KR100486784B1

KR100486784B1 - 솔비나무로 부터 추출된 렉틴 단백질, 그의 제조방법 및용도

Info

Publication number: KR100486784B1
Application number: KR10-2002-0026176A
Authority: KR
Inventors: 김하형; 김범수; 공광훈
Original assignee: 김하형
Priority date: 2001-05-22
Filing date: 2002-05-13
Publication date: 2005-04-29
Also published as: WO2002094869A1; US20050084903A1; KR20020089144A; US7045300B2

Abstract

본 발명은 한국산 콩과 식물에 속하는 솔비나무 수피로부터 분리·정제된 렉틴 성분인 MFA 물질, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 이 단백질은 여러 가지의 세포 또는 당단백질의 당말단에서 기능 발현에 중요한 역할을 하는 N-아세틸뉴라민산을 인식하는 능력에 의해 탄수화물 결합단백질에 관한 연구에 있어서 각종 시약으로 활용할 수 있을 뿐만 아니라 발병시 생체내에서 N-아세틸뉴라민산의 분포의 변화를 확인하는데 사용할 수 있고, 유방암, 멜라노마, 간암을 포함하는 각종 암 세포에 대한 세포증식 억제제로서도 활용할 수 있다.

Description

솔비나무로 부터 추출된 렉틴 단백질, 그의 제조방법 및 용도{Lectin protein prepared from Maackia fauriei, process for preparing the same and the use thereof}

본 발명은 한국산 콩과식물(Leguminosae)에 속하는 솔비나무(Maackia fauriei)로 부터 분리·정제된 렉틴 단백질, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 솔비나무의 수피로부터 분리·정제된, N-아세틸뉴라민산에 특이적으로 결합하는 단백질 성분인 렉틴 MFA, 그의 제조 방법 및 분리된 MFA의 생화학적 활성에 기초한 여러 가지 용도에 관한 것이다.

최근, 유전공학이나 단백질공학에 있어서 생체 물질의 구조와 기능을 해석, 제어하는 기술이 급격하게 발전함에 따라 유전자, 단백질 레벨에서 생명 현상의 이해가 진행되고, 그와 동시에 생체에 있어서 올리고당과 같은 당질 역시 생체조절기구의 해명에 중요한 연구 과제로 인식되고 있다. 이와 관련된 연구를 진행시키기 위해서는, 올리고당이 생체의 구조와 기능에 미치는 영향, 세포간 상호 정보전달에 미치는 역할 등에 관한 연구가 종합적으로 연구되어져야 한다.

생체를 구성하는 중요한 성분 중 하나인 올리고당은 단백질 또는 지질과 결합한 당단백질 또는 당지질 같은 복합 분자를 형성하여 세포의 접착, 세포간의 정보전달, 조직 개체의 형태형성 등 개체의 생물활성 유지에 필수 불가결한 기능을 담당하고 있다.

지금까지 알려진 올리고당의 기능은 크게 세 가지를 들 수가 있다. 먼저, 올리고당이 다른 단백질과 결합하여, 그 상호작용으로 인해 세포의 특이적인 인식에 중요한 역할을 하는 것이며, 그 다음으로는 단백질 자신에 결합된 올리고당이 그 단백질 특유의 기능을 현저하게 변하게 하는 경우로 폴리시알산(polysialic acid)과 같이 뇌에 특이적으로 발현하는 올리고당의 세포접착분자인 N-CAM을 예로 들 수가 있다. 세번째로는 대부분의 단백질이 당단백질인데, 그 단백질 자체의 Asn 또는 Ser/Thr을 통하여 올리고당이 결합하고 있어 그 단백질의 기능을 활성화시키는 경우이다. 즉, 올리고당은 그 자체로서 뿐만이 아니라 다른 생체 물질과의 결합에 의해 그 기능의 변화를 초래시킬 수 있는 중요한 물질로 생각할 수 있다.

세포간의 인식은 주로 세포 표면의 당을 통하여 이루어지게 되는데, 이를 원활히 매개하기 위하여서는 당을 인식하는 분자가 세포 표면에 존재하여야 한다. 그 일례로서 세포 표면에 렉틴(lectin)과 같은 당결합 단백질(carbohydrate-binding protein)의 존재가 필요로 하게 된다.

솔비나무(Maackia fauriei)는 콩과 식물에 속하는 낙엽 교목으로 우리나라 특산 식물이며 주로 제주도의 해발 1,100∼1800m에서 다량으로 분포하고 있으나 이에 대한 생화학적 연구 결과는 매우 빈약한 실정이다.

본 발명자들은 솔비나무의 수피로 부터 후술하는 방법에 의해 그 동안 존재가 알려져 있지 않던 단백질 렉틴 MFA를 분리·정제하여 이 물질을 특성화하고 생화학적 활성을 시험한 결과, 이것이 N-아세틸뉴라민산에 특이적으로 결합하는 등 여러 가지 유익한 생화학적 특성을 가짐으로써 각종 당결합 단백질 관련 연구시약과 암세포 증식 억제제 등으로 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 일면에 있어서 본 발명의 목적은 솔비나무(Maackia fauriei)의 수피로부터 추출된, N-아세틸뉴라민산을 인식하는 단백질의 일종인 렉틴 성분인 MFA를 제공하는데 있다.

다른 일면에 있어서 본 발명의 목적은 상기 렉틴 MFA의 제조 방법을 제공하는데 있다.

추가의 일면에 있어서 본 발명의 목적은 상기 렉틴 MFA를 포함하는, 세포내의 당의 구조가 N-아세틸뉴라민산을 포함하고 발병시 그의 분포가 변화하는 경우 이를 감지할 수 있는 진단 시약을 제공하는데 있다.

다른 일면에 있어서 본 발명의 목적은 상기 렉틴 MFA의 암세포에 대한 증식 억제효과를 나타내는 항암제로의 용도를 제공하는데 있다.

더욱 다른 일면에 있어서 본 발명의 목적은 상기 렉틴 MFA의 면역생화학에 의한 연구재료에 있어서 또는 암세포 등의 응집에 있어서의 용도을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명에 관하여 더욱 상세히 설명한다.

렉틴은 탄수화물에 선택적으로 결합하는 단백질로 식물, 미생물, 바이러스, 무척추동물, 척추동물 등에서 분리·정제되어 각종 질병관련 연구의 재료로 널리 활용되고 있으며 현재까지 약 300 여종이 보고되어 있다. 렉틴은 적혈구를 응집시켜 침강시키는 작용이 잘 알려져 있고 혈액형을 분류하기도 하며, 최근에는 암세포를 특이적으로 응집시키는 기능이 밝혀지는 등 다양한 기능을 갖고 있다. 즉, 렉틴은 특정한 구조를 갖고 있는 당과 결합하며, 렉틴성 물질을 갖고 있는 세포와 그것에 결합하는 당을 가지고 있는 세포간의 선택적 정보교환을 성립하게 한다.

렉틴에 관한 연구는 분자 인식을 통한 세포간의 정보 전달에 관한 기구를 해명하는데 중요한 분야로 생각할 수 있으며, 현재 이와 같은 분자 및 세포 레벨에서의 인식기구의 해명을 중심으로 신경계, 면역계, 염증반응 등의 측면에서의 연구와 감염, 질병(암, 류마티즘)과 당과의 관계의 측면에서 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

특히, 암과 관련하여 세포 표면의 당쇄가 실험 모델에 대한 암의 전이성을 결정하는 중요한 인자인 것으로 밝혀졌으며, 이러한 사실은 전이성이 다른 암세포 변이주의 표면 당쇄에 대해 렉틴의 결합성이 다르고, 렉틴을 이용하여 시험관내(in vitro)에서 선별된 암세포에서 전이성이 차이가 나며, 또한 암세포의 당쇄를 수식함으로서 전이성을 변화시킬 수 있는 가능성에 관한 보고 등의 연구 결과로부터 확인되고 있다. 이들 특성은 암세포의 종류와 전이의 표적(target)이 되는 장기를 불문하고 공통적인 성질인 것으로 알려져 있다. 전이 종양은 수술 등의 외과적 치료에 의해 원발 종양이 완전히 제거된 후에도 시간이 경과함에 따라 출현이 빈번해져 악성 종양의 치료를 곤란하게 하는 최대의 원인 중 하나가 된다. 이와 같은 관점에서 최근, 아시알로당단백질(asialoglycoprotein)을 캐리어(carrier)로 이용한 경우와 당쇄 수식 고분자를 이용한 방법, 단백성 의약품의 당 수식에 의한 표적화, 미립자 캐리어에 의한 당쇄 도입 등이 암과 관련되어 연구되고 있다.특히, 전신성 약물 표적화에 빈번히 이용되는 당인식 기구로는 간실질세포 표면에 존재하는 갈락토오스 수용체(galactose receptor), 쿠퍼(kupffer) 세포를 비롯한 각종 대식구(macrophage) 상의 만노오스 수용체(mannose receptor) 등을 들 수가 있고 이들 수용체는 결합성이 대단히 높으며 각 장기 및 세포 특이적인 발현을 하고 있는 것으로부터 이 기구를 이용한 세포 특이적인 약물의 표적화가 기대되고 있다.

최근 류머티즘, 암, 에이즈 발병시 체내 단백질의 올리고당의 구조적 변화가 보고되기 시작하면서 이들 질병의 결과를 올리고당의 구조적 변화로부터 해석하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 특히, 병원균이나 종양의 세포 표면에 있는 시알로컨쥬게이트(sialoconjugate)에서 시알릴 에피토프(sialyl epitope)의 현저한 변화는, 올리고당에 있어서 시알산(sialic acid)의 종류나 인접당과의 당 결합방식에 기인하는 것으로 여겨지고 있다. 따라서 이렇게 다양한 시알산과 그들의 당 결합방식만을 특이적으로 인식하는 렉틴은 병원균과 악성 종양 생검에서의 다양한 시알릴 에피토프를 확인하는데 있어서 유용한 도구로 이용될 수 있다.

시알산(sialic acid)은 N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid)이나 그 C-5 아미노기의 아실 치환체인 N-글리콜릴뉴라민산(N-glycolylneuraminic acid) 등과 같은 유도체 약 30 여개를 통칭하는 화합물이다. 다른 대부분의 시알산은 C-4, C-7, C-8, C-9 하이드록실기 한 개나 그 이상의 O-아세틸 치환체를 갖는다. 이렇게 치환된 시알산은 세포환경에 있어서의 형질전환이나 그밖에 변화를 일으킬 수도 있으며, 세균이나 바이러스의 시알산 가수분해효소를 저해하거나 약하게 하여 그들의 면역능을 변화시켜 복합당질의 이화작용에서의 효소능에 영향을 주는 것으로 알려져 있다.

대부분의 렉틴은 만노오스(D-mannose), 갈락토오스(D-galactose)를 특이적으로 인식하는 것으로 보고되고 있으며, 당의 비환원말단에서 구조적·기능적으로 중요한 역할을 하는 N-아세틸뉴라민산을 특이적으로 인식하는 렉틴은 수종에 불과하다. N-아세틸뉴라민산에 결합하는 렉틴은 Wheat germ agglutinin(WGA, 밀 유래), Maackia amurensis agglutinin(MAA, 다릅나무 유래), Limulus polyphemus lectin(limulin, 투구게 유래), Sambucus niger agglutinin(SNA, 딱총나무 유래) 등이 알려져 있다. 이중 식물 유래 렉틴은 암성장을 저해하는 항암 효과와 발암 물질에 의한 암발생을 억제하는 항종양 효과에 대해서 많은 보고가 있다. WGA와 MAA는 간암, 흑색종, 융모암, 골육암등에 세포독 효과(cytotoxic effect)가 있는 것으로 알려져 있고, 생체내(in vivo)에서는 쥐 복수 종양(murine ascitic tumor)과 쥐 복수murine ascitic lymphoma tumor, 시험관내(in vitro)에서는 인간 비강 격벽암(human nasal septum tumor), 인간 대장 선암(human colon adenocarcinoma), 쥐의 배아암(murine embryonal carcinoma)을 억제하는 효과가 알려져 있다. MAA와 SNA는 인플루엔자 A 바이러스의 리셉터에 선택성이 있는 것으로 보고되고 있다. 또한, WGA는 HIV의 당 구조분석에 이용되기 하였으며 SNA는 간암세포에서 N-아세틸뉴라민산에 대한 동정을 하는데 사용되기도 한다(Abdullaev F. et al. Natural Toxin 5, 157-163, 1997).

또한, 많은 암관련 실험 모델에서 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 당쇄의 증가 또는 극적인 변화와 이에 대응하는 렉틴 결합성의 상승에는 큰 관련이 있다는 사실이 보고되고 있다. 이와 같은 N-아세틸뉴라민산의 증가는 당단백질의 N- 또는 O-결합 올리고사카라이드에서 동시에 보이며 tunicamycin과 같은 당쇄합성 저해제에 의한 당쇄의 형성 저해는 전이성의 저하를 보이고 있으며, 당지질에 있어서도 강글리오사이드류의 증가, 뉴라민산을 다수 포함하는 당쇄의 증가 등이 보이고 있다. 최근에는 동일 암환자로부터 얻은 인간 흑색종 세포주(human melanoma cell line) 중 원발성 종양(primary tumor)의 IGR39와 전이성 림프절(metastatic lymph node) 유래의 IGR37이 렉틴과 강하게 결합한다는 보고가 있으며, HM7 흑색종 세포(melanoma cell)의 원형질막(plasma membrane)으로부터 뮤신형 당단백질(mucin-type glycoprotein)을 분리·정제하는 데에도 렉틴을 세파로스(sepharose)에 결합한 친화 컬럼(affinity column)이 이용되고 있다. 또한, B16F10 흑색종(melanoma)과 루이스 폐암세포 (Lewis lung carcinoma cell)에서 효과적인 검출을 위하여 렉틴에 플루오로크롬(fluorochrome) 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트를 결합시킨 물질을 이용하고 있기도 하다. 한편, 대장암(colon carcinoma)에 대하여 독소루비신(doxorubicin)을 렉틴에 결합시킨 후 산에 불안정한(acid-labile) 화학요법 프로드럭으로 한 캐리어 단백질로서의 가능성을 보고한 예도 있다.

본 발명자들은 자연 생물체로부터 유용성 있는 물질을 탐색하고자 솔비나무를 재료로 선택하여 여러 가지 실험을 수행하였다.

일면에 있어서, 본 발명은 솔비나무의 수피로부터 추출된, N-아세틸뉴라민산을 인식하는 단백질의 일종인 렉틴 성분인 MFA를 제공한다.

상기 렉틴 성분은 전기영동과 질량분석기에 의한 분자량은 약 30.0 kDa이며 겔 여과 크로마토그래피에 의해서는 104,580 Da의 분자량을 가지며 N-말단 아미노산은 서열번호 1의 서열을 가지며, 적혈구응집반응, 적혈구응집저해반응에 의해 N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 당단백질과 결합하는 것으로 밝혀졌다.

다른 일면에 있어서 본 발명은 솔비나무로 부터 렉틴 MFA를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로 이 렉틴 MFA는 솔비나무의 수피의 껍질을 제거하고 잘게 절개한 후 0.15M NaCl 수용액을 가하여 4℃에서 24시간 교반하고, 필터로 침전물을 여과하여 여액을 세파로오스(Sepharose) CL-6B 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 1차 분리하고, 상기 분리액을 페튜인 친화(fetuin-affinity) 컬럼을 통해 상기 단백질 성분을 분리함으로써 제조된다.

추가의 일면에 있어서 본 발명은 상기 렉틴 MFA를 포함하는, 세포내의 당의 구조가 N-아세틸뉴라민산을 포함하고 그 양이 변화하는 경우의 질환을 진단하기 위한 진단 시약으로서의 용도가 제공된다. 이러한 질환의 예로는, 이들에 제한되지는 않고, 간암, 흑색종, 융모암, 골육암, 대장암 등을 들 수 있다.

상기 MFA의 생화학적 활성을 시험한 결과, 이는 단당으로는 N-아세틸뉴라민산에 특이적으로 결합하며 당단백질로는 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 페튜인(fetuin)에 특이적으로 결합한다. 따라서, 이러한 활성에 기초하여 간암, 흑색종, 융모암, 골육암, 대장암 등의 암질환을 진단하기 위한 진단 시약으로서 이용하는 것이 가능하다.

다른 일면에 있어서 본 발명은 상기 렉틴 MFA의 암세포에 대한 증식 억제효과를 나타내는 항암제로서의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 렉틴 MFA 물질은 적혈구응집반응, 적혈구응집저해반응에 의해 확인되는 바와 같이 N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 당단백질을 선택적으로 인식하여 결합하므로 진단제나 캐리어 단백질로도 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 그 자체로서도 후술하는 실시예에서 입증되는 바와 같이 항암 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 렉틴 MFA는 N-아세틸뉴라민산이 존재하는 질환에 있어서 암세포 증식 억제제(또는 항암제)의 유효성분으로서 유효하게 사용될 수 있다. 대상이 되는 질환의 예로는 이들에 제한되지는 않고, 유방암, 멜라노마 또는 간암을 들 수 있다.

본 발명에 따른 암세포증식 억제제의 제약 조성물은 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화할 수 있다. 일반적으로는, 유효 성분을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하고, 또한 필요에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등를 가하고, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 또한 이것을 사용전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로 만들 수 있는 건조품으로 할 수도 있다.

본 발명의 제약 조성물은 경구제나, 주사제, 점적용제 등의 비경구제 중의 어떠한 것에 의해서도 투여할 수 있다.

의약용 담체는 상기 투여형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있고, 경구제의 경우는, 예를 들어 전분, 유당, 백당, 만니톨, 카복시메틸셀룰로스, 콘 스타치, 무기염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는 추가로 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다.

한편, 비경구제의 경우는 통상의 방법에 따라서 본 발명의 유효성분인 렉틴 MFA를 포함하는 조성물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시켜서 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 가함으로써 조제된다.

본 발명의 의약 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여경로로 투여된다. 투여방법은 특히 한정할 필요는 없고, 내용, 외용 및 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 그 제제형태, 투여방법, 사용목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당 예컨대 10㎍∼200㎎/체중㎏이다. 물론 투여량은, 각종 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다.

더욱 추가의 일면에 있어서 본 발명은 국소부위 전달제용 캐리어 단백질로서 상기 렉틴 MFA와, 작동 물질이 항암제로서 선택적 약물이 결합된 약물 결합체를 제공한다. 이러한 항암제의 대상이 되는 질환의 예로는, 이들에 제한되지는 않고, 간암, 흑색종, 융모암, 골육암, 대장암 등을 들 수 있다.

더욱 추가의 일면에 있어서, 본 발명은 상기 렉틴 MFA의 면역생화학에 있어서 연구 재료로서 또는 암세포 등의 응집에 있어서의 용도를 제공한다.

본 발명의 렉틴 MFA 물질은 적혈구응집반응, 적혈구응집저해반응에 의해 확인되는 바와 같이 N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 당단백질을 선택적으로 인식하여 결합하므로 이러한 인식 원리에 기초하여 면역생화학이나 탄수화물 관련연구용 시약이나 또는 암세포 등의 응집 관련 연구에 활용될 수 있다.

이하, 본 발명은 다음의 대표적인 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1: 솔비나무로부터 렉틴 MFA를 포함하는 단백질 용액의 분리

솔비나무를 채취하여 3차 증류수로 세척한 후 줄기의 외피를 제거하고 수피를 잘게 절개하여 0.15M NaCl 용액과 함께 4℃에서 24시간 동안 잘 혼합하였다. 혼합액은 6㎛ 멤브레인 필터로 1차 필터링를 실시하고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 2차 여과를 실시하였다. 여액을 단백질 농축기(Stirred cell, Amicon사 제작)를 이용하여 약 10배로 농축하여 농축액을 취하였다. 농축액은 Sepharose CL-6B 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 이때는 Sepharose CL-6B를 컬럼(Econo Pac column, Bio-Rad)에 흘려 10㎖의 겔을 충진시키고 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl(pH 7.5)로 세척하여 평형화하였다. 여기에 솔비나무 수피 10배 농축액 1㎖를 흘려 얻은 분획 50개의 280nm에서 UV/VIS 분광기로 흡광도를 측정하여 크로마토그램을 작성하였으며 그 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다. Sepharose CL-6B에 의한 크로마토그램에서 후술하는 적혈구응집 활성이 있는 분획(9번-17번)들을 수집하여 MFA를 포함하는 단백질 용액이 분리되었다.

실시예 2: 솔비나무 단백질 용액으로부터 렉틴 MFA의 분리

실시예 1에서 얻어진 단백질 용액 중 1㎖를 페튜인 친화(fetuin-affinity) 컬럼에 적용하여 얻은 분획 70개에 대하여 280nm에서의 UV/VIS 분광기로 크로마토그램을 작성하였으며 그 결과는 도 2에 나타낸 바와 같다. 페튜인 친화 컬럼에 분획을 실은 후 실온에서 1시간 동안 방치하고 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl(pH 7.5)를 천천히 흘려보내면서 1㎖씩 분취하였다. 계속해서 280nm에서 흡광도 값이 0.0이 될 때까지 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl(pH 7.5)를 흘려보냈다. 흡광도 값이 0.1 이상인 8번-16번 분획을 받았으며 이들은 렉틴성분이 아님을 후술하는 적혈구응집반응에 의해 확인하고 흡광도 값이 완전히 0.0이 된 36번 분획부터는 50mM glycine buffer(pH 3.0)을 빠르게 흘려보내며 1㎖씩 분취한 후, 곧바로 1M Tris-HCl(pH 8.5)로 중성화하였다. 그러나 이들 분취된 분획들에 대하여서는 280nm에서 흡광도를 측정한 결과 결합된 렉틴이 분리되어 나오지 않는다는 사실을 확인하였다. 계속해서 분획 46번 부터는 fetuin-affinity 컬럼에 0.1N NaOH 용액을 빠르게 흘려보내며 1㎖씩 분취한 후, 곧바로 1.5N HCl로 중성화하였다. 이들 분취된 분획들에 대하여 280nm에서 흡광도를 측정한 결과, 53번-58번 분획에서 높은 흡광도를 나타내었다. 또한, 이들 분획들에 대하여 후술하는 적혈구응집반응 실험을 실시한 결과, 높은 활성을 갖는 렉틴임을 확인하였다.

실시예 1과 실시예 2에 의해 얻어진 렉틴 MFA의 정제 단계별 총단백질양, 활성, 회수율의 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

	총 단백질양(mg/ml)	활성(unit/1mg/ml)	MFA 회수율(%)
단백질 추출액	525.0	731	100.0
단백질 농축액	245.0	1170	46.7
Sepharose Cl-6B 컬럼9번-17번 분획(단백질 용액)	147.0	1707	28.0
Fetuin-affinity 컬럼53번-58번 분획(MFA)	25.5	1969	4.9

상기 표 1에서 활성은 1mg/ml의 단백질에 포함된 렉틴의 unit를 나타내며, unit는 적혈구 응집반응을 일으킨 희석 배수를 나타낸다. 솔비나무 단백질 추출액에서 최종 MFA의 회수율은 단백질 추출액으로부터 4.9%로 나타났다.

실시예 3: 렉틴 MFA의 순도 및 분자량 확인

실시예 1에서 얻어진 Sepharose CL-6B 9번-17번 분획, 즉 fetuin-affinity 컬럼에 통하기 전 분획(A), fetuin-affinity 크로마토그래피에 의해 얻어진 렉틴 성분인 53번-58번 분획(B)(이는 실시예 4와 실시예 5와 동일한 방법에 의해 렉틴 MFA 성분으로 밝혀짐), fetuin-affinity 컬럼에 결합하지 않은 미결합의 8번-16번 분획(C)에 대해 분자량 및 순도를 확인하기 위하여 전기영동, 겔 여과 크로마토그래피 및 MALDI-TOF 질량분석기를 적용하였다.

먼저, 상기에 나타낸 A, B, C 분획에 대해 0.1%의 SDS를 포함하는 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 실시하여 분자량 표준 물질과 비교하였다. 전개 완료 후에는 단백질 밴드를 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색 시약으로 염색하였다. 이 실험 결과를 도 3에 나타냈다. 도 3에 있어서, 레인 1은 분자 마커 (kDa)이고; 레인 2는 솔비나무 SepharoseCL-6B 분획(상기 A에 해당)이며; 레인 3은 분리된 솔비나무 렉틴 MFA이고(상기 B에 해당); 레인 4는 fetuin-affinity 컬럼 미결합 분획(상기 C에 해당)이다.

도 3의 전기영동 사진 결과로부터 확인되는 바와 같이 약 30.0kDa의 분자량을 갖는 1개의 밴드가 확인되어 순수한 상태의 렉틴이 분리되었음을 확인하였다.

한편, Superdex 200 HR 겔 여과 컬럼(Pharmacia)에 의해 10mM phosphate buffer, 150mM NaCl(PH 7.2)을 용매로 하여 유속 0.5ml/min으로 크로마토그래피를 실시하고, 그 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4에 있어서 (a)는 솔비나무 Sepharose CL-6B 분획(상기 A에 해당)이며; (b)는 분리된 솔비나무 렉틴 MFA이고(상기 B에 해당); (c)는 fetuin-affinity 컬럼 미결합 분획(상기 C에 해당)이다. 겔 여과 걸럼에 의해서도 렉틴성분인 B는 단일 피크를 나타내었으며 fetuin-affinity 컬럼에 결합하지 않은 불순물 C는 fetuin-affinity 컬럼 분리전인 A로부터 완전히 제거되었음을 나타냈다.

또한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 얻어진 분획의 분자량을 분자량 표준물질(200, 150, 66, 29, 12.4 kDa)과 비교하여 Ve/Vo(elution volume/elution volume for blue dextran)로부터 분자량을 확인한 결과 분자량이 104,580 Da임을 확인하였고, 그 결과는 도 5와 같다.

MALDI-TOF 질량분석기(제조원: Perceptive ; 제품명: Voyager^TM RP)를 사용하여 제조원의 지시에 따라 수행하여 분자량을 측정한 결과 29132.2 m/z의 값을 얻었으며 그 결과는 도 6에 나타낸 바와 같다.

상기 전기영동, 겔 여과 크로마토그래피, 질량분석기의 결과로부터 렉틴 MFA는 전지영동상 약 30.0 kDa, 질량분석기에 의해서는 29,132.2Da의 분자량을 가지며 겔여과 크로마토그래피 상에서는 104,580 Da의 분자량을 갖고 있음을 확인하였다.

실시예 4: 렉틴 MFA의 N-말단 아미노산분석

솔비나무 렉틴 MFA의 N-말단 아미노산을 아미노산서열분석기(제조원: Applied Biosystems; 제품명: Automatic Protein Sequencer, 476A-01-120)를 사용하여 제조원의 지시에 따라 수행하여 분석한 결과, 이 서열은 N-말단에서 Ser-Asp-Glu-Leu-Ser-Phe-Asn-Ile-Asn-Asn-Phe-Val-Pro-Asn-Gln-Ala-Asp- Leu-Leu-Phe(서열번호 1)을 포함하는 것으로 확인되었다.

실시예 5: 렉틴 MFA의 적혈구응집반응

실시예 2에서 얻어진 크로마토그램에서 분취한 53번-58번 분획을 이용하여 사람, 마우스, 렛트, 토끼의 혈청을 6.25%가 되도록 10mM 인산염 완충액(phosphate buffer), 0.15M NaCl(pH 7.2)로 희석하여 적혈구 응집반응을 실시하였다. 이 반응에서 양성을 보이는 분획을 모아 실시예 3에 나타낸 바와 같이 전기영동과 겔 여과 크로마토그래피를 실시한 결과, 이는 단일 밴드의 단일 물질임을 확인하고 이 부분을 MFA(Maackia fauriei agglutinin)로 명명하였다. 사람 A, B, O형, 개, 마우스, 랫트, 토끼의 적혈구를 상기와 동일한 방법으로 희석하여 100 ㎕를 렉틴 PPA 100 ㎕와 함께 실온에서 방치하고 적혈구응집 여부를 확인하였다. 그 결과 N-아세틸뉴라민산만을 구조로 하는 사람의 적혈구는 응집이 되었다. 그러나 적혈구 중에 N-글리콜릴뉴라민산을 포함하는 마우스, 랫트의 적혈구는 1024배, 토끼의 적혈구는 128배 희석한 경우까지 응집을 일으켰으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

적혈구	존재하는 시알산 종류	최소 적혈구 응집저해 활성
사람 A형	NeuAc	256
사람 B형	NeuAc	256
사람 O형	NeuAc	256
마우스	NeuGc, NeuAc, O-아세틸시알산	1024
랫트	NeuGc, NeuAc, O-아세틸시알산	1024
토끼	NeuGc, NeuAc, O-아세틸시알산	128
주 : 최소적혈구응집 저해활성의 숫자는 6.25%로 희석한 각종 적혈구에 대해 렉틴 MFA를 2배씩 희석하여 얻어지는 최소 적혈구 응집저해 희석배수를 나타내며, NeuGc는 N-글리콜릴뉴라민산, NeuAc는 N-아세틸뉴라민산을 나타냄.

이 결과는 MFA가 N-아세틸뉴라민산을 선택적으로 인식한다는 사실을 나타내며, 사람의 적혈구에서는 렉틴 MFA를 256배 희석농도까지 응집을 저해하여 렉틴 원액이 약 1 ㎍/㎖의 농도인 경우 응집이 일어나는 최소농도이므로 약 256㎍/㎖의 농도로 존재함을 나타낸다.

실시예 6: 렉틴 MFA의 적혈구응집저해반응

본 발명의 렉틴 MFA가 N-아세틸뉴라민산을 인식하는 사실을 확인하기 위하여 단당, 이당, 당단백질을 이용한 적혈구응집저해반응을 실시하였다. 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 0.15M NaCl로 용해되어 있는 PPA 렉틴을 128배로 희석한 용액 50 ㎕와 각종 단당류(β-D-글루코오스, D-갈락토오스, L-푸코오스, D-만노오스, N-아세틸뉴라민산, N-글리콜릴뉴라민산, N-아세틸-D-글루코자민, N-아세틸-D-갈락토자민, 메틸-α-D-글루코피라노사이드), 이당류(α-락토오스, β-락토오스, D-락토오스, β-젠티오비오스, 말토오스, D-라피노오스, D-셀로비오스, N-아세틸락토자민) 및 당단백질(페튜인, 아시알로페튜인)을 0.15M NaCl에 용해시킨 용액 50 ㎕를 각각 넣고, 실온에서 1시간 이상 반응시킨 후, 다시 0.15 M NaCl로 현탁된 적혈구 50 ㎕를 각 웰에 넣고, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 결과 단당으로는 N-아세틸뉴라민산, 당단백질로는 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 페튜인만이 응집을 저해하였고 그 이외의 단당, 이당, 당단백질은 응집을 저해하지 않았으며 그 결과는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.

분류	탄수화물	시알산 종류	최소적혈구응집저해농도
단당류	β-D-글루코오스	-	－
	D-갈락토오스	-	－
	L-푸코오스	-	－
	D-만노오스	-	－
	N-아세틸뉴라민산	NeuAc	10.0mM
	N-아세틸-D-글루코자민	-	－
	N-아세틸-D-갈락토자민	-	－
	메틸-α-D-글루코피라노시드	-	－
이당류	α-락토오스	-	－
	β-락토오스	-	－
	D-락토오스	-	－
	β-젠티바이오스	-	－
	말토오스	-	－
	D-라피노오스	-	－
	D-셀로비오스	-	－
	N-아세틸락토자민	-	－
당단백질	페튜인	NeuAc	5.2μM
	아시알로페튜인	-	－

상기 표 3에 있어서, 적혈구 응집저해 최소농도는 최소적혈구응집저해를 나타낸 마우스의 6.25% 적혈구를 대상으로 MFA가 최소 응집을 나타낸 128 배로 희석하고 단당류, 이당류, 당단백질을 각 농도별로 조제후 2 배씩 희석하여 응집 저해를 나타내는 최소 농도를 나타내며, -는 응집저해를 보이지 않음을 나타낸다. 단당류와 이당류(N-아세틸락토자민 제외)는 100mM, 아시알로페튜인은 100 μM에서도 응집저해를 나타내지 않았으며, N-아세틸락토자민은 10mM에서 응집저해를 나타내지 않았다. NeuGc는 N-글리콜릴뉴라민산, NeuAc는 N-아세틸뉴라민산을 나타냄.

실시예 7: 렉틴 MFA의 아미노산조성분석

솔비나무 렉틴 MFA의 아미노산 조성 분석을 위하여 아미노산조성 분석기(제조원: Pharmacia; 제품명: Biochrom 20 Auto-amino acid analyzer)를 사용하여 제조원의 지시에 따라 수행하여 분석한 결과는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.

아미노산	조성(%)
Asx	12.2
Glx	5.6
Ser	10.5
Thr	8.5
Pro	5.9
Gly	5.7
Ala	8.2
Cys	0.8
Val	9.8
Met	0.0
Ile	6.1
Leu	8.1
Tyr	3.4
Phe	7.8
His	1.6
Lys	3.1
Arg	2.6

Asx는 아스파라긴산, 아스파라긴을 나타내며. Glx는 글루타민산, 글루타민을 나타냄.

실시예 8: N-아세틸뉴라민산 결합 렉틴의 결합력 비교

기존에 이미 N-아세틸뉴라민산을 인식하는 렉틴으로 보고된 밀 배(Wheat germ) 응집소(agglutinin), 다릅나무(Maackia amurensis) 응집소, 투구게(Limulus polyphemus) 렉틴, 딱총나무(Sambucus niger) 응집소와 MFA와의 결합력을 10mM N-아세틸뉴라민산과 N-아세틸뉴라민산이 결합된 페튜인을 이용하여 적혈구응집 저해반응을 실시한 결과, 10mM N-아세틸뉴라민산의 경우에는 MFA에서만이 응집저해를 나타냈으며, 페튜인의 경우에는 MFA가 가장 낮은 농도에서 응집저해를 나타내는 것으로 나타났으며 그 결과는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.

렉 틴	최소응집저해농도
렉 틴	N-아세틸뉴라민산	페튜인
밀 배 유래 응집소	-	207 μM
다릅나무 유래 응집소	-	10.4 μM
투구게 유래 렉틴	-	10.4 μM
딱총나무 유래 응집소	-	12.9 μM
MFA	10.0mM	5.2 μM

상기 표 5에 있어서, 적혈구 응집 저해최소농도는 최소적혈구응집저해를 나타낸 사람 B형 6.25% 적혈구를 대상으로 최소 응집을 나타낸 농도를 나타내며, -는 10mM에서도 응집저해를 보이지 않음을 나타냄.

실시예 9: 렉틴 MFA의 2가 양이온에 의한 영향

일반적으로 렉틴은 Ca²⁺ 또는 Mn²⁺ 이온이 제거되면 활성이 없어지는 것으로 알려져 있으며 이를 확인하기 위하여 솔비나무 렉틴 MFA을 0.1M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)로 투석후 10mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.15M NaCl로 3회 투석을 실시하고 CaCl₂ 와 MnCl₂를 0-50mM씩 가하여 그 영향을 확인하였다. 그 결과 표 6에 나타난 바와 같이 EDTA에 의해 Ca²⁺ 또는 Mn²⁺ 이온이 제거된 솔비나무 렉틴 MFA는 활성을 나타내지 않았으나 25mM CaCl₂, 25mM MnCl_2,또는 25mM CaCl₂ 과 25mM MnCl_2, 첨가에 의해 그 활성이 100% 재생되었다.

양이온	농도	활성
CaCl₂	3.125mM6.25mM12.5mM25mM50mM	40%60%80%100%100%
MnCl₂	3.125mM6.25mM12.5mM25mM50mM	60%80%90%100%100%
CaCl₂ + MnCl₂	3.125mM6.25mM12.5mM25mM50mM	70%70%90%100%100%

실시예 10: 렉틴 MFA의 온도에 의한 영향

솔비나무 렉틴 MFA의 온도에 의한 활성을 확인하기 위하여 4℃, 15℃, 25℃37℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃에서 1시간 방치후 그 활성을 확인한 결과 표 7에 나타낸 바와 같이 50℃이하에서는 100%의 활성을 나타냈다.

온도	활성
4℃15℃25℃37℃45℃50℃55℃60℃	100%100%100%100%100%100%50%50%

실시예 11: 렉틴 MFA의 pH변화에 따른 영향

솔비나무 렉틴 MFA의 pH 변화에 따른 영향을 확인하기 위하여 25mM KCl-HCl (pH 1.96, 3.16), 20mM glycine-HCl (pH 4.04, 5.63, 6.00), 20mM Tris-HCl (pH 7.34, 9.06), 25mM sodium carbonate-HCl (pH 10.08, 10.89)에서 그 활성을 확인한 결과 표 8에 나타낸 바와 같이 pH 4.04 ∼ pH 7.34에서는 100%의 활성을 나타냈다.

완충액 (pH)	활성
25mM KCl-HCl (pH 1.96) 25mM KCl-HCl (pH 3.16)20mM glycine-HCl (pH 4.04)20mM glycine-HCl (pH 5.63)20mM glycine-HCl (pH 6.00)20mM Tris-HCl (pH 7.34)20mM Tris-HCl (pH 9.06)25mM sodium carbonate-HCl (pH 10.08)25mM sodium carbonate-HCl (pH 10.89)	10%10%100%100%100%100%50%50%10%

실시예 12: 렉틴 MFA의 암세포 증식억제 효과

암세포에 대한 증식 억제 효과를 MTT (3-[4,5-dimethyldiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay를 이용하여 실시하였다(MosmannT et al. J. Immunol. Methods 65, pp 55-63 (1983)). 각 암세포를 RPMI 1640 90%, FBS(fetal bovine serum) 10% 배지에서 배양후 헤마토사이토미터를 이용하여 그 수가 100㎕에 약 1×10⁴임을 확인한 후 96 웰 플레이트에 넣고 8, 0.8, 0.08 μM 렉틴 MFA 100㎕를 가하고, 이를 5% CO₂를 유지하는 37℃ 인큐베이터에 72시간 동안 방치하였다. 그리고 MTT 시약을 각 웰 당 50㎕씩 넣고 4시간 동안 CO₂인큐베이터에 방치한 후 상징액을 버리고 150㎕의 디메틸 술폭시드를 가하고 10분간 혼합한 후 마이크로플레이트로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실험 조건에서 렉틴 MFA를 가하지 않고 동일한 방법으로 실험을 실시한 경우를 대조군으로 하고, 이를 100%로 하여 렉틴 MFA를 가한 경우와의 상대적인 비교를 통해 감소비율을 확인하였으며, 동일한 실험을 3회 반복하여 감소비율을 평균값±표준편차값으로 나타냈다. 그 결과 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 렉틴 MFA는 사람 사람 유방암 MCF-7, 사람 멜라노마 G-361, 사람 간암 SNU-449에 대해 농도 의존적으로 세포증식 억제 효과를 나타냈다.

암세포 유래	암세포 일반명	배지조성	렉틴 MFA의 농도	암세포증식 억제%
사람 유방암	MCF-7	RPMI 1640 90%, FBS 10%	8 μM0.8 μM0.08 μM	54.1±3.9 %36.4±5.9%12.6±2.9%
사람 멜라노마	G-361	RPMI 1640 90%, FBS 10%	8 μM0.8 μM0.08 μM	33.2±8.7 %23.6±2.6%3.3±1.3%-
사람 간암	SNU-449	RPMI 1640 90%, FBS 10%	8 μM0.8 μM0.08 μM	35.6±1.7 %17.5±1.0%7.2±0.7%

실시예 13: 제약학적 제제

제형의 형태(정제)

유효성분(렉틴MFA) 10 mg

락토오스 80 mg

전분 17 mg

스테아르산 마그네슘 3 mg

결정성 셀룰로오스 10 mg

정제들은 통상의 방법에 의해 제조하였으며 상기한 성분들을 한 정제에 원료로서 함유하였다. 정제들은 통상의 장용피(예, 히드록시프로필메틸세룰로오스 프탈레이트), 당 코팅 또는 필름(에틸 세룰로오스)를 필요시 가할 수 있다.

본 발명에 따라, N-아세틸뉴라민산을 특이적으로 인식하는 렉틴 MFA를 사용하여 N-아세틸뉴라민산을 인식하는 원리에 기초한 탄수화물 관련연구용 시약으로 활용할 수 있으며 N-아세틸뉴라민산의 분포가 변하는 질환의 진단 및 항암제를 렉틴에 결합시켜 부작용을 최소화한 선택적 약물의 국소부위에의 전달을 위한 캐리어 단백질뿐만 아니라 유방암, 멜라노마, 간암에 대해 암세포 증식 억제제로도 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 제조된 렉틴 MFA를 포함하는 추출액의 Sepharose CL-6B 컬럼에 의한 UV(280nm) 분광분석 크로마토그램과 적혈구응집반응을 나타낸 그래프도.

도 2는 본 발명의 방법에 따라 제조된 렉틴 MFA의 페튜인 친화(fetuin-affinity) 컬럼에 의한 UV(280nm) 분광분석 크로마토그램과 적혈구응집반응을 나타낸 그래프도.

도 3은 본 발명의 방법에 따라 제조된 렉틴 MFA의 전기영동 결과를 나타내는 사진. 레인 1: 분자 마커 (66, 45, 36, 29, 24, 20.1, 14.2 kDa); 레인 2 : 솔비나무 Sepharose CL-6B 분리액(분획 9-17번); 레인 3: 페튜인 친화(fetuin-affinity) 컬럼에 의해 분리된 솔비나무 렉틴 MFA(분획 53-58번); 레인 4: 페튜인 친화(fetuin-affinity) 컬럼에 의해 미결합된 분리액(분획 8-16번).

도 4는 본 발명의 방법에 따라 제조된 렉틴 MFA의 겔 여과 컬럼에 의한 UV(280nm) 분광분석 크로마토그램을 나타낸 그래프도. 그래프 (a): 솔비나무 Sepharose CL-6B 분리액(분획 9-17번); 그래프 (b): 페튜인 친화 컬럼에 의해 분리된 솔비나무 렉틴 MFA(분획 53-58번); 그래프 (c): 페튜인 친화컬럼에 의해 미결합된 분리액(분획 8-16번).

도 5는 본 발명의 방법에 따라 제조된 렉틴 MFA의 겔 여과 컬럼에 의해 얻어진 분자량을 나타낸 그래프도. 분자 마아커 (200, 150, 66, 29, 12.4 kDa).

도 6은 본 발명의 방법에 따라 제조된 렉틴 MFA의 MALDI-TOF 질량분석기에 의한 분자량을 나타내는 그래프도.

<110> KIM, Ha-Hyung <120> Lectin protein prepared from Maackia fauriei, process for preparing the same and the use thereof <130> P01-0041 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Maackia fauriei <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> N-terminal <400> 1 Ser Asp Glu Leu Ser Phe Asn Ile Asn Asn Phe Val Pro Asn Gln Ala 1 5 10 15 Asp Leu Leu Phe 20

Claims

전기영동과 질량분석기에 의한 분자량은 30.0 kDa이며, N-말단 아미노산이 서열번호 1의 서열을 갖는 것인 솔비나무(Maackia fauriei)로 부터 추출된 렉틴 성분인 MFA(Maackia fauriei agglutinin) 단백질.
제1항에 있어서, 적혈구응집반응, 적혈구응집저해반응에 의해 N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸뉴라민산을 포함하는 당단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는MFA 단백질.
솔비나무의 수피를 채취하여 외피를 제거하고 잘게 절개하는 단계, 여기에 NaCl 수용액을 가하여 혼합한 후 필터로 혼합물을 여과하는 단계, 여액을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 단백질 성분을 포함하는 분획을 얻는 단계 및 얻어진 단백질 분획에 페튜인 친화 크로마토그래피를 적용하는 단계를 포함하는 솔비나무로부터 렉틴성분인 MFA를 제조하는 방법.
세포내의 당의 구조가 N-아세틸뉴라민산을 포함하고 발병시 그의 분포가 변화하는 것을 감지할 수 있는 제1항에 따른 렉틴 MFA를 포함하는 진단 시약.
국소부위 전달제용 캐리어 단백질로서 제1항에 따른 렉틴 MFA와 작동 물질로서 선택적 약물이 결합된 약물 결합체.
삭제
제1항에 따른 렉틴 MFA를 유효성분으로 하는 암세포 증식 억제제.
제7항에 있어서, 상기 암이 유방암, 멜라노마, 간암인 암세포 증식 억제제.