ES2862701T3

ES2862701T3 - Anticuerpos agonistas anti-MERTK y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2862701T3
Application number: ES15874253T
Authority: ES
Inventors: Sohail Tavazoie; Nils Halberg; Masoud Tavazoie
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2035-12-21
Also published as: US10221248B2; US11225524B2; CA2972048C; HK1245807A1; US20190241676A1; WO2016106221A1; CA2972048A1; US20180002444A1; EP3789039A1; EP3237450A1; JP2018504105A; EP3237450A4; EP3237450B1; JP7211703B2

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a tirosina cinasa Mer (MERTK) humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en el que: (i) la VH comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en el que las CDR se definen según la definición de Kabat; (ii) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 2, una CDR2 de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de SEQ ID NO: 12, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 16, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 23, en el que las CDR se definen según la definición de Chothia; (iii) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de SEQ ID NO: 11, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en el que las CDR se definen según la definición de AbM; (iv) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de SEQ ID NO: 13, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 17, una CDR2 de SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de SEQ ID NO: 24, en el que las CDR se definen según la definición de Contact; (v) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de SEQ ID NO: 10 y una CDR3 de SEQ ID NO: 14, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 18, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en el que las CDR se definen según la definición de IMGT; o (vi) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de SEQ ID NO: 11, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en el que las CDR se definen según la definición a modo de ejemplo.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos agonistas anti-MERTK y usos de los mismos

1. Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/095.325, presentada el 22 de diciembre de 2014.

2. Campo

La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a tirosina cinasa Mer (MERTK), en el que dicho anticuerpo agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales. La presente invención también se refiere a un anticuerpo heteroconjugado, a un kit que comprende dicho anticuerpo heteroconjugado. La presente invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo de la invención, a una célula ex vivo que contiene el ácido nucleico aislado, a un método para producir un anticuerpo de la invención, a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención y a la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de cáncer.

3. Antecedentes

La tirosina cinasa Mer (MERTK), también denominada c-mer, MER, protooncogén c-Mer, tirosina cinasa receptora MerTK, proteína tirosina cinasa Mer, STK cinasa, RP38 o MGC133349, es un miembro de la familia TAM de tirosina cinasas receptoras, que también incluye las cinasas AXL y TYRO3. MERTK transduce señales desde el espacio extracelular a través de la activación por la unión de ligandos, sobre todo Gas-6, una proteína soluble. La unión de Gas-6 a MERTK induce la autofosforilación de MERTK en su dominio intracelular, lo que da como resultado la activación de señales aguas abajo (Cummings CT et al., (2013) Clin Cancer Res 19: 5275-5280; Verma A et al., (2011) Mol Cancer Ther 10: 1763-1773). Además, se ha descubierto que las tirosina cinasas receptoras de TAM, Axl y Mer, desempeñan funciones distintas como receptores fagocíticos en la homeostasis de los tejidos y la resolución de la inflamación (Zagórska et al., 2014. Nature Immunology, 15: 920-928).

El receptor de MERTK existe tanto en forma unida a la membrana como en forma soluble. El dominio extracelular puede escindirse para generar un dominio extracelular soluble, que se supone que actúa como receptor señuelo para regular negativamente la activación del receptor de MERTK en las células, reduciendo la capacidad y/o disponibilidad del ligando soluble Gas-6 por la unión a MERTK unida a la membrana (Sather S et al., (2007) Blood 109: 1026-1033). Como resultado, MERTK tiene un doble papel relacionado con la progresión del cáncer, la angiogénesis y la metástasis. Por un lado, la activación de MERTK por parte de Gas-6 en células endoteliales tiene como resultado la inhibición del reclutamiento de células endoteliales por parte de las células cancerosas en un sistema de cultivo conjunto. El reclutamiento endotelial es una característica clave de las células cancerosas que permite la angiogénesis tumoral, el crecimiento tumoral y la metástasis. Sin embargo, por otro lado, MERTK desempeña un papel opuesto en las células cancerosas, en las que su sobreexpresión conduce a una metástasis aumentada, probablemente mediante la liberación de MERTK escindida para generar la proteína de dominio extracelular de MERTK soluble como un receptor señuelo. Así, las células tumorales secretan una forma soluble del receptor extracelular de MERTK que actúa como receptor señuelo para reducir la capacidad (y/o disponibilidad) del ligando soluble Gas-6 para activar MERTK en las células endoteliales, lo que en última instancia conduce al reclutamiento endotelial, la angiogénesis y la progresión del cáncer (Png KJ et al., (2012) Nature 481: 190-194).

Históricamente, se han intentado generar inhibidores, pero no activadores, de MERTK para el tratamiento de cáncer (por ejemplo, el compuesto UNC1062, un potente inhibidor de MERTK de molécula pequeña desarrollado como compuesto antineoplásico), porque se pensaba que MERTK funcionaba únicamente como oncogén (Liu J et al., (2013) Eur J Med Chem 65: 83-93; Cummings CT et al., (2013) Clin Cancer Res 19: 5275-5280; Verma A et al., (2011) Mol Cancer Ther 10: 1763-1773). Dado el doble papel de MERTK en las células cancerosas y en las células endoteliales, el tratamiento con una molécula que generalmente provoca la activación de MERTK (por ejemplo, tanto en células endoteliales como en células cancerosas) podría dar lugar a un mayor reclutamiento de células endoteliales y metástasis. Sin embargo, un compuesto que active la señalización de MERTK en células endoteliales pero no en células cancerosas sería potencialmente una terapia atractiva para la angiogénesis tumoral y la metástasis.

Por tanto, son necesarios anticuerpos que se unan específicamente a MERTK y agonicen la señalización de MERTK en células endoteliales.

4. Sumario

En el presente documento se dan a conocer anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agonizan la señalización de MERTK en células endoteliales. Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en el que (i) la VH comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en el que las CDR se definen según la definición de Kabat; (ii) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 2, una CDR2 de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de SEQ ID NO: 12, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 16, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 23, en el que las CDR se definen según la definición de Clothia; (iii) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de SEQ ID NO: 11, y la ^vL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en el que las CDR se definen según la definición de AbM; (iv) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de SEQ ID NO: 13, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 17, una CDR2 de SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de SEQ ID NO: 24, en el que las CDR se definen según la definición de Contact; (v) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de SEQ ID NO: 10 y una CDR3 de SEQ ID NO: 14, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 18, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en el que las CDR se definen según la definición de IMGT; o (vi) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de SEQ ID NO: 11, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en la que las CDR se definen según la definición a modo de ejemplo. La divulgación se refiere a un anticuerpo anti-MERTK o a un fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento que puede reconocer específicamente la porción extracelular de MERTK humana. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede reconocer específicamente la porción extracelular de MERTK de ratón. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede competir con Gas-6 por la unión a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERT^ktanto humana como de ratón). Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede ser una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende:

(a) una CDR1 de VH de NYGMN (SEQ ID NO: 1); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNY (SEQ ID NO: 2); y/o

(b) una CDR2 de VH de (SEQ ID NO: 7); y/o

(c) una CDR3 de VH de STVVSRYFD (SEQ ID NO: 12).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPT (SEQ ID NO: 8); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11).

(a) una CDR1 de VH de TNYGMN (SEQ ID NO: 4); y/o

(b) una CDR2 de VH de WMGWINTYTGEPT (SEQ ID NO: 9); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFD (SEQ ID NO: 13).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYG (SEQ ID NO: 5); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTYTGEP (SEQ ID NO: 10); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 14).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11).

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) que comprende:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(b) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VL de SQDVGDA (SEQ ID NO: 16); y/o

(b) una CDR2 de VL de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(c) una CDR3 de VL de YRSYPL (SEQ ID NO: 23).

(a) una CDR1 de VL de GDAVTWC (SEQ ID NO: 17); y/o

(b) una CDR2 de VL de LLIYWASTRH (SEQ ID NO: 21); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPL (SEQ ID NO: 24).

(a) una CDR1 de VL de QDVGDA (SEQ ID NO: 18); y/o

(b) una CDR2 de VL de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VH de DYSMH (SEQ ID NO: 25); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35).

Un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende:

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDY (SEQ ID NO: 26); y/o

(b) una CDR2 de VH de TDTG (SEQ ID NO: 31); y/o

(c) una CDR3 de VH de FGAMD (SEQ ID NO: 36).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPT (SEQ ID NO: 32); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35).

(a) una CDR1 de VH de TDYSMH (SEQ ID NO: 28); y/o

(b) una CDR2 de VH de WVGWINTDTGEPT (SEQ ID NO: 33); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMD (SEQ ID NO: 37).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYS (SEQ ID NO: 29); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTDTGEP (SEQ ID NO: 34); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMDY (SEQ ID NO: 38).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35).

Un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) que comprende:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39); y/o

(b) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(a) una CDR1 de VL de SQDVTNV (SEQ ID NO: 40); y/o

(b) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(c) una CDR3 de VL de YYRTPR (SEQ ID NO: 47).

(a) una CDR1 de VL de TNVVAWY (SEQ ID NO: 41); y/o

(b) una CDR2 de VL de LLIYSASYRY (SEQ ID NO: 45); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPR (SEQ ID NO: 48).

(a) una CDR1 de VL de QDVTNV (SEQ ID NO: 42); y/o

(b) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una, dos o las tres CDR de VH anteriores. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VH en la tabla 1 o la tabla 3. El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR2 de VH en la tabla 1 o la tabla 3. El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR3 de VH en la tabla 1 o la tabla 3. El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M6 (tabla 1). El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M19 (tabla 3).

El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una, dos o las tres CDR de VL anteriores. El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL en la tabla 2 o la tabla 4. El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR2 de VL en la tabla 2 o la tabla 4. El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una CDR3 de VL en la tabla 2 o la tabla 4. El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL del anticuerpo M6 (tabla 2). El anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de ^{V l ,}una CDR2 de VL y una CDR3 de VL del anticuerpo M19 (tabla 4).

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender:

(a) una CDR1 de VH de NYGMN (SEQ ID NO: 1); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(e) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNY (SEQ ID NO: 2); y/o

(b) una CDR2 de VH de (SEQ ID NO: 7); y/o

(c) una CDR3 de VH de STVVSRYFD (SEQ ID NO: 12); y/o

(d) una CDR1 de VL de SQDVGDA (SEQ ID NO: 16); y/o

(e) una CDR2 de VL de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(f) una CDR3 de VL de YRSYPL (SEQ ID NO: 23).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPT (SEQ ID NO: 8); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(e) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VH de TNYGMN (SEQ ID NO: 4); y/o

(b) una CDR2 de VH de WMGWINTYTGEPT (SEQ ID NO: 9); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFD (SEQ ID NO: 13); y/o

(d) una CDR1 de VL de GDAVTWC (SEQ ID NO: 17); y/o

(e) una CDR2 de VL de LLIYWASTRH (SEQ ID NO: 21); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPL (SEQ ID NO: 24).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYG (SEQ ID NO: 5); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTYTGEP (SEQ ID NO: 10); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 14); y/o

(d) una CDR1 de VL de QDVGDA (SEQ ID NO: 18); y/o

(e) una CDR2 de VL que comprende, de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(e) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VH de DYSMH (SEQ ID NO: 25); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39); y/o

(e) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDY (SEQ ID NO: 26); y/o

(b) una CDR2 de VH de TDTG (SEQ ID NO: 31); y/o

(c) una CDR3 de VH de FGAMD (SEQ ID NO: 36); y/o

(d) una CDR1 de VL de SQDVTNV (SEQ ID NO: 40); y/o

(e) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(f) una CDR3 de VL de YYRTPR (SEQ ID NO: 47).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPT (SEQ ID NO: 32); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39); y/o

(e) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(a) una CDR1 de VH de TDYSMH (SEQ ID NO: 28); y/o

(b) una CDR2 de VH de WVGWINTDTGEPT (SEQ ID NO: 33); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMD (SEQ ID NO: 37); y/o

(d) una CDR1 de VL de TNVVAWY (SEQ ID NO: 41); y/o

(e) una CDR2 de VL de LLIYSASYRY (SEQ ID NO: 45); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPR (SEQ ID NO: 48).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYS (SEQ ID NO: 29); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTDTGEP (SEQ ID NO: 34); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMDY (SEQ ID NO: 38); y/o

(d) una CDR1 de VL de QDVTNV (SEQ ID NO: 42); y/o

(e) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39); y/o

(e) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

Se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. Se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales que puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

Se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales que puede comprender una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales que puede comprender una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

En otra realización de la invención, se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, que comprende (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Se proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, que comprende (a) una región variable de cadena pesada que puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

Un anticuerpo proporcionado en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender regiones constantes de cadena pesada y/o ligera. La región constante de cadena pesada puede seleccionarse del grupo de inmunoglobulinas humanas que consiste en IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. La región constante de cadena ligera puede seleccionarse del grupo de inmunoglobulinas humanas que consiste en IgGK e IgGX. El anticuerpo puede comprender una región constante que tiene afinidad de unión aumentada a uno o más receptores de Fc gamma humanos. El anticuerpo puede comprender una región constante que tiene una afinidad de unión disminuida a uno o más receptores de Fc gamma humanos.

Se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que puede unirse al mismo epítopo de MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) que el anticuerpo descrito en el presente documento. Se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que puede competir con un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento por la unión a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón). Se proporciona en el presente documento un primer anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite con un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento por la unión a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), en el que la competencia puede mostrarse como una unión reducida del primer anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) en más del 80 % (por ejemplo, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 98 %, o entre el 80 % y el 85 %, entre el 80 % y el 90 %, entre el 85 % y el 90 %, o entre el 85 % y el 95 %) en presencia del anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento.

El anticuerpo proporcionado en el presente documento, que puede unirse específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agonizar la señalización de MERTK en células endoteliales, puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo murino o un anticuerpo quimérico. Por tanto, en una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo según la invención puede estar humanizado. El anticuerpo según la invención puede ser un anticuerpo heteroconjugado. El anticuerpo o fragmento del mismo según la invención puede comprender una región constante derivada de un ser humano. Un anticuerpo proporcionado en el presente documento, que puede unirse específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agonizar la señalización de MERTK en células endoteliales, se une a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) con una K^den el intervalo de aproximadamente 3 pM a 400 pM. Un anticuerpo proporcionado en el presente documento puede aislarse. Un anticuerpo proporcionado en el presente documento según la invención puede ser un anticuerpo monoclonal.

Se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico que pueden codificar para una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera, o una cadena pesada y/o una cadena ligera de un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento. Según un aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la invención. La molécula de ácido nucleico puede codificar para una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 55. La molécula de ácido nucleico puede codificar para una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 56. La molécula de ácido nucleico puede aislarse.

Un vector (por ejemplo, un vector aislado) comprende un polinucleótido que codifica para una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera, o una cadena pesada y/o una cadena ligera de un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento. Una célula huésped puede comprender el polinucleótido o el vector. Los ejemplos de células huésped incluyen E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, levadura, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, células BMT10, células vegetales, células de insecto y células humanas en cultivo tisular. Se proporciona en el presente documento un método para producir un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, que puede comprender el cultivo de una célula huésped para que se exprese el polinucleótido y se produzca el anticuerpo.

Se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que pueden comprender un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, un polinucleótido, un vector o una célula huésped descritos en el presente documento, y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede usarse para tratar el cáncer. Por tanto, según otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesita.

La divulgación también se refiere a un método para tratar el cáncer en un sujeto, que puede comprender administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento. Se proporciona en el presente documento un método para tratar el cáncer en un sujeto que puede comprender administrar al sujeto una composición farmacéutica descrita en el presente documento. El método para tratar el cáncer puede dar como resultado la inhibición de la migración de células endoteliales, la inhibición de la angiogénesis y/o la inhibición de la progresión tumoral.

El cáncer puede ser un cáncer de pulmón, mama, hueso, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, vías biliares, colon, recto, cuello uterino, endometrio, riñón, vejiga, próstata o tiroides. El cáncer tratado puede ser un sarcoma, un carcinoma de células escamosas, un melanoma, un glioma, un glioblastoma, un neuroblastoma o sarcomas de Kaposi.

El cáncer puede ser cáncer de mama. En una realización específica, el cáncer es cáncer de mama triple negativo. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de cáncer, en la que el tratamiento de cáncer comprende administrar al sujeto un agente terapéutico adicional. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales que pueden administrarse a un sujeto en combinación con un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento o una composición farmacéutica descrita en el presente documento se describen en las secciones 5.3 y 5.4, más adelante.

Los agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse a un sujeto en combinación con un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que es un agente usado para tratar el cáncer de mama, un agente usado para tratar el melanoma, una inmunoterapia o un inhibidor de la angiogénesis.

El agente terapéutico adicional puede ser un agente usado para tratar el cáncer de mama que se selecciona del grupo que consiste en tamoxifeno, raloxifeno, paclitaxel (TAXOL®), ciclofosfamida, docetaxel, vinblastina, fluorouracilo, everolimús, trastuzumab, trastuzumab-emtansina, pertuzumab y ditosilato de lapatinib.

El agente terapéutico adicional puede ser un agente usado para tratar el melanoma que se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de BRAF, un inhibidor de MEK y dacarbazina.

El agente terapéutico adicional puede ser un anticuerpo que es un inhibidor de CTLA-4, un inhibidor de PD-1 o un inhibidor de PD-L1.

El agente terapéutico adicional puede ser un inhibidor de la angiogénesis que se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de VEGF, un inhibidor de VEGFR2, sunitinib y sorafenib.

El sujeto puede ser un ser humano.

La divulgación se refiere a un anticuerpo o a un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a tirosina cinasa Mer (MERTK) humana, en el que el anticuerpo agoniza la señalización MERTK humana de las células endoteliales.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse específicamente a MERTK murina.

El anticuerpo dado a conocer en el presente documento puede reconocer específicamente el dominio extracelular de MERTK humana, y el dominio extracelular comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.

El anticuerpo dado a conocer en el presente documento puede competir con Gas-6 por la unión a MERTK humana. El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo puede ser una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH), que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de SeQ ID nO: 6 y una CDR3 de SEQ ID NO: 11. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL), que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ⁱD N^o: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 2, una CDR2 de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de SEQ ID NO: 12. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la V^lcomprende una CDR1 de SEQ ID NO: 16, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 23.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de SEQ ID NO: 11. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL), que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de SEQ ID NO: 13. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la V^lcomprende una CDR1 de SEQ ID NO: 17, una CDR2 de SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de SEQ ID NO: 24.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de SEQ ID NO: 10 y una CDR3 de SEQ ID NO: 14. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 18, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de SEQ ID NO: 11. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL), que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 25, una CDR2 de SEQ ID NO: 30 y una CDR3 de SEQ ID NO: 35. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 26, una CDR2 de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 de SEQ ID NO: 36. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 40, una CDR2 de SEQ ID NO: 44 y una CDR3 de SEQ ID NO: 47.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 27, una CDR2 de SEQ ID NO: 32 y una CDR3 de SEQ ID NO: 35. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 28, una CDR2 de SEQ ID NO: 33 y una CDR3 de SEQ ID NO: 37. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 41, una CDR2 de SEQ ID NO: 45 y una CDR3 de SEQ ID NO: 48.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 29, una CDR2 de SEQ ID NO: 34 y una CDR3 de SEQ ID NO: 38.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas puede comprender una región variable (VH) y la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 27, una CDR2 de SEQ ID NO: 30 y una CDR3 de SEQ ID NO: 35. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46. Cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 42, una CDR2 de SEQ ^{i D}NO: 44 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL), que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de ^{S e Q}iD NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 16, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 23.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 17, una CDR2 de SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de SEQ ID NO: 24.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 18, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 40, una CDR2 de SEQ ID NO: 44 y una CDR3 de SEQ ID NO: 47.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 41, una CDR2 de SEQ ID NO: 45 y una CDR3 de SEQ ID NO: 48.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas ligeras puede comprender una región variable (VL) y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 42, una CDR2 de SEQ ID NO: 44 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena pesada puede comprender una región variable (VH), que comprende la SEQ ID NO: 49. La cadena ligera puede comprender una región variable (VL), que comprende la SEQ ID NO: 50.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena ligera puede comprender una región variable (VL), que comprende la SEQ ID NO: 50.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena pesada puede comprender una región variable (VH), que comprende la SEQ ID NO: 51. La cadena ligera puede comprender una región variable (VL), que comprende la SEQ ID NO: 52.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena ligera puede comprender una región variable (VL), que comprende la SEQ ID NO: 52.

Cuando el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una región constante derivada de un ser humano. La región constante de cadena pesada puede tener un isotipo seleccionado del grupo que consiste en gamma1, gamma2, gamma3 y gamma4.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la invención puede estar humanizado.

El anticuerpo dado a conocer en el presente documento puede unirse a MERTK humana con una constante de disociación (K^d) en el intervalo de aproximadamente 3 picomolar (pM) a 400 pM.

El anticuerpo dado a conocer en el presente documento puede unirse a MERTK murina con una K^den el intervalo de aproximadamente 3 pM a 400 pM.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno dado a conocer en el presente documento puede inhibir la migración de células endoteliales in vitro en presencia de células de cáncer de mama, en el que la migración se inhibe en más del 30 % en comparación con las células endoteliales tratadas con un anticuerpo de control.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno dado a conocer en el presente documento puede fomentar la fosforilación de MERTK de las células endoteliales vasculares humanas in vitro.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno dado a conocer en el presente documento puede no fomentar la fosforilación de MERTK en las células cancerosas in vitro.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno dado a conocer en el presente documento puede inhibir la angiogénesis tumoral in vivo.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno dado a conocer en el presente documento puede no inhibir la migración de la línea celular de glioblastoma multiforme A172 en un ensayo de migración Transwell in vitro en ausencia de células endoteliales.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno dado a conocer en el presente documento puede no disminuir el nivel de expresión de MERTK en la línea celular de glioblastoma multiforme A172.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID ⁿO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 2, una CDR2 de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de SEQ ID NO: 12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL comprende una CDR1 de ^sE^qID NO: 16, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 23.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de SEQ ID NO: 11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de SEQ ID NO: 13. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL comprende una CDR1 de ^{s E q}ID NO: 17, una CDR2 de SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de SEQ ID NO: 24.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que puede comprender una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH comprende una CDR1 de SEQ ^{i D}NO: 5, una CDR2 de SEQ ID NO: 10 y una CDR3 de SEQ ID NO: 14. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 18, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que puede comprender una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH comprende una CDR1 de ^{S e Q}ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de SEQ ID NO: 11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL puede comprender una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH puede comprender una CDR1 de SEQ ID NO: 25, una CDR2 de SEQ ID NO: 30 y una CDR3 de SEQ iD NO: 35. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL puede comprender una CDR1 de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH puede comprender una CDR1 de SEQ ID NO: 26, una CDR2 de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 de SEQ ID NO: 36. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL puede comprender una CDR1 de SEQ ID NO: 40, una CDR2 de SEQ ID NO: 44 y una CDR3 de SEQ ID NO: 47.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH puede comprender una CDR1 de SEQ ID NO: 27, una CDR2 de SEQ ID NO: 32 y una CDR3 de SEQ ID NO: 35. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL puede comprender una CDR1 de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH puede comprender una CDR1 de SEQ ID NO: 28, una CDR2 de SEQ ID NO: 33 y una CDR3 de SEQ ID NO: 37. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL puede comprender una CDR1 de SEQ ID NO: 41, una CDR2 de SEQ ID NO: 45 y una CDR3 de SEQ ID NO: 48.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 29, una CDR2 de SEQ ID NO: 34 y una CDR3 de SEQ ID NO: 38.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH), en el que la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 27, una CDR2 de SEQ ID NO: 30 y una CDR3 de SEQ ID NO: 35. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL puede comprender una CDR1 de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además una región variable de cadena ligera (VL), en el que la VL comprende una CDR1 de s Eq ID NO: 42, una CDR2 de SEQ ID NO: 44 y una CDR3 de SEQ ID NO: 46.

El anticuerpo puede ser una inmunoglobulina, y el fragmento de unión a antígeno es una porción de una inmunoglobulina.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser una inmunoglobulina.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo dado a conocer en el presente documento puede estar humanizado.

En una realización específica de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región constante derivada de un ser humano. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser una inmunoglobulina humanizada.

Cuando el anticuerpo no es un anticuerpo monoclonal ni una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser un anticuerpo biespecífico.

La divulgación también proporciona en el presente documento una inmunoglobulina que se une específicamente a MERTK humana, que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

La divulgación también proporciona en el presente documento una inmunoglobulina que se une específicamente a MERTK humana, que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

La divulgación también proporciona en el presente documento una inmunoglobulina que se une específicamente a MERTK humana, que comprende:

(A) (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; o

(B) (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo que compite por la unión a MERTK con un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una primera inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; y

b) una segunda inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 2, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 12. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 13. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 10 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 14. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 25, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 30 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 35. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 26, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 36. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 27, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 32 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 35. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 28, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 33 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 37. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 29, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 34 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 38. La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 27, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 30 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 35. La divulgación también proporcionó en el presente documento una cadena pesada de anticuerpo que comprende:

(A) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11;

(B) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 2, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 12;

(C) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11;

(D) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 13;

(E) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 10 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 14;

(F) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11;

(G) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 25, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 30 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 35;

(H) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 26, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 31 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 36;

(I) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 27, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 32 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 35;

(J) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 28, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 33 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 37;

(K) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 29, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 34 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 38; o

(L) una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 27, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 30 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 35.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena ligera de anticuerpo que comprende: una CDR1 de región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 22.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena ligera de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 16, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 23.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena ligera de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 17, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 24.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena ligera de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 18, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 22.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena ligera de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 46.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena ligera de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 40, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 44 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 47.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena ligera de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 41, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 45 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 48.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena ligera de anticuerpo que comprende: una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 42, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 44 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 46.

La divulgación también proporciona en el presente documento una cadena ligera de anticuerpo que comprende:

(A) una CDR1 de región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 22;

(B) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 16, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 23;

(C) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 17, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 24;

(D) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 18, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 22;

(E) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 39, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 43 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 46;

(F) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 40, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 44 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 47;

(G) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 41, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 45 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 48; o

(H) una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 42, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 44 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 46.

La divulgación también proporciona en el presente documento un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica para la cadena pesada de anticuerpo descrita anteriormente.

La divulgación también proporciona en el presente documento un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica para la cadena ligera de anticuerpo descrita en cualquiera de los aspectos anteriores.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula ex vivo que contiene uno o más polinucleótidos que codifican para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la invención. La divulgación también proporciona en el presente documento una célula ex vivo que contiene uno o más polinucleótidos que codifican para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito anteriormente, o la inmunoglobulina descrita anteriormente, o un anticuerpo que compite por la unión a MERTK con un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en:

La divulgación también proporciona en el presente documento una célula ex vivo que contiene un polinucleótido que codifica para la cadena pesada de anticuerpo descrita en cualquiera de los aspectos anteriores.

La divulgación también proporciona en el presente documento una célula ex vivo que contiene un polinucleótido que codifica para la cadena ligera de anticuerpo descrita anteriormente.

En otro aspecto de la invención, se proporciona en el presente documento un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, que comprende cultivar una célula ex vivo según la invención que contiene uno o más polinucleótidos que codifican para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en condiciones tales que los uno o más polinucleótidos sean expresados por la célula para producir el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la inmunoglobulina codificados por los polinucleótidos. Además, se proporciona un método para producir la inmunoglobulina descrita anteriormente o un anticuerpo que compite por la unión a MERTK con un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en:

b) una segunda inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50,

en condiciones tales que los uno o más polinucleótidos sean expresados por la célula para producir el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la inmunoglobulina codificados por los polinucleótidos.

La divulgación también proporciona en el presente documento un método para producir una cadena pesada de anticuerpo, que comprende cultivar una célula ex vivo que contiene un polinucleótido que codifica para la cadena pesada de anticuerpo descrita anteriormente en condiciones tales que el polinucleótido sea expresado por la célula para producir el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la inmunoglobulina codificados por el polinucleótido. La divulgación también proporciona en el presente documento un método para producir una cadena ligera de anticuerpo, que comprende cultivar una célula ex vivo que contiene un polinucleótido que codifica para la cadena ligera de anticuerpo descrita anteriormente en condiciones tales que el polinucleótido sea expresado por la célula para producir el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la inmunoglobulina codificados por el polinucleótido. En otro aspecto de la invención, se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la invención o un anticuerpo heteroconjugado de la invención; y un portador farmacéuticamente aceptable. La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina descrita anteriormente o un anticuerpo que compite por la unión a MERTK con un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en:

b) una segunda inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50;

y un portador farmacéuticamente aceptable.

La divulgación también proporciona en el presente documento un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto la composición farmacéutica anterior. Según otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesita. El sujeto puede ser un ser humano.

El cáncer puede ser un cáncer de pulmón, mama, hueso, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, vías biliares, colon, recto, cuello uterino, endometrio, riñón, vejiga, próstata o tiroides. En una realización, el cáncer es cáncer de mama. En otra realización, el cáncer es cáncer de mama triple negativo.

En el método para tratar el cáncer, el cáncer puede ser un sarcoma, un carcinoma de células escamosas, un melanoma, un glioma, un glioblastoma, un neuroblastoma o sarcomas de Kaposi.

En el método para tratar el cáncer, el método puede comprender además administrar al sujeto un agente terapéutico adicional.

El método puede comprender además administrar al sujeto un agente terapéutico adicional o la composición farmacéutica puede administrarse conjuntamente al sujeto con un agente terapéutico adicional, en el que el agente terapéutico adicional es para tratar el cáncer.

El agente terapéutico adicional puede ser para tratar el cáncer, el agente terapéutico adicional es un agente usado para tratar el cáncer de mama, un agente usado para tratar el melanoma, una inmunoterapia o un inhibidor de la angiogénesis. El agente terapéutico adicional puede ser un agente usado para tratar el cáncer de mama que se selecciona del grupo que consiste en tamoxifeno, raloxifeno, paclitaxel, ciclofosfamida, docetaxel, vinblastina, fluorouracilo, everolimús, trastuzumab, trastuzumab-emtansina, pertuzumab y ditosilato de lapatinib. El agente terapéutico adicional puede ser un agente usado para tratar el melanoma que se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de BRAF, un inhibidor de MEK y dacarbazina. El agente terapéutico adicional puede ser un anticuerpo que es un inhibidor de CTLA-4, un inhibidor de PD-1 o un inhibidor de PD-L1. El agente terapéutico adicional puede ser un inhibidor de la angiogénesis que se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de VEGF, un inhibidor de VEGFR2, sunitinib y sorafenib.

En una realización de la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesita, el sujeto puede ser un ser humano.

5. Breves descripciones de las figuras

Figuras 1A y 1B: secuencias de MERTK. A) Un esquema del péptido MERTK recombinante usado para inmunizar ratones para la producción de anticuerpos. El péptido consiste en el dominio extracelular de MERTK (véase la figura 1B), un ligador corto y una porción de IgG1 humana. B) La secuencia de MERTK humana de longitud completa (SEQ ID NO: 57) que indica la porción de MERTK usada en el péptido MERTK recombinante descrito en la figura 1A (secuencia en negrita y subrayada; SEQ ID NO: 58).

Figura 2: cribado de anticuerpos monoclonales contra MERTK. Un diagrama que muestra los datos de los ensayos ELISA de captura de anticuerpos usados para caracterizar las propiedades de unión de los anticuerpos monoclonales de unión a MERTK recuperados a partir de clones de hibridoma individuales. Los clones de anticuerpos se designan arbitrariamente M1 a M20 en la primera columna. Varios de los anticuerpos monoclonales de unión a MERTK demostraron una alta afinidad de unión a MERTK, tal como indican los altos valores de D.O. (>3,5) en la segunda columna. Algunos de estos anticuerpos también neutralizaron la unión de MERTK a Gas-6, tal como indica un bajo valor de D.O. de bloqueo (< 2,5) en la tercera columna.

Figura 3: los anticuerpos de unión a MERTK M19 y M6 inhiben el reclutamiento endotelial. Un diagrama que muestra que las concentraciones fisiológicas de o bien el anticuerpo monoclonal M6 o bien M19 pueden inhibir significativamente el reclutamiento endotelial por parte de las células de cáncer de mama metastásico. Se sembraron 2,5 x 104 células MDA-MB-231 por cuadruplicado. Se evaluó la migración Transwell de 5 x 104 células HUVEC hacia las células cancerosas en presencia de 200 ng/ml de anticuerpo de control (IgG) o anticuerpos de unión a MERTK aislados a partir del cribado. Se obtuvieron imágenes de las células que migraron a través de los insertos Transwell y se contaron las células usando el software ImageJ. N=4. Los anticuerpos monoclonales que inhiben significativamente el reclutamiento de células endoteliales (M6 y M19) están marcados en rojo y verde, respectivamente. Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figuras 4A-C: el anticuerpo de unión a MERTK M19 activa MERTK en las células endoteliales. A) Las células HUVEC se trataron o bien sin FBS sin M19, con FBS al 10 % sin M19, con FBS al 10 % 25 |ig/ml de M19, o bien sin FBS 25 |ig/ml de M19 durante 16 horas antes de realizar el análisis de inmunotransferencia de tipo Western de MERTK activada (fosforilada) (P-MERTK) y de los niveles totales de MERTK y AKT. Tal como se muestra, el tratamiento con el anticuerpo M19 aumentó los niveles de MERTK activada. B) Cuantificación de la activación de MERTK con el tratamiento con el anticuerpo M19, calculada como la razón entre los niveles de expresión proteica de P-MERTK y MERTK, aislados de células HUVEC tratadas con M19 y sin tratar a partir de los datos de inmunotransferencia de tipo Western de la figura 4A. C) Las células HUVEC se trataron con concentraciones crecientes del anticuerpo M19, tal como se indica, durante 30 minutos antes del análisis de inmunotransferencia de tipo Western de P-MERTK. Obsérvese la activación de MERTK con dosis crecientes de tratamiento con M19.

Figuras 5A y B: el anticuerpo de unión a MERTK M6 activa MERTK en las células endoteliales. A) Las células HUVEC se trataron o bien sin FBS sin M6, con FBS al 10 % sin M6, con FBS al 10 % 25 |ig/ml de M6, o bien sin FBS 25 |ig/ml de M6 durante 16 horas antes de realizar el análisis de inmunotransferencia de tipo Western de MERTK activada (fosforilada) (P-MERTK) y de los niveles totales de MERTK. Tal como se muestra, el tratamiento con el anticuerpo M6 aumentó los niveles de MERTK activada. B) Cuantificación de la activación de MERTK con el tratamiento con el anticuerpo M6, calculada como la razón entre los niveles de expresión proteica de P-MERTK y MERTK, aislados de células HUVEC tratadas con M6 y sin tratar a partir de los datos de inmunotransferencia de tipo Western de la figura 5A.

Figura 6: el anticuerpo M19 de unión a MERTK no activa MERTK en células cancerosas. Las células de cáncer de mama LM2 se trataron o bien sin FBS sin anticuerpo M19, con FBS al 10 % sin anticuerpo M19, con FBS al 10 % 25 |ig/ml de anticuerpo M19 o bien sin FBS 25 |ig/ml de anticuerpo M19 durante 16 horas antes de realizar el análisis de inmunotransferencia de tipo Western de MERTK activada (P-MERTK) y de los niveles totales de MERTK. Tal como se muestra, no se indujeron niveles detectables de P-MERTK en las células cancerosas tratadas con el anticuerpo M19.

Figura 7: M19 se une a MERTK humana con alta afinidad. Un diagrama que muestra la cinética de unión de anticuerpos para M19 (Mer-M19) contra MERTK humana (hMer) usando interferometría de biocapa. El M19 purificado se cargó en un sensor AMQ a una concentración de 1 microgramo/ml para someter a prueba la unión contra analitos en disolución. Todos los analitos se prepararon a 5 nM con una serie de dilución doble para un total de 7 concentraciones. Los ajustes cinéticos se calcularon usando un modelo 1:1, con ajustes locales para cada concentración, así como un ajuste global general. El ajuste global general calculó que la afinidad de unión (K^d) para la unión de M19 a MERTK humana fue de 326 picomolar.

Figura 8: M19 se une a MERTK murina con alta afinidad. Un diagrama que muestra la cinética de unión de anticuerpos para M19 (Mer-M19) contra MERTK murina (msMer) usando interferometría de biocapa. El M19 purificado se cargó en un sensor AMQ a una concentración de 1 microgramo/ml para someter a prueba la unión contra analitos en disolución. Todos los analitos se prepararon a 5 nM con una serie de dilución doble para un total de 7 concentraciones. Los ajustes cinéticos se calcularon usando un modelo 1:1, con ajustes locales para cada concentración, así como un ajuste global general. El ajuste global general calculó que la afinidad de unión ^{( K d)}para la unión de M19 a MERTK de ratón fue de 305 picomolar.

Figuras 9A y B: el tratamiento con M19 inhibe el crecimiento de tumores primarios y la metástasis del cáncer de mama triple negativo in vivo. A) Crecimiento tumoral en la almohadilla de grasa mamaria de 2000 células de cáncer de mama MDA-MB-231 o 5000 Lm1a1 en ratones tratados quincenalmente con 250 |ig de o bien anticuerpo de control (IgG) o bien anticuerpo M19. B) Se inyectaron células de cáncer de mama Lm1a1 bilateralmente en la almohadilla de grasa mamaria en ratones tratados quincenalmente con 250 |ig de o bien anticuerpo de control (IgG) o bien anticuerpo M19. Después de 98 días se extrajeron los pulmones, se procesaron para la tinción de H&E y se contó el número de nódulos metastásicos. N=4. Las barras de error representan el error estándar de la media. Los valores de P se obtuvieron mediante la prueba de la t de Student (*p< 0,05)

Figura 10: el tratamiento con M19 inhibe la angiogénesis in vivo. Los tumores de xenoinjerto de almohadilla de grasa mamaria que se cultivaron durante 58 días tratados con 250 |ig de o bien anticuerpo de control (IgG) o bien anticuerpo M19 dos veces por semana se tiñeron doblemente para DAPI y CD31. La densidad de los vasos se cuantificó usando una señal de CD31 de umbral. N=4. Las barras de error representan el error estándar de la media. Los valores de P se obtuvieron mediante la prueba de la t de Student (*p< 0,05).

Figura 11: M6 se une a MERTK con alta afinidad. M6 se une a MERTK humana con alta afinidad. Un diagrama que muestra la cinética de unión de anticuerpos para M6 (Mer-M6) contra MERTK humana (hMer) usando interferometría de biocapa. El M6 purificado se cargó en un sensor AMQ a una concentración de 1 microgramo/ml para someter a prueba la unión contra analitos en disolución. Todos los analitos se prepararon a 5 nM con una serie de dilución doble para un total de 7 concentraciones. Los ajustes cinéticos se calcularon usando un modelo 1:1, con ajustes locales para cada concentración, así como un ajuste global general. Las afinidades de unión ^{( K d)}generales calculadas para la unión de M6 a MERTK humana fue de 4,6 picomolar.

Figura 12: el tratamiento con M6 inhibe el crecimiento de tumores primarios de cáncer de mama triple negativo in vivo. Crecimiento tumoral de la almohadilla de grasa mamaria de 2000 MDA-MB-231 en ratones tratados quincenalmente durante 21 días con 250 |ig de o bien anticuerpo de control o bien anticuerpo M6. N=4. Las barras de error representan el error estándar de la media.

6. Descripción detallada

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos anti-MERTK (por ejemplo, anticuerpos monoclonales), y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agonizan la señalización de MERTK en células endoteliales. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede reconocer específicamente el dominio extracelular de MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón). Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede no unirse a una glicoforma de MERTK de 185 kilodalton (kD) expresada en células Jurkat, a una glicoforma de MERTK de 205 kD en la línea celular monocítica U937, a glicoformas de MERTK de 135 140 kD expresadas en células de leucemia humanas (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda de células T humanas) o glicoformas de MERTK de 170-190 kD expresadas en células de leucemia humanas (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda de células T humanas). Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede no disminuir el nivel de expresión de MERTK en células cancerosas. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede no disminuir el nivel de expresión de MERTK en la línea celular de glioblastoma multiforme A172. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede aislarse. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede unirse específicamente a la proteína MERTK humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede unirse específicamente a la región extracelular de MERTK humana, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede unirse específicamente a SEQ ID NO: 58. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede comprender dos sitios de unión a antígeno que se unen a MERTK; los dos sitios de unión a antígeno pueden unirse al mismo epítopo en MERTK; los dos sitios de unión a antígeno pueden comprender CDR idénticas.

Los anticuerpos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos producidos de manera recombinante, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, inmunoglobulinas, anticuerpos sintéticos, anticuerpos tetraméricos que comprenden dos moléculas de cadena pesada y dos de cadena ligera, un monómero de cadena ligera de anticuerpo, un monómero de cadena pesada de anticuerpo, un dímero de cadena ligera de anticuerpo, un dímero de cadena pesada de anticuerpo, un par de cadena ligera de anticuerpo y cadena pesada de anticuerpo, intracuerpos, anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos monovalentes, anticuerpos monocatenarios o Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos camelizados, aficuerpos, Fv ligados a disulfuro (sdFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-anti-Id). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden referirse a poblaciones de anticuerpos policlonales. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden referirse a poblaciones de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY), de cualquier clase (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2) o de cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a o IgG2b) de molécula de inmunoglobulina. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser anticuerpos IgG, o una clase o subclase de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal humano, preferiblemente una inmunoglobulina.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “fragmento de unión a antígeno”, “región de unión a antígeno” y términos similares se refieren a una porción de una molécula de anticuerpo que comprende los residuos de aminoácidos que otorgan a la molécula de anticuerpo su especificidad por el antígeno (por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad (CDR)). La región de unión a antígeno puede derivarse de cualquier especie animal, tal como roedores (por ejemplo, ratón, rata o hámster) y seres humanos. A modo de ejemplo, los fragmentos de unión a antígeno incluyen fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “región variable” o “dominio variable” se usan de manera intercambiable y son habituales en la técnica. La región variable se refiere normalmente a una porción de un anticuerpo, generalmente, una porción de una cadena ligera o pesada, que difiere ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y se usa en la unión y especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. La variabilidad de secuencia se concentra en las regiones denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), mientras que las regiones más conservadas del dominio variable se denominan regiones de entramado (FR). Sin querer restringirse a ningún mecanismo o teoría en particular, se cree que las CDR de las cadenas ligeras y pesadas son las principales responsables de la interacción y la especificidad del anticuerpo con el antígeno. La región variable puede ser una región variable humana. La región variable puede comprender CDR de roedor o murinas y regiones de entramado (FR) humanas. La región variable puede ser una región variable de primate (por ejemplo, primate no humano). La región variable puede comprender CDR de roedor o murinas y regiones de entramado (FR) de primate (por ejemplo, primate no humanos).

Las CDR se definen de diversas maneras en la técnica, incluyendo las definiciones de Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT y a modo de ejemplo. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia y es la más usada para predecir las regiones CDR (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). La definición de Chothia se basa en la localización de las regiones de bucle estructurales (Chothia et al., (1987) J Mol Biol 196: 901-917). La definición de AbM, un compromiso entre las definiciones de Kabat y Chothia, es un conjunto integral de programas para el modelado de estructuras de anticuerpos producido por el Oxford Molecular Group (bioinf.org.uk/abs) (Martin ACR et al., (1989) PNAS 86: 9268 9272). La definición de Contact se basa en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles (bioinf.org.uk/abs) (véase MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 5: 732-745). La definición de Im Gt procede del IMGT (“IMGT®, international ImMunoGeneTics information system®, sitio web imgt.org, fundadora y directora: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Francia). La definición a modo de ejemplo es una combinación de AbM y Kabat (Presta et al., (1997) Cancer Res 57: 4593-4599).

También se proporcionan ácidos nucleicos (polinucleótidos) aislados, tales como ADN complementario (ADNc), que codifican para tales anticuerpos anti-MERTK y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Además, se proporcionan vectores (por ejemplo, vectores de expresión) y células (por ejemplo, células huésped) que comprenden ácidos nucleicos (polinucleótidos) que codifican para tales anticuerpos anti-MERTK o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se proporcionan métodos para fabricar tales anticuerpos. La divulgación también se refiere a métodos para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo. También se proporcionan composiciones relacionadas (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) y kits.

6.1. Anticuerpos

6.1.1. Secuencias y variantes

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento puede comprender la CDR1 de VH del anticuerpo en la tabla 1 o 3 tal como se define según Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o a modo de ejemplo. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento puede comprender la CDR2 de VH del anticuerpo en las tablas 1 ó 3 tal como se define según Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o a modo de ejemplo. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento puede comprender la CDR3 de VH del anticuerpo en las tablas 1 ó 3 tal como se define según Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o a modo de ejemplo. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento puede comprender una, dos o las tres CDR de VH de un anticuerpo en la tabla 1 o 3 (por ejemplo, las CDR de VH en una fila de la tabla 1, por ejemplo, todas las CDR de VH de Kabat para el anticuerpo M6).

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento puede comprender la CDR1 de VL del anticuerpo en la tabla 2o 4 tal como se define según Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o a modo de ejemplo. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento puede comprender la CDR2 de VL del anticuerpo en las tablas 2o 4 tal como se define según Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o a modo de ejemplo. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento puede comprender la CDR3 de VL del anticuerpo en las tablas 2o 4 tal como se define según Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o a modo de ejemplo. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento puede comprender una, dos o las tres CDR de VL de un anticuerpo en la tabla 2o 4 (por ejemplo, las CDR de VL en una fila de la tabla 2, por ejemplo, todas las CDR de VL de Kabat para el anticuerpo M6).

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de CDR de VH del anticuerpo M6

Tabla 2. Secuencias de aminoácidos de CDR de VL del anticuerpo M6

Tabla 3. Secuencias de aminoácidos de CDR de VH del anticuerpo M19

Tabla 4. Secuencias de aminoácidos de CDR de VL del anticuerpo M19

Tabla 5. Secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo M6

Tabla 6. Secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo M19

Tabla 7. Secuencias de ADN de la región variable del anticuerpo M6

Tabla 8. Secuencias de ADN de la región variable del anticuerpo M19

Tabla 9. Secuencias de la proteína MERTK

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, comprende una región variable de cadena pesada (VH) que puede comprender:

(a) una CDR1 de VH de NYGMN (SEQ ID NO: 1); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNY (SEQ ID NO: 2); y/o

(b) una CDR2 de VH de TYTG (SEQ ID NO: 7); y/o

(c) una CDR3 de VH de STVVSRYFD (SEQ ID NO: 12).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPT (SEQ ID NO: 8); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11)

(a) una CDR1 de VH de TNYGMN (SEQ ID NO: 4); y/o

(b) una CDR2 de VH de WMGWINTYTGEPT (SEQ ID NO: 9); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFD (SEQ ID NO: 13).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYG (SEQ ID NO: 5); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTYTGEP (SEQ ID NO: 10); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 14).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11).

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, comprende una región variable de cadena ligera (VL) que puede comprender:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(b) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VL de SQDVGDA (SEQ ID NO: 16); y/o

(b) una CDR2 de VL de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(c) una CDR3 de VL de YRSYPL (SEQ ID NO: 23).

(a) una CDR1 de VL de GDAVTWC (SEQ ID NO: 17); y/o

(b) una CDR2 de VL de LLIYWASTRH (SEQ ID NO: 21); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPL (SEQ ID NO: 24).

(a) una CDR1 de VL de QDVGDA (SEQ ID NO: 18); y/o

(b) una CDR2 de VL que comprende, de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

Un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, comprende una región variable de cadena pesada (VH) que puede comprender:

(a) una CDR1 de VH de DYSMH (SEQ ID NO: 25); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDY (SEQ ID NO: 26); y/o

(b) una CDR2 de VH de TDTG (SEQ ID NO: 31); y/o

(c) una CDR3 de VH de FGAMD (SEQ ID NO: 36).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPT (SEQ ID NO: 32); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35).

(a) una CDR1 de VH de TDYSMH (SEQ ID NO: 28); y/o

(b) una CDR2 de VH de WVGWINTDTGEPT (SEQ ID NO: 33); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMD (SEQ ID NO: 37).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYS (SEQ ID NO: 29); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTDTGEP (SEQ ID NO: 34); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMDY (SEQ ID NO: 38).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35).

Un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, comprende una región variable de cadena ligera (VL) que puede comprender:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39); y/o

(b) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(a) una CDR1 de VL de SQDVTNV (SEQ ID NO: 40); y/o

(b) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(c) una CDR3 de VL de YYRTPR (SEQ ID NO: 47).

(a) una CDR1 de VL de TNVVAWY (SEQ ID NO: 41); y/o

(b) una CDR2 de VL de LLIYSASYRY (SEQ ID NO: 45); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPR (SEQ ID NO: 48).

(a) una CDR1 de VL de QDVTNV (SEQ ID NO: 42); y/o

(b) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una, dos o las tres CDR de VH anteriores. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VH en la tabla 1 o la tabla 3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR2 de VH en la tabla 1 o la tabla 3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR3 de VH en la tabla 1 o la tabla 3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M6 (tabla 1). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M19 (tabla 3).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una, dos o las tres CDR de VL anteriores. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL en la tabla 2 o la tabla 4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR2 de VL en la tabla 2 o la tabla 4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR3 de VL en la tabla 2 o la tabla 4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL del anticuerpo M6 (tabla 2). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL del anticuerpo M19 (tabla 4). Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender:

(a) una CDR1 de VH de NYGMN (SEQ ID NO: 1); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(e) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNY (SEQ ID NO: 2); y/o

(b) una CDR2 de VH de TYTG (SEQ ID NO: 7); y/o

(c) una CDR3 de VH de STVVSRYFD (SEQ ID NO: 12); y/o

(d) una CDR1 de VL de SQDVGDA (SEQ ID NO: 16); y/o

(e) una CDR2 de VL de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(f) una CDR3 de VL de YRSYPL (SEQ ID NO: 23).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPT (SEQ ID NO: 8); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(e) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VH de TNYGMN (SEQ ID NO: 4); y/o

(b) una CDR2 de VH de WMGWINTYTGEPT (SEQ ID NO: 9); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFD (SEQ ID NO: 13); y/o

(d) una CDR1 de VL de GDAVTWC (SEQ ID NO: 17); y/o

(e) una CDR2 de VL de LLIYWASTRH (SEQ ID NO: 21); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPL (SEQ ID NO: 24).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYG (SEQ ID NO: 5); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTYTGEP (SEQ ID NO: 10); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 14); y/o

(d) una CDR1 de VL de QDVGDA (SEQ ID NO: 18); y/o

(e) una CDR2 de VL que comprende, de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(e) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(a) una CDR1 de VH de DYSMH (SEQ ID NO: 25); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39); y/o

(e) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDY (SEQ ID NO: 26); y/o

(b) una CDR2 de VH de TDTG (SEQ ID NO: 31); y/o

(c) una CDR3 de VH de FGAMD (SEQ ID NO: 36); y/o

(d) una CDR1 de VL de SQDVTNV (SEQ ID NO: 40); y/o

(e) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(f) una CDR3 de VL de YYRTPR (SEQ ID NO: 47).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPT (SEQ ID NO: 32); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39); y/o

(e) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(a) una CDR1 de VH de TDYSMH (SEQ ID NO: 28); y/o

(b) una CDR2 de VH de WVGWINTDTGEPT (SEQ ID NO: 33); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMD (SEQ ID NO: 37); y/o

(d) una CDR1 de VL de TNVVAWY (SEQ ID NO: 41); y/o

(e) una CDR2 de VL de LLIYSASYRY (SEQ ID NO: 45); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPR (SEQ ID NO: 48).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYS (SEQ ID NO: 29); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTDTGEP (SEQ ID NO: 34); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMDY (SEQ ID NO: 38); y/o

(d) una CDR1 de VL de QDVTNV (SEQ ID NO: 42); y/o

(e) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35); y/o

(d) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39); y/o

(e) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(f) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o las seis CDR anteriores. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VH en la tabla 1 o la tabla 3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR2 de VH en la tabla 1 o la tabla 3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR3 de VH en la tabla 1 o la tabla 3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL en la tabla 2 o la tabla 4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR2 de VL en la tabla 2 o la tabla 4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR3 de VL en la tabla 2 o la tabla 4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M6 (tabla 1). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M19 (tabla 3). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL del anticuerpo M6 (tabla 2). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL del anticuerpo M19 (tabla 4). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL, una CDR2 de VL, una CDR3 de VL, una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M6 (tablas 1 y 2). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una CDR1 de VL, una CDR2 de VL, una CDR3 de VL, una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de ^{V h}del anticuerpo M19 (tablas 3 y 4).

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en el que

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de DYSMH (SEQ ID NO: 25); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39) y/o;

(b) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43) y/o;

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDY (SEQ ID NO: 26); y/o

(b) una CDR2 de VH de TDTG (SEQ ID NO: 31); y/o

(c) una CDR3 de VH de FGAMD (SEQ ID NO: 36); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de SQDVTNV (SEQ ID NO: 40); y/o

(b) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(c) una CDR3 de VL de YYRTPR (SEQ ID NO: 47).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de NYGMN (SEQ ID NO: 1); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(b) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNY (SEQ ID NO: 2); y/o

(b) una CDR2 de VH de TYTG (SEQ ID NO: 7); y/o

una CDR3 de VH de STVVSRYFD (SEQ ID NO: 12); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de SQDVGDA (SEQ ID NO: 16); y/o

(b) una CDR2 de VL de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(c) una CDR3 de VL de YRSYPL (SEQ ID NO: 23).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPT (SEQ ID NO: 8); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(b) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de TNYGMN (SEQ ID NO: 4); y/o

(b) una CDR2 de VH de WMGWINTYTGEPT (SEQ ID NO: 9); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFD (SEQ ID NO: 13); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de GDAVTWC (SEQ ID NO: 17); y/o

(b) una CDR2 de VL de LLIYWASTRH (SEQ ID NO: 21); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPL (SEQ ID NO: 24).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYG (SEQ ID NO: 5); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTYTGEP (SEQ ID NO: 10); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARKSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 14); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de QDVGDA (SEQ ID NO: 18); y/o

(b) una CDR2 de VL que comprende, de WAS (SEQ ID NO: 20); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 3); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 6); y/o

(c) una CDR3 de VH de KSTVVSRYFDV (SEQ ID NO: 11); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVGDAVT (SEQ ID NO: 15); y/o

(b) una CDR2 de VL de WASTRHT (SEQ ID NO: 19); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYRSYPLT (SEQ ID NO: 22).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPT (SEQ ID NO: 32); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39) y/o;

(b) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de TDYSMH (SEQ ID NO: 28); y/o

(b) una CDR2 de VH de WVGWINTDTGEPT (SEQ ID NO: 33); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMD (SEQ ID NO: 37); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de TNVVAWY (SEQ ID NO: 41); y/o

(b) una CDR2 de VL de LLIYSASYRY (SEQ ID NO: 45); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPR (SEQ ID NO: 48).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYS (SEQ ID NO: 29); y/o

(b) una CDR2 de VH de INTDTGEP (SEQ ID NO: 34); y/o

(c) una CDR3 de VH de ARWFGAMDY (SEQ ID NO: 38); y

(ii) la VL comprende:

una CDR1 de VL de QDVTNV (SEQ ID NO: 42); y/o

(b) una CDR2 de VL de SAS (SEQ ID NO: 44); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

(i) la VH comprende:

(a) una CDR1 de VH de NYTFTDYSMH (SEQ ID NO: 27); y/o

(b) una CDR2 de VH de WINTDTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 30); y/o

(c) una CDR3 de VH de WFGAMDY (SEQ ID NO: 35); y

(ii) la VL comprende:

(a) una CDR1 de VL de KASQDVTNVVA (SEQ ID NO: 39); y/o

(b) una CDR2 de VL de SASYRYT (SEQ ID NO: 43); y/o

(c) una CDR3 de VL de QQYYRTPRT (SEQ ID NO: 46).

La VH puede comprender dos o las tres CDR de VH anteriores y/o la VL comprende dos o las tres CDR de VL anteriores. La VH puede comprender una CDR1 de VH de uno de los anticuerpos en la tabla 1 o la tabla 3. La VH puede comprender una CDR2 de VH de uno de los anticuerpos en la tabla 1 o la tabla 3. La VH puede comprender una CDR3 de VH de uno de los anticuerpos en la tabla 1 o la tabla 3. La VL puede comprender una CDR1 de VL de uno de los anticuerpos en la tabla 2 o la tabla 4. La VL puede comprender una CDR2 de VL de uno de los anticuerpos en la tabla 2 o la tabla 4. La VL puede comprender una CDR3 de VL de uno de los anticuerpos en la tabla 2 o la tabla 4. La VH puede comprender una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M6 (tabla 1). La VH puede comprender una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M19 (tabla 3). La VL puede comprender una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL del anticuerpo M6 (tabla 2). La VL puede comprender una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL de las CDR de VL del anticuerpo M19 (tabla 4). Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una VH y una ^vL, en el que la VH comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M19 (tabla 3) y la VL comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL de las CDR de VL del anticuerpo M19 (tabla 4). Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una VH y una VL, en el que la VH comprende una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH del anticuerpo M6 (tabla 1) y la VL comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una C^dR3 de VL de las CDR de VL del anticuerpo M6 (tabla 2).

Un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 (tabla 5) (por ejemplo, la VH del anticuerpo M6). Un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 (tabla 6) (por ejemplo, la VH del anticuerpo M19).

Un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ Id NO: 50 (tabla 5) (por ejemplo, la VL del anticuerpo M6). Un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I^dNO: 52 (tabla 6) (por ejemplo, la VL del anticuerpo M19).

Un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 (por ejemplo, la VH y VL del anticuerpo M6). Un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 (por ejemplo, la VH y VL del anticuerpo M19).

La divulgación también puede referirse a un anticuerpo descrito en el presente documento por su dominio VH solo, o su dominio VL solo, o por sus tres CDR de VH solas, o sus tres CDR de VL solas. Véase, por ejemplo, Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915, que describen la humanización del anticuerpo de ratón anti-avp3 mediante la identificación de una cadena ligera o una cadena pesada complementaria, respectivamente, a partir de una biblioteca de cadenas ligeras o cadenas pesadas humanas, dando como resultado variantes de anticuerpos humanizados que tienen afinidades tan altas o más altas que la afinidad del anticuerpo original. Véase también, Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628, que describen métodos para producir anticuerpos que se unen a un antígeno específico mediante el uso de un dominio VH (o dominio VL) específico y el cribado de una biblioteca para detectar dominios variables complementarios. Véase también, Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577, que describen métodos para producir anticuerpos que se unen a un antígeno específico mediante el uso de un dominio VH específico y el cribado de una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de VL humanas) para detectar dominios VL complementarios; los dominios VL seleccionados podrían usarse a su vez para guiar la selección de dominios VH complementarios adicionales (por ejemplo, humanos).

La posición de una o más CDR a lo largo de la región VH (por ejemplo, CDR1, CDR2 o CDR3) y/o VL (por ejemplo, CDR1, CDR2 o CDR3) de un anticuerpo descrito en el presente documento puede variar en una, dos, tres, cuatro, cinco o seis posiciones de aminoácidos, siempre que se mantenga la unión inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) (por ejemplo, se mantenga sustancialmente, por ejemplo, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %). La longitud de una o más CDR a lo largo de la región VH (por ejemplo, CDR1, CDR2 o CDR3) y/o VL (por ejemplo, CDR1, CDR2 o CDR3) de un anticuerpo descrito en el presente documento puede variar (por ejemplo, ser más corta o más larga) en uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más aminoácidos, siempre que se mantenga la unión inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) (por ejemplo, se mantenga sustancialmente, por ejemplo, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %). El extremo amino-terminal y/o el extremo carboxilo-terminal de una CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y/o CDR3 de VL descritas en el presente documento pueden extenderse o acortarse en uno, dos, tres, cuatro, cinco o más aminoácidos en comparación con una o más de las CDR descritas en el presente documento, siempre que se mantenga la unión inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) (por ejemplo, se mantenga sustancialmente, por ejemplo, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %). Tal como se usa en el presente documento, los términos “se une de manera inmunoespecífica”, “reconoce de manera inmunoespecífica”, “se une de manera específica” y “reconoce de manera específica” son términos análogos en el contexto de los anticuerpos y se refieren a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a un antígeno (por ejemplo, un epítopo o un inmunocomplejo) a través de los sitios de unión a antígeno tal como entiende un experto en la técnica, y no excluyen la reactividad cruzada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con otros antígenos. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para determinar si se mantiene la unión inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), por ejemplo, los ensayos y las condiciones de unión descritos en el ejemplo 4 y el ejemplo 7 (sección 6) proporcionados en el presente documento, más adelante.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada y/o una cadena ligera de anticuerpo, por ejemplo, una cadena pesada sola, una cadena ligera sola, o tanto una cadena pesada como una cadena ligera. Con respecto a la cadena ligera, la cadena ligera de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede ser una cadena ligera kappa. La cadena ligera de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede ser una cadena ligera lambda. La cadena ligera de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede ser una cadena ligera kappa humana o una cadena ligera lambda humana.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena ligera, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera comprende una CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de VL del anticuerpo M6 o del anticuerpo M19 (es decir, las enumeradas en la tabla 2 y la tabla 4) y en el que la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena ligera, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52 y en el que la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa. Tal como se usa en el presente documento, los términos “región constante” o “dominio constante” son intercambiables y tienen su significado habitual en la técnica. La región constante es una porción del anticuerpo, por ejemplo, una porción carboxilo-terminal de una cadena ligera y/o pesada que no está directamente implicada en la unión de un anticuerpo al antígeno, pero que puede presentar diversas funciones efectoras, tales como la interacción con el receptor de Fc. La región constante de una molécula de inmunoglobulina suele tener una secuencia de aminoácidos más conservada que el dominio variable de la inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede agonizar la señalización de MERTK.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena ligera, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera comprende una CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de VL del anticuerpo M6 o del anticuerpo M19 (es decir, las enumeradas en la tabla 2 y la tabla 4) y en el que la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera lambda. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena ligera, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52 y en el que la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera lambda. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede agonizar la señalización de MERTK.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena ligera, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera comprende una CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de VL del anticuerpo M6 o del anticuerpo M19 (es decir, las enumeradas en la tabla 2 y la tabla 4) y en el que la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa o lambda humana. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena ligera, en el que el aminoácido de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52 y en el que la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa o lambda humana. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede agonizar la señalización de MERTK. Se han descrito en la técnica ejemplos no limitativos de secuencias regiones constantes humanas, por ejemplo, véase Kabat EA et al., (1991).

Con respecto a la cadena pesada, la cadena pesada de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede ser una cadena pesada alfa (a), delta (8), épsilon (e), gamma (y) o mu (|i). En otra realización específica, la cadena pesada de un anticuerpo descrito puede comprender una cadena pesada alfa (a), delta (8), épsilon (e), gamma (y) o mu (|i) humana.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena pesada, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada comprende una CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de VH del anticuerpo M6 o del anticuerpo M19 (es decir, las enumeradas en la tabla 1 y la tabla 3) y en el que la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada gamma (y) humana. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena pesada, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51 y en el que la región constante de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada gamma (y) humana. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede agonizar la señalización de MERTK.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena pesada, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada comprende una CDR1 de VH, CDR2 de Vh y CDR3 de VH que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de VH del anticuerpo M6 o del anticuerpo M19 (es decir, las enumeradas en la tabla 1 y la tabla 3) y en el que la región constante de cadena pesada comprende el aminoácido de una cadena pesada humana descrita en el presente documento o conocida en la técnica. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una cadena pesada, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51 y en el que la región constante de cadena pesada comprende el aminoácido de una cadena pesada humana descrita en el presente documento o conocida en la técnica. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede agonizar la señalización de MERTK. Se han descrito en la técnica ejemplos no limitativos de secuencias de regiones constantes humanas, por ejemplo, véase Kabat EA et al., (1991) anteriormente.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) que comprenden cualquier secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento y en el que las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de una molécula de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY o una molécula de inmunoglobulina humana IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede comprender una VH y una VL que comprenden cualquier secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento y en el que las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de una molécula de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY, de cualquier clase (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o de cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de inmunoglobulina. En una realización particular, las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de una molécula de inmunoglobulina humana IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY, de cualquier clase (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o de cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de inmunoglobulina.

Pueden introducirse una, dos o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos) en la región Fc de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo.

Pueden introducirse una, dos o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos) en la región Fc de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento (por ejemplo, el dominio CH2 (residuos 231-340 de IgG1 humana) y/o el dominio CH3 (residuos 341-447 de IgG1 humana) y/o la región bisagra, con numeración según el sistema de numeración de Kabat (por ejemplo, el índice EU de Kabat)) para aumentar o disminuir la afinidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo por un receptor de Fc (por ejemplo, un receptor de Fc activado) en la superficie de una célula efectora. Un experto en la técnica conocer las mutaciones en la región Fc de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que disminuyen o aumentan la afinidad de un anticuerpo por un receptor de Fc y las técnicas para introducir tales mutaciones en el receptor de Fc o fragmento del mismo. Ejemplos de mutaciones en el receptor de Fc de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que pueden efectuarse para alterar la afinidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo por un receptor de Fc se describen en, por ejemplo, Smith P et al., (2012) PNAS 109: 6181-6186, la patente estadounidense n.° 6.737.056 y las publicaciones internacionales n.osWO 02/060919; WO 98/23289; y WO 97/34631.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una región constante glicosilada. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una región constante no glicosilada. Se ha notificado que los anticuerpos con un contenido reducido de fucosa tienen una afinidad aumentada por los receptores de Fc, tales como, por ejemplo, FcyRIIIa. Por consiguiente, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento pueden tener un contenido reducido de fucosa o no contener fucosa. Tales anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden producirse usando técnicas conocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden expresarse en células deficientes o carentes de la capacidad de fucosilación. En un ejemplo específico, pueden usarse líneas celulares con una supresión de ambos alelos de la a 1 ,6-fucosiltransferasa para producir anticuerpos con un contenido reducido de fucosa. El sistema Potelligent® (Lonza) es un ejemplo de un sistema de este tipo que puede usarse para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos con un contenido reducido de fucosa. Alternativamente, pueden producirse anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno con un contenido reducido de fucosa o sin contener fucosa, por ejemplo, mediante: (i) cultivo de células en condiciones que impidan o reduzcan la fucosilación; (ii) retirada postraduccional de fucosa (por ejemplo, con una enzima fucosidasa); (iii) adición postraduccional del hidrato de carbono deseado, por ejemplo, después de la expresión recombinante de una glicoproteína no glicosilada; o (iv) purificación de la glicoproteína para seleccionar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que no estén fucsoilados. Véase, por ejemplo, Longmore GD & Schachter H (1982) Carbohydr Res 100: 365-92 e Imai-Nishiya H et al., (2007) BMC Biotechnol. 7: 84 para los métodos para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos sin contener fucosa o con un contenido reducido de fucosa.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una cadena pesada y/o una cadena ligera, en el que (i) la cadena pesada comprende (a) una región variable que comprende una CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH que tiene las secuencias de aminoácidos de las CDR de VH del anticuerpo M6 o del anticuerpo M19 (es decir, las enumeradas en la tabla 1 y la tabla 3) y (b) comprende un dominio constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una cadena pesada de IgG humana; y/o (ii) la cadena ligera comprende (a) una región variable que comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL que tiene las secuencias de aminoácidos de las CDR de VL del anticuerpo M6 o del anticuerpo M19 (es decir, las enumeradas en la tabla 2 y la tabla 4) y (b) un dominio constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una IgG humana.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una cadena pesada y/o una cadena ligera, en el que (i) la cadena pesada comprende (a) una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51 y (b) un dominio constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una IgG humana; y/o (ii) la cadena ligera comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52 (b) un dominio constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una cadena ligera kappa humana.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias (por ejemplo, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácido nucleico) también puede llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. Un ejemplo específico y no limitativo de un algoritmo matemático usado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268, modificado como en Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877. Un algoritmo de este tipo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul SF et al., (1990) J Mol Biol 215: 403. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST pueden realizarse con los parámetros del programa de nucleótidos NBLAST establecidos, por ejemplo, para puntuación=100, longitud de palabra=12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Las búsquedas de proteínas con BLAST pueden realizarse con los parámetros del programa XBLAST establecidos, por ejemplo, para una puntuación de 50, longitud de palabra=3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína descrita en el presente documento. Para obtener alineaciones discontinuas con fines de comparación, puede usarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul SF et al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402. Alternativamente, puede usarse PSI BLAST para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se usan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, de XBLAST y NBLAST) (véase, por ejemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI) en Internet, ncbi.nlm.nih.gov). Otro ejemplo específico y no limitativo de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Un algoritmo de este tipo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se usa el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, normalmente sólo se cuentan las coincidencias exactas.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una VH que tenga al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la VH de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender un dominio VH que tenga al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la VH de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende CDR (por ejemplo, CDR de VH y/o CDR de VL) que son idénticas a las CDR (por ejemplo, CDR de VH y/o CDR de VL) expuestas en las tablas 1 a 4.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una VL que tenga al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la VL de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender una VL que tenga al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la VL de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende CDR (por ejemplo, CDR de VH y/o CDR de VL) que son idénticas a las CDR (por ejemplo, CDR de VH y/o CDR de VL) expuestas en las tablas 1 a 4.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender: (i) un dominio VH que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio VH de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51; y (ii) un dominio VL que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio VL de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede comprender (i) un dominio VH que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio VH de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51; y (ii) un dominio VL que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio VL de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende CDR (por ejemplo, CDR de VH y/o CDR de VL) que son idénticas a las CDR (por ejemplo, CDR de VH y/o CDR de VL) expuestas en las tablas 1 a 4.

La divulgación también proporciona en el presente documento anticuerpos que se unen al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto de MERTK (por ejemplo, un epítopo de MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) como un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo M6 o M19). Tal como se usa en el presente documento, un “epítopo” es un término de la técnica y se refiere a una región localizada de un antígeno a la que un anticuerpo puede unirse específicamente. Un epítopo puede ser, por ejemplo, aminoácidos contiguos de un polipéptido (epítopo lineal o contiguo) o un epítopo puede proceder, por ejemplo, de dos o más regiones no contiguas de un polipéptido o polipéptidos (epítopo conformacional, no lineal, discontinuo o no contiguo). El epítopo de un anticuerpo puede determinarse, por ejemplo, mediante espectroscopia de RMN, estudios de cristalografía por difracción de rayos X, ensayos ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio acoplado a espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas MALDI), ensayos de barrido de oligopéptidos basados en matrices y/o mapeo de mutagénesis (por ejemplo, mapeo de mutagénesis dirigida al sitio). Para la cristalografía de rayos X, la cristalización puede realizarse usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Los cristales de anticuerpo:antígeno pueden estudiarse usando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y pueden refinarse usando un software informático tal como X-PLOR (Universidad de Yale, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véase, por ejemplo, Meth Enzymol (1985) volúmenes 114 y 115, ed. Wyckoff hW et al.; solicitud de patente estadounidense n.° 2004/0014194) y BUSt Er (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed. Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Los estudios de mapeo de mutagénesis pueden realizarse usando cualquier método conocido por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Champe M et al., (1995) y Cunningham BC & Wells JA (1989) para una descripción de las técnicas de mutagénesis, incluyendo las técnicas de mutagénesis de exploración con alanina. Además, los anticuerpos que reconocen y se unen al mismo epítopo o a epítopos superpuestos de MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) pueden identificarse usando técnicas de rutina tales como un inmunoensayo, por ejemplo, mostrando la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. Los ensayos de unión competitiva también pueden usarse para determinar si dos anticuerpos tienen una especificidad de unión similar para un epítopo. La unión competitiva puede determinarse en un ensayo en el que la inmunoglobulina en estudio inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como MERTK. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo competitivo en sándwich (véase Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242-253); EIA con biotina-avidina directo en fase sólida (véase Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3614-9); ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo en sándwich marcado directo en fase sólida (véase Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcador directo en fase sólida usando la etiqueta I-125 (véase Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15); EIA con biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung RC et al., (1990) Virology 176: 546-52); y RIA marcado directo (Moldenhauer G et al., (1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Normalmente, un ensayo de este tipo implica el uso de antígeno purificado (por ejemplo, MERTK tal como MERTK humana) unido a una superficie sólida o a células que portan cualquiera de estas, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva puede medirse determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Normalmente, la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Normalmente, cuando un anticuerpo competitivo está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos el 50-55 %, el 55-60 %, el 60-65 %, el 65-70 %, el 70-75 % o más. Un ensayo de unión competitiva puede configurarse en un gran número de formatos diferentes usando antígeno marcado o anticuerpo marcado. En una versión habitual de este ensayo, el antígeno se inmoviliza en una placa de 96 pocillos. La capacidad de los anticuerpos no marcados para bloquear la unión de los anticuerpos marcados al antígeno se mide entonces usando marcadores radiactivos o enzimáticos. Para más detalles, véase, por ejemplo, Wagener C et al., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M et al., (1992) Hybridoma 11: 391-407 y Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D editores anteriormente, págs. 386-389.

La divulgación también se refiere a ensayos de unión competitiva que pueden usarse para determinar si un anticuerpo se bloquea de manera competitiva, por ejemplo, de manera dependiente de la dosis, por otro anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo, o a epítopos superpuestos, como anticuerpo de referencia, cuando los dos anticuerpos reconocen epítopos idénticos o estéricamente superpuestos en ensayos de unión competitiva, tales como ensayos ELISA competitivos, que pueden configurarse en todo número de formatos diferentes, usando antígeno marcado o anticuerpo marcado. En una realización particular, un anticuerpo puede someterse a prueba en ensayos de unión competitiva con un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, el anticuerpo M6 o M19).

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo que compite (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) por la unión a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) con un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, M6 o M19) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, tal como se determina usando ensayos conocidos por un experto en la técnica o descritos en el presente documento (por ejemplo, ensayos competitivos ELISA o resonancia de plasmón superficial). La divulgación también proporciona en el presente documento anticuerpos que inhiben de manera competitiva (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, ^m6 o M19) de la unión a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), tal como se determina usando ensayos conocidos por un experto en la técnica o descritos en el presente documento (por ejemplo, ensayos competitivos ELISA, o matriz de suspensión o resonancia de plasmón superficial).

Se proporciona en el presente documento un anticuerpo que puede competir con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) en la misma medida que el anticuerpo descrito en el presente documento autocompite por unirse a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón). Se proporciona en el presente documento un primer anticuerpo que compite con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), en el que la competencia puede mostrarse como una reducción de la unión del primer anticuerpo a MERTK en más del 80 % (por ejemplo, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 98 %, o entre el 80 % y el 85 %, entre el 80 % y el 90 %, entre el 85 % y el 90 % o entre el 85 % y el 95 %).

La divulgación también proporciona un anticuerpo que compite (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) por la unión específica a Me Rt K (por ejemplo, Me Rt K humana, o MERTK tanto humana como de ratón) con un anticuerpo que puede comprender un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51 y un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52.

La divulgación también proporciona en el presente documento un anticuerpo que compite (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) por la unión específica a MERTK (por ejemplo, MERT^khumana, o MERTK tanto humana como de ratón) con un anticuerpo que puede comprender (i) un dominio VH que comprende una CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH que tiene las secuencias de aminoácidos de las CDR de un anticuerpo enumerado en la tabla 1 o la tabla 3; y (ii) un dominio VL que comprende una CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL que tiene las secuencias de aminoácidos de las CDR de VL de un anticuerpo enumerado en la tabla 2 o la tabla 4.

Se proporciona en el presente documento un anticuerpo que compite (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) por la unión específica a MERTK (por ejemplo, MERTk humana, o MERTK tanto humana como de ratón) con un anticuerpo que puede comprender las CDR de VH y VL del anticuerpo M6 (tabla 1 y tabla 2).

Se proporciona en el presente documento un anticuerpo que compite (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) por la unión específica a MERTK (por ejemplo, MERT^khumana, o MERTK tanto humana como de ratón) con un anticuerpo que puede comprender las CDR de VH y VL del anticuerpo M19 (tabla 3 y tabla 4).

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento se une de manera inmunoespecífica al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto del anticuerpo que puede comprender (i) un dominio VH que comprende una CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH que tienen las secuencias de aminoácidos de las c Dr del anticuerpo enumeradas en la tabla 1 o la tabla 3, y (ii) un dominio VL que comprende una CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR del anticuerpo enumeradas en la tabla 2 o la tabla 4.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento se une de manera inmunoespecífica al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto del anticuerpo M6, que puede comprender un dominio VH con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y un dominio VL con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento se une de manera inmunoespecífica al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto del anticuerpo M19, que puede comprender un dominio VH con una secuencia de aminoácidos de SEQ ⁱD NO: 51 y un dominio VL con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. Para determinar si dos anticuerpos se unen al mismo epítopo pueden usarse ensayos conocidos por un experto en la técnica o descritos en el presente documento (por ejemplo, cristalografía de rayos X, ensayos ELISA, etc.).

La afinidad puede medirse y/o expresarse de varias maneras conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse а, la constante de disociación de equilibrio (Kd) y la constante de asociación de equilibrio (Ka). La Kd puede determinarse mediante técnicas conocidas por un experto en la técnica, tales como la interferometría de biocapa. La K^dpuede determinarse tal como se expone en el ejemplo 4 o en el ejemplo 7 de la sección 6, más adelante.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK o un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto de un anticuerpo descrito en el presente documento puede unirse a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) con una Kd de menos de 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4,5 nM, 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM, 0,75 nM, 0,5 nM, 0,25 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,025 nM, 0,01 nM o 0,005 nM. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK o un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto de un anticuerpo descrito en el presente documento puede unirse a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) con una K^dde aproximadamente 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4,5 nM, 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM, 0,75 nM, 0,5 nM, 0,25 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,025 nM, 0,01 nM o 0,005 nM. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK o un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que puede unirse al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto de un anticuerpo descrito en el presente documento se une a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o m ErTK tanto humana como de ratón) con una Kd de aproximadamente 3 pM a 400 pM. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede unirse a ME^rT^k(por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) con una Kd de aproximadamente 0,3 nM. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede unirse a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) con una K^dde aproximadamente 4,6 pM. Tal como se usa en el presente documento, los términos “aproximadamente”, cuando se usan para modificar un valor numérico o un intervalo numérico, indican que las desviaciones del 5 % al 10 % por encima y del 5 % al 10 % por debajo del valor o intervalo permanecen dentro del significado previsto del valor o intervalo recitado.

El epítopo de un anticuerpo descrito en el presente documento puede usarse como inmunógeno para producir anticuerpos. Véase, por ejemplo, la sección 5.2 más adelante para los métodos para producir anticuerpos.

б. 1.2. Características funcionales

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, aumenta la actividad de MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) en células endoteliales al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o 100 veces. La actividad de MERTK puede evaluarse mediante los métodos descritos en el presente documento o conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, midiendo la cantidad de fosforilación de MERTK. El aumento de la actividad de MERTK, medido por un aumento de la fosforilación de MERTK, puede ser de al menos 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o 30 veces, en relación con la actividad de MERTK (por ejemplo, actividad de MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) en células endoteliales sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une de manera inmunoespecífica a MERTK). El aumento de la actividad de MERTK puede ser de al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 %. El aumento de la actividad de MERTK puede evaluarse tal como se describe en el ejemplo 3, más adelante.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede competir con Gas-6 (por ejemplo, Gas-6 humana) por la unión a MERTK. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede inhibir (por ejemplo, inhibe completamente o inhibe sólo parcialmente) la unión de Gas-6 a MERTK (por ejemplo, MER^tK humana, o MERTK tanto humana como de ratón). Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o m ErTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede inhibir la unión de Gas-6 (por ejemplo, Gas-6 humana o de ratón) a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) en células endoteliales en más del 85 %, el 80 %, el 75 %, el 70 %, el 65 %, el 60 %, el 55 %, el 50 %, el 45 %, el 40 %, el 35 %, el 30 %, el 25 %, el 20 % o el 10 %, tal como se evalúa mediante un ensayo conocido por un experto en la técnica o descrito en el presente documento. El ensayo que se usa para evaluar la inhibición de la unión de Gas-6 (por ejemplo, Gas-6 humana) a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) en presencia de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede ser un ELISA de captura de anticuerpos tal como se describe en el ejemplo 1, más adelante.

El nivel de fosforilación de MERTK en células endoteliales puede medirse mediante inmunotransferencia de tipo Western específica de fosfo-MERTK tal como se describe en el ejemplo 3, más adelante.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que fomenta (es decir, aumenta) el nivel de fosforilación de MERTK en células endoteliales, puede no fomentar (es decir, aumentar) la fosforilación de MERTK en células cancerosas (por ejemplo, células de cáncer de mama) in vitro. El nivel de fosforilación de MERTK en células cancerosas puede medirse mediante inmunotransferencia de tipo Western específica de fosfo-MERTK tal como se describe en el ejemplo 3, más adelante.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede inhibir la migración de células endoteliales que expresan MERTK in vitro en presencia de células cancerosas (por ejemplo, células de cáncer de mama). La migración de células endoteliales puede inhibirse en al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 50 % o el 60 %, tal como se evalúa mediante los métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por un experto en la técnica. La migración de células endoteliales puede inhibirse en al menos el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 % o el 60 %, tal como se evalúa mediante los métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por un experto en la técnica. El grado de migración puede evaluarse mediante los métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por un experto en la técnica. La inhibición puede ser relativa al grado de migración de las células endoteliales que expresan MERTK sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une de manera inmunoespecífica a MERTK). El ensayo que se usa para evaluar la migración de células endoteliales puede ser un ensayo de migración Transwell tal como se describe en el ejemplo 2, más adelante.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede no inhibir la migración de la línea celular de glioblastoma multiforme A172 en un ensayo de migración Transwell in vitro en ausencia de células endoteliales.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede inhibir la angiogénesis dentro de los tumores. La inhibición de la angiogénesis puede ser de al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 55, el 60 %, el 65 %, el 70 % o el 75 %. La inhibición de la angiogénesis puede ser de al menos el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 % o el 70 %. La inhibición de la angiogénesis puede evaluarse mediante los métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por un experto en la técnica. La inhibición puede ser relativa al nivel de angiogénesis sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une de manera inmunoespecífica a MERTK). El ensayo que se usa para evaluar la angiogénesis in vivo puede ser tal como se describe en el ejemplo 6, más adelante.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, puede inhibir la progresión tumoral (por ejemplo, tumor de cáncer de mama humano). La inhibición de la progresión tumoral puede ser de al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 % y el 80 %. La progresión tumoral puede evaluarse mediante los métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por un experto en la técnica. La progresión tumoral puede ser relativa al estado del cáncer sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une de manera inmunoespecífica a MERTK). El ensayo que se usa para evaluar la progresión tumoral puede ser un modelo de trasplante tumoral murino tal como se describe en los ejemplos 5 y 8, más adelante.

6.2. Producción de anticuerpos

6.2.1. Producción y cribado de anticuerpos

En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento métodos para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agonizan la señalización de MERTK en células endoteliales.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante técnicas de expresión recombinante. Los métodos descritos en el presente documento emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, análisis genético, ADN recombinante, química orgánica, bioquímica, PCR, síntesis y modificación de oligonucleótidos, hibridación de ácidos nucleicos y campos relacionados dentro de la técnica. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en las referencias citadas en el presente documento y se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales); Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Un anticuerpo descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo recombinante) preparado, expresado, creado o aislado mediante cualquier medio que implique la creación, por ejemplo, a través de síntesis, ingeniería genética de secuencias de ADN. Tal anticuerpo puede comprender secuencias codificadas por secuencias de ADN que no existen de manera natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos de un animal o mamífero (por ejemplo, ser humano) in vivo. Un anticuerpo descrito en el presente documento puede fabricarse mediante un método que comprende el uso de MERTK humana (SEQ ID NO: 57) o el dominio extracelular de la misma (SEQ ID NO: 58) como inmunógeno.

La divulgación se refiere a un método para fabricar un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, que comprende cultivar una célula o célula huésped descrita en el presente documento. La divulgación se refiere a un método para fabricar un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, que comprende expresar (por ejemplo, expresar de manera recombinante) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo usando una célula o célula huésped descrita en el presente documento (por ejemplo, una célula o célula huésped que comprende polinucleótidos que codifican para un anticuerpo descrito en el presente documento). La célula puede ser una célula aislada. Los polinucleótidos exógenos pueden haberse introducido en la célula. El método puede comprender además la etapa de purificar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo obtenido a partir de la célula o célula huésped.

Los métodos para producir anticuerpos policlonales se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, el capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a ed., Ausubel FM et al., eds., John Wiley and Sons, Nueva York).

El término “anticuerpo monoclonal”, tal como se usa en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de visualización de fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse de manera recombinante a partir de células huésped que expresen de manera exógena un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento del mismo, por ejemplo, una cadena ligera y/o una cadena pesada de tal anticuerpo. Los métodos para la preparación de líneas celulares clonales y de anticuerpos monoclonales expresados por las mismas se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, el capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a ed., Ausubel FM et al., anteriormente). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridoma, incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling GJ et al.: Monoclonal Antibodies and T-Cel1Hybridomas 563681 (Elsevier, N.Y., 1981); y Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495. Los métodos de producción y cribado de anticuerpos específicos mediante la tecnología de hibridomas son rutinarios y se conocen bien en la técnica. Los ratones (u otros animales, tales como ratas, monos, burros, cerdos, ovejas, hámster o perros) pueden inmunizarse con un antígeno (por ejemplo, MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón)) y, una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero de ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponible en la Colección American de Cultivos Tipo (ATCC®) (Manassas, VA), para formar hibridomas. Los hibridomas se seleccionan y se clonan mediante dilución limitada.

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se somete a ensayo para detectar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón). Una vez identificadas las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse, hacerse crecer y separarse del medio de cultivo mediante métodos convencionales (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, anteriormente). La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

Se dan a conocer en el presente documento anticuerpos monoclonales que pueden producirse por una sola célula (por ejemplo, célula de hibridoma o huésped que produce un anticuerpo recombinante), en los que el anticuerpo se une de manera inmunoespecífica a MERT^k(por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), tal como se determina, por ejemplo, mediante ELISA u otro ensayo de unión a antígeno o de unión competitiva conocido en la técnica o tal como se describe en el ejemplo 1 proporcionado en el presente documento. Un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo monovalente o multivalente (por ejemplo, bivalente). Un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo monoespecífico o multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico).

Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen fragmentos de anticuerpo que reconocen MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y pueden generarse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 descritos en el presente documento pueden producirse mediante escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Un fragmento Fab corresponde a uno de los dos brazos idénticos de una molécula de anticuerpo y contiene la cadena ligera completa emparejada con los dominios VH y CH1 de la cadena pesada. Un fragmento F(ab')2 contiene los dos brazos de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo unidos por enlaces disulfuro en la región bisagra.

Además, los anticuerpos descritos en el presente documento o fragmentos de unión a antígeno de los mismos también pueden generarse usando diversos métodos de visualización de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de visualización de fagos, los dominios funcionales de los anticuerpos se muestran en la superficie de partículas de fagos que portan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. En particular, las secuencias de ADN que codifican para los dominios VH y VL se amplifican a partir de bibliotecas de ADNc animales (por ejemplo, bibliotecas de ADNc humanas o murinas de tejidos afectados). El ADN que codifica para los dominios VH y VL se recombina junto con un ligador de scFv mediante PCR y se clona en un vector fagémido. El vector se somete a electroporación en E. coli y la E. coli se infecta con fagos cooperadores. Los fagos usados en estos métodos suelen ser fagos filamentosos, incluyendo fd y M13, y los dominios VH y VL se fusionan normalmente de manera recombinante con o bien el gen III o bien el gen VIII del fago. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno particular puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o perla. Los ejemplos de métodos de visualización de fagos que pueden usarse para fabricar los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen los dados a conocer en Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al., (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al, (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; solicitud PCT n.° PCT/GB91/001134; publicaciones internacionales n.os WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 y WO 97/13844; y patentes estadounidenses n.os 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743 y 5.969.108.

Tal como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levadura y bacterias, por ejemplo, tal como se describe a continuación. También pueden emplearse técnicas para producir de manera recombinante fragmentos de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2, usando métodos conocidos en la técnica tales como los dados a conocer en la publicación PCT n.° WO 92/22324; Mullinax RL et al., (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H et al., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; y Better M et al., (1988) Science 240: 1041-1043.

Para generar anticuerpos completos, pueden usarse cebadores de PCR que incluyan secuencias de nucleótidos de VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias de VH o VL a partir de un molde, por ejemplo, clones de scFv. Usando técnicas de clonación conocidas por los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresen una región constante de VH y los dominios VL amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresen una región constante de VL, por ejemplo, regiones constantes kappa o lambda humanas. Los dominios VH y Vl también pueden clonarse en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de la cadena pesada y los vectores de conversión de la cadena ligera se transfectan conjuntamente en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresen anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede contener una región variable de un anticuerpo monoclonal de ratón o rata fusionada con una región constante de un anticuerpo humano. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD et al., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; y las patentes estadounidenses n.os 5.807.715, 4.816.567, 4.816.397 y 6.331.415.

Un anticuerpo humanizado puede unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región de entramado que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y CDR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, una inmunoglobulina murina). Un anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. Un anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y de cualquier isotipo, incluyendo IgG-i, IgG2, IgG3 e IgG4. Los anticuerpos humanizados pueden producirse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, injerto de CDR (patente europea n.° EP 239400; publicación internacional n.° WO 91/09967; y patentes estadounidenses n.os 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), remodelación o rechapado (patentes europeas n.os EP 592106 y EP 519596; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka GM et al., (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; y Roguska MA et al., (1994) PNAS 91: 969 973), intercambio de cadenas (patente estadounidense n.° 5.565.332) y las técnicas dadas a conocer en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.407.213, la patente estadounidense n.° 5.766.886, la publicación internacional n.° WO 93/17105; Tan P et al., (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas C et al., (2000) Protein Eng.

13(5): 353-60; Morea V et al., (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M et al., (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA et al., (1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR et al., (1995) Cancer Res. 55 (23 supl.): 5973s-5977s; Couto JR et al., (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10 y Pedersen JT et al., (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73. Véase también la publicación de solicitud estadounidense n.° US 2005/0042664 A1 (24 de febrero de 2005).

Se han descrito métodos para fabricar anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos); véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 7.951.917; 7.183.076; 8.227.577; 5.837.242; 5.989.830; 5.869.620; 6.132.992 y 8.586.713.

Los anticuerpos de dominio único, por ejemplo, los anticuerpos que carecen de las cadenas ligeras, pueden producirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Véase Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; la patente estadounidense n.° 6.005.079; y las publicaciones internacionales n.osWO 94/04678, WO 94/25591 y WO 01/44301.

Además, los anticuerpos que se unen de manera inmunoespecífica a un antígeno de MERTK pueden, a su vez, usarse para generar anticuerpos antiidiotipo que “imitan” a un antígeno usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Greenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444; y Nissinoff A (1991) J Immunol 147(8): 2429-2438).

Un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto de MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) como un anticuerpo agonista contra MERTK descrito en el presente documento, puede ser un anticuerpo anti-MERTK humano o fragmento de unión a antígeno del mismo. Un anticuerpo descrito en el presente documento, que bloquea de manera competitiva (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) uno cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, M6 o M19) de la unión a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón), puede ser un anticuerpo anti-MERTK humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse ratones transgénicos que no pueden expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. En particular, los complejos génicos de inmunoglobulina de las cadenas pesada y ligera humanas pueden introducirse al azar o por recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable, la región constante y la región de diversidad humanas pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón además de los genes de las cadenas pesada y ligera humanas. Los genes de inmunoglobulina de las cadenas pesada y ligera de ratón pueden dejar de ser funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de los loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica de la región Jh impide la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se cruzan para producir una descendencia homocigótica que exprese anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, toda o una porción de un antígeno (por ejemplo, MERTK). Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse a partir de ratones transgénicos inmunizados usando la tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de las inmunoglobulinas humanas que albergan los ratones transgénicos se reorganizan durante la diferenciación de células B y, posteriormente, sufren un cambio de clase y una mutación somática. Por tanto, usando una técnica de este tipo, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase, por ejemplo, Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93. Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véase, por ejemplo, las publicaciones internacionales n.os WO 98/24893, W^o96/34096 y W^o96/33735; y las patentes estadounidenses n.os 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318 y 5.939.598. Los ejemplos de ratones que pueden producir anticuerpos humanos incluyen el Xenomouse™ (Abgenix, Inc.; patentes estadounidenses n.os 6.075.181 y 6.150.184), el HuAb-Mouse™ (Mederex, Inc./Gen Pharm; patentes estadounidenses n.os 5.545.806 y 5.569, 825), el Trans Chromo Mouse™ (Kirin) y el KM Mouse™ (Medarex/Kirin). Los anticuerpos humanos que se unen específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) pueden fabricarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de visualización de fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véase también las patentes estadounidenses n.os 4.444.887, 4.716.111 y 5.885.793; y las publicaciones internacionales n.osWO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741.

Los anticuerpos humanos pueden producirse usando hibridomas de ratón-ser humano. Por ejemplo, los linfocitos de sangre periférica humanos transformados con el virus de Epstein-Barr (VEB) pueden fusionarse con células de mieloma de ratón para producir hibridomas de ratón-ser humano que secreten anticuerpos monoclonales humanos, y estos hibridomas de ratón-ser humano pueden examinarse para determinar los que secretan anticuerpos monoclonales humanos que se unen de manera inmunoespecífica a un antígeno diana (por ejemplo, MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón)). Tales métodos se conocen y se describen en la técnica, véase, por ejemplo, Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31.

Los métodos para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agonizan la señalización de MERTK en células endoteliales son tal como se describe en el ejemplo 1, más adelante.

Los métodos de cribado y selección de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agonizan la señalización de MERTK en células endoteliales pueden describirse en el ejemplo 1, más adelante.

Una vez que se ha producido un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la proteína A, y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede aislarse o purificarse. Generalmente, un anticuerpo aislado es uno que está sustancialmente libre de otros anticuerpos con diferentes especificidades antigénicas que el anticuerpo aislado. Por ejemplo, una preparación de un anticuerpo descrito en el presente documento puede estar sustancialmente libre de material celular y/o precursores químicos. La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de un anticuerpo en las que el anticuerpo está separado de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de manera recombinante. Por tanto, un anticuerpo que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de anticuerpo que tienen menos de aproximadamente el 30 %, el 20 %, el 10 %, el 5 %, el 2 %, el 1 %, el 0,5 % o el 0,1 % (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominada en el presente documento “proteína contaminante”) y/o variantes de un anticuerpo, por ejemplo, diferentes formas modificadas postraduccionales de un anticuerpo u otras versiones diferentes de un anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo). Cuando el anticuerpo se produce de manera recombinante, también suele estar sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 %, el 10 %, el 2 %, el 1 %, el 0,5 % o el 0,1 % del volumen de la preparación proteica. Cuando el anticuerpo se produce mediante síntesis química, suele estar sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas, es decir, está separado de los precursores químicos u otras sustancias químicas que intervienen en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, tales preparaciones del anticuerpo tienen menos de aproximadamente el 30 %, el 20 %, el 10 % o el 5 % (en peso seco) de precursores o compuestos químicos distintos del anticuerpo de interés. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden aislarse o purificarse.

6.2.2. Polinucleótidos

La divulgación se refiere a polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada) que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno de MERTK (por ejemplo, MERTK humano, o MERT^ktanto humano como de ratón) y vectores, por ejemplo, vectores que comprenden tales polinucleótidos para su expresión eficiente en células huésped (por ejemplo, células de E. coli y de mamífero). Un polinucleótido puede aislarse o purificarse.

Tal como se usa en el presente documento, una molécula de polinucleótido o de ácido nucleico “aislada” es aquella que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural (por ejemplo, en un ratón o un ser humano) de la molécula de ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico “aislada”, tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o del medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Por ejemplo, la expresión “sustancialmente libre” incluye preparaciones de una molécula de polinucleótido o de ácido nucleico que tienen menos de aproximadamente el 15 %, el 10 %, el 5 %, el 2 %, el 1 %, el 0,5 % o el 0,1 % de otro material, por ejemplo, material celular, medio de cultivo, otras moléculas de ácido nucleico, precursores químicos y/u otras sustancias químicas.

La divulgación se refiere a polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen de manera inmunoespecífica a un polipéptido de MERTK (por ejemplo, MERTK humana) y comprenden una secuencia de aminoácidos tal como se describe en el presente documento, así como a anticuerpos que compiten con tales anticuerpos por la unión a un polipéptido de MERTK (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis), o que se unen al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto que el de tales anticuerpos.

La divulgación se refiere a polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo descrito en el presente documento. Los polinucleótidos pueden comprender secuencias de nucleótidos que codifican para una cadena pesada que comprende las CDR de VH descritas en el presente documento (véase, por ejemplo, las tablas 1 y 3). Los polinucleótidos pueden comprender secuencias de nucleótidos que codifican para una cadena ligera que comprende las CDR de VL descritas en el presente documento (véase, por ejemplo, las tablas 2 y 4).

Se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo agonista contra MERTK que puede comprender tres CDR de cadena VH, por ejemplo, que contienen la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH tal como se describe en la tabla 1 o la tabla 3. Se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo agonista contra MERTK que puede comprender tres CDR de cadena VL, por ejemplo, que contienen la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CD^r3 de VL tal como se describe en la tabla 2 o la tabla 4. Se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo agonista contra MERTK que puede comprender tres CDR de cadena VH, por ejemplo, que contienen la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH tal como se describe en la tabla 1 o la tabla 3, y tres CDR de cadena VL, por ejemplo, que contienen la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL tal como se describe en la tabla 2 o la tabla 4. Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH de M6 (es decir, SEQ ID NO: 1, 6 y 11; SEQ ID NO: 2, 7 y 12; SEQ ID NO: 3, 8 y 11; SEQ ID ⁿO: 4, 9 y 13; SEQ ID NO: 5, 10 y 14; o SEQ ID NO: 3, 6 y 11). Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una ^cD^r3 de VL de M6 (es decir, SEQ ID NO: 15, 19 y 22; SEQ ID NO: 16, 20 y 23; SEQ ID NO: 17, 21 y 24; o SEQ ID NO: 18, 20 y 22). Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH de M6 (es decir, SEQ ID NO: 1, 6 y 11; SEQ ID NO: 2, 7 y 12; SEQ ID NO: 3, 8 y 11; SEQ ID NO: 4, 9 y 13; SEQ ID NO: 5, 10o 14; o SEQ ID NO: 3, 6, y 11) y las tres CDR de VL de M6 (es decir, SEQ ID NO: 15, 19 y 22; SEQ ID NO: 16, 20 y 23; SEQ ID NO: 17, 21 y 24; o SEQ ID NO: 18, 20 y 22).

Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VH de M19 (por ejemplo, SEQ ID NO: 25, 30 y 35; SEQ ID NO: 26, 31 y 36; SEQ ID NO: 27, 32 y 35; SEQ ID NO: 28, 33 y 37; ^sE^qID ⁿO: 29, 34 y 38; o SEQ ⁱD NO: 27, 30 y 35). Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL de M19 (por ejemplo, SEQ ID NO: 39, 43 y 46; SEQ ID NO: 40, 44 y 47; SEQ ID NO: 41, 45 y 48; o SEQ ID NO: 42, 44 y 46). Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para las tres CDR de VH de M19 (es decir, SEQ ID NO: 25, 30 y 35; SEQ ID NO: 26, 31 y 36; SEQ ID NO: 27, 32 y 35; SEQ ID NO: 28, 33o 37; SEQ ID NO: 29, 34 y 38; o SEQ ID NO: 27, 30 y 35) y las tres CDR de VL de M19 (es decir, SEQ ID NO: 39, 43 y 46; SEQ ID NO: 40, 44 y 47; SEQ ID NO: 41,45 y 48; o SEQ ID NO: 42, 44 y 46).

Un polinucleótido descrito en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, que puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento (SEQ ID NO: 49o 51), en el que el anticuerpo se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón). Un polinucleótido descrito en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, que puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento (SEQ ID NO: 50o 52), en el que el anticuerpo se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón). Un polinucleótido descrito en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, que puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, en el que el anticuerpo se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón). Un polinucleótido descrito en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, que puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, en el que el anticuerpo se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón).

Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para una VH que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 55. Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para una VL que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 56. Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para una VH que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 53 y una VL que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 54 (por ejemplo, M6). Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar para una VH que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 55 y una VL que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 56 (por ejemplo, M19).

La divulgación se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, por ejemplo, una cadena ligera y una cadena pesada separadas. Con respecto a la cadena ligera, un polinucleótido proporcionado en el presente documento puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera kappa. Un polinucleótido proporcionado en el presente documento puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera lambda. Un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo descrito en el presente documento que puede comprender una cadena ligera kappa humana o una cadena ligera lambda humana. Un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, en el que el anticuerpo puede comprender una cadena ligera, y en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52 y en el que la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa humana. Un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales, y que puede comprender una cadena ligera, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52 y en el que la región constante de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera lambda humana.

Una secuencia de polinucleótidos optimizada que codifica para un anticuerpo agonista contra MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, dominio VH y/o dominio VL) puede hibridarse con un polinucleótido antisentido (por ejemplo, complementario) de una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica para un anticuerpo agonista contra MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, dominio VH y/o dominio VL). Una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica para un anticuerpo agonista contra MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno puede hibridarse en condiciones de alta rigurosidad con el polinucleótido antisentido de una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica para un anticuerpo agonista contra MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica para un anticuerpo agonista contra MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede hibridarse en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, intermedias o de baja rigurosidad con un polinucleótido antisentido de una secuencia de nucleótidos no optimizada que codifica para un anticuerpo agonista contra MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Un polinucleótido descrito en el presente documento puede tener codones optimizados. Se ha descrito información relativa a las condiciones de hibridación, véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US 2005/0048549 (por ejemplo, párrafos 72-73).

Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, mediante cualquier método conocido en la técnica. Las secuencias de nucleótidos que codifican para los anticuerpos descritos en el presente documento, y las versiones modificadas de estos anticuerpos, pueden determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica, es decir, los codones de nucleótidos conocidos para codificar aminoácidos particulares se ensamblan de tal manera que generan un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo. Un polinucleótido de este tipo que codifica para el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, tal como se describe en Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-6), lo que, en resumen, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica para el anticuerpo, el apareamiento y el ligamiento de dichos oligonucleótidos, y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR.

Alternativamente, un polinucleótido que codifica para un anticuerpo descrito en el presente documento puede generarse a partir de un ácido nucleico de una fuente adecuada (por ejemplo, un hibridoma) usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR y otros métodos de clonación molecular). Por ejemplo, la amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridarse con los extremos 3' y 5' de una secuencia conocida puede realizarse usando ADN genómico obtenido de células de hibridoma que producen el anticuerpo de interés. Tales métodos de amplificación por PCR pueden usarse para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica para la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo. Tales métodos de amplificación por PCR pueden usarse para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica para la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada de un anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados pueden clonarse en vectores para su expresión en células huésped y para su posterior clonación, por ejemplo, para generar anticuerpos quiméricos y humanizados.

Si no se dispone de un clon que contenga un ácido nucleico que codifique para un anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, un ácido nucleico que codifique para la inmunoglobulina puede sintetizarse químicamente u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o un ácido nucleico, preferiblemente ARN poli A+, aislado de, cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo descrito en el presente documento) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridarse con los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación usando una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia génica particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifique para el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse entonces en vectores de clonación replicables usando cualquier método bien conocido en la técnica.

El ADN que codifica para los anticuerpos agonistas contra MERTK descritos en el presente documento puede aislarse y secuenciarse fácilmente mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos agonistas contra MERTK). Las células de hibridoma pueden servir como fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan a células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, células CHO del CHO GS System™ (Lonza)) o células de mieloma que no producen de otro modo proteínas de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos agonistas contra MERTK en las células huésped recombinantes.

Para generar anticuerpos completos, pueden usarse cebadores de PCR que incluyan secuencias de nucleótidos de VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias de VH o VL en clones de scFv. Usando técnicas de clonación conocidas por los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresen una región constante de cadena pesada, por ejemplo, la región constante gamma 4 humana, y los dominios VL amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresen una región constante de cadena ligera, por ejemplo, las regiones constantes kappa o lambda humanas. Los vectores para expresar los dominios VH o VL pueden comprender un promotor, una señal de secreción, un sitio de clonación para el dominio variable, dominios constantes y un marcador de selección. Los dominios VH y VL también pueden clonarse en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de la cadena pesada y los vectores de conversión de la cadena ligera se transfectan conjuntamente en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresen anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas, o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido distinto de inmunoglobulina.

También se proporcionan polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, intermedias o de menor rigurosidad con polinucleótidos que codifican para un anticuerpo descrito en el presente documento. Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden hibridarse en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, intermedias o de menor rigurosidad con polinucleótidos que codifican para una VH (SEQ ID NO: 49o 51) y/o VL (SEQ ID NO: 50o 52) proporcionados en el presente documento.

Las condiciones de hibridación se han descrito en la técnica y un experto en la técnica las conoce. Por ejemplo, la hibridación en condiciones rigurosas puede implicar la hibridación con el ADN unido al filtro en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2xSSC/SDS al 0,1 % a aproximadamente 50-65 °C; la hibridación en condiciones muy rigurosas puede implicar la hibridación con ácido nucleico unido al filtro en 6xSSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,1xSSC/SDS al 0,2 % a aproximadamente 68 °C. Los expertos en la técnica conocen, y se ha descrito, la hibridación en otras condiciones de hibridación rigurosas, véase, por ejemplo, Ausubel f M et al, ed., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, vol. I, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en las páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3.

6.2.3. Células y vectores

La divulgación se refiere a vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden polinucleótidos que codifican para secuencias de nucleótidos de anticuerpos agonistas contra MERTK o un fragmento de unión a antígeno de los mismos para la expresión recombinante en células huésped, preferiblemente en células de mamífero. También se proporcionan en el presente documento células huésped que comprenden tales vectores para expresar de manera recombinante anticuerpos agonistas contra MERTK o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos humanos o humanizados).

La expresión recombinante de un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa, una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo o un anticuerpo monocatenario descrito en el presente documento) que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) implica la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica para una molécula de anticuerpo, la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, las regiones variables de cadena pesada y/o ligera) descrito en el presente documento, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por tanto, en el presente documento se describen métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, cadena ligera o cadena pesada). Pueden usarse métodos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan secuencias codificantes de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, cadena ligera o cadena pesada) y señales de control transcripcional y traduccional adecuadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo. También se proporcionan vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo o una CDR de cadena pesada o ligera, unidos de manera operativa a un promotor. Tales vectores pueden incluir, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, las publicaciones internacionales n.os WO 86/05807 y WO 89/01036; y la patente estadounidense n.° 5.122.464) y los dominios variables del anticuerpo pueden clonarse en un vector de este tipo para la expresión de toda la cadena pesada, toda la cadena ligera o ambas.

Un vector de expresión puede transferirse a una célula (por ejemplo, una célula huésped) mediante técnicas convencionales y las células resultantes pueden cultivarse entonces mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Por tanto, se proporcionan en el presente documento células huésped que contienen un polinucleótido que codifica para un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un fragmento de la misma, o un anticuerpo monocatenario descrito en el presente documento, unidos de manera operativa a un promotor para la expresión de tales secuencias en la célula huésped. Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” puede ser cualquier tipo de célula, por ejemplo, una célula primaria, una célula en cultivo o una célula de una línea celular. El término “célula huésped” puede referirse a una célula transfectada con una molécula de ácido nucleico y a la progenie o progenie potencial de una célula de este tipo. La progenie de una célula de este tipo puede no ser idéntica a la célula parental transfectada con la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, debido a mutaciones o influencias ambientales que pueden producirse en generaciones sucesivas o a la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula huésped.

Puede usarse una variedad de sistemas de vectores de expresión-huésped para expresar moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento. Tales sistemas de expresión-huésped representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden expresar, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento in situ. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con ADN bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ^aDⁿcósmido o ADN plasmídico que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales (por ejemplo, algas verdes tales como Chlamydomonas reinhardtii) infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células ^cO^s(por ejemplo, COSI o COS), CHO, BHK, MD^cK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa, y NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 y BMT10) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, promotor tardío de adenovirus; promotor del virus vaccinia 7.5K). Las células para expresar los anticuerpos descritos en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno de los mismos pueden ser células CHO, por ejemplo, células CHO del CHO GS System™ (Lonza). Las células para expresar los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser células humanas, por ejemplo, líneas celulares humanas. Un vector de expresión de mamíferos puede ser pOptiVEC™ o pcDNA3.3. Para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante pueden usarse células bacterianas, tales como Escherichia coli, o células eucariotas (por ejemplo, células de mamífero), especialmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante completa. Por ejemplo, las células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para los anticuerpos (Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5; y Cockett MI et al., (1990) Biotechnology 8(7): 662-7). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden producirse por células CHO o células NS0. La expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican para los anticuerpos descritos en el presente documento, que se unen de manera inmunoespecífica a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agonizan la señalización de MERTK en células endoteliales, puede estar regulada por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.

En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente varios vectores de expresión en función del uso previsto para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de tal anticuerpo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794), en el que la secuencia codificante del anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en marco con la región codificante de lac Z para que se produzca una proteína de fusión; los vectores pIN (Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509); y similares. Por ejemplo, los vectores pGEX también pueden usarse para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con la glutatión 5-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y unión a perlas de agarosa con glutatión de matriz, seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de la trombina o de la proteasa del factor Xa, de modo que el producto génico diana clonado pueda liberarse del resto GST.

En un sistema de insectos, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), por ejemplo, puede usarse como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la poliedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor del AcNPV (por ejemplo, el promotor de la poliedrina).

En células huésped de mamífero, pueden usarse varios sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante del anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control transcripcional/traduccional del adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y que puede expresar la molécula de anticuerpo en los huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81(12): 3655-9). También pueden requerirse señales de iniciación específicas para la traducción eficiente de secuencias codificantes de anticuerpos insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de todo el inserto. Estas señales exógenas de control traduccional y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. (véase, por ejemplo, Bitter G et al., (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544).

Además, puede elegirse una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la manera específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Células huésped diferentes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccional de las proteínas y los productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped adecuados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para ello, pueden usarse células huésped eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamífero incluyen, pero no se limitan a, células CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, H^tB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce de manera endógena ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O, COS (por ejemplo, COS1 o COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 y HsS78Bst. Los anticuerpos agonistas contra MERTK descritos en el presente documento pueden producirse en células de mamífero, tales como células CHO.

Los anticuerpos descritos en el presente documento o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen un contenido reducido de fucosa o no contienen fucosa. Tales anticuerpos pueden producirse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden expresarse en células deficientes o carentes de la capacidad de fucosilación. En un ejemplo específico, pueden usarse líneas celulares con una supresión de ambos alelos de la a 1,6-fucosiltransferasa para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos con un contenido reducido de fucosa. El sistema Potelligent® (Lonza) es un ejemplo de un sistema de este tipo que puede usarse para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos con un contenido reducido de fucosa.

Para la producción de proteínas recombinantes a largo plazo y de alto rendimiento, pueden generarse células de expresión estable. Por ejemplo, pueden crearse líneas celulares que expresen de manera estable un anticuerpo agonista contra MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Una célula proporcionada en el presente documento puede expresar de manera estable un dominio variable de cadena ligera/cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada/cadena pesada que se asocian para formar un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación virales, las células huésped pueden transformarse con ADN controlado mediante elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN/polinucleótido extraño, puede dejar que las células modificadas por ingeniería crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable del plásmido recombinante otorga resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan hasta formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para modificar por ingeniería líneas celulares que expresan un anticuerpo agonista contra MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Tales líneas celulares modificadas por ingeniería pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de composiciones que interaccionan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo, pero sin limitarse a, la timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler M et al., (1977) Cell 11(1): 223-32), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy I et al., (1980) Cell 22(3): 817-23) pueden emplearse en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, la resistencia a los antimetabolitos puede usarse como base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que otorga resistencia al metotrexato (Wigler M et al., (1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K et al., (1981) PNAS 78: 1527-31); gpt, que otorga resistencia al ácido micofenólico (Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6); neo, que otorga resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu G& Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; y Morgan RA & Anderson W^f(1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); e hygro, que otorga resistencia a la higromicina (Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-56). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante pueden aplicarse de manera rutinaria para seleccionar el clon recombinante deseado y tales métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel FM et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli NC et al., (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbére-Garapin F et al., (1981) J Mol Biol 150: 1-14.

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante la amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington CR & Hentschel C^cG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, vol. 3 (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador del sistema de vectores que expresa anticuerpos es amplificable, el aumento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo (Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).

La célula huésped puede transfectarse conjuntamente con dos o más vectores de expresión descritos en el presente documento, codificando el primer vector para un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector para un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permitan una expresión igual de los polipéptidos de las cadenas pesada y ligera. Las células huésped pueden transfectarse conjuntamente con diferentes cantidades de los dos o más vectores de expresión. Por ejemplo, las células huésped pueden transfectarse con cualquiera de las siguientes razones de un primer vector de expresión y un segundo vector de expresión: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 o 1:50.

Alternativamente, puede usarse un único vector que codifique para, y pueda expresar, los polipéptidos de las cadenas pesada y ligera. En un vector de expresión de este tipo, la transcripción de ambos genes puede impulsarse mediante un promotor común, mientras que la traducción del ARNm del primer gen puede realizarse mediante un mecanismo de barrido dependiente de la caperuza y la traducción del ARNm del segundo gen puede realizarse mediante un mecanismo independiente de la caperuza, por ejemplo, mediante un IRES.

6.3. Composiciones farmacéuticas

Se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede purificarse. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede estar presente en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz. Los portadores aceptables, que pueden ser excipientes o estabilizadores, no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a, tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, tales como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Las composiciones farmacéuticas comprenden un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento y, opcionalmente, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, en un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento y, opcionalmente, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, en un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas y/o los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento pueden combinarse con una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los agentes terapéuticos adicionales descritos en el presente documento (véase la sección 5.4.2, más adelante).

El anticuerpo puede ser el único principio activo incluido en la composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden usarse para tratar el cáncer.

Los portadores farmacéuticamente aceptables usados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa isotónica, inyección de agua estéril, dextrosa e inyección de lactato de Ringer. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Pueden añadirse agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a las preparaciones parenterales envasadas en recipientes de dosis múltiples que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres metílicos y propílicos del ácido phidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen polisorbato 80 (TWEEN® 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Los portadores farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles en agua; e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.

Una composición farmacéutica puede formularse para cualquier vía de administración a un sujeto. Los ejemplos específicos de vías de administración incluyen intranasal, oral, pulmonar, transdérmica, intradérmica y parenteral. También se contempla en el presente documento la administración parenteral, caracterizada por o bien inyección subcutánea, intramuscular o bien intravenosa. Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, o bien como disoluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para la disolución o suspensión en líquido antes de la inyección o bien como emulsiones. Los inyectables, las disoluciones y las emulsiones también contienen uno o más excipientes. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que van a administrarse también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH, estabilizadores, potenciadores de la solubilidad y otros agentes de este tipo, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas.

Las preparaciones para la administración parenteral de un anticuerpo incluyen disoluciones estériles listas para inyección, productos secos solubles estériles, tales como polvos liofilizados, listos para combinarse con un disolvente justo antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, productos secos insolubles estériles listos para combinarse con un vehículo justo antes de su uso y emulsiones estériles. Las disoluciones pueden ser acuosas o no acuosas.

Si se administran por vía intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las disoluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.

Las mezclas tópicas que comprenden un anticuerpo se preparan tal como se describe para la administración local y sistémica. La mezcla resultante puede ser una disolución, suspensión, emulsiones o similares y puede formularse como cremas, geles, pomadas, emulsiones, disoluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendas, parches dérmicos o cualquier otra formulación adecuada para administración tópica.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede formularse como un aerosol para aplicación tópica, tal como, por ejemplo, por inhalación (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.044.126, 4.414.209 y 4.364.923, que describen aerosoles para la administración de un esteroide útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en particular asma). Estas formulaciones para la administración a las vías respiratorias pueden presentarse en forma de aerosol o disolución para un nebulizador, o como polvo microfino para insuflaciones, solas o en combinación con un portador inerte tal como lactosa. En tal caso, las partículas de la formulación pueden tener diámetros de menos de 50 micrómetros o menos de 10 micrómetros.

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede formularse para aplicación local o tópica, tal como, por ejemplo, para aplicación tópica a la piel y a las mucosas, tal como en el ojo, en forma de geles, cremas y lociones, y para su aplicación al ojo o para su aplicación intracisternal o intraespinal. La administración tópica se contempla para la administración transdérmica y también para la administración a los ojos o a la mucosa, o para terapias de inhalación. También pueden administrarse disoluciones nasales del anticuerpo solas o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables.

Los parches transdérmicos, incluyendo los dispositivos iontoforéticos y electroforéticos, se conocen bien por los expertos en la técnica, y pueden usarse para administrar un anticuerpo. Por ejemplo, tales parches se dan a conocer en las patentes estadounidenses n.os 6.267.983, 6.261.595, 6.256.533, 6.167.301, 6.024.975, 6.010715, 5.985.317, 5.983.134, 5.948.433 y 5.860.957.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede ser un polvo liofilizado, que puede reconstituirse para su administración como disoluciones, emulsiones y otras mezclas. También puede reconstituirse y formularse como sólidos o geles. El polvo liofilizado se prepara disolviendo un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, en un disolvente adecuado. El polvo liofilizado puede ser estéril. El disolvente puede contener un excipiente que mejore la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o de la disolución reconstituida, preparada a partir del polvo. Los excipientes que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado. El disolvente también puede contener un tampón, tal como citrato, fosfato de sodio o de potasio u otro tampón conocido por los expertos en la técnica, en una realización, con un pH aproximadamente neutro. La posterior esterilización por filtración de la disolución, seguido de liofilización en condiciones convencionales conocidas por los expertos en la técnica, proporciona la formulación deseada. La disolución resultante puede repartirse en viales para su liofilización. Cada vial contendrá una dosis única o múltiples dosis del compuesto. El polvo liofilizado puede almacenarse en condiciones apropiadas, tales como, por ejemplo, entre 4 °C y temperatura ambiente.

La reconstitución de este polvo liofilizado con agua para inyección proporciona una formulación para su uso en la administración parenteral. Para la reconstitución, el polvo liofilizado se añade a agua estéril u otro portador adecuado. La cantidad precisa depende del compuesto seleccionado. Tal cantidad puede determinarse empíricamente.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento y otras composiciones proporcionadas en el presente documento también pueden formularse para dirigirse a un tejido, receptor u otra zona particular del cuerpo del sujeto que va a tratarse. Muchos de estos métodos de direccionamiento los conocen bien los expertos en la técnica. Todos estos métodos de direccionamiento se contemplan en el presente documento para su uso en las presentes composiciones. Para ejemplos no limitativos de métodos de direccionamiento, véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.316.652, 6.274.552, 6.271.359, 6.253.872, 6.139.865, 6.131.570, 6.120.751, 6.071.495, 6.060.082, 6.048.736, 6.039.975, 6.004.534, 5.985.307, 5.972.366, 5.900.252, 5.840.674, 5.759.542 y 5.709.874. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede dirigirse a un tumor.

Las composiciones que se usarán para la administración in vivo pueden ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de, por ejemplo, membranas de filtración estériles.

6.4. Usos y métodos

6.4.1. Usos y métodos terapéuticos

6.4.11. Cáncer

La divulgación se refiere a métodos para tratar el cáncer en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento. Se presentan en el presente documento métodos para tratar el cáncer en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita una composición farmacéutica que puede comprender un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales. Se presentan en el presente documento métodos para tratar el cáncer en los que es deseable agonizar la señalización de MERTK en células endoteliales, por ejemplo, para inhibir la angiogénesis, que pueden comprender administrar a un sujeto que lo necesita una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agoniza la señalización de MERTK en células endoteliales.

La administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en el presente documento, o de una composición farmacéutica descrita en el presente documento, a un sujeto con cáncer puede lograr al menos uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos (i) la reducción o mejora de la gravedad de uno o más síntomas del cáncer; (ii) la reducción de la duración de uno o más síntomas asociados al cáncer; (iii) la prevención de la reaparición de un síntoma asociado al cáncer; (iv) la reducción de la hospitalización de un sujeto; (v) la reducción de la duración de la hospitalización; (vi) el aumento de la supervivencia de un sujeto; (vii) la potenciación o mejora del efecto terapéutico de otra terapia; (viii) la inhibición del desarrollo o la aparición de uno o más síntomas asociados al cáncer; (ix) la reducción del número de síntomas asociados al cáncer; (x) la mejora de la calidad de vida tal como se evalúa mediante métodos bien conocidos en la técnica; (x) la inhibición de la reaparición de un tumor; (xi) la regresión de los tumores y/o de uno o más síntomas asociados a los mismos; (xii) la inhibición de la progresión de los tumores y/o de uno o más síntomas asociados a los mismos; (xiii) la reducción del crecimiento de un tumor; (xiv) la disminución del tamaño del tumor (por ejemplo, volumen o diámetro); (xv) la reducción de la formación de un nuevo tumor; (xvi) la prevención, erradicación, extirpación o control de tumores primarios, regionales y/o metastásicos; (xvii) la disminución del número o tamaño de las metástasis; (xviii) la reducción de la mortalidad; (xix) el aumento de la supervivencia sin recidivas; (xx) el tamaño del tumor se mantiene y no aumenta o aumenta en menor medida que el aumento de un tumor tras la administración de una terapia convencional tal como se mide mediante métodos convencionales disponibles para un experto en la técnica, tales como obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), MRI potenciada por contraste dinámico (DCE-MRI), radiografía y tomografía computarizada (CT), o tomografía por emisión de positrones (PET); y/o (xxi) el aumento de la duración de la remisión en los pacientes.

El cáncer tratado según los métodos descritos en el presente documento puede ser un cáncer de pulmón, mama, hueso, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, vías biliares, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata o tiroides. El cáncer puede ser un sarcoma, un carcinoma de células escamosas, un melanoma, un glioma, un glioblastoma, un neuroblastoma o sarcomas de Kaposi. El cáncer tratado según los métodos puede ser metastásico.

El cáncer tratado según los métodos descritos en el presente documento puede ser un cáncer de mama. En una realización particular, el cáncer tratado según los métodos descritos en el presente documento es cáncer de mama triple negativo. El cáncer de mama triple negativo se refiere a cualquier tumor o célula derivada de o que crece en el tejido mamario que no expresa los genes Her2 (también conocidos como Neu), receptor de estrógenos (también conocido como ER) o receptor de progesterona (también conocido como PR).

En el presente documento, los términos “sujeto” y “paciente” se usan de manera intercambiable. El sujeto puede ser un mamífero, tal como un primate (por ejemplo, un mono o un ser humano), preferiblemente un ser humano.

Puede administrarse a un sujeto un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) (por ejemplo, anticuerpos M6 y M19). Pueden administrarse a un sujeto dos o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos diferentes que se unen específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana, o MERTK tanto humana como de ratón) y agonizan la señalización de MERTK en células endoteliales descritos en el presente documento. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede administrarse a un sujeto en combinación con una o más terapias (véase la sección 5.4.2, más adelante).

6.4.1.2. Vías de administración y dosificación

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, o la composición descrita en el presente documento, puede administrarse a un sujeto mediante una variedad de vías. Estas incluyen, pero no se limitan a, vías parenterales, intranasales, intratraqueales, orales, intradérmicas, tópicas, intramusculares, intraperitoneales, transdérmicas, intravenosas, intratumorales, conjuntivales y subcutáneas. También puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de aerosol para su uso como pulverizador. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición descrita en el presente documento, puede administrarse por vía parenteral a un sujeto. Dicha administración parenteral puede ser intravenosa, intramuscular o subcutánea.

La cantidad de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, o de una composición, que será eficaz en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, dependerá de la naturaleza de la enfermedad, y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales.

La dosis precisa que va a emplearse en una composición también dependerá de la vía de administración y del tipo de cáncer, y deberá decidirse según el criterio del profesional y las circunstancias de cada sujeto. Por ejemplo, las dosis eficaces también pueden variar en función de la vía de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente (incluyendo la edad, el peso corporal y la salud), si el paciente es un ser humano o animal, otros medicamentos administrados, o si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosis de tratamiento se titulan de manera óptima para optimizar la seguridad y la eficacia.

Se emplea un ensayo in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimas. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de prueba de modelos animales o in vitro.

Para un anticuerpo (o un fragmento de unión a antígeno del mismo), la dosificación oscila entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y 15 mg/kg, del peso corporal del paciente. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal, o dentro del intervalo de 1 10 mg/kg o, en otras palabras, 70 mg o 700 mg o dentro del intervalo de 70-700 mg, respectivamente, para un paciente de 70 kg. La dosificación administrada al paciente puede ser de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del paciente. Por lo general, los anticuerpos humanos tienen una semivida más larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies, debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos extraños. Por tanto, a menudo son posibles dosificaciones menores de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente.

Un régimen de tratamiento a modo de ejemplo implica la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada de 3 a 6 meses durante un periodo de un año o durante varios años, o durante varios intervalos al año. En algunos métodos, se administran simultáneamente a un sujeto dos o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos con diferentes especificidades de unión. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra normalmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser semanales, mensuales, cada 3 meses, cada 6 meses o anuales.

6.4.2. Terapias de combinación

Los métodos proporcionados en el presente documento para tratar el cáncer en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, pueden comprender además administrar al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales. El agente terapéutico adicional puede ser para tratar el cáncer. El agente terapéutico adicional puede ser para tratar cualquier efecto secundario del tratamiento con un anticuerpo MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento.

El agente adicional puede ser un agente usado para tratar el cáncer de mama, un agente usado para tratar el melanoma, una inmunoterapia o un inhibidor de la angiogénesis.

El agente terapéutico adicional un agente usado para tratar el melanoma que puede seleccionarse del grupo que consiste en un inhibidor de BRAF, un inhibidor de MEK y dacarbazina.

El agente terapéutico adicional puede ser un agente de la lista en la tabla 10.

Tabla 10. Agentes terapéuticos adicionales para su uso en la terapia de combinación con anticuerpos contra MERTK o fragmentos de unión a antígeno de los mismos

Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede administrarse con un agente terapéutico adicional de manera simultánea o secuencial (antes y/o después). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente terapéutico adicional pueden administrarse en las mismas o diferentes composiciones y mediante las mismas o diferentes vías de administración. Una primera terapia (que es un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, o el agente terapéutico adicional) puede administrarse antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), de manera simultánea con, o después de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) la administración de la segunda terapia (el anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, o el agente terapéutico adicional) a un sujeto con cáncer. Un agente terapéutico adicional administrado a un sujeto en combinación con un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede administrarse en la misma composición (composición farmacéutica). Un agente terapéutico adicional administrado en combinación con un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo puede administrarse a un sujeto en una composición diferente a la del anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, se usan dos o más composiciones farmacéuticas).

6.5. Kits

Según otro aspecto de la invención, se proporciona en el presente documento un kit que comprende un conjugado de un anticuerpo según la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Se proporciona en el presente documento un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de uno o más de los componentes de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, tales como uno o más anticuerpos conjugados de la invención o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. El kit puede contener una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un agente profiláctico o terapéutico.

Opcionalmente, puede asociarse a tal(es) envase(s) una notificación en la forma recomendada por un organismo gubernamental que regule la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, una forma de dosificación y/o instrucciones para su uso. Las instrucciones incluidas en el kit pueden proporcionar orientación con respecto a las cantidades de dosificación y/o las pautas posológicas para la administración de la(s) composición/composiciones farmacéutica(s).

Los ejemplos de materiales de acondicionamiento farmacéutico incluyen, pero no se limitan a, envases alveolados, frascos, paquetes, sobres, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas y cualquier material de acondicionamiento adecuado para una composición farmacéutica seleccionada y el modo de administración y tratamiento previsto.

Los kits proporcionados en el presente documento pueden incluir además dispositivos que se usan para administrar los principios activos. Los ejemplos de tales dispositivos incluyen, pero no se limitan a, jeringas, inyectores sin aguja, bolsas de goteo, parches e inhaladores.

Los kits proporcionados en el presente documento pueden incluir además vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse para administrar los componentes. Por ejemplo, si un componente se proporciona en forma sólida que debe reconstituirse para su administración parenteral, el kit puede comprender un recipiente sellado de un vehículo adecuado en el que el componente pueda disolverse para formar una disolución estéril sin partículas que sea adecuada para la administración parenteral o pueda reconstituirse como una suspensión para la administración oral. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, vehículos acuosos que incluyen, pero no se limitan a, agua para inyección USP, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio e inyección de lactato de Ringer; vehículos miscibles en agua que incluyen, pero no se limitan a, alcohol etílico, polietilenglicol y polipropilenglicol; y vehículos no acuosos que incluyen, pero no se limitan a, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

7. Ejemplos

7.1. Ejemplo 1: generación de anticuerpos monoclonales de alta afinidad de unión a MERTK

Este ejemplo describe anticuerpos monoclonales que inhiben el reclutamiento endotelial por parte de las células de cáncer de mama metastásico al unirse a MERTK y activar su fosforilación. El antígeno peptídico usado para inmunizar a los ratones con el fin de generar los anticuerpos descritos en este ejemplo se adquirió de R&D systems (quimera Fc de Mer humana recombinante, #CF891-MR-100). Se trata de un péptido quimérico compuesto por una gran porción del dominio extracelular de MERTK (Arg26 a Ala499; SEQ ID NO: 58) fusionado con una porción de la región Fc de la proteína IgG1 humana (Pro100-Lys330) con un pequeño ligador entre ambos (IEGRMD). Véase en la figura 1A un esquema del péptido quimérico. Después de inmunizar a los ratones con el péptido quimérico, se generaron bibliotecas de hibridomas mediante la fusión de células B aisladas de los ratones inmunizados con líneas celulares de mieloma. A continuación, se aisló el sobrenadante de estos hibridomas para identificar las células de hibridoma que generaban anticuerpos que se unían a MERTK, usando ensayos ELISA competitivos de captura de anticuerpos tal como se describe en la sección 6.1.1, más adelante. Una vez identificados, los hibridomas que generaban anticuerpos con alta afinidad por MERTK se cribaron para identificar los que generaban anticuerpos que podían inhibir la unión de MERTK a Gas-6, usando ensayos ELISA competitivos de captura de anticuerpos, tal como se describió en la sección 6.1.2, más adelante. Para aislar clones únicos (monoclonales) de células de hibridoma, se realizó la separación y el cribado de la biblioteca de hibridomas. Se seleccionaron 960 clones únicos de hibridoma (monoclonales) de esta biblioteca para identificar los que generaban anticuerpos monoclonales que se unían a MERTK con alta afinidad para neutralizar la unión de Gas-6.

7.1.1. Ensayo de captura ELISA para detectar la unión a MERTK:

Con el fin de identificar los anticuerpos monoclonales que se unen a MERTK, se usó un ensayo de captura de anticuerpos ELISA para cribar los anticuerpos secretados generados a partir de cada clon de hibridoma generado a partir de ratones inmunizados con la proteína MERTK recombinante. En primer lugar, se recubrieron placas de poliestireno con el anticuerpo de recubrimiento (anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (Fc); n.° de lote: Jackson 98959; concentración del anticuerpo de 10 ug/ml). A continuación, se añadió a cada pocillo de la placa el sobrenadante que contenía el anticuerpo primario de cada clon de hibridoma monoclonal. A continuación, se añadió a cada pocillo el antígeno marcado (Mer-Fc humano recombinante; RnD systems #891-MR; n.° de lote: CXK0211051; concentración de 300 ng/ml). A continuación, se añadió a cada pocillo el anticuerpo de detección (anticuerpo de cabra ant-IgG humana (Fc) conjugado con peroxidasa de rábano [HRP]; n.° de lote: Jackson 86954; dilución: 1/5000). A esto le siguió la adición del sustrato HRP y la posterior adición de la disolución de parada para completar la reacción. La señal (D.O.) de cada pocillo se leyó usando un espectrofotómetro. De los 960 clones de hibridoma sometidos a prueba, veinte demostraron valores de D.O. > 1, lo que indica una afinidad de unión a MERTK humana significativa. Una lectura de D.O. de 1 indica al menos 4 veces la señal que se observó con el control negativo (medio vacío sin anticuerpo), que tenía un valor de D.O. de 0,22. Estos veinte clones se denominaron arbitrariamente M1 a M20 y se enumeran en la figura 2. La segunda columna (con el título “Mer”) en la figura 2 indica la lectura de la D.O. (indicativa de la afinidad de unión) para cada clon.

7.1.2. Ensayo ELISA de unión competitiva de Gas-6

A continuación, con el fin de identificar los anticuerpos que inhiben la unión de Gas-6 a MERTK, se realizó un ensayo ELISA de unión competitiva de Gas-6 con los veinte anticuerpos de unión a MERTK (M1 - M20). En primer lugar, se recubrieron placas de poliestireno con GAS-6 humana recombinante (RnD systems rhGas6 #885-GS-050; concentración de 7 ug/ml). A continuación, se añadió a cada pocillo de la placa el sobrenadante que contenía el anticuerpo primario de cada clon de hibridoma monoclonal. Simultáneamente, se añadió a cada pocillo MERTK humana recombinante (Mer-Fc de RnD systems #891-MR; n.° de lote: CXK0211051; concentración de 300 ng/ml). A continuación, se añadió a cada pocillo el anticuerpo de detección (anticuerpo de cabra ant-IgG humana (Fc) conjugado con peroxidasa de rábano; n.° de lote: Jackson 86954; dilución: 1/5000). A continuación, se añadió el sustrato HRP y la disolución de parada para completar la reacción. Se midió la señal (D.O.) de cada placa usando un espectrofotómetro. De todos los clones de hibridoma sometidos a prueba en este ensayo, 11 demostraron valores de D.O. <2,4, lo que indicó que inhibían la unión de Gas-6 a MERTK. Una lectura de D.O. de 2,4 indica la inhibición de la unión de Gas-6 a MERTK, ya que la señal que se observó con el control negativo (medio vacío sin anticuerpo) fue de 2,43. Estos veinte clones se enumeran en la figura 2. La tercera columna (con el título “(Mer Clon)”) en la figura 2 indica la lectura de la D.O. (indicativa de la cantidad de inhibición de la unión de Gas-6) para cada clon.

Se seleccionaron los dos anticuerpos monoclonales M6 y M19 para un estudio adicional, incluyendo si podían inhibir el reclutamiento endotelial por parte de las células metastásicas mediante ensayos de migración endotelial Transwell.

7.2. Ejemplo 2: los anticuerpos M19 y M6 pueden inhibir el reclutamiento de células endoteliales por parte de células de cáncer de mama triple negativo in vitro

Para identificar anticuerpos monoclonales que pudieran inhibir el reclutamiento endotelial mediante la activación de MERTK, los anticuerpos monoclonales de alta afinidad que compiten con Gas-6 generados en el cribado descrito en el ejemplo 1, anteriormente, se sometieron a prueba en un ensayo de reclutamiento endotelial in vitro usando Transwell. Las células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 metastásicas se colocaron en el fondo de una cámara Boyden, en la que pudo someterse a ensayo su capacidad de reclutamiento de HUVEC a través de un inserto Transwell poroso. Los anticuerpos de unión a MERTK del cribado (incluyendo anticuerpos de alta y baja afinidad) se añadieron a Transwell de manera individual en concentraciones fisiológicas. De todos los anticuerpos sometidos a prueba, M19 y M6 fueron los que más podían inhibir significativamente el reclutamiento (células migradas/campo) de las células HUVEC (reducción del 50 % de las células migradas) frente al anticuerpo de control negativo IgG. Esto demuestra la capacidad de los anticuerpos monoclonales M19 y M6 para inhibir el reclutamiento de células endoteliales humanas por parte de células cancerosas metastásicas.

activan la fosforilación de MERTK en células endoteliales

Para confirmar que M19 y M6 son efectivamente anticuerpos activadores de MERTK, se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Western para cuantificar los niveles de MERTK fosforilada (activada) expresada por las células endoteliales (HUVEC) en presencia o ausencia de tratamiento con anticuerpos M19 o M6.

Para realizar el análisis de inmunotransferencia de tipo Western, se hicieron crecer células HUVEC (o células de cáncer de mama LM2) hasta el 80 % de confluencia en medio EGM-2 (Lonza, n.° de cat. CC-3162) que contenía FBS al 10 %. Después de una incubación de 16 horas en las condiciones indicadas, las células se lavaron en PBS y se lisaron en 1 ml de tampón RIPA (G-Biosceince, n.° de cat. 786-490) que contenía inhibidores de proteasas y fosfatasas (Roche, n.° de cat. 11836170001 y 04906845001, respectivamente). A continuación, las proteínas de los lisados celulares se separaron en un SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Para la detección de las proteínas se usaron los siguientes anticuerpos primarios: MERTK fosforilada (FabGennix, n.° de cat. PMKT-140AP), MERTK (Abcam, n.° de cat. ab52968), Akt fosforilada (Santa Cruz Biotechnology, n.° de cat. sc-7985R) y Akt (Santa Cruz Biotechnology, n.° de cat. sc-1618). Los anticuerpos primarios se detectaron usando los anticuerpos secundarios conjugados con HRP adecuados (Life Technologies).

Las células cultivadas tratadas con los anticuerpos especificados dieron como resultado un aumento de la activación de MERTK en células endoteliales, de manera dependiente de la dosis, durante el tratamiento con anticuerpos tanto prolongado (16 horas) como breve (30 minutos). Curiosamente, el tratamiento con el anticuerpo M19 no aumentó la activación de MERTK en las células de cáncer de mama LM2.

7.4. Ejemplo 4: M19 se une con alta afinidad a MERTK tanto humana como de ratón

Este ejemplo demuestra que el anticuerpo M19 se une con alta afinidad (K^dde ~0,3 nM) a MERTK tanto humana como murina. Para caracterizar la afinidad de unión del anticuerpo M19 contra MERTK recombinante humana y de ratón, se realizó un análisis de interacción biomolecular mediante interferometría de biocapa (figura 7 y figura 8). Se observó la unión entre M19 y MERTK tanto humana como de ratón. El ajuste global general calculó que la afinidad de unión (Kd) para la unión de M19 a MERTK humana y de ratón fueron similares (Kd = ~0,3 nM).

7.5. Ejemplo 5: la administración terapéutica de M19 inhibe la progresión tumoral del cáncer de mama humano in vivo.

Este ejemplo demuestra que el anticuerpo activador de MERTK M19 puede inhibir la progresión tumoral y la metástasis tumoral in vivo en un modelo de ratón de cáncer de mama humano. Para someter a prueba si el anticuerpo monoclonal M19 podía reducir la carga tumoral e inhibir la progresión tumoral in vivo, se mezclaron 2000 células MDA-MB-231 o 5000 Lm1a1 en una razón 1:1 con Matrigel con un contenido reducido de factores de crecimiento y se inyectaron bilateralmente en las almohadillas de grasa mamaria de ratones NOD-SCID. Después de la cirugía, se inyectaron por vía intraperitoneal 250 |ig de o bien anticuerpo M19 o bien anticuerpo IgG de control y posteriormente dos veces por semana. El tamaño de los tumores palpables se midió semanalmente usando un calibre. El tratamiento con el anticuerpo M19 demostró una inhibición terapéutica significativa tanto del crecimiento de tumores primarios como de la metástasis del cáncer de mama triple negativo in vivo.

7.6. Ejemplo 6: M19 inhibe la angiogénesis tumoral in vivo

Para investigar si el tratamiento terapéutico con el anticuerpo M19 da como resultado una inhibición de la angiogénesis in vivo, se cuantificó la densidad de los vasos sanguíneos dentro de los tumores de ratones tratados con M19 y sin tratar. Se inyectaron 2000 MDA-MB-231 bilateralmente en la almohadilla de moda mamaria de ratones NOD-SCID. Después de 58 días de tratamiento con 250 |ig de o bien anticuerpo M19 o bien anticuerpo IgG

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a tirosina cinasa Mer (MERTK) humana, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en el que:

(i) la VH comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 11, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID nO: 22, en el que las CDR se definen según la definición de Kabat;

(ii) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 2, una CDR2 de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de SEQ ID NO: 12, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 16, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID NO: 23, en el que las CDR se definen según la definición de Chothia;

(iii) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de SEQ ID n O: 11, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en el que las CDR se definen según la definición de AbM;

(iv) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de SEQ ID n O: 13, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 17, una CDR2 de SEQ ID NO: 21 y una CDR3 de SEQ ID NO: 24, en el que las CDR se definen según la definición de Contact;

(v) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de SEQ ID NO: 10 y una CDR3 de SEQ ID ⁿO: 14, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 18, una CDR2 de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de SEQ ID No : 22, en el que las CDR se definen según la definición de IMGT; o

(vi) la VH comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 3, una CDR2 de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de SEQ ID ⁿO: 11, y la VL comprende una CDR1 de SEQ ID NO: 15, una CDR2 de SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de SEQ ID NO: 22, en el que las CDR se definen según la definición a modo de ejemplo.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que comprende:

(i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que está humanizado.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que comprende una región constante derivada de un ser humano.
5. Un anticuerpo heteroconjugado que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
6. Un kit que comprende un conjugado del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
7. Un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
8. Una célula ex vivo que contiene uno o más polinucleótidos que codifican para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
9. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, que comprende cultivar la célula ex vivo según la reivindicación 8 en condiciones tales que dicho uno o más polinucleótidos sean expresados por la célula ex vivo para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno codificado por el uno o más polinucleótidos.
10. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o del anticuerpo heteroconjugado según la reivindicación 5; y un portador farmacéuticamente aceptable.
11. La composición farmacéutica según la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesita.
12. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 11, en la que dicho cáncer es un cáncer de pulmón, mama, hueso, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, vías biliares, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata o tiroides; o en la que dicho cáncer es un sarcoma o un melanoma.
13. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 12, en la que dicho cáncer es cáncer de mama.
14. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 11, en la que dicho cáncer es cáncer de mama triple negativo.
15. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en la que dicho tratamiento de cáncer comprende además administrar al sujeto un agente terapéutico adicional.
16. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en la que dicho sujeto es un ser humano.