KR20220162157A - 암을 치료하기 위한 세포 면역치료 - Google Patents

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KR20220162157A
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cell
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cancer
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케이티 레즈바니
메이라 샨리
코스타 데이빗 마린
힐라 쉐임
엘리자베스 쉬팔
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더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

본 발명의 구현예는 면역 효과기 세포, 예컨대 자연살해(NK) 세포를 포함하는 조성물을 포함하며, 상기 세포는 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨(IL)을 포함하고 상기 세포는 하나 이상의 조작된 수용체를 임의로 포함한다. 구체적인 구현예에서, 상기 IL은 IL-15가 아니며 IL-12, IL-21 또는 둘 다이다. 상기 NK 세포는 적어도 교모세포종을 비롯한 모든 종류의 암의 치료를 위해 활용될 수 있다.

Description

암을 치료하기 위한 세포 면역치료
본 출원은 2020년 3월 28에 제출된 미국 가특허원 63/001,275에 대한 우선권을 주장하며 이는 전체가 본원에 참조로 인용되어 있다.
기술분야
본 발명의 구현예는 적어도 세포 생물학, 분자 생물학, 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다.
교모세포종(GBM)은 예후가 좋지 않은 공격적인 악성종양이다. 재발 후, 표준 치료요법이 없으며 생존율이 9개월 미만이다. IL13Ra2 (Brown et al., 2016), Her2/CMV (Ahmed et al., 2010) 및 EGFRvIII (O'Rourke et al., 2017)을 표적으로 하는 세 가지 인간대상 최초(first-in-man) 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 실험의 결과가 최근에 실망스러운 임상 결과와 함께 보고되었다.
다른 고형 종양 뿐만 아니라, 이들이 백혈병과 림프종에서 입증한 엄청난 반응이 있는 GBM에 대한 세포 치료를 발전시킬 임상적 필요성이 현재 대두되고 있다. 본 출원은 오랜 숙원이었던 적어도 교모세포종을 포함하는 암에 대한 세포 치료를 발전시킬 필요성에 대한 해결책을 제공한다.
본 출원의 구현예는 의학적 조건을 위한 세포 치료의 방법 및 이와 관련된 조성물을 포함한다. 상기 세포 치료는 면역 효과기 세포 또는 이것이 필요한 개인에게 투여하기 위한 기타 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 상기 세포는 세포가 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨(IL)을 포함하고, 하나 이상의 기타 이종 유전자 생성물, 예컨대 하나 이상의 조작된 수용체를 임의로 포함하기 때문에, 다른 세포와 비교하여, 활성이 향상되었다. 상기 세포는 외부적으로 하나 이상의 사이토카인에 (예컨대 배양액 중에서) 노출될 수도 있고/있거나 이종, 하나 이상의 벡터에서 이종 사이토카인(상기 세포의 게놈에서 발현된 내생적 사이토카인과 반대되게)을 발현하도록 형질주입될 수도 있다. 본 출원의 개시는 교모세포종(GBM) 및 기타 암을 치료하기 위해 외생적 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-12, IL-21, IL-18, IL-15, IL-7)과 병합한 탈체 증식된(ex vivo-expanded) 및 활성화된 자연살해(NK) 세포를 사용하거나 또는 표면 상에서 막 결합 또는 결속 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-12, IL-21, IL-18, IL-15, IL-7)을 분비 또는 발현하도록 조작된 NK 세포를 사용한 면역치료를 포함한다. 상기 세포는 전달에 앞서 적절한 조건 하에서 배양액 중 유효량만큼의 IL-2, IL-12, IL-21, IL-18, IL-15 및/또는 IL-7에 노출되었을 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 세포는, 비록 대안적인 구현예에서 외생적으로 제공되는 IL-15를 포함하지만, IL-15가 아닌 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본원은 NK 세포를 포함하는 채택된 세포 요법을 사용하는 교모세포종을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 측면에서, 상기 NK 세포는 교모세포종 줄기 세포에 대해 특히 효과적이고, 본원은 교모세포종 세포를 비롯하여, 모든 종류의 교모세포종 세포에 대항하여 NK 세포를 증진시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본원은 교모세포종이 있는 개인에게서 교모세포종 줄기 세포를 살해하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 발현하도록 조작된 및/또는 하나 이상의 IL의 존재하에 배양된 NK 세포의 유효량을 상기 개인에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 교모세포종 줄기 세포는 하나 이상의 조작된 수용체를 발현하는 NK 세포에 의해 살해되고, 상기 조작된 수용체는 교모세포종 줄기 세포 상에서 발현되는 하나 이상의 항원을 표적으로 할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 일부 경우에, 교모세포종 줄기 세포는 하나 이상의 조작된 수용체를 발현하도록 조작된 바 있는, 하나 이상의 외생적 사이토카인을 발현하도록 조작된 바 있는, 및/또는 하나 이상의 IL의 존재하에 배양된 바 있는 NK 세포에 의해 살해된다.
본원의 구현예에는 자연살해(NK) 세포를 비롯한 모든 종류의 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물이 포함되며, 상기 세포는 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함하며, 임의로 상기 IL은 IL-15가 아니고, 상기 세포는 하나 이상의 조작된 수용체를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 IL은 IL-12, IL-21, IL-2, IL-15, IL-18, IL-7 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 구체적인 경우에, 상기 IL은 IL-12, IL-21 또는 둘 다이다. 본원의 임의의 구현예에서, 상기 IL은 상기 세포에서 분비되거나, 묶여 있거나 또는 막에 결합되어 있을 수 있다. 본원에 사용된 "외생적으로 제공되는"은 상기 세포에서 추가로 벡터에서 발현된 것으로 정의될 수 있으며/있거나 상기 세포는 외부적으로 하나 이상의 IL에 노출된다.
특정 구현예에서, 본원의 세포에서 사용되는 조작된 수용체는 조작된 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)이다. 상기 항원은 암 항원, 예컨대 고체 종양 항원일 수 있고, 또는 병원성과 관련된 항원일 수 있다. 상기 항원이 암 항원인 일부 경우에, 구체적인 예에는 5T4, 8H9, αvβ6　인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD5, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, CS1, CLL1, CD99, DLL3, EGFR, ErbB2(HER2)를 비롯한 EGFR 과(family), EGFRvIII, EGP2, EGP40, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글립피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-Al+NY-ESO-1, IL-llRα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, L1CAM, 카파, KDR, MCSP, 메소텔린, Muc1, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSC1, PSCA, PSMA, ROR1, SP17, 수르비빈, TAG72, TEMs, HMW-MAA, VEGFR2 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 항원이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 수용체는 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 또는 귀소성 수용체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 세포이다.
특정 구현예에서, 본원의 세포는 자살 유전자를 포함하는, NK 세포를 비롯한 세포이다. 일부 경우에, 상기 세포는 TDAG8, NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 내생적 유전자의 발현이 감소되거나 또는 억제된다.
본원의 구현예에는 본원에서 포함하는 임의의 세포 집단이 포함된다.
일 구현예에서, 개인의 암을 치료하는 방법이 존재하며, 상기 방법은 본원에 포함된 임의의 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 개인의 암 세포는 NK 리간드, 예컨대 MICA/B, ULBP1, ULBP2/5, ULBP3, B7-H6, CD112, CD155, HLA-ABC, HLA-DR, HLA-3 또는 이들의 조합물의 발현의 증가를 보인다. 상기 조작된 NK 세포는 이들 NK 리간드 중 하나 이상을 표적으로 삼거나, 또는 다른 표적들을 표적으로 삼을 수 있는 하나 이상의 조작된 항원 수용체를 발현할 수 있다. 상기 조성물은 두개 내로, 주사로, 정맥으로, 동맥으로, 복강 내로, 기도로, 종양 내로, 근육 내로, 내시경을 통해, 병변 내로, 두개 내로, 경피로, 피하로, 국부적으로, 관류에 의해, 종양 미세환경에서, 또는 이들의 조합으로 상기 개인에 제공될 수 있다.
암 치료의 경우, 상기 암은 고형 종양일 수 있고, 또는 고형 종양이 아니다. 상기 암은 폐, 뇌, 유방, 혈액, 피부, 췌장, 간, 결장, 두경부, 신장, 갑상선, 위, 비장, 담낭, 골, 난소, 고환, 자궁내막, 전립선, 직장, 항문, 자궁경관의 암이거나, 또는 혈액암일 수 있다. 구체적인 경우에, 상기 암은 교모세포종이다.
본원의 구현예에 따른 치료 방법에서, 상기 개인은 포유류, 예컨대 사람, 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지 또는 설치류일 수 있다. 개인에게 하나 이상의 추가의 암 요법, 예를 들면 수술, 방사선, 화학요법, 호르몬 요법, 면역요법, 또는 이들의 조합이 시행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 임의의 방법은 상기 개인에게서 암을 진단하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 임의의 방법은 상기 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 활용되는 임의의 세포는 상기 개인과 관련하여 자가조직이거나 또는 동종이계일 수 있다.
상기 내용은 뒤 이어 나오는 상세한 설명이 더 잘 이해되도록 하기 위해 본원의 특징 및 기술적 이점을 다소 광범위하게 요약하였다. 이 본원의 청구범위의 주제를 형성하는 추가의 특징 및 이점이 이후에 본원에 기술될 것이다. 당해기술의 숙련가라면, 본원에 개시된 개념 및 구체적인 구현예가 본원의 설계와 동일한 목적을 수행하기 위해 다른 구조물을 수정 또는 설계하기 위한 기본으로 쉽게 활용될 수 있음을 이해할 것이다. 또한 이와 같은 동등한 작제물이 청구범위에 제시된 원리 및 범위를 벗어나지 않음이 당해기술의 숙련가에 의해 이해되어야 한다. 추가의 대상 및 이점과 함께 조직 및 작동 방법과 관련하여, 본원에 개시된 설계의 특징으로 여겨지는 신규한 특징들은 수반된 도면과 연관하여 고려될 때 하기의 설명으로 더 잘 이해될 것이다. 하지만, 도면 각각이 예시와 설명을 위한 목적으로만 제공된 것이며, 본원의 한계의 정의로 의도된 것이 아님이 명백히 이해되어야 한다.
본원의 좀 더 완전한 이해를 위해, 첨부된 도면과 관련하여 이후 설명이 언급된다.
도 1a 및 도 1b. 성상 세포가 아닌 교모세포종 줄기 세포(GSC)는 NK-매개 세포용해에 상당히 민감하다. (도 1a) NK 세포는 상이한 비율로 4시간 동안 Cr51 표지 GSC와 함께 공동 배양되었고(n=4) Cr51 방출이 측정되었다. (도 1b) GSC 및 성상 세포 상에서의 NK 리간드의 발현.
도 2. 사이토카인 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 예의 도식적 표현. hIL-12p40링커p35는 p35 및 p40 하위단위가 링커와 함께 인위적으로 연결된 인간 IL-12이다.
도 3a 및 도 3b. 3-D 종양 배양 모형으로서 환자 유래 교모세포종 줄기 세포주(GSC)의 회전타원체 배양물(도 3a)과 GSC 표적에 대한 사이토카인-형질도입 CB-NK 세포의 세포 독성(도 3b). IL-12, IL-21 또는 IL-21 형질 도입 NK 세포(적색 (맨윗선), 녹색(위에서 3번째) 및 청색(위에서 2번째) 선들)가 Incucyte® 라이브 영상에 의해 보여진 바와 같이, 비-형질도입 CB-NK(검정 선(바닥))와 비교하여, GSC에 대해 월등한 세포독성을 발휘한다. 세포사멸적 세포는 카스파아제 3/7 녹색 신호에 의해 측정된다.
도 4a 내지 도 4c. FFluc-형질도입 GSC의 환자 유래 이종 이식(PDX) 모형에서 비-형질도입(NT) 대 IL12- 및 IL21-형질도입된 NK 세포의 비교. 1 x 105　세포의 용량으로 IL-12 또는 IL21 형질도입 NK 세포를 1회 주입함으로써 생물발광 영상화에 의해 보여진 바와 같이(도 4a 및 도 4b) 종양이 근절되고 결과적으로 동물의 장기적인 치료가 유발된다 (도 4c).
I. 정의의 예
지속적인 특허법 통념에 따라, 청구범위를 비롯하여 단어 '포함하는'과 함께 본 명세서에 사용되 단어 'a'와 'an'은 '하나 이상'을 지시한다. 본원의 일부 구현예는 하나 이상의 요소, 방법 단계, 및/또는 본원의 방법들로 이루어지거나 또는 이들로 필수적으로 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 방법 또는 조성물은 본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 실현될 수 있고, 상이한 구현예들이 조합될 수 있음이 고려된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단어 '포함하다', '포함하는'은 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계나 요소의 무리의 포함을 암시하는 것이나, 그밖의 임의의 단계 또는 요소, 또는 단계나 요소의 무리의 배제를 암시하는 것이 아님이 이해될 것이다. '로 이루어지는'은 '로 이루어지는'이란 어구 뒤에 오는 것을, 제한적으로 포함함을 의미한다. 따라서, 어구 '로 이루어지는'은 나열된 요소들이 필요한 것 또는 필수적인 것이며, 그 밖의 다른 요소는 존재할 수 없음을 가리킨다. '로 필수적으로 이루어지는'은 상기 어구 뒤에 나열되는 임의의 요소들을 포함하며, 나열된 요소들에 대해 본원에 명시된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 또는 도움이 되는 기타 요소들에 제한된다. 따라서, 어구 '로 필수적으로 이루어지는'은 나열된 요소들이 필요한 것 또는 필수적인 것임을 가리키지만, 그외 다른 요소는 선택사항이 아니고, 나열된 요소들의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 가리킨다.
본 명세서 전체에서 '일 구현예', '하나의 구현예', '특정 구현예', '관련 구현예', '일부 구현예', '추가의 구현예', 또는 '추가의 구현예' 또는 이들의 조합에 대한 언급은 상기 구현예와 연관되어 기술된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전역의 다수의 곳에서 상기 어구들의 등장은 반드시 동일한 구현예를 가리키는 것이 아니다. 더 나아가, 상기 특정 특징, 구조, 또는 특성들이 하나 이상의 구현예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 '또는' 및 '및/또는'은 서로의 조합으로 또는 서로를 배제한 다수의 성분들을 기술하는 데 활용된다. 예를 들어, 'x, y 및/또는 z'는 'x' 단독,'y' 단독, 'z' 단독을 가리킬 수 있고, 'x, y 및 z', '(x 및 y) 또는 z', 'x 또는 (y 및 z)', 또는 'x 또는 y 또는 z'을 가리킬 수 있다. 구체적으로 x, y 또는 z가 일 구현예에서 구체적으로 배제될 수 있음이 고려된다.
본 출원 전체에서, 용어 '약'은 세포 및 분자 생물학 분야에서 보통 일반적으로 쓰이는 의미로 사용되어 하나의 값이 상기 값을 결정하기 위해 활용되는 장치 또는 방법에 대한 표준 오류 편차를 포함함을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 '조작된'은 세포, 핵산, 폴리펩타이드, 벡터 등을 비롯하여 인간의 손에 의해 생성된 개체를 가리킨다. 적어도 일부 경우에, 조작된 개체는 합성이고 자연계에서는 본 출원에서 활용되는 방식으로 존재하거나 또는 구성되지 않는 요소들을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 '외생적'은 포유류 세포, 예컨대 면역 세포 내에 내생적으로 존재하지 않거나, 또는 포유류 세포의 밖에서 예컨대 재조합 기술에 의해 합성을 통해 생성되는 폴리뉴클레오타이드(유전자 생성물 또는 유전자 생성물의 일부를 인코딩하는 것)를 가리킨다. 구체적인 경우에, 특정 유전자 생성물은 세포에 외생적으로 제공될 수 있고, 상기 세포는 상기 세포 중 상응하는 내생적 유전자 생성물을 발현할 수도 있고 하지 않을 수도 있다.
본원에 사용된 용어 '예방하다' 및 '예방된', '예방하는' 등과 같은 유사 단어들은 질병 또는 질환, 예를 들면, 암의 발생 또는 재발의 가능성을 방지, 억제 또는 감소시키기 위한 접근 방법을 가리킨다. 이는 또한 질병 또는 질환의 시작, 또는 재발의 지연, 또는 질병 또는 질환의 증상의 발병 또는 재발의 지연을 가리킨다. 본원에 사용된 '예방' 및 유사 단어들은 또한 상기 질병 또는 질환의 시작 또는 재발에 앞서, 질병 또는 질환의 강도, 영향, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 '개체' 또는 '개인'은 상호교환하여 사용가능하고, 일반적으로 의학적 질환을 위한 치료가 필요한 개인을 가리킨다. 구체적인 경우에, 상기 개인은 암이 있거나 암이 있다고 의심된다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들어, 인간, 실험실 동물(예를 들면, 유인원, 래트, 마우스, 토끼), 가축(예를 들면, 소, 양, 염소, 돼지, 칠면조 및 닭), 반려동물(예를 들면, 개, 고양이 및 설치류), 말 및 유전자이식 비-인간 동물을 비롯하여, 방법 또는 물질의 대상인 임의의 생명체 또는 동물 개체일 수 있다. 상기 개체는 환자, 예를 들어 질병(의학적 질환으로 언급될 수 있음), 예컨대 양성 또는 악성 신생물(neoplasias) 또는 암이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 환자일 수 있다. 상기 개체는 치료 중이거나 또는 치료를 받았을 수 있다. 상기 개체는 무증상을 보일 수 있다. 상기 개체는 건강한 개인이지만 암을 예방하고자 할 수 있다. 본원에 사용된 '개체' 또는 '개인'은 의료 시설에 입원 중일 수도 그렇지 않을 수도 있고, 의료시설의 통원 환자로 치료받을 수도 있다. 상기 개인은 인터넷을 통해 하나 이상의 의학 조성물을 받을 수도 있다. 개인은 모든 연령의 인간 또는 비인간 동물을 포함할 수도 있고, 따라서 성인과 청소년(즉, 아동) 및 신생아를 포함하고, 자궁 내 개인을 포함한다. 상기 용어는 의학적 치료의 필요성을 함축하는 것이 아니기 때문에, 따라서 개인은 임상 또는 기초 과학 연구를 지원하기 위해 자발적 또는 비자발적으로 실험의 일부가 될 수도 있다. 대안적인 경우에, 상기 개체 또는 개인은 병원체 치료가 필요하다.
본원에 사용된 '치료' 또는 '치료하는'은 질병의 증상 또는 병리 또는 병리적 질환에 대한 임의의 유리한 또는 바람직한 효과를 포함하고, 치료 대상인 질병 또는 질환, 예를 들면 암의 하나 이상의 측정가능 마커의 최소한의 감소조차 포함할 수도 있다. 치료는 임의로 상기 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 감소 또는 개선, 또는 상기 질병 또는 질환의 발병 또는 진행의 지연 중 하나를 수반할 수 있다. 치료가 반드시 상기 질병 또는 질환, 또는 그것과 관련된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 가리키지 않는다. 치료는 의학적 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시는 것을 포함할 수도 있다.
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본원의 구현예는 임의의 종류의 암, 예컨대 교모세포종의 면역치료를 위한 면역 효과기 세포, 예컨대 NK 세포를 활용한다. 특정 구현예에서, 상기 면역 효과기 세포는 NK 세포이다. NK 세포는 상당한 이종 종양, 예컨대 GBM에 대한 치료적 효과기로 적합한데, 그 이유는 T 및 B 림프구와 달리, 이들은 재정렬된 V(D)J 수용체를 소유하지 않고 주조직 적합성 복합체(MHC)-결합 항원 제공에 의해 제한되지 않기 때문이다. 대신에, 이들의 효과기 기능은 특정 항원 특이성 또는 공동 자극에 대한 요구 없이 암 표적 상의 다수의 리간드를 인식할 수 있는 생식세포계열-인코딩된 수용체를 통해 수용된 신호들의 통합에 의해 좌우된다.
NK 세포는 교모세포종(GBM)에 침투하여 상기 질병의 면역 감시 중 NK 세포에 대한 역할을 지원하는 가장 풍부한 림프성 하위세트 중 하나를 포함한다. 아울러, 본원에서 정상적인 성상 세포가 아닌 GBM 줄기 세포(GSC)는 NK 활성 수용체, 예컨대 MHC 사슬-관련 항원(MICA/B)에 의해 인식되는 다수의 리간드 및 NKG2D 및 CD155에 의해 인식되는 (DNAM에 의해 인식됨) UL16-결합 단백질(ULBP)를 발현하고, GSC가 세포외 동종이계 건강한 NK 세포에 의한 세포용해에 상당히 민감한 것이 보여진다 (도 1a). 따라서, GBM의 경우 CAR T 세포에 비해 NK 세포 면역치료의 주요 이점은, CAR를 사용하여 특이적 항원을 표적으로 삼을 필요 없이, 생식세포계열-인코딩된 수용체를 통해 GSC 상의 다수의 항원을 표적으로 삼는 이의 내재적 능력이다. NK 세포의 이와 같은 특성은 항원 탈출 및 CAR T 세포 요법의 경우에 GBM을 비롯하여 관찰되는 종양 이종성과 관련된 어려운 숙제를 극복할 수 있다. 본원은 NK 세포를 하나 이상의 외생적 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-12, IL-21, IL-7 또는 IL-18에 노출시키거나, 및/또는 NK 세포가 하나 이상의 사이토카인 유전자를 발현하도록 조작하여 이의 효과기 기능, 지속성 및 거래(trafficking) 세포 면역치료를 돕기 위해 GBM에 대한 NK 세포의 추가의 개선을 허용한다. 상기 NK 세포는 특이적으로 교모세포종 세포를 표적으로 삼기 위해, 예컨대 교모세포종 세포 상의 항원을 표적으로 삼는 조작된 항원 수용체를 활용함으로써 추가로 변형될 수 있다.
본원의 구체적 구현예는 하나 이상의 외생적 사이토카인과 조합된 동종이계 NK 세포 및/또는 표면 상에서 하나 이상의 사이토카인을 분비 또는 발현하도록 유전자 조작된 NK 세포의 사용을 포함한다. 이와 같은 세포는 규격품(off-the-shelf) 세포 면역치료 치료법을 위해 활용됨으로써, 치료 비용을 줄이고 이와 같은 치료법이 다수의 환자에게 제공될 수 있게 한다.
II. 사이토카인
본 개시의 구현예는 외부에 존재하는 (예를 들어 배양액에 포함된) 하나 이상의 사이토카인에 노출되어 있는 면역 효과기 세포 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 발현하는 벡터가 형질주입된 세포를 포함한다. 상기 사이토카인이 임의의 종류일 수 있으나, 구체적인 구현예에서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, IL-7 또는 IL-18이다. 하지만, 특정 구현예에서, 상기 사이토카인은 IL-15가 아니다.
특정 구현예에서, 상기 세포 중 벡터에서 발현되는 하나 이상의 외생적으로 제공되는 사이토카인은 막에 결합되어 있다. 임의의 사이토카인은 막에 결합되어 NK 세포의 표면 상에서 발현될 수 있는데, 상기 사이토카인은 임의의 종류의 막 부착 분자, 예를 들어 B7-1, CD40 ,CD28, CD8, GMCSF 수용체, IgGl 또는 IgG4의 막통과 영역에 이종으로 부착될 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 사이토카인이 또 다른 유전자 생성물, 예컨대 조작된 수용체로서, 동일한 벡터 분자 상에 존재하지만, 다른 경우에는 별개의 분자에 존재한다. 특정 구현예에서는, 하나 이상의 사이토카인이 하나 이상의 조작된 수용체로서 동일한 벡터에서 공동발현된다. 하나 이상의 사이토카인은 항원-특이적 수용체에서 별개의 폴리펩타이드로서 생성될 수 있다. 구체적인 경우에, 상기 사이토카인은 NK 세포의 발달 및 세포 증식을 유도하여, 종양-거주 세포의 기능적 억제가 완화됨으로써 성립된 종양의 근절을 촉진하고, 및/또는 활성-유도 세포 사멸을 억제한다. 다른 사이토카인이 예상된다. 여기에는, 비제한적으로, 케모카인과 인간에 적용하기 위해 사용되는 세포의 활성 및 증식에 기여하는 다른 분자들이 포함된다.
구체적인 구현예에서, NK 세포는 하나 이상의 외생적으로 제공되는 사이토카인을 발현한다. 상기 사이토카인은 공급자 세포 내의 발현 벡터에서 발현되기 때문에 상기 세포에 외생적으로 제공될 수도 있고, 또는 NK 세포 배양액에 직접적으로 첨가될 수도 있다. 대안적인 경우에, 내생적 사이토카인의 발현의 조절을 조작할 때, 예컨대 사이토카인의 촉진자 자리(들)에서 유전자 재조합 시, 세포 중 내생적 사이토카인은 상향조절된다. 사이토카인이 발현 작제물 상에서 세포에 제공되는 경우, 상기 사이토카인은 또다른 유전자 생성물, 예컨대 자살 유전자를 발현하는 것으로서 동일한 벡터에서 인코딩될 수 있다. 사이토카인은 자살 유전자로서 별개의 폴리펩타이드 분자로 발현될 수 있고, 세포의 조작된 수용체에서 별개의 폴리펩타이드로 발현될 수도 있다. 일부 구현예에서, 본원은 IL-15가 아닌 사이토카인이 존재하는 CAR 및/또는 TCR 벡터의 공동 활용에 관한 것이다.
III. 면역 효과기 세포
본원은 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 가진 임의의 종류의 면역 효과기 세포를 포함하며, 상기 인터루킨은 IL-15가 아니고, 상기 세포는 하나 이상의 조작된 수용체 및/또는 다른 이종 유전자 생성물을 임의로 포함한다. 구체적인 구현예에서, 세포에 외생적으로 제공되는 IL은 인간의 손에 의한 세포의 의도적인 조작의 직간접적 결과이다. 이는 상기 세포가 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, 배양액에서)에 외부적으로 노출된 경우, 및/또는 상기 세포가 형질주입되어 벡터에서 하나 이상의 IL(세포 게놈에 통합되었을 수도 그렇지 않았을 수도 있음)을 발현한 경우, 사실이다. 이와 같은 방식으로 면역 효과기 세포의 조작이 임의의 기전에 의해 이루어질 수도 있다. 면역 효과기 세포는 NK 세포, T 세포, T 조절 세포, iNKT 세포, B 세포, MSC 등일 수 있다.
상기 면역 효과기 세포가 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 갖는 경우, 상기 세포는 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양되는 과정에 의해 외부에서 하나 이상의 사이토카인에 노출되었을 수도 있다. 배지 중 사이토카인의 농도의 범위는 예를 들어 0.1ng 내지 1000ng; 0.1ng 내지 750ng; 0.1ng 내지 500ng; 0.1 내지 250ng; 0.1 내지 100ng; 0.1 내지 75ng; 0.1 내지 50ng; 0.1 내지 25ng; 0.1 내지 10ng 등일 수 있다. 상기 배지 중 사이토카인의 농도 범위는 예를 들어 1 단위 내지 5000 단위; 1 단위 내지 4000 단위; 1 단위 내지 3000 단위; 1 단위 내지 2000 단위; 1 단위 내지 1000 단위; 1 단위 내지 750 단위; 1 단위 내지 500 단위; 1 단위 내지 250 단위; 1 단위 내지 100 단위; 1 단위 내지 75 단위; 1 단위 내지 50 단위; 1 단위 내지 25 단위 등일 수 있다. 일부 경우에, 상기 사이토카인(들)은 세포가 배양되는 전 시간 동안 배지에 존재하는 반면, 다른 경우에는 사이토카인(들)은 배양의 시간 중 후반부에 배양액에 첨가된다. 사이토카인(들)은 제1, 제2, 제3, 제4 또는 그보다 나중의 계대 배양에 존재할 수 있고, 또는 이들의 조합 시 배양액 배지에 존재할 수 있다.
본원은 종래의 T 세포, 감마-델타 T 세포, NK 세포, NK T 세포, 불변 NK T 세포, 조절 T 세포, 대식세포, B 세포, 수상돌기 세포, 종양-침투 림프구, 또는 이들의 혼합물을 비롯하여, 임의의 종류의 면역 효과기 세포를 포함한다. 상기 세포는 상기 세포가 필요한 개인, 예컨대 암이 있는 개인과 관련하여 동종이계, 자가조직, 이종계일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 면역 효과기 세포는 하나 이상의 사이토카인을 발현하거나 또는 그렇지 않으면 그것을 생산하기 위해 수작업으로 변형되는데, 이들 사이토카인은 상기 세포 내의 내생적 사이토카인이 아닌, 예컨대 재조합된 것이다. 면역 효과기 세포는, 예컨대 추가의 이종 단백질, 예컨대 조작된 수용체, 자살 유전자, 이들의 조합 등을 발현함으로써, 추가로 변형될 수 있다. 상기 세포는 또한 하나 이상의 내생적 유전자의 발현이 감소 또는 억제되도록 변형될 수 있다.
상기 면역 효과기 세포가 둘 이상의 방법으로 변형된 경우, 면역 효과기 세포가 변형되는 순서는 임의적일 수 있다. 예를 들어, 외생적으로 제공되는 사이토카인(및/또는 예컨대 배양 시 외부에서 하나 이상의 사이토카인에 노출됨)을 발현하는 면역 효과기 세포는 하나 이상의 조작된 수용체가 형질주입될 수 있다. 다른 경우에, 하나 이상의 조작된 수용체를 발현하는 면역 효과기 세포가 외생적으로 제공되는 사이토카인으로 형질주입될 수 있고 및/또는 배양 시 하나 이상의 사이토카인에 노출된다.
특정 구현예에서, IL-15가 아닌 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함하는 상기 면역 효과기 세포는 조작된 수용체, 예컨대 항원 수용체를 발현하도록 변형된 동일한 세포이다. 본원에서 포함하는 임의의 면역 효과기 세포는 임의의 종류의 항원 수용체, 예컨대 고형 종양 항원일 수 있는 암 항원인 항원을 향해 있는 수용체를 발현한다. 구체적인 구현예에서, 상기 수용체는 예를 들어 키메라 항원 수용체 또는 T-세포 수용체이다. 상기 면역 효과기 세포는 특이적으로 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함하도록 설계될 수 있고, 또한 특이적으로 상기 개인에게서 암 세포 상의 항원을 표적으로 삼는 항원 수용체를 발현하도록 설계될 수도 있다. 다시 말해서, 상기 세포는 개인의 암 세포에 존재하는 것으로 알려진 항원을 표적으로 하는 하나 이상의 항원 수용체를 포함하도록 맞춤될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원의 세포는 제조되어 규격품의 세포로 사용된다. 예를 들어, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함하는 세포는 예를 들어 저장소에 존재할 수 있고, 이들은 저장소에서 획득되어 외생적으로 제공되는 사이토카인(들)을 발현하는 것 이외의 추가의 변형을 갖도록 조작될 수 있다. 다른 경우에, 외생적으로 제공되는 사이토카인을 발현하는 것 이외의 변형을 갖는 세포는 저장소에서 획득되어 하나 이상의 외생적으로 제공되는 사이토카인을 발현하도록 조작된다. 저장소에서 세포를 획득한 후 세포에 이와 같은 변형을 한 다음, 상기 세포는 보관될 수도 있고, 또는 이것이 필요한 개인에게 유효량만큼 상기 세포가 제공된다.
임의의 면역 효과기 세포는 임의의 형태의 저장소, 예컨대 극저온으로 보존된 것에서 획득될 수 있고, 추가로 변형될 수 있다. 세포는 하나 이상의 사이토카인을 발현하는 발현 작제물을 가지면서 보관되고, 나중에 획득되어 관심대상의 특정 하나 이상의 조작된 항원 수용체, 이것이 필요한 개인을 위해 특정 암에 대해 맞춤변형된 항원을 표적으로 삼도록 조작된 예컨대 수용체를 발현하도록 변형될 수도 있다. 상기 세포는 관심 대상의 하나 이상의 조작된 항원 수용체, 예컨대 특정 암에 대한 항원을 표적으로 하는 수용체를 발현하는 발현 작제물을 가지며 보관될 수 있고, 이후 필요한 하나 이상의 외생적 사이토카인을 발현하도록 변형된다. 보관 전후로, 상기 세포는 자살 유전자를 포함하도록 변형될 수 있고, 일부 경우에, 상기 자살 유전자는 각각의 사이토카인 또는 조작된 항원 수용체로서 동일한 벡터에서 발현된다.
특정 구현예에서, 상기 면역 효과기 세포는 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함하고, 또한 하나 이상의 조작된 항원-표적 수용체를 발현하고 및/또는 적어도 하나의 자살 유전자를 발현한다. 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함하는 세포의 일부 경우에, 상이한 벡터들이 항원-표적 수용체(들)을 인코딩하거나 자살 유전자(들) 및/또는 외생적 사이토카인(들)을 인코딩한다. 다른 경우에, 이들(또는 하위세트)는 동일한 벡터 상에 존재한다. 면역 효과기 세포, 예컨대 NK 세포는 임의의 적합한 원료, 예컨대 제대혈, 말초 혈액, 유도된 다분화성 줄기 세포(iPSCs), 조혈 줄기 세포 (HSCs), 골수 또는 이들의 혼합물에서 유래될 수 있다. 상기 NK 세포는 세포주 예컨대, 비제한적으로, 예를 들어 NK-92 세포에서 유래될 수 있다. 상기 NK 세포는 제대혈 단핵세포, 예컨대 CD56+ NK 세포일 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함하는 상기 면역 효과기 세포(예컨대 NK 세포)는 유효량의 보편적 항원 제공 세포(UAPC)의 존재하에 임의의 적합한 비율로 확장된 바 있다. 상기 세포는 10:1 내지 1:10; 9:1 내지 1:9; 8:1 내지 1:8; 7:1 내지 1:7; 6:1 내지 1:6; 5:1 내지 1:5; 4:1 내지 1:4; 3:1 내지 1:3; 2:1 내지 1:2; 또는 1:1의 비로, 예를 들어 1:2의 비로, UAPC와 배양될 수 있다. 일부 경우에, 상기 NK 세포는 IL-2의 존재하에, 예컨대 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200, 10 내지 100, 10 내지 50, 100 내지 500, 100 내지 400, 100 내지 300, 100 내지 200, 200 내지 500, 200 내지 400, 200 내지 300, 300 내지 500, 300 내지 400, 또는 400 내지 500 U/mL의 농도로 확장되었다.
임의의 벡터(들)로의 유전적 변형 이후, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함하는 면역 효과기 세포는 즉시 개인에게 전달될 수도 있거나 보관될 수도 있다 (또는 상기 세포 중 일부는 개인에게 전달되고 나머지 세포는 보관된다). 일정 측면에서, 유전적 변형 이후, 상기 세포는 세포로 유전자 주입 후 약 1, 2, 3, 4, 5일 또는 그 이상 내에 대량 집단으로서 생체 밖에서 며칠, 몇주 또는 몇달 동안 증식될 수 있다. 추가의 측면에서,형질주입체는 복제되고, 단일 통합 또는 에피솜이 유지된 발현 카세트 또는 플라스미드의 존재를 입증하는 클론이 생체 밖에서 증식된다. 증식을 위해 선택된 클론은 하나 이상의 외생적으로 제공되는 사이토카인의 발현을 입증한다. 상기 재조합 면역 세포는 IL-2, 또는 일반적인 감마-사슬(예를 들어, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 및 기타)를 결합하는 기타 사이토카인을의 자극에 의해 증식될 수 있다. 상기 재조합 면역 세포는 인위적 항원 제공 세포로의 자극에 의해 증식될 수 있다. 추가의 측면에서, 임의의 유전학적으로 변형된 세포는 극저온에서 보존될 수 있다.
본원의 구현예는 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL과 하나 이상의 조작된 수용체, 예컨대 하나 이상의 항원 수용체를 포함하는 면역 효과기 세포를 포함한다. 상기 하나 이상의 조작된 항원 수용체는 수작업으로, 예를 들어 재조합 기법을 사용하여 생성되고, 상기 면역 효과기 세포에 자연적이지 않다. 조작된 수용체(들)이 임의의 종류일 수 있으나, 구체적인 구현예에서, 상기 수용체는 키메라 항원 수용체, T-세포 수용체, 귀소성 수용체, 일정한 간격으로 분포하는 짧은 회문성 반복 서열(CRISPR)/Cas9-매개 유전자 돌연변이, 유인 수용체, 사이토카인 수용체, 키메라 사이토카인 수용체, 및 이들의 조합이다.
본원의 구현예는 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL과 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 세포를 포함한다. 상기 면역 효과기 세포는 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함할 수 있고, 임의의 유형의 자살 유전자를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함할 수 있다. 자살 유전자의 예에는 조작된 비분비성(예컨대 막 결합된) 종양 괴사 인자(TNF)-알파 돌연변이체 폴리펩타이드(PCT/US2019/062009 참조, 이는 전체가 본원에 참조로 편입됨)가 포함되고, TNF-알파 돌연변이체를 결합하는 항체의 전달에 의해 영향을 받을 수 있다. 사용될 수 있는 자살 유전자/전구약물 조합의 예는 단순 포진 바이러스-티미딘 키나아제(HSV-tk) 및 간시클로버(ganciclovir), 아시클로버(acyclovir), 또는 FIAU; 산화환원 효소 및 사이클로헥사마이드; 사이토신 데아미나아제 및 5-플루오로사이토신; 티미딘 키나아제 티미딜레이트 키나아제(Tdk:Tmk) 및 AZT; 및 데옥시사이티딘 키나아제 및 사이토신 아라비노사이드이다. 대장균(E.coli) 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제, 소위 전구약물 6-메틸퓨린 데옥시리보사이드를 독성 퓨린 6-메틸퓨린으로 전환시키는 자살 유전자가 활용될 수 있다. 기타 자살 유전자에 예를 들어 CD20, CD52, 유도가능 카스파아제 9, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제(PNP), 사이토크롬 p450 효소(CYP), 카르복시펩티다아제(CP), 카르복실에스테라아제(CE), 나이트로환원효소(NTR), 구아닌 리보실전이효소(XGRTP), 글리코시다아제 효소, 메티오닌-α,γ-리아제(MET) 및 티미딘 포스포릴아제(TP)가 포함된다.
상기 세포는 개인에게서 직접 획득될 수도 있고, 보관소 또는 다른 보관 시설에서 획득될 수도 있다. 치료법으로서 세포는 상기 세포가 치료법으로 제공될 개인과 관련하여 자가조직 또는 동종이계일 수 있다.
상기 세포는 의료적 질환을 위해 치료법이 필요한 개인에게서 유래될 수 있고, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL, 선택적 자살 유전자, 선택적 사이토카인(들), 및 선택적 수용체(들)을 포함하도록 조작된 후(예를 들어 채택적 세포 치료법을 위한 형질주입 및 증식을 위한 표준 기법을 사용함), 이들은 원래 유래되었던 개인에게 다시 제공될 수 있다. 일부 경우에, 상기 세포는 상기 개인 또는 또 다른 개인을 위해 나중에 사용하기 위해 보관된다.
상기 면역 세포는 세포 집단에 포함될 수 있고, 상기 집단은 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 다수를 가질 수 있다. 세포 집단은 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 조작된 수용체를 포함하는 면역 세포를 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 포함할 수 있고; 이들 유전자 생성물들 각각은 별개의 폴리펩타이드로 생성될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
상기 면역 세포는, 특정 목적과 관련하여 모듈화할 의도로, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 포함하도록 생성될 수 있다. 예를 들어, 상업적 배포를 위해, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL 및/또는 하나 이상의 자살 유전자를 포함하는 세포가 생성될 수 있고(또는 추후 형질주입을 위해 자살 유전자를 인코딩하는 핵산으로 배포됨), 사용자가 의도된 목적에 따라 (치료적 유전자를 비롯하여) 관심 대상의 하나 이상의 다른 유전자를 발현하도록 세포를 변형할 수 있다. 예를 들면, 암 세포를 치료하는 데 관심이 있는 개인은 자살 유전자-발현세포 (또는 이종 사이토카인-발현 세포)를 획득 또는 생성하여 이들이 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL을 포함하도록 변형하거나, 또는 그 반대로도 할 수 있다.
특정 구현예에서, NK 세포가 활용되고, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 IL 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 조작된 수용체를 포함하는 NK 세포의 게놈이 변형될 수 있다. 상기 게놈은 임의의 방식으로 변형될 수 있으나, 구체적인 구현예에서 상기 게놈은 예를 들어, CRISPR 유전자 편집에 의해 변형된다. 상기 세포의 게놈은 임의의 목적을 위해 상기 세포의 효과성을 증진시키기 위해 변형될 수 있다. 구체적인 경우에, 상기 세포는 하나 이상의 유전자의 발현을 억제함으로써 추가로 변형된다. 일부 경우에, 편집된 상기 유전자 때문에 상기 세포가 종양 미세환경에서 좀 더 효과적으로 작용할 수 있다. 구체적인 경우에, 상기 유전자는 TDAG8, NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM 17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5 및 CD7 중 하나 이상이다. 구체적인 구현예에서, 이들 유전자 중 하나 이상은 상기 세포에서 녹아웃 또는 녹다운된다.
상기 세포가 하나 이상의 유전자의 녹아웃 또는 녹다운 발현을 갖도록 유전자편집이 시행된 경우, 이와 같은 유전자 편집은 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포 중 임의의 유전자 편집은 하나 이상의 DNA-결합 핵산, 예컨대 RNA-유도 엔도뉴클레아제(RGEN)를 통한 변형을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 상기 변형은 CRISPR 및 CRIS PR-연관(Cas) 단백질을 사용하여 수행될 수 있고; 일부 구현예에서는, Cas9 대신 CpFl이 활용된다. 일반적으로, 'CRISPR 계'는 종합적으로 CRISPR-부속("Cas") 유전자, 예컨대 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr(트랜스-활성 CRISPR) 서열(예를 들면, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-mate 서열('직접적인 반복서열'과 내생적 CRISPR계의 맥락에서 tracrRNA-처리된 부분적 직접 반복 서열을 포함함), 유도 서열(내생적 CRISPR계의 맥락에서 '스페이서'로도 지칭됨), 및/또는 기타 서열 및 CRISPR 좌(locus)의 전사체의 발현에 관여되거나 또는 이들의 활성을 지시하는 전사체 및 기타 요소들을 가리킨다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제계는 서열 특이적으로 DNA에 결합되는 비코딩 RNA 분자(유도) RNA 및 뉴클레아제 기능성(예를 들어, 뉴클레아제 영역 2개 포함) Cas 단백질(예를 들어, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 계의 하나 이상의 요소는 예를 들어, 내생적 CRISPR계를 포함하는 특정 생명체, 예컨대 스트렙토코커스 피오젠에서 유래된 유형 I, 유형 II, 또는 유형 III CRISPR계에서 유래될 수 있다.
일부 측면에서, Cas 뉴클레아제와 gRNA(표적 서열 및 고정된 tracrRNA에 특이적인 crRNA의 융합을 포함)가 상기 세포에 유입된다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단에 위치한 표적 부위는 보완적 염기쌍을 이용하여 상기 표적 부위, 예를 들어 유전자에 Cas 뉴클레아제를 적중시킨다. 상기 표적 부위는 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif)(PAM) 서열의 근접한 5', 예컨대 전형적으로 NGG 또는 NAG에서의 위치를 근거로 선택될 수 있다. 이러한 측면에서, gRNA는 표적 DNA 서열에 상응하도록 유도 RNA의 첫 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 또는 10개 뉴클레오타이드를 변형함으로써 원하는 서열에 적중된다. 일반적으로, CRISPR계는 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소들이 특징적이다. 전형적으로'표적 서열'은 일반적으로 유도 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 상기 표적 서열과 유도 서열 사이의 혼성화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 야기하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 존재한다면, 온전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다.
CRISPR계는 표적 부위에서 이중 가닥 절단(DSBs)를 유도하고, 이어서 본원에 논의된 바와 같이 파괴 또는 변형을 유도할 수 있다. 다른 구현예에서, '닉카아제'로 불리는 Cas9 변이체가 사용되어 표적 부위에서 단일 가닥을 끊을 수 있다. 예를 들어, 쌍을 이룬 닉카아제가 사용되어 특이성을 개선할 수 있고, 이들 각각은 닉(nicks)을 도입함과 동시에, 5' 돌출이 도입되도록 서열을 표적으로 하는 한 쌍의 상이한 gRNA에 의해 좌우된다. 다른 구현예에서, 촉매작용에서 불활성인 Cas9가 이종 효과기 영역, 예컨대 전사 억제기 또는 활성기에 융합되어 유전자 발현에 영향을 미친다.
상기 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질, 예컨대 세포의 소기관내에 위치될 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적이 된 좌로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 템플레이트는 '편집 템플레이트' 또는 '편집 폴리뉴클레오타이드' 또는 '편집 서열'이라 불린다. 일부 측면에서, 외생적 템플레이트 폴리뉴클레오타이드는 편집 템플레이트라 불릴 수 있다. 일부 측면에서, 상기 재조합은 동종 재조합이다.
전형적으로, 내생적 CRISPR계의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질로 복합체화된 유도 서열을 포함함)의 형성이 표적 서열 내에 또는 이의 근처에(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 또는 그 이상의 염기쌍만큼 떨어져서) 하나 또는 두 가닥의 쪼개짐을 초래한다. 야생형 tracr 서열(예를 들어 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)의 전부 또는 일부분을 포함하거나 또는 이들로 이루어질 수 있는 상기 tracr 서열은 또한 예컨대 tracr 서열의 적어도 일부분을 따라 유도 서열에 작업가능하게 연결된 tracr mate 서열의 전부 또는 일부분에 혼성화함으로써 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. 상기 tracr 서열은 tracr mate 서열에 대한 상보성이 충분하여 CRISPR 복합체의 형성을 혼성화하고 참여하며, 예컨대 최적으로 정렬된 경우 tracr mate 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하도록 CRISPR계의 하나 이상의 요소의 발현을 추진시키는 하나 이상의 벡터가 상기 세포에 유입될 수 있다. 성분들은 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-mate 서열에 연결된 유도 서열, 및 tracr 서열은 각각 작업가능하게 연결되어 별도의 벡터 상의 조절 요소들을 분리할 수 있다. 대안적으로, 동일한 또는 상이한 조절 요소들에서 발현된 둘 이상의 요소들은 단일 벡터에서 조합될 수 있고, 하나 이상의 추가적 벡터가 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR계의 임의의 성분들을 제공한다. 상기 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예컨대 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열('복제 부위'라고도 불림)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 다수의 상이한 유도 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물이 사용되어 세포 내 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 적중시킬 수 있다.
벡터는 CRISPR 효소, 예컨대 Cas 단백질을 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작업가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예에는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csnl 및 Csx12라고도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 동족체 또는 이들의 변형체가 포함된다. 이들 효소가 알려져 있으며, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오젠 Cas9 단백질의 아미노산 서열이 접속 번호 Q99ZW2의 SwissProt 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
CRISPR 효소는 Cas9 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오젠 또는 폐렴구균)일 수 있다. 일부 경우에, CpF1이 Cas9 대신에 엔도뉴클레아제로 사용될 수 있다. CRISPR 효소는, 예컨대 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보완물 내 표적 서열의 위치에서 하나 또는 두 가닥의 직접적인 쪼개짐을 일으킬 수 있다. 벡터는 돌연변이된 CRISPR 효소에 표적 서열을 함유한 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 두 가닥을 쪼개는 능력이 결핍되도록 상응하는 야생형 효소과 관련하여 돌연변이되는 CRISPR 효소를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오젠의 Cas9의 RuvC I 촉매 영역에서 아스파르테이트-알라닌 치환(D10A)이 두 가닥을 쪼개는 뉴클레아제의 Cas9를 닉카아제(단일 가닥을 쪼갬)로 전환한다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카아제는 유도 서열(들), 예를 들어 2개의 유도 서열과 조합하여 사용될 수 있는데, 이들은 각기 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 표적으로 삼는다. 이와 같은 조합으로 두 가닥이 베인 자국이 나서 NHEJ 또는 HDR를 유도하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 특정 세포, 예컨대 진핵 세포 내에서 발현에 최적화된 코돈이다. 상기 진핵 세포는 특정 생명체, 예컨대 포유류, 예를 들면, 비제한적으로, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 인간 아닌 영장류의 세포 또는 이들에서 유래된 세포일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 본래의 아미노산 서열을 유지하면서 본래 서열의 코돈 중 적어도 하나를 숙주 세포의 유전자에 좀 더 자주 또는 가장 자주 사용되는 코돈으로 교체함으로써, 관심대상의 숙주 세포에서 발현 증진을 위한 핵산 서열의 변형 과정을 가리킨다. 다양한 종들이 특정 아미노산의 일정 코돈에 대해 특정 편향을 보인다. 코돈 편향(생명체들 사이에서 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역의 효율성과 상관관계가 있고, 이는 이어서, 다른 무엇보다, 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전이 RNA(tRNA) 분자의 활용가능성에 따라 좌우되는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 가장 두드러지는 점은 일반적으로 펩타이드 합성에 가장 자주 사용되는 코돈의 반영이다. 이에 따라, 코돈 최적화를 기반으로 주어진 생명체에서의 최적의 유전자 발현을 위해 유전자가 맞춤변형될 수 있다.
일반적으로, 유도 서열은 표적 서열과 혼성화하고 CRISPR 복합체의 표적 서열로의 서열-특이적 결합을 지시하기에 충분한 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 유도 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬된 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상이다.
최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있는데, 이의 비제한적인 예에는 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler 변형 (예를 들어 Burrows Wheeler Aligner)을 기반으로 한 알고리즘, Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genoms.org.cn에서 입수 가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 입수 가능)이 포함된다.
CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 영역을 포함하는 융합 단백질의 일부분일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가적 단백질 서열과, 임의의 두 영역 사이의 링커 서열을 임의로 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 영역의 예에는 비제한적으로, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기 활성 중 하나 이상의 단백질 영역이 포함된다: 메틸라아제 활성, 디메틸라아제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 쪼개짐 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적 예에는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 독감 헤막글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오렉독신(Trx) 태그가 포함된다. 리포터 유전자의 예로는, 비제한적으로, 글루타티온-5-전이효소(GST), 겨자무 과산화효소(HRP), 클로르암페니콜 아세틸전이효소(CAT) 베타 갈락토시다아제, 베타-글루큐로니다아제, 루시퍼라아제, 초록형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 자가형광 단백질, 예컨대 청색 형광(BFP)이 포함된다. CRISPR 효소는 DNA 분자를 결합시키거나 또는 다른 세포 분자를 결합시키는 단백질 또는 단백질의 절편, 예컨대, 비제한적으로, 말토오즈 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 영역(DBD) 융합, GAL4A DNA 결합 영역 융합, 및 단순 포진 바이러스(HSV) BP 16 단백질 융합을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가의 영역이 본원에 참조로 편입된 US 20110059502에 기술되어 있다.
IV. 치료의 방법
본원의 구현예는 예를 들어, 암 면역치료, 항-병원체 면역치료, 자가면역, 또는 동종면역과 관련된 치료의 방법을 포함한다. 특이적 경우에, 상기 암 면역치료 및 항-병원체 면역치료는 적어도 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 방법들은 암 및/또는 병원체가 있는 개인에게 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 면역 효과기 세포를 유효량만큼 제공하는 단계를 포함한다.
특정 경우에, 개인에게 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 세포가 유효량만큼 제공된다. 구체적인 경우에, 상기 세포는 또한 하나 이상의 조작된 항원 수용체를 발현한다. 구체적인 경우에, 상기 세포는 또한 CRISPR/Cas9를 사용하여 녹아웃된다. 유전적으로 조작된 면역 효과기 세포는 고형 종양에 대한 효과성을 증가시키기 위해 다양한 세포 치료법에 사용되고, 이들 세포 치료법은 개인에게 제공된다.
하나의 예로서, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 NK 세포는 하나 이상의 CAR를 발현하고, 고형 종양의 산성 TME에서 이의 효과성을 증가시키기 위한 목적으로 하나 이상의 내생적 유전자를 삭제하도록 유전적으로 조작되고, 이는 특정 구현예에서 상기 치료법의 고형 종양으로의 확대를 야기한다. 더불어, 이와 같은 유전자 조작 전략이 세포 치료법, 예컨대 CAR-NK 세포, T-세포 수용체 (TCR)-T 세포, 종양-침투 림프구(TIL)의 다양한 기타 형태에 사용되어, 고형 종양의 다양한 유형에 대해 이들을 전능화한다.
일정 구현예에서, 본원의 세포는 의학적 질환, 예컨대 임의의 종류의 암 및/또는 임의의 종류의 병원체 감염을 개선하기 위한 목적으로 개인에게 제공된다. 본원에서 고안된 세포, 예컨대 상기 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 암 질환, 예컨대 종양 질병 또는 병원체 감염의 예방, 치료 또는 완화를 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 본원의 약제학적 조성물은 예를 들어 고형 종양일 수도 아닐 수도 있는 암을 비롯하여 암을 예방, 완화 및/또는 치료하는 데 특히 유용할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원은 부분적으로 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료법과 병행하여, 그리고 적어도 일부 측면에서, 약제학적으로 허용가능한 운반체 또는 부형제와 함께 투여될 수 있는 본원에서 포함하는 세포의 사용이 기대된다. 일정 구현예에서, 임의의 핵산 분자 또는 벡터는 상기 세포의 개체로의 전달 전에 상기 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다.
본원의 임의의 세포는 주사로, 정맥으로, 동맥으로, 복강 내로, 기도로, 종양 내로, 근육 내로, 내시경을 통해, 병변 내로, 두개 내로, 경피로, 피하로, 국부적으로, 관류에 의해, 종양 미세환경에서, 또는 이들의 조합으로 개인에게 투여될 수 있다.
추가로, 본원은 종양 질병의 예방, 치료 또는 완화를 위한 방법에 관한 것으로, 본원에서 고안된 바와 같이, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 임의의 세포를 이것이 필요한 개체에 유효량만큼 투여하는 단계를 포함한다.
상기 세포의 조성물(들)의 투여에 대한 가능한 징후는 암 질병, 예를 들어, 종양 질병, 예컨대, 예를 들어, 교모세포종, B 세포 악성, 다발성 골수종, 폐, 뇌, 유방, 혈액, 피부, 췌장, 간, 결장, 두경부, 신장, 갑상선, 위, 비장, 담낭, 골, 난소, 고환, 자궁내막, 전립선, 직장, 항문 또는 자궁경관의 암이다. 상기 세포의 조성물(들)의 투여를 위한 예시적 징후는 암 질병, 예를 들어, 개인의 암과 연관된 하나 이상의 특정 항원을 발현하는 임의의 악성이다. 본원의 조성물(들)의 투여는 모든 단계 및 모든 유형의 암, 예컨대, 예를 들어, 최소 잔류 종양, 조기암, 진행된 암, 및/또는 전이암 및/또는 난치성 암에 유용하다.
본원은 추가로 면역 세포를 통해 작용하는 다른 화합물, 예를 들어, 이중특이성 항체 작제물, 표적이된 톡신 또는 다른 화합물과의 병용 투여 프로토콜을 포함한다. 신규한 화합물(들)의 병용 투여의 임상적 요법은 다른 성분의 투여와 동시에, 이전에 또는 이후에 병용 투여를 포함할 수 있다. 특정한 병용 치료에는 화학요법, 방사선 요법, 수술, 호르몬 요법 또는 다른 유형의 면역치료가 포함된다.
본원의 구현예는 동일한 세포 면역치료에서의 표적으로서 성상 세포를 제외시키면서 세포 면역치료를 교모세포종 줄기 세포에 적중시키는 방법을 포함한다. 상기 세포 면역치료는 적어도 NK 세포를 비롯한 임의의 종류의 면역 효과기 세포를 포함할 수 있다. 상기 세포 면역치료는 하나 이상의 외생적으로 제공되는 사이토카인을 포함하는 면역 효과기 세포를 포함할 수 있다.
구현예는 상기 세포를 생산하는 작제물, 본원에 정의된 핵산 서열, 본원에 정의된 벡터 및/또는 본원에 정의된 숙주 세포(예컨대, 면역 효과기 세포)를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본원의 키트는 본원에서 앞서 기술된 약제학적 조성물을, 단독으로 또는 의학적 치료 또는 개입이 필요한 개인에게 투여될 추가의 약물과 병행하여 포함하는 것이 고안되었다.
V. 유전적으로 조작된 수용체
하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 본원의 면역 세포는 하나 이상의 비-내생적 유전자 생성물을 발현하도록 변형될 수 있다. 상기 유전자 생성물은 유전적으로 조작된 수용체일 수도 있고 아닐 수도 있다. 상기 수용체는 임의의 종류로서, 예를 들어 항원의 수용체, 케모카인, 또는 사이토카인이 포함될 수 있다. 상기 수용체가 항원용인 경우, 상기 항원은 고형 종양 항원을 비롯한 암 항원일 수 있다.
하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 면역 효과기 세포는 특이적 항원을 표적으로 삼는 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있고, 그와 같은 세포는 개인의 암 세포 상에 존재하는 하나 이상의 항원을 표적으로 삼도록 특이적으로 설계될 수 있다.
구체적인 구현예에서, 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 면역 효과기 세포는 조작된 항원 수용체, 예컨대 조작된 TCR 또는 CAR를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 면역 세포는 하나 이상의 특이적 항원에 대한 항원 특이성을 갖는 하나 이상의 CAR 및/또는 TCR를 발현하도록 변형되는 NK 세포일 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역 세포는 예를 들어 CRISPR를 사용하여 CAR 또는 TCR의 녹인(knock-in)에 의해 항원-특이적 CAR 또는 항원-특이적 TCR를 발현하도록 조작된다.
변형의 적절한 방법이 당해기술에 공지되어 있다. 예를 들어 앞의 Sambrook 및 Ausubel 참조할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Heemskerk et al, 2008 and Johnson et al, 2009]에 기술된 형질도입 기법을 사용하여 암 항원에 대한 항원 특이성을 갖는 TCR를 발현하기 위해 상기 세포가 형질도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 하나 이상의 항원 수용체를 인코딩하는 유전 조작을 통해 유입된 하나 이상의 핵산 및 이와 같은 핵산의 유전적으로 조작된 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 이종으로, 즉 예를 들어, 조작 중인 세포 및/또는 그와 같은 세포가 유래되는 생명체에서 일반적으로 발견되지 않는, 또 다른 생명체 또는 세포에서 획득되는 것과 같이, 세포 또는 상기 세포에서 획득된 샘플에 정상적으로 존재하지 않는 것이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 자연적으로 발생되지 않으며, 예컨대 자연적으로 발견되지 않는 핵산이다 (예를 들어, 키메라).
CAR 및 재조합 재조합 TCR를 포함하는 예시적 항원 수용체와, 상기 수용체를 조작하여 세포에 유입시키는 방법은 예를 들어 국제특허 출원 공보 WO 200014257, WO 2013126726, WO 2012/129514, WO 2014031687, WO 2013/166321, WO 2013/071154, WO 2013/123061 미국 특허 출원 공보 US 2002131960, US 2013287748, US 20130149337, 미국 특허 제6,451,995호, 제7,446,190호, 제8,252,592호, 제8,339,645호, 제8,398,282호, 제7,446,179호, 제6,410,319호, 제7,070,995호, 제7,265,209호, 제7,354,762호, 제7,446,191호, 제8,324,353호 및 제8,479,118호, 및 유럽 특허 출원 EP 2537416에 기술된 것 및/또는 문헌[Sadelain et al., 2013; Davila et al., 2013; Turtle et al., 2012; Wu et al., 2012]에 의해 기술된 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 유전적으로 조작된 항원 수용체는 미국 특허 제7,446,190호에 기술된 CAR 및 국제 특허 출원 공보 WO 2014055668 A1에 기술된 것들을 포함한다.
상기 조작된 수용체가 항원 수용체인 경우, 상기 항원은 5T4, 8H9, αvβ6　인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD5, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, CS1, CLL1, CD99, DLL3, EGFR, ErbB2(HER2)를 비롯한 EGFR과(family), EGFRvIII, EGP2, EGP40, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글립피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-Al+NY-ESO-1, IL-llRα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, L1CAM, 카파, KDR, MCSP, 메소텔린, Muc1, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSC1, PSCA, PSMA, ROR1, SP17, 수르비빈, TAG72, TEMs, HMW-MAA, VEGFR2로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
A. 키메라 항원 수용체
일부 구현예에서, 상기 항원-특이적 CAR는 a) 하나 이상의 세포내 신호전달 영역, b) 막관통 영역, 및 c) 상기 원하는 항원을 표적으로 삼는, 특이적으로 결합시키는 항원 결합 부위를 포함하는 세포외 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 항원 수용체는 활성화 또는 자극성 CAR, 동시자극성 CAR(WO 2014/055668 참조), 및/또는 억제성 CAR(iCARs, Fedorov et al., 2013 참조)를 비롯한 CAR를 포함한다. 상기 CAR는 일반적으로, 일부 측면에서, 링커 및/또는 막관통 영역(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된세포외 항원(또는 리간드) 결합 영역을 포함한다. 이와 같은 분자는 전형적으로 천연 항원 수용체를 통한 신호를, 동시자극성 수용체와 조합된 그와 같은 수용체를 통한 신호를, 및/또는 동시자극성 수용체 단독을 통한 신호를 모사하거나 또는 이들과 유사하다.
본원의 일정 구현예는 항원-특이적 CAR 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 예컨대 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된 CAR(hCAR)를 포함하고, 적어도 하나의 세포내 신호전달 영역, 막관통 영역, 및 하나 이상의 신호전달 모티프를 포함하는 세포외 영역을 포함하는 핵산의 사용에 관한 것이다. 일정 구현예에서, 상기 항원-특이적 CAR는 하나 이상의 항원들 사이의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인식할 수 있다. 일정 구현예에서, 상기 결합 부위는 단클론성 항체의 상보적 결정 영역, 단클론성 항체의 가변 영역, 및/또는 이들의 항원 결합 절편을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 특이성은 수용체에 결합되는 펩타이드(예를 들어, 사이토카인)에서 유래된다.
인간 항원 CAR 핵산은 인간 환자를 위한 세포 면역치료를 향상시키기 위한 인간 유전자일 수 있다고 고려된다. 특정 구현예에서, 본원은 전장 항원-특이적 CAR cDNA 또는 코딩 부위를 포함한다. 상기 항원 결합 부위 또는 영역은 예컨대 본원에 참조로 편입된 미국 특허 제7,109,304호에 기술된, 특정 인간 단클론성 항체에서 유래된 단일 사슬 가변 절편(scFv)의 VH 및 VL의 절편을 포함할 수 있다. 상기 절편은 또한 인간 항원-특이적 항체의 다수의 개의 상이한 항원 결합 영역일 수 있다. 좀 더 특이적인 구현예에서, 상기 절편은 인간 세포에서의 발현을 위한 인간 코돈 사용을 위해 최적화된 서열에 의해 인코딩된 항원-특이적 scFv이다.
배열은 다중결합, 예컨대 디아바디 또는 다량체일 수 있다. 상기 다량체는 경쇄 및 중쇄의 가변 부분을 디아바디 내로 교차쌍 짓기에 의해 형성될 가능성이 높다. 상기 작제물의 경첩 부분은 완전히 결실되는 것에서 제1 시스테인이 유지되는 것으로, 세린 치환 대신 프롤린 치환으로, 제1 시스테인으로 끝이 절단된 것으로 다양한 대안을 가질 수 있다. 상기 Fc 부분은 결실될 수 있다. 안정적인 및/또는 이량체화되는 임의의 단백질은 이와 같은 목적을 달성할 수 있다. Fc 영역 중 단 하나, 예를 들어, 인간 면역 글로불린의 CH2 또는 CH3 영역 중 하나를 사용할 수 있다. 또한, 이량체화를 개선하기 위해 변형된 바 있는 인간 면역 글로불린의 경첩, CH2 및 CH3의 부위를 사용할 수 있다. 또한 면역 글로불린의 경첩 부분만을 사용할 수도 있다. 또한 CD8알파의 일부분들을 사용할 수도 있다.
일부 구현예에서, CAR 핵산은 다른 동시자극성 수용체, 예컨대 막관통 영역 및 변형된 CD28 세포내 신호전달 영역을 인코딩하는 서열을 포함한다. 다른 동시자극성 수용체에는, 비제한적으로, CD28, CD27, OX-40(CD134), DAP10, DAP12 및 4-1BB(CD137) 중 하나 이상이 포함된다. CD3ζ에 의해 개시되는 원시 신호와 더불어, 인간 CAR에 삽입된 인간 동시자극성 수용체에 의해 제공되는 추가의 신호가 NK 세포의 완전한 활성화를 위해 중요하고, 채택된 면역치료의 체내 지속성 및 성공적인 치료를 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원, 예컨대 정상적인 또는 비질병 세포 유형 상에서 또는 질병 세포 유형 상에서 발현되는 항원에 대한 특이성이 있는 항원-특이적 CAR가 구성된다. 따라서, CAR는 전형적으로 이의 세포외 부분에 하나 이상의 항원-결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원-결합 절편, 영역, 또는 일부분, 또는 하나 이상의 항체 가변 영역, 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원-특이적 CAR는 항원-결합 부분 또는 항체 분자의 일부분, 예컨대 단클론성 항체(mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)에서 유래된 단쇄 항체 절편(scFv)을 포함한다.
상기 키메라 수용체를 인코딩하는 개방 판독 기틀의 서열은 게놈 DNA 원료, cDNA 원료에서 획득될 수 있고, 또는 (예를 들어, PCR를 통해), 또는 이의 조합에 의해 합성될 수 있다. 인트론이 mRNA를 안정화시키는 것이 발견되면서, 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 개수에 따라, cDNA 또는 이들의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 내생적 또는 외생적 비-코딩 부위를 사용하여 mRNA를 안정화시키는 것이 더 이로울 수 있다.
상기 키메라 작제물이 순수한(naked) DNA로서 또는 적합한 벡터를 통해 면역 세포에 유입될 수 있음이 예상된다. 순수한 DNA를 사용하여 전기천공에 의해 세포를 안정적으로 형질주입하는 방법이 당해기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,410,319호 참조. 순수한 DNA는 일반적으로 발현을 위해 적절한 방향성의 플라스미드 발현 벡터에 함유된 키메라 수용체를 인코딩하는 DNA를 가리킨다.
대안적으로, 키메라 작제물을 면역 세포에 유입시키기 위해 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터)가 사용될 수 있다. 본원의 방법에 따라 사용하기 위한 적합한 벡터는 면역 세포에서 복제되지 않는다. 바이러스 기반의 수많은 벡터가 알려져 있는데, 세포에서 유지되는 바이러스의 카피 개수는 세포, 예컨대, 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV를 기반으로 한 벡터의 생존능력을 유지시킬 만큼 충분히 낮다.
일부 측면에서, 상기 항원-특이적 결합, 또는 인식 성분이 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호 전달 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, CAR는 CAR의 세포외 영역에 융합된 막관통 영역을 포함한다. 일 구현예에서, CAR의 영역들 중 하나와 자연적으로 연관된 막관통 영역이 사용된다. 일부 경우에, 상기 막관통 영역은 그와 같은 영역이 동일한 또는 상이한 표면막 단백질의 막관통 영역에 결합되는 것을 방지하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 또는 변형됨으로써, 상기 수용체 복합체의 다른 구성원들과의 상호작용을 최소화한다.
일부 구현예에서, 막관통 영역은 자연적인 원료 또는 합성 원료 중 하나에서 유래된다. 상기 원료가 자연적인 경우, 상기 영역은, 일부 측면에서, 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질에서 유래된다. 막관통 부위는 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357, NKG2D 및 DAP 분자(즉, 적어도 이들의 막관통 부위(들)을 포함함)에서 유래된 것들을 포함한다. 대안적으로, 상기 막관통 영역은, 일부 구현예에서, 합성된 것이다. 일부 측면에서, 상기 합성된 막관통 영역은 지배적으로 소수성인 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린 세 쌍둥이는 합성된 막관통 영역의 각 말단에서 발견될 것이다.
일정 구현예에서, 면역 세포, 예컨대 NK 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 본원에 개시된 플랫폼 기술은 (i) 전기천공 장치(예를 들어, 뉴클레오펙터)를 사용한 비바이러스 유전자 전이, (ii) 엔도도메인(예를 들어, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ, 또는 기타 조합)을 통해 신호전달하는 CAR, (iii) CD70-인식 영역을 상기 세포 표면에 연결하는 세포외 영역의 길이가 가변적인 CAR, 및 일부 경우에, (iv) CAR+　면역 세포를 강력하게 그리고 수치상 증식시킬 수 있도록 K562에서 유래된 인공 항원 제공 세포(aAPC)(Singh et al., 2008; Singh et al., 2011)를 포함한다.
B. T 세포 수용체 (TCR)
일부 구현예에서, 상기 유전적으로 조작된 항원 수용체는 재조합 TCR 및/또는 자연적으로 발생하는 T 세포에서 복제된 TCR를 포함한다. 'T 세포 수용체' 또는 'TCR'는 가변 α 및 β 사슬을 함유하거나(각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐) 또는 가변 γ 및 δ 사슬을 함유하고(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 알려짐), 주조직적합성 복합체(MHC) 수용체에 결합된 항원 펩타이드에 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 가리킨다. 일부 구현예에서, 상기 TCR는 αβ 형태로 존재한다.
전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR는 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 구별되는 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR는 세포의 표면 상에서 또는 용해된 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR는 이것이 일반적으로 MHC 분자에 결합된 항원을 인식하는 기능을 갖는 T 세포(또는 T 림프구) 상에서 발견된다. 일부 구현예에서, TCR는 또한 불변 영역, 막관통 영역 및/또는 짧은 세포질 꼬리(예를 들어, Janeway et al., 1997 참조)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 상기 TCR의 각 사슬이 하나의 N-말단 면역 글로불린 가변 영역, 하나의 면역 글로불린 불변 영역, 막관통 부위 및 C-말단 단부에서의 짧은 세포질 꼬리를 소유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR는 신호 형질도입을 중개하는 데 관여되는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연관된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 'TCR'는 이의 기능적 TCR 절편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한 상기 용어는 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR를 비롯하여, 손상되지 않은, 즉, 전장 TCR를 포함한다.
따라서, 본원의 목적을 위해, TCR에 대한 언급에는 임의의 TCR 또는 기능성 절편, 예컨대 MHC 분자에 결합된 특이적 항원 펩타이드, 즉, MHC-펩타이드 복합체에 결합되는 TCR의 항원-결합부가 포함된다. 상호교환하여 사용될 수 있는 TCR의 '항원-결합부' 또는 '항원-결합 절편'은 TCR의 구조적 영역의 일부분을 함유하며, 상기 항원(예를 들어 MHC-펩타이드 복합체)을 전장 TCR가 결합되는 것에 결합시키는 분자를 가리킨다. 일부 경우에, 항원-결합부는, 예컨대 일반적으로 각 사슬이 상보성 결정 영역 3개를 함유하는 특이적 MHC-펩타이드 복합체에 결합되기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 영역, 예컨대 TCR의 가변 α 사슬 및 β 사슬을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬의 가변 영역들이 고리, 또는 항원 인식을 제공하고 TCR 분자의 결합 부위를 형성함으로써 펩타이드 특이성을 결정하며, 펩타이드 특이성을 결정하는 면역 글로불린의 유사체인 상보성 결정 부위(CDR)를 형성하기 위해 회합한다. 전형적으로, 면역 글로불린과 마찬가지로, 상기 CDR는 기틀 부위(FR)에 의해 분리된다 (예를 들어, Jores et al., 1990; Chothia et al., 1988; Lefranc et al., 2003 참조). 일부 구현예에서, 비록 알파 사슬의 CDR1이 항원 펩타이드의 N-말단부와 상호작용하는 것으로 보여진 바 있고 한편 베타 사슬의 CDR1이 상기 펩타이드의 C-말단부와 상호작용하지만, CDR3이 처리된 항원을 인식하는 책임을 지는 주요 CDR이다. CDR2는 MHC 분자를 인식하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, β-사슬의 가변 부위가 추가의 고변이성(HV4) 부위를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 TCR 사슬은 불변 영역을 함유한다. 예를 들어, 면역 글로불린과 마찬가지로, TCR 사슬의 세포외 부분(예를 들어, α 사슬, β 사슬)은 2개의 면역 글로불린 영역, N-말단에 가변 영역(예를 들어, Va　또는 Vp; 전형적으로 Kabat 넘버링을 기반으로 아미노산 1 내지 116, Kabat et al, "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and 인간 Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th　ed.) 및 세포막에 이웃한 하나의 불변 영역(예를 들어, α 사슬 불변 영역 또는 Ca, 전형적으로 Kabat을 기반으로 아미노산 117 내지 259, β-사슬 불변 영역 또는 Cp, 전형적으로 Kabat을 기반으로 아미노산 117 내지 295)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 상기 두 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막-근위 불변 영역과, CDR를 함유하는 2개의 막-원위 가변 영역을 함유한다. TCR 영역의 불변 영역은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하는 짧은 연결 서열을 함유함으로써, 상기 2개의 사슬 사이에 링크를 만든다. 일부 구현예에서, 상기 TCR가 불변 영역에 2개의 이황화 결합을 함유하도록 TCR는 α 및 β 사슬 각각에 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 TCR 사슬은 막관통 영역을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 영역은 양 전하를 띈다. 일부 경우에, 상기 TCR 사슬은 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 상기 구조물은 TCR가 CD3과 같은 다른 분자와의 회합을 허용한다. 예를 들어, 막관통 부위가 있는 불변 영역을 함유한 TCR가 상기 세포막에 상기 단백질을 고정시킬 수 있고, CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변 하위단위와 회합할 수 있다.
일반적으로, CD3은 포유류에서 3가지 뚜렷히 구별되는 사슬(γ, δ 및 ε)과 ζ-사슬을 소유할 수 있는 다중 단백질 복합체이다. 예를 들어, 포유류에서, 상기 복합체는 CD3γ 사슬 하나, CD3δ 사슬 하나, CD3ε 사슬 2개 및 CD3ζ 사슬들의 호머다이머를 함유할 수 있다. 상기 CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬들은 단일 면역 글로불린 영역을 함유한 면역 글로불린 상과(superfamily)의 상당히 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬들의 막관통 부위는 음전하를 띄고, 이는 이들 사슬들이 양전하를 띄는 T 세포 수용체 사슬들과 회합하게 하는 특징이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬들의 세포내 꼬리 각각은 면역수용체 타이로신계 활성화 모티프, 즉 ITAM으로 알려진 단일 보존 모티프를 함유하는 반면, CD3ζ사슬 각각은 3개를 갖는다. 일반적으로, ITAM은 TCR 복합체의 신호전달 용량에 관여한다. 이들 부수적인 분자들은 음전하를 띄는 막관통 부위를 가지며 TCR의 신호를 상기 세포로 전파하는 데역할을 한다. CD3- 및 ζ-사슬은 TCR와 함께, T 세포 수용체 복합체로 알려진 것을 형성한다.
일부 구현예에서, 상기 TCR는 2개의 사슬 α 및 β(또는 임의로 γ 및 δ)의 헤테로다이머일 수 있거나 또는 단일 사슬 TCR 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR는 예컨대 하나의 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결되는 2개의 별도의 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 헤테로다이머이다. 일부 구현예에서, 표적 항원(예를 들어, 암 항원)에 대한 TCR가 식별되어 상기 세포에 유입된다. 일부 구현예에서, 상기 TCR를 인코딩하는 핵산이, 예컨대 공개적으로 입수가능한 TCR DNA 서열의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해, 다양한 원료에서 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 TCR는 생물학적 원료에서, 예컨대 세포에서, 예컨대 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), T 세포 하이브리도마 또는 기타 공개적으로 입수가능한 원료에서 획득된다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 체내에서 단리된 세포에서 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, 고친화성 T 세포 클론이 환자에게서, 그리고 단리된 TCR에서 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 배양된 T 세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론이 인간 면역계 유전자(예를 들어, 인간 백혈구 항원계, 즉 HLA)로 조작된 유전자이식 마우스에서 생성된 바 있다. 예를 들어, 종양 항원 참조(예를 들어, Parkhurst et al., 2009 and Cohen et al., 2005 참조). 일부 구현예에서, 표적 항원을 상대하는 TCR를 단리하기 위해 파지 디스플레이가 사용된다 (예를 들어, Varela-Rohena et al., 2008 and Li, 2005). 일부 구현예에서, 상기 TCR 또는 이의 항원-결합부는 TCR의 서열의 지식에서 합성으로 생성될 수 있다.
VI. 벡터
상기 면역 효과기 세포가 비-내생적 조작된 유전자 생성물 또는 외생적으로 제공되는 유전자 생성물, 예컨대 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 경우, 상기 유전자 생성물은 임의의 적합한 벡터에 의해, 예컨대 바이러스 벡터에 의해 또는 비-바이러스 벡터에 의해 수용부위 면역 효과기 세포로 전달될 수 있다. 바이러스 벡터의 예에는 적어도 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-부속 바이러스 벡터가 포함된다. 비-바이러스 벡터의 예에는 적어도 플라스미드, 트랜스포존, 지질, 나노입자 등이 포함된다.
상기 면역 세포에 항원-표적화 수용체를 인코딩하는 벡터가 형질도입되고, 또한 세포, 예컨대 자살 유전자 및/또는 사이토카인 및/또는 선택적 치료 유전자 생성물로의 또다른 유전자 또는 유전자들의 형질도입이 필요한 경우, 상기 항원-표적화 수용체, 자살 유전자, 사이토카인 및 선택적 치료 유전자는 동일한 벡터 상에 또는 동일한 벡터와 함께 포함될 수도 있고 포함되지 않을 수도 있다. 일부 경우에, 상기 항원-표적화 CAR, 자살 유전자, 사이토카인 및 선택적 치료 유전자는 동일한 벡터 분자, 예컨대 동일한 바이러스 벡터 분자에서 발현된다. 이와 같은 경우에, 사이토카인, 선택적 항원 표적화 수용체, 선택적 자살 유전자 및 선택적 치료 유전자의 발현이 동일한 조절 요소(들)에 의해 조절될 수도 있고 조절되지 않을 수도 있다. 상기 사이토카인, 선택적 항원-표적화 CAR, 선택적 자살 유전자 및 선택적 치료 유전자가 동일한 벡터 상에 존재할 경우, 이들은 별개의 폴리펩타이드로서 발현될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 이들이 별개의 폴리펩타이드로서 발현되는 경우, 이들은 예를 들어, 2A 요소 또는 IRES 요소(또는 두 종류 모두 동일한 벡터 상에서 1회 또는 2회 이상 사용될 수 있다)에 의해 벡터 상에서 분리될 수 있다.
A. 일반적 구현예
당해기술의 숙련가라면 본원의 항원 수용체의 발현을 위해 표준 재조합 기법(예를 들어, Sambrook et al., 2001 and Ausubel et al., 1996, 둘 다 본원에 참조로 편입됨)을 통해 벡터를 구성하도록 잘 갖춰져 있을 것이다.
1. 조절 요소
본원에서 유용한 벡터에 포함된 발현 카세트는 특히 (5'에서 3' 방향으로) 단백질-코딩 서열에 작업가능하게 연결된 진핵 전사 촉진자, 개입 서열을 포함하는 스플라이스 신호, 및 전사 종료/폴리아데닐화 서열을 함유한다. 진핵 세포에서 단백질 인코딩 유전자의 전사를 조절하는 상기 촉진자 및 인핸서는 다수의 유전 요소로 이루어질 수 있다. 세포 조직이 각 요소에 의해 운반되는 조절 정보를 수집하여 통합할 수 있어서, 상이한 유전자들이 뚜렷이 구별되고, 종종 복잡한 전사 조절 패턴을 진화시킬 수 있다. 본원의 맥락에서 사용된 촉진자는 예를 들어 구성적이며 유도가능하고 조직-특이적인 촉진자를 포함한다. 상기 벡터가 암 치료법의 생성을 위해 활용된 경우, 촉진자는 산소결핍의 조건 하에서 효과적일 수 있다.
2. 촉진자/인핸서
본원에 제공된 발현 작제물은 항원 수용체와 다른 시스트론 유전자 생성물의 발현을 유발하는 촉진자를 포함한다.일반적으로 촉진자는 RNA 합성을 위한 출발 자리의 위치를 정해주는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이지만, TATA 박스가 결핍된 일부 촉진자의 경우, 예컨대, 예를 들어, 포유류 말단 데옥시뉴클레오타이딜 전이효소 유전자용 촉진자 및 SV40 후기 유전자용 촉진자의 경우, 출발 자리 자체에 가로 놓이는 뚜렷한 요소가 개시의 자리를 고정하는 데 도움을 준다. 추가의 촉진자 요소가 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 자리의 상류에 있는 부위에 위치하지만, 수많은 촉진자들이 또한 출발 자리의 하류에 있는 기능적 요소들을 함유함이 보여진 바 있다. 코딩 서열을 촉진자의 '조절 하에' 두기 위해서는 선택된 촉진자의 '하류(즉, 이의 3')에 있는 전사 판독 기틀의 전사 개시 자리의 5' 단부를위치로 정한다. 상기 '상류' 촉진자는 DNA의 전사를 자극하고, 인코딩된 RNA의 발현을 촉진한다.
촉진자 요소들 사이의 간격은 종종 유동성이 있어서, 요소들이 역전되거나 또는 서로를 대상으로 이동될 때, 촉진자 기능이 보존된다. tk 촉진자에서, 예를 들어, 활성이 감소하기 시작하기 전에 촉진자 요소들 사이의 간격이 50 bp 벌어지도록 증가될 수 있다. 상기 촉진자에 따라, 개별 요소들이 전사를 활성화하기 위해 협조적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다. 촉진자는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여되는 시스-작용 조절 서열을 가리키는 '인핸서'와 함께 사용될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
촉진자는 코딩 분절 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 획득될 수 있는 바와 같이, 핵산 서열과 자연적으로 회합되는 것일 수 있다. 이와 같은 촉진자는 '내생적'이라고 불릴 수 있다. 이와 유사하게, 인핸서는 상기 서열의 하류 또는 상류 중 하나에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 회합되는 것일 수 있다. 대안적으로, 자연적인 환경에서는 정상적으로 핵산 서열과 회합되지 않는 촉진자를 가리키는, 재조합 또는 이종 촉진자의 조절 하에 상기 코딩 핵산 분절을 둠으로써 어떤 이점이 얻어진다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 이의 자연적인 환경에서는 정상적으로 핵산 서열과 회합되지 않는 인핸서를 가리킨다. 이와 같은 촉진자 또는 인핸서는 다른 유전자의 촉진자 또는 인핸서, 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵 또는 진핵 세포에서 단리된 촉진자 또는 인핸서 및, '자연적으로 발생하지' 않는, 즉 상이한 전사 제한 부위의 상이한 요소들, 및/또는 발현을 변형하는 돌연변이들을 함유하는 촉진자 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 구성에 가장 일반적으로 사용되는 촉진자에는 β-락타마아제(페니실리나아제), 락토오즈 및 트립토판(trp-) 촉진자계가 포함된다. 촉진자 및 인핸서의 핵산 서열 합성 방식으로 생산하는 것과 더불어, 서열들은 본원에 개시된 조성물들과 관련하여, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술, 예컨대 PCR™을 사용하여 생산될 수 있다. 더 나아가, 비핵 소기관, 예컨대 미토콘드리아, 엽록체 등 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열이 활용될 수 있다고 기대된다.
자연적으로, 발현을 위해 선택된 소기관, 세포 유형, 조직, 기관, 또는 생명체에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 촉진자 및/또는 인핸서를 활용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학의 기술의 숙련가는 일반적으로 단백질 발현을 위한 촉진자, 인핸서 및 세포 유형 조합의 사용을 알고 있다 (예를 들어 Sambrook et al. 1989 참조, 본원에 참조로 편입됨). 활용되는 촉진자는 적절한 조건 하에서 구성적이고, 조직-특이적이며, 유도적이고, 및/또는 유용하여 유입된 DNA 분절의 고수준 발현을 지시할 수 있어서, 예컨대 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생산에 이롭다. 상기 촉진자는 이종이거나 또는 내생적일 수 있다.
추가로, 임의의 촉진자/인핸서 조합(예를 들어, 월드 와이드 웹 상의 epd.isb-sib.ch/에서 진핵 촉진자 데이터베이스 EPDB)은 또한 발현을 유발하기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 구현예이다. 진핵 세포는 적절한 박테리아 중합효소가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전자 발현 작제물로서 제공되는 경우 특정 박테리아 촉진자로부터의 세포질 전사를 지원할 수 있다.
촉진자의 비제한적인 예에는 조기 또는 후기 바이러스 촉진자, 예컨대, SV40 조기 또는 후기 촉진자, 거대세포 바이러스(CMV) 즉각적 조기 촉진자, 라우스 육종 바이러스(RSV) 조기 촉진자; 진핵 세포 촉진자, 예컨대, 예를 들어, 베타 액틴 촉진자, GADPH 촉진자, 메탈로티오네인 촉진자; 및 연쇄(concatenated) 반응 요소 촉진자, 예컨대 환상 AMP 반응 요소 촉진자(cre), 혈청 반응 요소 촉진자(sre), 포르볼 에스테르 촉진자(TPA) 및 최소 TATA 박스 근처의 반응 요소 촉진자(tre)가 포함된다. 또한 인간 성장 호르몬 촉진자 서열(예를 들어, GenBank®에 기술된 인간 성장 호르몬 최소 촉진자, 승인 번호 X05244, 뉴클레오타이드 283 내지 341) 또는 마우스 유방 종양 촉진자(ATCC에서 입수 가능함, 카탈로그 번호 ATCC 45007)를 사용하는 것이 가능하다. 일정 구현예에서, 치료 유전자의 발현을 구동하는 데 유용한 임의의 다른 촉진자가 본원의 실행에 적용가능하지만, 상기 촉진자는 CMV IE, 덱틴-1, 덱틴-2, 인간 CD11c, F4/80, SM22, RSV, SV40, Ad MLP, 베타-액틴, MHC 부류 I 또는 MHC 부류 II 촉진자이다.
일정 측면에서, 본원의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉, 촉진자의 활성을 증가시키고, 심지어 상대적으로 먼 거리(표적 촉진자로부터 최대 다수의 킬로베이스 떨어진)에 걸쳐, 이들의 방향성과 무관하게, 시스(cis)에서 작용하는 잠재력을 가진 핵산 서열에 관한 것이다. 하지만, 인핸서 기능은 주어진 촉진자에 근접하여 기능할 수도 있어서 반드시 그와 같은 먼 거리에 제한되지 않는다.
3. 개시 신호 및 연결된 발현
특이적 개시 신호 역시 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 본원에 제공된 발현 작제물에 사용될 수 있다. 이와 같은 신호에는 ATG 개시 코돈 또는 이웃한 서열이 포함된다. 외생적 번역 조절 신호, 예컨대 ATG 개시 코돈이 제공될 필요가 있을 수 있다. 당해기술의 숙련가라면 손쉽게 이를 결정하여 필요한 신호들을 제공할 수 있을 것이다. 전체 삽입의 번역을 확보하기 위해서 개시 코돈이 반드시 원하는 코딩 서열의 판독 틀과 함께 '틀 안에(in-frame)' 존재해야 함이 잘 알려져 있다. 외생적 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 자연적이거나 또는 합성된 것일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소의 포함에 의해 향상될 수 있다.
일정 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소의 사용이 다중유전자, 또는 폴리시스트론 메시지를 형성하기 위해 사용된다. IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하여 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다. 포유류 메시지의 IRES 뿐만 아니라 피코르나바이러스 과(family)의 두 구성원(소아마비 및 뇌척수 심근염)의 IRES 요소들이 기술된 바 있다. IRES 요소들은 이종 개방 판독 틀에 연결될 수 있다. 다수의 개방 판독 틀이 함께 전사되고, 각각이 은 IRES에 의해 분리되어, 폴리시스트론 메시지를 형성할 수 있다. IRES 요소에 의해서, 각각의 개방 판독 틀은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근가능하다. 다수의 유전자가 단일 촉진자/인핸서를 사용하여 단일 메시지를 전사함으로써 효율적으로 발현될 수 있다.
본원의 다른 곳에 상세히 설명된 바와 같이, 특정한 2A 서열 요소는 본원에 제공되는 작제물 중 유전자의 연결된 또는 공동 발현을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 쪼개짐 서열이 개방 판독 특들을 연결하여 단일 시스트론을 형성함으로써 유전자를 공동 발현하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 쪼개짐 서열은 말 비염 A 바이러스(E2A) 또는 F2A(구제역 바이러스 2A) 또는 '2A-유사' 서열(예를 들어, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A; T2A) 또는 포르신 테스코바이러스-1 (P2A). 구체적인 구현예에서, 단일 벡터에서, 상기 다중 2A 서열은 동일하지 않지만, 대안적 구현예에서는, 동일한 벡터가 둘 이상의 동일한 2A 서열을 활용한다. 2A 서열의 예들이 본원에 전체가 참조로 편입된 US 2011/0065779에 제공된다.
4. 복제의 기원
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 이는 하나 이상의 복제 부위의 기원(종종 'ori'라 불림), 예를 들어, 앞서 기술된 바와 같이 EBV의 oriP에 상응하는 핵산 서열 또는 프로그래밍에서 유사한 또는 상승된 기능을 갖는 유전적으로 조작된 oriP를 함유할 수 있는데, 이는 복제가 개시되는 특이적 핵산 서열이다. 대안적으로 앞서 기술된 바와 같은 염색체 밖(extra-chromosomally)에서 복제되는 바이러스 또는 자율 복제 서열(ARS)의 복제 기원이 활용될 수 있다.
5. 선택 및 선별 가능 마커
일부 구현예에서, 본원의 CD70-표적화 수용체 작제물을 포함하는 NK 세포가 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써, 체외 또는 체내에서 식별될 수 있다. 이와 같은 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 쉬운 식별을 허용하는 세포에 식별가능한 변화를 제공할 것이다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 허용하는 특성을 제공하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 이의 선택을 허용하는 것인 반면, 음성 선택 마커는 이의 존재가 이의 선택을 막는 것이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 저항 마커이다.
보통, 약물 선택 마커의 포함이 형질전환체의 복제 및 식별을 돕는데, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 저항을 제공하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 조건의 실현을 기반으로 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 제공하는 마커와 더불어, 비색 분석을 근거로 선별가능한 마커, 예컨대 GFP를 비롯한 다른 유형의 마커가 고안되었다. 대안적으로, 음성 선택 마커로서 선별가능한 효소, 예컨대 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(tk) 또는 클로르암페니콜 아세틸전이효소(CAT)가 활용될 수 있다. 당해기술의 숙련가라면 또한 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 함께 활용하는 방법을 알 것이다. 사용되는 마커는 유전자 생성물을 인코딩하는 핵산과 함께 동시에 발현될 수 있는 한, 중요하게 여겨지지 않는다. 선택 및 선별가능 마커의 추가의 예가 당해기술의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
B. 다중시스트론성 벡터
특정 구현예에서, 상기 사이토카인, 선택적 항원-표적화 수용체, 선택적 자살 유전자, 및/또는 선택적 치료 유전자는 다중시스트론 벡터에서 발현된다 (본원에 사용된 용어 '시스트론'은 유전자 생성물이 생성될 수 있는 핵산 서열을 가리킨다). 구체적인 구현예에서, 상기 다중시스트론 벡터는 적어도 하나의 사이토카인, 자살 유전자, 및/또는 조작된 수용체, 예컨대 T-세포 수용체 및/또는 추가의 비-항원-표적화 CAR를 인코딩한다. 일부 경우에, 상기 다중시스트론 벡터는 적어도 하나의 항원-표적화 CAR, 적어도 하나의 자살 유전자 및 적어도 하나의 사이토카인을 인코딩한다. 상기 사이토카인은 특정한 유형의 사이토카인, 예컨대 인간 또는 마우스 또는 임의의 종일 수 있다. 구체적인 경우에, 상기 사이토카인은 IL-7, IL-12, IL-2, IL-18, 및/또는 IL-21이다.
일정 구현예에서, 본원은 실질적으로 동일한 수준으로 다수의 시스트론를 발현하는 능력을 가진 폴리시스트론 벡터를 활용하는 유연한 모듈 시스템(본원에서 사용되는 용어 '모듈'은 예를 들어 표준 재조합 기법을 사용하여, 예컨대 시스트론 전체 또는 시스트론의 구성성분의 제거 및 교체에 의해 상호교환 가능성을 허용하는 시스트론 또는 시스트론의 구성성분을 가리킨다.)을 제공한다. 상기 시스템은 다수의 유전자의 조합적 발현(과발현 포함)을 가능하게 하는 세포 조작을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 상기 벡터에 의해 발현되는 하나 이상의 유전자에는 하나, 둘 또는 그 이상의 항원 수용체가 포함된다. 상기 다수의 유전자는, 비제한적으로, CAR, TCR, 사이토카인, 케모카인, 귀소성 수용체, CRISPR/Cas9-매개 유전자 돌연변이체, 유인 수용체, 사이토카인 수용체, 키메라 사이토카인 수용체 등을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 추가로 하기를 포함할 수 있다: (1) 예컨대 세포 검정 및 동물 영상화를 위한 하나 이상의 리포터, 예를 들어 형광 또는 효소 리포터; (2) 하나 이상의 사이토카인 또는 기타 신호전달 분자; 및/또는 (3) 자살 유전자.
구체적인 경우에, 상기 벡터는 임의의 종류의 쪼개짐 부위, 예컨대 2A 쪼개짐 부위에 의해 분리되는 적어도 4개의 시스트론를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 pUC19 근간에 psi 패키징 서열이 있는 3' 및 5' LTR를 포함하는 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스(MoMLV 또는 MMLV)계일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 상기 벡터는 3개 이상의 2A 쪼개짐 부위가 있는 4개 이상의 시스트론과 유전자 스와핑을 위한 다중 ORF를 포함할 수 있다. 상기 시스템은 하위클로닝을 통한 빠른 통합을 위해 제한 부위(들)의 측면에 배치된 다수의 유전자(7개 이상)의 조합적인 과발현을 허용하고, 상기 시스템은 또한, 일부 구현예에서, 적어도 3개의 2A 자발적-쪼개짐 부위를 포함한다. 따라서, 상기 시스템은 다수의 CAR, TCR, 신호 전달 분자, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 및/또는 귀소성 수용체의 발현을 가능하게 한다. 이와 같은 시스템은 또한 비-바이러스 플라스미드뿐만 아니라, 비제한적으로, 렌티바이러스, 아데노바이러스 AAV를 비롯한 다른 바이러스 및 비-바이러스 벡터에 적용될 수 있다.
상기 시스템의 모듈 특성으로 인해 또한 폴리시스트론 발현 벡터에서 4개 시스트론 각각으로 유전자를 효율적으로 하위클로닝할 수 있고, 예컨대 빠른 검사를 위해, 유전자의 스와핑이 가능하다. 폴리시스트론 발현 벡터에 전략적으로 위치한 제한 부위는 유전자의 효율적인 스와핑을 가능하게 한다.
본원의 구현예는 폴리시스트론 벡터를 활용하는 시스템들을 포함하며, 상기 벡터의 적어도 일부는, 예를 들어 하나 이상의 시스트론(또는 하나 이상의 시스트론의 구성성분(들))의 제거 및 교체를 허용함으로써, 예컨대 상기 벡터의 모듈형 사용을 용이하게 하기 위해 정체성과 위치가 특이적으로 선택되는 하나 이상의 제한 효소 부위를 활용함으써, 모듈형이다. 상기 벡터는 또한 다수의 시스트론이 단일 폴리펩타이드로 번역되고 별도의 폴리펩타이드로서 처리됨으로써, 실질적으로 등몰 농도에서 별도의 유전자 생성물을 발현하는 벡터를 위해 이점을 주는 구현예들 또한 갖는다.
본원의 벡터는 모듈 방식이 상기 벡터의 하나 이상의 시스트론을 변경할 수 있고 및/또는 하나 이상의 특정 시스트론의 하나 이상의 구성 성분을 변경할 수 있도록 구성된다. 상기 벡터는 하나 이상의 시스트론의 단부의 측면에 위치한 및/또는 특정 시스트론의 하나 이상의 구성성분의 단부의 측면에 위치한 고유한 제한 효소 부위를 활용하도록 설계될 수 있다.
본원의 구현예는 하나 이상의 제한 효소 부위의 측면에 각각 위치하는 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 시스트론을 포함하는 폴리시스트론 벡터를 포함하며, 적어도 하나의 시스트론이 적어도 하나의 항원 수용체를 위해 인코딩한다. 일부 경우에, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 시스트론이 단일 폴리펩타이드로 번역되어 별도의 폴리펩타이드로 쪼개지는 반면, 다른 경우에는 다수의 시스트론이 단일 폴리펩타이드로 번역되어 별도의 폴리펩타이드로 쪼개진다. 상기 벡터 상의 이웃한 시스트론들은 자발적 쪼개짐 부위, 예컨대 2A 자발적 쪼개짐 부위에 의해 분리될 수도 있다. 일부 경우에, 상기 시스트론 각각은 상기 벡터에서 별도의 폴리펩타이드를 발현한다. 특정한 경우에, 상기 벡터 상의 이웃한 시스트론들은 IRES 요소에 의해 분리된다.
일정 구현예에서, 본원은 예를 들어, 1, 2개 또는 그 이상의 항원 수용체를 포함할 수 있는 다수의 시스트론의 과발현을 비롯한 조합적 발현을 가능하게 하는 세포 조작을 위한 시스템을 제공한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 폴리시스트론 벡터의 사용은 상기 벡터가 동일한 mRNA에서 등몰 수준의 다수의 유전자 생성물을 생산하도록 허용한다. 상기 다수의 유전자는, 비제한적으로, 사이토카인, CAR, TCR, 케모카인, 귀소성 수용체, CRISPR/Cas9-매개 유전자 돌연변이체, 유인 수용체, 사이토카인 수용체, 키메라 사이토카인 수용체 등을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 예컨대 세포 검정 및 동물 영상화를 위해, 하나 이상의 형광 또는 효소 리포터를 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 또한 더 이상 필요가 없거나 또는 이들이 제공된 숙주에 해로워진 경우, 상기 벡터를 품은 세포의 종료를 위한 자살 유전자 생성물을 포함할 수 있다.
본원의 특정 구현예에서, 상기 벡터 상의 시스트론들 중 적어도 하나는 둘 이상의 모듈형 구성 성분을 포함하며, 시스트론 내의 상기 모듈형 구성 성분들 각각은 하나 이상의 제한 효소 부위의 측면에 위치된다. 하나의 시스트론은 예를 들어, 3, 4 또는 5개 모듈형 구성 성분을 포함할 수 있다. 적어도 일부 경우에는, 하나의 시스트론이 상응하는 모듈형 구성 성분들에 의해 인코딩된 수용체의 다양한 부분을 가진 항원 수용체를 인코딩한다. 시스트론의 제1 모듈형 구성 성분은 상기 수용체의 항원 결합 영역을 인코딩할 수 있다. 추가로, 시스트론의 제2 모듈형 구성 성분은 상기 수용체의 경첩 부위를 인코딩할 수 있다. 추가로, 시스트론의 제3 모듈형 구성 성분은 상기 수용체의 막관통 영역을 인코딩할 수 있다. 추가로, 시스트론의 제4 모듈형 구성 성분은 제1 동시자극성 영역을 인코딩할 수 있다. 추가로, 시스트론의 제5 모듈형 구성 성분은 제2 동시자극성 영역을 인코딩할 수 있다. 추가로, 시스트론의 제6 모듈형 구성 성분은 신호 전달 영역을 인코딩할 수 있다.
본원의 특정 측면에서, 상기 벡터 상의 상이한 2개의 시스트론은 각각이 동일하지 않은 항원 수용체를 인코딩한다. 두 가지 항원 수용체는 둘 이상의 모듈형 구성 성분을 포함하는 시스트론, 예컨대 둘 이상의 모듈형 구성 성분을 포함하는 별도의 시스트론에 의해 인코딩될 수 있다. 상기 항원 수용체는 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T 세포 수용체(TCR)일 수 있다.
구체적인 구현예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 아데노-부속 바이러스 벡터) 또는 비-바이러스 벡터이다. 상기 벡터는 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스(MMLV) 5' LTR, 3' LTR, 및/또는 psi 패키징 요소를 포함할 수 있다. 구체적인 경우에, 상기 psi 패키징은 5' LTR와 상기 항원 수용체 코딩 서열 사이에 편입된다. 상기 벡터는 pUC19 서열을 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 상기 벡터의 일부 측면에서, 적어도 하나의 시스트론이 사이토카인(예를 들어, 인터루킨 15(IL-15), IL-7, IL-21, 또는 IL-2), 케모카인, 사이토카인 수용체, 및/또는 귀소성 수용체를 위해 인코딩한다.
2A 쪼개짐 부위가 상기 벡터에 활용되는 경우, 상기 2A 쪼개짐 부위는 P2A, T2A, E2A 및/또는 F2A 부위를 포함할 수 있다.
CD70-표적화 CAR를 인코딩하는 하나의 시스트론과 더불어, 상기 벡터의 임의의 시스트론은 자살 유전자를 포함할 수 있다. 상기 벡터의 임의의 시스트론은 리포터 유전자를 인코딩할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 제1 시스트론은 자살 유전자를 인코딩하고, 제2 시스트론은 CD70-표적화 CAR를 인코딩하고, 제3 시스트론은 리포터 유전자를 인코딩하고, 제4 시스트론은 사이토카인을 인코딩한다. 일정 구현예에서, 제1 시스트론은 자살 유전자를 인코딩하고, 제2 시스트론은 CD70-표적화 CAR를 인코딩하고, 제3 시스트론은 제2 CAR 또는 또다른 항원 수용체를 인코딩하고, 제4 시스트론은 사이토카인을 인코딩한다. 구체적인 구현예에서, CD70-표적화 CAR 및/또는 또 다른 수용체의 상이한 부분들이 상응하는 모듈형 구성 성분에 의해 인코딩되고, 상기 제2 시스트론의 제1 구성 성분이 항원 결합 영역을 인코딩하고, 제2 구성 성분이 경첩 및/또는 막관통 영역을 인코딩하고, 제3 구성 성분이 동시자극성 영역을 인코딩하고, 및 제4 구성 성분이 신호 전달 영역을 인코딩한다.
구체적인 구현예에서, 시스트론들 중 적어도 하나가 자살 유전자를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 시스트론들 중 적어도 하나가 사이토카인을 인코딩한다. 일정 구현예에서, 적어도 하나의 시스트론이 항원-표적화 CAR를 인코딩한다. 시스트론이 리포터 유전자를 인코딩할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 일정 구현예에서, 적어도 2개의 시스트론이 상이한 2개의 항원 수용체(예를 들어, CAR 및/또는 TCR)를 인코딩한다. 시스트론이 리포터 유전자를 인코딩할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
관심대상의 유전적 화물의 특정 구성에서, 단일 벡터가 항원-표적화 CAR를 인코딩하는 시스트론 및 항원-표적화 수용체와 동일하지 않은 제2 항원 수용체를 인코딩하는 시스트론을 포함할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 상기 제1 항원 수용체는 항원-표적화 CAR를 인코딩하고 상기 제2 항원 수용체는 TCR를 인코딩하고, 또는 그 반대도 마찬가지이다. 특정 구현예에서, 항원-표적화 CAR와 제2 항원 수용체를 각각 인코딩하는 별도의 시스트론을 포함하는 벡터가 또한 사이토카인 또는 케모카인을 인코딩하는 제3 시스트론과 자살 유전자을 인코딩하는 제4 시스트론을 포함한다. 하지만, 자살 유전자 및/또는 사이토카인(또는 케모카인)은 상기 벡터 상에 존재하지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 시스트론이 자신의 모듈 형식의 다수의 구성 성분(들)을 포함한다. 예를 들어, 하나의 시스트론은 다중-구성 성분 유전자 생성물, 예컨대 다수의 부분을 가빈 항원 수용체를 인코딩할 수 있고; 구체적인 경우에는, 상기 항원 수용체가 단일 시스트론에서 인코딩됨으로써, 궁극적으로 단일 폴리펩타이드를 생산한다. 상기 다수의 구성 성분을 인코딩하는 시스트론은 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 제한 효소 소화 부위, 예컨대 상기 시스트론을 포함하는 벡터에 고유한 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 제한 효소 소화 부위에 의해 분리되는 다수의 구성 성분을 가질 수 있다. 구체적인 구현예에서, 다수의 구성 성분을 가지는 시스트론은 각기 고유한 기능이 상기 수용체 때문인 다수의 상응하는 부분들을 가진 항원 수용체를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 상기 다중-구성 성분 시스트론의 구성 성분들 각각 또는 대다수는 상기 벡터에 고유한 하나 이상의 제한 효소 소화 부위에 의해 분리됨으로써, 원하는 경우 별도의 구성 성분들을 상호교환하여 쓸 수 있다.
구체적인 구현예에서, 시스트론의 다중 구성 성분 중 각각의 구성 성분은 인코딩된 항원 수용체, 예컨대 항원-표적화 CAR의 상이한 부분에 상응한다. 예시적인 구현예에서, 구성 성분(1)은 상기 수용체의 항원-결합 영역을 인코딩할 수 있고; 구성 성분(2)는 상기 수용체의 경첩 영역을 인코딩할 수 있고; 구성 성분(3)은 상기 수용체의 막관통 영역을 인코딩할 수 있고; 구성 성분(4)는 상기 수용체의 동시자극성 영역을 인코딩할 수 있고, 구성 성분(5)는 상기 수용체의 신호 전달 영역을 인코딩할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 항원-표적화 CAR는 하나 이상의 동시자극성 영역을 포함할 수 있고, 각각은 상기 수용체 내에서 동시자극성 영역(들)의 상호 교환 가능성을 위해 고유한 제한 효소 소화 부위에 의해 분리된다.
구체적인 구현예에서, 이웃한 시스트론들이 2A 쪼개짐 부위에 의해 분리되는 4개의 별도의 시스트론을 가진 폴리시스트론 벡터가 존재하며, 구체적인 구현예에서는 2A 쪼개짐 부위 대신에, 별도의 폴리펩타이드가 시스트론(예컨대, IRES 서열)에서 생산되도록 직접적 또는 간접적으로 유도하는 요소가 존재한다. 예를 들어, 4개의 별도의 시스트론은 3개의 2A 펩타이드 쪼개짐 부위에 의해 분리될 수 있고, 각각의 시스트론은 상기 시스트론의 각 단부의 측면에 위치한 제한 부위(X1, X2 등)을 가지고서 특정 시스트론의 상호교환성, 예컨대 표준 재조합 기법을 사용할 때 또 다른 시스트론 또는 다른 유형의 서열과의 상호교환성을 가능하게 한다. 구체적인 구현예에서, 시스트론 각각의 측면에 위치한 상기 제한 효소 부위(들)는 상기 벡터에 고유하여 용이한 재조합을 허용하며, 대안적인 구현예에서는 상기 제한 효소 부위가 상기 벡터에 고유하지는 않다.
특정 구현예에서, 상기 벡터는 특정 시스트론 내에서, 예컨대 특정 시스트론의 다수의 구성 성분 내에서 상호교환성을 가능하게 함으로써 제2 수준의 고유한 모듈화를 가능하게 한다. 특정 시스트론의 다수의 구성 성분은 하나 이상의 제한 효소 부위, 예컨대 상기 벡터에 고유한 것에 의해 분리되어, 상기 시스트론 내에서 하나 이상의 구성 성분의 상호교환성을 가능하게 한다. 예를 들어, 시스트론(2)은 5개의 별도의 구성 성분을 포함할 수 있으며, 시스트론 당 2, 3, 4, 5, 6개 그 이상의 구성 성분이 존재할 수 있다. 예로써, 벡터는 독특한 효소 제한 부위 X9, X10, X11, X12, X13 및 X14에 의해 각각 분리된 5개의 구성 성분을 가짐으로써 표준 재조합을 가능하게 하여 상이한 구성 성분(1, 2, 3, 4 및/또는 5)을 교환시키는 시스트론(2)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상이한 구성 성분들(고유하지만, 대안적으로 하나 이상은 고유하지 않음) 사이에 다수의 제한 효소 부위가 있을 수 있고, 상기 다수의 제한 효소 부위 사이에 서열이 존재할 수 있다 (비록 대안적으로는 그렇지 않을 수도 있다). 일정 구현예에서, 시스트론에 의해 인코딩되는 모든 구성 성분이 상호교환되기 위한 목적으로 설계된다. 특정 경우에, 시스트론의 하나 이상의 구성 성분들이 상호교환되도록 설계되고, 반면 상기 시스트론의 하나 이상의 다른 구성 성분이 상호교환되도록 설계되지 않을 수도 있다.
구체적인 구현예에서, 시스트론이 다수의 구성 성분을 가진 항원-표적화 CAR 분자를 인코딩한다. 예를 들어, 시스트론(2)는 구성 성분 1, 구성 성분 2, 구성 성분 3 등으로 표현되는 별도의 구성 성분을 가지는 항원-표적화 CAR 분자를 인코딩하는 서열들로 이루어질 수 있다. 상기 CAR 분자는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 상호교환 가능 구성 성분을 포함할 수 있다. 특이적 예에서, 구성 성분(1)은 scFv를 인코딩하고; 구성 성분(2)는 경첩을 인코딩하고; 구성 성분(3)은 막관통 영역을 인코딩하고; 구성 성분(4)은 동시자극성 영역을 인코딩하고(하지만 교환을 위해 제한 부위의 측면에 위치한 제2 또는 그 이상의 동시자극성 영역을 인코딩하는 구성 성분(4')가 또한 존재할 수도 있다); 및 구성 성분(5)는 신호 전달 영역을 인코딩한다. 특정 예에서, 구성 성분(1)은 scFv를 인코딩하고; 구성 성분(2)는 IgGl 경첩 및/또는 막관통 영역을 인코딩하고; 구성 성분(3)은 CD28을 인코딩하고; 및 구성 성분(4)는 CD3 제타를 인코딩한다.
당해기술의 숙련가는 상기 벡터의 설계에서 필요한 경우 다양한 시스트론과 구성 성분이 틀 안에 유지되도록 구성되어야 함을 인식한다.
특정 예에서, 시스트론(1)은 자살 유전자를 인코딩하고; 시스트론(2)은 항원-표적화 CAR를 인코딩하고; 시스트론(3)은 리포터 유전자를 인코딩하고; 시스트론(4)는 사이토카인을 인코딩하고; 시스트론(2)의 구성 성분(1)은 scFv를 인코딩하고; 시스트론(2)의 구성 성분(2)은 IgGl 경첩을 인코딩하고; 시스트론(2)의 구성 성분(3)은 CD28을 인코딩하고; 및 구성 성분(4)는 CD3 제타를 인코딩한다.
제한 효소 부위는 임의의 종류일 수 있고, 이의 인식 부위에 어떤 수의 염기든, 예컨대 4 내지 8개 염기를 포함할 수 있고; 인식 부위 내 염기의 수는 적어도 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상일 수 있다. 절단되는 경우, 상기 부위는 뭉뚝한 절단면 또는 접착성 단부를 생성할 수 있다. 상기 제한 효소는 예를 들어 유형 I, 유형 II, 유형 III, 또는 유형 IV일 수도 있다. 제한 효소 부위는 입수 가능한 데이터베이스, 예컨대 통합된 관계성 효소 데이터베이스(IntEnz) 또는 BRENDA(종합적인 효소 정보 시스템)에서 획득될 수 있다.
예시적 벡터는 원형일 수 있고, 관례상 위치(1)(원형의 상부에 12시 위치, 서열의 나머지는 시계 방향으로 배치됨)는 5' LTR의 출발부위로 설정된다.
자발적 쪼개짐 2A 펩타이드가 활용되는 구현예에서, 상기 2A 펩타이드는 진핵 세포에서 번역 중에 폴리펩타이드의 '쪼개짐'을 중재하는 18 내지 22개 아미노산(aa)-긴 바이러스 올리고펩타이드일 수 있다. 명칭 '2A'는 바이러스 게놈의 특이적 부위를 가리키고, 상이한 바이러스 2A는 일반적으로 이들이 유래된 바이러스의 이름을 딴다. 제일 먼저 발견된 2A는 F2A(구제역 바이러스)였고, 이후 E2A(말 비염 A 바이러스), P2A(돼지 테쇼바이러스(teschovirus)-1 2A) 및 T2A(토세아 아시그나 바이러스 2A) 또한 식별되었다. 2A-매개 '자발적 쪼개짐'의 기전이 2A의 C-말단에서 글리실-프로릴 펩타이드 결합의 형성을 건너 띄는 리보솜임이 발견되었다.
특정 경우에 상기 벡터는 γ-레트로바이러스 전이 벡터일 수 있다. 상기 레트로바이러스 전이 벡터는 플라스미드, 예컨대 pUC19 플라스미드(Hindlll 및 EcoRI 제한 효소 부위 사이의 큰 절편(2.63kb))을 기반으로 한 근간을 포함할 수 있다. 상기 근간은 5' LTR, psi 패키징 서열 및 3' LTR를 포함하는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MoMLV)의 바이러스 구성 성분을 운반할 수 있다. LTR는 레트로바이러스 프로바이러스의 일 측부에서 발견되는 긴 말단 반복부위이고, 전이 벡터의 경우에, 관심 대상의 유전적 화물, 예컨대 항원-표적화 CAR 및 부속 구성 성분을 한 데 묶는다. 뉴클레오캡시드에 의한 패키징을 위한 표적 부위인 상기 psi 패키징 서열이 또한 cis에 편입되어 5' LTR 및 CAR 코딩 서열 사이에 개재된다. 따라서, 전이 벡터의 일례의 기본 구조는 다음과 같이 구성될 수 있다: pUC19 서열 - 5' LTR - psi 패키징 서열 - 관심대상의 유전적 화물 - 3' LTR - pUC19 서열. 이와 같은 시스템은 또한 다른 바이러스 및 비-바이러스 벡터, 예컨대 비제한적으로 비-바이러스 플라스미드 뿐만 아니라 렌티바이러스, 아데노바이러스 AAV에 적용될 수 있다.
VII. 약제학적 조성물
본원에서 포함하는 면역 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형, 및 약제학적으로 허용가능한 운반체가 본원에 제공된다. 상기 세포는 개인에게 이전되기에 적합한 배지 및/또는 개인에게 이전되기 전에 보존, 예컨대 극저온 보존에 적합한 배지에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물 및 제형은 하나 이상의 선택적 약제학적으로 허용가능한 운반체(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd　edition, 2012)와 함께 원하는 정도의 순도를 가진 유효성분들(예컨대, 세포)을 혼합함으로써, 냉동건조된 제형 또는 수용액의 형태로, 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 운반체는 일반적으로 활용된 용량 및 농도에서 수용부위에 비독성이고, 비제한적으로 하기를 포함한다: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(잔기가 약 10개 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 설탕, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원의 예시적인 약제학적으로 허용가능한 운반체는 추가로 세포간 약물 분산제, 예컨대 용해성 중성 활성 히알루로니다아제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 용해성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 포함한다. 특정 예시적인 sHASEGP 및 rHuPH20을 비롯한 사용 방법이 미국 특허 공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기술되어 있다. 일 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티아나제와 조합된다.
VIII. 병용 요법
일정 구현예에서, 본 구현예의 조성물 및 방법은 적어도 하나의 추가의 치료법과 함께 면역 세포 집단(NK 세포 집단)을 수반한다. 상기 추가의 치료법은 방사선요법, 수술(예를 들어, 유방 종양 절제술 및 유방 절제술), 화학요법, 유전자 요법, DNA 치료법, 바이러스 치료법, RNA 치료법, 면역치료, 골수 이식, 나노치료법, 단클론성 항체 치료법, 호르몬 요법, 또는 이들의 조합일 수 있다. 추가의 치료법은 보조 요법 또는 신보조 요법의 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 추가의 치료법은 소분자 효소 억제제 또는 항전이 제제의 투여이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료법은 부작용 제한 제제(예를 들어, 치료의 부작용의 발생 및/또는 중증도를 감소시키기 위해 고안된 제제, 예컨대, 메스꺼움 방지제제 등)의 투여이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료법은 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료법은 수술이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료법은 방사선요법과 수술의 병용이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료법은 감마 조사 요법이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료법은 PBK/AKT/mTOR 경로를 표적으로 삼는 치료법, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 세포자멸사 억제제, 및/또는 화학예방성 작용제이다. 상기 추가의 치료법은 당해기술에 알려진 하나 이상의 화학요법 작용제일 수 있다.
면역 세포 치료법이 추가의 암 치료요법, 예컨대 면역 검문소 치료법 이전, 치료 중, 이후, 또는 그것과 다양한 조합으로 시행될 수 있다. 상기 치료법의 시행은 동시에, 몇분 간격으로, 며칠에서 몇주 간격으로 이루어질 수 있다. 면역 세포 치료법이 추가의 치료 작용제와는 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 유의미한 시기가 만료되지 않도록 함으로써, 상기 두 화합물은 여전히 상기 환자에게 병용요법의 이로운 효과를 발휘할 수 있을 것이다. 그와 같은 경우에, 환자에게 항체 치료법과 항암 치료법을 서로 약 12시간 내지 24시간 또는 72시간 내에, 좀 더 특별하게는 서로 약 6 내지 12시간 내에 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 일부 경우에, 각각의 치료법의 시행 사이에 며칠(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일) 내지 몇 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주)가 경과하도록 치료 시기를 유의미하게 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
다양한 병용이 활용될 수 있다. 아래 예에서, 면역 세포 치료법이 'A'이고 항암 치료법이 'B'이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
본 구현예의 환자에게 임의의 화합물의 투여 또는 세포 치료법의 시행은, 만약 독성이 있다면, 상기 작용제의 독성을 고려하면서, 이와 같은 화합물의 투여를 위한 일반적 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 병용 요법으로 인해 기인된 독성을 모니터링 하는 단계가 있다.
A. 화학요법
광범위한 화확요법 제제가 본 구현예에 따라 사용될 수 있다. 용어 '화학요법'은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 가리킨다. '화학치료 제제'가 암 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 가리키는 데 사용된다. 이들 제제 또는 약물은 세포 내에서의 활성 모드에 따라, 예를 들어, 이들이 세포 사이클에 영향을 미치는지 그렇다면 어떤 단계에 영향을 미치는지에 따라, 구분된다. 대안적으로, 제제는 직접적으로 DNA를 가교결합할 수 있는 능력, DNA로 끼어들어갈 수 있는 능력, 또는 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사 분열 이상을 유도하는 능력을 기반으로 특징지어질 수 있다.
화학치료 제제의 예에는 하기가 포함된다: 알킬화 제제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파마이드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판, 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 트리메틸롤멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신과 불라타시논); 캄프토테신(예컨대, 합성 유사체 토포테칸); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(예컨대, 이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 크립토파이신(특히 크립토파이신 1과 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(예컨대, 합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 겨자, 예컨대 클로르암부실, 클롬아파진, 촐로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜파란, 노벰비친, 펜네스테린, 프로드니무스틴, 트로포스파마이드 및 우라실 머스타드; 나이트로수레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가1I); 다이네미신, 예컨대 다이네미신 A; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페르아미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 크로모포르 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 크로모포르, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우스라르나이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(예컨대, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르나이신, 일리 보마이신, 펩로마이신, 폿피로마이신, 퓨로마이신, 퀘얼라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항대사산물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로 우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데놉테린, 프테롭테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항부신, 예컨대 미토탄 및 트리로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 펜마엣; 피라루비신; 로소산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카르바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 라이족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리초테센(특히 T-2 톡신, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 탁소이드, 예를 들어, 팍리탁셀 및 도세탁셀; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 배위 복합체, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미놉테린; 셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들어, CPT-11); 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 카르보플라틴, 프로카르바진, 플리코마이신, 겜시타빈, 나벨빈, 파메실-단백질 전이효소 억제제, 트란스 백금, 및 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 상기의 유도체.
B. 방사선요법
DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어온 다른 인자들에는 일반적으로 γ선, X선 및/또는 종양 세포로의 방사선동위원소의 지시된 전달로 알려진 것들이 포함된다. 다른 형태의 DNA 손상 인자가 고려되는데, 예컨대 극초단파, 양성자빔 조사(미국 특허 제5,760,395호 및 제4,870,287호) 및 UV-조사가 포함된다. 이들 인자들은 모두 DNA 상에, DNA의 전구체 상에, DNA의 복제 및 복구 상에, 그리고 염색체의 조립체 및 유지 상에 광범위한 손상을 입힐 가능성이 가장 높다. X선의 용량은 장기간(3 내지 4주)의 경우 일일 용량이 50 내지 200 뢴트겐부터 단일 용량 2000 내지 6000 뢴트겐의 범위에 속한다. 방사선동위원소의 용량 범위는 광범위하게 달라지는데, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 신생물 세포에 의한 흡수에 따라 달라진다.
C. 면역치료요법
당해기술의 숙련가는 추가의 면역 치료가 본 구현예의 방법과 병행하여 또결합하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료의 맥략에서, 면역치료는 일반적으로 암 세포를 표적으로 삼고 파괴하는 면역 효과기 세포와 분자의 사용에 달려 있다. 리툭시맙(RITUXAN®)이 그와 같은 예이다. 면역 효과기는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 대한 특이적인 항체일 수 있다. 상기 항체는 단독으로 치료법의 작용기로 기능할 수도 있고, 또는 실제로 세포 사멸에 영향을 미치는 다른 세포를 모집할 수도 있다. 상기 항체는 또한 약물 또는 톡신(화학요법, 방사선뉴클라이드, 리신 A 사슬, 콜레라 톡신, 백일해 톡신 등)에 접합되어 표적화 제제로 기능할 수도 있다. 대안적으로, 상기 작용기는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 작용기 세포는 세포독성 T 세포와 NK 세포를 포함한다.
항체-약물 접합체가 암 치료법의 발전에 돌파구가 되는 방법으로 떠오르고 있다. 암은 전세계 주요 사인 중 하나이다. 항체-약물 접합체(ADC)는 세포-사멸 약물에 공유결합된 단클론성 항체(MAb)를 포함한다. 이와 같은 접근 방법은 MAb의 항원 표적에 대한 높은 특이성을 상당히 강력한 세포독성 약물과 조합함으로써, 풍부한 수준의 항원이 있는 종양 세포에 탑재물(약물)를 전달하는 '무장한' MAb를 야기한다. 상기 약물의 표적화된 전달은 또한 정상적인 조직에서 약물의 노출을 최소화함으로써, 독성의 감소 및 치료 지수의 향상을 야기한다. FDA에 의한 두 가지 ADC 약물, ADCETRIS®(브렌툭시맙 베도틴)(2011년) 및 KADCYLA®(트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)(2013년)의 승인이 상기 접근 방법을 입증하였다. 현재 암 치료를 위한 다양한 단계의 임상 시험에서 30여개의 ADC 약물 후보가 존재한다 (Leal et al., 2014). 항체 조작 및 링커-탑재물 최적화가 점점 더 성숙해지면서, 새로운 ADC의 발견 및 개발이 점점 더 이와 같은 접근 방법에 적합한 식별과 입증, 및 표적화 MAbs의 생성에 좌우되고 있다. ADC 표적의 2가지 기준은 종양 세포에서 발현의 상향조절/높은 수준과 강력한 내재화(internalization)이다.
면역치료의 일 측면에서, 상기 종양 세포는 반드시 표적화를 잘 할 수 있는, 다시 말해서, 다수의 다른 세포 상에는 존재하지 않는 일부 마커를 함유해야 한다. 여러 종양 마커가 존재하고, 이들 중 임의의 것이 본 구현예의 맥락의 표적화에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커에는 CD20, 암배아 항원, 타이로시나아제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시아릴 루시으 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 pl55가 포함된다. 면역치료의 대안적인 측면은 항암 효과를 면역 자극 효과와 조합하는 것이다. 면역 자극 분자가 또한 존재하며, 여기에는 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예컨대 MIP-1, MCP-1, IL-8 및 성장 인자, 예컨대 FLT3 리간드가 포함된다.
현재 연구 중이거나 사용 중인 면역 치료의 예는 면역 보조법, 예를 들어, 소결핵균, 열대열원충(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물 (미국 특허 제5,801,005호 및 제5,739,.169호; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); 사이토카인 치료법, 예를 들어, 인터페론 α, β, 및 γ, IL-1, GM-CSF 및 TNF (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); 유전자 치료법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2 및 p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 미국 특허 제5,830,880호 및 제5,846,945호); 및 단클론성 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-갱글리오사이드 GM2 및 항-pl85 (Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; 미국 특허 제5,824,311호)이다. 하나 이상의 항암 치료법이 본원에 기술된 항체 치료법과 함께 활용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 면역치료는 면역 검문소 억제제일 수 있다. 면역 검문소은 신호를 증폭시키거나(예를 들어, 공종 자극 분자) 또는 신호를 줄인다. 면역 검문소 차단기에 의해 표적화될 수 있는 억제성 면역 검문소에는 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3(CD276으로도 알려짐), B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA), 세포독성 T-림프구-부속 단백질 4(CTLA-4, CD152로도 알려짐), 인도레아민 2,3-디옥시게나아제(IDO), 킬러-세포 면역 글로불린(KIR), 림프구 활성화 유전자-3(LAG3), 프로그램된 사멸 1(PD-1), T-세포 면역 글로불린 영역 및 점액 영역 3(TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-영역 Ig 억제제(VISTA)가 포함된다. 특히, 상기 면역 검문소 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적으로 삼는다.
상기 면역 검문소 억제제는 약물, 예컨대 소분자, 재조합 형태의 리간드 또는 수용체일 수 있고, 특히 항체, 예컨대 인간 항체(예를 들어, 국제 특허 공보 WO 2015/016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012; 둘 다 본원에 참조로 편입됨)이다. 면역 검문소 단백질 또는 이의 유사체의 알려진 억제제가 사용될 수 있고, 특히 키메라화된, 인간화된 또는 인간 형태의 항체가 사용될 수 있다. 당해기술의 숙련가가 알고 있듯이, 본원에서 언급된 특정 항체에 대해 대안적 및/또는 등가의 이름이 사용될 수 있다. 이와 같은 대안적 및/또는 등가의 이름은 본원의 맥락에서 상호교환될 수 있다. 예를 들어 람브로리주맙은 대안적 및 등가의 이름으로 MK-3475 및 펨브로리주맙으로도 알려진 것이 알려져 있다.
일부 구현예에서, 상기 PD-1 결합 대항제는 PD-1가 이의 리간드 결합 파트너에 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 특이적 측면에서, 상기 PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 구현예에서, PDL1 결합 대항제는 PDL1이 이의 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 특이적 측면에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구현예에서, 상기 PDL2 결합 대항제는 PDL2가 이의 결합 파트너에 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 특이적 측면에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 상기 대항제는 항체, 이의 항원 결합 절편, 면역접합체, 융합 단백질, 또는 올리고펩타이드일 수 있다. 예시적 항체가 미국 특허 제8735553호, 제8354509호 및 제8008449호에 기술되어 있고, 이들 모두가 본원에 참조로 편입되었다. 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 다른 PD-1 축 대항제는 당해기술에 알려져 있는데, 예컨대 미국 특허 출원 제US 2014/0294898호, 제US 2014/022021호 및 제US 2011/0008369호에 기술되어 있고, 이 모든 것은 본원에 참조로 편입되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 PD-1 결합 대항제는 항-PD-1 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 상기 항-PD-1 항체는 니보루맙, 펨브로리주맙 및 CT-011로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 PD-1 결합 대항제는 면역접합체(예를 들어, 불변 부위(예를 들어, 면역 글로불린 서열의 Fc 부위)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합부를 포함하는 면역접합체)이다. 일부 구현예에서, 상기 PD-1 결합 대항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 및 OPDIVO®라고도 알려진 니보루맙은 WO 2006/121168에 기술된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브로리주맙, KEYTRUDA® 및 SCH-900475라고도 알려진 펨브로리주맙은 WO 2009/114335에 기술된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1이라고도 알려진 CT-011은 WO 2009/101611에 기술된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg라고도 알려진 AMP-224는 WO 2010/027827과 WO 2011/066342에 기술된 PDL2-Fc 융합 용해성 수용체이다.
본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 검문소는 CD152라고도 알려진 세포독성 T-림프구-부속 단백질 4(CTLA-4)이다. 인간 CTLA-4의 상기 완전한 cDNA 서열은 GenBank® 승인 번호 L15006을 갖는다. CTLA-4는 T 세포의 표면 상에서 발견되며, 항원-제시 세포의 표면 상의 CD80 또는 CD86에 결합되는 경우, '꺼짐' 스위치로 작용한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면 상에서 발현되어 억제 신호를 T 세포에 전송하는 면역 글로불린 상과(superfamily)의 구성원이다. CTLA4는 T-세포 공통자극 단백질, CD28과 유사하고, 두 분자는 항원-제시 세포 상에서 각각 B7-1 및 B7-2라고도 불리는 CD80 및 CD86에 결합된다. CTLA4는 억제 신호를 T 세포에 전송하는 반면, CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4가 조절 T 세포에서도 발견되는데, 이는 이들의 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체와 CD28을 통한 T 세포 활성화가 B7 분자에 대한 억제 수용체인 CTLA-4의 발현 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 상기 면역 검문소 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 절편, 면역접합체, 융합 단백질, 또는 올리고펩타이드이다.
본원의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체(또는 여기서 유래된 VH 및/또는 VL 영역)는 당해기술에 잘 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당해기술에서 인정된 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,119,129호, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504(트레멜리무맙으로도 알려진 CP675,206; 이전에는 티실리무맙), 미국 특허 제6,207,156호; Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (항체 CP-675206); and Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304에 개시된 항-CTLA-4 항체가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 앞서 언급된 문헌들 각각의 교시는 본원에 참조로 편입되었다. CTLA-4에 결합하는 것에 대해 당해기술에서 인정된 임의의 항체와 경쟁하는 항체들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간화된 CTLA-4 항체가 국제 특허 공보 제WO 2001/014424호, 제WO 2000/037504호, 및 미국 특허 제8,017,114호에 기술되어 있고, 이 모든 것이 본원에 참조로 편입되었다.
예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(10D1, MDX-010, MDX-101 및 Yervoy®로도 알려짐) 또는 이의 항원 결합 절편 및 변이체(예를 들어, WO 01/14424 참조)이다. 다른 구현예에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 이에 따라서, 일 구현예에서, 상기 항체는 이필리무맙의 VH 부위의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역과 이필리무맙의 VL 부위의 CDR1, CDR2 and CDR3 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 상기 언급된 항체로서 CTLA-4 상의 동일한 에피토프와 결합을 놓고 경쟁하거나 또는 거기에 결합된다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 앞서 언급된 항체와 가변 부위 아미노산 서열 동일성이 적어도 약 90%이다 (예를 들어, 이필리무맙과의 가변 부위 동일성은 적어도 약 90%, 95%, 또는 99%임).
CTLA-4를 조절하기 위한 다른 분자에는 예컨대 미국 특허 제5844905호, 제5885796호 및 국제 특허 출원 제WO 1995/001994호 및 제WO 1998/042752호에 기술된 CTLA-4 리간드 및 수용체(이들 모두는 참조로 본원에 편입됨)와 예컨대 미국 특허 제8329867호에 기술된 면역접합체(본원에 참조로 편입됨)가 포함된다.
D. 수술
환자의 대략 60%가 일부 유형의 수술을 받는데, 여기에는 예방차원의 수술, 진단 또는 진전 파악 차원의 수술, 치료적 수술, 및 고식적(palliative) 수술이 포함된다. 치료 차원의 수술에는 암 조직의 전체 또는 일부가 신체에서 제거, 절제 및/또는 파괴되는 절제술이 포함되고, 이는 다른 치료법, 예컨대 본 구현예의 치료법, 암화학요법, 방사선 요법, 호르몬 치료법, 유전자 치료법, 면역치료 및/또는 대안적 치료법과 함께 사용될 수 이다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부분의 물리적 제거를 가리킨다. 종양 절제술과 더불어, 수술에 의한 치료에는 레이저 수술, 저온수술, 전기수술 및 현미경으로 조절된 수술(모스 수술)이 포함된다.
암 세포, 조직, 또는 종양의 일부 또는 전부를 절제할 때, 몸에 구멍이 생길 수 있다. 치료는 추가의 항암 치료와 함께 관류, 직접 주입, 또는 상긱 영역의 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 이와 같은 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월마다 반복될 수 있다. 이와 같은 치료는 또한 다양한 용량으로 이루어질 수 있다.
E. 기타 제제
본 구현예의 특정 측면과 조합하여 기타 제제가 사용되어 치료의 치료 효율을 향상시킬 수 있음이 고안되었다. 이와 같은 추가의 제제에는 세포 표면 수용체 및 GAP 접합점의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포 증식 및 분열 제제, 세포 접착의 억제제, 세포사멸적 유인제에 대한 과증식성 세포의 민감도를 증가시키는 제제, 또는 기타 생물학적 제제가 포함된다. GAP 접합점의 개수를 상승시킴으로써 세포내 신호 전달이 증가한 것은 이웃한 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킬 것이다. 다른 구현예에서, 세포 증식 또는 분열 제제가 본 구현예의 특정 측면과 조합하여 사용됨으로써, 치료의 항-과증식성 효능이 향상된다. 본 구현예의 효능을 향상시키기 위해 세포 접착의 억제제가 고려된다. 세포 접착 억제제 는 초점 접착 키나아제(FAKs) 억제제 및 로바스타틴이다. 세포자멸사에 대한 과증식성 세포의 민감도를 높이는 기타 제제, 예컨대 항체 c225가 본 구현예의 특정 측면과 조합하여 사용됨으로써 치료 효능을 향상시킬 수 있다고 추가로 고려된다.
IX. 본 개시의 키트
본원에 기술된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 비제한적인 예에서,하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨을 포함하는 세포, 상기 세포를 생산하는 시약, 벡터, 및 벡터 및/또는 이의 구성 성분을 생산하기 위한 시약이 키트에 포함될 수 있다. 일정 구현예에서, NK 세포가 키트에 포함될 수 있는데, 이들은 아직 어떤 방식으로든 변형되었을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 이와 같은 키트는 세포의 조작을 위한 하나 이상의 시약을 구비했을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 이와 같은 시약에는 예를 들어 사이토카인, 소분자, 단백질, 핵산, 항체, 완충제, 프라이머, 뉴클레오타이드, 염 및/또는 이들의 조합물이 포함된다. 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 조작된 항원 수용체를 발현하는 벡터가 제공될 수 있고, 또는 둘 중 하나를 제조하기 위한 시약이 상기 키트에 포함될 수 있다. 하나 이상의 사이토카인을 인코딩하는 뉴클레오타이드, 하나 이상의 특정 유전자를 KO하기 위한 CRISPR 시약을 인코딩하는 뉴클레오타이드, 자살 유전자 생성물, 수용체 등이 상기 키트에 포함될 수 있다. 단백질, 예컨대 사이토카인 또는 항체, 예를 들어 단클론성 항체가 상기 키트에 포함될 수 있다. 조작된 CAR 수용체 또는 TCR 수용체의 구성 성분을 인코딩하는 뉴클레오타이드가 상기 키트에 포함될 수 있고, 여기에는 동일한 것을 생성하기 위한 시약이 포함된다.
특정 측면에서, 상기 키트는 본 개시의 NK 세포 치료법과, 또한 또 다른 암 치료버을 포함한다. 일부 경우에, 세포 치료법 구현예와 더불어, 상기 키트는 또한 제2 암 치료법, 예컨대 예를 들어 화학요법, 호르몬 요법, 및/또는 면역치료를 포함한다. 상기 키트(들)은 개인을 위해 특정 암에 맞춤 제작될 수 있고, 상기 개인을 위한 각각의 제2 암 치료법을 포함할 수 있다.
상기 키트는 본원의 적합하게 분취된 조성물들을 포함할 수 있다. 상기 키트의 구성 성분은 수용성 배지 또는 냉동건조된 형태로 포장될 수 있다. 상기 키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이어, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 용기 수단을 포함할 것이고, 이 안에 구성 성분이 자리잡을 것이고, 바람직하게는 적절하게 분취될 것이다. 상기 키트에 둘 이상의 구성 성분이 있는 경우, 상기 키트는 또한 일반적으로 제2, 제3 또는 기타 추가의 용기를 포함하여, 거기에 추가의 구성 성분이 따로따로 놓일 수 있다. 하지만, 구성 성분들의 다양한 조합이 바이얼에 포함되어 있을 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 상기 조성물과 임의의 기타 시약 용기를 상업적 판매의 용도로 밀폐된 공간에 두기 위한 수단을 포함할 것이다. 이와 같은 용기에는 원하는 바이얼이 보존되는 사출 또는 취출 플라스틱 용기가가 포함될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본원의 비제한적인 특정 측면을 입증하기 위해 포함된다. 당해기술의 숙련가는 이후 실시예에 개시되는 기법들이 본 발명가에 의해 발견된, 개시된 주제의 실행에서 제대로 기능을 하는 기법들을 나타냄을 이해해야 한다. 하지만, 당해기술의 숙련가들은, 본 개시의 관점에서, 개시된 특정 구현예에 여러 변형이 이루어질 수 있으며 상기의 개시된 주제의 원리 및 범위에서 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 여전히 획득할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1
교모세포종의 치료를 위한 NK 세포 면역치료
교모세포종을 치료하는 NK 세포의 능력을 시험하였다. NK 세포는 환자 유래 교모세포종 줄기 세포주(GCS)를 사멸할 수 있지만 정상 성상 세포는 사멸할 수 없다 (도 1). 도 1b는 GCS와 성상 세포 사이에서 선택 NK 리간드의 발현의 차이를 보여준다.
NK 세포는 조작되어 원하는 특정 유전자, 예컨대 하나 이상의 사이토카인 유전자(예를 들어, IL-15, IL-12, IL-21)를 발현할 수 있다. 특이적 작제물의 예가 도 2에 제시되었는데, 여기서 2A 요소가 사이토카인의 생산과 IgGl의 생산을 분리하며, 이들은 동일한 발현 작제물 상에 존재한다. 이와 같은 특이적 예들에서, p35와 p40 하위 단위들이 링커와 함께 인위적으로 연결되는 인간 IL-15, 인간 IL-21, 또는 인간 IL-12가 구성된다. 이와 같은 발현 작제물은 상기 NK 세포 내의 임의의 유형의 벡터에 존재할 수 있다.
GSC의 3-D 종양 회전타원체 배양 모형을 활용하여 사이토카인-조작된 NK 세포의 활성을 시험하였다 (도 3a). 상기 종양 회전타원체 모형은 고형 종양 질량을 모사한다. 종양 세포 성장과 NK 세포에 의한 사멸의 실제 세포 영상을 만드는 Incucyte® 장치에서 사멸 검정을 수행하였다. 비-형질도입 NK 세포 (검정 줄)(도 3b)와 비교하여, 상기 잘 알려진 제대혈 유래 사이토카인-조작 NK 세포(적색, 청색 및 녹색 줄)가 환자 유래 교모세포종 줄기 세포주에 대해 뛰어난 사멸 능력을 발휘하였다.
GBM에 대한 NK 세포의 체내 활성의 특징을 규명하였다. NOD/SCID/IL2Rγc 귀무(null)마우스(그룹당 n=5)에 입체적으로 ffLuc+환자 유래 교모세포종 줄기 세포주(5 x 105)를 NSG 마우스의 오른쪽 전뇌에 이식하였다. 7일 후 종양이 형성되었음을 BLI 영상화에 의해 확인한 후, 매 실험에 대해 표시된 바와 같이 마우스에 1.O x 105　NK 세포를 두개 내로 처리하였다. IL-12-형질도입 또는 IL-21 -형질도입(분비 가능) 제대혈 NK 세포로 치료받은 동물은, 비-형질도입(NT) NK 세포로 치료받은 것과 비교하여, 전체 생존률이 유의미하게 향상되면서 종양의 퇴보가 눈에 띄었다 (종양이 BLI 영상화에 의해 더 이상 발견되지 않았다) (도 4a, 도 4b 및 도 4c).
*********************
본 개시와 이의 이점이 상세하게 기술되었으나, 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 설계의 원리와 범위에서 벗어나지 않으면서 본원에 다양한 변화, 치환 및 변경이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 이와 더불어, 본 출원의 범위는 본 명세서에 기술된 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법 및 단계들의 특정 구현예에 제한적인 것은 아니다. 당해기술의 숙련가라면 본 개시에서 쉽게 이해하듯이, 본원에 기술된 상응하는 구현예와 동일한 기능을 실질적으로 수행하고 동일한 결과를 실질적으로 달성하는 현재 존재하거나 또는 나중에 개발되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법 또는 방법은 본 개시에 따라 활용될 수 있다. 이에 따라, 청구범위는 이의 범위 내에 그와 같은 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법 또는 단계를 포함하도록 의도된다.
참조문헌
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 출판물은 본 발명과 관련된 해당기술의 숙련가의 수준을 보여준다. 모든 특허 및 출판물은 마치 각각의 개별 출판물이 구체적이며 개별적으로 참조로 편입되었음이 보여지는 것과 동등하게 본원에 참조로 편입되었다.
출판물
Figure pct00001
Figure pct00002
특허 및 특허 출원
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

Claims (29)

  1. 자연살해(NK) 세포를 포함하며, 상기 NK 세포가 하나 이상의 외생적으로 제공되는 인터루킨(IL)을 포함하고, 상기 IL이 IL-15가 아니며, 상기 NK 세포가 하나 이상의 조작된 수용체를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL이, IL-12, IL-21, IL-2, IL-18, IL-7, 인공적으로 링커와 연결된 IL-12의 p35 및 p40 하위단위, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IL이 IL-12, IL-21 또는 둘 다인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL이 세포에서 분비되거나, 묶여 있거나, 또는 막결합되어 있는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 외생적으로 제공되는은 세포 중 벡터에서 발현되는 것으로 추가로 정의되고/되거나 상기 NK 세포가 하나 이상의 IL의 존재하에 배양되는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 수용체가 조작된 항원 수용체인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조작된 항원 수용체가 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)인, 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항원이 암 항원인, 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 고형 종양 항원인, 조성물.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 5T4, 8H9, αvβ6　인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD5, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, CS1, CLL1, CD99, DLL3, EGFR, ErbB2(HER2)를 비롯한 EGFR과(family), EGFRvIII, EGP2, EGP40, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글립피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-Al+NY-ESO-1, IL-llRα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, L1CAM, 카파, KDR, MCSP, 메소텔린, Muc1, Mucl6, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSC1, PSCA, PSMA, ROR1, SP17, 수르비빈, TAG72, TEM, HMW-MAA, 및 VEGFR2로 이루어진 군에서 선택되는, 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 조작된 수용체가 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 또는 귀소성 수용체인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포가 자살 유전자를 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 TDAG8, NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM 17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 내생적 유전자의 발현에서 감소 또는 억제되는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하며, 적절한 배지에 포함되는, 세포 집단.
  15. 개인에게서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 치료 유효량으로 상기 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 개인의 암 세포가 NK 리간드의 발현 증가를 갖는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 개인의 암 세포가 MICA/B, ULBP1, ULBP2/5, ULBP3, B7-H6, CD112, CD155, HLA-ABC, HLA-DR, HLA-3, 또는 이들의 조합의 발현 증가를 갖는, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 고형 종양이거나 또는 고형 종양이 아닌, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 폐, 뇌, 유방, 혈액, 피부, 췌장, 간, 결장, 두경부, 신장, 갑상선, 위, 비장, 담낭, 골, 난소, 고환, 자궁내막, 전립선, 직장, 항문, 자궁경관의 암이거나, 또는 혈액 암인, 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 교모세포종인, 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개인이 포유류인, 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개인이 인간, 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지 또는 설치류인, 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개인에게 하나 이상의 추가의 암 치료요법이 시행되는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 추가의 암 치료요법이 수술, 방사선요법, 화학요법, 호르몬 요법, 면역요법, 또는 이들의 조합인, 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개인에게서 암을 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 개인과 관련된 자가조직인, 방법.
  28. 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 개인과 관련된 동종이계인, 방법.
  29. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단이 두개 내로, 주사로, 정맥으로, 동맥으로, 복강 내로, 기도로, 종양 내로, 근육 내로, 내시경을 통해, 병변 내로, 두개 내로, 경피로, 피하로, 국부적으로, 관류에 의해, 종양 미세환경에서, 또는 이들의 조합을 통해 상기 개인에게 투여되는, 방법.
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