JP2001516766A - 免疫反応の細胞内発現抗体仲介制御 - Google Patents
免疫反応の細胞内発現抗体仲介制御Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、例えば、細胞上の個別または複数クラスの免疫調節レセプター分子（ＩＲＭ）を選択的に標的化することによって、免疫系の調節を変化させる方法に関し、この方法は、細胞に細胞内で発現するＩＲＭに対する抗体（すなわち細胞内発現抗体）を形質導入する工程を包含する。好適な実施態様では、この細胞内発現抗体はＩＲＭ、例えばＭＨＣ−Ｉ分子に対する単鎖抗体を含む。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、細胞中の免疫応答を、その細胞を細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏ
ｄｙ）で標的化することによって操作することに関する。
ｄｙ）で標的化することによって操作することに関する。
【０００２】 （発明の背景） 抗原提示細胞は、ウイルス感染または腫瘍の存在に関して免疫系に組織をモニ
ターさせる。このプロセスにおいて、サイトゾル中のタンパク質がプロテオソー
ム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）によって、あるいは他のタンパク質分解酵素によっ
て加水分解され、そしてオリゴペプチド産物のうちのあるものは、抗原プロセシ
ングに関連するトランスポーター（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ＴＡＰ））によって
小胞体中（ＥＲ）に移動し、そして新たに組み立てられた免疫調節レセプター分
子（ＩＭＲ）に結合した後、原形質膜に輸送される。サイトゾルおよびＥＲ中に
常在するタンパク質のほとんど全てが抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって合成され
るので、この経路は免疫系にペプチドのサンプリングを提供する。ほとんどの場
合、これらのペプチドは自己のタンパク質由来であり、そして自己寛容のため免
疫系から無視される。しかし、細胞が外来ペプチド（ウイルスまたは変異遺伝子
産物）を提示する場合、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が加害細胞を殺す（Ｒ
ｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １７：１３１−１３７
（１９９６）。
ターさせる。このプロセスにおいて、サイトゾル中のタンパク質がプロテオソー
ム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）によって、あるいは他のタンパク質分解酵素によっ
て加水分解され、そしてオリゴペプチド産物のうちのあるものは、抗原プロセシ
ングに関連するトランスポーター（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ＴＡＰ））によって
小胞体中（ＥＲ）に移動し、そして新たに組み立てられた免疫調節レセプター分
子（ＩＭＲ）に結合した後、原形質膜に輸送される。サイトゾルおよびＥＲ中に
常在するタンパク質のほとんど全てが抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって合成され
るので、この経路は免疫系にペプチドのサンプリングを提供する。ほとんどの場
合、これらのペプチドは自己のタンパク質由来であり、そして自己寛容のため免
疫系から無視される。しかし、細胞が外来ペプチド（ウイルスまたは変異遺伝子
産物）を提示する場合、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が加害細胞を殺す（Ｒ
ｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １７：１３１−１３７
（１９９６）。
【０００３】 免疫調節レセプター分子（ＩＲＭ）は、分解されたタンパク質の断片を免疫系
に提示することによって免疫応答を制御し、そして引き金を引く機能を果たす。
これは厳密に調節されたシステムであり、代表的には身体を所望されない外来の
問題、例えばウイルス感染および外来細胞の侵入から保護する助けとなる。ＩＲ
Ｍの一例は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子である。ＭＨＣ分子は２つのクラ
ス、すなわちクラスＩおよびクラスＩＩ分子を含む。古典的な主要組織適合性複
合体（ＭＨＣ）クラスＩ経路はほとんど全ての細胞において作動可能である。機
能性のクラスＩ分子が細胞表面で見いだされ、そしてきっちりと折り畳まれたク
ラスＩ鎖糖タンパク質とＢ2−ミクログロブリンとの複合体および細胞内タンパ ク質の分解ターンオーバー由来の短いペプチドを含む。ＭＨＣ分子は多様な細胞
型で見いだされ、そして多数の細胞型におけるエンドサイトーシスによって効率
よく細胞内移行される。クラスＩ分子が、ＣＴＬを活性化させる寄生生物、細菌
もしくはウイルスまた腫瘍起源の外来ペプチドを含む場合、あるいはクラスＩの
細胞表面レベルがＮＫ細胞がもはや妨げられない点まで下がった場合のいずれか
の場合に、細胞の遭難シグナルが発せられる［Ｐａｒｈａｍ，Ｐ．，ＴＩＢＳ
２１：４２７−４３３（１９９６）］。Ｔ細胞に見つけられた抗原は、宿主細胞
の表面上でＴ細胞に対して提示されるより前に、宿主細胞の内部で分解される。
ウイルスタンパク質の断片は、細胞の表面上またはおそらくは細胞内部のＭＨＣ
分子と連合することによって、感染細胞の表面上に巻き上げられる。例えば、Ａ
ｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌ
ｌ，第２版（１９８６）、１０４３頁参照。
に提示することによって免疫応答を制御し、そして引き金を引く機能を果たす。
これは厳密に調節されたシステムであり、代表的には身体を所望されない外来の
問題、例えばウイルス感染および外来細胞の侵入から保護する助けとなる。ＩＲ
Ｍの一例は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子である。ＭＨＣ分子は２つのクラ
ス、すなわちクラスＩおよびクラスＩＩ分子を含む。古典的な主要組織適合性複
合体（ＭＨＣ）クラスＩ経路はほとんど全ての細胞において作動可能である。機
能性のクラスＩ分子が細胞表面で見いだされ、そしてきっちりと折り畳まれたク
ラスＩ鎖糖タンパク質とＢ2−ミクログロブリンとの複合体および細胞内タンパ ク質の分解ターンオーバー由来の短いペプチドを含む。ＭＨＣ分子は多様な細胞
型で見いだされ、そして多数の細胞型におけるエンドサイトーシスによって効率
よく細胞内移行される。クラスＩ分子が、ＣＴＬを活性化させる寄生生物、細菌
もしくはウイルスまた腫瘍起源の外来ペプチドを含む場合、あるいはクラスＩの
細胞表面レベルがＮＫ細胞がもはや妨げられない点まで下がった場合のいずれか
の場合に、細胞の遭難シグナルが発せられる［Ｐａｒｈａｍ，Ｐ．，ＴＩＢＳ
２１：４２７−４３３（１９９６）］。Ｔ細胞に見つけられた抗原は、宿主細胞
の表面上でＴ細胞に対して提示されるより前に、宿主細胞の内部で分解される。
ウイルスタンパク質の断片は、細胞の表面上またはおそらくは細胞内部のＭＨＣ
分子と連合することによって、感染細胞の表面上に巻き上げられる。例えば、Ａ
ｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌ
ｌ，第２版（１９８６）、１０４３頁参照。
【０００４】 クラスＩ ＭＨＣ経路は、ペプチドを小胞体（ＥＲ）と細胞の表面の原形質膜
との間で連続的に行き来させる。ＭＨＣペプチド複合体はＴ細胞レセプター複合
体に結合し得、これが次にＴ細胞を活性化させる。
との間で連続的に行き来させる。ＭＨＣペプチド複合体はＴ細胞レセプター複合
体に結合し得、これが次にＴ細胞を活性化させる。
【０００５】 ＩＲＭの他の例は、免疫応答に関与する多数のリガンドおよびレセプター、例
えば、種々のインターロイキンのようなサイトカイン、およびＢ７−１およびＢ
７−２のような同時刺激分子を含む。これらの分子は細胞性免疫反応の刺激およ
び／または増強を助ける。例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２は細胞レセプターＣ
Ｄ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用して、各々その活性を開始させ、そして活
性を停止させる。
えば、種々のインターロイキンのようなサイトカイン、およびＢ７−１およびＢ
７−２のような同時刺激分子を含む。これらの分子は細胞性免疫反応の刺激およ
び／または増強を助ける。例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２は細胞レセプターＣ
Ｄ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用して、各々その活性を開始させ、そして活
性を停止させる。
【０００６】 他のレセプター、例えばＣＤ４０、ＣＤ２０およびＣＤ４３はＴ細胞およびＢ
細胞の活性化に関与する。このやり方で、ＩＲＭは感染因子および腫瘍の免疫監
視において非常に重要な役割を果たす。この厳密な調節が所望されない影響を生
じさせる場合がある。これは外来物を身体に添加することが望まれる場合、例え
ば、臓器移植の場合、またはベクターが治療的に付加される場合に観察され得る
。例えば、移植反応（例えば組織拒絶）はＭＨＣクラスＩ分子によって調節され
る。移植反応は、移植された組織のレシピエントによる拒絶、ならびに移植片に
よるレシピエント組織の拒絶の両方を含む。後者のプロセスは、免疫不全の処置
として骨髄移植を受けた患者で起こり得る。すなわち、これは移植片対宿主反応
である。両方のタイプの拒絶とも、組織適合性抗原と呼ばれる外来細胞表面抗原
に対して起こる。その最も一般的なのは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に対
する遺伝子によってコードされる抗原である。従って、ＩＲＭ（例えば、ＭＨＣ
−１のようなＭＨＣ分子）、あるいはその経路またはときにはその標的をも選択
的に標的化して、それらを抑制またはダウンレギュレートし得ることは、移植反
応を予防または最小化するために有用である。しかし、他の細胞がその機能する
能力を維持することもまた重要である。それゆえ、その選択方法は、目的のＩＲ
Ｍをできる限り特異的に標的化し、そして細胞中の他の分子（例えば、レセプタ
ー）を標的化しないべきである。
細胞の活性化に関与する。このやり方で、ＩＲＭは感染因子および腫瘍の免疫監
視において非常に重要な役割を果たす。この厳密な調節が所望されない影響を生
じさせる場合がある。これは外来物を身体に添加することが望まれる場合、例え
ば、臓器移植の場合、またはベクターが治療的に付加される場合に観察され得る
。例えば、移植反応（例えば組織拒絶）はＭＨＣクラスＩ分子によって調節され
る。移植反応は、移植された組織のレシピエントによる拒絶、ならびに移植片に
よるレシピエント組織の拒絶の両方を含む。後者のプロセスは、免疫不全の処置
として骨髄移植を受けた患者で起こり得る。すなわち、これは移植片対宿主反応
である。両方のタイプの拒絶とも、組織適合性抗原と呼ばれる外来細胞表面抗原
に対して起こる。その最も一般的なのは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に対
する遺伝子によってコードされる抗原である。従って、ＩＲＭ（例えば、ＭＨＣ
−１のようなＭＨＣ分子）、あるいはその経路またはときにはその標的をも選択
的に標的化して、それらを抑制またはダウンレギュレートし得ることは、移植反
応を予防または最小化するために有用である。しかし、他の細胞がその機能する
能力を維持することもまた重要である。それゆえ、その選択方法は、目的のＩＲ
Ｍをできる限り特異的に標的化し、そして細胞中の他の分子（例えば、レセプタ
ー）を標的化しないべきである。
【０００７】 所望の免疫反応を得るための抗原を発現するために、ベクターを用いて所望の
ＤＮＡセグメントを送達する場合がある。あいにく、ときどきベクター自身が免
疫反応を生じさせ、これが抗原によって引き起こされる免疫反応をマスクする。
ベクターに対する反応を選択的に阻害するが、抗原に対する所望の応答を阻害し
ないことが望まれる。
ＤＮＡセグメントを送達する場合がある。あいにく、ときどきベクター自身が免
疫反応を生じさせ、これが抗原によって引き起こされる免疫反応をマスクする。
ベクターに対する反応を選択的に阻害するが、抗原に対する所望の応答を阻害し
ないことが望まれる。
【０００８】 ＩＲＭはまた、自己抗原に対する寛容が破壊された場合の自己免疫反応に関与
し、種々の疾患を導く。これらの疾患では、Ｔ細胞および／またはＢ細胞が自己
の組織抗原に対して作用する。ここでもＭＨＣ分子（特にＭＨＣ−１分子）はこ
れらの反応で活発な役割を有する。それゆえ、ＩＲＭをダウンレギュレートし得
ることは、特定の自己免疫疾患の処置のために有用である。
し、種々の疾患を導く。これらの疾患では、Ｔ細胞および／またはＢ細胞が自己
の組織抗原に対して作用する。ここでもＭＨＣ分子（特にＭＨＣ−１分子）はこ
れらの反応で活発な役割を有する。それゆえ、ＩＲＭをダウンレギュレートし得
ることは、特定の自己免疫疾患の処置のために有用である。
【０００９】 最後に、これらの分子の調節を助けて、形質導入細胞上の特定のＩＲＭの表面
発現を減少または防止して、これらの細胞のインビボでの生存の期間を増大させ
得ることも、遺伝子治療のために有用であり得る。このような細胞はＣＴＬおよ
びＮＫ細胞の免疫応答を回避する。これらの細胞はまたワクチンまたは他の治療
分子のインビボでの担体として用いられ得る。
発現を減少または防止して、これらの細胞のインビボでの生存の期間を増大させ
得ることも、遺伝子治療のために有用であり得る。このような細胞はＣＴＬおよ
びＮＫ細胞の免疫応答を回避する。これらの細胞はまたワクチンまたは他の治療
分子のインビボでの担体として用いられ得る。
【００１０】 従って、系を所望のやり方（例えばＩＲＭの表面発現のダウンレギュレートま
たは阻害）で調節するために、目的のＩＲＭ、その経路、または標的を選択的に
標的化する方法が所望される。
たは阻害）で調節するために、目的のＩＲＭ、その経路、または標的を選択的に
標的化する方法が所望される。
【００１１】 （発明の要旨） 本発明は、例えば、細胞上の個別または複数クラスの免疫調節レセプター分子
（ＩＲＭ）を選択的に標的化することによって、免疫系の調節を変化させる方法
に関し、この方法は、細胞に細胞内で発現するＩＲＭに対する抗体（または細胞
内発現抗体）を形質導入する工程を包含する。好適な方法では、多数のＩＲＭ、
例えばＭＨＣ−１分子の上に存在するエピトープを標的化し得る。他の例では、
ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ２８またはＣＤ４０、Ｔ細胞
レセプター、ＬＭＰ２分子、ＬＭＰ７分子およびＣＤ１分子を標的化する。
（ＩＲＭ）を選択的に標的化することによって、免疫系の調節を変化させる方法
に関し、この方法は、細胞に細胞内で発現するＩＲＭに対する抗体（または細胞
内発現抗体）を形質導入する工程を包含する。好適な方法では、多数のＩＲＭ、
例えばＭＨＣ−１分子の上に存在するエピトープを標的化し得る。他の例では、
ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ２８またはＣＤ４０、Ｔ細胞
レセプター、ＬＭＰ２分子、ＬＭＰ７分子およびＣＤ１分子を標的化する。
【００１２】 本発明はまた、ＩＲＭ自体の代わりに抗原プロセシング経路における成分を選
択的に標的化する方法に関する。例えば、これらの成分の１つでもブロックする
ことによって、抗原提示の結果起こる免疫応答が調節され得る。例えば、ＭＨＣ
クラスＩ経路を調節するために、細胞内発現抗体を用いて、ＭＨＣ−１α鎖、β
２−ミクログロブリン、ＴＡＰ．１分子、ＴＡＰ．２分子、カルネキシン、カル
レティキュリンおよびタパシン（ｔａｐａｓｉｎ）を含む経路中の標的成分を標
的化し得る。他の経路、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ経路、ＣＤ１経路の成分もま
た、類似の方法で特異的細胞内発現抗体によって選択的に標的化される。
択的に標的化する方法に関する。例えば、これらの成分の１つでもブロックする
ことによって、抗原提示の結果起こる免疫応答が調節され得る。例えば、ＭＨＣ
クラスＩ経路を調節するために、細胞内発現抗体を用いて、ＭＨＣ−１α鎖、β
２−ミクログロブリン、ＴＡＰ．１分子、ＴＡＰ．２分子、カルネキシン、カル
レティキュリンおよびタパシン（ｔａｐａｓｉｎ）を含む経路中の標的成分を標
的化し得る。他の経路、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ経路、ＣＤ１経路の成分もま
た、類似の方法で特異的細胞内発現抗体によって選択的に標的化される。
【００１３】 本発明はまた、細胞上での抗原提示を選択的に防止する方法に関し、この方法
は、所望されない免疫応答を誘発する抗原またはその特異的部分を細胞内発現抗
体で標的化する工程を包含する。
は、所望されない免疫応答を誘発する抗原またはその特異的部分を細胞内発現抗
体で標的化する工程を包含する。
【００１４】 この細胞内発現抗体は、抗体全体、重鎖、Ｆａｂ’フラグメント、単鎖抗体お
よび二本鎖抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）を含む。本発明の１つの好適な方法では、細
胞内発現抗体は単鎖抗体（ｓＦｖ）を含む。標的がレセプターである場合、その
抗体はリーダー配列およびＥＲまたはゴルジの適切な残留シグナル、例えばＫＤ
ＥＬを含む。好ましくは、リーダー配列および小胞体（ＥＲ）、例えばＫＤＥＬ
配列またはゴルジ装置残留シグナルを含むヒトＭＨＣ−１に対する単鎖抗体（ｓ
ＦｖＭＨＣ−１）を細胞に形質導入する。このような方法は細胞の表面上でのＭ
ＨＣ−１分子の発現を妨げる。ＭＨＣ−１分子のダウンレギュレーションは、組
織拒絶、自己免疫疾患および骨髄移植のような特定の免疫応答を制御するために
有用である。他の実施態様では、この標的は細胞の中の他の場所に存在し、そし
て機能性リーダー配列は存在しない。
よび二本鎖抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）を含む。本発明の１つの好適な方法では、細
胞内発現抗体は単鎖抗体（ｓＦｖ）を含む。標的がレセプターである場合、その
抗体はリーダー配列およびＥＲまたはゴルジの適切な残留シグナル、例えばＫＤ
ＥＬを含む。好ましくは、リーダー配列および小胞体（ＥＲ）、例えばＫＤＥＬ
配列またはゴルジ装置残留シグナルを含むヒトＭＨＣ−１に対する単鎖抗体（ｓ
ＦｖＭＨＣ−１）を細胞に形質導入する。このような方法は細胞の表面上でのＭ
ＨＣ−１分子の発現を妨げる。ＭＨＣ−１分子のダウンレギュレーションは、組
織拒絶、自己免疫疾患および骨髄移植のような特定の免疫応答を制御するために
有用である。他の実施態様では、この標的は細胞の中の他の場所に存在し、そし
て機能性リーダー配列は存在しない。
【００１５】 （発明の詳細な説明） 本発明者らは、免疫調節レセプター分子（「ＩＲＭ」）、その経路、またはこ
のような分子と相互作用する化合物を選択的に標的化する方法を発見した。この
方法はこれらの分子の細胞表面上での発現を制御することによって免疫系を選択
亭に調節するために用いられ得る。より詳細には、この方法は抗体による所望の
標的への細胞内結合の使用を伴う。この細胞内抗体結合の方法は、ＰＣＴ／ＵＳ
９３／０６７３５（１９９２年１月１７日出願）および米国特許出願０８／３５
０，２１５号（１９９４年１２月６日出願）に記載されており、これら本明細書
中に参考として援用される。細胞内で発現される抗体を細胞内発現抗体とよぶ。
抗体全体、重鎖、Ｆａｂ’フラグメント、単鎖抗体および二本鎖抗体（ｄｉａｂ
ｏｄｙ）を用い得る。好ましくは、細胞内発現抗体は単鎖抗体、二本鎖抗体、ま
たはＦａｂ’である。より好ましくは、これは単鎖抗体である。例えば、免疫調
節レセプター分子（例えばＭＨＣクラスＩ分子）に対する単鎖抗体（細胞内発現
抗体）を用いることで、これらのＩＲＭの表面発現がダウンレギュレートまたは
阻害される。
のような分子と相互作用する化合物を選択的に標的化する方法を発見した。この
方法はこれらの分子の細胞表面上での発現を制御することによって免疫系を選択
亭に調節するために用いられ得る。より詳細には、この方法は抗体による所望の
標的への細胞内結合の使用を伴う。この細胞内抗体結合の方法は、ＰＣＴ／ＵＳ
９３／０６７３５（１９９２年１月１７日出願）および米国特許出願０８／３５
０，２１５号（１９９４年１２月６日出願）に記載されており、これら本明細書
中に参考として援用される。細胞内で発現される抗体を細胞内発現抗体とよぶ。
抗体全体、重鎖、Ｆａｂ’フラグメント、単鎖抗体および二本鎖抗体（ｄｉａｂ
ｏｄｙ）を用い得る。好ましくは、細胞内発現抗体は単鎖抗体、二本鎖抗体、ま
たはＦａｂ’である。より好ましくは、これは単鎖抗体である。例えば、免疫調
節レセプター分子（例えばＭＨＣクラスＩ分子）に対する単鎖抗体（細胞内発現
抗体）を用いることで、これらのＩＲＭの表面発現がダウンレギュレートまたは
阻害される。
【００１６】 「細胞内免疫」または「細胞内阻害」というコンセプトは、病原性細菌、ウイ
ルスおよび寄生生物の機能を妨げる重要な戦略として、ここ１０年の間に現れた
。細胞内免疫は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、優性ネガティブ変異体およ
び細胞内抗体（細胞内発現抗体）のような分子モジュレーターを細胞内での機能
性遺伝子発現を阻害するために利用する。以前の研究は、細胞内発現抗体（例え
ばｓＦｖおよびＦａｂ）が細胞の異なるコンパートメント（核、ＥＲ、細胞質、
ゴルジ、原形質膜、ミトコンドリアを含む）での発現を標的化する効力を示して
おり、ここで細胞内発現抗体は特異的経路で抗原または分子を妨げるように作用
する。［Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．、ＵＳＡ９０：７８８９−７８９３（１９９３）；Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：５９５−６０１（１９９４）；Ｃｈ
ｅｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：５
９３２−５９３６（１９９４）；Ｍｈａｓｈｉｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｅｍｂｏ
Ｊ １４：１５４２−１５５１（１９９５）；Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら、Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１１−１５（１９９７）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ
，Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９２：３１３
７−３１４１（１９９５）；Ｄｕａｎ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ５：１３１５−１３２４（１９９４）］。抗体は特異的な細胞コンパ
ートメント、例えば、ＥＲ、核、原形質膜の内表面、細胞質およびミトコンドリ
アに対して局在化し得る。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３；Ｍｈａｓｈ
ｉｋａｒら、１９９５；Ｂｉｏｃｃａら、１９９５参照）。
ルスおよび寄生生物の機能を妨げる重要な戦略として、ここ１０年の間に現れた
。細胞内免疫は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、優性ネガティブ変異体およ
び細胞内抗体（細胞内発現抗体）のような分子モジュレーターを細胞内での機能
性遺伝子発現を阻害するために利用する。以前の研究は、細胞内発現抗体（例え
ばｓＦｖおよびＦａｂ）が細胞の異なるコンパートメント（核、ＥＲ、細胞質、
ゴルジ、原形質膜、ミトコンドリアを含む）での発現を標的化する効力を示して
おり、ここで細胞内発現抗体は特異的経路で抗原または分子を妨げるように作用
する。［Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．、ＵＳＡ９０：７８８９−７８９３（１９９３）；Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：５９５−６０１（１９９４）；Ｃｈ
ｅｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：５
９３２−５９３６（１９９４）；Ｍｈａｓｈｉｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｅｍｂｏ
Ｊ １４：１５４２−１５５１（１９９５）；Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら、Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１１−１５（１９９７）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ
，Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９２：３１３
７−３１４１（１９９５）；Ｄｕａｎ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ５：１３１５−１３２４（１９９４）］。抗体は特異的な細胞コンパ
ートメント、例えば、ＥＲ、核、原形質膜の内表面、細胞質およびミトコンドリ
アに対して局在化し得る。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３；Ｍｈａｓｈ
ｉｋａｒら、１９９５；Ｂｉｏｃｃａら、１９９５参照）。
【００１７】 本発明は細胞内発現抗体を用いて、生来の免疫調節を変化させ（例えば、免疫
調節分子の原形質膜への輸送を阻害する）、それにより免疫応答を減少または防
止させる。あるいは、本発明は細胞内発現抗体を用いて、プロセスされたペプチ
ドのような抗原がレセプタータンパク質と相互作用する前にそれを細胞内で標的
化する。本発明の方法は、組織拒絶、自己免疫性疾患などの防止に有用である。
調節分子の原形質膜への輸送を阻害する）、それにより免疫応答を減少または防
止させる。あるいは、本発明は細胞内発現抗体を用いて、プロセスされたペプチ
ドのような抗原がレセプタータンパク質と相互作用する前にそれを細胞内で標的
化する。本発明の方法は、組織拒絶、自己免疫性疾患などの防止に有用である。
【００１８】 本発明の方法は、標的抗原、例えば、目的の特定のＩＲＭの表面発現を選択的
にブロックすることを可能とする。例えば、異なるタンパク質鎖に基づいて異な
るハプロタイプのＭＨＣクラスＩ分子が存在することが知られている。本発明者
らは、特定のＭＨＣクラスＩ分子を選択的に標的化するか、あるいは複数のクラ
スＩ分子を標的化するように、細胞内発現抗体を設計し得ることを見いだした。
これは細胞内発現抗体が結合するエピトープの選択によって達成される。例えば
、その抗体を生じさせる保存エピトープを用いて、複数の分子が単一の細胞内発
現抗体でノックアウトされる。逆に、特定の分子に対してユニークなエピトープ
を用いると、選択的結合がもたらされる。このタイプの抗体は標準的手段によっ
て、個別の目的に応じて容易に生成され得る。例えば、これらの分子およびペプ
チドの大部分の構造は、これらの分子の保存領域およびユニークな領域と同様に
、知られている。従って、これらの領域のいずれかを標的化することによって、
ＭＨＣ分子の最終的な発現が細胞表面上で防止される。これは、組織拒絶、自己
免疫疾患または骨髄移植のような特定免疫応答に関与することが知られている特
異的なクラスＩ分子に対して、とくに有用である。
にブロックすることを可能とする。例えば、異なるタンパク質鎖に基づいて異な
るハプロタイプのＭＨＣクラスＩ分子が存在することが知られている。本発明者
らは、特定のＭＨＣクラスＩ分子を選択的に標的化するか、あるいは複数のクラ
スＩ分子を標的化するように、細胞内発現抗体を設計し得ることを見いだした。
これは細胞内発現抗体が結合するエピトープの選択によって達成される。例えば
、その抗体を生じさせる保存エピトープを用いて、複数の分子が単一の細胞内発
現抗体でノックアウトされる。逆に、特定の分子に対してユニークなエピトープ
を用いると、選択的結合がもたらされる。このタイプの抗体は標準的手段によっ
て、個別の目的に応じて容易に生成され得る。例えば、これらの分子およびペプ
チドの大部分の構造は、これらの分子の保存領域およびユニークな領域と同様に
、知られている。従って、これらの領域のいずれかを標的化することによって、
ＭＨＣ分子の最終的な発現が細胞表面上で防止される。これは、組織拒絶、自己
免疫疾患または骨髄移植のような特定免疫応答に関与することが知られている特
異的なクラスＩ分子に対して、とくに有用である。
【００１９】 本発明の方法はまた、伝統的には免疫関連疾患とは言われていなかった他の疾
患の処置のためにＩＲＭを標的化するのにも有用である。例えば、近年、ＨＬＡ
−２レセプターがアルツハイマー病の初期発症に関連していることが示されてい
る。それゆえ、これらの分子を抗炎症剤で標的化して、アルツハイマー病のリス
クのある人々の処置がなされている。しかし、このような薬剤では健康の問題が
生じ得るが、本発明の方法では生じない。
患の処置のためにＩＲＭを標的化するのにも有用である。例えば、近年、ＨＬＡ
−２レセプターがアルツハイマー病の初期発症に関連していることが示されてい
る。それゆえ、これらの分子を抗炎症剤で標的化して、アルツハイマー病のリス
クのある人々の処置がなされている。しかし、このような薬剤では健康の問題が
生じ得るが、本発明の方法では生じない。
【００２０】 本発明の方法を用いてまた、他の分子（例えば、ＨＬＡ−２分子またはＣＤ２
８分子）を特異的に標的化し、そしてその発現を妨げ得るが、他の表面分子は影
響を受けないままにしておくことができる。
８分子）を特異的に標的化し、そしてその発現を妨げ得るが、他の表面分子は影
響を受けないままにしておくことができる。
【００２１】 本発明の他の好適な方法では、細胞内発現抗体を用いてＩＲＭの複数の遺伝子
座がノックアウトされる。すなわち、上で簡単に述べたように、細胞内発現抗体
を用いて、タンパク質のファミリー中の１つより多くの単一ＩＲＭを静止させる
ことができる。例えば、ＭＨＣクラスＩ分子には多数のハプロタイプが存在する
とはいえ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃのα３ドメインは保存され
る。このようなドメインはときどき単形性であるといわれる。単形性領域を標的
化することによって、種々の分子が標的化される。本発明の細胞内発現抗体は、
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃに共通のこのアルファ鎖上のエピトー
プに対して向けられるように設計され得る。そのようにすることによって、複数
のＭＨＣ分子の発現を有効にブロックし得る。あるいは、ユニークな多型エピト
ープを標的化することによって、特異的なＭＨＣ分子のみがブロックされる。選
択は個々の目標に依存する。
座がノックアウトされる。すなわち、上で簡単に述べたように、細胞内発現抗体
を用いて、タンパク質のファミリー中の１つより多くの単一ＩＲＭを静止させる
ことができる。例えば、ＭＨＣクラスＩ分子には多数のハプロタイプが存在する
とはいえ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃのα３ドメインは保存され
る。このようなドメインはときどき単形性であるといわれる。単形性領域を標的
化することによって、種々の分子が標的化される。本発明の細胞内発現抗体は、
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃに共通のこのアルファ鎖上のエピトー
プに対して向けられるように設計され得る。そのようにすることによって、複数
のＭＨＣ分子の発現を有効にブロックし得る。あるいは、ユニークな多型エピト
ープを標的化することによって、特異的なＭＨＣ分子のみがブロックされる。選
択は個々の目標に依存する。
【００２２】 上で簡単に論じたように、ＩＲＭが関与する経路には多数の成分が関与する。
細胞中のＩＲＭが関与する経路中の任意の成分（例えば抗原の提示）が、その細
胞の免疫応答を調節するために、本発明の方法によって標的化される。例えば、
ＭＨＣ−Ｉ経路はエレガントな経路であり、これには多数の分子が関与して、ペ
プチドがＭＨＣ−Ｉ分子と会合すること、そして次にこのＭＨＣ−Ｉ−ペプチド
複合体が細胞の表面に提示されることを保証する。抗原提示の最初の段階では、
ＭＨＣ−Ｉ分子に結合するペプチドが、プロテアソームによって仲介されるサイ
トゾルタンパク質の開裂によって生じる。これらのペプチドは、抗原プロセシン
グに関連するトランスポーター（ＴＡＰ）によってＥＲ中に転移する。ＴＡＰは
トランスポーターのＡＴＰ結合カセットファミリーのメンバーであり、２つの相
同なＭＨＣをコードするサブユニット、ＴＡＰ．１およびＴＡＰ．２から構成さ
れる。ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体のアセンブリはＥＲ中でＭＨＣクラスＩ
−β２−ミクログロブリンダイマーの形成によって開始され、そして分子カルネ
キシンおよびカルレチキュリンを含む。例えば、Ｏｒｔｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，第２７７巻、１３０６−１３０９（１９９７年８月２９日）参照。
このペプチドがＭＨＣ−Ｉに結合する前に、カルレチキュリンが会合したクラス
Ｉ分子がＴＡＰに結合する。この相互作用はタパシンと呼ばれる分子で仲介され
る（同上）。ＴＡＰが対立遺伝子特異的クラスＩ結合ペプチドを転移させた後、
クラスＩ分子はＴＡＰ複合体から解離する（同上）。このペプチドが結合した新
たにアセンブルしたＭＨＣ−Ｉ分子は次にエキソサイトーシス経路によって原形
質膜に輸送される。ペプチドはこのようにして、適切なＴ細胞レセプター（ＴＣ
Ｒ）を有するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。例えば、
Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第１７巻第３号、１
３１−１３７（１９９６年３月）；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈら、Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｎｅｔｉｃｓ、第４１巻、１７８−２２８（１９９５）参照。
細胞中のＩＲＭが関与する経路中の任意の成分（例えば抗原の提示）が、その細
胞の免疫応答を調節するために、本発明の方法によって標的化される。例えば、
ＭＨＣ−Ｉ経路はエレガントな経路であり、これには多数の分子が関与して、ペ
プチドがＭＨＣ−Ｉ分子と会合すること、そして次にこのＭＨＣ−Ｉ−ペプチド
複合体が細胞の表面に提示されることを保証する。抗原提示の最初の段階では、
ＭＨＣ−Ｉ分子に結合するペプチドが、プロテアソームによって仲介されるサイ
トゾルタンパク質の開裂によって生じる。これらのペプチドは、抗原プロセシン
グに関連するトランスポーター（ＴＡＰ）によってＥＲ中に転移する。ＴＡＰは
トランスポーターのＡＴＰ結合カセットファミリーのメンバーであり、２つの相
同なＭＨＣをコードするサブユニット、ＴＡＰ．１およびＴＡＰ．２から構成さ
れる。ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体のアセンブリはＥＲ中でＭＨＣクラスＩ
−β２−ミクログロブリンダイマーの形成によって開始され、そして分子カルネ
キシンおよびカルレチキュリンを含む。例えば、Ｏｒｔｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，第２７７巻、１３０６−１３０９（１９９７年８月２９日）参照。
このペプチドがＭＨＣ−Ｉに結合する前に、カルレチキュリンが会合したクラス
Ｉ分子がＴＡＰに結合する。この相互作用はタパシンと呼ばれる分子で仲介され
る（同上）。ＴＡＰが対立遺伝子特異的クラスＩ結合ペプチドを転移させた後、
クラスＩ分子はＴＡＰ複合体から解離する（同上）。このペプチドが結合した新
たにアセンブルしたＭＨＣ−Ｉ分子は次にエキソサイトーシス経路によって原形
質膜に輸送される。ペプチドはこのようにして、適切なＴ細胞レセプター（ＴＣ
Ｒ）を有するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。例えば、
Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第１７巻第３号、１
３１−１３７（１９９６年３月）；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈら、Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｎｅｔｉｃｓ、第４１巻、１７８−２２８（１９９５）参照。
【００２３】 ＭＨＣ経路のこれらの任意の成分、例えば、ＭＨＣのα鎖、β２ミクログロブ
リン分子、カルネキシンおよびカルレチキュリン、ＴＡＰ（ＴＡＰ．１およびＴ
ＡＰ．２を含む）、およびタパシン、プロテアソーム中でペプチドを分解する酵
素でさえ、あるいは特定のペプチドでさえ、本明細書で記載するように、注目す
る特定の細胞の免疫応答を調節するために細胞内発現抗体で標的化され得る。調
製された細胞内発現抗体はいずれも、成分が局在する特定のコンパートメントに
対して標的化されなければならない。例えば、ＭＨＣ合成のＥＲ成分を標的化す
るために、細胞内発現抗体はＥＲに向けられなければならず、そしてさらに後述
するように、適切なリーダー配列を含まなければならない。
リン分子、カルネキシンおよびカルレチキュリン、ＴＡＰ（ＴＡＰ．１およびＴ
ＡＰ．２を含む）、およびタパシン、プロテアソーム中でペプチドを分解する酵
素でさえ、あるいは特定のペプチドでさえ、本明細書で記載するように、注目す
る特定の細胞の免疫応答を調節するために細胞内発現抗体で標的化され得る。調
製された細胞内発現抗体はいずれも、成分が局在する特定のコンパートメントに
対して標的化されなければならない。例えば、ＭＨＣ合成のＥＲ成分を標的化す
るために、細胞内発現抗体はＥＲに向けられなければならず、そしてさらに後述
するように、適切なリーダー配列を含まなければならない。
【００２４】 例えば、ＴＡＰはペプチドをＥＲ中に効率的に輸送するために必要である。Ｔ
ＡＰはヘテロダイマーであり、ここで各サブユニットはＡＴＰ結合ドメインを有
する。これらのサブユニットが両方ともペプチド輸送のために必要である。ＡＴ
Ｐ加水分解もまたペプチドがＥＲ中に転移するために必要である。例えば、Ｈｉ
ｌｌ，Ａ．およびＰｌｏｅｇｈ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．，第９２巻、３４１−３４３頁（１９９５年１月）参照。従って、ＴＡＰサブ
ユニットの一方または両方に対する細胞内発現抗体はＴＡＰ分子のアセンブルを
妨げ、抗原ペプチドがＥＲ中へと輸送されることを有効にブロックする。これは
抗原とＭＨＣ分子との会合を妨げ、最終的には抗原が細胞表面上で提示されるの
を妨げる。あるいは、細胞内発現抗体はアセンブルしたＴＡＰ分子上の抗原結合
部位を標的化するように設計され得る。さらに他の実施態様では、細胞内発現抗
体を用いてＴＡＰ ＡＴＰ結合部位を標的化して、ペプチドがＥＲ中に転移する
ことを妨げ得る。
ＡＰはヘテロダイマーであり、ここで各サブユニットはＡＴＰ結合ドメインを有
する。これらのサブユニットが両方ともペプチド輸送のために必要である。ＡＴ
Ｐ加水分解もまたペプチドがＥＲ中に転移するために必要である。例えば、Ｈｉ
ｌｌ，Ａ．およびＰｌｏｅｇｈ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．，第９２巻、３４１−３４３頁（１９９５年１月）参照。従って、ＴＡＰサブ
ユニットの一方または両方に対する細胞内発現抗体はＴＡＰ分子のアセンブルを
妨げ、抗原ペプチドがＥＲ中へと輸送されることを有効にブロックする。これは
抗原とＭＨＣ分子との会合を妨げ、最終的には抗原が細胞表面上で提示されるの
を妨げる。あるいは、細胞内発現抗体はアセンブルしたＴＡＰ分子上の抗原結合
部位を標的化するように設計され得る。さらに他の実施態様では、細胞内発現抗
体を用いてＴＡＰ ＡＴＰ結合部位を標的化して、ペプチドがＥＲ中に転移する
ことを妨げ得る。
【００２５】 他の実施態様では、ＭＨＣ分子自体のアセンブルを、ＭＨＣアセンブルライン
における成分を特異的に標的化することによって妨げ得る。この場合、新たに合
成されたＭＨＣクラスＩ重鎖、β２−ミクログロブリン、カルネキシン、および
カルレチキュリンの間の相互作用が、これらの成分のうちのいずれか１つまたは
混合物を標的化することによって阻害され得る。例えば、カルネキシンに対する
細胞内発現抗体が本発明の教示に基づいて調製され得、そしてこれはカルネキシ
ンとＭＨＣサブユニットとの相互作用を妨げるためにＥＲ特異的配列を含む。
における成分を特異的に標的化することによって妨げ得る。この場合、新たに合
成されたＭＨＣクラスＩ重鎖、β２−ミクログロブリン、カルネキシン、および
カルレチキュリンの間の相互作用が、これらの成分のうちのいずれか１つまたは
混合物を標的化することによって阻害され得る。例えば、カルネキシンに対する
細胞内発現抗体が本発明の教示に基づいて調製され得、そしてこれはカルネキシ
ンとＭＨＣサブユニットとの相互作用を妨げるためにＥＲ特異的配列を含む。
【００２６】 同様に、ＭＨＣ分子のＴＡＰへの結合を妨げるために、タパシンとの相互作用
が、この分子をタパシン特異的細胞内発現抗体で標的化することによって妨げ得
る。この分子は最近、配列決定された。Ｏｒｔｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，第２７７巻、１３０６−１３０９（１９９７年８月２９日）。
が、この分子をタパシン特異的細胞内発現抗体で標的化することによって妨げ得
る。この分子は最近、配列決定された。Ｏｒｔｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，第２７７巻、１３０６−１３０９（１９９７年８月２９日）。
【００２７】 上記のように、抗原提示経路の最初の段階は、タンパク質のような分子のサイ
トゾル分解を伴う。分解は代表的にはタンパク質がポリペプチドユビキチンの複
数の分子に共有結合することを伴う。このプロセスは、そのタンパク質を２６Ｓ
プロテアソームによる加水分解のためにマークする。例えば、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ
，Ａ．Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６８巻、５２２−５２３（１９９５年４月２
８日）参照。ＭＨＣ−１経路に関与するプロテアソームの２つのサブユニット（
ＬＭＰ２およびＬＭＰ７）はＭＨＣ遺伝子座でコードされる。例えば、Ｒｏｃｋ
，Ｋ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ，第７８巻、７６１−７７１（１９９４年９月９日）参
照（その中に引用されている文献参照）。
トゾル分解を伴う。分解は代表的にはタンパク質がポリペプチドユビキチンの複
数の分子に共有結合することを伴う。このプロセスは、そのタンパク質を２６Ｓ
プロテアソームによる加水分解のためにマークする。例えば、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ
，Ａ．Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６８巻、５２２−５２３（１９９５年４月２
８日）参照。ＭＨＣ−１経路に関与するプロテアソームの２つのサブユニット（
ＬＭＰ２およびＬＭＰ７）はＭＨＣ遺伝子座でコードされる。例えば、Ｒｏｃｋ
，Ｋ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ，第７８巻、７６１−７７１（１９９４年９月９日）参
照（その中に引用されている文献参照）。
【００２８】 本発明の方法は、抗原提示のこの第１段階の成分を標的化するために用いられ
得る。例えば、プロテアソームとの相互作用を妨げるために、ユビキチンに対す
る細胞内発現抗体を用いて抗原性タンパク質のユビキチンへの結合を妨げ得る。
同様に、細胞内発現抗体を用いて、プロテアソームの２つのサブユニットＬＭＰ
２およびＬＭＰ７の一方または両方を標的化して、プロテアソームのアセンブリ
を妨げ得る。これらは、本発明の方法を用いて、細胞タンパク質分解からのペプ
チド産生を妨げるため、次いで、ＭＨＣ−１分子のアセンブルをブロックするた
めに利用され得る多数の標的のうちのいくつかの例である。（例えば、Ｒｏｃｋ
，Ｋ．Ｌ．（前出）参照） 同様に、異なるタイプの分子（例えば、異なるＭＨＣクラスＩ分子）に対する
本発明の細胞内発現抗体をカクテルに混合して、細胞上の複数の遺伝子座を選択
的に標的化し得る。この「カクテル」アプローチ（すなわち抗体の混合物）を用
いて、注目されるタンパク質を、それがレセプタータンパク質、ウイルスタンパ
ク質、または他の抗原であっても、静止し得る。抗体のカクテルの使用は種々の
タンパク質を一度で標的化することを可能にする。これはある範囲のレセプター
をノックアウトするのに有用であり、あるいは、抗体を回避し得る機能性の標的
タンパク質を産生する変異体が進化するのをより困難にするために有用である。
例えば、ＭＨＣ−１分子の種々のハプロタイプの非保存領域に対する抗体のカク
テルを用いて、複数の遺伝子座をノックアウトし得る。このような「カクテル」
は一緒に投与され得、あるいは同時トランスフェクションによって投与され得る
。同じ細胞内領域で約３つを超えないタンパク質が標的化されることが好ましく
、好ましくは２つを超えないタンパク質が標的化され、例えば、小胞体において
ＣＤ２８およびＨＬＡ１Ａが標的化される。他の細胞内標的が異なる細胞領域中
にある限りは（すなわち、核に対して小胞体）、それもまた抗体産生に悪影響を
与えずに標的化され得る。
得る。例えば、プロテアソームとの相互作用を妨げるために、ユビキチンに対す
る細胞内発現抗体を用いて抗原性タンパク質のユビキチンへの結合を妨げ得る。
同様に、細胞内発現抗体を用いて、プロテアソームの２つのサブユニットＬＭＰ
２およびＬＭＰ７の一方または両方を標的化して、プロテアソームのアセンブリ
を妨げ得る。これらは、本発明の方法を用いて、細胞タンパク質分解からのペプ
チド産生を妨げるため、次いで、ＭＨＣ−１分子のアセンブルをブロックするた
めに利用され得る多数の標的のうちのいくつかの例である。（例えば、Ｒｏｃｋ
，Ｋ．Ｌ．（前出）参照） 同様に、異なるタイプの分子（例えば、異なるＭＨＣクラスＩ分子）に対する
本発明の細胞内発現抗体をカクテルに混合して、細胞上の複数の遺伝子座を選択
的に標的化し得る。この「カクテル」アプローチ（すなわち抗体の混合物）を用
いて、注目されるタンパク質を、それがレセプタータンパク質、ウイルスタンパ
ク質、または他の抗原であっても、静止し得る。抗体のカクテルの使用は種々の
タンパク質を一度で標的化することを可能にする。これはある範囲のレセプター
をノックアウトするのに有用であり、あるいは、抗体を回避し得る機能性の標的
タンパク質を産生する変異体が進化するのをより困難にするために有用である。
例えば、ＭＨＣ−１分子の種々のハプロタイプの非保存領域に対する抗体のカク
テルを用いて、複数の遺伝子座をノックアウトし得る。このような「カクテル」
は一緒に投与され得、あるいは同時トランスフェクションによって投与され得る
。同じ細胞内領域で約３つを超えないタンパク質が標的化されることが好ましく
、好ましくは２つを超えないタンパク質が標的化され、例えば、小胞体において
ＣＤ２８およびＨＬＡ１Ａが標的化される。他の細胞内標的が異なる細胞領域中
にある限りは（すなわち、核に対して小胞体）、それもまた抗体産生に悪影響を
与えずに標的化され得る。
【００２９】 他の好適なカクテルは、同じ標的であるが、細胞内の種々の位置に存在する標
的に対する抗体のカクテルである。これは異なる局在化配列を用いて行われ得る
。それゆえ、ある標的がその抗体に１つの位置で結合せず、そして例えば、さら
にプロセスされる場合、これは次の位置で標的化され得る。例えば、標的ＭＨＣ
−Ｉレセプターと共に局在化配列を用いて、系のタンパク質または成分をそのプ
ロセシング経路の多数のポイントで標的化し得る。例えば、β−ミクログロブリ
ンを標的化する１つの抗体と、ＭＨＣ−Ｉレセプターのα鎖を標的化する第２の
抗体とを用いる。
的に対する抗体のカクテルである。これは異なる局在化配列を用いて行われ得る
。それゆえ、ある標的がその抗体に１つの位置で結合せず、そして例えば、さら
にプロセスされる場合、これは次の位置で標的化され得る。例えば、標的ＭＨＣ
−Ｉレセプターと共に局在化配列を用いて、系のタンパク質または成分をそのプ
ロセシング経路の多数のポイントで標的化し得る。例えば、β−ミクログロブリ
ンを標的化する１つの抗体と、ＭＨＣ−Ｉレセプターのα鎖を標的化する第２の
抗体とを用いる。
【００３０】 目的の他のＩＲＭはＣＤ１タンパク質を包含し、これはある点でＭＨＣ分子に
関連する。ＣＤ１分子はＭＨＣ分子のように多形性ではない。しかし、そのα１
およびα２ドメインでＭＨＣとわずかに相同である。ＣＤ１分子は胸腺中、異な
る組織中の抗原提示樹状細胞上、およびサイトカインで活性化された単球上で発
現される。Ｓｉｅｌｉｎｇ，Ｐ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６９巻、２２７
−２３０（１９９５年７月１４日）。ＣＤ１分子は異なるアイソタイプ（ＣＤ１
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）を含み、これは数種の哺乳類種において保存される
。Ｂｅｎｄｅｌｅｃ，Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６９巻、１８５−１８６頁（
１９９５年７月１４日）。アイソタイプＣＤ１ｂはペプチドよりもむしろ、リポ
グリカンのような脂質をＴ細胞に提示することが見いだされている。Ｂｅｎｄｅ
ｌｅｃ，Ａ．（前出）；Ｓｉｅｌｉｎｇ，Ｐ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６
９巻、２２７−２３０（１９９５年７月１４日）；Ｂｅｃｋｍａｎ．Ｅ．Ｍ．ら
、Ｎａｔｕｒｅ．第３７２巻、６９１−６９４（１９９４年１２月１５日）。Ｍ
ＨＣをコードする抗原プロセシング分子（例えばＴＡＰ）は、脂質の提示には必
要ではない。それゆえ、関与する他の分子がＣＤ１輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎ
ｇ）および脂質抗原プロセシングのために用いられる。Ｂｅｎｄｅｌｅｃ，Ａ．
（前出）。ペプチド結合モチーフが、ランダムペプチドディスプレイライブラリ
を可溶性の空の（ｅｍｐｔｙ）マウスＣＤ１（ｍＣＤ１）でスクリーニングする
ことによって見いだされている。Ｃａｓｔａｎｏ，Ａ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
，第２６９巻、２２３−２２６（１９９５年７月１４日）。ＣＤ１ｄはマウスお
よびラットで発現される唯一のアイソタイプであり、ペプチドに特異的に結合す
るはずである。Ｂｅｎｄｅｌｅｃ，Ａ．（前出）。
関連する。ＣＤ１分子はＭＨＣ分子のように多形性ではない。しかし、そのα１
およびα２ドメインでＭＨＣとわずかに相同である。ＣＤ１分子は胸腺中、異な
る組織中の抗原提示樹状細胞上、およびサイトカインで活性化された単球上で発
現される。Ｓｉｅｌｉｎｇ，Ｐ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６９巻、２２７
−２３０（１９９５年７月１４日）。ＣＤ１分子は異なるアイソタイプ（ＣＤ１
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）を含み、これは数種の哺乳類種において保存される
。Ｂｅｎｄｅｌｅｃ，Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６９巻、１８５−１８６頁（
１９９５年７月１４日）。アイソタイプＣＤ１ｂはペプチドよりもむしろ、リポ
グリカンのような脂質をＴ細胞に提示することが見いだされている。Ｂｅｎｄｅ
ｌｅｃ，Ａ．（前出）；Ｓｉｅｌｉｎｇ，Ｐ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６
９巻、２２７−２３０（１９９５年７月１４日）；Ｂｅｃｋｍａｎ．Ｅ．Ｍ．ら
、Ｎａｔｕｒｅ．第３７２巻、６９１−６９４（１９９４年１２月１５日）。Ｍ
ＨＣをコードする抗原プロセシング分子（例えばＴＡＰ）は、脂質の提示には必
要ではない。それゆえ、関与する他の分子がＣＤ１輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎ
ｇ）および脂質抗原プロセシングのために用いられる。Ｂｅｎｄｅｌｅｃ，Ａ．
（前出）。ペプチド結合モチーフが、ランダムペプチドディスプレイライブラリ
を可溶性の空の（ｅｍｐｔｙ）マウスＣＤ１（ｍＣＤ１）でスクリーニングする
ことによって見いだされている。Ｃａｓｔａｎｏ，Ａ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
，第２６９巻、２２３−２２６（１９９５年７月１４日）。ＣＤ１ｄはマウスお
よびラットで発現される唯一のアイソタイプであり、ペプチドに特異的に結合す
るはずである。Ｂｅｎｄｅｌｅｃ，Ａ．（前出）。
【００３１】 本発明の１つの実施態様では、細胞内発現抗体は、ＣＤ１分子が細胞表面で発
現するのを妨げるために、ＣＤ１分子を標的化する。ＭＨＣ−１分子に関して上
で論じたように、ＩＲＭは多数の異なるやり方で標的化され得る。例えば、アイ
ソタイプの保存領域を標的化して、ＣＤ１分子の全範囲をノックアウトし得る。
あるいは、特定のアイソタイプのユニークな領域を標的化して、１つの特定のア
イソタイプをノックアウトし得る。
現するのを妨げるために、ＣＤ１分子を標的化する。ＭＨＣ−１分子に関して上
で論じたように、ＩＲＭは多数の異なるやり方で標的化され得る。例えば、アイ
ソタイプの保存領域を標的化して、ＣＤ１分子の全範囲をノックアウトし得る。
あるいは、特定のアイソタイプのユニークな領域を標的化して、１つの特定のア
イソタイプをノックアウトし得る。
【００３２】 他の例では、ＣＤ１抗原提示経路が調節され得る。抗原提示を妨げるために、
例えばＣＤ１分子のアセンブリ、抗原のＣＤ１分子への結合、またはＣＤ１抗原
複合体の細胞表面への輸送を妨げることによって、この経路の成分に対する細胞
内発現抗体を標的化し得る。
例えばＣＤ１分子のアセンブリ、抗原のＣＤ１分子への結合、またはＣＤ１抗原
複合体の細胞表面への輸送を妨げることによって、この経路の成分に対する細胞
内発現抗体を標的化し得る。
【００３３】 さらに他の実施態様では、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびそのＡＰ経路、ならび
にその合成経路が本発明の方法を用いて標的化され得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子
は抗原性ペプチドを細胞のエンドソーム／リソソーム成分中で獲得する。Ｔｅｙ
ｔｏｎ，Ｌ．ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、第４巻、第５号、４４
１−４４７（１９９２）。ＭＨＣクラスＩＩ分子は２つの同一ではない糖タンパ
ク質、αおよびβ鎖で構成される。第２の膜糖タンパク質である不変鎖（Ｉｉ）
はＥＲ中でαおよびβ鎖と複合して、結合ペプチドの非存在下でＭＨＣ−ＩＩを
安定化する。Ｉｉはまた、ＭＨＣＩＩをエンドサイトーシス経路へと導く。Ｇｈ
ｏｓｈ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７８巻、４５７−４６２頁（１９９５年１
１月）；Ｔｕｌｐ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，第３６９巻、１２０−１２６（１９
９４年５月）。これはエンドソーム中で、抗原性ペプチドがＭＨＣ−ＩＩ分子上
にロードされる前に、タンパク質加水分解によって除去される。（残基８１−１
０４内の）２０−２４残基Ｉｉフラグメントの重なったセットはＣＬＩＰ（クラ
スＩＩ関連不変鎖ペプチド）と呼ばれる。このＣＬＩＰセグメントはＩｉおよび
ＭＨＣ−ＩＩ分子の機能化に重要な役割を有する。例えば、ＣＬＩＰはインビボ
でのαβアセンブリに必要であることが研究で示されている（同上）。ＣＬＩＰ
はＭＨＣ−ＩＩ分子からペプチドローディングの前に除去されなければならない
。これはエンドソーム／リソソームコンパートメント中で起こると考えられてい
る。次に不変鎖が分解される。Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．（前出）。
にその合成経路が本発明の方法を用いて標的化され得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子
は抗原性ペプチドを細胞のエンドソーム／リソソーム成分中で獲得する。Ｔｅｙ
ｔｏｎ，Ｌ．ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、第４巻、第５号、４４
１−４４７（１９９２）。ＭＨＣクラスＩＩ分子は２つの同一ではない糖タンパ
ク質、αおよびβ鎖で構成される。第２の膜糖タンパク質である不変鎖（Ｉｉ）
はＥＲ中でαおよびβ鎖と複合して、結合ペプチドの非存在下でＭＨＣ−ＩＩを
安定化する。Ｉｉはまた、ＭＨＣＩＩをエンドサイトーシス経路へと導く。Ｇｈ
ｏｓｈ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７８巻、４５７−４６２頁（１９９５年１
１月）；Ｔｕｌｐ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，第３６９巻、１２０−１２６（１９
９４年５月）。これはエンドソーム中で、抗原性ペプチドがＭＨＣ−ＩＩ分子上
にロードされる前に、タンパク質加水分解によって除去される。（残基８１−１
０４内の）２０−２４残基Ｉｉフラグメントの重なったセットはＣＬＩＰ（クラ
スＩＩ関連不変鎖ペプチド）と呼ばれる。このＣＬＩＰセグメントはＩｉおよび
ＭＨＣ−ＩＩ分子の機能化に重要な役割を有する。例えば、ＣＬＩＰはインビボ
でのαβアセンブリに必要であることが研究で示されている（同上）。ＣＬＩＰ
はＭＨＣ−ＩＩ分子からペプチドローディングの前に除去されなければならない
。これはエンドソーム／リソソームコンパートメント中で起こると考えられてい
る。次に不変鎖が分解される。Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．（前出）。
【００３４】 他の目的のＩＲＭはＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ２８分子およびＣＤ４０分子
ＣＤ−１分子を包含する。ＭＨＣクラスＩＩ分子はＭＨＣクラスＩＩ分子に関与
し、免疫応答に関与する細胞上に主として位置し、そしてヘルパーＴ細胞で認識
され、これは免疫応答に関与する細胞、例えばＢ細胞および抗原提示細胞（ＡＰ
Ｃ）と相互作用する。ヘルパーＴ細胞の活性化が他のリンパ球の抗原に対する応
答を刺激するために必要とされる。活性化は、Ｔ細胞がＡＰＣ上のＭＨＣクラス
ＩＩ分子に結合した抗原を認識したときに起こる。本発明の方法は、ＭＨＣクラ
スＩＩ分子の仲介およびヘルパーＴ細胞の活性化の調節に有用である。ＣＤ２８
およびＢ７レセプターは同時刺激分子であり、これは至適なＴ細胞活性化のため
の同時刺激シグナルの引き金を引く。ＣＤ４０は、Ｂ細胞における多数の効果を
活性化するレセプターである。これらのレセプターに対する細胞内発現抗体を本
発明の方法に従って生成および使用して、これらのレセプターの表面発現を特異
的に標的化および制御し得る。
ＣＤ−１分子を包含する。ＭＨＣクラスＩＩ分子はＭＨＣクラスＩＩ分子に関与
し、免疫応答に関与する細胞上に主として位置し、そしてヘルパーＴ細胞で認識
され、これは免疫応答に関与する細胞、例えばＢ細胞および抗原提示細胞（ＡＰ
Ｃ）と相互作用する。ヘルパーＴ細胞の活性化が他のリンパ球の抗原に対する応
答を刺激するために必要とされる。活性化は、Ｔ細胞がＡＰＣ上のＭＨＣクラス
ＩＩ分子に結合した抗原を認識したときに起こる。本発明の方法は、ＭＨＣクラ
スＩＩ分子の仲介およびヘルパーＴ細胞の活性化の調節に有用である。ＣＤ２８
およびＢ７レセプターは同時刺激分子であり、これは至適なＴ細胞活性化のため
の同時刺激シグナルの引き金を引く。ＣＤ４０は、Ｂ細胞における多数の効果を
活性化するレセプターである。これらのレセプターに対する細胞内発現抗体を本
発明の方法に従って生成および使用して、これらのレセプターの表面発現を特異
的に標的化および制御し得る。
【００３５】 ＭＨＣ−ＩＩ経路の成分は、本明細書に記載のように細胞内発現抗体を用いて
標的化され得る。例えば、α鎖またはβ鎖に対して特異的なＥＲに対する細胞内
発現抗体は、ＭＨＣ−ＩＩ分子の組立を妨げる。他の実施態様では、細胞内発現
抗体はＣＬＩＰが通常結合するαβ複合体に結合するように、すなわちＣＬＩＰ
と相同に設計され得る。このような細胞内発現抗体は抗原性ペプチドのＭＨＣ−
ＩＩ分子への結合を妨げるはずである。
標的化され得る。例えば、α鎖またはβ鎖に対して特異的なＥＲに対する細胞内
発現抗体は、ＭＨＣ−ＩＩ分子の組立を妨げる。他の実施態様では、細胞内発現
抗体はＣＬＩＰが通常結合するαβ複合体に結合するように、すなわちＣＬＩＰ
と相同に設計され得る。このような細胞内発現抗体は抗原性ペプチドのＭＨＣ−
ＩＩ分子への結合を妨げるはずである。
【００３６】 本発明のさらに他の実施態様では、本発明の細胞内発現抗体を用いて特定の組
織または身体の部分における免疫応答をノックアウトして、それを細胞移植また
は組織移植のために調製し得る。このような実施態様では、構成ベクターを用い
て目的の領域、例えば、関節、胸膜腔または中枢神経系における標的細胞に形質
導入する。細胞内発現抗体を細胞に導入し、そして宿主細胞における目的のＩＲ
Ｍの発現を妨げ、その間、ベクターは細胞内発現抗体を産生し続ける。移植が行
われた後、宿主細胞は移植組織を拒絶しない。特定の時間の後、ベクターはもは
や細胞内発現抗体を産生せず、そして宿主細胞はゆっくりとＩＲＭを発現し始め
るが、順応が生じ、その結果、細胞はその正常な機能を回復させ、そして移植さ
れた細胞または組織を順応させる。あるいは、移植のための器官または組織は、
エクスビボで目的の細胞内発現抗体で灌流され得る。例えば、細胞を所望のベク
ターで予め調製するために、移植の前に腎臓が灌流される。同様に、β島細胞を
目的の細胞内発現抗体で形質導入し得、そしてこれを膵臓に注入し得る。
織または身体の部分における免疫応答をノックアウトして、それを細胞移植また
は組織移植のために調製し得る。このような実施態様では、構成ベクターを用い
て目的の領域、例えば、関節、胸膜腔または中枢神経系における標的細胞に形質
導入する。細胞内発現抗体を細胞に導入し、そして宿主細胞における目的のＩＲ
Ｍの発現を妨げ、その間、ベクターは細胞内発現抗体を産生し続ける。移植が行
われた後、宿主細胞は移植組織を拒絶しない。特定の時間の後、ベクターはもは
や細胞内発現抗体を産生せず、そして宿主細胞はゆっくりとＩＲＭを発現し始め
るが、順応が生じ、その結果、細胞はその正常な機能を回復させ、そして移植さ
れた細胞または組織を順応させる。あるいは、移植のための器官または組織は、
エクスビボで目的の細胞内発現抗体で灌流され得る。例えば、細胞を所望のベク
ターで予め調製するために、移植の前に腎臓が灌流される。同様に、β島細胞を
目的の細胞内発現抗体で形質導入し得、そしてこれを膵臓に注入し得る。
【００３７】 多くの場合、抗原がＩＲＭ（例えばＭＨＣ−１分子）と結合する前に、抗原自
体をノックアウトして、細胞表面上での提示を妨げることが所望される。このよ
うな場合、抗原がペプチドであれ、またはその分解産物であれ、この抗原に対す
る細胞内発現抗体を用いて、抗原のＩＲＭに対する結合を選択的に妨げ得る。細
胞内発現抗体は、適切なリーダー配列を用いることによって、異なる細胞コンパ
ートメントを標的化して、抗原提示経路に沿った種々の時点で抗原を妨害し得る
。例えば、ＳＩＩＮＦＥＫＬは卵白アルブミンの既知の細胞分解産物である。卵
白アルブミンをサイトゾル中に導入すると、そのタンパク質加水分解プロセスお
よびＭＨＣ−１分子上での提示が導かれることが知られている。Ｍｏｏｒｅら、
Ｃｅｌｌ，第５４巻、７７７−７８５（１９８８）；Ｒｏｃｋら、Ｃｅｌｌ、第
７８巻、７６１−７７１（１９９４）。アルブミンのような抗原は、プロテオソ
ームによる分解の前にサイトゾル中で標的化され得る。分解の後、分解産物（例
えばＳＩＩＮＦＥＫＬ）を、ＴＡＰとの結合の前に、またはＥＲ中で、ＭＨＣ−
１分子との結合の前に標的化し得る。細胞内発現抗体の抗原への結合は、細胞表
面上での抗原の提示を妨げる。
体をノックアウトして、細胞表面上での提示を妨げることが所望される。このよ
うな場合、抗原がペプチドであれ、またはその分解産物であれ、この抗原に対す
る細胞内発現抗体を用いて、抗原のＩＲＭに対する結合を選択的に妨げ得る。細
胞内発現抗体は、適切なリーダー配列を用いることによって、異なる細胞コンパ
ートメントを標的化して、抗原提示経路に沿った種々の時点で抗原を妨害し得る
。例えば、ＳＩＩＮＦＥＫＬは卵白アルブミンの既知の細胞分解産物である。卵
白アルブミンをサイトゾル中に導入すると、そのタンパク質加水分解プロセスお
よびＭＨＣ−１分子上での提示が導かれることが知られている。Ｍｏｏｒｅら、
Ｃｅｌｌ，第５４巻、７７７−７８５（１９８８）；Ｒｏｃｋら、Ｃｅｌｌ、第
７８巻、７６１−７７１（１９９４）。アルブミンのような抗原は、プロテオソ
ームによる分解の前にサイトゾル中で標的化され得る。分解の後、分解産物（例
えばＳＩＩＮＦＥＫＬ）を、ＴＡＰとの結合の前に、またはＥＲ中で、ＭＨＣ−
１分子との結合の前に標的化し得る。細胞内発現抗体の抗原への結合は、細胞表
面上での抗原の提示を妨げる。
【００３８】 同様に、上述のように、ベクターは、抗原を発現するために、所望のＤＮＡセ
グメントを特定の細胞に送達するのに有用である。この抗原は次に所望の免疫応
答を引き起こす。しかし、いくつかの例では、ベクター自体が免疫反応を発生さ
せ、これが所望の免疫反応をマスクする。このような反応では、ベクターは分解
され、そしてウイルスペプチドがＭＨＣ−１分子を介して感染細胞の表面上でＴ
細胞に提示される。これはウイルスペプチド／抗原に対する免疫反応を引き起こ
し、これは所望の反応を妨害する。本発明の他の実施態様では、細胞内発現抗体
を用いて、細胞内で妨害するウイルスペプチドと相互作用させ、これらのペプチ
ドが細胞の表面に輸送されることをブロックする。すなわち、細胞内発現抗体は
これらのペプチドとＭＨＣ−１分子との相互作用を阻害し、これらの抗原が細胞
表面で提示されることを妨げ、そして所望されない免疫応答を妨げる。
グメントを特定の細胞に送達するのに有用である。この抗原は次に所望の免疫応
答を引き起こす。しかし、いくつかの例では、ベクター自体が免疫反応を発生さ
せ、これが所望の免疫反応をマスクする。このような反応では、ベクターは分解
され、そしてウイルスペプチドがＭＨＣ−１分子を介して感染細胞の表面上でＴ
細胞に提示される。これはウイルスペプチド／抗原に対する免疫反応を引き起こ
し、これは所望の反応を妨害する。本発明の他の実施態様では、細胞内発現抗体
を用いて、細胞内で妨害するウイルスペプチドと相互作用させ、これらのペプチ
ドが細胞の表面に輸送されることをブロックする。すなわち、細胞内発現抗体は
これらのペプチドとＭＨＣ−１分子との相互作用を阻害し、これらの抗原が細胞
表面で提示されることを妨げ、そして所望されない免疫応答を妨げる。
【００３９】 細胞に形質導入するための広範囲なアプローチが用いられ得、これにはウイル
スベクター、「裸の」ＤＮＡ、アジュバントで補助されたＤＮＡ、遺伝子銃、カ
テーテルなどが含まれる。例えば、目的の抗原上のＩＲＭに対する細胞内発現抗
体を細胞に形質導入するために、レトロウイルスベクターもまた用いられ得る。
例えば、本発明者らはｓＦｖｈＭＨＣ−１をマウスＭａｌｏｎｅｙレトロウイル
スＬＮベクター中にクローニングした［Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、第１５８巻（１９９４）］。このレトロウイルス構築物を用いて、細
胞を目的のＩＲＭに対する細胞内発現抗体で感染させ得る。本発明を実施するの
に有用な他のベクター系はアデノウイルスおよびＨＩＶ−１に基づくベクター、
例えば、偽型ＨＩＶ−１を包含する。これらのベクターのｓＦｖＭＨＣ−１構築
物は、ヒトの造血および非造血細胞系の形質導入を可能にする。
スベクター、「裸の」ＤＮＡ、アジュバントで補助されたＤＮＡ、遺伝子銃、カ
テーテルなどが含まれる。例えば、目的の抗原上のＩＲＭに対する細胞内発現抗
体を細胞に形質導入するために、レトロウイルスベクターもまた用いられ得る。
例えば、本発明者らはｓＦｖｈＭＨＣ−１をマウスＭａｌｏｎｅｙレトロウイル
スＬＮベクター中にクローニングした［Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、第１５８巻（１９９４）］。このレトロウイルス構築物を用いて、細
胞を目的のＩＲＭに対する細胞内発現抗体で感染させ得る。本発明を実施するの
に有用な他のベクター系はアデノウイルスおよびＨＩＶ−１に基づくベクター、
例えば、偽型ＨＩＶ−１を包含する。これらのベクターのｓＦｖＭＨＣ−１構築
物は、ヒトの造血および非造血細胞系の形質導入を可能にする。
【００４０】 ＩＲＭ、例えばＭＨＣ−１分子、またはその経路が細胞中でダウンレギュレー
トまたは阻害される細胞はまた、ワクチンおよび他の治療分子のキャリアとして
有用である。なぜなら、これらの細胞の表面上に免疫調節分子が欠けていること
により、これらの細胞のインビボでの生存率が延長され得るからである。
トまたは阻害される細胞はまた、ワクチンおよび他の治療分子のキャリアとして
有用である。なぜなら、これらの細胞の表面上に免疫調節分子が欠けていること
により、これらの細胞のインビボでの生存率が延長され得るからである。
【００４１】 本発明において使用される、目的のＩＲＭまたは抗原に対する抗体は、当該分
野で公知の方法によって得られ得る。例えば、単鎖抗体はＰＣＴ／ＵＳ９３／０
６７３５（１９９２年１月１７日出願）および米国特許出願第０８／３５０，２
１５号（１９９４年１２月６日出願）の教示に従って調製され、これらは本明細
書中に参考として援用される。１つの実施態様では、抗体は、標的細胞のＥＲの
内腔に指向され、かつその中に残留するように構築される。このような構築物は
、細胞内発現抗体がＥＲ残留シグナル（例えばＫＤＥＬ）を含むように、公知の
方法によって容易に達成される。ＭＨＣ−１分子に対するＥＲ発現細胞内発現抗
体のＡＴＣＣ ＨＢ９４ハイブリドーマ細胞（融合名ＢＢ７．７、抗ＨＬＡ−Ａ
、Ｂ、Ｃ）を用いた構築について示した例を以下に示す。この教示および公知の
技術に基づいて、他のＩＲＭに対する細胞内発現抗体（例えばｓＦｖ）が当業者
によって容易に得られ得る。
野で公知の方法によって得られ得る。例えば、単鎖抗体はＰＣＴ／ＵＳ９３／０
６７３５（１９９２年１月１７日出願）および米国特許出願第０８／３５０，２
１５号（１９９４年１２月６日出願）の教示に従って調製され、これらは本明細
書中に参考として援用される。１つの実施態様では、抗体は、標的細胞のＥＲの
内腔に指向され、かつその中に残留するように構築される。このような構築物は
、細胞内発現抗体がＥＲ残留シグナル（例えばＫＤＥＬ）を含むように、公知の
方法によって容易に達成される。ＭＨＣ−１分子に対するＥＲ発現細胞内発現抗
体のＡＴＣＣ ＨＢ９４ハイブリドーマ細胞（融合名ＢＢ７．７、抗ＨＬＡ−Ａ
、Ｂ、Ｃ）を用いた構築について示した例を以下に示す。この教示および公知の
技術に基づいて、他のＩＲＭに対する細胞内発現抗体（例えばｓＦｖ）が当業者
によって容易に得られ得る。
【００４２】 標的分子は、動物および植物を含む多様な宿主中に存在し得る。好ましくは、
宿主は動物であり、そしてより好ましくは、その種は、家禽、ブタ、蓄牛、雌ウ
シ、ヒツジなどのような産業的な重要性を有するものである。最も好ましくは、
種はヒトである。
宿主は動物であり、そしてより好ましくは、その種は、家禽、ブタ、蓄牛、雌ウ
シ、ヒツジなどのような産業的な重要性を有するものである。最も好ましくは、
種はヒトである。
【００４３】 上述のように、本発明の１つの好適な実施態様では、細胞内発現抗体は目的の
ＩＲＭまたは抗原に対する単鎖抗体（ｓＦｖ）である。抗体フラグメントの三次
元構造のＸ腺結晶学による決定により、可変ドメインが各々折り畳まれて、密に
パッキングされたβシートの９つの鎖から構成される特徴的な構造になることが
理解されている。この構造は、ＶHおよびＶLドメインの配列のバリエーションに
もかかわらず維持される［Ｄｅｐｒｅｖａｌ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１０２：６５７（１９７６）；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．１０：３５（１９７７）］。抗体一次配列データの分析により、２つの
クラスの可変領域配列、すなわち超可変配列およびフレームワーク配列の存在が
確立された［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ、第４版、米国
保険社会福祉省（１９８７）］。フレームワーク配列は、ＶHおよびＶLドメイン
のβシートの正確な折り畳み、ならびにドメインを一緒にさせる鎖間相互作用を
担う。各可変ドメインは、ループ様である３つの超可変配列を含む。可変領域の
６つの超可変配列（３つがＶH由来であり、そして３つがＶL由来である）は、抗
原結合部位を形成し、そして相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる。
ＩＲＭまたは抗原に対する単鎖抗体（ｓＦｖ）である。抗体フラグメントの三次
元構造のＸ腺結晶学による決定により、可変ドメインが各々折り畳まれて、密に
パッキングされたβシートの９つの鎖から構成される特徴的な構造になることが
理解されている。この構造は、ＶHおよびＶLドメインの配列のバリエーションに
もかかわらず維持される［Ｄｅｐｒｅｖａｌ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１０２：６５７（１９７６）；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．１０：３５（１９７７）］。抗体一次配列データの分析により、２つの
クラスの可変領域配列、すなわち超可変配列およびフレームワーク配列の存在が
確立された［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ、第４版、米国
保険社会福祉省（１９８７）］。フレームワーク配列は、ＶHおよびＶLドメイン
のβシートの正確な折り畳み、ならびにドメインを一緒にさせる鎖間相互作用を
担う。各可変ドメインは、ループ様である３つの超可変配列を含む。可変領域の
６つの超可変配列（３つがＶH由来であり、そして３つがＶL由来である）は、抗
原結合部位を形成し、そして相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる。
【００４４】 目的のＶHおよびＶL鎖の両方に対する可変領域遺伝子をクローニングすること
によって、これらのタンパク質を細菌中で発現し、そしてその機能を迅速に試験
することが可能となる。１つの方法はハイブリドーマｍＲＮＡまたは脾臓ｍＲＮ
Ａをこのような遺伝子のＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いることによる［Ｈ
ｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６；１２７６（１９８９）］。例えば、細胞内
発現抗体はマウスモノクローナルハイブリドーマ由来であり得る［Ｒｉｃｈａｒ
ｄｓｏｎ Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９
２巻：３１３７−３１４１（１９９５）；Ｂｉｏｃｃａ Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ、１９７：４２２−４２７（１
９９３）Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１５４２−
１５５１（１９９５）］。これらのハイブリドーマは、細胞内発現抗体の構築の
ための詳しく特徴づけられた試薬の信頼性のある供給源を提供し、そしてそのエ
ピトープの反応性および親和性が先に特徴づけられている場合、特に有用である
。細胞内発現抗体構築物のための他の供給源は、ヒトモノクローナル抗体産生細
胞株の使用を包含する。［Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３；Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｙ．ら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５９３２−５９３６
（１９９４）］。他の例は、抗体ファージディスプレイ技術を使用して標的分子
上の異なるエピトープに対する新たな細胞内発現抗体を構築することを包含する
。［Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ８８：１０１３４−１０１３７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．
Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １３０：４１−６８（１９９２）；Ｗｉｎｔ
ｅｒ Ｇ．ら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：４３３−４５５（１
９９４）；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１６０
０７−１６０１０（１９９２）；Ｎｉｓｓｉｍ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ １３：
６９２−６９８（１９９４）；Ｖａｕｇｈａｎ Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏ １４：３０９−３１４（１９９６）；Ｍａｒｋｓ Ｃ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇ Ｊ Ｍｅｄ ３３５：７３０−７３３（１９９６）］。例えば、非常に大き
な天然ヒトｓＦｖライブラリーが作製されており、そして作製され得、大きな供
給源または過剰な標的分子に対する再配列された抗体遺伝子を提供し得る。より
小さなライブラリーが、自己免疫［Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ Ｓ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ １５１：２８３９−２８５１（１９９３）；Ｂａｒｂａｓ Ｓ．Ｍ．ら
、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：２５２９−２５３３
（１９９５）］または感染性疾患［Ｂａｒｂａｓ Ｃ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：９３３９−９３４３（１９９２）；Ｚ
ｅｂｅｄｅｅ Ｓ．Ｌ．ら、、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
８９：３１７５−３１７９（１９９２）］の個体から、疾患特異的抗体を単離
するために構築され得る。
によって、これらのタンパク質を細菌中で発現し、そしてその機能を迅速に試験
することが可能となる。１つの方法はハイブリドーマｍＲＮＡまたは脾臓ｍＲＮ
Ａをこのような遺伝子のＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いることによる［Ｈ
ｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６；１２７６（１９８９）］。例えば、細胞内
発現抗体はマウスモノクローナルハイブリドーマ由来であり得る［Ｒｉｃｈａｒ
ｄｓｏｎ Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９
２巻：３１３７−３１４１（１９９５）；Ｂｉｏｃｃａ Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ、１９７：４２２−４２７（１
９９３）Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１５４２−
１５５１（１９９５）］。これらのハイブリドーマは、細胞内発現抗体の構築の
ための詳しく特徴づけられた試薬の信頼性のある供給源を提供し、そしてそのエ
ピトープの反応性および親和性が先に特徴づけられている場合、特に有用である
。細胞内発現抗体構築物のための他の供給源は、ヒトモノクローナル抗体産生細
胞株の使用を包含する。［Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３；Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｙ．ら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５９３２−５９３６
（１９９４）］。他の例は、抗体ファージディスプレイ技術を使用して標的分子
上の異なるエピトープに対する新たな細胞内発現抗体を構築することを包含する
。［Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ８８：１０１３４−１０１３７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．
Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １３０：４１−６８（１９９２）；Ｗｉｎｔ
ｅｒ Ｇ．ら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：４３３−４５５（１
９９４）；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１６０
０７−１６０１０（１９９２）；Ｎｉｓｓｉｍ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ １３：
６９２−６９８（１９９４）；Ｖａｕｇｈａｎ Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏ １４：３０９−３１４（１９９６）；Ｍａｒｋｓ Ｃ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇ Ｊ Ｍｅｄ ３３５：７３０−７３３（１９９６）］。例えば、非常に大き
な天然ヒトｓＦｖライブラリーが作製されており、そして作製され得、大きな供
給源または過剰な標的分子に対する再配列された抗体遺伝子を提供し得る。より
小さなライブラリーが、自己免疫［Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ Ｓ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ １５１：２８３９−２８５１（１９９３）；Ｂａｒｂａｓ Ｓ．Ｍ．ら
、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：２５２９−２５３３
（１９９５）］または感染性疾患［Ｂａｒｂａｓ Ｃ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：９３３９−９３４３（１９９２）；Ｚ
ｅｂｅｄｅｅ Ｓ．Ｌ．ら、、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
８９：３１７５−３１７９（１９９２）］の個体から、疾患特異的抗体を単離
するために構築され得る。
【００４５】 細胞内発現抗体の他の供給源としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を対応す
るマウス遺伝子座の代わりに含むトランスジェニックマウス、ならびにヒト抗原
特異的抗体を分泌する安定なハイブリドーマが挙げられる。［Ｌｏｎｂｅｒｇ，
Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（ｌ９９４）；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ
．Ｌ．ら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ７：ｌ３−２１（ｌ９９４）］。このようなト
ランスジェニック動物は、従来のハイブリドーマ技術、またはファージディスプ
レイ技術との組み合わせのいずれかによって、ヒト抗体遺伝子の他の供給源を提
供する。抗原結合部位の親和性および微細な特異性を操作するためのインビトロ
手順が報告されており、これらの手順としては、レパートリークローニング［Ｃ
ｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）
；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１−５９７（１
９９１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７
３４（ｌ９９３）］、インビトロ親和性成熟［Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｇｒａｍ Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：３５７６−３５８０（ｌ９９２）
］、半合成ライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．（前出）；Ｂａｒｂ
ａｓ，Ｃ．Ｆ．（前出）：Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １
５１：４６３１−４６５９（ｌ９９３）］およびガイドされた選択［Ｊｅｓｐｅ
ｒｓ，Ｌ．Ｓ．ら，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ １２：８９９−９０３（１９９４）］が
挙げられる。これらの組換えＤＮＡに基づくストラテジーのための開始物質は、
マウス脾臓由来のＲＮＡ［Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．（前出）］およびヒト末梢血
リンパ球［Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ら（前出）；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ら（
前出）；Ｍａｒｃｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（前出）；Ｂｉｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｐｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２（１９
９１）］およびＨＩＶ−１感染ドナー由来のリンパ系器官および骨髄［Ｂｕｒｔ
ｏｎ．Ｄ．Ｒ．ら（前出）：Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：９３３９−９３４３（１９９２）］を含む。
るマウス遺伝子座の代わりに含むトランスジェニックマウス、ならびにヒト抗原
特異的抗体を分泌する安定なハイブリドーマが挙げられる。［Ｌｏｎｂｅｒｇ，
Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（ｌ９９４）；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ
．Ｌ．ら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ７：ｌ３−２１（ｌ９９４）］。このようなト
ランスジェニック動物は、従来のハイブリドーマ技術、またはファージディスプ
レイ技術との組み合わせのいずれかによって、ヒト抗体遺伝子の他の供給源を提
供する。抗原結合部位の親和性および微細な特異性を操作するためのインビトロ
手順が報告されており、これらの手順としては、レパートリークローニング［Ｃ
ｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）
；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１−５９７（１
９９１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７
３４（ｌ９９３）］、インビトロ親和性成熟［Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｇｒａｍ Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：３５７６−３５８０（ｌ９９２）
］、半合成ライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．（前出）；Ｂａｒｂ
ａｓ，Ｃ．Ｆ．（前出）：Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １
５１：４６３１−４６５９（ｌ９９３）］およびガイドされた選択［Ｊｅｓｐｅ
ｒｓ，Ｌ．Ｓ．ら，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ １２：８９９−９０３（１９９４）］が
挙げられる。これらの組換えＤＮＡに基づくストラテジーのための開始物質は、
マウス脾臓由来のＲＮＡ［Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．（前出）］およびヒト末梢血
リンパ球［Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ら（前出）；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ら（
前出）；Ｍａｒｃｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（前出）；Ｂｉｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｐｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２（１９
９１）］およびＨＩＶ−１感染ドナー由来のリンパ系器官および骨髄［Ｂｕｒｔ
ｏｎ．Ｄ．Ｒ．ら（前出）：Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：９３３９−９３４３（１９９２）］を含む。
【００４６】 従って、目的の抗原に対する十分な結合親和性を有することを保証するために
、抗体を容易にスクリーニングし得る。結合親和性（Ｋd）は少なくとも約１０- 7 ｌ／Ｍであるべきであり、より好ましくは少なくとも約１０-8ｌ／Ｍである。
、抗体を容易にスクリーニングし得る。結合親和性（Ｋd）は少なくとも約１０- 7 ｌ／Ｍであるべきであり、より好ましくは少なくとも約１０-8ｌ／Ｍである。
【００４７】 本発明で有用なｓＦｖ配列は、ときとして細胞内で遭遇する還元条件下でさえ
も適切に折り畳まれる。ｓＦｖは代表的には配列ＶH−リンカー−ＶLもしくはＶ L −リンカー−ＶHを有する一本鎖ペプチド、またはリンカーなしの二本鎖抗体（
ｄｉａｂｏｄｙ）を含む。リンカーが用いられる場合、これは重鎖および軽鎖が
互いにその適切なコンホメーションの配向で結合できるように選択される。例え
ば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．２０３：４
６−１２１（１９９１）を参照のこと。これは本明細書中に参考として援用され
る。それゆえ、リンカーは、その融合点から可変ドメインまでの間の３．５ｎｍ
の距離を天然のＦｖコンホメーションを歪めることなくつなぐことが可能である
べきである。リンカーを構築するアミノ酸残基は、この距離をつなぎ得るような
ものでなければならず、かつ５アミノ酸またはそれ以上であるべきである。選択
されるアミノ酸はまた、リンカーが親水性であるように選択される必要があり、
そのため、リンカーは抗体中に埋没しない。好ましくは、このリンカーは、少な
くとも約１０残基の長さであるべきである。さらになお好ましくは、これは約１
５残基であるべきである。リンカーは短すぎるべきではないが、その一方で長す
ぎるべきでもない。なぜなら長すぎることによって、結合部位での立体的妨害が
起こり得るからである。それゆえ、これは、好ましくは２５残基以下である。リ
ンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）3（配列番号１）が好適な リンカーであり、これは十分な可撓性を提供するので、多くの抗体に広く適用可
能である。他のリンカーとしては、
も適切に折り畳まれる。ｓＦｖは代表的には配列ＶH−リンカー−ＶLもしくはＶ L −リンカー−ＶHを有する一本鎖ペプチド、またはリンカーなしの二本鎖抗体（
ｄｉａｂｏｄｙ）を含む。リンカーが用いられる場合、これは重鎖および軽鎖が
互いにその適切なコンホメーションの配向で結合できるように選択される。例え
ば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．２０３：４
６−１２１（１９９１）を参照のこと。これは本明細書中に参考として援用され
る。それゆえ、リンカーは、その融合点から可変ドメインまでの間の３．５ｎｍ
の距離を天然のＦｖコンホメーションを歪めることなくつなぐことが可能である
べきである。リンカーを構築するアミノ酸残基は、この距離をつなぎ得るような
ものでなければならず、かつ５アミノ酸またはそれ以上であるべきである。選択
されるアミノ酸はまた、リンカーが親水性であるように選択される必要があり、
そのため、リンカーは抗体中に埋没しない。好ましくは、このリンカーは、少な
くとも約１０残基の長さであるべきである。さらになお好ましくは、これは約１
５残基であるべきである。リンカーは短すぎるべきではないが、その一方で長す
ぎるべきでもない。なぜなら長すぎることによって、結合部位での立体的妨害が
起こり得るからである。それゆえ、これは、好ましくは２５残基以下である。リ
ンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）3（配列番号１）が好適な リンカーであり、これは十分な可撓性を提供するので、多くの抗体に広く適用可
能である。他のリンカーとしては、
【００４８】
【化１】 が挙げられる。あるいは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）3（配 列番号１）リンカーのような１５マーを採用して（任意の配列が用いられ得るが
）、リンカー中のアミノ酸を変異誘発によってランダム化し得る。次に異なるリ
ンカーを有する抗体がファージディスプレイベクターによって引き出し得、そし
て生成された最も親和性の高い単鎖抗体についてスクリーニングし得る。
）、リンカー中のアミノ酸を変異誘発によってランダム化し得る。次に異なるリ
ンカーを有する抗体がファージディスプレイベクターによって引き出し得、そし
て生成された最も親和性の高い単鎖抗体についてスクリーニングし得る。
【００４９】 二本鎖抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）は二量体の抗体フラグメントであり、これは二
重に特異的な（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子である。これらは２つのｓＦｖ分子
の交差対形成（ｃｒｏｓｓ−ｐａｉｒｉｎｇ）によって形成され、この２つのｓ
Ｆｖ分子は各々、短縮化リンカーまたはリンカーなしのいずれかで軽鎖可変ドメ
イン（ＶL）と接続した重鎖可変ドメイン（ＶH）からなる。短縮化リンカー／リ
ンカーなしによって、同じ鎖上にあるドメインが互いに対形成することが妨げら
れる。２つの鎖は二量体化するかわりに、二価のフラグメントを形成する。二重
特異的フラグメントは、２つの異なる鎖ＶHＡ−ＶLＢおよびＶHＢ−ＶLＡを同じ
細胞中で同時発現することによって形成され得る。二本鎖抗体は単特異的（ｍｏ
ｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）または二重特異的のいずれかであり得る。ＭｃＧｕｉｎ
ｎｅｓｓ，Ｂ．Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻
、１１４９−１１５４（１９９６年９月）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第４巻、４４
６−４４９（１９９３）。二本鎖抗体に関するファージディスプレイライブラリ
ーが記載されており、そしてこれを用いて数千の異なる二重特異的分子を生成し
得、そして最も高い結合親和性、エピトープ認識、および対形成を有する二本鎖
抗体が選択され得る。ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ，Ｂ．Ｔ．（前出）。
重に特異的な（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子である。これらは２つのｓＦｖ分子
の交差対形成（ｃｒｏｓｓ−ｐａｉｒｉｎｇ）によって形成され、この２つのｓ
Ｆｖ分子は各々、短縮化リンカーまたはリンカーなしのいずれかで軽鎖可変ドメ
イン（ＶL）と接続した重鎖可変ドメイン（ＶH）からなる。短縮化リンカー／リ
ンカーなしによって、同じ鎖上にあるドメインが互いに対形成することが妨げら
れる。２つの鎖は二量体化するかわりに、二価のフラグメントを形成する。二重
特異的フラグメントは、２つの異なる鎖ＶHＡ−ＶLＢおよびＶHＢ−ＶLＡを同じ
細胞中で同時発現することによって形成され得る。二本鎖抗体は単特異的（ｍｏ
ｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）または二重特異的のいずれかであり得る。ＭｃＧｕｉｎ
ｎｅｓｓ，Ｂ．Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻
、１１４９−１１５４（１９９６年９月）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第４巻、４４
６−４４９（１９９３）。二本鎖抗体に関するファージディスプレイライブラリ
ーが記載されており、そしてこれを用いて数千の異なる二重特異的分子を生成し
得、そして最も高い結合親和性、エピトープ認識、および対形成を有する二本鎖
抗体が選択され得る。ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ，Ｂ．Ｔ．（前出）。
【００５０】 標的がＥＲまたはゴルジ装置中にない場合、遺伝子は可変鎖に対する機能性リ
ーダー配列をコードしない。なぜなら、抗体はリーダー配列をコードしないこと
が好ましいからである。抗体のこのような結合部分をコードするヌクレオチドは
、好ましくは抗体の分泌配列（すなわち、抗体が細胞から分泌されることを引き
起こす配列）をコードしない。このような配列は定常領域に含まれ得る。好まし
くは、抗体の定常領域全体をコードするヌクレオチドもまた用いない。より好ま
しくは、遺伝子は定常領域の６未満のアミノ酸をコードする。しかし、ＥＲまた
はゴルジに位置する標的を標的化する場合、リーダー配列によって、これらのコ
ンパートメントに導かれる抗体が得られる。好ましくは、ＥＲまたはゴルジ残留
配列もまた存在する。この後者の配列は好ましくはカルボキシ部分に付加される
。
ーダー配列をコードしない。なぜなら、抗体はリーダー配列をコードしないこと
が好ましいからである。抗体のこのような結合部分をコードするヌクレオチドは
、好ましくは抗体の分泌配列（すなわち、抗体が細胞から分泌されることを引き
起こす配列）をコードしない。このような配列は定常領域に含まれ得る。好まし
くは、抗体の定常領域全体をコードするヌクレオチドもまた用いない。より好ま
しくは、遺伝子は定常領域の６未満のアミノ酸をコードする。しかし、ＥＲまた
はゴルジに位置する標的を標的化する場合、リーダー配列によって、これらのコ
ンパートメントに導かれる抗体が得られる。好ましくは、ＥＲまたはゴルジ残留
配列もまた存在する。この後者の配列は好ましくはカルボキシ部分に付加される
。
【００５１】 上述のように、免疫系を用いて、標的タンパク質のような特定の分子に結合す
る抗体が標準的な免疫学的方法によって産生され得る。例えば、タンパク質また
はその免疫原性フラグメントまたはペプチドを用いて、このようなタンパク質ま
たはフラグメントに基づいて化学的合成される。これらの配列のいずれもが、所
望であればキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合体を形成し得、
そしてこれを用いて、マウス、ウサギ、ラット、およびハムスターのような動物
中で抗体が惹起される。その後、動物を屠殺し、その脾臓を得る。モノクローナ
ル抗体が、ハイブリドーマ細胞を形成するための標準の融合技術を用いて産生さ
れる。Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）参照
。これは代表的には、抗体産生細胞（すなわち脾臓）をミエローマ細胞のような
不死化細胞株と融合させて、ハイブリッド細胞を作製することを包含する。
る抗体が標準的な免疫学的方法によって産生され得る。例えば、タンパク質また
はその免疫原性フラグメントまたはペプチドを用いて、このようなタンパク質ま
たはフラグメントに基づいて化学的合成される。これらの配列のいずれもが、所
望であればキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合体を形成し得、
そしてこれを用いて、マウス、ウサギ、ラット、およびハムスターのような動物
中で抗体が惹起される。その後、動物を屠殺し、その脾臓を得る。モノクローナ
ル抗体が、ハイブリドーマ細胞を形成するための標準の融合技術を用いて産生さ
れる。Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）参照
。これは代表的には、抗体産生細胞（すなわち脾臓）をミエローマ細胞のような
不死化細胞株と融合させて、ハイブリッド細胞を作製することを包含する。
【００５２】 抗体を調製する別の方法は、例えば、脾臓細胞（例えばマウス脾臓細胞の培養
物）を用い、抗原を注入し、そして次にこの抗原に対して産生された抗体をスク
リーニングするなどのような、インビトロ免疫化技術によるものである。この方
法によって、０．１マイクログラムもの少ない抗原でも用い得るが、約１マイク
ログラム／ミリリットルが好ましい。インビトロ免疫化のために、脾臓細胞、例
えばマウス脾臓細胞を収穫し、そして所望の量、例えば１×１０7細胞／ミリリ ットルで、培地中および所望の抗原とともに、代表的には約１マイクログラム／
ミリリットルの濃度でインキュベートする。その後、数種のアジュバントのうち
の１つをフィルター免疫プラークアッセイの結果に基づいて細胞培養に加える。
これらのアジュバントとしては、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イ
ソグルタミン（Ｂｏｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２
１：２７−３３（１９８６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
マイトジェン［Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕ
ｎｏＣｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ］または
Ｔ−細胞条件が挙げられ、これらは従来技術［参照、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ
．Ａ．Ｋ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：８４１−８４５（１９８４）；Ｂｏ
ｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３７１０−３
７１５（１９８６）］によって生成され得るか、または、例えば、Ｈａｎｎａｈ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．またはＲｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ．Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．から市販されている。脾臓細胞を抗原と共に４日間イン
キュベートし、次いで、採取する。
物）を用い、抗原を注入し、そして次にこの抗原に対して産生された抗体をスク
リーニングするなどのような、インビトロ免疫化技術によるものである。この方
法によって、０．１マイクログラムもの少ない抗原でも用い得るが、約１マイク
ログラム／ミリリットルが好ましい。インビトロ免疫化のために、脾臓細胞、例
えばマウス脾臓細胞を収穫し、そして所望の量、例えば１×１０7細胞／ミリリ ットルで、培地中および所望の抗原とともに、代表的には約１マイクログラム／
ミリリットルの濃度でインキュベートする。その後、数種のアジュバントのうち
の１つをフィルター免疫プラークアッセイの結果に基づいて細胞培養に加える。
これらのアジュバントとしては、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イ
ソグルタミン（Ｂｏｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２
１：２７−３３（１９８６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
マイトジェン［Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕ
ｎｏＣｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ］または
Ｔ−細胞条件が挙げられ、これらは従来技術［参照、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ
．Ａ．Ｋ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：８４１−８４５（１９８４）；Ｂｏ
ｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３７１０−３
７１５（１９８６）］によって生成され得るか、または、例えば、Ｈａｎｎａｈ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．またはＲｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ．Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．から市販されている。脾臓細胞を抗原と共に４日間イン
キュベートし、次いで、採取する。
【００５３】 次いで、インビトロで免疫されたマウス脾臓細胞の単一細胞懸濁液を、例えば
、マイクロフィルタープレート中の抗原−ニトロセルロース膜（例えば、Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐから入手されるもの）上でインキュベートする。産生さ
れた抗体を抗体のための標識、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標
識二次抗体（例えば、ウサギ抗マウスＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を用いて
検出する。分泌された抗体のアイソタイプの決定において、ビオチン化ウサギ抗
マウス重鎖特異的抗体（例えば、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．製）を用い得
、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ−アビジン試薬（例えばＶｅｃｔｏ
ｒ Ｌａｂ．から入手されるもの）を用い得る。
、マイクロフィルタープレート中の抗原−ニトロセルロース膜（例えば、Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐから入手されるもの）上でインキュベートする。産生さ
れた抗体を抗体のための標識、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標
識二次抗体（例えば、ウサギ抗マウスＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を用いて
検出する。分泌された抗体のアイソタイプの決定において、ビオチン化ウサギ抗
マウス重鎖特異的抗体（例えば、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．製）を用い得
、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ−アビジン試薬（例えばＶｅｃｔｏ
ｒ Ｌａｂ．から入手されるもの）を用い得る。
【００５４】 酵素反応の不溶性産物は膜上で青いプラークとして可視化される。これらのプ
ラークを、例えば、２５倍の倍率を用いて計数する。種々の抗体を容易に吸着す
るマイクロフィルタープレートのニトロセルロース膜および洗浄工程のために用
いられる濾過ユニットは、プラークアッセイを容易にするので好ましい。
ラークを、例えば、２５倍の倍率を用いて計数する。種々の抗体を容易に吸着す
るマイクロフィルタープレートのニトロセルロース膜および洗浄工程のために用
いられる濾過ユニットは、プラークアッセイを容易にするので好ましい。
【００５５】 次に、抗体を標準的技術によってスクリーニングして、目的の抗体を見いだす
。目的の抗体を含む培養物を増殖および誘導し、そして上清をフィルター（例え
ば、０．４５マイクロメートルフィルター）、次いで、カラム（例えば抗原アフ
ィニティーカラムまたは抗タグペプチドカラム）に通す。結合親和性を、ミニゲ
ル濾過技術を用いて試験する。例えば、Ｎｉｅｄｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２５６：９２９５（１９８１）を参照のこと。例えば、抗ウサギＩｇＧをカッ
プリングした磁気ビーズを用いて、遊離125Ｉ標識抗原をウサギ抗タグペプチド 抗体に結合した125Ｉ標識抗原から分離するために、二次アッセイ（例えば、ラ ジオイムノアッセイ）もまた用い得る。好適な代替法では、「オン」速度および
「オフ」速度が、例えば、バイオセンサーに基づく分析系、例えばＰｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ製の「ＢＩＡｃｏｒｅ」を用いて測定され得
る［Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６−１８７（１９９３）を参照のこと］。
。目的の抗体を含む培養物を増殖および誘導し、そして上清をフィルター（例え
ば、０．４５マイクロメートルフィルター）、次いで、カラム（例えば抗原アフ
ィニティーカラムまたは抗タグペプチドカラム）に通す。結合親和性を、ミニゲ
ル濾過技術を用いて試験する。例えば、Ｎｉｅｄｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２５６：９２９５（１９８１）を参照のこと。例えば、抗ウサギＩｇＧをカッ
プリングした磁気ビーズを用いて、遊離125Ｉ標識抗原をウサギ抗タグペプチド 抗体に結合した125Ｉ標識抗原から分離するために、二次アッセイ（例えば、ラ ジオイムノアッセイ）もまた用い得る。好適な代替法では、「オン」速度および
「オフ」速度が、例えば、バイオセンサーに基づく分析系、例えばＰｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ製の「ＢＩＡｃｏｒｅ」を用いて測定され得
る［Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６−１８７（１９９３）を参照のこと］。
【００５６】 後者の技術はインビボ免疫に好ましい。なぜなら、インビボ方法は、代表的に
は、マウス１匹につき、１回の注射につき、約５０マイクログラムの抗原が必要
とされ、そしてインビボ法のためには、通常、２回の追加免疫が一次免疫の後に
行われるからである。
は、マウス１匹につき、１回の注射につき、約５０マイクログラムの抗原が必要
とされ、そしてインビボ法のためには、通常、２回の追加免疫が一次免疫の後に
行われるからである。
【００５７】 あるいは、既知の抗体を用いてタンパク質を標的化し得る。その後、抗体の少
なくとも抗原結合部分に対する遺伝子を以下に記載のように合成する。上記で簡
単に述べたように、いくつかの好適な実施態様では、これは細胞内局在化配列（
例えば、小胞体、核、核小体など）のための配列もまたコードする。ＥＲの正常
な抗体分泌系、例えば小胞体−ゴルジ装置での発現が所望される場合、リーダー
配列が用いられるべきである。このような抗体を特定の場所に保持するために、
ＫＤＥＬ配列（ＥＲ残留シグナル）のような局在化配列が用いられ得る。いくつ
かの実施態様では、抗体遺伝子はまた、好ましくは機能性分泌配列をコードしな
い。
なくとも抗原結合部分に対する遺伝子を以下に記載のように合成する。上記で簡
単に述べたように、いくつかの好適な実施態様では、これは細胞内局在化配列（
例えば、小胞体、核、核小体など）のための配列もまたコードする。ＥＲの正常
な抗体分泌系、例えば小胞体−ゴルジ装置での発現が所望される場合、リーダー
配列が用いられるべきである。このような抗体を特定の場所に保持するために、
ＫＤＥＬ配列（ＥＲ残留シグナル）のような局在化配列が用いられ得る。いくつ
かの実施態様では、抗体遺伝子はまた、好ましくは機能性分泌配列をコードしな
い。
【００５８】 抗体遺伝子は本開示に基づいて公知の技術を用いて調製され得る。
【００５９】 これらの抗体のいずれかを用いて、ＶHおよびＶL遺伝子を構築し得る。例えば
、ＶHおよびＶLライブラリーを上記のインビトロ免疫技術もしくは従来のインビ
ボ免疫によって免疫されたマウス脾臓細胞から、および既に生成された、または
市販のハイブリドーマ細胞株から作製し得る。市販のＶHおよびＶLライブラリー
もまた用い得る。１つの方法は、脾臓細胞を用いてｍＲＮＡを得て、これを用い
てｃＤＮＡを合成することを包含する。二重鎖ｃＤＮＡは、ＰＣＲを使用して、
可変領域を縮重Ｎ末端Ｖ領域プライマーおよびＪ領域プライマーを用いて、また
はＶHファミリー特異的プライマー（例えばマウス−１２、ヒト７）を用いて増 幅することによって作製され得る。
、ＶHおよびＶLライブラリーを上記のインビトロ免疫技術もしくは従来のインビ
ボ免疫によって免疫されたマウス脾臓細胞から、および既に生成された、または
市販のハイブリドーマ細胞株から作製し得る。市販のＶHおよびＶLライブラリー
もまた用い得る。１つの方法は、脾臓細胞を用いてｍＲＮＡを得て、これを用い
てｃＤＮＡを合成することを包含する。二重鎖ｃＤＮＡは、ＰＣＲを使用して、
可変領域を縮重Ｎ末端Ｖ領域プライマーおよびＪ領域プライマーを用いて、また
はＶHファミリー特異的プライマー（例えばマウス−１２、ヒト７）を用いて増 幅することによって作製され得る。
【００６０】 例えば、所望の抗体（たとえばＭＨＣ−１分子に対する抗体）のＶHおよびＶL ドメインの遺伝子をクローニングおよび配列決定し得る。第１鎖ｃＤＮＡは、例
えば、全ＲＮＡからオリゴｄＴプライミングおよびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病
ウイルス逆転写酵素を用いて、公知の手順に従って合成され得る。次いで、この
第１鎖ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行う。代表的なＰＣＲ条件、例えば、例え
ばＶｅｎｔポリメラーゼを用いる２５から３０サイクルを用いて免疫グロブリン
遺伝子のｃＤＮＡを増幅し得る。ＤＮＡ配列分析を次に行う［Ｓａｎｇｅｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５４６３−５４６７（
１９７７）］。
えば、全ＲＮＡからオリゴｄＴプライミングおよびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病
ウイルス逆転写酵素を用いて、公知の手順に従って合成され得る。次いで、この
第１鎖ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行う。代表的なＰＣＲ条件、例えば、例え
ばＶｅｎｔポリメラーゼを用いる２５から３０サイクルを用いて免疫グロブリン
遺伝子のｃＤＮＡを増幅し得る。ＤＮＡ配列分析を次に行う［Ｓａｎｇｅｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５４６３−５４６７（
１９７７）］。
【００６１】 重鎖プライマー対および軽鎖プライマー対の両方がこの方法論によって生成さ
れ得る。好ましくは、都合のよい制限部位をプライマーに挿入して、クローニン
グをより容易にさせる。
れ得る。好ましくは、都合のよい制限部位をプライマーに挿入して、クローニン
グをより容易にさせる。
【００６２】 用いられるストラテジーの例として、正方向ＶHプライマーおよび逆方向ＪHプ
ライマーから構成される重鎖プライマー対（各々クローニングのための都合のよ
い制限部位を含む）が調製され得る。例えば、免疫グロブリンに基づくＫａｂａ
ｔデータベース［Ｋａｂａｔら、前出］またはＶｂａｓｅデータベース（Ｉ．Ｔ
ｏｍｌｉｎｓｏｎ（ＭＲＣによって公開）；またＴｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．
ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４６２８−４６３８（１９９５）もまた参照のこと
）を用いて、７つの異なるヒトＶHファミリー中に見いだされるアミノ酸および コドン分布を分析し得る。これによって、３５塩基対のユニバーサル５’ＶHプ ライマーが設計される。ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡ（Ｇ／Ａ）
ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣ（Ｔ／Ｃ）ＧＧ（配列番号９）のようなプライマーを用
い得、これは２つの異なるヌクレオチドについて２つの位置で縮重し、そしてＦ
Ｒ１配列の５’末端にアニールする。５’Ｎｏｔ Ｉ部位のような制限部位（左
側下線）を、増幅したＤＮＡのクローニングのために導入し得、そしてこれはＶ H 遺伝子に対する最初のコドンの５’に位置する。同様に、内部ＸｈｏＩ部位の ような第２の制限部位もまた導入し得る（右側下線）。
ライマーから構成される重鎖プライマー対（各々クローニングのための都合のよ
い制限部位を含む）が調製され得る。例えば、免疫グロブリンに基づくＫａｂａ
ｔデータベース［Ｋａｂａｔら、前出］またはＶｂａｓｅデータベース（Ｉ．Ｔ
ｏｍｌｉｎｓｏｎ（ＭＲＣによって公開）；またＴｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．
ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４６２８−４６３８（１９９５）もまた参照のこと
）を用いて、７つの異なるヒトＶHファミリー中に見いだされるアミノ酸および コドン分布を分析し得る。これによって、３５塩基対のユニバーサル５’ＶHプ ライマーが設計される。ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡ（Ｇ／Ａ）
ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣ（Ｔ／Ｃ）ＧＧ（配列番号９）のようなプライマーを用
い得、これは２つの異なるヌクレオチドについて２つの位置で縮重し、そしてＦ
Ｒ１配列の５’末端にアニールする。５’Ｎｏｔ Ｉ部位のような制限部位（左
側下線）を、増幅したＤＮＡのクローニングのために導入し得、そしてこれはＶ H 遺伝子に対する最初のコドンの５’に位置する。同様に、内部ＸｈｏＩ部位の ような第２の制限部位もまた導入し得る（右側下線）。
【００６３】 同様に、６６塩基対ＪH領域ヌクレオチドを、重鎖可変遺伝子の３’末端での 逆プライミングのために設計し得る。例えば、ＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ
ＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＧＧＴ ＧＡＣＣ ＧＴＧＡＣＣ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧＴ（配列番号１０）。このプ
ライマーはさらに４５ヌクレオチド配列を含み、これはリンカー、例えば（Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）3（配列番号１）相互交換リンカーをコ ードする。このプライマーは、６つのヒトＪH領域ミニ遺伝子のヌクレオチド配 列に基づいて、２つのヌクレオチドに伴って２つの縮重位置を各位置で含む。制
限部位が用いられ得、例えば、ＢｓｐＥＩ部位（左側下線）を、重複正方向Ｖka ppa プライマーとの付着末端ライゲーションのために相互交換リンカー中に導入 する。内部ＢｓＴＥｌｌ部位（右側下線）もまた、さらなるリンカー交換手順の
ために導入される。
ＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＧＧＴ ＧＡＣＣ ＧＴＧＡＣＣ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧＴ（配列番号１０）。このプ
ライマーはさらに４５ヌクレオチド配列を含み、これはリンカー、例えば（Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）3（配列番号１）相互交換リンカーをコ ードする。このプライマーは、６つのヒトＪH領域ミニ遺伝子のヌクレオチド配 列に基づいて、２つのヌクレオチドに伴って２つの縮重位置を各位置で含む。制
限部位が用いられ得、例えば、ＢｓｐＥＩ部位（左側下線）を、重複正方向Ｖka ppa プライマーとの付着末端ライゲーションのために相互交換リンカー中に導入 する。内部ＢｓＴＥｌｌ部位（右側下線）もまた、さらなるリンカー交換手順の
ために導入される。
【００６４】 ４５ヌクレオチド相互交換リンカーを用いる同様のストラテジーが、６９ヌク
レオチドヒトＶkappaプライマーの設計に取り入れられる。ヒトＶkappa遺伝子の
４つのファミリーが存在する。ＦＲ１配列の５’末端にアニールする５’Ｖkapp a プライマー：ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧ ＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣ（Ｇ／Ｃ）（Ｔ／Ａ）Ｇ（Ａ／
Ｃ）ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ（配列番号１１）は３位で縮重している（各
々、２ヌクレオチド）。相互交換リンカー部分は、ＢｓｐＥＩ部位を逆方向ＪH プライマーでの付着末端クローニングのために含み得、他の制限部位もまた用い
られ得る。内部ＳａｃＩ部位（右側下線）をもまた、さらなるリンカー交換手順
を可能にするために導入され得る。
レオチドヒトＶkappaプライマーの設計に取り入れられる。ヒトＶkappa遺伝子の
４つのファミリーが存在する。ＦＲ１配列の５’末端にアニールする５’Ｖkapp a プライマー：ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧ ＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣ（Ｇ／Ｃ）（Ｔ／Ａ）Ｇ（Ａ／
Ｃ）ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ（配列番号１１）は３位で縮重している（各
々、２ヌクレオチド）。相互交換リンカー部分は、ＢｓｐＥＩ部位を逆方向ＪH プライマーでの付着末端クローニングのために含み得、他の制限部位もまた用い
られ得る。内部ＳａｃＩ部位（右側下線）をもまた、さらなるリンカー交換手順
を可能にするために導入され得る。
【００６５】 逆方向４７ヌクレオチドＣkappaプライマー（Ｋａｂａｔ位置１０９−１１３ ）：ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＧ
ＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴ（配列番号１２）は、カッパ鎖の定常領域（Ｋａｂ
ａｔ位置１０９−１１３）に対して相補性であるように設計される。このプライ
マーはカッパ定常領域の５’最末端にアニールする。プライマーは、２つの終止
コドンの前に内部ＭｌｕＩ部位（右側下線）を含む。加えて、複数の制限部位、
例えばＢａｍ ＨＩ ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ（左側下線）がタンデム終止コドンの
後に導入される。同様の逆方向ヌクレオチドＣ−カッパプライマー、例えば５９
ヌクレオチドプライマーもまた設計され得、これは特定の細胞内部位についての
シグナル、例えばカルボキシ末端小胞体残留シグナルである、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（配列番号１３）（ＳＥＫＤＥＬ）を含む。Ｇ
ＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＴ
ＴＴＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴ（配列番号１４）。同様の複数
の制限部位（Ｂａｍ ＨＩ ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ）をタンデム終止コドンの後に
導入し得る。
ＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴ（配列番号１２）は、カッパ鎖の定常領域（Ｋａｂ
ａｔ位置１０９−１１３）に対して相補性であるように設計される。このプライ
マーはカッパ定常領域の５’最末端にアニールする。プライマーは、２つの終止
コドンの前に内部ＭｌｕＩ部位（右側下線）を含む。加えて、複数の制限部位、
例えばＢａｍ ＨＩ ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ（左側下線）がタンデム終止コドンの
後に導入される。同様の逆方向ヌクレオチドＣ−カッパプライマー、例えば５９
ヌクレオチドプライマーもまた設計され得、これは特定の細胞内部位についての
シグナル、例えばカルボキシ末端小胞体残留シグナルである、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（配列番号１３）（ＳＥＫＤＥＬ）を含む。Ｇ
ＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＴ
ＴＴＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴ（配列番号１４）。同様の複数
の制限部位（Ｂａｍ ＨＩ ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ）をタンデム終止コドンの後に
導入し得る。
【００６６】 一次ヌクレオチド配列を、重鎖およびカッパ鎖遺伝子の両方について決定し、
そして生殖系遺伝子を決定した後、次にＰＣＲプライマーをＶH７１−４生殖系 遺伝子のリーダー配列に基づいて設計し得る。例えば、ＶH７１−４リーダープ ライマー：ＴＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＣ（配列番号１５
）は、５’ＮｃｏＩ部位（下線）を含む。このリーダープライマー（Ｐ−Ｌ）を
第２のＪHプライマーと組み合わせて、ＰＣＲ増幅実験のために用いる。３５塩 基対ＪH領域オリゴヌクレオチドは、重鎖可変遺伝子、ＴＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧ ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧＴ（配列番号１６）の
３’末端での逆プライミングのための同じ配列を含むように設計される。このプ
ライマーは、２つのヌクレオチドに伴って２つの縮重位置を各位置で含む。Ｊ領
域の最後のアミノ酸を決定するコドンに対して３’であり、かつ直ぐ隣接するＢ
ｓｓＨＩＩ部位（左側下線）は、ＶH遺伝子の３’末端での都合のよいクローニ ングを可能にする。内部ＢｓｔＥＩＩ部位（右側下線）も導入される。この配列
を用いてＶL配列を増幅する。次いで、Ｐ−Ｌ（リーダープライマー）およびＰ リンカー（逆方向プライマー）およびＰ−Ｋ（Ｖ2プライマー）およびＰ−ＣＫ プライマー（逆方向ＣＫプライマー）で増幅されたフラグメントを、ｐＲｃ／Ｃ
ＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような発現ベクター中にクローニングし、そし
て得られた組換え体は、ＣＭＶプロモーターのようなプロモーターの制御下で、
シグナルペプチドＶH内部鎖リンカーおよびＶL配列を含む。当業者は、選択した
細胞系、例えば哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞で遺伝子を発現する他のプロモ
ーターを容易に選択し得る。
そして生殖系遺伝子を決定した後、次にＰＣＲプライマーをＶH７１−４生殖系 遺伝子のリーダー配列に基づいて設計し得る。例えば、ＶH７１−４リーダープ ライマー：ＴＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＣ（配列番号１５
）は、５’ＮｃｏＩ部位（下線）を含む。このリーダープライマー（Ｐ−Ｌ）を
第２のＪHプライマーと組み合わせて、ＰＣＲ増幅実験のために用いる。３５塩 基対ＪH領域オリゴヌクレオチドは、重鎖可変遺伝子、ＴＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧ ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧＴ（配列番号１６）の
３’末端での逆プライミングのための同じ配列を含むように設計される。このプ
ライマーは、２つのヌクレオチドに伴って２つの縮重位置を各位置で含む。Ｊ領
域の最後のアミノ酸を決定するコドンに対して３’であり、かつ直ぐ隣接するＢ
ｓｓＨＩＩ部位（左側下線）は、ＶH遺伝子の３’末端での都合のよいクローニ ングを可能にする。内部ＢｓｔＥＩＩ部位（右側下線）も導入される。この配列
を用いてＶL配列を増幅する。次いで、Ｐ−Ｌ（リーダープライマー）およびＰ リンカー（逆方向プライマー）およびＰ−Ｋ（Ｖ2プライマー）およびＰ−ＣＫ プライマー（逆方向ＣＫプライマー）で増幅されたフラグメントを、ｐＲｃ／Ｃ
ＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような発現ベクター中にクローニングし、そし
て得られた組換え体は、ＣＭＶプロモーターのようなプロモーターの制御下で、
シグナルペプチドＶH内部鎖リンカーおよびＶL配列を含む。当業者は、選択した
細胞系、例えば哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞で遺伝子を発現する他のプロモ
ーターを容易に選択し得る。
【００６７】 抗ＭＨＣ−１ ｓＦｖを調製するために、ＶHについてはプライマー配列Ａ（ 配列番号４９）およびＢ（配列番号５０）を、そしてＶLについてはＣ（配列番 号５１）およびＤ（配列番号５２）を用い得る（これらは表３に示される）。こ
の抗体に好ましい鎖間リンカーは、（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ
）3であり、そしてペプチド合成機により容易に調製され得るか、または切り出 され、そしてＰＣＲにより、この配列を含むプラスミド（ｐｌａｓｍｉｃ）から
増幅され得る。ｓＦｖは、種々のフラグメント（ＶH、ＶL、および鎖間リンカー
）から、重複伸長［Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８（
１９８９）］、続いて配列番号４９および配列番号５２のプライマーを用いる増
幅によりアセンブルされ得る。完全な配列は、Ｓａｎｇｅｒ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（１９７７）］のダ
イデオキシチェーンターミネーション法により確認され得る。
の抗体に好ましい鎖間リンカーは、（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ
）3であり、そしてペプチド合成機により容易に調製され得るか、または切り出 され、そしてＰＣＲにより、この配列を含むプラスミド（ｐｌａｓｍｉｃ）から
増幅され得る。ｓＦｖは、種々のフラグメント（ＶH、ＶL、および鎖間リンカー
）から、重複伸長［Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８（
１９８９）］、続いて配列番号４９および配列番号５２のプライマーを用いる増
幅によりアセンブルされ得る。完全な配列は、Ｓａｎｇｅｒ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（１９７７）］のダ
イデオキシチェーンターミネーション法により確認され得る。
【００６８】 従って、本明細書中で用いられる、抗体に対する遺伝子は、重鎖および軽鎖の
領域の遺伝子を包含し得る。さらに、遺伝子は、その発現を生じる単数または複
数のプロモーターに作動可能に連結される。哺乳動物細胞中での発現を可能にす
るプロモーターは、周知であり、そしてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の中間
初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ（例えば、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ、Ｈ
ＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初
期プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、および単純ヘル
ペスｔｋウイルスプロモーターを含む。このＤＮＡ配列は、「抗体カセット」と
して記載される。
領域の遺伝子を包含し得る。さらに、遺伝子は、その発現を生じる単数または複
数のプロモーターに作動可能に連結される。哺乳動物細胞中での発現を可能にす
るプロモーターは、周知であり、そしてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の中間
初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ（例えば、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ、Ｈ
ＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初
期プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、および単純ヘル
ペスｔｋウイルスプロモーターを含む。このＤＮＡ配列は、「抗体カセット」と
して記載される。
【００６９】 しかし、より大きな程度の細胞内特異性が所望される例が存在する。例えば、
上記のように、ＭＨＣ−１分子を標的化する場合、ＥＲに対する抗体を指向する
ことが望ましい。従って、好ましくは、このような例において局所化配列を用い
る。この抗体は、細胞内送達され得、そしてそこで発現されて標的タンパク質に
結合し得る。
上記のように、ＭＨＣ−１分子を標的化する場合、ＥＲに対する抗体を指向する
ことが望ましい。従って、好ましくは、このような例において局所化配列を用い
る。この抗体は、細胞内送達され得、そしてそこで発現されて標的タンパク質に
結合し得る。
【００７０】 局所化配列は、ルーティング（ｒｏｕｔｉｎｇ）シグナル、ソーティングシグ
ナル、残留またはサルベージシグナル、および膜トポロジー停止トランスファー
シグナルに分けられている［Ｐｕｇｓｌｅｙ，Ａ．Ｐ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａ
ｒｇｅｔｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８９）］。例
えば、抗体を特定の位置に導くために、特定の局所化配列を用い得る。例えば、
シグナル（例えば、小胞体について、Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番
号１７）［Ｍｕｎｒｏら、Ｃｅｌｌ ４８：８９９−９０７（１９８７）］、Ａ
ｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番号１８）、Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌ
ｅｕ（配列番号１９）、Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ（配列番号２０）、お
よびＡｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番号２１）［Ｈａｎｇｅｊｏｒｄｅ
ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：６０１５（１９９１）］；核について
、Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ（配列番号２２）
［Ｌａｎｆｏｒｄら、Ｃｅｌｌ ４６：５７５（１９８６）］、Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（配列番号２３）［Ｓｔａｎｔｏｎ
，Ｌ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：１７７
２（１９８６）；Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ（配列番号２４）［
Ｈａｒｌｏｗら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１６０５ １９８５］、Ａ
ｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ（配列番号５８）；ならびに核小体領域について
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｎ（配列番号２５）［Ｓｅｏｍｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ ６４：１８０３（１９９０）］、Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ａｒｇ（配列番号２６）［Ｋｕｂｏｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ
Ｂｉｏｐｈｙ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６２：９６３（１９８９）］、Ｍｅｔ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ（
配列番号２７）［Ｓｉｏｍｉら、Ｃｅｌｌ ５５：１９７（１９８８）］；エン
ドソームコンパートメントについてＭｅｔ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ（
配列番号２８）［Ｂａｋｋｅら、Ｃｅｌｌ ６３：７０７−７１６（１９９０）
］）。標的化リポソームについてはＬｅｔｏｕｒｎｅｕｒら、Ｃｅｌｌ ６９：
１１８３（１９９２）を参照のこと。ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｌａｔｉ
ｏｎ）配列は、抗体を原形質膜に導くために用いられ得る。さらに、下記の表２
に示されるように、ミリストイル化配列は、抗体を異なる細胞内位置（例えば、
核領域）に導くために用いられ得る。局所化配列はまた、抗体を細胞内小器官（
例えば、ミトコンドリアおよびゴルジ装置）に導くために用いられ得る。配列Ｍ
ｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｘａａ Ｘａａ Ｌｅｕ Ａ
ｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａ
ｓｎ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｘａａ（配列番号２９）を用いて抗体をミトコ
ンドリアマトリックスに導き得る（Ｐｕｇｓｌｅｙ、前出）。ゴルジ装置へのタ
ンパク質の局在化についてはＴａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２０７：１０
１２２を参照のこと。
ナル、残留またはサルベージシグナル、および膜トポロジー停止トランスファー
シグナルに分けられている［Ｐｕｇｓｌｅｙ，Ａ．Ｐ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａ
ｒｇｅｔｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８９）］。例
えば、抗体を特定の位置に導くために、特定の局所化配列を用い得る。例えば、
シグナル（例えば、小胞体について、Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番
号１７）［Ｍｕｎｒｏら、Ｃｅｌｌ ４８：８９９−９０７（１９８７）］、Ａ
ｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番号１８）、Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌ
ｅｕ（配列番号１９）、Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ（配列番号２０）、お
よびＡｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ（配列番号２１）［Ｈａｎｇｅｊｏｒｄｅ
ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：６０１５（１９９１）］；核について
、Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ（配列番号２２）
［Ｌａｎｆｏｒｄら、Ｃｅｌｌ ４６：５７５（１９８６）］、Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（配列番号２３）［Ｓｔａｎｔｏｎ
，Ｌ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：１７７
２（１９８６）；Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ（配列番号２４）［
Ｈａｒｌｏｗら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１６０５ １９８５］、Ａ
ｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ（配列番号５８）；ならびに核小体領域について
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｎ（配列番号２５）［Ｓｅｏｍｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ ６４：１８０３（１９９０）］、Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ａｒｇ（配列番号２６）［Ｋｕｂｏｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ
Ｂｉｏｐｈｙ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６２：９６３（１９８９）］、Ｍｅｔ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ（
配列番号２７）［Ｓｉｏｍｉら、Ｃｅｌｌ ５５：１９７（１９８８）］；エン
ドソームコンパートメントについてＭｅｔ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ（
配列番号２８）［Ｂａｋｋｅら、Ｃｅｌｌ ６３：７０７−７１６（１９９０）
］）。標的化リポソームについてはＬｅｔｏｕｒｎｅｕｒら、Ｃｅｌｌ ６９：
１１８３（１９９２）を参照のこと。ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｌａｔｉ
ｏｎ）配列は、抗体を原形質膜に導くために用いられ得る。さらに、下記の表２
に示されるように、ミリストイル化配列は、抗体を異なる細胞内位置（例えば、
核領域）に導くために用いられ得る。局所化配列はまた、抗体を細胞内小器官（
例えば、ミトコンドリアおよびゴルジ装置）に導くために用いられ得る。配列Ｍ
ｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｘａａ Ｘａａ Ｌｅｕ Ａ
ｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａ
ｓｎ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｘａａ（配列番号２９）を用いて抗体をミトコ
ンドリアマトリックスに導き得る（Ｐｕｇｓｌｅｙ、前出）。ゴルジ装置へのタ
ンパク質の局在化についてはＴａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２０７：１０
１２２を参照のこと。
【００７１】
【表２】 1読者を補助するために、標準的な１文字アミノ酸コードを表において用い、３ 文字コードを用いるアミノ酸を配列表に示す。 ２略号は、ＰＭ、原形質膜；Ｇ、ゴルジ；Ｎ、核；Ｃ、細胞骨格；ｓ、細胞質（
可溶性）；Ｍ、膜である。
可溶性）；Ｍ、膜である。
【００７２】 抗体カセットは、任意の公知の手段によって細胞に送達される。１つの好まし
い送達系は、Ｍａｒａｓｃｏによる１９９４年２月２２日出願の米国特許出願第
０８／１９９，０７０号（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載
される。これは、標的部分および結合部分を含む融合タンパク質の使用を開示す
る。標的部分は、ベクターを細胞に運び、一方結合部分は抗体カセットを保有す
る。他の方法としては、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５
７：４５５−４６０（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｗｕら，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）が挙げられる。例えば、こ
れらの抗体遺伝子（例えば、ｓＦｖ遺伝子）を含むカセットは、多数の技術によ
って特定の細胞に標的化され得る。下記の議論において、本発明者らは、好まし
くはヒトＴ細胞に導入される、ＭＨＣ−１抗体をコードするｓＦｖ遺伝子を議論
する。他の送達方法としては、例えば、トランスフェクションを促進する溶液中
のベクターを送達するマイクロカテーテル（ｍｉｃｒｏｃａｔｈｅｔｅｒ）、遺
伝子銃、裸のＤＮＡ、隣接補助ＤＮＡ、リポソーム、ポックスウイルス、ヘルペ
スウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスなどの使用が挙げられる。
い送達系は、Ｍａｒａｓｃｏによる１９９４年２月２２日出願の米国特許出願第
０８／１９９，０７０号（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載
される。これは、標的部分および結合部分を含む融合タンパク質の使用を開示す
る。標的部分は、ベクターを細胞に運び、一方結合部分は抗体カセットを保有す
る。他の方法としては、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５
７：４５５−４６０（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｗｕら，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）が挙げられる。例えば、こ
れらの抗体遺伝子（例えば、ｓＦｖ遺伝子）を含むカセットは、多数の技術によ
って特定の細胞に標的化され得る。下記の議論において、本発明者らは、好まし
くはヒトＴ細胞に導入される、ＭＨＣ−１抗体をコードするｓＦｖ遺伝子を議論
する。他の送達方法としては、例えば、トランスフェクションを促進する溶液中
のベクターを送達するマイクロカテーテル（ｍｉｃｒｏｃａｔｈｅｔｅｒ）、遺
伝子銃、裸のＤＮＡ、隣接補助ＤＮＡ、リポソーム、ポックスウイルス、ヘルペ
スウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスなどの使用が挙げられる。
【００７３】 理論的には、分泌経路内には、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）が配置
されてトラフィッキングタンパク質に結合し、そしてその最終的な行き先からト
ラフィッキングタンパク質を迂回させる多数の点が存在する。ＥＲは、好ましい
位置である。なぜなら、ＥＲは、生合成の初期にタンパク質を捕獲し、そしてＥ
Ｒ内の分解系による免疫複合体の迅速な処理の可能性を生むことを可能にするか
らである［Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．およびＳｉｔｉａ，Ｒ．，Ｃｅｌｌ ６
２：６１１−６１４（１９９０）］。可溶性タンパク質のＥＲ残留に必要とされ
るペプチドシグナルは、充分に特徴付けされており、そしてカルボキシ末端テト
ラペプチドＬｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（ＫＤＥＬ）［Ｍｕｎｒｏｅ，Ｓ．
およびＰｅｈｈａｍ，Ｈ．Ｂ．、Ｃｅｌｌ ４８：８９９−９０７（１９８７）
］が好ましい配列である。ＥＲ残留系の効率は、部分的に、ＫＤＥＬタグ化タン
パク質がシスゴルジネットワークに逸脱した場合、その際にＫＤＥＬタグ化タン
パク質をＥＲに戻す回収機構の存在による［Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｊ．Ｅ．およびＯ
ｒｃｉ，Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：４０９−４１５（１９９２）］。ＥＲは
また、免疫グロブリン分子の正しい折畳みを補助する分子シャペロン（例えば、
ＢｉＰおよびＧＲＰ９４）の存在個所であるので、抗体アセンブリーの天然の部
位である［Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３７３−３７５（
１９９４）］。ＥＲはまた、ＥＲに存在するタンパク質がしばしば、延長された
半減期示すという利点を与える。
されてトラフィッキングタンパク質に結合し、そしてその最終的な行き先からト
ラフィッキングタンパク質を迂回させる多数の点が存在する。ＥＲは、好ましい
位置である。なぜなら、ＥＲは、生合成の初期にタンパク質を捕獲し、そしてＥ
Ｒ内の分解系による免疫複合体の迅速な処理の可能性を生むことを可能にするか
らである［Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．およびＳｉｔｉａ，Ｒ．，Ｃｅｌｌ ６
２：６１１−６１４（１９９０）］。可溶性タンパク質のＥＲ残留に必要とされ
るペプチドシグナルは、充分に特徴付けされており、そしてカルボキシ末端テト
ラペプチドＬｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（ＫＤＥＬ）［Ｍｕｎｒｏｅ，Ｓ．
およびＰｅｈｈａｍ，Ｈ．Ｂ．、Ｃｅｌｌ ４８：８９９−９０７（１９８７）
］が好ましい配列である。ＥＲ残留系の効率は、部分的に、ＫＤＥＬタグ化タン
パク質がシスゴルジネットワークに逸脱した場合、その際にＫＤＥＬタグ化タン
パク質をＥＲに戻す回収機構の存在による［Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｊ．Ｅ．およびＯ
ｒｃｉ，Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：４０９−４１５（１９９２）］。ＥＲは
また、免疫グロブリン分子の正しい折畳みを補助する分子シャペロン（例えば、
ＢｉＰおよびＧＲＰ９４）の存在個所であるので、抗体アセンブリーの天然の部
位である［Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３７３−３７５（
１９９４）］。ＥＲはまた、ＥＲに存在するタンパク質がしばしば、延長された
半減期示すという利点を与える。
【００７４】 レセプターまたはペプチドを発現する全ての細胞でそのレセプターまたはペプ
チドをノックアウトすることは、全ての例で所望されるわけではない。従って、
このような場合には、好ましくは、殺傷したい細胞（例えば、白血病細胞）にお
いて優先的にオンにする誘導性プロモーターを用いる。例えば、所望の細胞にお
いて選択的にオンにする照射により誘導されるプロモーターを用い得る。特定の
細胞の標的化を最大にする別のストラテジーは、標的化部分が、例えば、標的細
胞に関連する第２のタンパク質を標的とする送達系を用いることである。
チドをノックアウトすることは、全ての例で所望されるわけではない。従って、
このような場合には、好ましくは、殺傷したい細胞（例えば、白血病細胞）にお
いて優先的にオンにする誘導性プロモーターを用いる。例えば、所望の細胞にお
いて選択的にオンにする照射により誘導されるプロモーターを用い得る。特定の
細胞の標的化を最大にする別のストラテジーは、標的化部分が、例えば、標的細
胞に関連する第２のタンパク質を標的とする送達系を用いることである。
【００７５】 細胞内発現抗体は、細胞内で目的の分子と結合して複合体を形成する。適切な
標的化シグナル（例えば、ＫＤＥＬのような小胞体残留シグナル）の使用により
、細胞内発現抗体をさらに調整し得る。例えば、ＭＨＣ−１についての抗体を、
（１）標的化シグナルなしで（ｓＦｖＭＨＣ）、および（２）小胞体残留シグナ
ル（ＫＤＥＬ）ありで（ｓＦｖＭＨＣＫＤＥＬ）、調製し得る。次いで、これら
のｓＦｖをコードする遺伝子は、哺乳動物細胞内に挿入され得る。
標的化シグナル（例えば、ＫＤＥＬのような小胞体残留シグナル）の使用により
、細胞内発現抗体をさらに調整し得る。例えば、ＭＨＣ−１についての抗体を、
（１）標的化シグナルなしで（ｓＦｖＭＨＣ）、および（２）小胞体残留シグナ
ル（ＫＤＥＬ）ありで（ｓＦｖＭＨＣＫＤＥＬ）、調製し得る。次いで、これら
のｓＦｖをコードする遺伝子は、哺乳動物細胞内に挿入され得る。
【００７６】 両方の細胞内発現抗体は、細胞の内側で発現される。しかし、ｓＦｖ ＭＨＣ
−１ ＫＤＥＬ細胞内発現抗体はＥＲ内に保持され、一方、ｓＦｖ ＭＨＣ細胞
内発現抗体は細胞を通って移動しつづける。結果として、２つの細胞内発現抗体
は、異なる細胞内部位に結合して複合体を形成する。例えば、ＥＲ細胞内発現抗
体（ｓＦｖＭＨＣＫＤＥＬ）は、ＥＲ内のレセプター鎖に結合してこれを保持す
る。
−１ ＫＤＥＬ細胞内発現抗体はＥＲ内に保持され、一方、ｓＦｖ ＭＨＣ細胞
内発現抗体は細胞を通って移動しつづける。結果として、２つの細胞内発現抗体
は、異なる細胞内部位に結合して複合体を形成する。例えば、ＥＲ細胞内発現抗
体（ｓＦｖＭＨＣＫＤＥＬ）は、ＥＲ内のレセプター鎖に結合してこれを保持す
る。
【００７７】 いくつかの場合に、レセプターの全体としてのノックアウトが所望される場合
、選択マーカーに連結したＩＲＥＳ、および抗体に作動可能に連結された強力な
プロモーターの使用が好ましい。ＭＨＣ−１のような特定のレセプターについて
は、全体的なノックアウトがＮＫ反応を開始し得る。従って、好ましくは、この
ような細胞を、その所望でない免疫反応を開始する能力は欠損しているが、ＮＫ
反応を回避するためにＮＫ反応を開始しないＭＨＣ−１アナログでトランスフェ
クトする。例えば、このようなアナログの１つは、その細胞質ドメインを欠くＭ
ＨＣ−１分子である。従って、ＮＫ細胞が認識するＭＨＣ−１の細胞外部分は存
在するが、免疫反応のシグナルを送りそして免疫反応を開始する細胞内部分は存
在しない。この目的を達成し得る他のアナログは、当業者により容易に調製され
得る。
、選択マーカーに連結したＩＲＥＳ、および抗体に作動可能に連結された強力な
プロモーターの使用が好ましい。ＭＨＣ−１のような特定のレセプターについて
は、全体的なノックアウトがＮＫ反応を開始し得る。従って、好ましくは、この
ような細胞を、その所望でない免疫反応を開始する能力は欠損しているが、ＮＫ
反応を回避するためにＮＫ反応を開始しないＭＨＣ−１アナログでトランスフェ
クトする。例えば、このようなアナログの１つは、その細胞質ドメインを欠くＭ
ＨＣ−１分子である。従って、ＮＫ細胞が認識するＭＨＣ−１の細胞外部分は存
在するが、免疫反応のシグナルを送りそして免疫反応を開始する細胞内部分は存
在しない。この目的を達成し得る他のアナログは、当業者により容易に調製され
得る。
【００７８】 上記の方法論を用いて、特定のタンパク質（例えば、所望でない免疫応答を生
じる、ＩＲＭまたは抗原）の発現により引き起こされる病気を罹患している哺乳
動物（好ましくはヒト）を処置し得る。例えば、所望でない抗原に特異的に結合
する抗体を用いて、このような抗原を標的化し得る。細胞内発現を可能にする条
件下で、抗体を発現し得る有効量の遺伝子を、所望でない標的抗原の発現に感受
性の細胞に送達する。他の例では、この方法は、予防的処置として用いられて、
例えば、タンパク質のプロセシングおよびレセプターの発現を防ぐことによって
、このような細胞が、所望でない抗原により有害な影響を受けるのを防ぐかまた
はそれを困難にし得る。多数の標的が存在する場合、１つの好ましい標的は、小
胞体によりプロセシングされるタンパク質である。任意の抗体遺伝子の細胞内送
達は、上記のような遺伝子治療技術のような手順を用いて達成され得る。抗体は
、上記のように任意の抗体であり得る。本発明者らは、本明細書中で、組織移植
用に調製するため、または自己免疫疾患を処置するために、哺乳動物（例えば、
ヒト）の免疫応答（例えば、Ｔ細胞）を変えるために、抗体遺伝子をＴ細胞に送
達するこの系の使用を議論する。しかし、本開示に基づいて、例えば、レセプタ
ー異常を有する個体に、または特定の抗原に対する免疫応答を予防するために、
このようなアプローチを他の系に容易に適応させ得ることを理解されるべきであ
る。さらに、この系を用いて、レセプター発現を一過的に予防し得、それにより
所望でないＴ細胞媒介反応（例えば、同種移植片拒絶）をブロックし得る。
じる、ＩＲＭまたは抗原）の発現により引き起こされる病気を罹患している哺乳
動物（好ましくはヒト）を処置し得る。例えば、所望でない抗原に特異的に結合
する抗体を用いて、このような抗原を標的化し得る。細胞内発現を可能にする条
件下で、抗体を発現し得る有効量の遺伝子を、所望でない標的抗原の発現に感受
性の細胞に送達する。他の例では、この方法は、予防的処置として用いられて、
例えば、タンパク質のプロセシングおよびレセプターの発現を防ぐことによって
、このような細胞が、所望でない抗原により有害な影響を受けるのを防ぐかまた
はそれを困難にし得る。多数の標的が存在する場合、１つの好ましい標的は、小
胞体によりプロセシングされるタンパク質である。任意の抗体遺伝子の細胞内送
達は、上記のような遺伝子治療技術のような手順を用いて達成され得る。抗体は
、上記のように任意の抗体であり得る。本発明者らは、本明細書中で、組織移植
用に調製するため、または自己免疫疾患を処置するために、哺乳動物（例えば、
ヒト）の免疫応答（例えば、Ｔ細胞）を変えるために、抗体遺伝子をＴ細胞に送
達するこの系の使用を議論する。しかし、本開示に基づいて、例えば、レセプタ
ー異常を有する個体に、または特定の抗原に対する免疫応答を予防するために、
このようなアプローチを他の系に容易に適応させ得ることを理解されるべきであ
る。さらに、この系を用いて、レセプター発現を一過的に予防し得、それにより
所望でないＴ細胞媒介反応（例えば、同種移植片拒絶）をブロックし得る。
【００７９】 レセプター（例えば、ＭＨＣ−１レセプター）が長期の生存の間、活性である
特定の細胞については、細胞内発現抗体のみを異常細胞に選択的に投与するため
の手段が必要である。上記のように多数の手段（マイクロカテーテル、誘導性プ
ロモーター、および細胞内発現抗体の選択的投与を可能にする結合体）が存在す
る。例えば、マイクロカテーテルを用いて、抗体カセットを含む溶液を細胞に送
達し得る。あるいは、抗体の発現は、誘導性プロモーターにより制御され得る。
このようなプロモーターは、標的、または照射のような外部供給源の効果により
活性化され得る。このような細胞では、抗体の混合物を含む悪性「カクテル」を
用いて多数のレセプターを標的化し得る。別の場合には、選択により、細胞内発
現抗体を「オフ」にするか、または生存のためにもはやレセプターを必要としな
い、細胞の樹立を導き得る。これらの細胞については、１回でのタンパク質の使
用が所望される。なぜなら、これは、抗体を回避し得るタンパク質を生成するよ
うに変異体が進化することをより困難にするからである。このような「カクテル
」は、一緒にまたは同時トランスフェクションにより投与され得る。同じ細胞内
領域内の約３以下の、好ましくは約２以下の、タンパク質が標的化されることが
好ましい。別の細胞内標的が異なる細胞内領域（すなわち、核対小胞体）に存在
する限り、これはまた、抗体産生に有害な影響を与えずに標的化され得る。これ
は、異なる局在化配列を用いて行われ得る。いくつかの標的が１つの位置で抗体
に結合せず、そして例えば、さらにプロセシングされる場合、これは、次の位置
で標的化され得る。あるいは、分子の異なるエピトープを標的化する複数の抗体
を用い得る。
特定の細胞については、細胞内発現抗体のみを異常細胞に選択的に投与するため
の手段が必要である。上記のように多数の手段（マイクロカテーテル、誘導性プ
ロモーター、および細胞内発現抗体の選択的投与を可能にする結合体）が存在す
る。例えば、マイクロカテーテルを用いて、抗体カセットを含む溶液を細胞に送
達し得る。あるいは、抗体の発現は、誘導性プロモーターにより制御され得る。
このようなプロモーターは、標的、または照射のような外部供給源の効果により
活性化され得る。このような細胞では、抗体の混合物を含む悪性「カクテル」を
用いて多数のレセプターを標的化し得る。別の場合には、選択により、細胞内発
現抗体を「オフ」にするか、または生存のためにもはやレセプターを必要としな
い、細胞の樹立を導き得る。これらの細胞については、１回でのタンパク質の使
用が所望される。なぜなら、これは、抗体を回避し得るタンパク質を生成するよ
うに変異体が進化することをより困難にするからである。このような「カクテル
」は、一緒にまたは同時トランスフェクションにより投与され得る。同じ細胞内
領域内の約３以下の、好ましくは約２以下の、タンパク質が標的化されることが
好ましい。別の細胞内標的が異なる細胞内領域（すなわち、核対小胞体）に存在
する限り、これはまた、抗体産生に有害な影響を与えずに標的化され得る。これ
は、異なる局在化配列を用いて行われ得る。いくつかの標的が１つの位置で抗体
に結合せず、そして例えば、さらにプロセシングされる場合、これは、次の位置
で標的化され得る。あるいは、分子の異なるエピトープを標的化する複数の抗体
を用い得る。
【００８０】 最終的に、抗体結合体は、異常な細胞を標的化するために用いられ得る。例え
ば、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を細胞に運搬するのにレセプター媒介エンドサ
イトーシスを用いる、細胞特異的遺伝子移入機構を用いて遺伝子が送達され得る
。例えば、異常な細胞上のレセプターに対する抗体を用いる。
ば、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を細胞に運搬するのにレセプター媒介エンドサ
イトーシスを用いる、細胞特異的遺伝子移入機構を用いて遺伝子が送達され得る
。例えば、異常な細胞上のレセプターに対する抗体を用いる。
【００８１】 細胞を標的化するために用いられる抗体を結合部分に、スクシンイミジル−３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような試薬を用いる改
変後にジスルフィド結合を介する連結によりカップリングして、抗体結合部分を
形成し得る。抗体結合部分複合体は、融合タンパク質を、抗体カセットを保有す
る部分、すなわち、プロモーターに作動可能に連結された抗体を含むＤＮＡ配列
（例えば、プラスミドまたはベクター）と混合することにより産生される。別の
ベクターは、ポリリジン（ｐｏｌｙｙｓｉｎｅ）を結合部分として用いる。
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような試薬を用いる改
変後にジスルフィド結合を介する連結によりカップリングして、抗体結合部分を
形成し得る。抗体結合部分複合体は、融合タンパク質を、抗体カセットを保有す
る部分、すなわち、プロモーターに作動可能に連結された抗体を含むＤＮＡ配列
（例えば、プラスミドまたはベクター）と混合することにより産生される。別の
ベクターは、ポリリジン（ｐｏｌｙｙｓｉｎｅ）を結合部分として用いる。
【００８２】 上記のように、抗体との連結は、ＳＰＤＰを用いて達成され得る。第１のジチ
オピリジン基が、両方の抗体に、または例えばポリリジンにＳＰＤＰによって導
入され、次いで、例えば、ポリリジン中の基が還元されて遊離のスルフヒドリル
化合物を与え得、これは上記のように改変された抗体と混合された際に反応して
所望のジスルフィド結合結合体を与える。これらの結合体は、カチオン交換クロ
マトグラフィーを用いるような従来技術により精製され得る。例えば、Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｍｏｎｏ Ｓカラム、ＨＲ １０／１０。次いで、これらの結合体
は、抗体カセットと、結合を可能にする条件下で混合される。例えば、２５℃で
１時間インキュベートし、次いで０．１５Ｍ生理食塩水に対して、所望の分子量
限界を有する膜を介して２４時間透析する。このような膜は、例えば、Ｓｐｅｃ
ｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能であり得る。
オピリジン基が、両方の抗体に、または例えばポリリジンにＳＰＤＰによって導
入され、次いで、例えば、ポリリジン中の基が還元されて遊離のスルフヒドリル
化合物を与え得、これは上記のように改変された抗体と混合された際に反応して
所望のジスルフィド結合結合体を与える。これらの結合体は、カチオン交換クロ
マトグラフィーを用いるような従来技術により精製され得る。例えば、Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｍｏｎｏ Ｓカラム、ＨＲ １０／１０。次いで、これらの結合体
は、抗体カセットと、結合を可能にする条件下で混合される。例えば、２５℃で
１時間インキュベートし、次いで０．１５Ｍ生理食塩水に対して、所望の分子量
限界を有する膜を介して２４時間透析する。このような膜は、例えば、Ｓｐｅｃ
ｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能であり得る。
【００８３】 好ましくは、本発明のベクターは、発現させるために内部リボソーム侵入部位
（ＩＲＥＳ）配列を用いる。１９９５年１０月１６日に出願された出願第６０／
００５，３５９号に開示されるように、ＩＲＥＳの使用は、所望の遺伝子、例え
ば、ｓＦｖの「強制発現」を可能にする。別の実施態様では、軽鎖および重鎖の
、例えばＦａｂでの化学量論的発現をさせるＩＲＥＳを用い得る。この強制発現
は、所望のタンパク質を発現する細胞が、表現型的に見られないという、広範囲
の遺伝子産物について生じ得る「サイレンシング」の問題を回避する。別の実施
態様は、ＩＲＥＳ配列を用いることを含み、目的のＩＲＭに対する単鎖細胞内発
現抗体を選択マーカーと連結し得る。選択マーカーは、当該分野で周知である（
例えば、栄養素、抗生物質などのような刺激に対する細胞の感受性を変化させる
タンパク質を発現する遺伝子）。これらの遺伝子の例としては、ｎｅｏ ｐｕｒ
ｏ、ｔｋ、多剤耐性（ＭＤＲ）などが挙げられる。
（ＩＲＥＳ）配列を用いる。１９９５年１０月１６日に出願された出願第６０／
００５，３５９号に開示されるように、ＩＲＥＳの使用は、所望の遺伝子、例え
ば、ｓＦｖの「強制発現」を可能にする。別の実施態様では、軽鎖および重鎖の
、例えばＦａｂでの化学量論的発現をさせるＩＲＥＳを用い得る。この強制発現
は、所望のタンパク質を発現する細胞が、表現型的に見られないという、広範囲
の遺伝子産物について生じ得る「サイレンシング」の問題を回避する。別の実施
態様は、ＩＲＥＳ配列を用いることを含み、目的のＩＲＭに対する単鎖細胞内発
現抗体を選択マーカーと連結し得る。選択マーカーは、当該分野で周知である（
例えば、栄養素、抗生物質などのような刺激に対する細胞の感受性を変化させる
タンパク質を発現する遺伝子）。これらの遺伝子の例としては、ｎｅｏ ｐｕｒ
ｏ、ｔｋ、多剤耐性（ＭＤＲ）などが挙げられる。
【００８４】 このＩＲＥＳ連結の得られる産物は、融合タンパク質ではなく、そしてこれら
はその正常な生物学的機能を示す。従って、これらのベクターの使用は、所望の
タンパク質の強制発現を可能にする。
はその正常な生物学的機能を示す。従って、これらのベクターの使用は、所望の
タンパク質の強制発現を可能にする。
【００８５】 ＩＲＥＳ配列は、ＤＮＡの転写に作用するプロモーターの作用とは対照的に、
ＲＮＡの翻訳効率の改善に作用する。多数の異なるＩＲＥＳ配列が公知であり、
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）［Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５８４８−５８５９（１９９１）］；ＢｉＰタンパク質［
ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１（１９９１）
］；ＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ遺伝子（エキソンｄお
よびｅ）［Ｏｈら，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１６４３−
１６５３（１９９２）］由来の配列；ならびにポリオウイルス中の配列［Ｐｅｌ
ｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０−３２
５（１９８８）；ＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ，ＴＩＧ １１，１７９
−１８４（１９８５）もまた参照のこと］を含む。
ＲＮＡの翻訳効率の改善に作用する。多数の異なるＩＲＥＳ配列が公知であり、
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）［Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５８４８−５８５９（１９９１）］；ＢｉＰタンパク質［
ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１（１９９１）
］；ＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ遺伝子（エキソンｄお
よびｅ）［Ｏｈら，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１６４３−
１６５３（１９９２）］由来の配列；ならびにポリオウイルス中の配列［Ｐｅｌ
ｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０−３２
５（１９８８）；ＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ，ＴＩＧ １１，１７９
−１８４（１９８５）もまた参照のこと］を含む。
【００８６】 ＩＲＥＳ配列は、代表的には、遺伝子の５’非コード領域に見出される。文献
中のものに加えて、これらは経験的に、発現をもたらす遺伝的配列を探し、次い
でこの配列がＤＮＡに影響を与える（すなわち、プロモーターまたはエンハンサ
ーとして作用する）か、またはＲＮＡのみに影響を与える（ＩＲＥＳ配列として
作用する）かを決定することにより見出され得る。
中のものに加えて、これらは経験的に、発現をもたらす遺伝的配列を探し、次い
でこの配列がＤＮＡに影響を与える（すなわち、プロモーターまたはエンハンサ
ーとして作用する）か、またはＲＮＡのみに影響を与える（ＩＲＥＳ配列として
作用する）かを決定することにより見出され得る。
【００８７】 これらのＩＲＥＳ配列を、人工構築物（例えば、Ｍａｒａｓｃｏらに対する１
９９４年２月２２日出願の米国特許出願第０８／１９９，０７０号；ＰＣＴ第Ｐ
ＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０において）からＤＮＡおよびＲＮＡベクターの範囲
にわたる広範なベクターにおいて用い得る。ＤＮＡベクターとしては、ヘルペス
ウイルスベクター、ポックスウイルスベクターなどが挙げられる。ＲＮＡベクタ
ーが好ましい。なおさらに好ましくは、レトロウイルスベクター（例えば、モロ
ニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭＭＬＶ）またはレンチウイルスベクター
（例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ）など）を用いる。これらのベクターは、時々、欠損
ベクターと呼ばれ、そして本明細書中で用いられるように、この用語は、このベ
クターが、感染能力を保持するが、生産性の野生型疾患の確立をもたらさないよ
うに改変されていることを意味する。
９９４年２月２２日出願の米国特許出願第０８／１９９，０７０号；ＰＣＴ第Ｐ
ＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０において）からＤＮＡおよびＲＮＡベクターの範囲
にわたる広範なベクターにおいて用い得る。ＤＮＡベクターとしては、ヘルペス
ウイルスベクター、ポックスウイルスベクターなどが挙げられる。ＲＮＡベクタ
ーが好ましい。なおさらに好ましくは、レトロウイルスベクター（例えば、モロ
ニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭＭＬＶ）またはレンチウイルスベクター
（例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ）など）を用いる。これらのベクターは、時々、欠損
ベクターと呼ばれ、そして本明細書中で用いられるように、この用語は、このベ
クターが、感染能力を保持するが、生産性の野生型疾患の確立をもたらさないよ
うに改変されていることを意味する。
【００８８】 ＩＲＭに対するｓＦｖを含む強制発現ベクターは、インビトロからインビボの
範囲の種々の異なる系において用いられ得る。例えば、エキソビボでの研究が、
組織（例えば、角膜または骨髄）について、または培養され得る細胞について実
施され得る。従って、本系は、移植のために骨髄細胞を形質転換して、このよう
な細胞に対して特に有用である。本系はまた、上記のように、組織移植拒絶を防
止するため、または自己免疫疾患を処置するためなどにインビボで用いられ得る
。
範囲の種々の異なる系において用いられ得る。例えば、エキソビボでの研究が、
組織（例えば、角膜または骨髄）について、または培養され得る細胞について実
施され得る。従って、本系は、移植のために骨髄細胞を形質転換して、このよう
な細胞に対して特に有用である。本系はまた、上記のように、組織移植拒絶を防
止するため、または自己免疫疾患を処置するためなどにインビボで用いられ得る
。
【００８９】 発現ベクターは、当該分野で周知の任意の広範囲の技術（電気泳動、リン酸カ
ルシウム沈殿、カテーテル、リポソームなどを含む）によって細胞を形質転換す
るために用いられ得る。
ルシウム沈殿、カテーテル、リポソームなどを含む）によって細胞を形質転換す
るために用いられ得る。
【００９０】 標的細胞を処置するために、これらのベクターは、インビトロで細胞に導入さ
れ、形質導入された細胞は哺乳動物宿主に注射され得るか、またはベクターは、
例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞に結合し、次いで取り込まれる場合は、ヒトのよう
な哺乳動物宿主に注射され得る。インビボでの遺伝子発現の効率を増加させるた
めに、抗体カセットは、エピソーム哺乳動物発現ベクターの一部であり得る。例
えば、哺乳動物細胞における染色体外複製のためにヒトパポバウイルス（Ｐａｐ
ｐｏｖａ ｖｉｒｕｓ）（ＢＫ）の複製起点およびＢＫラージＴ抗原を含むベク
ター、高コピー数のエピソーム複製を可能にするエプスタイン−バー（ＥＢ）ウ
イルスの複製起点および核抗原（ＥＢＮＡ−１）を含むベクター。他の哺乳動物
発現ベクター（例えば、ヘルペスウイルス発現ベクターまたはポックスウイルス
発現ベクター）もまた用いられ得る。このようなベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ Ｃｏｒｐ．を含む広範囲の多数の供給源から利用可能である。抗体カセッ
トは、標準的な技術により、例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いて発現ベク
ターに挿入され、そしてこれをこのような哺乳動物発現ベクター中の特定の部位
に挿入する。これらの発現ベクターは、抗体−ポリリジン結合体と混合され得、
そして抗体カセット複合体を含む、得られる抗体−ポリリジン発現ベクターは、
本明細書中に含まれる開示に基づいて容易に作製され得る。
れ、形質導入された細胞は哺乳動物宿主に注射され得るか、またはベクターは、
例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞に結合し、次いで取り込まれる場合は、ヒトのよう
な哺乳動物宿主に注射され得る。インビボでの遺伝子発現の効率を増加させるた
めに、抗体カセットは、エピソーム哺乳動物発現ベクターの一部であり得る。例
えば、哺乳動物細胞における染色体外複製のためにヒトパポバウイルス（Ｐａｐ
ｐｏｖａ ｖｉｒｕｓ）（ＢＫ）の複製起点およびＢＫラージＴ抗原を含むベク
ター、高コピー数のエピソーム複製を可能にするエプスタイン−バー（ＥＢ）ウ
イルスの複製起点および核抗原（ＥＢＮＡ−１）を含むベクター。他の哺乳動物
発現ベクター（例えば、ヘルペスウイルス発現ベクターまたはポックスウイルス
発現ベクター）もまた用いられ得る。このようなベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ Ｃｏｒｐ．を含む広範囲の多数の供給源から利用可能である。抗体カセッ
トは、標準的な技術により、例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いて発現ベク
ターに挿入され、そしてこれをこのような哺乳動物発現ベクター中の特定の部位
に挿入する。これらの発現ベクターは、抗体−ポリリジン結合体と混合され得、
そして抗体カセット複合体を含む、得られる抗体−ポリリジン発現ベクターは、
本明細書中に含まれる開示に基づいて容易に作製され得る。
【００９１】 十分な量のこれらのベクターを注射して、約０．０５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／
ｍｌの抗体結合体の範囲の血清濃度を得る。より好ましくは、約０．１μｇ／ｍ
ｌ〜１０μｇ／ｍｌである。さらにより好ましくは、約０．５μｇ／ｍｌ〜１０
μｇ／ｍｌである。
ｍｌの抗体結合体の範囲の血清濃度を得る。より好ましくは、約０．１μｇ／ｍ
ｌ〜１０μｇ／ｍｌである。さらにより好ましくは、約０．５μｇ／ｍｌ〜１０
μｇ／ｍｌである。
【００９２】 これらのベクターは、任意の種々の手段（例えば、非経口注射（筋肉内（Ｉ．
Ｍ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、頭蓋内（Ｉ．Ｃ．）もしく
は皮下（Ｓ．Ｃ．））、経口または他の公知の投与経路）により投与され得る。
代表的には非経口注射が好ましい。
Ｍ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、頭蓋内（Ｉ．Ｃ．）もしく
は皮下（Ｓ．Ｃ．））、経口または他の公知の投与経路）により投与され得る。
代表的には非経口注射が好ましい。
【００９３】 この物質は、任意の便利な手段により投与され得る。例えば、物質は、スクロ
ース、ラクトース、または澱粉のような不活性キャリアと混合され得る。物質は
、錠剤、カプセル剤、および丸剤の形態であり得る。物質は、リポソームまたは
他のカプセル化手段の形態であり得る。物質はまた、エアロゾルの一部であり得
る。非経口投与のためには、物質は、代表的には、滅菌された水性または非水性
の溶液、懸濁液、またはエマルジョン中で薬学的に受容可能な非経口キャリア（
例えば、生理食塩水）とともに注射される。
ース、ラクトース、または澱粉のような不活性キャリアと混合され得る。物質は
、錠剤、カプセル剤、および丸剤の形態であり得る。物質は、リポソームまたは
他のカプセル化手段の形態であり得る。物質はまた、エアロゾルの一部であり得
る。非経口投与のためには、物質は、代表的には、滅菌された水性または非水性
の溶液、懸濁液、またはエマルジョン中で薬学的に受容可能な非経口キャリア（
例えば、生理食塩水）とともに注射される。
【００９４】 上記の任意の形態のこれらの物質を含むキットもまた包含される。好ましくは
、キットは、上記の教示に従うこれらの細胞内発現抗体の使用説明書を含む。
、キットは、上記の教示に従うこれらの細胞内発現抗体の使用説明書を含む。
【００９５】 本発明の１方法では、本発明者らは、ＭＨＣ−１分子に対する、ＥＲ指向性お
よびＫＤＥＬ含有ｓＦｖ細胞内発現抗体を生成した。８ｋ ｓＦｖは、ハイブリ
ドーマにおいて実際に発現される分子である。この場合、重鎖は、乱雑であり、
そして抗ＭＨＣ−１５ｋフラグメントもまた用いられ得る（図２ａおよび２ｂを
参照のこと）。しかし、抗ＭＨＣ−１−８ｋが好ましく、そしてこれは細胞中で
実際に発現される。
よびＫＤＥＬ含有ｓＦｖ細胞内発現抗体を生成した。８ｋ ｓＦｖは、ハイブリ
ドーマにおいて実際に発現される分子である。この場合、重鎖は、乱雑であり、
そして抗ＭＨＣ−１５ｋフラグメントもまた用いられ得る（図２ａおよび２ｂを
参照のこと）。しかし、抗ＭＨＣ−１−８ｋが好ましく、そしてこれは細胞中で
実際に発現される。
【００９６】 これらの構築物は、原核生物および真核生物発現ベクター（それぞれ、ｐＨＥ
ＮおよびｐＲｃ／ＣＭＶおよびｐＣＭＶ４）においてクローニングされた。ヒト
ＣＤ４＋ Ｔリンパ球細胞を、ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＣＭＶ４ベクター中のｓ
ＦｖｈＭＨＣ−１でトランスフェクトした。ＭＨＣ−１分子の細胞表面発現は、
免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーにより分析された。この結果は、ｓＦ
ｖが発現されること（図３）、ならびにＭＨＣ−１分子のαおよびβ2ミクログ ロブリン鎖がｓＦｖＭＨＣ−１分子とともに同時免疫沈降可能であることを示す
。従って、細胞内発現抗体は、発現され、そしてその標的に細胞内で結合し得た
。本発明者らはまた、ＥＲ内でｓＦｖｈＭＨＣ−１を構成的に発現するＣＤ４＋
細胞が、ＭＨＣ−１細胞表面発現を効果的に阻害することを見出した。
ＮおよびｐＲｃ／ＣＭＶおよびｐＣＭＶ４）においてクローニングされた。ヒト
ＣＤ４＋ Ｔリンパ球細胞を、ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＣＭＶ４ベクター中のｓ
ＦｖｈＭＨＣ−１でトランスフェクトした。ＭＨＣ−１分子の細胞表面発現は、
免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーにより分析された。この結果は、ｓＦ
ｖが発現されること（図３）、ならびにＭＨＣ−１分子のαおよびβ2ミクログ ロブリン鎖がｓＦｖＭＨＣ−１分子とともに同時免疫沈降可能であることを示す
。従って、細胞内発現抗体は、発現され、そしてその標的に細胞内で結合し得た
。本発明者らはまた、ＥＲ内でｓＦｖｈＭＨＣ−１を構成的に発現するＣＤ４＋
細胞が、ＭＨＣ−１細胞表面発現を効果的に阻害することを見出した。
【００９７】 本発明は、以下の実施例によりさらに例示される。実施例は本発明の理解を助
けるために提供され、本発明の限定としては解釈されない。
けるために提供され、本発明の限定としては解釈されない。
【００９８】 （実施例） （小胞体（ＥＲ）で発現されるｓＦｖｈＭＨＣ−１の構築） ヒトＭＨＣ−１に対するＥＲ指向性およびＫＤＥＬ含有単鎖細胞内発現抗体を
、ＡＴＣＣ ＨＢ９４ハイブリドーマ細胞（融合物名ＢＢ７．７、抗ＨＬＡ−Ａ
、Ｂ、Ｃ）を用いて作製した。この抗体は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、およびβ2ミ クログロブリンのコンビナトリアル決定基と反応する。ＨＢ９４細胞を用いて、
ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを単離した。
、ＡＴＣＣ ＨＢ９４ハイブリドーマ細胞（融合物名ＢＢ７．７、抗ＨＬＡ−Ａ
、Ｂ、Ｃ）を用いて作製した。この抗体は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、およびβ2ミ クログロブリンのコンビナトリアル決定基と反応する。ＨＢ９４細胞を用いて、
ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを単離した。
【００９９】 正方向マウスＶＨプライマー５’−ｃｃ−ｃｔｃ−ｔａｇ−ａｃａ−ｔａｔ−
ｇｔｇ−ａａｔ−ｔｃｃ−ａｃｃ−ａｔｇ−ｇｃｃ−ｃａｇ−ｇｔｃ（配列番号
５３）、および逆方向ＪＨプライマー５’−ｔｇ（ａ／ｃ）−ｇｇａ−ｇａｃ−
ｇｇｔ−ｇａｃ−ｃ（ａ／ｇ）（ａ／ｔ）−ｇｇｔ−ｃｃｃ−ｔ（配列番号５４
）を用いて、Ｖｋフラグメントを増幅した。ＶＨおよびＶｋフラグメントを、重
複伸長ＰＣＲ［Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６
２８（１９９１）］を用いて（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1）3鎖間リンカーを介して連結し た。
ｇｔｇ−ａａｔ−ｔｃｃ−ａｃｃ−ａｔｇ−ｇｃｃ−ｃａｇ−ｇｔｃ（配列番号
５３）、および逆方向ＪＨプライマー５’−ｔｇ（ａ／ｃ）−ｇｇａ−ｇａｃ−
ｇｇｔ−ｇａｃ−ｃ（ａ／ｇ）（ａ／ｔ）−ｇｇｔ−ｃｃｃ−ｔ（配列番号５４
）を用いて、Ｖｋフラグメントを増幅した。ＶＨおよびＶｋフラグメントを、重
複伸長ＰＣＲ［Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６
２８（１９９１）］を用いて（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ1）3鎖間リンカーを介して連結し た。
【０１００】 本発明者らは、２つの特異的Ｖκ鎖を単離し、従って本発明者らは、抗ＭＨＣ
−１−５ｋおよび抗ＭＨＣ−１−８ｋ ｓＦｖとして標識された、２つのシリー
ズのｓＦｖを有していた。これらは、類似する重鎖および異なるκ鎖を有する２
つの異なる抗ＭＨＣ−ｓＦｖを示す。両方とも、ＥＲ保持に特異的なＣ末端ＳＥ
ＫＤＥＬ配列を有していた。これらのヌクレオチド配列およびアミノ酸一次配列
を、図２ａ（ｓＦｖｈＭＨＣ−１−５ｋ）および図２ｂ（ｓＦｖｈＭＨＣ−１−
８ｋ）に示す。
−１−５ｋおよび抗ＭＨＣ−１−８ｋ ｓＦｖとして標識された、２つのシリー
ズのｓＦｖを有していた。これらは、類似する重鎖および異なるκ鎖を有する２
つの異なる抗ＭＨＣ−ｓＦｖを示す。両方とも、ＥＲ保持に特異的なＣ末端ＳＥ
ＫＤＥＬ配列を有していた。これらのヌクレオチド配列およびアミノ酸一次配列
を、図２ａ（ｓＦｖｈＭＨＣ−１−５ｋ）および図２ｂ（ｓＦｖｈＭＨＣ−１−
８ｋ）に示す。
【０１０１】 構築物を、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｅｍｂｏ Ｊ １４：１５４
２−１５５１（１９９５）に記載の方法に従って原核生物性発現ベクター（ｐＨ
ＥＮ）および真核生物発現ベクター（ｐＲｃ／ＣＭＶおよびｐＣＭＶ４）中にク
ローニングした。
２−１５５１（１９９５）に記載の方法に従って原核生物性発現ベクター（ｐＨ
ＥＮ）および真核生物発現ベクター（ｐＲｃ／ＣＭＶおよびｐＣＭＶ４）中にク
ローニングした。
【０１０２】 ｐＨＥＮ構築物を用いて、ｓＦｖタンパク質をＥ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔から
単離し、そしてｐＲｃ／ＣＭＶおよびｐＣＭＶ４構築物を用いてインビトロ転写
および翻訳を分析し、そして一過性のｓＦｖｈＭＨＣ−１発現細胞および安定な
ｓＦｖｈＭＨＣ−１発現細胞を生成した。
単離し、そしてｐＲｃ／ＣＭＶおよびｐＣＭＶ４構築物を用いてインビトロ転写
および翻訳を分析し、そして一過性のｓＦｖｈＭＨＣ−１発現細胞および安定な
ｓＦｖｈＭＨＣ−１発現細胞を生成した。
【０１０３】 （細胞培養） ヒトＣＤ４+ Ｔリンパ球細胞株、ＳｕｐＴ１およびＪｕｒｋａｔを、１０％ ウシ胎児血清、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０
０μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃および５％ Ｃ
Ｏ2にて培養した。上皮細胞株ＣＯＳ−１細胞を、１０％ウシ胎児血清および抗 生物質を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。
０μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃および５％ Ｃ
Ｏ2にて培養した。上皮細胞株ＣＯＳ−１細胞を、１０％ウシ胎児血清および抗 生物質を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。
【０１０４】 （哺乳動物細胞におけるｓＦｖｈＭＨＣ−１の細胞内発現） 種々のｓＦｖｈＭＨＣ−１の一過性および構成性発現を検出し、そして免疫沈
降およびＦＡＣＳ分析により分析した。用いた方法は以下の通りであった： （免疫沈降） １０7細胞（一過性トランスフェクションまたは安定発現細胞のいずれか）を １００ｍｍペトリプレート中においた。一過性トランスフェクションについては
、細胞（ＣＯＳ−１）を、トランスフェクションの２４時間前に上記の密度でプ
レーティングした。トランスフェクションのＤＥＡＥ−デキストラン方法を用い
た［Ｆｕｊｉｔａら，Ｃｅｌｌ ４６：４０１−４０７（１９８６）］。手短に
は、１０μｇのスーパーコイルプラスミドＤＮＡ（ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＣＭ
Ｖ４ベクター中のｓＦｖｈＭＨＣ−１）を、１．８ｍＬのＰＢＳで希釈し、そし
て１００μＬのＤＥＡＥ−デキストラン（水で作製した１０ｍｇ／ｍＬストック
）をこの混合物に添加した。接着細胞を、トランスフェクション前にＰＢＳで２
回洗浄した。
降およびＦＡＣＳ分析により分析した。用いた方法は以下の通りであった： （免疫沈降） １０7細胞（一過性トランスフェクションまたは安定発現細胞のいずれか）を １００ｍｍペトリプレート中においた。一過性トランスフェクションについては
、細胞（ＣＯＳ−１）を、トランスフェクションの２４時間前に上記の密度でプ
レーティングした。トランスフェクションのＤＥＡＥ−デキストラン方法を用い
た［Ｆｕｊｉｔａら，Ｃｅｌｌ ４６：４０１−４０７（１９８６）］。手短に
は、１０μｇのスーパーコイルプラスミドＤＮＡ（ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＣＭ
Ｖ４ベクター中のｓＦｖｈＭＨＣ−１）を、１．８ｍＬのＰＢＳで希釈し、そし
て１００μＬのＤＥＡＥ−デキストラン（水で作製した１０ｍｇ／ｍＬストック
）をこの混合物に添加した。接着細胞を、トランスフェクション前にＰＢＳで２
回洗浄した。
【０１０５】 ＤＮＡ−ＤＥＡＥ−デキストラン混合物を、細胞上に重層し、そしてプレート
を３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞を、クロロアクイン（ｃｈｌｏ
ｒｏａｑｕｉｎｅ）（最終濃度８０μＭ）と５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地中で反
応させ、そして３７℃にてさらに２．５時間インキュベートした。培地を吸引し
、そして５％ ＤＭＳＯを有する５ｍＬの新鮮な無血清ＤＭＥＭによって置換し
た。さらに２．５分間のインキュベーション後、培地を捨て、そして細胞をＰＢ
Ｓで２回洗浄し、そして７ｍＬの新鮮な１０％ウシ胎児血清ＤＭＥＭ培地を添加
し、そして細胞を代謝標識で処理するかまたは増殖する安定な細胞についてネオ
マイシン選択に曝露するまでインキュベートした（トランスフェクションの４８
〜６０時間後）。
を３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞を、クロロアクイン（ｃｈｌｏ
ｒｏａｑｕｉｎｅ）（最終濃度８０μＭ）と５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地中で反
応させ、そして３７℃にてさらに２．５時間インキュベートした。培地を吸引し
、そして５％ ＤＭＳＯを有する５ｍＬの新鮮な無血清ＤＭＥＭによって置換し
た。さらに２．５分間のインキュベーション後、培地を捨て、そして細胞をＰＢ
Ｓで２回洗浄し、そして７ｍＬの新鮮な１０％ウシ胎児血清ＤＭＥＭ培地を添加
し、そして細胞を代謝標識で処理するかまたは増殖する安定な細胞についてネオ
マイシン選択に曝露するまでインキュベートした（トランスフェクションの４８
〜６０時間後）。
【０１０６】 免疫沈降について、一過性にトランスフェクトされた細胞株または安定な細胞
株を、システインを含まないＰＲＭＩ培地に（２時間）曝露し、次いで１００〜
１５０μＣｉの35Ｓ−システインで代謝性標識した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し
、そしてＲＩＰＡ+溶解産物緩衝液で溶解させた。細胞溶解産物からの可溶性タ ンパク質を、ウサギ抗マウスＩｇＧ（分子全体、Ｓｉｇｍａ）タグ化プロテイン
Ａセファロースビーズを用いて免疫沈降させた。タンパク質を、１２．５％ Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した［Ｌ
ａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０）
］。
株を、システインを含まないＰＲＭＩ培地に（２時間）曝露し、次いで１００〜
１５０μＣｉの35Ｓ−システインで代謝性標識した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し
、そしてＲＩＰＡ+溶解産物緩衝液で溶解させた。細胞溶解産物からの可溶性タ ンパク質を、ウサギ抗マウスＩｇＧ（分子全体、Ｓｉｇｍａ）タグ化プロテイン
Ａセファロースビーズを用いて免疫沈降させた。タンパク質を、１２．５％ Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した［Ｌ
ａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０）
］。
【０１０７】 非接着Ｔリンパ球細胞株（Ｓｕｐ Ｔ１およびＪｕｒｋａｔ）の（一過性およ
び安定の両方の）トランスフェクションをまた、ＤＥＡＥ−デキストラン／エレ
クトロポレーション法を用いて行った。手短には、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し
、そして０．８ｍＬの無血清ＲＰＭＩ培地中に懸濁し、この中に１０μｇのプラ
スミドＤＮＡおよび１２．５μＬのＤＥＡＥ−デキストラン（１０ｍｇ／ｍＬ）
を添加した。ＤＮＡ−ＤＥＡＥ−デキストラン細胞混合物を、３７℃にて３０分
間インキュベートした。次いで、細胞を、無血清ＲＰＭＩで２回洗浄し、次いで
ＲＰＭＩ中１０％ウシ胎児血清に４８〜６０時間プレートした。
び安定の両方の）トランスフェクションをまた、ＤＥＡＥ−デキストラン／エレ
クトロポレーション法を用いて行った。手短には、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し
、そして０．８ｍＬの無血清ＲＰＭＩ培地中に懸濁し、この中に１０μｇのプラ
スミドＤＮＡおよび１２．５μＬのＤＥＡＥ−デキストラン（１０ｍｇ／ｍＬ）
を添加した。ＤＮＡ−ＤＥＡＥ−デキストラン細胞混合物を、３７℃にて３０分
間インキュベートした。次いで、細胞を、無血清ＲＰＭＩで２回洗浄し、次いで
ＲＰＭＩ中１０％ウシ胎児血清に４８〜６０時間プレートした。
【０１０８】 エレクトロポレーションのために、本発明者らは、同量の細胞を用い、そして
１０μｇのプラスミドＤＮＡ（スーパーコイル／線状化）を２５０ボルト、９６
０マイクロファラデーの静電容量で１８〜２４秒間の設定でパルスする、ＢＩＯ
ＲＡＤのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いた。
１０μｇのプラスミドＤＮＡ（スーパーコイル／線状化）を２５０ボルト、９６
０マイクロファラデーの静電容量で１８〜２４秒間の設定でパルスする、ＢＩＯ
ＲＡＤのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いた。
【０１０９】 次いで、形質転換細胞を、ＲＰＭＩ増殖培地中に入れ、そしてトランスフェク
ションの４８〜６０時間後に細胞をタンパク質発現について特徴付けたかまたは
ネオマイシン選択に曝露した。異なる安定細胞株の増殖のための液体培地中のネ
オマイシン濃度は、以下の通りであった：ＣＯＳ−１細胞、５００μｇ／ｍＬ；
Ｓｕｐ Ｔ１細胞、４００μｇ／ｍＬ、およびＪｕｒｋａｔ細胞、８００μｇ／
ｍＬ。
ションの４８〜６０時間後に細胞をタンパク質発現について特徴付けたかまたは
ネオマイシン選択に曝露した。異なる安定細胞株の増殖のための液体培地中のネ
オマイシン濃度は、以下の通りであった：ＣＯＳ−１細胞、５００μｇ／ｍＬ；
Ｓｕｐ Ｔ１細胞、４００μｇ／ｍＬ、およびＪｕｒｋａｔ細胞、８００μｇ／
ｍＬ。
【０１１０】 （ＦＡＣＳ分析） 免疫蛍光染色を用いて、ｓＦｖｈＭＨＣ−１形質導入／非形質導入細胞におけ
るＭＨＣ−１分子の細胞表面発現を分析した。細胞を、ＰＢＳ（１％ウシ胎児血
清を有する）で３回洗浄し、そしてＨＢ９４ハイブリドーマ細胞上清（１：５０
希釈）とともに４℃にて２時間インキュベートし、その後、細胞をＰＢＳで３回
洗浄し、次いでＦＩＴＣ結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧ（１：５００希釈、Ｓｉ
ｇｍａ）とともに４℃にて２時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで
３回洗浄し、そして４％ホルムアルデヒドを有する０．４ｍＬのＰＢＳ中に再懸
濁した。
るＭＨＣ−１分子の細胞表面発現を分析した。細胞を、ＰＢＳ（１％ウシ胎児血
清を有する）で３回洗浄し、そしてＨＢ９４ハイブリドーマ細胞上清（１：５０
希釈）とともに４℃にて２時間インキュベートし、その後、細胞をＰＢＳで３回
洗浄し、次いでＦＩＴＣ結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧ（１：５００希釈、Ｓｉ
ｇｍａ）とともに４℃にて２時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで
３回洗浄し、そして４％ホルムアルデヒドを有する０．４ｍＬのＰＢＳ中に再懸
濁した。
【０１１１】 次いで、細胞を、Ｃｏｒｅ−Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅ
ｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのフローサイトメトリーにより分析した
。
ｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのフローサイトメトリーにより分析した
。
【０１１２】 （小胞体（ＥＲ）により発現されるｓＦｖｈＭＨＣ−１） ｓＦｖＨＭＨＣ−１−５ｋおよび８ｋ構築物の両方は、インビトロ転写および
翻訳方法により観察されるオープンリーディングフレームを有していた（データ
は示さず）。
翻訳方法により観察されるオープンリーディングフレームを有していた（データ
は示さず）。
【０１１３】 一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞を、先に記載した通りの免疫沈
降プロトコルを用いてｓＦｖ発現について分析した。
降プロトコルを用いてｓＦｖ発現について分析した。
【０１１４】 図３は、ｓＦｖＭＨＣ−１ｓ（レーン２〜５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィー
ルを例示し、そしてＣＯＳ−１細胞中のｓＦｖＭＨＣ−１の一過性発現を示す。
一過性トランスフェクトされた、および代謝的に放射性標識された細胞の放射性
免疫沈降を、抗マウスＩｇＧ（分子全体、Ｓｉｇｍａ）結合プロテインＡ−セフ
ァロースを用いて実施した。サンプルを、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性ゲ
ルに泳動した。レーン１は、ｐＲｃ／ＣＭＶベクターコントロールであり、レー
ン２および３はｐＲｃ／ＣＭＶ−ｓＦｖＭＨＣ−１−５ｋの２つの異なるプラス
ミド調製物を用いるサンプルを含み、レーン４および５はｐＲｃ／ＣＭＶ−ｓＦ
ｖＭＨＣ−１−８ｋの２つの異なるプラスミド調製物を用いるサンプルを含む。
レーン２〜５では、さらなるバンド（’５０および２０ｋＤ）もまた同時免疫沈
降した。
ルを例示し、そしてＣＯＳ−１細胞中のｓＦｖＭＨＣ−１の一過性発現を示す。
一過性トランスフェクトされた、および代謝的に放射性標識された細胞の放射性
免疫沈降を、抗マウスＩｇＧ（分子全体、Ｓｉｇｍａ）結合プロテインＡ−セフ
ァロースを用いて実施した。サンプルを、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性ゲ
ルに泳動した。レーン１は、ｐＲｃ／ＣＭＶベクターコントロールであり、レー
ン２および３はｐＲｃ／ＣＭＶ−ｓＦｖＭＨＣ−１−５ｋの２つの異なるプラス
ミド調製物を用いるサンプルを含み、レーン４および５はｐＲｃ／ＣＭＶ−ｓＦ
ｖＭＨＣ−１−８ｋの２つの異なるプラスミド調製物を用いるサンプルを含む。
レーン２〜５では、さらなるバンド（’５０および２０ｋＤ）もまた同時免疫沈
降した。
【０１１５】 ｓＦｖを示す特徴的な３０ｋＤバンドが観察される。また、ｓＦｖＭＨｃ−１
分子で特異的に引き出される（同時免疫沈降可能な）ＭＨＣ−１分子のαおよび
Ｂ2ミクログロブリン鎖であり得る５０ｋＤおよび２３ｋＤのタンパク質に対応 する２つの特定のバンドが見られる。
分子で特異的に引き出される（同時免疫沈降可能な）ＭＨＣ−１分子のαおよび
Ｂ2ミクログロブリン鎖であり得る５０ｋＤおよび２３ｋＤのタンパク質に対応 する２つの特定のバンドが見られる。
【０１１６】 図４は、ネオマイシン選択下でのＪｕｒｋａｔクローンにおけるｓＦｖｈＭＨ
Ｃ−１の安定な細胞発現を示す。ネオマイシンで選択された、ｓＦｖＭＨＣ−１
発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の安定なサブクローンを、細胞内発現抗体発現について分
析した。レーン１は、ｐＲｃ／ＣＭＶベクタークローンを含む。レーン２および
３は、ｓＦｖｈＭＨＣ−１−５ｋ安定サブクローンを含む。レーン４および５は
、ｓＦｖｈＭＨＣ−１−８ｋ安定サブクローンを含む。結果は、３０ｋＤのｓＦ
ｖバンドを示す。
Ｃ−１の安定な細胞発現を示す。ネオマイシンで選択された、ｓＦｖＭＨＣ−１
発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の安定なサブクローンを、細胞内発現抗体発現について分
析した。レーン１は、ｐＲｃ／ＣＭＶベクタークローンを含む。レーン２および
３は、ｓＦｖｈＭＨＣ−１−５ｋ安定サブクローンを含む。レーン４および５は
、ｓＦｖｈＭＨＣ−１−８ｋ安定サブクローンを含む。結果は、３０ｋＤのｓＦ
ｖバンドを示す。
【０１１７】 （ｓＦｖｈＭＨＣ−１安定細胞における細胞表面ＭＨＣ−１発現のダウンレギ
ュレーション） 図５および６は、ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＣＭＶ４コントロールの下でｓＦｖ
５ｋまたはｓＦｖ８ｋのいずれかを用いる、異なるレベルのＭＨＣ−１ダウンレ
ギュレーションを示す、安定なｓＦｖｈＭＨＣ−１発現Ｊｕｒｋａｔサブクロー
ンを示す。
ュレーション） 図５および６は、ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＣＭＶ４コントロールの下でｓＦｖ
５ｋまたはｓＦｖ８ｋのいずれかを用いる、異なるレベルのＭＨＣ−１ダウンレ
ギュレーションを示す、安定なｓＦｖｈＭＨＣ−１発現Ｊｕｒｋａｔサブクロー
ンを示す。
【０１１８】 図５は、Ｊｕｒｋａｔ安定サブクローンのＦＡＣＳ分析を示す。ｓＦｖＭＨＣ
−１または空のベクターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、最初にＨＢ９４ハイブ
リドーマ上清とともにインキュベートし、次いでＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（
Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。これらの細胞を、ＭＨＣ−１細胞表
面発現についてモニタリングした。第１欄は、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター単独また
はｓＦｖｈＭＨＣ−１−５ｋサブクローンを示す。第２欄は、ｐＲｃ／ＣＭＶベ
クター単独またはｓＦｖｈＭＨＣ−１−８ｋサブクローンを示す。第３欄は、ｐ
ＣＭＶ４ベクター単独またはｓＦｖｈＭＨＣ−１−５ｋサブクローンを示す。第
４欄は、ｐＣＭＶ４ベクター単独またはｓＦｖＭＨＣ−１−８ｋサブクローンを
示す。これらの結果は、ＭＨＣ−１レセプター発現がｓＦｖＭＨＣ−１−８ｋ細
胞内発現抗体により阻害されることを示す。図５は、異なるサブクローンにおい
て観察される表現型ノックアウトの易変性を示す。例えば、サブクローンｐＲＣ
／ＣＭＶ／５ｋ６、ＣＭＶ４／５ｋ４、およびＣＭＶ４／８ｋ２においてはほぼ
完全なノックアウトが存在する。
−１または空のベクターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、最初にＨＢ９４ハイブ
リドーマ上清とともにインキュベートし、次いでＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（
Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。これらの細胞を、ＭＨＣ−１細胞表
面発現についてモニタリングした。第１欄は、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター単独また
はｓＦｖｈＭＨＣ−１−５ｋサブクローンを示す。第２欄は、ｐＲｃ／ＣＭＶベ
クター単独またはｓＦｖｈＭＨＣ−１−８ｋサブクローンを示す。第３欄は、ｐ
ＣＭＶ４ベクター単独またはｓＦｖｈＭＨＣ−１−５ｋサブクローンを示す。第
４欄は、ｐＣＭＶ４ベクター単独またはｓＦｖＭＨＣ−１−８ｋサブクローンを
示す。これらの結果は、ＭＨＣ−１レセプター発現がｓＦｖＭＨＣ−１−８ｋ細
胞内発現抗体により阻害されることを示す。図５は、異なるサブクローンにおい
て観察される表現型ノックアウトの易変性を示す。例えば、サブクローンｐＲＣ
／ＣＭＶ／５ｋ６、ＣＭＶ４／５ｋ４、およびＣＭＶ４／８ｋ２においてはほぼ
完全なノックアウトが存在する。
【０１１９】 図６は、選択されたＪｕｒｋａｔ安定サブクローンのＦＡＣＳ分析を示す。図
６は、ｐＲｃ／ＣＭＶコントロールの下のクローン５ｋおよびＣＭＶ４コントロ
ールの下のクローン８ｋが、それぞれＭＨＣ−１発現を示さないかまたは最少量
のＭＨＣ−１発現を示すことを示す。
６は、ｐＲｃ／ＣＭＶコントロールの下のクローン５ｋおよびＣＭＶ４コントロ
ールの下のクローン８ｋが、それぞれＭＨＣ−１発現を示さないかまたは最少量
のＭＨＣ−１発現を示すことを示す。
【０１２０】 図７は、１つのｐＲｃ／ＣＭＶ空ベクターおよび２つのｓＦｖｈＭＨＣ−１サ
ブクローンのＦＡＣＳ分析を示す。ベクター単独で形質転換したサブクローンお
よび２つのｓＦｖｈＭＨＣ−１で形質転換したクローンについて、ＭＨＣ−１、
ＭＨＣ−２、Ｂ２ミクログロブリン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８の
細胞表面発現レベルを分析した。図７は、ベクターコントロールを有する平行な
２つのクローンのパネルを示し、これは、他の異なる表面マーカーがそれらに存
在することを実証し、これらにはＭＨＣ−１（分子全体）、Ｂ２ミクログロブリ
ン、ＭＨＣ−２、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８が含まれる。これらの
結果は、ベクターコントロールに比較したＭＨＣ−１分子のダウンレギュレーシ
ョンを示し、一方、他の表面レセプターは、ベクターコントロールと比較して影
響されないままである。ＭＨＣ−１分子とは独立した非古典的経路におそらく起
因して、β２ミクログロブリンが表面に通りぬけるようである。
ブクローンのＦＡＣＳ分析を示す。ベクター単独で形質転換したサブクローンお
よび２つのｓＦｖｈＭＨＣ−１で形質転換したクローンについて、ＭＨＣ−１、
ＭＨＣ−２、Ｂ２ミクログロブリン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８の
細胞表面発現レベルを分析した。図７は、ベクターコントロールを有する平行な
２つのクローンのパネルを示し、これは、他の異なる表面マーカーがそれらに存
在することを実証し、これらにはＭＨＣ−１（分子全体）、Ｂ２ミクログロブリ
ン、ＭＨＣ−２、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８が含まれる。これらの
結果は、ベクターコントロールに比較したＭＨＣ−１分子のダウンレギュレーシ
ョンを示し、一方、他の表面レセプターは、ベクターコントロールと比較して影
響されないままである。ＭＨＣ−１分子とは独立した非古典的経路におそらく起
因して、β２ミクログロブリンが表面に通りぬけるようである。
【０１２１】 これらの研究は、ｓＦｖｈＭＨＣ−１をＥＲ中で構成的に発現するＣＤ４+ Ｊｕｒｋａｔ細胞が、ＭＨＣ−１細胞表面発現を効果的に阻害したこと、および
これらのｓＦｖを用いて本発明者らがＭＨＣ−１α鎖およびＢ２ミクログロブリ
ンを同時免疫沈降し得たことを実証する。
これらのｓＦｖを用いて本発明者らがＭＨＣ−１α鎖およびＢ２ミクログロブリ
ンを同時免疫沈降し得たことを実証する。
【０１２２】 （レトロウイルス感染） 本発明者らは、マウスモロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）レトロウイルスＬＮベクタ
ー［Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８巻（１９９４）］
中にｓＦｖｈＭＨＣ−１をクローニングした。
ー［Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８巻（１９９４）］
中にｓＦｖｈＭＨＣ−１をクローニングした。
【０１２３】 レトロウイルス構築物を、エコトロピック細胞株ｏＣＲＥ中に形質導入する。
４８時間後、上清を用いて、パッケージング細胞株ＰＡ３１７に感染させる。プ
ロデューサー細胞株を、Ｇ４１８およびＨＡＴ選択後に確立する。最初のスクリ
ーニングを行って組換えウイルスからのｓＦｖ発現を確実にする。Ｇ４１８耐性
細胞の上清を用いて、不死化Ｔリンパ球および刺激ＰＢＬに感染させる。形質導
入細胞株におけるタンパク質発現を、免疫蛍光、免疫沈降、およびＥＬＩＳＡに
より調べる。ベクターコントロール（ｓＦｖなし）および無関係なｓＦｖ（ｓＦ
ｖｔａｃ）を形質導入した細胞株を、平行に用い、そして分析する。
４８時間後、上清を用いて、パッケージング細胞株ＰＡ３１７に感染させる。プ
ロデューサー細胞株を、Ｇ４１８およびＨＡＴ選択後に確立する。最初のスクリ
ーニングを行って組換えウイルスからのｓＦｖ発現を確実にする。Ｇ４１８耐性
細胞の上清を用いて、不死化Ｔリンパ球および刺激ＰＢＬに感染させる。形質導
入細胞株におけるタンパク質発現を、免疫蛍光、免疫沈降、およびＥＬＩＳＡに
より調べる。ベクターコントロール（ｓＦｖなし）および無関係なｓＦｖ（ｓＦ
ｖｔａｃ）を形質導入した細胞株を、平行に用い、そして分析する。
【０１２４】 本明細書中で言及された全ての参考文献は、参考として援用される。
【０１２５】 本発明は、本発明の好ましい実施態様を特に参照して詳細に記載されてきた。
しかし、本発明の精神および教示の範囲内の改変および改善は本開示を考慮すれ
ば当業者によって行われ得ることが認識される。
しかし、本発明の精神および教示の範囲内の改変および改善は本開示を考慮すれ
ば当業者によって行われ得ることが認識される。
【図１】 図１Ａおよび１ＢはＭＨＣ−１表面発現の模式図を示し、図１ＡはＭＨＣ−１
細胞表面発現の通常の経路を示し、そして図１ＢはＥＲで発現されるｓＦｖｈＭ
ＨＣ−１の存在下での細胞表面発現を示す。
細胞表面発現の通常の経路を示し、そして図１ＢはＥＲで発現されるｓＦｖｈＭ
ＨＣ−１の存在下での細胞表面発現を示す。
【図２】 図２Ａおよび２Ｂは特定の単鎖抗体の配列を示す。図２ＡはｓＦｖｈＭＨＣ−
１−５ｋの一次ヌクレオチド配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番
号５６）を示し、そして図２ＢはｓＦｖｈＭＨＣ−１−８ｋ（Ｂ）の一次ヌクレ
オチド配列（配列番号５７）およびアミノ酸配列（配列番号５５）を示す。
１−５ｋの一次ヌクレオチド配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番
号５６）を示し、そして図２ＢはｓＦｖｈＭＨＣ−１−８ｋ（Ｂ）の一次ヌクレ
オチド配列（配列番号５７）およびアミノ酸配列（配列番号５５）を示す。
【図３】 図３は、ＣＯＳ−１細胞中でのｓＦｖｈＭＨＣ−１の一過性発現を示す。
【図４】 図４は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中でのｓＦｖｈＭＨＣ−１の安定発現を示す。
【図５】 図５は、Ｊｕｒｋａｔ安定サブクローンのＦＡＣＳ分析を示す。
【図６】 図６は、選択されたＪｕｒｋａｔ安定サブクローンのＦＡＣＳ分析を示す。
【図７】 図７は、１つのｐＲＣ／ＣＭＶ空ベクターおよび２つのｓＦｖｈＭＨＣ−１サ
ブクローンのＦＡＣＳ分析を示す。
ブクローンのＦＡＣＳ分析を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 マシカル， アブナー アメリカ合衆国 テキサス 77096， ヒ ューストン， メイヤー フォレスト ド ライブ 9701， アパートメント 2206 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA41 BA80 CA04 CA10 CA20 DA02 DA03 DA06 EA02 EA04 GA03 4B065 AA26X AA90X AA91X AA93X AA93Y AA94X AB01 AB05 AC14 AC15 AC16 BA02 BA03 BA08 BA25 BB01 BC03 BC07 BD50 CA25 CA44 CA46 4C084 AA13 MA65 NA14 ZB022 4C085 AA13 AA14 BB11 EE01 GG02 GG04 GG06 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74
Claims (12)
- 【請求項１】 所望されない免疫関連反応を阻害する方法であって、以下の
工程：該所望されない免疫関連反応に関与し得る細胞に抗体をコードする遺伝子
を形質導入する工程であって、該抗体は発現したときに該細胞中で該所望されな
い免疫関連反応に関与する標的分子および／またはリガンドを標的化する、工程
、該抗体を発現させる工程、ならびに該抗体を該標的レセプターおよび／または
リガンドに結合させる工程を包含する、方法。 - 【請求項２】 前記標的レセプターが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラス
ＩＩ分子、ＣＤ２８分子、ＣＤ４０分子、ＣＤ２０分子およびＣＤ４３分子から
なる群から選択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記標的レセプターが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラス
ＩＩ分子、ＣＤ２８分子、ＣＤ４０分子、ＣＤ１分子、ＣＤ２０分子、Ｔ細胞レ
セプターおよびＣＤ４３分子に関与する経路の成分からなる群から選択される、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記抗体が単鎖抗体を含む、請求項１に記載の方法。
- 【請求項５】 前記単鎖抗体がＭＨＣ−１分子に結合する、請求項４に記載
の方法。 - 【請求項６】 細胞を形質導入するための主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の
成分に結合する抗体の使用であって、ここで該抗体は該成分に該細胞中で結合し
て、所望されない免疫関連反応を阻害する、使用。 - 【請求項７】 請求項６に記載の抗体であって、ここで該抗体が、ＭＨＣの
Ｘ鎖、β２ミクログロブリン、カルネキシン、抗原プロセシングに関連するトラ
ンスポーター（ＴＡＰ）およびタパシンから選択されるＭＨＣ成分の群のうちの
１つと結合する、抗体。 - 【請求項８】 標的分子に結合する抗体をコードする遺伝子によって形質導
入された細胞であって、ここで該標的分子が主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の成
分であり、該抗体が発現されると、該発現された抗体が、該標的分子と該細胞中
で結合し、そして該細胞が所望されない免疫関連反応の一部となるのを阻害する
、細胞。 - 【請求項９】 前記抗体が、ＭＨＣのＸ鎖、β２ミクログロブリン、カルネ
キシン、抗原プロセシングに関連するトランスポーター（ＴＡＰ）およびタパシ
ンからなる選択されるＭＨＣ成分の群のうちの１つと結合する、請求項８に記載
の細胞。 - 【請求項１０】 前記抗体がＴＡＰと結合する、請求項９に記載の細胞。
- 【請求項１１】 前記抗体が単鎖抗体である、請求項９に記載の細胞。
- 【請求項１２】 主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の成分に結合する抗体をコ
ードする遺伝子を含むベクターであって、該抗体が細胞中に残留するように適合
されているベクターと、これを所望されない免疫関連反応の阻害に使用するため
の指示書とを含む、キット。
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