CN102893154A - 用于检测癌症的组合物和方法 - Google Patents
用于检测癌症的组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102893154A CN102893154A CN201180010659XA CN201180010659A CN102893154A CN 102893154 A CN102893154 A CN 102893154A CN 201180010659X A CN201180010659X A CN 201180010659XA CN 201180010659 A CN201180010659 A CN 201180010659A CN 102893154 A CN102893154 A CN 102893154A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- neu5gc
- glycan
- cancer
- sialylated
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供了唾液酸化聚糖和特异性结合其的抗体。本发明的组合物和关于使用其的方法对于癌症的早期检测和诊断是有用的。
Description
本申请要求于2010年1月15日提交的共同未决的美国临时申请序列号61/295,386、和于2011年1月14日提交的美国申请序列号13/007,237的优先权,其各自为了所有目的通过引用整体合并入本文。
本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)(NIH)授予的授权U01 CA128442-01和由美国国家癌症研究所小企业发明研究(National Cancer Institute Small BusinessInvention Research)(NCI SBIR)授予的HHSN261200700063C下由政府支持完成。政府在本发明中拥有一定权利。
发明领域
本发明提供了唾液酸化聚糖和特异性结合其的抗体。本发明的组合物和使用本发明组合物的方法对于癌症的早期检测和诊断是有用的。
背景
癌症是全世界的死亡主因,并且死亡率在很大程度上归于上皮起源的癌症,即肺、结肠、乳腺、肝、胃、前列腺、卵巢、子宫内膜和胰腺的癌(Parkin等人,2001)。当癌症被早期诊断出并且疾病限于起源的器官时,存活率得到显著改善。事实上,用于筛选的物理方法如宫颈癌中的巴氏涂片和乳腺癌中的乳房X线照相术已显著减少死亡比率(Marcial,1977,Nelson等人,2009b)。因此,针对开发在可容易接近的体液例如血清、尿或唾液中的新的早期检测生物标记的研究已得到鼓励(Srivastava和Gopal-Srivastava,2002)。某些众所周知的生物标记(Nossov等人,2008,Candefjord等人,2009,Greene等人,2009,Gupta和Lis,2009,Nelson等人,2009a,Nogueira等人,2009,van Leeuwen等人,2009)在疾病的晚期可靠地检测到,但对于早期癌症诊断缺乏足够的灵敏度且尤其是特异性,并且因此主要用于预后、分期、监控和治疗的选择(Ludwig和Weinstein,2005)。
备选的有希望的策略是利用针对癌症的免疫应答,其可以在肿瘤生成的早期引起。这通过针对肿瘤相关抗原的自身抗体的产生部分证实(Raedle等人,1998,Soussi,2000,Desmetz等人,2009a,Desmetz等人,2009b,Tan等人,2009)。然而,特异性和灵敏度已得到限制,主要是由于癌症的异质性质,其中不同蛋白质在具有相同类型癌症的患者中是异常表达或调节的,引起免疫应答中很大的变异性(Raedle等人,1998,Soussi,2000,Tan等人,2009)。
用于癌症筛选的新血清生物标记是需要的,因为目前的那些对于早期诊断缺乏足够的灵敏度且尤其是特异性(18,19),主要在晚期中是可靠检测的,并且因此更多用于预后、分期、监控和治疗选择(18)。虽然针对肿瘤相关抗原的抗体通常在早期时在癌症患者中发现,并且可以潜在成为用于恶性转化的灵敏检测物(21,22),但先前描述的自身抗体无一在筛选中显示足够的特异性。
由于弱灵敏度和特异性,可用的基于血液的测定对于癌症的早期诊断具有最低限度的临床效用。一般地,它们用于监控转移性癌症的治疗。广泛用于筛选前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)是有用的基于血液的癌症筛选测定的最佳例子,并且在近期公开的随机化研究中具有边缘临床效用。使用下述基于血液的癌症测试:PSA、CA27.29、CA19.9、CA125、CEA和αFP。除PSA外,仅αFP用作筛选测试,在这种情况下用于处于关于肝细胞癌的高危中的且具有丙型肝炎诱导的肝硬化的患者。这些测试无一已显示以合理的经济或发病成本减少癌症特异性死亡率。然而,由于关于基于血液的癌症筛选的极度需要,通常使用PSA和αFP筛选以及CA125筛选。
尽管本领域中的进展,仍需要用于癌症筛选的改良生物标记。
发明概述
本发明提供了用于检测受试者中的癌症的方法,其包括在得自受试者的生物学样品中测定选自下述的一种或多种化合物的水平:a)Neu5Gc-唾液酸化抗原,b)Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位,c)Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物,和d)特异性结合所述抗原、表位和衍生物中的一种或多种的抗体,其中当相对于对照正常样品,检测到更高水平的一种或多种化合物时,所述受试者鉴定为具有癌症,并且当化合物的水平无一高于对照正常样品时,受试者鉴定为无癌症的。在一个实施方案中,Neu5Gc-唾液酸化抗原选自i)Neu5Gc-唾液酸化聚糖、ii)Neu5Gc-唾液酸化-Lex、和iii)Neu5Gc-唾液酸化-Lea。在一个特定实施方案中,Neu5Gc-唾液酸化聚糖选自Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-R(聚糖2)、Neu5Gcα2-6Lacβ-R(聚糖20)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-R(聚糖34)、Neu5Gcα2-6GalNAcα-OR(聚糖6)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-OR(聚糖2)、Neu5Gcα2-6Lacβ-OR(聚糖20)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-OR(聚糖34),其中R选自生物素、白蛋白、ProNH2、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydrido、羟基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2=O(CH2)2CH2NH2、(OCH2CH2)6NH2、O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2、荧光标记2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺类似物(AEAB)、氨基氧基-基团、甲氨基氧基-基团、酰肼基团、氨基脂质1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI),并且其中Lac是Galβ1-4GlcNAc。在一个优选实施方案中,Neu5Gc-唾液酸化聚糖包含Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)。在一个备选实施方案中,Neu5Gc-唾液酸化-Lex包含Neu5Gcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)。在另外一个实施方案中,Neu5Gc-唾液酸化-Lea包含(Neu5Gcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc和9-O-乙酰基-GD3(Neu5,9Ac2α2-8Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ1-1神经酰胺)中的一种或多种。虽然不预期将抗体限于任何特定类型或特异性,但在一个实施方案中,抗体特异性结合包含Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)的Neu5Gc-唾液酸化聚糖。在一个进一步的实施方案中,测定步骤包括检测特异性结合Neu5Gc-唾液酸化抗原、抗原的表位和抗原的衍生物中的一种或多种的抗体。在某些实施方案中,当检测到一种或多种化合物的水平中的增加时,受试者指示用于开始抗癌治疗。在备选实施方案中,检测到一种或多种化合物的水平中的增加时,受试者指示用于确证诊断癌症测试。在再进一步的实施方案中,本发明的方法进一步包括在具有一种或多种化合物的水平的增加的受试者中开始抗癌治疗。在特定实施方案中,该方法可以进一步包括在具有一种或多种化合物的水平的增加的受试者中执行确证诊断癌症测试。在某些实施方案中,受试者缺乏可检测的癌症症状,具有一种或多种可检测的癌症症状,和/或处于癌症的危险中。在特定实施方案中,癌症包含癌。在备选实施方案中,癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌。在特定实施方案中,本发明的方法进一步包括治疗受试者以减少一种或多种癌症症状。在进一步的实施方案中,抗体特异性结合包含Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)的Neu5Gc-唾液酸化聚糖。在另一个实施方案中,抗体具有大于0.50的关于癌症的接受者操作特性(Receiver Operator Characteristic(ROC))曲线的曲线下面积(AUC),和/或具有大于50%的癌症特异性,和/或具有大于50%的癌症灵敏度。
本发明进一步提供了选自下述的经分离的Neu5Gc-唾液酸化抗原:i)Neu5Gc-唾液酸化聚糖、ii)Neu5Gc-唾液酸化-Lex、和iii)Neu5Gc-唾液酸化-Lea。
本文另外提供的是特异性结合本文描述的一种或多种Neu5Gc-唾液酸化抗原的抗体。
本发明还提供了特异性结合一种或多种抗体的抗体,所述一种或多种抗体特异性结合本文描述的一种或多种Neu5Gc-唾液酸化抗原。
本发明还提供的是包含组合物的试剂盒,所述组合物含有本文描述的一种或多种Neu5Gc-唾液酸化抗原、和/或本文描述的一种或多种抗体。在某些实施方案中,一种或多种Neu5Gc-唾液酸化抗原包含在阵列中。
附图简述
图1.用于检测抗Neu5Gc抗体的唾液酸聚糖(sialoglycan)微阵列载玻片的验证。将具有末端Neu5Gc或Neu5Ac的多种聚糖对(如表2中详述的聚糖#1-40)点在环氧化物包被的载玻片上,随后使用(A)通过Cy3-抗-鸡IgY检测的亲和力纯化的鸡抗-Neu5GcIgY(1∶10,000)(34)(0.5μg/ml);或(B)通过Cy3抗人IgG检测的人抗Neu5Gc Ig阳性人血清(1∶100;S34(5)(1.5μg/ml)显色。数据用Excel枢轴表分析,代表超过三次独立实验,并且显示4个重复点的平均值±SD(以125μM印刷的聚糖)。
图2.接受者操作特性(“ROC”)曲线。在左上图中是二元分类测试的简化图示。TP是真阳性,FP是假阳性,FN是假阴性,并且TN是真阴性。
图3.抗GcSTn是用于癌症病例/对照的分类器,并且表明为人特异性和肿瘤相关的癌生物标记。使用逻辑回归计算成为癌症病例的概率,其中预测物是两个参数,α和β,其概括针对20种Neu5Ac聚糖的泛抗体(pan antibody)水平对于聚糖6(Neu5Gc-唾液酸基-Tn;GcSTn)的抗-Neu5Gc抗体应答。(A)关于用于选择聚糖6的训练数据的ROC曲线,所述训练数据具有67个非转移性乳腺癌病例和25个对照。(B)关于第一个验证数据集的ROC曲线,所述第一个验证数据集具有74个新的非转移性乳腺癌病例和25个新对照。(C)关于第二个验证数据集的ROC曲线,所述第二个验证数据集具有99个其他癌症类型病例和55个对照。示意性呈现了用于生成新型人癌生物标记的生物化学和遗传学原理。(D)体细胞Cosmc突变生成不完全O联糖基化,导致在许多癌中唾液酸化的Tn抗原的肿瘤相关表达(左图)。通过此类癌的饮食-Neu5Gc掺入生成通过体液适应性免疫系统检测为外源的Neu5Gc-唾液酸基Tn,从而生成针对其的抗体。对于Neu5Gc-唾液酸基Tn特异性的此类异种-自身抗体在本文中显示为新型生物标记,用于癌的早期筛选和/或潜在免疫治疗工具(右图)。
图4.作为用于癌症病例/对照的分类器的抗GcSTn的ROC分析的交叉验证。使用逻辑回归模型计算成为病例的概率,其中预测物是两个参数,α和β,其概括针对20种Neu5Ac-聚糖的表达水平的聚糖6(Neu5Gc-唾液酸基-Tn;GcSTn)的抗Neu5Gc抗体应答。十倍交叉验证用于评估预测能力。对ROC曲线水平地求平均值,以计算在所需灵敏度水平的特异性,并且对于特异性制备箱形图。(A)关于训练数据的ROC曲线,所述训练数据具有67个非转移性乳腺癌病例和25个对照,基于500次十倍交叉验证运行,平均AUC=0.63,在AUC上的95%CI=(0.29,0.91),IQR=(0.46,0.71)。(B)关于第一个验证数据集的ROC曲线,所述第一个验证数据集具有74个新的非转移性乳腺癌病例和25个新对照,基于500次十倍交叉验证运行,平均AUC=0.58,在AUC上的95%CI=(0.167,0.917),IQR=(0.458,0.708)。(C)关于第二个验证数据集的ROC曲线,所述第二个验证数据集具有99个其他癌症类型的非转移性病例和55个对照,基于500次十倍交叉验证运行,平均AUC=0.57,在AUC上的95%CI=(0.283,0.817),IQR=(0.483,0.683)。
定义
为了促进本发明的理解,下文定义了许多术语。
如本文使用的,术语“纯化的”、“分离的”及其语法等价物指来自样品的至少一种不希望的组分(例如细胞类型、蛋白质和/或核酸序列)的量的减少,包括从5%到100%的任何数目百分比的减少,例如但不限于从10%到100%、从20%到100%、从30%到100%、从40%到100%、从50%到100%、从60%到100%、从70%到100%、从80%到100%、和从90%到100%。因此,纯化导致“富集”,即样品中希望的细胞类型、蛋白质和/或核酸序列的量的增加。在一个实施方案中,本发明考虑了纯化或分离的唾液酸化聚糖。
如本文使用的,术语“治疗”、“处理”和语法等价物指对抗疾病或病症,如例如在患者的管理和护理中。在一个实施方案中,治疗疾病(例如癌症、转移等)包括减少一种或多种疾病症状。
如本文使用的,术语“诊断”指通过其体征和症状(例如对常规治疗的抗性)的疾病识别,或遗传分析、病理学分析、组织学分析等。
如本文使用的,术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”指经历多步赘生性进展的早、中或晚期的细胞,如通过引用合并入本文的先前描述的(Pitot等人,Fundamentals of Oncology,15-28(1978))。赘生性进展的早、中或晚期的特征已使用显微镜检查进行描述。在赘生性进展的三个阶段各自的癌细胞一般具有异常核型,包括易位、倒转、缺失、等臂染色体、单体和额外染色体。恶性进展的早期中的细胞被称为“增生细胞”,并且特征在于不受控制的分裂和/或以比相同组织中相同细胞类型的正常细胞更大的速率分裂。增生可以是缓慢或快速的,但持续不减弱的。赘生性进展的中期中的细胞被称为“发育不良细胞”。发育不良细胞类似未成熟的上皮细胞,在组织内一般是空间紊乱的且丧失其专门结构和功能。在赘生性进展的中期过程中,增加百分比的上皮变得由发育不良细胞组成。
“增生”和“发育不良”细胞被称为“前肿瘤”细胞。在赘生性进展的晚期中,发育不良细胞变成“赘生性”细胞。赘生性细胞一般是侵袭性的,即它们侵入邻近组织,或从原发部位脱落且通过血液和淋巴循环至体内的其他位置,在其中它们开始继发性癌症。癌症包括例如癌例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌;胃癌、食管癌、口癌、舌癌、齿龈癌(gum cancer)、皮肤癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、卡波济氏肉瘤等)、肌肉癌、心脏癌、肝癌、支气管癌、软骨癌、骨癌、睾丸癌、肾癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、骨髓癌、淋巴瘤癌、脾脏癌、胸腺癌、甲状腺癌、脑癌、神经元癌、间皮瘤、胆囊癌、眼癌(例如角质层癌、葡萄膜癌、脉络膜癌、斑翳(macula)癌、玻璃体癌等)、关节癌(例如滑膜癌)、成胶质细胞瘤、淋巴瘤和白血病。恶性赘生物通过肉瘤(例如骨肉瘤和卡波济氏肉瘤)进一步例示。
术语“癌症”或“瘤形成”指多个癌细胞。
“处于转移危险中的癌症”指可以分化成转移性癌的癌症。此类危险可以基于家族史、遗传因素、癌症类型、环境因素等。
“癌”指由上皮细胞构成的恶性新生长,其趋于浸润外围组织且产生转移。
“转移性”癌细胞指从原发癌部位(即在其中癌细胞最初由正常、增生或发育不良细胞形成的位置)易位到除原发部位外的部位的癌细胞,易位的癌细胞在其中寄居且增生。
可以获益于本发明的方法“受试者”和“动物”可互换地包括任何多细胞动物,优选哺乳动物。哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、鼠类、绵羊科动物、牛科动物、反刍动物、兔类动物、猪科动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、鸟类等)。因此,非人哺乳动物受试者通过小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、雪貂和栗鼠例示。
需要减少一种或多种疾病症状例如需要减少癌症转移和/或需要减少一种或多种癌症症状的“受试者”包括显示出一种或多种疾病症状和/或处于显示出一种或多种疾病症状的危险中的受试者。例如,基于家族史、遗传因素、环境因素等,受试者可以处于危险中。这个术语包括疾病的动物模型。因此,给需要减少疾病和/或减少一种或多种疾病症状的受试者施用组合物(其减少疾病和/或减少一种或多种疾病症状)包括组合物的预防施用(即在疾病和/或一种或多种疾病症状可检测前)和/或组合物的治疗施用(即在疾病和/或一种或多种疾病症状可检测后)。
“处于疾病(例如癌症)的危险中”的受试者指倾向于招致(contracting)和/或表达一种或多种疾病症状的受试者。这种倾向可以是遗传的(例如表达一种或多种疾病例如可遗传病症等症状的特定遗传趋势),或由于其他因子(例如环境条件、暴露于环境中存在的有害化合物,包括致癌物等)。术语“处于危险中”的受试者包括“患有疾病”的受试者,即经历一种或多种疾病症状的受试者。不预期本发明限于任何特定体征或症状。因此,预期本发明包含经历任何范围的疾病,从亚临床症状到充分发展的疾病的受试者,其中受试者显示出与疾病相关的至少一种标记(例如体征和症状)。
如本文使用的,术语“样品”和“样本”以其最广泛含义使用,以包括得自和/或衍生自生物学或环境来源的任何组合物,以及达到与生物学或环境样品接触的取样装置(例如拭子)。“生物学样品”包括得自动物的那些,包括体液样品例如血清、血浆、血液、尿、脑脊髓液(CSF)、痰、唾液、细胞提取物、组织提取物等,以及固体样品例如组织(例如活组织检查材料)、细胞等。
术语“抗体”包含得自任何来源(例如鸟、人、啮齿类动物、非人灵长类动物、公山羊、牛科动物、马科动物、绵羊科动物等)的任何免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)。在这个定义内包括的是多克隆抗体、单克隆抗体和嵌合抗体。“多克隆抗体”指由浆细胞的超过一个单个克隆产生的免疫球蛋白;相比之下“单克隆抗体”指由浆细胞的单个克隆产生的免疫球蛋白。“嵌合抗体”含有两种不同抗体,一般是两个不同物种的部分。参见例如:给予Cabilly等人的美国专利号4,816,567;给予Shoemaker等人的美国专利号4,978,745;给予Beavers等人的美国专利号4,975,369;和给予Boss等人的美国专利号4,816,397。
当对于分子做出提及时,术语“抗原”、“免疫原”、“抗原的”、“免疫原性的”、“抗原活性的”、“免疫学的”和“免疫学活性的”,指能够诱导特异性体液免疫应答(包括引起可溶性抗体应答)和/或细胞介导的免疫应答(包括引起CTL应答)的任何物质。
在一个实施方案中,抗原包含表位。术语“表位”和“抗原决定簇”指在抗原上的结构,由于分子互补性,其与抗体的结合位点或T细胞受体相互作用。表位可以与它由其衍生的完整抗原竞争结合抗体。一般地,分泌抗体及其相应膜结合形式能够将广泛多样的物质识别为抗原,而T细胞受体能够仅识别蛋白质的片段,其与细胞表面上的MHC分子复合。由B细胞上的免疫球蛋白受体识别的抗原再分成三个分类:T细胞依赖性抗原、1型T细胞不依赖性抗原;和2型T细胞不依赖性抗原。此外,例如,当蛋白质或蛋白质的片段用于免疫接种宿主动物时,蛋白质的众多区域可以诱导抗体的产生,所述抗体特异性结合蛋白质上的给定区域或三维结构;这些区域或结构被称为抗原决定簇。抗原决定簇可以与完整抗原(即用于引起免疫应答的免疫原)竞争结合抗体。
当对于第一种分子(例如多肽、糖蛋白、核酸序列、多糖、抗原等)与第二种分子(例如多肽、糖蛋白、核酸序列、多糖、抗体等)的结合做出提及时,术语“特异性结合”、“结合特异性”及其语法等价物指与在第二种分子与第三种分子之间的相互作用相比较,在第一种分子与第二种分子之间的优先相互作用。特异性结合是不要求结合的绝对特异性的相对术语;换言之,术语“特异性结合”不要求在不存在第二种分子与第三种分子之间的相互作用的情况下,第二种分子与第一种分子相互作用。相反,在第一种分子与第二种分子之间的相互作用水平高于在第二种分子与第三种分子之间的相互作用水平是足够的。第一种分子与第二种分子的“特异性结合”还意指在第一种分子与第二种分子之间的相互作用取决于在第一种分子上或其内的特定结构的存在。例如,如果第二种分子对于在第一种分子上或其内的结构“A”是特异性的,那么含有结构A的第三种核酸序列的存在将减少结合第一种分子的第二种分子的量。
方法和/或分子对于疾病的“特异性”,例如与“癌症特异性”可互换使用的“对于癌症的特异性”,指正确鉴定的否定(即不具有疾病的健康个体)的比例(例如百分比、部分等),即正确鉴定为不具有疾病的健康受试者的百分比。特异性可以根据下式进行计算:
特异性=真阴性的数目/(真阴性的数目+假阳性的数目)
因此,在某些实施方案中,本发明的组合物和/或方法具有大于50%的“癌症特异性”,包括从51%到100%的任何数值,例如52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%。虽然100%特异性是最希望的,即不将来自健康组的任何一个预测为具有癌症,但它不是必需的。本文数据显示在某些实施方案中,假阳性率(灵敏度)和假阴性率(特异性)都是1/6=20%(实施例4)。在另一个实施方案中,本文数据显示灵敏度是37/176=21.1%,并且特异性是34/60=68%(实施例5)。在一个进一步的实施方案中,当灵敏度是0.25时,平均特异性是0.79(实施例7)。在另外一个实施方案中,当灵敏度是0.2和0.3时,平均特异性分别是0.84和0.75(实施例8)。另外的特异性值显示于实施例9中。
在备选实施方案中,特异性表示(连同灵敏度)为二元分类测试的性能的统计测量,例如使用接受者操作特性(“ROC”)曲线”。对于任何测试,在特异性和灵敏度之间通常存在权衡。例如:在人受试者的癌症筛选测试中,由于高成本,不希望冒险将健康人错误地鉴定为具有癌症(低特异性)。这些成本是身体(不必需的危险程序)和经济上的。这种权衡可以使用ROC曲线图解表示(图2)。“接受者操作特性曲线”和“ROC曲线”指真阳性率(AKA灵敏度)对真阴性率(AKA 1-特异性)的曲线图。测试的测量结果在x轴上表示,而y轴表示对照(例如健康)或病例(例如癌症)受试者的数目。对于任何给定切割点(沿着x轴的每个点),可以测量测定的灵敏度和特异性。对于任何给定测定的灵敏度和特异性的范围可以在0%到100%中变化,取决于所选的切割点。为此,在某些优选实施方案中,AUC用作测定的特异性和/或灵敏度的标准测量。关于ROC曲线曲线图的“曲线下面积”(“AUC”)等于分类器排序随机选择的肯定情形高于随机选择的否定情形的概率。因此,AUC是成功区分病例(例如癌症)与对照(例如健康)受试者的测试能力的一般测量。随机机率将生成0.5的AUC。因此,在一个实施方案中,有用的测试优选具有大于0.50的AUC,包括从0.51到1.00的任何值,例如从0.55到1.00、从0.60到1.00、从0.65到1.00、从0.70到1.00、从0.75到1.00、从0.80到1.00、从0.85到1.00、从0.90到1.00、从0.95到1.00,且最优选1.00。大于0.50的AUC值包括0.51、0.52、0.52、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98和0.99。本文数据显示抗GcSTn抗体给出在乳腺癌受试者与女性对照比较的两个独立集上0.67和0.60的AUC,和在肺、卵巢、胰腺、子宫内膜、前列腺和结肠癌与对照比较的独立集上0.69的AUC。内部交叉验证证实这些结果分别具有0.63、0.68和0.67的平均AUCs。基于内部交叉验证的非常严格的排列检验,确定了关于每个独立集的平均AUC的96%置信区间。对于训练乳腺癌集、验证乳腺癌集和对于其他癌症验证集,这些分别是0.29-0.91、0.167-0.917、和0.283-0.817。
方法和/或分子对于疾病的“灵敏度”,例如与“癌症灵敏度”可互换使用的“对于癌症的灵敏度”,指阳性(即具有癌症的个体)的比例(例如百分比、部分等),其像这样正确鉴定(例如其鉴定为具有该状况的具有癌症的人的百分比)。灵敏度可以根据下式进行计算:
灵敏度=真阳性的数目/(真阳性的数目+假阴性的数目)。
因此,在某些实施方案中,本发明的组合物和/或方法具有大于50%的“癌症特异性”,包括从51%到100%的任何数值,例如52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%。虽然100%灵敏度是最希望的(即将来自癌症组的所有受试者预测为具有癌症),但它不是必需的。
在备选实施方案中,本发明的组合物和/或方法具有等于或低于50%的“癌症灵敏度”,包括从0%到50%的任何数值,例如1%、2%、3%、4%、6%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%和49%。本文数据显示在某些实施方案中,假阳性率(灵敏度)和假阴性率(特异性)都是1/6=20%(实施例4)。在另一个实施方案中,本文数据显示灵敏度是37/176=21.1%,并且特异性是34/60=68%(实施例5)。在一个进一步的实施方案中,当灵敏度是0.25时,平均特异性是0.79(实施例7)。在另外一个实施方案中,当灵敏度是0.2和0.3时,平均特异性分别是0.84和0.75(实施例8)。另外的灵敏度值显示于实施例9中。
在某些实施方案中,灵敏度表示(连同特异性)为二元分类测试的性能的统计测量,例如使用ROC曲线的AUC,如上文就特异性而言讨论的。
“聚糖”指多糖或寡糖。聚糖还可以用于指糖缀合物例如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖的碳水化合物部分。聚糖通常由单糖的O-糖苷键组成。例如,纤维素是由β-1,4-连接的D-葡萄糖组成的聚糖(或更具体而言葡聚糖),并且壳多糖是由β-1,4-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺组成的聚糖。聚糖可以是单糖残基的同或异聚物,并且可以是线性或分支的。在本发明中测试的聚糖显示于表3中。
“唾液酸化”和“唾液酸基”化合物(例如唾液酸化抗原、唾液酸化聚糖、唾液酸化-Lex和唾液酸化-Lea)可互换地指含有唾液酸的化合物。
“Neu5Gc-唾液酸化”化合物(例如Neu5Gc-唾液酸化抗原、Neu5Gc-唾液酸化聚糖、Neu5Gc-唾液酸化-Lex和Neu5Gc-唾液酸化-Lea)指含有末端N-羟乙酰神经氨酸(“Neu5Gc”)的唾液酸化化合物。相比之下,“Neu5Ac唾液酸化”化合物(例如Neu5Ac唾液酸化抗原、Neu5Ac唾液酸化聚糖、Neu5Ac唾液酸化-Lex和Neu5Ac唾液酸化-Lea)指含有N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的唾液酸化化合物。例如,“Neu5Gc-唾液酸化聚糖”通过Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)例示,其中“R”通过下述基团例示:生物素、白蛋白、ProNH2、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydrido、羟基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2=O(CH2)2CH2NH2、(OCH2CH2)6NH2、O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2、荧光标记2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺类似物(AEAB)、氨基氧基-基团、甲氨基氧基-基团、酰肼基团、氨基脂质1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)。不预期限制“R”的来源或性质,这包括影响GcSTn的物理间隔的结构。在某些实施方案中,与下层底物组合的R基团影响GcSTn间隔。
“Neu5Gc-唾液酸化抗原”包括Neu5Gc-唾液酸化聚糖、Neu5Gc-唾液酸化-Lex和Neu5Gc-唾液酸化-Lea,并且指含有末端N-羟乙酰神经氨酸(“Neu5Gc”)的免疫原性延长的聚糖链。
“Neu5Gc-唾液酸化聚糖”通过GcSTn、Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-R(聚糖2)、Neu5Gcα2-6Lacβ-R(聚糖20)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-R(聚糖34)、Neu5Gcα2-6GalNAcα-OR(聚糖6)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-OR(聚糖2)、Neu5Gcα2-6Lacβ-OR(聚糖20)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-OR(聚糖34)例示,其中R选自生物素、白蛋白、ProNH2、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydrido、羟基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2=O(CH2)2CH2NH2、(OCH2CH2)6NH2、O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2、荧光标记2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺类似物(AEAB)、氨基氧基-基团、甲氨基氧基-基团、酰肼基团、氨基脂质1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI),并且其中Lac是Galβ1-4GlcNAc。不预期限制“R”的来源或性质,这包括影响GcSTn的物理间隔的结构。在某些实施方案中,与下层底物组合的R基团影响GcSTn间隔。
“Neu5Gc-唾液酸化探针”指具有末端N-羟乙酰神经氨酸和非还原末端接头基团的延长聚糖链,其可以用于将探针缀合至底物。探针可以是在溶液中或固定在固体底物例如阵列上。
化合物的“衍生物”指已通过一个或多个其元件的修饰改变的化合物。例如,“唾液酸化聚糖的衍生物”指已通过一个或多个其元件的修饰改变的唾液酸化聚糖,包括在癌症中的修饰,如由9OAc-GcSTn例示的。
下述术语是可互换使用的:“GcSTn”、“Neu5Gc-唾液酸基-Tn”、“Neu5Gcα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr”和“二糖N-羟乙酰神经氨酸-α2-6-N-乙酰半乳糖胺-α”。GcSTn是Neu5Gc-唾液酸化抗原的一个例子。
“抗Neu5Gc-唾液酸基-Tn抗体”指特异性结合本发明的新型Neu5Gcα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr的抗体。
“N-羟乙酰神经氨酸”和“Neu5Gc”是可互换的。
“N-乙酰神经氨酸”和“Neu5Ac”是可互换使用的,并且指羟基化形式的N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。
“唾液酸基-Tn”和“STn”是可互换使用的,以指粘蛋白碳水化合物相关抗原(Neu5Acα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr)(唾液酸α2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr)。
“唾液酸基-Lex”指Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc。
“唾液酸基-Lea”指唾液酸基-Lex的区域异构体(Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc)。
“9-O-乙酰基-GD3”指Neu5,9Ac2α2-8Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ1-1神经酰胺。
当提及相对于第二种样品(或相对于第二个受试者),在第一种样品中(或在第一个受试者中)的任何分子(例如,氨基酸序列和核酸序列、聚糖、Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如唾液酸化聚糖)、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位、Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物、抗体(例如其特异性结合Neu5Gc-唾液酸化抗原、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位和Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物中的一种或多种)等)、细胞和/或现象(例如疾病症状、与分子的结合、两种分子的结合特异性、两种分子的结合亲和力、对于癌症的特异性、对于癌症的灵敏度、结合的亲和力、酶活性等)时,术语“减少”、“抑制”、“减小”、“压制”、“降低”和语法等价物(包括“更低的”、“更小的”等),意指在第一种样品中(或在第一个受试者中)分子、细胞和/或现象的量低于在第二种样品中(或在第二个受试者中)任何量,所述量使用任何领域公认的统计分析法是统计上显著的。在一个实施方案中,在第一种样品中(或在第一个受试者中)分子、细胞和/或现象的数量比在第二种样品中(或在第二个受试者中)中相同分子、细胞和/或现象的量低至少10%、低至少25%、低至少50%、低至少75%、和/或低至少90%。在另一个实施方案中,在第一种样品中(或在第一个受试者中)分子、细胞和/或现象的量比在第二种样品中(或在第二个受试者中)中相同分子、细胞和/或现象的量低从5%到100%的任何数目百分比,例如但不限于从10%到100%、从20%到100%、从30%到100%、从40%到100%、从50%到100%、从60%到100%、从70%到100%、从80%到100%、和从90%到100%。在一个实施方案中,第一个受试者没有通过使用本发明的组合物和/或方法处理的受试者例示,但不限于其。在一个进一步的实施方案中,第二个受试者通过没有使用本发明的组合物和/或方法处理的受试者例示,但不限于其。在一个备选实施方案中,第二个受试者通过与第一个受试者相比较,已使用本发明的组合物和/或方法、以不同剂量和/或不同持续时间和/或经由不同施用途径处理的受试者例示,但不限于其。在一个实施方案中,第一个和第二个受试者可以是相同个体,例如其中寻求在一个个体中测定本发明的组合物和/或方法的不同方案(例如剂量、持续时间、施用途径等)的效应。在另一个实施方案中,第一个和第二个受试者可以是不同个体,例如当比较本发明的组合物和/或方法对参加临床试验的一个个体和在医院中的另一个个体的作用时。
当提及相对于第二种样品(或相对于第二个受试者),在第一种样品中(或在第一个受试者中)的任何分子(例如,氨基酸序列和核酸序列、聚糖、Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如唾液酸化聚糖)、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位、Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物、抗体(例如其特异性结合Neu5Gc-唾液酸化抗原、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位和Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物中的一种或多种)等)、细胞和/或现象(例如疾病症状、与分子的结合、两种分子的结合特异性、两种分子的结合亲和力、对于癌症的特异性、对于癌症的灵敏度、结合的亲和力、酶活性等)时,术语“增加”、“升高”、“上升”和语法等价物(包括“更高的”、“更大的”等),意指在第一种样品中(或在第一个受试者中)分子、细胞和/或现象的量高于在第二种样品中(或在第二个受试者中)任何量,所述量使用任何领域公认的统计分析法是统计上显著的。在一个实施方案中,在第一种样品中(或在第一个受试者中)分子、细胞和/或现象的数量比在第二种样品中(或在第二个受试者中)中相同分子、细胞和/或现象的数量高至少10%、高至少25%、高至少50%、高至少75%、和/或高至少90%。这包括但不限于,在第一种样品中(或在第一个受试者中)分子、细胞和/或现象的数量比在第二种样品中(或在第二个受试者中)中相同分子、细胞和/或现象的数量超过至少10%、超过至少15%、超过至少20%、超过至少25%、超过至少30%、超过至少35%、超过至少40%、超过至少45%、超过至少50%、超过至少55%、超过至少60%、超过至少65%、超过至少70%、超过至少75%、超过至少80%、超过至少85%、超过至少90%、和/或超过至少95%。在一个实施方案中,第一个受试者通过已使用本发明的组合物和/或方法处理的受试者例示,但不限于其。在一个进一步的实施方案中,第二个受试者通过没有使用本发明的组合物和/或方法处理的受试者例示,但不限于其。在一个备选实施方案中,第二个受试者通过与第一个受试者相比较,已使用本发明的组合物和/或方法、以不同剂量和/或不同持续时间和/或经由不同施用途径处理的受试者例示,但不限于其。在一个实施方案中,第一个和第二个受试者可以是相同个体,例如其中寻求在一个个体中测定本发明的组合物和/或方法的不同方案(例如剂量、持续时间、施用途径等)的效应。在另一个实施方案中,第一个和第二个受试者可以是不同个体,例如当比较本发明的组合物和/或方法对参加临床试验的一个个体和在医院中的另一个个体的作用时。
本文提及任何数目范围特别包括由那个范围包含的每个数值(包括分数和整数)。为了举例说明且非限制性地,本文提及“至少50”的范围包括50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60等的整数,和分数50.1、50.2、50.3、50.4、50.5、50.6、50.7、50.8、50.9等。在进一步举例说明中,本文提及“小于50”的范围包括整数49、48、47、46、45、44、43、42、41、40等,和分数49.9、49.8、49.7、49.6、49.5、49.4、49.3、49.2、49.1、49.0等。在另外一个举例说明中,本文提及“5-10”的范围包括5、6、7、8、9和10的每个整数,和每个分数例如5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9等。
如本文使用的,当提及样品、细胞、组织、动物等时,术语“对照”指本领域普通技术人员可以用于比较结果与另一个样品、细胞、组织、动物等的任何类型的样品、细胞、组织、动物等,通过维持相同条件,除了某一个特定因子外,且从而推断这个改变因子的原因显著性。
发明简述
本发明提供了下述发现:当Neu5Gc替换在人癌症中是超表达的任何唾液酸化抗原中的Neu5Ac时,这生成新型癌症特异性抗原和癌症特异性抗体应答。因此,本发明提供了下述发现:癌症与在人癌症中是超表达的任何唾液酸化抗原中天然存在的Neu5Ac由Neu5Gc的替换相关。
因此,本发明提供了由下述例示的癌症标记:a)Neu5Gc-唾液酸化抗原,b)Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位,c)Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物,和d)特异性结合抗原、表位和衍生物中的一种或多种的抗体。本发明进一步提供了通过检测这些癌症标记中的一种或多种用于检测癌症的方法,例如通过检测特异性结合抗原、表位和衍生物中的一种或多种和针对这些标记的抗体的抗体。
人癌可以代谢掺入且呈现饮食非人唾液酸Neu5Gc,其与人唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)相差一个氧原子。肿瘤相关的Neu5Gc可以与低水平的循环抗Neu5Gc抗体相互作用,从而在人样Neu5Gc缺陷小鼠模型中促进经由慢性炎症的肿瘤进展。
人抗Neu5Gc抗体的这种多克隆谱还包括潜在的癌症生物标记。我们在癌症和非癌症患者的血清中表征其,使用呈现多种Neu5Gc聚糖和对照Neu5Ac聚糖的新型唾液酸聚糖微阵列。在一个实施方案中,发现针对Neu5Gcα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr(GcSTn)的抗体在具有癌比具有其他疾病的患者中更显著。这种罕见表位源于掺入癌标记唾液酸基-Tn内的饮食Neu5Gc,并且是用于生物标记生成的此类新型机制的第一个例子。
在一个实施方案中,本发明提供了用于检测受试者中的癌症的组合物和方法,其包括检测相对于对照样品,在来自受试者的样品中一种或多种Neu5Gc-唾液酸化抗原、Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位和Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物中的一种或多种的增加水平,其中Neu5Gc-唾液酸化抗原选自Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-R(聚糖2)、Neu5Gcα2-6Lacβ-R(聚糖20)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-R(聚糖34),其中R是聚糖可以与之偶联的任何天然或非天然分子,例如生物素、白蛋白、ProNH2(表3)、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydrido、羟基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2=O(CH2)2CH2NH2、(OCH2CH2)6NH2、O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2、荧光标记2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺类似物(AEAB)、氨基氧基-基团、甲氨基氧基-基团、酰肼基团、氨基脂质1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)等,并且其中Lac是Galβ1-4GlcNAc,从而检测受试者中癌症的存在。在某些实施方案中,唾液酸化聚糖是纯化的。在一个实施方案中,该方法进一步包括治疗受试者。本文数据显示虽然具有不同特异性的抗Neu5Gc抗体在人血清中是普遍的,但与健康对照相比较,抗Neu5Gc-唾液酸基-Tn抗体在癌患者中是一致升高的(表3)。在某些实施方案中,R是ProNH2,并且唾液酸化聚糖选自Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-R(聚糖2)、Neu5Gcα2-6Lacβ-R(聚糖20)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-R(聚糖34)。在一个特别优选的实施方案中,唾液酸化聚糖包含Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)和/或Neu5Gcα2-6GalNAcα-OR(表3)。
在某些实施方案中,检测样品中的唾液酸化聚糖涉及检测抗体的存在和/或水平,所述抗体特异性结合唾液酸化聚糖和/或特异性结合其表位。本发明并不限于抗体的特定类型、或用于测定抗体水平的方法,所述抗体特异性结合唾液酸化聚糖。事实上,用于检测N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和抗Neu5Gc特异性抗体的一般方法是本领域已知的(例如Varki等人美国专利申请2007/0275409,2007年11月29日公开)且在本文中公开。
在特定实施方案中,特异性结合唾液酸化聚糖的抗体以较低水平结合选自N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和唾液酸基-Tn(STn)的一种或多种分子。在一个更优选实施方案中,特异性结合唾液酸化聚糖的抗体不特异性结合选自N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和唾液酸基-Tn(STn)的一种或多种分子。
虽然本发明的组合物和方法并不限于任何特定特异性和/或灵敏度,但在一个实施方案中,特异性结合唾液酸化聚糖的抗体具有大于0.50的关于癌症的接受者操作特性(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)。在另一个实施方案中,特异性结合唾液酸化聚糖的抗体具有大于50%的癌症特异性和/或具有大于50%的癌症灵敏度。在其他实施方案中,癌症特异性等于或低于50%。
本发明的组合物和方法的一个优点是癌症的早期检测。因此,在一个实施方案中,本发明的组合物和方法可以应用于缺乏可检测的癌症症状的受试者(在例如早期筛选中有用)、处于癌症的危险中的受试者(在例如早期筛选中有用)、和具有一种或多种可检测的癌症症状的受试者(在例如癌症诊断的证实中有用)。因此,在某些实施方案中,本发明的组合物和方法可以用于监控癌症和/或癌症治疗的进展。
本发明的组合物和方法可以与任何癌症例如癌结合使用。不预期将癌症限于任何特定来源,在某些实施方案中,癌症选自前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和子宫内膜癌。在另一个实施方案中,癌症选自转移性癌症(例如转移性癌)和非转移性癌症(例如非转移性癌)。
在某些实施方案中,本发明的方法采用对照样品的使用。不限制对照样品的类型或来源,在一个实施方案中,对照样品来自缺乏癌症的组织。这通过来自相同或不同受试者的对照样品例示,例如对于性别和/或年龄匹配的受试者,具有良性肿瘤的受试者等。
本发明还提供了选自下述的经分离的唾液酸化聚糖:Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖23)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-R(聚糖21)、Neu5Gcα2-6Lacβ-R(聚糖30)、Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-R(聚糖37)、Neu5Gcα2-6GalNAcα-OR(聚糖23)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-OR(聚糖21)、Neu5Gcα2-6Lacβ-OR(聚糖30)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-OR(聚糖37),其中R是聚糖可以与之偶联的任何天然或非天然分子,例如生物素、白蛋白、ProNH2(表3)、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydrido、羟基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2=O(CH2)2CH2NH2、(OCH2CH2)6NH2、O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2、荧光标记2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺类似物(AEAB)、氨基氧基-基团、甲氨基氧基-基团、酰肼基团、氨基脂质1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)等,并且其中Lac是Galβ1-4GlcNAc。在一个实施方案中,唾液酸化聚糖选自Neu5Gcα2-6GalNAcαProNH2(聚糖23)、Neu5Gcα2-6LacβProNH2(聚糖30)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβProNH2(聚糖21)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβProNH2(聚糖37)。本发明的唾液酸化聚糖用作抗原用于生成特异性结合唾液酸化聚糖的抗体。抗唾液酸化聚糖抗体依次可以用于生成特异性结合抗唾液酸化聚糖抗体的次级抗体。这些次级抗体用于检测抗唾液酸化聚糖抗体,例如来自筛选癌症的受试者的样品中的那些。
本发明还提供的是抗唾液酸化聚糖抗体,其特异性结合唾液酸化聚糖、唾液酸化聚糖的表位和唾液酸化聚糖的衍生物,其中所述唾液酸化聚糖选自Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖23)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-R(聚糖21)、Neu5Gcα2-6Lacβ-R(聚糖30)、Neu5Gcα2-3Gαβ1-3GalNAcβ-R(聚糖37)、Neu5Gcα2-6GalNAcα-OR(聚糖23)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-OR(聚糖21)、Neu5Gcα2-6Lacβ-OR(聚糖30)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-OR(聚糖37),其中R是聚糖可以与之偶联的任何天然或非天然分子,例如生物素、白蛋白、ProNH2(表3)、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydrido、羟基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2=O(CH2)2CH2NH2、(OCH2CH2)6NH2、O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2、荧光标记2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺类似物(AEAB)、氨基氧基-基团、甲氨基氧基-基团、酰肼基团、氨基脂质1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI),并且其中Lac是Galβ1-4GlcNAc。在一个特定实施方案中,唾液酸化聚糖选自Neu5Gcα2-6GalNAcαProNH2(聚糖23)、Neu5Gcα2-6LacβProNH2(聚糖30)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβProNH2(聚糖21)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβProNH2(聚糖37)。如上文讨论的,抗唾液酸化聚糖抗体可以用于生成特异性结合抗唾液酸化聚糖抗体的次级抗体。这些次级抗体用于检测抗唾液酸化聚糖抗体,例如来自筛选癌症的受试者的样品中的那些。
本发明进一步提供了含有选自下述的一种或多种分子的组合物和试剂盒:(a)一种或多种唾液酸化聚糖、唾液酸化聚糖的表位、和唾液酸化聚糖的衍生物,其中所述唾液酸化聚糖选自Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖23)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-R(聚糖21)、Neu5Gcα2-6Lacβ-R(聚糖30)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-R(聚糖37)、Neu5Gcα2-6GalNAcα-OR(聚糖23)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-OR(聚糖21)、Neu5Gcα2-6Lacβ-OR(聚糖30)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-OR(聚糖37),其中R是聚糖可以与之偶联的任何天然或非天然分子,例如生物素、白蛋白、ProNH2(表3)、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydrido、羟基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2=O(CH2)2CH2NH2、(OCH2CH2)6NH2、O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2、荧光标记2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺类似物(AEAB)、氨基氧基-基团、甲氨基氧基-基团、酰肼基团、氨基脂质1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI)等,并且其中Lac是Galβ1-4GlcNAc,(b)抗唾液酸化聚糖特异性抗体,和(c)特异性结合抗唾液酸化聚糖抗体的抗体。
发明详述
在一个实施方案中,基于针对免疫原性非人饮食异种-自身抗原的异种-自身抗体可以充当生物标记的发现,本发明提供了用于癌症检测的组合物和方法。本发明的实施方案提供了癌症的早期检测,例如在通过其他方法例如乳房X线照相术检测癌症前。本发明的实施方案还提供了癌症进展和治疗的监控。
本发明的实施方案基于下述发现:饮食Neu5Gc可以代谢替换STn中的Neu5Ac,生成由异种-自身抗体特异性识别的,独特的新肿瘤相关异种-自身抗原GcSTn。这种新型癌症生物标记涉及代谢掺入的免疫原性饮食分子。本发明的实施方案进一步基于下述观察:Neu5Gc还可以替换其他肿瘤相关聚糖结构中的Neu5Ac,从而生成其他新型生物标记,例如Gc-唾液酸基-Lex、Gc-唾液酸基-Lea、和Gc-9-O-乙酰基-GD3。新型Neu5Gc-唾液酸化抗原的例子在表3中在实施例2中提供(参见下文)。
在一个实施方案中,本发明提供了抗GcSTn IgG是独特的人癌相关生物标记的发现。有趣的是,聚糖6类似癌相关生物标记唾液酸基-Tn(STn;Neu5Acα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr),除Neu5Ac替换为Neu5Gc(GcSTn;Neu5Gcα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr)外。
本文数据证实通过癌症患者的饮食Neu5Gc消耗将STn的末端Neu5Ac替换为Neu5Gc,生成新型异种-自身抗原GcSTn,连同其相应特异性抗GcSTn抗体(图3D),作为新型癌生物标记(基于约400个癌患者和对照)。这些步骤在早期肿瘤阶段时类似地发生,暗示抗GcSTn抗体对于癌的早期检测或测定未来危险有用。
本发明提供了用于检测作为用于癌症检测和监控的有用生物标记的抗GcSTn IgG的组合物和方法,包括但不限于癌的早期检测。例如,本发明的一个实施方案显示乳腺癌的检测,具有0.6的估计AUC。
本发明提供了体现下述发现的组合物和方法:通过癌症患者的Neu5Gc消耗将Neu5Ac代谢替换为Neu5Gc,生成聚糖异种-自身抗原。本发明还提供了体现相应异种-自身抗体是独特肿瘤生物标记的发现的组合物和方法。
在一个实施方案中,使用含有多种Neu5Gc聚糖与对照Neu5Ac匹配聚糖的新型高流通量唾液酸聚糖微阵列,我们显示针对Neu5Gc-唾液酸基-Tn(GcSTn;Neu5Gcα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr)的人血清抗体在癌患者中富集超过对照。
用于检测癌症特异性抗原的方法是本领域已知的(例如在通过引用整体合并的Robbins等人,美国专利号5,902,725中描述的前列腺特异性抗原(PSA)的检测)。然而,与前列腺特异性抗原(PSA)不同,在某些实施方案中,本发明基于通过Neu5Gc摄取的癌症特异性,和/或Cosmc灭活依赖性Neu5Gc掺入本发明的Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)内,和/或针对本发明的Neu5Gc-唾液酸化抗原的人抗体应答。换言之,通过测定针对本发明的Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)的异种自身抗体,我们可以利用人免疫应答的扩增效应,增加用于检测本发明的隐蔽Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)的灵敏度。可以监控通过改变这些抗体水平来减少癌症危险的另外治疗操纵且用于调整治疗。因此,本发明组合物和方法可以用于发展癌症的增加危险的预测、癌症的早期诊断、和免疫的药效监控和/或由于抗Neu5Gc-Tn抗体用于处于发展癌症的增加危险中的患者的饮食调节处理。
O联糖基化在癌症中是不完全的,因为在X染色体上的体细胞Cosmc突变导致在癌症特别是癌中唾液酸化Tn(STn)抗原的表达。在一个实施方案中,本发明提供了体现下述发现的方法和组合物:饮食Neu5Gc在癌症中的掺入导致一部分STn转化成Neu5Gc-唾液酸基Tn(GcSTn)。在另一个实施方案中,本发明提供了体现下述发现的方法和组合物:免疫系统将GcSTn视为外源的且生成针对其的抗体,其可以使用本发明的组合物和方法在受试者的组织包括血清中检测。在另一个实施方案中,本发明提供了体现下述发现的方法和组合物:与现有技术癌症标记相比较,针对GcSTn的这些抗体显示对于癌症与正常血清比较改善的灵敏度和特异性。因此,在一个进一步的实施方案中,本发明提供了体现下述发现的方法和组合物:测量这些的水平中的增加可以用于多种癌症特别是癌的早期检测。
在特定实施方案中,本发明提供了用于检测下述的方法和组合物:针对非人二糖N-羟乙酰神经氨酸-α2-6-N-乙酰半乳糖胺-α-OR(Neu5Gcα2-6-GalNAcα-OR;Neu5Gc-唾液酸基-Tn,下文称为“Gc-STn”)诱导的人抗体(包括循环抗体),用于癌症的诊断、癌症危险和疫苗接种/耐受化(tolerization)效应。Neu5Gc在人中不制备,但以大量存在于饮食中(特别是红色肉类和饮食中),且经由在癌症中是上调的胞饮作用和唾液酸溶酶体转运蛋白,优先通过癌性和癌前细胞吸收。癌细胞也频繁经历X联基因COSMC的半合子丧失,导致肿瘤标记唾液酸基-Tn的产生。唾液酸基-Tn和饮食Neu5Gc掺入的组合生成本发明的新型异种自身抗原Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)。人免疫系统将本发明的Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)视为外源的,并且生成针对其的抗体应答。具有不适当升高水平的针对本发明Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)的抗体的个体因此具有增加的癌症危险,因为免疫系统检测在隐蔽癌性细胞中异种自身抗原的存在。在这些抗体的水平中的变化可以用于筛选癌症的发展和/或进展。本发明还可以用于监控疫苗接种/耐受化的效应用于癌症预防,使用本发明的Neu5Gc-唾液酸化抗原(例如Gc-STn)作为抗原。
除唾液酸基-Tn外,本发明的实施方案包括其他癌症相关唾液酸糖苷(sialosides),包括但不限于唾液酸基-Lex(Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)及其区域异构体唾液酸基-Lea(Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc;和9-O-乙酰基-GD3(Neu5,9Ac2α2-8Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ1-1神经酰胺)。Neu5Gc还可以替换其他肿瘤相关聚糖结构中的Neu5Ac,从而生成其他新型生物标记例如Gc-唾液酸基-Lex。
虽然大多数生物标记发现策略基于癌症与对照比较的总体比较搜索,但基于我们关于抗Neu5Gc抗体的令人惊讶发现,我们选择假设驱动的生物标记方法。本文数据证实尤其是通过癌症患者的饮食Neu5Gc消耗导致Neu5Ac替换为Neu5Gc,生成新型异种-自身抗原,伴随相应特异性异种-自身抗体,其用作生物标记用于例如癌的早期筛选。
本文数据提供了通过人体液免疫系统特异性检测的示例性异种-自身抗原Neu5Gcα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr(GcSTn)。使用具有20对Neu5Gc和Neu5Ac聚糖(相差单个氧原子)的聚糖阵列的数据显示与健康对照相比较,针对GcSTn的抗体具有区分具有癌(且特别是非转移性癌)的患者的有希望的能力。此类异种-自身抗体具有用于对于人癌症的诊断和预测方法的潜力。
用20种可能的含Neu5Gc结构及其相应Neu5Ac匹配聚糖作为对照印刷高流通量唾液酸聚糖微阵列。来自具有乳腺癌或其他癌的患者的血清和来自健康对照的血清覆盖在聚糖阵列上,并且测定结合每种聚糖的抗体。将样品分成训练和验证数据集用于统计分析。此处我们显示虽然具有不同特异性的抗Neu5Gc抗体在人血清中是普遍的,但与健康对照相比较,抗Neu5Gc-唾液酸基-Tn抗体在癌患者中是一致升高的。
本文数据证实令人惊讶的发现:尤其是通过癌症患者的饮食Neu5Gc消耗导致Neu5Ac替换为Neu5Gc,生成新型异种-自身抗原。具体地,当细胞表面聚糖标记唾液酸基-Tn(Neu5Acα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr)中的末端Neu5Ac替换为Neu5Gc时,这导致新型异种-自身抗原Neu5Gcα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr(GcSTn)的生成,连同其相应特异性异种-自身抗体,抗Neu5Gc-STn抗体(图3D)。此处我们证实针对这种新型异种-自身抗原的抗体,抗Neu5Gc-STn抗体,可以用作新型生物标记用于癌的早期筛选。这在无偏差聚糖微阵列方法中在相对大样品大小的人血清中发现,所述相对大样品大小的人血清允许我们使用严格的统计分析(Hawkins,2004,Ransohoff,2004)。
在某些实施方案中,本发明的组合物(例如Neu5Gc-唾液酸化抗原、Neu5Gc-唾液酸化聚糖等)固定在固体表面上(例如珠或阵列上)(参见美国专利公开号2010/0075344)。在一个优选实施方案中,本发明的聚糖与载体结合,所述载体将三维聚糖结构最佳地暴露在阵列或珠表面上。用于制备聚糖阵列的方法在2005年3月7日提交的PCT/US2005/007370、2004年11月19日提交的美国临时专利申请号60/629,666中描述,其各自通过这种引用整体合并入本文并且构成本说明书的部分。连接系统已在2006年7月26日提交的美国临时专利申请号60/833,249中描述,其通过这种引用整体合并入本文并且构成本说明书的部分。
实验
下述实施例作用于举例说明本发明的特定实施方案和方面,并且不应解释为限制其范围。
实施例1
材料与方法
血清样品。研究总共386个癌症病例和对照人血清,具有来自Institutional Review Board of the University of California,San Diego的批准。事先获得书面知情同意书。从在Moore′s UCSDCancer Center Clinic就诊的患者中收集血清,所述患者不具有已知或怀疑的妊娠或感染。将未鉴定的(De-identified)血清置于12个分开的条形编码的等分试样内,并且贮存于-80℃。预期捕获与样品处理有关的EDRN通用数据元素(CDE)且在Biorepository数据库中记录。我们测试来自175个乳腺癌患者和其他类型的癌,以及对于性别和可能的年龄匹配的对照(80)的血清,所述其他类型的癌包括前列腺(39)、卵巢(29)、肺(14)、结肠(22)、胰腺(16)、子宫内膜(11)。从在CancerCenter诊所就诊的患者中获得对照血清,所述患者不具有诊断的癌症,包括具有良性肿瘤的那些,因此升高条,因为它使得更加难以区分癌症与对照(在对照组中存在13个良性肿瘤受试者,包括3个甲状旁腺、3个皮肤、2个卵巢、2个甲状腺、1个肾上腺、1个乳腺和1个口咽)。跨越所有癌症病例,存在具有转移性疾病的总共66个患者(34个乳腺癌、5个前列腺、3个卵巢、8个肺、7个结肠、9个胰腺、0个子宫内膜)。用于分析的血清样品在2个分开的研究室之间分开,具有10个样品重叠用于质量控制。根据最佳化方案,对来自Biorepository受试者的未鉴定的血清样品实施微阵列杂交。将原始数据提供给生物统计学中心用于分析。因此,对于样品的病例/对照状态不知情地进行微阵列测定和初步统计分析。
抗体。纯化的人免疫球蛋白(IgG)、Cy5-或Cy3-链霉亲和素、Cy3-山羊抗人IgG(H+L)、Cy5-或Cy3-AffiniPure驴抗鸡IgY(IgG)(H+L)、HRP-缀合的山羊抗人Fc片段和HRP-缀合的山羊抗小鼠Fc片段来自Jackson ImmunoResearch Laboratories,并且亲和力纯化的鸡抗Neu5Gc如所述的(4)制备。
糖缀合物。所有聚丙烯酰胺(PAA)-糖缀合物来自GlycoTech。人血清白蛋白(HSA)-缀合的唾液酸糖苷如所述的(6,7)合成。如先前描述的(8-10),使用有效的单罐(one-pot)三酶化学酶促合成系统合成唾液酸聚糖对(其中唯一差异是Neu5Ac与Neu5Gc比较)。使用的所有糖缀合物的唾液酸(Sia)含量就其类型(NeuAc/Neu5Gc+/-O-乙酰基化)、数量和纯度进行分析。使用2M乙酸随后为在80℃的3小时水解,通过酸水解从糖缀合物中释放Sias。随后将游离Sias用1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)衍生,且通过反相HPLC(DMB-HPLC)用荧光检测分析。Sias的定量通过与已知数量的DMB衍生的Neu5Ac比较完成(11)。
唾液酸聚糖微阵列制造。环氧化物衍生的Corning载玻片购自Thermo Fisher Scientific(Pittsburgh,PA),并且用来自ParallelSynthesis Technologies(Santa Clara,CA)的具有50x50μm尖端的SMT-S50,Classic硅针印刷阵列,使用UCSF DeRisi Linear ServoMotor Microarrayer,生成~70μm直径点。将40种糖缀合物(表2)分布在384孔来源平板上,使用4个重复孔/样品和5μl/孔(版本7)。每种糖缀合物以250、125、62.5和12.5μM的四个浓度在最佳化的印刷缓冲液(300mM磷酸盐缓冲液,pH 8.4)中制备。为了监控印刷质量,我们对于每个印刷针使用以150μg/ml(在PBS中)的人IgG(Jackson ImmunoResearch)的重复孔。使用16根针,其中每根针印刷4个重复点/孔(通过使用384孔来源平板4次),20个点/行,具有220mm的间隔。在每个载玻片上印刷一个全阵列(在约1小时/~200个载玻片内)。在阵列室中的湿度水平在印刷过程中维持在约70%。将印刷的载玻片留在阵列甲板(arrayer deck)上过夜,允许湿度下降至环境水平。接下来,记录载玻片的印刷次序(使用来自VWR的Fine TipBlack实验室标记),并且将载玻片包装,真空密封且贮存于干燥室中在RT直至使用时。在各~200个载玻片的四个分批中经过12天印刷载玻片,来自两块384孔来源平板(一块平板用于每两个印刷分批),其在一个月内显色。如本文详述的测试且分析与阵列载玻片的血清结合。
20个唾液酸聚糖对(Neu5Ac与Neu5Gc比较;表2)如所述的(27-29)合成,且在最佳化的印刷缓冲液(300mM磷酸盐缓冲液,pH 8.4)中以250、125、62.5和12.5μM以各4次重复印刷在环氧化物载玻片(Thermo Fisher Scientific,Corning,Pittsburgh,PA)上,并且如本文详述的测试且分析与阵列的血清结合。
血清结合测定。将载玻片在染色皿中与50℃预温的封闭溶液(在0.1M Tris pH 9中0.05M乙醇胺)温育1小时,以封闭在载玻片表面上的剩余反应基团,随后用50℃预温的dH2O洗涤2次。将载玻片置于Antibody Amplifier ProHisto(Columbia,SC)中,并且用5ml/载玻片封闭溶液2(PBS/OVA,在PBS pH 7.4中1%w/v卵白蛋白)在室温(RT)封闭1小时,伴随轻轻振荡。接下来,将封闭溶液抽吸,且将1∶100稀释的血清样品加入每个载玻片(在PBS/OVA中,2.5ml/载玻片),且允许伴随轻轻振荡在RT温育2小时。将载玻片用PBST(PBS,1%Tween)随后用PBS洗涤2次,共10分钟/洗涤伴随振荡。通过与在PBS中1∶500稀释的Cy3-山羊抗人IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch)(1.5mg/ml)在RT温育1小时检测结合的抗体。将载玻片用PBST(PBS,1%Tween)随后用PBS随后为dH2O洗涤2次,共10分钟/洗涤伴随振荡,随后以200xg离心3分钟。将干燥载玻片真空密封且贮存于黑暗中,直至第二天扫描时。
阵列载玻片加工。使用来自4个印刷日的载玻片(第1天:198个载玻片;第2天:118个载玻片;第3天:150;和第4天:2)。根据人血清样品的分布,载玻片测定在两个研究室平行执行。进行统计分析以比较在研究室之间的再现性,并且显示它们在检测升高的Neu5Gc聚糖抗体表达水平中是非常可比较的。载玻片通过两个研究室在总共10个不同日同时显色(在印刷后一个月内),同时对于待测定的样品的病例/对照状态不知情。如下所述,以两个增益(以避免边缘高/低信号的丧失)在显色后一天扫描载玻片(最多48个载玻片/天)。对于在每个实验日中的质量控制(QC),测定三个对照载玻片连同血清样品。这包括在载玻片上作为单独检测物的Cy3-抗人IgG抗体(1∶500,1.5μg/ml),用Cy3-抗人IgG抗体检测的与多重Neu5Gc聚糖表位具有已知高反应性的人血清(1∶100;如所述的S34(7)),和用Cy3-AffiniPure驴抗鸡IgY抗体(1∶1,000,0.75μg/ml)检测的具有多克隆亲和力纯化的鸡抗Neu5Gc抗体(1∶10,000)(4),如主要正文中详述的。如果我们使用聚糖6作为代表(因此存在16个值/载玻片:具有浓度12.5、62.5、125、250μM的4个重复滴定曲线),来自Cy3-抗人IgG在增益=350时的对数抗体表达值是一致很低的且具有很少变异性(11个载玻片;Q1范围:5.70-5.70;中值范围:5.70-5.71;Q3范围:5.70-5.75),而来自多克隆鸡抗Neu5Gc抗体的值(10个载玻片;Q1范围:5.71-7.15;中值范围:6.80-7.53;Q3范围:7.0-7.68)是一致很高的,并且来自S34的值(11个载玻片;Q1范围:5.70-7.28;中值范围:6.09-7.69;Q3范围:6.33-7.81)是更可变的。这32个对照载玻片在11个扫描日期、5个印刷日且用5个不同载玻片印刷编号进行。
图像加工。载玻片以10μm分辨率用Genepix 4000B微阵列扫描仪(Molecular Devices Corporation,Union City,CA)扫描,使用两个增益(350和450)。图像分析用Genepix Pro 6.0分析软件(Molecular Devices Corporation)进行。质量检查和图像分析程序使用5个病例和5个对照的初步训练数据集进行测定。点定义为具有100μm固定半径的循环特征;这给出比在Genepix扫描软件中的可变半径特征更一致的结果。执行局部本底扣除,并且通过相对小的常数(基于用于原始数据的曲线图,视觉上选择为300)上移差异,以消除负值;如果它们是≤100单位,那么将移动的差异设为100;并且将所有值对数转化,以确保正常性。使用两个增益的结果是一致的;来自增益350的数据用于最终分析中。
受试者特征。如表1中所述,总共386个癌症病例和对照涉及这个研究中。跨越所有癌症病例,存在具有转移性疾病的总共66个病例。为了开发基本分析计划且训练初步分类器,使用具有知情的病例/对照状态的5个乳腺癌病例和5个对照。用于初步分类器的验证数据包括175个乳腺癌受试者和50个对照,具有对于分析统计学家和测定血清的科学家不知情的病例/对照状态。关于这些受试者的病例/对照状态随后仅对于第一作者(senior author)是知情的,并且随机选择一半先前样品(87个癌症受试者和25个对照)作为训练集,以选择聚糖用于进一步考虑。另一半(86个癌症受试者和25个对照)用作第二个验证集,统计学家在这个阶段时对于其仍是不知情的。最后独立验证集包括来自其他癌症类型的131病例和30个另外对照。
阵列统计方法。我们最初使用与具有高抗Neu5Gc抗体(如先前描述的S34(Padler-Karavani等人,2008))的人血清杂交的24个载玻片,以开发质量控制和分析方法。随后,5个乳腺癌病例和5个对照的小训练集用于开发我们的Neu5Gc抗体应答的定量评估且训练我们的初步分类器。
数据对于每个受试者载玻片分开标绘,具有不同符号用于不同针块或浓度;我们使用如上所述在本底扣除、移动和阈值和对数转化后的抗体表达值。针对20种Neu5Ac聚糖的抗体的表达值跨越受试者保持一致很低的,并且因此在每个载玻片内的平均Neu5Ac抗体表达视为标准化因素。在载玻片上的每个受试者的抗Neu5Gc抗体应答用两个参数(截距α和斜率β)概括,其将抗Neu5Gc抗体应答描述为Neu5Gc聚糖浓度的函数。这些参数由对于关于每个受试者的数据的混合效应模型拟合进行估计。在该模型中,我们最初包括关于所有潜在主要变异来源(印刷日、扫描日、载玻片印刷编号和针块编号)的随机效应,然而,我们仅保留跨越受试者一致显著的效应,使用以10%显著性水平的似然比检验。对于每个受试者用于驱动参数α(在以最低浓度的Neu5Gc和Neu5Ac聚糖之间的平均差)和β(随着浓度增加,在Neu5Gc和Neu5Ac聚糖之间在斜率中的差异)的最终模型在下文详述。这个模型包括关于Neu5Gc的指示物(1个用于Neu5Gc和0个用于Neu5Ac),用于浓度的项(值0、1、2和3分别对应于四个浓度12.5、62.5、125和250μM)和Neu5Gc指示物与浓度的相互作用项;包括随机块效应以解释在针块之间的变异(在每个载玻片上通常存在16个块;1个载玻片对应于一个受试者):
yijk=α0+α*Ii(Gc)+β0*浓度j+β*Ii(Gc)*浓度j+随机(块)+误差ijk
yijk是经转化的抗体表达值;
i=1,…,20(指出20种Neu5Ac聚糖)和21(指出4种目的Neu5Gc聚糖中的每一种)。
j=1,2,3和4,其分别指出测试的四个浓度值;
k=1,2,3和4,其指出四次重复(每个浓度中的每种聚糖)。
对于训练和两个验证数据集,对于每种聚糖,对于每个受试者获得参数α和β作为抗Neu5Gc抗体应答的测量,并且随后在逻辑回归模型中用作预测物以区分癌症病例与对照。回归的预测力使用ROC曲线的曲线下面积(AUC)进行估计,并且10倍交叉验证(cv)用于评估ROC曲线的变异性。在每次cv运行中,随机选择数据集中的90%病例和90%对照,并且随后获得来自拟合的逻辑回归的估计系数,以计算关于受试者成为剩余10%受试者中的病例的概率。对于每次运行计算AUC,并且随后跨越所有500次运行计算平均AUC。2.5和97.5百分位数用于构建在AUC上的95%置信区间。标绘概括ROC曲线;对ROC曲线水平地求平均值,以计算在给定灵敏度水平的特异性。分析在R版本2.5中执行;ROCR包(12)用于概括交叉验证ROC曲线。
实施例2
在一个示例性实施方案中,我们使用独特的唾液酸聚糖微阵列,以描述针对作为新型类型的人血清癌生物标记的饮食有关抗原的抗体。这建立了饮食衍生的抗原可以代谢掺入肿瘤内的新概念,生成通过免疫系统检测的新型抗原。
表1.通过癌症类型的研究受试者综述
表2.在阵列上研究的聚糖列表
将相差单个氧原子的20个聚糖对合成且印刷在环氧化物包被的载玻片上。聚糖编号根据末端唾液酸聚类:Neu5Ac(Ac:1-20)和Neu5Gc(Gc:21-40)。聚糖根据末端Sia进行编号:奇数指示Neu5Ac(Ac),并且偶数是Neu5Gc(Gc)。ProNH2=O(CH2)2CH2NH2
表3.用于验证测试的显著聚糖的选择
将具有超过0.55的AUC的聚糖(21、23、30和37)选择为目的聚糖以进行验证测试,排除转移性病例。对于每种聚糖,使用逻辑回归,得自混合效应模型的两个抗体应答概括变量α和β用于区分病例与对照。十倍交叉验证验证估计AUC:在每次运行时,随机选择11个受试者用于交叉验证,并且剩余101个受试者用于估计逻辑回归模型。来自该模型的系数用于区分在11个交叉验证受试者上的病例与对照且记录AUC。对于20种聚糖各自进行总共500次交叉验证运行,并且下文呈现来自交叉验证的平均AUC。对于500次十倍交叉验证运行计算ROC曲线和相应AUC。将具有超过0.55的平均AUC的聚糖(2、6、20和34)选择为目的聚糖以进行验证。ProNH2=O(CH2)2CH2NH2。
表4.使用验证数据4种示例性聚糖的预测能力的概括。
如表2中概括的,四种聚糖(聚糖2、6、20和34)推进至独立验证数据集(74个非转移性乳腺癌病例,25个对照)。这些聚糖中的两种(#6和20)验证为具有超过0.55的平均AUC,如通过交叉验证估计的。
表5.根据验证数据中的癌症类型,聚糖6的预测能力的概括
癌症类型 | 受试者数目 | 聚糖6平均AUC |
前列腺 | 34 | 0.567 |
卵巢 | 26 | 0.605 |
肺 | 6 | 0.615 |
结肠 | 15 | 0.486 |
胰腺 | 7 | 0.359 |
子宫内膜 | 11 | 0.615 |
实施例3
结果:用于生物标记发现的唾液酸聚糖微阵列的估计和最佳化:阵列灵敏度分析和验证。
微阵列方法允许多重样品的高流通量分析,并且对于比较人血清概况分析是有价值的(33)。为了筛选人血清中的多重抗Neu5Gc IgGs,我们使用高度有效的化学酶促方法(27-29),以合成代表在肿瘤细胞上的潜在共同唾液酸化聚糖的40种唾液酸化聚糖。末端为Neu5Gc或Neu5Ac(表2;相差一个氧原子)的这20种匹配的唾液酸聚糖对以及其9-O-乙酰化形式中的某些,以一系列浓度印刷在环氧化物包被的载玻片上。载玻片印刷质量用多克隆亲和力纯化的鸡抗Neu5Gc IgY(34)和用阳性对照人血清进行监控,两者都显示对于多重Neu5Gc聚糖而不是Neu5Ac聚糖的特异性高反应性。接下来,在唾液酸聚糖微阵列上测试来自癌症或非癌症患者的血清,并且评估抗Neu5Gc IgGs作为癌症生物标记的潜力。
为了测定识别多种含Neu5Gc表位或至少其中一些的循环抗Neu5Gc抗体是否可以用作癌症的预测物,需要多路化方法以评估在癌症患者与对照血清比较中多种抗Neu5Gc抗体的概况。微阵列方法允许用最低限度材料在相对短的时间内多重样品的同时分析,并且对于比较人血清概况分析是有价值的,尤其当筛选许多靶时。然而,这种技术还倾向于应估计且正确解决且通过最佳化降到最低的变异性(Li等人,2009,Liu等人,2009,Oyelaran等人,2009)。
为了筛选抗Neu5Gc抗体在多重人血清中的多样化,我们使用有效的单罐三酶化学酶促合成系统(Wu等人,2004,Yu等人,2006,Yu等人,2007,Padler-Karavani等人,2008),以化学合成代表可能在肿瘤细胞上出现的最常见末端唾液酸化结构的40种唾液酸化聚糖。这些聚糖末端为Neu5Gc或Neu5Ac,给出仅相差一个氧原子的20个匹配的聚糖对(表2)。此外,每种聚糖含有在还原末端上具有伯氨基的间隔物,设计为允许共价固定至环氧化物包被的载玻片。每种聚糖首先通过DMB-HPLC分析纯度和确切浓度,随后以250、125、62.5和12.5μM的四个浓度用最佳化浓度印刷,各具有4次重复,即16个点/聚糖,允许用于信号检测的动态范围。此外,将人IgG点上,以控制每个载玻片的印刷和显色条件。
三种不同试剂用于监控载玻片质量控制(QC)。首先,我们使用荧光标记的抗人IgG抗体作为载玻片上的单独检测物,以监控对照点印刷(检测人IgG和无一聚糖),允许我们监控总体印刷条件中的一般变异性。其次,我们使用多克隆亲和力纯化的鸡抗Neu5Gc抗体,其对于所有Neu5Gc而不是Neu5Ac聚糖是高度特异性的,如图1A中所示(Diaz等人,2009)。最后,我们使用对于多重Neu5Gc聚糖表位具有已知高反应性和对于Neu5Ac聚糖表位具有低反应性的代表性人血清,如图1B中所示(如先前描述的血清S34(Padler-Karavani等人,2008))。
实施例4
结果:使用对于每个受试者具有显著表达的抗Neu5Gc抗体的编号聚糖,训练初步分类器。我们最初使用与具有已知高抗Neu5Gc抗体(如所述的S34(7))的人血清杂交的24个载玻片,以开发质量控制和分析方法。随后,为了评估以特异性抗Neu5Gc抗体的形式的可能癌症生物标记,我们生成含有多重Neu5Gc表位连同其分别Neu5Ac作为对照的聚糖微阵列。测试来自癌症或对照患者的血清样品。我们使用训练数据的最初小集合(5个癌症病例和5个对照),以训练分类器,使用与20种Neu5Ac聚糖的泛抗体水平相比较,在每个受试者内显著升高的抗Neu5Gc抗体数目。如果关于其概括参数α和β的似然比检验p值在0.0025水平上显著不同于0(0.05的显著性水平的Bonferroni调整,对于测试的20种Neu5Gc聚糖调整的),那么抗Neu5Gc抗体视为显著表达的。数据暗示10次显著比较的中值数目待用作截断,以将受试者分类成病例和对照。来自两个增益的结果给出非常相似的结果:假阳性率和假阴性率都是1/5=20%。
实施例5
结果:使用225个新乳腺癌病例/对照的初步分类器验证。具有不知情的病例/对照状态的总共175个乳腺癌病例和50个对照根据对初步训练数据开发的分类规则进行分析。在接受数据前,这种分析在主要作者之间在备忘录(memorandum)中预说明且格式化:对于每个受试者,如先前对于每种抗Neu5Gc抗体衍生概括参数α和β,并且如果测试的20种抗Neu5Gc抗体中的10种或更多种是显著表达的,那么受试者将分类为病例;否则受试者将分类为对照。在225个受试者中,49个(21.8%)分类为病例,并且176个(78.2%)分类为对照。通过第三方完成的计算显示灵敏度是37/175=21.1%,并且特异性是34/50=68%。统计团队在这个分析自始至终关于这些受试者的病例对照状态保持不知情的。
执行类似的预说明二级分析,以使用根据与潜在聚糖(α2~3或α2-6)的联系或根据Sia O-乙酰化状态选择的Neu5Gc聚糖的特异性亚组,以比较泛Neu5Ac水平。比较的中值数目也用作截断用于比例与对照相比较。在增加灵敏度或特异性中不存在显著改善。
实施例6
结果:使用每种抗Neu5Gc抗体的应答水平训练二级分类器。对于癌症与对照状态比较训练分类器。我们使用唾液酸聚糖微阵列开发了分类器,以区分癌症病例与对照。此类分类器是将受试者看做病例或对照的规则,使用来自受试者的血清的唾液酸聚糖微阵列的输出。我们使用5个病例和5个对照的初步训练集,以开发我们的数据标准化和过滤方案,并且开发用于每个受试者的抗体应答的概括测量。在这些预备数据上训练的初步分类器使用对于每种受试者具有显著升高的抗Neu5Gc IgG信号的Neu5Gc聚糖数目(从20种中),并且导致有限的灵敏度和特异性。随后,在载玻片上每个受试者的抗Neu5Gc IgG应答用两个参数(截距α和斜率β)概括,其将抗Neu5Gc IgG应答描述为Neu5Gc聚糖浓度的函数。我们测试使用对于每种聚糖的这种更详细的应答测量(α和β)是否可以改善灵敏度和特异性。从225个受试者中随机选择一半乳腺癌病例和不具有癌症的女性对照(表1;112个乳腺癌病例,包括67个非转移性病例和50个对照)。这些数据用于就预测力筛选20种聚糖,并且统计团队保持对于选择不知情的。病例/对照状态随后是知情的,并且来自每个受试者的参数α和β用作用于分类器的训练数据。20种聚糖最初对于区分能力单独筛选,并且十倍交叉验证用于估计关于每种聚糖的AUC(接受者操作特性(ROC)曲线下面积)(表3)。ROC曲线对于诊断测试的不同可能切割点针对假阳性率标绘真阳性率。曲线下面积(AUC)测量区分,即测试正确分类具有和不具有疾病的那些的能力。多变量模型不比单变量结果好;然而,从分析中去除转移性病例轻微改善大多数分类结果(表3),可能是由于通过在升高的肿瘤负荷上的肿瘤细胞的抗Neu5Gc抗体吸收。选择具有超过0.55的平均AUC的聚糖用于进一步验证测试(聚糖2、6、20和34)。
实施例7
结果:使用独立的乳腺癌病例和对照的二级分类器验证。验证数据由74个新的非转移性乳腺癌病例和25个新对照组成。分析计划在数据传输至统计团队前格式化。聚糖2、6、20和34如上就显著性评估,使用交叉验证平均AUC作为预测力的测量。我们能够对于4种聚糖中的两种(6和20)独立地复制我们的结果,因为在这些独立数据中具有超过0.55的估计的平均交叉验证AUC(表4)。多变量模型(当测试4种聚糖的所有可能组合时;总共15个模型)不比单变量结果好,并且两个最后的最好模型是使用单独的聚糖6和20的那些。然而,具有最高平均AUCs的多变量模型都包括聚糖6;因此,使用单独的聚糖6的分类器构建视为用于进一步分析的最有希望的候选物。
作为概括,关于聚糖6的ROC曲线呈现于图3中,使用对训练和验证数据估计的逻辑回归模型(来自交叉验证的结果在图4A-C中给出)。对于用于从20种聚糖中选择聚糖6的乳腺癌训练数据(图3A),使用抗Neu5Gc抗体应答作为分类器给出0.67的AUC。在用于重复结果的乳腺癌验证数据中,估计的AUC是0.60(图3B),在10倍交叉验证后具有0.58的平均AUC(图4B;95%CI=(0.167,0.917),IQR=(0.458,0.708))。这些AUC值与目前用于癌症检测的基于某些常见蛋白质的筛选有利地比较(35,36)。在这些乳腺癌验证数据中,估计的平均特异性分别是在0.20的灵敏度时的0.86(95%CI=(0.37,1.00))和在0.30的灵敏度时的0.76(95%CI=(0.27,1.00))。
实施例8
结果:使用其他类型的癌病例与对照比较,聚糖23的独立验证。为了进一步验证聚糖6的预测价值,我们使用第二组独立验证数据,其包括55个对照(包括来自乳腺癌验证的25个对照和30个新对照)和具有其他类型的非转移性癌症的99个病例(表1)。在这些数据中,估计的AUC是0.59(图3C),在10倍交叉验证后具有0.57的平均AUC(图4C;95%CI=(0.283,0.817),IQR=(0.483,0.683))。当灵敏度是0.2和0.3时,估计的平均特异性分别是0.89(95%CI=(0.50,1.00))和0.81(95%CI=(0.33,1.00))(图4C)。根据癌症类型的聚糖6的单变量逻辑回归(表5)揭示在来自前列腺、卵巢、肺和子宫内膜的癌中的预测价值,同时它与结肠和胰腺癌无关,然而,在这些癌症各自中测试的病例数目是非常小的,因此,应慎重作出基于这些小尺寸结果的结论。
总之,无偏差的聚糖微阵列方法和相对大集合的人血清允许严格的统计分析,以指示针对聚糖6的抗体显示以相对高的特异性(真阴性)分类癌症病例与对照的希望,尽管具有低灵敏度(真阳性)。
实施例9
用于癌症的示例性灵敏度和特异性
表6.在所选灵敏度时,关于抗GcSTn抗体癌症检测特异性的值
灵敏度水平 | 平均特异性 | 特异性范围 | |
乳腺癌训练集 | 10% | 96.1% | 43.3-100% |
20% | 91.4% | 20-100% | |
30% | 85.1% | 0-100% | |
乳腺癌验证集 | 10% | 93.9% | 40-100% |
20% | 85.9% | 13.3-100% | |
30% | 76.0% | 0-100% | |
其他癌症验证集 | 10% | 95.1% | 33.3-100% |
20% | 88.9% | 33.3-100% | |
30% | 81.0% | 16.7-100% |
对于每个数据集,我们使用10倍交叉验证(CV),以估计在给定灵敏度时的特异性。在每个CV迭代中,将90%的病例/对照随机选择到CV训练集内,并且CV测试集由剩余10%的受试者组成。随后使用CV训练集估计来自拟合的逻辑回归的系数,并且使用在CV训练集中关于每个受试者的这些系数计算成为病例的概率。随后使用CV训练集计算ROC曲线。
为了估计在所需灵敏度时的特异性,在给定灵敏度时来自ROC曲线的特异性经过500次交叉验证迭代求平均值。为了是特异性的,使用R包(由“r-project”网站在线的)ROCR(由德国中的“rocr.bioinf.mpi-sb.mpg”网站在线的)计算ROC曲线。这种算法使用线性插值法以描绘来自离散数据的ROC曲线。这个包用于描绘图3中的ROC曲线和箱形图。
下文代码用于生成交叉验证的ROC曲线且计算上表中的估计量:
plot(perf,avg=″horizontal″,spread.estimate=″boxplot″,main=main,cex.main=1,sub=aucsummary,xlab=′1-Specificity′,ylab=′Sensitivity′)
下述R源代码得自R函数曲线图性能,来自R包ROCR,并且用于生成在给定灵敏度水平时的特异性的概括值:
参考文献:Technical Report HPL-2003-4 Fawcett,T.(2004)ROCgraphs:notes and practical considerations for researchers.,Palo Alto,CA HP Labs.
参考文献(按字母顺序)
●An,H.J.,Kronewitter,S.R.,de Leoz,M.L.and Lebrilla,C.B.(2009)Glycomics anddisease markers.Curr Opin Chem Biol
●Candefjord,S.,Ramser,K.and Lindahl,O.A.(2009)Technologies for localization anddiagnosis of prostate cancer.J Med Eng Technol 33,585-603
●Conze,T.,Carvalho,A.S.,Landegren,U.,Almcida,R.,Reis,C.A.,David,L.andSoderberg,O.(2009)MUC2 mucin is a major carrier of the cancer-associated sialyl-Tnantigen in intestinal metaplasia and gastric carcinomas.Glycobiology
●Desmetz,C.,Cortijo,C.,Mange,A.and Solassol,J.(2009a)Humoral response to canceras a tool for biomarker discovery.J Proteomics 72,982-988
●Desmetz,C.,Maudelonde,T.,Mange,A.and Solassol,J.(2009b)Identifyingautoantibody signatures in cancer:a promising challenge.Expert Rev Proteomics 6,377-386
●Diaz,S.L.,Padler-Karavani,V.,Ghaderi,D.,Hurtado-Ziola,N.,Yu,H.,Chen,X.,Brinkman-Van der Linden,E.C.,Varki,A.and Varki,N.M.(2009)Sensitive andspecific detection of the non-human sialic Acid N-glycolylneuraminic acid in humantissues and biotherapeutic products.PLoS ONE 4,e4241
●Du,J.,Meledeo,M.A.,Wang,Z.,Khanna,H.S.,Paruchuri,V.D.and Yarema,K.J.(2009)Metabolic glyooengineering:sialic acid and beyond,Glycobiology 19,1382-1401
●Dube,D.H.and Bertozzi,C.R.(2005)Glycans in cancer and inflammation--potential fortherapeutics and diagnostics.Nat Rev Drug Discov 4,477-488
●Greene,K.L.,Albertsen,P.C.,Babaian,R.J.,Carter,H.B.,Gann,P.H.,Han,M.,Kuban,D.A.,Sartor,A.O.,Stanford,J.L.,Zietman,A.and Carroll,P.(2009)Prostatespecific antigen best practice statement:2009 update.J Urol 182,2232-2241
●Gupta,D.and Lis,C.G.(2009)Role of CA125 in predicting ovarian cancer survival-areview of the epidemiological literature.J Ovarian Res 2,13
●Hara,S.,Yamaguchi,M.,Takemori,Y.,Nakamura,M.and Ohkura,Y.(1986)Highlysensitive determination of N-acetyl-and N-glycolylneuraminic acids in human serum andurine and rat serum by reversed-phase liquid chromatography with fluorescencedetection.J Chromatogr 377,111-119
●Hawkins,D.M.(2004)The problem of overfitting.J Chem Inf Comput Sci 44,1-12
●Hedlund,M.,Padler-Karavani,V.,Varki,N.M.and Varki,A.(2008)Evidence for ahuman-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinomaprogression.Proc Natl Acad Sci U S A 105,18936-18941
●Hedlund,M.,Tangvoranuntakul,P.,Takematsu,H.,Long,J.M.,Housley,G.D.,Kozutsumi,Y.,Suzuki,A.,Wynshaw-Boris,A.,Ryan,A.F.,Gallo,R.L.,Varki,N.andVarki,A.(2007)N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice:implications for humanbiology and evolution.Mol Cell Biol 27,4340-4346
●Johansen,E.,Schilling,B.,Lerch,M.,Niles,R.K.,Liu,H.,Li,B.,Allen,S.,Hall,S.C.,Witkowska,H.E.,Regnier,F.E.,Gibson,B.W.,Fisher,S.J.and Drake,P.M.(2009)Alectin HPLC method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biologicalsamples.J Vis Exp
●Ju,T.and Cummings,R.D.(2002)A unique molecular chaperone Cosmc required foractivity of the mammalian core 1 beta 3-galactosyltransferase.Proc Natl Acad Sci U S A99,16613-16618
●Ju,T.,Lanneau,G.S.,Gautam,T.,Wang,Y.,Xia,B.,Stowell,S.R.,Willard,M.T.,Wang,W.,Xia,J.Y.,Zuna,R.E.,Laszik,Z.,Benbrook,D.M.,Hanigan,M.H.andCummings,R.D.(2008)Human tumor antigens Tn and sialyl Tn arise from mutations inCosmc.Cancer Res 68,1636-1646
●Kim,Y.J.and Varki,A.(1997)Perspectives on the significance of altered glycosylationof glycoproteins in cancer,Glycoconj J 14,569-576
●Kim,Y.S.,Yoo,H.S.and Ko,J.H.(2009)Implication of aberrant glycosylation incancer and use of lectin for cancer biomarker discovery.Protein Pept Lett 16,499-507
●Kobata,A.and Amano,J.(2005)Altered glycosylation of proteins produced bymalignant cells,and application for the diagnosis and immunotherapy of tumours.Immunol Cell Biol 83,429-439
●Li,C.,Simeone,D.M.,Brenner,D.E.,Anderson,M.A.,Shedden,K.A.,Ruffin,M.T.and Lubman,D.M.(2009)Pancreatic cancer serum detection using a lectin/glyco-antibody array method.J Proteome Res 8,483-492
●Liu,C.C.,Hu,J.,Kalakrishnan,M.,Huang,H.and Zhou,X.J.(2009)Integrative diseaseclassification based on cross-platform microarray data.BMC Bioinformatics 10 Suppl 1,S25
●Ludwig,J.A.and Weinstein,J.N.(2005)Biomarkers in cancer staging,prognosis andtreatment selection.Nat Rev Cancer 5,845-856
●Malykh,Y.N.,Schauer,R.and Shaw,L.(2001)N-Glycolylneuraminic acid in humantumours.Biochimie 83,623-634
●Marcial,V.A.(1977)Carcinoma of the cervix:present status and future.Cancer 39,945-958
●Martin,L.T.,Marth,J.D.,Varki,A.and Varki,N.M.(2002)Genetically altered micewith different sialyltransferase deficiencies show tissue-specific alterations in sialylationand sialic acid 9-O-acetylation.J Biol Chem 277,32930-32938
●Mechref,Y.,Hussein,A.,Bekesova,S.,Pungpapong,V.,Zhang,M.,Dobrolecki,L.E.,Hickey,R.J.,Hammoud,Z.T.and Novotny,M.V.(2009)Quantitative serum glycomicsof esophageal adenocarcinoma and other esophageal disease onsets.J Proteome Res 8,2656-2666
●Nelson,A.E.,Francis,J.E.and Zorbas,H.(2009a)Population screening and earlydetection of ovarian cancer in asymptomatic women.Aust N Z J Obstet Gynaecol 49,448-450
●Nelson,H.D.,Tyne,K.,Naik,A.,Bougatsos,C.,Chan,B.K.and Humphrey,L.(2009b)Screening for breast cancer:an update for the U.S.Preventive Services Task Force.AnnIntern Med 151,727-37,W237-42
●Nguyen,D.H.,Tangvoranuntakul,P.and Varki,A.(2005)Effects of natural humanantibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activatedand malignant immune cells.J Immunol 175,228-236
●Nogueira,L.,Corradi,R.and Eastham,J.A.(2009)Prostatic specific antigen for prostatecancer detection.Int Braz J Urol 35,521-9;discussion 530-2
●Nossov,V.,Amneus,M.,Su,F.,Lang,J.,Janco,J.M.,Reddy,S.T.and Farias-Eisner,R.(2008)The early detection of ovarian cancer:from traditional methods to proteomics.Can we really do better than serum CA-125?Am J Obstet Gynecol 199,215-223
●Oyelaran,O.,McShane,L.M.,Dodd,L.and Gildersleeve,J.C.(2009)Profiling humanserum antibodies with a carbohydrate antigen microarray.J Proteome Res 8,4301-4310
●Padler-Karavani,V.,Yu,H.,Cao,H.,Chokhawala,H.,Karp,F.,Varki,N.,Chen,X.andVarki,A.(2008)Diversity in specificity,abundance,and composition of anti-Neu5Gcantibodies in normal humans:potential implications for disease.Glycobiology 18,818-830
●Parkin,D.M.,Bray,F.I.and Devesa,S.S.(2001)Cancer burden in the year 2000.Theglobal picture.Eur J Cancer 37 Suppl 8,S4-66
●Raedle,J.,Oremek,G.,Truschnowitsch,M.,Lorenz,M.,Roth,W.K.,Caspary,W.F.and Zeuzem,S.(1998)Clinical evaiuation of autoantibodies to p53 protein in patientswith chronic liver disease and hepatocellular carcinoma.Eur J Cancer 34,1198-1203
●Ransohoff,D.F.(2004)Rules of evidence for cancer molecular-marker discovery andvalidation.Nat Rev Cancer 4,309-314
●Saldova,R.,Wormald,M.R.,Dwek,R.A.and Rudd,P.M.(2008)Glycosylationchanges on serum glycoproteins in ovarian cancer may contribute to disease pathogenesis.Dis Markers 25,219-232
●Sing,T.,Sander,O.,Beerenwinkel,N.and Lengauer,T.(2005)ROCR:visualizingclassifier performance in R.Bioinformatics 21,3940-3941
●Soussi,T.(2000)p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer:areview.Cancer Res 60,1777-1788
●Srivastava,S.and Gopal-Srivastava,R.(2002)Biomarkers in cancer screening:a publichealth perspective.J Nutr 132,2471S-2475S
●Tan,H.T.,Low,J.,Lim,S.G.and Chung,M.C.(2009)Serum autoantibodies asbiomarkers for early cancer detection.FEBS J
●Tangvoranuntakul,P.,Gagneux,P.,Diaz,S.,Bardor,M.,Varki,N.,Varki,A.andMuchmore,E.(2003)Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhumandietary sialic acid.Proc Natl Acad Sci U S A 100,12045-12050
●Uygur-Bayramicli,O.,Dabak,R.,Orbay,E.,Dolapcioglu,C.,Sargin,M.,Kilicoglu,G.,Guleryuzlu,Y.and Mayadagli,A.(2007)Type 2 diabetes mellitus and CA 19-9 levels.World J Gastroenterol 13,5357-5359
●van Leeuwen,P.J.,Connolly,D.,Gavin,A.,Roobol,M.J.,Black,A.,Bangma,C.H.andSchroder,F.H.(2009)Prostate cancer mortality in screen and clinically detected prostatecancer:Estimating the screening benefit.Eur J Cancer
●Varki,A.(2001)N-glycolylneuraminic acid deficiency in humans.Biochimie 83,615-622
●Varki,A.(2009)Multiple changes in sialic acid biology during human evolution.Glycoconj J 26,231-245
●Wu,C.Y.,Liang,P.H.and Wong,C.H.(2009)New development of glycan arrays.OrgBiomol Chem 7,2247-2254
●Wu,X.,Ling,C.C.and Bundle,D.R.(2004)A new homobifunctional p-nitro phenylester coupling reagent for the preparation of neoglycoproteins.Org Lett 6,4407-4410
●Yu,H.,Chokhawala,H.A.,Huang,S.and Chen,X.(2006)One-pot three-enzymechemoenzymatic approach to the synthesis of sialosides containing natural and non-natural functionalities.Nat Protoc 1,2485-2492
●Yu,H.,Chokhawala,H.A.,Varki,A.and Chen,X.(2007)Efficient chemoenzymaticsynthesis of biotinylated human serum albumin-sialoglycoside conjugates containing O-acetylated sialic acids.Org Biomol Chem 5,2458-2463
●Zhang,D.Y.,Ye,F.,Gao,L.,Liu,X.,Zhao,X.,Che,Y.,Wang,H.,Wang,L.,Wu,J.,Song,D.,Liu,W.,Xu,H.,Jiang,B.,Zhang,W.,Wang,J.and Lee,P.(2009)Proteomics,Pathway Array and Signaling Network-Based Medicine in Cancer.Cell Div 4,20
关于实施例1、4和5的参考文献
1.Ghaderi D,Taylor RE,Padler-Karavani V,Diaz S,Varki A.Implications of thepresence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins.NatBiotechnol.2010;28:863-7.
2.Singer O,Marr RA,Rockenstein E et al.Targeting BACE1 with siRNAs amelioratesAlzheimer disease neuropathology in a transgenic model.Nat Neurosci.2005;8:1343-9.
3.Tiscornia G,Singer O,Verma IM.Production and purification of lentiviral vectors.NatProtoc.2006;1:241-5.
4.Diaz SL,Padler-Karavani V,Ghaderi D et al.Sensitive and specific detection of thenon-human sialic Acid N-glycolylneuraminic acid in human tissues and biotherapeuticproducts.PLoS ONE.2009;4:e4241.
5.Kjeldsen T,Clausen H,Hirohashi S,Ogawa T,Iijima H,Hakomori S.Preparation andcharacterization of monoclonal antibodies directed to the tumor-associated O-linkedsialosyl-2----6 alpha-N-acetylgalactosaminyl(sialosyl-Tn)epitope.Cancer Res.1988;48:2214-20.
6.Yu H,Chokhawala HA,Varki A,Chen X.Efficient chemoenzymatic synthesis ofbiotinylated human scrum albumin-sialoglycoside conjugates containing O-acetylatedsialic acids.Org Biomol Chem.2007;5:2458-63.
7.Padler-Karavani V,Yu H,Cao H et al.Diversity in specificity,abundance,andcomposition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans:potential implications fordisease.Glycobiology.2008;18:818-30.
8.Yu H,Chokhawala HA,Huang S,Chen X.One-pot three-enzyme chemoenzymaticapproach to the synthesis of sialosides containing natural and non-naturalfunctionalities.Nat Protoc.2006;1:2485-92.
9.Yu H,Huang S,Chokhawala H,Sun M,Zheng H,Chen X.Highly efficientchemoenzymatic synthesis of naturally occurring and non-natural alpha-2,6-linkedsialosides:a P.damsela alpha-2,6-sialyltransferase with extremely flexible donor-substrate specificity.Angew Chem Int Ed Engl.2006;45:3938-44.
10.Yu H,Chokhawala H,Karpel R et al.A multifunctional Pasteurella multocidasialyltransferase:a powerful tool for the synthesis of sialoside libraries.J Am ChemSoc.2005;127:17618-9.
11.Hara S,Yamaguchi M,Takemori Y,Nakamura M,Ohkura Y.Highly sensitivedotormination of N-acetyl-and N-glycolylneuramlnlc acids in human serum and urineand rat serum by reversed-phase liquid chromatography with fluorescence detection.JChromatogr.1986;377:111-9.
12.Sing T,Sander O,Beerenwinkel N,Lengauer T.ROCR:visualizing classifierperformance in R.Bioinformatics.2005;21:3940-1.
Additional Numbered Refernces
1.Varki A,Kannagi R,Toole BP.Glycosylation Changes in Cancer.In:Varki A,Cummings RD,Esko JD,Freeze HH,Stanley P,Bertozzi CR,Hart GW,Etzler ME,editors.Essentials of Glycobiology.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring HarborLaboratory Press;2009.p.617-32.
2.Malykh YN,Schauer R,Shaw L.N-Glycolylneuraminic acid in human tumours.Biochimie.2001;83:623-34.
3.Tangvoranuntakul P,Gagneux P,Diaz S et al.Human uptake and incorporation of animmunogenic nonhuman dietary sialic acid.Proc Natl Acad Sci U S A.2003;100:12045-50.
4.Nguyen DH,Tangvoranuntakul P,Varki A.Effects of natural human antibodies againsta nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignantimmune cells.J Immunol.2005;175:228-36.
5.Padler-Karavani V,Yu H,Cao H et al.Diversity in specificity,abundance,andcomposition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans:potential implications fordisease.Glycobiology.2008;18:818-30.
6.Varki A.Colloquium paper:uniquely human evolution of sialic acid genetics andbiology.Proc Natl Acad Sci U S A.2010;107 Suppl 2:8939-46.
7.Hedlund M,Tangvoranuntakul P,Takematsu H et al.N-glycolylneuraminic aciddeficiency in mice:implications for human biology and evolution.Mol Cell Biol.2007;27:4340-6.
8.Taylor RE,Gregg CJ,Padler-Karavani V et al.Novel mechanism for the generation ofhuman xeno-autoantibodies against the nonhuman sialic acid N-glycolylneuraminicacid.J Exp Med.2010;207:1637-46.
9.Hedlund M,Padler-Karavani V,Varki NM,Varki A.Evidence for a human-specificmechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression,Proc Natl Acad Sci U S A.2008;105:18936-41.
10.de Visser KE,Korets LV,Coussens LM.De novo carcinogenesis promoted by chronicinflammation is B lymphocyte dependent.Cancer Cell.2005;7:411-23.
11.Andreu P,Johansson M,Affara NI et al.FcRgamma activation regulates inflammation-associated squamous carcinogenesis.Cancer Cell.2010;17:121-34.
12.Adams GP,Weiner LM.Monoclonal antibody therapy of cancer.Nat Biotechnol.2005;23:1147-57.
13.Ferris RL,Jaffee EM,Ferrone S.Tumor Antigen-Targeted,Monoclonal Antibody-Based Immunotherapy:Clinical Response,Cellular Immunity,and Immunoescape.JClin Oncol.2010
14.Finn OJ.Cancer immunology.N Engl J Med.2008;358:2704-15.
15.Prehn RT,Prehn LM.The flip side of immune surveillance:immune dependency.Immunol Rev.2008;222:341-56.
16.Marcial VA.Carcinoma of the cervix:present status and future.Cancer.1977;39:945-58.
17.Nelson HD,Tyne K,Naik A,Bougatsos C,Chan BK,Humphrey L.Screening forbreast cancer:an update for the U.S.Preventive Services Task Force.Ann Intern Med.2009;151:727-37,W237-42.
18.Ludwig JA,Weinstein JN.Biomarkers in cancer staging,prognosis and treatmentselection.Nat Rev Cancer.2005;5:845-56.
19.Gupta D,Lis CG.Role of CA125 in predicting ovarian cancer survival-a review of theepidemiological literature.J Ovarian Res.2009;2:13.
20.Schroder FH,Hugosson J,Roobol MJ et al.Screening and prostate-cancer mortality ina randomized European study.N Engl J Med.2009;360:1320-8.
21.Tan HT,Low J,Lim SG,Chung MC.Serum autoantibodies as biomarkers for earlycancer detection.FEBS J.2009
22.Soussi T.p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer:a review.Cancer Res.2000;60:1777-88.
23.Drake PM,Cho W,Li B et al.Sweetening the pot:adding glycosylation to thebiomarker discovery equation.Clin Chem.2010;56:223-36.
24.Singer O,Marr RA,Rockenstein E et al.Targeting BACE1 with siRNAs amelioratesAlzheimer disease neuropathology in a transgenic model.Nat Neurosci.2005;8:1343-9.
25.Tiscornia G,Singer O,Verma IM.Production and purification of lentiviral vectors.NatProtoc.2006;1:241-5.
26.Bardor M,Nguyen DH,Diaz S,Varki A.Mechanism of uptake and incorporation of thenon-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells.J Biol Chem.2005;280:4228-37.
27.Yu H,Chokhawala HA,Huang S,Chen X.One-pot three-enzyme chemoenzymaticapproach to the synthesis of sialosides containing natural and non-naturalfunctionalities.Nat Protoc.2006;1:2485-92.
28.Yu H,Huang S,Chokhawala H,Sun M,Zheng H,Chen X.Highly efficientchemoenzymatic synthesis of naturally occurring and non-natural alpha-2,6-linkedsialosides:a P.damsela alpha-2,6-sialyltransferase with extremely flexible donor-substrate specificity.Angew Chem Int Ed Engl.2006;45:3938-44.
29.Yu H,Chokhawala H,Karpel R et al.A multifunctional Pasteurella multocidasialyltransferase:a powerful tool for the synthesis of sialoside libraries.J Am ChemSoc.2005;127:17618-9.
30.Jolles S,Sewell WA,Misbah SA.Clinical uses of intravenous immunoglobulin.ClinExp Immunol.2005;142:1-11.
31.Oppmann B,Lesley R,Blom B et al.Novel p19 protein engages IL-12p40 to form acytokine,IL-23,with biological activities similar as well as distinct from IL-12.Immunity.2000;13:715-25.
32.Weiss JM,Subleski JJ,Wigginton JM,Wiltrout RH.Immunotherapy of cancer by IL-12-based cytokine combinations.Expert Opin Biol Ther.2007;7:1705-21.
33.Oyelaran O,McShane LM,Dodd L,Gildersleeve JC.Profiling human serum antibodieswith a carbohydrate antigen microarray.J Proteome Res.2009;8:4301-10.
34.Diaz SL,Padler-Karavani V,Ghaderi D et al.Sensitive and specific detection of thenon-human sialic Acid N-glycolylneuraminic acid in human tissues and biotherapeuticproducts.PLoS ONE.2009;4:e4241.
35.Thompson IM,Ankerst DP,Chi C et al.Operating characteristics of prostate-specificantigen in men with an initial PSA level of 3.0ng/ml or lower.JAMA.2005;294:66-70.
36.Cavadas V,Osorio L,Sabell F,Teves F,Branco F,Silva-Ramos M.Prostate CancerPrevention Trial and European Randomized Study of Screening for Prostate CancerRisk Calculators:A Performance Comparison in a Contemporary Screened Cohort.EurUrol.2010
37.Martin LT,Marth JD,Varki A,Varki NM.Genetically altered mice with differentsialyltransferase deficiencies show tissue-specific alterations in sialylation and sialicacid 9-O-acetylation.J Biol Chem.2002;277:32930-8.
38.Conze T,Carvalho AS,Landegren U et al.MUC2 mucin is a major carrier of thecancer-associated sialyl-Tn antigen in intestinal metaplasia and gastric carcinomas.Glycobiology.2010;20:199-206.
39.Yonezawa S,TachikawaT,Shin S,Sato E.Sialosyl-Tn antigen.Its distribution innormal human tissues and expression in adenocarcinomas.Am J Clin Pathol.1992;98:167-74.
40.Cao Y,Stosiek P,Springer GF,Karsten U.Thomsen-Friedenreich-related carbohydrateantigens in normal adult human tissues:a systematic and comparative study.HistochemCell Biol.1996;106:197-207.
41.Ogata S,Koganty R,Reddish M et al.Different modes of sialyl-Tn expression duringmalignant transformation of human colonic mucosa.Glycoconj J.1998;15:29-35.
42.Kobayashi H,Terao T,Kawashima Y.Serum sialyl Tn as an independent predictor ofpoor prognosis in patients with epithelial ovarian cancer.J Clin Oncol.1992;10:95-101.
43.Imai J,Ghazizadeh M,Naito Z,Asano G.Immunohistochemical expression of T,Tnand sialyl-Tn antigens and clinical outcome in human breast carcinoma.AnticancerRes.2001;21:1327-34.
44.Kim GE,Bae HI,Park HU et al.Aberrant expression of MUC5AC and MUC6 gastricmucins and sialyl Tn antigen in intraepithelial neoplasms of the pancreas.Gastroenterology.2002;123:1052-60.
45.Ju T,Cummings RD.A unique molecular chaperone Cosmc required for activity of themammalian core 1 beta 3-galactosyltransferase.Proc Natl Acad Sci U S A.2002;99:16613-8.
46.Ju T,Lanneau GS,Gautam T et al.Human tumor antigens Tn and sialyl Tn arise frommutations in Cosmc.Cancer Res.2008;68:1636-46.
47.Sewell R,Backstrom M,Dalziel M et al.The ST6GalNAc-I sialyltransferase localizesthroughout the Golgi and Is responsible for the synthesis of the tumor-associated sialyl-Tn O-glycan in human breast cancer.J Biol Chem.2006;281:3586-94.
48.Ostrand-Rosenberg S.Immune surveillance:a balance between protumor and antitumorimmunity.Curr Opin Genet Dev.2008;18:11-8.
49.Slovin SF,Keding SJ,Ragupathi G.Carbohydrate vaccines as immunotherapy forcancer.Immunol Cell Biol.2005;83:418-28.
50.de Leon J,Fernandez A,Clavell M et al.Differential influence of the tumour-specificnon-human sialic acid containing GM3 ganglioside on CD4+CD25-effector andnaturally occurring CD4+CD25+regulatory T cells function.Int Immunol.2008;20:591-600.
在上文说明书中提及的所有公开物和专利通过引用合并入本文。本发明的所述组合物和方法的多种修饰和变化对于本领域技术人员将是显而易见的,而不背离本发明的范围和精神。尽管本发明已与特定优选实施方案结合描述,但应当理解本发明不应不适当地限于此类特定实施方案。事实上,对于本领域和与之相关领域的技术人员显而易见的用于执行本发明的所述模式的多种修饰预期在下述权利要求的范围内。
Claims (20)
1.一种用于检测受试者中的癌症的方法,其包括在得自所述受试者的生物学样品中测定选自下述的一种或多种化合物的水平
a)Neu5Gc-唾液酸化抗原,
b)所述Neu5Gc-唾液酸化抗原的表位,
c)所述Neu5Gc-唾液酸化抗原的衍生物,和
d)特异性结合所述抗原、所述表位和所述衍生物中的一种或多种的抗体,
其中当相对于对照正常样品,检测到更高水平的一种或多种所述化合物时,所述受试者鉴定为具有癌症,并且当所述化合物的水平无一高于对照正常样品时,所述受试者鉴定为无癌症的。
2.权利要求1的方法,其中所述Neu5Gc-唾液酸化抗原选自
i)Neu5Gc-唾液酸化聚糖,
ii)Neu5Gc-唾液酸化-Lex,和
iii)Neu5Gc-唾液酸化-Lea。
3.权利要求2的方法,其中所述Neu5Gc-唾液酸化聚糖选自Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-R(聚糖2)、Neu5Gcα2-6Lacβ-R(聚糖20)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-R(聚糖34)、Neu5Gcα2-6GalNAcα-OR(聚糖6)、Neu5Gc9Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-OR(聚糖2)、Neu5Gcα2-6Lacβ-OR(聚糖20)、和Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAcβ-OR(聚糖34),其中R选自生物素、白蛋白、ProNH2、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2-CH3、-H、hydrido、羟基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、磷、NH2、ProNH2=O(CH2)2CH2NH2、(OCH2CH2)6NH2、O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2、荧光标记2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺类似物(AEAB)、氨基氧基-基团、甲氨基氧基-基团、酰肼基团、氨基脂质1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨基氧基(AO)官能化DHPE、糖基磷脂酰肌醇(GPI),并且其中Lac是Galβ1-4GlcNAc。
4.权利要求3的方法,其中所述Neu5Gc-唾液酸化聚糖包含Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)。
5.权利要求2的方法,其中所述Neu5Gc-唾液酸化-Lex包含Neu5Gcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc)。
6.权利要求2的方法,其中所述Neu5Gc-唾液酸化-Lea包含(Neu5Gcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc和9-O-酰基-GD3(Neu5,9Ac2α2-8Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ1-1神经酰胺)中的一种或多种。
7.权利要求1的方法,其中所述抗体特异性结合包含Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)的Neu5Gc-唾液酸化聚糖。
8.权利要求1的方法,其中所述测定包括检测特异性结合所述Neu5Gc-唾液酸化抗原、所述抗原的所述表位和所述抗原的所述衍生物中的一种或多种的抗体。
9.权利要求1的方法,其中当检测到一种或多种所述化合物的水平中的增加时,所述受试者指示用于开始抗癌治疗。
10.权利要求1的方法,其中检测到一种或多种所述化合物的水平中的增加,所述受试者指示用于确证诊断癌症测试。
11.权利要求1的方法,其进一步包括在具有一种或多种所述化合物的水平中的增加的受试者中开始抗癌治疗。
12.权利要求1的方法,其进一步包括在具有一种或多种所述化合物的水平的增加的受试者中执行确证诊断癌症测试。
13.权利要求8的方法,其中所述抗体特异性结合包含Neu5Gcα2-6GalNAcα-R(聚糖6)的Neu5Gc-唾液酸化聚糖。
14.权利要求8的方法,其中所述抗体具有大于0.50的关于癌症的接受者操作特性(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)。
15.权利要求8的方法,其中所述抗体具有大于50%的癌症特异性。
16.权利要求8的方法,其中所述抗体具有大于50%的癌症灵敏度。
17.一种经分离的Neu5Gc-唾液酸化抗原,其选自
i)Neu5Gc-唾液酸化聚糖,
ii)Neu5Gc-唾液酸化-Lex,和
iii)Neu5Gc-唾液酸化-Lea。
18.一种抗体,其特异性结合权利要求17的一种或多种Neu5Gc-唾液酸化抗原。
19.一种抗体,其特异性结合权利要求18的一种或多种抗体。
20.一种包含组合物的试剂盒,所述组合物含有权利要求17的Neu5Gc-唾液酸化抗原、权利要求18的抗体和权利要求19的抗体中的一种或多种。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US29538610P | 2010-01-15 | 2010-01-15 | |
US61/295,386 | 2010-01-15 | ||
US13/007,237 | 2011-01-14 | ||
US13/007,237 US20110177614A1 (en) | 2010-01-15 | 2011-01-14 | Compositions and methods for detecting cancer |
PCT/US2011/021387 WO2011088385A2 (en) | 2010-01-15 | 2011-01-14 | Compositions and methods for detecting cancer |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102893154A true CN102893154A (zh) | 2013-01-23 |
Family
ID=44277862
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201180010659XA Pending CN102893154A (zh) | 2010-01-15 | 2011-01-14 | 用于检测癌症的组合物和方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20110177614A1 (zh) |
EP (2) | EP2524233A4 (zh) |
CN (1) | CN102893154A (zh) |
WO (1) | WO2011088385A2 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105263960A (zh) * | 2013-04-18 | 2016-01-20 | 国家医疗保健研究所 | 具有降低的免疫原性的组合物 |
CN108709994A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-10-26 | 吉林大学 | 一种n-羟乙酰神经氨酸快速检测试纸及检测方法 |
CN110018312A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-07-16 | 辽宁师范大学 | 用于诊断尿路上皮癌的尿液检测试剂盒 |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102893154A (zh) | 2010-01-15 | 2013-01-23 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于检测癌症的组合物和方法 |
WO2013151649A1 (en) | 2012-04-04 | 2013-10-10 | Sialix Inc | Glycan-interacting compounds |
WO2015054600A2 (en) * | 2013-10-10 | 2015-04-16 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
WO2016057916A1 (en) * | 2014-10-10 | 2016-04-14 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
US9879087B2 (en) | 2014-11-12 | 2018-01-30 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
FI3218005T3 (fi) | 2014-11-12 | 2023-03-31 | Seagen Inc | Glykaanin kanssa vuorovaikutteisia yhdisteitä ja käyttömenetelmiä |
WO2016201240A1 (en) * | 2015-06-12 | 2016-12-15 | Siamab Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for targeting cancer stem cells |
IL258768B2 (en) | 2015-11-12 | 2023-11-01 | Siamab Therapeutics Inc | Compounds interacting with glycans and methods of use |
WO2018094143A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Siamab Therapeutics, Inc. | Glycan-interacting compounds and methods of use |
KR20240044544A (ko) | 2017-03-03 | 2024-04-04 | 씨젠 인크. | 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법 |
US20200377598A1 (en) | 2017-03-03 | 2020-12-03 | New York University | Induction and Enhancement of Antitumor Immunity Involving Virus Vectors Expressing Multiple Epitopes of Tumor Associated Antigens and Immune Checkpoint Inhibitors or Proteins |
PT110526B (pt) | 2018-01-26 | 2021-02-04 | Univ Nova De Lisboa | Anticorpo, fragmento funcional ou sonda do mesmo contra antigénios tumorais |
CN109212227B (zh) * | 2018-09-07 | 2021-07-16 | 深圳格道糖生物技术有限公司 | 基于唾液特异糖蛋白糖链结构的肝病/肝硬化相关筛查、评估的产品及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005010485A2 (en) * | 2003-07-15 | 2005-02-03 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting and analyzing n-glycolylneuraminic acid (neu5gc) in biological materials |
US20070059769A1 (en) * | 2004-03-05 | 2007-03-15 | Ola Blixt | High throughput glycan microarrays |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4978745A (en) * | 1987-11-23 | 1990-12-18 | Centocor, Inc. | Immunoreactive heterochain antibodies |
US4975369A (en) * | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
AU720802B2 (en) * | 1996-07-03 | 2000-06-15 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Detection of cancer by assaying for cancer-specific antigens having linked oligosaccharides which are at least triantennary |
WO2006068758A2 (en) * | 2004-11-19 | 2006-06-29 | The Scripps Research Institute | Detection, prevention and treatment of breast cancer |
US8298773B2 (en) | 2008-05-02 | 2012-10-30 | Marko Vuskovic | Methods, assays and kits for cancer diagnosis and screening utilizing glycan-binding and glycan epitopes |
CN102893154A (zh) | 2010-01-15 | 2013-01-23 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于检测癌症的组合物和方法 |
-
2011
- 2011-01-14 CN CN201180010659XA patent/CN102893154A/zh active Pending
- 2011-01-14 EP EP11733477.1A patent/EP2524233A4/en not_active Withdrawn
- 2011-01-14 WO PCT/US2011/021387 patent/WO2011088385A2/en active Application Filing
- 2011-01-14 EP EP13184707.1A patent/EP2680004B1/en active Active
- 2011-01-14 US US13/007,237 patent/US20110177614A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-12-23 US US14/138,879 patent/US9423401B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005010485A2 (en) * | 2003-07-15 | 2005-02-03 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting and analyzing n-glycolylneuraminic acid (neu5gc) in biological materials |
US20070059769A1 (en) * | 2004-03-05 | 2007-03-15 | Ola Blixt | High throughput glycan microarrays |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
MARIA HEDLUND 等: "Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression", 《PNAS》, vol. 105, no. 48, 18 November 2008 (2008-11-18), XP055064489, DOI: doi:10.1073/pnas.0803943105 * |
PETER L.DEVINE 等: "The breast tumor-associated epitope defined by monoclonal antibody 3E1.2 is an O-linked mucin carbohydrate containing N-glycolylneuraminic acid", 《CANCER RESEARCH》, vol. 51, no. 21, 1 November 1991 (1991-11-01), XP001121854 * |
VERED PADLER-KARAVANI 等: "Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: Potential implications for disease", 《GLYCOBIOLOGY》, vol. 18, no. 10, 31 July 2008 (2008-07-31) * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105263960A (zh) * | 2013-04-18 | 2016-01-20 | 国家医疗保健研究所 | 具有降低的免疫原性的组合物 |
CN105263960B (zh) * | 2013-04-18 | 2020-05-22 | 国家医疗保健研究所 | 具有降低的免疫原性的组合物 |
CN108709994A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-10-26 | 吉林大学 | 一种n-羟乙酰神经氨酸快速检测试纸及检测方法 |
CN110018312A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-07-16 | 辽宁师范大学 | 用于诊断尿路上皮癌的尿液检测试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2011088385A3 (en) | 2011-11-24 |
EP2524233A4 (en) | 2013-07-31 |
EP2524233A2 (en) | 2012-11-21 |
EP2680004A2 (en) | 2014-01-01 |
EP2680004B1 (en) | 2016-08-31 |
WO2011088385A2 (en) | 2011-07-21 |
EP2680004A3 (en) | 2014-07-02 |
US20110177614A1 (en) | 2011-07-21 |
US9423401B2 (en) | 2016-08-23 |
US20140113979A1 (en) | 2014-04-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102893154A (zh) | 用于检测癌症的组合物和方法 | |
Muthana et al. | Competition between serum IgG, IgM, and IgA anti-glycan antibodies | |
Gomes et al. | Glycoproteomic analysis of serum from patients with gastric precancerous lesions | |
Qiu et al. | Plasma glycoprotein profiling for colorectal cancer biomarker identification by lectin glycoarray and lectin blot | |
Chandler et al. | Glycoprotein disease markers and single protein-omics | |
Badr et al. | Lectin approaches for glycoproteomics in FDA-approved cancer biomarkers | |
Loureiro et al. | Novel monoclonal antibody L2A5 specifically targeting sialyl-Tn and short glycans terminated by alpha-2–6 sialic acids | |
Llop et al. | Glycoprotein biomarkers for the detection of pancreatic ductal adenocarcinoma | |
US20120100558A1 (en) | Lung cancer diagnosis | |
Noguchi et al. | Assessment of immunological biomarkers in patients with advanced cancer treated by personalized peptide vaccination | |
Even-Desrumeaux et al. | State of the art in tumor antigen and biomarker discovery | |
US20130005598A1 (en) | Methods for Diagnosing The Malignant Potential of Pancreatic Cystic Lesions | |
Guu et al. | Serum N-glycome characterization and anti-carbohydrate antibody profiling in oral squamous cell carcinoma patients | |
Yang et al. | Abnormal Galactosylated–Glycans recognized by Bandeiraea Simplicifolia Lectin I in saliva of patients with breast Cancer | |
Song et al. | MUC1 glycopeptide epitopes predicted by computational glycomics | |
Wang | N-glycan cryptic antigens as active immunological targets in prostate cancer patients | |
US20110177525A1 (en) | Antibodies and methods of diagnosing diseases | |
Amon et al. | A combined computational-experimental approach to define the structural origin of antibody recognition of sialyl-Tn, a tumor-associated carbohydrate antigen | |
Napoletano et al. | Investigating patterns of immune interaction in ovarian cancer: probing the O-glycoproteome by the macrophage galactose-like C-type lectin (MGL) | |
Kurtenkov | Profiling of Naturally Occurring Antibodies to the Thomsen‐Friedenreich Antigen in Health and Cancer: The Diversity and Clinical Potential | |
JP6172687B2 (ja) | シアリル化糖鎖を認識するモノクローナル抗体 | |
Kurtenkov et al. | The Thomsen‐Friedenreich Antigen‐Specific Antibody Signatures in Patients with Breast Cancer | |
Wang et al. | Glycan markers as potential immunological targets in circulating tumor cells | |
Yie et al. | A protein fragment derived from DNA-topoisomerase I as a novel tumour-associated antigen for the detection of early stage carcinoma | |
Lin et al. | Precise mapping of increased sialylation pattern and the expression of acute phase proteins accompanying murine tumor progression in BALB/c mouse by integrated sera proteomics and glycomics |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130123 |