Neu5Gc를 포함하는 암 세포의 존재를 특징으로 하는 다른 형태의 암의 글리칸-상호작용 항체 치료를 위해 고려된다.
글리칸을 포함하는 추가적인 항원이 암과 관련하여 발현되는 것이 확인되었다 (Heimburg-Molinaro, J. et al., Cancer vaccines and carbohydrate epitopes. Vaccine. 2011 Nov 8;29(48):8802-26). 이들 종양-관련된 탄수화물 항원은, 제한되는 것은 아니지만, 혈액형 루이스 관련 항원 [제한되는 것은 아니지만, LewisY (LeY), LewisX (LeX), 시알릴 LewisX (SLeX) 및 시알릴 LewisA (SLeA) 포함], 당스핑고지질-관련된 항원 [제한되는 것은 아니지만, Globo H, 스테이지-특이적 배아 항원-3 (SSEA-3) 및 시알산을 포함하는 당스핑고지질 포함], 갱글리오사이드-관련된 항원 [제한되는 것은 아니지만, 갱글리오사이드 GD2, GD3, GM2, 푸코실 GM1 및 Neu5GcGM3 포함] 및 폴리시알산-관련된 항원을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 치료제는 루이스 혈액형 항원에 대한 것일 수도 있다. 루이스 혈액형 항원은 α1-3 연결 또는 α1-4 연결에 의해 GlcNAc에 연결된 푸코오스 잔기를 포함한다. 그것들은 당지질 및 당단백질에서 발견될 수 있다. 루이스 혈액형 항원은 이들 항원의 분비자인 개체의 체액에서 발견될 수도 있다. 적혈구 상에서 그것들의 출현은 적혈구에 의한 혈청으로부터의 루이스 항원의 흡수 때문이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 치료제는 LeY에 관한 것일 수도 있다. LeY (CD174로도 알려져 있음)는 α1,2-, 뿐만 아니라 α1,3-연결된 푸코오스 잔기를 포함하는 Galβ1,4GlcNAC로 구성되어 Fucα(1,2)Galβ(1,4)Fucα(1,3)GlcNAc 에피토프를 수득한다. 그것은 모체 사슬의 GlcNAc 잔기에 α1,3 푸코오스를 부착시키는 α1,3 푸코실트랜스퍼라아제에 의해 H 항원으로부터 합성된다. LeY는, 제한되는 것은 아니지만, 난소, 유방, 전립선, 결장, 폐 및 상피를 포함한 다양한 암에서 발현될 수 있다. 정상 조직에서 낮은 발현 및 많은 암에서 높아진 발현 수준으로 인해, LeY 항원은 치료 항체에 대한 매력적인 표적이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 치료제는 LeX에 관한 것일 수도 있다. LeX는 에피토프 Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-R을 포함한다. 그것은 또한 CD15 및 스테이지-특이적 배아 항원-1 (SSEA-1)으로도 알려져 있다. 이 항원은 처음에 F9 기형 암종 세포로 면역화된 마우스로부터 채취된 혈청과 면역반응성인 것으로 인식되었다. LeX는 또한 특정 스테이지의 배발생과 연관성이 있는 것으로 발견되었다. 그것은 또한 암의 존재 및 부재에 관계없이 다양한 조직에서 발현되지만, 암성 세포에 의해서만 발현되는 유방암 및 난소암에서도 발견될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 치료제는 SLeA 및/또는 SLeX에 관한 것일 수도 있다. SLeA 및 SLeX는 각각 구조 [Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ-R] 및 [Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-R]을 포함한다. 발현은 암성 세포에서 상향조절된다. 혈청에서 이들 항원의 존재는 악성 종양 및 불량한 예후와 연관성이 있다. SLeX는 대부분 뮤신 말단 에피토프로서 발견된다. 그것은 유방, 난소, 흑색종, 결장, 간, 폐 및 전립선을 포함한 많은 상이한 암에서 발현된다. 본 발명의 일부 구체예에서, SLeA 및 SLeX 표적은 Neu5Gc (본원에서 각각 GcSLeA 및 GcSLeX로 불림)를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 치료제는 당지질 및/또는 당지질 상에 존재하는 에피토프에 관한 것일 수도 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 당스핑고지질을 포함한다. 당스핑고지질은 세라미드 하이드록실 기에 의해 글리칸에 연결된 지질 세라미드를 포함한다. 세포막에서, 당스핑고지질은 "지질 뗏목"으로 불리는 클러스터를 형성한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 치료제는 Globo H와 관련이 있을 수도 있다. Globo H는 유방암 세포에서 최초로 확인된 암-관련된 당스핑고지질이다. Globo H의 글리칸 부분은 Fucα(1-2)Galβ(1-3)GalNAcβ(1-3)Galα(1-4)Galβ(1-4)Glcβ(1)을 포함한다. 많은 정상 상피 조직에서 발견되지만, Globo H는, 제한되는 것은 아니지만, 소세포 폐, 유방, 전립선, 폐, 췌장, 위, 난소 및 자궁 내막 종양을 포함한 많은 종양 조직과 함께 확인되었다.
일부 구체예에서, 본 발명의 치료제는 갱글리오사이드와 관련이 있을 수도 있다. 갱글리오사이드는 시알산을 포함하는 당스핑고지질이다. 갱글리오사이드 명명법에 따라, G는 갱글리오사이드에 대한 약어로 사용된다. 이 약어 다음에는 부착된 시알산 잔기의 번호 (각각 1, 2 또는 3)를 지칭하는 문자 M, D 또는 T로 이어진다. 마지막으로, 숫자 1, 2 또는 3은 박막 크로마토그래피에 의해 분석될 때 각각 이동한 거리의 순서를 나타내는데 사용된다 (3이 가장 먼 거리를 이동하고, 이어서 2 그 다음에 1이다). 갱글리오사이드는 암-관련된 성장 및 전이에 수반되는 것으로 알려져 있고 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현될 수도 있다. 종양 세포 상에서 발현된 갱글리오사이드는 GD2, GD3, GM2 및 푸코실 GM1 (본원에서 Fuc-GM1이라고도 불림)을 포함할 수도지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 GD3에 관한 것이다. GD3은 세포 성장의 조절자이다. 일부 구체예에서, GD3-관련 항체는 세포 성장 및/또는 혈관 신생을 조절하는데 사용된다. 일부 구체예에서, GD3-관련 항체는 세포 부착을 조절하는데 사용된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 글리칸 상호작용 항체는 GM2에 관한 것이다. 일부 구체예에서, GM2-관련 항체는 세포 대 세포 접촉을 조절하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 갱글리오사이드 표적은 Neu5Gc를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 표적은 Neu5Gc를 포함하는 GM3 변이체 (본원에서 GcGM3이라고 불림)를 포함할 수도 있다. GcGM3의 글리칸 구성요소는 Neu5Gcα2-3Galβ1-4Glc이다. GcGM3은 종양 세포의 공지된 구성요소이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-TACA 항체에 의해 표적화된 TACA는, 제한되는 것은 아니지만, 미국 공개 번호 US2013/0236486A1, US2013/0108624A1, US2010/0178292A1, US2010/0104572A1, US2012/0039984A1, US2009/0196916A1, 및 US2009/0041836A1 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 나열된 것들 중 어느 것도 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 본원에서 기술된 항체 중 하나 이상으로 암을 치료하는 방법을 기술한다. 이러한 항체는 표 2에서 제공된 가변 도메인 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 항체는 표 2에서 제공된 IgG 불변 도메인 중 하나 이상을 더 포함할 수도 있다. 항체는 인간화된 항체일 수도 있다. 항체는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는 치료제를 포함한 항체 약물 컨쥬게이트일 수도 있다. 치료제는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는 세포독성제일 수도 있다. 세포독성제는 MMAE일 수도 있다. 세포독성제는 링커에 의해 항체에 결합될 수도 있다.
암에서 STn
면역 시스템은 선천적 및 적응적 면역 활성 모두를 포함하는 항-종양 세포 면역 활성을 촉진하는 다수의 메커니즘을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항-종양 세포 면역 활성"은 종양 세포를 살해하거나 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 방지하는 면역 시스템의 임의의 활성을 말한다. 어떤 경우에는, 항-종양 면역 활성은 자연 살해 (NK) 세포에 의한 인식 및 종양 세포 살해 및 대식 세포에 의한 식균작용을 포함한다. 적응적 항-종양 면역 반응은 항원 제공 세포 (APC) 예컨대 수지상세포 (DC)에 의한 종양 항원 흡수 및 제공을 포함하며 종양-특이적 항체의 분비로 T 세포 항-종양 활성의 조절 및/또는 B 세포의 확장을 유도한다. 종양-특이적 항체의 종양으로의 결합은 종양 세포사의 항체-의존적 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존적 세포독성 (CDC) 메커니즘으로 이어질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역-저항성 종양 세포"는 항-종양 세포 면역 활성을 감소시키거나 회피하는 종양 세포를 말한다. 일부 연구에서는 종양 세포 표면 상에서의 또는 종양 세포 미세 환경으로 분비되는 STn (공지된 TACA)의 발현이 항-종양 면역 활성의 종양 세포 회피를 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "종양 세포 미세 환경"은 종양 세포에 인접하거나 주위를 둘러싼 임의의 지역을 말한다. 이러한 지역은 종양 세포 사이, 종양 세포와 비-종양 세포 사이, 주위 유동체 및 세포 외 매트릭스의 주위 구성요소를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
STn을 포함하는 시알릴화된 뮤신은 Ogata 등에 의해 종양 세포의 NK 세포 표적화를 감소시키는 것이 입증되었다 (Ogata, S. et al., 1992. Canc. Res. 52:4741-6 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 이 연구는 양, 소 및 돼지 턱밑샘 뮤신 (각각 OSM, BSM 및 PSM)의 존재가 세포독성의 거의 100 퍼센트 억제를 유도한다는 것을 발견하였다 (Ogata 등의 표 2 참조). Jandus 등에 의한 추가의 연구는 일부 종양 세포가 NK 세포 siglec 수용체와 상호작용하여, NK 억제를 유도할 수 있는 시알로글리칸 리간드의 발현으로 인해 NK 파괴를 회피할 수 있다는 것을 입증한다 (Jandus, C. et al., 2014, JCI. pii: 65899 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
Toda 등에 의한 연구는 STn이 B 세포 상에서 CD22 수용체에 결합하여, 신호 형질 도입을 감소시키고 B 세포 활성화를 감소시킬 수도 있다는 것을 입증하였다 (Toda, M. et al., 2008. Biochem Biophys Res Commun. 372(1):45-50 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 수지상세포 (DC)는 T 세포 활성을 조절함으로써 적응적 면역 활성에 영향을 줄 수 있다. Carrascal 등에 의한 연구에서 방광암 세포에 의한 STn 발현이 DC에서 내성을 유도하여, T 세포에서 항-종양 세포 면역 활성을 유도하는 능력을 감소시킨다는 것이 발견되었다 (Carrascal, MA et al., 2014. Mol Oncol. pii: S1574-7891(14)00047-7 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 이들 연구는 DC가 STn-양성 방광암 세포와 접촉된 DC가 CD80, CD86, IL-12 및 TNF-α의 낮은 발현을 가진 톨로리제닉(tolorigenic) 발현 프로파일을 나타냈다는 것을 보여주었다. 또한, DC는 T 세포가 IFNγ의 낮은 발현 및 FoxP3의 높은 발현을 갖도록 조절 T 세포를 조절하는 것이 발견되었다. van Vliet 등에 의한 다른 연구는 대식 세포 갈락토오스형 렉틴 (MGL)의 DC 표면 발현이 종양 조직으로의 상기 세포의 표적화로 이어질 수 있다는 것을 나타낸다 (van Vliet, SJ., 2007. Amsterdam: Vrije Universiteit. p1-232 및 van Vliet, SJ. et al., 2008. J Immunol. 181(5):3148-55, Nollau, P. et al., 2013. J Histochem Cytochem. 61(3):199-205 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). MGL 상호작용으로 인해 조직에 도달한 DC는 세 가지 방법 중 하나로 T 보조 (Th) 세포에 영향을 미칠 수도 있다. DC는 T 세포 내성, T 세포 면역 활성 또는 효과기 T 세포의 하향조절을 유도할 수 있다. MGL은 AcSTn 및 GcSTn 모두에 결합하는 것으로 나타났고 친화도가 심층 분석되었다 (Mortezai, N. et al., 2013. Glycobiology. 23(7):844-52 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 흥미롭게도, 종양에서 MUC1 발현은 T 세포 내성을 유도하여, 면역 근절로부터 종양 세포를 보호하는 것으로 나타났다.
일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체 (제한되는 것은 아니지만, 항-STn 항체 포함)는 하나 이상의 TACA를 발현하는 하나 이상의 종양 세포를 포함하는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체 (제한되는 것은 아니지만, 항-STn 항체 포함)는 STn을 발현하는 종양 세포에 대한 항-종양 세포 면역 활성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 면역-저항성 종양 세포에 대한 적응적 면역 반응 및/또는 선천적 면역 반응을 증가시킬 수도 있다. 일부 글리칸-상호작용 항체는 NK 항-종양 세포 활성을 증가시키는데 사용될 수도 있다. 이러한 글리칸-상호작용 항체, 어떤 경우에는, NK 세포 상의 글리칸 수용체와 암 세포상의 또는 주위 조직의 STn 글리칸 간의 상호작용을 차단한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체 (제한되는 것은 아니지만, 항-STn 항체 포함)는 B 세포 항-종양 세포 활성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 B 세포 상의 CD22 수용체와 암세포 상의 또는 주변 조직에서의 STn 글리칸 간의 상호작용을 감소시킬 수 있다. Sjoberg 등에 의한 연구는 당단백질 상의 α2,6-연결된 시알산의 9-O-아세틸화가 또한 B 세포 CD22 수용체와 이러한 당단백질 간의 상호작용을 감소시켰다는 것을 입증한다 (Sjoberg, E.R. et al. 1994. JCB. 126(2): 549-562). Shi 등에 의한 또 다른 연구에서는 백혈병 세포 상의 보다 높은 수준의 9-O-아세틸화된 시알산 잔기가 이러한 세포를 보체-매개된 용해에 더욱 취약하게 만드는 것으로 나타났다 (Shi, W-X. et al., 1996. J of Biol Chem. 271(49): 31526-32 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 일부 구체예에서, 본 발명의 항-STn 항체는 비-9-O-아세틸화된 STn에 선택적으로 결합하여, 전체적인 STn 결합을 감소시키지만, 종양 세포 성장 및/또는 증식을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 증가된 B 세포 항-종양 활성 및 증가된 보체-매개된 종양 세포 파괴를 통해). 일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체 (제한되는 것은 아니지만, 항-STn 항체 포함)는 DC 항-종양 활성을 증가시키는데 사용될 수있다. 이러한 항체는 종양 세포에 대한 DC 내성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 감소된 DC 내성은 CD80, CD86, IL-12 및/또는 TNF-α의 DC 발현 증가를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, DC 항-종양 세포 활성은 T 세포 항-종양 세포 활성의 촉진을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 암 세포 상에서 또는 주위에서 발현되는 글리칸 및 DC MGL간의 결합을 방지할 수 있다.
Ibrahim 등에 의한 연구는 내분비 요법과 함께 높은 수준의 항-STn 항체가 전이성 유방암에 걸린 여성에서 전체 생존률 및 진행되기까지의 시간(time to progression; TTP)을 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다(Ibrahim, NK et al, 2013 4(7): 577-584, 이들의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함됨). 이 연구에서, 항-STn 항체 수준은 키홀-림펫 헤모시아닌 (KLH)에 연결된 STn으로 백신 접종 후 증가하였다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-STn 항체는 내분비 요법 (예를 들어, 타목시펜 및/또는 아로마타아제 억제자)와 조합하여 사용될 수 있다.
STn 발현은 난소 종양 세포의 전이 가능성에 기여하는데 연관된다. 본 발명의 일부 방법에 따르면, 항-STn 항체는 난소 종양 세포 전이를 감소시키는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 약 1% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 95%, 또는 적어도 95%까지 전이 감소를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 방법은 본원에서 기술된 항체 중 하나 이상으로 대상체의 암을 치료하는 방법을 포함하는데, 대상체는 STn을 발현하는 적어도 하나의 암 세포를 갖는다. 항체는 STn에 결합할 수도 있다. 이러한 항체는 표 2에서 제공된 가변 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에서 기술된 항체 서열의 상이한 조합을 포함할 수도 있다. 이러한 항체는 표 3에서 제공된 IgG 불변 도메인 중 하나 이상을 더 포함할 수도 있다. 항체는 인간화된 항체일 수도 있다. 항체는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는 치료제를 포함한 항체 약물 컨쥬게이트일 수도 있다. 치료제는 세포독성제일 수도 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함한다. 세포독성제는 MMAE일 수도 있다. 세포독성제는 링커에 의해 항체에 결합될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 대상체는 STn을 발현하는 적어도 하나의 암 세포를 갖고 대상체는 백금 불응성(platinum refractory) 질환에 걸린다. 백금 불응성 질환은 암에 대하여 치료된 대상체의 전체 집단의 퍼센트에 의해 경험되는 백금 기반 치료에 저항성이다. 대상체는 항-STn 항체를 대상체에게 투여함으로써 치료될 수 있다. 적어도 하나의 암 세포는 난소암 세포일 수 있다. 적어도 하나의 암 세포는 시스플라틴에 저항성일 수도 있다. 적어도 하나의 암 세포는 종양의 일부일 수도 있다.
백금 불응성 질환에 걸린 대상체에서 암을 치료하는데 사용된 항-STn 항체는 ADC일 수도 있다. ADC는 세포독성제와 컨쥬게이션될 수도 있으며, 본원에서 제공된 포맷 중 어느 것을 포함한다. 항-STn 항체는 약 0.1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 정맥내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 투여는 매일 투여, 매주 투여, 또는 매월 투여를 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 항-STn 항체 처리는 대상 체액 및/또는 조직에서 STn의 검출 가능한 수준을 감소시킬 수 있다. STn은 단백질 또는 다른 담체와 회합될 수도 있다. 어떤 경우에는, 혈청 중의 STn의 수준이 감소된다.
요법 표적으로서의 암 줄기 세포
암 줄기 세포 또는 CSC (종양 개시 세포라고도 불림)는 암 줄기 세포 또는 CSC(종양 개시 세포라고도 불림)는 원발성 및 전이성 종양의 개시, 성장, 전파 및 재발을 구동하는 이종성 암성 조직 또는 종양 세포 집단 내 세포의 부분집합이며 (Karsten and Goletz, SpringerPlus, 2013, 2, 301), 이것은 종양 유형에 따라 전체 집단의 다양한 비율에서 발생할 수 있다. CSC는 자가-재생에 대한 수용력에 의해 말단 분화된 세포와 구별되고, 비-CSC, 분화된 자손을 발생시킨다 (Gupta et al., Nature medicine, 2009, 15, 1010-1012). 이러한 성질들은 정상 줄기 세포와 유사하다. 정상 줄기 세포와 CSC 사이의 이러한 차이는 치료에 대해 중요한 영향을 미친다.
CSC를 비-CSC 대응물과 구별하려는 목적의 점점 더 많은 수의 세포-표면 바이어마커가 확인되었다 (Medema et al., Nature cell biology, 2013, 15, 338-344; Zoller, Cancer, 2011, 11, 254-267). 이것들은 CD44, CD133, CD117, 및 알데하이드 데하이드로게나아제 아이소폼 1 (ALDH1)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이것들 중의 일부는 마우스 종양 및 인간 세포주의 연구로부터 유래되지만, 다른 것은 원발성 인간 종양 샘플을 사용하여 검증되었다. 이들 중의 하나, 다양한 유형의 종양의 널리 공지된 구성요소인 막-스패닝(spanning) CD44 당단백질, 또는 히알루로난 수용체는 또한 보다 최근에 인간 암에서 진짜 CSC 마커로서 받아 들여졌으며, 사실상 가장 빈번하게 관찰된 것이다 (Lobo et al, 2007, 23, 675-699).
CD44는 전장 CD44 유전자의 20개 엑손과 19개 인트론 사이에서 발생하는 대안의 스플라이싱 이벤트에 의해 생성되는 여러 변이체 아이소폼으로 존재한다 (Williams et al, Experimental biology and medicine, 2013, 238, 324-338). 커지는 실험적 증거가, 부분적으로는 세포 내 신호 형질 도입 경로의 조절로 인해 (Williams et al, Experimental biology and medicine, 2013, 238, 324-338), CSC의 선천적 전이성 및 약물 내성 표현형에 기여하는데 있어서 CD44 및 이것의 변이체를 지지하는 역할을 지적한다 (Negi et al., Journal of drug targeting,2012, 20, 561-573). 추가적으로, 몇 가지 다른 암 유형과 함께, 높은 수준의 CD44 세포를 나타내는 삼중 음성 유방암에 걸린 환자는 불량한 예후 및 더 높은 사망율을 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 결과는 CD44를 표적화하는 것이 성숙 암 세포 이외에 CSC의 억제 또는 제거를 통해 암을 치료하는 수단을 제공한다는 개념을 뒷받침한다. 사실상, CD44를 표적화하는 많은 접근법들이 다양한 성공의 정도로 실험적으로 시도되어 왔다. 이것들은 컨쥬게이션된 및 컨쥬게이션되지 않은 항체, 나노-담체 약물 시스템, 및 히알루로난-컨쥬게이션된 약물의 사용을 포함한 광범위한 기술을 포함한다 (Negi et al., Journal of drug targeting, 2012, 20, 561-573). 하지만, 몇 가지 예에서, 생체 내 연구에서 독성 효과가 관찰되었으며; 이러한 뜻밖의 부작용은 표적화된 CSC 및 성숙 종양 세포의 표면 상에서의 존재 이외에 대부분의 척추동물 세포의 막에서의 CD44 및 변이체의 광범위한 발생에 기인할 수 있다 (Naor et al., Seminars in cancer biology, 2008, 18, 260-267). 정상적인 인간 줄기 세포의 구성요소 (Williams et al, Experimental biology and medicine, 2013, 238, 324-338)인 CD44 단백질을 표적화하는 것은 또한 정상적인 줄기 세포 기능을 해칠 수 있다 (Leth-Larsen et al., Molecular medicine, 2012, 18, 1109-1121). 대규모의 연구가 CSC 뿐만 아니라 성숙 종양 세포에 대한 표적화 CD44 단백질의 만족도를 지적하지만, 이러한 접근법이 갖는 본질적인 문제는 정상 조직, 뿐만 아니라 정상 줄기 세포를 할애하는 억제제를 디자인하는데 있어서 여전히 어려운 것으로 남아 있다.
CSC 생물학에 영향을 미치는 또 다른 널리 공지된 종양 항원은 대부분의 선암종에서는 높은 수준으로 차등적으로 발현되지만 정상 상피 세포에서는 낮은 수준으로 발현되거나 전혀 발현되지 않는 막 테더링된 당단백질인 상피 뮤신 MUC1이다. MUC1은 최근에 유방암 (Engelmann et al, Cancer research, 2008, 68, 2419-2426) 및 췌장암을 포함한 다양한 종양 형성에 대한 CSC 바이오마커로서 확인되었으며, 그것의 발현은 높은 전이성 및 불량한 예후와 연관성이 있다. CSC의 구성요소로서, MUC1은 세포 부착, 증식, 생존 및 신호 전달의 기능을 하는 것으로 나타났으며 (Engelmann et al, Cancer research, 2008, 68, 2419-2426) 또한 CD44와 동시-발현될 수 있다 (Leth-Larsen et al, Molecular medicine,2012, 18, 1109-1121). 암에서 MUC1을 표적화하기 위한 면역치료 접근법은 백신, 뿐만 아니라 다른 접근법을 사용하지만, 주로 성숙 암 세포 요법의 맥락에서 추구되고 있다 (Julien et al., 생체 분자,2012, 2, 435-466; Acres et al., Expert review of vaccines,2005, 4, 493-502).
암 줄기 세포는 상피-중간엽 (EMT) 전이 (Gupta et al, Nature medicine, 2009, 15, 1010-1012) 및/또는 역으로 전이 부위에서 발생하는 중간엽-상피 (MET) 전이 (Leth-Larsen et al, Molecular medicine, 2012, 18, 1109-1121) (CSC 가소성라고도 불리며, 비-CSC가 CSC를 발생시킬 수 있음)을 통해 생성되는 것으로 가정되었다. 이러한 발견은 암성 조직 또는 종양 세포 집단에서 CSC 및 비-CSC 둘 다를 제거할 필요성을 더욱 강조한다.
풍부화된 CSC 집단에 대한 최근 연구에서는 이들 세포는, 종양의 대부분과는 달리, 비교적 정지성(quiescent)이며 화학요법 및 방사선을 포함한 현재의 많은 유형의 요법에 대해 우선적으로 저항성인 것으로 드러났다 (Leth-Larsen et al., Molecular medicine,2012, 18, 1109-1121). 따라서 현재의 치료 전략은 종양의 비-CSC 구성요소를 표적화하므로, CSC는 대체로 영향을 받지 않아서 적절한 치료 후 재출현하여 처음 부위에 재발성 원발성 종양을 재형성하거나 별개의 부위에 전파되고, 콜로니화하여 암 사망률의 주 원인인 전이성 질환을 생성한다.
암 줄기 세포의 성질에 대한 현재의 이해는 현 관행대로, 종양에 존재하는 세포의 대부분을 표적화할 뿐만 아니라 잠재적으로 완치를 야기하기 위해 CSC 구획도 표적화할 필요성을 분명히 강조하였다.
상기 논의된 바와 같이, (CSC를 포함한) 종양 관련 바이오마커에 기초하여 개발된 전략들은 대부분의 암 바이오마커가 정상 줄기 세포를 포함한 정상 세포에도 존재한다는 도전에 직면하다. CSC를 제거하기 위해 단백질 바이오마커를 표적으로 하는 치료법은 정상 줄기 세포를 또한 표적화할 수 있어, 정상 세포의 제거를 초래할 수 있다.
CSC에서의 종양-특이적 글리칸
톰젠-누보(톰젠-누보)(Tn) 항원 (GalNAc-O-Ser/Thr)의 출현을 포함한, 글리코실화의 비정상적인 형태가 많은 인간 암에서 기술되었으며, 글리칸을 특이적 종양 표적화에 적합한 신규한 분류의 종양-관련된 탄수화물 항원인 것을 확인하였다 (Rabu et al., Future oncology, 2012, 8, 943-960). Tn의 시알릴 유도체 (STn)의 형성은 α2,6 결합에서 Tn 항원에 시알산을 추가하는 시알릴 트랜스퍼라제 ST6GalNAc-I에 의해 매개된다. Tn의 시알릴화는 추가의 당 부가를 방지하며, 따라서 추가의 글리칸 연장을 절단한다 (Schultz et al., Cancer metastasis reviews, 2012, 31, 501-518).
정상적인 성인 인간 조직에서 STn의 존재는 드물지만, STn은 다른 것들 중에서도 난소, 방광, 유방, 자궁경부, 결장 및 폐암을 포함한 다양한 인간 암에서 발생한다 (Ferreira et al., Molecular oncology, 2013, 7, 719-731; Kinney et al., Cancer,1997, 80, 2240-2249). 게다가, 종양에서의 STn의 존재는 전이성 질환, 불량한 예후 및 감소된 전체 생존율과 연관된다 (Ferreira et al., Molecular oncology, 2013, 7, 719-731; Kinney et al., Cancer,1997, 80, 2240-2249); 그러므로, STn은 암 검출 및 요법을 위한 매우 매력적인 표적으로 간주된다. STn의 말단 위치에 위치한 두 개의 별개의 형태의 시알산, Neu5Ac 및 Neu5Gc가 있다. Neu5Ac-시알릴화된 형태가 인간에서 두드러지는데, 인간이 비활성 CMP-Neu5Ac 하이드록실라아제 (CMAH) 유전자로 인해 Neu5Gc를 합성할 수 없기 때문이다. 하지만, Neu5Gc-풍부 식품의 소비는 인간 세포에, 특히 암종에 외래 Neu5Gc 혼입을 유도한다. 선행 연구들에서는 고체 종양이 시알산의 Neu5Gc 형태를 흡수하고 발현시키는 것으로 나타났다 (Inoue et al., Glycobiology,2010, 20, 752-762; Malykh et al., Biochimie, 2001, 83, 623-634; Padler-Karavani et al., Cancer research, 2011, 71, 3352-3363). 잠재적인 암 표적인 STn의 글리코-아이소폼, Neu5Ac-STn(AcSTn) 및 Neu5Gc-STn(GcSTn) 둘 다에 결합하는 mAb는 pan-STn 항체로서 지정된다.
STn 축적은 고체 종양에서 반복적으로 관찰되는 특이적 체세포 돌연변이 및 활성 T-신타아제의 형성에 필요한 분자적 샤프론 코어 1 베타3-갈락토실트랜스퍼라아제-특이적 분자 샤프론 (COSMC)를 암호화하는 유전자의 비활성화와 관련이 있다 (Ju et al., Nature,2005, 437, 125). T-신타아제는 GalNAc 기질에 대해 ST6GalNAc-I과 경쟁하며 그러므로 돌연변이에 의해 불활성화될 때 증가된 STn 합성을 초래한다. 추가적으로, STn 축적은 또한 ST6GalNAc-I의 증가된 발현으로부터 발생할 수 있는데, 이것은 때때로 관찰된다 (Brockhausen et al., Biological chemistry,2001, 382, 219-232; Ikehara et al., Glycobiology,1999, 9, 1213-1224). STn의 데 노보 발현은 암종 세포를 조절하고, 악성 표현형을 변화시키고, 보다 공격적인 세포 행동을 유도할 수 있다 (Pinho et al., Cancer letters, 2007, 249, 157-170). 이와 같이, STn은 흥미로운 암 바이오마커이자 치료 표적일 뿐만 아니라 STn 기능을 방해하는 것은 상당한 기능성, 항-전이성 치료 이점을 갖는 매우 흥미로운 가능성을 제공한다.
세포 당단백질의 글리코실화가 암에서 변한다는 것은 널리 알려져 있지만, 비정상적인 글리코실화는 해당 당단백질 및 글리칸 둘 다에 대해 선택적인 것으로 보인다. 사실상, 인간 종양 CSC에서 CD44 및 MUC1 만이 STn 항원의 주요 담체이며 (Cazet et al., Breast cancer research: BCR,2010, 12,204; Julien et al., Glycobiology, 2006, 16, 54-64), 이는 즉시, 성숙 종양 세포, 뿐만 아니라 CSC를 표적화하기 위한 선택적인 접근법을 시사한다. MUC1은 장벽 기능을 제공하는 일부 상피 세포의 정상적인 표면 구성 성분인 반면, 종양-관련 MUC1은 성숙 암 세포에서 관찰된 바와 동일한 방식으로 CSC에 대한 글리코실화 저하(hypoglycosylation) 및 증가된 시알릴화를 특징으로 하며, STn은 CSC 및 성숙 종양 세포 둘 다에 대한 특이적 마커로 보인다 (Curry et al., Journal of surgical oncology,2013, 107, 713-722). MUC1의 비정상적인 올리고당 프로파일은 시알릴-Lea (CA19-9 테스트에서 사용됨), 시알릴-Lex 및 시알릴-Tn (TAG-72)과 같은 네오마커, 뿐만 아니라 암 세포 (예컨대, CSC)에서의 Tn과 같은 은성 에피토프의 발현을 일으킨다. 이에 더하여, 글리코실화감소 (underglycosylation) 때문에, 뮤신의 펩타이드 코어는 코어 내의 에피토프 (정상 조직-유래 MUC1 내에서는 접근 불가능함)가 잠재적인 항원으로서 작용할 수 있도록 노출된다.
따라서, STn을 표적화하는 임상 접근법들은 STn 백신만으로 이루어졌다. 가장 진보된 임상 후보는 키홀 림펫 헤모시아닌에 커플링된 STn으로 이루어진 치료 백신인 테라토프이다. 생체 내 마우스 연구에서 테라토프 면역화는 강력한 항체 반응을 유도하여, 주사된 STn-발현 유선 암종 세포의 성장 지연을 매개하는 것으로 나타났다 (Julien et al., British journal of cancer, 2009, 100, 1746-1751). 하지만, 테라토프는 전이성 유방암에서 단계 III 임상 시험에서 이것의 1차 종점을 충족시키지 못했다. 테라토프 시험이 일차 종점에 이르지 못한 이유에 대한 주요 가설은 환자 집단을 등록 전에 STn 발현에 대해 평가하지 않았다는 것이다. 유방암에서 STn 발현은 연구 및 검출 방법에 따라 25%-80% 범위로 환자들 사이에서 매우 이종성이기 때문에, STn 발현을 반응과 연관지을 수 있는 능력의 부족이 테라토프로부터의 어떠한 이익을 감출 수도 있다. 중요하게도, 호르몬 요법을 받고 있는 환자의 부분 집단은 호르몬 요법 단독과 비교하여 테라토프로 처리된 경우 중간 전체 생존율의 상당한 7.5개월 증가를 나타내었으며 (Ibrahim et al., Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology, 2004, 22, 2547; and Miles et al., The oncologist,2011, 16, 1092-1100), 이는 특정 환자 집단에서 STn 표적화의 치료적 가능성을 입증하였다. 추가로, 면역 반응은 때때로 백신 접종된 환자들 간에 상당히 다르기 때문에, 백신 접근법은 항체 역가를 제어하거나 조절할 수 있는 능력이 부족하여, 환자들 사이에서 광범위한 치료 항체 노출을 초래한다. 그럼에도, 테라토프는 최소한의 독성으로 잘 받아들여졌으며, 이는 암 치료법을 위한 표적화 STn의 안전성을 입증한다.
암 세포에서 STn 발현의 분자 기초의 커지는 이해는 임의의 세포 표면 단백질 상에서 STn을 발현하는 세포가 또한 다수의 (전부는 아니지만) 다른 O-글리코실화된 세포 표면 단백질 상에서 STn을 발현하여, 광범위하게 분포된 탁월한 암-관련 치료 표적으로 되게 한다는 것을 강력하게 시사한다. 따라서, STn 양성 암 세포군은 CSC가 풍부할 수 있다. 이에 더하여, 최근 데이터는 STn 발현의 폐지가 암이 덜 공격적이게 하고 전이성 행동에 있어서 상당한 감소를 초래한다는 것을 입증한다 (Gill et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2013, 110, E3152-3161).
암 치료로서 항- STn 항체 표적화 CSC
여러 항-STn 항체가 해당 분야에 기술되어 있지만, 일부는 STn 항원 또는 시알릴화 아이소폼에 대해 낮은 특이성을 입증한다. 예를 들어, 상업적 B72.3 항-STn 항체는 STn에 뿐만 아니라 Tn 항원에도 결합하는 것으로 나타났다 (Bapat, S A (2010) Human ovarian cancer stem cells Reproduction 140, 33-41). 항체-의존적 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 유도하도록 조작되거나, 세포독성 페이로드 [예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)]와 컨쥬게이션된, STn을 표적화하는 단클론성 항체(mAb)의 이용 가능성은 STn-발현 종양을 갖는 암 환자에 대해 상당한 치료 이점의 가능성을 제공한다. 이에 더하여, 이러한 항체는 요법에 가장 반응할 것 같은 환자를 미리 선택할 수 있는 동반 진단제(companion diagnostic)의 개발을 또한 가능케 할 것이다.
STn은 때때로 CSC 표면 항원 중 하나 이상에 존재하며, 함께 이것들은 CSC와 연관된 줄기세포능 및 화학내성 성질을 촉진시키는 역할을 한다. 따라서, 항-STn 항체는 직접적인 관여 및/또는 ADCC를 통해 CSC를 직접 살해할 수 있는 가능성을 갖는 CSC-관련 암 표적화제를 제공할 뿐만 아니라, 다수의 세포-표면 단백질에 결합하고 CSC 생존력, 자기-재생 및 복제에 필수적인 관련 기능을 방해하는 독특한 기회를 제공한다.
본원에 논의된 바와 같이, CSC 상에서 STn을 표적화하는 근거 및 이점은 다음을 포함할 수 있다: (1) 다수의 종양-특이적 절단된 당단백질은 암에서 STn을 운반하고; (2) STn은 CSC 및 성숙 종양 세포 둘 다에서, 증식 상태와 무관하게, CD44, MUC1 및 잠재적으로 다른 중요한 세포-표면 마커 상에서 우선적으로 발현되는 고유의 글리칸 표적이어서, 단일 치료제에 의한 이러한 종양 구성요소 둘 다의 표적화를 가능하게 하고; (3) STn은 또한 난소암 및 기타의 바이오마커인 CA-125의 구성요소이고; (4) STn은 난소 CSC 마커 CD44의 성분이다. 그러므로, Tn에 연결된 시알산의 Neu5Ac 및 Neu5Gc 형태 둘 다를 포함하는 에피토프를 표적화하는 팬-STn 쥐 mAb의 사용은, CSC 및, 공통의 에피토프에 의해, 비-CSC 종양 세포에 결합하여 이것들을 살해하거나 이것들의 기능을 손상시킬 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 인간 CSC, 뿐만 아니라 성숙 종양 세포의 특이적인 제거를 위한 신규한 항-팬 STn mAb(들)를 제공한다. 본 발명의 한 양태에서, 항-STn 항체는 검증된 STn 글리칸 자체 - 특정한 당펩타이드 또는 운반 단백질이 아니라 - 를 표적화할 것이며, 이것은 CSC 및 비-CSC 종양 집단 둘 다에서 CD44, MUC1, 또는 다른 STn-글리코실화된 마커에 결합할 폭넓은 가능성을 제공할 것이다.
종양-관련된 STn을 표적화하는데 있어서 예외적 특이성을 고려해보면, 본 발명은 정상 성인 줄기 세포를 포함한 정상 조직을 할애함으로써 탁월한 치료 창을 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 종양 구획 내에 함유된 CSC 및 성숙 암 세포 둘 다를 제거함으로써 인간 종양형성을 퇴치하는 것을 목표로 한 독특한 면역치료 해법이 본원에 제공된다. 본 발명은 종양을 특이적으로 표적화하는 치료법 및 방법을 제공하며, 이것은 본 발명에 이르러 CSC를 표적화하고, 따라서 이러한 잠재적 표적의 관련 종양-특이적 탄수화물 모이어티를 표적화함으로써 치료 창을 확장시킴을 포함한다. 제거는 암 줄기 세포를 포함한 암 조직에 독특하게 존재하는 종양 관련 세포-표면 시알릴화 Tn 항원(STn) 구조를 표적화함을 통해 특이적으로 부여된다.
암성 조직 및/또는 종양 세포 집단에 함유된 암 줄기 세포 (CSC) 및 성숙 암 세포 둘 다를 제거함으로써 인간 종양 형성을 퇴치하는 것을 목표로 한 고유의 면역치료 해법이 본원에서 제공된다. 제거는 암 줄기 세포와 관련된 이러한 구조를 포함하여, 암성 조직 및/또는 종양 세포 집단에 고유하게 존재하는 세포-표면 시알릴화된 Tn 항원 (STn) 구조를 표적화하는 것을 통해 특이적으로 부여된다.
결장직장암
결장직장 암(CRC)은 4번째로 가장 큰 발병률을 가지며, 현재 미국에서 암-관련 사망의 3번째로 주요한 원인이다. 현재, 환자의 20%는 전이성 질환으로 진단되며 CRC에 걸린 환자의 대략 50%는 결국 전이될 것이다. 전이성 질환으로 진단된 경우, 5년 생존률은 13.1%이다. 전이성 결장암(mCRC)에 걸린 환자에서, 항-표피 성장 인자 수용체(EGFR) 단클론성 항체 (예를 들어, 세툭시맙 및 파니투무맙) 및 항-혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 단클론성 항체 (예를 들어, 베바시쥬맙 및 라무시루맙)와 같은 치료 항체(예컨대, 단클론성 항체)의 사용에 대한 선례가 있다.
STn의 발현은 83.4%의 CRC 환자 샘플에 존재하는 것으로 보고되며 증가된 악성 종양 및 불량한 예후와 관련이 있다. STn 항원은 정상 성인 결장 세포에 존재하지만 생체 내에서 자연적으로 발생하지 않는 공정인 사포닌화에 의한 O-아세틸 기의 제거 후에만 검출 가능하다 (Julien et al., Biomolecules, 2012, 2, 435-466). 따라서, STn은 CRC를 치료하기 위한 치료 표적으로 사용될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체가 CRC 및/또는 mCRC를 치료하는데 사용될 수 있다. 어떤 경우에는, 이러한 글리칸-상호작용 항체는 항-STn 항체이며, 본원에 기술된 것들 중의 어느 것을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. CRC 및/또는 mCRC를 치료하는데 사용된 글리칸-상호작용 항체는 세포독성제 (예를 들어, MMAE 및 MMAF)와 컨쥬게이션될 수 있다. 글리칸-상호작용 항체는 화학치료제 (예를 들어, 플루오로피리미딘, 옥살리플라틴, 및/또는 이리노테칸) 및/또는 치료 항체 (예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시쥬맙 및/또는 라무시루맙)로의 요법과 같은 다른 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 어떤 경우에는, 글리칸-상호작용 항체는 하나 이상의 다른 치료적 처리에 대하여 저항성인 결장직장암을 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 결장직장암을 치료하는데 사용된 글리칸-상호작용 항체는 약 0.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여될 수도 있다. 예를 들어, 항체는 약 0.5 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 2.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여될 수도 있다.
난소암
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 난소암을 치료하는 방법을 포함한다. 난소암은 여성에게 영향을 미치는 주요 부인과 암이다. 미국에서, 2013년 동안 22,240명의 여성이 이 질환으로 진단되고 14,030명이 이 질환으로 사망할 것으로 추정되어, 이것은 미국에서 여성-관련 암 사망의 다섯 번째로 주요한 원인이며 가장 치명적인 부인과 악성 종양일 것이다 (Siegel et al., Cancer statistics, 2013. CA: a cancer journal for clinicians 63, 11-30). 이러한 높은 사망률은 증상을 보이지 않는 개시, 말기에 처음 진단, 이러한 유형의 암의 공격성 및 치료적으로 표적화 가능한 유전적 변화의 일반적인 부족에 기인할 수 있다. 현재의 치료 기준은 종양 용적축소(tumor debulking)에 이은 탁산 및 백금 기반 화학요법이다. 이러한 초기 치료로 환자의 ~70%가 초기 완전한 임상 반응을 달성하게 되지만, 이들 환자의 대부분에서는 불행하게도 화학내성 질환이 재발할 것이다 (Foster et al., Cancer letters, 2013, 338, 147-157; and McCann et al., PloS one, 2011,6, e28077). 부분적으로, 재발성 질환은, 다른 암 유형에서처럼, 전체 종양 집단 내의 CSC의 존재에 기인할 수 있다. 실제로, 난소 CSC가 화학- 및 방사선요법에 저항성인 것으로 확인되었고 나타났다 (Burgos-Ojeda et al., Cancer letters, 2012, 322, 1-7). 따라서, 다시 다른 형태의 암에서처럼, 암성 조직 및/또는 종양 세포 집단에서 성숙 세포와 함께 CSC를 제거하는 것은 재발성 질환을 관리하고 이상적으로 치료를 실시할 수 있다는 낙관을 제공한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 항-STn 항체를 사용하여 난소암을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 난소암에 걸리거나 걸린 것으로 의심되는 대상체에게 항-STn 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제한되는 것은 아니지만, 암성 조직 및/또는 종양 세포 집단에 존재하는 것들을 포함하는 난소 CSC가 난소암 치료를 위해 표적화될 수 있다. CD133이 가장 널리 연구된 추정상의 난소 CSC 마커이지만, 상기 논의된 바와 같이 STn의 공지된 담체인 CD44가 난소암과 관련이 있으며 난소 CSC를 확인하는 마커 세트에 포함되는 것으로 인지된다 (Zhang et al., Cancer research, 2008, 68, 4311-4320; Foster et al., Cancer letters, 2013, 338, 147-157; 및 Zoller, Cancer, 2011, 11, 254-267). 또한, STn은 널리 공지된 난소암 바이오마커 CA-125 (MUC16) 상에서 뿐만 아니라 MUC1 상에서 발현되며, 여기서 혈청 중의 이들 STn-관련 뮤신의 수준은 암성 대 양성 난소 질환의 추가의 식별인자(differentiator)로서 최근에 사용되었다. STn의 증가된 혈청 수준은 난소암 환자의 ~50%에서 발생하며 보다 낮은 5년 생존률과 연관성이 있다 (Kobayashi et al., Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology, 1991, 9, 983-987; Kobayashi et al., Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology,1992, 10, 95-101; 및 Chen et al., Journal of proteome research, 2013, 12, 1408-1418). 마지막으로, Vathipadiekal 등은 인간 원발성 난소 암종 CSC 및 비-CSC 집단 간의 차등적 유전자 발현의 연구에서 STn-생성 시알릴 트랜스퍼라아제 ST6GalNAc I의 발현이 세포들 간에 두 구획이 상이하지 않았음을 발견하였다.
일부 구체예에서, 난소암에 걸리거나 난소암에 걸린 것으로 의심되는 대상체에게 항-STn 항체를 투여하는 것은, 본원에서 기술된 방법에 따르면, 이러한 대상체에서 STn-양성 세포의 감소 및/또는 이러한 대상체에 존재하는 하나 이상의 난소암성 조직 또는 종양 세포 집단에서 STn-양성 세포의 감소로 이어진다. 일부 구체예에서, 감소는 약 10% 내지 약 90% 초과 (예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%)의 STn-양성 세포의 감소를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 CSC와 관련된 암의 제어 또는 치유를 막는 CSC를 표적화하기 위한 항체를 제공한다. 이러한 항체는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 기술된 것들 중 어느 것을 포함하는, 항-STn 항체를 포함할 수도 있다. 추가의 항-STn 항체는 3F1 및/또는 인간화된 유도체의 CDR을 가진 재조합 항체를 포함하여, 항체 3F1 (SBH Sciences, Natick, MA) 또는 이것의 유도체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-STn 항체는 다른 형태의 치료에 저항성인 난소암 줄기 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 이러한 치료는 화학요법을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어, "화학요법"은 화학 물질을 사용하는 치료의 형태를 말한다. 이러한 화학 물질은 본원에서 "화학치료제"라고 불린다. 암 치료시, 화학치료제는 암 세포의 증식을 늦추거나 금지하는 작용제이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "화학요법-저항성" 또는 "화학저항성"은 화학요법 처리에 영향을 받지 않거나 화학요법 처리에 대하여 제한된 민감성을 가진 세포를 지칭하는데 사용된다. 이러한 화학요법 처리는 올라파립, 카르보플라틴, 및/또는 파클리탁셀로의 처리를 포함할 수 있다. 화학요법-저항성 난소암 줄기 세포를 표적화하는 방법은 난소암 줄기 세포에서 화학요법 처리 후 발생한 STn 발현의 변화를 이용할 수 있다. 어떤 경우에는, 화학요법-저항성 난소암 줄기 세포는 화학요법 처리 전 및/또는 후에 STn을 발현한다. 어떤 경우에는, 화학요법-저항성 난소암 줄기 세포에서 세포 표면 STn 발현은 화학요법 처리 이후에 증가될 수 있다. 올라파립, 카르보플라틴, 및/또는 파클리탁셀로의 화학요법 처리 후, 일부 난소암 줄기 세포가 증식하여 올라파립-, 카르보플라틴-, 및/또는 파클리탁셀-저항성인 STn-발현 암 세포의 집단을 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-STn 항체는 올라파립-, 카르보플라틴-, 및/또는 파클리탁셀-저항성 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 어떤 경우에는, 이들 저항성 세포는 암 줄기 세포이다. 일부 구체예에서, 대상체의 항-STn 항체 처리는 올라파립, 카르보플라틴, 및/또는 파클리탁셀로 대상체의 처리 후 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 난소암에 걸린 대상체에게 항-STn 항체를 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 포함할 수도 있다. 항-STn 항체는 화학치료제 (예를 들어, 올라파립, 카르보플라틴, 및/또는 파클리탁셀)로의 처리 전에, 동안에, 또는 후에 투여될 수 있다. 항-STn 항체는 화학치료제 (예를 들어, 올라파립, 카르보플라틴, 및/또는 파클리탁셀)의 투여 전에, 동안에, 및/또는 후에 존재하는 STn-발현 난소암 줄기 세포를 표적화할 수 있다. 항-STn 항체는 서열 번호: 1-12 중 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 가변 도메인을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 항-STn 항체는 항체-약물 컨쥬게이트이다. 이러한 항체 약물 컨쥬게이트는 세포독성제 (예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 E)를 포함할 수 있다. 항-STn 항체로 처리된 대상체에서 암성 조직은 STn-양성 세포의 감소를 경험할 수 있다. 일부 구체예에서, 감소는 약 10% 내지 약 90% 초과 (예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%)의 STn-양성 세포의 감소를 포함할 수도 있다. 항체는 CSC를 표적화할 수도 있다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 화학요법-저항성 난소암 줄기 세포를 가진 대상체는 하나 이상의 화학치료제 (예를 들어, 올라파립, 카르보플라틴, 및/또는 파클리탁셀)로 처리 후 본 발명의 항-STn 항체로 처리될 수 있다. 화학치료제 처리 후 항-STn 항체 처리는 종양 재발을 방지할 수 있다. 종양 재발은 하나 이상의 종양 세포 또는 종양의 수준이 감소된 이후의 (예를 들어, 사전 또는 현재의 요법으로 인해) 하나 이상의 종양 세포 또는 종양의 발달이다.
일부 난소암 치료 방법에서, 본 발명의 항-STn 항체는 줄기세포능 및/또는 분화에 기인하는 세포 신호 전달의 조절자와 조합하여 투여된다. 이러한 조절자는 Notch 및/또는 헤지호그 신호 전달의 조절자를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 난소암에 걸리거나 걸린 것으로 의심되는 대상체로부터 샘플을 얻고 샘플에서 STn을 검출함으로써 난소암을 치료하는 방법을 포함하는데, STn이 검출되면, 항-STn 항체가 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 샘플은 세포 샘플 (예를 들어, 암성 조직 샘플 또는 종양 샘플)이다. 세포 샘플은 BRCA1 돌연변이 세포 또는 비-BRCA1 돌연변이 세포를 포함할 수 있다.
대상 샘플에서 STn 검출은 분자 화합물의 검출을 대하여 해당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 하나 이상의 STn-검출 항체의 사용을 포함할 수 있다. STn-검출 항체는 STn에 결합할 수 있는 임의의 항체를 포함할 수 있다. 일부 STn 검출 방법은 질량 분석법, 웨스턴 블롯팅, 유동 세포 분석법, 면역침강법, 및 효소-결합 면역 흡착 분석 (ELISA)을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 단백질-관련된 STn이 검출된다.
일부 구체예에서, 검출된 STn은 난소암 줄기 세포-관련된 단백질과 연관성이 있을 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "난소암 줄기 세포-관련된 단백질"은 하나 이상의 난소암 줄기 세포와 관련된 임의의 단백질을 말한다. 이러한 단백질은 세포 표면 단백질, 마커, 세포 내 단백질, 전사 인자, 및 난소암 줄기 세포 생존, 성장, 복제, 및/또는 유지에 영향을 주는 세포 신호 전달에 수반된 단백질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 난소암 줄기 세포-관련된 단백질은 Notch, 헤지호그, MUC1, CD44, CD117, CD133, 및 인테그린을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 본 발명은 올라파립 및 항-STn 항체로의 조합 처리를 제공하는 단계를 포함하는 난소암 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법은 대상체를 올라파립으로 처리하고 나중에 대상체를 항-STn 항체로 처리하는 단계를 포함할 수도 있다. 어떤 경우에는, 난소암을 치료하는 방법은 올라파립으로의 처리에 완전히 반응하지 않는 대상체를 확인하고 항-STn 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 통합 암 치료 방법을 포함할 수도 있다. 통합 치료는 지속적인 차도를 달성하기 위해 화학 요법 이후에 수행되는 치료이다. 전형적으로는, 통합 치료는 종양 재발을 방지하기 위해 더 작은 용량의 화학 요법을 수반하는 한편 독성 수준을 낮게 유지한다. 통합 암 치료를 위한 본 발명의 방법은 적어도 하나의 화학치료제를 투여함으로써 대상체에서 암 세포의 수를 감소시키고 항-STn 항체를 투여함으로써 대상체에서 암 세포 또는 대상체에서 하나 이상의 암성 조직의 감소된 수를 유지하는 (또는 수를 더 감소시키는) 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 난소암이다. 화학치료제는 올라파립, 카르보플라틴, 및/또는 파클리탁셀일 수 있다. 일부 구체예에서, 항-STn 항체는 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)이다. ADC는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 항-STn 항체의 투여를 통해 오래가는 초기 차도를 유도하기 위해 난소 종양 세포를 완전히 근절하는 단계를 포함한다. 다른 방법은, 어떤 경우에는 과도한 독성 없이, 하나 이상의 항-STn 항체의 투여를 통한 일정 기간 동안의 난소 종양 재발의 억제를 포함한다. 이러한 기간은 약 1개월 내지 약 18개월, 약 1년 내지 약 5년, 약 2년 내지 약 10년, 또는 10년 초과일 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 대상체로부터 하나 이상의 난소 종양 세포를 단리시키는 단계, 하나 이상의 난소 종양 세포를 가진 숙주 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 또는 영장류)에서 이종 이식 종양을 생성하는 단계, 숙주에게 하나 이상의 항-STn 항체를 투여하는 단계, 및 대상체를 치료하기 위한 치료 항체로서 사용하기 위해 테스트된 하나 이상의 항-STn 항체 중 적어도 하나를 선택하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 항-STn 항체는 상기 항체가 숙주에서 종양 부피를 감소시키는 능력에 기초하여 선택될 수 있다.
면역-관련된 표적
일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 면역조절 항체일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 면역조절 항체는 하나 이상의 면역 기능 또는 경로를 향상시키거나 억제하는 항체이다.
다수의 박테리아성 글리칸이 시알산을 포함하는 것으로 알려져 있다. 어떤 경우에는, 이러한 글리칸은 박테리아가 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 숙주의 선천성 면역 시스템을 피할 수 있게 한다. 한 예에서, 박테리아 글리칸은 인자 H 인식을 통해 대체 보체 경로 활성화를 억제한다. 또 다른 예에서, 박테리아 글리칸은 항원성일 수 있는 기본 잔기를 감춘다. 일부 박테리아 글리칸은 특정 시알릴화된 모이어티를 포함한 실체물에 대한 면역 반응을 약화시키는 억제성 시알산 결합 Ig-유사 렉틴(Siglecs)의 활성화를 통해 세포 신호 전달 이벤트에 참여한다 (Chen, X. et al., Advances in the biology and chemistry of sialic acids. ACS Chem Biol. 2010 Feb 19;5(2):163-76). 일부 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 박테리아 글리칸에 관한 면역 합병증을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 Neu5Gc의 외래 특성으로 인해, 일부 Neu5Gc 글리칸은 면역원성이어서, 이들 글리칸이 발현될 수 있는 세포 및 다른 실체물의 면역 관련 파괴를 초래한다. 이러한 자가면역 파괴는 병원성일 수 있다. 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 Neu5Gc 글리칸과 관련된 자가면역 장애로 고통받는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 면역 조절 항체는 T 세포-매개된 면역력을 촉진시키거나 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 T 세포, T 세포-관련 단백질 및/또는 T 세포와 상호작용하는 하나 이상의 다른 세포 유형 상에 존재하는 하나 이상의 글리칸과 상호작용할 수 있다. T 세포 매개된 면역력을 향상시키는 면역 조절 항체는 암 세포의 T 세포 매개된 표적화를 자극하는데 사용될 수 있다.
일부 종양에서, 종양-관련 대식세포 (TAM)에 의한 침윤이 종양 세포 생존 및 성장을 촉진시키는 면역 억제를 유도할 수 있다. 이것은 TAM 상에 존재하는 골수성 C형 렉틴 수용체(CLR) 및 종양-관련된 뮤신 간의 상호작용을 통해 일어나는 면역 억제 세포 신호 전달로 인한 것으로 생각된다 (Allavena, P. et al., Clin Dev Immunol. 2010;2010:547179). 일부 구체예에서, 하나 이상의 종양-관련된 뮤신 또는 TACA로의 본 발명의 면역 조절 항체의 결합은 TAM에서 면역 억제 세포 신호 전달을 방지한다.
수의과 용도
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 비-인간 척추동물의 치유 및 치료를 포함한 수의과적 관리 영역에서 유용성을 발견할 것으로 고려된다. 본원에서 기술된 바와 같이, 용어 "비-인간 척추동물"은 야생 및 사육 종, 예를 들어, 반려 동물 및 가축을 포함하여, 호모 사피엔스(Homo sapiens)를 제외한, 모든 척추동물을 포함한다. 비-인간 척추동물은 알파카, 들소(banteng), 들소(bison), 낙타, 고양이, 젖소, 사슴, 개, 당나귀, 가얄, 염소, 기니피그, 말, 라마, 노새, 돼지, 토끼, 순록, 양, 물소 및 야크와 같은 포유동물을 포함한다. 가축은 식량, 노동 및 유래 제품, 예컨대 섬유 및 화학물질과 같은 재료를 생산하기 위해 농업 환경에서 자라는 사육 동물을 포함한다. 일반적으로, 가축은 잠재적인 농업상의 중요성을 갖는 모든 포유동물, 조류 및 어류를 포함한다. 특히, 네 발 달린 도축 동물은 거세한 수소, 암송아지, 젖소, 송아지, 황소, 소, 돼지 및 양을 포함한다.
생물 가공
일부 구체예에서 본 발명은 세포를 유전자 발현을 조절하거나, 생산된 글리칸의 수준 및/또는 유형을 변화시킬 수 있는 하나 이상의 글리칸-상호작용 항체 (예컨대 항체 또는 융합 단백질)와 접촉시킴으로써 (여기서 이러한 조절 또는 변화는 생물학적 생성물의 생산을 향상시킨다) 숙주 세포에서 생물학적 생성물을 생산하는 방법이다. 본 발명에 따르면, 생물 가공 방법은 본 발명의 글리칸-상호작용 항체 중의 하나 이상을 사용하여 개선될 수 있다. 이들은 또한 하나 이상의 글리칸-상호작용 항체를 보충, 대체 또는 부가함으로써 개선될 수 있다.
진단제
일부 구체예에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 진단제로서 사용될 수 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 항체는 표적 항원을 발현하는 세포, 조직, 기관 등을 확인하거나 라벨링하거나 염색하는데 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 항체는 암성 세포를 갖는 것으로 알려지거나 의심되는 조직을 포함한 조직 섹션 (즉, 조직학적 조직 섹션)에 존재하는 STn을 확인하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체를 사용하는 이러한 방법은 어떤 경우에는 조직 섹션에서 암성 세포 또는 종양을 확인하는데 사용될 수 있다. 조직 섹션은, 제한되는 것은 아니지만, 유방, 결장, 췌장, 난소, 뇌, 간, 신장, 폐, 피부, 위, 창자, 식도, 또는 뼈를 포함하는 임의의 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 진단 방법은 면역조직화학적 기법을 사용한 하나 이상의 세포 또는 조직의 분석을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 본원에 기술된 하나 이상의 글리칸-상호작용 항체 중의 어느 것의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명의 면역조직화학적 방법은 조직 섹션을 염색하여 하나 이상의 글리코실화된 단백질 또는 기타 마커의 존재 및/또는 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 조직 섹션은 대상 종양(예컨대, 환자 종양 및 동물 종양, 예컨대 동물 모델 종양)으로부터 유도될 수 있다. 조직 섹션은 포르말린-고정되거나 고정되지 않은 신선한 동결 조직으로부터 비롯될 수 있다. 어떤 경우에, 조직 섹션은 포르말린-고정되고 파라핀-매립된 (FFPE) 조직으로부터 비롯된다. 본원에 기술된 글리칸-상호작용 항체가 일차 항체로서 사용될 수 있다. 일차 항체는 조직 섹션과 직접 접촉하여 표적 에피토프에 결합하는데 사용된다. 일차 항체는 검출 가능한 라벨과 직접 컨쥬게이션될 수 있거나 이차 항체와 같은 검출제의 사용을 통해 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 일차 항체 또는 검출제는 기질과 반응하여 가시적인 산물(예컨대, 침전물)을 생성하는데 사용될 수 있는 효소를 포함한다. 이러한 효소는 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 및 카탈라아제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 항-STn 항체는 조직 또는 세포에서 STn-글리코실화된 단백질을 검출하기 위해 본 발명의 면역조직화학적 방법에 따라 사용될 수 있다. 어떤 경우에는, 이들 항체는 종양 조직에서 STn의 수준을 검출 및/또는 결정하는데 사용된다. 이러한 종양 조직은 종양 마이크로어레이에 포함된 종양 조직을 포함할 수 있다. 적합한 종양 유형은 유방, 결장, 난소, 췌장, 피부, 장, 폐 및 뇌 종양을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 면역조직화학적 염색 기술에서 사용되는 항-STn 항체의 수준은 가시적인 염색을 증가시키거나 염색의 배경 수준을 감소시키기 위해 달라질 수 있다. 일부 구체예에서, 약 0.01 μg/ml 내지 약 50 μg/ml의 항체 농도가 사용된다. 예를 들어, 약 0.01 μg/ml 내지 약 1 μg/ml, 약 0.05 μg/ml 내지 약 5 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 3 μg/ml, 약 1 μg/ml 내지 약 10 μg/ml, 약 2 μg/ml 내지 약 20 μg/ml, 약 3 μg/ml 내지 약 25 μg/ml, 약 4 μg/ml 내지 약 30 μg/ml, 또는 약 5 μg/ml 내지 약 50 μg/ml의 항체 농도가 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 진단 방법은 STN-연결된 당단백질 프로파일을 생성하는 방법을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "STN-연결된 당단백질 프로파일"은 샘플 또는 대상체에서 STN-연결된 당단백질의 수준 및/또는 정체를 나타내는 일련의 정보를 말한다. STN-연결된 당단백질 프로파일을 생성하는 방법은 대상체로부터 수득된 샘플에서 수행될 수 있다. 이러한 샘플은, 제한되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 것들 중의 어느 것을 포함하는 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 세포 샘플일 수 있다. 어떤 경우에는, 세포 샘플은 적어도 하나의 종양 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 세포 샘플은 BRCA1 돌연변이 또는 비-BRCA1 돌연변이 종양 세포를 포함할 수 있다.
STN-연결된 당단백질 프로파일에 포함된 당단백질은 암 세포 마커, 줄기 세포 마커, 암 줄기 세포 마커 및 줄기 세포-관련 단백질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, STN-연결된 당단백질 프로파일의 일부로서 확인되고/되거나 정량된 당단백질은 CD44, CD133, CD117, 인테그린, Notch, 및 헤지호그를 포함할수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
STN-연결된 당단백질 프로파일에서 STN-연결된 당단백질의 수준 및/또는 정체는 단백질을 확인하고 및/또는 단백질 수준을 정량하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법들에 따라 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 질량 분석법, 어레이 분석 (예컨대, 항체 어레이 또는 단백질 어레이), 웨스턴 블롯팅, 유동 세포 분석법, 면역침강법 및 ELISA를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. STn-연결된 당단백질은 어떤 경우에는 분석 전에 샘플로부터 면역침강될 수 있다. 이러한 면역침강법은 항-STn 항체를 사용하여 수행될 수 있다. STN-연결된 당단백질의 면역침강을 위해 사용되는 항-STn 항체는 해당 분야에 공지되거나 본원에 기술된 것들 중의 어느 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, STn-당단백질은 항-STn 항체를 사용하여 생물학적 샘플로부터 면역침강시킨 다음 질량 분석법을 사용하여 확인 및/또는 정량한다.
일부 구체예에서, 암 치료는 STN-연결된 당단백질 프로파일 정보에 의해 알 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계, 샘플로부터 STN-연결된 당단백질 프로파일을 생성하는 단계, STN-연결된 당단백질 프로파일로부터 STn-글리코실화된 단백질에 결합하는 글리칸-상호작용 항체를 선택하는 단계 및 글리칸-상호작용 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 이러한 방법에 따라 투여된 글리칸-상호작용 항체는 본원에 교시된 하나 이상의 CDR 또는 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 동반 진단으로서 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "동반 진단"은 결과가 대상체의 진단 또는 치료를 돕는 분석을 가리킨다. 동반 진단제는 비용을 감소시키고, 임상 시험의 지속시간을 단축시키고, 안전성을 증가시키고 및/또는 효과를 증가시키기 위해 치료 양생법 및 용량을 조절할 수 있도록 환자 질환, 장애 또는 병태 심각도 수준을 계층화하는데 유용할 수 있다. 동반 진단제는 질환, 장애 또는 병태의 발달을 예측하고 예방적 치료법의 처방을 돕는데 사용될 수 있다. 일부 동반 진단제는 하나 이상의 임상 시험을 위해 대상체를 선택하는데 사용될 수 있다. 어떤 경우에는, 동반 진단 분석은 치료 최적화를 촉진시키기 위해 특정 치료와 병행될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 암과 관련된 질환, 장애 및/또는 병태를 위한 동반 진단제로서 유용할 수 있다. 본 발명의 일부 동반 진단제는 하나 이상의 형태의 암의 심각도를 예측 및/또는 결정하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 일부 동반 진단제는 하나 이상의 형태의 암이 발병할 위험에 의해 대상체를 계층화하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 동반 진단제는 암 치료제를 위한 약물 개발을 촉진 및 용이하게 하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 캡쳐 항체 및 검출 항체의 사용을 통해 샘플에서 STn을 검출하고 및/또는 정량하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "캡쳐 항체"는 검출될 수 있는 방식으로 분석물에 결합하는 항체이다. 캡쳐 항체는 표면 또는 다른 담체와 회합될 수도 있다. 검출 항체는 분석물의 존재 또는 부재의 관찰을 용이하게 하는 항체이다. 일부 구체예에서, 캡쳐 항체 및 검출 항체는 둘 다 STn에 결합한다. 이러한 구체예에 따르면, 캡쳐 항체 및 검출 항체는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 이것은 검출 항체만을 인식하고 캡쳐 항체의 존재에 의해 영향을 받지 않는 2차 항체의 사용을 가능하게 할 수 있다. 일부 구체예에서, 캡쳐 항체는 STn에 결합할 수 있고 검출 항체는 결합된 STn의 단백질 또는 담체에 결합할 수 있다. 샘플에서 STn 검출에 사용된 캡쳐 항체 및 검출 항체는 상업적으로 이용 가능한 항-STn 항체, 뿐만 아니라 본원에서 제공된 항-STn 항체 중 어느 것으로부터 선택될 수도 있다.
STn 발현-변형된 세포
일부 구체예에서, 본 발명은 STn 수준이 변화된 변형된 세포를 제공한다. 이러한 세포는 다양한 목적 (예를 들어, 실험, 치료, 항체 테스트, 등)으로 사용될 수 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 방법은 하나 이상의 세포 또는 조직에서 ST6GalNAc I의 발현을 향상시키는 방법을 포함한다. 이것은 세포 STn (예를 들어, 표면-발현된 STn)의 발현이 증가된 하나 이상의 세포의 생성을 초래할 수 있다. ST6GalNAc I의 발현은, 예를 들어, ST6GalNAc I 발현 구조체를 가지고 있는 하나 이상의 벡터를 도입함으로써 향상될 수 있다. 이러한 발현 구조체는 천연 ST6GalNAc I 프로모터 또는 유전자 발현을 향상시키기 위한 프로모터와 함께 디자인될 수 있다. 유전자 발현의 향상을 위해 구성된 프로모터는 구성적 또는 과도하게 활성인 프로모터 요소를 가질 수 있다. 어떤 경우에는, 프로모터는 유도성 유전자 발현을 위해 구성될 수 있다. 이러한 프로모터는 프로모터의 유도성 요소를 활성화시키는 인자와 접촉될 때 활성화되거나 증가된 활성을 가질 수 있다. STn 발현 구조체는 Julien, S. et al., 2001. Glycoconj J, 18: 883-93 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 바와 같은 hST6GalNAc I pRc-CMV를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 발현 구조체는 STn 합성 및/또는 발현에 관여하는 다른 인자들을 암호화할 수 있다. 이러한 인자는 T-신타아제 및 코어 1 베타3-갈락토실트랜스퍼라아제-특이적 분자 샤프론 (COSMC)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 최소 STn 발현을 갖는 세포가 STn-발현 세포로 전환된다. 이러한 세포는 SKOV3 세포, BRCA1 돌연변이 세포 및 비-돌연변이 BRCA1 세포를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 비변형 세포에 비해 감소된 STn 발현을 갖는 변형된 세포가 제공된다. 따라서, 본 발명의 방법은 STn 발현을 억제하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 ST6GalNAc I 발현의 감소를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 ST6GalNAc I 발현을 억제하는 하나 이상의 핵산 분자의 투여를 포함할 수 있다. 이러한 핵산 분자는 억제 RNA (예를 들어, RNAi 또는 침묵 siRNA)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, STn 합성 및/또는 발현에 수반된 다른 인자들은 감소될 수 있다. 이러한 인자들은 T-신타아제 및 COSMC를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, STn를 자연적으로 발현하는 세포가 STn-결핍 세포로 전환된다. 이러한 세포는 OVCAR3 세포 및 OVCAR4 세포를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
III. 약학적 조성물
일부 구체예에서, 본 발명은 약학적 조성물을 포함한다. 이러한 약학적 조성물은 본 발명의 항체 및/또는 이러한 항체로부터 유래된 단편, 펩타이드, 또는 단백질을 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 생물학적 이용 가능성, 치료 창 및/또는 분포 용적 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다.
생물학적 이용 가능성
글리칸-상호작용 항체는, when formulated into a composition with a
본원에서 기술된 전달/제제화 작용제 또는 비히클과 함께 조성물로 제제화될 때, 본원에서 기술된 전달제가 결핍된 조성물과 비교하여 생물학적 이용 가능성의 증가를 나타낼 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 이용 가능성"은 포유류에 투여될 때 주어진 양의 글리칸-상호작용 항체의 전신 이용 가능성을 말한다. 생물학적 이용 가능성은 포유류에 화합물을 투여한 후 변화되지 않은 형태의 화합물의 곡선 아래 면적 (AUC) 또는 최대 혈청 또는 혈장 농도 (Cmax)를 측정함으로써 평가될 수 있다. AUC는 가로 좌표 (X-축)를 따르는 시간에 대한 세로 좌표 (Y-축)를 따른 화합물의 혈청 또는 혈장 농도를 플롯팅한 곡선 아래 면적의 결정이다. 일반적으로, 특정 화합물에 대한 AUC는 당업자들에게 공지된 방법을 사용하고 G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc., 1996 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 바와 같이 계산될 수 있다. 일부 구체예에서, AUC는 선형/선형 보간법(interpolation)과 함께 선형 사다리꼴 방법을 사용하여 계산된다. AUC는 시간 단위에 농도를 곱한 값 (즉, 시간 단위*질량 단위/부피 단위)으로 표현될 수 있다. 예를 들어, AUC는 일*μg/ml의 단위로 표현될 수 있다. 각각의 농도 대 시간 곡선의 말단 제거 단계는 관찰된 하나 이상의 최종 농도값을 사용하여 확인될 수 있다. 말단 제거 단계 기울기는 비가중 농도 데이터에 대한 로그 선형 회귀를 사용하여 결정될 수 있다.
Cmax 값은 투여 후 대상체의 혈청 또는 혈장에서 달성된 화합물의 최대 농도이다. 특정 화합물의 Cmax 값은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 구절 "생물학적 이용 가능성 증가" 또는 "약물동역학 개선"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 포유류에서 AUC, Cmax, 또는 Cmin으로 측정된 글리칸-상호작용 항체의 전신 이용 가능성이 동시-투여가 일어나지 않았을 때보다 본원에서 기술된 전달제와 함께 동시-투여될 때 더 크다는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체의 생물학적 이용 가능성은 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%까지 증가할 수 있다.
일부 구체예에서, 항-STn 항체의 생물학적 이용 가능성은 약학적 조성물 투여 후 결정될 수 있다. 항-STn 항체는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는, 치료제를 포함한 항체 약물 컨쥬게이트일 수 있다. 치료제는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는 세포독성제일 수 있다. 세포독성제는 MMAE일 수 있다. 세포독성제는 링커에 의해 항체에 결합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 대상체에게 항-STn 항체를 제공하는데 사용될 수 있는데, 항-STn 항체는 약 1 μg/ml 내지 약 5 μg/ml, 약 2 μg/ml 내지 약 10 μg/ml, 약 3 μg/ml 내지 약 15 μg/ml, 약 4 μg/ml 내지 약 20 μg/ml, 약 5 μg/ml 내지 약 50 μg/ml, 약 20 μg/ml 내지 약 100 μg/ml, 약 50 μg/ml 내지 약 200 μg/ml, 약 75 μg/ml 내지 약 150 μg/ml, 또는 약 100 μg/ml 내지 약 500 μg/ml의 Cmax를 나타낸다. 본 발명의 약학적 조성물은 대상체에 항-STn 항체를 제공하는데 사용될 수 있는데, 항-STn 항체는 약 1일*μg/ml 내지 약 5일*μg/ml, 약 2일*μg/ml 내지 약 10일*μg/ml, 약 5일*μg/ml 내지 약 50일*μg/ml, 약 20일*μg/ml 내지 약 200일*μg/ml, 약 100일*μg/ml 내지 약 500일*μg/ml, 또는 약 250일*μg/ml 내지 약 1000일*μg/ml의 AUC (투여 시작부터 마지막으로 관찰된 정량화 가능한 농도)를 나타낸다.
치료 창
글리칸-상호작용 항체는, 본원에 기술된 전달제와 함께 조성물로 제제화되는 경우, 본원에 기술된 전달제가 결핍된 투여된 글리칸-상호작용 항체 조성물의 치료 창과 비교하여 투여된 글리칸-상호작용 항체 조성물의 치료 창의 증가를 나타낼 수 있다. 본원에서 사용된 "치료 창"은 치료 효과를 유발할 가능성이 높은, 작용 부위에서의 치료적 활성 물질의 혈장 농도 범위 또는 수준 범위를 말한다. 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체의 치료 창은 본원에 기술된 전달제와 동시-투여될 때 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%까지 증가할 수 있다.
일부 구체예에서, 화합물 반감기 및/또는 클리어런스 율은 치료 창의 지표로서 모니터링될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "반감기" 또는 "t1/ 2"은 주어진 공정 또는 화합물 농도가 최종 값의 절반에 도달하는데까지 걸리는 시간을 말한다. "말단 제거 반감기" 또는 "말단 반감기"는 인자의 농도가 슈도-평형에 도달한 후 인자의 혈장 농도가 절반까지 감소하는데 필요한 시간을 말한다. 농도의 감소가 제거와 독립적인 하나 이상의 인자 (예를 들어, 흡수율 또는 분포율)에 의해 영향을 받을 수 있을 때, 관찰된 반감기는 "적절한 반감기"라고 불린다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "클리어런스 율"은 특정 화합물이 생물학적 시스템 또는 유체로부터 제거되는 속도를 말한다. 비율이 클리어런스와 독립적인 하나 이상의 인자에 의해 영향을 받을 수 있는 경우, 클리어런스 율은 "적절한" 클리어런스 율이라고 불린다.
일부 구체예에서, 항-STn 항체의 치료 창은 약학적 조성물 투여 이후 결정될 수 있다. 항-STn 항체는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는, 치료제를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트일 수 있다. 치료제는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는, 세포독성제일 수 있다. 세포독성제는 MMAE일 수 있다. 세포독성제는 링커에 의해 항체에 결합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 대상체에게 항-STn 항체를 제공하는데 사용될 수 있는데, 항-STn 항체는 약 1시간 내지 약 10시간, 약 2시간 내지 약 12시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 20시간 내지 약 30시간, 약 1일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 14일, 약 4일 내지 약 21일, 약 8일 내지 약 28일, 또는 28일 초과의 적절한 말단 제거 반감기를 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 대상체에게 항-STn 항체를 제공하는데 사용될 수 있는데, 항-STn 항체는 약 1 ml/kg/일 내지 약 10 ml/kg/일, 약 5 ml/kg/일 내지 약 20 ml/kg/일, 약 15 ml/kg/일 내지 약 50 ml/kg/일, 또는 50 ml/kg/일 초과의 적절한 클리어런스 율을 나타낸다.
분포 용적
글리칸-상호작용 항체는, 본원에 기술된 전달제와 함께 조성물로 제제화되는 경우, 본원에 기술된 전달제가 결핍된 조성물에 비해 개선된, 예를 들어, 감소되거나 표적화된 분포 용적(Vdist)을 나타낼 수 있다. 분포 용적(Vdist)은 체내 약물의 양을 혈액 또는 혈장 중의 약물의 농도에 관련시킨다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분포 용적"은 혈액 또는 혈장에서와 동일한 농도로 체내 약물의 총량을 신체에 함유하는데 필요한 체액 용적을 말하며: Vdist는 체내 약물의 양/혈액 또는 혈장 중의 약물의 농도와 같다. 예를 들어, 10mg 용량 및 10mg/L의 혈장 농도에 대해, 분포 용적은 1리터일 것이다. 분포 용적은 약물이 혈관 외 조직에 존재하는 정도를 반영한다. 큰 분포 용적은 혈장 단백질 결합에 비해 조직 구성요소에 결합하는 화합물의 경향을 반영한다. 임상 설정에서, Vdist는 정지 상태 농도를 달성하기 위한 로딩 용량을 결정하는데 사용될 수 있다. Vss는 정지 상태에서 적절한 분포 용적을 말한다. 일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체의 분포 용적은, 본원에 기술된 전달제와 동시-투여되는 경우, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 감소할 수 있다.
일부 구체예에서, 대상체에서 항-STn 항체의 분포 용적은 약학적 조성물 투여 이후 결정될 수 있다. 항-STn 항체는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는, 치료제를 포함한 항체 약물 컨쥬게이트일 수 있다. 치료제는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는, 세포독성제일 수 있다. 세포독성제는 MMAE일 수 있다. 세포독성제는 링커에 의해 항체에 결합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 대상체에 항-STn 항체를 제공하는데 사용될 수 있는데, 항-STn 항체는 약 1 ml/kg 내지 약 10 ml/kg, 약 5 ml/kg 내지 약 50 ml/kg, 약 20 ml/kg 내지 약 100 ml/kg, 약 75 ml/kg 내지 약 150 ml/kg, 또는 150 ml/kg 초과의 적절한 Vss를 나타낸다.
일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 조합된 조성물 및/또는 복합체를 포함된다. 약학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질, 예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 활성 물질을 포함할 수 있다. 약학적 작용제의 제제화 및/또는 제조에 있어서의 일반적인 고려사항은, 예를 들어, Remington : The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (본원에 참고로 포함됨)에서 발견될 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 인간, 인간 환자 또는 대상체에 투여된다. 본 발명의 목적을 위해, 구절 "활성 성분"은 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 전달되는 글리칸-상호작용 항체를 말한다.
본원에 제공된 약학적 조성물의 설명이 주로 인간에게 투여하기에 적합한 약제적 조성물에 대한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 임의의 다른 동물, 예를 들어, 비-인간 동물, 예를 들어, 비-인간 포유류에게 투여하기에 적합한 것으로 당업자들은 이해할 것이다. 조성물이 다양한 동물에서 투여하기에 적합하도록 하기 위한 인간에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물의 변형은 잘 이해되며, 통상의 숙련된 수의과 약리학자는 단지 보통의, 있다면, 실험으로 이러한 변형을 디자인 및/또는 수행할 수 있다. 약학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는, 제한되는 것은 아니지만, 인간 및/또는 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 랫트와 같이 상업적으로 관련된 포유류를 포함한 포유류; 및/또는 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조와 같이 상업적으로 관련된 조류를 포함한 조류를 포함한다.
본원에 기술된 약학적 조성물의 제제는 약리학 분야에서 공지되거나 이후에 개발된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 함께 조합한 다음, 필요에 따라 및/또는 경우에 따라, 생성물을 원하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 분할, 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르는 약학적 조성물은 대량으로, 단일 단위 용량으로서 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 이산량이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에 투여되는 활성 성분의 투약량 및/또는 이러한 투약량의 통상적인 분획, 예컨대 이러한 투약량의 1/2 또는 1/3과 같다.
본 발명에 따르는 약학적 조성물 중의 활성 성분, 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 신원, 체격 및/또는 상태에 따라 및 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들자면, 조성물은 01% 내지 100%, 예를 들어, 5 내지 50%, 1-30%, 5-80%, 또는 적어도 80% (w/w) 활성 성분을 포함할 것이다. 한 구체예에서, 활성 성분은 암 세포에 대한 항체이다.
제제
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 다음을 위해 하나 이상의 부형제를 사용하여 제제화될 수 있다: (1) 안정성 증가; (2) 세포 투과성 증가; (3) permit the 서방출 또는 지연 방출 (예를 들어, 글리칸-상호작용 항체의 제제로부터) 허용; 및/또는 (4) 생물 분포 (예를 들어, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 글리칸-상호작용 항체의 표적화) 변화. 임의의 및 모든 용제, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액제 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 에멀젼화제, 보존제와 같은 전통적인 부형제 이외에, 본 발명의 제제는, 제한 없이, 리포솜, 지질 나노입자, 폴리머, 리포플렉스, 코어-쉘 나노입자, 펩타이드, 단백질, 글리칸-상호작용 항체로 트랜스펙션된 세포 (예를 들어, 대상체로의 이식을 위해) 및 이것들의 조합을 포함할 수 있다.
부형제
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 사용 전에 본 발명의 화합물 및/또는 조성물과 조합되는 임의의 물질을 말한다. 일부 구체예에서, 부형제는 비활성이며 본 발명의 화합물 및/또는 조성물을 위한 담체, 희석제 또는 부형제로서 주로 사용된다. 약학적 조성물을 제제화하기 위한 다양한 부형제 및 조성물을 제조하기 위한 기술은 해당 분야에 공지되어 있다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006 (본원에 참조로 포함됨) 참조).
통상적인 부형제 매질의 사용은 임의의 통상의 부형제 매질이, 예를 들어, 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생산하거나 그렇지 않으면 약학적 조성물의 다른 구성요소(들)와 해로운 방식으로 상호작용함으로써 물질 또는 이의 유도체와 호환 불가능할 수 있는 한을 제외하고는 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
본원에 기술된 약학적 조성물의 제제는 약리학의 분야에서 공지되거나 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르는 약학적 조성물은 대량으로, 단일 단위 용량으로서 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다.
본 발명에 따르는 약학적 조성물 중의 활성 성분, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 처리되는 대상체의 신원, 체격 및/또는 상태에 따라 및 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 수 있다.
일부 구체예에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 순수하다. 일부 구체예에서, 부형제는 인간에서 사용하기 위해 및 수의과 사용을 위해 승인된다. 일부 구체예에서, 부형제는 미국 식품 의약국에 의해 승인된다. 일부 구체예에서, 부형제는 약학적 등급이다. 일부 구체예에서, 부형제는 미국 약전 (USP), 유럽 약전 (EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전의 기준을 충족한다.
약학적 조성물의 제조에 사용되는 약학적으로 허용 가능한 부형제는 불활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 에멀젼화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제 및/또는 오일을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 부형제는 선택적으로 약학적 조성물에 포함될 수 있다.
예시의 희석제는 칼슘 카보네이트, 나트륨 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 이칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 수소 포스페이트, 나트륨 포스페이트 락토오스, 수크로오스, 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 나트륨 클로라이드, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말 당, 등, 및/또는 이것들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시의 과립화제 및/또는 분산제는 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트, 점토, 알긴산, 구아 검(guar gum), 시트러스 펄프, 한천, 벤토나이트, 셀룰로오스 및 목제품, 해면 스펀지, 양이온-교환 수지, 칼슘 카보네이트, 실리케이트, 나트륨 카보네이트, 가교된 폴리(비닐-피롤리돈) (크로스포비돈), 나트륨 카르복시메틸 전분 (나트륨 전분 글리콜레이트), 카르복시메틸 셀룰로오스, 가교된 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 (크로스카르멜로오스), 메틸셀룰로오스, 전호화분 전분 (전분 1500), 미정질 전분, 수불용성 전분, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (VEEGUM®), 나트륨 라우릴 설페이트, 제4 암모늄 화합물, 등, 및/또는 이것들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시의 표면 활성제 및/또는 에멀젼화제는 천연 에멀젼화제(예컨대 아카시아, 한천, 알긴산, 나트륨 알지네이트, 트라가칸트, 콘드룩스, 콜레스테롤, 잔탄, 펙틴, 젤라틴, 난황, 카제인, 라놀린, 콜레스테롤, 왁스 및 레시틴), 콜로이드성 점토 (예를 들어, 벤토나이트 [알루미늄 실리케이트] 및 VEEGUM® [마그네슘 알루미늄 실리케이트]), 장쇄 아미노산 유도체, 고분자량 알콜 (예를 들어, 스테아릴 알콜, 세틸 알콜, 올레일 알콜, 트리아세틴 모노스테아레이트, 에틸렌 글리콜 디스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 및 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리비닐 알콜), 카보머 (예를 들어, 카복시 폴리메틸렌, 폴리아크릴산, 아크릴산 폴리머 및 카르복시비닐 폴리머), 카라기난, 셀룰로오스성 유도체 (예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스 나트륨, 분말 셀룰로오스, 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스), 소르비탄 지방산 에스터 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 [TWEEN®20], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 [TWEEN®60], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 [TWEEN®80], 소르비탄 모노팔미테이트 [SPAN®40], 소르비탄 모노스테아레이트 [Span®60], 소르비탄 트리스테아레이트 [Span®65], 글리세릴 모노올레에이트, 소르비탄 모노올레에이트 [SPAN®80]), 폴리옥시에틸렌 에스터 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트 [MYRJ®45], 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유, 폴리에톡실화 피마자유, 폴리옥시메틸렌 스테아레이트, 및 SOLUTOL®), 수크로오스 지방산 에스터, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스터 (예를 들어, CREMOPHOR®), 폴리옥시에틸렌 에테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 [BRIJ®30]), 폴리(비닐-피롤리돈), 디에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 나트륨 올레에이트, 칼륨 올레에이트, 에틸 올레에이트, 올레산, 에틸 라우레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, 세트리모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 도쿠세이트 나트륨, 등 및/또는 이것들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시의 결합제는 전분 (예컨대 옥수수전분 및 전분 페이스트); 젤라틴; 당 (예를 들어, 수크로오스, 글루코오스, 덱스트로오스, 덱스트린, 당밀, 락토오스, 락티톨, 만니톨); 천연 및 합성 검 (예를 들어, 아카시아, 나트륨 알기네이트, 아일랜드 이끼 (Irish moss)의 추출물, 판워 검 (panwar gum), 가티 검 (ghatti gum), 이사폴 허스크의 점액질 (mucilage of isapol husk), 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 미세결정성 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리(비닐-피롤리돈), 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (Veegum®) 및 낙엽송 아라보갈락탄); 알기네이트; 폴리에틸렌 옥사이드; 폴리에틸렌 글리콜; 무기 칼슘 염; 규산; 폴리메타크릴레이트; 왁스; 물; 알콜; 등; 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시의 보존제는 항산화제, 킬레이트화제, 항균성 보존제, 항진균성 보존제, 알콜 보존제, 산성 보존제 및/또는 기타의 보존제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시의 항산화제는 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 칼륨 메타비설파이트, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 나트륨 아스코르베이트, 나트륨 비설파이트, 나트륨 메타비설파이트, 및/또는 나트륨 설파이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시의 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산 일수화물, 이나트륨 에데테이트, 이칼륨 에데테이트, 에데트산, 푸마르산, 말산, 인산, 나트륨 에데테이트, 타르타르산 및/또는 삼나트륨 에데테이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시의 항균성 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 브로노폴, 세트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레솔, 클로르옥실레놀, 크레솔, 에틸 알콜, 글리세린, 헥세티딘, 이미두레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알콜, 페닐 수은 니트레이트, 프로필렌 글리콜, 및/또는 티메로살을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시의 항진균 보존제는 부틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 하이드록시벤조산, 칼륨 벤조에이트, 칼륨 소르베이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 피로피오네이트 및/또는 소르브산을 포함하지만, 이에 제한되지않는다. 예시의 알콜 보존제는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 페놀, 페놀 화합물, 비스페놀, 클로로부탄올, 하이드록시벤조에이트 및/또는 페닐에틸 알콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시의 산성 보존제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-캐로틴, 시트르산, 아세트산, 데하이드로아세트산, 아스코르브산, 소르브산 및/또는 피틴산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 보존제는 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 데테록심 메실레이트, 세트리미드, 부틸화된 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔 (BHT), 에틸렌디아민, 나트륨 라우릴 설페이트 (SLS), 나트륨 라우릴 에테르 설페이트 (SLES), 나트륨 비설파이트, 나트륨 메타비설파이트, 칼륨 설파이트, 칼륨 메타비설파이트, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, 메틸파라벤, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™, 및/또는 EUXYL®을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시의 완충제는 시트레이트 완충 용액, 아세테이트 완충 용액, 포스페이트 완충 용액, 암모늄 클로라이드, 칼슘 카보네이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, d-글루콘산, 칼슘 글리세로포스페이트, 칼슘 락테이트, 프로판산, 칼슘 레불리네이트, 펜탄산, 2염기 칼슘 포스페이트, 인산, 3염기 칼슘 포스페이트, 칼슘 하이드록사이드 포스페이트, 칼륨 아세테이트, 칼륨 클로라이드, 칼륨 글루코네이트, 칼륨 혼합물, 2염기 칼륨 포스페이트, 1염기 칼륨 포스페이트, 칼륨 포스페이트 혼합물, 나트륨 아세테이트, 나트륨 비카보네이트, 나트륨 클로라이드, 나트륨 시트레이트, 나트륨 락테이트, 2염기 나트륨 포스페이트, 1염기 나트륨 포스페이트, 나트륨 포스페이트 혼합물, 트로메타민, 마그네슘 하이드록사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알긴산, 무피로겐 수, 등장성 염수, 링거액(Ringer's solution), 에틸 알콜, 등, 및/또는 이것들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시의 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 탈크, 맥아, 글리세릴 베헤네이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드, 류신, 마그네슘 라우릴 설페이트, 나트륨 라우릴 설페이트 등, 및 이것들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시의 오일은 아몬드, 행인, 아보카도, 바바수, 베르가못, 블랙 커런트 시드 (black current seed), 보리지 (borage), 케이드 (cade), 캐모마일, 캐놀라, 캐러웨이, 카나우바, 피마자, 계피, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 면실, 에뮤, 유칼립투스, 달맞이꽃, 어류, 아마씨, 게라니올, 박 (gourd), 포도씨, 헤이즐넛, 히솝, 아이소프로필 미리스테이트, 호호바, 쿠쿠이 너트 (kukui nut), 라반딘, 라벤더, 레몬, 리트시 쿠베바 (litsea cubeba), 마카다미아 너트, 아욱, 망고씨, 메도우폼 시드 (meadowfoam seed), 밍크, 육두구, 올리브, 오렌지, 오렌지 러피, 야자, 야자핵, 도핵, 땅콩, 양귀비씨, 호박씨, 평지씨, 쌀겨, 로즈메리, 잇꽃, 백단, 사스콰나 (sasquana), 세이버리 (savoury), 산자나무, 참깨, 시어 버터, 실리콘, 대두, 해바라기, 티 트리, 엉겅퀴, 동백, 베티베르, 호두 및 밀 배아 오일을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시의 오일은 부틸 스테아레이트, 카프릴산 트리글리세라이드, 카프르산 트리글리세라이드, 사이클로메티콘, 디에틸 세바케이트, 디메티콘 360, 아이소프로필 미리스테이트, 미네랄 오일, 옥틸도데칸올, 올레일 알콜, 실리콘 오일, 및/또는 이것들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
코코아 버터 및 좌제 왁스, 착색제, 피복제, 감미제, 방향제 및/또는 향미제와 같은 부형제가 제제 업자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 부형제와 함께 제제화된다. 항체는 항-STn 항체일 수 있다. 항체는 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는, 치료제를 포함한 항체 약물 컨쥬게이트일 수 있다. 치료제는, 제한되는 것은 아니지만, 본원에서 제공된 것들 중 어느 것을 포함하는, 세포독성제일 수 있다. 세포독성제는 MMAE일 수 있다. 세포독성제는 링커에 의해 항체에 결합될 수 있다.
비히클
리포솜, 리포플렉스 및 지질 나노입자
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 하나 이상의 리포솜, 리포플렉스, 또는 지질 나노입자를 사용하여 제제화될 수 있다. 한 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체를 포함한 약학적 조성물은 리포솜을 더 포함한다. 리포솜은 주로 하나 이상의 지질 이중층을 포함하고 영양소 및 약학적 제제의 투여를 위한 전달 비히클로서 사용될 수 있는 인공적으로 제조된 소포이다. 리포솜은, 제한되는 것은 아니지만, 직경이 수백 나노미터일 수 있고 좁은 수성 구획에 의해 분리된 일련의 동심성 이중층을 함유할 수 있는 다중층 소포 (MLV), 직경이 50 nm 미만일 수 있는 소형 단세포 소포 (SUV), 및 직경이 50 내지 500 nm일 수 있는 대형 단세포 소포 (LUV)와 같이 상이한 크기일 수 있다. 리포솜 디자인은 건강하지 않은 조직에의 리포솜의 부착을 개선하거나, 제한되는 것은 아니지만, 세포 내 섭취(endocytosis)와 같은 이벤트를 활성화시키기 위해 옵소닌 또는 리간드를 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 리포솜은 약학적 제제의 전달을 개선하기 위해 낮은 또는 높은 pH를 가질 수 있다.
리포솜의 형성은, 제한되는 것은 아니지만, 포획된 약학적 제제 및 리포솜 성분, 지질 소포가 분산되는 매질의 성질, 포획된 물질의 유효 농도 및 이의 잠재적 독성, 소포의 적용 및/또는 전달 동안 수반되는 임의의 추가적인 공정들, 최적화 크기, 의도된 용도를 위한 소포의 다분산성 및 저장-수명 및 안전하고 효율적인 리포솜 생성물의 대규모 생산의 가능성 및 배치 간(batch-to-batch) 재현성과 같은 물리화학적 특징에 따라 달라질 수 있다.
한 구체예에서 이러한 제제는 또는 그것들이 생체 내에서 수동적으로 또는 능동적으로 상이한 세포 유형에 지시되도록 구성되거나 조성 변화될 수 있다.
제제는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 폴레이트, 트랜스페린, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), 및 항체 표적화된 ㅈ접근법에 의해 예시된 바와 같이, 표면 상에서 상이한 리간드의 발현을 통해 선택적으로 표적화될 수 있다.
리포솜, 리포플렉스, 또는 지질 나노입자는 이들 제제가 글리칸-상호작용 항체로의 세포 트랜스펙션을 증가시킬 수 있기 때문에 글리칸-상호작용 항체 기능의 효율을 개선하는데 사용될 수 있다. 리포솜, 리포플렉스, 또는 지질 나노입자는 또한 글리칸-상호작용 항체의 안정성을 증가시키는데 사용될 수 있다.
항체 카고를 위해 특수하게 제제화된 리포솜은 Eppstein 등 (Eppstein, D.A. et al., Biological activity of liposome -encapsulated murine interferon gamma is mediated by a cell membrane receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 Jun;82(11):3688-92); Hwang 등 (Hwang, K.J. et al., Hepatic uptake and degradation of unilamellar sphingomyelin /cholesterol liposomes : a kinetic study. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Jul;77(7):4030-4); US 4,485,045 및 US 4,544,545에 의해 기술된 것처럼, 해당 분야에 공지된 기술에 따라 제조된다. 지속적인 순환 시간을 갖는 리포솜의 생산은 또한 US 5,013,556에 기술되어 있다.
본 발명의 글리칸-상호작용 항체를 포함하는 리포솜은 지질, 예컨대, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 뿐만 아니라 폴리에틸렌 글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 이용하는 역상 증발을 사용하여 생성될 수 있다. 정의된 기공 크기를 갖는 필터는 원하는 직경의 리포솜을 압출하는데 사용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 Martin 등에 기술된 바와 같이 이황화 교환 반응에 의해 리포솜의 외부 표면에 컨쥬게이션될 수 있다 (Martin, F.J. et al., Irreversible coupling of immunoglobulin fragments to preformed vesicles. An improved method for liposome targeting. J Biol Chem. 1982 Jan 10;257(1):286-8).
폴리머 및 나노입자
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 천연 및/또는 합성 폴리머를 사용하여 제제화될 수 있다. 전달에 사용될 수 있는 폴리머의 비제한적인 예는 DMRI/DOPE, 폴록사머, 키토산, 사이클로덱스트린 및 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) 폴리머를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들은 생분해성일 수 있다.
폴리머 제제는 글리칸-상호작용 항체의 서방출 또는 지연 방출 (예를 들어, 근육내 또는 피하 주사 후)을 허용할 수 있다. 글리칸-상호작용 항체에 대한 변화된 방출 프로파일은, 예를 들어, 연장된 시간에 걸친 글리칸-상호작용 항체의 방출을 초래할 수 있다. 폴리머 제제는 또한 글리칸-상호작용 항체의 안정성을 증가시키는데 사용될 수 있다.
폴리머 제제는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 폴레이트, 트랜스페린, 및 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)에 의해 예시되는, 상이한 리간드의 발현을 통해 선택적으로 표적화될 수 있다 (Benoit et al., Biomacromolecule. 2011 12:2708-2714; Rozema et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:12982-12887; Davis, Mol Pharm. 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010 464:1067-1070 ((준문이 본원에 참조로 포함됨).
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 또한 폴리머, 지질, 및/또는, 제한되는 것은 아니지만, 칼슘 포스페이트와 같은 다른 생분해성 작용제의 조합을 사용하여 나노입자로서 제제화될 수 있다. 성분들을 코어-쉘, 하이브리드(hybrid) 및/또는 층상 구조(layer-by-layer architecture)로 조합하여, 글리칸-상호작용 항체의 전달이 향상될 수 있도록 나노입자의 미세-조정을 가능하게 할 수 있다. 글리칸-상호작용 항체의 경우, 폴리(2-(메타크릴로일옥시)에틸 포스포릴콜린)-블럭-(2-(디아이소프로필아미노)에틸 메타크릴레이트), (PMPC-PDPA), 폴리머솜(polymersome)이라고도 알려져 있는, 생리학적 pH에서 자가-조립하여 나노미터 크기의 소포를 형성하는 pH 민감성 이블럭 코폴리머를 기본으로 하는 시스템이 사용될 수 있다. 이들 폴리머솜은 살아있는 세포 내에서 비교적 높은 항체 페이로드를 성공적으로 전달하는 것으로 나타났다 (Massignani, et al, Cellular delivery of antibodies: effective targeted subcellular imaging and new therapeutic tool. Nature Proceedings, May, 2010).
한 구체예에서, PEG-전하-변환 폴리머 (Pitella et al, Biomaterials 2011 32:3106-3114)가 본 발명의 글리칸-상호작용 항체를 전달하기 위해 나노입자를 형성하는데 사용될 수 있다. PEG-전하-변환 폴리머는 산성 pH에 서 다양이온으로 분열되어 엔도솜 탈출을 향상시킴으로써 PEG-다음이온 블럭 코폴리머를 개선할 수 있다.
코어-쉘 나노입자의 사용은 양이온성 가교된 나노겔 코어 및 다양한 쉘을 합성하기 위해 고 처리량 접근법에 추가적으로 중점을 두었다 (Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-13001). 폴리머 나노입자의 복합체 형성, 전달, 및 내재화는 나노입자의 코어 및 쉘 구성요소 둘 다에서 화학 조성을 변경함으로써 정확하게 제어될 수 있다.
한 구체예에서, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스는 본 발명의 글리칸-상호작용 항체를 전달하는데 사용된다. 이러한 매트릭스는 Nature Biotechnology 10, 1446 - 1449 (1992)에 기술되어 있다.
항체 제제
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 정맥내 투여 또는 혈관 외 투여를 위해 제제화될 수 있다 (Daugherty, et al., Formulation and delivery issues for monoclonal antibody therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Aug 7;58(5-6):686-706, US 특허 공개 번호 2011/0135570 (모두 그 전문이 본원에 포함됨)). 혈관 외 투여 경로는, 피하 투여, 복강내 투여, 뇌내 투여, 안내 투여, 병변내 투여, 국소 투여 및 근육내 투여를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
항체 구조는 치료제로서의 이들의 효능을 개선하기 위해 변형될 수 있다. 개선은 개선된 열역학적 안정성, 감소된 Fc 수용체 결합 성질 및 개선된 폴딩 효율을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 변형은 아미노산 치환, 글리코실화, 팔미토일화 및 단백질 컨쥬게이션을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
글리칸-상호작용 항체는 항체 산화를 감소시키기 위해 항산화제와 함께 제제화될 수 있다. 글리칸-상호작용 항체는 또한 단백질 응집을 감소시키기 위한 참가제로 제제화될 수 있다. 이러한 첨가제는 알부민, 아미노산, 당, 유레아, 구아니디늄 클로라이드, 폴리알콜, 폴리머 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 및 텍스트란), 계면활성제 (제한되는 것은 아니지만, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80 포함) 또는 심지어 다른 항체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 항체 구조 및 기능에 대한 물의 영향을 감소시키도록 제제화될 수 있다. 이러한 제제 중의 항체 제제는 동결건조될 수 있다. 동결건조되는 제제는 항체 구조를 보호하고 안정화하기 위해 탄수화물 또는 폴리올 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 수크로오스, 트레할로오스 및 만니톨을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 폴리머로 제제화될 수 있다. 한 구체예에서, 폴리머 제제는 소수성 폴리머를 함유할 수 있다. 이러한 폴리머는 수중유중고체(solid-in-oil-in-water) 캡슐화 방법을 통해 폴리락티드-코-글리콜리드로 제제화된 미소구체일 수 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머를 포함하는 미소구체가 또한 항체 전달을 위해 고려되며 전달 부위에서 항체 방출의 시간 경과를 연장하는데 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리머는 수성 겔일 수 있다. 이러한 겔은, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스를 포함할 수 있다. 수성 겔은 또한 히알루론산 하이드로겔을 포함할 수 있다. 항체는, 제한되는 것은 아니지만, 중추 신경계의 조직을 포함한 조직에서 지속적인 전달(sustained delivery)을 허용하는 히드라존 연결을 통해 이러한 겔에 공유 결합될 수 있다.
펩타이드 및 단백질 제제
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 펩타이드 및/또는 단백질로 제제화될 수 있다. 한 구체예에서, 제한되는 것은 아니지만, 세포 침투 펩타이드 및 단백질과 세포내 전달을 가능하게 하는 펩타이드와 같은 펩타이드가 약학적 제제를 전달하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 제제와 함께 사용될 수 있는 세포 침투 펩타이드의 비-제한적인 예는 세포 내 공간으로의 전달을 촉진하는 다양이온에 부착된 세포-침투 펩타이드 서열, 예컨대, HIV-유도된 TAT 펩타이드, 페네트라틴, 트랜스포르탄, 또는 hCT 유도된 세포-침투 펩타이드를 포함한다 (예를 들어, Caron et al., Mol. Ther. 3(3):310-8 (2001); Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL, 2002); El-Andaloussi et al., Curr. Pharm. Des. 11(28):3597-611 (2003); 및 Deshayes et al., Cell. Mol. Life Sci. 62(16):1839-49 (2005) (모두 본원에 참조로 포함됨) 참조). 조성물은 또한 세포 내 공간으로의 조성물의 전달을 향상시키는 세포 침투제, 예컨대, 리포솜을 포함하도록 제제화될 수 있다. 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 세포 내 전달을 가능하게 하기 위해, 제한되는 것은 아니지만, Aileron Therapeutics (Cambridge, MA) 및 Permeon Biologics (Cambridge, MA)로부터의 펩타이드 및/또는 단백질과 같은 펩타이드 및/또는 단백질과 복합체를 형성할 수 있다 (Cronican et al., ACS Chem. Biol. 2010 5:747-752; McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009 106:6111-6116; Sawyer, Chem Biol Drug Des. 2009 73:3-6; Verdine and Hilinski, Methods Enzymol. 2012; 503:3-33 (모두 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
한 구체예에서, 세포-침투 폴리펩타이드는 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함할 수 있다. 제1 도메인은 과하전된(supercharged) 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 제2 도메인은 단백질-결합 파트너를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단백질-결합 파트너"는 항체 및 이것의 기능적 단편, 스캐폴드 단백질, 또는 펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 세포-침투 폴리펩타이드는 단백질-결합 파트너에 대한 세포 내 결합 파트너를 추가로 포함할 수 있다. 세포-침투 폴리펩타이드는 글리칸-상호작용 항체가 도입될 수 있는 세포로부터 분비될 수 있다.
본 발명의 제제에서, 펩타이드 또는 단백질은 글리칸-상호작용 항체에 의한 세포 트랜스펙션을 증가시키거나 글리칸-상호작용 항체의 생체 분포를 변화시키기 위해 (예를 들어, 특정 조직 또는 세포 유형을 표적화함으로써) 삽입될 수 있다.
세포 제제
본 발명의 글리칸-상호작용 항체 조성물의 세포-기반 제제는 세포 트랜스펙션을 보장하거나 (예를 들어, 세포 담체에서) 또는 조성물의 생물 분포를 변화시키는데 (예를 들어, 세포 담체를 특정 조직 또는 세포 유형으로 표적화함으로써) 사용될 수 있다.
세포 전달 방법
바이러스 및 비-바이러스 매개된 기술을 포함한, 다양한 방법이 해당 분야에 공지되어 있고 세포로의 핵산 또는 단백질, 예컨대 글리칸-상호작용 항체의 도입에 적합하다. 전형적인 비-바이러스 매개된 기술의 예는 전기천공법, 칼슘 포스페이트 매개된 전달, 뉴클레오펙션, 초음파 천공, 열 충격, 마그네토펙션, 리포솜 매개된 전달, 미량 주사, 미세투사물 매개된 전달 (나노입자), 양이온성 폴리머 매개된 전달 (DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등) 또는 세포 융합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
초음파 천공, 또는 세포 초음파 기술은 세포 원형질막의 투과성을 변형시키기 위해 소리 (예를 들어, 초음파 주파수)를 사용하는 것이다. 초음파 천공법은 당업자에게 공지되어 있으며 생체 내에서 핵산을 전달하는데 사용된다 (Yoon and Park, Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:321-330; Postema and Gilja, Curr Pharm Biotechnol. 2007 8:355-361; Newman and Bettinger, Gene Ther. 2007 14:465-475 (모두 전문이 본원에 참고로 포함됨)). 초음파 천공법은 해당 분야에 공지되어 있으며 또한, 예를 들어, 박테리아에 관련됨에 따라 미국 특허 공보 20100196983에서 및 다른 세포 타입에 관련됨에 따라, 예를 들어, 미국 특허 공보 20100009424에서 교시되어 있다 (각각 전문이 본원에 참고로 포함됨).
전기천공 기술 또한 해당 분야에 널리 공지되어 있으며 생체 내에서 임상적으로 핵산을 전달하는데 사용된다 (Andre et al., Curr Gene Ther. 2010 10:267-280; Chiarella et al., Curr Gene Ther. 2010 10:281-286; Hojman, Curr Gene Ther. 2010 10:128-138 (모두 전문이 본원에 참고로 포함됨)). 한 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 전기천공법에 의해 전달될 수 있다.
투여 및 전달
본 발명의 조성물은 해당 분야에 공지된 표준 방법 또는 경로 중 어느 것에 의해서도 투여될 수 있다.
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 치료적으로 유효한 결과를 발생시키는 임의의 경로로 투여될 수 있다. 이것들은 장관, 위장, 경막외, 경구, 경피, 경막외 (경막 주위), 뇌내 (대뇌 안으로), 뇌실내 (뇌실 안으로), 피부외 (피부에 적용), 피부내 (피부 자체 안으로), 피하 (피부 아래), 비강 투여 (코를 통해), 정맥내 (정맥 안으로), 동맥 내 (동맥 안으로), 근육내 (근육 안으로), 심장내 (심장 안으로), 골내 주입 (골수 안으로), 경막내 (척추관 안으로), 복강내 (복막 안으로 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내 (눈을 통해), 해면내 주사 (음경의 기저 안으로), 질내 투여, 자궁내, 양막외 투여, 경피 (전신 분포를 위해 온전한 피부를 통해 확산), 경점막 (점막을 통해 확산), 통기 (코흡입), 설하, 입술밑, 관장, 점안액 (결막에), 또는 점이액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 조성물은 이들이 혈액-뇌 장벽, 혈관 장벽, 또는 다른 상피 장벽을 건너갈 수 있도록 하는 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 글리칸-상호작용 항체에 대한 비-제한적인 투여 경로는 하기 기술되어 있다.
비경구 및 주사성 투여
경구 및 비경구 투여를 위한 액체 투약 형태는 약학적으로 허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 및/또는 엘릭서를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 활성 성분 이외에, 액체 투약 형태는, 예를 들어, 물 또는 다른 용제와 같이 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 가용화제 및 에멀젼화제, 예컨대, 에틸 알콜, 아이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 면실유, 땅콩 오일, 옥수수 오일, 배아 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 호마 오일), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스터 및 이것들의 혼합물을 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 습윤제, 에멀젼화제 및 현탁제, 감미제, 방향제 및/또는 향미제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 특정 구체예에서, 조성물은 CREMOPHOR®, 알콜, 오일, 변성유, 글리콜, 폴리소르베이트, 사이클로덱스트린, 폴리머, 및/또는 이것들의 조합과 같은 가용화제와 혼합된다. 다른 구체예에서, 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제가 포함된다.
주사 가능 조제물, 예를 들어, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 사용하여 해당 분야에 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사 가능한 조제물은 비경구로 허용 가능한 비독성 희석제 및/또는 용제 중의 멸균 주사 가능한 용액, 현탁액 및/또는 에멀젼, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용제에는 물, 링거액, U.S.P, 및 등장성 나트륨 클로라이드 용액이 있다. 멸균 고정유가 통상적으로 용제 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함한 임의의 완하성 고정유가 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용될 수 있다.
주사 가능한 제제는, 예를 들어, 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해, 및/또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사 가능 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입함으로써 멸균될 수 있다.
활성 성분의 효과를 연장하기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 활성 성분의 흡수를 느리게 하는 것이 때때로 바람직할 수 있다. 이것은 불량한 수용해도를 갖는 결정질 또는 무정질 재료의 액체 현탁액의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이때 약물의 흡수율은 이의 용해율에 따라 달라지며, 용해 속도는 결국 결정 크기 및 결정질 형태에 따라 다를 수 있다. 대안으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연 흡수는 약물을 오일 비히클에 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다. 주사 가능한 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 폴리머에 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비 및 사용되는 특정 폴리머의 성질에 따라, 약물 방출 비율이 제어될 수 있다. 다른 생분해성 폴리머의 예는 폴리(오르쏘에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포 주사 가능 제제는 체 조직과 상용성인 리포솜 또는 마이크로에멀젼에 약물을 포획함으로써 제조된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 정맥내로 투여될 수 있다. 투여는 정맥내 볼루스 주사에 의해 이루어질 수 있다.
직장 및 질 투여
직장 또는 질 투여를 위한 조성물은 전형적으로, 조성물을 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌제 왁스와 같이 주위 온도에서는 고체이지만 체온에서는 액체이어서 직장 또는 질강에서 용융되어 활성 성분을 방출하는 적합한 비-자극 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌제이다.
경구 투여
경구 투여를 위한 고체 투약 형태는 캡슐, 타블렛, 알약, 분말, 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투약 형태에서, 활성 성분은 적어도 하나의 불활성의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 나트륨 시트레이트 또는 이칼슘 포스페이트 및/또는 충전제 또는 증량제 (예를 들어, 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 및 규산), 바인더 (예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로오스, 및 아카시아), 보습제 (예를 들어, 글리세롤), 붕해제 (예를 들어, 한천, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 나트륨 카보네이트), 용해 지연제 (예를 들어, 파라핀), 흡수 촉진제 (예를 들어, 제4 암모늄 화합물), 습윤제 (예를 들어, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트), 흡착제 (예를 들어, 카올린 및 벤토나이트 점토), 및 윤활제 (예를 들어, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트), 및 이것들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 타블렛 및 알약의 경우에, 투약 형태는 완충제를 포함할 수도 있다.
국소 또는 경피 투여
본원에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체를 함유하는 조성물은 국소 투여용으로 제제화될 수 있다. 피부는 쉽게 접근 가능하기 때문에 전달을 위한 이상적인 표적 부위일 수 있다. 유전자 발현은 피부에 제한되어 잠재적으로 비특이적 독성을 피할 뿐만 아니라 피부 내의 특정 층 및 세포 유형에 제한될 수 있다.
전달된 조성물의 피부 발현의 부위는 핵산 전달의 경로에 따라 다를 것이다. 세 가지 경로가 글리칸-상호작용 항체를 피부에 전달하는데 흔히 고려된다: (i) 국소 적용 (예를 들어, 국소/국부 치료 및/또는 미용적 적용의 경우); (ii) 피부내 주사 (예를 들어, 국소/국부 치료 및/또는 미용적 적용의 경우); 및 (iii) 전신 전달 (예를 들어, 피부 및 피부외 영역 둘 다에 영향을 미치는 피부 질환의 치료의 경우). 글리칸-상호작용 항체는 해당 분야에 공지된 여러 상이한 접근법에 의해 피부에 전달될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 편리하게 및/또는 효과적으로 수행하기 위한 각종 드레싱 (예를 들어, 상처 드레싱) 또는 붕대 (예를 들어, 접착 붕대)를 제공한다. 전형적으로 드레싱 또는 붕대는 사용자가 대상체(들)의 다중 치료를 수행하도록 하기 위해 본원에 기술된 약학적 조성물 및/또는 글리칸-상호작용 항체의 충분한 양을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 1회 이상의 주사로 전달되는 글리칸-상호작용 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
조성물의 국소 및/또는 경피 투여를 위한 투약 형태는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 및/또는 패치를 포함할 수 있다. 일반적으로, 활성 성분은 멸균 조건하에서 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 임의의 필요한 보존제 및/또는 필요한 경우 완충제와 혼합된다.
추가적으로, 본 발명은 경피 패치의 사용을 고려하며, 이것은 때때로 신체로의 화합물의 제어 전달을 제공하는 추가의 이점을 갖는다. 이러한 투약 형태는, 예를 들어, 화합물을 적절한 매질에 용해 및/또는 분배함으로써 제조될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 비율은 비율 제어 막을 제공하고 및/또는 화합물을 폴리머 매트릭스 및/또는 겔에 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
국소 투여에 적합한 제제는 액체 및/또는 반 액체 조제물, 예컨대 도찰제(liniment), 로션, 수중유 및/또는 유중수 에멀젼, 예컨대 크림, 연고 및/또는 페이스트, 및/또는 용액 및/또는 현탁액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
국소-투여 가능한 제제는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10% (w/w) 활성 성분을 포함할 수 있지만, 활성 성분의 농도는 용제 중의 활성 성분의 용해도 한계만큼 높을 수 있다. 국소 투여를 위한 제제는 본원에 기술된 하나 이상의 추가적인 성분을 더 포함할 수 있다.
데포 투여
본원에서 기술된 바와 같이, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 연장 방출을 위해 데포로 제제화된다. 일반적으로, 특정 기관 또는 조직 ("표적 조직")이 투여를 위해 표적화된다.
본 발명의 일부 양태에서, 글리칸-상호작용 항체는 표적 조직 내에 또는 근위에 공간적으로 보유된다. (하나 이상의 표적 세포를 포함한) 하나 이상의 표적 조직을 조성물, 특히 조성물의 글리칸-상호작용 항체 구성요소(들)가 표적 조직에 실질적으로 보유되는 조건 (적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 또는 99.99% 이상의 조성물이 표적 조직에 보유됨을 의미한다) 하에 조성물과 접촉시킴으로써 포유류 대상체의 하나 이상의 표적 조직에 조성물을 제공하는 방법이 제공된다. 유리하게는, 보유는 표적 조직 및/또는 세포로 들어가는 조성물에 존재하는 글리칸-상호작용 항체의 수준을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 대상체에 투여되는 글리칸-상호작용 항체의 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 또는 99.99% 이상이 투여 후 일정 기간에 세포 내에 존재한다. 예를 들어, 포유류 대상체로의 근육내 주사는 하나 이상의 글리칸-상호작용 항체 및 트랜스펙션 시약을 포함하는 수성 조성물을 사용하여 수행될 수 있으며, 조성물의 보유는 근육 세포에 존재하는 글리칸-상호작용 항체의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 특정 양태는 (하나 이상의 표적 세포를 함유한) 표적 조직을 조성물이 표적 조직에 실질적으로 보유되는 조건 하에 조성물과 접촉시킴으로써 포유류 대상체의 표적 조직에 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 조성물은 관심있는 효과가 적어도 하나의 표적 세포에서 생산되도록 유효량의 글리칸-상호작용 항체를 함유한다. 조성물은 일반적으로 세포 침투제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하지만, "네이키드" 글리칸-상호작용 항체 (예컨대 세포 침투제 또는 다른 작용제가 없는 글리칸-상호작용 항체)도 고려된다.
일부 구체예에서, 조성물은 복수의 상이한 글리칸-상호작용 항체를 포함하며, 글리칸-상호작용 항체 중의 하나 또는 하나 이상은 관심있는 글리칸을 표적화한다. 선택적으로, 조성물은 또한 조성물의 세포 내 전달을 돕기 위해 세포 침투제를 함유한다. 사전 결정된 부피의 표적 조직 내에 함유된 세포의 상당 비율에서 관심있는 글리칸을 표적화하는데 필요한 조성물 용량을 결정한다 (일반적으로, 사전 결정된 부피에 인접한, 또는 표적 조직의 원위에 있는 조직에 글리칸을 표적화하지 않으면서). 이러한 결정 이후에, 결정된 용량은 포유류 대상체의 조직에 직접 도입될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 1회 초과의 주사로 또는 분할 용량 주사에 의해 전달되는 글리칸-상호작용 항체를 제공한다.
폐 투여
약학적 조성물은 협강을 통한 폐 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는 활성 성분을 더 포함하고 약 0.5 nm 내지 약 7 nm 또는 약 1 nm 내지 약 6 nm의 범위의 직경을 갖는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 적절하게는, 추진제의 스트림이 분말을 분산시키도록 지시될 수 있는 건조 분말 레저버를 포함하는 디바이스를 사용하여 및/또는 밀봉된 용기에서 저비점(low-boiling) 추진제에 용해 및/또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 디바이스와 같은 자가-추진 용제/분말 분배 용기를 사용하여 투여하기 위한 건조 분말 형태일 수 있다. 이러한 분말은 입자의 중량의 적어도 98%가 0.5 nm 초과의 직경을 갖고 입자의 수의 적어도 95%가 7 nm 미만의 직경을 갖는 입자를 포함한다. 대안으로, 입자의 중량의 적어도 95%가 1 nm 초과의 직경을 갖고 입자의 수의 적어도 90%가 6 nm 미만의 직경을 갖는다. 건조 분말 조성물은 당과 같은 고체 미세 분말 희석제를 포함할 수 있으며 통상적으로는 단위 용량 형태로 제공된다.
저비점 추진제는 일반적으로 대기압에서 65℉ 미만의 비점을 갖는 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로, 추진제는 조성물의 50% 내지 99.9% (w/w)를 구성할 수 있으며, 활성 성분은 조성물의 01% 내지 20% (w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 추가적인 성분, 예컨대 액체 비-이온성 및/또는 고체 음이온성 계면활성제 및/또는 고체 희석제 (활성 성분을 포함하는 입자와 동위의 입자 크기를 가질 수 있음)를 더 포함할 수 있다.
폐 전달을 위해 제제화된 약학적 조성물은 용액 및/또는 현탁액의 액적의 형태로 활성 성분을 제공할 수 있다. 이러한 제제는 활성 성분을 포함하고, 선택적으로 멸균 상태인 수성 및/또는 희석 알콜성 용액 및/또는 현택액으로서 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있고, 통상적으로 임의의 분무화 및/또는 미립자화 디바이스를 사용하여 투여될 수 있다. 이러한 제제는, 제한되는 것은 아니지만, 방향제, 예컨대 사카린 나트륨, 휘발성 오일, 완충제, 표면 활성제, 및/또는 보존제, 예컨대 메틸하이드록시벤조에이트를 포함하는 하나 이상의 추가적인 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 투여 경로에 의해 제공된 액적은 약 0.1 nm 내지 약 200 nm 범위의 평균 직경을 가질 수 있다.
비내 , 비강 및 협강 투여
폐 전달에 유용한 것으로 본원에 기술된 제제는 약학적 조성물의 비강내 투여에 유용하다. 비강내 투여에 적합한 또 다른 제제는 활성 성분을 포함하고 약 약 0.2 μm 내지 500 μm의 평균 입자를 갖는 거친 분말이다. 이러한 제제는 코로 들이쉬는 방식으로, 즉, 코 가까이에 유지된 분말의 용기로부터 비강을 통한 신속한 흡입에 의해 투여된다.
비강 투여에 적합한 제제는, 예를 들어, 작게는 약 0.1% (w/w)에서 많게는 100% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 본원에 기술된 하나 이상의 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 협강 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어, 통상의 방법을 사용하여 타블렛 및/또는 로젠지 형태로 제조죌 수 있으며, 예를 들어, 0.1% 내지 20% (w/w) 활성 성분을 포함할 수 있고, 나머지는 경구 용해 가능한 및/또는 분해 가능한 조성물 및, 선택적으로, 본원에 기술된 하나 이상의 추가적인 성분을 포함한다. 대안으로, 협강 투여에 적합한 제제는 활성 성분을 포함하는 분말 및/또는 에어로졸화 및/또는 분무화 용액 및/또는 현탁액을 포함할 수 있다. 이러한 분말화, 에어로졸화 및/또는 에어로졸화 제제는, 분산되는 경우, 약 0.1 nm 내지 약 200nm 범위의 평균 입자 및/또는 액적 크기를 가질 수 있고, 본원에 기술된 하나 이상의 임의의 추가적인 성분을 더 포함할 수 있다.
눈 또는 귀 투여
약학적 조성물은 눈 또는 귀 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어, 수성 또는 유성 액체 부형제 중의 활성 성분의 0.1/1.0% (w/w) 용액 및/또는 현택액을 포함한 점안액 또는 점이액 형태일 수 있다. 이러한 점적제는 완충제, 염, 및/또는 본원에 기술된 하나 이상의 다른 임의의 추가적인 성분을 더 포함할 수 있다. 유용한 다른 안과적으로-투여 가능한 제제는 미정질 형태로 및/또는 리포솜 조제물로 활성 성분을 포함하는 것들을 포함한다. 망막하 인서트가 또한 투여의 한 형태로서 사용될 수 있다.
페이로드 투여
본원에 기술된 글리칸-상호작용 항체는 생물학적 표적으로의 물질 ("페이로드")의 전달이 요구되는 많은 상이한 시나리오, 예를 들면 표적의 검출을 위한 검출 가능한 물질의 전달, 또는 치료제 또는 진단제의 전달에 사용될 수 있다. 검출 방법은 시험관 내 이미지화 및 생체 내 이미지화 방법 둘 다, 예를 들어, 면역조직화학, 생물발광 이미지화 (BLI), 자기 공명 이미지화 (MRI), 양전자 방사 단층 촬영 (PET), 전자 현미경법, X선 컴퓨터 단층 촬영, 라만(Raman) 이미지화, 광 간섭 단층 촬영, 흡수 이미지화, 열 이미지화, 형광 반사 이미지화, 형광 현미경법, 형광 분자 단층 촬영 이미지화, 핵 자기 공명 이미지화, X선 이미지화, 초음파 이미지화, 광음향 이미지화, 실험실 분석, 또는 태그화/염색/이미지화가 요구되는 임의의 상황을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
글리칸-상호작용 항체는 임의의 유용한 배향으로 링커 및 페이로드 둘 다를 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 단부를 가진 링커는 하나의 단부를 페이로드에 부착시키고 다른 단부를 글리칸-상호작용 항체에 부착시키는데 사용된다. 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 하나 이상의 페이로드 뿐만 아니라 분열 가능한 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 링커를 통해 글리칸-상호작용 항체에 부착될 수 있고 형광 라벨링될 수 있는 약물은 생체 내에서, 예컨대 세포 내에서 약물을 추적하는데 사용될 수 있다.
또 다른 예는 세포로의 가역적 약물 전달에 있어서의 글리칸-상호작용 항체의 사용을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기술된 글리칸-상호작용 항체는 특정 소기관으로의 페이로드, 예컨대, 검출 가능한 작용제 또는 치료제의 세포 내 표적화에 사용될 수 있다. 이에 더하여, 본원에 기술된 글리칸-상호작용 항체는, 예를 들어, 살아있는 동물에서 치료제를 세포 또는 조직에 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 글리칸-상호작용 항체는 암 세포를 살해하 위해 화학요법제를 전달하는데 사용될 수 있다. 링커를 통해 치료제에 부착된 글리칸-상호작용 항체는 막 침투를 촉진시켜 치료제가 세포로 이동하여 세포 내 표적에 도달하도록 할 수 있다.
일부 구체예에서, 페이로드는 세포독소, 방사성 이온, 화학요법제, 또는 다른 치료제와 같은 치료제일 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로울 수 있는 임의의 작용제를 포함한다. 예는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테니포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시안트라신디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄시놀 (미국 특허 번호 5,208,020 (본원에 전문이 참고로 포함됨) 참조), 라켈마이신 (CC-1065, 미국 특허 제5,475,092호, 제5,585,499호 및 제5,846,545호 참조 (모두 본원에 참고로 포함됨)) 및 이것들의의 유사체 또는 상동체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 방사성 이온은 요오드 (예컨대, 요오드 125 또는 요오드 131), 스트론튬 89, 인, 팔라듐, 세슘, 이리듐, 포스페이트, 코발트, 이트륨 90, 사마륨 153 및 프라세오디뮴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 치료제는 항대사산물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오테파 클로람부실, 라첼마이신 (CC-1065), 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 씨스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)) 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 탁솔 및 메이탄시노이드)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항-STn 항체의 경우에, 종양 사멸은 독소를 이러한 항-STn 항체에 컨쥬게이션시킴으로써 촉진될 수 있다.
일부 구체예에서, 페이로드는 검출 가능한 작용제, 예컨대 다양한 유기 소분자, 무기 화합물, 나노입자, 효소 또는 효소 기질, 형광 물질, 발광 재료 (예를 들어, 루미놀), 생물발광 재료 (예를 들어, 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린), 화학 발광 재료, 방사성 재료 (예를 들어, 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 111In, 123I, 133Xe, 201Tl, 125I, 35S, 14C, 3H, 또는 99mTc (예를 들어, 퍼테크네테이트 (테크네테이트(VII), TcO4 -로서)), 및 콘트라스트제 (예를 들어, 금 (예를 들어, 금 나노입자), 가돌리늄 (예를 들어, 킬레이트화 Gd), 산화철 (예를 들어, 초상자성 산화철(SPIO), 단결정성 산화철 나노입자 (MION) 및 초소형 초상자성 산화철 (USPIO)), 망간 킬레이트 (예를 들어, Mn-DPDP), 바륨 설페이트, 요오드화 조영제 (이오헥솔), 미세기포, 또는 과불화탄소)일 수 있다. 이러한 광학-검출 가능한 표지는, 예를 들어, 제한 없이, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'디설폰산; 아크리딘 및 유도체 (예를 들어, 아크리딘 및 아크리딘 아이소티오시아네이트); 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS); 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈이미드-3,5 디설포네이트; N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드; 안트라닐아미드; BODIPY; 브릴리언트 옐로 (Brilliant Yellow); 쿠마린 및 유도체 (예를 들어, 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120) 및 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린 (쿠마린 151)); 시아닌 염료; 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI); 5'5"-디브로모피로갈롤-설포나프탈레인 (Bromopyrogallol Red); 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린; 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트; 4,4'-디이소티오시아네이토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산; 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산; 5-[디메틸아미노]-나프탈렌-1-설포닐 클로라이드 (DNS, 단실클로라이드); 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트 (DABITC); 에오신 및 유도체 (예를 들어, 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트); 에리트로신 및 유도체 (예를 들어, 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트); 에티듐; 플루오레세인 및 유도체 (예를 들어, 5-카복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인 (DTAF), 2',7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카복시플루오레세인, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, X-로다민-5-(및-6)-이소티오시아네이트 (QFITC 또는 XRITC) 및 플루오레사민); 2-[2-[3-[[1,3-디하이드로-1,1-디메틸-3-(3-설포프로필)-2H-벤즈[e]인돌-2-일리덴]에틸리덴]-2-[4-(에톡시카보닐)-1-피페라지닐]-1-사이클로펜텐-1-일]에테닐]-1,1-디메틸-3-(3-설포르프로필)-1H-벤즈[e]인돌륨 하이드록사이드, 분자 내염, n,n-디에틸에탄아민(1:1)을 갖는 화합물 (IR144); 5-클로로-2-[2-[3-[(5-클로로-3-에틸-2(3H)-벤조티아졸-일리덴)에틸리덴]-2-(디페닐아미노)-1-사이클로펜텐-1-일]에테닐]-3-에틸 벤조티아졸륨 퍼클로레이트 (IR140); 말라카이트 그린 (Malachite Green) 이소티오시아네이트; 4-메틸룸벨리페론 오르쏘크레솔프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드; B-피코에리트린; o-프탈디알데히드; 피렌 및 유도체 (예를 들어, 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌); 부티레이트 양자점; Reactive Red 4 (CIBACRON TM Brilliant Red 3B-A); 로다민 및 유도체 (예를 들어, 6-카복시-X-로다민 (ROX), 6-카복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드 로다닌 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체 (Texas Red), N,N,N',N'테트라메틸-6-카복시로다민 (TAMRA) 테트라메틸 로다민 및 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC)); 리보플라빈; 로졸산; 테르븀 킬레이트 유도체; 시아닌-3 (Cy3); 시아닌-5 (Cy5); 시아닌-55 (Cy5.5), 시아닌-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa 647; La Jolta Blue; 프탈로 시아닌; 및 나프탈로 시아닌을 포함한다.
일부 구체예에서, 검출 가능한 작용제는 활성화시 검출 가능해지는 비-검출 가능한 전구물질일 수 있다 (예를 들어, 형광원성 테트라진-형광단 구조체 (예를 들어, 테트라진-BODIPY FL, 테트라진-Oregon Green 488, 또는 테트라진-BODIPY TMR-X) 또는 효소 활성화 가능한 형광원성 작용제 [예를 들어, PROSENSE® (VisEn Medical)]). 효소 라벨링된 조성물이 사용될 수 있는 시험관 내 검정은 효소 결합 면역흡착법 (ELISA), 면역침강 분석, 면역형광법, 효소 면역검정 (EIA), 방사 면역 검정 (RIA), 및 웨스턴 블롯 분석을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
조합
글리칸-상호작용 항체는 하나 이상의 다른 치료제, 예방제, 진단제, 또는 이미화제와 조합하여 사용될 수 있다. "조합하여"는, 작용제들이 함께 전달을 위해 동시에 투여되고 및/또는 제제화되어야 함을 의미하는 것은 아니지만, 이러한 전달방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 조성물은 하나 이상의 다른 원하는 치료 또는 의료 절차와 동시에, 이전에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각 작용제는 그 작용제에 대해 결정된 용량 및/또는 일정으로 투여될 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 약학적, 예방적, 진단적 및/또는 이미지화 조성물을 이것들의 생물학적 이용 가능성을 개선하고, 이것들의 대사를 감소 및/또는 변화시키고, 이것들의 배출을 억제하고, 및/또는 이것들의 체내 분포를 변화시킬 수 있는 작용제와 조합하여 전달하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체는 하나 이상의 암 치료제, 예컨대 화학치료제, 치료 항체, 및/또는 세포 주기 억제자와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 암 치료제로의 조합 글리칸-상호작용 항체 처리는 이로운 치료적 성질, 예를 들어, 상승 작용 항-종양 활성을 제공할 수 있으며, 암 치료를 위해 사용될 수도 있다. 어떤 경우에는, 이러한 방법은 화학요법, 항체 요법 및/또는 세포 주기 억제자 처리에 저항성인 암 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 약물-저항성 암 세포를 표적화하는 방법은 화학요법, 항체 요법 및/또는 세포 주기 억제자 처리 후 발생하는 암 세포에서의 STn 발현의 변화를 이용할 수 있다. 어떤 경우에는, 약물-저항성 암 세포는 처리 전에 및/또는 후에 STn을 발현한다. 어떤 경우에는, 약물-저항성 암 세포에서 세포 표면 STn 발현은 처리 이후 증가될 수 있다. 처리 후, 일부 암 세포는 증식하여 사용된 암 치료제(들)에 저항성인 STn-발현 암 세포의 집단을 발생시킬 수 있다. 어떤 경우에는, 약물-저항성 암 세포는 암 줄기 세포이다.
따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 암 치료제의 투여 후 존재하는 STn-발현 암 세포를 표적화하기 위해 대상체에게 항-STn 항체를 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 이러한 항-STn 항체는 서열 번호: 1-12 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 가변 도메인을 포함할 수 있다. 항-STn 항체로 처리된 대상체 및/또는 대상체 내 암성 조직은 STn-양성 세포의 감소를 경험할 수 있다. 일부 구체예에서, 감소는 약 10% 내지 약 90% 초과 (예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%)의 STn-양성 세포의 감소를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 항-STn 항체와 조합하여 사용된 화학치료제는 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 백금-기반 작용제 (예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카르보플라틴), 토포이소머라아제 억제자 (예를 들어, 이리노테칸), 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 5-플루오로우라실 및 젬시타빈), 키나아제 억제자 [예를 들어 포나티닙 (ICLUSIG®) 및 소라페닙 (NEXAVAR®)], 및 PARP 억제자 [예를 들어 올라파립 (LYNPARZA™)]를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 화학치료제는, 제한되는 것은 아니지만, 미소관 기능, 효소 기능, 또는 DNA 합성의 억제를 포함하는 메커니즘을 통해 세포사를 유발하거나 세포 성장을 방지할 수 있다.
일부 구체예에서, 항-STn 항체와 조합된 치료 항체는 암 세포 표면 수용체를 표적화하는 항체를 포함할 수 있다. 이러한 표면 수용체는 세포 증식 및/또는 이동에 중요한 세포 신호 전달 경로에 수반될 수 있다. 어떤 경우에는, 표면 수용체는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 또는 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER)일 수 있다. 이들 수용체 또는 관련 인자들을 표적화하는 항체는 암 세포 성장 및/또는 이동을 억제할 수 있다. 예시의 항-EGFR 항체는 세툭시맙 (ERBITUX®) 및 파니투무맙 (VECTIBIX®)을 포함한다. 예시의 항-VEGF 항체는 베바시쥬맙 (AVASTIN®) 및 라무시루맙 (CYRAMZA®)을 포함한다. 예시의 항-HER2 항체는 트라스투쥬맙 (HERCEPTIN®)을 포함한다. 그것들 중에서 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시쥬맙 및 라무시루맙은 결장직장암을 치료하기 위해 FDA-승인된 항체이다.
일부 구체예에서, 세포 주기 억제자는 항-STn 항체 처리와 조합하여 사용될 수 있다. 세포 주기 억제자는 사이클린-의존적 키나아제 (CDK) 억제자, 체크포인트 키나아제 억제자, Polo-유사 키나아제 (PLK) 억제자, 및 Aurora 키나아제 억제자를 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포 주기 억제자"는 세포 주기 진행을 늦추거나 멈추는 임의의 작용제를 말한다. 세포 주기 억제자는 상이한 스테이지에서 세포 주기 정지를 유도할 수 있으며, 세포사 및/또는 성장 억제로 이어질 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 주기 억제자는 CDK 억제자일 수 있다. 사이클린-의존적 키나아제 (CDK)는 세린/트레오닌 키나아제의 군이다. CDK 및 이것의 사이클린 파트너는 세포 주기 전이를 구동시키는 주요 조절 효소이다. 그 중에서, CDK4 및 CDK6은 G0 또는 G1 단계에서 S 단계로의 전이의 주요 구동물질이다. CDK4 및 CDK6 (본원에서 CDK4/6으로도 불림)은 조직-특이적 방식으로 발현되는 밀접한 상동체이다. CDK4/6은 사이클린 D와 복합체를 형성하고 망막아종 (Rb) 단백질을 인산화한다. Rb 인산화는 DNA 복제에 필요한 단백질을 암호화하는 유전자의 전사를 일으키는 E2F 전사 인자의 억제를 약화시킨다. 이것은 S 단계로의 세포 진입을 가능하게 할 수 있다. S 단계로의 진행은 사이클린 E-CDK2 및 사이클린 A-CDK2 복합체에 의해 제어된다. G2에서 M 단계로의 전이는 사이클린 파트너, 사이클린 A2 및 사이클린 B와의 상호작용을 통해 CDK1에 의해 조절된다. CDK (일반적으로 또는 특정 CDK)를 표적화하는 치료제는 세포 주기 진행을 방해하고 세포 증식을 방지할 수 있다. Otto and Sicinski, Nat Rev Cancer. 2017;17(2):93-115; 및 Asghar et al., Nat Rev Drug Discov. 2015; 14(2): 130-146 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
어떤 경우에는, CDK 억제자는 선택적 CDK4/6 억제자일 수 있다. G1에서 S로의 전이시 CDK4/6의 역할 때문에, CDK4/6의 억제는 G1 단계에서 세포 주기 정지를 유발한다. 예시의 CDK4/6 억제자는 팔보시클립 (Pfizer), 리보시클립 (Novartis), 및 아베마시클립 (Eli Lilly)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 팔보시클립 (PD-0332991, IBRANCE®)은 진행된 (전이성) 유방암의 치료에 대하여 승인된 약물이다 (Finn et al., Breast Cancer Res. 2009;11(5):R77; Rocca et al., Expert Opin Pharmacother. 2014;15(3):407-20; U.S. Pat. Nos. 6,936,612; 7,863,278; 7,208,489; 및 7,456,168 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 팔보시클립은 미국 특허 번호 7,345,171 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 방법에 따라 제조 및 특성화될 수 있다. 유사하게, 리보시클립 (LEE011)은 또한 선택적으로 CDK4/6를 고효능으로 억제한다. 리보시클립 및 리보시클립의 약학적으로 허용 가능한 염은 미국 특허 번호 8,685,980 및 9,193,732 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 상세히 설명된 방법에 따라 제조될 수 있다. 아베마시클립 (LY-2835219)은 CDK4 및 CDK6, 뿐만 아니라 PIM1을 포함한 여러 다른 키나아제를 억제한다 (미국 특허 번호 7,855,211 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 아베마시클립의 초기 활성은 폐암, 난소암, 및 흑색종 환자에서 보고되었다 (Shapiro et al., ASCO Meeting abstracts 2013; 31:2500).
어떤 경우에는, CDK 억제자는 팬-CDK 억제자일 수 있다. 이러한 억제자는 여러 CDK를 차단하여 상이한 스테이지에서의 세포 주기 정지, 예컨대 G1 정지, G2 정지, 및/또는 G2/M 정지를 일으킬 수 있다. 예시의 팬-CDK 억제자는 플라보피리돌 (알보시딥), 디나시클립 (MK-7965), R-로소코비틴, AT7519, 밀시클립, TG02, CYC065 및 RGB-286638을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 팬-CDK 억제자는 반-합성 플라보피리돌 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,900,727 참조) 또는 플라보피리돌의 유사체 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,733,920 및 5,849,733 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조)일 수 있다. 또 다른 예로서, 팬-CDK 억제자는 미국 특허 번호 7,119,200 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 바와 같이 디나시클립, 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
일부 구체예에서, 글리칸-상호작용 항체와 조합하여 사용된 세포 주기 억제자는 체크포인트 키나아제 억제자일 수 있다. 체크포인트 키나아제, 예를 들어, CHK1, CHK2, 또는 WEE1의 억제는 세포 주기 체크포인트 (예를 들어, S 체크포인트, G2/M 체크포인트 또는 유사분열 방추사 조립 체크포인트)를 포함하여서, DNA 손상이 존재시에도 세포 주기 진행을 허용한다. 이것은 유사분열 동안에 "유사분열 카타스트로프(catastrophe)"로 알려져 있는 메커니즘을 통해 세포사를 촉발시킬 수 있다. 예시의 체크포인트 키나아제 억제자는 MK-8776, 프렉사세르팁 (LY2606368), AZD1775, GDC-0575, 및 Visconti et al. J Exp Clin Cancer Res. 2016; 35:153 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다
일부 구체예에서, 세포 주기 억제자는 Polo-유사 키나아제 (PLK) 억제자일 수 있다. Polo-유사 키나아제 (PLK)는 세포 주기의 조절 세린/트레오닌 키나아제이다. PLK1은 PLK 패밀리의 가장 특징적인 구성원이며 G2/M 전이, 방추사 조립 성숙화, 염색체 분리, 및 유사분열 종결과 같은 다수의 조절 이벤트에 수반된 중요한 유사분열 단백질 키나아제이다. 예시의 PLK1 억제자는 리고세르팁 (ON 01910.Na), 볼라세르팁 (BI 6727), BI 2536, HMN-176, TKM-080301, NMS-P937, DAP-81, Cyclopalin1, ZK-티아졸리디논 (TAL), SBE13, COM-36, LFM-A13, 스시토네민, 보르트만닌, 및 GSK461364A (Kumar and Kim, Biomed Res Int. 2015;2015:705745 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨))를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 세포 주기 억제자는 Aurora 키나아제 억제자일 수 있다. Aurora 키나아제는 유사분열을 통한 충실한 전이에 중요한 고도로 보존된 세린/트레오닌 키나아제의 패밀리를 포함한다. Aurora A는 중심체 성숙화, 염색체 정렬, 방추사 조립, 감수분열 성숙화, 및 세포질 분열(cytokinesis)을 포함한 다양한 유사분열 이벤트에서 중요한 역할을 한다. Aurora B는 염색체 나그네 복합체(chromosomal passenger complex)의 구성요소이고 염색체 응축 및 배향, 뿐만 아니라 세포질 분열의 적절한 이행에 수반된다. 예시의 Aurora 키나아제 억제자는 바라세르팁 (AZD1152), 알리세르팁 (MLN8237), 다누세르팁 (PHA-739358), ENMD-2076, AT9283, PF-03814735, 및 AMG 900 (Bavetsias and Linardopoulos, Front Oncol. 2015; 5: 278 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)).
투약량
본 발명은 약물 전달 과학에서 진보할 것으로 간주되는 임의의 적절한 경로에 의한 치료, 약제, 진단 또는 이미지화 위한 글리칸-상호작용 항체의 전달을 포함한다. 전달은 네이키드 또는 제제화될 수 있다.
네이키드 전달
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 네이키드 형태로 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "네이키드"는 트랜스펙션 또는 투과성을 촉진하는 작용제 또는 변형 없이 전달되는 글리칸-상호작용 항체를 말한다. 네이키드 글리칸-상호작용 항체는 해당 분야에 공지되고 본원에서 기술된 투여 경로를 사용하여 세포, 조직, 기관 및/또는 유기체에 전달될 수 있다. 네이키드 전달은 염수 또는 PBS와 같은 단순 완충액 중의 제제를 포함할 수 있다.
제제화된 전달
본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 본원에 기술된 방법을 사용하여 제제화될 수 있다. 제제는 변형 및/또는 비변형될 수 있는 글리칸-상호작용 항체를 포함할 수 있다. 제제는 추가로 세포 침투제, 약학적으로 허용 가능한 담체, 전달제, 생분해성 또는 생체적합성 중합체, 용제 및 서방출 전달 데포를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 제제화된 글리칸-상호작용 항체는 해당 분야 공지되고 본원에 기술된 투여 경로를 사용하여 전달될 수 있다.
조성물은 또한, 제한되는 것은 아니지만, 직접 침지 또는 배싱(bathing), 카테터를 통해, 겔, 분말, 연고, 크림, 겔, 로션 및/또는 점적제에 의해, 조성물로 피복되거나 함침된 직물 또는 생분해성 물질과 같은 기재의 사용을 포함한, 해당 분야의 몇 가지 방법 중의 어느 것으로 기관 또는 조직에 직접 전달을 위해 제제화될 수 있다.
투약
본 발명은 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따르는 하나 이상의 글리칸-상호작용 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 글리칸-상호작용 항체를 암호화하는 핵산, 글리칸-상호작용 항체를 포함하는 단백질 또는 복합체, 또는 이것들의 약학적, 이미지화, 진단적, 또는 예방적 조성물은 질환, 장애, 및/또는 병태를 예방, 치료, 진단, 또는 이미지화하는데 효과적인 임의의 투여량 및 투여 경로를 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 필요한 정확한 양은 대상체의 종, 연령, 및 일반적인 상태, 질환의 심각도, 특정 조성물, 이것의 투여 방식, 이것의 활성 방식, 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 본 발명에 따르는 조성물은 전형적으로 투여 용이성 및 투약량 균일성을 위해 투약 단위 형태로 제제화된다. 하지만, 본 발명의 조성물의 총 1일 사용량은 타당한 의학적 판단 범위 내에서 담당의에 의해 결정되는 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자를 위한 구체적인 치료적으로 유효한, 예방적으로 유효한, 또는 적합한 이미지화 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 심각도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 사용되는 특정 화합물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도; 치료의 지속시간; 사용되는 특정 화합물과 조합되거나 일치하는 약물; 및 의료 분야에 널리 공지된 유사 인자들을 포함한 다양한 인자에 따라 다를 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 화합물 (예를 들어, 항-STn 항체)은 조성물의 일부로서 투여될 수 있으며, 조성물은 약 0.01 mg/ml 내지 약 1 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 2 mg/ml 내지 약 20 mg/ml 또는 약 5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml의 이러한 농도의 화합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 약 0.01 ml/kg 내지 약 1 ml/kg, 약 0.2 ml/kg 내지 약 1.2 ml/kg, 약 0.05 ml/kg 내지 약 2 ml/kg, 약 0.1 ml/kg 내지 약 3 ml/kg, 약 0.5 ml/kg 내지 약 5 ml/kg, 약 2 ml/kg 내지 약 10 ml/kg, 또는 약 5 ml/kg 내지 약 20 ml/kg의 대상체 중량 당 부피로 투여될 수 있다. 투여는 정맥내 투여 (예를 들어, 정맥내 볼루스 주사)에 의한 것일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 6mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg 내지 약 200 mg/kg의 대상체 체중 당 활성 화합물 (예를 들어, 항-STn 항체 또는 화학치료제)의 양을 전달하기에 충분한 투약 수준으로 투여될 수 있다. 투여는 원하는 치료적, 진단적, 예방적, 또는 이미지화 효과를 얻기 위해 하루에 1회 이상 수행될 수 있다. 원하는 투약량은, 제한되는 것은 아니지만, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 격일마다, 3일마다, 1주마다, 2주마다, 3주마다, 또는 4주마다, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다, 또는 매년을 포함한, 임의의 투약 일정에 따라 전달될 수 있다. 특정 구체예에서, 원하는 투약량은 다회수 투여 (예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 또는 그 이상의 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.
본 발명에 따르면, 글리칸-상호작용 항체는 분할-용량 양생법으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "분할 용량"은 단일 단위 용량 또는 총 1일 용량을 둘 이상의 용량으로 나눈 것, 예를 들어, 단일 단위 용량의 2회 이상의 투여이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단일 단위 용량"은 1회 용량으로/한 번에/단일 경로/단일 접촉점, 즉, 단일 투여 이벤트로 투여되는 임의의 치료제의 용량이다. 본원에 사용된 바와 같이, "총 1일 용량"은 24시간 내에 제공되거나 처방되는 양이다. 이것은 단일 단위 용량으로서 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 글리칸-상호작용 항체는 분할 용량으로 대상체에 투여된다. 글리칸-상호작용 항체는 완충액 단독으로 또는 본원에 기술된 제제로 제제화될 수 있다. 본원에 기술된 글리칸-상호작용 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 국소, 비강내, 기관내, 또는 주사 가능한 투약 형태 (예를 들어, 정맥내, 안내, 유리체내, 근육내, 심장내, 복강내 또는 피하)와 같은 본원에 기술된 투약 형태로 제제화될 수 있다. 약학적 작용제의 제제화 및/또는 제조에 있어서의 일반적인 고려사항은, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (본원에 참조로 포함됨)에서 발견될 수 있다.
코팅 또는 쉘
정제, 당의정, 캡슐, 알약 및 과립의 고체 투약 형태는 장용 코팅 및 약학적 제제화 분야에서 널리 공지된 기타의 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 제조될 수 있다. 이것들은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있으며 이것들이 단지 활성 성분(들)만을, 또는 우선적으로 활성 성분(들)을, 장관의 특정 부분에서, 선택적으로, 지연된 방식으로 방출하는 조성의 것일 수 있다. 사용될 수 있는 임베딩된 조성물의 예는 폴리머 물질 및 왁스를 포함한다. 유사한 유형의 고체 조성물이 락토오스 또는 유액 당과 같은 부형제, 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다.
IV. 키트 및 디바이스
키트
본원에 기술된 조성물 중의 어느 것이 키트에 포함될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 항원 분자를 포함하는, 글리칸-상호작용 항체를 생성하기 위한 시약이 키트에 포함된다. 키트는 글리칸-상호작용 항체를 생성 또는 합성하기 위한 시약 또는 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 또한 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 키트는 글리칸-상호작용 항체 단백질 또는 핵산 어레이 또는 라이브러리를 제조하기 위한 구성요소를 포함할 수 있으며, 따라서, 예를 들면, 고체 지지체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 글리칸-상호작용 항체를 포함하는, 대상체의 스크리닝, 모니터링, 및/또는 진단을 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는 단독으로 또는 스크리닝, 모니터링 및/또는 진단 (예를 들어, 동반 진단으로서)의 하나 이상의 다른 방법들과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 키트는 완충제, 생물학적 표준, 이차 항체, 검출 시약 및 샘플 전처리용 조성물 (예를 들어, 항원 회복, 차단 등을 위한) 중의 하나 이상을 포함한다.
키트의 구성요소들은 수성 매질로 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로, 구성요소가 배치될 수 있고, 바람직하게는 적합하게 앨리쿼트될 수 있는 적어도 하나의 바이알, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이다. 키트에 하나 이상의 구성요소이 있는 경우(라벨링 시약 및 라벨가 함께 포장될 수 있다), 키트는 또한 일반적으로 추가적인 구성요소가 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 기타의 추가 용기를 함유할 것이다. 키트는 또한 멸균성 약제학적으로 허용 가능한 완충제 및/또는 기타 희석제를 함유하는 제2 용기 수단을 포함할 수 있다. 하지만, 구성요소들의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 엄밀하게 가둬진 글리칸-상호작용 항체, 예를 들어, 단백질, 핵산, 및 임의의 다른 시약 용기를 담기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 보유된, 사출성형되거나 취입성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
키트의 구성요소들이 하나 및/또는 그 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액이며, 멸균 수용액이 특히 바람직하다. 하지만, 키트의 구성요소들은 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 성분이 건조 분말로서 제공되는 경우, 분말은 적합한 용제의 첨가에 의해 복원될 수 있다. 용제는 또한 다른 용기 수단으로 제공될 수 있는 것으로 생각된다. 일부 구체예에서, 라벨링 염료는 건조 분말로서 제공된다. 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 마이크로그램 또는 적어도 1000 마이크로그램 또는 최대 10g의 건조된 염료가 본 발명에 키트에 제공되는 것으로 고려된다. 그 후 염료는 DMSO와 같은 임의의 적합한 용제에 재현탁될 수 있다.
키트는 키트 구성요소의 사용 및 키트에 포함되지 않은 임의의 다른 시약의 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 지침서는 실행될 수 있는 변화들을 포함할 수 있다.
디바이스
본원에 기재된 조성물 중의 어느 것은 디바이스와 조합되거나 이에 코팅되거나 이에 임베딩될 수 있다. 디바이스는 치아 임플란트, 스텐트, 뼈 대체물, 인공 관절, 판막, 심박 조율기 또는 기타 이식 가능한 치료 디바이스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
V. 등가물 및 범위
당업자들은 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본원에 기술된 발명에 따르는 특정 구체예들에 대한 많은 등가물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명에 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 첨부된 청구항에 제시된 바와 같다.
청구항에서, "a", "an" 및 "the"와 같은 관사는, 반대로 나타내거나 달리 문맥으로부터 자명하지 않은 한, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는 (or)"을 포함하는 청구항 또는 설명은 군 구성원 중의 하나, 하나 이상, 또는 전부가, 반대로 나타내거나 달리 문맥으로부터 자명하지 않은 한, 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나 또는 달리 이에 관련된다면 충족된 것으로 간주한다. 본 발명은 군의 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나 또는 달리 이에 관련되는 구체들을 포함한다. 본 발명은 하나 이상의, 또는 전체 군 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나 사용되거나 또는 달리 이에 관련되는 구체예들을 포함한다.
용어 "포함하는 (comprising)"은 개방적인 것으로 의도되며 추가의 요소들 또는 단계들의 포함을 허용하지만 필요로 하지 않는 것으로 또한 주지된다. 용어 "포함하는"이 본원에서 사용되는 경우, 용어 "로 이루어진 (consisting of)"이 또한 포함되고 개시된다.
범위가 주어진 경우, 종점이 포함된다. 게다가, 달리 나타내거나 그렇지 않으면 문맥 및 당업자의 합의로부터 자명하지 않은 한, 범위로서 표현된 값들은 본 발명의 상이한 구체예들에서 명시된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위범위를, 문맥이 달리 명백히 나타내지 않는 한, 범위의 하한치의 단위의 1/10까지 추정할 수 있는 것으로 이해된다.
이에 더하여, 선행 기술 내에 포함되는 본 발명의 임의의 특정 구체예는 청구항 중의 어느 하나 이상으로부터 명백히 배제될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 구체예들은 당업자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이것들은 배제가 본원에 명백히 제시되어 있지 않더라도 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물의 임의의 특정 구체예 (예를 들어, 임의의 핵산 또는 이에 의해 암호화된 단백질; 임의의 생산 방법; 임의의 사용 방법, 등)는 선행 기술의 존재와 관련되는지에 관계없이, 어떤 이유로든, 하나 이상의 청구항으로부터 배제될 수 있다.
본원에 명시된 모든 인용된 자료, 예를 들어, 참고문헌, 간행물, 데이터베이스, 데이터베이스 엔트리 및 기사는, 인용문에 명백히 명시되지 않더라도, 본원에 참고로 포함된다. 인용 자료 및 본 출원의 진술이 상반되는 경우에, 본 출원의 진술이 우선되어야 한다.
섹션 제목과 표 제목은 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1. 글리칸 어레이 분석
최적화된 글리칸 어레이를 사용하여 단일 실험에서 다중 글리칸에 대한 항체 친화도 및 특이성을 테스트한다. 글리칸 어레이는 71개의 화학적으로 합성되고 잘 정의된 글리칸을 포함하며, 이것들 중 대부분은 Neu5Ac 및 Neu5Gc 글리칸 쌍이다. 어레이 슬라이드는 상업적으로 입수되며 (ArrayIt Corp, Sunnyvale, CA) 표 4에 나열된 글리칸을 포함한다.
300ml의 에폭시 차단 완충액을 15ml의 2 M Tris 완충액 (pH 8)을 0.9 ml의 16.6 M 에탄올아민 및 284.1 ml의 증류수와 조합하여 제조한다. 용액을 HCl을 사용하여 9.0의 최종 pH로 되게 한다. 용액을 0.2 μM 니트로셀룰로오스 막을 사용하여 여과한다. 에폭시 완충 용액, 뿐만 아니라 1 L의 증류수를 50℃로 미리 가온한다. 유리 슬라이드를 슬라이드 홀더에 정렬시키고 가온한 에폭시 차단 완충액을 갖는 염색 통에 신속하게 침지시킨다. 슬라이드를 50℃에서 1시간 동안 에폭시 차단 완충액에서 인큐베이션하고 주기적으로 진탕하여 에폭시 결합 부위를 불활성화시킨다. 그 후, 슬라이드를 세정하고 1% OVA를 갖는 PBS로 25℃에서 1시간 동안 차단하였다. 다클론성 항체 (1:1000) 또는 정제된 단클론성 항체 (1ug/mL)를 갖는 혈청 샘플을 1% OVA를 갖는 PBS에서 희석시키고 25℃에서 1시간 동안 글리칸 어레이에 추가한다. 광범위하게 세척한 후, 글리칸 마이크로어레이 슬라이드를 Cy3-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)와 1시간 동안 인큐베이션함으로써 항체의 결합을 검출한다. 그 후, 슬라이드를 광범위하게 세척하고, 건조시키고 Genepix 4000B 스캐너(레이저 100%로; 350에서 획득; 10 μm 픽셀)로 스캐닝한다. 스캐닝한 이미지의 미가공 데이터를 Genepix 소프트웨어를 사용하여 추출하고 미가공 데이터의 분석을 실시한다. 항체는, 이것들이 AcSTn 및 GcSTn 분자 둘 다에는 결합하지만 Tn 또는 어레이 상의 임의의 다른 글리칸에는 결합하지 않는 것을 입증한다면, AcSTn 및 GcSTn에 매우 특이적인 것으로 간주된다.
어레이 분석에 기초하여, 항체를 어레이 글리칸 결합 프로파일에 따라 분류한다. 항체가 글리칸 5, 6, 23 및 24에 결합한다면, AcSTn 및 GcSTn에 결합할 수 있는 "1군" 항체로 분류된다. 이러한 항체는 광범위한 STn 구조 및 도 1A에 큰 타원으로 나타낸 STn의 일부와 관련되는 이들의 능력으로 인해 팬-STn 항체라고 불린다. 항체가 글리칸 5, 6, 23, 24, 27 및 31에 결합한다면, STn, 뿐만 아니라 세린 또는 트레오닌으로의 O-연결을 포함하는 일부 관련된 구조에 결합할 수 있는 "2군" 항체로 분류된다. 이러한 항체는 도 1B에 큰 타원으로 나타낸 STn의 일부와 관련되는 것으로 생각된다. 일부 2군 항체는 바람직하게는 GcSTn을 갖는 구조보다 AcSTn을 갖는 구조에 결합한다. 항체가 글리칸 5, 6, 23, 24, 17, 3, 19, 37, 27 및 31에 결합한다면, "3군" 항체 (STn에 결합할 수 있지만, 또한 보다 광범위한 관련 구조에도 결합할 수 있음)로서 분류된다. 2군 항체와는 달리, 3군 항체는 이러한 구조가 세린 또는 트레오닌으로의 O-연결을 갖는 것을 필요로 하지 않는다. 3군 항체는 도 1C에 큰 타원으로 나타낸 STn의 일부와 관련되는 것으로 생각된다. 마지막으로, 항체가 글리칸 5, 6, 23, 24 및 47에 결합한다면, AcSTn 및 GcSTn 둘 다, 뿐만 아니라 비-시알릴화 Tn 항원에 결합할 수 있는 (따라서 보다 광범위한 특이성을 갖는) "4군" 항체이다. 4군 항체는 도 1D에 큰 타원으로 나타낸 STn의 일부와 관련되는 것으로 생각된다.
실시예 2. 마우스 항- STn 항체의 생성
앞서 미국 공개 번호 US2016/0130356 (이것의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 바와 같이, 얻어진 항-STn 단클론성 항체의 가변 도메인을 사용하여 뮤신을 사용한 쥐 면역화를 통해 mSIA101 및 mSIA102 항체를 생성하였다. mSIA103 가변 도메인 서열을 3F1 IgG1 항체 (SBH Biosciences, Natick, MA)로부터 얻었다. IgG2a 발현 벡터 구조체 (항체 중쇄에 대해서 플라스미드 H1206 및 항체 경쇄에 대해서 플라스미드 L1206, LakePharma, Belmont, CA)를 변형시켜 IgG2a 불변 영역의 mSIA101, mSIA102, 및 mSIA103 가변 도메인 업스트림을 암호화하였다. 발현된 도메인의 서열은 표 5에서 제공된다.
IgG2a 항체 생성에 사용된 서열
도메인 서열 서열 번호
mSIA101 VH 도메인 QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGYFSPGNDDIKYNEKFRGKATLTADKSSSTAYMQLNSLSSDDSAVYFCKRSLSTPYWGQGTLVTVSA 1
mSIA101 VL 도메인 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNRGNHKNYLTWYRQKPGLPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFALTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPYTFGGGTKLEIKR 2
mSIA102 VH 도메인 QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGYFSPGNDDIKYNEKFKVKATLTADKSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYFCKRSYYGDWGQGTTLTVSS 3
mSIA102 VL 도메인 DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSHLAWYQQKQGKSPQLLVYGATNLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKIHSLQSEDFGSYYCQHFWGAPFTFGSGTKLEIK 4
mSIA103 VH 도메인 QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLDWIGYISPGNGDIKYNEKFKDKVTLTADKSSSTACMHLNSLTSEDSAVYFCKRSLLALDYWGQGTTLTVSS 5
mSIA103 VL 도메인 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTNIAWYQQKPGRSPKVLIYSASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLTDYFCQQYSSFPLTFGVGTKLELK 6
IgG2a 중쇄 불변 도메인 AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 13
카파 경쇄 불변 도메인 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 14
전체 중쇄 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드 및 전체 경쇄 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션하고 발현시켜 성숙 항체를 생산하였다.
IgG2a 항체를 발현하는 안정한 세포주의 생성을 위해 중국 햄스터 난소-K1 (CHO-K1) 세포를 트랜스펙션하였다. 세포를 37℃에서 L-글루타민으로 보충된 화학적으로 한정된 배지 (CD-CHO, Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 가습 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
로그 단계로 성장하는, 대략 8천만 개의 현탁액 CHO 세포를 전기천공법 (MaxCyte)에 의해 전장 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 전체 플라스미드 80 μg으로 트랜스펙션하였다. 24시간 후, 트랜스펙션된 세포를 항체 유전자의 안정한 혼입을 위한 선별 하에 두었다. 선별 공정 중에, 풀이 성장률과 생존력을 회복할 때까지 2-3일마다 세포를 스핀 다운하고 신선한 선택 배지에서 재현탁시켰다. 세포를 성장, 역가, 및 항체 발현 구조체의 안정한 혼입에 대하여 모니터링하였다. 배증 시간(doubling time)는 20시간이었다.
안정한 세포주를 대규모 생산을 위해 배양하여 10 L의 배양물을 생산하였다. 안정한 세포 풀 생산 실행으로부터 수득된 조정 배지를 원심분리 및 0.2 μm 막 여과로 정화시켰다. 항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제한 다음, 멸균하고 0.2 μm 막 필터를 통과시켜 미립자를 제거하였다. 저 내독소 정제 및 여과 후, 농도를 5 mg/mL로 설정하고 항체 120 mg을 회수하였다.
항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 제조하기 위해, 항체를 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)와 컨쥬게이션시켰다. 항체를 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐-모노메틸 아우리스타틴 E (MC-vc-PAB-MMAE, 본원에서 CL-MMAE라고 불림)와 접촉시킴으로써 이를 수행하였다. 결과로 생성된 컨쥬게이션은 말레이미드-시스테인 기반이며, 항체 사슬 간 이황화 결합은 TCEP로 환원된 다음 약물의 말레이미드 모이어티에 연결되었다.
컨쥬게이션된 항체를 Sephadex G50 컬럼에서 탈염하여 잔류 미반응 독소를 제거한 다음 150 mM NaCl를 갖는 30 mM HEPES pH 7.7에서 투석하였다. 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 사용하여 약물-대-항체 비 (DAR)를 결정하였다.
실시예 3. 마우스 항체 및 ADC의 특징
유방, 결장 및 난소암 모델에서 마우스 항체를 시험관 내 및 생체 내 효율에 대하여 특성화하였다. 항체를 사용하여 표면 상에서 STn을 발현하는 CRC 세포주를 확인하였다. 5개의 CRC 세포주를 시험관 내에서 인큐베이션하여 밀집될 때까지 성장시켰다. 항-STn 항체를 사용하는 유동 세포 분석법에 의해 %STn 발현을 결정하였다. 배양된 SW403, COLO205 및 LS174T 세포의 대략 30-70%가 표면 상에서 STn을 자연적으로 발현하는 한편 (mSIA103을 사용하여 검출됨), HT29 및 RKO는 그 세포 표면 상에서 검출 가능한 STn이 거의 없거나 전혀 없었다 (hSIA101을 사용하여 검출됨) (표 6 참조).
CRC 세포주에서 STn 발현
세포주 % STn 발현
COLO205 67.7
LS174T 69.9
SW403 30.0
RKO 낮거나 검출 불가능
HT29 낮거나 검출 불가능
또한, CRC 조직 마이크로어레이 (TMA) (NBP2-30214; Novus Bio, Littleton, CO)를 STn 발현에 대하여 염색하였다. 어레이는 뉴라미니다아제 (시알리다아제) 효소 처리 여부에 관계없이 59개의 코어로 이루어진다. 뉴라미니다아제는 말단 시알산을 특이적으로 분열시키고 조직에 존재하는 STn 항원을 파괴한다. TMA 상의 51개의 신생 코어 중에서, 45개가 일부 수준의 양성 막 염색을 입증하였고, 항-STn mSIA103을 사용한 45개 전부에 대한 염색을 250 mU/mL 뉴라미니다아제 처리로 폐지하였다. 비멘틴-특이적 항체로의 염색은 영향을 받지 않았으며, mSIA103 항-STn 항체 결합이 시알산-특이적임을 시사한다. 정상 결장 (8개의 코어)에 대한 염색은 선와 및 표면 점막에 제한되고, 정맥내로 투여된 ADC 치료제로부터 보호되어야 하는 세포의 정단측에 제한된다.
예비 이종 이식 연구를 마우스 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)의 생체 내 효율을 평가하기 위해 COLO205 세포를 사용하여 수행하였다. COLO205 피하 이종 이식 모델을 5x106개 세포/마우스를 무흉선 누드 마우스의 우측면으로 주사함으로써 생성하였다. 종양이 180 mm3의 평균 크기에 도달한 경우 처리를 시작하였다. 마우스에 3주 동안 5 mg/kg으로 주 1회 투약하였다. 독소 없이 mSIA103 단독, mSIA103-CL-MMAE, 비-분열 가능한 링커를 사용하여 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)와 컨쥬게이션된 mSIA103, 및 비히클 대조군을 이 연구에서 평가하였다. mSIA103-CL-MMAE는 다른 세 군과 비교하여 44.5% 처리군 대 대조군 (T/C) 비 (p=0.008)의 큰 종양 성장 억제를 입증하였다.
실시예 4. 인간화된 항- STn 항체의 생성
mSIA101, mSIA102, 및 mSIA103 가변 도메인의 인간화된 버젼을 "CDR 이식"이라고 불리는 공정인, CDR을 인간 생식계열 서열에 혼입함으로써 제조하였다. 인간 IgG1 불변 도메인과 함께 인간화된 가변 도메인을 암호화하는 구조체를 발현시킴으로써 인간화된 항체 hSIA101, hSIA102, 및 hSIA103을 제조하기 위해 결과로 생성된 가변 도메인을 사용하였다. 발현된 항체 가변 도메인과 불변 도메인의 서열은 표 7에서 제공된다.
인간화된 가변 도메인
항체 도메인 서열 서열 번호
hSIA101 VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHAIHWVRQAPGQGLEWMGYFSPGNDDIKYNEKFRGRVTMTADKSSSTAYMELRSLRSDDTAVYFCKRSLSTPYWGQGTLVTVSS 7
hSIA101 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNRGNHKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPYTFGQGTKVEIK 8
hSIA102 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVRQAPGQGLEWIGYFSPGNDDIKYNEKFKVRATLTADKSSSTAYMELRSLRSDDTAVYFCKRSYYGDWGQGTLVTVSS 9
hSIA102 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSHLAWYQQKPGKAPKLLVYGATNLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGAPFTFGQGTKVEIK 10
hSIA103 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHAIHWVRQAPGQGLEWMGYISPGNGDIKYNEKFKDRVTMTADKSSSTAYMQLRSLRSDDTAVYFCKRSLLALDYWGQGTLVTVSS 11
hSIA103 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTNIAWYQQKPGKAPKVLIYSASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSFPLTFGQGTKVEIK 12
인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 15
인간 IgG1 경쇄 불변 도메인 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 16
MMAE로의 인간화된 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)의 제조를 이전에 쥐 항체를 사용하여 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 수행하였다.
실시예 5. 인간화된 항체의 특성
상기 기술된 바와 같이 제조된 인간화된 IgG1 항체를 MDA-MB-231-STn 세포를 사용한 유동 세포 분석법-기반 결합 분석; BSM ELISA에 의한 결합 분석; 글리칸 어레이 분석을 포함한, 특성 분석을 수행하였다.
유동 세포 분석법-기반 결합 연구에서, 트랜스펙션-유도된 STn 발현 여부에 관계없이 MDA-MB-231 세포로의 결합과 비교하여 0 내지 300 nM의 농도 범위에 걸쳐 항체를 스크리닝하였다. 결합을 항-인간 APC 컨쥬게이션된 2차 항체를 사용하여 결정하였고 단지 살아있는 세포만을 고려하였다 (프로피듐 아이오다이드 음성 게이팅(gating) 기반). 평균적으로 샘플 당 5,000개의 이벤트를 수집하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (Asland, OR)를 사용하여 분석하고 결과의 APC 평균 및 % APC를 획득하였다. 이들 데이터는 로그 변환시킨 다음 비선형 회귀 모델에 맞춰 조정하여 용량 반응 곡선 및 절반-최대 효과 농도 (EC50) 결합 정보를 획득하였다. 인간 아이소타입 IgG1 항체를 아이소타입 음성 대조군으로 사용하였다. 표피 성장 인자 수용체 (LA22, EMD Millipore, Billerica, MA)를 양성 대조군으로 사용하였다.
BSM ELISA 분석을 위해, 소 턱밑샘 뮤신 (BSM) 코팅된 웰에서 0 내지 100 nM의 농도 범위에 걸쳐 항체를 스크리닝하였다. (STn 항원을 파괴하는) 말단 시알산 잔기에서 측쇄를 제거하기 위해 항체 도입 전에 웰의 부분집합을 약한 페리오데이트 용액으로 처리하였다. 페리오데이트 및 비-페리오데이트-처리된 웰의 광학적 밀도를 결정하고 용량 반응 곡선을 얻기 위해 로그 변환시켜 비선형 회귀 모델에 맞춰 조정하였다. 페리오데이트-처리된 웰로부터 얻어진 광학적 밀도 값을 비-페리오데이트 처리된 웰에서 빼서 페리오데이트-민감성 STn 결합 곡선 및 상응하는 EC50 값을 얻었다.
글리칸 어레이 분석을 앞서 기술된 바와 같이 수행하였고 이들 결과에 기초하여 항체를 어레이 글리칸 결합 프로파일에 할당하였다.
유동 세포 분석법, ELISA, 및 글리칸 어레이 분석의 결과는 표 8에서 제공된다.
항체 특성화 결과
클론 ID MDA-MB-231-STn 세포 결합 [EC50 (nM)] BSM ELISA
[EC50 (nM)]		 어레이 글리칸 결합 프로파일
hSIA101 2.0 4.2 1군
hSIA102 0.1 미결정 4군
hSIA103 0.3 1.8 1군
테스트된 모든 항체는 세포- 및 BSM-관련된 STn으로의 결합을 입증하였다. 인간 IgG1 아이소타입 대조군 (Southern Biotech, Birmingham, AL)을 사용해서는 결합이 관찰되지 않았다. hSIA102 결합은 ELISA 분석에서 페리오데이트 민감성이 아니었으며, 따라서 BSM ELISA에 의해 신뢰 가능한 EC50을 결정할 수 없었다.
실시예 6. 인간화된 항체-약물 컨쥬게이트의 분석
hSIA101, hSIA102, 및 hSIA103의 MMAE-컨쥬게이션된 ADC 버젼을 MDA-MB-231 세포 (모체 또는 STn의 향상된 발현을 위해 트랜스펙션됨)를 사용한 ADC 세포독성 분석으로 평가하였다. 모체 세포를 10% FBS, 1x Pen/Strep 및 45 μg/mL 겐타마이신으로 보충된 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)에서 키웠다. STn 양성 세포를 항생제 선별을 위해 1 mg/mL G418을 추가한 것을 제외하고 동일한 배지에서 키웠다. 세포를 상기 기술된 적절한 배지를 사용하여 96-웰 플레이트에 별도로 분주하였다 (모체 세포에 대해서 4,000 세포/웰 또는 STn 양성 세포에 대해서는 2,000/웰). 세포를 밤새도록 키웠다. 16-20시간 후, 세포에 72시간 동안 테스트 항체의 다양한 농도 (50 nM 내지 0.012 nM)를 3배수로 처리하였다. 그 후, 세포를 대사적으로 활성인 세포의 지표인 ATP 존재의 양을 결정하기 위해 ADC CELLTITER-GLO® 발광 세포 생존력 분석 키트 (Promega, Madison, WI)를 사용하여 분석하였다. 분석은 혈청-보충된 배지에서 배양된 세포에 직접적으로 추가되는 단일 시약을 사용한다. 시약은 세포를 용해시키고 ATP 존재의 양에 비례하는 발광 신호를 발생시킨다. 발광 신호를 분석하여 절반-최대 수준으로 STn 양성 세포를 살해하는데 필요한 농도에 기초하여 사용된 각 항체에 대한 절반-최대 억제 농도 (IC50) 값을 계산하는데 사용하였다 (표 9 참조).
인간화된 ADC 항체에 대한 IC 50 값
인간화된 항체 IC 50 (nM)
hSIA103 1.3
hSIA102 2.6
hSIA101 5.2
테스트된 모든 항체는 각각 STn 발현 세포를 살해하기 위한 강력한 수용력을 나타내는 단일 나노몰 범위의 IC50 값을 입증하였다.
배양 중인 OVCAR3 세포를 사용하여유사한 연구를 수행하였다. 5 pM 내지 약 300 nM의 hSIA101-MMAE 및 hSIA102-MMAE의 용량을 사용하여, hSIA101-MMAE에 대하여 29 nM의 IC50 값 및 hSIA102-MMAE에 대하여 15 nM의 IC50 값을 수득하였다.
실시예 7. STn 검정
대상 샘플에서 STn 수준을 확인하고 정량하기 위해 ELISA 분석을 개발하였다. 매우 많이 시알릴화된 소 턱밑샘 뮤신 (BSM)을 표준 곡선을 생성하고 분석 최적화를 돕는데 사용하였다. 초기 분석에서는, 상업적으로 이용 가능한 마우스 항-STn 항체 [예를 들어, 항체 3F1 (SBH Sciences, Natick, MA), 항체 B72.3 (Colcher, D. et al., 1981. PNAS. 78(5): 3199-203 참조), 및 항체 CC49 (Muraro, R. et al., 1988. Cancer Res. 48: 4588-96) 참조]을 사용하여 분석 플레이트를 코팅하고 테스트되는 샘플 (BSM이 추가된 완충 용액 또는 혈청 샘플)에서 BSM을 캡쳐하였다. 인간화된 항-STn 항체 (예를 들어, hSIA101, hSIA102, 및 hSIA103)를 사용하여 캡쳐된 BSM을 검출하였다. 캡쳐 및 검출을 위해 사용된 항체를 두 가지 모델로 테스트한다. 하나는 샌드위치 ELISA 분석에서 쌍 매칭을 테스트하는 것이다. 다른 하나는 형광 항체 라벨을 사용하고 STn-발현 세포로의 노출 순서를 변경함으로써 경쟁 결합에 대하여 유동 세포 분석하는 것이다. 경쟁적으로 결합하지 않는 항체 쌍을 추가의 분석 개발에 사용하였다.
추가의 분석은 캡쳐 항체로서 분석 플레이트에 결합된 항-STn 항체, 및 결합된 단백질을 검출하기 위해 종-특이적 검출 항체를 사용하였다. 예를 들어, 인간 항-STn mAb는 검출 mAb가 직접적으로 라벨링된 경우 (예를 들어, Alexa-488, HRP 등) 코팅 및 검출 mAb 둘 다로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 쥐 항-STn mAb는 검출 mAb가 직접적으로 라벨링된 경우 (예를 들어, Alexa-488, HRP 등) 코팅 및 검출 mAb 둘 다로 사용될 수 있다. 마우스 샘플 (예를 들어, 본원에서 기술된 이종 이식 모델 연구로부터 수거됨) 및 인간 샘플 (예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 얻어진 혈청 샘플)에서 STn의 검출을 쥐 및 인간 검출 항체 둘 다로 평가한다.
실시예 8. 인간화된 항- STn 항체를 사용한 STn 분석
캡쳐 항체로서 mSIA102 및 검출 항체로서 hSIA102 또는 hSIA103를 사용하여 STn ELISA 분석을 수행하였으며, 대조군 검출 항체로서 인간 아이소타입 IgG를 사용하였다. 캡쳐 항체의 밀리리터 당 5 마이크로그램 (μg/ml) 용액을 사용하여 ELISA 분석 플레이트의 표면을 밤새도록 코팅하였다. 0 nM 내지 6 x 10-8 nM의 범위의 소 턱밑샘 뮤신 (BSM)의 일련의 희석액으로 처리하기 전에 플레이트를 세척하고 차단하였다. 분석 표면에 결합된 BSM을 3 μg/ml 검출 항체를 사용하여 검출하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이트를 가진 항-인간 항체 (0.08 μg/ml)를 사용하여 검출 항체에 결합시켰고 항체-항원 복합체를 HRP 기질을 사용하여 검출하였다. 결과는 인간화된 항-STn 항체가 항체 결합에 대하여 hSIA103에 대해 9 x 10-9 nM 및 hSIA101에 대해 2 x 10-8 nM의 절반-최대 효과 농도 (EC50)로 검출된 BSM을 검출할 수 있다는 것을 입증하였다. 아이소타입 대조군 검출 항체로 결합을 관찰할 수 없었다.
실시예 9. 약물동역학 연구
둘 다 MMAE와 컨쥬게이션된 항체 hSIA101 및 hSIA102를 정맥내 (IV) 꼬리 정맥 주사 투여에 의해 5 mg/kg의 용량 (중량 측정에 의해 결정된 투약량)으로 암컷 무흉선 마우스에 투여하여 항체 말단 제거 반감기를 평가하였다. 각 군은 9마리의 마우스로 이루어진다. 혈액 (혈청)을 1, 4, 8, 24, 48, 72, 168, 336 및 672시간에 수거하여 항체 반감기를 계산하는데 사용하였다.
약물동역학 (PK) 파라미터 평가를 연구가 끝날 때 WINNONLIN® 소프트웨어 (Pharsight Corp., Mountain View, CA)를 사용하여 평가하였다. 곡선 아래 면적 (AUC)을 투여된 최초 용량으로부터 마지막 정량화 가능한 관찰된 농도의 투약 후 시점까지 (AUClast) 및 연구 개시에서부터 무한대로 (AUCINF) 평가하였다. 최대 관찰된 혈창 농도 (Cmax), 관찰된 클리어런스 (CL), 말단 제거 반감기 (HL), 정지 상태 분포 용적 (Vss) 및 말단 단계 분포 용적 (Vz)를 또한 평가하였다. PK 파라미터를 비-구획적 분석을 사용하여 계산하였으며 간헐적으로 샘플링하였다. 결과는 표 10에서 제공된다.
PK 파라미터
항체 C max
( μg /ml) 		AUC last
(일* μg /ml) 		AUC INF
(일* μg /ml) 		CL
(ml/일/kg) 		HL
(일) 		Vz
(ml/kg) 		V ss
(ml/kg)
hSIA101-MMAE 254 1050.00 1050.00 4.77 2.55 17.51 20.07
hSIA102-MMAE 285 1075.00 1079.17 4.63 3.77 25.16 23.57
연구로부터, hSIA101-MMAE를 2.55일의 말단 제거 반감기를 갖는 것으로 결정하는 한편, hSIA102-MMAE를 3.77일의 말단 제거 반감기를 갖는 것으로 결정하였다. 이들 값은 다른 항체-약물 컨쥬게이트를 사용하여 보고된 것들과 비슷하였다 (예를 들어, 항-5T4 항체-약물 컨쥬게이트에 대한 3.5일의 말단 제거 반감기를 보고하는 Leal, M. et al., 2015, Bioconjugate Chem, 26: 2223-32 참조).
실시예 10. STn를 과발현하는 세포주의 생성
확립된 암 세포주를 Julien 등 (Julien, S. et al., 2005. Breast Cancer Res Treat. 90(1): 77-84)에 의해 기술된 바와 같이 안정하게 STn을 발현하도록 조작한다. 세포에 렌티바이러스 벡터로 형질도입하여 ST6GalNAc I 발현 구조체 (hST6GalNAc I pRc-CMV) 또는 대조군 (pRc-CMV 빈 벡터)을 전달한다. 제네티신 418 (G418, 1 mg/mL)을 함유하는 배지에서 안정한 트랜스펙션을 선별하였다. 저항성 세포를 제한 희석 전략을 사용하여 96 웰 플레이트에 분주하고 3회 서브클로닝하여 안정한 클론 라인을 획득한다. 클론 라인은 ST6GalNAc I의 다양한 발현을 입증한다 [정량적 폴리머라아제 연쇄 반응 (qPCR) 분석에 의해 결정됨]. 추가적인 STn을 안정하게 발현하는 (야생형 세포와 비교하여) OVCAR3 세포주는 "OVCAR3-STn" 세포라고 부른다. STn의 성공적인 발현을 항-STn 항체를 사용한 유동 세포 분석법을 사용하여 검증한다.
실시예 11. ST6GalNAc I 발현이 향상된 SKOV3 세포주의 생성
SKOV3 세포에 렌티바이러스 벡터로 형질도입하여 ST6GalNAc I 발현 구조체 (hST6GalNAc I pRc-CMV)를 전달하였다. 안정한 세포 풀을 생성하였고 ST6GalNAc I의 다양한 발현을 갖는 6개의 클론을 선별하였다 [정량적 폴리머라아제 연쇄 반응 (qPCR) 분석에 의해 결정됨] (표 11 참조).
선별된 클론에서 ST6GalNAc I의 발현 수준
클론 ID ST6GalNAc I mRNA 발현 수준 (대조군보다 배수 발현 수준)
클론 7 165
클론 8 105
클론 10 15
클론 13 125
클론 15 20
클론 16 30
클론 7, 8, 및 13은 비-형질도입된 세포주의 수준과 비교할 때 가장 높은 수준의 ST6GalNAc I mRNA를 입증하였다.
아무것도 발현하지 않는 SKOV3 클론 (야생형), 중간 수준 (클론 15), 및 높은 수준 (클론 13)의 STn을 발현하는 SKOV3 클론을 항-STn 항체 처리에 대한 민감도에 대하여 테스트하였다. 세포를 배양하고 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 및 100 nM의 농도 수준으로 비히클 대조군, hSIA101, hSIA101-MMAE, hSIA102, 또는 hSIA102-MMAE를 처리하였다. 그 후 세포 생존력을 MTT 분석 (EMD Millipore, Billerica, MA)으로 측정하였다. 세포 생존력은 높은 수준의 STn을 발현하는 세포에서 모든 용량의 hSIA101-MMAE 및 hSIA102-MMAE 처리 및 중간 STn-발현 세포에서는 2.5 nM 초과의 용량에서 감소하였다. 세포 생존력은 중간 수준의 STn을 발현하는 세포에서 모든 용량의 hSIA101-MMAE 및 hSIA102-MMAE 처리로 및 중간 STn-발현 세포에서 5 nM 초과의 용량에서 감소하였다. STn을 발현하지 않는 세포에서, hSIA101-MMAE 및 hSIA102-MMAE는 사용된 최고 용량을 제외하면 거의 효과가 없었다. 이들 결과는 항-STn 처리에 대한 세포 민감도가 STn의 발현 수준에 따라 다르다는 것을 나타낸다.
실시예 12. OVCAR3 세포주- 유래된 마우스 이종 이식에서 생체 내 연구
무흉선 누드 마우스 피하 이종 이식 마우스 모델을 OVCAR3 인간 난소암 세포를 사용하여 생성하였다. 동물에 인간화된 항-STn ADC (1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg), 아이소타입 ADC (1 mg/kg, 5 mg/kg), 파클리탁셀 (20 mg/kg) 또는 비히클 단독으로 처리하였다. ADC를 4주 동안 1주 1회 정맥내로 투여하였다. 파클리탁셀을 3주 동안 1주 1회 복강내로 투여하였다. 종양 부피 및 체중을 표 12에 표시된 날에 측정하였다. 인간화된 ADC는 비히클 및 아이소타입 ADC 대조군과 비교하여 종양 부피를 크게 감소시키는 한편 (표 12 참조), 총 체중에 대한 효과는 거의 없었다. 이 데이터는 항-STn ADC가 생체 내에서 독성이 아니고 혈청 난소 이종 이식 부피를 감소시키는데 효과적임을 시사한다. 연구가 끝날 때, 종양 조직을 수거하고 면역조직화학법을 사용하여 STn의 발현에 대하여 분석하였다. 항-STn ADC로 처리된 마우스의 종양 조직은 다른 처리와 비교하여 감소된 STn 발현을 나타냈다.
종양 부피
처리 평균 종양 부피 (mm3)
제1일 제4일 제9일 제12일 제15일 제18일 제23일 제26일 제30일 제31일
비히클 161.8 242.8 373.5 539.1 678.4 803.1 987.1 1039.3 1175.6 1224.0
hSIA101-MMAE,
1 mg/kg		 161.7 228.9 347.7 448.2 551.5 609.0 768.4 882.7 937.1 966.8
hSIA101-MMAE,
2.5 mg/kg		 161.9 213.2 275.8 302.6 313.5 299.7 234.0 195.9 169.7 169.1
hSIA101-MMAE,
5 mg/kg		 161.7 203.4 211.0 193.4 165.0 131.1 77.8 59.4 39.5 39.1
hSIA102-MMAE,
1 mg/kg		 161.7 219.7 335.5 465.7 567.1 707.1 871.9 897.0 957.7 984.8
hSIA102-MMAE,
2.5 mg/kg		 161.8 202.9 291.8 358.5 399.5 420.8 414.3 370.2 384.0 384.7
hSIA102-MMAE,
5 mg/kg		 161.7 210.7 210.6 187.4 168.7 127.2 84.0 67.3 50.5 46.8
아이소타입-MMAE,
1 mg/kg		 161.1 222.1 312.6 368.8 423.1 468.3 510.6 472.5 531.4 548.2
아이소타입-MMAE,
5 mg/kg		 161.4 196.5 255.9 241.8 205.9 176.9 127.1 94.3 78.0 74.0
파클리탁셀, 20mg/kg 161.2 210.0 370.0 482.3 620.4 767.4 971.6 1133.0 1277.8 1385.2
실시예 13. 환자 CRC 샘플에서 STn 발현
주요 환자 CRC 샘플을 hSIA101 및 두 개의 상업적 항체 B72.3 및 CC49를 사용한 유동 세포 분석법으로 조사하였다. 테스트된 10개의 샘플 모두 STn 양성이었다. 결과는 표 13에서 제공된다. 표에서, %STn은 생 CD45-/CD34- 집단의 %로 표현된다. STn 발현은 때때로 상업적 항체보다 hSIA101을 사용할 때 더 강력하게 확인되었다. 발현은 3-47% 양성의 범위에 있으며, 전이성 샘플이 가장 높은 퍼센트의 양성 세포를 입증한다. 이는 항-STn 항체가 종양 샘플에서 STn 특이적 집단을 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
환자 샘플에서 STn 발현
샘플 기원 조직 항체 %STn+
160093-2
 결장

 SIA201a 22.9
B72.3 18.9
CC49 17.1
160101-2
 결장
 SIA201a 10
B72.3 5.8
CC49 5
160102-2
 결장
 SIA201a 12.9
B72.3 14.7
CC49 11.4
160115-2
 결장

 SIA201a 5.4
B72.3 13
CC49 5.7
160127-2

 결장 SIA201a 4.2
B72.3 14.4
CC49 3.5
160149-1

 결장

 SIA201a 22.7
B72.3 10.5
CC49 9.8
160151-1

 결장 SIA201a 19.6
B72.3 6.8
CC49 11.5
169068-1
 결장 SIA201a 10.9
B72.3 7.4
CC49 8.4
1601666 결장 SIA201a 29.4
B72.3 17.3
CC49 20.6
160104-2 결장과 간
 SIA201a 47.8
B72.3 46.6
CC49 39.4
실시예 14. CRC 라인에서 시험관 내 독소 테스트
COLO205 및 LS174T 라인의 총 세포 집단의 대략 60-70%가 STn을 발현한다는 것을 보여주는 예비 유동 세포 분석법에 기초하여, 시험관 내 테스트를 수행하여 항-STn 항체-기반 처리를 테스트하였다. 마우스 및 인간화된 항-STn MMAE ADC로의 예비 결과를 고려하여, 결장직장암에 대한 항-STn ADC에 대하여 최적의 독소/링커를 확인하기 위해 실험을 수행한다. 다양한 수준의 STn 발현을 가진 8개의 CRC 라인 (COLO205, LS174T, RKO, HT-29, LS180, 및 SW403), 뿐만 아니라 STn 발현-변형된 세포주 [COLO205 STn 넉다운(knockdown), LS174T STn 넉다운, RKO STn+ (ST6GalNAc I 과발현), 및 HT-29 STn+ (ST6GalNAc I 과발현)]의 저항성을 아우리스타틴 (MMAE 및 MMAF), 메이탄신 (DM4 및 DM1), 피롤로벤조디아제핀 다이머 (탈리린 및 테시린) 및 토포이소머라아제 억제자 (SN-38 및 DXd) 및 다른 천연 작용제 (듀오카르마이신 및 아마니틴)를 포함한 10개의 공통 ADC 독소의 패널로 검사한다. CRC의 민감도를 치료 표준 (이리노테칸, CPT-11로도 알려져 있음) 및 비히클 단독과 비교하여 반 최대 억제 (세포독성) 농도 (IC50)를 얻었다. 이를 달성하기 위해, 컨쥬게이션되지 않은 독소를 다양한 수준의 내인성 STn 발현을 가진 CRC 세포주, 뿐만 아니라 STn 수준이 증가되거나 고갈된 상기 세포주의 유도체에서 테스트한다.
COLO205 및 LS174T 세포에서 STn 발현의 넉다운을 ST6GalNAc I-관련 침묵 siRNA (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 문헌에서 기술된 방법 (예를 들어, Gao et al., Nat Med. 2015 Nov;21(11):1318-25)을 사용하여 수행한다. 반대로, (STn의 검출 가능한 수준을 거의 발현하지 않거나 전혀 발현하지 않는) RKO 및 HT-29 세포를 ST6GalNAc I 발현 구조체를 전달하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하여 증가된 수준의 STn을 발현하는 클론 집단을 얻었다. 조작된 세포를 유동 세포 분석법 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 세포 표면 상에서의 STn 발현에 대하여 모니터링하고 qRT-PCR을 사용하여 ST6GalNac I mRNA 수준을 모니터링한다. 민감도를 확립하기 위해 컨쥬게이션되지 않은 독소를 CRC 라인에 추가하여 인큐베이션 후 24, 48, 72 및 96시간에 IC50 값을 얻는다. CELLTITER-GLO® 발광 세포 생존력 분석 키트 (Promega, Madison, WI)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 처리 후 세포 생존력을 평가한다. 바람직한 ADC 성질을 가진 두 개의 독소를 항체 컨쥬게이션 및 추가의 특성화를 위해 선별한다.
실시예 15. CRC 모델에서 항- STn ADC의 평가
두 개의 독소를 두 개의 선택된 인간화된 항-STn 항체에 컨쥬게이션하고 결합 분석을 사용하여 STn 결합 특이성이 유지되는지 확인한다. 결합 분석 (유동 세포 분석법-기반 분석, ELISA 및 글리칸 어레이)을 이전에 기술된 바와 같이 수행한다. 하나의 인간 아이소타입 IgG1 항체는 두 개의 독소 각각에 별도로 컨쥬게이션되고 음성 결합 대조군으로 사용한다. EGFR (클론 LA22) 및 CEA (클론 CD66e) 항체를 각각 MDA-MB-231 및 CRC 라인으로의 결합에 대한 양성 대조군으로 사용한다.
항-STn ADC를 시험관 내 효율에 대하여 상기 기술된 CRC 라인에서 테스트한다. 다음을 포함한 총 8가지 조건을 테스트한다: 항-STn 1+독소 1; 항-STn 1+독소2; 항-STn 2+독소 1; 항-STn 2+독소 2; 아이소타입+독소 1; 아이소타입+독소 2; 표준 관리 및 비히클. 항-STn ADC를 각각 생존력 분석 및 연한천 성장 분석을 사용하여 세포 생존력 및 콜로니 형성에 대한 효과에 대하여 평가한다. 생존력 분석을 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 분석 키트 (Promega, Madison, WI)에 따라 수행한다. 상대적 ADC 효력을 제조사의 지침서에 따라 계산하여, 퍼센트 생존력 및 IC50 값을 얻는다. 콜로니 형성 분석을 수행하며 여기서 세포는 메틸셀룰로오스-기반 배지에 희석되고 ADC의 존재 하에 37℃에서 5-14일 동안 키워진다. 두 분석 모두에서, 광범위한 항-STn ADC 농도를 테스트하고 적용 가능한 IC50 값을 생성한다. 결과를 표준 관리 화학 치료제 및 아이소타입 ADC 대조군과 비교한다. IC50 데이터 및 콜로니 형성 정보를 기반으로 두 개의 상위 ADC를 선별한다.
CRC 이종 이식 TMA를 생체 내 연구를 위한 두 개의 STn 양성 CRC 모델을 확인하기 위해 STn 발현에 대하여 평가한다. 어레이는 다양한 스테이지, 하위유형, 유전적 배경 및 치료 반응성/저항성 모델을 커버하는 20개의 고유의 모델들로 이루어진다. STn 발현을 면역조직화학법 (IHC)으로 평가한다. TMA를 두 가지 항-STn 항체, 아이소타입 대조군 및 2차 항체 단독으로 염색한다. 항-인간 IgG 비오틴-라벨링된 2차 항체와 함께 인큐베이션한 다음 조직과 함께 인큐베이션되는 사전 복합체 형성 전략을 사용하여 IHC 검출을 수행한다. 신생물 특이적 막 염색을 평가하기 위해 염색을 채점한다. 두 개의 CRC 이종 이식 모델 및 한 개의 항-STn ADC를 생체 내 이종 이식 연구를 위해 선별한다.
항-STn ADC 후보를 평가한다. 두 가지 세포주 및 세 가지 용량 농도 (1, 2.5 및 5 mg/kg)를 사용한 단일 작용제, 다회수 약물용량 연구에서 생체 내 효능에 대하여 평가한다. 이종 이식 마우스 모델을 ICR SCID 마우스 (80마리 이하의 마우스)의 우측면으로 인간 CRC STn 발현 세포 (즉, 5x106 세포 1:1 (v/v) Matrigel)의 피하 주사에 의해 제조한다. 60마리 마우스가 ~200 mm3의 평균 종양 부피에 도달하면, 그것들을 대략 동등한 군 평균 종양 크기를 가진 6개의 군 (군 당 n=10 마우스)으로 무작위로 분류한다. 군들은 항-STn ADC (1, 2.5 또는 5 mg/kg), 아이소타입 ADC 대조군 (5 mg/kg), SOC (이리노테칸 40 mg/kg) 또는 비히클 (DPBS)을 받는다. 처리는 이전의 항-STn ADC MMAE PK 연구에 기초하여 4주 동안 주 1회 정맥내 주사를 통해 투여된다. 종양 부피 및 체중을 주 2회 측정하고 종양 크기가 비히클 대조군에서 종점 부피 (≥1500mm3)에 도달할 때 또는 마우스가 빈사상태가 되면 개개의 마우스를 희생시켰다. 각 군의 마우스를 연구가 끝날 때 IHC 및 유동 세포 분석법을 통해 종양 STn 발현에 대하여 평가한다.
이 연구의 결과에 기초하여, 독소/링커를 추가로 최적화하여 항-STn ADC의 생체 내 및 시험관 내 효능을 개선한다.
실시예 16. CRC PDX 모델의 선별
PDX 연구에 대한 반응성 모델을 결정하기 위해 환자-유래된 종양 (PDX) 세포의 CRC 종양 마이크로어레이 (TMA)를 인간화된 항-STn 항체를 사용하여 STn 발현에 대하여 평가한다. 총 200개 이상의 코어를 함유하는 잘 특성화된 상업적 포르말린-고정된 파라핀-매립된 (FFPE) PDX TMA (CrownBio, Santa Clara, CA)를 IHC에 의해 STn 발현에 대하여 평가한다. 이들 TMA는 AP24534 [포나티닙, (RET 억제자)], 세툭시맙, 베바시쥬맙 (Avastin®), 트라스투쥬맙 (Herceptin®), 소라페닙, 5-플루오로유라실, 시스플라틴, 도세탁셀, 젬시타빈, 이리노테칸 또는 파클리탁셀에 대해 저항성인 것들을 포함한 다수의 나이브 및 표준 관리 저항성 PDX 모델로 이루어진다. TMA를 컨쥬게이션되지 않은 항-STn 항체, 아이소타입 항체 또는 2차 항체 단독으로 염색한다. 모든 IHC 분석된 TMA를 항체 염색 강도, 빈도, 및 국소화에 대하여 맹검 방식으로 현미경으로 채점한다. STn 발현과 CRC 진행 간의 상관관계를 검사하고 사용하여 모델 선택을 통지한다.
IHC 데이터에 기초하여, 항-STn ADC 후보를 사용한 시험관 내 테스트를 위해 10개의 PDX를 선택한다. 이들 10개의 PDX 모델을 이전에 기술된 생존력 분석 및 콜로니 형성 분석에서 세포독성 및 콜로니 형성에 대하여 평가한다. 아이소타입 ADC 대조군, 세 개의 SOC 작용제 (이리노테칸, 세툭시맙 및 베바시쥬맙, 단일 작용제로서) 및 비히클 대조군이 분석에 포함된다. 생체 내 연구를 위해 STn 발현 및 항-STn ADC 시험관 내 반응에 기초하여 세 개의 PDX 모델 [1개의 표준 관리 (SOC) 저항성 PDX 모델 사용]을 선별한다.
실시예 17. 단일 용량 PK 연구
생체 내 연구 전에, 항-STn ADC 후보를 단일 용량 생체 내 마우스 연구에서 PK 성질에 대하여 평가한다. 두 가지 용량 수준 (2.5 및 5 mg/kg) 및 10번의 시점 (투여 후 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 168, 336, 및 672시간)을 이 단일 용량 연구에 사용한다. 총 9마리의 마우스가 처리 군에 포함되며, 마우스의 세 개의 부분군에서 시차를 두고 혈액을 수거한다. 할당된 시점에서, 마우스를 채혈하고 혈청을 혈청 분리 튜브로 수거한다. 혈책을 최소 30분 동안 응고시킨 다음 수거 1시간 내에 원심분리 (5℃에서 10 min 동안 3500 rpm)로 처리한다. 원심분리 후, 혈청을 분리하고 면역 분석에 사용하여 혈청에 존재하는 항-STn ADC를 결정한다. 말단 제거 반감기 (HL), 곡선 아래 면적 (AUC), 최대 관찰된 혈장 농도 (Cmax), 정지 상태 분포 용적 (Vss) 및 말단 단계 분포 용적 (Vz)을 결정한다. PK 파라미터를 사용하여 생체 내 PDX 연구를 위한 최적의 주입 양생법을 결정한다.
실시예 18. 마우스의 PDX 모델에서 생체 내 효능의 평가
단일 작용제 요법으로서 항-STn ADC 후보의 생체 내 효능을 평가하기 위해 PDX TMA의 면역조직화학적 분석을 통해 확인된 세 개의 PDX 모델을 사용하여 PDX 마우스 연구를 실행한다. 6개의 군 (군 당 10마리 마우스)으로 무작위로 분류된 PDX 마우스를 1, 2.5 또는 5 mg/kg의 항-STn ADC, 아이소타입 ADC 대조군 (5 mg/kg), SOC (이리노테칸 (40 mg/kg), 세툭시맙 (10 mg/kg) 또는 베바시쥬맙 (10 mg/kg)) 또는 비히클 단독으로 투여한다. 동물에 4주 동안 주 1회 투여한다. STn 발현을 IHC 및 유동 세포 분석법에 의해 연구의 시작과 끝에 검사한다.
실시예 19. 마우스의 PDX 모델에서 조합 처리
선별된 PDX 마우스 모델에서 항-STn ADC 후보를 동시 또는 순차적 처리로의 표준 관리 (SOC) 요법과 조합 요법에 대하여 평가한다.
동시 처리에 대하여, 다음을 포함하여, 아암 당 10마리의 마우스를 갖는 총 9회 처리 아암을 테스트한다: 비히클 단독, 항-STn ADC (1 mg/kg), 항-STn ADC (5 mg/kg), SOC 단독, SOC + 비히클, SOC + 항-STn ADC (1 mg/kg), SOC + 항-STn ADC (5 mg/kg), SOC + 컨쥬게이션되지 않은 항-STn (1 mg/kg), 및 SOC + 컨쥬게이션되지 않은 항-STn (5 mg/kg). 동물을 4주 동안 매주 투여한다. STn 종양 발현을 IHC 및 유동 세포 분석법에 의해 연구 시작과 끝에 검사한다.
순차적 처리에 대하여, 마우스를 초기에 SOC로 처리한다. 4주 처리 또는 원래의 종양 부피의 < 25%까지의 중간 종양 퇴행 후, 마우스를 다음과 같이 6개의 암으로 무작위로 분류한다: 항-STn ADC (1 mg/kg), 항-STn ADC (5 mg/kg), 컨쥬게이션되지 않은 항체 (1 mg/kg), 컨쥬게이션되지 않은 항체 (5 mg/kg), 하나의 아이소타입 ADC 대조군 및 비히클 대조군. 동물을 4주 동안 매주 투여한다. STn 종양 발현을 IHC 및 유동 세포 분석법에 의해 연구 시작과 끝에 검사한다.
실시예 20. 예비 다회수 용량 독성 연구
게먹이 원숭이에서 hSIA101-MMAE 투여를 사용하여 약물동역학적 특성 및 독성을 평가하기 위해다회수 용량 연구를 실행하였다. 연구는 사망률/이환률, 임상 관찰, 체중, 음식 소비, 체중, 국소 자극, 안과학, 및 임상병리학 평가과 같은 생전(in-life) 평가를 포함하였다. 9마리의 수컷 동물 (2-4 연령)을 이들 연구에 사용하였으며, 표 14에서 나열된 처리군 당 3마리의 원숭이를 이용하였다.
처리군
군 용량 (mg/kg) 투여 부피
(ml/kg)		 투여 농도
(mg/ml)		 군 당
동물
1 1 1.2 0.833 3
2 3 1.2 2.5 3
3 6 1.2 5 3
모든 군에 정맥내 볼루스 주사에 의해 제1 일에 1회 및 다시 제22 일에 1회, 총 2회 투여하였다. 혈액 샘플을 다음 일정을 사용하여 약물동역학 연구를 위해 제1 일 및 제22 일에 수거하였다: 투약 (0) 전 및 이어서 투약 후 1, 3, 6, 24, 48, 72, 96, 및 168시간. 추가적인 혈액 샘플을 단지 투약 제1 일 동안에만 투약 후 240, 336, 및 504시간에 수거하였다. 혈액 샘플을 다음 일정을 사용하여 임상병리학적 평가 (임상화학, 혈액학, 및 응고)를 위해 수거하였다: 투약 (사전 테스트) 전에, 제8 일, 제22 일 (사전 제2 투약) 및 안락사 전 제29 일. 임상화학적 평가는 나트륨 크레아티닌, 총 단백질, 칼륨, 알칼리성 포스파타아제, 트리글리세리드, 클로라이드, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제, 전체 빌리루빈, 칼슘 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제, 알부민, 무기 인, 글루코오스, 글로불린, 요소 질소, 콜레스테롤, 및 알부민/글로불린 비의 평가를 포함하였다. 혈액학적 평가는 헤마토크리트(hematocrit), 평균 혈구 헤모글로빈 농도, 헤모글로빈, 망상적혈구 수 (절대 수 및 상대 수), 혈소판 수, 적혈구 수, 평균 혈소판 부피, 총 백혈구 수, 평균 혈구 헤모글로빈, 차등적 백혈구 수 (절대 수 & 상대 수), 평균 혈구 부피, 및 적혈구 분포 너비의 평가를 포함하였다. K3-EDTA를 응고방지제로 사용하였다. 응고 평가는 프로트롬빈 시간 및 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간의 평가를 포함하였다. 모든 군을 제29 일에 안락사시키고 검시를 위해 장기를 수거하였다.
대상 혈액 샘플의 혈청을 인간 IgG 수준의 약물동역학 (PK) 평가에 사용하였다. PK 파라미터를 정맥내 볼루스 투여 경로와 일치하는 비-구획적 접근법을 사용하는 Phoenix 약물동역학 소프트웨어 (Certara, USA)를 사용하여 추정하였다. 모든 파라미터를 제1 일 및 제22 일의 혈청의 개개의 인간 IgG 농도로부터 생성하였다. 파라미터를 각각의 용량의 투여가 끝날 때에 관하여 명목상 샘플링 시간을 사용하여 추정하였다. 파라미터 판단의 목적을 위해 처음 두 개의 관찰된 혈청 농도를 기반으로 제1 일 0시의 농도를 역추론하였다. 정량화 가능하지 않은 것으로 보고된 농도값을 부재 샘플로 처리하였다.
최초 용량에 관하여 얻어진 혈청 항체 농도값은 도 2에서 제공되고 두 번째 용량에 관하여 얻어진 값은 표 3에서 제공된다. 농도 대 시간 곡선 아래 면적 (AUC)을 선형/선형 보간법과 함께 선형 사다리꼴 방법을 사용하여 계산하였다. AUC는 별도의 시점에서 테스트 아이템의 3개 미만의 정량화 가능한 농도를 가진 PK 프로파일에 대하여 계산되지 않았다. 실제로, 각각의 농도 대 시간 곡선의 말단 제거 단계를 적어도 마지막 세 개의 관찰된 농도값을 사용하여 확인하였다. 말단 제거 단계의 기울기를 로그 비가중 농도 데이터에 대한 선형 회귀를 사용하여 결정하였다. 평균값은 표준 편차 (SD; 괄호 안)와 함께 표 15 및 표 16에서 제공된다. Cmax는 투약 후 측정된 최대 관찰 농도를 말한다. AUClast는 용량 투여 시작부터 선형 또는 선형/로그 사다리꼴 방법을 사용하여 마지막으로 관찰된 정량화 가능한 농도까지의 농도 대 시간 곡선 아래 면적을 말한다. AUC0 - 7Day는 동일하지만, 제7 일 아래의 면적이 포함되지 않는 것을 말한다. AUCINF는 추정된 용량 투여 시작에서부터 무한대 시간까지의 농도 대 시간 곡선 아래 면적을 말한다. CL은 분석된 매트릭스로부터 항체의 적절한 클리어런스 율을 말한다. HL은 적절한 말단 제거 반감기를 말한다. Vss는 정지 상태에서의 적절한 분포 용적을 말한다.
제2 투여 후 얻어진 PK 파라미터
용량 (mg/kg) C max ( μg /ml);
평균 (SD) 		AUC last (일* μg /ml);
평균 (SD)
1 22.16
(0.01)		 41.59
(4.68)
3 75.27 (5.18) 145.48
(51.93)
6 117.23 (45.7) 172.36
(141.18)
제1 일에, 인간 IgG로의 전신 노출의 증가는 1 내지 6 mg/kg/용량에서 선형 및 용량-비례하며, 용량-비례보다 더 큰 약간의 경향이 있다. 제22 일에, 전신 노출의 증가는 1 내지 6 mg/kg/용량에서 비-선형이다. AUC(0-t)에 관하여, 제1 일 및 제22일을 비교할 때 인간 IgG에 대한 전신 노출의 감소가 관찰되었으며, 용량 수준이 증가함에 따라 증가한다.
제29 일까지 생존하는 동물을 안락사시키고 검시를 위해 제출하였다. 현미경 평가에 필요한 조직을 잘라내고, 일상적으로 가공하고, 파라핀에 임베딩시키고, 광학 현미경에 의한 평가 전에 헤마톡시린과 에오신으로 염색하였다.
테스트 물품-관련 총 결과를 주지하지 않았다. 관찰된 총 결과는 게먹이 원숭이의 이러한 계통 및 연령에서 일반적으로 관찰되는 성질 중에서 부수적인 것으로 간주되었고 및/또는 대조군 및 처리된 동물에서 유사한 발병률을 나타내며, 그러므로, 항체 투여와 무관한 것으로 간주된다. 연구 동물들 중에서 체중 손실 또는 사망이 발생하지 않았고 평가된 모든 장기에 걸쳐 총 병리학적 변화를 관찰하지 못 했다. 조직병리학적 변화는 골수에 제한되며, 이것은 MMAE와 관련된 효과이다. 최소 또는 약간 감소된 세포성 및 골수성 대 적혈구 비의 약간의 감소를 관찰하였다. 혈액학적 파라미터의 변화 (즉, 보통의 호중성 백혈구 감소증(neutropenia))는 다른 MMAE 항체 약물 컨쥬게이트와 일치하고, 표적 관련된 것으로 간주되지 않는다. 마지막으로, 모든 임상 화학 결과는 연구 전반에 걸쳐 정상으로 유지된다.
실시예 21. 세포주 생성
임상 등급 항체를 생산하기 위해서, 안정한 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 Gibco® Freedom® CHO-S® Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에 따라 생성한다. CHO-S 세포를 인간화된 항-STn 항체를 암호화하는 유전자를 함유하는 구조체로 트랜스펙션한다. 2단계 선별 계획을 기반으로 하여 안정한 클론을 선별한다. 높은 생산 수율을 가진 클론을 추가의 특성화를 위해 선별한다. 안정한 세포주를 GLP 독성 테스트 및 단계 I 임상 시험 공급을 위한 항체를 생산하기 위해 Good Manufacturing Practice (GMP) 시설로 이전된다.
실시예 22. 조직 교차-반응성 연구
조직 교차-반응성 연구를 실행하여 비임상 안전성 테스트에서 사용된 인간 및 적절한 종으로의 결합 프로파일 (표적(on-target) 및 잠재적 비-표적 결합 둘 다)을 평가하였다. 인간화된 항-STn 항체를 정상 인간, 래트, 마우스, 및 게먹이 원숭이 조직의 패널로의 결합에 대하여 검사하였다. 연구를 1-3 μg/ml에서 10개의 정상 냉동 조직 섹션에서 실행하였다: 심장, 뇌, 신장, 위, 폐, 소장, 결장, 간, 췌장, 비장 및 골수. 양성 대조군은 STn 양성 암을 함유하는 인간 췌장 신생물이었고 음성 대조군은 같은 견본 내에 함유된 정상 간질 세포였다. 모든 정상 조직에 걸친 염색은 세포질에 제한된다. 추가적인 분석을 1차 항체 없이 또는 음성 대조군으로서 아이소타입 대조군 IgG를 사용하여 실행하였다.
세 개의 테스트된 항체 중에서, hSIA101은 정상 인간 조직과의 가장 낮은 교차-반응성을 갖는다. 심장 혈관, 위 상피 세포, 소장 상피 세포s 및 비장 혈관의 조직을 사용하여 중간 결합 활성을 볼 수 있다. 항체는 또한 게먹이 원숭이 (표 17 참조) 및 래트 (미도시)의 유사한 조직과 교차 반응하는 것으로 발견되었다. 표에서: 1+ = 약한 염색; 2+ = 중간 염색; 3+ = 강한 염색; 4+ = 매우 강렬한 염색; Neg = 음성; freq = 빈번 (세포의 >75%-100%에서 염색); occ = 간헐적 (세포의 >25%-50%에서 염색); 및 rare는 세포의 1-5%에서의 염색을 말한다.
조직 교차 반응성 연구 결과
조직 인간 Cyno
심장 혈관 2+ rare (세포질) Neg
위 상피 세포 2-3+ freq (세포질) 2-3+ occ (세포질)
위 혈관 Neg 2+ occ (세포질)
폐 상피 Neg 2-3+ freq (세포질)
소장 상피 세포 2-4+ freq (세포질) 3-4+ freq (세포질)
결장 상피 세포 1+ freq (세포질) Neg
결장 혈관 Neg 4+ freq (세포질)
췌장 혈관 Neg 2-3+ freq (세포질)
비장 혈관 2-3+ freq (세포질) Neg
어떠한 조직에서도 세포막 상에서 염색을 관찰할 수 없었다. 대뇌, 소뇌, 신장 및 간은 염색되지 않았다. 아이소타입 및 2차-전용 대조군 분석은 염색을 입증하지 못하는 한편, 단지 양성 대조군 조직 (췌장 신생물)만이 hSIA101로의 강한 막 염색을 입증하였다.
실시예 23. 난소 PDX 종양 모델에서 항- STn 항체 처리와 시스플라틴 처리간의 비교
두 명의 상이한 환자의 인간 환자-유래된 난소암 종양을 사용하는 이종 이식 종양 모델에서 항-STn ADC 후보를 표준 관리 (SOC) 요법과 비교하였다. 환자 샘플은 면역조직화학적 염색에 의해 STn을 발현하는 것으로 확인되었고 이전에 화학요법으로 처리되지 않은 (케모-나이브) 환자와 이전에 화학요법으로 처리된 환자의 것들 중 하나의 종양은 무흉선 누드(nude) 면역-결핍 마우스에서 이식되었다. 성공적인 종양 성장을 가진 마우스를 선별하고 매주 IV 주사에 의해 항체 (5 mg/kg 용량); 매주 복강내 주사 (3회 용량으로 제한됨)에 의해 시스플라틴 (3 mg/kg 용량); 또는 비히클 대조군을 투여하였다. 투여된 항체는 hSIA101, hSIA101-ADC (MMAE와 컨쥬게이션됨), 또는 MMAE와 컨쥬게이션된 IgG 아이소타입 대조군 (아이소타입-ADC)을 포함하였다. 케모-나이브 종양을 가진 마우스는 4주 동안 항체 처리를 받은 한편, 화학-저항성 종양을 가진 마우스는 6주 동안 항체 처리를 받았다. hSIA101-ADC 또는 아이소타입-ADC로 처리된 마우스에서 종양 부피를 종양 회귀를 평가하기 위해 처리가 끝난 후 4-5주 동안 모니터링하였다.
시스플라틴-민감성 (도 4, 상부 패널) 및 시스플라틴-저항성 (도 4, 하부 패널) 종양 부피를 시간이 흐름에 따라 측정하였다. hSIA101-ADC 처리는 다른 처리와 비교하여 가장 효과적인 종양 부피 감소를 수득하였다. 시스플라틴-저항성 세포를 사용하여 생성된 종양은 시스플라틴 처리 (도 4, 하부 패널)와 비교하여 hSIA101-ADC 처리에 의해 크게 감소하였다. 따라서, hSIA101-ADC 처리는 시스플라틴-민감성 및 시스플라틴-저항성 종양을 효과적으로 치료하는데 사용될 수 있다. 흥미롭게도, hSIA101-ADC로 처리된 케모-나이브 마우스 중 75%에서는 처리가 끝난 후 4주에 종양이 완전히 없는 한편, hSIA101-ADC 처리가 끝난 후 5주에 화학-저항성 종양을 가진 마우스의 75%에서 50% 초과의 종양 회귀가 관찰되었다.
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Claims (58)

  1. 항체-약물 컨쥬게이트(antibody drug conjugate; ADC)를 포함하는, 대상체에서 백금 불응성(platinum refractory) 암을 치료하기 위한 약학적 조성물로서,
    상기 백금 불응성 암은 (i) 유방암, 흑색종(melanoma), 결장직장암, 간암, 폐암, 방광암, 자궁경부암, 위암 및 전립선암에서 선택되거나, (ii) 시스플라틴 또는 옥살리플라틴 저항성이거나, 또는 (iii) 난소암이고 시스플라틴 저항성이고,
    상기 백금 불응성 암은 STn을 발현하는 적어도 하나의 암세포를 포함하고,
    상기 ADC는:
    a) 항-STn 항체로서, 상기 항-STn 항체는:
    서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는, 항-STn 항체;
    b) 적어도 하나의 인간 IgG1 불변 영역; 및
    c) 링커를 통해 항-STn 항체에 컨쥬게이션된 세포독성제를 포함하는, 약학적 조성물.
  2. 제1 항에 있어서, 세포독성제는 아우리스타틴, 메이탄신, 튜불리신, 빈카 알칼로이드, 피롤로벤조디아제핀 다이머, 캄프토테신, 듀오카르마이신 및 아마니틴으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1 항에 있어서, 링커는 분열 가능한 링커인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1 항에 있어서, 링커는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드) (폴리HPMA), 폴리(α-아미노산), 탄수화물 폴리머, 다당류, 당지질, 당컨쥬게이트, 폴리글리세롤, 폴리비닐 알콜, 폴리(아크릴산), 폴리케탈, 폴리아세탈, 및 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말) (PHF)에서 선택된 하나 이상의 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1 항에 있어서, 링커는 발린-시트룰린을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 백금 불응성 암은 난소암이고 시스플라틴 저항성인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 백금 불응성 암은 결장직장암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제7 항에 있어서, 결장직장암은 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시쥬맙, 라무시루맙, 트라스투쥬맙, 포나티닙, 소라페닙, 5-플루오로우라실, 도세탁셀, 젬시타빈, 이리노테칸 또는 파클리탁셀 중 적어도 하나로의 처리에 대하여 저항성인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이고, 링커는 발린-시트룰린을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, ADC는 1 mg/kg 내지 6 mg/kg의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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