JP7066613B2 - グリカン相互作用化合物および使用方法 - Google Patents

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Description

本開示は、グリカン相互作用化合物、例えば、抗体、ならびに生物からのグリコシル化された物質を検出および／または除去するためのこのような化合物および関連する組成物の開発のための方法に関する。本発明はまた、異常なグリコシル化に関連する疾患、例えば、がんを、本明細書において提示するグリカン相互作用化合物および組成物で処置する方法に関する。
異常なグリコシル化は、癌腫において一般に観察される他の変異のいくつかを伴う。全ての癌腫の約８０％は、切断型グリカンであるＴｎ抗原、およびシアル酸付加形態であるシアリルＴｎ（ＳＴｎ）を発現していると推定される。殆ど例外なく、ＴｎおよびＳＴｎは、正常な健常組織において発現していない。さらに、非ヒト免疫原性シアル酸であるＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）は、Ｎｅｕ５Ｇｃ－ＳＴｎ（ＧｃＳＴｎ）の形態で癌腫、例えば、乳がん上で異なって発現しているように思われる。
複数の異常なグリコシル化形態がヒトがんにおいて記載されてきており、特異的腫瘍ターゲッティングに適した細胞表面分子の１クラスとして特定のグリカンが同定されてきた（（非特許文献１））。例えば、様々なヒトがんタイプ（例えば、とりわけ、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、肺、および卵巣がん）は、正常なヒト組織においてまれであるＳＴｎ抗原が高発現していることが示される（（非特許文献２）；（非特許文献３））。さらに、腫瘍関連ムチン上のＳＴｎの存在は、予後不良を伴うがんと関連し、それによって、がん検出および標的療法のための魅力的なエピトープと考えられる（（非特許文献４）；（非特許文献５）；（非特許文献６）；（非特許文献７）；（非特許文献８））。ＴｎおよびＳＴｎ形成は、活性Ｔ－シンターゼの形成に必要とされる分子シャペロンをコードする遺伝子Ｃｏｓｍｃにおける体細胞変異と関連する（（非特許文献９）；（非特許文献１０））。これはまた、シアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ－Ｉの発現の増加に起因し得る（（非特許文献１１）；（非特許文献１２））。ＳＴｎの新規の発現は、癌腫細胞をモジュレートし、悪性の表現型を変化させ、より攻撃的な細胞挙動をもたらし得る（（非特許文献１３））。ＳＴｎは悪性組織において高度に発現しているが、健康なヒト細胞上では低レベルがまた見出される（（非特許文献１４）；（非特許文献１５））。ＳＴｎ単独は、がん検出および治療のための標的として注目を集めてきた（（非特許文献１））。ＳＴｎはまたがん幹細胞と関連するムチンにおいて存在し（（非特許文献１６））、ＳＴｎは免疫抑制において結び付けられている（（非特許文献１７））。
ＳＴｎの存在に加えて、他のグリコシル化の変化ががんにおいて記載されてきた。これらの１つは、Ｎｅｕ５Ｇｃが関与する。Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）およびＮｅｕ５Ｇｃは、哺乳動物細胞表面上の２つの主要なシアル酸である。Ｎｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃは、Ｎｅｕ５Ｇｃが炭素５に付着している化学基と会合しているさらなる酸素原子を含むことのみが異なる。機能性遺伝子の喪失によって、ヒトは、Ｎｅｕ５ＧｃではなくＮｅｕ５Ａｃの形態のシアル酸のみ合成することができる。しかし、Ｎｅｕ５Ｇｃは、動物に由来する食事源、例えば、赤肉からヒトに代謝的に組み込むことができる（（非特許文献１８）；（非特許文献１９）；（特許文献１）、（特許文献２）、（特許文献３）、（特許文献４）および（特許文献４））。Ｎｅｕ５Ｇｃは、ヒト腫瘍において有意に豊富であり（（非特許文献２０）；（非特許文献２１）；（非特許文献２２）；（非特許文献２３）；（非特許文献２４）；（非特許文献２５）および（非特許文献２６））、正常なヒト組織において著しく低く、これは数十年の間見過ごされてきた（（非特許文献２７）；（非特許文献２８）；（非特許文献２９））。健康なヒト組織と比較したがん組織における食事に由来するＮｅｕ５Ｇｃの代謝性蓄積の増加は、少なくとも３つの要因によって恐らく説明される。競合する内因性Ｎｅｕ５Ａｃの産生不足を伴う急速な成長、成長因子によって誘発されるマクロピノサイトーシスの増進（（非特許文献３０）；（非特許文献３１）；（非特許文献３２）；（非特許文献３３））、および低酸素によるリソソームのシアル酸輸送体遺伝子であるシアリンの遺伝子発現のアップレギュレーション（（非特許文献３４））。さらに、現在までに試験された全てのヒトは、非ヒトＮｅｕ５Ｇｃに対するポリクローナル抗体のレザバーを含み、これによってＮｅｕ５Ｇｃは異種自己抗原の第１の例となっている（（非特許文献３５）；（非特許文献３６））。抗Ｎｅｕ５Ｇｃ応答にも関わらず悪性腫瘍における食事性のＮｅｕ５Ｇｃの蓄積は、低悪性度慢性炎症を誘発することによって腫瘍進行を促進することが示された（（非特許文献３７））。このように、ヒト腫瘍上のＮｅｕ５Ｇｃ含有グリカンエピトープは、薬物ターゲッティングのための貴重な可能性を表す。最近の研究は、がん患者における、Ｎｅｕ５Ａｃ－ＳＴｎ（ＡｃＳＴｎ）ではなく、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有ＳＴｎ（ＧｃＳＴｎ）に対する抗体の存在を示唆し、がん検出のための特異的バイオマーカーとしてのこれらの可能性を探究している（（非特許文献３８））。
米国特許第７，６８２，７９４号明細書 米国特許第８，０８４，２１９号明細書 米国特許出願公開第２０１２／０１４２９０３号明細書 国際公開第２０１００３０６６６号
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疾患ならびに異常細胞および組織と関連するグリカンを含めたグリカンを結合することができる治療用抗体が当技術分野で依然として必要とされている。さらに、このような抗体、および異常細胞および組織を標的とするこれらの抗体を使用する方法を開発するより良好な方法が依然として必要とされている。本開示は、関連する化合物および方法を提供することによって、これらの必要性を満たす。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１１４～１２０、１４０、および１４１からなる群から選択されるアミノ配列と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＣＤＲ－Ｈ３相補性決定領域を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する抗体を提供する。ＶＨは、配列番号１０５、１０６、および１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ－Ｈ１、ならびに配列番号１０７～１１３、および１３７～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するＣＤＲ－Ｈ２を含み得る。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号８９、９１、９３、９５～９８、１０１～１０３、１３３～１３５、および１４８からなる群から選択されるアミノ配列と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＣＤＲ－Ｌ３を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ＶＬは、配列番号１２１～１２９、および１４２～１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ－Ｌ１、ならびに配列番号７７、７９～８１、８３～８６、８８、１３０～１３２、および１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ－Ｌ２を含み得る。抗体は、配列番号２０６～２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を有し得る。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２２０～２２４、２３０～２３４、２３７～２４１、２４９～２５３、および２５６～２６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するＶＨを含む。抗体は、配列番号２１７～２１９、２２５～２２９、２３５、２３６、２４２～２４８、２５４、および２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するＶＬを含み得る。ＶＨは、配列番号２２０～２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し得、ＶＬは、配列番号２１７～２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。ＶＨは、配列番号２３７～２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し得、ＶＬは、配列番号２３５および２３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプであり得る。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であり得る。抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体であり得る。
一部の実施形態では、本開示は、記載されている抗体をコードし得る構築物を提供する。構築物を含み得る細胞をさらに提供する。構築物は、ベクター中に含まれ得る。一部の実施形態では、本開示の抗体をコードする構築物を含む細胞から産生される抗体を提供する。
一部の実施形態では、約０．０１ｎＭ～約３０ｎＭの最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を伴って細胞関連ＳＴｎに結合する抗体を提供する。
一部の実施形態では、抗体は、治療剤にコンジュゲートし得る。治療剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される細胞毒性剤であり得る。抗体は、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭの最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を伴ってＳＴｎ関連細胞を死滅させることができ得る。
一部の実施形態では、開示されている抗体を投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。がんは、少なくとも１つの腫瘍を含み得る。腫瘍の体積は、処置によって低減し得る。腫瘍サイズの低減は、少なくとも２０％であり得る。腫瘍は、少なくとも１種の腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）を含み得る少なくとも１個の腫瘍細胞を含み得る。ＴＡＣＡは、シアリル（α２，６）Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）を含み得る。がんは、乳がん、結腸がん、膵臓がん、肺がん、子宮頸がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、および肝臓がんの１つもしくは複数を含み得る。抗体は、化学療法剤および／または治療用抗体と組み合わせて投与し得る。化学療法剤は、フルロピリミジン、オキサリプラチン、およびイリノテカンの少なくとも１つから選択し得る。治療用抗体は、ベバシズマブおよび抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体の少なくとも１つから選択し得る。抗体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し得る。用量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇであり得る。抗体は、処置の約１日後から処置の約１カ月後に得た少なくとも１つの対象試料において検出可能であり得る。抗体は、ＭＭＡＥとコンジュゲートし得る。試料中のＭＭＡＥと抗体の、薬物と抗体の比（ＤＡＲ）は、少なくとも１つの対象試料において５０％未満で変化し得る。
一部の実施形態では、細胞または試料と開示されている抗体とを接触させることを含む、少なくとも１種のＴＡＣＡの存在について細胞または試料をスクリーニングする方法を提供する。少なくとも１種のＴＡＣＡは、ＳＴｎを含み得る。試料は、生体試料であり得る。生体試料は、対象から得てもよい。対象は、がんを有するか、またはがんを有することが疑われていてもよい。生体試料は、細胞、組織、組織切片、および体液の１つもしくは複数を含み得る。抗体は、検出可能な標識を含み得る。抗体は、検出剤を使用して検出し得る。検出剤は、二次抗体であり得る。二次抗体は、検出可能な標識を含み得る。方法は、対象におけるがんを診断するために使用し得る。方法は、コンパニオン診断の部分であり得る。コンパニオン診断は、がんの重症度を層別化すること、がんの危険性を層別化すること、臨床治験のために対象を選択すること、治療レジメンを開発すること、治療レジメンをモジュレートすること、処置の安全性を増加させること、および処置の有効性をモジュレートすることの１つもしくは複数のために使用し得る。方法は、タンパク質アレイの使用を含み得る。タンパク質アレイは、試料中に存在する１種もしくは複数のタンパク質を結合するように構成された１種もしくは複数の抗体を含み得る。
一部の実施形態では、本開示は、記載した方法を実施するためのキットを提供する。キットは、記載した抗体を含み得る。キットは、二次抗体を含み得る。二次抗体は、検出可能な標識を含み得る。
一部の実施形態では、本開示は、記載されている抗体の１つもしくは複数を含む組成物を提供する。組成物は、少なくとも１種の添加剤を含み得る。組成物は、薬学的に許容される添加剤を含み得る。組成物は、抗体をコーティングした薬剤を含み得る。抗体をコーティングした薬剤は、粒子、ナノ粒子、タンパク質、融合タンパク質、脂質、リポソーム、および細胞の１つもしくは複数を含み得る。抗体は、抗体フラグメントであり得る。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントおよび単鎖Ｆｖの１つもしくは複数から選択し得る。
一部の実施形態では、本開示は、合成構築物を有する改変された細胞を提供する。合成構築物は、細胞のＳＴｎレベルをモジュレートする因子をコードし得る。因子は、ＳＴｎ合成に関与する少なくとも１種の因子を含み得る。因子は、（アルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニル－２，３－ベータ－ガラクトシル－１，３）－Ｎ－アセチルガラクトサミニド、アルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ）、Ｔ－シンターゼ、およびコア１ベータ３－ガラクトシルトランスフェラーゼ特異的分子シャペロン（ＣＯＳＭＣ）の少なくとも１つから選択し得る。改変された細胞は、少なくとも１種の改変されていない細胞と比較したとき、上昇したＳＴｎレベルを有し得る。因子は、ＳＴ６ＧａｌＮＡＣの発現を低減し得る。因子は、阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。改変された細胞は、改変された卵巣腫瘍細胞であり得る。改変された卵巣腫瘍細胞は、ＳＫＯＶ３細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、ＯＶＣＡＲ４細胞、ＢＲＣＡ１変異腫瘍細胞、および非ＢＲＣＡ１変異腫瘍細胞の１つもしくは複数から選択し得る。
一部の実施形態では、抗体結合を特性決定する方法を提供する。方法は、グリカンアレイと抗体とを接触させることを含み得る。グリカンアレイは、複数種のグリカンを含み得る。複数のグリカンは、Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｎｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｎｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｇａｌ３βＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；およびＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２のそれぞれの１つもしくは複数からなるグリカンのパネルを含み得る。複数のグリカンのそれぞれは、ネオ糖脂質プローブの部分であり得る。
上記および他の目的、フィーチャおよび利点は、同様の参照文字が異なる図を通して同じ部分を指す添付図面において例示するように、本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかである。図面は必ずしも尺度通りではなく、代わりに本発明の様々な実施形態の原理を例示することに重点を置く。
α２，６－シアル酸付加Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）を示し、抗ＳＴｎ抗体結合に関与している推定上のエピトープを示す図。各図における最も大きな楕円形は、４つの抗体群のそれぞれによって標的とされるＳＴの特定の領域を示す。これらの群は、群１抗体（図１Ａにおいて示す大きな楕円形の領域への結合）を含む。 α２，６－シアル酸付加Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）を示し、抗ＳＴｎ抗体結合に関与している推定上のエピトープを示す図。各図における最も大きな楕円形は、４つの抗体群のそれぞれによって標的とされるＳＴの特定の領域を示す。これらの群は、群２抗体（図１Ｂにおいて示す大きな楕円形の領域への結合）を含む。 α２，６－シアル酸付加Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）を示し、抗ＳＴｎ抗体結合に関与している推定上のエピトープを示す図。各図における最も大きな楕円形は、４つの抗体群のそれぞれによって標的とされるＳＴの特定の領域を示す。これらの群は、群３抗体（図１Ｃにおいて示す大きな楕円形の領域への結合）を含む。 α２，６－シアル酸付加Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）を示し、抗ＳＴｎ抗体結合に関与している推定上のエピトープを示す図である。各図における最も大きな楕円形は、４つの抗体群のそれぞれによって標的とされるＳＴの特定の領域を示す。これらの群は、群４抗体（図１Ｄにおいて示す大きな楕円形の領域への結合）を含む。 可変ドメインの概略図。
導入
本発明によるものは、本明細書においてグリカンと称される炭水化物基を含むエピトープに対して特異的であるか、または相互作用する抗体である。本明細書に記載されているいくつかのグリカン相互作用抗体は、生物学的薬剤として使用し得る。他の実施形態は、このようなグリカン相互作用抗体を生じさせるための方法を提供する。
天然で、ＳＴｎは、Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）でシアル酸付加し得る。本発明によるグリカン相互作用抗体は、任意のＳＴｎ（汎ＳＴｎ抗体）を有するグリカン、Ｎｅｕ５Ａｃを含むＳＴｎ、特に、（ＡｃＳＴｎ）を有するグリカン、またはＮｅｕ５Ｇｃを含むＳＴｎ、特に、（ＧｃＳＴｎ）を有するグリカンに向けられ得る。一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、がんに関連するグリカン抗原、例えば、α２，６－シアル酸付加Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）を標的とする。
一部の実施形態では、本開示は、グリカン相互作用抗体を産生する方法を提供する。このような方法は、ＳＴｎ（例えば、ＡｃＳＴｎおよび／またはＧｃＳＴｎ）を含めた１種もしくは複数の抗原に対する免疫応答を生じさせるためのマウスの使用を含み得る。本明細書に記載のように、いくつかの方法は、マウスの免疫化によって産生されたこのように得られた抗体を操作するために利用し得る。このような方法は、免疫化されているマウスの系統および／または性別を変更すること、使用される抗原を変更すること、抗原投与に含まれるアジュバントのタイプおよび用量ならびにハイブリドーマ融合の開始前の免疫化の時間経過を変更することを含み得る。
一部の実施形態では、本開示は、グリカン相互作用抗体を使用してがん幹細胞を排除するための方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、グリカン相互作用抗体を使用してがん幹細胞を排除することによって、対象においてがんを処置する方法を提供する。いくつかの態様では、グリカン相互作用抗体は、単独で使用し得る。他の態様では、グリカン相互作用抗体は、化学療法剤と組み合わせて使用される。
さらに提供するのは、本明細書において開示されているグリカン相互作用抗体の最適化されたヒト化およびコンジュゲートされた形態である。さらに、本発明の抗体および／または方法を含むキット、アッセイおよび試薬を提示する。
定義
隣接した：本明細書において使用する場合、用語「隣接した」は、所与の実体に近接しているか、隣接しているか、または隣であるものを指す。一部の実施形態では、「隣接した残基」は、互いに連結しているグリカン鎖内の糖残基である。一部の実施形態では、「隣接したグリカン」は、直接接触しているか、または２つの間に別のグリカンを伴わずに近接している、互いに隣り合っているグリカン鎖である。
組み合わせて投与される：本明細書において使用する場合、用語「組み合わせて投与される」または「合わせた投与」は、対象が、ある時点で両方に同時に曝露されているように、および／または患者に対する各薬剤の効果におけるオーバーラップが存在し得るように、対象が、同時にまたは時間間隔内に投与された２種もしくはそれよりも多い薬剤に同時に曝露されることを意味する。一部の実施形態では、１種もしくは複数の薬剤の少なくとも１つの用量は、１種もしくは複数の他の薬剤の少なくとも１つの用量の約２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、３時間以内、１時間以内、３０分以内、１５分以内、１０分以内、５分以内、または１分以内に投与される。一部の実施形態では、投与は、オーバーラップする投与量レジメンにおいて起こる。本明細書において使用する場合、用語「投与量レジメン」は、時間的に間隔を置いた複数の用量を指す。このような用量は、規則的間隔で起こり得るか、または投与における１回もしくは複数の中断を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のような１種もしくは複数のグリカン相互作用抗体の個々の用量の投与は、組合せの（例えば、相乗的）効果が達成されるように十分に一緒に接近して間隔を置いている。
アミノ酸：本明細書において使用する場合、用語「アミノ酸（複数可）」は、全ての天然Ｌ－アルファ－アミノ酸および非天然アミノ酸を指す。アミノ酸は、下記のような一文字または三文字の記号表示によって同定される。アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、リシン（Ｌｙｓ：Ｋ）、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）。ここでは、アミノ酸が最初に列挙され、それに続いて、それぞれ、三文字および一文字のコードが括弧内に列挙される。
動物：本明細書において使用する場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階におけるヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階におけるヒトではない動物を指す。ある特定の実施形態では、ヒトではない動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、これらに限定されないが、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、魚、および虫が含まれる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子工学処理された動物、またはクローンである。
抗体：本明細書において使用する場合、用語「抗体」は最も広範な意味で使用され、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される二重特異的抗体）、およびこれらが所望の生物活性を示す限り、抗体フラグメント、例えば、二特異性抗体を含めた様々な実施形態を特にカバーする。抗体は主にアミノ酸をベースとする分子であるが、例えば、糖部分による１つもしくは複数の修飾をまた含み得る。
抗体フラグメント：本明細書において使用する場合、用語「抗体フラグメント」は、好ましくは、その抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の部分を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体を含む。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと称される２個の同一の抗原結合性フラグメントを生じさせ、それぞれは、単一の抗原結合部位を有する。また産生されるのは、残留する「Ｆｃ」フラグメントであり、その名前は、容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処理は、２個の抗原結合部位を有し、かつまだ抗原を架橋することができる、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせる。グリカン相互作用抗体は、これらのフラグメントの１つもしくは複数を含み得る。本明細書における目的のために、抗体は、重鎖および軽鎖可変ドメイン、ならびにＦｃ領域を含み得る。
抗原結合性領域：本明細書において使用する場合、用語「抗原結合性領域」は、標的分子またはエピトープと直接相互作用する、抗体の部分、抗体フラグメント、または関連する分子を指す。抗原結合性領域は典型的には、抗体のＦａｂ領域におけるように、またはｓｃＦｖにおいて一緒に連結するように、可変ドメイン対を含む。
概ね：本明細書において使用する場合、用語「概ね」または「約」は、１つもしくは複数の目的の値に適用されるように、記述した参照値と同様の値を指す。ある特定の実施形態では、用語「概ね」または「約」は、他に記述しない限り、または文脈から他に明らかでない限り（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、いずれの方向にしても（それ超またはそれ未満）、記述した参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、もしくはこれ未満の範囲に入る一連の値を指す。
会合した：本明細書において使用する場合、用語「会合した」、「コンジュゲートした」、「連結した」、「付着した」および「繋ぎ止められた」は、２つまたはそれよりも多い部分に関して使用されるとき、直接的に、または連結剤としての役割を果たす１つもしくは複数のさらなる部分を介して、部分が互いに物理的に会合または接続して、十分に安定的である構造を形成し、その結果、構造が使用される条件、例えば、生理学的条件下で、部分が物理的に会合したままであることを意味する。「会合」は、厳密に直接の化学的共有結合を介してである必要はない。これはまた、「会合した」実体が物理的に会合したままであるように十分に安定的である、イオン結合もしくは水素結合、またはハイブリダイゼーションをベースとする接続性を示唆し得る。
二機能性：本明細書において使用する場合、用語「二機能性」は、任意の物質、少なくとも２つの機能を維持すことができるか、または維持する、分子または部分を指す。機能は、同じ成果または異なる成果に影響を与え得る。機能を生じさせる構造は、同じまたは異なり得る。
生体分子：本明細書において使用する場合、用語「生体分子」は、アミノ酸をベースとする、核酸をベースとする、炭水化物をベースとする、または脂質をベースとするなどである任意の天然分子である。
二重特異的抗体：本明細書において使用する場合、用語「二重特異的抗体」は、２つの異なる抗原を結合することができる抗体を指す。このような抗体は典型的には、少なくとも２つの異なる抗体からの領域を含む。二重特異的抗体は、そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、リエスマラー，Ｇ．（Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．）、２０１２年、がん免疫（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）１２巻：１２～１８頁、マーヴィン，Ｊ．Ｓ．（Ｍａｒｖｉｎ，Ｊ．Ｓ．）ら著、２００５年、アクタファルマコロジカシニカ（Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ．）２６巻（６号）：６４９～５８頁およびシェーファー，Ｗ．（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．）ら著、２０１１年、ＰＮＡＳ．、１０８巻（２７号）：１１１８７～９２頁に記載されているもののいずれかを含み得る。
分岐：本明細書において使用する場合、用語「分岐」は、連結されているか、または主要な実体もしくは源から伸びる、実体、部分または付属物を指す。一部の実施形態では、「分岐鎖」または「分岐状鎖」は、親鎖から伸長する１個もしくは複数の残基（これらに限定されないが、糖残基を含めた）を含む。本明細書において使用する場合、「親鎖」は、そこから分岐状鎖が連結している残基の鎖（これらに限定されないが、糖残基を含めた）を指すために使用される。複数の分岐を有するグリカンの場合、親鎖はまた、そこから全てのこのような分岐が直接的または間接的に付着している源鎖を指し得る。ヘキソース残基の鎖を有する多糖類の場合、親鎖連結は典型的には、隣接する残基の炭素１および４の間に生じ、一方、分岐状鎖は、分岐状残基の炭素１、およびそこから分岐が伸びている親残基の炭素３の間の連結によって親鎖に付着している。本明細書において使用する場合、用語「分岐状残基」は、分岐状鎖における親鎖に付着している残基を指す。
がん幹細胞：本明細書において使用する場合、がん幹細胞（ＣＳＣ）は、自己再生する能力を有する腫瘍細胞のサブセットを指す。ＣＳＣは、多様な細胞型を再び生じさせることができ得る。場合によって、これらの細胞は、腫瘍の外科的または化学的処置によって除去することは困難または不可能である。
化合物：本明細書において使用する場合、用語「化合物」は、別個の化学的実体を指す。一部の実施形態では、特定の化合物は、１つもしくは複数の異性体または同位体形態（これらに限定されないが、立体異性体、幾何異性体および同位体を含めた）で存在し得る。一部の実施形態では、化合物は、単一のこのような形態のみで、提供されるか、または利用される。一部の実施形態では、化合物は、２つもしくはそれよりも多いこのような形態の混合物（これらに限定されないが、立体異性体のラセミ混合物を含めた）として、提供されるか、または利用される。いくつかの化合物が異なるこのような形態で存在し、異なる特性および／または活性（これらに限定されないが、生物活性を含めた）を示すことを当業者は認識する。このような場合では、本発明による使用のために化合物の特定の形態を選択または回避することは当業者の通常の技術の範囲内である。例えば、非対称的に置換された炭素原子を含有する化合物は、光学活性な形態またはラセミ体で単離することができる。ラセミ混合物の分離による、または立体選択的合成によるなど、光学活性な出発材料から光学活性な形態をどのように調製するかの方法は、当技術分野において公知である。
環状または環化：本明細書において使用する場合、用語「環状」は、連続的ループの存在を指す。環状分子は、円状である必要はなく、単に接合して、サブユニットの壊れていない鎖を形成する。
シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ：本明細書において使用する場合、用語「シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ」または「ＣＭＡＨ」は、ヒトにおいては存在しないが、Ｎ－アセチルノイラミン酸からのＮ－グリコリルノイラミン酸の形成を触媒する、大部分の他の哺乳動物（これらに限定されないが、マウス、ブタおよびチンパンジーを含めた）において存在する酵素を指す。ヒトにおいてこの酵素が存在しないことは、ＣＭＡＨ転写物の中途終止、および非機能タンパク質の産生をもたらすフレームシフト変異によるものである。
細胞毒性：本明細書において使用する場合、用語「細胞毒性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、もしくはこれらの組合せを死滅させるか、または傷害効果、毒性効果、もしくは致命的効果をもたらす薬剤を指すために使用される。
送達：本明細書において使用する場合、「送達」は、意図する目的場所への化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードを輸送する行為または様式を指す。
送達剤：本明細書において使用する場合、「送達剤」は、少なくとも部分的に、化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードのｉｎ ｖｉｖｏでの送達を促進する任意の物質を指す。
検出可能な標識：本明細書において使用する場合、「検出可能な標識」は、付着しているか、組み込まれているか、または別の実体と会合している１つもしくは複数のマーカー、シグナルまたは部分を指し、このマーカー、シグナルまたは部分は、放射線透過写真、蛍光、化学発光、酵素活性、吸収度などを含めた当技術分野において公知の方法によって容易に検出される。検出可能な標識は、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドットなどを含む。検出可能な標識は、これらが付着しているか、組み込まれているか、または会合している実体における任意の位置において位置し得る。例えば、ペプチドまたはタンパク質と付着しているか、組み込まれているか、または会合しているとき、これらはアミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質内にあってもよいか、またはＮ末端もしくはＣ末端に位置し得る。
ディスプレイライブラリー：本明細書において使用する場合、用語「ディスプレイライブラリー」は、生体分子相互作用を同定するための科学的発見において使用されるツールを指す。バクテリオファージ、イーストおよびリボソームの利用を含む、ディスプレイライブラリーの異なるバリエーションが存在する。いずれの場合にも、所与のライブラリー内のタンパク質（本明細書において、「ライブラリーメンバー」とまた称される）は、タンパク質をコードする核酸に連結（物理的に、または宿主との関連によって）している。標的分子がディスプレイライブラリーのメンバーと共にインキュベートされるとき、標的に結合する任意のライブラリーメンバーは単離し得、結合したタンパク質をコードする配列は連結された核酸の分析によって決定し得る。一部の実施形態では、ディスプレイライブラリーは、「ファージディスプレイライブラリー」であり、ディスプレイライブラリーは、バクテリオファージウイルス粒子（本明細書において、「ファージ粒子」とまた称される）で構成されており、核酸は、ファージゲノム中に組み込まれており、導入されてきた核酸によってコードされるタンパク質に融合しているウイルスコートタンパク質の産生がもたらされる。このような融合されたタンパク質は、アセンブルされたファージ粒子の外表面上に「ディスプレイ」されており、ここでこれらは所与の標的と相互作用し得る。
遠位：本明細書において使用する場合、用語「遠位」は、中心から遠くにあるか、または目的のポイントもしくは領域から遠くにあることを意味する。
工学処理された：本明細書において使用する場合、本発明の実施形態は、構造的または化学的であろうと、出発点、野生型または天然分子とは異なるフィーチャまたは特性を有するように設計されているとき、「工学処理」されている。このように、工学処理された薬剤または実体は、その設計および／または産生が人の手の行為を含むものである。
エピトープ：本明細書において使用する場合、「エピトープ」は、これらに限定されないが、抗体を含めた免疫系の構成要素と相互作用することができる分子上の表面または領域を指す。一部の実施形態では、エピトープは、標的部位を含み得る。エピトープは、対応する抗体によって特異的に認識および結合される、抗原上または２つもしくはそれよりも多い抗原の間の領域を含み得る。いくつかのエピトープは、１種もしくは複数のグリカンに沿って１個もしくは複数の糖残基を含み得る。このようなエピトープは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは少なくとも１０個の糖残基を含み得る。エピトープはまた、実体の間の相互作用の１つもしくは複数の領域を含み得る。一部の実施形態では、エピトープは、２個の糖残基の間、分岐状鎖および親鎖の間、またはグリカンおよびタンパク質の間のジャンクションを含み得る。
エーテル結合：本明細書において使用する場合、「エーテル結合」は、２個の炭素原子の間に結合されている酸素を含む化学結合を指す。一部の実施形態では、エーテル結合は、糖残基を、これらに限定されないが、グリカン鎖を形成する他の糖残基を含めた他の実体に連結する。このような結合はまた、「グリコシド結合」または「グリコシド連結」と称される。少なくとも１個の糖残基との関連で、用語「連結する」および／または「連結」がまた、グリコシド連結に言及するとき本明細書において使用される。一部の実施形態では、連結は、グリカンを、これらに限定されないが、タンパク質、脂質、リン脂質およびスフィンゴ脂質を含めた他の実体に連結し得る。一部の実施形態では、糖残基は、タンパク質に連結し得、典型的には、糖残基およびアミノ酸残基の間に連結を形成する。このようなアミノ酸残基は、セリンおよびトレオニンを含む。一部の実施形態では、エーテル結合は、結合形成に関与している炭水化物リンカーを介してグリカンをグリカンアレイに連結する。グリコシド連結は、これらの立体化学的特性において異なり得る。一部の実施形態では、アルファ配向されたグリコシド連結（本明細書において、「アルファ連結」とまた称される）は、エーテル結合の結合した酸素、および糖残基のシクロヘキサン環の間に軸方向の配向をもたらす。一部の実施形態では、ベータ配向されたグリコシド連結（本明細書において、「ベータ連結」とまた称される）は、エーテル結合の結合した酸素、および糖残基のシクロヘキサン環の間にエクアトリアル配向をもたらす。
発現：本明細書において使用する場合、核酸配列の「発現」は、下記の事象の１つもしくは複数を指す。（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）；（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；（４）ポリペプチドまたはタンパク質のフォールディング；ならびに（５）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
フィーチャ：本明細書において使用する場合、「フィーチャ」は、特徴、特性、または特有のエレメントを指す。
製剤：本明細書において使用する場合、「製剤」は、処方によって調製され、かつ少なくとも１種の抗体、化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードおよび送達剤、担体または添加剤を含み得る、材料または混合物を指す。
官能的：本明細書において使用する場合、「官能的」生物学的分子は、それによってこれが特性決定される特性および／または活性を示す構造を有し、その形態にある生物学的実体である。本明細書において使用する場合、「官能基」または「化学基」は、より大きな分子の部分である原子または化学結合の特徴的な基を指す。一部の実施形態では、官能基は、異なる分子と会合し得るが、官能基がその部分である分子に関わらず同様の化学反応に参加し得る。一般の官能基には、これらに限定されないが、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、アセチル基（－ＣＯＨ）、アミノ基（－ＮＨ２）、メチル基（－ＣＨ３）、硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）およびアシル基が含まれる。一部の実施形態では、分子への１個もしくは複数の官能基の付加は、官能基の名前を語尾「－化」で修飾する用語、例えば、アセチル化、メチル化および硫酸化を使用して伝え得る。
グリカン：本明細書において使用する場合、用語「グリカン」、「オリゴ糖類」および「多糖類」は、互換的に使用され、本明細書において、また連結と称されるグリコシド結合によって典型的には接合している糖モノマーでできているポリマーを指す。一部の実施形態では、用語「グリカン」、「オリゴ糖類」および「多糖類」は、グリココンジュゲートの炭水化物部分（例えば、糖タンパク質、糖脂質またはプロテオグリカン）を指すために使用し得る。
グリカン鎖：本明細書において使用する場合、用語「グリカン鎖」は、２つもしくはそれよりも多い糖を含む糖ポリマーを指す。一部の実施形態では、グリカン鎖は、タンパク質上のセリンまたはトレオニン残基を介してタンパク質に共有結合的に連結している。
グリカンに富んだ組成物：本明細書において使用する場合、用語「グリカンに富んだ組成物」は、大きな百分率のグリカンを含む混合物を指す。一部の実施形態では、グリカンに富んだ組成物中のグリカンは、組成物の総重量に対して約１％～約１０％、約５％～約１５％、約２０％～約４０％、約３０％～約５０％、約６０％～約８０％、約７０％～約９０％または少なくとも１００％を構成し得る。
グリコシド結合：本明細書において使用する場合、用語「グリコシド結合」は、炭水化物および別の化学基の間に形成される共有結合を指す。一部の実施形態では、グリコシド結合は、１個の糖分子の還元末端、および第２の糖分子または多糖類鎖の非還元末端の間に形成される。このようなグリコシド結合はまた、接合した糖の間の酸素によってＯ－グリコシド結合（またはエーテル結合）として公知である。一部の実施形態では、２つの糖の間、または糖およびリンカーの間のグリコシド結合はまた、「連結」と称し得る。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書において使用する場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内よりはむしろ、人工環境において、例えば、試験管または反応槽において、細胞培養物において、ペトリ皿などにおいて起こる事象を指す。
Ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書において使用する場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしくは組織）内で起こる事象を指す。
単離された：本明細書において使用する場合、用語「単離された」は、「分離された」と同義であるが、これによって推論による分離が人の手によって行われたことを伝える。一実施形態では、単離された物質または実体は、それと従前に会合していた構成要素の少なくともいくつかから分離されているものである（天然でまたは実験の設定において）。単離された物質は、これらが会合している物質に関して変動するレベルの純度を有し得る。単離された物質および／または実体は、それと共にこれらが最初に会合している他の構成要素の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ超から分離し得る。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、または約９９％超の純度である。本明細書において使用する場合、物質は、他の構成要素が実質的に非含有である場合、「純粋」である。
キット：本明細書において使用する場合、用語「キット」は、協同的な目的のために適合された１つもしくは複数の構成要素、およびその使用のための説明書を含むセットを指す。
ノックアウト：本明細書において使用する場合、用語「ノックアウト」は、現存する遺伝子が、人の手が典型的には関与するプロセスによって不活性化されている生物を指す。ノックアウト生物において、不活性化されている遺伝子は、「ノックアウト」されていると言われる。一部の実施形態では、ノックアウトされた遺伝子は、遺伝子へのヌクレオチド配列の挿入によって、または遺伝子全体の置換えによって不活性化し得る。
リンカー：本明細書において使用する場合、「リンカー」は、２つもしくはそれよりも多いドメイン、部分または実体を接続する部分を指す。一実施形態では、リンカーは、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個またはそれ超の原子を含み得る。さらなる実施形態では、リンカーは、原子の群、例えば、１０～１，０００個の原子を含み得る。このような原子またはその群には、これらに限定されないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミンが含まれてもよい。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。一部の実施形態では、リンカーによって結合されている部分には、これらに限定されないが、原子、化学基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸塩基、糖、核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、ペイロード（例えば、治療剤）またはマーカー（これらに限定されないが、化学、蛍光、放射性または生物発光マーカーを含めた）が含まれてもよい。リンカーは、任意の有用な目的のために、例えば、マルチマーまたはコンジュゲートを形成するために、かつ本明細書に記載のようなペイロードを投与するために使用することができる。リンカー中に組み込むことができる化学基の例には、これらに限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが含まれ、これらのそれぞれは、本明細書に記載のように任意選択で置換することができる。リンカーの例には、これらに限定されないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、およびデキストランポリマーが含まれる。他の例には、これらに限定されないが、還元剤または光分解を使用して切断することができる、リンカー内の切断可能な部分、例えば、ジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）が含まれる。選択的に切断可能な結合の非限定的例は、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または他の還元剤、および／もしくは光分解の使用によって切断し得るアミド結合、ならびに例えば、酸性または塩基性加水分解によって切断し得るエステル結合を含む。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、グリカンアレイにおいて、グリカンを基材に連結するために使用される炭水化物部分である。このような炭水化物リンカーには、これらに限定されないが、－Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＨＮ２および－Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＮＨ２が含まれる。
ｍＲＮＡ：本明細書において使用する場合、用語「ｍＲＮＡ」は、遺伝子転写、および生じた転写物のプロセシングの結果として産生されたメッセンジャーＲＮＡを指す。一部の実施形態では、細胞の細胞核を離れたｍＲＮＡを細胞または一連の細胞から抽出し、分析して、どの遺伝子が所与の時間においてまたは所与の一連の状況下で転写を受けたかを決定し得る。
ムチン：本明細書において使用する場合、用語「ムチン」は、重度にグリコシル化されているタンパク質のファミリーを指す。一部の実施形態では、ムチンは顎下腺によって産生され、唾液および粘液において見出される。
ネガティブ選択：本明細書において使用する場合、用語「ネガティブ選択」は、標的抗原を含まない組成物の実体および／または構成要素を結合するこれらの能力に基づいた、ディスプレイライブラリーからのライブラリーメンバーの選択を指す。一部の実施形態では、ネガティブ選択は、標的に非特異的に結合し得るエレメントを除去するポジティブ選択の前に使用する。
オフターゲット：本明細書において使用する場合、「オフターゲット」は、任意の１種もしくは複数の標的、遺伝子、または細胞の転写物への任意の意図されない効果を指す。
患者：本明細書において使用する場合、「患者」は、処置を求めているか、もしくは必要としているか、処置を必要としているか、処置を受けているか、処置をこれから受け得る対象、または特定の疾患もしくは状態についての訓練された（例えば、免許を受けた）専門家によるケアの元にある対象を指す。
ペプチド：本明細書において使用する場合、「ペプチド」は、５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個のアミノ酸の長さと等しいかもしくはこれ未満であるタンパク質またはポリペプチドである。
薬学的に許容される：語句「薬学的に許容される」は本明細書において用いられて、合理的な利益／リスク比と釣り合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、正しい医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織と接触させる使用に適したこれらの化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
薬学的に許容される添加剤：語句「薬学的に許容される添加剤」は、本明細書において使用する場合、医薬組成物中に存在する活性剤（例えば、本明細書に記載のような）以外であり、患者において実質的に無毒性および非炎症性である特性を有する任意の成分を指す。一部の実施形態では、薬学的に許容される添加剤は、活性剤を懸濁または溶解することができるビヒクルである。添加剤は、例えば、抗粘着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、色素（色）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（賦形剤）、皮膜形成剤またはコーティング、フレーバー、香料、流動促進剤（流動増進剤）、滑沢剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁化剤または分散化剤、甘味剤、および水和水を含み得る。例示的な添加剤には、これらに限定されないが、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、（第二）リン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが含まれる。
薬学的に許容される塩：本明細書に記載されている化合物の薬学的に許容される塩は、開示された化合物の形態であり、ここで、酸または塩基部分は、（例えば、遊離塩基基と適切な有機酸とを反応させることによって生じさせるような）その塩の形態である。薬学的に許容される塩の例には、これらに限定されないが、塩基性残基、例えば、アミンの鉱酸塩または有機酸塩；酸性残基、例えば、カルボン酸のアルカリ塩または有機塩などが含まれる。代表的な酸付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、ならびにこれらに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンを含めたアミンカチオンなどを含む。薬学的に許容される塩は、例えば、無毒性の無機酸または有機酸からの通常の無毒性の塩を含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される塩は、通常の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から調製される。一般に、このような塩は、水もしくは有機溶媒、または２つの混合物中で、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基形態と、化学量論量の適当な塩基または酸とを反応させることによって調製することができる。一般に、非水性媒体、例えば、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルが好ましい。適切な塩のリストは、これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、マックパブリッシングカンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、Ｐａ．，１９８５年、１４１８頁、医薬塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ）、Ｐ．Ｈ．ＳｔａｈｌおよびＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編）、ワイリー－ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、２００８年、およびバーグ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、薬学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、６６巻、１～１９頁（１９７７年）において見出される。薬学的に許容される溶媒和物：用語「薬学的に許容される溶媒和物」は、本明細書において使用する場合、化合物の結晶形態を指し、適切な溶媒の分子は、結晶格子中に組み込まれている。例えば、溶媒和物は、結晶化、再結晶化、または有機溶媒、水、もしくはこれらの混合物を含む溶液からの沈殿によって調製し得る。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、および三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒であるとき、溶媒和物は、「水和物」と称される。一部の実施形態では、溶媒和物中に組み込まれる溶媒は、（例えば、医薬組成物の単位剤形で）溶媒和物が投与される生物にとって生理学的に許容できるタイプ、またはレベルのものである。
薬物動態：本明細書において使用する場合、「薬物動態」は、生きている生物に投与される物質の運命の決定に関するような、分子または化合物の任意の１つもしくは複数の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝、ならびに排泄の程度および速度を含めたいくつかの領域に分けられる。これは、ＡＤＭＥと一般に称され、（Ａ）吸収は、血液循環に入る物質のプロセスであり；（Ｄ）分布は、体液および体の組織に亘る物質の分散または蔓延であり；（Ｍ）代謝（または生体内変化）は、娘代謝物への親化合物の不可逆的な転換であり；（Ｅ）排泄（または排除）は、体からの物質の排除を指す。まれに、いくつかの薬物は身体組織において不可逆的に蓄積する。
物理化学的：本明細書において使用する場合、「物理化学的」は、物理的および／または化学的特性を意味するか、またはこれに関する。
ポジティブ選択：本明細書において使用する場合、用語「ポジティブ選択」は、独自の実体の群からの所与の実体の選択を指す。このような実体およびその群は、例えば、抗体であり得る。場合によって、これらは抗体フラグメントであり得るか、または発現している抗体フラグメントは、このようなフラグメント（例えば、ディスプレイライブラリーからのライブラリーメンバー）を発現することができる薬剤と関連している。選択は、所望の標的またはエピトープに結合する選択された実体の能力に基づき得る。一部の実施形態では、ポジティブ選択はファージディスプレイライブラリーと共に使用して、所望の標的に結合するｓｃＦｖを発現しているファージ粒子を同定し得る。他の実施形態では、ポジティブ選択は、抗体のプールからの抗体候補の選択を指し得る。他の場合では、実体は、ハイブリドーマ選択の間のクローンの選択におけるように、細胞、細胞系またはクローンであり得る。このような場合において、ポジティブ選択は、このようなクローンによって産生される抗体の１つもしくは複数のフィーチャ（例えば、１つもしくは複数の所望のエピトープに対する特異性）に基づくクローン選択を指し得る。場合によって、ポジティブ選択方法における所望のエピトープは、ＳＴｎ（例えば、ＡｃＳＴｎおよび／またはＧｃＳＴｎ）を含み得る。
逆に、「ネガティブ選択」は、本明細書において使用する場合、ポジティブ選択について記載したのと同じ原理および例を含むが、これが独自の実体の群からの望ましくない実体の除去のために使用されるという際立った特徴を伴う。
予防すること：本明細書において使用する場合、用語「予防すること」は、感染症、疾患、障害および／もしくは状態の発症を部分的にもしくは完全に遅延させること；特定の感染症、疾患、障害および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状、フィーチャ、または臨床的顕在化の発生を部分的にもしくは完全に遅延させること；特定の感染症、疾患、障害および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状、フィーチャ、または顕在化の開始を部分的にもしくは完全に遅延させること；感染症、特定の疾患、障害および／もしくは状態からの進行を部分的にもしくは完全に遅延させること；ならびに／または感染症、疾患、障害および／もしくは状態と関連する病態を発生する危険性を減少させることを指す。
プロドラッグ：本開示はまた、本明細書に記載されている化合物のプロドラッグを含む。本明細書において使用する場合、「プロドラッグ」は、化学的または物理的変化によって治療剤として作用するその物質、分子または実体を含意する形態の任意の物質、分子または実体を指す。プロドラッグは、何らかの方法で共有結合または隔離し得、哺乳動物対象への投与の前に、投与によって、または投与の後に、活性薬物部分を放出するか、活性薬物部分に変換される。プロドラッグは、親化合物へと、修飾が通例の操作でまたはｉｎ ｖｉｖｏで切断されるように、化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が、哺乳動物対象に投与したとき、切断されて、それぞれ、遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基を形成する任意の基に結合している化合物を含む。プロドラッグの調製および使用は、これらの両方が参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｔ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．Ｓｔｅｌｌａ（Ｖ．ステラ）、「新規な送達系としてのプロドラッグ（Ｐｒｏ－ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、第１４巻、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）、およびドラッグデザインにおける生物可逆的担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）、編、エドワードＢ．ロシェ（Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ）、米国薬学会およびペルガモンプレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＰｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年に記載されている。
近位：本明細書において使用する場合、用語「近位」は、中心、または目的のポイントもしくは領域のより近くに位置することを意味する。
相互作用の領域：本明細書において使用する場合、用語「相互作用の領域」は、このような実体が相互作用またはオーバーラップする、２つもしくはそれよりも多い実体のいずれかに沿った領域を指す。一部の実施形態では、相互作用の領域は、第２のグリカン鎖に接触するグリカン鎖に沿った１個もしくは複数の糖残基を含み得る。一部の実施形態では、グリカン鎖は、同じ親鎖からの分岐状鎖である。一部の実施形態では、相互作用の領域は、２個のグリカン鎖の間に起こり得、ここで、１個の鎖は分岐状鎖であり、第２の鎖は親鎖である。グリカン鎖の場合、相互作用の領域は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または少なくとも１０個の糖残基を含み得る。一部の実施形態では、相互作用の領域はまた、グリカンおよびタンパク質の間、またはグリカンおよび脂質の間に起こり得る。
残基：本明細書において使用する場合、用語「残基」は、ポリマーと関連しているか、もしくは関連することができるモノマーを指す。一部の実施形態では、残基は、これらに限定されないが、グルコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸を含めた糖分子を含む。一部の実施形態では、残基は、アミノ酸を含む。
試料：本明細書において使用する場合、用語「試料」は、源から採取し、かつ／または分析もしくはプロセシングのために提供される、一定分量または部分を指す。一部の実施形態では、試料は、生物学的源（本明細書において、「生体試料」とまた称される）、例えば、組織、細胞または構成要素部分（例えば、これらに限定されないが、血液、血漿、血清、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血液、尿、膣液および精液を含めた体液）からのものである。一部の実施形態では、試料は、これらに限定されないが、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、気道、腸管、および尿生殖路の外部セクション、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含めた、完全な生物またはその組織、細胞もしくは構成要素部分のサブセットから調製したホモジネート、ライセートもしくは抽出物、またはその画分もしくは部分であり得るか、これらを含む。一部の実施形態では、試料は、細胞構成要素、例えば、タンパク質または核酸分子を含有し得る、培地、例えば、栄養ブイヨンまたはゲルを含む。一部の実施形態では、「一次」試料は、一定分量の源である。一部の実施形態では、一次試料は１つもしくは複数のプロセシング（例えば、分離、精製など）ステップに供し、分析または他の使用のための試料を調製する。
シアリル：本明細書において使用する場合、接頭辞「シアリル」および用語「シアル酸付加」は、シアル酸を含む化合物を説明する。
単一の単位用量：本明細書において使用する場合、「単一の単位用量」は、１つの用量で／１回／単一の経路／単一の接触点、すなわち、単回投与事象において投与される任意の治療剤の用量である。一部の実施形態では、単一の単位用量は、別個の剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、パッチ、充填されたシリンジ、バイアルなど）として提供される。
分割用量：本明細書において使用する場合、「分割用量」は、２つもしくはそれよりも多い用量への単一の単位用量または総１日用量の分割である。
安定的：本明細書において使用する場合、「安定的」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離を生き残るのに十分にロバストであり、好ましくは、効果的な治療剤へと製剤化することができる化合物または実体を指す。
安定化した：本明細書において使用する場合、用語「安定化する」、「安定化した」、「安定化した領域」は、安定的とするか、安定的となることを意味する。一部の実施形態では、安定性は、絶対値に対して測定される。一部の実施形態では、安定性は、参照化合物または実体に対して測定される。
対象：本明細書において使用する場合、用語「対象」または「患者」は、例えば、実験目的、診断目的、予防目的、および／または治療目的のために、本発明による組成物を投与し得る任意の生物を指す。典型的な対象は、動物（例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒトではない霊長類、およびヒト）ならびに／または植物を含む。
顎下腺：本明細書において使用する場合、用語「顎下腺」または「顎下の腺」は、口腔底の下に位置している粘液産生腺を指す。これらの腺は、ムチンを産生することができ、一部の実施形態では、ムチンの源として哺乳動物から抽出し得る。
患っている：疾患、障害および／もしくは状態を「患っている」個体は、疾患、障害および／もしくは状態と診断されているか、または疾患、障害および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状を示す。
影響を受けやすい：疾患、障害および／もしくは状態に「影響を受けやすい」個体は、疾患、障害および／もしくは状態の症状と診断されておらず、かつ／または疾患、障害および／もしくは状態の症状を示し得ないが、疾患またはその症状を発生させる傾向を持つ。一部の実施形態では、疾患、障害および／もしくは状態（例えば、がん）の影響を受けやすい個体は、下記の１つもしくは複数によって特性決定し得る。（１）疾患、障害および／もしくは状態の発生と関連する遺伝子変異；（２）疾患、障害および／もしくは状態の発生と関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害および／もしくは状態と関連するタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増加および／または減少；（４）疾患、障害および／もしくは状態の発生と関連する習慣および／またはライフスタイル；（５）疾患、障害および／もしくは状態の家族歴；ならびに（６）疾患、障害および／もしくは状態の発生と関連する微生物への曝露および／またはこれによる感染。一部の実施形態では、疾患、障害および／もしくは状態の影響を受けやすい個体は、疾患、障害および／もしくは状態を発生させる。一部の実施形態では、疾患、障害および／もしくは状態の影響を受けやすい個体は、疾患、障害および／もしくは状態を発生させない。
合成の：用語「合成の」は、人の手によって生成、調製、および／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であり得る。
標的：本明細書において使用する場合、用語「標的」は、作用によって影響を受ける目的または実体を指す。一部の実施形態では、標的は、抗原を特異的に結合する抗体の開発のために使用される抗原を指す。
標的スクリーニング：本明細書において使用する場合、用語「標的スクリーニング」は、その物質についての結合パートナーを同定する標的物質の使用を指す。
標的部位：本明細書において使用する場合、用語「標的部位」は、１種もしくは複数のグリカン、糖タンパク質、生体分子上もしくは内の領域、ならびに／または結合剤もしくはエフェクター分子（例えば、抗体）によって認識される細胞、細胞外空間、組織、器官および／または生物上もしくは内の生体構造を指す。一部の実施形態では、グリカン標的部位は、１個の糖残基上にもっぱら存在し得るか、２個もしくはそれよりも多い残基によって形成し得るか、またはグリカンおよび非グリカン構成要素の両方を含み得る。一部の実施形態では、標的部位は、２つもしくはそれよりも多いグリカンまたは糖タンパク質の間で形成される。一部の実施形態では、標的部位は、同じグリカンの分岐状鎖の間に、または１個もしくは複数の分岐状鎖および親鎖の間に形成される。
標的とされる細胞：本明細書において使用する場合、「標的とされる細胞」は、任意の１個もしくは複数の目的の細胞を指す。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕで、または生物の組織もしくは器官において見出し得る。生物は、動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト、最も好ましくは、患者であり得る。
末端残基：本明細書において使用する場合、用語「末端残基」は、ポリマー鎖における最後の残基を指す。一部の実施形態では、末端残基は、多糖類鎖の非還元末端に位置している糖残基である。
治療剤：用語「治療剤」は、対象に投与したとき、治療、診断、および／もしくは予防効果を有し、かつ／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を引き出す任意の薬剤を指す。
治療的有効量：本明細書において使用する場合、用語「治療的有効量」は、感染症、疾患、障害および／もしくは状態を患っているかもしくは影響を受けやすい対象に投与したとき、感染症、疾患、障害および／もしくは状態を処置し、その症状を改善させ、診断し、予防し、かつ／またはその発症を遅延させるのに十分な送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断用剤、予防剤など）の量を意味する。一部の実施形態では、治療的有効量は、単回用量で提供される。一部の実施形態では、治療的有効量は、複数の用量を含む投与量レジメンで投与される。一部の実施形態では、単位剤形は、これがこのような投与量レジメンの部分として投与したとき有効である量を含む場合、治療的有効量の特定の薬剤または実体を含むと考えられてもよいことを当業者なら理解するであろう。
治療的に有効な成果：本明細書において使用する場合、用語「治療的に有効な成果」は、感染症、疾患、障害および／もしくは状態を患っているかもしくは影響を受けやすい対象において、感染症、疾患、障害および／もしくは状態を処置し、その症状を改善させ、診断し、予防し、かつ／またはその発症を遅延させるのに十分な成果を意味する。
総１日用量：本明細書において使用する場合、「総１日用量」は、２４時間の期間において与えられるかもしくは処方される量である。これは、単一の単位用量として投与し得る。
トランスジェニック：本明細書において使用する場合、用語「トランスジェニック」は、その生物において天然に見出されない生物のゲノム内に組み込まれている１種もしくは複数の遺伝子を含む生物を指す。
処置する：本明細書において使用する場合、用語「処置する」は、特定の感染症、疾患、障害および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状またはフィーチャを、部分的にもしくは完全に軽減し、回復させ、改善させ、軽減し、その発症を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減させ、かつ／またはその発生率を低減させることを指す。例えば、がんを「処置すること」は、腫瘍の生存、成長、および／または拡大を阻害することを指す。処置は、疾患、障害および／もしくは状態の徴候を示さない対象、ならびに／または疾患、障害および／もしくは状態と関連する病態を発生する危険性を減少させる目的のために、疾患、障害および／もしくは状態の初期徴候のみを示す対象に投与し得る。
可変領域：本明細書において使用する場合、用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の間で配列が広範に異なる特異的抗体ドメインを指し、その特定の抗原についてのそれぞれの特定の抗体の結合および特異性において使用される。
全ＩｇＧ：本明細書において使用する場合、用語「全ＩｇＧ」は、完全ＩｇＧ分子を指す。一部の実施形態では、全ＩｇＧ分子は、２つもしくはそれよりも多い他の生物において天然に見出される領域を含む。
野生型：本明細書において使用する場合、用語「野生型」は、天然ゲノム（他の生物に由来する遺伝子を非含有）を含む生物を指す。
Ｉ．本発明の組成物
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１種のグリカン相互作用抗体を含む化合物および組成物を提供する。グリカン内で、単糖類モノマーは全て同じであり得るか、またはこれらは異なり得る。一般のモノマーには、これらに限定されないが、トリオース、テトロース、ペントース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イオドース、リボース、マンノヘプツロース、セドヘプツロースおよびタロースが含まれる。アミノ糖はまた、グリカン内のモノマーであり得る。このような糖を含むグリカンは、本明細書でアミノグリカンと称する。アミノ糖は、本明細書において使用する場合、ヒドロキシル基の代わりにアミン基、または一部の実施形態では、このような糖に由来する糖を含む糖分子である。アミノ糖の例には、これらに限定されないが、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸（これらに限定されないが、Ｎ－アセチルノイラミン酸およびＮ－グリコリルノイラミン酸を含めた）ならびにＬ－ダウノサミンが含まれる。
本明細書において使用する場合、用語「グリカン相互作用抗体」は、グリカン部分と相互作用することができる抗体を指す。このような抗体は、グリカン部分単独に、複数のグリカン部分に、またはグリカンおよび非グリカン構成要素の両方を含むエピトープに結合し得る。非グリカン構成要素には、これらに限定されないが、タンパク質、タンパク質関連部分（例えば、翻訳後修飾）、細胞、および細胞関連分子／構造が含まれてもよい。グリカン相互作用抗体は、グリカンまたはグリカン関連分子または実体に結合し、変更し、活性化させ、阻害し、安定化させ、分解し、かつ／またはモジュレートするように機能し得る。その際、グリカン相互作用抗体は、対症療法的、予防的であると、または進行中の処置組成物としてであろうと、治療剤として機能し得る。一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、他の分子とのコンジュゲートまたは組合せを含み得る。一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、１種もしくは複数のアミノ糖を有するグリカンに対して向けられる。さらなる実施形態では、１種もしくは複数のアミノ糖は、シアル酸である。さらなる実施形態では、１種もしくは複数のシアル酸は、Ｎ－アセチルノイラミン酸および／またはＮ－グリコリルノイラミン酸である。
抗体
グリカン相互作用抗体は、全抗体またはそのフラグメントを含み得る。本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、これらに限定されないが、これらが、所望の生物活性（例えば、１つもしくは複数の標的を結合し、活性化し、阻害し、安定化させ、分解し、かつ／またはモジュレートすること）を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される二重特異的抗体）、抗体コンジュゲート（これらに限定されないが、抗体－薬物コンジュゲートを含めた）、抗体バリアント［これらに限定されないが、抗体模倣物、キメラ抗体（例えば、複数の種に由来するアミノ酸配列を有する抗体）、および合成バリアントを含めた］、ならびに抗体フラグメントを含めた様々なフォーマットを包含する。抗体は主にアミノ酸をベースとする分子であるが、１つもしくは複数の翻訳後修飾または合成修飾を含み得る。翻訳後修飾は、グリコシル化を含み得る。
本明細書において使用する場合、用語「抗体フラグメント」は、場合によって、少なくとも１つの抗原結合領域を含む、インタクトな抗体またはその融合タンパク質の一部を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；二特異性抗体；トリ（ａ）ボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体を含む。抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位有する、「Ｆａｂ」フラグメントと称される２個の同一の抗原結合性フラグメントを産生する。また産生されるのは、残留する「Ｆｃ」フラグメントであり、その名前は容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処理は、２個の抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせ、抗原をまだ架橋することができる。グリカン相互作用抗体は、これらのフラグメントの１つもしくは複数を含み得、例えば、全抗体の酵素消化または組換え発現によって生じ得る。
「天然抗体」は通常、２個の同一の軽（Ｌ）鎖および２個の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は公知であり、それぞれを構成するセグメントは良好に特性決定され、説明されてきた（そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、マツダ，Ｆ．（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｆ．）ら著、１９９８年、実験医学ジャーナル（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．）、１８８巻（１１号）；２１５１～６２頁およびリー，Ａ．（Ｌｉ，Ａ．）ら著、２００４年、血液（Ｂｌｏｏｄ．）、１０３巻（１２号：４６０２～９頁）。各軽鎖は、１個の共有結合的ジスルフィド結合によって重鎖に連結しており、一方、ジスルフィド連結の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を置いた鎖内のジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、１つの端部において、可変ドメイン（ＶＨ）、それに続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、１つの端部において可変ドメイン（ＶＬ）およびその他の端部において定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列化し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列化する。
本明細書において使用する場合、用語「可変ドメイン」は、抗体の間で配列が広範に異なり、かつその特定の抗原についてのそれぞれの特定の抗体の結合および特異性において使用される、抗体重鎖および軽鎖の両方上に見出される特異的抗体ドメインを指す。可変ドメインは、超可変領域を含む。本明細書において使用する場合、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与するアミノ酸残基を含む可変ドメイン内の領域を指す。超可変領域内に存在するアミノ酸は、抗体の抗原結合部位の部分となる相補性決定領域（ＣＤＲ）の構造を決定する。本明細書において使用する場合、用語「ＣＤＲ」は、その標的抗原またはエピトープに対して相補性である構造を含む抗体の領域を指す。抗原と相互作用しない可変ドメインの他の部分は、フレームワーク（ＦＷ）領域と称される。抗原結合部位（抗原接合部位またはパラトープとしてまた公知である）は、特定の抗原と相互作用することが必要とされるアミノ酸残基を含む。抗原結合部位を構成する正確な残基は典型的には、結合した抗原による共結晶学によって解明されるが、他の抗体との比較に基づいたコンピュータを利用したアセスメントをまた使用することができる（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ストロール，Ｗ．Ｒ．（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．）、治療用抗体工学（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．）ウッドヘッドパブリッシング（Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、フィラデルフィア、ＰＡ．、２０１２年、第３章、４７～５４頁）。ＣＤＲを構成する決定残基は、これらに限定されないが、カバット（Ｋａｂａｔ）［そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ウー，Ｔ．Ｔ．（Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．）ら著、１９７０年、ＪＥＭ、１３２巻（２号）：２１１～５０頁およびジョンソン，Ｇ．（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．）ら著、２０００年、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２８巻（１号）：２１４～８頁］、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）［そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびレスク（Ｌｅｓｋ）、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９６巻、９０１頁（１９８７年）、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４２巻、８７７頁（１９８９年）およびアル－ラジカニ，Ｂ．（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．）ら著、１９９７年、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、２７３巻（４号）：９２７～４８頁］、ルフラン（Ｌｅｆｒａｎｃ）（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ルフラン，Ｍ．Ｐ．（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．）ら著、２００５年、イムノームリサーチ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓ．）、１：３）およびオネゲル（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ）（オネゲル，Ａ．（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．）およびプルッカン，Ａ．（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．）、２００１年、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、３０９巻（３号）：６５７～７０頁）によって教示されたものを含めたナンバリングスキームの使用を含み得る。
ＶＨおよびＶＬドメインは、それぞれ３個のＣＤＲを有する。ＶＬ ＣＤＲは、本明細書において、可変ドメインポリペプチドに沿ってＮ末端からＣ末端に移動するとき現れた順に、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３と称される。ＶＨ ＣＤＲは、本明細書において、可変ドメインポリペプチドに沿ってＮ末端からＣ末端に移動するとき現れた順に、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３と称される。ＣＤＲのそれぞれは、ＣＤＲ－Ｈ３を例外として、好ましい極限構造を有し、これは抗原結合性ドメインにおける種々の三次元構造をもたらす、抗体の間で配列および長さにおいて高度に可変であり得るアミノ酸配列を含む（ニコラウディス，Ｄ．（Ｎｉｋｏｌｏｕｄｉｓ，Ｄ．）ら著、２０１４年、ピアＪ（ＰｅｅｒＪ．）、２巻：ｅ４５６頁）。場合によって、ＣＤＲ－Ｈ３は関連する抗体のパネルの間で分析し、抗体の多様性をアセスメントし得る。ＣＤＲ配列を決定する様々な方法は当技術分野において公知であり、公知の抗体配列に適用し得る（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ストロール，Ｗ．Ｒ．（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．）、治療用抗体工学（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．）ウッドヘッドパブリッシング（Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、フィラデルフィア、ＰＡ．、２０１２年、第３章、４７～５４頁）。
本明細書において使用する場合、用語「Ｆｖ」は、完全抗原結合部位を形成するのに必要とされる抗体上の最小のフラグメントを含む抗体フラグメントを指す。これらの領域は、密接な非共有結合的に会合している１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。Ｆｖフラグメントは、タンパク質分解的切断によって生じさせることができるが、大いに不安定である。典型的には、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの間の柔軟なリンカーの挿入［単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成させる］によって、または重鎖および軽鎖可変ドメインの間のジスルフィド架橋の導入によって、安定的なＦｖフラグメントを生じさせるための組換え方法は、当技術分野において公知である（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ストロール，Ｗ．Ｒ．（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．）、治療用抗体工学（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．）、ウッドヘッドパブリッシング（Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、フィラデルフィア、ＰＡ．、２０１２年、第３章、４６～４７頁）。
任意の脊椎動物種からの抗体「軽鎖」は、これらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパおよびラムダと称される２つの明らかに別個のタイプの１つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、抗体は、異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスのインタクトな抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分けてもよい。
本明細書において使用する場合、用語「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＨおよびＶＬ抗体ドメインの融合タンパク質を指し、これらのドメインは、柔軟なペプチドリンカーによって一本鎖ポリペプチドへと一緒に連結している。一部の実施形態では、Ｆｖポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能とする。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイまたは他のディスプレイ方法と合わせて利用され、ここでこれらは表面メンバー（例えば、ファージコートタンパク質）と関連して発現し、所与の抗原についての高親和性ペプチドの同定において使用し得る。
用語「二特異性抗体」は、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、フラグメントは、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメインＶＬに接続した重鎖可変ドメインＶＨを含む。短すぎて同じ鎖上の２個のドメインの間の対形成を可能としないリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成し、２個の抗原結合部位を生じさせることを強いられる。二特異性抗体は、例えば、これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書中に組み込まれている欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；およびホリンガー（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９０巻：６４４４～６４４８頁（１９９３年）においてより完全に記載されている。
用語「細胞内抗体」は、それが産生される細胞から分泌されない抗体の１形態を指すが、代わりに、１種もしくは複数の細胞内タンパク質を標的とする。細胞内抗体を使用して、これらに限定されないが、細胞内輸送、転写、翻訳、代謝過程、増殖シグナル伝達および細胞分裂を含めた多数の細胞過程に影響を与え得る。一部の実施形態では、本発明の方法は、細胞内抗体をベースとする治療を含み得る。一部のこのような実施形態では、本明細書において開示されている可変ドメイン配列および／またはＣＤＲ配列は、細胞内抗体をベースとする治療のための１種もしくは複数の構築物中に組み込み得る。場合によって、本発明の細胞内抗体は、１種もしくは複数の糖化された細胞内タンパク質を標的とし得るか、または１種もしくは複数の糖化された細胞内タンパク質および代替タンパク質の間の相互作用をモジュレートし得る。
用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、本明細書において使用する場合、免疫エフェクター細胞の表面上に発現するように工学処理されて、人工的な受容体に高親和性を伴って結合する実体を発現している細胞へのこのような免疫エフェクター細胞の特異的ターゲッティングがもたらされる、人工的な受容体を指す。ＣＡＲは、このようなＣＡＲが免疫エフェクター細胞上に発現しているとき、免疫エフェクター細胞はＣＡＲの抗体部分によって認識される任意の細胞を結合および排除するように、抗体、抗体可変ドメインおよび／または抗体ＣＤＲの１つもしくは複数のセグメントを含むように設計し得る。場合によって、ＣＡＲは、がん細胞を特異的に結合し、がん細胞の免疫によってレギュレートされるクリアランスをもたらすように設計される。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用する場合、実質的に均一な細胞（またはクローン）の集団から得た抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生の間に生じ得る可能なバリアントを除いて、同一であり、かつ／または同じエピトープを結合し、このようなバリアントは一般に、少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。
修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得たという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されない。モノクローナル抗体は、本明細書において、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖（複数可）の残部は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびこのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一または相同である。
ヒトではない（例えば、マウスの）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここでは、レシピエントの抗体からの超可変領域からの残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有するヒトではない種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヒトではない霊長類の抗体からの超可変領域からの残基で置き換えられている。ヒト化抗体は、ドナー抗体において見出されるアミノ酸への１個もしくは複数のアミノ酸の復帰を含む、１つもしくは複数の逆突然変異を含み得る。逆に、ヒト化抗体に含まれるドナー抗体からの残基は、ヒトレシピエント抗体中に存在するマッチ残基に変異し得る。
一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、抗体模倣物であり得る。用語「抗体模倣物」は、抗体の機能または効果を模倣し、かつ特異的および高親和性を伴ってそれらの分子標的に結合する任意の分子を指す。一部の実施形態では、抗体模倣物は、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（Ｆｎ３）をタンパク質スカフォールドとして組み込むように設計されたモノボディであり得る（米国特許第６，６７３，９０１号明細書；米国特許第６，３４８，５８４号明細書）。一部の実施形態では、抗体模倣物は、これらに限定されないが、ａｆｆｉｂｏｄｙ分子、アフィリン、アフィチン、アンチカリン、アヴィマー、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒおよびクニッツおよびドメインペプチドを含めた当技術分野において公知のものであり得る。他の実施形態では、抗体模倣物は、１つもしくは複数の非ペプチド領域を含み得る。
本明細書において使用する場合、用語「抗体バリアント」は、構造、配列および／または機能において、生体分子類似抗体を指すが、別の抗体または天然抗体と比較してこれらのアミノ酸配列、組成物または構造においていくつかの差異を含む。
抗体の開発
本発明のグリカン相互作用抗体は、抗原、例えば、本明細書に記載されているものを結合するように開発される。本明細書において使用する場合、「抗原」は、生物において免疫応答を誘発または誘起する実体である。免疫応答は、異種実体の存在に対する生物の細胞、組織および／または器官の反応によって特性決定される。このような免疫応答は典型的には、生物による異種実体、例えば、抗原または抗原の部分に対する１種もしくは複数の抗体の産生をもたらす。場合によって、免疫化の方法は、１つもしくは複数の所望の免疫化の成果に基づいて変化し得る。ここで使用するように、用語「免疫化の成果」は、免疫化の１つもしくは複数の所望の効果を指す。例は、目的の標的について高い抗体力価および／または増加した抗体特異性を含む。
本発明の抗原は、グリカン、グリココンジュゲート（これらに限定されないが、糖タンパク質および糖脂質を含めた）、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、または上記のいずれかを含み得、１種もしくは複数の別々のアジュバントもしくは異種タンパク質にコンジュゲートするか、または複合体化し得る。一部の実施形態では、本発明の方法によって使用される抗原は、シアル酸付加されたグリカン、例えば、ＳＴｎを含み得る。ＳＴｎを有する抗原は、ムチンを含み得る。ムチンは、重度にグリコシル化されているタンパク質のファミリーである。これらは、上皮細胞に由来する多くの腫瘍の構成要素である（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、イシダ，Ａ．（Ｉｓｈｉｄａ，Ａ．）ら著、２００８年、プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、８巻：３３４２～９頁）。これらは顎下腺によって高度に発現されており、高レベルで唾液および粘液において見出すことができる。動物由来の顎下ムチンは、免疫原性宿主において抗ＳＴｎ抗体を生じさせるために抗原として使用し得る。異なる種からの顎下ムチンは、ＡｃＳＴｎ対ＧｃＳＴｎ形態に関して、これらのＳＴｎ含量において異なる。ブタの顎下ムチン（ＰＳＭ）は、ＧｃＳＴｎが特に富んでおり、総ＳＴｎの約９０％を構成する。ウシの顎下ムチン（ＢＳＭ）からのＳＴｎは、概ね等しい百分率のＧｃＳＴｎおよびＡｃＳＴｎを含む。ヒツジの顎下ムチン（ＯＳＭ）は、ＡｃＳＴｎにおいて特に富んでおり、総ＳＴｎの約９０％を構成する。場合によって、免疫化のために調製される溶液は、このような免疫化からもたらされる抗体の所望の標的によって、ＰＳＭ、ＢＳＭおよびＯＳＭの１つもしくは複数を含むように修飾し得る。ＰＳＭは、ＧｃＳＴｎに対して特異的である可能性が高い免疫原性宿主において抗体を生じさせるために免疫化において使用し得る。ＰＳＭは、ＧｃＳＴｎで装飾されている、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有ムチンタイプの糖タンパク質に富んでいる。高いＮｅｕ５Ｇｃ含量の現在公知の源の中には、赤肉がある。特に、顎下腺は、Ｎｅｕ５Ｇｃ前駆体であるＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを産生する反応を触媒するＣＭＡＨ酵素の高発現によってＮｅｕ５Ｇｃの豊富な源として従前に記載された。場合によって、ＰＳＭは、汎抗Ｎｅｕ５Ｇｃ応答を防止し、かつＧｃＳＴｎに対するより特異的免疫応答を誘発するために使用し得る。ＯＳＭは、ＡｃＳＴｎに対して特異的である可能性が高い免疫原性宿主において抗体を生じさせる免疫化において使用し得る。
一実施形態では、本発明は、ＧｃＳＴｎ特異的であるグリカン相互作用抗体を提供する。抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃ－ＳＴｎまたはＴｎへの僅かな交差反応性を有する。抗体は、ＧｃＳＴｎを結合することができるが、ＡｃＳＴｎに対して低減した親和性を有する。
一部の実施形態では、抗原は、免疫化の前に酵素消化に供し、免疫原性宿主におけるこのように得られた免疫応答をモジュレートし得る。一例では、顎下ムチンは、免疫化の前にトリプシンまたはプロテイナーゼＫ酵素で処理し得る。このような酵素の活性は切断されることを助け、それによって、非ＳＴｎエピトープの百分率および可変性を低減し得る。グリカン部分は、それらが付着しているペプチドの領域を酵素によるタンパク質分解から遮蔽し得、それによってインタクトなままである。免疫化に由来する抗体力価は、このような免疫化において使用される抗原のタイプおよび量によって異なる抗体レベルを有し得る。場合によって、特定の抗原は、予想される力価に基づいて免疫化において使用するために選択し得る。
本明細書において使用する場合、「アジュバント」は、他の薬剤の効果を修飾する薬理学的または免疫学的薬剤である。本発明によるアジュバントは、これらに限定されないが、化学組成物、生体分子、治療剤、および／または治療レジメンを含む。アジュバントは、フロイントアジュバント（完全および／または不完全）、免疫賦活性オリゴヌクレオチド［例えば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）］、鉱物含有組成物、細菌のＡＤＰ－リボシル化毒素、バイオ接着剤、粘膜接着剤、微粒子、脂質、リポソーム、ムラミルペプチド、Ｎ－酸化ポリエチレン－ピペラジン誘導体、サポニンおよび／または免疫刺激複合体（ＩＳＣＯ）を含み得る。一部の実施形態では、アジュバントは、水中油型乳剤（例えば、サブミクロン水中油型乳剤）を含み得る。本発明によるアジュバントはまた、そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１２００２７８１３号明細書および／または米国特許第８５０６９６６号明細書において開示されているもののいずれかを含み得る。
本発明の抗体は、当技術分野において公知の方法によって、または本出願に記載されているように産生される、ポリクローナルまたはモノクローナルまたは組換えであり得る。一部の実施形態では、本発明の抗体は、検出の目的のために当業者には公知の検出可能な標識で標識し得る。標識は、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、もしくは酵素補因子、または当技術分野において公知の任意の他の標識でよい。いくつかの態様では、所望の抗原に結合する抗体は標識されていないが、一次抗体に特異的に結合する標識された二次抗体の結合によって検出し得る。
本発明の抗体（例えば、グリカン相互作用抗体）には、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含めた）、細胞内に作製された抗体（すなわち、細胞内抗体）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる。本発明の抗体（例えば、グリカン相互作用抗体）は、鳥および哺乳動物を含めた任意の動物起源からでよい。好ましくは、このような抗体は、ヒト、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ起源のものである。本発明の抗体は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異的、三重特異性、もしくはそれ超の多重特異性）でよい。多重特異的抗体は、本発明の標的抗原の異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または本発明の標的抗原、および異種エピトープ、例えば、異種グリカン、ペプチドもしくは固体支持体材料の両方に対して特異的であり得る。（例えば、国際公開第９３／１７７１５号パンフレット；国際公開第９２／０８８０２号パンフレット；国際公開第９１／００３６０号パンフレット；国際公開第９２／０５７９３号パンフレット；タット，Ａ．（Ｔｕｔｔ，Ａ．）ら、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体およびＣＤ２を介して協同的シグナル伝達を使用し、休止している細胞毒性Ｔ細胞を活性化および再方向付ける三重特異的Ｆ（ａｂ’）３誘導体（Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆ（ａｂ’）３ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈａｔ ｕｓｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｖｉａ ｔｈｅ ＴＣＲ／ＣＤ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ＣＤ２ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ａｎｄ ｒｅｄｉｒｅｃｔ ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、免疫学ジャーナル（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９１年７月１日；１４７巻（１号）：６０～９頁；米国特許第４，４７４，８９３号明細書；同第４，７１４，６８１号明細書；同第４，９２５，６４８号明細書；同第５，５７３，９２０号明細書；同第５，６０１，８１９号明細書；およびコステルニ，Ｓ．Ａ．（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．）ら著、ロイシンジッパーの使用による二重特異的抗体の形成（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒｓ．）、免疫学ジャーナル（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９２年３月１日；１４８巻（５号）：１５４７～５３頁を参照されたい）。
本開示のグリカン相互作用抗体は、モノクローナル抗体を開発するための当技術分野において公知の十分に確立した方法を使用して調製し得る。一実施形態では、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製される（ケーラー，Ｇ．（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．）ら著、所定の特異性の抗体を分泌する融合細胞の連続培養（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７５年８月７日；２５６巻（５５１７号）：４９５～７頁）。ハイブリドーマ形成のために、最初に、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物は典型的には、免疫剤（例えば、本発明の標的抗原）で免疫化して、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、もしくは産生することができるリンパ球を引き出す。代わりに、リンパ球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化し得る。次いで、リンパ球は、適切な融剤、例えば、ポリエチレングリコールを使用して不死化細胞系と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（ゴディング，Ｊ．Ｗ．（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．）、モノクローナル抗体：原理および実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．）、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．）、１９８６年；５９～１０３１頁）。不死化細胞系は通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウサギ、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞系が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合不死化細胞の成長または生存を阻害する１種もしくは複数の物質を含有する適切な培養培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の成長を防止する。
好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベル発現を支援し、培地、例えば、ＨＡＴ培地に対して感受性であるものである。より好ましい不死化細胞系は、例えば、サルク研究所の細胞配布センター（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）、サンディエゴ、カリフォルニアおよびアメリカ培養細胞系統保存機関、マナッサス、ヴァージニアから得ることができるマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞系はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されてきた（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．ら著、ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトハイブリッド骨髄腫（Ａ ｈｕｍａｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍｙｅｌｏｍａ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．）、免疫学ジャーナル（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９８４年１２月；１３３巻（６号）：３００１～５頁；ブロジャー，Ｂ．（Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｂ．）ら著、モノクローナル抗体産生技術および用途（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．）、マルセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９８７年；３３巻：５１～６３頁）。
一部の実施形態では、骨髄腫細胞は、遺伝子操作に供し得る。このような操作は、本明細書に記載のようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）突然変異誘発を使用して行い得る。代わりに、当技術分野において公知のトランスフェクション方法を使用し得る。ＮＳ０骨髄腫細胞または他のマウス骨髄腫細胞系は使用し得る。例えば、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４は、ハイブリドーマ開発のための代替の細胞系であり得る。
転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）によって誘発される遺伝子エディティングは、代替の遺伝子ノックアウト方法を提供する。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生じる人工的な制限酵素である。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、エラープローンＮＨＥＪによって修復することができる所望の座位における二重鎖切断を誘発し、切断部位における挿入／欠失を生じさせる（ウッド，Ａ．Ｊ．（Ｗｏｏｄ，Ａ．Ｊ．）ら著、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを使用した種に亘る標的化されたゲノムエディティング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｃｒｏｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＺＦＮｓ ａｎｄ ＴＡＬＥＮｓ．）、科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１１年７月１５日；３３３巻（６０４０号）：３０７頁）。セレクティスバイオリサーチ（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ）（ケンブリッジ、ＭＡ）は、ＴＡＬＥＮ設計およびプラスミド構築のサービスを提供する。ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、次いで、モノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性（すなわち、特異的免疫反応性）は、免疫沈降によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合アッセイ、例えば、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。このような技術およびアッセイは、当業者には公知である。モノクローナル抗体の結合特異性は、例えば、スキャッチャード分析によって決定することができる（マンソン，Ｐ．Ｊ．（Ｍｕｎｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．）ら、リガンド：リガンド結合系の特性決定のための多用途のコンピュータ化されたアプローチ（Ｌｉｇａｎｄ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ）、分析生化学（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９８０年９月１日；１０７巻（１号）：２２０～３９頁）。場合によって、所与の抗原の領域についての抗体特異性は、抗体結合についてアッセイする前に、抗原を化学的に修飾することによって特性決定し得る。一例では、シアル酸のＣ６側鎖を破壊するために過ヨウ素酸処理を使用し得る。アッセイは、過ヨウ素酸処理を伴っておよび伴わずに行って、無処理の試料における結合がシアル酸特異的であるかどうかを明らかにし得る。場合によって、９－Ｏ－アセチル化シアル酸を有する抗原は、穏やかな塩基処理（例えば、０．１ＭのＮａＯＨによる）に供し、９－Ｏ－アセチル基を破壊し得る。アッセイは、穏やかな塩基処理を伴っておよび伴わずに行って、無処理の試料における結合がシアル酸の９－Ｏ－アセチル化によって決まるかどうかを明らかにし得る。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させ得る。この目的のための適切な培養培地は、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地またはＲＰＭＩ－１６４０培地を含む。代わりに、ハイブリドーマ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物における腹水として成長し得る。
ハイブリドーマをクローニングする代替方法は、ＳＴＥＭＣＥＬＬテクノロジーズ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（バンクーバー、ＢＣ、カナダ）からのキット、例えば、ハイブリドーマクローンの選択および成長をサポートする、メチルセルロースをベースとする半流動培地および他の培地および試薬を含有するＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）－ＨＹキットによって提供されるものを含み得る。しかし、このキットにおける培地はＦＣＳを含有し、これはＮｅｕ５Ｇｃ組込みのための外因性の源を提供する。内因性Ｎｅｕ５Ｇｃ合成のための機構はＣｍａｈ－／－ハイブリドーマにおいて破壊されるが、培養培地から組み込まれたＮｅｕ５Ｇｃはまた、場合によって問題を提起し得る（バルドー，Ｍ．（Ｂａｒｄｏｒ，Ｍ．）ら、ヒト細胞中への非ヒトシアル酸Ｎ－グリコリルノイラミン酸の取込みおよび組込みの機序（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ Ｎ－ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）、生物化学ジャーナル（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．）、２００５年、２８０巻：４２２８～４２３７頁）。そのような場合、培養培地は、Ｎｅｕ５Ａｃを補充して、代謝競合によるＮｅｕ５Ｇｃ組込みを排除し得る（ガデリ，Ｄ．（Ｇｈａｄｅｒｉ，Ｄ．）ら著、組換え治療用糖タンパク質におけるＮ－グリコリルノイラミン酸の存在の意味（Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｎ－ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１０年、２８巻：８６３～８６７頁）。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、通常の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロンテインＡ－セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによって、培養培地または腹水から単離または精製し得る。
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法、例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれている米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されているものによって作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、通常の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、ＤＮＡの好ましい源としての役割を果たす。単離すると、ＤＮＡは発現ベクター中に配置することができ、次いでこれは、宿主細胞中にトランスフェクトされる。宿主細胞には、これらに限定されないが、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るために免疫グロブリンタンパク質を他に産生しない、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、および骨髄腫細胞が含まれてもよい。ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てもしくは部分を共有結合的に接合することによって改変することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに代えて用いることができるか、またはキメラ二価抗体を生じさせるために、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに代えて用いることができる。
一部の実施形態では、本発明の抗体（例えば、グリカン相互作用抗体）は、当業者には公知の様々な手順によって産生し得る。ｉｎ ｖｉｖｏでのポリクローナル抗体の産生のために、宿主動物、例えば、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ロバ、ニワトリ、サル、ヒツジまたはヤギは、例えば、腹腔内および／または皮内注射によって、遊離または担体がカップリングした抗原で免疫化される。一部の実施形態では、注射材料は、約１００μｇの抗原または担体タンパク質を含有するエマルジョンであり得る。一部の実施形態では、注射材料は、グリカンに富んだ組成物、例えば、溶液中のヒトではない哺乳動物の顎下ムチンを含み得る。様々なアジュバントはまた、宿主動物種によって免疫応答を増加させるために使用することができる。アジュバントには、これらに限定されないが、フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）（ＣｙｔＲｘ社（ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐ）、ロサンゼルス、ＣＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウムパルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が含まれる。このようなアジュバントはまた当技術分野で周知である。いくつかのブースター注射は、例えば、固体表面に吸着されたグリカンおよび／または遊離ペプチドを使用したＥＬＩＳＡアッセイによって検出することができる有用な力価の抗体を実現するために、例えば、約２週間の間隔で必要とし得る。免疫化された動物からの血清中の抗体の力価は、抗体の選択によって、例えば、固体支持体上への抗原の吸着、および当技術分野で周知の方法による選択した抗体の溶出によって増加することができる。
グリカン相互作用抗体、そのバリアントおよびフラグメントは、発見のハイスループット方法を使用して選択および産生し得る。一実施形態では、合成抗体、そのバリアントおよびフラグメントを含むグリカン相互作用抗体は、ディスプレイライブラリーの使用によって産生される。用語「ディスプレイ」は、本明細書において使用する場合、所与の宿主の表面上のタンパク質またはペプチドの発現または「ディスプレイ」を指す。用語「ライブラリー」は、本明細書において使用する場合、独自のｃＤＮＡ配列および／またはこれらによってコードされるタンパク質のコレクションを指す。ライブラリーは、２つほどに少ない独自のｃＤＮＡから数千億の独自のｃＤＮＡを含有し得る。一部の実施形態では、合成抗体であるグリカン相互作用抗体は、抗体ディスプレイライブラリーまたは抗体フラグメントディスプレイライブラリーを使用して産生される。用語「抗体フラグメントディスプレイライブラリー」は、本明細書において使用する場合、ディスプレイライブラリーを指し、各メンバーは、抗体の少なくとも１個の可変領域を含有する抗体フラグメントをコードする。このような抗体フラグメントは好ましくは、Ｆａｂフラグメントであるが、他の抗体フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）もまた同様に意図される。Ｆａｂ抗体フラグメントライブラリーにおいて、コードされる各Ｆａｂは、Ｆａｂフラグメントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の可変ループ内に含有されるアミノ酸配列を除いて同一であり得る。代替またはさらなる実施形態では、個々のＶＨおよび／またはＶＬ領域内のアミノ酸配列もまた同様に異なり得る。
ディスプレイライブラリーは、これらに限定されないが、酵母、バクテリオファージ、細菌およびレトロウイルスを含めたいくつかの可能な宿主において発現し得る。使用し得るさらなるディスプレイ技術は、リボソーム－ディスプレイ、マイクロビース－ディスプレイおよびタンパク質－ＤＮＡ連結技術を含む。好ましい実施形態では、Ｆａｂディスプレイライブラリーは、酵母またはバクテリオファージ（本明細書において、また「ファージ」または「ファージ粒子」と称される）において発現している。発現しているとき、Ｆａｂは、ファージまたは酵母の表面を装飾し、ここで、これらは所与の抗原と相互作用することができる。グリカンを含む抗原、または所望の標的からの他の抗原は、その抗原への最も高い親和性を有する抗体フラグメントを発現しているファージ粒子または酵母細胞を選択するために使用し得る。結合した抗体フラグメントのＣＤＲをコードするＤＮＡ配列は、次いで、結合した粒子または細胞を使用した配列決定によって決定することができる。一実施形態では、ポジティブ選択は、抗体の開発において使用される。一部の実施形態では、ネガティブ選択は、抗体の開発において利用される。一部の実施形態では、ポジティブおよびネガティブ選択方法の両方は、ディスプレイライブラリーを使用して抗体の開発において複数のラウンドの選択の間に利用される。
酵母ディスプレイにおいて、異なる抗体フラグメントをコードするｃＤＮＡは、これらが発現している酵母細胞中に導入され、抗体フラグメントは、チャオ（Ｃｈａｏ）らによって記載されているように細胞表面上に「ディスプレイ」される（チャオ，Ｇ．（Ｃｈａｏ，Ｇ．）ら著、酵母表面ディスプレイを使用したヒト抗体の単離および工学処理（Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ．）、ネイチャープロトコル（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．）、２００６年；１巻（２号）：７５５～６８頁）。酵母表面ディスプレイにおいて、発現した抗体フラグメントは、酵母アグルチニンタンパク質、Ａｇａ２ｐを含むさらなるドメインを含有し得る。このドメインは、表面発現したＡｇａ１ｐとのジスルフィド結合の形成によって、抗体フラグメント融合タンパク質が酵母細胞の外表面に付着することを可能とする。結果は、特定の抗体フラグメントでコーティングした酵母細胞である。これらの抗体フラグメントをコードするｃＤＮＡのディスプレイライブラリーは最初に利用され、ここでは、抗体フラグメントはそれぞれユニーク配列を有する。これらの融合タンパク質は、数百万の酵母細胞の細胞表面上に発現しており、ここでこれらは所望の抗原性標的抗原と相互作用し、細胞と共にインキュベートすることができる。標的抗原は化学基または磁気基で共有結合的にまたは他の方法で修飾され、適切な抗体フラグメントとの結合の成功が起こった後、効率的な細胞選別を可能とし得る。回収は、磁力活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または当技術分野において公知の他の細胞選別方法によってであり得る。酵母細胞のサブ集団が選択されると、ＣＤＲ配列を決定するために対応するプラスミドを分析し得る。
バクテリオファージディスプレイ技術は典型的には、これらに限定されないが、ｆｄ、Ｆ１およびＭ１３ビリオンを含めた繊維状ファージを利用する。このような系統は非溶解性であり、宿主の連続した増殖、およびウイルス力価の増加を可能とする。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ方法の例は、ミエルシュ（Ｍｉｅｒｓｃｈ）らによって開示されているものを含む（ミエルシュ，Ｓ．（Ｍｉｅｒｓｃｈ，Ｓ．）ら著、合成抗体：コンセプト、可能性および実践的な考察（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．）、方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．）、２０１２年８月；５７巻（４号）：４８６～９８頁）、Ｂｒａｄｂｕｒｙ（ブラッドベリー）ら（ブラッドベリー，Ａ．Ｒ．（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａ．Ｒ．）ら著、天然抗体を超えて：ｉｎ ｖｉｔｒｏのディスプレイ技術のパワー（Ｂｅｙｏｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｈｅ ｐｏｗｅｒ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年３月；２９巻（３号）：２４５～５４頁）、ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）ら（ブリンクマン，Ｕ．（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．）ら著、ジスルフィド安定化されたＦｖフラグメントのファージディスプレイ（Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．）、免疫学的方法ジャーナル（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．）、１９９５年５月１１日；１８２巻（１号）：４１～５０頁）；エイムス（Ａｍｅｓ）ら（エイムス，Ｒ．Ｓ．（Ａｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．）ら著、全長免疫グロブリンへのコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーから単離したマウスＦａｂの変換（Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ Ｆａｂｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｔｏ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．）、免疫学的方法ジャーナル（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．）、１９９５年８月１８日；１８４巻（２号）：１７７～８６頁）；ケトルボロー（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ）ら（ケトルボロー，Ｃ．Ａ．（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．）ら著、ファージ－抗体ライブラリーを使用した免疫化されたマウスからの腫瘍細胞特異的単鎖Ｆｖの単離、およびこれらの抗体フラグメントからの全抗体の再構築（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅ－ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．）、ヨーロッパ免疫学ジャーナル（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９４年４月；２４巻（４号）：９５２～８頁）；パーシック（Ｐｅｒｓｉｃ）ら（パーシック，Ｌ．（Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．）ら著、ファージディスプレイライブラリーからの選択後の真核生物の抗体またはこれらのフラグメントの発現のための統合されたベクター系（Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｒ ｔｈｅｉｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．）、遺伝子（Ｇｅｎｅ．）、１９９７年３月１０日；１８７巻（１号）：９～１８頁）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号パンフレット；国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；国際公開第９１／１０７３７号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９３／１１２３６号パンフレット；国際公開第９５／１５９８２号パンフレット；国際公開第９５／２０４０１号パンフレット；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；同第５，５８０，７１７号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，７５０，７５３号明細書；同第５，８２１，０４７号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，５１６，６３７号明細書；同第５，７８０，２２５号明細書；同第５，６５８，７２７号明細書；同第５，７３３，７４３号明細書および同第５、９６９，１０８号明細書（これらのそれぞれは、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている）。バクテリオファージ上の抗体フラグメント発現は、フラグメントをコードするｃＤＮＡを、ウイルスコートタンパク質を発現している遺伝子中に挿入することによって行い得る。繊維状バクテリオファージのウイルスコートは、一本鎖ゲノムによってコードされる５つのコートタンパク質で構成されている。コートタンパク質ｐＩＩＩは、典型的には、Ｎ末端における抗体フラグメント発現のための好ましいタンパク質である。抗体フラグメント発現がｐＩＩＩの機能を損なう場合、ウイルス機能は、野生型ｐＩＩＩの同時発現によって回復し得る。しかし、このような発現は、ウイルスコート上に発現している抗体フラグメントの数を低減させるが、標的抗原による抗体フラグメントへのアクセスを増強し得る。ウイルスおよび抗体フラグメントタンパク質の発現は、代わりに複数のプラスミド上でコードし得る。この方法は、感染性プラスミドの全体的なサイズを低減させ、形質転換効率を増進するために使用し得る。
上記のように、高親和性抗体または抗体フラグメント（例えば、グリカン相互作用抗体）を発現している宿主の選択の後で、抗体または抗体フラグメントからのコード領域は、ヒト抗体を含めた全抗体、または任意の他の所望の抗原結合性フラグメントを生じさせるために単離および使用し、例えば、下記で詳細に記載するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含めた任意の所望の宿主において発現させることができる。
高親和性抗体をコードするＤＮＡ配列は、親和性成熟として公知であるプロセスにおけるさらなるラウンドの選択のために変異することができる。用語「親和性成熟」は、本明細書において使用する場合、それによって、抗体または抗体フラグメントをコードするｃＤＮＡ配列の連続的ラウンドの変異および選択によって、所与の抗原に対する増加した親和性を有する抗体が産生される方法を指す。場合によって、このプロセスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。これを達成するために、ＣＤＲコード配列の増幅は、エラープローンＰＣＲを使用して行い、これらに限定されないが、点変異、局所変異、挿入変異および欠失変異を含めた変異を含有する数百万のコピーを産生し得る。本明細書において使用する場合、用語「点変異」は、ヌクレオチド配列内の１個のヌクレオチドが異なるヌクレオチドに変化する核酸変異を指す。本明細書において使用する場合、用語「局所変異」は、２個もしくはそれよりも多い連続したヌクレオチドが異なるヌクレオチドに変化する核酸変異を指す。本明細書において使用する場合、用語「挿入変異」は、１個もしくは複数のヌクレオチドがヌクレオチド配列中に挿入される核酸変異を指す。本明細書において使用する場合、用語「欠失変異」は、１個もしくは複数のヌクレオチドがヌクレオチド配列から除去される核酸変異を指す。挿入変異または欠失変異は、全コドンの完全な置換え、または出発コドンの１個もしくは２個のヌクレオチドを変化させることによる１個のコドンの別のコドンへの変化を含み得る。
突然変異誘発は、ＣＤＲをコードするｃＤＮＡ配列上で行い、ＣＤＲ重鎖および軽鎖領域において唯一の変異を有する数百万の変異体を生じさせ得る。別のアプローチにおいて、ランダム変異は、親和性を改善させる可能性が最も高いＣＤＲ残基においてのみ導入される。これらの新規に生じた変異原性ライブラリーは、標的抗原に対してさらにより高い親和性を有する抗体フラグメントをコードするクローンについてスクリーニングするプロセスを繰り返すために使用することができる。連続するラウンドの変異および選択は、より大きな親和性を有するクローンの合成を促進する（チャオ，Ｇ．（Ｃｈａｏ，Ｇ．）ら著、酵母表面ディスプレイを使用したヒト抗体の単離および工学処理（Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ．）、ネイチャープロトコル（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．）、２００６年；１巻（２号）：７５５～６８頁）。
抗体および抗体フラグメント、例えば、ＦａｂおよびｓｃＦｖを産生するために使用することができる技術の例は、これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、米国特許第４，９４６，７７８号明細書および同第５，２５８、４９８号明細書；ミエルシュら（ミエルシュ，Ｓ．（Ｍｉｅｒｓｃｈ，Ｓ．）ら著、合成抗体：概念、可能性および実践的考察（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．）、方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．）、２０１２年８月；５７巻（４号）：４８６～９８頁）、チャオ（Ｃｈａｏ）ら（チャオ，Ｇ．（Ｃｈａｏ，Ｇ．）ら著、酵母表面ディスプレイを使用したヒト抗体の単離および工学処理（Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ．）、ネイチャープロトコル（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．）、２００６年；１巻（２号）：７５５～６８頁）、ヒューストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら（ヒューストン，Ｊ．Ｓ．（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．）ら著、単鎖Ｆｖ類似体および融合タンパク質のタンパク質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎａｌｏｇｓ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１９９１年；２０３巻：４６～８８頁）；シュー（Ｓｈｕ）ら（シュー，Ｌ．（Ｓｈｕ，Ｌ．）ら著、骨髄腫細胞からの単一遺伝子がコードする免疫グロブリンの分泌（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｇｅｎｅ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｒｏｍ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ．）、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．）、１９９３年９月１日；９０巻（１７号）：７９９５～９頁）；およびシュケラー（Ｓｋｅｒｒａ）ら（シュケラー，Ａ．（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．）ら著、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における機能的免疫グロブリンＦｖフラグメントのアセンブリー（Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．）、科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ．）、１９８８年５月２０日；２４０巻（４８５５号）：１０３８～４１頁）において記載されているものを含む。
ヒトおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出アッセイにおける抗体（例えば、グリカン相互作用抗体）のｉｎ ｖｉｖｏでの使用を含めたいくつかの使用のために、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましくあり得る。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウス単クローン性免疫グロブリンおよびヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有する抗体である。キメラ抗体を産生する方法は、当技術分野において公知である。（全内容が参照により本明細書中に組み込まれている、モリソン，Ｓ．Ｌ．（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．）、トランスフェクトーマは新規なキメラ抗体を提供する（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｎｏｖｅｌ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．）、科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ．）、１９８５年９月２０日；２２９巻（４７１９号）：１２０２～７頁；ギリース，Ｓ．Ｄ．（Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．）ら著、適合されたｃＤＮＡ可変領域カセットを使用したキメラ抗体の高レベル発現（Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｄａｐｔｅｄ ｃＤＮＡ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．）、免疫学的方法ジャーナル（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．）、１９８９年１２月２０日；１２５巻（１～２号）：１９１～２０２頁；ならびに米国特許第５，８０７、７１５号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書；および同第４，８１６，３９７号明細書）。
ヒト化抗体は、所望の抗原に結合し、かつ非ヒト種からの１つもしくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する、ヒトではない種からの抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、ドナー抗体のＣＤＲおよびフレームワーク領域からの対応する残基で置換され、抗原結合を変化させ、好ましくは、改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって、および特定の位置における普通でないフレームワーク残基を同定する配列比較によって同定される。（米国特許第５，６９３，７６２号明細書および同第５，５８５、０８９号明細書；リーシュマン，Ｌ．（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．）ら著、治療のためのヒト抗体のリシェーピング（Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８８年３月２４日；３３２巻（６１６２号）：３２３～７頁、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれている）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；および同第５，５８５，０８９号明細書）；ベニヤリングまたはリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号明細書；欧州特許第５１９，５９６号明細書；パドラン，Ｅ．Ａ．（Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．）、それらのリガンド結合特性を保存する一方で、抗体可変ドメインの免疫原性を低減させるための可能な手順（Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｈｉｌｅ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、分子免疫学（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９１年４月～５月；２８巻（４～５号）：４８９～９８頁；スタドニッカ，Ｇ．Ｍ．（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ，Ｇ．Ｍ．）ら著、ヒト工学処理されたモノクローナル抗体は、非ＣＤＲ相補性調節残基を保存することによって完全な特異的結合活性を保持する（Ｈｕｍａｎ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｔａｉｎ ｆｕｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｎｏｎ－ＣＤＲ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ．）、タンパク質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．）、１９９４年６月；７巻（６号）：８０５～１４頁；ログスカ，Ｍ．Ａ．（Ｒｏｇｕｓｋａ，Ｍ．Ａ．）ら著、可変ドメインリサーフェシングによるマウスモノクローナル抗体のヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ．）、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．）、１９９４年２月１日；９１巻（３号）：９６９～７３頁）；ならびに鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）；（これらのそれぞれは参照により本明細書中にその全体が組み込まれている）を含めた当技術分野で公知の種々の技術を使用してヒト化することができる。本発明のヒト化抗体は、所望の結合特異性、補体依存性細胞毒性、および抗体依存性細胞媒介細胞毒性などのために開発し得る。
場合によって、ヒトフレームワークは、ドナー抗体配列とヒトフレームワーク配列とのアラインメントによって選択され、最も高いレベルの相同性を有するヒトフレームワーク候補を見出す。場合によって、フレームワーク領域は、複数のヒトフレームワーク候補（例えば、フレームワーク領域１～３は、１つの候補から選択し得、フレームワーク領域４は、代替の候補から選択し得る）から選択し得る。場合によって、フレームワーク領域は、体細胞変異によって生じる免疫原性エピトープを含む危険性を回避するためにヒトコンセンサス配列から選択し得る。コンセンサス配列は、多くの配列を比較し、各位置において最も一般に出現する残基を採用することによって形成される配列である。場合によって、ヒトフレームワークは、ヒト生殖系列配列から選択し得る。これらは、データベース検索（例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベースまたは他のデータベースを使用した）によって同定し得る。
軽鎖および重鎖ヒトフレームワークは、同じまたは異なるクローンから選択し得る。同じクローンに由来する軽鎖および重鎖は、機能的である結合部位を形成する会合のより大きな可能性を有する。しかし、重鎖および軽鎖の間のインターフェースの保存された性質は典型的には、異なるクローンからの軽鎖および重鎖が会合して、機能的であることを可能とする。ヒト軽鎖および重鎖フレームワークの間の対形成の頻度は、例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｔｉｌｌｅｒら著、２０１３年、ＭＡｂｓ．、５巻（３号）：４４５～７０頁において概観することができる。
ヒト化抗体配列における残基には、ヒト化の間に失われた抗体親和性を改善または回復するために、「逆突然変異」を考慮し得る。逆突然変異は、当初の非ヒト抗体配列において存在するものに戻る、ヒト化の間に変化した残基を変更することを伴う。逆突然変異についての候補である残基は、例えば、極限抗体構造において見出される標準的な高次構造と比較することによって同定し得る（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、アル－ラジカニ（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら）著、１９９７年、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、２７３巻：９２７～４８頁を参照されたい）。普通でない極限残基は、同定され、逆突然変異について標的とし得る。場合によって、逆突然変異についての候補である残基は、ＣＤＲと接触している残基を指すために使用される用語である「バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）残基」であり得る。これらの残基は、ＣＤＲの位置付けおよび高次構造、したがって、抗体の親和性および／または特異性に影響を与えるより高い可能性を有する（ストロール，Ｗ．Ｒ．（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．）、治療用抗体工学（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ウッドヘッドパブリッシング（Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、フィラデルフィア、ＰＡ．、２０１２年、第６章、１１７頁）。場合によって、ヒトフレームワーク領域は定常に維持し、ドナー抗体からのＣＤＲは、経験による方法によって結合を維持する一方で、ヒトＣＤＲ領域にフィットするように逆突然変異する。
完全ヒト抗体（例えば、グリカン相互作用抗体）は、異種タンパク質への免疫反応を回避または軽減するためにヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、上記の抗体ディスプレイ方法を含めた当技術分野において公知の種々の方法によって作製することができる。これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、米国特許第４，４４４，８８７号明細書および同第４，７１６，１１１号明細書；ならびに国際公開第９８／４６６４５号パンフレット、国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９８／１６６５４号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、および国際公開第９１／１０７４１号パンフレットをまた参照されたい。
ヒト抗体（例えば、グリカン相互作用抗体）はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリンポリヌクレオチドを発現することができる、トランスジェニックマウスを使用して産生することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリヌクレオチド複合体は、ランダムに、または相同組換えによって、マウス胚性幹細胞中に導入することができる。代わりに、ヒト重鎖および軽鎖ポリヌクレオチドに加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域は、マウス胚性幹細胞中に導入し得る。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリヌクレオチドは、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座位の導入と別々にまたは同時に非機能的とすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内因性抗体の産生を防止する。改変された胚性幹細胞は増殖し、胚盤胞に微量注射し、キメラマウスを生じさせる。次いで、キメラマウスは、ヒト抗体を発現するホモ接合型子孫を産生するように飼育される。トランスジェニックマウスは、正常な様式で選択した抗原、例えば、本発明のグリカン、グリココンジュゲートおよび／またはポリペプチドの全てまたは部分で免疫化される。
このように、このような技術を使用して、有用なヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するための技術の概要については、ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）およびフサール（Ｈｕｓｚａｒ）（ロンバーグ，Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．）ら著、トランスジェニックマウスからのヒト抗体（Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．）、免疫学国際レビュー（Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９５年；１３巻（１号）：６５～９３頁）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するための技術、ならびにこのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察について、例えば、これらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９６／３４０９６号パンフレット；国際公開第９６／３３７３５号パンフレット；米国特許第５，４１３，９２３号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８８５，７９３号明細書；同第５，９１６，７７１号明細書；同第５，９３９，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；および同第６，１１４，５９８号明細書を参照されたい。さらに、会社、例えば、アブジェニクス社（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）（フリーモント、カリフォルニア）、プロテインデザインラブ社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）（マウンテンビュー、カリフォルニア）およびジェンファーム（Ｇｅｎｐｈａｒｍ）（サンホゼ、カリフォルニア）は、上記の技術と同様の技術を使用して、選択した抗原に対するヒト抗体を提供するように従事することができる。
本発明の抗体分子が動物、細胞系によって産生されるか、化学的に合成されるか、または組み換え技術によって発現されると、これは免疫グロブリンまたはポリペプチド分子の精製のための当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、特異的抗原、タンパク質Ａに対する親和性による、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度によって、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製（すなわち、単離）することができる。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書に記載されているかまたは他に当技術分野において公知の異種ポリペプチド配列に融合して、精製を促進することができる。
抗体および標的またはリガンド（例えば、所与の抗体を生じさせるために使用される抗原）の間の親和性は、本明細書に記載のような１つもしくは複数の結合アッセイを使用して、ＫＤに関して測定し得る。所与の抗体についての所望の用途によって、変動するＫＤ値が望ましくてもよい。高親和性抗体は典型的には、約１０－５Ｍもしくはこれ未満、例えば、約１０－６Ｍもしくはこれ未満、約１０－７Ｍもしくはこれ未満、約１０－８Ｍもしくはこれ未満、約１０－９Ｍもしくはこれ未満、約１０－１０Ｍもしくはこれ未満、約１０－１１Ｍもしくはこれ未満または約１０－１２Ｍもしくはこれ未満のＫＤを伴ってリガンド結合を形成する。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、これらの最大半量有効濃度または阻害濃度（それぞれ、ＥＣ５０またはＩＣ５０）によって特性決定し得る。場合によって、この値は、最も高い濃度の抗体で観察される最大阻害の半分と等しいレベルで、ＳＴｎを発現している細胞を阻害する（例えば、死滅させ、増殖を低減させ、かつ／または１つもしくは複数の細胞機能を低減する）のに必要とされる抗体の濃度を表し得る。このようなＩＣ５０値は、約０．００１ｎＭ～約０．０１ｎＭ、約０．００５ｎＭ～約０．０５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．０５ｎＭ～約５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．５ｎＭ～約２５ｎＭ、約１ｎＭ～約５０ｎＭ、約５ｎＭ～約７５ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約２５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約１０００ｎＭまたは１０００ｎＭ超であり得る。
一部の実施形態では、本開示において教示される抗体は、患者に由来するがん細胞および／またはがん幹細胞（ＣＳＣ）を標的とするこれらの能力について試験し得る。このような実施形態によると、患者に由来するがん細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養してもよく、本開示の抗体は、このような細胞を標的とするために使用し得る。
他の実施形態では、患者に由来する細胞は、患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍を生じさせるために使用し得る。場合によって、組織構造として維持されている原発性または転移性の固形腫瘍の小片は、手術または生検手順によって集め得る。場合によって、悪性の腹水または胸水から流れる液体を使用し得る。腫瘍は、単独で、またはいくつかの研究において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニングライフサイエンス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、コーニング、ＮＹ）でコーティングして、またはヒト線維芽細胞もしくは間葉系幹細胞と混合して、小片または単一の細胞懸濁液として埋め込み得る。埋込の部位は、マウスの背側の領域（皮下埋込）を含み得るが、最初の腫瘍と同じ器官における埋込はオプションであり得る（同所性埋込、すなわち、膵臓、口腔、卵巣、乳房脂肪体、脳など）。さらに、腫瘍の起源とは無関係に、いくつかのアプローチは、生着成功率を増加させるために、腎被膜において原発性腫瘍を埋め込むことを含み得る。異なる程度の免疫抑制を有する種々のマウス系統は、このような研究において使用し得る。ホルモン感受性腫瘍について、いくつかの研究は、生着率を増加させる目的でホルモン補充を使用し得る。一部の実施形態では、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスにおいてＰＤＸ腫瘍を生じさせ得る。抗体は、ＰＤＸ腫瘍を有するマウスに投与し得、腫瘍体積に対する効果を分析し得る。場合によって、ＰＤＸ腫瘍は、切開し、細胞解離に供し、このように得られた細胞は培養液中で成長させ得る。これらの細胞を標的とする本開示の抗体の能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアセスメントし得る。
抗体の調製は、モノクローナルまたはポリクローナルであろうと、当技術分野において公知である。抗体の産生のための技術は当技術分野で周知であり、例えば、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８８年およびハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、「抗体の使用：実験室マニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９９年に記載されている。
標的
本発明のグリカン相互作用抗体は、１種もしくは複数のグリカンまたはグリカン関連標的またはグリカンに関連する標的に（可逆的にまたは不可逆的に）結合することによってこれらの効果を発揮し得る。一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、本明細書において教示されている標的の任意の領域から調製することができる。一部の実施形態では、本発明の標的は、グリカンを含む。抗体を生じさせるために使用されるグリカンは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個の残基を有する糖の鎖を含み得る。抗体を生じさせるために使用されるいくつかのグリカンは、約２個の残基から約５個の残基を含み得る。
一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体標的抗原は、シアル酸を含む。Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）およびＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）は、哺乳動物細胞表面上の主要なシアル酸である。これらのうち、Ｎｅｕ５Ａｃは、ヒトにおいて天然に産生される。Ｎｅｕ５Ｇｃは、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡｃからのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ｇｃ産生に関与するシチジン一リン酸（ＣＭＰ）－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）遺伝子における変異によって、ヒトを例外として大部分の哺乳動物において天然に産生される。ヒトにおけるＮｅｕ５Ｇｃは、実際、免疫原性であり、殆ど全てのヒトは抗Ｎｅｕ５Ｇｃ抗体を発現している。産生の欠如にも関わらず、大部分のヒト系は、食事摂取によってある程度のレベルのＮｅｕ５Ｇｃを含む。これらの異種産物は、ヒト糖タンパク質中にそれに続いて組み込まれる。このような糖タンパク質は、本発明の標的として意図される。本発明のグリカン標的抗原には、これらに限定されないが、下記の表において列挙したものが含まれてもよい。
Figure 0007066613000001
Figure 0007066613000002
 下記の略語を本明細書において使用する。Ｇｌｃ－グルコース、Ｇａｌ－ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＧａｌＮＡｃ－Ｎ－アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ－６－スルホ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＫＤＮ－２－ケト－３－デオキシ－Ｄ－ｇｌｙｃｅｒｏ－Ｄ－ガラクトノノン酸、Ｎｅｕ５，９Ａｃ２－Ｎ－アセチル－９－Ｏ－アセチルノイラミン酸、Ｆｕｃ－フコースおよびＮｅｕ５ＧｃＯＭｅ－２－Ｏ－メチル－Ｎ－グリコリルノイラミン酸。Ｏ－グリコシド結合は、結合によって接合している２個の残基の間の相対的化学量論を示すαおよびβと共に列挙されているグリカンにおける各残基の間に存在し、ここで、αは、軸方向の配向を示し、βは、エクアトリアル配向を示す。フォーマットｘ，ｘにおけるαおよび／またはβに続く数は、結合形成に関与する近接した残基のそれぞれからの炭素のそれぞれの炭素数を示す。従前の表において列挙するグリカンは、意図する個々のグリカン標的抗原を表す一方、本発明はまた、上記で提示したグリカンが、提示したものと異なるαおよびβ－配向されたＯ－グリコシド結合の組合せを含む実施形態を含む。また従前の表において、Ｒは、グリカンがカップリングし得る実体を表す。一部の実施形態では、Ｒは、タンパク質であり、グリカンは典型的には、セリンまたはトレオニン残基に連結している。一部の実施形態では、Ｒは、例えば、グリカンアレイにおいて、グリカンを基材に接合するために使用されるリンカー分子である。一部の実施形態では、Ｒは、－（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２または－（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＮＨ２の式を有するリンカーであり得る。一部の実施形態では、Ｒは、ビオチン、アルブミン、ＰｒｏＮＨ２、－ＣＨ－、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＯＣＨ２ＣＨ３、－Ｈ、ヒドリド、ヒドロキシ、アルコキシル、酸素、炭素、硫黄、窒素、ポリアクリルアミド、リン、ＮＨ２、ＰｒｏＮＨ２＝Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＮＨ２、蛍光標識２－アミノベンズアミド（ＡＢ）および／または２－アミノ安息香酸（ＡＡ）、アルキルアミンを含有する２－アミノベンズアミド類似体（ＡＥＡＢ）、アミノオキシ基、メチルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アミノ脂質１，２－ジヘキサデシル－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、アミノオキシ（ＡＯ）官能化ＤＨＰＥ、ならびにグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）であり得る。Ｒの源または性質を限定することを意図しないが、これはグリカン残基の物理的な間隔に影響を与える構造を含み得る。一部の実施形態では、Ｒ基は、ここで提示するＲ基、例えば、ビオチン化ポリアクリルアミドの組合せを含み得る。一部の実施形態では、基礎をなす基材と組み合わせたＲ基は、グリカン残基の間隔をもたらす。
本発明のグリカン標識は、抗体認識の１つもしくは複数の領域を含み得る。本明細書において使用する場合、用語「抗体認識の領域」は、分子、付着基の任意の部分上に位置しているか、またはグリカンと、これらに限定されないが、別のグリカン、タンパク質、膜、細胞表面構造、もしくは細胞外マトリックス構成要素を含めた別の分子との間の相互作用の領域上に位置している、セグメントを指す。一部の実施形態では、抗体認識の領域は、鎖間の標的部位において位置しており、ここで、用語「鎖間」は、本ポリマー鎖内を意味する。鎖間の標的部位は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または少なくとも１０個の残基、残基の間の結合、または残基および結合の組合せを有する抗体認識の領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体認識の領域は、１個もしくは複数のグリカン鎖の間の相互作用の領域において位置している。このような領域は、２個、３個、４個または少なくとも５個のグリカン鎖の間であり得る。
一部の実施形態では、抗体認識の領域は、一般の親鎖に接続しているグリカン分岐鎖の間の相互作用の領域において位置している。一部の実施形態では、抗体認識の領域は、グリカン分岐鎖および親鎖の間の相互作用の領域において位置している。一部の実施形態では、抗体認識の領域は、グリカンおよびタンパク質の間の相互作用の領域において位置している。相互作用のこのような領域は、これらに限定されないが、共有結合、イオン結合、静水結合（ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ ｂｏｎｄ）、疎水性結合および水素結合を含めた、グリカンおよびタンパク質の間の化学結合を含み得る。一部の実施形態では、抗体認識の領域は、グリカンと、これらに限定されないが、脂質および核酸を含めた他の生体分子との間の相互作用の領域において位置している。相互作用のこのような領域は、これらに限定されないが、共有結合、イオン結合、静水結合、疎水性結合および水素結合を含めたグリカンおよび生体分子の間の化学結合を含み得る。
一部の実施形態では、本発明のグリカン標的は、グリココンジュゲートの構成要素である。本明細書において使用する場合、用語「グリココンジュゲート」は、グリカン部分と接合した任意の実体を指す。一部の実施形態では、グリココンジュゲートは、糖脂質である。本明細書において使用する場合、用語「糖脂質」は、炭水化物部分が共有結合的に付着している脂質の１クラスを指す。一部の実施形態では、糖脂質上に存在する炭水化物部分は、グリカンであり得る。一部の実施形態では、糖脂質の脂質構成要素は、セラミド部分を含む。本発明の標的として意図される糖脂質の例には、これらに限定されないが、グリセロ糖脂質（これらに限定されないが、ガラクト脂質および硫脂質を含めた）、スフィンゴ糖脂質（これらに限定されないが、セレブロシド（例えば、ガラクトセレブロシド、グルコセレブロシドおよびスルファチド）、ガングリオシド、グロボシドおよび糖スフィンゴリン脂質を含めた）ならびにグリコシルホスファチジルイノシトールが含まれる。細胞膜内に位置しているとき、糖脂質のグリカン部分は、膜の細胞外側上に位置しており、ここでこれらは、他の細胞および細胞シグナル伝達リガンドと相互作用し得る（マッキオーニ，Ｈ．Ｊ．（Ｍａｃｃｉｏｎｉ，Ｈ．Ｊ．）ら著、ゴルジ複合体における糖脂質オリゴ糖の合成の機構（Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｏｌｇｉ ｃｏｍｐｌｅｘ）、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、２０１１年６月６日；５８５巻（１１号）：１６９１～８頁）。
一部の実施形態では、本発明のグリココンジュゲート標的は、糖タンパク質および／またはプロテオグリカンである。糖タンパク質は、グリカンと共有結合している任意のタンパク質を指す。プロテオグリカンは、負の電荷を担持することが多いグリカンで重度にグリコシル化されているタンパク質の１クラスである。この特性によって、これらは非常に親水性であり、かつ結合組織の重要な構成要素となる。
がんに関連する標的
一部の実施形態では、本発明の標的は、がんに関連する抗原またはエピトープである。本明細書において使用する場合、用語「がん関連」は、がん、がん性細胞および／またはがん組織と何らかの方法で関連し得る実体を記載するために使用される。腫瘍細胞と相関して発現している、グリカンを含む多くのがんに関連する抗原またはエピトープが同定されてきた（ヘインバーグ－モリナロ，Ｊ．（Ｈｅｉｍｂｕｒｇ－Ｍｏｌｉｎａｒｏ，Ｊ．）ら著、がんワクチンおよび炭水化物エピトープ（Ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．）、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ．）、２０１１年１１月８日；２９巻（４８号）：８８０２～２６頁）。これらは、本明細書において、「腫瘍関連炭水化物抗原」または「ＴＡＣＡ」と称される。ＴＡＣＡには、これらに限定されないが、ムチン関連抗原［これらに限定されないが、Ｔｎ、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）およびトムゼン－フリーデンライヒ抗原を含めた］、血液型ルイス関連抗原［これらに限定されないが、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ルイスＸ（ＬｅＸ）、シアリルルイスＸ（ＳＬｅＸ）およびシアリルルイスＡ（ＳＬｅＡ）を含めた］、スフィンゴ糖脂質関連抗原［これらに限定されないが、グロボＨ、ステージ特異的胎児抗原－３（ＳＳＥＡ－３）、およびシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質を含めた］、ガングリオシド関連抗原［これらに限定されないが、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、フコシルＧＭ１およびＮｅｕ５ＧｃＧＭ３を含めた］、ならびにポリシアル酸関連抗原が含まれる。このような抗原の多くは、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１５０５４６００号パンフレットに記載されている。
一部の実施形態では、本発明のＴＡＣＡ標的は、ルイス血液型抗原を含む。ルイス血液型抗原は、α１－３連結またはα１－４連結によってＧｌｃＮＡｃに連結したフコース残基を含む。これらは糖脂質および糖タンパク質の両方上で見出し得る。ルイス血液型抗原は、これらの抗原の分泌者である個体の体液において見出し得る。赤血球上にこれらが現れることは、赤血球による血清からのルイス抗原の吸収による。
一部の実施形態では、本発明のＴＡＣＡ標的は、ＬｅＹを含む。ＬｅＹ（ＣＤ１７４としてもまた公知である）は、α１，２－およびα１，３－連結フコース残基を有するＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡＣで構成されており、Ｆｕｃα（１，２）Ｇａｌβ（１，４）Ｆｕｃα（１，３）ＧｌｃＮＡｃエピトープを生じさせる。これはα１，３フコースを親鎖のＧｌｃＮＡｃ残基に付着させるα１，３フコシルトランスフェラーゼによってＨ抗原から合成される。ＬｅＹは、これらに限定されないが、卵巣、乳房、前立腺、結腸、肺および上皮を含めた種々のがんにおいて発現し得る。正常組織におけるその低い発現レベル、および多くのがんにおける上昇した発現レベルによって、ＬｅＹ抗原は、治療用抗体についての魅力的な標的である。
一部の実施形態では、本発明のＴＡＣＡ標的は、ＬｅＸを含む。ＬｅＸは、エピトープＧａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ－Ｒを含む。これはまた、ＣＤ１５およびステージ特異的胎児抗原－１（ＳＳＥＡ－１）として公知である。この抗原は、Ｆ９奇形癌細胞による免疫化に供したマウスから採取した血清と免疫反応性であると最初に認識された。ＬｅＸはまた、特定の段階における胚発生と相関することが見出された。これはまた、がんの存在下および非存在下の両方における種々の組織において発現しているが、また乳がんおよび卵巣がんにおいて見出すことができ、これはがん性細胞によってのみ発現される。
一部の実施形態では、本発明のＴＡＣＡ標的は、ＳＬｅＡおよび／またはＳＬｅＸを含む。ＳＬｅＡおよびＳＬｅＸは、それぞれ、構造Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ－ＲおよびＮｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ－Ｒで構成されている。これらの発現は、がん細胞においてアップレギュレートされる。血清中のこれらの抗原の存在は、悪性腫瘍および予後不良と相関する。ＳＬｅＸは、ムチン末端エピトープとして大部分が見出される。これは、乳房、卵巣、黒色腫、結腸、肝臓、肺および前立腺を含めたいくつかの異なるがんにおいて発現している。本発明の一部の実施形態では、ＳＬｅＡおよびＳＬｅＸ標的は、Ｎｅｕ５Ｇｃ（本明細書において、それぞれ、ＧｃＳＬｅＡおよびＧｃＳＬｅＸと称される）を含む。
場合によって、本発明のがんに関連する標的は、ムチンを含み得る。イシダ（Ｉｓｈｉｄａ）らは、ＭＵＣ２と樹状細胞（抗腫瘍活性を有する）との相互作用が、樹状細胞アポトーシスをもたらすことを示す（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、イシダ，Ａ．（Ｉｓｈｉｄａ，Ａ．）ら著、２００８年、プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．）、８巻：３３４２～９頁）。いくつかの態様では、本発明は、樹状細胞のアポトーシスを防止し、抗腫瘍活性を支持する抗ムチン抗体を提供した。
一部の実施形態では、本発明のＴＡＣＡ標的は、糖脂質および／またはこれらに限定されないが、スフィンゴ糖脂質を含めた糖脂質上に存在するエピトープを含む。スフィンゴ糖脂質は、セラミドヒドロキシル基によってグリカンに連結した脂質セラミドを含む。細胞膜上で、スフィンゴ糖脂質は、「脂質ラフト」と称されるクラスターを形成する。
一部の実施形態では、本発明のＴＡＣＡ標的は、グロボＨを含む。グロボＨは、乳がん細胞において最初に同定されたがんに関連するスフィンゴ糖脂質である。グロボＨのグリカン部分は、Ｆｕｃα（１－２）Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃβ（１－３）Ｇａｌα（１－４）Ｇａｌβ（１－４）Ｇｌｃβ（１）を含む。いくつかの正常な上皮組織において見出されるが、グロボＨは、これらに限定されないが、小細胞肺、乳房、前立腺、肺、膵臓、胃、卵巣および子宮内膜の腫瘍を含めた多くの腫瘍組織と関連して同定されてきた。
一部の実施形態では、本発明のがんに関連するスフィンゴ糖脂質標的は、ガングリオシドを含む。ガングリオシドは、１種もしくは複数のシアル酸を有するスフィンゴ糖脂質である。ガングリオシドの命名法によると、Ｇは、ガングリオシドについての略語として使用される。この略語に、付着したシアル酸残基の数（それぞれ、１、２または３）を意味する文字Ｍ、ＤまたはＴが続く。最後に、数１、２または３は、薄層クロマトグラフィーによって分析したときに、それぞれが移動した距離の順序を指すために使用される（ここで、３は最も長い距離を移動し、それに続いて、２、次いで、１である）。ガングリオシドは、がんに関連する成長および転移に関与していることが公知であり、腫瘍細胞の細胞表面上に発現し得る。腫瘍細胞上で発現しているガングリオシドには、これらに限定されないが、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２およびフコシルＧＭ１（本明細書において、Ｆｕｃ－ＧＭ１とまた称される）が含まれてもよい。本発明の一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、ＧＤ３に対して方向付けされる。ＧＤ３は、細胞成長のレギュレーターである。一部の実施形態では、ＧＤ３に向けられる抗体を使用して、細胞成長および／または血管形成をモジュレートする。一部の実施形態では、ＧＤ３に向けられる抗体を使用して、細胞付着をモジュレートする。いくつかの腫瘍細胞と会合しているＧＤ３は、９－Ｏ－アセチル化シアル酸残基を含み得る（そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ムケルジー，Ｋ．（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｋ．）ら著、２００８年、細胞生化学ジャーナル（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１０５巻：７２４～３４頁およびムケルジー，Ｋ．（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｋ．）ら著、２００９年、生物化学（Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．）、３９０巻：３２５～３５頁）。場合によって、本発明の抗体は、９－Ｏ－アセチル化シアル酸残基に対して選択的である。いくつかの抗体は、９－Ｏ－アセチル化ＧＤ３に対して特異的であり得る。このような抗体は、９－Ｏ－アセチル化ＧＤ３を発現している腫瘍細胞を標的とするために使用し得る。本発明の一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、ＧＭ２に方向付ける。一部の実施形態では、ＧＭ２に向けられる抗体を使用して、細胞と細胞の接触をモジュレートする。一部の実施形態では、本発明のガングリオシド標的は、Ｎｅｕ５Ｇｃを含む。一部の実施形態では、このような標的は、Ｎｅｕ５Ｇｃを有するＧＭ３バリアントを含み得る（本明細書において、ＧｃＧＭ３と称される）。ＧｃＧＭ３のグリカン構成要素は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃである。ＧｃＧＭ３は、腫瘍細胞の公知の構成要素である（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、カザドシュ，Ａ．Ｖ．（Ｃａｓａｄｅｓｕｓ，Ａ．Ｖ．）ら著、２０１３年、グリココンジュゲートジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．）、３０巻（７号）：６８７～９９頁）。
一部の実施形態では、本開示のＴＡＣＡは、少なくとも１個のＮｅｕ５Ｇｃ残基を含む。
組換え抗体
本発明の組換え抗体（例えば、グリカン相互作用抗体）は、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して生じさせ得る。一部の実施形態では、組換え抗体は、抗グリカン抗体であり得る。さらなる抗体は、抗ＳＴｎ抗体（例えば、抗ＧｃＳＴｎまたは抗ＡｃＳＴｎ抗体）であり得る。本発明の組換え抗体は、本明細書に記載されている方法によって産生されるハイブリドーマ細胞由来の抗体から得た可変ドメインを使用して産生し得る。抗体の重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡ配列は、標準的な生化学的技術を使用して決定し得る。総ＲＮＡは、抗体産生ハイブリドーマ細胞から抽出し、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｃＤＮＡに変換し得る。ＰＣＲ増幅は、結果として生じたｃＤＮＡ上で行って、可変領域遺伝子を増幅し得る。このような増幅は、重鎖および軽鎖配列の増幅に対して特異的なプライマーの使用を含み得る。他の実施形態では、組換え抗体は、他の源から得た可変ドメインを使用して産生し得る。これは、１種もしくは複数の抗体フラグメントライブラリー、例えば、抗原パニングにおいて使用されるｓｃＦｖライブラリーから選択される可変ドメインの使用を含む。次いで、結果として生じたＰＣＲ産物は、配列分析のためにプラスミド中にサブクローニングし得る。配列決定されると、抗体コード配列は、発現ベクター中に配置し得る。ヒト化のために、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのためのコード配列は、相同マウス配列を置換するために使用し得る。次いで、このように得られた構築物は、大規模翻訳のために哺乳動物細胞にトランスフェクトし得る。
抗Ｔｎ抗体
一部の実施形態では、本発明の組換え抗体（例えば、グリカン相互作用抗体）は、抗Ｔｎ抗体であり得る。このような抗体は、Ｔｎを有する標的に結合し得る。抗Ｔｎ抗体は、Ｔｎに対して特異的であり得るか、またはＴｎを有する他の修飾された形態、例えば、これらに限定されないが、さらなる炭水化物残基を含めた他の部分に連結したＴｎを結合し得る。場合によって、抗Ｔｎ抗体は、抗シアリル－Ｔｎ抗体であり得る。このような抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃを含むシアル酸付加されたＴｎおよび／またはＮｅｕ５Ｇｃを含むシアル酸付加されたＴｎに結合し得る。いくつかの抗Ｔｎ抗体は、Ｔｎ抗原のクラスターに特異的に結合し得る。
抗ＳＴｎ抗体
一部の実施形態では、本発明の抗体（例えば、グリカン相互作用抗体）は、ＳＴｎに特異的に結合し得る。本発明の抗ＳＴｎ抗体は、ＳＴｎ抗原の特定の部分へのこれらの結合によって、および／またはＡｃＳＴｎ対ＧｃＳＴｎについてのこれらの特異性によってカテゴリー化し得る。場合によって、本発明の抗ＳＴｎ抗体は、群１抗体である。本発明による「群１」抗体は、ＡｃＳＴｎおよびＧｃＳＴｎを結合することができる抗体である。このような抗体はまた、本明細書において、より広範囲のＳＴｎ構造と関連するこれらの能力によって汎ＳＴｎ抗体と称し得る。一部の実施形態では、群１抗体は、図１Ａにおける大きな楕円によって示されるＳＴｎの部分と関連し得る。場合によって、本発明の抗ＳＴｎ抗体は、群２抗体である。「群２」抗体は、本発明によると、ＳＴｎ、およびセリンまたはトレオニンへのＯ－連結を含むいくつかの関連する構造を結合することができる抗体である。一部の実施形態では、群２抗体は、シアル酸付加されたガラクトース残基を含むグリカンと関連し得る。場合によって、群２抗体は、図１Ｂにおける大きな楕円によって示されるＳＴｎの部分と関連し得る。いくつかの群２抗体は、好ましくは、ＧｃＳＴｎを有する構造を超えてＡｃＳＴｎを有する構造に結合する。さらなる抗ＳＴｎ抗体は、群３抗体であり得る。本明細書において言及するように、「群３」抗体は、ＳＴｎを結合することができる抗体であるが、またより広範な一連の関連する構造を結合し得る。群２抗体とは異なり、群３抗体は、このような構造がセリンまたはトレオニンへのＯ－連結を有することを必要としない。一部の実施形態では、群３抗体は、図１Ｃにおける大きな楕円によって示されるＳＴｎの部分と関連し得る。最後に、本発明のいくつかの抗ＳＴｎ抗体は、群４抗体であり得る。本明細書において言及するように、「群４」抗体は、ＡｃＳＴｎおよびＧｃＳＴｎの両方、ならびに非シアル酸付加されたＴｎ抗原に結合することができ、従って、より広範な特異性を有する。一部の実施形態では、群４抗体は、図１Ｄにおける大きな楕円によって示されるＳＴｎの部分と関連し得る。
場合によって、本発明の抗ＳＴｎ抗体は、特定の抗原または細胞表面上のＳＴｎのクラスターに特異的に結合し得る。いくつかのこのような抗体は、付近のＳＴｎ構造の間の接触のエリアを含むエピトープを含めた、ＳＴｎのクラスター化によって形成されたエピトープを認識し得る。このようなエピトープは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれ超のＳＴｎ構造のクラスター化によって形成し得る。
一部の実施形態では、本開示の抗ＳＴｎ抗体は、ＳＴｎを担持する細胞タンパク質を結合するのに使用し得る。このような抗体は、ＳＴｎ発現によって非がん性細胞における同様のタンパク質から鑑別可能である、がん細胞と会合する細胞タンパク質を標的とするのに有用であり得る。場合によって、このようなタンパク質は、細胞表面タンパク質を含み得る。ＳＴｎを担持するがん細胞表面タンパク質は、がん処置および／または診断の間に、抗ＳＴｎ抗体によって標的とされてもよい。ＳＴｎを担持する細胞表面タンパク質は、質量分析法を使用して、かつ／または免疫学的方法（例えば、ＦＡＣＳ分析、免疫沈降、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡなど）を使用して同定し得る。場合によって、ＳＴｎを担持する細胞タンパク質は、がん細胞マーカー、がん幹細胞マーカー、および／またはがん幹細胞シグナル伝達タンパク質を含み得る。一部の実施形態では、ＳＴｎを担持する細胞タンパク質には、これらに限定されないが、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ１１７、インテグリン、ノッチ、およびヘッジホッグが含まれてもよい。
抗体構成要素
場合によって、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、本明細書において提供する可変ドメインおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列を含み得る。いくつかの抗体または抗原結合性フラグメントは、このような配列の異なる組合せを含み得る。場合によって、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙した可変ドメイン配列の１つもしくは複数を含み得る。「Ｘ」で示す残基は、存在しないか、または任意のアミノ酸残基から選択し得る。表において提示する軽鎖可変ドメインは、Ｃ末端アルギニン残基を伴いもしくは伴わずに発現し得る。この残基は典型的には、軽鎖可変ドメインを軽鎖定常ドメインに連結し、軽鎖可変ドメインの代わりに軽鎖定常ドメインの部分として発現し得る。場合によって、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙した可変ドメイン配列の１つもしくは複数と約５０％～約９９．９％の配列同一性（例えば、約５０％～約６０％、約５５％～約６５％、約６０％～約７０％、約６５％～約７５％、約７０％～約８０％、約７５％～約８５％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９９．９％、約９５％～約９９．９％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％または約９９．８％）を有するアミノ酸配列を含み得る。場合によって、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙した配列のいずれかの１個もしくは複数のフラグメントを有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 0007066613000003
Figure 0007066613000004
Figure 0007066613000005
Figure 0007066613000006
 場合によって、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙するＣＤＲアミノ酸配列の１つもしくは複数を含み得る。「Ｘ」で示す残基は、存在しないか、または任意のアミノ酸残基から選択し得る。場合によって、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙したＣＤＲ配列の１つもしくは複数と約５０％～約９９．９％の配列同一性（例えば、約５０％～約６０％、約５５％～約６５％、約６０％～約７０％、約６５％～約７５％、約７０％～約８０％、約７５％～約８５％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９９．９％、約９５％～約９９．９％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％または約９９．８％）を有するアミノ酸配列を含み得る。場合によって、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙した配列のいずれかの１個もしくは複数のフラグメントを有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 0007066613000007
Figure 0007066613000008
Figure 0007066613000009
Figure 0007066613000010
 場合によって、本開示の抗体は、下記の表において列挙したＣＤＲ配列群からの１つもしくは複数のＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含み得る。「Ｘ」で示す残基は、存在しないか、または任意のアミノ酸残基から選択し得る。場合によって、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙したＣＤＲ配列の１つもしくは複数と約５０％～約９９．９％の配列同一性（例えば、約５０％～約６０％、約５５％～約６５％、約６０％～約７０％、約６５％～約７５％、約７０％～約８０％、約７５％～約８５％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９９．９％、約９５％～約９９．９％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％または約９９．８％）を有するアミノ酸配列を含み得る。場合によって、抗体は、下記の表において列挙した配列のいずれかの１個もしくは複数のフラグメントを有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 0007066613000011
 場合によって、本開示の抗体は、下記の表において列挙したＣＤＲ配列群からの１つもしくは複数のＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。「Ｘ」で示す残基は、存在しないか、または任意のアミノ酸残基から選択し得る。場合によって、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙したＣＤＲ配列の１つもしくは複数と約５０％～約９９．９％の配列同一性（例えば、約５０％～約６０％、約５５％～約６５％、約６０％～約７０％、約６５％～約７５％、約７０％～約８０％、約７５％～約８５％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９９．９％、約９５％～約９９．９％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％または約９９．８％）を有するアミノ酸配列を含み得る。場合によって、抗体は、下記の表において列挙した配列のいずれかの１個もしくは複数のフラグメントを有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 0007066613000012
 場合によって、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙する可変ドメイン配列の１つもしくは複数を含むヌクレオチド配列によってコードし得る。「Ｎ」と標識された残基は、存在しないか、またはヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧもしくはＴから選択し得る。場合によって、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙した可変ドメイン配列の１つもしくは複数と約５０％～約９９．９％の配列同一性（例えば、約５０％～約６０％、約５５％～約６５％、約６０％～約７０％、約６５％～約７５％、約７０％～約８０％、約７５％～約８５％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９９．９％、約９５％～約９９．９％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％または約９９．８％）を有する配列を含むヌクレオチド配列によってコードし得る。場合によって、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、下記の表において列挙した配列のいずれかの１個もしくは複数のフラグメントを含むヌクレオチド配列によってコードし得る。
Figure 0007066613000013
Figure 0007066613000014
Figure 0007066613000015
Figure 0007066613000016
Figure 0007066613000017
Figure 0007066613000018
Figure 0007066613000019
Figure 0007066613000020
Figure 0007066613000021
Figure 0007066613000022
 場合によって、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、下記の表において提示するＩｇＧフレームワーク領域のいずれかを含み得る。場合によって、抗体またはそのフラグメントは、下記の表において列挙した定常ドメイン配列の１つもしくは複数と約５０％～約９９．９％の配列同一性（例えば、約５０％～約６０％、約５５％～約６５％、約６０％～約７０％、約６５％～約７５％、約７０％～約８０％、約７５％～約８５％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９９．９％、約９５％～約９９．９％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％または約９９．８％）を有するアミノ酸配列を含み得る。場合によって、本発明の抗体またはそのフラグメントは、下記の表において列挙した配列のいずれかの１個もしくは複数のフラグメントを有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 0007066613000023
 場合によって、抗体は、下記の表におけるアミノ酸配列の１つまたは両方を含んでもよく、かつ／または下記の表において提示するヌクレオチド配列もしくはその最適化されたバージョンの１つまたは両方によってコードし得る。
Figure 0007066613000024
Figure 0007066613000025
 場合によって、抗体またはそのフラグメントは、従前の表において提示するアミノ酸配列の１つもしくは複数と約５０％～約９９．９％の配列同一性（例えば、約５０％～約６０％、約５５％～約６５％、約６０％～約７０％、約６５％～約７５％、約７０％～約８０％、約７５％～約８５％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９９．９％、約９５％～約９９．９％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％または約９９．８％）を有するアミノ酸配列を含み得る。場合によって、抗体またはそのフラグメントは、従前の表において提示するヌクレオチド配列の１つもしくは複数と約５０％～約９９．９％の配列同一性（例えば、約５０％～約６０％、約５５％～約６５％、約６０％～約７０％、約６５％～約７５％、約７０％～約８０％、約７５％～約８５％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約９０％～約９９．９％、約９５％～約９９．９％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％または約９９．８％）を有するヌクレオチド配列によってコードし得る。
一部の実施形態では、本開示は、上記の抗体配列または関連するバリアントの１つもしくは複数を使用して産生される抗体フラグメントを含む。このような抗体フラグメントは、本明細書に記載されているもののいずれかを含めた、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、または任意の他の抗体フラグメントを含み得る。
ヒト化抗体
ヒトではない（例えば、マウスの）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここではレシピエントの抗体からの超可変領域からの残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有するヒトではない種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヒトではない霊長類の抗体からの超可変領域からの残基で置き換えられている。
一部の実施形態では、完全ヒト化重鎖および軽鎖は、抗体配列から、および／または本明細書において提示するＣＤＲと共に設計し得る。抗体可変領域のタンパク質モデルは、現存する抗体構造をテンプレートとして使用して生じさせ得る。出発重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列のセグメントは、ヒト配列と比較して、同様の配列を有するヒト生殖系列抗体を同定し得る。一連のヒト化重鎖および軽鎖可変領域は、Ｔ細胞エピトープを回避する目的で、ヒト可変ドメインフレームワーク領域配列を使用して設計し得る。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの技術によって決定するような潜在的なＴ細胞エピトープの有意な発生率を伴うバリアントヒト配列セグメントは廃棄し得る。場合によって、結果として生じた可変ドメインにおけるアミノ酸残基のいくつかは、当初のマウス可変ドメイン中に存在するアミノ酸に逆突然変異し得る。場合によって、このように得られた可変ドメインにおけるマウス残基のいくつかは、ヒト生殖系列配列中に存在するマッチ残基に変異し得る。
ヒト化重鎖および軽鎖可変領域遺伝子は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を使用して、全長遺伝子にアセンブルされたオーバーラップオリゴヌクレオチドから構築し得る。ＬＣＲ産物は増幅してもよく、適切な制限部位は、発現ベクターへのクローニングのために加え得る。ＰＣＲ産物は、中間ベクターにクローニングされ、配列決定によって確認し得る。
ヒト定常領域を有する完全ヒト化抗体をコードする発現プラスミドの構築のために、抗体可変領域をコードするＤＮＡ配列は、上流のプロモーター／エンハンサー、例えば、サイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）、プラス免疫グロブリンシグナル配列と、下流の免疫グロブリン定常領域遺伝子との間の、発現ベクター（例えば、哺乳動物の発現ベクター）中に挿入し得る。次いで、ＤＮＡ試料は、哺乳動物細胞へのトランスフェクションのために調製し得る。
細胞系の産生、および完全ヒト化抗体の選択のために、重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡ対は、発現のために細胞中にトランスフェクトし得る。一部の実施形態では、哺乳動物のＮＳ０細胞を使用し得る。ヒト化抗体を産生する細胞系は、細胞培養培地から収集および精製し得る抗体の発現のために増殖し得る。
一部の実施形態では、本開示の抗体は、当技術分野において公知のヒト化方法によって調製し得る。このような方法には、これらに限定されないが、ＣＤＲグラフティング、リサーフェシング、超ヒト化、およびヒトストリング内容最適化が含まれてもよい（例えば、アルマグロ（Ａｌｍａｇｒｏ）ら著、２００８年、バイオサイエンスにおけるフロンティア（Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．）、１３巻：１６１９～３３頁を参照されたい）。一部の実施形態では、経験による方法が使用される。このような方法は、濃縮技術、例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、または他のハイスループットスクリーニング技術によって、大きなコンビナトリアルライブラリーの生成、および所望のバリアントを選択することを含み得る。これらの方法は、単独で、またはフレームワークライブラリー、誘導選択、フレームワークシャフリング、およびヒューマニアリングと組み合わせて利用し得る。
一部の実施形態では、ヒト化抗体は、下記の表において提示するヒト可変ドメインの１つもしくは複数を利用することによって調製し得る。このような抗体は、ヒト可変ドメイン中に存在するＣＤＲ配列に代えて用いられる、本明細書において提示するＣＤＲ配列、またはそのフラグメントもしくはバリアントのいずれかの１つもしくは複数を含み得る。場合によって、ヒト可変ドメイン配列のバリアントを利用し、このようなバリアントは、下記の表において提示するヒト可変ドメイン配列のいずれかに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。
Figure 0007066613000026
 一部の実施形態では、本開示のヒト化抗体は、下記の表において提示するヒトフレームワーク領域の１つもしくは複数を含み得る。いくつかの抗体は、下記の表において提示するフレームワーク領域のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するフレームワーク領域を含み得る。
Figure 0007066613000027
 一部の実施形態では、ヒト化抗体の１個もしくは複数の残基はバッククロスして、抗体結合または他の特性を改善し得る。
一部の実施形態では、本開示の抗体中に存在するヒト化可変ドメインは、下記の表におい提示する可変ドメインのいずれかを含み得る。場合によって、抗体は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するこれらの可変ドメインの１つもしくは複数のバリアントを含む。
Figure 0007066613000028
Figure 0007066613000029
Figure 0007066613000030
Figure 0007066613000031
 抗体配列最適化
可変ドメイン配列は、抗体機能、発現、安定性、および／または免疫原性に影響を与え得る配列特徴について分析し得る。場合によって、このような特徴は、ＮＧ残基対を含み得る。ＮＧ残基対はアスパラギン脱アミドの影響を受けやすくてもよく、時間と共に３：１比のグルタメートおよびピログルタメートへの変換の可能性を伴う。これらの残基対は、例えば、ＳＧまたはＱＧ対に変異され、これらの部位における脱アミドを防止し得る。代わりに、これらの抗体は配合され、脱アミドを低減し得る。
一部の実施形態では、アスパルテート異性化部位は、同定および変更し得る。アスパルテート異性化部位は、ＤＧアミノ酸残基対を含む。これらの部位におけるアスパラギン酸は、時間と共に３：１比でグルタメートおよびピログルタメートに変換することができる。ＤＧ残基対は、ＳＧまたはＱＧ残基対に変異され、これらの部位において異性化を防止し得る。代わりに、これらの抗体は配合され、脱アミドを低減し得る。
一部の実施形態では、Ｎ末端グルタミン残基は、Ｎ末端グルタメート残基に変換し得る。これは、Ｎ末端熱分解を防止し得る。
一部の実施形態では、アミノ酸残基の１つもしくは複数の凝集を起こしやすいパッチは変異し得る。これらはかさ高い側鎖を有するアミノ酸、例えば、ヒスチジン、フェニルアラニン、およびトリプトファンを有するパッチを含み得る。
一部の実施形態では、１個もしくは複数のシステイン残基は変異して、不対システインの存在を防止し得る。不対システインは、例えば、溶媒が到達可能であるとき、抗体の部分として反応性であり得る。場合によって、不対システイン残基は、セリンに変異し得る。
一部の実施形態では、１つもしくは複数のグリコシル化部位（例えば、Ｎ－連結ＮＸＳ／Ｔ部位）、酸切断部位、およびアミノ酸酸化部位は変異して、抗体の産生、安定性、結合、および／または活性が改善する。
ＩｇＧ合成
本明細書において提示する１つもしくは複数の可変ドメインおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列（またはフラグメントもしくはそのバリアント）を含めたＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）は、さらなる試験および／または生成物開発のために合成し得る。このような抗体は、所望のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの１つもしくは複数のセグメントを、ＩｇＧ産生に適した発現ベクター中に挿入することによって産生し得る。発現ベクターは、哺乳動物細胞におけるＩｇＧ発現に適した哺乳動物の発現ベクターを含み得る。哺乳動物のＩｇＧの発現は、産生された抗体が哺乳動物のタンパク質の特徴を示す修飾（例えば、グリコシル化）を含むことを確実にし、かつ／または抗体調製物が細菌発現系からのタンパク質調製物において存在し得る内毒素および／または他の汚染物質を欠いていることを確実にするために行い得る。
免疫原性宿主
一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、本明細書において、「免疫原性宿主」と称される、免疫化のための宿主としてヒトではない動物を使用することによって開発し得る。一部の実施形態では、免疫原性宿主は、哺乳動物である。一部の実施形態では、免疫原性宿主は、トランスジェニックノックアウトマウスである。グリカン相互作用抗体の標的部位および／またはエピトープ標的を有する抗原を使用して、免疫応答を刺激し、かつ導入された抗原上に存在する標的部位および／またはエピトープ標的を特異的に結合する免疫原性宿主における抗体を産生するために、免疫原性宿主に接触し得る。
本発明のいくつかの方法によると、抗ＳＴｎ抗体の開発は、Ｃｍａｈ遺伝子が撹乱されているマウスを免疫化することを含み得る。このような変異は、シアル酸の免疫原性非ヒト形態であるＮｅｕ５Ｇｃがこのようなマウスにおいてもはや産生されないという点で、よりヒト様の生理学をもたらし得る。また提供するのは、回収可能な抗ＧｃＳＴｎの量を低減させることによるＧｃＳＴｎモノクローナル抗体の産生のための、Ｎｅｕ５Ｇｃ発現がないハイブリドーマを産生するためのＣｍａｈ－／－骨髄腫細胞であるか、またはハイブリドーマは、ハイブリドーマへの抗体結合によって死滅し始める。他の遺伝子は、Ｃｍａｈ－／－骨髄腫細胞のバックグラウンドにおいてノックアウトすることができる。例えば、ヒトに対して高度に免疫原性であるエピトープの形成のために重大である酵素をコードするアルファ１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（チャン，Ｃ．Ｈ．（Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｈ．）ら著、セツキシマブによって誘発されるアナフィラキシー、およびガラクトース－アルファ－１，３－ガラクトースに対して特異的なＩｇＥ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ ａｎｄ ＩｇＥ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｇａｌａｃｔｏｓｅ－ａｌｐｈａ－１，３－ｇａｌａｃｔｏｓｅ．）、ニューイングランドジャーナルオブメディシン（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．）、２００８年３月１３日；３５８巻（１１号）：１１０９～１７頁）は、Ｃｍａｈ－／－骨髄腫細胞のバックグラウンドにおいてノックアウトすることができる。
本発明の他の方法によると、野生型マウスは、免疫化のために使用し得る。このような方法は時々、ＡｃＳＴｎまたは汎ＳＴｎエピトープと相互作用する抗体の産生のために好ましくあり得る。場合によって、野生型マウスにおける免疫応答は、よりロバストであり得る。
免疫化により産生された抗体は、免疫原性宿主の血清から単離し得る。免疫原性宿主からの抗体産生細胞はまた、所望の抗体を産生する細胞系を生じさせるために使用し得る。一部の実施形態では、免疫原性宿主からの抗体および／または抗体産生細胞についてのスクリーニングは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および／またはグリカンアレイの使用によって行い得る。
アジュバント
本明細書に記載されている抗原による免疫原性宿主の免疫化は、１種もしくは複数のアジュバントの使用を含み得る。アジュバントは、このような免疫原性宿主においてより高い免疫応答を発揮するために使用し得る。したがって、本発明によって使用されるアジュバントは、抗体力価に影響を与えるこれらの能力に基づいて選択し得る。
一部の実施形態では、油中水型乳剤は、アジュバントとして有用であり得る。油中水型乳剤は、可動な抗原デポーを形成し、遅い抗原放出を促進し、免疫構成要素への抗原提示を増進することによって作用し得る。フロイントアジュバントは、乾燥および不活性化されているマイコバクテリア粒子を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）として、またはこのような粒子を欠いている不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）として使用し得る。他の油中水型をベースとするアジュバントは、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）（ＭＶＰテクノロジーズ（ＭＶＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、オマハ、ＮＥ）を含み得る。ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）は、動物をベースとする構成要素が非含有であるミクロンサイズの油滴を含む。これは、単独で、またはこれらに限定されないが、水酸化アルミニウムおよびＣＡＲＢＩＧＥＮ（商標）（ＭＶＰテクノロジーズ（ＭＶＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、オマハ、ＮＥ）を含めた他のアジュバントと組み合わせて使用し得る。
一部の実施形態では、ＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）アジュバントを使用し得る。ＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）は、スクアレン、およびモノオレイン酸ソルビタン８０（乳化剤として）および他の構成要素を含む別の油中水型乳剤である。場合によって、ＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）は、より高い免疫応答を提供し得るが、免疫原性宿主に対する減少した毒性を伴う。
免疫賦活性オリゴヌクレオチドはまた、アジュバントとして使用し得る。このようなアジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含み得る。ＣｐＧ ＯＤＮは、トール様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識され、強力な免疫賦活効果をもたらす。Ｃ型ＣｐＧ ＯＤＮは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）およびＢ細胞刺激からの強力なＩＦＮ－α産生、ならびにヘルパーＴ（ＴＨ）細胞からのＩＦＮ－γ産生を誘発する。ＣｐＧ ＯＤＮアジュバントは、マウスにおいて肺炎球菌多糖体（１９Ｆおよびｔｙｐｅ ６Ｂ）特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３を有意に増進することが示されてきた。ＣｐＧ ＯＤＮはまた、タンパク質担体ＣＲＭ１９７、特に、ＣＲＭ１９７特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３に対する抗体応答を増強した（チュー（Ｃｈｕ）ら著、感染（（症））免疫（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、２０００年、第６８巻（３号）：１４５０～６頁）。さらに、ＣｐＧ－ＯＤＮと合わせた肺炎球菌莢膜多糖類のセロタイプ１４（ＰＰＳ１４）による老化マウスの免疫化は、ＩｇＧ抗ＰＰＳ１４応答を若い成体レベルに回復させた（セン（Ｓｅｎ）ら著、感染免疫（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、２００６年、７４巻（３号）：２１７７～８６頁）。本発明によって使用されるＣｐＧ ＯＤＮは、Ａ型、Ｂ型またはＣ型のＯＤＮを含み得る。一部の実施形態では、ＯＤＮは、商業的に入手可能なもののいずれか、例えば、これらのそれぞれが、例えば、インビボジェン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）（サンディエゴ、ＣＡ）から購入し得る、ＯＤＮ－１５８５、ＯＤＮ－１６６８、ＯＤＮ－１８２６、ＯＤＮ－２００６、ＯＤＮ－２００７、ＯＤＮ－２２１６、ＯＤＮ－２３３６、ＯＤＮ－２３９５および／またはＯＤＮ－Ｍ３６２を含み得る。場合によって、ＯＤＮ－２３９５を使用し得る。ＯＤＮ－２３９５は、ヒトおよびマウスＴＬＲ９を特異的に刺激したＣ型ＣｐＧ ＯＤＮである。これらのＯＤＮは、ホスホロチオエート骨格およびＣｐＧパリンドロームモチーフを含む。
一部の実施形態では、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）は、アジュバントとして使用し得る。ＩＳＣＯＭは、特定の化学量論下でコレステロール、リン脂質およびキラヤサポニンと一緒に混合されたときに、自発的に形成される球状のオープンケイジ様構造（典型的には、直径が４０ｎｍ）である。ＩＳＣＯＭ技術は、大きな糖タンパク質からの多様な抗原、例えば、エプスタインバーウイルスからのｇｐ３４０（８０％の炭水化物からなる３４０ｋＤａの抗原）から、担体がコンジュゲートされた合成ペプチドおよび小さなハプテン、例えば、ビオチンまで立証されている。いくつかのＩＳＣＯＭは、ＴＨ１およびＴＨ２特徴の両方を有する釣り合った免疫応答を生じさせることができる。ＩＳＣＯＭに対する免疫応答は、流入領域リンパ節において開始するが、脾臓に効率的に移動し、これによってこれはモノクローナル抗体をまた生じさせるのに特に適したものとなる。一部の実施形態では、ＩＳＣＯＭアジュバントＡｂＩＳＣＯ－１００（イスコノーバ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）、ウプサラ、スウェーデン）を使用し得る。ＡｂＩＳＣＯ－１００は、他のサポニンに対して感受性であり得る免疫原性宿主、例えば、マウスにおける使用のために特に開発されたサポニンをベースとするアジュバントである。
本発明の実施形態によると、所望の結果を達成するために、免疫化溶液のアジュバント構成要素は変動し得る。このような結果は、免疫原性宿主における免疫応答の全体的レベルおよび／または毒性のレベルをモジュレートすることを含み得る。
抗体配列および構造分析および最適化
一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列分析および／または構造分析に供してもよく、ここでこれらは、抗体の化学、親和性、特異性、タンパク質フォールディング、安定性、製造、発現、および／または免疫原性（すなわち、このような抗体で処置されている対象における免疫反応）に影響を与え得る特徴について分析される。このような分析は、同じまたは同様のエピトープへの抗体結合の間の比較を含み得る。
同じエピトープへの抗体結合の抗体配列は、軽鎖および／または重鎖配列におけるバリエーションについて分析し得る。このような分析は、生殖系列配列および／またはＣＤＲ配列を含み得る。このような分析から得た情報は、保存されたアミノ酸残基；アミノ酸の保存されたセグメント；保存された側鎖の特徴を有するアミノ酸位置；保存されたＣＤＲ長；および同じエピトープへの抗体結合の間に保存された他のフィーチャを同定する（かつ任意選択で、改変するか、欠失させるか、置き換えるか、もしくは修復する）ために使用し得る。この情報は、バリアントを設計するか、または抗体の親和性、特異性、タンパク質フォールディング、安定性、製造、発現および／もしくは免疫原性を改善させる抗体最適化手順について情報を与えるために使用し得る。
配列分析は、同じまたは同様のエピトープに結合する２つもしくはそれよりも多い抗体を整列化し、類似性を同定することを含み得る。このような分析は、抗体領域（例えば、ＣＤＲ、可変ドメイン、生殖系列セグメント）の配列および／または長さを比較し得る。アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、および置換は、同定およびアセスメントし得る。配列の差異は、抗体の親和性および／または特異性に対して比較し得る。
場合によって、配列分析は、不対システインまたは不規則なジスルフィド；グリコシル化部位（例えば、Ｎ－連結ＮＸＳ／Ｔ部位）；酸切断部位、アミノ酸酸化部位、マウス生殖系列配列との整合性；アスパラギン脱アミド部位；アスパルテート異性化部位；Ｎ末端ピログルタメート形成部位；およびＣＤＲにおける凝集を起こしやすいパッチの１つもしくは複数を同定する（かつ任意選択で、改変するか、欠失させるか、置き換えるか、もしくは修復する）ために行われる。
場合によって、本発明は、本明細書において提示する抗体の、配列分析の情報に基づくバリアントを提供する。本明細書において使用する場合、用語「配列分析の情報に基づくバリアント」は、抗体配列分析から導かれる１つもしくは複数の結論に基づいて改変されている抗体バリアントを指す。場合によって、本発明の抗体は改変して、抗体親和性、特異性、タンパク質フォールディング、安定性、製造、発現および／または免疫原性の１つもしくは複数への改変を含む抗体バリアントを産生し得る。
いくつかの配列分析の情報に基づくバリアントは、１つもしくは複数のＣＤＲ長の改変を含む。ＣＤＲ長を改変された抗体は、１つもしくは複数のＣＤＲにおいて、当初の抗体配列に対して、１個もしくは複数の付加または欠失したアミノ酸を含み得る。場合によって、配列分析の情報に基づくバリアントは、１つもしくは複数のＣＤＲを別の抗体に由来する１つもしくは複数のＣＤＲ（例えば、同じまたは同様のエピトープへの抗体結合）で置換することを含み得る。場合によって、配列分析の情報に基づくバリアントは、別の抗体からの重鎖または軽鎖可変ドメインの置換を含み得る（例えば、同じまたは同様のエピトープへの抗体結合）。配列分析の情報に基づくバリアントは、抗体がそこから発現している１つもしくは複数の生殖系列遺伝子への改変を含み得る。このような改変は、点変異、局所変異、挿入変異または欠失変異を含み得る。場合によって、生殖系列遺伝子改変が行われて、ＣＤＲが１つの公知の生殖系列遺伝子から別のものに動く。配列分析の情報に基づくバリアントは、これらに限定されないが、ｓｃＦｖ、モノボディ、二特異性抗体、細胞内抗体、ＣＡＲ、抗体模倣物などを含めた本明細書に記載されている他のバリアントを含み得る。
一部の実施形態では、配列および／または構造分析を使用して、抗体フラグメントディスプレイライブラリー（これらに限定されないが、ｓｃＦｖライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、およびイーストディスプレイライブラリーを含めた）の構築について情報を提供し得る。一例では、配列アラインメントを行って、２つもしくはそれよりも多い抗体と一般の抗原またはエピトープとを整列化し得、整列化した抗体の間に保存されているか、または整列化した抗体の間で可変であるアミノ酸残基は同定し得る。このような場合、ライブラリーメンバーの間の可変性が、配列分析において同定される可変アミノ酸に主に限定されるように、抗体フラグメントディスプレイライブラリーを構築し得る。場合によって、このようなライブラリーは、標的抗原（例えば、ＳＴｎ）について変化した親和性および／もしくは特異性を有するバリアント、または標的抗原の特異的エピトープ（例えば、本明細書の下記で実施例１において記載されているような群１、２、３および４抗体によって認識されるエピトープ）を同定するために使用し得る。
一部の実施形態では、本発明の抗体は改変して、１個もしくは複数の不対システイン残基を除去するか、置き換えるか、またはその他の方法で排除し得る。場合によって、不対システイン残基は反応性であり得、場合によって、抗体親和性および／または特異性に影響を与え得る。したがって、本発明のいくつかの抗体は改変して、不対システイン残基が排除されてきた。場合によって、このようなバリアントは、改変されたエピトープ特異性および／または親和性を有し得る。場合によって、不対システイン残基の改変は、抗体フォールディングを変化させ得る。場合によって、これらのバリアントは、１個もしくは複数のシステイン残基の置換または欠失を含む。場合によって、これらのバリアントは、不対システイン残基からの望ましくない効果を防止または低減するための１個もしくは複数のさらなるアミノ酸残基（これらに限定されないが、１個もしくは複数のシステイン残基の添加を含めた）を含む。場合によって、システイン残基は、疎水性側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンまたはトリプトファン）で置き換えられる。
抗体試験および特性決定
本明細書に記載されている抗体は、種々の方法を使用して試験および／または特性決定し得る。このような方法は、これらに限定されないが、抗体の親和性；特異性；および活性（例えば、細胞シグナル伝達経路または他の細胞もしくは生物活性の活性化または阻害）が含まれてもよい種々の特徴を決定するために使用し得る。抗体試験は、毒性、治療効果、薬力学、薬物動態、吸収、沈着、代謝、および排泄の１つもしくは複数についてｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、動物および／またはヒト研究において）試験することをさらに含み得る。動物における試験には、これらに限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、霊長類（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびウシにおける試験が含まれてもよい。
セルベースアッセイ
一部の実施形態では、本発明の抗体は、１つもしくは複数のセルベースアッセイの使用によって試験または特性決定し得る。このようなセルベースアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養液中の細胞で行い得る。場合によって、セルベースアッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏで行い得る。セルベースｉｎ ｖｉｖｏアッセイの例は、腫瘍細胞が宿主に注射されるか、または他の方法で導入される腫瘍モデルを含む。
場合によって、セルベースアッセイにおいて使用される細胞は、１種もしくは複数の本発明の抗体によって認識される１種もしくは複数の標的グリカンを発現し得る。このようなグリカンは、このような細胞が天然に発現し得るか、あるいは代わりに、細胞は、特定のアッセイの目的のために望ましい１種もしくは複数のグリカンを発現するように誘発し得る。誘発された発現は、グリコシル化をレギュレートするグリコシル化されたタンパク質または酵素の発現をアップレギュレートする１つもしくは複数の処理によってであり得る。他の場合では、誘発された発現は、グリコシル化のレギュレーションに関与する１種もしくは複数のグリコシル化されたタンパク質または酵素の内因性発現のための１種もしくは複数の遺伝子または転写物のトランスフェクション、形質導入、または他の形態の導入を含み得る。
場合によって、本明細書において使用されるセルベースアッセイは、がん細胞の使用を含み得る。多くのがん細胞系は、本発明の抗体を試験する実験のために利用可能である。このような細胞は、標的グリカンを発現し得るか、または標的グリカンを発現するように誘発し得る。さらに、がん細胞系は、本発明の抗体を試験するために使用してもよく、ここで、がん細胞系は、がん幹細胞の代表的なものである。がん幹細胞（ＣＳＣ）細胞系は、培養液中で成長したがん細胞から単離または分化し得る（例えば、がん幹細胞に対して特異的なマーカーをベースとするソーティングによる）。セルベースアッセイにおいて使用される細胞系は、これらに限定されないが、乳房、結腸、卵巣、リンパ球、骨髄、および皮膚の細胞系を含み得る。特定の細胞系には、これらに限定されないが、ＳＮＵ－１６細胞、ＬＳ－１７４Ｔ細胞、ＭＣ３８細胞、ＴＯＶ－１１２Ｄ細胞、ＴＯＶ－２１Ｇ細胞、Ｊｕｒｋａｔｅ Ｅ６．１細胞、Ｋ－５６２細胞、Ｂ１６－Ｆ０細胞、Ｂ１６－Ｆ１０細胞、ＬＳ１８０細胞、ＣＯＬＯ２０５細胞、ＴＢ４細胞、ＨＴ２９細胞、Ｐａｎｃ１細胞、ＨＰＡＣ細胞、ＨＰＡＦＩＩ細胞、ＲＫＯ細胞、ＳＷ４８０細胞、およびＳＮＵ－Ｃ２Ａ細胞が含まれてもよい。
一部の実施形態では、卵巣がん細胞系は、使用し得る。このような細胞系には、これらに限定されないが、ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０およびＡ２８７０細胞系が含まれてもよい。場合によって、ＣＳＣ細胞は、ＣＤ４４および／またはＣＤ１３３細胞マーカーを発現している細胞を単離することによってこれらの細胞系から単離し得る。
ＯＶＣＡＲ３細胞は、進行性卵巣腺癌を患っている患者から得た悪性の腹水を使用して最初に確立した（ハミルトン，Ｔ．Ｃ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｔ．Ｃ．）ら著、１９８３年、がんリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、４３巻：５３７９～８９頁）。がん幹細胞集団は、特異的細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ４４（細胞接着および移動に関与する）、ＣＤ１３３およびＣＤ１１７をベースとする選択によってＯＶＣＡＲ３細胞培養物から単離し得る（リャン，Ｄ．（Ｌｉａｎｇ，Ｄ．）ら著、２０１２年、ＢＭＣがん（ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ）、１２巻：２０１頁、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれている）。ＯＶ９０細胞は、ヒト腹水に同様に由来した上皮卵巣がん細胞である（米国特許第５，７１０，０３８号明細書を参照されたい）。ＯＶ－９０細胞はまた、活性化されたとき、ＣＤ４４を発現し得る（ムニエ，Ｌ．（Ｍｅｕｎｉｅｒ，Ｌ．）ら著、２０１０年、トランスレーショナル腫瘍学（Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ．）、３巻（４号）：２３０～８頁）。
一部の実施形態では、胃がんに由来する細胞系は使用し得る。このような細胞系には、これらに限定されないが、ＳＮＵ－１６細胞が含まれてもよい（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、パークＪ．Ｇ．（Ｐａｒｋ Ｊ．Ｇ．）ら著、１９９０年、がんリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、５０巻：２７７３～８０頁における記載を参照されたい）。ＳＮＵ－１６細胞は、ＳＴｎを天然に発現するが、低レベルである。
一部の実施形態では、本開示の方法は、結腸直腸細胞とグリカン相互作用抗体とを接触させ、細胞への抗体結合、細胞中への抗体内部移行、および／または抗体による細胞死滅を評価することによって、グリカン相互作用抗体を特性決定する方法を含む。いくつかのこのような方法によると、結腸直腸細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長した結腸直腸細胞系に由来し得る（例えば、細胞培養物によって増殖する）。場合によって、結腸直腸細胞系は、腫瘍に由来する。他の実施形態では、結腸直腸細胞系は、異種移植片動物モデル（例えば、異種移植片マウスモデル）を使用して形成した腫瘍に由来し得る。グリカン相互作用抗体を特性決定するために使用される結腸直腸細胞は、患者（例えば、患者腫瘍）からであり得る。グリカン相互作用抗体を特性決定する方法は、１種もしくは複数の結腸直腸細胞を有するものを含めた、組織マイクロアレイの使用を含み得る。
結腸直腸細胞によってグリカン相互作用抗体と特性決定することは、結腸直腸細胞へのグリカン相互作用抗体の結合のＥＣ５０を決定することによって、このような抗体および細胞の間の結合を評価することを含み得る。ＥＣ５０は、フローサイトメトリー分析およびＥＬＩＳＡ分析の１つもしくは複数を使用することによって決定し得る。一部の実施形態では、結腸直腸細胞によってグリカン相互作用抗体を特性決定することは、グリカン相互作用抗体によるこのような細胞の死滅を評価することを含み得る。これは、結腸直腸細胞をグリカン相互作用抗体で処理し、細胞生存率アッセイを使用して、処置によって死滅した細胞の百分率を決定することによって行い得る。場合によって、グリカン相互作用抗体による結腸直腸細胞の死滅を評価することは、グリカン相互作用抗体による結腸直腸細胞の死滅についてのＩＣ５０を決定することを含む。場合によって、抗体は、細胞毒性剤（例えば、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ）とコンジュゲートし得る。
グリカンアレイ
一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、グリカンアレイの使用によって開発し得る。本明細書において使用する場合、用語「グリカンアレイ」は、アレイ基材に連結したいくつかの異なるグリカンのいずれかと相互作用する薬剤を同定するために使用されるツールを指す。一部の実施形態では、グリカンアレイは、本明細書において「グリカンプローブ」と称される、いくつかの化学的に合成されたグリカンを含む。一部の実施形態では、グリカンアレイは、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも３５０、少なくとも１０００または少なくとも１５００のグリカンプローブを含む。一部の実施形態では、グリカンアレイは、所望の一連のグリカンプローブを提示するようにカスタマイズし得る。一部の実施形態では、グリカンプローブは、リンカー分子によってアレイ基材に付着し得る。このようなリンカーは、これらに限定されないが、－Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ２）ＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＮＨ２を含めた分子を含み得る。
一部の実施形態では、グリカンアレイは、７０超の化学的に合成されたグリカンを有し、これらの大部分はＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃ含有グリカン対として提示される。グリカンプローブのいくつかの例は、Ｎｅｕ５Ａｃ－α－２－６－ＧａｌＮＡｃ（ＡｃＳＴｎ）；Ｎｅｕ５Ｇｃ－α－２－６－ＧａｌＮＡｃ（ＧｃＳＴｎ）；Ｎｅｕ５，９Ａｃ２－α－２，６－ＧａｌＮＡｃ；Ｎｅｕ９Ａｃ５Ｇｃ－α－２，６－ＧａｌＮＡｃ、およびＧａｌＮＡｃ（Ｔｎ）を含み得る。ＡｃＳＴｎ対ＧｃＳＴｎへの抗体結合特異性は、アレイ、または当技術分野において公知の特異性を決定する他の方法を使用して決定することができる。さらに、Ｏ－アセチル化ＳＴｎへの抗体の結合プロファイルは決定することができる。がん関連発現は、抗体によるＳＴｎ認識の増加と相関するため、ＳＴｎ上のＯ－アセチル化の喪失はがんに関連する（オガタ，Ｓ．（Ｏｇａｔａ，Ｓ．）ら著、腫瘍関連シアル酸付加された抗原は正常なヒト結腸粘膜において恒常的に発現している（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｒｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｍｕｃｏｓａ．）、がんリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、１９９５年５月１日；５５巻（９号）：１８６９～７４頁）。場合によって、グリカンアレイは、ＳＴｎ対Ｔｎの認識を決定するために使用し得る。
抗体フラグメントディスプレイライブラリースクリーニング技術
一部の実施形態では、本発明の抗体は、発見のハイスループット方法を使用して産生および／または最適化し得る。このような方法は、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている国際出願第２０１４０７４５３２号パンフレットに開示されているディスプレイ技術（例えば、ディスプレイライブラリースクリーニング技術）のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、合成抗体は、ディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ技術）を使用して標的抗原をスクリーニングすることによって設計、選択または最適化し得る。ファージディスプレイライブラリーは、無数のファージ粒子を含み得、それぞれは、これらのウイルスコート上に独自の抗体フラグメントを発現している。このようなライブラリーは、１つもしくは複数の目的の抗原に対して多様なレベルの親和性を有する潜在的に数百の抗体フラグメントを選択するために使用し得る十分に多様なリソースを提供し得る（そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、マッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら著、１９９０年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４８巻：５５２～４頁；エドワーズ，Ｂ．Ｍ．（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｂ．Ｍ．）ら著、２００３年、ＪＭＢ．、３３４巻：１０３～１８頁；スコフィールド，Ｄ．（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｄ．）ら著、２００７年、ゲノム生物学（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．）、８巻、Ｒ２５４頁およびペルシャード，Ｋ．（Ｐｅｒｓｈａｄ，Ｋ．）ら著、２０１０年、タンパク質工学の設計および選択（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．）、２３巻：２７９～８８頁）。しばしば、このようなライブラリー中に存在する抗体フラグメントは、柔軟なリンカーによって接合しているＶＨおよびＶＬ抗体ドメインの融合タンパク質を含むｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む。場合によって、ｓｃＦｖは、相補性決定領域（ＣＤＲ）の可変ループをコードするユニーク配列を例外として、同じ配列を含有し得る。場合によって、ｓｃＦｖは、ウイルスコートタンパク質（例えば、ウイルスｐＩＩＩコートタンパク質のＮ末端）に連結した融合タンパク質として発現する。ＶＬ鎖は、ウイルスコート中への複雑な組込みの前に、ペリプラズム中のＶＨ鎖とのアセンブリーのために別々に発現し得る。沈殿したライブラリーメンバーは結合したファージから配列決定して、所望のｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡを得てもよい。このような配列は、組換え抗体産生のための抗体配列中に直接組み込まれるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの親和性成熟によるさらなる最適化のために変異および利用し得る。
細胞毒性抗体の開発
一部の実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を誘発することができ得る。ＡＤＣＣは、免疫機序であり、それによって免疫細胞の攻撃の結果として細胞は溶解される。このような免疫細胞は、ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ３－ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球および好中球を含み得る（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ストロール，Ｗ．Ｒ．（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．）、治療用抗体工学（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．）、ウッドヘッドパブリッシング（Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、フィラデルフィア、ＰＡ．、２０１２年、第８章、１８６頁）。
場合によって、本発明の抗体は、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰが抗体結合によって望ましいかどうかによって、所与のアイソタイプを含むように工学処理し得る。このような抗体は、例えば、オールダーソン，Ｋ．Ｌ．（Ａｌｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．）ら著、バイオ医薬品およびバイオテクノロジージャーナル（Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、２０１１年：３７９１２３頁）によって開示された方法のいずれかによって工学処理し得る。マウス抗体の場合、抗体の異なるアイソタイプは、ＡＤＣＣを促進することにおいてより有効である。ＩｇＧ２ａは、ＩｇＧ２ｂより、例えば、ＡＤＣＣを誘発することにおいてより有効である。マウスＩｇＧ２ｂ抗体を含めた本発明のいくつかの抗体は、ＩｇＧ２ａ抗体となるように再工学処理し得る。このような再工学処理された抗体は、細胞関連抗原を結合することによって、ＡＤＣＣを誘発することにおいてより有効であり得る。一部の実施形態では、１つもしくは複数の翻訳後修飾を修飾または導入することによって抗体は再工学処理され、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ生物活性を改善する。
一部の実施形態では、本発明の方法によって開発された抗体の可変領域をコードする遺伝子は、ヒトＦｃ領域をコードする哺乳動物の発現ベクター中にクローニングし得る。このようなＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１κからのＦｃ領域であり得る。ＩｇＧ１κＦｃ領域は、Ｆｃ－受容体結合および抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増進することが公知であるアミノ酸変異を含み得る。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の治療用途のために開発し得る。ＡＤＣは、１つもしくは複数のカーゴ（例えば、治療剤）が付着している［例えば、直接、またはリンカー（例えば、開裂可能なリンカーもしくは開裂可能でないリンカー）を介して］抗体である。ＡＤＣは、１つもしくは複数の標的細胞または組織への治療剤（例えば、薬物または細胞毒性剤）の送達のために有用である（パノウスキ，Ｓ．（Ｐａｎｏｗｓｋｉ，Ｓ．）ら著、２０１４年、ｍＡｂｓ、６巻：１号、３４～４５頁）。場合によって、ＡＤＣは、標的とされた細胞上の表面抗原に結合するように設計し得る。結合によって、全抗体－抗原複合体は内部移行され、細胞のリソソームに向けられ得る。次いで、ＡＤＣは分解され、結合したカーゴを放出し得る。カーゴが細胞毒性剤である場合、標的細胞は死滅するか、またはその他の方法で無能にされる。細胞毒性剤には、これらに限定されないが、細胞骨格阻害剤［例えば、チューブリン重合阻害剤、例えば、メイタンシンまたはアウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ［ＭＭＡＥ］およびモノメチルアウリスタチンＦ［ＭＭＡＦ］）］ならびにＤＮＡ傷害剤（例えば、ＤＮＡ重合阻害剤、例えば、カリケアマイシンおよびデュオカルマイシン）が含まれてもよい。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、ＡＤＣとして開発されたとき、細胞死を促進するこれらの能力について試験し得る。細胞生存率アッセイは、二次抗体－薬物コンジュゲートの存在下および非存在下で行い得る。次いで、強力な細胞成長阻害を有する抗体は、直接の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を設計するために使用し得る。セルベース細胞毒性アッセイにおけるこのような二次抗体－薬物コンジュゲートの使用は、多くのＡＤＣ候補の迅速な事前スクリーニングを可能とし得る。このようなアッセイに基づいて、コンジュゲートしていない抗体候補は、１種もしくは複数の細胞毒性剤にコンジュゲートされた二次抗体の存在下で細胞に直接加える（本明細書において、２°ＡＤＣと称される）。高密度の標的とされる抗原を発現している細胞中への抗体／２°ＡＤＣ複合体の内部移行は、細胞内で用量依存的な薬物放出を達成し、細胞毒性効果が細胞（例えば、腫瘍細胞）を死滅させることをもたらすことができ、一方、低密度の標的とされる抗原を発現している細胞は影響を受けない（例えば、正常細胞）。
本発明のＡＤＣは、がん細胞を標的とするように設計し得る。このようなＡＤＣは、１種もしくは複数の腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）に向けられる抗体を含み得る。場合によって、本発明のＡＤＣは、抗ＳＴｎ抗体である。
キメラ抗原受容体の開発
一部の実施形態では、本発明の抗体配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開発するために使用し得る。ＣＡＲは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の認識および死滅を促進する免疫細胞上に発現している膜貫通受容体である。ＣＡＲは典型的には、３つの基本的部分を含む。これらは、外部ドメイン（認識ドメインとしてもまた公知である）、膜貫通ドメインおよび細胞内（シグナル伝達）ドメインを含む。外部ドメインは標的細胞上の細胞性抗原への結合を促進し、一方、細胞内ドメインは典型的には、結合した標的細胞の死滅を促進する細胞シグナル伝達機能を含む。さらに、これらは、本明細書に記載されている１種もしくは複数の抗体可変ドメインまたはそのフラグメントを有する細胞外ドメインを有し得る。本発明のＣＡＲはまた、膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を含む。ＣＡＲは、このようなＣＡＲが免疫エフェクター細胞上に発現しているとき、免疫エフェクター細胞はＣＡＲの抗体部分によって認識される任意の細胞を結合および排除するように、抗体、抗体可変ドメインおよび／または抗体ＣＤＲの１つもしくは複数のセグメントを含むように設計し得る。
ＣＡＲの特徴は、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、非ＭＨＣに制限された様式で選択した標的に対するＴ細胞の特異性および反応性を再方向付けするそれらの能力を含む。非ＭＨＣに制限された抗原認識は、ＣＡＲを発現しているＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与え、このように、腫瘍エスケープの主要な機序を迂回する。さらに、Ｔ細胞において発現しているとき、ＣＡＲは有利に、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖およびベータ鎖と二量体化しない。
腫瘍を標的とするように工学処理されたＣＡＲは、１つもしくは複数の腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）に対する特異性を有し得る。一部の実施形態では、これらのＣＡＲの外部ドメインは、１種もしくは複数の抗体可変ドメインまたはそのフラグメントを含み得る。一部の実施形態では、ＣＡＲはＴ細胞において発現しており、「ＣＡＲ工学処理されたＴ細胞」または「ＣＡＲ－Ｔ」と称し得る。ＣＡＲ－Ｔは、１種もしくは複数の抗体可変ドメインを有するＣＡＲ外部ドメインと共に工学処理し得る。
キメラ抗原受容体の構造的フィーチャ
遺伝子移入技術によって、Ｔ細胞は、それらの表面上で抗体を安定して発現するように工学処理され、所望の抗原特異性を与えることができる。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、単一のキメラ融合タンパク質へと、特異的抗体の抗原認識ドメインと、Ｔ細胞活性化特性を有するＣＤ３－ゼータ鎖またはＦｃγＲＩタンパク質の細胞内ドメインとを合わせる。ＣＡＲ技術は、Ｔ細胞による標的細胞のＭＨＣに制限されない認識を実現する。Ｔ細胞のＭＨＣ制限を取り除くことは、それぞれ、ＭＨＣ Ｉ型またはＩＩ型エピトープに通常制限されている、任意の患者における、ならびにまた、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方におけるこれらの分子の使用を促進する。Ａｂ結合領域の使用によって、Ｔ細胞が、タンパク質によってだけではなく、炭水化物および脂質によって形成されるエピトープに応答することを可能とする。このキメラ受容体アプローチは、がんの免疫療法に特に向いており、それによって腫瘍が免疫認識を回避する機序の多く、例えば、ＭＨＣダウンレギュレーション、共刺激分子の発現の欠乏、ＣＴＬ抵抗性、およびＴ細胞抑制の誘発を迂回することができ、ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の使用は最適な抗腫瘍の有効性のために最良に合わせられる。このアプローチは、ウイルス、例えば、ＨＩＶに加えて、広範囲の腫瘍抗原に適用可能であることが示されてきた（フィニィ（Ｆｉｎｎｅｙ）ら著、免疫学ジャーナル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２００４年、１７２巻：１０４～１１３頁）。
内因性Ｔ細胞受容体のそれと同様の様式で実際に、キメラ抗原受容体はＴ細胞の活性化をトリガーすることができるが、ＣＡＲ技術の臨床適用は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞の不適切なｉｎ ｖｉｖｏでの増殖によって妨害されてきた。例えば、第一世代ＣＡＲは、それらのシグナル伝達ドメインとして、ＣＤ３ζまたはＦｃ受容体γ鎖の細胞質領域を含んだ。これらの第一世代ＣＡＲは、卵巣がん、腎臓がん、リンパ腫、および神経芽細胞腫を有する患者における第１相臨床研究において試験し、中程度の応答を誘発し、Ｔ細胞の細胞毒性を効果的に再方向付けするが、繰り返される抗原曝露によってＴ細胞増殖および生存を可能にすることができないことが見出された。第二世代ＣＡＲについてのプロトタイプは、ＣＤ２８およびＣＤ３ζの両方を包含する受容体を伴い、第二世代ＣＡＲは、Ｂ細胞悪性腫瘍および他のがんの処置について試験されてきた（サデレイン（Ｓａｄｅｌａｉｎ）ら著、（２００９年）、カレントオピニオン（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ）、免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２１巻（２号）：２１５～２２３頁）。このように、ＣＡＲは、異なる機能特性を有する受容体の多様なアレイに急速に拡張してきた。
より最近では、ＣＡＲが媒介するＴ細胞応答は、共刺激ドメインの添加によって増進することができることが発見された。前臨床モデルにおいて、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達ドメインを含むことは、ＣＤ３－ゼータ鎖単独を含むことと比較して、抗腫瘍活性およびキメラ抗原受容体のｉｎ ｖｉｖｏでの持続を有意に増加させることが見出された（ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）ら著、ニューイングランドジャーナルオブメディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、２０１１年、３６５巻：７２５～７３３頁）。
このように、本開示の一部の実施形態では、本発明の抗体配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開発するために使用し得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の認識および死滅を促進する免疫細胞上に発現している膜貫通受容体である。
多くのがんにおいて、標的化のための腫瘍特異的抗原が定義されてきたが、Ｂ細胞新生物において、ＣＤ１９は、魅力的な標的である。ＣＤ１９の発現は、正常および悪性のＢ細胞およびＢ細胞前駆体に制限される。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲＴ１９）を発現している自己Ｔ細胞による処置のパイロット臨床治験は、進行性ｐ５３欠乏性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する患者において行った。骨髄におけるＣＤ１９特異的免疫応答が生じることは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞のピーク浸潤と同時に起こるサイトカインの一時的放出および白血病細胞の消失によって示された。（ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）ら著、ニューイングランドジャーナルオブメディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、２０１１年、３６５巻：７２５～７３３頁）。
ＣＡＲのさらなる構造的フィーチャは、シティオブホープ（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）に譲渡され、共有発明者マイケルジェンセン（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊｅｎｓｅｎ）を有するいくつかの国際公開に開示されているもののいずれかを含み得る。例えば、国際公開第００／２３５７３号パンフレットは、ＣＤ２０に対して特異的な受容体を含む細胞外ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、および膜貫通ドメインを有する、細胞表面タンパク質を発現している遺伝子工学処理されたＣＤ２０特異的再方向付けされたＴ細胞について記載している。ＣＤ２０＋悪性腫瘍の細胞免疫療法のための、任意の有害なＢ細胞機能を抑止するためのこのような細胞の使用。一実施形態では、細胞表面タンパク質は、単鎖ＦｖＦｃ：ζ受容体であり、ここで、Ｆｖは、ペプチドによって連結されたＣＤ２０への単鎖モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ鎖を示し、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３領域を表し、ζは、ヒトＣＤ３のゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを表す。受容体をコードするネイキッドＤＮＡを使用した電気穿孔によってキメラＴ細胞受容体を発現している再方向付けされたＴ細胞を作製する方法。同様に、国際公開第０２／０７７０２９号パンフレットは、ＣＤ１９に対して特異的な受容体を含む細胞外ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、および膜貫通ドメインを有する、細胞表面タンパク質を発現している遺伝子工学処理されたＣＤ１９特異的再方向付けされた免疫細胞について記載している。ＣＤ１９＋悪性腫瘍の細胞免疫療法のため、および任意の有害なＢ細胞機能を抑止するためのこのような細胞の使用。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞であり、細胞表面タンパク質は、単鎖ｓｖＦｖＦｃ：ζ受容体であり、ここで、ｓｃＦｃは、ＣＤ１９への単鎖モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ鎖を示し、Ｆｃは、ＩｇＧ１の定常領域の少なくとも部分を表し、ゼータは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖（ヒトＣＤ３のゼータ鎖）の細胞内シグナル伝達ドメインを表す。細胞外ドメインｓｃＦｖＦｃおよび細胞内ドメインゼータは、膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ４の膜貫通ドメインによって連結している。受容体をコードするネイキッドＤＮＡを使用したエレクトロポレーションによってキメラＴ細胞受容体を発現している再方向付けされたＴ細胞を作製する方法。これらのキメラ抗原受容体は、Ｔ細胞において発現しているとき、モノクローナル抗体の特異性に基づいた抗原認識を再方向付けする能力を有する。ｓｃＦｖＦｃの設計：腫瘍細胞表面エピトープに対して標的特異性を有する受容体は、既存の抗腫瘍免疫に依存しないため、養子療法のための抗腫瘍免疫エフェクター細胞を生じさせるための概念的に魅力的な戦略である。これらの受容体は、ＭＨＣ非依存的様式で抗原を結合するという点で「ユニバーサル」であり、このように、１つの受容体構築物は抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を処置するために使用することができる。シティオブホープ（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）の国際公開第０２／０８８３３４号パンフレット、国際公開第２００７／０５９２９８号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０６５８１８号パンフレットは、細胞外ドメインを細胞表面、膜貫通領域および細胞内シグナル伝達ドメインに繋ぎ止めることができる支持領域に連結した可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインで構成されている「ゼータカイン」について記載している。ゼータカインは、Ｔリンパ球の表面上で発現しているとき、Ｔ細胞活性を、それに対して可溶性受容体リガンドが特異的である受容体を発現しているそれらの特異的細胞に向けられる。
ＣＡＲのさらなるフィーチャは、テキサス大学に譲渡され、共有発明者ローレンスクーパー（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃｏｏｐｅｒ）を有する２つの国際公開において開示されているもののいずれかを含み得る。国際公開第２００９／０９１８２６号パンフレットは、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むヒトＣＤ１９特異的キメラＴ細胞受容体（またはキメラ抗原受容体、ＣＡＲ）ポリペプチド（ｈＣＤ１９ＣＡＲと命名）を含む組成物について記載しており、細胞外ドメインは、ヒトＣＤ１９結合領域を含む。別の態様において、ＣＤ１９結合領域は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖである。細胞内ドメインは、ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含み得、ヒトＣＤ２８細胞内セグメントをさらに含み得る。ある特定の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。国際公開第２０１３／０７４９１６号パンフレットは、遺伝子改変されてＴ細胞受容体および／またはＨＬＡの発現が排除されるＣＡＲ＋Ｔ細胞を用いる、免疫療法についての方法および組成物について記載している。特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体陰性および／またはＨＬＡ陰性Ｔ細胞は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して生じさせる。健康な同種異系ドナーからのＣＡＲ＋Ｔ細胞は、医学的状態、例えば、がん、自己免疫、および感染症の既製の処置のためのユニバーサル試薬として作用し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）をもたらすことなく任意の患者に投与することができる。
米国保健社会福祉省に譲渡された国際公開第２０１１／０４１０９３号パンフレットは、ＫＤＲ－１１２１またはＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含む抗血管内皮成長因子受容体－２キメラ抗原受容体、ならびにがんの処置におけるこれらの使用について記載している。
そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０４０５５７号パンフレットは、ペンシルバニア大学に譲渡され、共有発明者カールＨ．ジュン（Ｃａｒｌ Ｈ．Ｊｕｎｅ）を共有している。これらの公開資料は、それぞれ、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ、ならびにＲＮＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をトランスフェクトしたＴ細胞を生じさせる方法について記載している。
またペンシルバニア大学に譲渡され、共有発明者カールＨ．ジュン（Ｃａｒｌ Ｈ．Ｊｕｎｅ）を共有する国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットは、リガンド非依存性であり、かつがんの処置のために有用である外因性サイトカインまたは支持細胞の添加と無関係である、培養液中で長期に亘る指数関数的増殖を示すＴ細胞の持続性の集団を生じさせるための組成物および方法について記載している。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗ｃＭｅｔ結合ドメインである。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗メソテリン結合ドメインである。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９結合ドメインである。ヒンジドメインは、ＩｇＧ４であり、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８シグナル伝達領域である。また提供するのは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列と、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲとを含むベクターである。
ペンシルバニア大学に譲渡された国際公開第２０１４／０３９５１３号パンフレットは、細胞の細胞溶解活性を増進するための、細胞において１つもしくは複数のジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）アイソフォームを阻害するための組成物および方法について記載している。細胞は、養子Ｔ細胞移入において使用してもよく、ここで細胞は改変されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。養子Ｔ細胞移入において使用されるＴ細胞におけるＤＧＫの阻害は、Ｔ細胞の細胞溶解活性を増加させ、このように、がん、感染症、および免疫障害を含めた種々の状態の処置において使用し得る。
ペンシルバニア大学に譲渡された国際公開第２０１４／０５５７７１号パンフレットは、卵巣がんを処置するための組成物および方法について記載している。具体的には、本発明は、卵巣がんを処置するためにアルファ－葉酸受容体（ＦＲ－アルファ）結合ドメインおよびＣＤ２７同時刺激ドメインを有する遺伝子改変されたＴ細胞を投与することに関する。一実施形態では、ＦＲ－アルファ結合ドメインは、完全ヒトであり、それによって宿主免疫応答を防止すると言われる。
一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは工学処理して、腫瘍を標的とし得る。このようなＣＡＲは、１種もしくは複数のＴＡＣＡに対する特異性を有し得る。場合によって、これらのＣＡＲの外部ドメインは、本明細書において提示する１種もしくは複数の抗体可変ドメイン、またはそのフラグメントを含み得る。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、本明細書において、「ＣＡＲ－工学処理されたＴ細胞」または「ＣＡＲ－Ｔ」と称されるＴ細胞において発現している。ＣＡＲ－Ｔは、本明細書において提示する１種もしくは複数の抗体可変ドメインを有するＣＡＲ外部ドメインと共に工学処理し得る。
多重特異的抗体
一部の実施形態では、本発明の抗体は、複数のエピトープを結合し得る。本明細書において使用する場合、用語「マルチボディ」または「多重特異的抗体」は、２つもしくはそれよりも多い可変領域が異なるエピトープに結合する抗体を指す。エピトープは、同じまたは異なる標的上にあり得る。ある特定の実施形態では、多重特異的抗体は、同じまたは異なる抗原上の２つの異なるエピトープを認識する「二重特異的抗体」である。
二重特異的抗体
二重特異的抗体は、２つの異なる抗原を結合することができる。このような抗体は典型的には、少なくとも２つの異なる抗体からの抗原結合性の領域を含む。例えば、二重特異的モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂ、ＢｓＡｂ）は、２つの異なるモノクローナル抗体のフラグメントから構成され、このように、ＢｓＡｂが２つの異なるタイプの抗原に結合することを可能とする人工的なタンパク質である。この技術についての１つの一般の用途は、がん免疫療法においてであり、ＢｓＭＡｂは、細胞毒性細胞（受容体、例えば、ＣＤ３を使用して）および破壊される標的、例えば、腫瘍細胞に同時に結合するように工学処理される。
二重特異的抗体は、このそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、リエスマラー，Ｇ．（Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．）、２０１２年、がん免疫（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．）、１２巻：１２～１８頁；マーヴィン，Ｊ．Ｓ．（Ｍａｒｖｉｎ，Ｊ．Ｓ．）ら著、２００５年、アクタファルマコロジカシニカ（Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ．）、２６巻（６号）：６４９～５８頁；およびシェーファー，Ｗ．（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．）ら著、２０１１年、ＰＮＡＳ．、１０８巻（２７号）：１１１８７～９２頁に記載されているもののいずれかを含み得る。
「三機能性二重特異的」抗体と称される新世代のＢｓＭＡｂが開発されてきた。これらは２個の重鎖および２個の軽鎖からなり、それぞれの１個は２つの異なる抗体からのものであり、２つのＦａｂ領域（アーム）は２つの抗原に対して向けられており、Ｆｃ領域（フット）は２個の重鎖を含み、第３の結合部位を形成する。
二重特異的抗体の可変ドメインのトップを形成する２つのパラトープのうち、１つは標的抗原に対して向けられており、他方はＴリンパ球抗原、例えば、ＣＤ３に対して向けられることができる。三機能性抗体の場合、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体を発現している細胞、例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または樹状細胞にさらに結合し得る。要するに、標的とされる細胞は、免疫系の１個もしくは２個の細胞に接続しており、これらはそれに続いて標的とされる細胞を破壊する。
他のタイプの二重特異的抗体は、特定の問題、例えば、短い半減期、免疫原性、およびサイトカイン遊離によってもたらされる副作用を克服するために設計されてきた。これらは、Ｆａｂ領域のみからなる化学的に連結されたＦａｂ、ならびに様々なタイプの二価および三価の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、２つの抗体の可変ドメインを模倣する融合タンパク質を含む。これらのより新しいフォーマットのさらに開発されたものは、二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）およびｍＡｂ２、Ｆｃ定常領域の代わりにＦｃａｂ抗原結合性フラグメントを含有するように工学処理された抗体である。
二重特異的単鎖抗体Ｆｖフラグメント（Ｂｓ－ｓｃＦｖ）は、がん細胞を死滅させるために成功裏に使用した。いくつかのヒトがんは、ｐ５３における機能的欠点によってもたらされ、これは野生型ｐ５３による遺伝子療法によって回復する。ウェイスバート（Ｗｅｉｓｂａｒｔ）らは、生きている結腸がん細胞を透過し、細胞内ｐ５３を結合し、その野生型機能を標的とし、回復する二重特異的単鎖抗体の構築および発現について記載している（ウェイスバート（Ｗｅｉｓｂａｒｔ）ら著、腫瘍学国際ジャーナル（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．）、２００４年１０月；２５巻（４号）：１１１３～８頁；およびウェイスバート（Ｗｅｉｓｂａｒｔ）ら著、腫瘍学国際ジャーナル（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．）、２００４年１２月；２５巻（６号）：１８６７～７３頁）。これらの研究において、二重特異的、単鎖抗体Ｆｖフラグメント（Ｂｓ－ｓｃＦｖ）は、（ｉ）生細胞を透過し、細胞核において局在化している、ｍＡｂ３Ｅ１０の単鎖Ｆｖフラグメント、および（ｉｉ）ｐ５３のＣ末端を結合する非透過性抗体、ｍＡｂ ＰＡｂ４２１の単鎖Ｆｖフラグメントから構築された。ＰＡｂ４２１結合は、ＳＷ４８０ヒト結腸がん細胞のそれらを含めていくつかのｐ５３変異体の野生型機能を回復する。Ｂｓ－ｓｃＦｖはＳＷ４８０細胞を透過し、細胞毒性であったが、変異体ｐ５３への活性を回復する能力を示唆する。ＣＯＳ－７細胞（野生型ｐ５３を有するサル腎細胞）は、ｐ５３へのＰＡｂ４２１の結合を阻害するＳＶ４０ラージＴ抗原の存在によって、ＰＡｂ４２１に対して非応答性であるため、対照としての役割を果たした。Ｂｓ－ｓｃＦｖはＣＯＳ－７細胞を透過したが、細胞毒性ではなく、それによってｐ５３の結合とは無関係なＢｓ－ｓｃＦｖの非特異的毒性を除去した。Ｆｖフラグメント単独は、細胞毒性でなかったが、死滅はｐ５３の形質導入によるものであったことを示す。ＰＡｂ４２１ＶＨのＣＤＲ１における単一の変異は、ｐ５３へのＢｓ－ｓｃＦｖの結合を除去し、細胞の透過を変化させることなくＳＷ４８０細胞についての細胞毒性を抑止し、細胞毒性についてのｐ５３へのＰＡｂ４２１結合の必要性をさらに指示した（ウェイスバート（Ｗｅｉｓｂａｒｔ）ら著、腫瘍学国際ジャーナル（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．）、２００４年１０月；２５巻（４号）：１１１３～８頁；およびウェイスバート（Ｗｅｉｓｂａｒｔ）ら著、腫瘍学国際ジャーナル（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．）、２００４年１２月；２５巻（６号）：１８６７～７３頁）。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、二特異性抗体であり得る。二特異性抗体は、機能的二重特異的単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）である。これらの二価抗原結合性分子は、ｓｃＦｖの非共有結合的二量体から構成され、組換え方法を使用して哺乳動物細胞において産生することができる。（例えば、マック（Ｍａｃｋ）ら著、科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、９２巻：７０２１～７０２５頁、１９９５年を参照されたい）。少数の二特異性抗体が臨床開発に入っている。抗ＣＥＡキメラ抗体ｃＴ８４．６６のヨウ素－１２３－標識二特異性抗体バージョンは、シティオブホープのベックマン研究所（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）（クリニカルトライアルズドットガブ（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）ＮＣＴ００６４７１５３）によって援助された研究において、結腸直腸がんの前外科的イムノシンチグラフィー検出について評価されてきた（ネルソン，Ａ．Ｌ．（Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．）、ＭＡｂｓ．２０１０年１月～２月；２巻（１号）：７７～８３頁）。
分子遺伝学を使用して、２つのｓｃＦｖは、単一のポリペプチド中にタンデムで工学処理され、リンカードメインによって分離され、「タンデムｓｃＦｖ」（ｔａｓｃＦｖ）と称することができる。ＴａｓｃＦｖは難溶性であることが見出されてきており、細菌において産生されたときリフォールディングを必要とするか、またはこれらは哺乳動物細胞培養系において製造してもよく、これはリフォールディングの必要性を回避するが、乏しい収率をもたらし得る。２つの異なるｓｃＦｖについての遺伝子を有するｔａｓｃＦｖの構築は、「二重特異的単鎖可変フラグメント」（ｂｉｓ－ｓｃＦｖ）を生じさせる。２つのみのｔａｓｃＦｖが、企業によって臨床的に開発されてきており、両方は、腫瘍の適応症のためにマイクロメット（マイクロメット）によって活発に前期開発中にある二重特異的薬剤であり、「二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）」と記載されている。ブリナツモマブは、第２相におけるＢ細胞非ホジキンリンパ腫へのＴ細胞応答を増強する抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３二重特異的ｔａｓｃＦｖである。ＭＴ１１０は、第１相における固形腫瘍へのＴ細胞応答を増強する抗ＥＰ－ＣＡＭ／抗ＣＤ３二重特異的ｔａｓｃＦｖである。二重特異的四価「ＴａｎｄＡｂ」はまた、アファームド（Ａｆｆｉｍｅｄ）（ネルソン，Ａ．Ｌ．（Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．）、ＭＡｂｓ．２０１０年１月～２月；２巻（１号）：７７～８３頁）によってリサーチされている。
また含まれるのは、ＩｇＧのマキシボディである（Ｆｃ（ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン）のアミノ末端に融合した二価ｓｃＦＶ）。
二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）抗体は、選択した標的細胞の溶解のために細胞毒性Ｔ細胞を一過的に会合するように設計されている。これらは典型的には、２個のｓｃＦｖ（１個の結合はＴ細胞上のＣＤ３に、および１個の結合は破壊の標的とされている細胞の表面上の標的抗原に）を含む。一部の実施形態では、２個のｓｃＦｖは、リンカーによって接合されている。他の実施形態では、２個のｓｃＦｖは、抗体上の異なる領域である。ＢｉＴＥ抗体の臨床活性は、腫瘍組織に由来するか、または特定のＴ細胞受容体でトランスフェクトされたｅｘ ｖｉｖｏで増殖した自己Ｔ細胞が、固形腫瘍の処置における治療可能性を示してきたという知見を実証する。これらの個別化されたアプローチは、Ｔ細胞単独が後期のがんにおいてでさえかなりの治療活性を有することができることを証明する一方で、これらは広範なベースで行うには煩雑である。これは、腫瘍特異的Ｔ細胞クローンの産生を促進する細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）抗体によって、ならびにまた、がん細胞溶解のために患者のＴ細胞の大きな割合を直接会合する二重および三重特異的抗体によって異なる。Ｔ細胞会合抗体によるヒトがん療法についての包括的Ｔ細胞会合の可能性は、活発な調査中である（そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ボイエルレＰＡ（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ）ら著、カレントオピニオン（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ）、分子療法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、２００９年、１１巻（１号）：２２～３０頁およびボイエルレＰＡ（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ）およびラインハルトＣ（Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｃ）、がんリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ）、２００９年、６９巻（１２号）：４９４１～４頁）。
第三世代分子は、「ミニチュア化された」抗体を含む。ｍＡｂミニチュア化さの最良の例の中には、トルビオンファーマシューティカルズ（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）からの小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）がある。一価または二価でよいこれらの分子は、全てリンカードメインによって接続している１個のＶＬ、１個のＶＨ抗原結合性ドメイン、および１個または２個の定常「エフェクター」ドメインを含有する組換え単鎖分子である。おそらく、このような分子は、定常ドメインによって与えられる免疫エフェクター機能を保持する一方で、フラグメントによるものと主張される増加した組織または腫瘍浸透の利点を提供し得る。少なくとも３種の「ミニチュア化された」ＳＭＩＰが、臨床開発に入っている。ワイス（Ｗｙｅｔｈ）と共同して開発されたＴＲＵ－０１５、抗ＣＤ２０ＳＭＩＰは、最も進行したプロジェクトであり、関節リウマチ（ＲＡ）のために第２相まで進行している。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびＢ細胞リンパ腫における以前の試みは、最終的に中断された。トルビオン（Ｔｒｕｂｉｏｎ）およびファセットバイオテクノロジー（Ｆａｃｅｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、ＣＬＬおよび他のリンパ性新組織形成の処置のための、ＴＲＵ－０１６、抗ＣＤ３７ＳＭＩＰのＴＲＵ－０１６、抗ＣＤ３７ＳＭＩＰの開発において協力しており、第２相に達したプロジェクトである。ワイス（Ｗｙｅｔｈ）は、ＲＡ、ＳＬＥおよび恐らく多発性硬化症を含めた自己免疫疾患の処置のための抗ＣＤ２０ＳＭＩＰ ＳＢＩ－０８７を許可してきたが、これらのプロジェクトは、臨床試験の最も早い段階に留まっている。（ネルソン，Ａ．Ｌ．（Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．）、ＭＡｂｓ．２０１０年１月～２月；２巻（１号）：７７～８３頁）。
ジェンマブ（Ｇｅｎｍａｂ）は、ヒンジ領域がＩｇＧ４分子から除去されている、これらの「ユニボディ」技術の適用についてリサーチしている。一方、ＩｇＧ４分子は不安定であり、軽鎖－重鎖ヘテロ二量体を交換することができ、ヒンジ領域の欠失は、重鎖－重鎖対形成を全体的に防止し、高度に特異的な一価軽鎖／重鎖ヘテロ二量体を残し、一方、Ｆｃ領域を保持して、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性および延長された半減期を確実にする。この立体配置は、ＩｇＧ４はＦｃＲと不十分に相互作用し、一価ユニボディは細胞内シグナル伝達複合体形成を促進できないため、免疫活性化または癌化成長の危険性を最小化し得る。しかし、これらの論点は、臨床上の証拠よりはむしろ実験室の証拠によって大いに支持される。バイオテクノール（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）はまた、前臨床リサーチにおける「コンパクト化された」１００ｋＤａの抗ＨＥＲ２抗体である「ミニチュア化された」ｍＡｂ、ＣＡＢ０５１を開発している（ネルソン，Ａ．Ｌ．（Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．）、ＭＡｂｓ．２０１０年１月～２月；２巻（１号）：７７～８３頁）。
単一の抗原結合性ドメインから構成される組換え治療剤がまた開発されてきたが、これらは現在臨床パイプラインの４％のみを占める。これらの分子は極めて小さく、分子量はフルサイズのｍＡｂについて観察されるものの概ね１０分の１である。アラナ（Ａｒａｎａ）およびドマンティス（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）は、ヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖抗原結合性ドメインから構成される分子を工学処理しているが、アラナ（Ａｒａｎａ）のみが、臨床試験において候補である、乾癬および関節リウマチの処置のための第２相研究における抗ＴＮＦα分子であるＡＲＴ－６２１を有する。アブリンクス（Ａｂｌｙｎｘ）は、軽鎖を欠いている、ラクダおよびラマにおいて見出される重鎖抗体の抗原結合性可変重鎖領域（ＶＨＨ）に由来する「ナノボディ」を産生する。２つのアブリンクス（Ａｂｌｙｎｘ）抗フォンウィルブランド因子ナノボディは、急性冠症候群についての経皮的冠動脈インターベンションを受けている患者における血栓症を予防するための静脈内治療として第２相開発にあるＡＬＸ－００８１、および急性冠症候群および血栓性血小板減少性紫斑病を有する両方の患者を対象とした皮下投与のための第１相分子であるＡＬＸ－０６８１を含めて臨床開発に進んでいる（ネルソン，Ａ．Ｌ．（Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．）、ＭＡｂｓ．２０１０年１月～２月；２巻（１号）：７７～８３頁）。
多重特異的抗体の開発
一部の実施形態では、本発明の抗体配列を使用して、多重特異的抗体（例えば、二重特異的、三重特異性、またはそれ超の多重特異性）を開発し得る。多重特異的抗体は、本発明の標的抗原の異なるエピトープに対して特異的でよいか、または本発明の標的抗原、および異種エピトープ、例えば、異種グリカン、ペプチドまたは固体支持体材料の両方に対して特異的であり得る。（例えば、国際公開第９３／１７７１５号パンフレット；国際公開第９２／０８８０２号パンフレット；国際公開第９１／００３６０号パンフレット；国際公開第９２／０５７９３号パンフレット；タット，Ａ．（Ｔｕｔｔ，Ａ．）ら、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体およびＣＤ２を介して協同的シグナル伝達を使用し、休止している細胞毒性Ｔ細胞を活性化および再方向付けする三重特異的Ｆ（ａｂ’）３誘導体（Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆ（ａｂ’）３ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈａｔ ｕｓｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｖｉａ ｔｈｅ ＴＣＲ／ＣＤ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ＣＤ２ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ａｎｄ ｒｅｄｉｒｅｃｔ ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、免疫学ジャーナル（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９１年７月１日；１４７巻（１号）：６０～９頁；米国特許第４，４７４，８９３号明細書；同第４，７１４，６８１号明細書；同第４，９２５，６４８号明細書；同第５，５７３，９２０号明細書；同第５，６０１，８１９号明細書；およびコステルニ，Ｓ．Ａ．（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．）ら著、ロイシンジッパーの使用による二重特異的抗体の形成（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒｓ）、免疫学ジャーナル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９２年３月１日；１４８巻（５号）：１５４７～５３頁；米国特許第５，９３２，４４８号明細書を参照されたい）。
スローンケッタリング記念がんセンター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ－Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）への国際公開第２０１４１４４５７３号パンフレットにおいて開示および特許請求されているのは、二量体化の能力を伴わない多重特異的結合剤を超えた改善された特性を有する二量体の多重特異的結合剤（例えば、抗体構成要素を含む融合タンパク質）を作製するための多量体化技術である。
メルクパテントＧＭＢＨ（Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ ＧＭＢＨ）への国際公開第２０１４１４４３５７号パンフレットにおいて開示および特許請求されているのは、四価の二重特異的抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）、ならびにＴｅｔＢｉＡｂを作製する方法、および診断法、およびがんまたは免疫障害の処置のためにＴｅｔＢｉＡｂを使用する方法である。ＴｅｔＢｉＡｂは、抗体のＣ末端に付着した第２の抗原特異性を有するＦａｂフラグメントの第２の対をフィーチャし、このように、２つの抗原特異性のそれぞれについて二価である分子を提供する。四価抗体は、遺伝子工学方法によって、抗体重鎖を、その同族の同時発現したＦａｂ重鎖と関連しているＦａｂ軽鎖に共有結合的に連結することによって産生される。
ＩＢＣファーマセウティカルズ社（ＩＢＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）への国際公開第２０１４０２８５６０号パンフレットにおいて開示および特許請求されているのは、疾患の処置のために、Ｔ細胞抗原について少なくとも１つの結合部位、および異常細胞または病原体上の抗原について少なくとも１つの結合部位を有する、Ｔ細胞を再方向付けする二重特異的抗体（ｂｓＡｂ）である。好ましくは、このｂｓＡｂは、抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異的抗体であるが、他のＴ細胞抗原および／または疾患関連抗原に対する抗体を使用し得る。複合体は、エフェクターＴ細胞を標的とし、疾患、例えば、がん、自己免疫疾患または感染症と関連する細胞のＴ細胞が媒介する細胞毒性を誘発することができる。細胞毒性免疫応答は、インターフェロン－α、インターフェロン－ｂｇｒ；インターフェロン－λ１、インターフェロン－λ２またはインターフェロン－λ３を含むインターフェロンをベースとする薬剤の同時の投与によって増進される。
シュニムネＧＭＢＨ（Ｓｙｎｉｍｍｕｎｅ ＧＭＢＨ）への国際公開第２０１３０９２００１号パンフレットにおいて開示および特許請求されているのは、二重特異的抗体分子、およびこれを産生する方法、その使用、および二重特異的抗体分子をコードする核酸分子である。特に、免疫細胞の標的細胞に制限された活性化を媒介することができる抗体分子を提供する。
国際公開第２０１２００７１６７号パンフレットにおいて開示および特許請求されているのは、腫瘍細胞の表面上の少なくとも糖エピトープ、およびｅｒｂＢクラスの受容体に特異的に結合し、それによって糖エピトープおよび受容体を架橋する、多重特異的モジュラー抗体であり、この抗体は、ＮＫ細胞と無関係に細胞溶解をもたらすアポトーシス活性を有する。
国際公開第２０１２０４８３３２号パンフレットおよび国際公開第２０１３０５５４０４号パンフレットにおいて開示および特許請求されているのは、メディトープ、メディトープ結合抗体、メディトープ送達系、およびメディトープのためのモノクローナル抗体フレームワーク結合インターフェース、ならびにこれらの使用のための方法である。具体的には、２つの抗体結合ペプチドである、Ｃ－ＱＦＤＬＳＴＲＲＬＫ－Ｃ（「ｃＱＦＤ」；その中の配列識別番号１；本明細書において配列番号２６１）およびＣ－ＱＹＮＬＳＳＲＡＬＫ－Ｃ（「ｃＱＹＮ」；その中の配列識別番号２；本明細書において配列番号２６２）は、新規なｍＡｂ結合特性を有することが示された。「メディトープ」とまた称される、ｃＱＦＤおよびｃＱＹＮは、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂセツキシマブのＦａｂフレームワークの領域に結合し、抗原を結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を結合しないことが示された。Ｆａｂフレームワーク上の結合領域は、他のフレームワーク結合抗原、例えば、スーパー抗原ブドウ球菌プロンテインＡ（ＳｐＡ）（Ｇｒａｉｌｌｅら著、２０００年）およびペプトストレプトコッカスマグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）タンパク質Ｌ（ＰｐＬ）（Ｇｒａｉｌｌｅら著、２００１年）とは異なる。したがって、開示されている一実施形態は、環状メディトープを結合する、独自のマウス－ヒト抗体またはその機能的フラグメントのフレームワーク領域を含む、フレームワーク結合インターフェースである。
例示的な目的の特許および特許公報は、全てがプロテインデザインラブ社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に譲渡されている、米国特許第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６１号明細書；および同第５，６９３，７６２号明細書（全て１９９５年６月７日に出願）、ならびに米国特許第６，１８０，３７０号明細書であり、１つもしくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびドナー免疫グロブリンからの可能なさらなるアミノ酸、および受容性ヒト免疫グロブリンからのフレームワーク領域を有するヒト化免疫グロブリンを産生するための方法、ならびにヒト化免疫グロブリンの組成物について記載している。各ヒト化免疫グロブリン鎖は、ＣＤＲに加えて、例えば、ＣＤＲと相互作用し、結合親和性をもたらすことができるドナー免疫グロブリンフレームワークからのアミノ酸、例えば、ドナー免疫グロブリン中のＣＤＲと直接隣接した１個もしくは複数のアミノ酸、または分子モデリングによって予測されるように約３Å以内のものを通常含むと言われる。重鎖および軽鎖はそれぞれ、様々な位置の基準の任意の１つまたは全てを使用することによって設計し得る。インタクトな抗体中に合わせたとき、本発明のヒト化免疫グロブリンは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、かつ抗原、例えば、エピトープを含有するタンパク質または他の化合物へのドナー免疫グロブリンの親和性と実質的に同じ親和性を保持すると言われている。
ルーヴァンカトリック大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｃａｔｈｏｌｉｑｕｅ Ｄｅ Ｌｏｕｖａｉｎ）およびバイオトランスプラント株式会社（Ｂｉｏ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，Ｉｎｃ．）に譲渡された米国特許第５，９５１，９８３号明細書は、Ｔリンパ球に対するヒト化抗体について記載している。ＨＵＭ５４００として命名されているヒトＶカッパ遺伝子（ＥＭＢＬ受託番号Ｘ５５４００）およびヒト抗体クローンＡｍｕ５－３（ジェンバンク受託番号Ｕ００５６２）からのフレームワーク領域が、その中に記載されている。
クリエイティブバイオモレキュール社（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， Ｉｎｃ．）への米国特許第５，０９１，５１３号明細書は、事前に選択した抗原に対する親和性を有する合成タンパク質のファミリーについて記載している。タンパク質は、生合成抗体結合部位（ＢＡＢＳ）のように挙動する領域を構成するアミノ酸の１つもしくは複数の配列によって特性決定される。部位は、１）非共有結合的に会合もしくはジスルフィド結合された合成ＶＨおよびＶＬ二量体、２）ＶＨ－ＶＬもしくはＶＬ－ＶＨ単鎖（ここで、ＶＨおよびＶＬは、ポリペプチドリンカーによって付着している）、または３）個々のＶＨもしくはＶＬドメインを含む。結合ドメインは、別々の免疫グロブリンに由来し得る、連結したＣＤＲおよびＦＲ領域を含む。タンパク質はまた、例えば、酵素、毒素、結合部位、または固定化媒体への付着の部位、または放射性原子として機能する他のポリペプチド配列を含み得る。タンパク質を産生するための、抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの産生によって引き出すことができる任意の特異性を有するＢＡＢＳを設計するための、およびその類似体を産生するための方法が開示されている。
ＥＳＢＡテック、アルコンバイオメディカルリサーチユニット、ＬＬＣ（ＥＳＢＡＴｅｃｈ、Ａｌｃｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｎｉｔ、ＬＬＣ）への米国特許第８，３９９，６２５号明細書は、抗体アクセプターフレームワーク、および特に適切な抗体アクセプターフレームワークを使用した、非ヒト抗体、例えば、ウサギ抗体をグラフトするための方法について記載している。
細胞内抗体
一部の実施形態では、本発明の抗体は、細胞内抗体であり得る。細胞内抗体は、それが産生される細胞から分泌されないが、代わりに、１種もしくは複数の細胞内タンパク質を標的とする抗体の１形態である。細胞内抗体は細胞内に発現および機能しており、使用されて、これらに限定されないが、細胞内輸送、転写、翻訳、代謝過程、増殖シグナル伝達および細胞分裂を含めた多数の細胞過程に影響を与え得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、細胞内抗体をベースとする治療を含む。一部のこのような実施形態では、本明細書において開示されている可変ドメイン配列および／またはＣＤＲ配列は、細胞内抗体をベースとする治療のための１つもしくは複数の構築物中に組み込まれている。例えば、細胞内抗体は、１種もしくは複数の糖化された細胞内タンパク質を標的とし得るか、または１種もしくは複数の糖化された細胞内タンパク質および代替タンパク質の間の相互作用をモジュレートし得る。
２０年超前、細胞内の標的に対する細胞内の抗体について最初に記載された（ビオッカ（Ｂｉｏｃｃａ）、ニューベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）およびカッターネオ（Ｃａｔｔａｎｅｏ）、ＥＭＢＯ Ｊ．、９：１０１～１０８頁、１９９０年）。哺乳動物細胞の異なるコンパートメントにおける細胞内抗体の細胞内発現は、内因性分子の機能のブロッキングまたはモジュレーションを可能とする（ビオッカ（Ｂｉｏｃｃａ）ら著、ＥＭＢＯ Ｊ．、９巻：１０１～１０８頁、１９９０年；Ｃｏｌｂｙら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、１０１巻：１７６１６～２１頁、２００４年）。細胞内抗体は、タンパク質フォールディング、タンパク質－タンパク質、タンパク質－ＤＮＡ、タンパク質－ＲＮＡ相互作用およびタンパク質修飾を変化させることができる。これらは表現型ノックアウトを誘発し、標的抗原への直接の結合によって、その細胞内の交通を迂回させることによって、または結合パートナーとのその会合を阻害することによって、中和剤として作用することができる。これらは研究ツールとして多くは用いられてきており、ウイルス病理学、がんおよびミスフォールディング疾患としてのヒト疾患の処置のための治療用分子として登場している。組換え抗体の急成長しているバイオマーケットは、治療におけるこれらの使用のための、より低い免疫原性と一緒に増進された結合特異性、安定性および溶解性を伴う細胞内抗体を提供する（ビオッカ（Ｂｉｏｃｃａ）、抗体発現および産生、細胞工学（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）におけるアブストラクト、第７巻、２０１１年、１７９～１９５頁）。
一部の実施形態では、細胞内抗体は、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）への利点を有する。例えば、ｉＲＮＡは、複数の非特異的効果を発揮することが示されてきており、一方では、細胞内抗体は、標的抗原に対して高い特異性および親和性を有することが示されてきた。さらに、タンパク質として、細胞内抗体は、ｉＲＮＡより非常により長い活性半減期を有する。このように、細胞内の標的分子の活性半減期が長いとき、ｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制は、効果を生じるのが遅いことがあり得、一方、細胞内抗体発現の効果は殆ど即時的であり得る。最後に、他のものを残す一方で、特定の標的分子の特定の結合相互作用をブロックする細胞内抗体を設計することが可能である。
細胞内抗体の開発
細胞内抗体は、組換え核酸分子から発現し、かつ細胞内に保持されるように工学処理された（例えば、細胞質、小胞体、またはペリプラズム中に保持された）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であることが多い。細胞内抗体は、例えば、胞内抗体が結合するタンパク質の機能を除去するために使用し得る。細胞内抗体の発現はまた、細胞内抗体を含む核酸発現ベクターにおける誘導性プロモーターの使用によってレギュレートし得る。細胞内抗体は、当技術分野において公知の方法、例えば、（Ｍａｒａｓｃｏ（マラスコ）ら著、１９９３年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９０巻：７８８９～７８９３頁；Ｃｈｅｎ（チェン）ら著、１９９４年、ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、５巻：５９５～６０１頁；Ｃｈｅｎ（チェン）ら著、１９９４年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９１巻：５９３２～５９３６頁；Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ（マシエジェウスキ）ら著、１９９５年、ネイチャーメディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．）、１巻：６６７～６７３頁；Ｍａｒａｓｃｏ（マラスコ）、１９９５年、免疫技術（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、１巻：１～１９頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ（マシルカー）ら著、１９９５年、ＥＭＢＯ Ｊ．、１４巻：１５４２～５１頁；Ｃｈｅｎ（チェン）ら著、１９９６年、ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．）、７巻：１５１５～１５２５頁；Ｍａｒａｓｃｏ（マラスコ）、遺伝子治療（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、４巻：１１～１５頁、１９９７年；Ｒｏｎｄｏｎ（ロンドン）およびＭａｒａｓｃｏ（マラスコ）、１９９７年、微生物学年次レビュー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、５１巻：２５７～２８３頁；コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら著、１９９８年、癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、１７巻：２４４５～５６頁；Ｐｒｏｂａら著、１９９８年、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、２７５巻：２４５～２５３頁；コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら著、１９９８年、癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、１７巻：２４４５～２４５６頁；ハサンザデ（Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ）ら著、１９９８年、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、４３７巻：８１～６頁；リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）ら著、１９９８年、遺伝子治療（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、５巻：６３５～４４頁；オハゲ（Ｏｈａｇｅ）およびステイプ（Ｓｔｅｉｐｅ）、１９９９年、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、２９１巻：１１１９～１１２８頁；オハゲ（Ｏｈａｇｅ）ら著、１９９９年、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、２９１巻：１１２９～１１３４頁；ワーツ（Ｗｉｒｔｚ）およびステイプ（Ｓｔｅｉｐｅ）、１９９９年、タンパク質科学（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．）、８巻：２２４５～２２５０頁；シュー（Ｚｈｕ）ら著、１９９９年、免疫学的方法ジャーナル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２３１巻：２０７～２２２頁；アラファト（Ａｒａｆａｔ）ら著、２０００年、がん遺伝子治療（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、７巻：１２５０～６頁；デルマール（ｄｅｒ Ｍａｕｒ）ら著、２００２年、生物化学ジャーナル（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７７巻：４５０７５～８５頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ（マシルカー）ら著、２００２年、遺伝子治療（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、９巻：３０７～１９頁；およびウィーラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）ら著、２００３年、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１７巻：１７３３～５頁；およびその中に引用された参照文献）において開示および概説されているものを使用して産生し得る。特に、ＣＣＲ５細胞内抗体は、シュタインバーガー（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、２０００年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９７巻：８０５～８１０頁）によって産生されてきた。一般に、マラスコ，ＷＡ（Ｍａｒａｓｃｏ，ＷＡ）、１９９８年、「細胞内抗体：基礎研究および臨床遺伝子療法用途（Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ：Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：ニューヨークを参照されたい；およびｓｃＦｖの概説については、プルックサン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）、「モノクローナル抗体の薬理学（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、１９９４年、第１１３巻、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ）およびムーア（Ｍｏｏｒｅ）編、シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、２６９～３１５頁を参照されたい。
一部の実施形態では、抗体配列は、細胞内抗体を開発するために使用される。細胞内抗体は、細胞内の単一ドメインフラグメント、例えば、単離したＶＨおよびＶＬドメインとして、または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体として組み換え技術によって発現していることが多い。例えば、細胞内抗体は単一のポリペプチドとして発現し、柔軟なリンカーポリペプチドによって接合した重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む単鎖抗体を形成することが多い。細胞内抗体は典型的にはジスルフィド結合を欠いており、これらの特異的結合活性によって標的遺伝子の発現または活性をモジュレートすることができる。単鎖抗体はまた、軽鎖定常領域に接合した単鎖可変領域フラグメントとして発現することができる。
当技術分野において公知のように、細胞内抗体は、組換えポリヌクレオチドベクター中に工学処理し、そのＮ末端もしくはＣ末端における細胞内輸送シグナルをコードし、標的タンパク質が位置している細胞内コンパートメントにおける高濃度での発現を可能とすることができる。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的とされた細胞内抗体は、リーダーペプチド、および任意選択で、Ｃ末端ＥＲ保留シグナル、例えば、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフを組み込むように工学処理される。細胞核において活性を発揮させることを意図する細胞内抗体は、核局在化シグナルを含むように工学処理される。脂質部分は、細胞内抗体を形質膜の細胞質ゾル側に繋ぎ止めるために細胞内抗体に接合している。細胞内抗体はまた標的とされ、細胞質ゾルにおいて機能を発揮することができる。例えば、細胞質ゾルの細胞内抗体は、細胞質ゾル内の因子を捕捉し、それによって因子がこれらの天然の細胞の目的場所に輸送されることを防止するために使用される。
細胞内抗体発現には特定の技術的難関が存在する。特に、細胞内の新規に合成された細胞内抗体のタンパク質高次構造フォールディングおよび構造的安定性は、細胞内環境の還元条件によって影響を受ける。ヒト臨床治療において、細胞内の細胞内抗体発現を達成するために使用される、トランスフェクトされた組換えＤＮＡの適用を取り囲む安全性の懸念が存在する。特に懸念されるのは、遺伝子操作において一般に使用される様々なウイルスをベースとするベクターである。このように、これらの問題を回避する１つのアプローチは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をｓｃＦｖ抗体に融合して、「細胞透過性」抗体または「トランスボディ」を生じさせることである。トランスボディは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体と融合している細胞透過性抗体である（ヘング（Ｈｅｎｇ）およびキャオ（Ｃａｏ）、２００５年、医学仮説（Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．）、６４巻：１１０５～８頁）。
標的遺伝子との相互作用によって、細胞内抗体は、標的タンパク質機能をモジュレートし、かつ／または、機序、例えば、標的タンパク質分解を加速し、非生理学的細胞内コンパートメント中に標的タンパク質を隔離することによって、表現型／機能的ノックアウトを達成する。細胞内抗体が媒介する遺伝子不活性化の他の機序は、細胞内抗体が向いているエピトープ、例えば、標的タンパク質上の触媒作用部位への、またはタンパク質－タンパク質、タンパク質－ＤＮＡ、もしくはタンパク質－ＲＮＡの相互作用に関与しているエピトープへの結合によって決まり得る。
一実施形態では、細胞内抗体を使用して、細胞核における標的を捕獲し、それによって、細胞核内のその活性を防止する。核標的化シグナルは、所望のターゲッティングを達成するために、このような細胞内抗体中に工学処理される。このような細胞内抗体は、特定の標的ドメインに特異的に結合するように設計される。別の実施形態では、標的タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾルの細胞内抗体は、標的が細胞核にアクセスすることを防止し、それによって、標的が細胞核内で任意の生物活性を発揮することを防止する（例えば、標的が他の因子との転写複合体を形成することを防止する）ために使用される。
このような細胞内抗体の発現を特定の細胞に特異的に方向付けるために、細胞内抗体の転写を、適当な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節性制御下に置く。細胞内抗体発現が特異的に前立腺を標的とするために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーを利用することができる（例えば、１９９９年７月６日に発行された米国特許第５，９１９，６５２号明細書を参照されたい）。
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、非定型分泌経路および内部移行経路を通して、タンパク質が細胞膜を横切って転座し、細胞質ゾル内に内部移行されることを可能とする短いペプチド配列である。細胞内に発現している通常の細胞内抗体を超えて、「トランスボディ」が有するいくつかの別個の利点が存在する。第一に、「正しい」高次構造のフォールディングおよびジスルフィド結合形成は、標的細胞中への導入の前に起こることができる。より重要なことに、細胞透過性抗体または「トランスボディ」の使用は、細胞内の細胞内抗体発現のために必要とされる、ヒト臨床治療における組換えＤＮＡ技術の直接適用を取り巻く圧倒的な安全性および倫理的な懸念を回避する。細胞中に導入される「トランスボディ」は、永久の遺伝子変化をもたらすことなしに単に制限された活性半減期を有する。これは、ヒト臨床治療におけるこれらの適用に関する安全性の懸念を和らげる（ヘング（Ｈｅｎｇ）およびキャオ（Ｃａｏ）、２００５年、医学仮説（Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．）、６４巻：１１０５～８頁）。
細胞内抗体は、病理学的アイソフォームを含めたタンパク質の異なる高次構造と特異的に認識するこれらの実質的に無限の能力のため、およびこれらが凝集の潜在的部位（細胞内および細胞外部位の両方）を標的とすることができるため、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病およびプリオン病を含めたミスフォールディング疾患の処置のための有望な治療剤である。これらの分子は、これらの凝集を防止することによって、および／またはその潜在的な凝集部位からタンパク質をコース変更させることによって細胞内交通の分子シャンターとして、アミロイド原性タンパクに対する中和剤として作用することができる（カルディナーレ（Ｃａｒｄｉｎａｌｅ）、およびヒビオッカ（Ｂｉｏｃｃａ）、現在の分子医学（Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、２００８年、８巻：２～１１頁）。
細胞内の抗体または細胞内抗体について記載している例示的な特許公報は、本明細書の下に記載し、これらのそれぞれは参照によりその全体が組み込まれている。
カッターネオ（Ｃａｔｔａｎｅｏ）らに付与された国際公開第０３０１４９６０号パンフレットおよび米国特許第７，６０８，４５３号明細書は、検証された細胞内の抗体の配列を含むデータベース（ＶＩＤＡデータベース）を生じさせ、カバット（Ｋａｂａｔ）によって検証された細胞内の抗体の配列を整列化するステップと；特定のアミノ酸が整列化した抗体の位置のそれぞれにおいて生じる頻度を決定するステップと；７０％～１００％の範囲の頻度閾値（ＬＰまたはコンセンサス閾値）を選択するステップと；特定のアミノ酸の頻度がＬＰ値と等しいかもしくはこれ超であるアラインメントの位置を同定するステップと；前記アラインメントの位置において最も頻度の高いアミノ酸を同定するステップとを含む、細胞内の抗体（ＩＣＳ）について少なくとも１つのコンセンサス配列を同定する細胞内の抗体捕獲技術の方法について記載している。
発明者カッターネオ（Ｃａｔｔａｎｅｏ）らを含めた全て医療研究審議会に譲渡された、国際公開第００５４０５７号パンフレット；国際公開第０３０７７９４５号パンフレット；国際公開第２００４０４６１８５号パンフレット；国際公開第２００４０４６１８６号パンフレット；国際公開第２００４０４６１８７号パンフレット；国際公開第２００４０４６１８８号パンフレット；国際公開第２００４０４６１８９号パンフレット；米国特許出願公開第２００５２７２１０７号明細書；同第２００５２７６８００号明細書；同第２００５２８８４９２号明細書；同第２０１０１４３９３９号明細書；登録米国特許第７，５６９，３９０号明細書および同第７，８９７，３４７号明細書および登録欧州特許第１５６０８５３号明細書；および欧州特許第１１６６１２１号明細書は、細胞内単一ドメイン免疫グロブリン、および細胞内環境における標的に結合する免疫グロブリン単一ドメインの能力を決定する方法、および細胞内の抗体を生じさせる方法について記載している。
カッテネオ（Ｃａｔｔｅｎｅｏ）が発明者として挙げられ、Ｓ．Ｉ．Ｓ．Ｓ．Ａ．国際高等研究大学院大学（Ｓ．Ｉ．Ｓ．Ｓ．Ａ．Ｓｃｕｏｌａ Ｉｎｔｅｒｎａｚｉｏｎａｌｅ Ｓｕｐｅｒｉｏｒｅ）に譲渡された国際公開第０２３５２３７号パンフレット；米国特許出願公開第２００３２３５８５０号明細書および登録欧州特許第１３２８８１４号明細書は、細胞内の抗原のエピトープのｉｎ ｖｉｖｏでの同定のための方法について記載している。
レイラインジェノミクスＳＰＡ（Ｌａｙ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＳＰＡ）に譲渡され、カッテネオ（Ｃａｔｔｅｎｅｏ）が発明者として挙げられている国際公開第２００４０４６１９２号パンフレットおよび欧州特許第１５６５５５８号明細書は、細胞内のタンパク質リガンドｘおよびタンパク質リガンドｙの間の相互作用を撹乱および中和する細胞内の抗体を単離するための方法について記載している。また開示されているのは、ｘおよびｙの間の相互作用をすることができる細胞内の抗体を使用して、既知のｙリガンドに結合することができるタンパク質リガンドｘを同定する方法；ならびに所与の細胞のタンパク質間相互作用の相当な割合（インタラクトーム）に対する、または細胞内経路もしくはネットワークを構成するタンパク質相互作用に対する一連の抗体フラグメントの単離のための方法である。
「免疫反応の細胞内抗体が媒介する制御（Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」という名称であり、ダナファーバーがん研究所（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）に譲渡され、発明者マラスコ（Ｍａｒａｓｃｏ）およびマシルカー（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ）が挙げられている、米国特許出願公開第２００６０３４８３４号明細書および国際公開第９９１４３５３号パンフレットは、細胞をＩＲＭに対する細胞内に発現された抗体、または細胞内抗体で形質導入することを含む、例えば、細胞上の個々のまたはクラスの免疫調節性受容体分子（ＩＲＭ）を選択的に標的とすることによって、免疫系のレギュレーションを変化させる方法を対象とする。好ましい実施形態では、細胞内抗体は、ＩＲＭ、例えば、ＭＨＣ－１分子に対する単鎖抗体を含む。
ダナファーバー癌研究所（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）およびホワイトヘッド研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に譲渡され、発明者ブラドナー（Ｂｒａｄｎｅｒ）、ラール（Ｒａｈｌ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）が挙げられている国際公開第２０１３０３３４２０号パンフレットは、ブロモドメインタンパク質および免疫グロブリン（Ｉｇ）調節エレメントの間の相互作用を阻害し、Ｉｇ座位と共に転座する癌遺伝子の発現をダウンレギュレートするために、およびＩｇ座位と共に転座する癌遺伝子の発現の増加によって特徴付けられるがん（例えば、血液悪性腫瘍）を処置するために有用である方法および組成物について記載いている。細胞内抗体が一般に記載されている。
「真核細胞において細胞内抗体を産生または同定する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」という名称であり ロチェスター大学医療センターに譲渡され、発明者ザウダラー（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）、ウェイ（Ｗｅｉ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）が挙げられている国際公開第０２０８６０９６号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００３１０４４０２号明細書は、３分子組換え方法を使用して、真核細胞において細胞内免疫グロブリン分子および細胞内免疫グロブリンライブラリーを発現させる高効率の方法について記載している。さらに提供するのは、細胞内免疫グロブリン分子およびそのフラグメントについて選定およびスクリーニングする方法、ならびに細胞内免疫グロブリン分子を産生、スクリーニングおよび選択するためのキット、ならびにこれらの方法を使用して産生する細胞内免疫グロブリン分子およびフラグメントである。
アフィニティバイオサイエンス株式会社（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＰＴＹ ＬＴＤ）に譲渡され、発明者ビーズレイ（Ｂｅａｓｌｅｙ）、ニーブン（Ｎｉｖｅｎ）およびキーフェル（Ｋｉｅｆｅｌ）が挙げられている国際公開第２０１３０２３２５１号パンフレットは、ポリペプチド、例えば、抗体分子、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそのライブラリーについて記載しており、ここで発現したポリペプチドは、高い安定性および溶解性を示す。特に、還元性環境または細胞内環境において可溶性発現およびフォールディングを示す対形成したＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチドについて記載されており、ここでは、ヒトｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングし、ヒト生殖系列配列と同一のフレームワーク領域、ならびにｓｃＦｖスカフォールド上へのＣＤＲ３グラフティングの著しい熱安定性および耐性を有する可溶性ｓｃＦｖ遺伝子の単離をもたらした。
エスバテックＡＧ（Ｅｓｂａｔｅｃｈ ＡＧ）およびチューリッヒ大学に譲渡され、発明者エバート（Ｅｗｅｒｔ）、フーバー（Ｈｕｂｅｒ）、オネゲル（Ｈｏｎｎｅｇｅｒ）およびプリュックテュン（Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ）が挙げられている欧州特許出願公開第２３１４６２２号明細書および国際公開第０３００８４５１号パンフレットおよび国際公開第０３０９７６９７号パンフレットは、ヒト可変ドメインの改変について記載し、非常に安定的および可溶性単鎖Ｆｖ抗体フラグメントを生じさせるためのフレームワークとして有用な組成物を提供している。これらのフレームワークは細胞内動作のために選択されてきており、したがって、安定性および溶解性が、例えば、細胞の還元性環境における抗体フラグメントの動作のための制限因子である用途のための、ｓｃＦｖ抗体フラグメントまたはｓｃＦｖ抗体ライブラリーを生じさせるために理想的には適している。このようなフレームワークはまた、増進した溶解性および安定性を示す高度に保存された残基およびコンセンサス配列を同定するために使用することができる。
「細胞内抗体標的化送達、および治療剤の再充填のためのシステム、装置および方法（Ｓｙｓｔｅｍｓ ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｒｅｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）」という名称の国際公開第０２０６７８４９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００４０４７８９１号明細書は、分子の細胞内抗体標的化送達のためのシステム、装置および方法について記載いている。より特定すると、いくつかの実施形態は、局在化および適時の様式で対象の組織領域への治療剤の標的化された送達を可能とする再充填可能な薬物送達システムに関する。
アムジェン株式会社（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．）に譲渡され、発明者チョウ（Ｚｈｏｕ）、シェン（Ｓｈｅｎ）およびマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）が挙げられている国際公開第２００５０６３８１７号パンフレットおよび米国特許第７，８８４，０５４号明細書は、細胞内抗体を含めた機能的抗体を同定するための方法について記載いている。特に、ホモ二量体細胞内抗体について記載されており、ホモ二量体の各ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域、ｓｃＦｖ、および細胞内局在化配列を含む。細胞内局在化配列は、細胞内抗体がＥＲまたはゴルジに局在化することをもたらし得る。任意選択で、各ポリペプチド鎖は、１つ以下のｓｃＦｖを含む。
パーミオンバイオロジクス株式会社（Ｐｅｒｍｅｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）に譲渡されたボーガン（Ｖｏｇａｎ）らによる国際公開第２０１３１３８７９５号パンフレットは、細胞内の抗体および抗体様部分の送達のための細胞透過性組成物、ならびにこれら（本明細書において、「ＡＡＭ部分（複数可）」と称される）を細胞中に送達する方法について記載いている。理論に束縛されるものではないが、本開示は、少なくとも部分的に、ＡＡＭ部分と、表面の正の電荷を有する細胞透過性ポリペプチド（本明細書において、「表面＋透過性ポリペプチド」と称される）とを複合体化することによって、ＡＡＭ部分を細胞中に送達することができるという発見に基づいている。イントラフィリン技術のいくつかの適用の例がまた提供される。
パスツール研究所（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に譲渡された国際公開第２０１０００４４３２号パンフレットは、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマおよびアルパカ）からの免疫グロブリンについて記載いており、これらの約５０％は軽鎖を欠いている抗体である。これらの重鎖抗体は、ＶＨＨ（複数可）、ＶＨＨドメイン（複数可）またはＶＨＨ抗体（複数可）と称される１個のみの単一の可変ドメインによって、抗原と相互作用する。軽鎖が存在しないにも関わらず、これらのホモ二量体抗体は、これらの超可変領域を拡大することによって広範な抗原結合性レパートリーを示し、ＶＨＨドメインが細胞内の標的に対するとき、トランスボディおよび／または細胞内抗体としてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで作用することができる。
国際公開第２０１４１０６６３９号パンフレットは、細胞表現型を改変することができる細胞内抗体を同定し、かつ細胞内抗体の直接もしくは間接の細胞の標的を同定することによって、細胞表現型に関与している細胞の標的を同定する方法について記載している。特に、細胞内抗体３Ｈ２－１、３Ｈ２－ＶＨおよび５Ｈ４は、アレルギー性の刺激によってトリガーされる肥満細胞における脱顆粒反応を阻害することができ、さらに、細胞内抗体３Ｈ２－１および５Ｈ４は、それぞれ、ＡＢＣＦ１ファミリーおよびＣ１２０ＲＦ４ファミリーのタンパク質を直接的または間接的に標的とした。これらのＡＢＣＦ１およびＣ１２０ＲＦ４阻害剤は、治療において、特に、アレルギー状態および／または炎症状態を処置するために有用であると言われる。
ウロジェネシス社（Ｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｃ）に譲渡された国際公開第０１４０２７６号パンフレットは一般に、細胞内の抗体（細胞内抗体）を使用したＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）タンパク質の阻害の可能性について記載している。
マンチェスター大学に譲渡され、発明者サイモン（Ｓｉｍｏｎ）およびベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）が挙げられている国際公開第０２０８６５０５号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２００４１１５７４０号明細書は、標的分子の細胞内分析のための方法について記載しており、細胞内抗体が好ましいと言われている。一実施形態では、ＣＦＰにカップリングしている抗ＭＵＣ１細胞内抗体を発現することができるベクター（ｐＳｃＦｖ－ＥＣＦＰと命名）について記載されている。
ジーンセラピーシステムズ社（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）に譲渡された国際公開第０３０９５６４１号パンフレットおよび国際公開第０１４３７７８号パンフレットは、細胞内タンパク質送達のための組成物および方法について記載しており、細胞内抗体を全体的に記載している。
セレクティブジェネティックス社（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ）に譲渡された国際公開第０３０８６２７６号パンフレットは、細胞内感染の処置のためのプラットフォーム技術について記載している。その中で記載されている組成物および方法は、感染と関連する細胞表面受容体／部分を結合しそれによって内部移行する連結したリガンドを介して感染可能な細胞を標的とする非標的特異的ベクターを含む。ベクターは、標的細胞への内部移行によって発現する外因性核酸配列を含む。ベクター関連リガンドおよび核酸分子は、異なる感染病原体を標的とするために変更し得る。さらに、本発明は、ベクターの内部移行を方向付けることができ、かつウイルス侵入をブロックすることができるエピトープおよびリガンドを同定する方法を提供する。
エラスムス大学に譲渡された国際公開第０３０６２４１５号パンフレットは、異種抗原ガラクトースアルファ１，３ガラクトースの産生の触媒作用を撹乱する細胞内の抗体をコードするポリヌクレオチド構築物、および／またはレトロウイルスタンパク質、例えば、ＰＥＲＶ粒子タンパク質に特異的に結合する細胞内の抗体をコードするポリヌクレオチド構築物を含む、トランスジェニック生物について記載いている。トランスジェニック生物の細胞、組織および器官は、異種移植において使用し得る。
「タンパク質高次構造を検出するための手段およびその用途（Ｍｅａｎｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）」という名称の国際公開第２００４０９９７７５号パンフレットは、高次構造のタンパク質状態を特に検出するための、高次構造特異的抗体としてｓｃＦｖフラグメントの使用について記載いており、生細胞において、細胞内発現によって、内在性タンパク質の挙動を追跡するためのセンサーとしての用途を有すると言われる。
イムクローンシステムズ社（Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）に譲渡された国際公開第２００８０７０３６３号パンフレットは、細胞内タンパク質に、または細胞内タンパク質、例えば、非受容体チロシンキナーゼのＴｅｃファミリーのメンバーであるＥｔｋ、内皮および上皮チロシンキナーゼの細胞内ドメインに結合する、単一ドメイン細胞内抗体について記載している。また提供するのは、細胞内抗体または細胞内抗体を発現している核酸を投与することによって、細胞内酵素を阻害し、患者において腫瘍を処置する方法である。
コーネルリサーチファンデーション社（Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｉｎｃ）に譲渡された国際公開第２００９０１８４３８号パンフレットは、標的分子に結合するタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む構築物を提供することによって、標的分子に結合し、かつ細胞内機能性を有するタンパク質を同定する方法について記載いており、ＤＮＡ分子は、ストール配列にカップリングしている。宿主細胞は構築物と共に形質転換され、次いで、宿主細胞内で、その翻訳がストールされているタンパク質の複合体、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびリボソームを形成するのに有効な条件下で培養される。複合体中のタンパク質は、適切にフォールドされた活性形態であり、複合体は細胞から回収される。この方法は、宿主細胞の代わりにリボソームを含有する細胞非含有の抽出物調製で行うことができる。本発明はまた、標的分子に結合するタンパク質をコードするＤＮＡ分子、およびＤＮＡ分子にカップリングしているＳｅｃＭストール配列を含む構築物に関する。ＤＮＡ分子およびＳｅｃＭストール配列は、十分な距離を伴ってこれらの間でカップリングし、細胞内の適切にフォールドされた活性形態でのこれらのコードされたタンパク質の発現を可能とする。細胞内抗体の使用について一般に記載されている。
モーガンバイオテックリサーチインスティテュート（Ｍｏｇａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に譲渡された国際公開第２０１４０３０７８０号パンフレットは、遺伝子構築物（標的タンパク質および抗生物質耐性タンパク質は、Ｔａｔシグナル配列に連結している）を調製し、次いで、これを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現することによって、より高い溶解性および優れた熱安定性を有する標的タンパク質、特に、ヒト生殖細胞に由来する免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨもしくはＶＬ）をスクリーニングするための、Ｔａｔ関連タンパク質工学（ＴＡＰＥ）という方法について記載している。また開示されているのは、ＴＡＰＥ方法によってスクリーニングされる、溶解性および優れた熱安定性を有する、ヒトまたは工学処理されたＶＨおよびＶＬドメイン抗体、ならびにヒトまたは工学処理されたＶＨおよびＶＬドメイン抗体スカフォールドである。また提供されるのは、ＴＡＰＥ方法によってスクリーニングされるヒトまたは工学処理されたＶＨもしくはＶＬドメイン抗体スカフォールドにおけるランダムＣＤＲ配列を含むライブラリー、その調製方法、ライブラリーを使用することによってスクリーニングされる標的タンパク質への結合能力を有するＶＨもしくはＶＬドメイン抗体、ならびにドメイン抗体を含む医薬組成物である。
欧州特許出願公開第２４２２８１１号明細書は、細胞内エピトープに結合する抗体について記載している。このような細胞内抗体は、抗原を特異的に結合することができ、好ましくは、その分泌のための動作可能配列コーディングを含有せず、したがって細胞内に留まっている抗体の少なくとも一部を含む。一実施形態では、細胞内抗体は、ｓｃＦｖを含む。ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能とするＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。また記載されているのは、細胞内抗体がＥｐｈ受容体の細胞質ドメインに結合し、そのシグナル伝達（例えば、自己リン酸化）を防止する特定の実施形態である。別の特定の実施形態では、細胞内抗体は、Ｂ型エフリンの細胞質ドメイン（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２またはＥｐｈｒｉｎＢ３）に結合する。
国際公開第２０１１００３８９６号パンフレットおよび欧州特許出願公開第２２７５４４２号明細書は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸分子を使用して作製された、細胞内機能的ＰＣＮＡ－Ｃｈｒｏｍｏｂｏｄｉｅｓについて記載いている。１つまたは２つのフレームワーク領域において１個もしくは複数のアミノ酸の保存的置換を含むこのようなポリペプチドの例は、ポリペプチドのフレームワーク領域を含めて、
ＭＡＮＶＱＬＮＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＤＩＳＰＳＧＡＶＫＡＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＲＬＹＬＱＭＮＳＬＴＰＥＤＴＧＥＹＦＣＴＫＶＱＳＰＲＴＲＩＰＡＰＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳ （配列番号２６３）および
ＭＡＮＶＱＬＮＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＳＰＳＧＡＶＫＡＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＲＬＹＬＱＭＮＳＬＴＰＥＤＴＧＥＹＦＣＴＫＶＱＳＰＲＴＲＩＰＡＰＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳ （配列番号２６４）を含む。実施例において、フレームワーク領域、およびＰＣＮＡの結合に関与しているＣＤＲ領域は決定されてきた。
欧州特許出願公開第２７０３４８５号明細書は、形質細胞または形質芽細胞を選択するための、ならびに標的抗原特異的抗体、および新規なモノクローナル抗体を産生するための方法について記載いている。一実施形態では、細胞内免疫グロブリンを発現している細胞を同定した。
抗体をコーティングした薬剤
一部の実施形態では、本明細書に記載されている抗体または抗体フラグメントを使用して、抗体をコーティングした薬剤を含む組成物を調製し得る。本明細書において使用する場合、用語「抗体をコーティングした薬剤」は、１種もしくは複数の表面関連抗体または抗体フラグメントを含む、任意の粒子、ナノ粒子、分子、タンパク質、融合タンパク質、脂質、リポソーム、細胞膜、細胞、または他の構造を指す。抗体をコーティングした薬剤は、コーティングのために使用される抗体または抗体フラグメントの特異性に基づいて、１種もしくは複数のグリカン、タンパク質、細胞、組織、および／または器官を標的とし得る。
抗体をコーティングした薬剤は、会合された、封入された、または包埋されたカーゴを含み得る。カーゴは、検出可能な標識であり得る。いくつかのカーゴは、１種もしくは複数の治療剤を含み得る。このような治療剤には、これらに限定されないが、薬物、化学療法剤、および細胞毒性剤が含まれてもよい。細胞毒性剤は、細胞を死滅またはその他の方法で無能にするために使用し得る。細胞毒性剤には、これらに限定されないが、細胞骨格阻害剤［例えば、チューブリン重合阻害剤、例えば、メイタンシンまたはアウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ［ＭＭＡＥ］およびモノメチルアウリスタチンＦ［ＭＭＡＦ］）］ならびにＤＮＡ傷害剤（例えば、ＤＮＡ重合阻害剤、例えば、カリケアマイシンおよびデュオカルマイシン）が含まれてもよい。
一部の実施形態では、抗体をコーティングした薬剤は、本明細書に記載されている１種もしくは複数の抗体または抗体フラグメントでコーティングされているナノ粒子を含み得る。このような抗体をコーティングした薬剤は、これらに限定されないが、細胞関連グリカンを含めた１種もしくは複数のグリカンを標的とし得る。いくつかのこのような抗体をコーティングした薬剤は、１種もしくは複数の細胞毒性剤を含む。
タンパク質およびバリアント
本発明のグリカン相互作用抗体は、完全なポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドのフラグメントとして存在してもよく、これは１種もしくは複数の核酸、複数種の核酸、核酸のフラグメント、または上記のいずれかのバリアントによって独立にコードし得る。本明細書において使用する場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって殆どの場合、一緒に連結されるアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書において使用する場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。場合によって、コードされるポリペプチドは、約５０個のアミノ酸より小さく、ポリペプチドはそのときペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは少なくとも約２個、３個、４個、または少なくとも５個のアミノ酸残基の長さである。このように、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オーソログ、パラログ、フラグメント、ならびに上記の他の同等物、バリアント、および類似体を含む。ポリペプチドは単一分子でよいか、または複数分子錯体、例えば、二量体、三量体もしくは四量体でよい。これらはまた、単鎖または多鎖ポリペプチドを含んでもよく、会合または連結し得る。ポリペプチドという用語はまた、１個もしくは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに適用し得る。
用語「ポリペプチドバリアント」は、これらのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置において置換、欠失、および／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、天然または参照配列と少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、これらは天然または参照配列と少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％同一（相同）である。
一部の実施形態では、「バリアント模倣物」が提供される。本明細書において使用する場合、用語「バリアント模倣物」は、活性化配列を模倣する１個もしくは複数のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタメートは、ホスホロ－トレオニンおよび／またはホスホロ－セリンについての模倣物としての役割を果たし得る。代わりに、バリアント模倣物は、非活性化、または模倣物を含有する不活化された産物をもたらしてもよく、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの代わりの不活性化置換として作用し得るか、あるいはアラニンは、セリンの代わりの不活性化置換として作用し得る。本発明のグリカン相互作用抗体のアミノ酸配列は、天然アミノ酸を含み得、したがって、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、またはそのフラグメントであると考えてもよい。代わりに、グリカン相互作用抗体は、天然および非天然アミノ酸の両方を含み得る。
用語「アミノ酸配列バリアント」は、天然または出発配列と比較してこれらのアミノ酸配列においていくつかの差異を伴う分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、アミノ酸配列内の特定の位置において置換、欠失、および／または挿入を有し得る。「天然」または「出発」配列は、野生型配列と混同すべきではない。本明細書において使用する場合、天然または出発配列は、それに対して比較を行い得る最初の分子を指す相対用語である。「天然」または「出発」配列または分子は、野生型（天然に見出されるその配列）を表し得るが、野生型配列である必要はない。
通常、バリアントは、天然配列と比較して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。「配列同一性」は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に適用するように、配列を整列化し、ギャップおよびフラグメントを考慮に入れて、必要に応じて、最大パーセントの配列同一性を達成した後の、第２の配列における残基と同一である、候補配列における残基の百分率として定義される。２つのポリマー配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列化することによって行うことができる（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのための第１および第２のポリマー配列の１つもしくは両方に導入することができ、同一ではない配列は、比較目的のために無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的のために整列化された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応する位置における残基を比較する。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じ残基によって占められているとき、分子は、その位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、これらの配列によって共有されている同一の位置の数の関数である。配列の比較、および２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、方法、例えば、分子計算生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年；バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編，アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年；分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、フォンハンジェ，Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；配列データのコンピュータ分析、パートＩ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ）、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー、１９９４年；および配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍストックトンプレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年（これらのそれぞれは参照により本明細書中に組み込まれている）に記載されているものを使用して決定することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込んだ、マイヤース（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、４巻：１１～１７頁）のアルゴリズムを使用して決定することができる。２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、代わりに、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。配列の間の同一性パーセントを決定するために一般に用いられる方法には、これらに限定されないが、参照により本明細書中に組み込まれているカリージョ，Ｈ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）およびリップマン，Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）、ＳＩＡＭ応用数学ジャーナル（ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、４８巻：１０７３頁（１９８８年）において開示されているものが含まれる。同一性を決定するための技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２つの配列の間の相同性を決定する例示的なコンピュータソフトウェアには、これらに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、デベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１２巻（１号）、３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ、アルツシュール，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）、２１５巻、４０３頁（１９９０年））が含まれる。
「相同体」は、アミノ酸配列に提供されるように、第２の種の第２の配列と実質的な同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、１個もしくは複数のアミノ酸の変更、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失が異なるが、親ポリペプチドの特性をまだ維持する、ポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
本発明は、バリアントおよび誘導体を含めた、アミノ酸をベースとするいくつかのタイプのグリカン相互作用抗体を意図する。これらは、置換による、挿入による、欠失によるおよび共有結合的なバリアントおよび誘導体を含む。したがって、本発明の範囲内に含まれるのは、置換、挿入および／または付加、欠失および共有結合的改変を含有するグリカン相互作用抗体分子である。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１個もしくは複数のリシンは、本発明のペプチド配列に加えることができる（例えば、Ｎ末端またはＣ端末側終端において）。配列タグは、ペプチド精製または局在化のために使用することができる。リシンは、ペプチド溶解性を増加させるか、またはビオチン化を可能とするために使用することができる。代わりに、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端の領域に位置しているアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、切断型配列を実現し得る。特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は代わりに、配列、例えば、可溶性であるか、もしくは固体支持体に連結している、より大きな配列の部分としての配列の発現の使用によって欠失し得る。
「置換によるバリアント」は、タンパク質に言及するとき、天然または出発配列における少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、かつ異なるアミノ酸がその場所において同じ位置にて挿入されているものである。分子における１個のみのアミノ酸が置換されている場合、置換は単一であり得るか、または２個もしくはそれよりも多いアミノ酸が同じ分子において置換されている場合、置換は複数であり得る。
本明細書において使用する場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、同様のサイズ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸を有する配列において通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例は、別の非極性残基を非極性（疎水性）残基、例えば、イソロイシン、バリンおよびロイシンで置換することを含む。同様に、保存的置換の例は、別のものを１個の極性（親水性）残基で置換すること、例えば、アルギニンおよびリシンの間、グルタミンおよびアスパラギンの間、およびグリシンおよびセリンの間を含む。さらに、別の塩基性残基を、塩基性残基、例えば、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンで置換すること、または別の酸性残基を、１個の酸性残基、例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸で置換することは、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例は、極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンを、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンで置換すること、および／または非極性残基を、極性残基で置換することを含む。
「挿入バリアント」は、タンパク質に言及するとき、天然または出発配列における特定の位置におけるアミノ酸に直接隣接して挿入した１個もしくは複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接した」は、アミノ酸のアルファ－カルボキシまたはアルファ－アミノ官能基に接続していることを意味する。
「欠失バリアント」は、タンパク質に言及するとき、天然または出発アミノ酸配列における１個もしくは複数のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域において欠失した１個もしくは複数のアミノ酸を有する。
本明細書において使用する場合、用語「誘導体」は用語「バリアント」と同意語として使用され、参照分子または出発分子に対して何らかの方法で改変または変更されている分子を指す。一部の実施形態では、誘導体は、有機タンパク質性または非タンパク質性誘導体化剤、および翻訳後修飾で修飾されている天然タンパク質または出発タンパク質を含む。共有結合的修飾は、タンパク質の標的とされたアミノ酸残基と、選択した側鎖もしくは末端残基と反応することができる有機誘導体化剤とを反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾の機序を利用することによって、従来導入されている。結果として生じた共有結合性誘導体は、生物活性のため、免疫アッセイのため、または組換え糖タンパク質のイムノアフィニティー精製のための抗タンパク質抗体の調製のために重要である残基を同定することに向けられているプログラムにおいて有用である。このような修飾は当技術分野で通常の技量の範囲内であり、過度の実験をせずに行われる。
特定の翻訳後修飾は、発現ポリペプチド上の組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へと翻訳後に脱アミドされることが多い。代わりに、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミドされる。これらの残基のいずれかの形態は、本発明によって使用されるタンパク質中に存在し得る。
他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアルファ－アミノ基のメチル化を含む（Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、タンパク質：構造および分子の特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、Ｗ．Ｈ．フリーマンアンドカンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．）、サンフランシスコ、７９～８６頁（１９８３年））。
共有結合性誘導体は特に、本発明のタンパク質が非タンパク質性ポリマーに共有結合している融合分子を含む。非タンパク質性ポリマーは通常、親水性合成ポリマー、すなわち、天然ではその他に見出されないポリマーである。しかし、天然で存在し、かつ組換えまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法によって生成されるポリマーは、天然から単離されるポリマーと同様に有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンは、本発明の範囲内に入る。特に有用なのは、ポリビニルアルキレンエーテル、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールである。タンパク質は、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書または同第４，１７９，３３７号明細書に記載された様式で、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに連結し得る。
「フィーチャ」は、タンパク質に言及するとき、分子の別個のアミノ酸配列をベースとする構成要素として定義される。本発明のタンパク質のフィーチャは、表面顕在化、局所高次構造の形状、フォールド、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端または任意のこれらの組合せを含む。
本明細書において使用する場合、タンパク質に言及するとき、用語「表面顕在化」は、最も外側の表面上に現れる、タンパク質のポリペプチドをベースとする構成要素を指す。
本明細書において使用する場合、タンパク質に言及するとき、用語「局所高次構造の形状」は、タンパク質の限定できる空間内に位置している、タンパク質のポリペプチドをベースとする構造的顕在化を意味する。
本明細書において使用する場合、タンパク質に言及するとき、用語「フォールド」は、エネルギー最小化によるアミノ酸配列の結果として生じた高次構造を意味する。フォールドは、フォールディングプロセスの二次または三次レベルにおいて起こり得る。二次レベルフォールドの例は、ベータシートおよびアルファヘリックスを含む。三次フォールドの例は、エネルギー力の凝集または分離によって形成されたドメインおよび領域を含む。このように形成された領域は、疎水性および親水性ポケットなどを含む。
本明細書において使用する場合、用語「ターン」は、タンパク質高次構造に関連するように、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変更させる曲がりを意味し、１個、２個、３個もしくはそれ超のアミノ酸残基が関与し得る。
本明細書において使用する場合、タンパク質に言及するとき、用語「ループ」は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させ、かつ４個もしくはそれ超のアミノ酸残基を含む、ペプチドまたはポリペプチドの構造的フィーチャを指す。オリバ（Ｏｌｉｖａ）らは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを同定してきた（分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）、２６６巻（４号）：８１４～８３０頁；１９９７年）。
本明細書において使用する場合、タンパク質に言及するとき、用語「ハーフループ」は、これが由来するループとしてアミノ酸残基の数の少なくとも半分を有する同定されたループの部分を指す。ループは、必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有し得ないことが理解される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと同定される場合、奇数のループのハーフループは、ループの整数部分または一番近い整数部分を含む（ループのアミノ酸の数／２＋／－０．５個のアミノ酸）。例えば、７個のアミノ酸ループとして同定されるループは、３個のアミノ酸または４個のアミノ酸のハーフループを生じさせることができる（７／２＝３．５＋／－０．５は３または４である）。
本明細書において使用する場合、タンパク質に言及するとき、用語「ドメイン」は、タンパク質間相互作用のための部位としての役割を果たす、１つもしくは複数の同定可能な構造的または機能的な特徴または特性（例えば、結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
本明細書において使用する場合、タンパク質に言及するとき、用語「ハーフドメイン」は、これが由来するドメインとしてアミノ酸残基の数の少なくとも半分を有する同定されたドメインの部分を指す。ドメインは、必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有し得ないことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと同定される場合、奇数のドメインのハーフドメインは、ドメインの整数部分または一番近い整数部分を含む（ドメインのアミノ酸の数／２＋／－０．５個のアミノ酸）。例えば、７個のアミノ酸ドメインとして同定されるドメインは、３個のアミノ酸または４個のアミノ酸のハーフドメインを生じさせることができる（７／２＝３．５＋／－０．５は３または４である）。サブドメインは、ドメインまたはハーフドメイン内で同定し得ることがまた理解され、これらのサブドメインは、これらが由来するドメインまたはハーフドメインにおいて同定される構造特性または機能特性の全てに満たないものを有する。本明細書におけるドメインタイプのいずれかのアミノ酸は、ポリペプチドの骨格に沿って近接している必要はないことがまた理解される（すなわち、隣接していないアミノ酸は構造的にフォールドして、ドメイン、ハーフドメインまたはサブドメインを産生し得る）。
本明細書において使用する場合、タンパク質に言及するとき、用語「部位」は、アミノ酸をベースとする実施形態に関するように、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同意語として使用される。部位は、本発明のポリペプチドをベースとする分子内で改変するか、操作するか、変更するか、誘導体化するか、または変化し得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
本明細書において使用する場合、用語「末端」は、タンパク質に言及するとき、ペプチドまたはポリペプチドの先端を指す。このような先端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位のみに限定されず、末端領域におけるさらなるアミノ酸を含み得る。本発明のポリペプチドをベースとする分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で終結）およびＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で終結）の両方を有すると特性決定し得る。本発明のタンパク質は、場合によって、ジスルフィド結合または非共有結合力によって一緒になった複数のポリペプチド鎖（マルチマー、オリゴマー）で構成されている。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有する。代わりに、ポリペプチドの末端は、場合によっては、非ポリペプチドをベースとする部分、例えば、有機コンジュゲートで始まるかまたは終わるように改変し得る。
フィーチャのいずれかが本発明の分子の構成要素として同定または定義されると、これらのフィーチャのいくつかの操作および／または改変のいずれかは、動かすか、交換するか、反転させるか、欠失させるか、ランダム化するか、または重複させることによって行い得る。さらに、フィーチャの操作は、本発明の分子への改変として同じ成果をもたらし得ることが理解される。例えば、ドメインを欠失させることが関与した操作は、全長分子に満たないものをコードする核酸の改変がそうであるように、分子の長さの変更をもたらす。
改変および操作は、当技術分野において公知の方法、例えば、部位特異的突然変異誘発によって達成することができる。次いで、このように得られた改変された分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでのアッセイ、例えば、本明細書に記載されているもの、または当技術分野において公知の任意の他の適切なスクリーニングアッセイを使用して、活性について試験し得る。
同位体のバリエーション
本発明のグリカン相互作用抗体は、同位体である１個もしくは複数の原子を含有し得る。本明細書において使用する場合、用語「同位体」は、１個もしくは複数のさらなる中性子を有する化学元素を指す。一実施形態では、本発明の化合物は、重水素化し得る。本明細書において使用する場合、用語「重水素化」は、１個もしくは複数の水素原子が重水素同位体で置き換えられている物質を指す。重水素同位体は、水素の同位体である。水素の原子核は、１個のプロトンを含有し、一方、重水素核は、プロトンおよび中性子の両方を含有する。グリカン相互作用抗体は、化合物の物理的特性、例えば、安定性を変化させるため、または化合物が診断および実験用途において使用されるのを可能とするために、重水素化し得る。
コンジュゲートおよび組合せ
本発明のグリカン相互作用抗体は、１個もしくは複数の相同または異種分子と共に複合体化するか、コンジュゲートするか、または合わせ得ることが本発明によって意図される。本明細書において使用する場合、「相同分子」は、出発分子に対して構造または機能の少なくとも１つにおいて同様である分子を意味し、一方、「異種分子」は、出発分子に対して構造または機能の少なくとも１つにおいて異なるものである。したがって、構造的相同体は、実質的に構造的に同様である分子である。これらは同一でよい。機能的相同体は、実質的に機能的に同様である分子である。これらは同一でよい。
本発明のグリカン相互作用抗体は、コンジュゲートを含み得る。本発明のこのようなコンジュゲートは、天然物質またはリガンド、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンもしくはヒアルロン酸）；または脂質を含み得る。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であり得る。ポリアミノ酸の例は、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンである。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣物ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファヘリックスペプチドを含む。
コンジュゲートはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤または基、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、特定の細胞型、例えば、腎細胞に結合する抗体を含むことができる。標的化基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化されたポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、ホレート、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物またはアプタマーでよい。
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドへの特異親和性を有する分子、または抗体、例えば、特定の細胞型、例えば、がん細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞に結合する抗体でよい。標的化基はまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含み得る。これらはまた、非ペプチド性種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーを含むことができる。
標的化基は、特異的受容体を標的とすることができる任意のリガンドでよい。例には、これらに限定されないが、ホレート、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドが含まれる。特定の実施形態では、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、無改変であるか、または本明細書において開示されている改変の任意の組合せを有することができる。
また他の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、細胞透過性ポリペプチドに共有結合的にコンジュゲートしている。細胞透過性ペプチドはまた、シグナル配列を含み得る。本発明のコンジュゲートは、増加した安定性；増加した細胞トランスフェクション；および／または変化した体内分布（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とする）を有するように設計することができる。
コンジュゲート部分は、クリアランスのために標的を標識するかまたはフラグ付けすることを可能とするようにグリカン相互作用抗体に加えてもよい。このようなタグ付け／フラグ付け分子には、これらに限定されないが、ユビキチン、蛍光分子、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、ｃ－ｍｙｃ［配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２６５）を有するヒト癌原遺伝子ｍｙｃの１０個のアミノ酸セグメント］、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、フラグ［配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２６６）の短いペプチド］、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｖ５（サルウイルスの５つのエピトープのパラミクソウイルス）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびジゴキシゲニンが含まれる。
一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、疾患または状態の処置において、互いにまたは他の分子と合わせ得る。
核酸
本発明は、核酸分子を包含する。一部の実施形態では、核酸は、本発明の抗体（これらに限定されないが、抗体、抗体フラグメント、細胞内抗体およびキメラ受容体抗原を含めた）をコードする。このような核酸分子には、これらに限定されないが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ分子、ベクター、プラスミドおよび他の構築物が含まれる。本明細書において使用する場合、用語「構築物」は、これらに限定されないが、プラスミド、コスミド、自己複製ポリヌクレオチド分子、または直鎖状もしくは円状の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチド分子を含めた任意の組換え核酸分子を指す。本発明はまた、グリカン相互作用抗体をコードする核酸分子を発現するようにプログラムされているかまたは生じた細胞を包含する。このような細胞は、トランスフェクション、電気穿孔、ウイルス送達などの使用によって生じさせ得る。本発明の構築物と共に工学処理されるウイルスには、これらに限定されないが、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびファージが含まれてもよい。場合によって、本発明の核酸は、コドンが最適化された核酸を含む。コドンが最適化された核酸を生じさせる方法は当技術分野において公知であり、これらに限定されないが、そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，７８６，４６４号明細書および同第６，１１４，１４８号明細書に記載されているものが含まれてもよい。一部の実施形態では、核酸配列は、タンパク質発現が改善されるか、または潜伏スプライス部位が除去されるように最適化されたコドンである。
ＩＩ、方法および使用
本開示の方法には、これらに限定されないが、治療目的、診断目的、定量目的、バイオプロセシング目的、実験目的、および／または調査目的のための１種もしくは複数のグリカン相互作用抗体を利用する方法が含まれる。このようなグリカン相互作用抗体は、抗ＳＴｎ抗体を含み得る。
治療剤
がん関連用途
異常なグリコシル化は、がん細胞形質転換の顕著な特徴である。特異的腫瘍ターゲッティングに適した１クラスの細胞表面分子として特定の腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）を同定する複数の異常なグリコシル化形態が、ヒトがんにおいて記載されてきた（チーバー，Ｍ．Ａ．（Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．Ａ．）ら著、臨床がんリサーチ（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、２００９年９月１日；１５巻（１７号）：５３２３～３７頁）。ＴＡＣＡ抗原発現は、これらに限定されないが、乳房、結腸、肺、膀胱、子宮頸部、卵巣、胃、前立腺、および肝臓を含めた上皮がんにおいて見出されてきた。ＴＡＣＡ抗原発現は、これらに限定されないが、卵黄嚢腫瘍および精上皮腫を含めた胎児性がんにおいて見出されてきた。さらに、ＴＡＣＡ抗原発現は、様々な組織の多くの黒色腫、癌腫、および白血病において見出されてきた（ヘインバーグ－モリナロ（Ｈｅｉｍｂｕｒｇ－Ｍｏｌｉｎａｒｏ）ら著、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ．）、２０１１年１１月８日：２９巻（４８号）：８８０２～８８２６頁）。１つもしくは複数のＴＡＣＡを標的とする本発明の抗体は、本明細書において、「抗ＴＡＣＡ抗体」と称される。
ＭＵＣ１は、通常広範にグリコシル化されているが、腫瘍細胞においてグリコシル化が不十分である重要な細胞表面糖タンパク質である。ＭＵＣ１の僅かなグリコシル化は、免疫原性抗原の曝露をもたらす。これらは、ＭＵＣ１コアペプチド配列に沿って、またはコア炭水化物残基に沿ってであり得る。これらのＴＡＣＡには、これらに限定されないが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）、シアリル（α２，６）Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）およびガラクトース（β１－３）Ｎ－アセチルガラクトサミン（トムゼン－フリーデンライヒ抗原またはＴＦとしてもまた公知である）が含まれる。全ての癌腫の約８０％は、ＭＵＣ１のコア炭水化物においてＴｎを発現しており、ＳＴｎはヒト癌腫細胞上に強く発現しており、かつがんの進行および転移と連結していると推定されてきた。殆ど例外なく、ＴｎおよびＳＴｎは、正常な健常組織において発現していない。シアル酸は、ＳＴｎ上で顕著なエピトープを形成する。本発明は、異常なＮｅｕ５Ｇｃ－ＳＴｎ（ＧｃＳＴｎ）グリカン発現が様々な癌腫に高度に特異的であるようであるという事実を利用する。
ＭＵＣ１の場合、ＳＴｎへのＮｅｕ５Ｇｃ組込みは、腫瘍組織を処置する抗体をベースとする治療のための魅力的な標的である部位である、腫瘍特異的標的を生じさせる。本発明の一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃを含む、ＭＵＣ１を発現しているがん細胞を標的とする。現在まで、Ｎｅｕ５Ｇｃは、これらに限定されないが、結腸がん、網膜芽細胞腫組織、黒色腫、乳がんおよび卵黄嚢腫瘍組織を含めたいくつかのヒトがん組織からのグリココンジュゲートにおいて検出されてきた。本発明の一部の実施形態では、Ｎｅｕ５Ｇｃを含むがん細胞の存在によって特徴付けられる、これらの形態のがん、およびここで特に列挙されていない他の形態のがんのグリカン相互作用抗体処置のための方法が意図される。
がんと相関して発現されている、グリカンを含むさらなる抗原が同定されてきた（ヘインバーグ－モリナロ，Ｊ．（Ｈｅｉｍｂｕｒｇ－Ｍｏｌｉｎａｒｏ，Ｊ．）ら著、がんワクチンおよび炭水化物エピトープ。（Ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．）、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ．）、２０１１年１１月８日；２９巻（４８号）：８８０２～２６頁）。これらの腫瘍関連炭水化物抗原には、これらに限定されないが、血液型ルイス関連抗原［これらに限定されないが、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ルイスＸ（ＬｅＸ）、シアリルルイスＸ（ＳＬｅＸ）およびシアリルルイスＡ（ＳＬｅＡ）を含めた］、スフィンゴ糖脂質関連抗原［これらに限定されないが、グロボＨ、ステージ特異的胎児抗原－３（ＳＳＥＡ－３）、およびシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質を含めた］、ガングリオシド関連抗原［これらに限定されないが、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、フコシルＧＭ１およびＮｅｕ５ＧｃＧＭ３を含めた］、ならびにポリシアル酸関連抗原が含まれる。
一部の実施形態では、本発明の治療剤は、ルイス血液型抗原に対して方向付け得る。ルイス血液型抗原は、α１－３連結またはα１－４連結によってＧｌｃＮＡｃに連結しているフコース残基を含む。これらは、糖脂質および糖タンパク質の両方上で見出し得る。ルイス血液型抗原は、これらの抗原の分泌者である個体の体液において見出し得る。赤血球上でのこれらの出現は、赤血球による血清からのルイス抗原の吸収によるものである。
一部の実施形態では、本発明の治療剤は、ＬｅＹに対して方向付け得る。ＬｅＹ（ＣＤ１７４としてもまた公知である）は、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡＣで構成されており、α１，２－およびα１，３－連結フコース残基を含み、Ｆｕｃα（１，２）Ｇａｌβ（１，４）Ｆｕｃα（１，３）ＧｌｃＮＡｃエピトープを生じさせる。これは、α１，３フコースを親鎖のＧｌｃＮＡｃ残基に付着させるα１，３フコシルトランスフェラーゼによってＨ抗原から合成される。ＬｅＹは、これらに限定されないが、卵巣、乳房、前立腺、結腸、肺および上皮を含めた種々のがんにおいて発現し得る。正常組織におけるその低発現レベルおよび多くのがんにおける上昇した発現レベルによって、ＬｅＹ抗原は、治療用抗体についての魅力的な標的である。
一部の実施形態では、本発明の治療剤は、ＬｅＸに対して方向付け得る。ＬｅＸは、エピトープＧａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ－Ｒを含む。これはまた、ＣＤ１５およびステージ特異的胎児抗原－１（ＳＳＥＡ－１）として公知である。この抗原は、Ｆ９奇形癌細胞による免疫化に供したマウスから採取した血清と免疫反応性であると最初に認識された。ＬｅＸはまた、特定の段階における胚発生と相関することが見出された。これはまた、がんの存在下および非存在下の両方において種々の組織において発現しているが、また乳がんおよび卵巣がんにおいて見出すことができ、ここではこれはがん性細胞によってのみ発現されている。
一部の実施形態では、本発明の治療剤は、ＳＬｅＡおよび／またはＳＬｅＸに対して方向付け得る。ＳＬｅＡおよびＳＬｅＸは、それぞれ、構造Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ－ＲおよびＮｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ－Ｒを含む。これらの発現は、がん細胞においてアップレギュレートされる。血清におけるこれらの抗原の存在は、悪性腫瘍および予後不良と相関する。ＳＬｅＸは、ムチン末端エピトープとして大部分は見出される。これは、乳房、卵巣、黒色腫、結腸、肝臓、肺および前立腺を含めたいくつかの異なるがんにおいて発現している。本発明の一部の実施形態では、ＳＬｅＡおよびＳＬｅＸ標的は、Ｎｅｕ５Ｇｃ（本明細書において、それぞれ、ＧｃＳＬｅＡおよびＧｃＳＬｅＸと称される）を含む。
一部の実施形態では、本発明の治療剤は、糖脂質および／またはこれらに限定されないが、スフィンゴ糖脂質を含めた糖脂質上に存在するエピトープに対して方向付け得る。スフィンゴ糖脂質は、セラミドヒドロキシル基によってグリカンに連結した脂質セラミドを含む。細胞膜上で、スフィンゴ糖脂質は、「脂質ラフト」と称されるクラスターを形成する。
一部の実施形態では、本発明の治療剤は、グロボＨに対して方向付け得る。グロボＨは、乳がん細胞において最初に同定されたがんに関連するスフィンゴ糖脂質である。グロボＨのグリカン部分は、Ｆｕｃα（１－２）Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃβ（１－３）Ｇａｌα（１－４）Ｇａｌβ（１－４）Ｇｌｃβ（１）を含む。いくつかの正常な上皮組織において見出されるが、グロボＨは、これらに限定されないが、小細胞肺、乳房、前立腺、肺、膵臓、胃、卵巣および子宮内膜の腫瘍を含めた多くの腫瘍組織と関連して同定されてきた。
一部の実施形態では、本発明の治療剤は、ガングリオシドに対して方向付け得る。ガングリオシドは、１種もしくは複数のシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質である。ガングリオシドの命名法によると、Ｇは、ガングリオシドについての略語として使用される。この略語に、付着しているシアル酸残基の数（それぞれ、１、２または３）を意味する文字Ｍ、Ｄ、またはＴが続く。最後に、数１、２または３は、薄層クロマトグラフィーによって分析したときに、それぞれが移動した距離の順序を指すために使用される（ここで、３は最も長い距離を移動し、それに続いて、２、次いで、１である）。ガングリオシドは、がんに関連する成長および転移に関与していることが公知であり、腫瘍細胞の細胞表面上に発現し得る。腫瘍細胞上で発現しているガングリオシドには、これらに限定されないが、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２およびフコシルＧＭ１（本明細書において、Ｆｕｃ－ＧＭ１とまた称される）が含まれてもよい。本発明の一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、ＧＤ３に対して方向付けされる。ＧＤ３は、細胞成長のレギュレーターである。一部の実施形態では、ＧＤ３に向けられる抗体を使用して、細胞成長および／または血管形成をモジュレートする。一部の実施形態では、ＧＤ３に向けられる抗体を使用して、細胞付着をモジュレートする。本発明の一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、ＧＭ２に対して方向付けられる。一部の実施形態では、ＧＭ２に向けられる抗体を使用して、細胞と細胞の接触をモジュレートする。一部の実施形態では、本発明のガングリオシド標的は、１個もしくは複数のＮｅｕ５Ｇｃ残基を含む。一部の実施形態では、このような標的は、Ｎｅｕ５Ｇｃを有するＧＭ３バリアント（本明細書において、ＧｃＧＭ３と称される）を含み得る。ＧｃＧＭ３のグリカン構成要素は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃである。ＧｃＧＭ３は、腫瘍細胞の公知の構成要素である。
一部の実施形態では、本発明の抗ＴＡＣＡ抗体によって標的とされるＴＡＣＡには、これらに限定されないが、そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１３／０２３６４８６Ａ１号明細書、同第２０１３／０１０８６２４Ａ１号明細書、同第２０１０／０１７８２９２Ａ１号明細書、同第２０１０／０１０４５７２Ａ１号明細書、同第２０１２／００３９９８４Ａ１号明細書、同第２００９／０１９６９１６Ａ１号明細書、および同第２００９／００４１８３６Ａ１号明細書において列挙されているもののいずれかが含まれてもよい。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書において教示される抗グリカン抗体の投与、またはこのような抗体の組成物（例えば、少なくとも１種の添加剤を有する抗グリカン抗体の組成物）の投与を含む、がんを処置する方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示の方法は、腫瘍細胞を完全に根絶して、１種もしくは複数のグリカン相互作用抗体の投与による長期の最初の寛解を誘発することを含む。他の方法は、ある期間、場合によって、過剰な毒性を伴わずに腫瘍の復活を阻害することを含む。このような期間は、約１カ月～約１８カ月、約１年～約５年、約２年～約１０年、または１０年超であり得る。
がんにおけるＳＴｎ
免疫系は、先天性免疫および適応免疫活性の両方を含めた抗腫瘍細胞免疫活性を促進するための複数の機序を有する。本明細書において使用する場合、用語「抗腫瘍細胞免疫活性」は、腫瘍細胞を死滅させ、または腫瘍細胞の成長および／もしくは増殖を防止する免疫系の任意の活性を指す。場合によって、抗腫瘍免疫活性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による認識および腫瘍細胞死滅、ならびにマクロファージによる食作用を含む。適応抗腫瘍免疫応答は、腫瘍抗原取込み、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞（ＤＣ）による提示を含み、Ｔ細胞抗腫瘍活性のモジュレーションおよび／または腫瘍特異的抗体の分泌によるＢ細胞の増殖をもたらす。腫瘍への腫瘍特異的抗体の結合は、腫瘍細胞死の抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）機序をもたらすことができる。
本明細書において使用する場合、用語「免疫耐性腫瘍細胞」は、抗腫瘍細胞免疫活性を低減させるか、または逃れる腫瘍細胞を指す。いくつかの研究は、腫瘍細胞表面上、もしくは腫瘍細胞微小環境中に分泌されたＳＴｎ（公知のＴＡＣＡ）の発現が、抗腫瘍免疫活性の腫瘍細胞の回避を促進することができることを示す。本明細書において使用する場合、用語「腫瘍細胞微小環境」は、腫瘍細胞に隣接するかその周囲の任意のエリアを指す。このようなエリアには、これらに限定されないが、腫瘍細胞の間、腫瘍および非腫瘍細胞の間、細胞外マトリックスの周囲の液体および周囲の構成要素のエリアが含まれる。
ＳＴｎを有するシアル酸付加されたムチンは、オガタ（Ｏｇａｔａ）らによって腫瘍細胞のＮＫ細胞標的化を低減させることが示された（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、オガタ，Ｓ．（Ｏｇａｔａ，Ｓ．）ら著、１９９２年、がんリサーチ（Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．）、５２巻：４７４１～６頁）。ヒツジ、ウシおよびブタの顎下ムチン（それぞれ、ＯＳＭ、ＢＳＭおよびＰＳＭ）の存在が、細胞毒性の概ね１００パーセント阻害をもたらしたことをこの研究によって見出された（オガタ（Ｏｇａｔａ）らの表２を参照されたい）。ジャンダス（Ｊａｎｄｕｓ）らによるさらなる研究は、いくつかの腫瘍細胞が、ＮＫ細胞シグレック受容体と相互作用し、ＮＫ阻害をもたらすことができるシアログリカンリガンドの発現によってＮＫ破壊を逃れることができることを示す（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ジャンダス，Ｃ．（Ｊａｎｄｕｓ，Ｃ．）ら著、２０１４年、ＪＣＩ．ｐｉｉ：６５８９９）。
トダ（Ｔｏｄａ）らによる研究は、ＳＴｎが、Ｂ細胞上のＣＤ２２受容体を結合し得、シグナル伝達の減少およびＢ細胞活性化の低減をもたらすことを示す（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、トダ，Ｍ．（Ｔｏｄａ，Ｍ．）ら著、２００８年、生化学および生物物理学のリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．）、３７２巻（１号）：４５～５０頁）。樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞活性をモジュレートすることによって適応免疫活性に影響を与えることができる。カラスカル（Ｃａｒｒａｓｃａｌ）らによる研究は、膀胱がん細胞によるＳＴｎ発現がＤＣにおける耐性を誘発し、Ｔ細胞における抗腫瘍細胞免疫活性を誘発するこれらの能力を低減させたことが見出された（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、カラスカル，ＭＡ（Ｃａｒｒａｓｃａｌ，ＭＡ）ら著、２０１４年、分子腫瘍学（Ｍｏｌ Ｏｎｃｏｌ．）、ｐｉｉ：Ｓ１５７４－７８９１巻（１４号）、０００４７～７頁）。ＳＴｎ陽性膀胱がん細胞と接触したＤＣが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－１２およびＴＮＦ－αの低発現を伴ってトロリジェニック発現プロファイルを示したことをこれらの研究は明らかにした。さらに、ＤＣは、Ｔ細胞が低発現のＩＦＮγおよび高発現のＦｏｘＰ３を有するように、調節性Ｔ細胞をモジュレートすることが見出された。ファンフリート（ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ）およびその他による他の研究は、マクロファージガラクトース型レクチン（ＭＧＬ）のＤＣ表面発現が、腫瘍組織へのこれらの細胞の標的化をもたらすことができることを示す（そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、バンブリエット，ＳＪ．（ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ，ＳＪ．）、２００７年、アムステルダム：アムステルダム自由大学（Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ．）、１～２３２頁およびバンブリエット，ＳＪ．（ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ，ＳＪ．）ら著、２００８年、免疫学ジャーナル（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１８１巻（５号）：３１４８～５５頁、ノロー，Ｐ．（Ｎｏｌｌａｕ，Ｐ．）ら著、２０１３年、組織化学および細胞化学ジャーナル（Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｎｈｅｍ．）、６１巻（３号）：１９９～２０５頁）。ＭＧＬ相互作用によって組織に到達するＤＣは、３つの方法の１つにおいてヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞に影響を与え得る。ＤＣは、Ｔ細胞耐性、Ｔ細胞免疫活性、またはエフェクターＴ細胞のダウンレギュレーションを誘発し得る。ＭＧＬは、ＡｃＳＴｎおよびＧｃＳＴｎの両方に結合することが示されてきており、親和性は徹底的に分析されてきた（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、モルテツァイ，Ｎ．（Ｍｏｒｔｅｚａｉ，Ｎ．）ら著、２０１３年、糖生物学（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．）、２３巻（７号）：８４４～５２頁）。興味深いことに、腫瘍上のＭＵＣ１発現は、Ｔ細胞耐性をもたらし、腫瘍細胞を免疫根絶から保護することを示した。
一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体（これらに限定されないが、抗ＳＴｎ抗体を含めた）は、１種もしくは複数のＴＡＣＡを発現している１個もしくは複数の腫瘍細胞を有する対象を処置するために使用し得る。場合によって、本発明のグリカン相互作用抗体（これらに限定されないが、抗ＳＴｎ抗体を含めた）は、ＳＴｎを発現している腫瘍細胞に対する抗腫瘍細胞免疫活性を増加させるために使用し得る。このような抗体は、免疫耐性腫瘍細胞に対する適応性免疫応答および／または先天性免疫応答を増加し得る。いくつかのグリカン相互作用抗体は、ＮＫ抗腫瘍細胞活性を増加させるために使用し得る。このようなグリカン相互作用抗体は、場合によって、ＮＫ細胞上に発現しているグリカン受容体、およびがん細胞上または周辺組織中のＳＴｎグリカンの間の相互作用をブロックし得る。
一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体（これらに限定されないが、抗ＳＴｎ抗体を含めた）は、Ｂ細胞抗腫瘍細胞活性を増加させるために使用し得る。このような抗体は、Ｂ細胞上のＣＤ２２受容体、およびがん細胞上または周辺組織中のＳＴｎグリカンの間の相互作用を低減し得る。シェーベリ（Ｓｊｏｂｅｒｇ）らによる研究は、糖タンパク質上のα２，６－連結シアル酸の９－Ｏ－アセチル化がまた、Ｂ細胞ＣＤ２２受容体およびこのような糖タンパク質の間の相互作用を低減させたことを示す（シェーベリ，Ｅ．Ｒ．（Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｅ．Ｒ．）ら、１９９４年、ＪＣＢ．１２６巻（２号）：５４９～５６２頁）。シ（Ｓｈｉ）らによる別の研究は、マウスの赤白血病細胞上のより高いレベルの９－Ｏ－アセチル化シアル酸残基によって、これらの細胞が、補体媒介の溶解の影響をより受けやすくなることを明らかにした（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、シ，Ｗ－Ｘ．（Ｓｈｉ，Ｗ－Ｘ．）ら著、１９９６年、生物化学ジャーナル（Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．）、２７１巻（４９号）：３１５２６～３２頁）。一部の実施形態では、本発明の抗ＳＴｎ抗体は、非９－Ｏ－アセチル化ＳＴｎを選択的に結合することができ、全体的なＳＴｎ結合を低減させるが、腫瘍細胞成長および／または増殖を低減させる。（例えば、増加したＢ細胞抗腫瘍活性および増加した補体媒介の腫瘍細胞破壊による）。一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体（これらに限定されないが、抗ＳＴｎ抗体を含めた）は、ＤＣ抗腫瘍活性を増加させるために使用し得る。このような抗体は、腫瘍細胞に対するＤＣ耐性を低減させるために使用し得る。低減したＤＣ耐性は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－１２および／またはＴＮＦ－αの増加するＤＣ発現を含み得る。場合によって、ＤＣ抗腫瘍細胞活性は、Ｔ細胞抗腫瘍細胞活性の促進を含み得る。このような抗体は、ＤＣ ＭＧＬおよび、がん細胞上もしくは周りに発現しているグリカンの間の結合を防止し得る。
イブラヒム（Ｉｂｒａｈｉｍ）らによる研究は、内分泌療法を伴う高レベルの抗ＳＴｎ抗体が、転移性乳がんを有する女性において全生存期間および無増悪期間（ＴＴＰ）を増加し得ることを示唆する（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、イブラヒム，Ｎ．Ｋ．（Ｉｂｒａｈｉｍ，Ｎ．Ｋ．）ら著、２０１３年、４巻（７号）：５７７～５８４頁）。この研究において、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結したＳＴｎによるワクチン接種の後で、抗ＳＴｎ抗体レベルは上昇した。一部の実施形態では、本発明の抗ＳＴｎ抗体は、内分泌療法（例えば、タモキシフェンおよび／またはアロマターゼ阻害剤）と組み合わせて使用し得る。
一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、がん性細胞および／またはＳＴｎを発現している細胞を低減または排除するために使用し得る。このような細胞は、腫瘍の部分であり得る細胞を含む。
場合によって、本発明は、１つもしくは複数の腫瘍を有する対象に本発明の抗グリカン抗体を投与することによって腫瘍体積を低減させる方法を提供する。腫瘍体積の低減は、処置の前および後の対象における腫瘍体積を比較することによって、または抗グリカン抗体で処置された対象および対照で処置された対象の間の腫瘍体積を比較することによって決定し得る。
場合によって、本発明の抗グリカン抗体は、対象における腫瘍体積の所望の低減パーセントを達成するために投与し得る。これは、抗グリカン抗体による処置の前および後の対象において１つもしくは複数の腫瘍の容量を決定し（例えば、カリパスまたはイメージング技術、例えば、ＣＴスキャンの使用による）、次いで、２つの値からの腫瘍体積の低減パーセントを計算することによってアセスメントし得る。一部の実施形態では、抗グリカン抗体で処置されている対象における腫瘍体積は、約０．１％～約２％、約１％～約５％、約３％～約１２％、約１０％～約３０％、約２０％～約５０％、約４０％～約６０％、約５０％～約７５％、約６０％～約８５％、または約８０％～約９９％低減し得る。場合によって、抗グリカン抗体で処置されている対象における腫瘍体積は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減し得る。
場合によって、本発明の抗グリカン抗体は、所望の腫瘍成長阻害パーセント（Ｔ／Ｃ％）を達成するために投与し得る。Ｔ／Ｃ％は、処置されている対象において腫瘍体積を決定し、これらを非処置対象またはプラセボ処置対象における腫瘍体積と比較することによって計算する。一部の実施形態では、本発明は、抗グリカン抗体を投与することによって対象において腫瘍体積を低減させる方法を提供し、ここで、Ｔ／Ｃ％は、約０．１％～約１％、約０．５％～約５％、約２％～約２０％、約３％～約１６％、約１０％～約３０％、約２０％～約６０％、または約４０％～約８０％である。場合によって、Ｔ／Ｃ％は、少なくとも８０％である。場合によって、Ｔ／Ｃ％は、０．１％未満である。
一部の実施形態では、対象における腫瘍体積を低減させるために使用される抗体は、細胞表面グリカン（例えば、ＳＴｎ）を結合するこれらの能力、および／またはがん性細胞を死滅されるこれらの能力に基づいて選択し得る。場合によって、抗体は、細胞表面ＳＴｎを有する細胞を結合するためのこれらの最大半量有効濃度（ＥＣ５０）に基づいて選択し得る。このような抗体についてのＥＣ５０値は、例えば、細胞表面ＳＴｎを有する細胞によるフローサイトメトリー分析によって決定し得る。このような抗体は、約０．１ｎＭ～約２ｎＭ、約０．５ｎＭ～約５ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約２０ｎＭ、または約１０ｎＭ～約３０ｎＭのＥＣ５０値を有し得る。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書において提示する１種もしくは複数の抗体を投与することによって、がん細胞、例えば、腫瘍細胞を死滅させる方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、がん細胞（これらに限定されないが、がん幹細胞を含めた）を単離し、かつ／または対象から生検材料を得て、ＳＴｎ発現についてがん細胞および／または生検材料をスクリーニングすることによって、抗ＳＴｎ抗体処置を必要としている対象を同定する方法を提供する。このような方法によると、ＳＴｎを発現しているがん細胞および／または生検材料を有する対象は、抗ＳＴｎ抗体処置から恩恵を受ける可能性が高いか、または抗ＳＴｎ抗体処置（例えば、本明細書に記載されている１種もしくは複数の抗体による処置）を必要とすると見なされる。場合によって、本明細書に記載されている抗体は、がん細胞および／または生検材料のスクリーニングのために使用し得る。がん細胞は、がん細胞を培養し、標準的な免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、または他の標準的な免疫学的アッセイ）を使用してＳＴｎ発現を検出することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングし得る。場合によって、がん細胞は、フローサイトメトリー技術を使用してＳＴｎ発現についてスクリーニングし得る。他の実施形態では、がん細胞は、培養液中で成長させ、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である抗ＳＴｎ抗体による処置の後、生存率について試験し得る。このようなＡＤＣは、これらに限定されないが、本明細書に記載されているものを含めた細胞毒性剤を含み得る。細胞毒性剤は、ＭＭＡＥを含み得る。抗ＳＴｎ抗体は、これらに限定されないが、本明細書に記載されているものを含めたヒト化抗体を含み得る。他の実施形態では、がん細胞は、がん細胞を使用して、マウス（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）において腫瘍を形成させることによってスクリーニングし得る。マウスにおいて発生した腫瘍は、このような腫瘍から組織切片を調製し、これらに限定されないが、本明細書に記載されている抗ＳＴｎ抗体を含めた抗ＳＴｎ抗体を使用して組織切片を免疫組織化学分析に供することによってスクリーニングし得る。場合によって、マウスにおいて形成された腫瘍は、これらに限定されないが、本明細書に記載されている抗ＳＴｎ抗体を含めた抗ＳＴｎ抗体によるマウスの処置の後に、腫瘍体積の変化についてアセスメントし得る。このような抗ＳＴｎ抗体は、ＡＤＣを含み得る。ＡＤＣは、これらに限定されないが、本明細書に記載されているもののいずれか（例えば、ＭＭＡＥ）を含めた１種もしくは複数の細胞毒性剤を含み得る。スクリーニングの後にＳＴｎ発現を示すがん細胞を有する対象は、抗ＳＴｎ抗体処置を必要としていると決定し得る。
一部の実施形態では、本開示は、対象からがん細胞（これらに限定されないが、がん幹細胞を含めた）を単離し、ＳＴｎ発現についてがん細胞をスクリーニングし、ＳＴｎを発現しているがん細胞と、ＳＴｎに対して特異的な１種もしくは複数の候補抗体とを接触させ、１種もしくは複数の候補抗体のいずれかががん細胞を結合することができるかを決定することによって、がんを処置するのに適した抗体を同定する方法を提供する。本明細書において使用する場合、用語「候補抗体」は、１つもしくは複数の目的について評価されている抗体または抗体の群の１つを指す。対象がん細胞は、標準的な免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、もしくは他の標準的な免疫学的アッセイ）によるＳＴｎ検出抗体を使用して、またはフローサイトメトリー技術を使用して、がん細胞を培養し、ＳＴｎ発現を検出することによってｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングし得る。本明細書において使用する場合、用語「ＳＴｎ検出抗体」は、ＳＴｎを結合し、かつ組み込まれた検出可能な標識の存在によって、または検出可能な標識を有する二次抗体の使用によって、このような結合の観察を可能とする抗体を指す。他の実施形態では、がん細胞をスクリーニングすることは、これらを使用して、マウス（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）において腫瘍を形成することが関与し得る。スクリーニングは、これらに限定されないが、ＡＤＣを含めた抗ＳＴｎ抗体の投与の後で、ＳＴｎの発現についてまたは体積の低減について、マウス腫瘍をアセスメントすることによって行い得る。
一部の実施形態では、本発明は、対象からのがん細胞を得て、がん細胞を使用してマウス（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）において腫瘍を形成させ、抗ＳＴｎ抗体をマウスに投与し、マウスにおける腫瘍体積の変化を測定することによって、対象においてがんを処置するための抗体の適合性を評価する方法を含み、マウスにおける腫瘍体積が減少する場合、抗ＳＴｎ抗体は、対象においてがんを処置するのに有用であると決定される。場合によって、抗ＳＴｎ抗体は、複数回投与される。このような方法によって、抗体は、毎時、毎日、毎週、毎月、および／または毎年投与し得る。場合によって、抗体は、約２～約１２週間の期間、毎週投与される。場合によって、抗体は、少なくとも１２週間の期間、毎週投与される。
ＳＴｎ発現は、がん細胞の転移能の一因となることにおいて結び付けられてきた。本開示のいくつかの方法によると、グリカン相互作用抗体は、転移を低減させるために使用し得る。このような方法は、約１％～約１５％、約５％～約２５％、約１０％～約５０％、約２０％～約６０％、約３０％～約７０％、約４０％～約８０％、約５０％～約９０％、約７５％～約９５％、または少なくとも９５％の転移の低減を含み得る。
治療標的としてのがん幹細胞
がん幹細胞またはＣＳＣ（腫瘍開始細胞とまた称される）は、原発性および転移性腫瘍の開始、成長、蔓延、および再発を推進する不均一な腫瘍集団内のがん細胞のサブセットであり（カルステン（Ｋａｒｓｔｅｎ）およびゴレツ（Ｇｏｌｅｔｚ）、シュプリンガープラス（ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ）、２０１３年、２巻、３０１頁）、これは腫瘍タイプによって変動する割合の総集団において起こり得る。ＣＳＣは、自己再生し、非ＣＳＣ、分化した子孫を生じさせるそれらの能力によって、最終分化細胞と区別される（グプタ（Ｇｕｐｔａ）ら著、ネイチャーメディシン（Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２００９年、１５巻、１０１０～１０１２頁）。これらの特性は、正常な幹細胞の特性と類似している。正常な幹細胞およびＣＳＣの間のこのような区別は、治療のための重要な意味を有する。
これらの非ＣＳＣカウンターパートからＣＳＣを分化すると主張する増加する数の細胞表面バイオマーカーが同定されてきた（メデマ（Ｍｅｄｅｍａ）ら著、ネイチャー細胞生物学（Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１３年、１５巻、３３８～３４４頁；ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）、がん（Ｃａｎｃｅｒ）、２０１１年、１１巻、２５４～２６７頁）。これらは、これらに限定されないが、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ１１７、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼアイソフォーム１（ＡＬＤＨ１）を含み得る。これらのいくつかはマウス腫瘍およびヒト細胞系の研究に由来するが、その他は原発性ヒト腫瘍試料を使用して検証されてきた。これらの１つである膜貫通ＣＤ４４糖タンパク質、または種々の腫瘍タイプの周知の構成物であるヒアルロナン受容体はまた、ヒトがんにおける真実のＣＳＣマーカーとして最近認められてきており、実際、最も頻繁に観察されるものである（ロボ（Ｌｏｂｏ）ら著、２００７年、２３巻、６７５～６９９頁）。
ＣＤ４４は、完全長ＣＤ４４遺伝子の２０個のエクソンおよび１９個のイントロンの間で起こる選択的スプライシング事象によって生じるいくつかのバリアントアイソフォームで存在する（ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら著、実験生物学および医薬（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１３年、２３８巻、３２４～３３８頁）。増大する実験的根拠は、部分的に、細胞内シグナル伝達経路のモジュレーションによって（ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら著、実験生物学および医薬（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１３年、２３８巻、３２４～３３８頁）、ＣＳＣの生得的な転移性および薬物耐性表現型をもたらすことにおけるＣＤ４４およびそのバリアントの支持をする役割に注意が向いている（Ｎｅｇｉら著、薬物ターゲッティングジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、２０１２年、２０巻、５６１～５７３頁）。さらに、高レベルのＣＤ４４細胞を示す、いくつかの他のがんタイプと共に、三種陰性乳がんを有する患者は、予後不良およびより高い死亡率を有することが公知である（Ｎｅｇｉら著、薬物ターゲッティングジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、２０１２年、２０巻、５６１～５７３頁）。これらの観察は、ＣＤ４４を標的とすることは、成熟がん細胞に加えてＣＳＣの阻害または排除によってがんを処置する手段を提供するという概念を支持する。実際に、ＣＤ４４を標的とする多数のアプローチは、変動する程度の成功を伴って実験的に試みされてきた。これらは、コンジュゲートしている抗体およびコンジュゲートしていない抗体、ナノ担体薬物系、およびヒアルロナンがコンジュゲートした薬物の使用を含む広範囲の技術を含む（Ｎｅｇｉら著、薬物ターゲッティングジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、２０１２年、２０巻、５６１～５７３頁）。しかし、いくつかの場合では、毒性効果がｉｎ ｖｉｖｏでの研究において観察された。これらの有害な副作用は、標的とされるＣＳＣおよび成熟腫瘍細胞の表面上のその存在に加えて、大部分の脊椎動物細胞の膜上のＣＤ４４およびバリアントの広範な出現に起因し得る（ナオール（Ｎａｏｒ）ら著、がん生物学のセミナー（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００８年、１８巻、２６０～２６７頁）。正常なヒト幹細胞の構成物であるＣＤ４４タンパク質を標的とすることは（ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら著、実験生物学および薬物（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１３年、２３８巻、３２４～３３８頁）また、正常な幹細胞機能を害し得る（レス－ラーセン（Ｌｅｔｈ－Ｌａｒｓｅｎ）ら著、分子医学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１２年、１８巻、１１０９～１１２１頁）。大規模リサーチはＣＳＣ上および成熟腫瘍細胞上のＣＤ４４タンパク質を標的とする望ましさを指摘するが、このアプローチに関連する固有の問題は、正常組織および正常な幹細胞を残す阻害剤を設計することにおける現在の困難が残ることである。
ＣＳＣ生物学への意味を伴う別の周知の腫瘍抗原は、腺癌の大部分上では高レベルで異なって発現しているが、正常な上皮細胞上では低レベルで発現しているか、または全く発現していない、膜に繋ぎ止められた糖タンパク質である上皮のムチンＭＵＣ１である。ＭＵＣ１は最近、乳がん（エンゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ）ら著、がんリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００８年、６８巻、２４１９～２４２６頁）、および膵臓がんを含めた種々の新組織形成に対するＣＳＣバイオマーカーとして同定されてきており、その発現は、高い転移および予後不良と相関する。ＣＳＣの構成物として、ＭＵＣ１は、細胞接着、増殖、生存、およびシグナル伝達において機能することが示されてきており（エンゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ）ら著、がんリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００８年、６８巻、２４１９～２４２６頁）、またＣＤ４４と共に共発現し得る（レス－ラーセン（Ｌｅｔｈ－Ｌａｒｓｅｎ）ら著、分子医学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１２年、１８巻、１１０９～１１２１頁）。がんにおいてＭＵＣ１を標的とする免疫療法アプローチが、ワクチンおよび他のアプローチを使用して探究されているが、主に、成熟がん細胞治療との関連である（Ｊｕｌｉｅｎ（ジュリアン）ら著、生体分子（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１２年、２巻、４３５～４６６頁；アクレス（Ａｃｒｅｓ）ら著、ワクチンのエキスパートレビュー（Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ）、２００５年、４巻、４９３～５０２頁）。
がん幹細胞は、上皮間葉（ＥＭＴ）転換（グプタ（Ｇｕｐｔａ）ら著、ネイチャーメディシン（Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２００９年、１５巻、１０１０～１０１２頁）、および／または逆に、転移の部位において起こる間葉上皮（ＭＥＴ）転換（レス－ラーセン（Ｌｅｔｈ－Ｌａｒｓｅｎ）ら著、分子医学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１２年、１８巻、１１０９～１１２１頁）（ＣＳＣ可塑性とまた称され、非ＣＳＣはＣＳＣを生じさせることができる）によって生じると仮定されてきた。この発見は、腫瘍集団においてＣＳＣおよび非ＣＳＣの両方を排除する必要性をさらに強調する。
濃縮されたＣＳＣ集団による最近の研究によって、これらの細胞が、腫瘍の塊とは異なり、相対的に静止状態であり、化学療法および放射線を含めた多くのタイプの現在の治療に対して優先的に耐性であることが明らかになってきた（レス－ラーセン（Ｌｅｔｈ－Ｌａｒｓｅｎ）ら著、分子医学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１２年、１８巻、１１０９～１１２１頁）。このように、現在の治療方針は、腫瘍の非ＣＳＣ構成要素を標的とし、ＣＳＣを殆ど影響されないままとし、適当なきっかけの後で再出現して、最初の部位において再発性原発性腫瘍を再編成するか、または遠い部位に蔓延し、コロニー形成し、がん死亡の主要な原因である転移性疾患を生じさせる。
がん幹細胞の特性の現在の理解は明らかに、完全な治癒を潜在的にもたらすために、現在実践されているように腫瘍中に存在する細胞の塊のみでなく、ＣＳＣコンパートメントもまた標的とする必要性を強調した。
上記で考察するように、腫瘍（ＣＳＣを含む）関連バイオマーカーに基づいて開発されてきた戦略は、大部分のがんバイオマーカーがまた、正常な幹細胞を含めた正常細胞中に存在するという難問に直面している。ＣＳＣを排除するためにタンパク質バイオマーカーを標的とする治療はまた、正常な幹細胞を標的とし、正常細胞の排除をもたらし得る。
ＣＳＣにおける腫瘍特異的グリカン
特異的腫瘍ターゲッティングに適した完全に新規なクラスの腫瘍関連炭水化物抗原としてグリカンを同定する、トムゼン－ヌーヴォー（Ｔｎ）抗原（ＧａｌＮＡｃ－Ｏ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の出現を含むグリコシル化の異常な形態が、多数のヒトがんにおいて記載されてきた（ラブ（Ｒａｂｕ）ら著、将来の腫瘍学（Ｆｕｔｕｒｅ ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、２０１２年、８巻、９４３～９６０頁）。Ｔｎ（ＳＴｎ）のシアリル誘導体の形成は、Ｔｎ抗原にα２，６連結におけるシアル酸を加えるシアリルトランスフェラーゼＳＴ６ＧａｌＮＡｃ－Ｉによって媒介される。ＳＴｎのシアル酸付加はさらなる糖添加を防止し、このようにさらなるグリカン延長部を切り詰める（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）ら著、がん転移レビュー（Ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｒｅｖｉｅｗｓ）、２０１２年、３１巻、５０１～５１８頁）。
正常な成人ヒト組織におけるＳＴｎの存在はまれである一方、ＳＴｎは、とりわけ、卵巣、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、および肺がんを含めた様々なヒトがんにおいて発生する（Ｆｅｒｒｅｉｒａ（ファレイラ）ら著、分子腫瘍学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、２０１３年、７巻、７１９～７３１頁；Ｋｉｎｎｅｙ（キニー）ら著、がん（Ｃａｎｃｅｒ）、１９９７年、８０巻、２２４０～２２４９頁）。さらに、腫瘍におけるＳＴｎの存在は、転移性疾患、予後不良、および全生存期間の低減と関連する（Ｆｅｒｒｅｉｒａ（ファレイラ）ら著、分子腫瘍学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、２０１３年、７巻、７１９～７３１頁；Ｋｉｎｎｅｙ（キニー）ら著、がん（Ｃａｎｃｅｒ）、１９９７年、８０巻、２２４０～２２４９頁）。したがって、ＳＴｎは、がん検出および治療のための高度に魅力的な標的であると考えられる。ＳＴｎの末端位置において位置している２つの別個の形態のシアル酸（Ｎｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃ）が存在する。Ｎｅｕ５Ａｃ－シアル酸付加形態は、ヒトが、不活性なＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）遺伝子によってＮｅｕ５Ｇｃを合成することができないため、ヒトにおいて優勢である。しかし、Ｎｅｕ５Ｇｃに富んだ食物の消費は、ヒト細胞への、特に、癌腫における異種Ｎｅｕ５Ｇｃ組込みをもたらす。従前の研究は、固形腫瘍がシアル酸のＮｅｕ５Ｇｃ形態を取り込み、発現することを示してきた（Ｉｎｏｕｅら著、糖生物学（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１０年、２０巻、７５２～７６２頁；Ｍａｌｙｋｈら著、生化学（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ）、２００１年、８３巻、６２３～６３４頁；パドラー－カラヴァニ（Ｐａｄｌｅｒ－Ｋａｒａｖａｎｉ）ら著、がんリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１１年、７１巻、３３５２～３３６３頁）。ｍＡｂは、潜在的ながん標的であるＳＴｎの両方のグリコアイソフォーム：Ｎｅｕ５Ａｃ－ＳＴｎ（ＡｃＳＴｎ）およびＮｅｕ５Ｇｃ－ＳＴｎ（ＧｃＳＴｎ）に結合する（すなわち、汎ＳＴｎ抗体と命名される）。
ＳＴｎ蓄積は、固形腫瘍において繰り返し観察される特定の体細胞変異と、および活性Ｔ－シンターゼの形成のために必要とされる分子シャペロンコア１ベータ３－ガラクトシルトランスフェラーゼ特異的分子シャペロン（ＣＯＳＭＣ）をコードする遺伝子の不活性化と関連している（ジュ（Ｊｕ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００５年、４３７巻、１２５頁）。Ｔ－シンターゼは、ＧａｌＮＡｃ基質についてＳＴ６ＧａｌＮＡｃ－Ｉと競合し、したがって、変異によって不活性化されるとき、ＳＴｎ合成の増加をもたらす。さらに、ＳＴｎ蓄積はまた、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ－Ｉの発現の増加に起因し得、これは観察されることが多い（ブロックハウゼン（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ）ら著、生物化学（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００１年、３８２巻、２１９～２３２頁；イケハラ（Ｉｋｅｈａｒａ）ら著、糖生物学（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９９年、９巻、１２１３～１２２４頁）。ＳＴｎの新規の発現は、癌腫細胞をモジュレートし、悪性の表現型を変化させ、より攻撃的な細胞挙動をもたらすことができる（ピンホー（Ｐｉｎｈｏ）ら著、がんレター（Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ）、２００７年、２４９巻、１５７～１７０頁）。したがって、ＳＴｎは、興味深いがんバイオマーカーおよび治療標的であるだけでなく、ＳＴｎ機能を妨げることは、かなりの機能的、抗転移性の治療上の利点を有するという興味深い可能性を提供する。
細胞糖タンパク質のグリコシル化はがんにおいて変化していることは周知であるが、異常なグリコシル化は、問題になっている糖タンパク質およびグリカンの両方に関して選択的であるようである。実際は、ヒト腫瘍ＣＳＣにおいて、ＣＤ４４およびＭＵＣ１のみは、ＳＴｎ抗原の主要な担体であり（カゼット（Ｃａｚｅｔ）ら著、乳がんリサーチ（Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）：ＢＣＲ，２０１０年、１２巻、２０４頁；Ｊｕｌｉｅｎ（ジュリアン）ら著、糖生物学（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２００６年、１６巻、５４～６４頁）、成熟腫瘍細胞だけではなく、ＣＳＣもまた標的とするための選択的なアプローチを直ちに示唆する。ＭＵＣ１は、これがバリア機能を果たすいくつかの上皮細胞の正常な表面構成物である一方、腫瘍関連ＭＵＣ１は、成熟がん細胞において観察されるのと同じ様式でＣＳＣ上の低グリコシル化および増加したシアル酸付加によって特性決定され、ＳＴｎはＣＳＣおよび成熟腫瘍細胞の両方についての特異的マーカーとして現れる（カリー（Ｃｕｒｒｙ）ら著、外科的腫瘍学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、２０１３年、１０７巻、７１３～７２２頁）。ＭＵＣ１の異常なオリゴ糖類プロファイルは、ネオマーカー、例えば、シアリル－Ｌｅａ（ＣＡ１９－９試験において使用）、シアリル－Ｌｅｘ、およびシアリル－Ｔｎ（ＴＡＧ－７２）、ならびに潜在性エピトープ、例えば、がん細胞（例えば、ＣＳＣ）におけるＴｎの発現を生じさせる。さらに、低グリコシル化によって、コア内のエピトープ（正常組織由来のＭＵＣ１内で到達可能でない）が潜在的な抗原としての役割を果たし得るように、ムチンのペプチドコアは曝露される。
ＳＴｎを標的とする臨床アプローチは、ここまではもっぱらＳＴｎワクチンからなった。最も進行した臨床候補は、キーホールリンペットヘモシアニンにカップリングしたＳＴｎからなる治療ワクチンであるテラトープ（Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）である。ｉｎ ｖｉｖｏでのマウス研究において、テラトープ（Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）免疫化は、注射したＳＴｎを発現している乳癌細胞の成長における遅延を媒介することが示された強力な抗体応答を誘発した（Ｊｕｌｉｅｎ（ジュリアン）ら著、イギリスがんジャーナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ）、２００９年、１００巻、１７４６～１７５１頁）。しかし、テラトープ（Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）は、転移性乳がんにおける第ＩＩＩ相臨床治験においてその一次エンドポイントを満たすことができなかった。なぜテラトープ（Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）トライアルがその一次エンドポイントを逃したかについての主要な仮説は、患者集団が登録の前にＳＴｎ発現について評価されなかったことである。乳がんにおけるＳＴｎ発現は、研究および検出方法によって２５％から８０％まで変動し患者の間で高度に不均一であるため、ＳＴｎ発現と応答とを相関させる能力がないことは、テラトープ（Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）からの利点をマスクしてきた。重要なことに、ホルモン療法を受けている患者のサブセットは、ホルモン療法単独と比較してテラトープ（Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）で処置したときに、全生存期間中央値における有意な７．５カ月の増加を示しており（イブラヒム（Ｉｂｒａｈｉｍ）ら著、臨床腫瘍学ジャーナル：米国臨床腫瘍学会の学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、２００４年、２２巻、２５４７頁；およびマイルズ（Ｍｉｌｅｓ）ら著、腫瘍学者（Ｔｈｅ ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ）、２０１１年、１６巻、１０９２～１１００頁）、特定の患者集団におけるＳＴｎを標的とすることの治療可能性を検証する。さらに、免疫応答はワクチン接種した患者の間でかなり変動することが多いため、ワクチンアプローチは抗体力価を制御またはモジュレートする能力を欠いており、患者の間で広範な治療用抗体への曝露をもたらす。それにもかかわらず、テラトープ（Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）は最小の毒性を伴って耐容性良好であったが、これはがん療法のためにＳＴｎを標的とする安全性を示す。
がん細胞におけるＳＴｎ発現の分子基盤の高まりつつある理解は、任意の細胞表面タンパク質上でＳＴｎを発現している細胞がまた、（全部ではないが）多くの他のＯ－グリコシル化された細胞表面タンパク質上でＳＴｎを発現させており、優れた広範に分布したがん関連治療標的となっていることを強く示唆している。このように、ＳＴｎ陽性がん細胞集団は、ＣＳＣについて濃縮され得る。さらに、最近のデータは、ＳＴｎ発現の抑止は、転移性挙動におけるかなりの低減を伴ってがんをより攻撃的でないものとすることを示す（ジル（Ｇｉｌｌ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、２０１３年、１１０巻、Ｅ３１５２～３１６１頁）。
がん処置としてのＣＳＣを評定とする抗ＳＴｎ抗体
いくつかの抗ＳＴｎ抗体は当技術分野において記載されてきたが、いくつかはＳＴｎ抗原またはシアル酸付加されたアイソフォームに対する低い特異性を示す。例えば、市販のＢ７２．３抗ＳＴｎ抗体は、ＳＴｎだけではなく、Ｔｎ抗原にも結合することが示されてきた（バパット，Ｓ．Ａ．（Ｂａｐａｔ，Ｓ．Ａ．）（２０１０年）、ヒト卵巣がん幹細胞（Ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．）。生殖（Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、１４０巻、３３～４１頁）。抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／もしくは補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発するように工学処理されるか、または細胞毒性ペイロード［例えば、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）］とコンジュゲートされた、ＳＴｎを標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の利用可能性は、ＳＴｎを発現している腫瘍を有するがん患者についての相当な治療上の利点の可能性を提供する。さらに、このような抗体はまた、治療に応答する可能性が最も高い患者を事前選択するコンパニオン診断の開発を可能とする。
ＳＴｎは、ＣＳＣ表面抗原の１つもしくは複数上に存在することが多く、一緒にこれらはＣＳＣと関連する幹細胞性および化学療法耐性の特性を促進する役割を果たす。このように、抗ＳＴｎ抗体は、直接の会合および／もしくはＡＤＣＣを介してＣＳＣを直接死滅させるだけでなく、細胞表面タンパク質の広範なアレイに結合し、かつＣＳＣ生存率、自己再生、および複製に必須であるこれらの関連する機能を妨げる独特の機会を提供する可能性を伴う、ＣＳＣ関連がん標的化剤を提供する。
本明細書において考察するように、ＣＳＣ上のＳＴｎを標的とする理論的根拠および利点は、（１）多くの腫瘍特異的切断型糖タンパク質は、がんにおいてＳＴｎを担持すること；（２）ＳＴｎは、増殖状態に関わらず、ＣＳＣおよび成熟腫瘍細胞の両方上のＣＤ４４、ＭＵＣ１、および潜在的に他の重要な細胞表面マーカー上に優先的に発現している独自のグリカン標的であり、単一の治療剤によるこれらの腫瘍構成要素の両方の標的化を可能とすること；（３）ＳＴｎはまた、卵巣がんなどのバイオマーカーであるＣＡ－１２５の構成要素であること；（４）ＳＴｎは、卵巣ＣＳＣマーカーＣＤ４４の構成要素であることを含み得る。したがって、Ｔｎに連結したシアル酸のＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃ形態の両方を包含するエピトープを標的化する汎ＳＴｎマウスｍＡｂの使用は、ＣＳＣ、および共通のエピトープによって、非ＣＳＣ腫瘍細胞に結合するか、死滅させるか、または機能を損なわせる。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＣＳＣおよび成熟腫瘍細胞の特異的排除のための新規な抗汎ＳＴｎ ｍＡｂ（複数可）を提供する。本発明の一態様では、抗ＳＴｎ抗体は、特定の糖ペプチドまたは担体タンパク質ではなく検証されたＳＴｎグリカン自体を標的とし、これはＣＳＣおよび非ＣＳＣ腫瘍集団の両方上のＣＤ４４、ＭＵＣ１、または他のＳＴｎ－グリコシル化されたマーカーへの結合の広範な可能性を提供するはずである。一部の実施形態では、本開示のグリカン相互作用抗体は、１種もしくは複数の関連するグリカンを有する幹細胞関連タンパク質を標的とするために使用し得る。本明細書において使用する場合、用語「幹細胞関連タンパク質」は、１種もしくは複数の幹細胞と会合している任意のタンパク質を指す。このようなタンパク質には、これらに限定されないが、細胞表面タンパク質、マーカー、細胞内タンパク質、転写因子、ならびに幹細胞の生存、成長、複製、および／または維持に影響を与える細胞シグナル伝達に関与しているタンパク質が含まれてもよい。場合によって、このようなグリカンは、ＳＴｎを含む。幹細胞関連タンパク質には、これらに限定されないが、ノッチ、ヘッジホッグ、ＣＤ４４、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、およびインテグリンが含まれてもよい。
腫瘍関連ＳＴｎの標的化における並外れた特異性を所与として、本発明は、正常な成体幹細胞を含めた正常組織を残し、それによって優れた治療濃度域を可能とし得る。
本発明によると、本明細書において提供するのは、腫瘍コンパートメント内に含有されるＣＳＣおよび成熟がん細胞の両方を排除することによってヒト新組織形成を根絶することを目的とする独特の免疫療法のソリューションである。本発明は、ＣＳＣを標的とし、したがって、これらの潜在的な標的の関連する腫瘍特異的炭水化物部分を標的とすることによって治療濃度域を拡大することを含む、腫瘍を特異的に標的とする治療および方法を提供する。排除は、がん幹細胞を含めたがん組織において独自に存在する腫瘍関連細胞表面シアル酸付加されたＴｎ抗原（ＳＴｎ）構造を標的とすることによって特に行われる。
卵巣ＣＳＣ
卵巣がんは、米国の女性に影響を与えている主要な婦人科がんである。２０１３年において、２２，２４０人の女性がこの疾患であると診断され、１４，０３０人がこの疾患で死亡すると推定され、米国において女性が関連するがん死亡の第５の主要原因および最も致命的な婦人科の悪性腫瘍となっている（シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）ら著、がん統計（Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）、２０１３年、ＣＡ：臨床医のためのがんジャーナル（ａ ｃａｎｃｅｒ ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ）、６３巻、１１～３０頁）。この高死亡率は、非症候性の発症、後期における最初の診断、このタイプのがんの攻撃性、および治療的に標的とし得る遺伝的変化が一般に欠けていることに帰することができる。現在の標準治療は、腫瘍の減量、それに続くタキサンおよび白金をベースとする化学療法である。この最初の処置は患者の約７０％が最初の完全な臨床応答を達成することをもたらす一方、これらの患者の大部分は、残念ながら化学療法耐性疾患を再発する（フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）ら著、がんレター（Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ）、２０１３年、３３８巻、１４７～１５７頁；およびマッカン（ＭｃＣａｎｎ）ら著、プロスワン（ＰｌｏＳ ｏｎｅ）、２０１１年、６巻、ｅ２８０７７頁）。部分的に、再発性疾患は、他のがんタイプと同様に、総腫瘍集団内のＣＳＣの存在に帰せられてきた。実際に、卵巣ＣＳＣは、化学療法および放射線療法に対して耐性であることが同定され、示されてきた（ブルゴス－オジェダ（Ｂｕｒｇｏｓ－Ｏｊｅｄａ）ら著、がんレター（Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ）、２０１２年、３２２巻、１～７頁）。このように、再び他の形態のがんの場合のように、腫瘍集団における成熟細胞と共にＣＳＣを排除することは、再発性疾患を管理し、理想的には治癒をもたらす一番の期待を提供する。
本発明の一部の実施形態では、卵巣ＣＳＣは、卵巣がん処置のために標的とし得る。ＣＤ１３３は、推定上の卵巣ＣＳＣマーカーの中で最も広範に研究されているが、上記で考察するようにＳＴｎの公知の担体であるＣＤ４４は、卵巣がんと関連しており、卵巣ＣＳＣを同定する一連のマーカーに含まれることが認識されている（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、がんリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００８年、６８巻、４３１１～４３２０頁；フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）ら著、がんレター（Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ）、２０１３年、３３８巻、１４７～１５７頁；およびゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）、がん（Ｃａｎｃｅｒ）、２０１１年、１１巻、２５４～２６７頁）。さらに、ＳＴｎは、周知の卵巣がんバイオマーカーであるＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６）上、およびＭＵＣ１上で発現しており、血清中のこれらのＳＴｎ関連ムチンのレベルは、がんに対して良性の卵巣疾患のさらなる区別する要因として最近使用されてきた。ＳＴｎの血清レベルの上昇は卵巣がん患者の約５０％において起こり、より低い５年生存率と相関する（コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら著、臨床腫瘍学ジャーナル：米国臨床腫瘍学会の学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、１９９１年、９巻、９８３～９８７頁；コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら著、臨床腫瘍学ジャーナル：米国臨床腫瘍学会の学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、１９９２年、１０巻、９５～１０１頁；およびＣｈｅｎ（チェン）ら著、プロテオームリサーチジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年、１２巻、１４０８～１４１８頁）。最後に、ヴァチパジエカル（Ｖａｔｈｉｐａｄｉｅｋａｌ）らは、ヒト原発性卵巣癌ＣＳＣおよび非ＣＳＣ集団の間の識別的遺伝子発現の研究において、ＳＴｎを生じさせるシアリルトランスフェラーゼＳＴ６ＧａｌＮＡｃ－Ｉの発現が、２つのコンパートメントからの細胞の間で異ならなかったことが見出された。
一部の実施形態では、本発明は、ＣＳＣに関連するがんを予防するか、制御するか、または治癒させるためにＣＳＣを標的とするための抗体を提供する。このような抗体は、これらに限定されないが、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／６００７９号パンフレットに記載されたもののいずれかを含めた（または記載されたもののいずれかに由来する）抗ＳＴｎ抗体を含み得る。３Ｆ１および／またはヒト化誘導体からのＣＤＲを有する組換え抗体を含めたさらなる抗ＳＴｎ抗体は、抗体３Ｆ１（ＳＢＨサイエンスＳＢＨ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ナティック、ＭＡ）またはその誘導体を含み得る。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、他の形態の処置に対して耐性である卵巣がん幹細胞を標的とするために使用し得る。このような処置は、化学療法を含み得る。化学療法による処置は、本明細書に記載されているもののいずれかを含んでもよく、これらに限定されないが、カルボプラチンおよび／またはパクリタキセルによる処置が含まれてもよい。化学療法耐性卵巣がん幹細胞を標的とする方法は、化学療法による処置の後に起こる卵巣がん幹細胞における細胞表面グリカン発現の変化を利用し得る。場合によって、化学療法耐性卵巣がん幹細胞は、化学療法による処置の前および／または後にＳＴｎを発現する。化学療法による処置の後、いくつかの化学療法耐性卵巣がん幹細胞は、増殖し、これらの細胞を周囲の細胞と区別する、１つもしくは複数の細胞表面グリカン（例えば、ＳＴｎ）を発現している腫瘍細胞の集団をもたらし得る。これらに限定されないが、本明細書において提示するものを含めた抗グリカン抗体は、これらの区別をつけるグリカンを標的とすることによって、卵巣がん幹細胞のこのような集団を死滅させるために使用し得る。場合によって、抗ＳＴｎ抗体は提供し得る。このような抗体には、これらに限定されないが、本明細書に記載されている抗体のいずれかが含まれてもよい。場合によって、このような抗体は、ヒトまたはヒト化である少なくとも１つの可変ドメインを有し得る。一部の実施形態では、１つもしくは複数の化学療法耐性卵巣がん肝細胞を有する対象は、カルボプラチンおよび／またはパクリタキセルによる処置に後で、本発明の抗ＳＴｎ抗体で処置し得る。
結腸直腸がん
結腸直腸がん（ＣＲＣ）は４番目に多い発生率を有し、現在米国におけるがんに関連する死亡の第３の主要原因である。現在、患者の２０％は転移性疾患と診断されており、ＣＲＣを有する患者の概ね５０％は転移を最終的に発生させる。転移性疾患と診断された者について、５年生存率は、１３．１％である。転移性結腸がん（ｍＣＲＣ）を有する患者において、治療用抗体（例えば、モノクローナル抗体）、例えば、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体および抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の使用について先行事例がある。
一部の実施形態では、本開示のグリカン相互作用抗体を使用して、ＣＲＣおよび／またはｍＣＲＣを処置し得る。場合によって、このようなグリカン相互作用抗体は、これらに限定されないが、本明細書に記載されているもののいずれかを含めた抗ＳＴｎ抗体である。ＣＲＣおよび／またはｍＣＲＣを処置するために使用されるグリカン相互作用抗体は、細胞毒性剤（例えば、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）とコンジュゲートし得る。グリカン相互作用抗体は、他の治療、例えば、化学療法剤（例えば、フルロピリミジン、オキサリプラチン、および／もしくはイリノテカン）ならびに／または治療用抗体（例えば、ベバシズマブおよび／もしくは抗ＥＧＦＲ）による治療と組み合わせて使用し得る。
一部の実施形態によれば、結腸直腸がんを処置するために使用されるグリカン相互作用抗体は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し得る。例えば、抗体は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し得る。
併用がん療法
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、１つもしくは複数のさらなる形態のがん処置と合わせ得る。場合によって、このようなさらなる形態は、化学療法処置を含み得る。したがって、本発明のいくつかの方法は、がんを有する対象に少なくとも１種の化学療法剤を投与し、グリカン相互作用抗体を投与することによって、がんを処置する方法を含む。このような抗体は、本明細書に記載されている抗ＳＴｎ抗体を含み得る。
本明細書において使用する場合、用語「化学療法」は、化学物質を使用した処置の一形態を指す。このような化学物質は、本明細書において、「化学療法剤」と称される。がんの処置において、化学療法剤は、がん細胞の増殖を遅延させるか、または阻害する薬剤である。
一部の実施形態では、本発明の化学療法剤は、核酸拮抗剤であり得る。このような薬剤は主に、増殖性細胞、例えば、がん細胞に影響を与え、典型的には、ＤＮＡ修復および／または合成を撹乱することによって機能する。場合によって、核酸拮抗剤は、アルキル化剤（例えば、二官能性アルキル化薬または単官能性アルキル化薬）である。アルキル化剤は、分裂細胞におけるＤＮＡ合成を撹乱するために使用し得る反応性化合物である。本発明のアルキル化剤には、これらに限定されないが、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロランブシル、メルファラン、デカルバジン、ニトロソ尿素、およびテモゾロミドが含まれてもよい。
他の実施形態では、本発明の核酸拮抗剤は、アントラサイクリンを含み得る。アントラサイクリンは、核酸合成を撹乱する細菌由来の化合物である。本発明のアントラサイクリンには、これらに限定されないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシンが含まれてもよい。一部の実施形態では、アントラサイクリンは、リポソームにカプセル化し得る。
さらなる実施形態では、核酸拮抗剤は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤および／またはトポイソメラーゼ阻害剤であり得る。これらの阻害剤は、ＤＮＡ合成および修復のために必要とされるＤＮＡ高次コイル形成における変化を防止する。トポイソメラーゼＩの阻害剤には、これらに限定されないが、イリノテカンおよびトポテカンが含まれてもよい。トポイソメラーゼＩＩの阻害剤には、これらに限定されないが、エトポシド、テニポシド、およびタフルポシドが含まれてもよい。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤には、これらに限定されないが、ボリノスタットおよびロミデプシンが含まれてもよい。
一部の実施形態では、本発明の核酸拮抗剤は、ヌクレオチド類似体および／またはヌクレオチド前駆体類似体を含み得る。増殖性細胞は、結果として生じた娘細胞中の核酸中への組込みのためにヌクレオチドを必要とする。ヌクレオチド類似体は、このような核酸の形成を撹乱するか、またはこれらを非機能性とし得る。本発明のヌクレオチド類似体には、これらに限定されないが、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メソトレキセート、およびチオグアニンが含まれてもよい。一部の実施形態では、ロイコボリンは、これらの効果を増進し、かつ／または有害な副作用を低減させるために、ヌクレオチド類似体と共に投与される。
一部の実施形態では、本発明の核酸拮抗剤は、白金をベースとする薬剤である。これらの薬剤は、核酸を架橋することによってこれらを撹乱する。本発明の白金をベースとする薬剤には、これらに限定されないが、オキサリプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチンが含まれてもよい。
場合によって、本発明の化学療法剤は、細胞骨格撹乱剤を含む。活発に分裂している細胞は、これらの化合物によって撹乱し得る主要な細胞骨格の変化を起こす。本発明の細胞骨格撹乱剤には、これらに限定されないが、ビンカアルカロイド、エポチロン、パクリタキセル、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（注射用懸濁剤のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子）、およびドセタキセルが含まれてもよい。
増殖性がん細胞を標的とするのに有効ではあるが、化学療法剤は、いくつかの非がん性細胞にも影響を与えることが多い。このために、これらの投与は典型的には、用量、処置の長さ、または処置のエリアによって制限される。さらに、化学療法剤は主に増殖性細胞に影響を与えるため、非増殖性がん幹細胞は、処置の後に生存可能であり続けることがあり、がん性細胞を再編成することができる。したがって、一部の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１種の化学療法剤ががんを有する対象に最初に投与され、それに続いて、グリカン相互作用抗体が投与される、がんを処置する方法を含む。場合によって、グリカン相互作用抗体は、化学療法耐性細胞と会合している特異的細胞表面グリカンを標的とするように選択される。本明細書において使用する場合、用語「化学療法耐性」は、化学療法による処置によって影響をされないか、または化学療法による処置に対して限定された感受性を有する細胞を指すために使用される。
化学療法耐性細胞（例えば、化学療法耐性がん幹細胞）を標的とする方法は、化学療法による処置の後に起こるこれらの細胞におけるＳＴｎ発現の変化を利用し得る。場合によって、化学療法耐性細胞は、化学療法による処置の前および／または後にＳＴｎを発現している。場合によって、化学療法耐性細胞における細胞表面ＳＴｎ発現は、化学療法による処置に続いて増加し得る［例えば、ＳＴｎ合成に関与している因子（例えば、ＳＴｎＧａｌＮＡｃ Ｉ、Ｔ－シンターゼ、もしくはＣｏｓｍｃ）の発現の変化、分解の減少、または細胞表面ＳＴｎ発現の増加をもたらす他の機序による］。化学療法による処置の後、細胞表面ＳＴｎを発現しているいくつかの化学療法耐性細胞は増殖して、化学療法耐性であるＳＴｎを発現している腫瘍細胞の集団をもたらし得る。一部の実施形態では、抗ＳＴｎ抗体を使用して、化学療法耐性細胞を標的とし得る。場合によって、これらの細胞は、がん幹細胞である。したがって、本発明の方法は、１種もしくは複数の化学療法剤の投与の後に存在するＳＴｎを発現している化学療法耐性細胞を標的とするために抗ＳＴｎ抗体を投与する方法を含み得る。
化学療法耐性細胞上の細胞表面グリカンの同定は、これらの細胞を周囲の細胞から区別する細胞表面グリカンの同一性のために、化学療法による処置の後、化学療法耐性細胞を分析することによって行い得る。一部の実施形態では、このような細胞表面グリカンには、これらに限定されないが、ムチン関連抗原（これらに限定されないが、Ｔｎ、ＳＴｎおよびトムゼン－フリーデンライヒ抗原を含めた）、血液型ルイス関連抗原［これらに限定されないが、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ルイスＸ（ＬｅＸ）、シアリルルイスＸ（ＳＬｅＸ）およびシアリルルイスＡ（ＳＬｅＡ）を含めた］、スフィンゴ糖脂質関連抗原［これらに限定されないが、グロボＨ、ステージ特異的胎児抗原－３（ＳＳＥＡ－３）およびシアル酸を有するスフィンゴ糖脂質を含めた］、ガングリオシド関連抗原［これらに限定されないが、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、フコシルＧＭ１およびＮｅｕ５ＧｃＧＭ３を含めた］、ならびにポリシアル酸関連抗原が含まれてもよい。このような抗原の多くは、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１５０５４６００号パンフレットに記載されている。化学療法の後に残存するがん幹細胞上に発現している細胞表面グリカンを同定するために行われる分析は、当技術分野において公知の任意の方法によって行い得る。場合によって、このような分析は、組織試料を得て、１つもしくは複数の免疫学的アッセイ（例えば、免疫組織化学分析、ＥＬＩＳＡ分析、フローサイトメトリー分析、抗体アレイ、または質量分析法）を使用して組織試料中の細胞表面グリカンの発現についてアセスメントすることによって行う。
一部の実施形態では、化学療法耐性細胞を分析して、細胞表面ＳＴｎの発現レベルをアセスメントする。これは、組織試料を得て、細胞表面ＳＴｎの発現について試料を分析する［例えば、１つもしくは複数の免疫学的アッセイ（例えば、免疫組織化学分析、ＥＬＩＳＡ分析、フローサイトメトリー分析、抗体アレイ、または質量分析法）を使用した］ことによって行い得る。化学療法耐性細胞がＳＴｎを発現している場合、抗ＳＴｎ抗体は、化学療法剤の投与の後で対象に投与し得る。
一部の実施形態では、１つもしくは複数の腫瘍は、腫瘍と少なくとも１種の化学療法剤とを接触させることによって、１種もしくは複数のグリカン相互作用抗体による処置のために予備刺激される。このような実施形態によると、グリカン相互作用抗体処置のために腫瘍を予備刺激することは、腫瘍における増殖性細胞を低減させ、１つもしくは複数の化学療法耐性腫瘍細胞を残すことを指す。このような方法によると、グリカン相互作用抗体は、１種もしくは複数の化学療法剤による処置の後に残る化学療法耐性細胞を排除することによって、腫瘍体積をさらに低減させるために使用し得る。
１種もしくは複数の化学療法剤の投与の後のグリカン相互作用抗体の投与は、１種もしくは複数の化学療法剤による処置の後、約１日～約１年行い得る（例えば、約１日～約１０日、１週間～約４週間、約２週間～約１０週間、約１カ月～約３カ月、約２カ月～約６カ月、または約３カ月～約１２カ月）。場合によって、グリカン相互作用抗体の投与は、１種もしくは複数の化学療法剤による処置の後、少なくとも１年行い得る。
一部の実施形態では、１種もしくは複数の化学療法剤による複数のラウンドの投与は、グリカン相互作用抗体の投与が続き得る（例えば、２ラウンド、３ラウンド、４ラウンド、５ラウンド、６ラウンド、７ラウンド、８ラウンド、９ラウンド、１０ラウンド、または少なくとも１０ラウンド）。場合によって、組織分析によってがん性細胞および／または化学療法耐性細胞が低減または排除されたことが明らかにされるまで処置のラウンドは繰り返される。
化学療法剤の用量は、処置を受けている対象のサイズに基づいて調節し得る。一部の実施形態では、用量は、カルボ（Ｃａｌｖｏ）ら、２０１４年（カルボ，Ｅ．（Ｃａｌｖｏ，Ｅ．）ら著、２０１４年、化学療法剤、およびこれらの使用、投与量、および毒性（Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，ｄｏｓａｇｅｓ，ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ．）、がんネットワーク（Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ．）、１～１２頁）によって記載されているものを含む。場合によって、用量は、処置される対象の表面積に基づいて調節される［典型的には、平方メートル（ｍ２）で測定される］。本発明の化学療法剤は、約０．０１ｍｇ／ｍ２～約１ｍｇ／ｍ２、約０．１ｍｇ／ｍ２～約５ｍｇ／ｍ２、約１ｍｇ／ｍ２～約２０ｍｇ／ｍ２、約１０ｍｇ／ｍ２～約１００ｍｇ／ｍ２、約５０ｍｇ／ｍ２～約５００ｍｇ／ｍ２、約２００ｍｇ／ｍ２～約２０００ｍｇ／ｍ２、または約１０００ｍｇ／ｍ２～約１００００ｍｇ／ｍ２の用量で投与し得る。場合によって、本発明の化学療法剤は、少なくとも１００００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。いくつかの方法によると、化学療法剤は、静脈内に投与される。
一部の実施形態では、化学療法剤の投与は、カルボプラチンの投与を含む。いくつかの方法によると、カルボプラチンは、約２００ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。一部の実施形態では、化学療法剤の投与は、パクリタキセルの投与を含む。いくつかの方法によると、パクリタキセルは、約２０ｍｇ／ｍ２～約３００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
一部の実施形態では、本開示のグリカン相互作用抗体は、抗血管新生治療（例えば、ベバシズマブ）と組み合わせて投与される。一部の実施形態によれば、がん処置を必要としている対象（対象は、少なくとも１種のポリ－ＡＤＰ－リボースポリメラーゼ阻害剤による処置に対して完全に応答性ではないがんを有する）を同定し、抗ＳＴｎ抗体を対象に投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。このような抗ＳＴｎ抗体は、当技術分野において公知であるか、または本明細書に記載されているもののいずれかを含み得る。
免疫関連標的
一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、免疫調節性抗体であり得る。本明細書において使用する場合、免疫調節性抗体は、１つもしくは複数の免疫機能または経路を増進または抑制する抗体である。
多くの細菌グリカンはシアル酸を含むことが公知である。場合によって、このようなグリカンは、細菌が、これらに限定されないがヒトを含めた宿主の先天性免疫系を逃れることを許容する。一例では、細菌グリカンは、Ｈ因子認識によって代替の補体経路活性化を阻害する。別の例では、細菌グリカンは、抗原性であり得る根底にある残基をマスクする。いくつかの細菌グリカンは、特定のシアル酸付加部分を含む実体への免疫応答を弱める阻害性シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（シグレック）の活性化によって細胞シグナル伝達事象に関与する（チェン，Ｘ．（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、シアル酸の生物学および化学の進展（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＡＣＳケミカルバイオロジー（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．）、２０１０年２月１９日；５巻（２号）：１６３～７６頁）。一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、細菌グリカンと関連する免疫合併症を処置するために使用し得る。
本明細書に記載のようなＮｅｕ５Ｇｃの外来性の性質によって、いくつかのＮｅｕ５Ｇｃグリカンは、これらのグリカンが発現し得る細胞および他の実体の免疫関連の破壊をもたらすように免疫原性である。このような自己免疫性の破壊は、病原性であり得る。一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃグリカンと関連する自己免疫障害を患っている患者を処置するために使用し得る。
一部の実施形態では、本発明の免疫調節性抗体は、Ｔ細胞が媒介する免疫を促進または抑制するために使用し得る。このような抗体は、Ｔ細胞、Ｔ細胞関連タンパク質および／またはＴ細胞と相互作用する１つもしくは複数の他の細胞型上に存在する１種もしくは複数のグリカンと相互作用し得る。Ｔ細胞が媒介する免疫を増進する免疫調節性抗体は、Ｔ細胞が媒介するがん細胞の標的化を刺激するために使用し得る。
いくつかの腫瘍において、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）による浸潤は、免疫抑制促進腫瘍細胞の生存および成長をもたらし得る。これは、ＴＡＭ上に存在する骨髄Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）と腫瘍関連ムチンとの間の相互作用から生じる免疫抑制細胞シグナル伝達によるものと考えられる（アラベナ，Ｐ．，Ｐ．（Ａｌｌａｖｅｎａ，Ｐ．）ら著、臨床および発生免疫学（Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２０１０年；２０１０年：５４７１７９頁）。一部の実施形態では、１種もしくは複数の腫瘍関連ムチンまたはＴＡＣＡへの本発明の免疫調節性抗体の結合は、ＴＡＭにおいて免疫抑制細胞シグナル伝達を防止する。
抗ウイルス用途
一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、ウイルスを標的とし得る。ウイルスコートタンパク質およびウイルス外被は、本明細書においてウイルス表面グリカンと称されるグリカンを含むことが多い。このようなグリカンは、グリカン相互作用抗体の標的であり得る。一部の実施形態では、ウイルス表面グリカンは、シアリル－ＳＴｎを含む。さらなる実施形態では、ウイルス表面グリカンは、ＧｃＳＴｎを含み得る。グリカン相互作用抗体によって標的とし得るウイルスには、これらに限定されないが、ＨＩＶ、インフルエンザ、ライノウイルス、水痘帯状疱疹、ロタウイルス、ヘルペス（例えば、１型および２型）、肝炎（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型）、黄熱病ならびにヒトパピローマウイルスが含まれる。
他の治療用途
一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、タンパク分解事象を変化させるか、または制御するように作用し得る。一部の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、標的への結合の前に細胞中に内部移行し得る。
獣医学用途
本発明のグリカン相互作用抗体は、ヒトではない脊椎動物のケアおよび処置を含めた獣医学のケアの領域において有用性を見出すことが意図されている。本明細書に記載のように、用語「ヒトではない脊椎動物」は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を例外として、野生種および飼い慣らされた種、例えば、ペット動物および家畜を含めた全ての脊椎動物を含む。ヒトではない脊椎動物は、哺乳動物、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、およびヤクを含む。家畜は、材料、例えば、食物、労働、および誘導製品、例えば、繊維および化学物質を生産するために農業の状況において飼育された飼い慣らされた動物を含む。一般に、家畜は、潜在的な農業の重要性を有する全ての哺乳動物、鳥類および魚を含む。特に、四つ足の食肉処理動物は、去勢ウシ、若雌ウシ、雌ウシ、子ウシ、雄ウシ、ウシ、ブタおよびヒツジを含む。
バイオプロセシング
本発明の一部の実施形態は、細胞と、遺伝子発現をモジュレートするか、または産生されるグリカンのレベルおよび／もしくはタイプを変更することができる１種もしくは複数のグリカン相互作用抗体（例えば、抗体または融合タンパク質）とを接触させることによって、宿主細胞において生物由来物を産生する方法であり、このようなモジュレーションまたは変更は、生物由来産物の産生を増進する。本発明によれば、バイオプロセシング方法は、本発明のグリカン相互作用抗体の１つもしくは複数を使用することによって改善し得る。これらはまた、１種もしくは複数のグリカン相互作用抗体を補充するか、置き換えるか、または加えることによって改善し得る。
診断
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、診断として使用し得る。場合によって、本発明の抗体は、標的抗原を発現している細胞、組織、器官などを同定、標識または染色するために使用し得る。さらなる実施形態では、本発明の抗体は、がん性細胞を有することが公知であるかまたは疑われている組織を含めた組織切片（すなわち、組織学的組織切片）中に存在するＳＴｎを同定するために使用し得る。本発明の抗体を使用するこのような方法は、場合によって、組織切片においてがん性細胞または腫瘍を同定するために使用し得る。組織切片は、これらに限定されないが、乳房、結腸、膵臓、卵巣、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、皮膚、胃、腸、食道、または骨を含めた任意の組織または器官からでよい。
一部の実施形態では、本発明の診断法は、免疫組織化学技術を使用した１つもしくは複数の細胞または組織の分析を含み得る。このような方法は、本明細書に記載されているグリカン相互作用抗体のいずれかの１つもしくは複数の使用を含み得る。本発明の免疫組織化学法は、１つもしくは複数のグリコシル化されたタンパク質または他のマーカーの存在および／またはレベルを決定するための組織切片の染色を含み得る。組織切片は、対象腫瘍（例えば、患者の腫瘍および動物の腫瘍、例えば、動物モデルの腫瘍）に由来し得る。組織切片は、ホルマリン固定したか、もしくは固定していない新鮮な凍結した組織から由来し得る。場合によって、組織切片は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から由来し得る。本明細書に記載されているグリカン相互作用抗体は、一次抗体として使用し得る。一次抗体は、組織切片を直接接触させ、標的エピトープに結合するために使用される。一次抗体は、検出可能な標識と直接コンジュゲートし得るか、または検出剤、例えば、二次抗体の使用によって検出し得る。一部の実施形態では、一次抗体または検出剤は、目に見える生成物（例えば、沈殿物）を生じさせるために基質と反応させるために使用することができる酵素を含む。このような酵素には、これらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、およびカタラーゼが含まれてもよい。
本明細書に記載されている抗ＳＴｎ抗体は、組織または細胞におけるＳＴｎ－グリコシル化されたタンパク質を検出するために本開示の免疫組織化学法によって使用し得る。場合によって、これらの抗体は、腫瘍組織におけるＳＴｎのレベルを検出および／または決定するために使用される。このような腫瘍組織は、腫瘍マイクロアレイ中に含まれる腫瘍組織を含み得る。適切な腫瘍タイプは、これらに限定されないが、乳房、結腸、卵巣、膵臓、皮膚、腸、肺、および脳の腫瘍を含む。免疫組織化学染色技術において使用される抗ＳＴｎ抗体のレベルは、目に見える染色を増加させるか、または染色のバックグラウンドレベルを減少させるために変化し得る。一部の実施形態では、約０．０１μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの抗体濃度を使用する。例えば、約０．０１μｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約０．０５μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約３μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ～約２５μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ～約３０μｇ／ｍｌ、または約５μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの抗体濃度を使用し得る。
一部の実施形態では、本発明の診断法は、ＳＴｎ－連結糖タンパク質プロファイルを生じさせる方法を含む。本明細書において使用する場合、用語「ＳＴｎ－連結糖タンパク質プロファイル」は、試料または対象中のＳＴｎ－連結糖タンパク質のレベルおよび／または同一性を示す一連の情報を指す。ＳＴｎ－連結糖タンパク質プロファイルを生じさせる方法は、対象から得た試料上で行い得る。このような試料は、これらに限定されないが、本明細書に記載されているもののいずれかを含めた生体試料であり得る。生体試料は、細胞試料であり得る。場合によって、細胞試料は、少なくとも１個の腫瘍細胞を含み得る。一部の実施形態では、腫瘍細胞試料は、ＢＲＣＡ１変異腫瘍細胞または非ＢＲＣＡ１変異腫瘍細胞を含み得る。
ＳＴｎ－連結糖タンパク質プロファイルに含まれる糖タンパク質には、これらに限定されないが、がん細胞マーカー、幹細胞マーカー、がん幹細胞マーカー、および幹細胞関連タンパク質が含まれてもよい。一部の実施形態では、ＳＴｎ－連結糖タンパク質プロファイルの部分として同定および／または定量化される糖タンパク質には、これらに限定されないが、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ１１７、インテグリン、ノッチ、およびヘッジホッグが含まれてもよい。
ＳＴｎ－連結糖タンパク質プロファイルにおけるＳＴｎ－連結糖タンパク質のレベルおよび／またはアイデンティティーは、タンパク質を同定し、かつ／またはタンパク質レベルを定量化するための当技術分野において公知の任意の方法によって決定し得る。一部の実施形態では、このような方法には、これらに限定されないが、質量分析法、アレイ分析（例えば、抗体アレイまたはタンパク質アレイ）、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫沈降、およびＥＬＩＳＡが含まれてもよい。ＳＴｎ－連結糖タンパク質は、場合によって、分析の前に試料から免疫沈降し得る。このような免疫沈降は、抗ＳＴｎ抗体を使用して行い得る。ＳＴｎ－連結糖タンパク質の免疫沈降のために使用される抗ＳＴｎ抗体は、当技術分野において公知または本明細書に記載されているもののいずれかを含み得る。一部の実施形態では、ＳＴｎ－糖タンパク質は、抗ＳＴｎ抗体を使用して生体試料から免疫沈降し、次いで、質量分析法を使用して同定および／または定量化される。
一部の実施形態では、がん処置は、ＳＴｎ－連結糖タンパク質プロファイル情報によって情報を得られる。したがって、本開示は、がん処置を必要としている対象から試料を得ることと、試料からＳＴｎ－連結糖タンパク質プロファイルを生じさせることと、ＳＴｎ－連結糖タンパク質プロファイルからＳＴｎ－グリコシル化されたタンパク質に結合するグリカン相互作用抗体を選択することと、対象にグリカン相互作用抗体を投与することとを含む、がんを処置する方法を提供する。このような方法によって投与されるグリカン相互作用抗体は、本明細書において教示される１つもしくは複数のＣＤＲまたは可変ドメインを含み得る。
一部の実施形態では、本開示の方法は、コンパニオン診断として使用し得る。本明細書において使用する場合、用語「コンパニオン診断」は、その結果が対象の診断または処置において助けるアッセイを指す。コンパニオン診断は、患者の疾患、障害または状態の重症度レベルを層別化し、処置レジメンおよび用量のモジュレーションを可能としてコストを低減させ、臨床治験の期間を短縮し、安全性を増加させ、かつ／または有効性を増加させるために有用であり得る。コンパニオン診断は、疾患、障害または状態の発生を予想し、かつ予防治療の処方を助けるために使用し得る。いくつかのコンパニオン診断は、１つもしくは複数の臨床治験のために対象を選択するために使用し得る。場合によって、コンパニオン診断アッセイは、処置の最適化を促進する特定の処置と提携し得る。
一部の実施形態では、本開示の方法は、がんに関連する疾患、障害および／もしくは状態のためのコンパニオン診断として有用である。本発明のいくつかのコンパニオン診断は、１つもしくは複数の形態のがんの重症度を予想および／または決定するために有用であり得る。本発明のいくつかのコンパニオン診断は、がんの１つもしくは複数の形態を発生する危険性によって対象を層別化するために使用し得る。本発明のいくつかのコンパニオン診断は、がん治療のための薬物開発を促進および早めるために使用し得る。
ＳＴｎ発現－改変された細胞
一部の実施形態では、本開示は、変化したＳＴｎレベルを有する改変された細胞を提供する。このような細胞は、様々な目的（例えば、実験、治療、抗体試験など）のために使用し得る。場合によって、本開示の方法は、１つもしくは複数の細胞または組織においてＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉの発現を増進させる方法を含む。これは、細胞のＳＴｎ（例えば、表面に発現したＳＴｎ）の増加した発現を有する１つもしくは複数の細胞が生じることをもたらし得る。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉの発現は、例えば、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ発現構築物を担持する１つもしくは複数のベクターを導入することによって増進し得る。このような発現構築物は、天然ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉプロモーターと共にまたは遺伝子発現を増進するプロモーターと共に設計し得る。遺伝子発現の増進のために構成されたプロモーターは、恒常的または過度に活性のプロモーターエレメントを有し得る。場合によって、プロモーターは、誘導性遺伝子発現のために構成し得る。このようなプロモーターは、プロモーターの誘導性エレメントを活性化する因子と接触したときに、活性となるか、または上昇した活性を有し得る。ＳＴｎ発現構築物は、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ジュリアン，Ｓ．（Ｊｕｌｉｅｎ，Ｓ．）ら著、２００１年、グリココンジュゲートジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ）、１８巻：８８３～９３頁に記載されているように、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ ｐＲｃ－ＣＭＶを含み得る。一部の実施形態では、発現構築物は、ＳＴｎ合成および／または発現に関与する他の因子をコードし得る。このような因子には、これらに限定されないが、Ｔ－シンターゼ、およびコア１ベータ３－ガラクトシルトランスフェラーゼ特異的分子シャペロン（ＣＯＳＭＣ）が含まれてもよい。一部の実施形態では、最小のＳＴｎ発現を伴う細胞は、ＳＴｎ発現細胞に変換される。このような細胞には、これらに限定されないが、ＳＫＯＶ３細胞、ＢＲＣＡ１変異細胞、および非変異ＢＲＣＡ１細胞が含まれてもよい。
また提供するのは、改変されていない細胞に対して減少したＳＴｎ発現を有する改変された細胞である。したがって、本開示の方法は、ＳＴｎ発現を抑圧する方法を含む。このような方法は、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ発現を低減させることを含み得る。一部の実施形態では、このような方法は、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ発現を抑圧する１個もしくは複数の核酸分子の投与を含み得る。このような核酸分子には、これらに限定されないが、阻害性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉまたはサイレンサーｓｉＲＮＡ）が含まれてもよい。一部の実施形態では、ＳＴｎ合成および／または発現に関与する他の因子は、低減させ得る。このような因子には、これらに限定されないが、Ｔ－シンターゼおよびＣＯＳＭＣが含まれてもよい。一部の実施形態では、ＳＴｎを天然に発現している細胞は、ＳＴｎ欠乏性細胞に変換される。このような細胞には、これらに限定されないが、ＯＶＣＡＲ３細胞およびＯＶＣＡＲ４細胞が含まれてもよい。
ＩＩＩ．医薬組成物
一部の実施形態では、本開示は、医薬組成物を含む。このような医薬組成物は、本開示の抗体、および／またはこのような抗体に由来するフラグメント、ペプチド、もしくはタンパク質を含み得る。医薬組成物は、バイオアベイラビリティー、治療濃度域および／または分布容積の１つもしくは複数によって特徴付けられてもよい。
バイオアベイラビリティー
グリカン相互作用抗体は、本明細書に記載のような送達剤／製剤化剤またはビヒクルと共に組成物中に製剤化されるとき、本明細書に記載のような送達剤を欠いている組成物と比較して、バイオアベイラビリティーの増加を示すことができる。本明細書において使用する場合、用語「バイオアベイラビリティー」は、哺乳動物に投与された所与の量のグリカン相互作用抗体の全身的アベイラビリティーを指す。バイオアベイラビリティーは、哺乳動物への化合物の投与に続いて化合物の未変化形態の曲線下面積（ＡＵＣ）または最大血清もしくは血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測定することによってアセスメントすることができる。ＡＵＣは、横座標（Ｘ軸）に沿った時間に対する、縦座標（Ｙ軸）に沿った化合物の血清または血漿濃度をプロットする曲線下面積の決定である。一般に、特定の化合物についてのＡＵＣは、当業者には公知の方法を使用して、および参照により本明細書中に組み込まれているＧ．Ｓ．バンカー（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ）、現在の薬剤学、薬物および薬学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第７２巻、マルセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク社（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．），１９９６年に記載されているように計算することができる。
Ｃｍａｘ値は、哺乳動物への化合物の投与に続いて哺乳動物の血清または血漿において達成される化合物の最高濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者には公知の方法を使用して測定することができる。語句「バイオアベイラビリティーを増加させる」または「薬物動態を改善する」は、本明細書において使用する場合、哺乳動物においてＡＵＣ、Ｃｍａｘ、またはＣｍｉｎとして測定されるグリカン相互作用抗体の全身的なアベイラビリティーが、このような同時の投与が起こらないときより、本明細書に記載のような送達剤と同時投与したときより大きいことを意味する。一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体のバイオアベイラビリティーは、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加させることができる。
治療濃度域
グリカン相互作用抗体は、本明細書に記載のような送達剤を有する組成物中に製剤化されたとき、本明細書に記載のような送達剤を欠いている本明細書に記載のような送達剤を欠いている投与されたグリカン相互作用抗体組成物の治療濃度域と比較して、投与されたグリカン相互作用抗体組成物の治療濃度域の増加を示すことができる。本明細書において使用する場合、「治療濃度域」は、作用の部位における、治療的活性物質の血漿濃度の範囲、またはレベルの範囲を指し、治療効果を引き出す高確率を伴う。一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体の治療濃度域は、本明細書に記載のような送達剤と同時投与するとき、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加させることができる。
一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、投与後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも１４日、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも６カ月、または少なくとも１年の間、対象試料中で検出可能である。抗体が細胞毒性剤（例えば、ＭＭＡＥ）とコンジュゲートされている場合、薬物と抗体の比（ＤＡＲ）は、依然として安定的であり得る。場合によって、ＤＡＲは、所与の期間（例えば、抗体レベルが対象試料中で検出可能である期間）に亘り、１％未満、５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、または７５％未満で変化し得る。
分布容積
グリカン相互作用抗体は、本明細書に記載のような送達剤を有する組成物中に製剤化されるとき、本明細書に記載のような送達剤を欠いている組成物に対して、改善された分布容積（Ｖｄｉｓｔ）（例えば、低減したか、または標的とした）を示すことができる。分布容積（Ｖｄｉｓｔ）は、体内の薬物の量を、血液または血漿中の薬物の濃度と関連付ける。本明細書において使用する場合、用語「分布容積」は、血液または血漿中と同じ濃度での体内の薬物の総量を含有するのに必要とされる液量を指し、Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物の量／血液または血漿中の薬物の濃度と等しい。例えば、１０ｍｇの用量および１０ｍｇ／Ｌの血漿濃度について、分布容積は、１リットルである。分布容積は、薬物が血管外組織中に存在する程度を反映する。大きな分布容積は、血漿タンパク質結合と比較して、組織構成要素に結合する化合物の傾向を反映する。臨床現場において、Ｖｄｉｓｔは、定常状態濃度を達成する充填用量を決定するために使用することができる。一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体の分布容積は、本明細書に記載のような送達剤と同時投与されるとき、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％減少させることができる。
一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体は、１種もしくは複数の薬学的に許容される添加剤と共に組成物および／または複合体中に含まれる。医薬組成物は、１種もしくは複数のさらなる活性物質、例えば、治療的および／または予防的活性物質を任意選択で含み得る。医薬品の製剤化および／または製造における全般的な考察は、例えば、レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッピンコットウィリアムズアンドウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照により本明細書中に組み込まれている）において見出し得る。
一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、語句「活性成分」は一般に、本明細書に記載のように送達されるグリカン相互作用抗体を指す。
本明細書において提供される医薬組成物の説明は、ヒトへの投与に適した医薬組成物を主に対象としているが、このような組成物は一般に、任意の他の動物、例えば、ヒトではない動物、例えば、ヒトではない哺乳動物への投与に適していることを当業者は理解する。組成物を様々な動物への投与に適したものとするためのヒトへの投与に適した医薬組成物の改変はより理解されており、通常の技能の獣医学の薬理学者は、もしあれば単に通常の実験法によってこのような改変を設計し、かつ／または行うことができる。医薬組成物の投与が意図される対象には、これらに限定されないが、ヒトおよび／または他の霊長類；商業的に関連性のある哺乳動物を含めた哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラット；ならびに／または商業的に関連性のある鳥を含めた鳥、例えば、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウが含まれる。
本明細書に記載されている医薬組成物の製剤は、薬理学の当技術分野で公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製し得る。一般に、このような調製方法は、活性成分を添加剤および／または１種もしくは複数の他の補助成分と会合させるステップと、次いで、必要および／もしくは望まし場合、生成物を所望の単回用量もしくは複数用量単位へと分割し、形作り、かつ／もしくはパッケージするステップを含む。
本発明による医薬組成物は、バルクで、単一の単位用量として、および／または複数の単一の単位用量として調製し、パッケージし、かつ／または販売し得る。本明細書において使用する場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の別個の量である。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投与量および／またはこのような投与量の好都合な画分、例えば、このような投与量の２分の１もしくは３分の１と等しい。
本発明による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される添加剤、および／または任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、および／または状態によって、ならびにさらに組成物が投与される経路によって変化する。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、５～５０％、１～３０％、５～８０％、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。一実施形態では、活性成分は、がん細胞に向けられる抗体である。
製剤
本発明のグリカン相互作用抗体は、（１）安定性を増加させ；（２）細胞透過性を増加させ；（３）（例えば、グリカン相互作用抗体の製剤からの）持続放出もしくは遅延放出を可能とし；かつ／または（４）体内分布を変化させる（例えば、特定の組織もしくは細胞型へとグリカン相互作用抗体を標的とする）ための１種もしくは複数の添加剤を使用して製剤化することができる。伝統的な添加剤、例えば、ありとあらゆる溶媒、分散媒、賦形剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤に加えて、本発明の製剤には、これらに限定されないが、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア－シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、グリカン相互作用抗体をトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植のため）、およびこれらの組合せが含まれることができる。
添加剤
本明細書において使用する場合、用語「添加剤」は、使用前に本発明の化合物および／または組成物と合わせる任意の物質を指す。一部の実施形態では、添加剤は不活性であり、本発明の化合物および／または組成物のための担体として主に使用される、賦形剤またはビヒクルとして主に使用される。医薬組成物を製剤化するための様々な添加剤、および組成物を調製するための技術は、当技術分野において公知である（参照により本明細書中に組み込まれている、レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナーロ、リピンコット、ウィリアムズおよびウイルキンス（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルティモア、ＭＤ、２００６年を参照されたい）。
通常の添加剤媒体の使用は、任意の通常の添加剤媒体が、例えば、任意の望ましくない生物学的効果を生じさせるか、または有害な様式で医薬組成物の任意の他の構成要素（複数可）とその他の方法で相互作用することによって、物質もしくはその誘導体と不適合性であり得る限りを除いて、本開示の範囲内で意図される。
本明細書に記載されている医薬組成物の製剤は、薬理学の当技術分野で公知であるか、または今後開発される任意の方法によって調製し得る。一般に、このような調製方法は、活性成分と添加剤および／または１種もしくは複数の他の補助成分とを会合するステップ含む。
本開示による医薬組成物は、バルクで、単一の単位用量として、および／または複数の単一の単位用量として調製し、パッケージし、かつ／または販売し得る。
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される添加剤、および／または任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、および／または状態によって、ならびにさらに組成物が投与される経路によって変化し得る。
一部の実施形態では、薬学的に許容される添加剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の純度である。一部の実施形態では、添加剤は、ヒトにおける使用および獣医学での使用のために承認されている。一部の実施形態では、添加剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。一部の実施形態では、添加剤は、医薬グレードである。一部の実施形態では、添加剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の標準を満たす。
医薬組成物の製造において使用される薬学的に許容される添加剤には、これらに限定されないが、不活性な賦形剤、分散化剤および／または造粒剤、表面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、および／または油が含まれる。このような添加剤は、任意選択で医薬組成物中に含み得る。
例示的な賦形剤には、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉糖など、および／またはこれらの組合せが含まれる。
例示的な造粒剤および／または分散化剤には、これらに限定されないが、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類の果肉、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木からの生成物、海綿、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、シリケート、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル－ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物など、および／またはこれらの組合せが含まれる。
例示的な表面活性剤および／または乳化剤には、これらに限定されないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリン、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮｎ（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル－ピロリドン）、モノラウリン酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウムなど、ならびに／またはこれらの組合せが含まれる。
例示的な結合剤には、これらに限定されないが、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプン糊）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成のガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイルランドコケの抽出物、パンワールガム、ガッティガム、イサポール皮の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル－ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標））、およびカラマツアラビノガラクタン）；アルギネート；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；など；ならびにこれらの組合せが含まれる。
例示的な保存剤には、これらに限定されないが、抗酸化剤、キレート剤、抗微生物保存剤、抗真菌保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、および／または他の保存剤が含まれてもよい。例示的な抗酸化剤には、これらに限定されないが、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムが含まれる。例示的なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムを含む。例示的な抗微生物保存剤には、これらに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポル、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが含まれる。例示的な抗真菌保存剤には、これらに限定されないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が含まれる。例示的なアルコール保存剤には、これらに限定されないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、および／またはフェニルエチルアルコールが含まれる。例示的な酸性保存剤には、これらに限定されないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が含まれる。他の保存剤には、これらに限定されないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテルオキシム、セトリミド、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、および／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が含まれる。
例示的な緩衝剤には、これらに限定されないが、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオナートカルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコールなど、および／またはこれらの組合せが含まれる。
例示的な滑沢剤には、これらに限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、モルト、ベヘン酸グリセリル、硬化植物性油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびこれらの組合せが含まれる。
例示的な油には、これらに限定されないが、アーモンド、キョウニン、アボカド、ババス、ベルガモット、クロスグリ種、ルリヂサ、カデ、カモミール、キャノーラ、キャラウェー、カルナウバ、トウゴマ、ケイヒ、カカオバター、ココナツ、タラ肝、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、アマニ、ゲラニオール、ヒョウタン、グレープシード、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンディン、ラベンダー、レモン、リトシーキュービバ（ｌｉｔｓｅａ ｃｕｂｅｂａ）、マカダミアナッツ、アオイ、マンゴー種、メドウフォーム種、ミンク、ナツメッグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラッフィー、パーム、パーム核、トウニン、ピーナッツ、ケシの実、カボチャ種、ナタネ、コメ糠、ローズマリー、ベニバナ、ビャクダン、サスカナ、セイバリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、ダイズ、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、およびコムギ胚芽の油が含まれる。例示的な油には、これらに限定されないが、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはこれらの組合せが含まれる。
添加剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、および／または香料は、配合者の判断によって組成物中に存在することができる。
一部の実施形態では、本発明の抗グリカン抗体は、シトレートおよび／またはＮａＣｌを含む添加剤と共に製剤化される。このような組成物は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約２ｍＭ～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１００ｍＭ～約１，０００ｍＭのシトレートを含み得る。さらなる組成物は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２５０ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌを含み得る。
ビヒクル
リポソーム、リポプレックスおよび脂質ナノ粒子
本発明のグリカン相互作用抗体は、１種もしくは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化し得る。一実施形態では、グリカン相互作用抗体を含む医薬組成物は、リポソームをさらに含む。リポソームは、１つもしくは複数の脂質二重層を含み得る人工的に調製した小胞であり、栄養素および医薬製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用し得る。リポソームは、これらに限定されないが、直径が数百ナノメートルであり得る多重膜小胞（ＭＬＶ）などの異なるサイズのものでよく、狭い水性コンパートメントによって分離された一連の同心円状の二重層、直径が５０ｎｍ未満であり得る小さな単細胞小胞（ＳＵＶ）、および直径が５０ｎｍ～５００ｎｍであり得る大きな単膜小胞（ＬＵＶ）を含有し得る。リポソーム設計には、これらに限定されないが、不健全組織へのリポソームの付着を改善するたえに、またはこれらに限定されないが、エンドサイトーシスなどの事象を活性化するために、オプソニンまたはリガンドが含まれてもよい。リポソームは、医薬製剤の送達を改善させるために低または高ｐＨを含有し得る。
リポソームの形成は、これらに限定されないが、捕捉された医薬製剤およびリポソームの成分、脂質小胞が分散している媒体の性質、捕捉された物質およびその潜在的な毒性の有効濃度、小胞の用途および／または送達の間に関与する任意のさらなるプロセス、最適化サイズ、意図する用途のための小胞の多分散性および保存寿命、ならびに安全および効率的なリポソーム生成物の大規模な生成のバッチ間の再現性および可能性などの物理化学的特徴によって決まり得る。
一実施形態では、異なる細胞型にｉｎ ｖｉｖｏで受動的または能動的に向けられるように、このような製剤は、また構築されるか、または組成物は、変化し得る。
製剤はまた、これらに限定されないが、ホレート、トランスフェリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、および抗体標的アプローチによって例示されるように、これらの表面上の異なるリガンドの発現によって選択的に標的とすることができる。
これらの製剤は、グリカン相互作用抗体による細胞トランスフェクションを増加し得るため、リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、グリカン相互作用抗体機能の有効性を改善するために使用し得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、グリカン相互作用抗体の安定性を増加させるために使用し得る。
抗体カーゴのために特に配合されるリポソームは、当技術分野で公知の技術によって調製され、例えば、エップシュタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）らによって記載されている（エップシュタイン，Ｄ．Ａ．（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ、Ｄ．Ａ．）ら、リポソームにカプセル化されたマウスインターフェロンガンマの生物活性は細胞膜受容体によって媒介される（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．）、１９８５年６月；８２巻（１１号）：３６８８～９２頁）；ウォン（Ｈｗａｎｇ）ら（ウォン，Ｋ．Ｊ．（Ｈｗａｎｇ，Ｋ．Ｊ．）ら著、単膜スフィンゴミエリン／コレステロールリポソームの肝臓の取込みおよび分解：動力学的研究。（Ｈｅｐａｔｉｃ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ．）、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．）、１９８０年７月；７７巻（７号）：４０３０～４頁）；米国特許第４，４８５，０４５号明細書および米国特許第４，５４４，５４５号明細書。持続する循環時間を伴うリポソームの産生はまた、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に記載されている。
本発明のグリカン相互作用抗体を含むリポソームは、脂質、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびポリエチレングリコール誘導体化されているホスファチジルエタノールアミンを利用して、逆相蒸発を使用して生じさせ得る。画定した孔径を有するフィルターを使用して、所望の直径のリポソームを押し出す。別の実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）らによって記載されているように、ジスルフィド交換反応によってリポソームの外表面にコンジュゲートすることができる（マーチン，Ｆ．Ｊ．（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．）ら、事前形成された小胞への免疫グロブリンフラグメントの不可逆的カップリング。リポソーム標的化のための改善された方法。Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｏ ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．、生物化学ジャーナル（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．）、１９８２年１月１０日；２５７巻（１号）：２８６～８頁）。
ポリマーおよびナノ粒子
本発明のグリカン相互作用抗体は、天然および／または合成ポリマーを使用して配合することができる。送達のために使用し得るポリマーの非限定的例には、これらに限定されないが、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、キトサン、シクロデキストリン、およびポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマーが含まれる。これらは、生分解性であり得る。
ポリマー製剤は、グリカン相互作用抗体の持続放出または遅延放出を許容することができる（例えば、筋内または皮下注射に続いて）。グリカン相互作用抗体についての変化した放出プロファイルは、長期間に亘って、例えば、グリカン相互作用抗体の放出をもたらすことができる。ポリマー製剤はまた、グリカン相互作用抗体の安定性を増加させるために使用し得る。
ポリマー製剤はまた、これらに限定されないが、ホレート、トランスフェリン、およびＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）によって例示されるような異なるリガンドの発現によって選択的に標的化することができる（ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、生体高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．）、２０１１年、１２巻：２７０８～２７１４頁；ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．）、２００７年、１０４巻：１２９８２～１２８８７頁；デイビス（Ｄａｖｉｓ）、分子薬剤学（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．）、２００９年、６巻：６５９～６６８頁；デイビス（Ｄａｖｉｓ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、４６４巻：１０６７～１０７０頁；その内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている）。
本発明のグリカン相互作用抗体はまた、ポリマー、脂質、および／またはこれらに限定されないが、リン酸カルシウムなどの他の生分解性薬剤の組合せを使用して、ナノ粒子として製剤化することができる。構成要素は、コア－シェル、ハイブリッド、および／または層が重なった構造において合わせ、ナノ粒子の微調整を許容してもよく、グリカン相互作用抗体の送達を増進し得る。グリカン相互作用抗体について、自己アセンブルしてポリマーソームとしてまた公知であるナノメートルサイズの小胞を生理学的ｐＨにて形成するポリ（２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）－ｂｌｏｃｋ－（２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート）、（ＰＭＰＣ－ＰＤＰＡ）、ｐＨ感受性ジブロックコポリマーに基づいた系を使用し得る。これらのポリマーソームは、生細胞内で相対的に高い抗体ペイロードをうまく送達することが示されてきた。（マシグナニ（Ｍａｓｓｉｇｎａｎｉ）ら著、抗体の細胞送達：有効な標的とされる細胞内イメージングおよび新規な治療ツール（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｏｏｌ．）、ネイチャープロシーディングス（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）、２０１０年５月）。
一実施形態では、ＰＥＧ電荷変換型ポリマー（ピテラ（Ｐｉｔｅｌｌａ）ら著、生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．）、２０１１年、３２巻：３１０６～３１１４頁）は、本発明のグリカン相互作用抗体を送達するナノ粒子を形成するために使用し得る。ＰＥＧ電荷変換型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンへと切断され、それ故にエンドソームからの脱出を増進させることによって、ＰＥＧ－ポリアニオンブロックコポリマー改善し得る。
コア－シェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコアおよび様々なシェルを合成するハイスループットなアプローチにさらに焦点を合わせてきた（ジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．）、２０１１年、１０８巻：１２９９６～１３００１頁）。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内部移行は、ナノ粒子のコアおよびシェル構成要素の両方における化学組成を変化させることによって正確に制御することができる。
一実施形態では、ポリ（エチレン－ｃｏ－酢酸ビニル）のマトリックスは、本発明のグリカン相互作用抗体を送達するために使用される。このようなマトリックスは、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０巻、１４４６～１４４９頁（１９９２年）において記載されている。
抗体製剤
本発明のグリカン相互作用抗体は、静脈内投与または血管外投与のために製剤化し得る（ドアティ（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ）ら、モノクローナル抗体療法のための製剤化および送達の問題（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｓｓｕｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．）、先進的薬物送達レビュー（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．）、２００６年８月７日；５８巻（５～６号）：６８６～７０６頁、米国特許出願公開第２０１１／０１３５５７０号明細書、これらの全ては本明細書においてその全体が組み込まれている）。血管外投与経路には、これらに限定されないが、皮下投与、腹腔内投与、脳内投与、眼球内投与、病巣内投与、局所投与および筋内投与が含まれてもよい。
抗体構造は改変して、治療剤としてのこれらの有効性を改善し得る。改善には、これらに限定されないが、改善された熱力学的安定性、低減したＦｃ受容体結合特性および改善されたフォールディング効率が含まれてもよい。改変には、これらに限定されないが、アミノ酸置換、グリコシル化、パルミトイル化およびタンパク質コンジュゲーションが含まれてもよい。
グリカン相互作用抗体は抗酸化剤と共に製剤化して、抗体の酸化を低減させ得る。グリカン相互作用抗体はまた添加物と共に製剤化して、タンパク質凝集を低減させ得る。このような添加物には、これらに限定されないが、アルブミン、アミノ酸、糖、尿素、塩酸グアニジニウム、多価アルコール、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールおよびデキストラン）、界面活性剤（これらに限定されないが、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０を含めた）またはそれどころか他の抗体が含まれてもよい。
本発明のグリカン相互作用抗体は、抗体の構造および機能に対する水の影響を低減させるために配合し得る。このような製剤における抗体調製物は、凍結乾燥し得る。凍結乾燥に供する製剤は、抗体構造を保護および安定化する炭水化物またはポリオール化合物を含み得る。このような化合物には、これらに限定されないが、スクロース、トレハロースおよびマンニトールが含まれる。
本発明のグリカン相互作用抗体は、ポリマーと共に製剤し得る。一実施形態では、ポリマー製剤は、疎水性ポリマーを含有し得る。このようなポリマーは、水中油中固体カプセル化方法によってポリラクチド－ｃｏ－グリコリドと共に配合されたミクロスフィアであり得る。エチレン－酢酸ビニルコポリマーを含むミクロスフィアはまた、抗体送達のために意図され、送達の部位における抗体放出の時間経過を伸ばすために使用し得る。別の実施形態では、ポリマーは、水性ゲルであり得る。このようなゲルは、例えば、カルボキシメチルセルロースを含み得る。水性ゲルはまた、ヒアルロン酸ヒドロゲルを含み得る。抗体は、これらに限定されないが、中枢神経系の組織を含めた組織における持続送達を可能とするヒドラゾン連結を介して、このようなゲルに共有結合的に連結し得る。
ペプチドおよびタンパク質製剤
本発明のグリカン相互作用抗体は、ペプチドおよび／またはタンパク質と共に製剤化し得る。一実施形態では、これらに限定されないが、細胞透過性ペプチドおよびタンパク質、ならびに細胞内送達を可能とするペプチドなどのペプチドは、医薬製剤を送達するために使用し得る。本発明の医薬製剤と共に使用し得る細胞透過性ペプチドの非限定的例は、細胞内空間への送達を促進するポリカチオンに付着した細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドを含む（これらの全てが参照により本明細書中に組み込まれている、例えば、キャロン（Ｃａｒｏｎ）ら著、分子治療（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、３巻（３号）：３１０～８頁（２００１年）；ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ）、細胞透過性ペプチド：プロセスおよび用途（Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、ボカラトン、ＦＬ、２００２年）；Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ（エル－アンダルーシ）ら著、現在の医薬設計（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．）、１１巻（２８号）：３５９７～６１１頁（２００３年）；およびデエー（Ｄｅｓｈａｙｅｓ）ら著、細胞および分子ライフサイエンス（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．）、６２巻（１６号）：１８３９～４９頁（２００５年）を参照されたい）。組成物はまた、細胞内空間への組成物の送達を増進する細胞浸透剤、例えば、リポソームを含むように配合することができる。本発明のグリカン相互作用抗体は、細胞内送達を可能とするために、これらに限定されないが、エイルロンセラピューティクス（Ａｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ケンブリッジ、ＭＡ）およびパーミオンバイオロジクス（Ｐｅｒｍｅｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（ケンブリッジ、ＭＡ）からのペプチドおよび／またはタンパク質などのペプチドおよび／またはタンパク質と複合体化し得る（クロニカン（Ｃｒｏｎｉｃａｎ）ら著、（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）、２０１０年、５巻：７４７～７５２頁；マクノートン（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００９年、１０６巻：６１１１～６１１６頁；ソーヤー（Ｓａｗｙｅｒ）、ケミカルバイオロジー薬物設計（Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．）、２００９年、７３巻：３～６頁；バーディン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）およびヒリンスキ（Ｈｉｌｉｎｓｋｉ）、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、２０１２年；５０３巻：３～３３頁；これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）。
一実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、第１のドメインおよび第２のドメインを含み得る。第１のドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第２のドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書において使用する場合、「タンパク質結合パートナー」は、これらに限定されないが、抗体およびその機能的フラグメント、スカフォールドタンパク質、またはペプチドを含む。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーのための細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、グリカン相互作用抗体を導入し得る細胞から分泌されることができ得る。
本発明の製剤において、ペプチドまたはタンパク質は、グリカン相互作用抗体による細胞トランスフェクションを増加させるか、またはグリカン相互作用抗体の体内分布（例えば、特定の組織または細胞型を標的とすることによって）を変化させるために組込み得る。
細胞製剤
本発明のグリカン相互作用抗体組成物の細胞をベースとする製剤は、細胞トランスフェクション（例えば、細胞の担体における）を確実にするか、または（例えば、細胞担体を特定の組織または細胞型に標的とすることによって）組成物の体内分布を変化させるために使用し得る。
細胞移入方法
種々の方法は当技術分野において公知であり、ウイルスおよび非ウイルスが媒介する技術を含めて、細胞中への核酸またはタンパク質、例えば、グリカン相互作用抗体の導入に適している。典型的な非ウイルスが媒介する技術の例には、これらに限定されないが、電気穿孔、リン酸カルシウムが媒介する移入、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソームが媒介する移入、マイクロインジェクション、イクロプロジェクタイルが媒介する移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマーが媒介する移入（ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）または細胞融合が含まれる。
ソノポレーション、または細胞超音波処理の技術は、細胞形質膜の透過性を改変するための音（例えば、超音波周波数）の使用である。ソノポレーション方法は当業者に公知であり、核酸をｉｎ ｖｉｖｏで送達するために使用される（ユーン（Ｙｏｏｎ）およびパーク（Ｐａｒｋ）、エキスパートオピニオンオンドラッグデリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．）、２０１０年、７巻：３２１～３３０頁；ポステマ（Ｐｏｓｔｅｍａ）およびジルジャ（Ｇｉｌｊａ）、現在の医薬バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００７年、８巻：３５５～３６１頁；ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）およびベティンジャー（Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ）、遺伝子治療（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２００７年、１４巻：４６５～４７５頁；全ては参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれている）。ソノポレーション方法は当技術分野において公知であり、また、例えば、細菌と関連しているように、米国特許出願公開第２０１００１９６９８３号明細書において、および他の細胞型と関連しているように、例えば、米国特許出願公開第２０１００００９４２４号明細書（これらのそれぞれの全内容は参照により本明細書中に組み込まれている）において教示されている。
電気穿孔技術はまた当技術分野で周知であり、核酸をｉｎ ｖｉｖｏでおよび臨床的に送達するために使用される（アンドレ（Ａｎｄｒｅ）ら著、現在の遺伝子治療（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、１０巻：２６７～２８０頁；チアレラ（Ｃｈｉａｒｅｌｌａ）ら著、現在の遺伝子治療（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、１０巻：２８１～２８６頁；ホグマン（Ｈｏｊｍａｎ）、現在の遺伝子治療（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、１０巻：１２８～１３８頁；全ては参照により本明細書中にそれらの全体が組み込まれている）。一実施形態では、グリカン相互作用抗体は、電気穿孔によって送達し得る。
投与および送達
本発明の組成物は、当技術分野において公知の標準的な方法または経路のいずれかによって投与し得る。
本発明のグリカン相互作用抗体は、治療的に有効な成果をもたらす任意の経路によって投与し得る。これらには、これらに限定されないが、経腸、胃腸、硬膜外、経口、経皮的、硬膜外（硬膜上）、脳内（大脳中へ）、側脳室内（脳室中へ）、皮膚上への（皮膚上への適用）、皮内（皮膚自体中へ）、皮下（皮膚下）、経鼻投与（鼻を通した）、静脈内（静脈中へ）、動脈内（動脈中へ）、筋内（筋肉中へ）、心臓内（心臓中へ）、骨内注入（骨髄中へ）、くも膜下腔内（脊柱管中へ）、腹腔内（腹膜中への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（目を通した）、海綿体注射（陰茎のベース中への）、腟内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮的（全身的分布のための傷のない皮膚を通した拡散）、経粘膜的（粘膜を通した拡散）、吹送（鼻から吸い込む）、舌下、唇下、浣腸、点眼薬（結膜上への）、または点耳薬が含まれる。特定の実施形態では、組成物は、これらが血液脳関門、血管関門、または他の上皮性関門を通過することを可能とする方法で投与し得る。本発明のグリカン相互作用抗体のための非限定的な投与経路は、下記に記載する。
非経口および注射剤投与
経口および非経口投与のための液体剤形には、これらに限定されないが、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、および／またはエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用される不活性な賦形剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含み得る。不活性な賦形剤に加えて、経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および／または香料を含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態では、組成物は、可溶化剤、例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組合せと混合する。他の実施形態では、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースが含まれる。
注射用調製物、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁剤は、適切な分散化剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を使用して公知技術によって製剤化し得る。無菌注射用調製物は、無毒性の非経口的に許容される賦形剤および／または溶媒中の無菌注射用溶液剤、懸濁剤、および／または乳剤、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液としてでよい。用いてもよい許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張食塩液がある。無菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として従来通り用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含めて任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射剤の調製において使用することができる。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、および／または使用前に滅菌水または他の無菌注射用媒体に溶解もしくは分散させることができる無菌固体組成物の形態中に滅菌剤を組み込むことによって無菌化することができる。
活性成分の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延することが望ましいことが多い。これは、乏しい水溶解性を有する結晶性またはアモルファスの材料の液体懸濁剤の使用によって達成し得る。次いで、薬物の吸収の速度は、その溶解の速度によって決まり、これは、結晶サイズおよび結晶形態によって決まり得る。代わりに、非経口的に投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁させることによって達成される。注射用のデポー形態は、生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド－ポリグリコリド中に薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物とポリマーの比、および用いられる特定のポリマーの性質によって、薬物放出の速度は制御することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）を含む。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を捕捉することによって調製する。
直腸および膣投与
直腸または膣投与のための組成物は典型的には、組成物と、適切な非刺激性の添加剤、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスとを混合することによって調製することができる坐剤であり、これは周囲温度にて固体であるが、体温にて液体であり、したがって、直腸または膣腔において溶融し、活性成分を放出する。
経口投与
経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤を含む。このような固体剤形において、活性成分は、少なくとも１種の不活性な薬学的に許容される添加剤、例えば、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムおよび／または充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）、および滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにこれらの混合物と混合する。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含み得る。
局所的または経皮的投与
本明細書に記載のように、本発明のグリカン相互作用抗体を含有する組成物は、局所的投与のために製剤化し得る。皮膚は、容易に到達可能であるため、送達のための理想的な標的部位であり得る。遺伝子発現は、非特異的毒性を潜在的に回避して、皮膚のみでなく、また皮膚内の特定の層および細胞型に制限し得る。
送達された組成物の皮膚の発現の部位は、核酸送達の経路によって決まる。３つの経路がグリカン相互作用抗体を皮膚へと送達するために考慮される。（ｉ）局所用途（例えば、局所／領域性処置および／または化粧用途のため）；（ｉｉ）皮内注射（例えば、局所／領域性処置および／または化粧用途のため）；ならびに（ｉｉｉ）全身的送達（例えば、皮膚および真皮外領域の両方に影響を与える皮膚病の処置のため）。グリカン相互作用抗体は、当技術分野において公知のいくつかの異なるアプローチによって皮膚に送達することができる。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法を好都合および／または効果的に行うための種々の被覆材（例えば、創傷被覆材）または包帯（例えば、粘着包帯）を提供する。被覆材または包帯は、使用者が対象（複数可）の複数の処置を行うことを可能とする十分な量の医薬組成物および／または本明細書に記載されているグリカン相互作用抗体を含み得る。
一実施形態では、本発明は、複数の注射において送達されるグリカン相互作用抗体を含む組成物を提供する。
組成物の局所的および／または経皮的投与のための剤形は、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、溶液剤、スプレー剤、吸入剤および／またはパッチを含み得る。一般に、活性成分は、無菌状態下にて、薬学的に許容される添加剤ならびに／または必要に応じて任意の必要とされる保存剤および／もしくは緩衝液と混合される。
さらに、本発明は、経皮パッチの使用を意図し、これは、体への化合物の制御された送達を実現する加えた利点を有することが多い。このような剤形は、例えば、化合物を適切な培地に溶解および／または分注することによって調製し得る。代わりにまたはさらに、速度は、律速膜を提供することによって、ならびに／または化合物をポリマーマトリックスおよび／もしくはゲルに分散させることによって制御し得る。
局所投与に適した製剤には、これらに限定されないが、液体および／または半液体調製物、例えば、リニメント剤、ローション剤、水中油型および／もしくは油中水型乳剤、例えば、クリーム剤、軟膏剤および／またはペースト剤、および／または溶液剤および／または懸濁剤が含まれる。
局所的に投与可能な製剤は、例えば、約１％～約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限度と同じ高さでよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記載されているさらなる成分の１つもしくは複数をさらに含み得る。
デポー投与
本明細書に記載のように、一部の実施形態では、本発明の組成物は、延長放出のためにデポーにおいて製剤化される。一般に、特定の器官または組織（「標的組織」）は、投与のために標的とされる。
本発明のいくつかの態様では、グリカン相互作用抗体は、標的組織内でまたは近位で空間的に保持される。組成物、特に、組成物のグリカン相互作用抗体構成要素（複数可）が、標的組織中に実質的に保持されるような条件下で、１つもしくは複数の標的組織（１つもしくは複数の標的細胞を含めた）と組成物とを接触させることによって、哺乳動物対象の１つもしくは複数の標的組織に組成物を提供する方法を提供し、組成物の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９％超が、標的組織中に保持されることを意味する。有利なことには、保持は、標的組織および／または細胞に入る組成物中に存在するグリカン相互作用抗体のレベルを測定することによって決定される。例えば、対象に投与されたグリカン相互作用抗体の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９％超は、投与に続いてある期間において細胞内に存在する。例えば、哺乳動物対象への筋肉内注射は、１種もしくは複数のグリカン相互作用抗体およびトランスフェクション試薬を含む水性組成物を使用して行ってもよく、組成物の保持は、筋細胞中に存在するグリカン相互作用抗体のレベルを測定することによって決定し得る。
本発明のある特定の態様は、組成物が標的組織において実質的に保持されるような条件下で、標的組織（１個もしくは複数の標的細胞を含有する）と組成物とを接触させることによって、哺乳動物対象の標的組織に組成物を提供する方法を対象とする。組成物は、目的の効果が少なくとも１個の標的細胞において生じるように、有効量のグリカン相互作用抗体を含有する。組成物は一般に、細胞透過剤および薬学的に許容される担体を含有するが、「ネイキッド」グリカン相互作用抗体（例えば、細胞透過剤または他の薬剤を伴わないグリカン相互作用抗体）がまた意図される。
一部の実施形態では、組成物は、複数種の異なるグリカン相互作用抗体を含み、グリカン相互作用抗体の１つもしくは複数は、目的のグリカンを標的とする。任意選択で、組成物はまた、組成物の細胞内送達において補助する細胞透過剤を含有する。所定の容量の標的組織内に含有される相当な百分率の細胞中の目的のグリカンを標的とするのに必要とされる組成物用量について決定が行われる（一般に、所定の容量に隣接した組織における、または標的組織とは遠位での、グリカンを標的とすることなしに）。この決定に続いて、決定された用量は、哺乳動物対象の組織中に直接導入し得る。
一実施形態では、本発明は、複数の注射においてまたは分割用量注射によって送達されるグリカン相互作用抗体を提供する。
肺への投与
医薬組成物は、口腔を介した肺への投与に適した製剤で調製し、パッケージし、かつ／または販売し得る。このような製剤は、活性成分をさらに含み、かつ約０．５ｎｍ～約７ｎｍまたは約１ｎｍ～約６ｎｍの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、それに対して噴射剤の流れが向けられ、粉末を分散し得る乾燥粉末レザバーを含む装置を使用した、ならびに／または自動推進式溶媒／粉末分注容器、例えば、シール容器において低沸点の噴射剤に溶解および／もしくは懸濁した活性成分を含む装置を使用した、適切な投与のための乾燥粉末の形態であり得る。このような粉末は、粒子を含んでもよく、粒子の少なくとも９８重量％は、０．５ｎｍ超の直径を有し、数によって粒子の少なくとも９５％は、７ｎｍ未満の直径を有する。代わりに、粒子の少なくとも９５重量％は、１ｎｍ超の直径を有し、数によって粒子の少なくとも９０％は、６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、固体微粉賦形剤、例えば、糖を含み得、単位用量形態で好都合に提供される。
低沸点の噴射剤は一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、噴射剤は、組成物の５０％～９９．９％（ｗ／ｗ）を構成し得、活性成分は、組成物の０．１％～２０％（ｗ／ｗ）を構成し得る。噴射剤は、さらなる成分、例えば、液体非イオン性および／もしくは固体アニオン性界面活性剤、ならびに／または固体賦形剤（活性成分を含む粒子と同じ程度の粒径を有し得る）をさらに含み得る。
肺への送達のために製剤化された医薬組成物は、溶液および／または懸濁液の液滴の形態の活性成分を提供し得る。このような製剤は、活性成分を含む、任意選択で無菌の、水性および／または希アルコール性の溶液および／または懸濁液として調製し、パッケージし、かつ／または販売してもよく、任意の噴霧および／または微粒化装置を使用して好都合に投与し得る。このような製剤は、これらに限定されないが、香味剤、例えば、サッカリンナトリウム、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、および／または保存剤、例えば、メチルヒドロキシベンゾエートを含めた１種もしくは複数のさらなる成分をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
鼻腔内、経鼻およびバッカル投与
肺への送達のために有用であるような本明細書に記載されている製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達のために有用である。鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含み、かつ約０．２μｍ～５００μｍの平均粒子を有する粗末である。このような製剤は、鼻から吸い込む様式で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻道を通した急速な吸入によって投与される。
経鼻投与に適した製剤は、例えば、概ねせいぜい０．１％（ｗ／ｗ）から１００％（ｗ／ｗ）と同量の活性成分を含んでもよく、本明細書に記載されているさらなる成分の１つもしくは複数を含み得る。医薬組成物は、バッカル投与に適した製剤で調製し、パッケージし、かつ／または販売し得る。このような製剤は、例えば、通常の方法を使用して作製された錠剤および／またはロゼンジ剤の形態でもよく、例えば、０．１％～２０％（ｗ／ｗ）の活性成分でよく、残余は、経口的に溶解可能および／または分解可能な組成物、ならびに任意選択で、本明細書に記載されているさらなる成分の１つもしくは複数を含む。代わりに、バッカル投与に適した製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは微粒化された溶液ならびに／または懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散されたとき、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均粒子および／または液滴径を有し得、本明細書に記載されている任意のさらなる成分の１つもしくは複数をさらに含み得る。
眼へのまたは耳への投与
医薬組成物は、眼へのまたは耳への投与に適した製剤で調製し、パッケージし、かつ／または販売し得る。このような製剤は、例えば、例えば、水性または油性の液体添加剤中の活性成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）の溶液および／または懸濁液を含む点眼薬または点耳薬の形態であり得る。このようなドロップ剤は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載されている任意のさらなる成分の１種もしくは複数の他のものをさらに含み得る。有用である他の眼から投与可能な製剤は、微結晶形態および／またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものを含む。網膜下のインサートはまた、投与形態として使用し得る。
ペイロード投与
本明細書に記載されているグリカン相互作用抗体は、いくつかの異なるシナリオにおいて使用してもよく、ここでは生物学的標的への物質（「ペイロード」）の送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤もしくは診断用剤の送達が望ましい。検出方法には、これらに限定されないが、両方のイメージングであるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのイメージング方法、例えば、免疫組織化学、バイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、電子顕微鏡法、Ｘ線コンピュータ断層撮影法、ラマンイメージング、光干渉断層撮影法、吸収イメージング、熱イメージング、蛍光反射率イメージング、蛍光顕微鏡法、蛍光分子トモグラフィーイメージング、核磁気共鳴イメージング、Ｘ線イメージング、超音波イメージング、光音響イメージング、実験室アッセイが含まれることができるか、あるいはタグ付け／染色／イメージングが必要とされる任意の状況。
グリカン相互作用抗体は、任意の有用な配向でリンカーおよびペイロードの両方を含むように設計することができる。例えば、２つの端部を有するリンカーを使用して、１つの端部をペイロードに付着させ、他の端部をグリカン相互作用抗体に付着させる。本発明のグリカン相互作用抗体は、複数のペイロードおよび開裂可能なリンカーを含むことができる。別の例において、リンカーを介してグリカン相互作用抗体に付着してもよく、かつ蛍光性標識してもよい薬物は、薬物をｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、細胞内でトラックするために使用することができる。
他の例には、これらに限定されないが、細胞中への可逆的な薬物送達におけるグリカン相互作用抗体の使用が含まれる。
本明細書に記載されているグリカン相互作用抗体は、特定の細胞小器官へのペイロード、例えば、検出可能薬剤または治療剤の、細胞内の標的化において使用することができる。さらに、本明細書に記載されているグリカン相互作用抗体は、例えば、生きている動物における細胞または組織に治療剤を送達するために使用し得る。例えば、本明細書に記載されているグリカン相互作用抗体は、化学療法剤を送達してがん細胞を死滅させるために使用し得る。リンカーを介して治療剤に付着しているグリカン相互作用抗体は、メンバー透過を促進して、治療剤が細胞中に移動して、細胞内標的に達すことを可能とすることができる。
一部の実施形態では、ペイロードは、治療剤、例えば、細胞毒、放射性イオン、化学療法剤、または他の治療剤であり得る。細胞毒または細胞毒性剤は、細胞には有害であり得る任意の薬剤を含む。例には、これらに限定されないが、タキソール（ｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール（本明細書においてその全体が組み込まれている米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照されたい）、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５、これらの全てが参照により本明細書中に組み込まれている米国特許第５，４７５，０９２号明細書、同第５，５８５，４９９号明細書、および同第５，８４６，５４５号明細書を参照されたい）、ならびにその類似体または相同体が含まれる。放射性イオンには、これらに限定されないが、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、およびプラセオジムが含まれる。他の治療剤には、これらに限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メソトレキセート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロランブシル、ラケルマイシン（ＣＣ－１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（従前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（従前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール（ｔａｘｏｌ）およびマイタンシノイド）が含まれる。本発明の抗ＳＴｎ抗体の場合、腫瘍死滅は、このような抗ＳＴｎ抗体への毒素のコンジュゲーションによって後押しし得る。
一部の実施形態では、ペイロードは、検出可能な薬剤、例えば、様々な有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素または酵素基質、蛍光材料、発光材料（例えば、ルミノール）、生物発光材料（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン）、化学発光材料、放射性物質（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、または９９ｍＴｃ（例えば、ペルテクネテート（テクネテート（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４ －）として）、およびコントラスト剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレートＧｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、および極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ－ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ化造影剤（イオヘキソール）、超微粒気泡、またはペルフルオロカーボン）であり得る。このような光学的に検出可能な標識は、例えば、これらに限定されないが、４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体（例えば、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート）；５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４－アミノ－Ｎ－［３－ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド－３，５ジスルホネート；Ｎ－（４－アニリノ－１－ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体（例えば、クマリン、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、および７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１））；シアニン色素；シアノシン；４’，６－ジアミニジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’－ジブロモピロガロール－スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’－ジイソチオシアナトジヒドロ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸；４，４’－ジイソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸；５－［ジメチルアミノ］－ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体（例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート）；エリスロシンおよび誘導体（例えば、エリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体（例えば、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５－（４，６－ジクロロトリアジン－２－イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’－ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、Ｘ－ローダミン－５－（および－６）－イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣまたはＸＲＩＴＣ）、およびフルオレサミン）；２－［２－［３－［［１，３－ジヒドロ－１，１－ジメチル－３－（３－スルホプロピル）－２Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドール－２－イリデン］エチリデン］－２－［４－（エトキシカルボニル）－１－ピペラジニル］－１－シクロペンテン－１－イル］エテニル］－１，１－ジメチル－３－（３－スルホプロピル）－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドリウム水酸化物、分子内塩、ｎ，ｎ－ジエチルエタンアミン（１：１）を有する化合物（ＩＲ１４４）；５－クロロ－２－［２－［３－［（５－クロロ－３－エチル－２（３Ｈ）－ベンゾチアゾール－イリデン）エチリデン］－２－（ジフェニルアミノ）－１－シクロペンテン－１－イル］エテニル］－３－エチルベンゾチアゾリウムペルクロレート（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４－メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ－フィコエリトリン；ｏ－フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（例えば、ピレン、ピレンブチレート、およびスクシンイミジル１－ピレン）；ブチレート量子ドット；リアクティブレッド４（ＣＩＢＡＣＲＯＮ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ－Ａ）；ローダミンおよび誘導体（例えば、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス赤色）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン－３（Ｃｙ３）；シアニン－５（Ｃｙ５）；シアニン－５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン－７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；アレクサ６４７（Ａｌｅｘａ６４７）；ラホーヤブルー；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンを含む。
一部の実施形態では、検出可能な薬剤は、活性化によって検出可能となる、検出可能でない前駆体であり得る（例えば、蛍光発生テトラジン－フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン－ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、テトラジン－オレゴングリーン４８８、もしくはテトラジン－ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ－Ｘ）または酵素活性化可能な蛍光発生剤（例えば、ＰＲＯＳＥＮＳＥ（登録商標）（ビセンメディカル（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ））））。酵素標識された組成物を使用することができるＩｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイには、これらに限定されないが、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット分析が含まれる。
組合せ
グリカン相互作用抗体は、１種もしくは複数の他の治療剤、予防剤、診断剤、または造影剤と組み合わせて使用し得る。「組み合わせた」とは、薬剤が同時に投与され、かつ／または送達のために一緒に製剤化されなければならないことを意味することを意図しないが、送達のこれらの方法は本開示の範囲内である。組成物は、１つもしくは複数の他の所望の治療剤または医療処置と併行的に、その前に、またはそれに続けて投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定される用量でおよび／またはタイムスケジュールで投与される。一部の実施形態では、本開示は、これらのバイオアベイラビリティーを改善させ、これらの代謝を低減および／もしくは改変し、これらの排泄を阻害し、かつ／または体内でのこれらの分布を改変し得る薬剤と組み合わせた、医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、および／またはイメージング組成物の送達を包含する。
投与量
本開示は、薬物送達の科学における有望な進歩を考慮に入れて、治療、医薬、診断またはイメージングのいずれかのための任意の適当な経路によるグリカン相互作用抗体の送達を包含する。送達は、ネイキッドであるか、または配合し得る。
ネイキッド送達
本発明のグリカン相互作用抗体は、細胞、組織、器官または生物へとネイキッド形態で送達し得る。本明細書において使用する場、用語「ネイキッド」は、トランスフェクションまたは透過性を促進する薬剤または改変を伴わずに送達されるグリカン相互作用抗体を指す。ネイキッドグリカン相互作用抗体は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して、細胞、組織、器官および／または生物へと送達し得る。ネイキッド送達は、単純な緩衝液、例えば、食塩水またはＰＢＳ中の製剤を含み得る。
製剤化された送達
本発明のグリカン相互作用抗体は、本明細書に記載されている方法を使用して製剤化し得る。製剤は、改変してもよくかつ／または改変しなくてもよいグリカン相互作用抗体を含み得る。製剤はさらに、これらに限定されないが、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生体侵食性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーを含む。配合されたグリカン相互作用抗体は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して細胞に送達し得る。
組成物はまた、これらに限定されないが、直接の浸漬もしくは槽に漬けること、カテーテルを介する、ゲル剤、散剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および／またはドロップ剤による、組成物をコーティングもしくは含浸させた基材、例えば、布帛もしくは生分解性材料を使用することによるなどを含めた当技術分野におけるいくつかの方法のいずれかで、器官または組織への直接の送達のために製剤化し得る。
投薬
一部の実施形態では、本開示は、本発明による１種もしくは複数のグリカン相互作用抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。グリカン相互作用抗体をコードする核酸、グリカン相互作用抗体を含むタンパク質もしくは複合体、またはその医薬、イメージング、診断用、もしくは予防用組成物は、疾患、障害および／もしくは状態を予防、処置、診断、または画像処理するのに有効な任意の量および任意の投与経路を使用して対象に投与し得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、投与のそのモード、活性のそのモードなどによって、対象毎に変化する。本発明による組成物は典型的には、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与量単位形態で製剤化される。しかし、本発明の組成物の毎日の総用法は、主治医によって正しい医学的判断の範囲内で決定されることが理解される。任意の特定の患者のための特定の治療的に有効な、予防的に有効な、または適当なイメージング用量レベルは、処置される障害、および障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、身体全体の健康、性別および食事；用いられる特定の化合物の投与の時、投与経路、および排せつ率；処置の期間；用いられる特定の化合物と組み合わせて、もしくは同時に使用される薬物；ならびに医学の技術分野において周知の同様の要因を含めた種々の要因によって決まる。
ある特定の実施形態では、本発明による組成物は、所望の治療、診断、予防、またはイメージング効果を得るために、１日当たり、１日１回もしくは複数回、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ対象体重を送達するのに十分な投与量レベルで投与し得る。所望の投与量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、２日おき、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に送達し得る。ある特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれ超の投与）を使用して送達し得る。
本発明によれば、グリカン相互作用抗体は、分割用量レジメンにおいて投与し得る。本明細書において使用する場合、「分割用量」は、単一の単位用量または総１日用量を２つもしくはそれよりも多い用量への分割、例えば、単一の単位用量の２つもしくはそれよりも多い投与である。本明細書において使用する場合、「単一の単位用量」は、１つの用量で／１回／単一の経路／単一の接触のポイントで、すなわち、単回投与事象で投与される任意の治療剤の用量である。本明細書において使用する場合、「総１日用量」は、２４時間の期間において与えられるかもしくは処方される量である。これは、単一の単位用量として投与し得る。一実施形態では、本発明のグリカン相互作用抗体は、対象に分割用量で投与される。グリカン相互作用抗体は、緩衝液のみ中にまたは本明細書に記載されている製剤中に配合し得る。本明細書に記載のようなグリカン相互作用抗体を含む医薬組成物は、本明細書に記載されている剤形、例えば、局所、鼻腔内、気管内、または注射剤（例えば、静脈内、眼球内、硝子体内、筋内、心臓内、腹腔内もしくは皮下）に製剤化し得る。医薬品の製剤化および／または製造における全般的な考察は、例えば、レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッピンコットウィリアムズアンドウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照により本明細書中に組み込まれている）において見出し得る。
一部の実施形態では、グリカン相互作用抗体の投与量は、バイスタンダー効果を低減させるために調節し得る。本明細書において使用する場合、「バイスタンダー効果」は、非標的細胞または標的細胞に隣接する細胞（また、本明細書において、バイスタンダー細胞と称される）上へのネガティブ効果を指す。このような方法によると、抗体の用量またはコンジュゲートタイプは、バイスタンダー効果を低減させるために調節し得る。このような調節は、バイスタンダー細胞の９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超、５０％超、４５％超、４０％超、３５％超、３０％超、または２５％超が生存可能なままである処置をもたらし得る。
コーティングまたはシェル
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティング、および医薬製剤の技術分野において周知の他のコーティングと共に調製することができる。これらは任意選択で乳白剤を含んでもよく、活性成分（複数可）のみを、または優先的に、腸管の特定の部分において、任意選択で遅延した様式で放出する組成のものでよい。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを含む。同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖などの添加剤、および高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟および硬ゼラチンカプセル中の充填剤として用い得る。
ＩＶ．キットおよび装置
キット
本明細書に記載されている組成物のいずれかは、キットに含まれてもよい。非限定例において、抗原分子を含む、グリカン相互作用抗体を生じさせるための試薬がキットに含まれる。キットは、グリカン相互作用抗体を生じさせるか、または合成するための試薬または説明書をさらに含み得る。これはまた、１種もしくは複数の緩衝液を含み得る。本発明の他のキットは、グリカン相互作用抗体タンパク質または核酸アレイまたはライブラリーを作製するための構成要素を含んでもよく、このように、例えば、固体支持体を含んでもよい。
一部の実施形態では、本開示は、１種もしくは複数のグリカン相互作用抗体を含む、対象をスクリーニングし、モニターし、かつ／または診断するためのキットを含む。このようなキットは、単独で、またはスクリーニング、モニタリング、および／もしくは診断（例えば、コンパニオン診断として）の１つもしくは複数の他の方法と組み合わせて使用し得る。いくつかのキットは、緩衝液、生物学的標準品、二次抗体、検出試薬、および試料事前処理のための組成物（例えば、抗原回収、ブロッキングなどのため）の１つもしくは複数を含む。
キットの構成要素は、水性媒体中でまたは凍結乾燥した形態でパッケージし得る。キットの容器手段は一般に、その中に構成要素が入れられ、好ましくは、適切に等分される、少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含む。キットにおいて複数の構成要素が存在する場合（標識化試薬および標識は一緒にパッケージし得る）、キットはまた一般に、その中にさらなる構成要素が別々に入れられてもよい、第２、第３または他のさらなる容器を含有する。キットはまた、無菌の薬学的に許容される緩衝液および／または他の賦形剤を含油するための第２の容器手段を含み得る。しかし、構成要素の様々な組合せは、バイアル中に含み得る。本発明のキットはまた典型的には、グリカン相互作用抗体を含有するための手段、例えば、タンパク質、核酸、および商業的販売のために厳重に閉じ込める任意の他の試薬容器を含む。このような容器は、その中に所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。
キットの構成要素が１種および／もしくはそれ超の溶液中で提供されるとき、溶液は水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供し得る。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として提供されるとき、粉末は、適切な溶媒を添加することによって再構成することができる。溶媒はまた、別の容器手段中で提供し得ることが想定される。一部の実施形態では、標識化色素は、乾燥粉末として提供される。１０、マイクログラム２０、マイクログラム３０、マイクログラム４０、マイクログラム５０、マイクログラム６０、マイクログラム７０、マイクログラム８０、マイクログラム９０、マイクログラム１００、マイクログラム１２０、マイクログラム１２０、マイクログラム１３０、マイクログラム１４０、マイクログラム１５０、マイクログラム１６０、マイクログラム１７０、マイクログラム１８０、マイクログラム１９０、マイクログラム２００、マイクログラム３００、マイクログラム４００、マイクログラム５００、マイクログラム６００、マイクログラム７００、マイクログラム８００、マイクログラム９００、１０００マイクログラムまたは少なくとも１０００マイクログラムまたは最大で１０ｇの乾燥色素は、本発明のキットにおいて提供されることが意図されている。次いで、色素は、任意の適切な溶媒、例えば、ＤＭＳＯに再懸濁し得る。
キットは、キット構成要素を用いるため、およびキットには含まれていない任意の他の試薬の使用の説明書を含み得る。説明書は、実施することができるバリエーションを含み得る。
装置
本明細書に記載されている組成物のいずれかは、装置と合わせるか、装置上にコーティングされるか、装置中に包埋し得る。装置には、これらに限定されないが、歯科インプラント、ステント、骨置換、人工関節、バルブ、ペースメーカーまたは他の埋め込み可能な治療用装置が含まれる。
Ｖ．同等物および範囲
当業者であれば本明細書に記載されている本発明による特定の実施形態に対する多くの同等物を理解するか、または単に通例の実験法を使用して確認することができる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図せず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている。
特許請求の範囲において、冠詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、逆の記載がない限り、または文脈から他に明らかでない限り、１つもしくは複数を意味し得る。群の１つもしくは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または明細書は、群メンバーの１つ、複数、または全てが所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在するか、所与の生成物もしくはプロセスにおいて用いられるか、または所与の生成物もしくはプロセスに対して他に関連性がある場合、逆の記載がない限り、または文脈から他に明らかでない限り、満たされると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在するか、所与の生成物もしくはプロセスにおいて用いられるか、または所与の生成物もしくはプロセスに対して他に関連性のある実施形態を含む。本発明は、複数のメンバー、または全群メンバーが所与の生成物もしくはプロセスにおいて存在するか、所与の生成物もしくはプロセスにおいて用いられるか、または所与の生成物もしくはプロセスに対して他に関連性がある実施形態を含む。
用語「含む」は、オープンであることを意図し、さらなるエレメントまたはステップを含むことを許容するが、含むことを必要としないことがまた留意される。用語「含む」が本明細書において使用されるとき、用語「からなる」はこのようにまた包含および開示されている。
範囲が示されている場合、エンドポイントは含まれる。さらに、他に示さない限り、または文脈および当業者の理解から他に明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態における記述した範囲内の任意の特定の値または部分範囲を仮定することができることを理解すべきである。
さらに、従来技術の範囲に入る本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲の任意の１つもしくは複数から明示的に除外し得ることを理解すべきである。このような実施形態は当業者には公知であると見なされるため、除外が本明細書において明示的に記載されていないとしても、これらは除外し得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによってコードされるタンパク質；産生の任意の方法；使用の任意の方法など）は、任意の理由のために、従来技術の存在に関連してももしくはしなくても、任意の１つもしくは複数の特許請求の範囲から除外することができる。
全ての引用した源、例えば、本明細書において引用した参照文献、公開資料、データベース、データベースエントリー、および技術は、たとえ引用において明確に記述されなくても参照により本出願に組み込まれている。引用した源および本出願が矛盾した記述である場合、本出願における記述が優先する。
セクションおよび表の見出しは限定的なものではない。
（実施例）
実施例１
グリカンアレイ分析
最適化されたグリカンアレイは、単一の実験における複数のグリカンについての抗体の親和性および特異性を試験するために利用する。グリカンアレイは、７１の化学的に合成され、詳細に明らかにされたグリカンを含み、これらの大部分はＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃグリカン対である。アレイスライドは、商業的に得られ（アレイイット社（ＡｒｒａｙＩｔ Ｃｏｒｐ）、サニーベール、ＣＡ）、下記の表において列挙したグリカンを含む。
Figure 0007066613000032
Figure 0007066613000033
 ３００ｍｌのエポキシブロッキング緩衝液は、１５ｍｌのトリス緩衝液（ｐＨ８、２Ｍ）と０．９ｍｌのエタノールアミン（１６．６Ｍ）および２８４．１ｍｌの蒸留水とを合わせることによって調製する。ＨＣｌで溶液を９．０の最終ｐＨとする。０．２μＭのニトロセルロース膜を使用して溶液を濾過する。エポキシ緩衝溶液および１Ｌの蒸留水は５０℃に事前に温める。スライドガラスはスライドホルダーに配置し、温めたエポキシブロッキング緩衝液を有する染色タブ中に迅速に浸す。スライドをエポキシブロッキング緩衝液中で周期的に振盪しながら５０℃にて１時間インキュベートし、エポキシ結合部位を不活性化する。次に、スライドをすすぎ、１％ＯＶＡを有するＰＢＳで２５℃にて１時間ブロックする。ポリクローナル抗体（１：１０００）または精製したモノクローナル抗体（１ｕｇ／ｍＬ）を有する血清試料は、１％ＯＶＡを有するＰＢＳに希釈し、グリカンアレイに１時間２５℃にて加える。広範な洗浄の後、抗体の結合は、グリカンマイクロアレイスライドをＣｙ３がコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ウエストグローブ、ＰＡ）と共に１時間インキュベートすることによって検出する。次いで、スライドは広範に洗浄し、乾燥させ、ジェネピックス４０００Ｂ（Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ｂ）スキャナー（１００％でのレーザー；３５０でのゲイン；１０μｍのピクセル）でスキャンする。スキャンしたイメージからの生データは、Ｇｅｎｅｐｉｘソフトウェアを使用して抽出し、生データの分析を行う。抗体は、これらが両方の分子への結合を示し、アレイ上のＴｎまたは任意の他のグリカンへの結合を示さない場合、ＡｃＳＴｎおよびＧｃＳＴｎについて高度に特異的であると考えられる。
アレイ分析に基づいて、抗体は、アレイグリカン結合プロファイルによって分類される。抗体は、これらがグリカン５、６、２３および２４に結合する場合、ＡｃＳＴｎおよびＧｃＳＴｎを結合することができる「群１」抗体として分類される。このような抗体は、より広範囲のＳＴｎ構造および図１Ａにおいて大きな楕円によって示されるＳＴｎの部分と関連するこれらの能力によって汎ＳＴｎ抗体と称される。抗体は、これらがグリカン５、６、２３、２４、２７および３１に結合する場合、ＳＴｎ、およびセリンまたはトレオニンへのＯ－連結を含むいくつかの関連する構造を結合することができる「群２」抗体として分類される。これらの抗体は、図１Ｂにおいて大きな楕円によって示されるＳＴｎの部分と関連していると考えられる。いくつかの群２抗体は好ましくは、ＧｃＳＴｎを有する構造を上回って、ＡｃＳＴｎを有する構造に結合する。抗体は、これらがグリカン５、６、２３、２４、１７、３、１９、３７、２７および３１を結合する場合、「群３」抗体として分類される（ＳＴｎを結合することができるが、また、より広範な一連の関連する構造を結合し得る）。群２抗体とは異なり、群３抗体は、このような構造がセリンまたはトレオニンへのＯ－連結を有することを必要としない。群３抗体は、図１Ｃにおいて大きな楕円によって示されるＳＴｎの部分と関連していると考えられる。最後に、抗体は、これらがグリカン５、６、２３、２４および４７に結合する場合、ＡｃＳＴｎおよびＧｃＳＴｎの両方ならびに非シアル酸付加されたＴｎ抗原に結合することができる（したがって、より広範な特異性を有する）「群４」抗体である。群４抗体は、図１Ｄにおいて大きな楕円によって示されるＳＴｎの部分と関連していると考えられる。
実施例２
抗体結合のフローサイトメトリーをベースとする分析
フローサイトメトリーをベースとする分析は、細胞表面抗原への抗体の結合についての用量応答曲線を解明するために行う。これらの分析のために、様々な細胞系が用いられる。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ヒト乳がん細胞である。これらは、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、１００ＵＩ／ｍｌのストレプトマイシンおよび４５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したアールの最小必須培地において成長させる。ＭＣＦ－７細胞はまたヒト乳がん細胞であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と同じ条件下で成長させる。（アルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニル－２，３－ベータ－ガラクトシル－１，３）－Ｎ－アセチルガラクトサミニドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼＩ（ＧａｌＮＡｃα２，６－シアリルトランスフェラーゼＩまたはＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ）を過剰発現している、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＳＴｎ、クローンＴＡＨ３．Ｐ１０）およびＭＣＦ－７細胞（ＭＣＦ－７細胞についてクローンＡ１２．１）の安定的にトランスフェクトされたバージョンはまた、導入遺伝子を発現している細胞をサポートする加えた１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を例外として同じ条件下で培養する。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉは、ＧａｌＮＡｃをシアル酸付加することができる酵素である。過剰発現の結果として、トランスフェクトされた細胞は、高レベルのＮｅｕ５Ａｃ－ＳＴｎを発現している（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ジュリアン，Ｓ．（Ｊｕｌｉｅｎ，Ｓ．）ら著、グリココンジュゲートジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｊｏｕｒｎａｌ．）、２００１年、１８巻、８８３～９３頁を参照されたい）。
Ｅ３細胞は、マウス乳がん細胞である。これらは１０％ＦＣＳを有するダルベッコのＥ４培地中で培養する。高レベルのＮｅｕ５Ｇｃ－ＳＴｎ（Ｅ３－ＳＴｎ）を発現しているＥ３細胞の安定にトランスフェクトされたバージョンは、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８および２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンと共に培養する。実験用細胞の成長および維持の間に、トリプシンは細胞継代のために使用しない。
ＯＶ９０およびＯＶＣＡＲ３細胞がまた使用される。これらは、従前に記載したヒト卵巣がん細胞系である。
ＳＮＵ－１６細胞がまた使用される。これらは、低レベルのＳＴｎを発現している胃がん細胞系である。
分析のために、細胞はＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カールズバッド、ＣＡ）を使用して収集し、５％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、その後、軽い遠心分離によってペレット化する。細胞数および生存率はトリパンブルー色素排除分析によって決定し、細胞濃度は５％ＦＢＳを有するＰＢＳ中で５×１０６個の細胞／ｍｌに調節する。５０μｌの細胞はアッセイプレートの各ウェルに加える。細胞は分析される抗体または対照抗体の５０μｌ溶液と合わせ、４℃にて１時間インキュベートする。細胞を洗浄し、５％ＦＢＳを有するＰＢＳと共に２回ペレット化し、その後、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）とコンジュゲートした１：１，５００希釈の抗マウスＩｇＧ（サザンバイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、バーミングハム、アラバマ）を含む５％ＦＢＳを有する１００μｌのＰＢＳで処理する。細胞を４℃にて３０分間インキュベートし、その後、洗浄し、５％ＦＢＳを有するＰＢＳ中で１：１０００希釈した２００μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に再懸濁させる。次いで、処理した細胞はフローサイトメトリー分析に供し、１０，０００の事象を各試料について得る。
実施例３
抗体ヒト化
完全ヒト化重鎖および軽鎖は、本明細書において提示するＣＤＲと共に設計する。可変領域のタンパク質モデルは、テンプレートとして現存する抗体構造を使用して生じさせる。出発重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列のセグメントは、完全ヒト化配列において含まれることの可能性についてヒト配列と比較する。一連のヒト化重鎖および軽鎖可変領域は、Ｔ細胞エピトープが回避される目的を伴って、ヒト可変領域配列のセグメントから全体的に設計される。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの技術によって決定するような潜在的なＴ細胞エピトープの有意な発生率を伴うバリアントヒト配列セグメントは廃棄する。
ヒト化重鎖および軽鎖可変領域遺伝子は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を使用して全長遺伝子にアセンブルされるオーバーラップオリゴヌクレオチドから構築される。ＬＣＲ産物は増幅し、発現ベクター中へのクローニングのために適切な制限部位を加える。ＰＣＲ産物は中間ベクター中にクローニングし、配列決定によって確認する。
ヒト定常領域を有する完全ヒト化抗体をコードする発現プラスミドの構築のために、各可変領域についてのＤＮＡ配列は、上流のサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）プラス免疫グロブリンシグナル配列、および下流の免疫グロブリン定常領域遺伝子の間の哺乳動物の発現ベクター中に挿入する。ＤＮＡ試料は、哺乳動物細胞へのトランスフェクションのために調製する。
細胞系の産生、およびリード完全ヒト化抗体の選択のために、重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡ対は、哺乳動物細胞（ＮＳ０）中にトランスフェクトする。ヒト化抗体を産生する細胞系は増殖し、抗体試料は精製する。抗体は一次および二次結合アッセイにおいて試験し、主要な抗体候補を決定する。３つの主要な候補は、さらなる分析のために使用される。
実施例４
免疫原性試験
リード抗体は、健康なボランティアのドナーからの最小で２０の血液試料を使用して、エピスクリーン（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ）（アンチトープ（Ａｎｔｉｔｏｐｅ）、パラダイスヴァレー、ＡＺ）全抗体ヒトＴ細胞アッセイに供する。リード抗体の免疫原性は、出発抗体可変領域およびマッチしたヒト定常領域を有する対照キメラ抗体と比較する。データは、臨床段階生物製剤についてのエピスクリーン（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ）総タンパク質データに対してベンチマークする。
実施例５
抗体配列分析
抗グリカン抗体可変ドメイン配列は、配列類似性について、および抗体の機能、発現、安定性または免疫原性に影響を与え得る特徴について分析した。使用した抗体は市販であるか、またはその内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１６／０２６４６８４号明細書および米国特許出願公開第２０１６／０１３０３５６号明細書において従前に記載されているように開発した。分析によって、重鎖可変ドメインと比較して、軽鎖可変ドメインにおけるはるかにより大きな可変性が明らかとなった。さらに、抗グリカン抗体の重鎖可変ドメインが、当技術分野において公知の抗ＳＴｎ抗体：抗体３Ｆ１（ＳＢＨサイエンス（ＳＢＨ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ナティック、ＭＡ）、抗体Ｂ７２．３（Ｃｏｌｃｈｅｒ，Ｄ．ら著、１９８１年、ＰＮＡＳ．７８巻（５号）：３１９９～２０３頁を参照されたい）、および抗体ＣＣ４９（Ｍｕｒａｒｏ，Ｒ．（ムラーロ，Ｒ．）ら著、１９８８年、がんリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、４８巻：４５８８～９６頁を参照されたい）と共有されている生殖系列遺伝子である、１つの生殖系列遺伝であるｍｕＩＧＨＶ１Ｓ５３に由来したことが決定された。分析に基づいた重鎖ＣＤＲ配列の比較上の表示は、下記の表において提示する。
Figure 0007066613000034
 長さの中央値に対してプラスまたはマイナス１個のアミノ酸だけ変化するＣＤＲ－Ｈ３配列。
興味深いことに、標的特異的軽鎖は、５つの軽鎖生殖系列ファミリー：ＩＧＫＶ６、ＩＧＫＶ１５、ＩＧＫＶ８、ＩＧＫＶ１およびＩＧＫＶ１２に由来することが見出された。これらのうち、全ては、同じＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３配列長を有した。２クラスのＣＤＲ－Ｌ１配列は持続することが見出され［長（ＩＧＫＶ８およびＩＧＫＶ１）ならびに短（ＩＧＫＶ６、ＩＧＫＶ１５、およびＩＧＫＶ１２）］、各クラスにおける統合されたトポロジーを潜在的提示した。
軽鎖ＣＤＲ配列の比較は、下記の表において提示する。
Figure 0007066613000035
 まとめると、配列分析は、特定の軽鎖生殖系列対形成と対応するＣＤＲ－Ｈ３多様性の別個のパターンを示唆する。３つの配列群［群Ａ（部分群Ａ１およびＡ２を有する）、群Ｂ（部分群Ｂ１およびＢ２を有する）、ならびに群Ｃ］は、これらの対形成に基づいて同定した。各群に分類される抗体のリストは、下記の表において提示する。
Figure 0007066613000036
 群Ａは、抗体８Ｃ２－２Ｄ６、４Ｇ８－１Ｅ３および３Ｆ１を含む。これらの抗体は、ＣＤＲ－Ｈ３長さに関して全ての他の抗体とは別個である（追加のアミノ酸を有し、より長いループを生じさせる）３Ｆ１を例外として、同様のＣＤＲ－Ｈ３配列を有する。群Ａ抗体はまた、特に、ＣＤＲ残基長さにおいて類似性を伴う軽鎖ＣＤＲを有する。
群Ｂは、抗体２Ｇ１２－２Ｂ２およびＣＣ４９を含む。重鎖配列における類似性の中で、これらの抗体は、ＣＤＲ－Ｈ２において保存されたＦ残基およびＤ残基、ならびにＣＤＲ－Ｈ３において保存されたＬ残基を有する。さらに、群Ｂ抗体は、高度に同様の軽鎖配列を有する。
群Ｃ抗体は、５Ｇ２－１Ｂ３およびＢ７２．３を含む。これらの重鎖配列の間の類似性の中で、これらの抗体は、これらのＣＤＲ－Ｈ２配列において保存されたＤ残基、ならびにこれらのＣＤＲ－Ｈ３配列においてＹＹＧモチーフを有する。群Ｃ抗体はまた、高度に同様の軽鎖配列を有する。
同定された限定された数の群は、抗ＳＴｎ結合のために必要とされる相対的にまれな配列特異性を強調する。抗体の分類は、エピトープ結合への関連性のある群間の配列をベースとする寄与の同定を促進する。特に、群Ａ内で、３Ｆ１は独自に、新規な結合プロファイルの一因となり得る延長されたＣＤＲ－Ｈ３ループを含有する。興味深いことに、免疫組織化学データは、内皮細胞への望ましくない結合を含めて、３Ｆ１がより広範な範囲の標的に結合し得ることを示す。
実施例６
抗体バリアント
本発明の抗グリカン抗体についての可変ドメイン配列は、抗体の機能、発現、安定性および／または免疫原性に影響を与え得る配列特徴について分析した。
分析された抗体の多くは、ＮＧ残基対を含有するＣＤＲ－Ｈ２配列を有したが、これによってアスパラギン脱アミドの影響を受けやすくなり、時間と共に３：１比のグルタメートおよびピログルタメートへの変換の可能性を伴う。これらの配列は、突然変異誘発に供して、ＮＧ残基対をＳＧまたはＱＧ対に変換し、これらの部位における脱アミドを防止し得る。代わりに、これらの抗体は配合して、脱アミドを低減し得る。
抗体２Ｂ２－２Ａ７および５Ｇ２－１Ｂ３は、これらの軽鎖可変ドメインにおいてアスパルテート異性化部位（ＤＧアミノ酸残基対によって同定される）を有した。これらの部位におけるアスパラギン酸は、時間と共にグルタメートおよびピログルタメートに３：１比で変換することができる。これらの配列は、突然変異誘発に供し、ＤＧ残基対をＳＧまたはＱＧに変換し、これらの部位における異性化を防止し得る。代わりに、これらの抗体は、異性化を低減するために配合し得る。
抗体の多くは、Ｎ末端グルタミン残基を伴う重鎖を有する。これらの配列は、突然変異誘発に供され、Ｎ末端グルタミン残基をグルタメート残基に変換し得る。
凝集を起こしやすいパッチについての配列分析は、５Ｇ２－１Ｂ３のＣＤＲ－Ｌ３におけるＨＦＷセグメントを明らかにしたが、これは抗体凝集を増加させる危険性を有する。凝集安定性研究は、このモチーフのバリアントで行って、凝集をより起こしやすくない抗体を同定し得る。
実施例７
抗体のヒト化
リード抗体のヒト化バージョンは、配列および構造分析を使用して開発した。最初に、各抗体について、マウス生殖系列抗体配列を同定した（下記の表を参照されたい）。
Figure 0007066613000037
 次いで、抗体可変ドメイン配列をヒトフレームワーク配列と比較し、ＣＤＲグラフティングに適したヒトフレームワーク配列は、相同性によって同定した。可変ドメインの概略図は、図２において示すが、ＣＤＲと関連して、抗体可変ドメインフレームワーク領域のレイアウト［フレームワーク領域１（ＦＲ１）、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、フレームワーク領域３（ＦＲ３）およびフレームワーク領域４（ＦＲ４）］を示す。下記の表は、抗体４Ｇ８－１Ｅ３、５Ｇ２－１Ｂ３、２Ｇ１２－２Ｂ２、８Ｃ２－２Ｄ６、および３Ｆ１の対応するフレームワーク領域を置き換えるために選択されたヒトフレームワークまたはヒトコンセンサス配列を示す。ヒトコンセンサス１重鎖のＦＲ４は、アミノ酸配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２１５）に対応し、ヒトコンセンサス１軽鎖のＦＲ４は、アミノ酸配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２１６）に対応する。
Figure 0007066613000038
 さらなる分析を行って、バッククロスして、抗体結合または他の特性を改善し得る残基を同定した。この分析に基づいて、いくつかのヒト化ＶＬおよびＶＨ配列は、合成および試験のために設計した。これらは、下記の表において提示する可変ドメイン配列を含む。表において、ＶＨもしくはＶＬドメイン、それに続いてバリアント数を示す数字を示す。数字「０」を伴うドメインは、逆突然変異を有さないヒト化配列を表す。
Figure 0007066613000039
Figure 0007066613000040
Figure 0007066613000041
 可変ドメイン対は、完全抗体の最初の発現および試験のために選択した。５Ｇ２－１Ｂ３のために選択した対の中には、ＶＬ０およびＶＨ０（逆突然変異なし）；ＶＬ１およびＶＨ１；ＶＬ１およびＶＨ２；ＶＬ２およびＶＨ１；ＶＬ２およびＶＨ２；ならびにＶＬ１およびＶＨ３があった。４Ｇ８－１Ｅ３のために選択した対の中には、ＶＬ０およびＶＨ０（逆突然変異なし）；ＶＬ１およびＶＨ１；ＶＬ１およびＶＨ２；ＶＬ２およびＶＨ１；ＶＬ２およびＶＨ２；ＶＬ１およびＶＨ３；ＶＬ３およびＶＨ１；ならびにＶＬ３およびＶＨ３があった。２Ｇ１２－２Ｂ２のために選択した対の中には、ＶＬ０およびＶＨ０（逆突然変異なし）；ＶＬ０およびＶＨ１；ＶＬ０およびＶＨ２；ＶＬ２およびＶＨ１；ＶＬ２およびＶＨ２；ならびにＶＬ０およびＶＨ３があった。８Ｃ２－２Ｄ６のために選択した対の中には、ＶＬ０およびＶＨ０（逆突然変異なし）；ＶＬ１およびＶＨ１；ＶＬ１およびＶＨ２；ＶＬ２およびＶＨ１；ＶＬ２およびＶＨ２；ならびにＶＬ１およびＶＨ３があった。８Ｃ２－２Ｄ６（Ｖ２）のために選択した対の中には、ＶＬ０およびＶＨ０（逆突然変異なし）；ＶＬ１およびＶＨ１；ＶＬ１およびＶＨ２；ＶＬ２およびＶＨ１；ＶＬ２およびＶＨ２；ＶＬ３およびＶＨ２；ならびにＶＬ１およびＶＨ３があった。
３Ｆ１全長重鎖アミノ酸配列（配列番号４０）は、不対システイン残基の存在についてアセスメントした。重鎖の残基８０は、ＩｇＧの部分であるとき対形成しないシステインであると同定された。システインは、溶液中にあるとき溶媒が到達可能であり、したがって反応性であると決定された。マウス３Ｆ１ＶＨバリアントは、この残基（配列番号４０の残基８０）を、セリン残基
（ＱＶＱＬＱＱＳＤＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＨＡＩＨＷＶＫＱＫＰＥＱＧＬＤＷＩＧＹＩＳＰＧＮＧＤＩＫＹＮＥＫＦＫＤＫＶＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＳＭＨＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＫＲＳＬＬＡＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ； 配列番号４２）
で置換するように設計した。
ヒト化３Ｆ１抗体可変ドメインがまた設計されたが、下記の表において提示する。表において、ＶＨもしくはＶＬドメイン、それに続いてバリアント数を示す数字を示す。数字「０」を有するドメインは、逆突然変異を伴わないヒト化配列を表す。提示した全てのＶＨバリアントは、不対システイン残基（配列番号４０の残基８０）をセリン残基で、または疎水性側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン）で置換して設計される。
Figure 0007066613000042
 可変ドメイン対は、完全抗体の最初の発現および試験のために選択した。３Ｆ１のために選択した対の中には、ＶＬ０およびＶＨ０、ＶＬ１およびＶＨ１、ＶＬ１およびＶＨ２、ＶＬ１およびＶＨ３、ＶＬ１およびＶＨ４、ＶＬ０およびＶＨ３があった。
実施例８
ヒト化抗体の特性決定
従前の実施例に記載されているような可変ドメインを有するヒト化ＩｇＧ１抗体を発現させ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＳＴｎ細胞によるフローサイトメトリーをベースとする結合分析；ＢＳＭ ＥＬＩＳＡによる結合分析；およびグリカンアレイ分析を含めた特性決定分析に供した。
フローサイトメトリーをベースとする結合研究において、０～３００ｎＭの濃度範囲に亘り抗体をスクリーニングし、トランスフェクションによって誘発されるＳＴｎ発現を伴うもしくは伴わないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合を比較した。結合は抗ヒトＡＰＣがコンジュゲートした二次抗体を使用して決定し、生細胞のみを考慮した（ヨウ化プロピジウムネガティブゲーティングに基づいて）。試料毎に平均して５，０００の事象を集めた。フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェア（アスランド（Ａｓｌａｎｄ）、ＯＲ）を使用してデータを分析し、結果として生じたＡＰＣ平均およびＡＰＣ％を得た。これらのデータはログ変換し、次いで、非線形回帰モデルにフィットさせ、用量応答曲線およびＥＣ５０結合情報を得た。ヒトアイソタイプＩｇＧ１抗体は、アイソタイプ陰性対照として使用した。上皮成長因子受容体（ＬＡ２２、ＥＭＤミリポア（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ビルリカ、ＭＡ）は、陽性対照として使用した。
ＢＳＭ ＥＬＩＳＡ分析のために、ウシの顎下ムチン（ＢＳＭ）をコーティングしたウェル上で０～１００ｎＭの濃度範囲に亘り抗体をスクリーニングした。ウェルのサブセットは抗体結合の前に穏やかな過ヨウ素酸溶液で処理し、末端シアル酸残基上の側鎖を除去した（ＳＴｎ抗原を破壊する）。過ヨウ素酸および非過ヨウ素酸で処理されたウェルの光学濃度を決定し、ログ変換し、次いで、非線形回帰モデルにフィットさせ、用量応答曲線を得た。過ヨウ素酸で処理されたウェルから得た光学密度値は非過ヨウ素酸で処理されたウェルから減算し、過ヨウ素酸感受性ＳＴｎ結合曲線および対応するＥＣ５０値を得た。
グリカンアレイ分析は従前に記載されたように行い、抗体はその中に記載されているパラメーターによって、アレイグリカン結合プロファイルを割り当てられた。
フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、およびグリカンアレイ分析からの結果は、下記の表において提示する。
Figure 0007066613000043
 試験した全ての抗体は、細胞関連およびＢＳＭ関連ＳＴｎへの結合を示した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（サザンバイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、バーミングハム、ＡＬ）では結合は観察されなかった。ヒト化５Ｇ２－１Ｂ３結合は、信頼できるＥＣ５０をＢＳＭ ＥＬＩＳＡによって決定することができなかったため、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて過ヨウ素酸感受性でなかった。
特性決定実験の結果に基づいて、１リットル発現のために各クローン群からの２つの抗体を選択し、結果として生じた抗体は同じ手順によって再び試験した（下記の表において提示した結果を参照されたい）。
Figure 0007066613000044
 発現した全ての抗体は、細胞関連およびＢＳＭ関連ＳＴｎ結合の両方について２ｎＭ未満のＥＣ５０を示した。
実施例９
抗体－薬物コンジュゲートによるヒト化抗体の分析
従前の実施例に記載されているヒト化抗体の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）バージョンは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）とのコンジュゲーションによって開発した。これは、抗体と、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル－モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＣ－γｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ、本明細書においてＣＬ－ＭＭＡＥと称する）とを接触させることによって行った。このように得られたコンジュゲーションは、マレイミド－システインをベースとし、ここで、抗体鎖間ジスルフィド結合はＴＣＥＰで還元し、次いで、薬物のマレイミド部分に連結させる。
コンジュゲートされた抗体はセファデックスＧ５０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０）カラム上で脱塩し、残留する非反応性の毒素を除去し、次いで、１５０ｍＭのＮａＣｌを有する３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）中で透析した。
次いで、ＡＤＣ抗体は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（親細胞またはＳＴｎの増進された発現のためにトランスフェクト）を使用してＡＤＣ細胞毒性アッセイにおいてアセスメントした。親細胞は、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシンおよび４５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で成長させた。ＳＴｎ陽性細胞は、抗生物質選択のために１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を添加する以外は、同じ培地中で成長させた。細胞は、上記の適切な培地を使用して９６ウェルプレートにおいて別々に播種した（親細胞について４，０００個の細胞／ウェルまたはＳＴｎ陽性細胞について２，０００個／ウェル）。細胞は一晩成長させた。１６～２０時間後、細胞を変動する濃度の試験抗体によって３連で（５０ｎＭから０．０１２ｎＭ）７２時間処理した。次いで、ＡＤＣ ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存率アッセイキット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン、ＷＩ）を使用して細胞を分析し、代謝的に活性細胞の指標である存在するＡＴＰの量を決定した。アッセイは、血清－補足培地中の培養細胞に直接加えられる単一の試薬を使用する。試薬は細胞を溶解し、存在するＡＴＰの量に比例した発光シグナルを生じさせる。発光シグナルは分析し、ＳＴｎ陽性細胞を死滅させるこれらの能力に基づいて使用される各抗体についてのＩＣ５０値を計算するために使用した（下記の表を参照されたい）。
Figure 0007066613000045
 試験した全ての抗体は、一桁のナノモル範囲におけるＩＣ５０値を示したが、それぞれについてのＳＴｎ発現細胞を死滅させる強力な能力を示す。
実施例１０
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片モデル研究
異種移植片モデル研究は、ヒト化ＡＤＣ抗体をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために行う。がん性細胞の皮下注射によってマウスにおいて腫瘍を誘発する。注射のために使用されるがん性細胞は、（１）ＳＴｎの発現を誘発するようにトランスフェクトされた細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＳＴｎ＋細胞）、（２）それらの表面上にＳＴｎを天然に発現するがん細胞系、および（３）原発性ヒト患者腫瘍から採取した患者に由来する腫瘍細胞から選択される。
患者の腫瘍細胞を使用するモデルは、ヒト腫瘍生物学をより忠実に複製し、他のモデルより薬物応答をより良好に予測し得る。いくつかの実験において、患者の腫瘍細胞は、結腸直腸がん患者に由来する。いくつかの実験において、ＲＮＡ配列データベースをサーチして、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉを発現している細胞を同定した後で患者の腫瘍細胞が選択される。いくつかの実験において、患者の腫瘍細胞は、抗ＳＴｎ抗体を使用した免疫染色またはフローサイトメトリー分析によってアセスメントするように、ＳＴｎの発現をベースとして選択する。
腫瘍細胞が研究マウスに注射されると、所望の腫瘍体積（典型的には、約１７５ｍｍ３～約２２５ｍｍ３）に達するまで腫瘍を発生させる。この時点で、マウスは処置群に隔離する。次いで、マウスは、ヒト化ＭＭＡＥがコンジュゲートされた抗体、無関係の対照抗体またはネイキッド（コンジュゲートしていない）抗体対照を含む組成物で処置する。用量は、１キログラムのマウス体重当たり約１～約２０ｍｇの抗体を送達するのに十分である。マウスは、単回用量もしくは複数回用量（例えば、３週間の間週１回）を受ける。処置の間、マウスは、重量の変化および腫瘍体積についてモニターされる。ヒト化ＡＤＣ抗体で処置したマウスにおける腫瘍体積は、約２０～１００％低減する。
実施例１１
組織研究
ヒト化抗体は、ビオチンで直接標識されるか、または抗ヒトＩｇＧビオチン標識二次抗体と事前複合体化させる。ホルマリン固定したパラフィン包埋された組織マイクロアレイ組織切片は、ビオチン化抗体または抗体複合体による処理の前に、脱パラフィンし、再水和し、抗原回収に供する。組織への抗体結合は、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（商標）ＡＢＣキット（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリンゲーム、ＣＡ）を使用して検出され、目に見える沈殿物を生成させる。ヘマトキシリンによる対比染色に続いて、スライドは、染色強度、頻度、および局在化について顕微鏡的に盲検法でスコア化する。各候補抗体について、６０個の試料（３０の器官、または器官の小領域についてそれぞれ２人のヒトドナー）を含有する正常組織マイクロアレイ（ＡＣ１、スーパーバイオチップス（Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）、ソウル、韓国）は、正常組織結合をアセスメントするために使用される。１１８のドナー腫瘍試料を含有するヒトがん組織マイクロアレイ（ＭＡ２およびＭＡ４、スーパーバイオチップス（Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）、ソウル、韓国）を試験して、がん性細胞への抗体結合をアセスメントする。全部で１３の異なる一般の腫瘍タイプは全体的に試験し、各腫瘍タイプについて捕獲した多数の細分類アノテーションを伴う。ヒト化抗体は、ヒトがん組織切片におけるがん性細胞（膵臓および結腸直腸がん細胞を含めた）に結合し、正常な組織切片における細胞には最小の結合を伴うか、または結合しない。
実施例１２
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生存率アッセイ
ＳＴｎを内因的に発現しているがん細胞系（例えば、膵臓および結腸直腸の細胞系）を同定するために実験を行う。試験したものの中には、結腸直腸がんの細胞系［例えば、ＬＳ１８０（ＣＬ－１８７）、ＣＯＬＯ２０５（ＣＬ－２２２）、ＴＢ４（ＣＣＬ－２４８）、ＨＴ２９（ＨＴＢ－３８）、ＲＫＯ（ＣＲＬ－２５７７）、ＳＷ４８０（ＣＣＬ－２２８）およびＳＮＵ－Ｃ２Ａ（ＣＣＬ－２５０．１）細胞系］ならびに膵臓の細胞系［例えば、Ｐａｎｃ－１（ＣＲＬ－１４６９）、ＣＦＰＡＣ１（ＣＲＬ－１９１８）、ＨＰＡＣ（ＣＲＬ－２１１９）、ＡＳＰＣ１（ＣＲＬ－１６８２）、ＢＸＰＣ３（ＣＲＬ－１６８７）、ＣＰＡＮ１（ＨＴＢ－７９）、およびＨＰＡＦＩＩ（ＣＲＬ－１９９７）細胞系］がある。
フローサイトメトリーは、ＳＴｎ発現をアセスメントするために利用する。抗ＳＴｎ抗体は、試験されている細胞系からの細胞と合わせる。ＡＰＣがコンジュゲートされた二次抗体を使用して結合を決定し、生細胞のみを考慮する（ヨウ化プロピジウムネガティブゲートを使用して死細胞を除去する）。試料毎に平均して５，０００の事象を集める。フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェア（アシュランド、ＯＲ）を使用してデータを分析し、結果として生じたＡＰＣ平均およびＡＰＣ％を得る。アイソタイプ対照として、正常なＩｇＧ１抗体を利用する。ＳＴｎを発現している細胞系を同定する。ＳＴｎを発現していることが見出された細胞系を使用して、フローサイトメトリーをヒト化抗体で繰り返す。ヒト化抗体は、ＳＴｎを発現しているがん細胞系に結合することが見出される。
細胞生存率研究は、同定されたＳＴｎを発現しているがん細胞系で行う。ヒト化抗体を使用して、ＭＭＡＥとコンジュゲートしたＡＤＣ抗体を形成させる。細胞はヒト化ＡＤＣ抗体で処理し、各細胞系についてＩＣ５０値を計算する。試験したヒト化ＡＤＣ抗体は、試験したＳＴｎを発現しているがん細胞系を死滅させることにおいて有用である。
実施例１３
組織交差反応性研究
組織交差反応性（ＴＣＲ）研究は、非臨床安全性試験において使用されるヒトおよび関連性のある種に対する抗体の結合プロファイル（オンターゲットおよび潜在的なオフターゲット結合の両方）をアセスメントするために行う。最初の特性決定および最適化のために、予備的なＴＣＲ研究は、ヒト組織（正常に対してがん）におけるヒト化リードＡＤＣ抗体の染色パターンをアセスメントするために行う。リード候補は、最適な染色プロファイルを示し、特定のがん細胞の染色、および正常組織において染色されないかまたは最小の染色を伴う。
ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルの正常組織パネル（例えば、脳、結腸、心臓、肝臓、肺、膵臓、小腸、脾臓、および胃）の凍結切片は、抗ＳＴｎ抗体結合についてプローブする。ヒト膵臓の新生物内の癌腫細胞を陽性対照組織として使用し、同じ組織内のストローマ細胞を陰性対照として使用する。検出は、間接的免疫ペルオキシダーゼ技術、それに続いてＡＢＣ三次システムを利用し、抗ＳＴｎヒト化抗体は、組織のインキュベーションの前にビオチン化二次抗体と事前複合体化されている。検証染色の実行は、全組織パネルを染色する前に、組織の限定されたパネルによって行われ、適切な抗体濃度および条件を決定する。
実施例１４
毒性学および薬物動態研究
毒性学研究は、毒性効果を有する抗体を同定し、各抗体についての無毒性量（ＮＯＡＥＬ）を決定するために、ヒト化ＡＤＣ抗体を使用してラットにおいて行う。マウスはＡＤＣ抗体の細胞毒性構成要素であるアウリスタチンに対して耐性であるため、ラットは適切なモデルである。単回用量および複数回用量研究の両方は、１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇの用量を使用して行う。複数のラットが各処置群に含まれる。単回用量研究のために、動物の健康および体重をモニターし、処置の７２時間後および処置の２週間後を含めた腹腔内（ＩＰ）の抗体投与の後の異なる時点においてラットを殺処分する。複数回用量研究のために、ラットは、０日目、２週目および４週目においてＩＰ抗体注射を受ける。これらの研究において、ラットの健康および体重をモニターし、最後の用量の２４時間後および最後の用量の２週間後を含めた投与後の異なる時点においてラットを殺処分する。
殺処分の後、器官（副腎、脳、結腸、腸、心臓、腎臓、肺、顎下唾液腺、パンクレアーゼ、脾臓、胃、および甲状腺）を収集し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および病理学的評価のために、ホルマリン固定し、パラフィン包埋する。
試験したヒト化ＡＤＣ抗体の単回および複数回用量投与に供したラットは、体重減少または有害な健康効果の徴候を示さない。器官はまた、試験した全ての時点において正常のように思われる。
薬物動態分析のために利用されたラットにおいて、研究期間の前および研究期間に亘り血液試料を得て、研究抗体の血清濃度レベルを定量化し、薬物動態モデリングを行う。単回用量の結果および複数回用量研究デザインに基づいて、投薬の少なくとも２４時間前に、１日目に（投与の概ね１時間後、４時間後、および８時間後に）、２日目に（投与の概ね２４時間後に）、３日目に（投与の概ね４８時間後に）、４日目に（投与の概ね７２時間後に）、ならびに投与の後の様々な時間に血液を得る。
血液試料は凝血させ、血清は遠心分離によって分離する。結果として生じた試料は、臨床病理評価（臨床化学、血液学、および凝固）に供する。臨床化学評価は、ナトリウム、クレアチニン、総タンパク質、カリウム、アルカリホスファターゼ、トリグリセリド、クロリド、アラニンアミノトランスフェラーゼ、総ビリルビン、カルシウム、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、無機リン、グルコース、グロブリン、尿素、窒素、コレステロール、およびアルブミン／グロブリン比の分析を含む。血液学評価は、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン濃度、ヘモグロビン、網状赤血球数（絶対的および相対的）、血小板数、赤血球数、平均血小板容積、総白血球数、平均赤血球ヘモグロビン量、白血球百分率数（絶対的および相対的）、平均赤血球容積、ならびに赤血球分布幅の評価を含む。凝固分析のために、プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間を決定する。臨床病理評価は、ヒト化ＡＤＣ抗体による処置からの有害効果を示さない。
実施例１５
患者に由来する腫瘍細胞の評価
患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）細胞のＳＴｎ発現プロファイルを特性決定するために実験を行う。従前に記載したように、患者に由来するがん細胞を使用して、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍を生じさせる。結果として生じたＰＤＸ腫瘍からの細胞を取り出し、解離し、ＳＴｎ発現についてスクリーニングする。スクリーニングは免疫組織化学（ＩＨＣ）によって最初に行い、次いで、フローサイトメトリー分析によって確認する。連続した研究のために、ＳＴｎの最良の発現を伴うＰＤＸ腫瘍からの細胞を選択する。
１つの連続した研究において、選択したＰＤＸ腫瘍からの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。いくつかの培養物は細胞毒性剤であるＭＭＡＥとコンジュゲートした本明細書に記載されているヒト化抗ＳＴｎ抗体で処理し、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成させる。これらのＡＤＣが培養細胞を死滅させる能力は、細胞生存率アッセイを使用して決定する。化学療法剤を伴うもしくは伴わないこれらの培養物の処理を比較するために研究を行う。ヒト化抗ＳＴｎ ＡＤＣは、ＳＴｎを発現しているＰＤＸ腫瘍からの細胞を死滅させることができる。細胞を化学療法剤で最初に処理したとき、ヒト化抗ＳＴｎ ＡＤＣがこれらの細胞を死滅させる能力は増進される。
別の連続した研究において、選択したＰＤＸ腫瘍からの細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、化学療法剤を伴ってまたは伴わずに処理する。化学療法剤処置の前および後のＳＴｎ発現を評価する。評価した細胞におけるＳＴｎ発現は、化学療法剤処置の後に増加する。
実施例１６
ＯＶＣＡＲ３異種移植片モデルを使用した抗体試験
ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍モデルにおいてがん細胞を低減させるヒト化抗ＳＴｎ抗体の有効性を評価する。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニングライフサイエンス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、コーニング、ＮＹ）懸濁液中の５×１０５個のＯＶＣＡＲ３細胞を注入し、ＯＶＣＡＲ３腫瘍形成を誘発させる。マウスが１７５～２２５ｍｍ３の範囲の腫瘍体積を示すと、これらを本質的に同等である群平均腫瘍体積を伴う群に無作為化する。ＭＭＡＥコンジュゲートを伴うヒト化抗ＳＴｎ抗体、アイソタイプ対照抗体、またはビヒクル対照［２０ｍＭのシトレート（ｐＨ５．５）および１５０ｍＭのＮａＣｌ］は、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、処置の後、週２回、４週間、マウスは腫瘍体積および体重の変化についてモニターする（または腫瘍サイズが≧１０００ｍｍ３のエンドポイント体積に達するまで）。次いで、腫瘍は抽出し、生存腫瘍細胞の存在およびＳＴｎ発現について評価する。腫瘍体積を阻害もしくは低減させ；がん細胞数を低減させることができる抗体；および／または腫瘍におけるＳＴｎ発現は、さらなる研究において同定および使用される。
実施例１７
単一の抗体処置の後のＰＤＸ試料の評価
異なる抗体用量における抗ＳＴｎ抗体療法に対する異なる特徴を有するＰＤＸモデルの応答性を比較するために実験を行う。継代された卵巣癌ＰＤＸ腫瘍からのゆっくり凍結した組織をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに埋め込み、これらのマウスにおいて１６週間に亘りＰＤＸ腫瘍を生じさせる。腫瘍を収集し、２５匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに再注入し、１２週間に亘りＰＤＸ腫瘍を生じさせる。結果として生じた腫瘍を再び収集し、５２匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに再注入し、１２週間の間、腫瘍を形成させる。次いで、これらのマウスは、２．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ用量でのヒト化抗ＳＴｎ抗体（ＭＭＡＥとコンジュゲートしている）；アイソタイプ対照抗体；またはビヒクル対照［２０ｍＭのシトレート（ｐＨ５．５）および１５０ｍＭのＮａＣｌ］の腹腔内注射で処置する。マウスの体重および腫瘍体積の変化は、処置の後（または腫瘍サイズが≧１０００ｍｍ３のエンドポイント体積に達するまで）週に２回モニターする。次いで、腫瘍を抽出し、フローサイトメトリーを使用して腫瘍細胞生存率およびＳＴｎ発現について評価する。抗ＳＴｎ抗体処置に応答するＰＤＸ腫瘍を同定する。
実施例１８
ＰＤＸ腫瘍の複数用量処置
ヒト化抗ＳＴｎ処置への応答性を示すＰＤＸ腫瘍からの細胞は、複数用量抗体処置研究において使用するために選択する。継代された卵巣癌ＰＤＸ腫瘍からのゆっくり凍結した組織はＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに埋め込み、１６週間に亘りこれらのマウスにおいてＰＤＸ腫瘍を生じさせる。腫瘍は収集し、２５匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに再注入し、１２週間に亘りＰＤＸ腫瘍を生じさせる。結果として生じた腫瘍は再び収集し、５２匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに再注入し、腫瘍を１２週間形成させる。次いで、これらのマウスは、５ｍｇ／ｋｇの用量のヒト化抗ＳＴｎ抗体（ＭＭＡＥとコンジュゲートしている）；アイソタイプ対照抗体；またはビヒクル対照［２０ｍＭのシトレート（ｐＨ５．５）および１５０ｍＭのＮａＣｌ］の腹腔内注射によって、４週間の間毎週処置する。マウスの体重および腫瘍体積の変化は、処置の後週２回モニターする（または腫瘍サイズが≧１０００ｍｍ３のエンドポイント体積に達するまで）。次いで、腫瘍は抽出し、腫瘍細胞生存率およびＳＴｎ発現についてフローサイトメトリーを使用して評価する。抗ＳＴｎ抗体処置に応答性であるＰＤＸ腫瘍が同定される。ＭＭＡＥがコンジュゲートされたヒト化抗ＳＴｎ抗体は、腫瘍体積を低減させるのに最も有効である。
実施例１９
交差反応性、毒性学
交差反応性研究を行って、組織パネルを使用した免疫組織化学染色によって、ヒト、イヌ、およびラット対象の間のヒト化抗ＳＴｎ抗体の交差反応性を決定する。ヒト化抗ＳＴｎ抗体は、イヌおよびラット対象の両方と交差反応することが見出される。ラットにおいてさらなる毒物学的研究を行い、ヒト化抗ＳＴｎ抗体の毒性をアセスメントする。アセスメントは、生存中のアセスメント、例えば、死亡率／罹患率、臨床所見、体重、摂食量、体温、局所刺激、および眼科学を含む。ヒト化抗ＳＴｎ抗体は、１０ｍｇ／ｋｇおよびそれ未満の用量で毒性であることが見出されない。
実施例２０
薬物動態研究
ＭＭＡＥとコンジュゲートしたヒト化抗ＳＴｎ抗体は、げっ歯類（例えば、ラット）または霊長類研究モデルに２．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、抗体半減期および臨床病理学（例えば、臨床化学、血液学、および凝固）を評価する。アセスメントは、７２時間、２週および４週の時点で行う。
半減期分析のために、抗体投与の１時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に、抗体体液濃度を決定する。
臨床病理学のために、血液試料は、投薬の前（事前試験）、および投薬後の複数の時点において研究対象から集める。臨床化学のために、ナトリウム、クレアチン、総タンパク質、カリウム、アルカリホスファターゼ、トリグリセリド、クロリド、アラニンアミノトランスフェラーゼ、総ビリルビン、カルシウム、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、無機リン、グルコース、グロブリン、尿素、窒素、コレステロール、およびアルブミン／グロブリン比を測定する。血液学のために、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン濃度、ヘモグロビン、網状赤血球数（絶対的および相対的）、血小板数、赤血球数、平均血小板容積、総白血球数、平均赤血球ヘモグロビン量、白血球百分率数（絶対的および相対的）、平均赤血球容積、ならびに赤血球分布幅を決定する。凝固のために、プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間を評価する。
最後に、研究動物は安楽死させ、器官（副腎、脳、結腸、腸、心臓、腎臓、肺、顎下唾液腺、膵臓、脾臓、胃および甲状腺）を収集し、ホルマリン固定し、Ｈ＆Ｅ染色のためのパラフィン包埋、専門委員会に認可された病理学者による病理学的評価を行う。試験したヒト化抗体では有害効果は観察されない。
実施例２１
ヒト化抗ＳＴｎ抗体を産生する安定的な細胞系
産生のためのＧＭＰ施設への移行に適した安定的な細胞系は、ヒト化抗ＳＴｎ抗体を産生するために産生される。ＦＲＥＥＤＯＭ（登録商標）ｐＣＨＯ１．０ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォルサム、ＭＡ）は、本明細書において提示する可変ドメインの１つもしくは複数を有するヒト化抗体を発現している構築物を生じさせるために使用する。構築物は、Ｇｉｂｃｏ ＦＲＥＥＤＯＭ（登録商標）ＣＨＯ－Ｓ（登録商標）キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォルサム、ＭＡ）を使用してトランスフェクションによってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）浮遊細胞中に導入し、細胞はキット説明書によって培養し、統合された構築物の安定発現を示すピューロマイシン耐性細胞を選択する。結果として生じた安定的な細胞系は、抗体産生および貯蔵のために成長させる。
実施例２２
増進されたＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ発現を伴うＳＫＯＶ３細胞系の生成
ＳＫＯＶ３細胞は、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ発現構築物（ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ＿ｐＲｃ－ＣＭＶ）を送達するレンチウイルスベクターで形質導入した。安定的な細胞プールを生じさせ、［定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析によって決定するように］変動する発現のＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉを伴う６つのクローンを選択した（下記の表を参照されたい）。
Figure 0007066613000046
 クローン７、８、および１３は、形質導入されていない細胞系におけるレベルと比較したときに、最も高いレベルのＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ ｍＲＮＡを示した。
実施例２３
変動するＳＴｎ発現レベルを伴う細胞を使用した異種移植片腫瘍モデル研究
ヒト化抗ＳＴｎ抗体処置に対する変動するレベルのＳＴｎ発現を伴う異種移植片腫瘍の応答性を比較するために実験を行う。変動するレベルのＳＴｎ発現（すなわち、ＳＴｎ発現を伴わない細胞、低レベルのＳＴｎ発現を伴う細胞、中間レベルのＳＴｎ発現を伴う細胞、および高レベルのＳＴｎ発現を伴う細胞）を伴う腫瘍細胞を得る。これらは、ＳＴ６ＧＡｌＮＡＣ Ｉを過剰発現するように改変された細胞；ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ発現がノックダウンされた細胞；およびＳＴｎが発現されていない、低発現レベル、中発現レベル、または高発現レベルの改変されていない細胞を含む。腫瘍細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに埋め込み、腫瘍を生じさせる。
次いで、マウスは、ヒト化抗ＳＴｎ抗体（コンジュゲートしたＭＭＡＥを有するもしくは有さない）；アイソタイプ対照抗体；またはビヒクル対照［２０ｍＭのシトレート（ｐＨ５．５）および１５０ｍＭのＮａＣｌ］の腹腔内注射で８週間処置する。マウスの体重および腫瘍体積の変化は、処置後に週２回モニターする。８週間後、抗ＳＴｎ抗体処置を受けているマウスは、さらに８週間の初期治療を続けるか、またはビヒクル対照での８週間の処置に無作為化する。１６週の期間の終わりに、血清試料を得て、腫瘍細胞生存率およびＳＴｎ発現についてのフローサイトメトリーを使用した評価のために腫瘍を抽出する。
ＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＳＴｎ抗体は、最も高いレベルの抗腫瘍活性を生じさせる。無作為化による抗ＳＴｎ－ＭＭＡＥ処置の中止は腫瘍の復活を促進し、一方、抗ＳＴｎ－ＭＭＡＥ抗体による持続性の治療は腫瘍の復活を防止する。
実施例２４
ＳＴｎの発現のための細胞系のスクリーニング
乳房、結腸、卵巣、リンパ球、骨髄、胃、膵臓、結腸直腸、皮膚細胞および他の腫瘍学的徴候の細胞系は、ＳＴｎ発現についてスクリーニングする。試験した細胞系は、ＳＮＵ－１６細胞、ＬＳ－１７４Ｔ細胞、ＭＣ３８細胞、ＣＯＬＯ２０５、ＲＫＯ、ＨＴ２９、Ｐａｎｃ１、ＨＰＡＣ、ＨＰＡＦＩＩ、ＴＯＶ－１１２Ｄ細胞、ＴＯＶ－２１Ｇ細胞、Ｊｕｒｋａｔｅ Ｅ６．１細胞、Ｋ－５６２細胞、Ｂ１６－Ｆ０細胞、およびＢ１６－Ｆ１０細胞を含む。
結腸直腸細胞系［例えば、ＬＳ１８０（ＣＬ－１８７）、ＣＯＬＯ２０５（ＣＬ－２２２）、ＴＢ４（ＣＣＬ－２４８）、ＨＴ２９（ＨＴＢ－３８）、ＲＫＯ（ＣＲＬ－２５７７）、ＳＷ４８０（ＣＣＬ－２２８）、およびＳＮＵ－Ｃ２Ａ（ＣＣＬ－２５０．１）］は、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ発現および望ましい特徴（例えば、倍増時間、腫瘍化特性、化学療法抵抗性および抗原発現）に基づいてスクリーニングのために選択する。表面および酵素発現が発生および分化の間の細胞成長条件に基づいて異なり得ることを考え、ＳＴｎ発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで成長した両方の細胞上で試験する。
細胞系は、フローサイトメトリーによってＳＴｎ発現分析に供する。ヒト化抗ＳＴｎ抗体はＳＴｎ発現についてプローブするために使用され、ヒトアイソタイプ対照は陰性対照として利用する。
各細胞系は培養液中で増殖し、異なる成長フォーマットの間で分配する。ｉｎ ｖｉｖｏでのフォーマットのために、細胞はＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（コーニングライフサイエンス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、コーニング、ＮＹ）懸濁液［１：１（ｖ／ｖ）の比で５×１０６個の細胞、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を伴う］中でＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注入し、異種移植片モデルを生じさせる。２００ｍｍ３、４００ｍｍ３、６００ｍｍ３、または１０００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有するマウスを殺処分し、フローサイトメトリーによるＳＴｎ発現分析のために、および免疫組織化学分析のためのホルマリン固定したパラフィン包埋のために腫瘍を抽出する。
ＳＴｎ発現を示す細胞は、抗ＳＴｎ抗体の選択、特性決定、および試験を含めたさらなる研究のために使用する。ＳＴｎの低発現または無発現を示すいくつかの細胞は、さらなる研究（例えば、抗ＳＴｎ抗体の選択、特性決定、および試験）において使用する前に、ＳＴｎを発現するようにトランスフェクトする。
実施例２５
ＳＴｎを発現している結腸直腸細胞系におけるヒト化抗ＳＴｎ抗体の試験
ヒト化抗ＳＴｎ抗体は、ＳＴｎを発現している結腸直腸細胞系中に内部移行するこれらの能力についてアセスメントする。抗ＣＥＡ抗体は、陽性対照として使用する。ＣＥＡは、多くのタイプの結腸がん細胞の表面上で発現していることが公知であり、ＣＥＡを発現している他の細胞型と共に、結腸直腸細胞中に内部移行し得る。抗ＳＴｎ抗体および対照は、メーカーの指示によってＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標）４８８（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、ＭＡ）で共有結合的に標識する。フローサイトメトリーによって内部移行をアセスメントする前に、表面結合した抗体シグナルは、抗ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標）４８８抗体を使用してブロックする。結果は、抗ＳＴｎ抗体がＳＴｎを発現している結腸直腸細胞系によって内部移行することを示す。
実施例２６
バイスタンダー死滅アッセイ
ＳＴｎ－陽性細胞はｔｒａｎｓｗｅｌｌ中に播種し、ＳＴｎ－低または陰性ｅｘｐｒｅｓｓｏｒはプレートの底上に播種する。ＳＴｎ陽性細胞のみまたはＳＴｎ陰性細胞のみを有するウェルは、対照として含める。ＭＭＡＥコンジュゲートを伴う０～３００ｎＭの用量の抗ＳＴｎ抗体は、培養物（および毒性対照としていくつかのウェルにおける遊離ＭＭＡＥ）に加え、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（マディソン、ＷＩ）ＡＤＣ ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存率アッセイキットを使用して、ＳＴｎ低発現または陰性発現細胞の生存率を決定し、これは代謝的に活性な細胞の指標として存在するＡＴＰの量を決定する。
結果は、ＳＴｎ発現細胞が、抗ＳＴｎ ＭＭＡＥがコンジュゲートした抗体を内部移行することを示す。死にかけている細胞は切断された遊離ＭＭＡＥを放出し、これはｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜を横切って移動し、僅かから皆無のバイスタンダー死滅が非／低ＳＴｎ発現細胞における毒性を通して観察される。
実施例２７
血漿安定性研究
ヒト化抗ＳＴｎ抗体の血漿安定性は、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウス血漿において評価する。抗体はヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスの血漿中にｉｎ ｖｉｔｒｏでスパイクし、次いで、３７℃にて１４日間までインキュベートする。血漿試料中の総ヒト化抗体、ヒト化抗体ＭＭＡＥコンジュゲート、および遊離ＭＭＡＥの濃度は、免疫アッセイおよびＬＣ－ＭＳをベースとする方法を使用して異なる日において定量化する。薬物と抗体の比（ＤＡＲ）はまた、同じ試料においてアセスメントする。抗体は血漿中で相対的に安定的であり続け、ＤＡＲは研究に亘って僅かなバリエーションを示す。
実施例２８
抗体マイクロアレイを使用したＳＴｎ含有タンパク質の同定
ＳＴｎ発現を誘発するトランスフェクションを伴うもしくは伴わないがん細胞（ＭＤＡ ＭＢ２３１）は、ＳＴｎグリコシル化を担持するタンパク質を同定するために使用した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＳＴｎ＋／－からの粗細胞ライセートは、プリントされた抗体マイクロアレイでプローブした（Ｒｈｏら著、２０１３年）。各アレイは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）－エステル反応性３Ｄ薄膜表面スライド（ネクステリオンＨスライド（Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ Ｈ ｓｌｉｄｅ）、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ））によって共有結合的に不動化された、概ね２１００の独自のタンパク質を標的とする概ね３５００のヒトタンパク質特異的抗体を三連で含有する。プリントされた抗体の標的は、がんに関連するタンパク質、シグナル伝達タンパク質、および従前に同定された血漿がんタンパク質から選択した。
凍結したマイクロアレイスライドは、室温へと３０分間平衡化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％Ｔｗｅｅｎ２０中で水和し、次いで、蒸留／脱イオン水（ｄｄ Ｈ２Ｏ）ですすいだ。次いで、５０ｍＭのホウ酸ナトリウムｐＨ８中の０．３％（ｖ／ｖ）エタノールアミンで３０分間、それに続いて、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で３０分間インキュベートすることによってスライドをブロックした。次に、アレイは、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、それに続いてｄｄ Ｈ２Ｏで洗浄した。次いで、スライドラックホルダー（（ソーバルレジェンドＲＴ）Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ ＲＴ）を有するスインギングバケットロータにおいて、アレイは５００ｒｐｍでの８分間の遠心分離によって乾燥させた。アレイの抗体をプリントされたエリアはカバーガラス（ｍシリーズリフタースリップ（ｍＳｅｒｉｅｓ Ｌｉｆｔｅｒ Ｓｌｉｐｓ）、２２×２５×１ｍｍ、サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））でカバーした。
ＳＴｎ含有タンパク質の存在を検出するために、ＳＴｎ＋／－細胞を培養し、３つの生物学的反復試験片で粗細胞ライセートを集め、試料を得た（ＳＴｎ＋についてＮ＝３およびＳＴｎ－についてＮ＝３）。ライセートはスライド上にマイクロアレイ／カバーガラスのジャンクションにおいてピペット処理し、６０分間室温にてインキュベートした。次いで、スライドは、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分間、２回洗浄した。蛍光シアニン５色素にコンジュゲートしたシアマブ（Ｓｉａｍａｂ）のＳＴｎ抗体（Ｈｕ３Ｆ１、Ｌ１Ｈ１；Ｈｕ２Ｇ１２－２Ｂ２、Ｌ２Ｈ２；Ｈｕ５Ｇ２－１Ｂ３、Ｌ１Ｈ２およびＨｕ３Ｆ１、Ｌ１Ｈ１）と共にインキュベートした後で、ＳＴｎ含有糖タンパク質が検出された。アレイはＰＢＳ中の０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回、５分間、それに続いてＰＢＳで２回（それぞれ５分）、およびｄｄ Ｈ２Ｏ水で１回洗浄し、それに続いて遠心分離による乾燥を行った。シグナルのバックグラウンドレベルを決定するために、アレイは単にＳＴｎ抗体（細胞ライセートは加えない）と共にインキュベートし、このように得られたシグナルはバックグラウンド除去法のために使用した。次いで、スライドはジェネピックス（Ｇｅｎｅｐｉｘ）４２００Ａマイクロアレイスキャナー（アクソンインストルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））上でスキャンし、赤い（Ｃｙ５）イメージを生じさせた。スキャンしたアレイイメージのスポット蛍光強度は、ジェネピックスプロ（ＧｅｎｅｐｉｘＰｒｏ）６．０イメージ分析ソフトウェアを使用して得た。
ＳＴｎ＋およびＳＴｎ－条件の間の蛍光強度（ＦＩ）の差異は、３つの統計的方法によって分析した。（１）エフェクトサイズ（（（平均ＦＩ ＳＴｎ＋細胞－平均ＦＩ ＳＴｎ－細胞））／ＳＴｎ－細胞の標準偏差）。エフェクトサイズ＞３は、このアッセイにおいて望ましと考えられる。（２）ｐ値。ｐ値＜０．２５は、このアッセイにおいて望ましい。（３）比（２（対数平均ＦＩ ＳＴｎ＋細胞）－対数平均ＦＩ ＳＴｎ－細胞）。比＞１．２は、タンパク質がＳＴｎ＋細胞において増加していることを示し、比＜０．８は、タンパク質がＳＴｎ＋細胞において減少していることを示唆する。
各抗体異なる結合特性を有するように見えたが、異なる抗体の間の特定のタンパク質結合の確認は、がんのシアリルＴｎ含量の全体的なアップレギュレーションの強力な証拠であった。さらに、公知のＳＴｎ担体であるＭＵＣ１６およびＭＵＣ１が、このアッセイにおいて検出された。トップ３５ヒットは、形質膜（７）、細胞外空間（８）、細胞核（６）および細胞質（１７）に位置しているタンパク質からなった。全体的に、Ｈｕ３Ｆ１、Ｌ１Ｈ１は、最も広範な特異性を有し、検出した全部で８６のタンパク質の６３においてアップレギュレーションを検出した。このアッセイにおいてＨｕ３Ｆ１，Ｌ１Ｈ１、Ｈｕ２Ｇ１２－２Ｂ２、Ｌ２Ｈ２、Ｈｕ５Ｇ２－１Ｂ３、Ｌ１Ｈ２を使用して検出したＳＴｎグリコシル化を有するいくつかのタンパク質の一例を、下記の表において列挙する。
Figure 0007066613000047
 列挙した全てのタンパク質は、少なくとも１種のＳＴｎ抗体に対する親和性を示したが、これはＳＴｎグリコシル化の存在を示唆する。ＩＨＨは、リスト上に３つの別々のエントリーとして現れる。これらはＩＨＨに対する３種の独自の抗体によって捕獲される。下記のタンパク質は、２つの異なる抗体クローン：ＩＬ１０、ＳＰＰ１、ＬＹ６Ｄ、ＭＵＣ１６、Ｆ５、ＰＤＰＫ１、ＳＭＳ、ＭＡＰＫ３、ＯＡＳ１、ＣＲＡＤＤ、ＧＲＢ２、ＰＲＤＸ６、ＰＣＮＡおよびＣＵＸ１との結合を示し、これらのＳＴｎグリコシル化を強力に示した。
これらのＩＬ１０、ＳＰＰ１、ＬＹ６ＤおよびＭＵＣ１６は、細胞外または細胞膜局在化を有し、がんバイオマーカーとして従前に結び付けられてきた。
ＩＬ１０：インターロイキン－１０は、活性化されたマクロファージおよびヘルパーＴ細胞によって産生される、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＴＮＦおよびＧＭ－ＣＳＦを含めたいくつかのサイトカインの合成を阻害する。
ＳＰＰ１：オステオポンチンは、リガンド、シアル酸によって活性化され、Ｉ型免疫のために必須である。これは、ＣＤ４４と相互作用することができる。ＳＰＰ１は、サイトカインとして作用し、インターフェロン－ガンマおよびインターロイキン－１２の産生を増強し、インターロイキン－１０の産生を減少させる。
ＭＵＣ１６：ムチン－１６またはＣＡ－１２５は、卵巣がんについての公知のがんバイオマーカーである。
ＬＹ６Ｄ：リンパ球抗原６Ｄは、Ｂ細胞およびＴ細胞発生の間のリンパ球の特異化段階においてＢ細胞特異化マーカーとしての役割を果たす。
スクリーニングによって同定されるタンパク質のいくつかは、１種のみのＳＴｎ抗体クローンに特有であった。Ｈｕ３Ｆ１、Ｌ１Ｈ１によってグリコシル化を示すタンパク質は、下記の表において表す。
Figure 0007066613000048
 ＴＬＮ１：タリン－１は、細胞骨格構造および形質膜の間の接続の部分である。ＴＬＮ１は、マウス挿入突然変異誘発実験において従前に同定されたが、がんにおける原因となる役割を示唆する。ＴＬＮ１発現は、がん細胞の浸潤および移動と相関する。
ＭＵＣ１：ムチン－１のベータサブユニットは、リン酸化およびタンパク質間相互作用によって細胞シグナル伝達に関与しているＣ末端ドメインを含有し、これを通してこれは腫瘍成長を促進することができる。Ｂ細胞において、Ｍｕｃ１は、ＥＲＫ、ＳＲＣおよびＮＦ－カッパ－Ｂシグナル伝達経路をモジュレートする。一方、活性化Ｔ細胞において、これはＲａｓ／ＭＡＰＫ経路をモジュレートする。
Ｈｕ２Ｇ１２－２Ｂ２、Ｌ２Ｈ２によるグリコシル化を示すタンパク質は、下記の表において表す。
Figure 0007066613000049
 ＡＬＤＨ１Ａ１：レチナールデヒドロゲナーゼは、がん幹細胞マーカーである。これはまた化学療法耐性において結び付けられてきた。
ＡＮＯ１：アノクタミン－１は、カルシウム活性化クロライドチャネルであり、これは経上皮アニオン輸送において役割を果たす。ＡＮＯ１は、乳がん細胞系および原発性腫瘍において増幅され、高度に発現されている。
Ｈｕ５Ｇ２－１Ｂ３、Ｌ１Ｈ２によるグリコシル化を示すタンパク質は、下記の表において表す。
Figure 0007066613000050
 ＧＰＣ３：グリピカン－３は、ヘパラン硫酸を担持する細胞表面プロテオグリカンである。これは主に中胚葉組織および器官における成長の抑制に関与している。抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体は、マウスにおいて抗がん活性を有することが示されてきた。
Ｈｕ３Ｆ１、Ｌ１Ｈ１抗体によってＳＴｎグリコシル化を示すタンパク質は、Ｍｕ３Ｆ１を使用してグリコシル化を示すタンパク質と比較した。結果は、下記の表におい提示する。
Figure 0007066613000051
 実施例２９
代替グリカンアレイを使用したヒト化抗体試験
列挙した全てのタンパク質は、両方のＳＴｎ抗体に対して親和性を示し、ＳＴｎグリコシル化の存在を示した。これらのＣＯＬ４Ａ３、ＣＣＲ５、およびＭＵＣ１は、細胞外または細胞膜局在化を有し、がんバイオマーカーとして従前に結び付けられてきた。
ＣＯＬ４Ａ３：コラーゲンアルファ－３（ＩＶ）鎖。ＩＶ型コラーゲンは、ラミニン、プロテオグリカンおよびエンタクチン／ナイドジェンと一緒に「チキンワイヤー」網目構造を形成する、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の主要な構造的構成要素である。コラーゲンアルファ３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインに対応する切断フラグメントであるタムスタチンは、抗血管新生および抗腫瘍細胞活性の両方を有する。
ＣＣＲ５：Ｃ－Ｃケモカイン受容体５型は、いくつかの炎症性ＣＣ－ケモカインについての受容体である。ＣＣＲ５は、血液からヒト結腸直腸がんにおける腫瘍部位への調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の動員において結び付けられてきた。腫瘍成長はＣＣＲ５－／－マウスにおいて遅延しており、腫瘍Ｔｒｅｇ浸潤の低減と関連している。
１３の化学的に合成され、詳細に明らかにされたグリカンを有する代替グリカンアレイはまた、単一の実験において複数のグリカンについての抗体の親和性および特異性を試験するために利用した。代替グリカンアレイは、下記の表において列挙したＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃグリカン対を含む。
Figure 0007066613000052
 ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）がコンジュゲートされた、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）がコンジュゲートされた、またはアミンがコンジュゲートされたグリココンジュゲートは、グリカンプローブ調製のために利用した。グリココンジュゲートは、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ユー，Ｈ．（Ｙｕ，Ｈ．）ら著、２００７年、有機化学および生体分子化学（Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ．）、５巻：２４５８～６３頁において記載された方法によって化学酵素的に合成した。シアログリカンは、ユー（Ｙｕ）らによって記載されているように「ワンポット３酵素」アプローチを使用して合成される（そのそれぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、ユー，Ｈ．（Ｙｕ，Ｈ．）ら著、ネイチャープロトコル（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．）、２００６年、１巻（５号）：２４８５～９２頁、ユー，Ｈ．（Ｙｕ，Ｈ．）ら著、アメリカ化学会誌（Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．）、２００５年、１２７巻：１７６１８～９頁およびユー，Ｈ．（Ｙｕ，Ｈ．）ら著、２００６年、アンゲヴァンテケミーインターナショナルエディション英語版（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．）、４５巻：３９３８～４４頁）。化合物構造は、ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）質量分析法によって確認した。それぞれの合成されたグリカンの純度はＨＰＬＣ分析によってアセスメントし、９５％超の純度を伴うグリカン調製物のみを使用した。
アレイは、各スライド上に１６のサブアレイブロックを有する９４６ＭＰ３マイクロアレイプリンティングピン（アレイイット社（Ａｒｒａｙｉｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、サニーベール、カリフォルニア）を備えたナノプリント（ＮａｎｏＰｒｉｎｔ）ＬＭ－６０マイクロアレイヤーでエポキシド誘導体化スライド（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ニューヨーク）上にプリントした。グリカンプローブは、試料毎に４つの複製ウェルおよびウェル毎に８μＬを使用して３８４ウェル源プレート中に分配した。グリカンプローブを、プリント緩衝液（３００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．４）中でグリカン毎に１００μＭの濃度で調製した。さらに、リンカー（Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２）単独および緩衝液単独（３００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．４）は、４連でアレイ上にプリントした。プリント品質をモニターするために、マウスＩｇＧおよびヒトＩｇＧはまた、各スライド上にプリントした（１０％グリセロールを含有するＰＢＳ中４０ｎｇ／ｕＬおよび２０ｎｇ／ｕＬ、ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウエストグローブ、ペンシルベニア）。アレイは４個の９４６ＭＰ３ピンでプリントした（５μｍのチップ、０．２５ｕＬの試料チャネル、概ね１００μｍのスポット直径、アレイイット社（Ａｒｒａｙｉｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））。各ブロック（サブアレイ）は、１０列、８カラム、２７５μｍのスポット間の間隔を有した。アレイチャンバーにおける湿度レベルは、プリントの間に約７０％に維持した。プリントされたスライドはアレイヤーデッキ上に一晩静置し、湿度を周囲レベル（４０～４５％）に低下させた。次いで、スライドをパックし、真空シールし、室温にて貯蔵した。
グリカンアレイは、Ｈｕ２Ｇ１２－２Ｂ２、Ｌ０Ｈ２、Ｈｕ８Ｃ２－２Ｄ６、Ｌ１Ｈ１、Ｈｕ５Ｇ２－１Ｂ３、Ｌ１Ｈ２、Ｍｕ２Ｇ１２－２Ｂ２、およびＭｕ３Ｆ１を使用してアッセイした。
さらに、対照抗体およびレクチンはまたアレイ上で試験し、アレイにおけるグリカンが公知のグリカン結合剤によって認識することができるかを決定した。これらは、（ａ）Ｇｃ含有グリカン、Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（ＧｃＳＴｎ）（グリカン識別番号２）、Ｎｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号４）、Ｎｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号６）、Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号８）およびＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号１３）に結合する抗Ｇｃ抗体；（ｂ）（２，３）－連結シアル酸を含有するグリカン、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号１２）およびＮｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号１３）に結合するＭＡＬ－ＩＩ（イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）レクチンＩＩ）；（ｃ）末端ガラクトースに連結した（２、６）シアル酸を含有するグリカン、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号３）、Ｎｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号４）、Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号５）およびＮｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２（グリカン識別番号６）に優先的に結合するＳＮＡ（セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａ）レクチン）；ならびに（ｄ）アイソタイプ陰性対照として、予想どおりグリカンも、リンカー／緩衝液プリントされた対照も結合していないパリビズマブを含む。
エポキシブロッキング緩衝液（３００ｍｌ）は、１５ｍｌのトリス緩衝液（ｐＨ８、２Ｍ）と、０．９ｍｌのエタノールアミン（１６．６Ｍ）および２８４．１ｍｌの蒸留水とを合わせることによって調製した。０．２μＭのニトロセルロース膜を使用して溶液を濾過した。エポキシ緩衝溶液および１Ｌの蒸留水を５０℃に事前に温めた。スライドガラスはスライドホルダー中に配置し、温めたエポキシブロッキング緩衝液を有する染色タブに迅速に浸した。スライドをエポキシブロッキング緩衝液中で定期的に振盪しながら５０℃にて１時間インキュベートし、エポキシ結合部位を不活性化した。次に、スライドを蒸留水ですすぎ、プロプレート（ＰｒｏＰｌａｔｅ）スライドホルダー（グレースバイオラボ（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ）＃２０４８６２ １６、四角、７×７ｍｍチャンバー）中に置き、次いで、１％ＯＶＡを有するＰＢＳで２５℃にて１時間ブロックした。試験抗体およびアイソタイプ対照抗体は、１ｕｇ／ｍＬおよび２．５ｕｇ／ｍＬで試験した。対照抗体抗Ｇｃは、０．５ｕｇ／ｍＬおよび１ｕｇ／ｍＬで試験した。対照ビオチンタグ付けレクチンは、ＭＡＬＩＩについて４０ｕｇ／ｍＬで、およびＳＮＡについて２０ｕｇ／ｍＬで試験した。全ての抗体／レクチンは、ブロッキング緩衝液（１％ＯＶＡ／ＰＢＳ）に希釈し、グリカンアレイと共に２５℃にて１時間インキュベートした。広範な洗浄の後、ポリクローナル血清抗体の結合は、グリカンマイクロアレイスライドをＣｙ３がコンジュゲートされた抗ＳＡ、抗マウスＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＧ（ジャクソンイミュノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ウエストグローブ、ＰＡ）と共に１時間インキュベートすることによって検出した。次いで、スライドは広範に洗浄し、乾燥させ、ジェネピックス（Ｇｅｎｅｐｉｘ）４０００Ｂスキャナー（１００％でのレーザー；３５０でのゲイン；１０μｍピクセル）でスキャンした。スキャンしたイメージからの生蛍光強度データはジェネピックス（Ｇｅｎｅｐｉｘ）ソフトウェアを使用して抽出し、生データの分析を行った。抗体は、両方の分子への結合を示すが、アレイ上のＴｎまたは任意の他のグリカンへの結合を示さなかった場合、ＡｃＳＴｎおよびＧｃＳＴｎに対して高度に特異的であると考えられた。
抗体Ｈｕ２Ｇ１２－２Ｂ２、Ｌ０Ｈ２、Ｈｕ８Ｃ２－２Ｄ６、Ｌ１Ｈ１、Ｈｕ５Ｇ２－１Ｂ３、Ｌ１Ｈ２、Ｍｕ２Ｇ１２－２Ｂ２、およびＭｕ３Ｆ１は、ＡｃＳＴｎおよびＧｃＳＴｎ（グリカン識別番号１および２）への結合を示すが、アレイにおける他のグリカンへの結合を示さなかったが、これは、これらの抗体が特異的にＳＴｎグリカンのみについて親和性を有することを示す。予想どおりに、Ｇｃを含有するアレイ中の全てのグリカンに結合する抗Ｇｃ抗体、（２，３）－連結シアル酸を含有するアレイ中のグリカンに結合するＭＡＬＩＩ、末端ガラクトースに連結した（２、６）シアル酸を含有するアレイ中のグリカンに結合するＳＮＡ、およびパリビズマブ対照は、グリカンへの結合を示さなかった。これらの結果は、グリカンアレイが、プリントされたグリカンに対して特異的である抗体およびタンパク質によって認識することができるグリカンを含有することを示した。
実施例３０
ネオ糖脂質アレイ分析
ネオ糖脂質プローブは、下記の表に記載されている化学的に合成したグリカンから調製する。
Figure 0007066613000053
 ネオ糖脂質は、グリカンを、アミノリン脂質Ｎ－アミノアセチル－Ｎ－（９－アントラセニルメチル）－１，２－ジヘキサデシル－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ホスホエタノールアミン（ＡＤＨＰ）にコンジュゲートすることによって蛍光プローブを生じさせるか、または還元的アミノ化によってＬ－１，２－ジヘキサデシル－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）とコンジュゲートするか、またはオキシム連結によってＮ－アミノオキシアセチル－１，２－ジヘキサデシル－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ホスホエタノールアミン（ＡＯＰＥ）とコンジュゲートし非蛍光プローブを生じさせることによって調製する。コンジュゲーション反応は、ＮＧＬが固体マトリックス上に固定化されることを可能とする。糖タンパク質から還元的に放出されてきたグリカンは、コンジュゲーションの前に穏やかな過ヨウ素酸反応に供する。コンジュゲーションの後に、ＮＧＬ産物を精製し、過剰な脂質および塩を除去し、質量分光光度法によって分析し、デンシトメトリーによる高性能薄層クロマトグラフィー上で定量化する。
ネオ糖脂質アレイは、リポソーム製剤において、ニトロセルロースをコーティングしたスライドガラス上にネオ糖脂質プローブをロボットにより分注することによって生成される。プローブは複数の濃度および密度でプリントし、最適なハイブリダイゼーション条件を決定する。
スライドは、精製した抗ＳＴｎ抗体溶液、または抗ＳＴｎ抗体を含有するポリクローナル血清でプローブする。抗体結合は、ビオチン化二次抗体、それに続いて蛍光標識されたストレプトアビジンを使用して検出する。スライドはプロスキャンアレイ（ＰｒｏＳｃａｎＡｒｒａｙ）（パーキンエルマーライフサイエンス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用してスキャンし、蛍光結合シグナルはスキャンアレイエキスプレス（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ）ソフトウェア（パーキンエルマーライフサイエンス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して定量化する。精製した抗体または血清は、両方の分子への結合を示すが、アレイ上のＴｎまたは任意の他のグリカンへの結合を示さない場合、ＡｃＳＴｎおよびＧｃＳＴｎに対して高度に特異的であると考えられる。
（付記）
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、以下に記載する。
［項目１］
配列番号１１５、１１４、１１６～１２０、１４０、および１４１からなる群から選択されるアミノ配列と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＣＤＲ－Ｈ３相補性決定領域を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、抗体。
［項目２］
前記ＶＨが、
配列番号１０５、１０６、および１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ－Ｈ１；ならびに
配列番号１０７～１１３、および１３７～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するＣＤＲ－Ｈ２を含む、項目１に記載の抗体。
［項目３］
配列番号８９、９１、９３、９５～９８、１０１～１０３、１３３～１３５、および１４８からなる群から選択されるアミノ配列と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＣＤＲ－Ｌ３を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体。
［項目４］
前記ＶＬが、
配列番号１２１～１２９、および１４２～１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ－Ｌ１；ならびに
配列番号７７、７９～８１、８３～８６、８８、１３０～１３２、および１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ－Ｌ２を含む、項目３に記載の抗体。
［項目５］
配列番号２０６～２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含む、項目１から４のいずれか一項に記載の抗体。
［項目６］
配列番号２２０～２２４、２３０～２３４、２３７～２４１、２４９～２５３、および２５６～２６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するＶＨを含む抗体。
［項目７］
配列番号２１７～２１９、２２５～２２９、２３５、２３６、２４２～２４８、２５４、および２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するＶＬを含む抗体。
［項目８］
配列番号２２０～２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ；および
配列番号２１７～２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬを含む、項目６または７に記載の抗体。
［項目９］
配列番号２３７～２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ；ならびに
配列番号２３５および２３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬを含む、項目６または７に記載の抗体。
［項目１０］
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるアイソタイプを含む、項目１から９のいずれか一項に記載の抗体。
［項目１１］
前記抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体である、項目１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
［項目１２］
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１抗体である、項目１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
［項目１３］
項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体をコードする構築物。
［項目１４］
項目１３に記載の構築物を含む細胞。
［項目１５］
項目１３に記載の構築物を含むベクター。
［項目１６］
項目１４に記載の細胞によって産生される抗体。
［項目１７］
約０．０１ｎＭ～約３０ｎＭの最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を伴って細胞関連ＳＴｎに結合する、項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
［項目１８］
前記抗体が、治療剤にコンジュゲートしている、項目１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
［項目１９］
前記治療剤が、細胞毒性剤である、項目１８に記載の抗体。
［項目２０］
前記細胞毒性剤が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される、項目１９に記載の抗体。
［項目２１］
前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＥであり、前記抗体が、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭの最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を伴ってＳＴｎ関連細胞を死滅させることができる、項目２０に記載の抗体。
［項目２２］
項目１～１２または１７～２１のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、がんを処置する方法。
［項目２３］
前記がんが、少なくとも１個の腫瘍を含む、項目２２に記載の方法。
［項目２４］
前記少なくとも１個の腫瘍の体積が低減する、項目２３に記載の方法。
［項目２５］
前記少なくとも１個の腫瘍の体積が、少なくとも２０％低減する、項目２４に記載の方法。
［項目２６］
前記少なくとも１個の腫瘍が、少なくとも１個の腫瘍細胞を含み、前記少なくとも１個の腫瘍細胞が、少なくとも１種の腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）を含む、項目２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
［項目２７］
前記少なくとも１種のＴＡＣＡが、シアリル（α２，６）Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）を含む、項目２６に記載の方法。
［項目２８］
前記がんが、乳がん、結腸がん、膵臓がん、肺がん、子宮頸がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、および肝臓がんの１つもしくは複数を含む、項目２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
［項目２９］
前記抗体が、化学療法剤および治療用抗体の少なくとも一方と組み合わせて投与される、項目２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
［項目３０］
前記化学療法剤が、フルロピリミジン、オキサリプラチン、およびイリノテカンの少なくとも１つから選択される、項目２９に記載の方法。
［項目３１］
前記治療用抗体が、ベバシズマブおよび抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体の少なくとも１つから選択される、項目２８または２９に記載の方法。
［項目３２］
前記抗体が、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、項目２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
［項目３３］
前記抗体が、約２．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、項目３２に記載の方法。
［項目３４］
前記抗体が、処置の約１日後から処置の約１カ月後に得た少なくとも１つの対象試料において検出可能である、項目３２または３３に記載の方法。
［項目３５］
前記抗体が、ＭＭＡＥとコンジュゲートしており、前記ＭＭＡＥと前記抗体の、薬物と抗体の比（ＤＡＲ）が、前記少なくとも１つの対象試料において５０％未満変化する、項目３４に記載の方法。
［項目３６］
少なくとも１種のＴＡＣＡの存在について細胞または試料をスクリーニングする方法であって、前記細胞または試料と項目１～１２のいずれか一項に記載の抗体とを接触させることを含む、方法。
［項目３７］
前記少なくとも１種のＴＡＣＡが、ＳＴｎを含む、項目３６に記載の方法。
［項目３８］
前記試料が、生体試料であり、前記生体試料が、対象から得られる、項目３６または３７に記載の方法。
［項目３９］
前記対象が、がんを有するか、またはがんを有することが疑われている、項目３８に記載の方法。
［項目４０］
前記生体試料が、細胞、組織、組織切片、および体液の１つもしくは複数を含む、項目３８または３９に記載の方法。
［項目４１］
前記抗体が、検出可能な標識を含む、項目３６～４０のいずれか一項に記載の方法。
［項目４２］
前記抗体が、検出剤を使用して検出される、項目３６～４０のいずれか一項に記載の方法。
［項目４３］
前記検出剤が、二次抗体である、項目４２に記載の方法。
［項目４４］
前記二次抗体が、検出可能な標識を含む、項目４３に記載の方法。
［項目４５］
項目３８～４４のいずれか一項に記載の方法によって試料をスクリーニングすることを含む、対象においてがんを診断する方法。
［項目４６］
コンパニオン診断の一部である、項目４５に記載の方法。
［項目４７］
前記コンパニオン診断が、がんの重症度を層別化し、がんの危険性を層別化し、臨床治験のために対象を選択し、治療レジメンを開発し、治療レジメンをモジュレートし、処置の安全性を増加させ、処置の有効性をモジュレートすることの１つもしくは複数のために使用される、項目４６に記載の方法。
［項目４８］
前記試料が、タンパク質アレイを含む、項目３６～４０のいずれか一項に記載の方法。
［項目４９］
前記タンパク質アレイが、１種もしくは複数のタンパク質を結合するように構成された１種もしくは複数の抗体を含み、前記１種もしくは複数のタンパク質の少なくとも１つが、前記試料中に存在する、項目４８に記載の方法。
［項目５０］
項目１～１２のいずれか一項に記載の抗体を含む、項目３６～４９のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
［項目５１］
二次抗体を含む、項目５０に記載のキット。
［項目５２］
前記二次抗体が、検出可能な標識を含む、項目５１に記載のキット。
［項目５３］
項目１～１２および１７～２１のいずれか一項に記載の抗体の１つもしくは複数を含む組成物。
［項目５４］
少なくとも１種の添加剤を含む、項目５３に記載の組成物。
［項目５５］
前記少なくとも１種の添加剤が、薬学的に許容される添加剤を含む、項目５４に記載の組成物。
［項目５６］
抗体をコーティングした薬剤を含む、項目５３に記載の組成物。
［項目５７］
前記抗体をコーティングした薬剤が、粒子、ナノ粒子、タンパク質、融合タンパク質、脂質、リポソーム、および細胞の１つもしくは複数を含む、項目５６に記載の組成物。
［項目５８］
前記抗体が、抗体フラグメントである、項目５６または５７に記載の組成物。
［項目５９］
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂフラグメントおよび単鎖Ｆｖの１つもしくは複数から選択される、項目５８に記載の組成物。
［項目６０］
合成構築物を含む改変された細胞であって、前記合成構築物が、因子をコードし、前記因子が、細胞のＳＴｎレベルをモジュレートする、細胞。
［項目６１］
前記因子が、ＳＴｎ合成に関与する少なくとも１種の因子を含む、項目６０に記載の改変された細胞。
［項目６２］
前記少なくとも１種の因子が、（アルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニル－２，３－ベータ－ガラクトシル－１，３）－Ｎ－アセチルガラクトサミニド、アルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ）、Ｔ－シンターゼ、およびコア１ベータ３－ガラクトシルトランスフェラーゼ特異的分子シャペロン（ＣＯＳＭＣ）の少なくとも１つから選択される、項目６１に記載の改変された細胞。
［項目６３］
少なくとも１種の改変されていない細胞と比較したときに、上昇したＳＴｎレベルを含む、項目６０～６２のいずれか一項に記載の改変された細胞。
［項目６４］
前記因子が、ＳＴ６ＧａｌＮＡＣの発現を低減させる、項目６０に記載の改変された細胞。
［項目６５］
前記因子が、阻害性リボ核酸（ＲＮＡ）分子である、項目６４に記載の改変された細胞。
［項目６６］
改変された卵巣腫瘍細胞である、項目６０～６５のいずれか一項に記載の改変された細胞。
［項目６７］
前記改変された卵巣腫瘍細胞が、ＳＫＯＶ３細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、ＯＶＣＡＲ４細胞、ＢＲＣＡ１変異腫瘍細胞、および非ＢＲＣＡ１変異腫瘍細胞の１つもしくは複数から選択される、項目６６に記載の改変された細胞。
［項目６８］
抗体の結合を特性決定する方法であって、グリカンアレイと前記抗体とを接触させることを含み、前記グリカンアレイが、複数のグリカンを含む、方法。
［項目６９］
前記グリカンアレイが、グリカンのパネルを含み、前記グリカンのパネルが、
Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｎｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｎｅｕ５Ａｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｎｅｕ５Ｇｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｎｅｕ５Ａｃα６ＧａｌβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｎｅｕ５Ｇｃα６ＧａｌβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｇａｌ３βＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２；および
Ｎｅｕ５Ｇｃα３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃαＯ（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ２のそれぞれの１つもしくは複数からなる、項目６８に記載の方法。
［項目７０］
前記複数のグリカンのそれぞれが、ネオ糖脂質プローブの部分である、項目６８または６９に記載の方法。

Claims (49)

  1. シアリル（α２，６）Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）に結合する抗体であって、
    前記抗体が、配列番号２３７～２４１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２３５または２３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、抗体。
  2. 配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 前記抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 約０．０１ｎＭ～約３０ｎＭの最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を伴って細胞関連ＳＴｎに結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 治療剤にコンジュゲートしている、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体を含む、抗体－薬物コンジュゲート。
  8. 前記治療剤が、細胞毒性剤である、請求項７に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  9. 前記細胞毒性剤が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  10. 前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＥである、請求項９に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  11. 前記細胞毒性剤が、ＭＭＡＥであり、前記抗体－薬物コンジュゲートが、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭの最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を伴ってＳＴｎ関連細胞を死滅させることができる、請求項１０に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  12. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体、または請求項７～１１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物。
  13. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
  14. 請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
  15. 請求項１３に記載の核酸または請求項１４に記載のベクターを含む単離された細胞。
  16. 請求項１５に記載の細胞を、前記抗体の発現のために適切な条件下で培養することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法。
  17. 前記抗体を精製することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 請求項１５に記載の細胞により製造される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
  19. がんの処置用の医薬組成物であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体、または請求項７～１１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲートを含み、該医薬組成物は、がんを有する対象に投与される、医薬組成物。
  20. 前記対象が、１以上の固形腫瘍を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記医薬組成物による処置後に、１以上の固形腫瘍の体積が低減する、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記１以上の固形腫瘍の体積が、少なくとも２０％低減する、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 前記がんが、がん細胞表面に少なくとも１種の腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 前記少なくとも１種のＴＡＣＡが、シアリル（α２，６）Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＳＴｎ）を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記がんが、乳がん、結腸がん、膵臓がん、肺がん、子宮頸がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、肝臓がん、子宮内膜がん、食道がん、または結腸直腸がんである、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  26. 化学療法剤および治療用抗体の少なくとも一方と組み合わせて投与される、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  27. 前記化学療法剤が、フルロピリミジン、オキサリプラチン、イリノテカン、およびこれらの組合せから選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 前記治療用抗体が、ベバシズマブおよび抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  29. 前記抗体または前記抗体－薬物コンジュゲートが、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１９～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  30. 前記抗体または前記抗体－薬物コンジュゲートが、約２．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 前記抗体または前記抗体－薬物コンジュゲートが、処置の約１日後から処置の約１カ月後に得た少なくとも１つの対象試料において検出可能である、請求項２９または３０に記載の医薬組成物。
  32. 前記抗体－薬物コンジュゲートが、ＭＭＡＥを含み、前記ＭＭＡＥと前記抗体の、薬物と抗体の比（ＤＡＲ）が、前記少なくとも１つの対象試料において５０％未満変化する、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 少なくとも１種のＴＡＣＡの存在について細胞または試料をスクリーニングする方法であって、前記細胞または試料と請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体とを接触させることを含む、方法。
  34. 前記少なくとも１種のＴＡＣＡが、ＳＴｎを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記試料が、生体試料であり、前記生体試料が、対象から得られるものである、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記対象が、がんを有するか、またはがんを有することが疑われている、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記生体試料が、細胞、組織、組織切片、および体液の１つもしくは複数を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 前記抗体が、検出可能な標識を含む、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 検出剤を使用して、少なくとも１種のＴＡＣＡに結合した抗体を検出することを含む、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記検出剤が、二次抗体である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記二次抗体が、検出可能な標識を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体、または請求項７～１１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュケートを用いた処置から恩恵を受ける可能性が高いがんを有する対象を同定する方法であって、
    前記対象からの腫瘍の試料を、少なくとも１種のＴＡＣＡの存在についてスクリーニングすることを含む、方法。
  43. 前記少なくとも１種のＴＡＣＡが、ＳＴｎを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体、または請求項７～１１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュケートを用いた処置から恩恵を受ける可能性が高いがんを有する対象を同定する方法であって、
    対象由来の試料を、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の方法に従ってスクリーニングすることを含む、方法。
  45. 少なくとも１種のＴＡＣＡが存在する場合、前記対象が、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体、または請求項７～１１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュケートを用いた処置から恩恵を受ける可能性が高いと決定される、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記方法が、がんの重症度を層別化し、がんの危険性を層別化し、臨床治験のための対象を選択し、治療レジメンを開発し、治療レジメンをモジュレートし、処置の安全性を増加させ、処置の有効性をモジュレートすることの１つもしくは複数のために使用される、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体を含む、請求項３３～４６のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
  48. 二次抗体を含む、請求項４７に記載のキット。
  49. 前記二次抗体が、検出可能な標識を含む、請求項４８に記載のキット。
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