JP2023519908A - 癌の治療のための細胞免疫療法 - Google Patents

Abstract

本開示の実施形態は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞を含む組成物を包含し、細胞は１つ以上の外来的に提供されるインターロイキン（ＩＬ）を含み、細胞は、任意で、１つ以上の操作された受容体を含む。特定の実施形態では、ＩＬはＩＬ－１５ではなく、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１又はその両方である。ＮＫ細胞は、少なくとも神経膠芽細胞腫を含む、任意の種類の癌の治療に利用することができる。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は２０２０年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／００１，２７５号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（技術分野）
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学、及び医学の分野に関する。

神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）は、予後不良の侵攻性悪性腫瘍である。再発後は標準療法がなく、生存期間は９カ月未満である。最近、ＩＬ１３Ｒα２（Ｂｒｏｗｎら、２０１６）、Ｈｅｒ２／ＣＭＶ（Ａｈｍｅｄら、２０１０）、及びＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅら、２０１７）を標的とする３つの初の人体適用となるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞試験からの結果が、期待外れの臨床結果とともに報告された。

現在、他の固形腫瘍と同様にＧＢＭについて、特に白血病及びリンパ腫において証明された大きな応答性を伴った細胞療法を進めることに極めて重要な必要性がある。本開示は、少なくとも神経膠芽細胞腫を含む、癌に対して細胞療法を進展させるという長年にわたる必要性に対する解決策を提供する。

本開示の実施形態は、医学的状態のための細胞療法に関連する方法及び組成物を含む。細胞療法は、それを必要とする個体への投与のための免疫エフェクター細胞又は他の細胞を包含する。特定の実施形態では、細胞が１つ以上の外来的に提供されるインターロイキン（ＩＬ）を含み、任意で１つ以上の他の異種遺伝子産物、例えば、１つ以上の操作された受容体を含むので、他の細胞療法と比較して活性が増強される。細胞は、（培養中など）１つ以上のサイトカインの外部に曝露されてもよく、及び／又は１つ以上のベクターに由来する（細胞のゲノムから発現される内在性サイトカインとは対照的に）異種サイトカインを発現するようにトランスフェクトされてもよい。本開示は、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）及び他の癌の治療のために、外来性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－７）と組み合わせた、エクスビボで拡張され活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又は、膜結合又は繋留されたサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－７）を分泌するか、若しくは表面に発現するＮＫ細胞による免疫療法を包含する。送達前に、細胞は、培養中に有効量のＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－７に適切な条件下で曝露されていてもよい。特定の実施形態では、細胞は、ＩＬ－１５ではない１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを含むが、代替の実施形態では、細胞は、外来的に提供されたＩＬ－１５を含む。

特定の実施形態では、本開示は、ＮＫ細胞を含む養子細胞療法を用いて神経膠芽細胞腫を治療する方法を包含する。特定の態様では、ＮＫ細胞は、神経膠芽細胞腫幹細胞に対して特に有効であり、本開示は、神経膠芽細胞腫細胞を含む、任意の種類の神経膠芽細胞腫細胞に対してＮＫ細胞を増強するための方法及び組成物を提供する。本開示は、神経膠芽細胞腫を有する個体において神経膠芽細胞腫幹細胞を殺傷する方法であって、１つ以上の外来的に提供されたＩＬを発現するように操作された、及び／又は１つ以上のＩＬの存在下で培養されたＮＫ細胞の有効量を個体に投与することを含む、方法を包含する。いくつかの実施形態では、神経膠芽細胞腫幹細胞は、１つ以上の操作された受容体を発現するＮＫ細胞によって殺傷されるが、該操作された受容体は、神経膠芽細胞腫幹細胞上で発現される１つ以上の抗原を標的にしても、しなくてもよい。ある場合には、神経膠芽細胞腫幹細胞は、１つ以上の操作された受容体を発現するように操作された、１つ以上の外来性サイトカインを発現するように操作された、及び／又は、１つ以上のＩＬの存在下で培養された、ＮＫ細胞によって殺傷される。

本開示の実施形態は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む任意の種類の免疫エフェクター細胞を含有する組成物を含み、前記細胞は、１つ以上の外来的に提供されたＩＬを含み、任意選択でＩＬはＩＬ－１５ではなく、細胞は、１つ以上の操作された受容体を含む。特定の実施形態では、ＩＬがＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－７及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の場合において、ＩＬは、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１又はその両方である。本開示の任意の実施形態では、ＩＬが細胞において分泌され、繋留され、又は膜結合され得る。本明細書で使用される場合、「外来的に提供される」は、細胞中のベクターから発現される、及び／又は、細胞が１つ以上のＩＬに外部から曝露されることとしてさらに定義され得る。

特定の実施形態では、本開示の細胞において利用される操作された受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの操作された抗原受容体である。抗原は、固形腫瘍抗原を含む癌抗原であってもよく、又は病原体に関連する抗原であってもよい。抗原が癌抗原である場合の具体例としては、５Ｔ４、８Ｈ９、α_ｖβ_６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＣＳ１、ＣＬＬ１、ＣＤ９９、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、Ｌ１ＣＡＭ、Ｋａｐｐａ、ＫＤＲ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭｓ、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＶＥＧＦＲ２、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される抗体を含む。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、又はホーミング受容体であるか、又は、細胞がこれらの組み合わせを有し得る。

特定の実施形態では、本開示の細胞は、自殺遺伝子を含むＮＫ細胞を含む細胞である。いくつかの場合において、細胞は、ＴＤＡＧ８、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７及びそれらの組み合わせからなる群より選択される内在性遺伝子の１つ以上の発現が減少又は阻害される。

本開示の実施形態は、本明細書に包含される任意の細胞の集団を含む。

一実施形態では、本明細書に包含される組成物のいずれかの治療有効量を投与するステップを含む、個体における癌を治療する方法がある。いくつかの場合において、個体における癌細胞は、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５、ＵＬＢＰ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ若しくはＨＬＡ－３、又はそれらの組み合わせなどのＮＫリガンドの発現が増加している。操作されたＮＫ細胞は、これらのＮＫリガンドの１つ以上を標的とする、又は他の標的を標的とし得る、１つ以上の操作された抗原受容体を発現し得る。組成物は、頭蓋内に、注射によって、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病変内に、頭蓋内に、経皮的に、皮下に、局所的に、潅流によって、腫瘍微小環境内において、又はそれらの組み合わせによって、個体に提供され得る。

癌治療のために、癌は固形腫瘍であっても、固形腫瘍でなくてもよい。癌は、肺、脳、乳房、血液、皮膚、膵臓、肝臓、結腸、頭頸部、腎臓、甲状腺、胃、脾臓、胆嚢、骨、卵巣、精巣、子宮内膜、前立腺、直腸、肛門、子宮頸部の癌であってもよいし、血液性の癌であってもよい。特定の場合において、癌は神経膠芽細胞腫である。

本開示の治療方法の実施形態では、個体がヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、又はげっ歯類などの哺乳動物であってもよい。個体は、手術、放射線、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、又はそれらの組み合わせを含む、１つ以上の追加の癌療法を施され得る。いくつかの実施形態では、本開示の任意の方法は、個体における癌を診断するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示の任意の方法は、細胞を生成するステップをさらに含む。本明細書において利用される任意の細胞は、個体に関して自己由来（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）又は同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）であり得る。

上記では、本開示の特徴及び技術的利点が、下記の詳細な説明がよりよく理解され得るためにかなり広く概説されている。本明細書中における請求項の主題を形成するさらなる特徴及び利点が本明細書中下記において記載されるであろう。開示される概念及び具体的な実施形態は、本件設計の同じ目的を実施するために他の構成を変更するための、又は設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって理解されなければならない。そのような同等な組立ては、添付された請求項において示されるような精神及び範囲から逸脱しないこともまた、当業者によって認識されなければならない。さらなる目的及び利点と一緒にではあるが、構成及び操作方法の両方に関して、本明細書中に開示される設計に特徴的であると考えられる新規な特徴が、添付されている図面に関連して検討されたとき、下記の説明からよりよく理解されるであろう。しかしながら、図面のそれぞれが例示及び説明のためだけに提供されており、本開示の限界の定義として意図されないことが、明確に理解されなければならない。

本開示のより完全な理解のために、ここで、添付の図面と併せて以下の説明を参照する：

図１Ａ及び図１Ｂ。アストロサイトではなく神経膠芽細胞腫幹細胞（ＧＳＣ）は、ＮＫ媒介溶解に非常に感受性である。（図１Ａ）ＮＫ細胞を、異なる比率でＣｒ５１標識ＧＳＣと４時間共培養し（ｎ＝４）、Ｃｒ５１放出を測定した。（図１Ｂ）ＧＳＣ及びアストロサイト上のＮＫリガンドの発現。

サイトカイン遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターの例の概略図：ｈＩＬ－１２ｐ４０ｌｉｎｋｅｒｐ３５は、ｐ３５及びｐ４０サブユニットがリンカーとともに人工的に連結されたヒトＩＬ－１２である。

図３Ａ及び図３Ｂ。３次元腫瘍培養モデルとしての患者由来神経膠芽細胞腫幹細胞株（ＧＳＣ）のスフェロイド培養（図３Ａ）及びＧＳＣ標的に対するサイトカイン形質導入ＣＢ－ＮＫ細胞の細胞傷害性（図３Ｂ）。ＩＬ－１２、ＩＬ－２１又はＩＬ－２１形質導入ＮＫ細胞（赤線（上）、緑線（上から３番目）及び青線（上から２番目））はＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）ライブイメージングによって示されるように、非形質導入ＣＢ－ＮＫ（黒線（下））と比較してＧＳＣに対して優れた細胞傷害性を発揮する。アポトーシス細胞は、カスパーゼ３／７緑色シグナルによって測定される。

図４Ａ～４Ｃ。ＦＦｌｕｃ形質導入ＧＳＣの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおける非形質導入（ＮＴ）対ＩＬ１２及びＩＬ２１形質導入ＮＫ細胞の比較。ＩＬ－１２又はＩＬ２１形質導入ＮＫ細胞を１×１０^５細胞の投与量で１回注入すると、生物発光イメージングによって示されるように腫瘍が根絶され（図４Ａ～４Ｂ）、動物の長期治癒もたらされる（図４Ｃ）。

［Ｉ．定義例］
長年の特許法の条約に従い、用語「ａ」及び「ａｎ」は本明細書において、特許請求の範囲を含む「１つ以上」を含む用語と併せて使用される場合、本開示のいくつかの実施形態は本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／又は方法から構成され得るか、又は本質的にそれらから構成され得る。本明細書に記載の任意の方法又は組成物を、本明細書に記載の任意の他の方法又は組成物に関して実施することができ、異なる実施形態を組み合わせ得ることが企図される。

本明細書全体を通して、文脈が別途必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は記述されたステップ又は要素又はステップ又は要素の群の包含を意味するが、任意の他のステップ若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群の除外を意味しないと理解される。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句に続くものを含むこと、及びそれに限定されることを意味し、したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句は列挙された要素が必要又は必須であることを示す。「から本質的になる」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素についての開示において指定された活性又は作用に干渉しないか、又は寄与しない他の要素に限定される。したがって、語句「から本質的になる」は列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は任意ではなく、列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在してもよいし、存在しなくてもよいことを示す。

本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加の実施形態」、又は「さらなる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態と関連して記載された特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを意味している。したがって、本明細書中の様々な場所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わされてもよい。

本明細書で使用するとき、用語「又は」及び「及び／又は」は、互いに組み合わせて又は排他的に複数の構成要素を説明するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ、及び／又はｚ」は「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、及びｚ」、「（ｘ及びｙ）又はｚ」、「ｘ又は（ｙ及びｚ）」又は「ｘ又はｙ又はｚ」を指し得る。ｘ、ｙ、又はｚは実施形態から具体的に除外され得ることが具体的に企図される。

本出願を通して、用語「約」は、細胞及び分子生物学の分野におけるその単純で通常の意味に従って使用され、値が値を決定するために使用されるデバイス又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示す。

本明細書で使用される「操作された」という用語は、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクターなどを含む、人の手によって生成される実体を指す。少なくともいくつかの場合において、操作された実体は合成であり、本開示において利用される様式で天然に存在しないか、又は構成されない要素を含む。

本明細書で使用される「外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、免疫細胞などの哺乳動物細胞中に内因的に存在しないか、又は組換え技術などによって哺乳動物細胞の外部で合成的に生成されるポリヌクレオチド（遺伝子産物又は遺伝子産物の一部をコードするものなど）を指す。特定の場合には、特定の遺伝子産物を細胞に外来的に提供することができ、細胞は細胞中で対応する内在性遺伝子産物を発現していてもよく、発現していなくてもよい。

本明細書で使用される場合、「予防する」及び、「予防された」「予防すること」等の類似の語は、疾患又は状態、例えば、癌の発生又は再発の可能性を予防、阻害、又は低減するためのアプローチを示す。それはまた、疾患若しくは状態の発症若しくは再発を遅延させること、又は疾患若しくは状態の症状の発症若しくは再発を遅延させることを指す。本明細書で使用される場合、「予防」及び同様の用語はまた、疾患又は状態の発症又は再発に先立って、疾患又は状態の強度、効果、症状及び／又は負担を低減することを含む。

本明細書で使用される「対象」又は「個体」という用語は互換性があり、一般に、医学的状態の治療を必要とする個体を指す。特定の場合において、個体は、癌を有するか、又は癌を有することが疑われる。対象は哺乳動物、例えば、ヒト、実験動物（例えば、霊長類、ラット、マウス、ウサギ）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シチメンチョウ、及びニワトリ）、家庭用ペット（例えば、イヌ、ネコ、及びげっ歯類）、ウマ、及びトランスジェニック非ヒト動物を含む、方法又は材料の対象である任意の生物又は動物対象であり得る。対象は、患者、例えば、良性若しくは悪性新生物、又は癌などの疾患（医学的状態と称され得る）を有するか、又は有することが疑われる患者であり得る。対象は、治療を受けているか、又は受けたことがあってもよい。対象は、無症候性であり得る。対象は健康な個体であり得るが、癌の予防を望んでいる。本明細書で使用される「対象」又は「個体」は、医療施設に収容されていても、収容されていなくてもよく、医療施設の外来患者として治療されてもよい。個体は、インターネットを介して１つ以上の医療用組成物を受け取っていてもよい。個体はヒト又は非ヒト動物の任意の年齢を含んでもよく、したがって、成人及び若者（すなわち、子供）及び乳児の両方を含み、子宮内の個体を含む。したがって、この用語は医学的治療の必要性を示唆するものではなく、個人は、臨床的なものであるか基礎科学研究を支援するものであるかを問わず、自発的に又は非自発的に、実験に参加することができる。代替的な場合において、対象又は個体は、病原体処置を必要とする。

本明細書で使用される場合、「治療」又は「処置」は、疾患又は病理学的状態の症状又は病態に対する任意の有益な又は望ましい効果を含み、治療される疾患又は状態、例えば、癌の１つ以上の測定可能なマーカーの最小限の低減さえ含み得る。治療は、場合により、疾患若しくは状態の１つ以上の症状の軽減若しくは改善、又は疾患若しくは状態の発症若しくは進行の遅延のいずれかを含むことができる。治療は、必ずしも、疾患若しくは状態、又はその関連症状の完全な根絶又は治癒を示すものではない。治療は、医学的状態の１つ以上の症状の重症度を低減することを含み得る。

本開示の実施形態は、神経膠芽細胞腫を含む任意の種類の癌の免疫療法のために、ＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞を利用する。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞である。ＮＫ細胞は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球とは異なり、再構成されたＶ（Ｄ）Ｊ受容体を有さず、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）結合抗原提示によって制限されないので、ＧＢＭなどの高度に不均一な腫瘍に対する治療エフェクターとして適している。その代わりに、それらのエフェクター機能は、特定の抗原特異性又は共刺激の必要性なしに癌標的上の複数のリガンドを認識することができる生殖系列コード化受容体を通して受容されたシグナルの統合により決定される。

ＮＫ細胞は、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）に浸潤する最も豊富なリンパ系サブセットの１つを含み、この疾患の免疫監視におけるＮＫ細胞の役割を支持する。さらに、正常なアストロサイトではなく、ＧＢＭ幹細胞（ＧＳＣ）がＭＨＣ鎖関連抗原（ＭＩＣＡ／Ｂ）及び（ＤＮＡＭによって認識される）ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１５５によって認識されるＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）などのＮＫ活性化受容体によって認識されるリガンドの多くを発現し、ＧＳＣは、インビトロで同種異系の健常ＮＫ細胞による溶解に対して高度に感受性であることが本明細書において示されている（図１Ａ）。このように、ＧＢＭに対してのＣＡＲ Ｔ細胞を超えるＮＫ細胞免疫療法の主な利点は、ＣＡＲを使用して特定の抗原を標的とすることを必要とせず、生殖系列にコードされた受容体を介してＧＳＣ上の複数の抗原を標的とするそれらの固有の能力にある。ＮＫ細胞のこの特性は、ＧＢＭを含むＣＡＲ Ｔ細胞療法で観察される抗原回避及び腫瘍不均一性に関連する課題を克服し得る。本開示は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、又はＩＬ－１８などの１つ以上の外来性サイトカインのいずれかにＮＫ細胞を曝露することによって、及び／又は、それらのエフェクター機能、持続性、及び輸送を助けるために１つ以上のサイトカイン遺伝子を発現するようにそれらを操作することによって、ＧＢＭに対するＮＫ細胞の活性をさらに改善することを可能にする。ＮＫ細胞は、神経膠芽細胞腫細胞上の抗原を標的とする操作された抗原受容体を利用することを含め、神経膠芽細胞腫細胞を特異的に標的とするようにさらに改変されてもよい。

本開示の特定の実施形態は、１つ以上の外来性サイトカインと組み合わせた同種異系のＮＫ細胞及び／又は１つ以上のサイトカインを表面に分泌又は発現するよう遺伝子操作されたＮＫ細胞を包含する。このような細胞は、コストを低減し、この療法を多くの患者に拡張する既製の治療に利用することができる。

［ＩＩ．サイトカイン］
本開示の実施形態は、１つ以上のサイトカインに外部から（例えば、培養物中を含む）に曝露された免疫エフェクター細胞、及び／又は１つ以上のサイトカインを発現するベクターで細胞をトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞を含む。サイトカインは任意の種類であり得るが、特定の実施形態ではサイトカインがＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、又はＩＬ－１８である。しかしながら、特定の実施形態では、サイトカインはＩＬ－１５ではない。

特定の実施形態では、細胞中でベクターから発現された１つ以上の外来的に提供されるサイトカインは、膜結合性である。サイトカインは、任意の種類の膜結合分子、例えば、Ｂ７－１、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＧＭＣＳＦ受容体、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の膜貫通ドメインに異種的に結合され得るので、任意のサイトカインが膜結合され、ＮＫ細胞の表面上に発現され得る。

いくつかの場合において、１つ以上のサイトカインは、操作された受容体などの別の遺伝子産物と同じベクター分子上に存在するが、他の場合において、それらは別々の分子上にある。特定の実施形態では、１つ以上のサイトカインが１つ以上の操作された受容体と同じベクターから共発現される。１つ以上のサイトカインは、抗原特異的受容体とは別個のポリペプチドとして産生されてもよい。特定の場合において、サイトカインはＮＫ細胞の発生及び細胞増殖を誘導し、腫瘍常在細胞の機能的抑制を緩和することによって定着腫瘍の根絶を促進し、及び／又は、活性化誘導細胞死を阻害する。他のサイトカインも想定される。これらにはヒトへの適用に使用される細胞の活性化及び増殖に寄与するケモカイン及び他の分子が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、１つ以上の外来的に提供されるサイトカインを発現する。サイトカインは、フィーダー細胞内の発現ベクターから発現されるために、又はＮＫ細胞培養物に直接添加され得るために、細胞に外来的に提供され得る。別の場合において、細胞中の内在性サイトカインは、サイトカインのプロモーター部位での遺伝子組換えなどの内在性サイトカインの発現の調節の操作の際にアップレギュレートされる。サイトカインが発現構築物上で細胞に提供される場合、サイトカインは、自殺遺伝子などの別の遺伝子産物を発現するものと同じベクターからコードされ得る。サイトカインは、自殺遺伝子とは別個のポリペプチド分子として、及び細胞の操作された受容体とは別個のポリペプチドとして発現され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＬ－１５ではないサイトカインとＣＡＲ及び／又はＴＣＲベクターの共利用に関する。

［ＩＩＩ．免疫エフェクター細胞］
本開示は、１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを有する、任意の種類の免疫エフェクター細胞を包含し、ここでインターロイキンはＩＬ－１５ではなく、任意選択で、細胞が１つ以上の操作された受容体及び／又は他の異種遺伝子産物を含む。特定の実施形態では、細胞に外来的に提供されたＩＬは、人の手による細胞の意図的操作の直接的又は間接的な結果である。これは、細胞が１つ以上のサイトカイン（例えば、培養物中）に外部から曝露されているかどうか、及び／又は細胞がベクター（細胞ゲノムに組み込まれていても、組み込まれていなくてもよい）から１つ以上のＩＬを発現するようにトランスフェクトされているかどうかにかかわらず、当てはまる。そのような方法での免疫エフェクター細胞の操作は、任意の機構によるものであり得る。免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、ｉＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＭＳＣなどであってもよい。

免疫エフェクター細胞が１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを有する場合、細胞は、１つ以上のサイトカインを含む培地中で培養されるプロセスによって、１つ以上のサイトカインに外部から曝露されていてもよい。培地中のサイトカインの濃度の範囲は、例えば、０．１ｎｇ～１０００ｎｇ、０．１ｎｇ～７５０ｎｇ、０．１ｎｇ～５００ｎｇ、０．１～２５０ｎｇ、０．１～１００ｎｇ、０．１～７５ｎｇ、０．１～５０ｎｇ、０．１～２５ｎｇ、０．１～１０ｎｇなどである。培地中のサイトカインの濃度の範囲は、例えば、１単位～５０００単位、１単位～４０００単位、１単位～３０００単位、１単位～２０００単位、１単位～１０００単位、１単位～７５０単位、１単位～５００単位、１単位～２５０単位、１単位～１００単位、１単位～７５単位、１単位～５０単位、１単位～２５単位などであり得る。いくつかの場合において、サイトカインは、細胞が培養される間中培地中にあり、一方、他の場合において、サイトカインは、培養の後の時点で培養物に添加される。サイトカインは、第１、第２、第３、第４、若しくはそれ以降の継代、又はそれらの組み合わせにおいて培養培地中に存在し得る。

本開示は、従来のＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、インバリアントＮＫ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、腫瘍浸潤リンパ球、又はそれらの混合物を含む、任意の種類の免疫エフェクター細胞を包含する。細胞は、癌を有する個体などの、細胞を必要とする個体を含む個体に対して、同種異系、自己由来、又は異種由来であり得る。

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、人の手によって修飾されて、１つ以上のサイトカインを発現するか、そうでなければ産生し、これらは組換えであるなど、細胞中の内在性サイトカインではない。免疫エフェクター細胞は、操作された受容体、自殺遺伝子、それらの組み合わせなどの追加の異種タンパク質を発現させるなどによって、さらなる方法で改変され得る。細胞はまた、１つ以上の内在性遺伝子の発現が低減又は抑制されるように改変され得る。

免疫エフェクター細胞が２種以上の方法で改変されている場合、免疫エフェクター細胞が改変される順序は任意の種類であり得る。例えば、外来的に提供されたサイトカインを発現する（及び／又は培養物中などの、１つ以上のサイトカインに外部的に曝露されている）免疫エフェクター細胞を、１つ以上の操作された受容体でトランスフェクトすることができる。他の場合において、１つ以上の操作された受容体を発現する免疫エフェクター細胞は、外来的に提供されたサイトカインでトランスフェクトされ得、及び／又は培養物中の１つ以上のサイトカインに曝露され得る。

特定の実施形態では、ＩＬ－１５ではない１つ以上の外来的に提供されたＩＬを含む免疫エフェクター細胞は、抗原受容体などの操作された受容体を発現するように改変された細胞と同じ細胞である。本開示に包含される任意の免疫エフェクター細胞は、固形腫瘍抗原でもあり得る癌抗原である抗原に対する受容体を含む、任意の種類のものであってよい抗原受容体を発現する。特定の実施形態では、受容体は、例えば、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体である。免疫エフェクター細胞は、１つ以上の外来的に提供されるＩＬを含むように特異的に設計されてもよく、個体の癌細胞上の抗原を標的とする抗原受容体を発現するように特異的に設計されてもよい。すなわち、細胞は、個体の癌細胞上に存在することが知られている抗原を標的とする１つ以上の抗原受容体を含むように調整され得る。

特定の実施形態では、本開示の細胞は、既製の細胞として使用される目的で産生される。例えば、１つ以上の外来的に提供されたＩＬを含む細胞は、例えば、リポジトリ中に存在してもよく、それらは、リポジトリから得られ、外来的に提供されたサイトカインを発現すること以外のさらなる修飾を有するように操作されてもよい。他の場合には、外来的に提供されたサイトカインを発現する他の修飾を有する細胞がリポジトリから得られ、１つ以上の外来的に提供されたサイトカインを発現するように操作される。リポジトリから細胞を得た後の細胞へのそのような改変に続いて、細胞を保存してもよく、又は有効量の細胞を、それを必要とする個体に提供してもよい。

任意の免疫エフェクター細胞は、極低温保存などの任意の形態のリポジトリから得ることができ、さらに改変することができる。細胞は１つ以上のサイトカインを発現する発現構築物を有するものとして保存されてもよく、その後得られ、例えば、必要とする個体の特定の癌に合わせて調整された抗原を標的とするように操作された受容体などの目的とする特定の１つ以上の操作された抗原受容体を発現するようにも改変され得る。細胞は、特定の癌に対する抗原を標的とする受容体などの、１つ以上の目的とする操作された抗原受容体を発現する発現構築物を有するものとして保存され得、その後、必要に応じて１つ以上の外来性サイトカインを発現するように改変される。貯蔵の前又は後に、細胞は自殺遺伝子を含むように改変され得、場合によっては自殺遺伝子がそれぞれのサイトカイン又は操作された抗原受容体と同じベクターから発現される。

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１つ以上の外来的に提供されたＩＬを含み、１つ以上の操作された抗原標的化受容体も発現し、及び／又は少なくとも１つの自殺遺伝子を発現する。１つ以上の外来的に提供されたＩＬを含む細胞について、いくつかの場合、異なるベクターが抗原標的化受容体をコードするのに対して、自殺遺伝子及び／又は外来性サイトカインをコードする。他の場合には、それら（又はサブセット）が同じベクター上にある。ＮＫ細胞を含む免疫エフェクター細胞は、臍帯血、末梢血、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄、又はそれらの混合物などの、任意の適切な供給源に由来し得る。ＮＫ細胞は、例えば、限定されないが、ＮＫ－９２細胞などの細胞株に由来し得る。ＮＫ細胞は、臍帯血単核細胞、例えば、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞であり得る。

いくつかの場合において、１つ以上の外来的に提供されたＩＬを含む免疫エフェクター細胞（ＮＫ細胞を含む）は、任意の適切な比率で含む有効量のユニバーサル抗原提示細胞（ＵＡＰＣ）の存在下で増殖させたものである。細胞は、例えば、１０：１～１：１０；９：１～１：９；８：１～１：８；７：１～１：７；６：１～１：６；５：１～１：５；４：１～１：４；３：１～１：３；２：１～１：２；又は１：１の比でＵＡＰＣと共培養されてもよく、例えば１：２の比を含んでＵＡＰＣと共培養されてもよい。いくつかの場合において、ＮＫ細胞は、ＩＬ－２の存在下、例えば、１０～５００、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～５０、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～５００、３００～４００、又は４００～５００Ｕ／ｍＬの濃度のＩＬ－２の存在下で増殖したものであり得る。

任意のベクターによる遺伝子改変に続いて、１つ以上の外来的に提供されたＩＬを含む免疫エフェクター細胞は、個体に直ちに送達されてもよいし、又は保存されてもよい（又は細胞の一部が個体に送達され、細胞の残りが保存される）。特定の態様では、遺伝子改変後、細胞は、細胞への遺伝子導入後に約１、２、３、４、５日又はそれ以上以内に、バルク集団としてエクスビボで数日、数週間又は数ヶ月間増殖させることができる。さらなる態様では、トランスフェクタントをクローン化し、単一の組み込まれた又はエピソーム的に維持された発現カセット又はプラスミドが実際に存在するクローンをエクスビボで増殖させる。増殖のために選択されたクローンは１つ以上の外来的に提供されたサイトカインの発現を示す。組換え免疫細胞は、ＩＬ－２、又は共通のγ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１など）による刺激によって増殖され得る。組換え免疫細胞は、人工抗原提示細胞による刺激によって増殖させることができる。さらなる態様では、任意の遺伝子改変細胞を凍結保存することができる。

本開示の実施形態は、１つ以上の外来的に提供されるＩＬ及び１つ以上の抗原受容体を含む１つ以上の操作された受容体を含む免疫エフェクター細胞を包含する。１つ以上の操作された抗原受容体は、例えば組換え技術を用いて人の手によって生成され、免疫エフェクター細胞にとって天然のものではない。操作された受容体は任意の種類のものであってもよいが、特定の実施形態では、受容体は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、ホーミング受容体、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９媒介遺伝子変異、デコイ受容体、サイトカイン受容体、キメラサイトカイン受容体、それらの組み合わせなどである。

本開示の実施形態は、１つ以上の外来的に提供されたＩＬ及び１つ以上の自殺遺伝子を含む細胞を包含する。免疫エフェクター細胞は、１つ以上の外来的に提供されたＩＬを含み得、任意の種類の自殺遺伝子をコードする組換え核酸を含み得る。自殺遺伝子の例としては、操作された非分泌性（膜結合型を含む）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α変異体ポリペプチド（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６２００９を参照されたい）が挙げられ、それらはＴＮＦ－α変異体に結合する抗体の送達によって影響され得る。使用され得る自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）及びガンシクロビル、アシクロビル、又はＦＩＡＵ；オキシドレダクターゼ及びシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼ及び５－フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジル酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）及びＡＺＴ；ならびにデオキシシチジンキナーゼ及びシトシンアラビノシドなどが挙げられる。プロドラッグ６－メチルプリンデオキシリボシドを毒性のあるプリン６－メチルプリンに変換する、いわゆる自殺遺伝子である大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼを利用することもできる。他の自殺遺伝子として、ＣＤ２０、ＣＤ５２、誘導性カスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チトクロームｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン－α、γ－リアーゼ（ＭＥＴ）、及びチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）などが挙げられる。

細胞は、個体から直接得ることができ、又はデポジトリ若しくは他のデポジトリから得ることができる。治療としての細胞は、細胞が治療として提供される個体に関して、自己由来又は同種異系であり得る。

細胞は、医学的状態のための治療を必要とする個体からのものであってもよく、１つ以上の外来的に提供されたＩＬ、任意の自殺遺伝子、任意のサイトカイン、及び任意の受容体を含むように（例えば、養子細胞療法のための形質導入及び拡大のための標準的技術を使用して）操作した後で、それらは、それらが最初に供給された個体に戻されてもよい。場合によっては、細胞が個体又は別の個体のための後の使用のために保存される。

免疫細胞は細胞の集団に含まれてもよく、その集団は１つ以上の外来的に提供されたＩＬ及び／又は１つ以上の自殺遺伝子及び／又は１つ以上のサイトカインを含む大部分を有してもよい。細胞集団は、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の、１つ以上の外来的に提供されたＩＬ及び／又は１つ以上の自殺遺伝子、及び／又は１つ以上の操作された受容体を含む免疫細胞を含み得；これらの遺伝子の各々は別個のポリペプチドとして産生されていても産生されていなくてもよい。

免疫細胞は、特定の目的に関してモジュール式であることを目的として、１つ以上の外来的に提供されたＩＬ及び／又は１つ以上の自殺遺伝子及び／又は１つ以上のサイトカインを含むように産生され得る。例えば、１つ以上の外来的に提供されたＩＬ及び／又は１つ以上の自殺遺伝子（又はその後の形質導入のために自殺遺伝子をコードする核酸とともに流通する）を含む商業的流通のためを含めて細胞を作製することができ、ユーザーは、目的に応じて１つ以上の他の目的の遺伝子（治療用遺伝子を含む）を発現するようにそれらを改変することができる。例えば、癌細胞を治療することに関心のある個体は、自殺遺伝子発現細胞（又は異種サイトカイン発現細胞）を取得又は生成し、１つ以上の外来的に提供されたＩＬを含むようにそれらを改変することができ、逆もまた可能である。

特定の実施形態では、ＮＫ細胞が利用され、１つ以上の外来的に提供されたＩＬ及び／又は１つ以上の自殺遺伝子及び／又は１つ以上の操作された受容体を含むＮＫ細胞のゲノムが改変され得る。ゲノムは任意の様式で改変され得るが、特定の実施形態ではゲノムが例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集によって改変される。細胞のゲノムは任意の目的のために、細胞の有効性を増強するように改変され得る。特定の場合において、細胞は、１つ以上の遺伝子の発現の阻害によってさらに改変される。いくつかの場合において、編集される遺伝子は、細胞が腫瘍微小環境においてより効果的に働くことを可能にする。特定の場合、遺伝子は、ＴＤＡＧ８、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、及びＣＤ７のうちの１つ以上である。特定の実施形態では、これらの遺伝子の１つ以上が細胞内でノックアウトされるか、又はノックダウンされる。

細胞が１つ以上の遺伝子の発現のノックアウト又はノックダウンを有するように遺伝子編集される場合、そのような遺伝子編集は、任意の適切な様式で実施され得る。いくつかの実施形態において、細胞における任意の遺伝子編集は、ＲＮＡガイド化エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介する改変などの、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を使用して実施される。例えば、改変は、ＣＲＩＳＰＲ及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行うことができ、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９の代わりにＣｐＦ１が利用される。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」はＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与する転写物及び他のエレメント、例えば、Ｃａｓ遺伝子、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡでプロセシングされた内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈における部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において「スペーサー」とも呼ばれる）、並びに／又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写物を含む。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡと、ヌクレアーゼ機能性（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の構成要素が、例えば、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）など）から得られるＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来することができる。

いくつかの態様において、Ｃａｓヌクレアーゼと、（標的配列について特異的なｃｒＲＮＡと、固定されたｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物を含む）ｇＲＮＡとが細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端における標的部位は、Ｃａｓヌクレアーゼを、相補的な塩基対形成を使用して標的部位に対して、例えば、遺伝子に対して標的化する。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（典型的にはＮＧＧ又はＮＡＧなど）のすぐ５’側のその位置に基づいて選択される場合がある。この点で、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するようにガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１又は１０ヌクレオチドを改変することによって所望の配列に標的化される。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進させる構成要素によって特徴づけられる。典型的には、「標的配列」は一般には、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列で、標的配列とガイド配列との間でのハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進させる配列を示す。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進させるための十分な相補性が存在するならば、完全な相補性は必ずしも要求されない。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）、続いて、本明細書中で議論されるような破壊又は改変を誘導することができる。他の実施形態において、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９バリアントが、標的部位において一本鎖に切れ目を入れるために使用される。一対の異なるｇＲＮＡによってそれぞれ指向化される対となったニッカーゼが、例えばニックを同時に導入する際に５’側突出部が導入されるように配列を標的化することにより、例えば、特異性を改善するために使用することができる。他の実施形態において、触媒不活性なＣａｓ９が、遺伝子発現に影響を及ぼすために異種のエフェクタードメイン（例えば、転写リプレッサー又は転写活性化因子など）に融合される。

標的配列は、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドなど、任意のポリヌクレオチドを含む場合がある。標的配列は細胞の核又は細胞質に、例えば、細胞のオルガネラの内部などに位置する場合がある。一般に、標的配列を含む標的となった遺伝子座の中への組換えのために使用され得る配列又はテンプレートが、「編集用テンプレート」又は「編集用ポリヌクレオチド」又は「編集用配列」として示される。いくつかの態様において、外来性のテンプレートポリヌクレオチドが編集用テンプレートとして示される場合がある。いくつかの態様において、組換えは相同組換えである。

典型的には、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連において、（標的配列にハイブリダイゼーションし、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化するガイド配列を含む）ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成により、標的配列内又は標的配列の近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対以内、又はそれ以上の塩基対以内で）の一方又は両方のストランドの切断がもたらされる。ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全体又は一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、又はそれ以上のヌクレオチド）を含む場合があり、ｔｒａｃｒ配列はまた、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を、例えば、ガイド配列に機能的に連結されるｔｒａｃｒメイト配列の全体又は一部に対するｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどによって形成する場合がある。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイゼーションし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に加わるためにｔｒａｃｒメイト配列に対する十分な相補性を有しており、例えば、最適にアラインメントされたときには、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％などの配列相補性を有する。

ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の構成要素を発現させる１つ以上のベクターを、ＣＲＩＳＰＲシステムの当該構成要素の発現により、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が１つ以上の標的部位で導かれるように細胞に導入することができる。構成要素はまたタンパク質及び／又はＲＮＡとして細胞に送達されることが可能である。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれが、別個のベクターにおいて別個の調節エレメントに機能的に連結され得るであろう。代替として、同じ調節エレメント又は異なる調節エレメントから発現される構成要素の２つ以上が単一のベクターにおいて組み合わされてもよく、この場合、１つ以上のさらなるベクターにより、第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素が提供される。ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（これはまた、「クローニング部位」として示される）などを含む場合がある。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位が１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流側及び／又は下流側に位置する。複数の異なるガイド配列が使用されるときには、単一の発現構築物が、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するのに使用してもよい。

ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結される調節エレメントを含む場合がある。Ｃａｓタンパク質の限定されない例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（これはまた、Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２として知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、又はそれらの改変型が含まれる。これらの酵素は知られており、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列がＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２により見出され得る。

ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ又はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａから得られるもの）であり得る。いくつかの場合、Ｃａｓ９の代わりにＣｐＦ１がエンドヌクレアーゼとして使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の場所において、例えば、標的配列の内部及び／又は標的配列の相補体の内部などで一方の鎖又は両方の鎖の直接的な切断をもたらすことができる。ベクターは、変異させたＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方の鎖又は両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に関して変異させられるＣＲＩＳＰＲ酵素をコードすることができる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣＩ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）により、Ｃａｓ９は、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼに変わる（一本鎖が切断される）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼがガイド配列（１つ以上）と組み合わせて、例えば、ＤＮＡ標的のセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする２つのガイド配列と組み合わせて使用される場合がある。この組み合わせは、両方の鎖に切れ目を入れ、両方の鎖が、ＮＨＥＪ又はＨＤＲを誘導するために使用されることを可能にする。

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列が、真核生物細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化される。真核生物細胞は、特定の生物、例えば、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又は非ヒト霊長類を含む哺乳動物などの細胞、あるいはそれらに由来する細胞である場合がある。一般に、コドン最適化は、目的とする宿主細胞における強化された発現のために、ネイティブ型配列の少なくとも１つのコドンを、ネイティブ型のアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に、又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって核酸配列を改変するプロセスを示す。様々な生物種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定の偏りを示す。コドンの偏り（生物間のコドン使用頻度における差）は多くの場合、とりわけ、翻訳されているコドンの特性、及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に結果として依存していると考えられるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関する。選択されたｔＲＮＡが細胞において優勢であることは一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子を、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現ができるように遺伝子を調整することができる。

一般に、ガイド配列には、標的配列とハイブリダイゼーションし、標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的な結合を導くために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされたとき、ガイド配列と、その対応する標的配列との間における相補性の程度は、約５０％又は約５０％超、約６０％又は約６０％超、約７５％又は約７５％超、約８０％又は約８０％超、約８５％又は約８５％超、約９０％又は約９０％超、約９５％又は約９５％超、約９７％又は約９７％超、約９９％又は約９９％超、あるいはそれ以上である。

最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用することにより求めてもよく、そのようなアルゴリズムの限定されない例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）が含まれる。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部である場合がある。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列を含む場合があり、また、必要な場合にはリンカー配列をいずれか２つのドメインの間に含む場合がある。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例には、限定されないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、並びに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが含まれる。エピトープタグの限定されない例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自家蛍光タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ ＡのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の融合物、ＧＡＬ４ＡのＤＮＡ結合ドメインの融合物、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質の融合物（これらに限定されない）を含めて、ＤＮＡ分子と結合するタンパク質又は当該タンパク質のフラグメント、あるいは他の細胞分子と結合するタンパク質又は当該タンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合される場合がある。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインが米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される。

［ＩＶ．治療方法］
本開示の実施形態は、例えば、癌免疫療法、抗病原体免疫療法、自己免疫又は同種免疫に関連する治療の方法を含む。特定の場合において、癌免疫療法及び抗病原体免疫療法は、１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを含む免疫エフェクター細胞を含む組成物を少なくとも含む。本方法は癌及び／又は病原体を有する個体に、１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを含む有効量の免疫エフェクター細胞を提供することを含む。

特定の場合において、個体は、１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを含む有効量の細胞を提供される。特定の場合において、細胞はまた、１つ以上の操作された抗原受容体を発現している。特定の場合において、細胞はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてノックアウトされる。遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、固形腫瘍に対するそれらの有効性を高めるために様々な細胞療法において使用され、これらの細胞療法は個体に提供される。

一例として、１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを含むＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲを発現し、固形腫瘍の酸性ＴＭＥにおけるそれらの有効性を高める目的で、１つ以上の内在性遺伝子を欠失させるように遺伝子操作され、特定の実施形態では、この療法の固形腫瘍への拡大をもたらす。さらに、この遺伝子操作戦略は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）－Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの様々な他の形態の細胞療法において使用され、様々なタイプの固形腫瘍に対してそれらを増強する。

特定の実施形態では、本開示の細胞が任意の種類の癌及び／又は任意の種類の病原体感染症などの医学的状態を改善する目的で個体に提供される。本明細書で企図される細胞（それを含む医薬組成物を含む）の使用は、腫瘍性疾患などの癌性疾患又は病原体感染症の予防、治療、又は改善のために使用される。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、固形腫瘍であってもなくてもよい癌を含む、癌の予防、改善及び／又は治療に特に有用であり得る。

特定の実施形態では本開示は、部分的に、単独で又は１つ以上の他の療法との任意の組み合わせで、そして少なくともいくつかの態様において薬学的に許容される担体又は賦形剤と一緒に投与され得る、本明細書に包含される細胞の使用を企図する。特定の実施形態では、任意の核酸分子又はベクターは、対象に細胞を送達する前に、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。

本開示の任意の細胞は、注射、静脈内、動脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的に、病変内、頭蓋内、経皮、皮下、局所、潅流で、腫瘍微小環境内に、又はそれらの組み合わせによって個体に投与され得る。

さらに、本開示は、本明細書において企図される１つ以上の外来的に提供されるインターロイキンを含む任意の細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、腫瘍性疾患の予防、治療、又は改善のための方法に関する。

細胞の組成物の投与の可能な適応症は、例えば、神経膠芽細胞腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、肺、脳、乳房、血液、皮膚、膵臓、肝臓、結腸、頭頸部、腎臓、甲状腺、胃、脾臓、胆嚢、骨、卵巣、精巣、子宮内膜、前立腺、直腸、肛門又は子宮頸部等の腫瘍性疾患を含む癌性疾患である。細胞の組成物の投与における例示的な適応症は、個体の癌に関連する１つ以上の特定の抗原を発現する任意の悪性腫瘍を含む、癌性疾患である。本開示の組成物の投与は、例えば、微小残存病変、早期癌、進行癌、及び／又は転移性癌及び／又は難治性癌を含む、全ての病期及びタイプの癌に有用である。

本開示はさらに、免疫細胞を介して作用する他の化合物、例えば、二重特異性抗体構築物、標的化毒素又は他の化合物との共投与プロトコルを包含する。本発明の化合物の共投与のための臨床レジメンは、他の成分の投与と同時に、投与前に、又は投与後に共投与することを包含し得る。特定の併用療法には、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法、又は他のタイプの免疫療法が含まれる。

本開示の実施形態は、アストロサイトを同じ細胞免疫療法から標的化することから除外しながら、細胞免疫療法を神経膠芽細胞腫幹細胞に標的化する方法を含む。細胞免疫療法は、少なくともＮＫ細胞を含む任意の種類の免疫エフェクター細胞を含み得る。細胞免疫療法は、１つ以上の外来的に提供されたサイトカインを含む免疫エフェクター細胞を含み得る。

実施形態は、細胞を産生するための構築物、本明細書で定義される核酸配列、本明細書で定義されるベクター、及び／又は本明細書で定義される宿主細胞（免疫エフェクター細胞など）を含むキットに関する。本開示のキットは、本明細書に記載の医薬組成物を、単独で、又は医学的処置若しくは介入を必要とする個体に投与されるさらなる薬剤と組み合わせて含むことも企図される。

［Ｖ．遺伝子操作された受容体］
１つ以上の外来的に提供されるインターロイキンを含む本開示の免疫細胞は、１つ以上の非内在性遺伝子産物を発現するようにさらに修飾され得る。遺伝子産物は、遺伝子操作された受容体であってもなくてもよい。受容体は、例えば、抗原、ケモカイン、又はサイトカインに対する受容体を含む、任意の種類のものであってもよい。受容体が抗原に対するものである場合、抗原は、固形腫瘍抗原を含む癌抗原であってもよい。

１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを含む免疫エフェクター細胞は、特定の抗原を標的とする抗原受容体を発現するように遺伝子操作されてもよく、そのような細胞は、個体の癌細胞上に存在する１つ以上の抗原を標的とするように特異的に設計されてもよい。

特定の実施形態では、１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを含む免疫エフェクター細胞は、操作されたＴＣＲ又はＣＡＲなどの操作された抗原受容体を含み得る。例えば、免疫細胞は、１つ以上の特定の抗原に対して抗原特異性を有する１つ以上のＣＡＲ及び／又はＴＣＲを発現するように改変されたＮＫ細胞であってもよい。いくつかの態様では、免疫細胞は、例えばＣＲＩＳＰＲを用いたＣＡＲ又はＴＣＲのノックインによって、抗原特異的ＣＡＲ又は抗原特異的ＴＣＲを発現するように操作される。

改変の適切な方法は、当技術分野で公知である。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ及びＡｕｓｕｂｅｌを参照されたい。例えば、細胞は、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ ｅｔ ａｌ、２００８及びＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、２００９に記載されている形質導入技術を用いて、癌抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲを発現するように形質導入され得る。

いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作によって導入された１つ以上の抗原受容体をコードする１つ以上の核酸、及びそのような核酸の遺伝子操作産物を含む。いくつかの実施形態では、核酸が異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）、すなわち、例えば、別の生物又は細胞から得られるものなどの、細胞又は細胞から得られる試料中に通常は存在しないものであり、例えば、操作される細胞及び／又はそのような細胞が由来する生物において通常見出されないものである。いくつかの実施形態では、核酸が天然に存在しない（例えば、天然に見出されない核酸（例えば、キメラ））。

ＣＡＲ及び組換えＴＣＲをはじめとした例示的な抗原受容体、ならびにそれらの受容体を操作するための方法及び細胞に導入するための方法には、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３１９６０、ＵＳ２０１３２８７７４８、ＵＳ２０１３０１４９３３７、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号及び同第８，４７９，１１８号、ならびに欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されているもの、及び／又はＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２によって記載されたものが含まれる。いくつかの態様において、遺伝的に操作された抗原受容体には、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されているようなＣＡＲ、及び国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４０５５６６８Ａｌに記載されているものが含まれる。

操作された受容体が抗原受容体である場合、抗原は、５Ｔ４、８Ｈ９、α_ｖβ_６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＣＳ１、ＣＬＬ１、ＣＤ９９、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、Ｌ１ＣＡＭ、Ｋａｐｐａ、ＫＤＲ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭｓ、ＨＭＷ－ＭＡＡ及びＶＥＧＦＲ２からなる群より選ばれてもよい。

（Ａ．キメラ抗原受容体）
いくつかの態様において、抗原特異的ＣＡＲは、ａ）１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）所望の抗原を標的とする（特異的に結合することを含む）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、上記操作された受容体はＣＡＲを含み、活性化型又は刺激型のＣＡＲ、共刺激型のＣＡＲ（ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照のこと）及び／又は阻害型のＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照のこと）をはじめとしたＣＡＲが含まれる。それらのＣＡＲは、一般に、１つ以上の細胞内のシグナル伝達構成要素に、いくつかの態様ではリンカー及び／又は膜貫通ドメインを介して連結された、細胞外の抗原（又はリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は、通常、天然の抗原受容体を介するシグナル、共刺激受容体とともにそのような受容体を介するシグナル、及び／又は共刺激受容体のみを介するシグナルを模倣するか近似している。

本開示のある特定の実施形態は、細胞内の少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外のドメインを含む、抗原特異的ＣＡＲポリペプチド（免疫原性を低減するためにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含む）をコードする核酸を含む核酸の使用に関する。ある特定の実施形態において、抗原特異的ＣＡＲは、１つ以上の抗原の間で共有される空間を含むエピトープを認識し得る。ある特定の実施形態において、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／又はそれらの抗原結合フラグメントを含み得る。別の実施形態において、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。

ヒト抗原ＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞免疫療法を増強するために使用されるヒト遺伝子であり得ると企図される。具体的な実施形態において、本開示は、抗原特異的ＣＡＲの完全長ｃＤＮＡ又はコード領域を含む。その抗原結合領域又はドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のフラグメント（例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許第７，１０９，３０４号に記載されているもの）を含み得る。そのフラグメントは、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインでもあり得る。より具体的な実施形態において、そのフラグメントは、ヒト細胞における発現のためにヒトのコドン使用頻度に最適化された配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。

配置は、多量体であり得る（例えば、ダイアボディ又は多量体）。その多量体は、軽鎖及び重鎖の可変部分がダイアボディに交差対形成することによって形成される可能性が最も高い。その構築物のヒンジ部分には、完全欠失から、１つ目のシステインが維持されること、セリン置換ではなくプロリン置換であること、１つ目のシステインまで切断されることにまで及ぶ複数の選択肢があり得る。Ｆｃ部分を欠失させることができる。安定したかつ／又は二量体化する任意のタンパク質が、この目的にかない得る。Ｆｃドメインのうちの１つだけ、例えば、ヒト免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインを使用することができる。二量体化を改善するように改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を使用することもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分だけを使用することもできる。ＣＤ８αの部分を使用することもできる。

いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメイン及び改変されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの、他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体としては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ３ζによって惹起される１次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激受容体によって提供されるさらなるシグナルが、ＮＫ細胞の完全な活性化にとって重要であり、インビボでの持続性及び養子免疫療法の治療の成功の改善を助け得る。

いくつかの実施形態において、抗原特異的ＣＡＲは、抗原、例えば、正常細胞型上又は非罹患細胞型又は罹患細胞型上に発現される抗原に対する特異性を有するように構築される。したがって、上記ＣＡＲは通常、その細胞外の部分に、１つ以上の抗原結合分子（例えば、１つ以上の抗原結合フラグメント、抗原結合ドメイン若しくは抗原結合部分）又は１つ以上の抗体可変ドメイン、及び／又は抗体分子を含む。いくつかの実施形態において、抗原特異的ＣＡＲは、抗体分子の抗原結合部分（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ））を含む。

キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ起源、ｃＤＮＡ起源から得ることができるか、又は合成することができるか（例えば、ＰＣＲを介して）、又はそれらの組み合わせであり得る。イントロンはｍＲＮＡを安定化すると見出されているので、ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡ又はそれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化するために内在性又は外来性の非コード領域を使用することもさらに有益であり得る。

上記キメラ構築物は、裸のＤＮＡとして又は好適なベクターに入った状態で免疫細胞に導入され得ることが企図される。裸のＤＮＡを用いたエレクトロポレーションによって細胞を安定的にトランスフェクトする方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。裸のＤＮＡとは、一般に、発現にとって適切な向きでプラスミド発現ベクターに含まれるキメラ受容体をコードするＤＮＡのことを指す。

あるいは、キメラ構築物を免疫細胞に導入するために、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）を用いることができる。本開示の方法に従って使用するのに適したベクターは、免疫細胞において非複製性のベクターである。細胞内に維持されるそのウイルスのコピー数は、その細胞の生存能を維持するほど十分低いウイルスに基づくベクターが多数知られており、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ又はＢＰＶに基づくベクターが挙げられる。

いくつかの態様において、抗原に特異的に結合する構成要素又は抗原特異的認識構成要素は、１つ以上の膜貫通ドメイン及び細胞内のシグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。１つの実施形態において、そのＣＡＲにおけるドメインの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合において、その膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるためにそのようなドメインが同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避するように、選択されるか又はアミノ酸置換によって改変される。

膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、天然起源又は合成起源に由来する。起源が天然である場合、そのドメインは、いくつかの態様において、任意の膜結合型タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ分子に由来する（すなわち、それらの分子の膜貫通領域を少なくとも含む）膜貫通領域を含む。あるいは、膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、合成の膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、合成の膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含む。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成の膜貫通ドメインの各末端に見られる。

ある特定の実施形態において、免疫細胞、例えばＮＫ細胞を遺伝的に改変するための本明細書中に開示されるプラットフォーム技術としては、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を用いた非ウイルス遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３－ζ又は他の組み合わせ）を介してシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）長さが不定の細胞外ドメインであってＣＤ７０認識ドメインを細胞表面に接続する細胞外ドメインを有するＣＡＲ、及びいくつかの場合では、（ｉｖ）ＣＡＲ^＋免疫細胞を頑強かつ数値的に拡大することができる、Ｋ５６２に由来する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）が挙げられる。

（Ｂ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は、天然に存在するＴ細胞からクローニングされた組換えＴＣＲ及び／又はＴＣＲを含む。「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は可変α鎖及びβ鎖（それぞれ、ＴＣＲα及びＴＣＲβとしても知られる）又は可変γ鎖及びδ鎖（それぞれ、ＴＣＲγ及びＴＣＲδとしても知られる）を含み、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子を指す。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはαβ型である。

典型的には、αβ型及びγδ型で存在するＴＣＲは、一般に構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は、解剖学的位置又は機能が異なる場合がある。ＴＣＲは、細胞の表面上に、又は可溶性形態で見出すことができる。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（又はＴリンパ球）の表面に見出され、ここで、ＴＣＲは一般に、ＭＨＣ分子に結合した抗原を認識する役割を果たす。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び／又は短い細胞質尾部を含むことができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ、１９９７を参照されたい）。例えば、いくつかの態様では、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端の短い細胞質尾部を有することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲがシグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と関連する。特に明記しない限り、「ＴＣＲ」という用語は、その機能的ＴＣＲ断片を包含すると理解されるべきである。この用語は、αβ型又はγδ型のＴＣＲを含む、インタクト又は完全長のＴＣＲも包含する。

したがって、本明細書の目的のために、ＴＣＲへの言及は、ＭＨＣ分子中に結合した特異的抗原性ペプチド、すなわちＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分などの任意のＴＣＲ又は機能的断片を含む。互換的に使用され得るＴＣＲの「抗原結合部分」又は「抗原結合フラグメント」はＴＣＲの構造ドメインの一部を含むが、完全長ＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合する分子を指す。いくつかの場合において、抗原結合部分は、ＴＣＲの可変ドメイン、例えば、ＴＣＲの可変α鎖及び可変β鎖を含むが、これは、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体への結合のための結合部位を形成するのに十分であり、例えば、一般に、各鎖が３つの相補性決定領域を含む。

いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは、会合して、ループ、又は免疫グロブリンに類似する相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成し、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することによって抗原認識を付与し、ペプチド特異性を決定する。典型的には、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）によって分離されている（例えば、Ｊｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ、１９９０； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ、１９８８； Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ、２００３参照）。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識に関与する主要なＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１も抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、一方β鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２はＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態では、β鎖の可変領域は、さらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含むことができる。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンのように、ＴＣＲ鎖の細胞外部分（例えば、ａ鎖、β鎖）は２つの免疫グロブリンドメイン、即ちＮ末端に可変ドメイン（例えば、Ｖ_ａ又はＶｐ；典型的にはＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ「Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5^thed.」に基づくＫａｂａｔのナンバリングに基づくアミノ酸１～１１６番）、及び、細胞膜に近接する１つの定常ドメイン（例えば、典型的にはＫａｂａｔ、に基づくアミノ酸１１７～２５９番であるａ鎖定常ドメイン又はＣ_ａ、典型的にはＫａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２９５であるβ鎖定常ドメイン又はＣｐ）を含んでもよい。例えば、場合によっては、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜近位定常ドメインと、ＣＤＲを含有する２つの膜遠位可変ドメインとを含有する。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、２つの鎖の間に連結を形成する短い連結配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲが定常ドメイン中に２つのジスルフィド結合を含むように、α鎖及びβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有してもよい。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は膜貫通ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは正に荷電している。いくつかの場合において、ＴＣＲ鎖は、細胞質尾部を含む。いくつかの場合において、この構造は、ＴＣＲがＣＤ３のような他の分子と会合することを可能にする。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含むＴＣＲは、タンパク質を細胞膜に固定し、ＣＤ３シグナル伝達機構又は複合体のインバリアントサブユニットと会合することができる。

一般に、ＣＤ３は、哺乳動物では３つの異なる鎖（γ、δ、及びε）とζ鎖においてを有し得るマルチタンパク質複合体である。例えば、哺乳動物において、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、及びＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含み得る。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に荷電しており、これは、これらの鎖が正に荷電したＴ細胞受容体鎖と会合することを可能にする特徴である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖の細胞質尾部はそれぞれ、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られる１つの保存されたモチーフを含むが、各ＣＤ３ζ鎖には３つ存在する。一般に、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に関与する。これらのアクセサリー分子は負に帯電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲから細胞へのシグナルの伝播に役割を果たす。ＣＤ３鎖及びζ鎖はＴＣＲとともに、Ｔ細胞受容体複合体として知られるものを形成する。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲが２つの鎖α及びβ（又は場合によりγ及びδ）のヘテロ二量体であってもよく、又は単鎖ＴＣＲ構築物であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲがジスルフィド結合又はジスルフィド結合などによって連結された２つの別々の鎖（α及びβ鎖又はγ及びδ鎖）を含有するヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、標的抗原（例えば、癌抗原）に対するＴＣＲが同定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸は、公的に利用可能なＴＣＲ ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの様々な供給源から得ることができる。いくつかの態様において、ＴＣＲは生物学的供給源から、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）か、Ｔ細胞ハイブリドーマ又は他の公的に利用可能な供給源などから得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞がインビボで単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態では、高親和性Ｔ細胞クローンを患者から単離し、ＴＣＲを単離することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞が培養Ｔ細胞ハイブリドーマ又はクローンであり得る。いくつかの態様において、標的抗原のためのＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、又はＨＬＡ）を用いて操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製されている。例えば、腫瘍抗原を参照されたい（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９及びＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、標的抗原に対するＴＣＲを単離するためにファージディスプレイが用いられる（例えば、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａら、２００８年及びＬｉ、２００５年を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ又はその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識により合成的に作製することができる。

［ＩＶ．ベクター］
免疫エフェクター細胞が非内在性の操作された遺伝子産物又は外来的に提供された遺伝子産物、例えば、１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを含む場合、遺伝子産物は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含む任意の適切なベクターによってレシピエントの免疫エフェクター細胞に送達され得る。ウイルスベクターの例としては、少なくともレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターの例としては、少なくともプラスミド、トランスポゾン、脂質、ナノ粒子などが挙げられる。

免疫細胞が抗原標的化受容体をコードするベクターで形質導入され、また、別の遺伝子又は遺伝子、例えば、自殺遺伝子及び／又はサイトカイン及び／又は任意の治療用遺伝子産物の細胞への形質導入を必要とする場合において、抗原標的化受容体、自殺遺伝子、サイトカイン及び任意の治療用遺伝子は、同じベクター上に、又は同じベクターとともに含まれてもよいし、含まれなくてもよい。いくつかの場合において、抗原標的化ＣＡＲ、自殺遺伝子、サイトカイン及び任意の治療用遺伝子は、同一のウイルスベクター分子などの同一のベクター分子から発現される。そのような場合、サイトカイン、任意の抗原標的化受容体、任意の自殺遺伝子、及び任意の治療用遺伝子の発現は、同じ調節エレメントによって調節されてもよいし、同じ調節エレメントによって調節されなくてもよい。サイトカイン、任意の抗原標的化ＣＡＲ、任意の自殺遺伝子、及び任意の治療用遺伝子が同じベクター上に存在する場合において、それらは、別個のポリペプチドとして発現されてもよいし、別個のポリペプチドとして発現されなくてもよい。それらが別々のポリペプチドとして発現される場合、それらは、例えば、２Ａエレメント又はＩＲＥＳエレメントによってベクター上で分離され得る（又は両種が同じベクター上で１回又は２回以上使用されてもよい）。

（Ａ．一般的実施形態）
当業者は、本開示の抗原受容体の発現のための標準的な組換え技術（例えば、両方とも参照により本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、２００１ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ、１９９６を参照されたい）によりベクターを構築することは十分に可能であろう。

（１．調節エレメント）
本開示において有用なベクターに含まれる発現カセットは、特に（５’から３’方向に）、タンパク質コード配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、及び転写終結／ポリアデニル化配列を含む。真核細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の転写を制御するプロモーター及びエンハンサーは、複数の遺伝的エレメントから構成され得る。細胞機構は各エレメントによって運ばれる調節情報を集め、統合することができ、異なる遺伝子が区別され、しばしば複雑な転写調節のパターンを発生させることを可能とする。本開示の文脈において使用されるプロモーターは、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び組織特異的プロモーターを含む。ベクターが癌治療の生成のために利用される場合、プロモーターは、低酸素の条件下で有効であり得る。

（２．プロモーター／エンハンサー）
本明細書で提供される発現構築物は、抗原受容体及び他のシストロン遺伝子産物の発現を駆動するためのプロモーターを含む。プロモーターは一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置付けるように機能する配列を含む。この最もよく知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター、例えば、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子プロモーターでは、開始部位自体に重なる別個のエレメントが開始部位を確定するのに役立つ。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的にはこれらは開始部位の上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。コード配列をプロモーターの「制御下に」置くために、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’側）に転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を配置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。

プロモーターエレメント間の間隔は、多くの場合柔軟であり、そのため、プロモーター機能は、エレメントが反転されたり、又は相対的に移動しても保存される。ｔｋプロモーターにおいて、例えば、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始めることなく５０ｂｐ離れるまで増加させることができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために協同的に又は独立して機能することが可能と思われる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と併せて使用されてもよく、又は使用されなくてもよい。

プロモーターは、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができるように、核酸配列と天然において関連するものであってもよい。そのようなプロモーターは、「内在性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する核酸配列と天然において関連するものであってもよい。あるいはある種の利点がコード核酸セグメントを組換え又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）プロモーターの制御下に配置することによって得られるが、異種プロモーターはその天然環境において核酸配列と通常は関連していないプロモーターを指す。組換えエンハンサー又は異種エンハンサーはまた、その天然環境において核酸配列と通常は関連していないエンハンサーを指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他のウイルス又は原核細胞又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、並びに「天然に存在しない」、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント及び／又は発現を変化させる変異を含む、プロモーター又はエンハンサーを含み得る。例えば、組換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるプロモーターは、β－ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース及びトリプトファン（ｔｒｐ－）プロモーター系を含む。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物に関連して、組換えクローニング及び／又はＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を使用して生成され得る。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核オルガネラ内の配列の転写及び／又は発現を指示する制御配列も同様に用い得ることが企図される。

もちろん、発現のために選択された細胞小器官、細胞型、組織、器官、又は生物においてＤＮＡセグメントの発現を効果的に指令するプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー及び細胞型の組み合わせの使用を知っている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ。１９８９、参照により本明細書に組み込まれる）。使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導性、及び／又は組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模生産において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指向するための適切な条件下で有用であり得る。プロモーターは、異種又は内在性であり得る。

さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢ、ｅｐｄ．ｉｓｂ－ｓｉｂ．ｃｈ／のワールドワイドウェブによる）も、発現を駆動するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核細胞は、送達複合体の一部として、又はさらなる遺伝子発現構築物として、適切な細菌ポリメラーゼが提供される場合は、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持することができる。

プロモーターの非限定的な例としては、初期又は後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えば、ベータアクチンプロモーター、ＧＡＤＰＨプロモーター、メタロチオネインプロモーター；及び連結型応答エレメントプロモーター、例えば、サイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）及び最小ＴＡＴＡボックス付近の応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ）が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）のアクセッション番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３～３４１に記載のヒト成長ホルモン最小プロモーター）又はマウス乳房腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＡＴＣＣ ４５００７から入手可能）を使用することも可能である。特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ、デクチン－１、デクチン－２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ ＭＬＰ、β－アクチン、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩプロモーターであるが、治療用遺伝子の発現を駆動するのに有用な任意の他のプロモーターは本開示の実施に適用可能である。

特定の態様では、本開示の方法はまた、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を増加させ、シスで、そしてそれらの配向にかかわらず、比較的長い距離（標的プロモーターから数キロベースまで）にわたってさえも作用する可能性を有する核酸配列に関する。しかし、エンハンサー機能は、必ずしもこのような長距離に限定されず、所与のプロモーターにごく近接して機能してもよい。

（３．開始シグナルと連結発現）
本開示において提供される発現構築物においては、コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルもまた使用され得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルを提供する必要があり得る。当業者であれば、これを決定し、必要なシグナルを提供することが容易に可能であろう。開始コドンはインサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは周知である。外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然又は合成のいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって増強され得る。

特定の実施形態では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用が、多重遺伝子又はポリシストロニックメッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５′メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内在部位で翻訳を開始することができる。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）からのＩＲＥＳエレメント、ならびに哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳが記載されている。ＩＲＥＳエレメントは異種オープンリーディングフレームと連結させることができる。複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写させることができ、各々はＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロニックメッセージを生じる。ＩＲＥＳエレメントによって、各オープンリーディングフレームはリボソームにアクセス可能であり、効率的な翻訳が可能である。複数の遺伝子を単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現させて、単一のメッセージを転写することができる。

本明細書の他の箇所で詳述されるように、特定の２Ａ配列エレメントが、本開示で提供される構築物中の遺伝子の連結又は共発現を作製するために使用され得る。例えば、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを形成することによって遺伝子を共発現させるのに、切断配列を使用することができる。例示的な切断配列は、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）又はＦ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）又は「２Ａ様」配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）又はブタテッショウウイルス（ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）－１（Ｐ２Ａ）である。特定の実施形態では、単一のベクターにおいて複数の２Ａ配列は非同一であるが、代替の実施形態では同一のベクターが２つ以上の同じ２Ａ配列を利用する。２Ａ配列の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００６５７７９号に提供されている。

（４．複製起点）
宿主細胞中でベクターを増殖させるために、それは、複製が開始される特定の核酸配列である、１つ以上の複製起点（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）、例えば、上記のようなＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、又はプログラミングにおいて類似の又は上昇した機能を有する遺伝子操作されたｏｒｉＰを含み得る。あるいは、上記のような他の染色体外複製ウイルスの複製起点又は自律複製配列（ＡＲＳ）を用いることができる。

（５．選択マーカーとスクリーニング可能なマーカー）
いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ７０標的化受容体構築物を含むＮＫ細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることによってインビトロ又はインビボで同定され得る。そのようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を与えるため、発現ベクターを含有する細胞を容易に同定することができる。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。陽性選択マーカーはマーカーの存在がその選択を可能にするものであり、一方、陰性選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。陽性選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。

通常、薬物選択マーカーを含めることは形質転換体のクローニング及び同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、測色分析を基礎とするＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他のタイプのマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素を利用してもよい。当業者はまた、おそらくＦＡＣＳ分析と併せて、免疫学的マーカーを使用する方法を知っているであろう。使用されるマーカーは遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要であるとは考えられない。選択及びスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。

（Ｂ．マルチシストロン性ベクター）
特定の実施形態では、サイトカイン、任意の抗原標的化受容体、任意の自殺遺伝子、及び／又は任意の治療用遺伝子は、マルチシストロン性ベクターから発現される（本明細書で使用される用語「シストロン」は、遺伝子産物が産生され得る核酸配列を指す）。特定の実施形態では、マルチシストロン性ベクターが少なくとも１つのサイトカイン、自殺遺伝子、及び／又は操作された受容体、例えば、Ｔ細胞受容体及び／又は追加の非抗原標的化ＣＡＲをコードする。いくつかの場合において、マルチシストロン性ベクターは、少なくとも１つの抗原標的化ＣＡＲ、少なくとも１つの自殺遺伝子、及び少なくとも１つのサイトカインをコードする。サイトカインは、ヒト又はマウス又は任意の種などの特定のタイプのサイトカインであってもよい。特定の場合において、サイトカインは、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、及び／又はＩＬ－２１である。

特定の実施形態では、本開示は、実質的に同一のレベルで複数のシストロンを発現する能力を有するポリシストロン性ベクターを利用する、融通性があるモジュラーシステム（本明細書で使用される「モジュラー」という用語はシストロン全体又はシストロンの構成要素の除去及び置換などによって、それぞれシストロン全体又はシストロンの構成要素の交換を可能にするシストロン又はシストロンの構成要素を指す）を提供する。このシステムは、複数の遺伝子のコンビナトリアル発現（過剰発現を含む）を可能にする細胞操作に使用され得る。特定の実施形態では、ベクターによって発現される１つ以上の遺伝子は、１つ、２つ、又はそれ以上の抗原受容体を含む。複数の遺伝子は、ＣＡＲ、ＴＣＲ、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング受容体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子変異、デコイ受容体、サイトカイン受容体、キメラサイトカイン受容体などを含み得るが、これらに限定されない。ベクターはさらに、（１）１つ以上のレポーター、例えば、細胞アッセイ及び動物イメージングのための蛍光又は酵素レポーター；（２）１つ以上のサイトカイン又は他のシグナル伝達分子；及び／又は（３）自殺遺伝子を含み得る。

特定の場合において、ベクターは、２Ａ切断部位などの任意の種類の切断部位によって分離された少なくとも４個のシストロンを含み得る。ベクターは、ｐＵＣ１９骨格にｐｓｉパッケージング配列を有する３’及び５’ＬＴＲを含むモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ又はＭＭＬＶ）ベースのものであってもよく、そうでなくてもよい。ベクターは、３つ以上の２Ａ切断部位及び遺伝子スワッピングのための複数のＯＲＦを有する４つ以上のシストロンを含み得る。システムはサブクローニングを介した迅速な組み込みのために制限部位に隣接する複数の遺伝子（７以上）のコンビナトリアル過剰発現を可能にし、このシステムはまた、いくつかの実施形態において、少なくとも３つの２Ａ自己切断部位を含む。したがって、システムは、複数のＣＡＲ、ＴＣＲ、シグナル伝達分子、サイトカイン、サイトカイン受容体、及び／又はホーミング受容体の発現を可能にする。このシステムはまた、レンチウイルス、アデノウイルスＡＡＶ、ならびに非ウイルスプラスミドを含むがこれらに限定されない、他のウイルスベクター及び非ウイルスベクターに適用され得る。

本システムのモジュラー特性はまた、ポリシストロン性発現ベクター中の４つのシストロンのそれぞれへの遺伝子の効率的なサブクローニング、及び、迅速な試験などのための遺伝子のスワッピングを可能にする。ポリシストロン性発現ベクターに戦略的に配置された制限部位により、効率的に遺伝子のスワッピングを行うことができる。

本開示の実施形態は、ポリシストロン性ベクターを利用するシステムを包含し、ここで、例えば、１つ以上のシストロン（又は１つ以上のシストロンの構成要素）の除去及び置換を可能にすることによって、例えば、ベクターのモジュラー的な使用を容易にするためにその同一性及び位置が特異的に選択される１つ以上の制限酵素部位を利用することなどによって、ベクターの少なくとも一部がモジュラーである。ベクターはまた、複数のシストロンが単一のポリペプチドに翻訳され、別々のポリペプチドにプロセシングされる実施形態を有し、それにより、ベクターが実質的に等モル濃度で別々の遺伝子産物を発現する利点を付与する。

本開示のベクターは、ベクターの１つ以上のシストロンを変化させることができるように、及び／又は１つ以上の特定のシストロンの１つ以上の構成要素を変化させることができるようモジュール化された構成である。ベクターは、１つ以上のシストロンの末端に隣接する、及び／又は特定のシストロンの１つ以上の構成要素の末端に隣接する、ユニークな制限酵素部位を利用するように設計され得る。

本開示の実施形態は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのシストロンを含むポリシストロン性ベクターを含み、各シストロンは１つ以上の制限酵素部位に隣接し、少なくとも１つのシストロンが少なくとも１つの抗原受容体をコードする。いくつかの場合において、シストロンのうちの２つ、３つ、４つ、又はそれ以上が単一のポリペプチドに翻訳され、別個のポリペプチドに切断されるが、他の場合において、シストロンのうちの複数が単一のポリペプチドに翻訳され、別個のポリペプチドに切断される。ベクター上の隣接シストロンは、２Ａ自己切断部位などの自己切断部位によって分離され得る。いくつかの場合において、シストロンのそれぞれは、ベクターから別々のポリペプチドを発現する。特定の場合には、ベクター上の隣接するシストロンがＩＲＥＳエレメントによって分離される。

ある特定の実施形態では、本開示は、例えば、１つ、２つ、又はそれ以上の抗原受容体を含み得る複数のシストロンの過剰発現を含む、コンビナトリアル発現を可能にする細胞工学のためのシステムを提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリシストロン性ベクターの使用は、ベクターが同じｍＲＮＡから等モルレベルの複数の遺伝子産物を産生することを可能にする。複数の遺伝子はサイトカイン、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ケモカイン、ホーミング受容体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子変異、デコイ受容体、サイトカイン受容体、キメラサイトカイン受容体などを含み得るが、これらに限定されない。ベクターは、細胞アッセイ及び動物イメージングのためなどの、１つ以上の蛍光レポーター又は酵素レポーターをさらに含み得る。ベクターはまた、ベクターを保有する細胞がもはや必要でなくなった場合、又はベクターが提供された宿主に対して有害になった場合に、ベクターを保有する細胞を停止させるための自殺遺伝子産物を含んでもよい。

本開示の特定の実施形態では、ベクター上のシストロンの少なくとも１つは、２つ以上のモジュラー構成要素を含み、シストロン内のモジュラー構成要素のそれぞれが、１つ以上の制限酵素部位に隣接している。シストロンは、例えば、３つ、４つ、又は５つのモジュラー構成要素を含むことができる。少なくともいくつかの場合において、シストロンは、対応するモジュラー構成要素によってコードされる受容体の異なる部分を有する抗原受容体をコードする。シストロンの第１のモジュラー構成要素は、受容体の抗原結合ドメインをコードし得る。さらに、シストロンの第２のモジュラー構成要素は、受容体のヒンジ領域をコードし得る。さらに、シストロンの第３のモジュラー構成要素は、受容体の膜貫通ドメインをコードし得る。加えて、シストロンの第４のモジュラー構成要素は、第１の共刺激ドメインをコードし得る。さらに、シストロンの第５のモジュラー構成要素は、第２の共刺激ドメインをコードし得る。さらに、シストロンの第６のモジュラー構成要素は、シグナル伝達ドメインをコードし得る。

本開示の特定の態様では、ベクター上の２つの異なるシストロンは、それぞれ、非同一の抗原受容体をコードする。両方の抗原受容体は、２つ以上のモジュラー構成要素を含む別個のシストロンを含む、２つ以上のモジュラー構成要素を含むシストロンによってコードされ得る。抗原受容体は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であってもよい。

特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター）又は非ウイルスベクターである。ベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ、及び／又はｐｓｉパッケージングエレメントを含み得る。特定の場合において、ｐｓｉパッケージングは、５’ＬＴＲと抗原受容体コード配列との間に組み込まれる。ベクターは、ｐＵＣ１９配列を含んでも含まなくてもよい。ベクターのいくつかの態様において、少なくとも１つのシストロンは、サイトカイン（例えば、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、又はＩＬ－２）、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、及び／又はホーミング受容体をコードする。

２Ａ切断部位がベクターにおいて利用される場合、２Ａ切断部位は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ及び／又はＦ２Ａ部位を含み得る。

ＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードする１つのシストロンに加えて、ベクターの任意のシストロンは、自殺遺伝子を含み得る。ベクターの任意のシストロンは、レポーター遺伝子をコードし得る。特定の実施形態では、第１のシストロンが自殺遺伝子をコードし、第２のシストロンがＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードし、第３のシストロンがレポーター遺伝子をコードし、第４のシストロンがサイトカインをコードする。特定の実施形態では、第１のシストロンが自殺遺伝子をコードし、第２のシストロンがＣＤ７０標的化ＣＡＲをコードし、第３のシストロンが第２のＣＡＲ又は別の抗原受容体をコードし、第４のシストロンがサイトカインをコードする。特定の実施形態では、ＣＤ７０標的化ＣＡＲ及び／又は別の受容体の異なる部分が対応するモジュラー構成要素によってコードされ、第２のシストロンの第１の構成要素が抗原結合ドメインをコードし、第２の構成要素がヒンジ及び／又は膜貫通ドメインをコードし、第３の構成要素が共刺激ドメインをコードし、第４の構成要素がシグナル伝達ドメインをコードする。

特定の実施形態において、シストロンの少なくとも１つは、自殺遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、シストロンの少なくとも１つは、サイトカインをコードする。特定の実施形態において、少なくとも１つのシストロンは、抗原標的化ＣＡＲをコードする。シストロンは、レポーター遺伝子をコードしてもしなくてもよい。特定の実施形態において、少なくとも２つのシストロンは、２つの異なる抗原受容体（例えば、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲ）をコードする。シストロンは、レポーター遺伝子をコードしてもしなくてもよい。

目的の遺伝的カーゴの特定の構成において、単一のベクターは、抗原標的化ＣＡＲをコードするシストロン、及び抗原標的化受容体と同一ではない第２の抗原受容体をコードするシストロンを含み得る。特定の実施形態では、第１の抗原受容体は抗原標的化ＣＡＲをコードし、第２の抗原受容体はＴＣＲをコードし、逆もまた同様である。特定の実施形態では、抗原標的化ＣＡＲ及び第２の抗原受容体をそれぞれコードする別個のシストロンを含むベクターはまた、サイトカイン又はケモカインをコードする第３のシストロンと、自殺遺伝子をコードする第４のシストロンとを含む。しかし、自殺遺伝子及び／又はサイトカイン（又はケモカイン）は、ベクター上に存在しなくてもよい。

特定の実施形態では、少なくとも１つのシストロンがモジュラーである複数の構成要素自体を含む。例えば、１つのシストロンは、複数の部分を有する抗原受容体などのマルチコンポーネント遺伝子産物をコードし得；特定の場合、抗原受容体は単一のシストロンからコードされ、それによって、最終的に単一のポリペプチドを産生する。複数の構成要素をコードするシストロンは、複数の構成要素が１、２、３、４、５、又はそれ以上の制限酵素消化部位によって分離されていてもよく、１、２、３、４、５又はそれ以上の制限酵素部位は、シストロンを含むベクターにおいて他にないものであってもよい。特定の実施形態では、複数の構成要素を有するシストロンは、それぞれ固有の機能を受容体に帰属させる複数の対応する部分を有する抗原受容体をコードする。特定の実施形態では、マルチコンポーネントシストロンの構成要素のそれぞれ又は大部分は、ベクターに固有の１つ以上の制限酵素消化部位によって分離され、所望の場合、別々の構成要素の相互交換可能性をもたらす。

特定の実施形態では、マルチコンポーネントシストロンの各構成要素は、抗原標的化ＣＡＲなどのコードされた抗原受容体の異なる部分に対応する。例示的な実施形態では、構成要素１が受容体の抗原結合ドメインをコードし得；構成要素２が受容体のヒンジドメインをコードし得；構成要素３が受容体の膜貫通ドメインをコードし得；構成要素４が受容体の共刺激ドメインをコードし得、構成要素５が受容体のシグナル伝達ドメインをコードし得る。特定の実施形態では、抗原標的化ＣＡＲは、受容体内の共刺激ドメインの相互交換可能性のために、ユニークな制限酵素消化部位によってそれぞれ分離された１つ以上の共刺激ドメインを含み得る。

特定の実施形態では、隣接するシストロンが２Ａ切断部位によって分離される、４つの別個のシストロンを有するポリシストロン性ベクターが存在するが、特定の実施形態では、２Ａ切断部位の代わりに、シストロンから別個のポリペプチドを直接的又は間接的に産生させる要素（ＩＲＥＳ配列など）が存在する。例えば、４つの別個のシストロンは３つの２Ａペプチド切断部位によって分離され得、各シストロンはシストロンの各末端に隣接する制限部位（Ｘ_１、Ｘ_２など）を有し、標準的な組換え技術を使用する際の別のシストロン又は他のタイプの配列などの特定のシストロンの相互交換可能性をもたらす。特定の実施形態では、シストロンの各々に隣接する制限酵素部位は、組換えを容易にするためにベクターにおいてユニークなものであるが、代替の実施形態では、制限酵素部位はベクターにおいてユニークなものではない。

特定の実施形態では、ベクターは、特定のシストロンの複数の構成要素内を含む特定のシストロン内での相互交換可能性を可能にすることによって、特有の第２のレベルのモジュール性を提供する。特定のシストロンの複数の構成要素は、シストロン内の１つ以上の構成要素の相互交換を可能にするために、ベクターにユニークなものを含む、１つ以上の制限酵素部位によって分離され得る。一例として、シストロン２はシストロン当たり２、３、４、５、６、又はそれ以上の構成要素があってもよいが、５つの別個の構成要素を含んでもよい。例えば、ベクターは各々が独特の酵素制限部位Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、及びＸ_１４によって分離された５つの構成要素を有するシストロン２を含み得、異なる構成要素１、２、３、４、及び／又は５を交換するための標準的な組換えを可能にすることができる。いくつかの場合において、異なる構成要素間に複数の制限酵素部位が存在し得（これはユニークであるが、あるいは１つ以上はユニークではない）、複数の制限酵素部位間に配列が存在し得る（しかし、代替的には、存在し得ない）。特定の実施形態では、シストロンによってコードされるすべての構成要素が相互交換可能であることを目的として設計される。特定の場合には、シストロンの１つ以上の構成要素は交換可能であるように設計されるが、シストロンの１つ以上の他の構成要素は交換可能であるように設計されなくてもよい。

特定の実施形態では、シストロンは、複数の構成要素を有する抗原標的化ＣＡＲ分子をコードする。例えば、シストロン２は、構成要素１、構成要素２、構成要素３などで表されるその別個の構成要素を有する抗原標的化ＣＡＲ分子をコードする配列から構成され得る。ＣＡＲ分子は、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上の交換可能な構成要素を含み得る。具体的には構成要素１はｓｃＦｖをコードし、構成要素２はヒンジをコードし、構成要素３は膜貫通ドメインをコードし、構成要素４は共刺激ドメインをコードし（ただし、交換のための制限部位に隣接する第２以上の共刺激ドメインをコードする構成要素４′も存在し得る）、構成要素５はシグナル伝達ドメインをコードする。特定の例において、構成要素１は、ｓｃＦｖをコードし；構成要素２がＩｇＧ１ヒンジ及び／又は膜貫通ドメインをコードし；構成要素３がＣＤ２８をコードし；構成要素４がＣＤ３ζをコードする。

当業者は、ベクターの設計において、様々なシストロン及び構成要素が必要なときにインフレームで保持されるように構成されなければならないことを認識する。

特定の例において、シストロン１が自殺遺伝子をコードし；シストロン２が抗原標的化ＣＡＲをコードし；シストロン３がレポーター遺伝子をコードし；シストロン４がサイトカインをコードし；シストロン２の構成要素１がｓｃＦｖをコードし；シストロン２の構成要素２がＩｇＧ１ヒンジをコードし；シストロン２の構成要素３がＣＤ２８をコードし；そして構成要素４がＣＤ３ζをコードする。

制限酵素部位は任意の種類であってもよく、その認識部位中の任意の数の塩基、例えば、４～８塩基を含んでもよく；認識部位中の塩基の数は、少なくとも４、５、６、７、８、又はそれ以上であってもよい。切断されると、その部位は、平滑末端又は付着末端を生成し得る。制限酵素は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型又はＩＶ型であってもよい。制限酵素部位は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩｎｔＥｎｚ）又はＢＲＥＮＤＡ（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）などの利用可能なデータベースから取得することができる。

例示的ベクターは、円形であってよく、慣例により、位置１（円の頂点の１２時の位置、シーケンスの残りの部分は時計回り方向）が５’ＬＴＲの開始点に設定される。

自己切断型２Ａペプチドが利用される実施形態では、２Ａペプチドは、真核細胞における翻訳中のポリペプチドの「切断」を媒介する１８～２２アミノ酸（ａａ）長のウイルスオリゴペプチドであってもよい。「２Ａ」という名称はウイルスゲノムの特定の領域を指し、異なるウイルス２Ａは一般に、それらが由来したウイルスにちなんで命名されている。最初に発見された２ＡはＦ２Ａ（口蹄疫ウイルス）であり、その後Ｅ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス）、Ｐ２Ａ（ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ）、及びＴ２Ａ（ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ）も同定された。２Ａによる「自己切断」の機構は、リボソームが２ＡのＣ末端でのグリシル－プロリルペプチド結合の形成をスキップすることであることが発見された。

特定の場合において、ベクターは、γ－レトロウイルストランスファーベクターであってもよい。レトロウイルストランスファーベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素サイト間のｐＵＣ１９遺伝子（２．６３ｋｂ）のようなプラスミドに基づくバックボーンを含むことができる。バックボーンは、５’ＬＴＲ、ｐｓｉパッケージング配列、及び３’ＬＴＲを含むモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来のウイルス成分を保有し得る。ＬＴＲは、レトロウイルスプロウイルスのいずれかの側に見出される長い末端反復であり、トランスファーベクターの場合、目的の遺伝子カーゴ（例えば、抗原標的化ＣＡＲ及び関連構成要素）を囲む。ヌクレオカプシドによるパッケージングの標的部位であるｐｓｉパッケージング配列もまた、５’ＬＴＲとＣＡＲコード配列との間に挟まれてシスで組み込まれる。したがって、トランスファーベクターの一例の基本構造は、ｐＵＣ１９配列－５’ＬＴＲ－ｐｓｉパッケージング配列－目的の遺伝的カーゴ－３’ＬＴＲ－ｐＵＣ１９配列のように構成することができる。このシステムはまた、レンチウイルス、アデノウイルスＡＡＶ、ならびに非ウイルスプラスミドを含むがこれらに限定されない、他のウイルスベクター及び非ウイルスベクターに適用され得る。

［ＶＩＩ．医薬組成物］
本明細書に包含される免疫エフェクター細胞及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物及び製剤が、本明細書に提供される。細胞は、個体に移入するのに適した培地に含まれてもよく、個体に移入する前に凍結保存などの保存に適した個体及び／又は培地に移入するのに適した培地に含まれてもよい。

本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、所望の程度の純度を有する活性成分（細胞など）を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ ^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１２）と混合することによって調製することができる。薬学的に許容される担体は、使用される投与量及び濃度において一般にレシピエントに対して無毒性であり、限定はされないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウム等の塩を形成する対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤などを含む。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、バクスターインターナショナル社）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質薬物分散剤（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｄｒｕｇ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ａｇｅｎｔ）をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。ある態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼのような１つ以上の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。

［ＶＩＩＩ．併用療法］
ある特定の実施形態において、本実施形態の組成物及び方法には、少なくとも１つの追加の療法と組み合わされる免疫細胞集団（ＮＫ細胞集団を含む）に関する。追加の治療法は、放射線療法、手術（例えば、乳腺腫瘤摘出術及び乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、ホルモン療法、又は前述の組み合わせである場合がある。さらなる治療法はアジュバント療法又はネオアジュバント療法の形態である場合がある。

いくつかの実施形態において、さらなる治療法は小分子酵素阻害剤（１つ以上）又は転移抑制剤（１つ以上）の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生及び／又は重篤度を軽減するために意図される薬剤（例えば、制吐剤など）など）の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は放射線療法である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は手術である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は放射線療法と手術との組み合わせである。いくつかの実施形態において、さらなる治療法はガンマ線照射である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする治療、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、及び／又は化学予防剤（１つ以上）である。さらなる治療法は、この技術分野において知られている化学療法剤の１つ以上であってもよい。

免疫細胞療法が、さらなる癌療法（例えば、免疫チェックポイント療法など）の前に、その期間中に、その後で、又はそれに対して様々な組み合わせで施される場合がある。施すことが、同時から、数分にまで、数日にまで、数週間にまで及ぶ間隔で行われる場合がある。免疫細胞療法が追加の治療剤とは別個に患者に与えられる実施形態においては一般に、かなりの期間がそれぞれの送達時との間で経過せず、その結果、２つの化合物が依然として、好適な併用効果を患者に及ぼされることが保証されるであろう。そのような場合、患者には抗体療法及び抗癌療法が互いに約１２時間～２４時間又は７２時間の範囲内で、より具体的には互いに約６時間～１２時間の範囲内で与えられ得ることが意図される。いくつかの状況では、処置のための期間を著しく延長することが望ましい場合があり、この場合、数日（２、３、４、５、６又は７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）までがそれぞれの投与の間において経過する。

様々な組み合わせを用いることができる。以下の例では、免疫細胞療法は「Ａ」、抗癌療法は「Ｂ」とする：
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ
Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ
Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ。

本実施形態の任意の化合物又は細胞療法を患者に施すことは、因子の毒性がもし存在するならばそれを考慮したうえで、そのような化合物の投与のための一般的プロトコルに従うこととなる。したがって、いくつかの実施形態において、併用療法に起因し得る毒性をモニタリングする工程が存在する。

（Ａ．化学療法）
広範囲の様々な化学療法剤が本実施形態に従って使用される場合がある。用語「化学療法」は、癌を処置するために薬物を使用することを示す。「化学療法剤」が、癌の処置において投与される化合物又は組成物を含意するように使用される。これらの薬剤又は薬物は、細胞内におけるそれらの活性様式によって、例えば、それらが細胞周期に影響を与えるかどうか、及びどの段階で影響を与えるかによって分類される。代替において、薬剤が、ＤＮＡを直接に架橋し得るか、ＤＮＡ内へのインターカレーションを生じさせ得るか、又は核酸合成に影響を与えることによって染色体異常及び有糸分裂異常を誘導し得るかに基づいて特徴づけられる場合がある。

化学療法剤の例には、下記のものが含まれる：アルキル化剤（例えば、チオテパ及びシクロホスファミドなど）；アルキルスルホナート（例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなど）；アジリジン系化合物（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など）；エチレンイミン系化合物及びメチルメラミン系化合物（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）（例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチイレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチロールメラミンなど））；アセトゲニン類（とりわけ、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン類（例として、合成類似体のトポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（例として、その合成類似体であるアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン）；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例として、合成類似体のＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）類；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド及びウラシルマスタードなど）；ニトロソウレア系化合物（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンなど）；抗生物質、例えば、エンジイン系抗生物質（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアミシンオメガＩＩ）など）；ジネミシン（例えば、ジネミシンＡ）；ビスホスホネート系化合物、例えば、クロドロナートなど；エスペラミシン類；同様にまた、ネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連する色素タンパク質エンジイン系抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オートラルニシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（例として、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣなど）、ミコフェノール酸、ノガラルニシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン及びゾルビシン；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）など）；葉酸類似体（例えば、デノプテリン、プテロプテリン及びトリメトレキサートなど）；プリン類似体（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン及びチオグアニンなど）；ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン及びフロクスウリジンなど）；アンドロゲン類（例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン及びテストラクトンなど）；抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）（例えば、ミトタン及びトリロスタンなど）；葉酸補充剤（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）など）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エポチロン類；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（例えば、メイタンシン及びアンサミトシン類など）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（とりわけ、Ｔ－２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ及びアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル；ゲムシタビン）；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位複合体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなど）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（例えば、レチノイン酸など）；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、並びに上記のいずれかの医薬的に許容され得る塩、酸又は誘導体。

（Ｂ．放射線療法）
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範囲に使用されている他の因子として、γ線、Ｘ線、及び／又は放射性同位体の腫瘍細胞への誘導送達として一般に知られているものが含まれる。他の形態のＤＮＡ損傷因子もまた意図される：例えば、マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び同第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射など。これらの因子のすべてが、ＤＮＡに関して、ＤＮＡの前駆体に関して、ＤＮＡの複製及び修復に関して、また、染色体の組み立て及び維持に関して広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線についての適用量範囲は、長期間（３週間～４週間）にわたっての５０レントゲン～２００レントゲンの１日線量から、２０００レントゲン～６０００レントゲンの単回線量にまで及ぶ。放射性同位体についての適用量範囲は、放射性同位体の半減期、放射される放射線の強度及びタイプ、並びに腫瘍細胞による取り込みに依存して、多岐にわたる。

（Ｃ．免疫療法）
当業者は、さらなる免疫療法が、本実施形態の方法との組み合わせで、又は本実施形態の方法との併用で使用され得ることを理解するであろう。癌処置との関連において、免疫療法剤は一般に、癌細胞を標的とし、破壊するための免疫エフェクター細胞及び免疫エフェクター分子の使用による。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））がそのような一例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面における何らかのマーカーについて特異的な抗体であってもよい。抗体は単独では治療のエフェクターとして役立つ場合があり、又は抗体は、他の細胞を動員して、実際に細胞殺傷に影響を与えることもある。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲート化され、標的化剤として役立つ場合がある。代替において、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的又は間接的のどちらでも相互作用する表面分子を保持するリンパ球である場合がある。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。

抗体－薬物コンジュゲートが、癌治療剤の開発に対する画期的な取り組みとして現れている。癌は世界中で最大の死因の一つである。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞殺傷薬物に共有結合により連結されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチでは、ＭＡｂの、その抗原標的に対する高い特異性が、非常に強力な細胞毒性薬物と組み合わされ、これにより、抗原を高レベルで有する腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装」ＭＡｂがもたらされる。薬物の標的化された送達はまた、正常な組織におけるその曝露を最小限にし、これにより、毒性の低下及び治療指数の改善をもたらしている。ＦＤＡによる２つのＡＤＣ薬物の承認により、すなわち、２０１１年におけるＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）及び２０１３年におけるＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシン又はＴ－ＤＭ１）の承認により、この取り組みが有効であることが証明された。現在では３０を超えるＡＤＣ薬物候補が、癌処置のための臨床試験の様々な段階にある（Ｌｅａｌ他、２０１４）。抗体工学及びリンカー－ペイロード最適化がますます成熟しつつあるので、新しいＡＤＣの発見及び開発は、このアプローチに適した新しい標的の特定及び検証、並びに標的化用ＭＡｂの作製にますます依存している。ＡＤＣ標的のための２つの基準は、腫瘍細胞におけるアップレギュレーションされた／高い発現レベルと、ロバストな内在化である。

免疫療法の１つの態様において、腫瘍細胞は、標的化されやすい何らかのマーカー、すなわち、他の細胞の大部分には存在しない何らかのマーカーを有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらのどれもが、本実施形態との関連において標的化のために好適である場合がある。一般的な腫瘍マーカーには、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、及びｐ１５５が含まれる。免疫療法の１つの代替となる態様が、抗癌作用を免疫刺激作用と組み合わせることである。免疫刺激分子もまた存在しており、これらには、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、γ－ＩＦＮなど）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８など）、及び増殖因子（例えば、ＦＬＴ３リガンドなど）が含まれる。

現時点で検討中又は使用中である免疫療法の例には、免疫アジュバント、例えば、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ジニトロクロロベンゼン及び芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号及び同第５，７３９，１６９号；Ｈｕｉ及びＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ他、１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β及びγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ他、１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ他、１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ他、１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２及びｐ５３（Ｑｉｎ他、１９９８；Ａｕｓｔｉｎ－Ｗａｒｄ及びＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号及び同第５，８４６，９４５号）；及びモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２及び抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ他、１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）がある。１つ以上の抗癌療法が本明細書中に記載される抗体療法とともに用いられる場合があることが意図される。

いくつかの実施形態において、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤である場合がある。免疫チェックポイントはシグナル（例えば、共刺激分子）を強めるか、又はシグナルを弱めるかのどちらもある。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る抑制性の免疫チェックポイントには、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（これはＣＤ２７６としてもまた知られている）、Ｂリンパ球・Ｔリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、これはＣＤ１５２としてもまた知られている）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、並びにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が含まれる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸及び／又はＣＴＬＡ－４を標的とする。

免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、リガンド又は受容体の組換え体などの薬物であってもよく、又は特に、ヒト抗体などの抗体であってもよい（例えば、国際特許公開第２０１５／０１６７１８号；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、１２（４）： ２５２－６４、２０１２；両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。免疫チェックポイントタンパク質の公知の阻害剤又はそのアナログを使用することができ、特にキメラ化、ヒト化又はヒト型の抗体を使用することができる。当業者が知っているように、本開示で言及される特定の抗体のために、代替的及び／又は等価な名称が使用され得る。そのような代替的及び／又は等価な名称は、本開示の文脈において交換可能である。例えば、ラムブロリズマブは、ＭＫ－３４７５及びペムブロリズマブという代替名及び等価名でも知られている。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１及び／又はＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質又はオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許第８７３５５５３号，同第８３５４５０９号、及び同第８００８４４９号に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される方法で使用するための他のＰＤ－１軸アンタゴニストは、米国特許出願第２０１４／０２９４８９８号、同第２０１４／０２２０２１号、及び同第２０１１／０００８３６９号に記載されているような当技術分野で公知であり、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体）である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ及びＣＴ－０１１からなる群より選択される。いくつかの態様において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外又はＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。ニボルマブはＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られており、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ペムブロリズマブは、ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ ３４７５、ラムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ＳＣＨ－９００４７５とも呼ばれ、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１は、ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ－１としても知られ、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ＡＭＰ－２２４は、Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られ、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。

本明細書において提供される方法において標的化され得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全なｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上に見出され、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０又はＣＤ８６に結合すると、「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上に発現され、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８に類似しており、両分子は抗原提示細胞上でＣＤ８０及びＣＤ８６（それぞれＢ７－１及びＢ７－２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４はＴ細胞に抑制性シグナルを伝達するが、ＣＤ２８は刺激性シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４はまた制御性Ｔ細胞にも見出され、それらの機能にとって重要であり得る。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を介したＴ細胞活性化は、Ｂ７分子に対する抑制性受容体であるＣＴＬＡ－４の発現の増加をもたらす。

いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質又はオリゴペプチドである。

本方法での使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（又はそれに由来するＶＨ及び／又はＶＬドメイン）は、当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる。あるいは、当技術分野で認識されている抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号、ＷＯ０１／１４４２４号、ＷＯ９８／４２７５２号；ＷＯ００／３７５０４号（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブとしても知られる；以前はチシリムマブ）、米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１；Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（抗体ＣＰ－６７５２０６）；及びＭｏｋｙｒら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：５３０１－５３０４に開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体は、本明細書に開示される方法において使用することができる。前述の刊行物の各々の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＴＬＡ－４への結合について、これらの当技術分野で認識されている抗体のいずれかと競合する抗体もまた使用することもできる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、国際特許公開第２００１／０１４４２４、国際公開第２０００／０３７５０４号、及び米国特許第８，０１７，１１４号（全て参照により本明細書に組み入れられる）。

例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、及びヤーボイ（登録商標）としても知られる）又はその抗原結合フラグメント及びバリアントである（例えば、国際特許公開第０１／１４４２４号を参照されたい）。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又はＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、並びにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ－４上の上記抗体と同じエピトープとの結合について競合し、及び／又は同じエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、又は９９％の可変領域同一性）を有する。

ＣＴＬＡ－４を調節するための他の分子には、米国特許第５８４４９０５号、同５８８５７９６号及び国際特許出願番号ＷＯ１９９５／００１９９４及びＷＯ１９９８／０４２７５２（全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなＣＴＬＡ－４リガンド及び受容体、並びに米国特許第８３２９８６７号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のようなイムノアドヘシンがある。

（Ｄ．手術）
癌を有する人のおよそ約６０％が、予防的、診断的又は病期分類、治療的及び緩和的な手術を含めて、何らかのタイプの手術を受けることになる。治療的手術は、癌性組織のすべて又は一部が物理的に除かれ、切除され、かつ／又は破壊される摘出を含んでおり、他の治療法との併用で、例えば、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／又は代替療法などとの併用で使用される場合がある。腫瘍摘出は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除くことを示す。腫瘍摘出に加えて、手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術及び顕微鏡下手術（モース術）が含まれる。

癌細胞、組織又は腫瘍の一部又はすべてを切除すると、空洞が体内に形成される場合がある。処置が、灌流、直接注入、又はさらなる抗癌療法による当該部位への局所適用によって達成される場合がある。そのような処置が、例えば、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎若しくは７日毎に、又は１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎及び５週間毎に、又は１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎若しくは１２か月毎に繰り返される場合がある。これらの処置は同様に、様々な適用量のものである場合がある。

（Ｅ．他の薬剤）
処置の治療効果を改善するために、他の薬剤を本実施形態のある特定の態様との組み合わせで使用することが意図される。これらのさらなる薬剤には、細胞表面受容体及びＧＡＰ結合のアップレギュレーションに影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる薬剤、又は他の生物学的薬剤が含まれる。ＧＡＰ結合の数を増加させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、近傍の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大させるであろう。他の実施形態では、処置の抗過剰増殖効果を改善するために、細胞増殖抑制剤又は分化剤を本実施形態の特定の態様との組み合わせで使用することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の効果を改善するために意図される。細胞接着阻害剤の例は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増大させる他の薬剤（例えば、抗体ｃ２２５など）が、処置効果を改善するために本実施形態のある特定の態様との組み合わせで使用され得るであろうことがさらに意図される。

［ＩＸ．本開示のキット］
本明細書に記載される組成物のいずれもがキットに含まれ得る。非限定的な例では、１つ以上の外来的に提供されたインターロイキンを含む細胞、細胞を産生するための試薬、ベクター、及びベクター及び／又はその構成要素を産生するための試薬は、キットに含まれ得る。特定の実施形態では、ＮＫ細胞がキットに含まれてもよく、それらは任意の様式で改変されてもよいし、改変されなくてもよい。そのようなキットは、細胞の操作のための１つ以上の試薬を有していてもよいし、有していなくてもよい。そのような試薬には、例えば、サイトカイン、小分子、タンパク質、核酸、抗体、緩衝液、プライマー、ヌクレオチド、塩、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。１つ以上のサイトカイン及び／又は１つ以上の操作された抗原受容体を発現するベクター、又はいずれかを製造するための試薬を、キットに含めることができる。１つ以上のサイトカインをコードするヌクレオチド、１つ以上の特定の遺伝子をＫＯするためのＣＲＩＳＰＲ試薬をコードするヌクレオチド、自殺遺伝子産物、受容体などが、キットに含まれ得る。サイトカイン、又はモノクローナル抗体を含む抗体などのタンパク質をキットに含めることができる。操作されたＣＡＲ受容体又はＴＣＲ受容体の構成要素をコードするヌクレオチドは、それを生成するための試薬を含めて、キットに含まれ得る。

特定の態様において、キットは、本開示のＮＫ細胞療法、及び別の癌療法も含む。いくつかの場合において、キットは、細胞療法の実施形態に加えて、例えば、化学療法、ホルモン療法、及び／又は免疫療法などの第２の癌療法も含む。キットは、個体の特定の癌に合わせて調整することができ、個体のそれぞれの第２の癌療法を含むことができる。

キットは、本開示の適切に分注した組成物を含み得る。キットの構成要素は、水性媒質中に又は凍結乾燥された形態で、包装され得る。キットの容器手段としては、一般に、構成要素が入れられ得る、好ましくは、適切に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段が挙げられる。２つ以上の構成要素がキットに存在する場合、そのキットは、通常、追加の構成要素が別々に入れられ得る、第２、第３又は他のさらなる容器も含み得る。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、１つのバイアルに含められてもよい。本発明のキットはまた、典型的には、組成物を含めるための手段並びに他の任意の試薬容器を、商業的販売のために厳重に閉じ込められた状態で含む。そのような容器には、所望のバイアルを保持する、射出成形又はブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。

以下の実施例は、本開示の特定の非限定的な態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、開示された主題の実施において良好に機能するように本発明者らによって発見された技術を表すことを、当業者は理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでも開示される主題の精神及び範囲から逸脱することなく、同様又は類似の結果を得ることができることを理解するはずである。

［実施例１ 神経膠芽細胞腫の治療のためのＮＫ細胞免疫療法］
ＮＫ細胞を、神経膠芽細胞腫を処置する能力について試験した。ＮＫ細胞は、患者由来神経膠芽細胞腫幹細胞株（ＧＣＳ）を殺傷することができるが、正常なアストロサイトを殺傷できない（図１）。図１Ｂは、ＧＣＳとアストロサイトとの間の選択的ＮＫリガンドの発現の差異を示す。

ＮＫ細胞は１つ以上のサイトカイン遺伝子（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１）などの特定の所望の遺伝子を発現するように操作することができる。特定のコンストラクトの例を図２に示すが、２Ａエレメントは同じ発現コンストラクト上にあるが、ＩｇＧ１の産生とサイトカインの産生を分離する。これらの具体例において、ヒトＩＬ－１５、ヒトＩＬ－２１、又はヒトＩＬ－１２は、ｐ３５及びｐ４０サブユニットがリンカーで人工的に連結されるように構成される。そのような発現コンストラクトは、ＮＫ細胞内の任意のタイプのベクターに存在し得る。

ＧＳＣの３Ｄ腫瘍スフェロイド培養モデルを用いて、サイトカイン操作ＮＫ細胞の活性を試験した（図３Ａ）。腫瘍スフェロイドモデルは、固形腫瘍塊をシミュレートする。腫瘍細胞増殖及びＮＫ細胞による殺傷の生細胞イメージングを用いて、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）デバイスにおいて殺傷アッセイを行った。記された臍帯血由来サイトカイン操作ＮＫ細胞（赤色、青色及び緑色の線）は、非形質導入ＮＫ細胞（黒色の線）と比較して、患者由来神経膠芽細胞腫幹細胞株に対して優れた殺傷を示した（図３Ｂ）。

ＧＢＭに対するＮＫ細胞のＩｎ ｖｉｖｏ活性を特徴づけた。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｃヌルマウス（各群ｎ＝５）において、ｆｆＬｕｃ＋患者由来神経膠芽細胞腫幹細胞株（５×１０^５）をＮＳＧマウスの右前脳に定位的に移植した。７日後、ＢＬＩイメージングにより腫瘍ができたことを確認した後、マウスに１．０×１０^５個のＮＫ細胞を頭蓋内投与した。ＩＬ－１２形質導入又はＩＬ－２１形質導入（分泌可能）臍帯血ＮＫ細胞で処置された動物は、非形質導入（ＮＴ）ＮＫ細胞で処置された動物と比較して生存率の有意な改善を伴って、腫瘍の著しい退縮（腫瘍がＢＬＩイメージングではもはや検出できない）が見られた（図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃ）。

本開示及びその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義されるような設計の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、及び変更を本明細書で行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、及びステップの特定の実施形態に限定されるものではない。当業者は本開示から、本明細書に記載された対応する実施形態が本開示に従って利用され得るのと実質的に同じ機能を実行するか、又は実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか、又は後に開発される、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、又はステップを容易に理解するのであろう。したがって、添付の特許請求の範囲はその範囲内に、そのようなプロセス、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、又はステップを含むことが意図される。

（参考文献）
本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。すべての特許及び刊行物は各個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
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＜特許及び特許出願＞
European patent application number EP2537416
U.S. Patent Publication No. 2005/0260186
U.S. Patent Publication No. 2006/0104968
U.S. Patent Publication No. 2002131960
U.S. Patent Publication No. 2013287748
U.S. Patent Publication No. 20130149337
U.S. Patent Application No. 2014/0294898
U.S. Patent Application No. 2014/022021
U.S. Patent Application No. 2011/0008369
U.S. Patent No. 5,739,169
U.S. Patent No. 5,801,005
U.S. Patent No. 5,824,311
U.S. Patent Nos. 5,830,880
U.S. Patent No. 5,846,945
U.S. Patent No. 5,844,905
U.S. Patent No. 5,885,796
U.S. Patent No. 6,207,156
U.S. Patent No. 6,410,319
U.S. Patent No. 6,451,995
U.S. Patent No. 7,070,995
U.S. Patent No. 7,109,304
U.S. Patent No. 7,265,209
U.S. Patent No. 7,354,762
U.S. Patent No. 7,446,179
U.S. Patent No. 7,446,190
U.S. Patent No. 7,446,191
U.S. Patent No. 8,008,449
U.S. Patent No. 8,017,114
U.S. Patent No. 8,119,129
U.S. Patent No. 8,252,592
U.S. Patent No. 8,324,353
U.S. Patent No. 8,329,867
U.S. Patent No. 8,339,645
U.S. Patent No. 8,354,509
U.S. Patent No. 8,398,282
U.S. Patent No. 8,479,118
U.S. Patent No. 8,735,553
WO 1995/001994
WO 1998/042752
WO 2000/14257
WO 2000/37504
WO 2001/014424
WO 2009/101611
WO 2009/114335
WO 2010/027827
WO 2011/066342
WO 2012/129514
WO 2013/071154
WO 2013/123061
WO 2013/126726
WO 2013/166321
WO 2014/031687
WO 2014/055668
WO 2015/016718

Claims (29)

1. ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む組成物であって、前記ＮＫ細胞が、１つ以上の外来的に提供されたインターロイキン（ＩＬ）を含み、前記ＩＬがＩＬ－１５ではなく、前記ＮＫ細胞が１つ以上の操作された受容体を含む、組成物。
2. 前記ＩＬが、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－７、リンカーで人工的に連結されたＩＬ－１２のｐ３５及びｐ４０サブユニット、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＩＬが、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１又はその両方である、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記ＩＬが、前記細胞において、分泌されている、繋留されている、又は膜結合されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 外来的に提供されたことが、前記細胞中のベクターから発現されていることとしてさらに定義され、及び／又は、前記ＮＫ細胞が、１つ以上のＩＬの存在下で培養された、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記操作された受容体が、操作された抗原受容体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記操作された抗原受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項６に記載の組成物。
8. 前記抗原が、癌抗原である、請求項６又は７に記載の組成物。
9. 前記抗原が、固形腫瘍抗原である、請求項６～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記抗原が、５Ｔ４、８Ｈ９、α_ｖβ_６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＣＳ１、ＣＬＬ１、ＣＤ９９、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、Ｌ１ＣＡＭ、Ｋａｐｐａ、ＫＤＲ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭｓ、ＨＭＷ－ＭＡＡ及びＶＥＧＦＲ２からなる群より選択される、請求項６～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記操作された受容体が、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体又はホーミング受容体である、請求項６に記載の組成物。
12. 前記ＮＫ細胞が、自殺遺伝子を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記細胞が、ＴＤＡＧ８、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ７及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の内在性遺伝子の発現が減少又は阻害されている、請求項１～１２のいずれか一項記載の組成物。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物を含み、適切な培地中に含まれた、細胞の集団。
15. 個体における癌を治療する方法であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を個体に投与する工程を含む、方法。
16. 前記個体における癌細胞が、ＮＫリガンドの発現が増加している、請求項１５に記載の方法。
17. 前記個体における前記癌細胞が、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５、ＵＬＢＰ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－３又はそれらの組み合わせの発現が増加している、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記癌が固形腫瘍であるか、又は固形腫瘍ではない、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記癌が、肺、脳、乳房、血液、皮膚、膵臓、肝臓、結腸、頭頸部、腎臓、甲状腺、胃、脾臓、胆嚢、骨、卵巣、精巣、子宮内膜、前立腺、直腸、肛門、子宮頸部の癌、又は血液学的な癌である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記癌が、神経膠芽細胞腫である、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記個体が、哺乳動物である、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記個体が、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、又は齧歯類である、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記個体が、１つ以上の追加の癌療法を投与される、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記追加の癌療法が、手術、放射線、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、又はそれらの組み合わせである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記個体において癌を診断する工程をさらに含む、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記細胞を生成する工程をさらに含む、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記細胞が、前記個体に対して自己由来である、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記細胞が、前記個体に対して同種異系である、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記細胞の集団が、頭蓋内に、注射によって、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病変内に、頭蓋内に、経皮的に、皮下に、局所的に、潅流によって、腫瘍微小環境内に、又はそれらの組み合わせで前記個体に投与される、請求項１５～２８のいずれか一項に記載の方法。

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