JP2024519333A - Ｍｅｒｔｋペプチドおよびその使用 - Google Patents

Ｍｅｒｔｋペプチドおよびその使用 Download PDF

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イザベル カース，
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Abstract

本開示は、ヒトＭＥＲＴＫのアミノ酸配列を含むペプチド、ならびに抗体の産生およびスクリーニングのためのその使用を提供する。本発明は、ヒトＭＥＲＴＫの連続したアミノ酸配列（配列番号１）または連続したアミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドであって、連続したアミノ酸配列が、ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）のアミノ酸番号３７９～４２３、およびヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて４００個の連続したアミノ酸を含む、ポリペプチドを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は米国仮特許出願第６３／１８９，０３６号（２０２１年５月１４日出願）の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照
本出願は、“１３２５６－０１２－２２８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ”と題されるテキストファイル（２０２２年５月４日作成、５３，１２１バイトのサイズ）として本出願とともに提出される配列表を参照によって組み込む。
１．分野
本開示は、ヒトＭＥＲＴＫのアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに抗体の産生およびスクリーニングのためのその使用を提供する。
２．背景
Ｍｅｒチロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）は、ｃ－ｍｅｒ、ＭＥＲ、癌原遺伝子ｃ－Ｍｅｒ、受容体チロシンキナーゼＭｅｒＴＫ、チロシン－プロテインキナーゼＭｅｒ、ＳＴＫキナーゼ、ＲＰ３８またはＭＧＣ１３３３４９としてもまた示されるものであり、ＡＸＬキナーゼおよびＴＹＲＯ３キナーゼもまた含む受容体チロシンキナーゼのＴＡＭファミリーのメンバーである。ＭＥＲＴＫは、リガンドが結合することによる活性化を介して、最も顕著にはＧａｓ－６（可溶性タンパク質）が結合することによる活性化を介して細胞外空間からのシグナルを伝達する。ＭＥＲＴＫへのＧａｓ－６結合はその細胞内ドメインでのＭＥＲＴＫの自己リン酸化を誘導し、その結果、下流側のシグナル活性化をもたらす（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＣＴら、（２０１３）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９：５２７５－５２８０；Ｖｅｒｍａ Ａら、（２０１１）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０：１７６３－１７７３）。
ＭＥＲＴＫが膜結合形態および可溶性形態の両方で存在する。細胞外ドメインは切断されて、可溶性の細胞外ドメインを生じさせることができ、この可溶性の細胞外ドメインは、膜結合ＭＥＲＴＫと結合する可溶性Ｇａｓ－６リガンドの能力および／または利用可能性を低下させることによって細胞上でのＭＥＲＴＫ受容体活性化を負に調節するためにデコイ受容体として作用すると仮定されている（Ｓａｔｈｅｒ Ｓら、（２００７）Ｂｌｏｏｄ １０９：１０２６－１０３３）。結果として、ＭＥＲＴＫは、がんの進行、血管新生および転移に関連づけられる二重の役割を有する。一方で、内皮細胞上のＭＥＲＴＫのＧａｓ－６活性化は、共培養系におけるがん細胞による内皮細胞動員の阻害をもたらす。内皮動員は、腫瘍の血管新生、腫瘍の成長および転移を可能にするがん細胞の重要な特徴である。しかしながら、他方で、ＭＥＲＴＫは逆の役割をがん細胞において果たしており、この場合、その過剰発現が、切断されたＭＥＲＴＫを放出して、可溶性のＭＥＲＴＫ細胞外ドメインタンパク質をデコイ受容体として生じさせることによってであると思われるが、増大した転移を引き起こしている。したがって、腫瘍細胞は、発癌性シグナル伝達を促進させるようにＭＥＲＴＫを過剰発現する。また、腫瘍細胞は、内皮細胞上のＭＥＲＴＫを活性化し、これにより最終的には内皮動員、血管新生およびがん進行を引き起こす可溶性Ｇａｓ－６リガンドの能力（および／または利用可能性）を低下させるためにデコイ受容体として作用する細胞外ＭＥＲＴＫ受容体の可溶性形態を分泌する（Ｐｎｇ ＫＪら、（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４８１：１９０－１９４）。
歴史的には、ＭＥＲＴＫは癌遺伝子としてもっぱら機能すると考えられていたので、様々な努力が、がんを処置するためのＭＥＲＴＫの阻害剤（例えば、化合物ＵＮＣ１０６２、すなわち、抗がん化合物として開発された強力な小分子ＭＥＲＴＫ阻害剤）を生じさせるためになされてきている（Ｌｉｕ Ｊら、（２０１３）Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ６５：８３－９３；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＣＴら、（２０１３）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９：５２７５－５２８０；Ｖｅｒｍａ Ａら、（２０１１）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０：１７６３－１７７３）。近年では、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、がん治療剤の最も急速に成長しているクラスの１つになっている（Ｂｅｃｋ Ａら、（２０１７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １６：３１５－３３７；Ｐｅｔｅｒｓ ＣおよびＢｒｏｗｎ Ｓ、（２０１５）Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ ３５：ａｒｔ：ｅ００２２５）。様々な抗ＭＥＲＴＫ抗体を含む様々なＡＤＣが記載されており、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１９／００５７５６および同ＷＯ２０２０／１７６４９７を参照のこと。
様々な抗ＭＥＲＴＫ抗体が記載されており、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／１０６２２１、同ＷＯ２０１９／００５７５６および同ＷＯ２０２０／１７６４９７を参照のこと。
本明細書中における参考文献の引用は、そのようなものが本開示に対する先行技術であることを認めるものとして解釈してはならない。
国際公開第２０１９／００５７５６号 国際公開第２０２０／１７６４９７号
Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＣＴら、（２０１３）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９：５２７５－５２８０ Ｖｅｒｍａ Ａら、（２０１１）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０：１７６３－１７７３ Ｓａｔｈｅｒ Ｓら、（２００７）Ｂｌｏｏｄ １０９：１０２６－１０３３ Ｐｎｇ ＫＪら、（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４８１：１９０－１９４
３．概要
本発明は、ヒトＭＥＲＴＫの連続したアミノ酸配列（配列番号１）または連続したアミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドであって、連続したアミノ酸配列が、ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）のアミノ酸番号３７９～４２３、およびヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて４００個の連続したアミノ酸を含み、バリアントが、（ａ）配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみ、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する多くて２個の保存的置換を有する、ポリペプチドを提供する。
具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４を含む。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、連続したアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、バリアントを含む。具体的な実施形態において、バリアントは配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも９０％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、バリアントは配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する多くて２個の保存的置換を有する。具体的な実施形態において、バリアントは配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも９０％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、バリアントは配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４に対する保存的置換のみを有する。
具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて３００個の連続したアミノ酸を含む。
具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて２００個の連続したアミノ酸を含む。
具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて１００個の連続したアミノ酸を含む。
具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて５０個の連続したアミノ酸を含む。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、連続したアミノ酸配列からなる。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、第２のアミノ酸配列に連結される連続したアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。具体的な実施形態において、第２のアミノ酸配列はアジュバントのアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、アジュバントはキーホールリンペットヘモシアニンである。具体的な実施形態において、第２のアミノ酸配列はタグまたは標識を含む。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、凍結乾燥形態である。
本発明は、分子に結合しているポリペプチドを含むコンジュゲートも提供する。具体的な実施形態において、分子はアジュバントである。具体的な実施形態において、分子はポリペプチドに共有結合により結合している。具体的な実施形態において、コンジュゲートは凍結乾燥形態である。
本発明は、ポリペプチドまたはコンジュゲートと、免疫目的のために好適であるキャリアとを含む、免疫原性組成物も提供する。具体的な実施形態において、免疫原性組成物は、さらにアジュバントを含む。
本発明は、抗ＭＥＲＴＫ抗体を産生する方法であって、（ａ）非ヒト哺乳動物をポリペプチド、コンジュゲート、あるいは免疫原性組成物により免疫すること、（ｂ）非ヒト哺乳動物からの抗体産生細胞を不死化して、不死化された抗体産生細胞を産生すること、（ｃ）ＭＥＲＴＫと免疫特異的に結合する抗体を分泌する不死化された抗体産生細胞を選択すること、および（ｄ）不死化された抗体産生細胞を、抗体が産生されるように細胞培養物において培養することを含む、方法も提供する。具体的な実施形態において、哺乳動物はマウスである。具体的な実施形態において、抗体産生細胞を不死化する工程は、抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して、抗体産生ハイブリドーマを産生することを含む。具体的な実施形態において、産生する方法はさらに、抗体を細胞培養物から単離することを含む。具体的な実施形態において、産生する方法はさらに、単離された抗体を精製することを含む。
本発明は、抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする抗体配列を特定する方法であって、（ａ）非ヒト哺乳動物をポリペプチド、コンジュゲート、あるいは免疫原性組成物により免疫すること、（ｂ）抗体産生細胞を非ヒト哺乳動物から単離すること、（ｃ）抗体産生細胞の抗体配列をクローニングし、抗体配列のライブラリーを作製すること、（ｄ）抗体配列をライブラリーにおいて発現させること、および（ｅ）ライブラリーにおいて発現されるときに、ＭＥＲＴＫに免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する抗体配列を選択することを含む、方法も提供する。
本発明は、候補の抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合抗体フラグメントをスクリーニングする方法であって、（ａ）抗体またはフラグメントを、ポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する能力についてアッセイすること、および（ｂ）ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定することを含む、方法も提供する。具体的な実施形態において、抗体またはフラグメントを、ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する能力についてアッセイすることは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して行われる。具体的な実施形態において、スクリーニングする方法は、ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する能力についてアッセイし、かつ、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定する工程をさらに含む。具体的な実施形態において、方法はさらに、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することを含む。具体的な実施形態において、スクリーニングする方法は、ポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの分解を誘導する能力についてアッセイし、かつ、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの分解を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定する工程をさらに含む。具体的な実施形態において、方法はさらに、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの分解を誘導する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することを含む。具体的な実施形態において、スクリーニングする方法はさらに、前記ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することを含む。
本発明は、抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合フラグメントを、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合フラグメントを特定するためにスクリーニングする方法であって、（ａ）抗体またはフラグメントを、ポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する能力についてアッセイすること、および（ｂ）ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定し、それによって、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定することを含む、方法も提供する。具体的な実施形態において、スクリーニングする方法は、工程（ｂ）において特定される１またはそれを超える抗体またはフラグメントを、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する能力についてアッセイし、かつ、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定することをさらに含む。具体的な実施形態において、スクリーニングする方法はさらに、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することを含む。具体的な実施形態において、スクリーニングする方法はさらに、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの分解を誘導する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することを含む。
４．図の簡単な説明
図１は、１８０分のインキュベーション時間にわたる（ＣｏｖａｌＸのＫ２００ ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析キットを使用する）Ｋ２００による架橋の前後における０．８４μＭの濃度での抗体ｚ１０（１／８の希釈、総体積：１０μｌ）のＨｉｇｈ Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ（飛行時間型質量分析）分析の結果を示す。
図２は、１８０分のインキュベーション時間にわたるＫ２００による架橋の前後における１．３１μＭの濃度でのｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ（１／４の希釈、総体積：１０μｌ）のＨｉｇｈ Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ分析の結果を示す。
図３は、抗体ｚ１０（０．８４μＭ）に架橋されるｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ（２．６２μＭ）（総体積：１０μｌ）のＨｉｇｈ Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ分析の結果を示す。架橋を３６０分のインキュベーション時間にわたってＫ２００により行った。
図４Ａ～図４Ｂは、トリプシンペプチド、キモトリプシンペプチド、ＡＳＰ－Ｎペプチド、エラスターゼペプチドおよびサーモリシンペプチドのオーバーラップマッピングを示す。トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼおよびサーモリシンによるタンパク質分解のペプチドを組み合わせることにより、配列の９８．７３％が網羅される。 図４Ａ～図４Ｂは、トリプシンペプチド、キモトリプシンペプチド、ＡＳＰ－Ｎペプチド、エラスターゼペプチドおよびサーモリシンペプチドのオーバーラップマッピングを示す。トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼおよびサーモリシンによるタンパク質分解のペプチドを組み合わせることにより、配列の９８．７３％が網羅される。
図５Ａ～図５Ｂは、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃのトリプシン消化についてｎＬＣ（ナノ液体クロマトグラフィー）クロマトグラム（図５Ａ）およびＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐによって検出されるイオンの総和（図５Ｂ）を示す。 図５Ａ～図５Ｂは、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃのトリプシン消化についてｎＬＣ（ナノ液体クロマトグラフィー）クロマトグラム（図５Ａ）およびＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐによって検出されるイオンの総和（図５Ｂ）を示す。
図６は抗体ｚ１０とｒｈＭＥＲ＿Ｆｃとの相互作用を示す。アミノ酸ナンバリングは配列番号１に従っている。
図７は抗体ｚ１０とｒｈＭＥＲ＿Ｆｃとの相互作用を示す。図７Ａ：前面から見たリボン／表面表示；図７Ｂ：背面から見たリボン／表面表示；図７Ｃ：側面から見たリボン／表面表示１；図７Ｄ：側面から見たリボン／表面表示２；図７Ｅ：上面から見たリボン／表面表示；図７Ｆ：前面から見たリボン表示；図７Ｇ：背面から見たリボン表示；図７Ｈ：側面から見たリボン表示１；図７Ｉ：側面から見たリボン表示２；図７Ｊ：上面から見たリボン表示。
５．詳細な説明
本発明は、抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメント、好ましくは抗ヒトＭＥＲＴＫ抗体および抗原結合フラグメント、特に細胞表面に存在するＭＥＲＴＫ（特に、ヒトＭＥＲＴＫ）の内部移行および／または分解を誘導するそのような抗体を生じさせるための免疫原として使用することができるポリペプチドを提供する。そのような抗体およびその抗原結合フラグメントは、がん治療剤としての使用のために意図される。ポリペプチドはまた、そのような抗体および抗原結合フラグメントについてのスクリーニングにおいて使用することができる。本明細書中に記載されるように、ポリペプチドはヒトＭＥＲＴＫの連続したアミノ酸配列（配列番号１）または前記連続したアミノ酸配列のバリアントを含む。本明細書中に記載されるようなヒトＭＥＲＴＫの連続したアミノ酸配列またはバリアントを含むポリペプチドに加えて、本発明ではまた、当該連続したアミノ酸配列またはバリアントからなるポリペプチド、あるいは当該連続したアミノ酸配列またはバリアントから本質的になるポリペプチドも意図される。
ヒトＭＥＲＴＫの配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｑ１２８６６）（これにはシグナル配列が含まれる）は下記の通りである：
Figure 2024519333000002
 ５．１ ポリペプチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」には、タンパク質がペプチドと同様に含まれる。
本明細書中で使用される場合、「ヒトＭＥＲＴＫ」または「ＭＥＲＴＫ」に言及するときには、文脈がそうでないことを示している場合を除いて、そのようなものは、シグナル配列を欠く成熟形態のヒトＭＥＲＴＫまたはＭＥＲＴＫであるとそれぞれ見なされる。ヒトＭＥＲＴＫのシグナル配列は配列番号１のアミノ酸１～２０からなる。したがって、ヒトＭＥＲＴＫの成熟形態のアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸番号２１～９９９である。具体的な実施形態において、ＭＥＲＴＫは、本明細書中で言及される場合、（文脈がそうでないことを示している場合を除いて）ヒトＭＥＲＴＫである。
本発明は、ヒトＭＥＲＴＫの連続したアミノ酸配列（配列番号１）または連続したアミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドであって、連続したアミノ酸配列が、ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）のアミノ酸番号３７９～４２３、およびヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて４００個の連続したアミノ酸を含み、バリアントが、（ａ）配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも７０％（例えば、少なくとも９０％）の配列同一性を有するか、または配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみ、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する多くて１０個（例えば、多くて２個）の保存的置換を有する、ポリペプチドを提供する。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、連続したアミノ酸配列を含む（ポリペプチドはバリアントを含まない）。別の具体的な実施形態において、ポリペプチドはバリアントを含む。
本発明のポリペプチドはヒトＭＥＲＴＫの全長未満の細胞外ドメイン配列を含み、ヒトＭＥＲＴＫのシグナル配列を欠く。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、連続したアミノ酸配列を含む（ポリペプチドはバリアントを含まない）。
具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて３００個の連続したアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて２００個の連続したアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて１００個の連続したアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて９０個の連続したアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて８０個の連続したアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて７０個の連続したアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて６０個の連続したアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて５０個の連続したアミノ酸を含む。
具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列は、ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個または４００個の連続したアミノ酸からなる。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸番号３７９～４２３からなる。
具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドは、生来の全長ヒトＭＥＲＴＫの内部に含有される三次元構造（例えば、ＭＥＲＴＫのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインによって形成される三次元構造）と同じであるか、または類似している三次元構造を形成することができる。ヒトＭＥＲＴＫの２つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインが配列番号１のアミノ酸番号２８６～３８１およびアミノ酸番号３８６～４８４にそれぞれ対応する。当業者に知られている好適な技法はどれも、構造類似性を評価するために使用することができる。例えば、生来のＭＥＲＴＫを認識する抗体に対する、例えば、非変性条件のもとでの結合、または分子モデリングが、恐らくは構造類似性を示すために使用される。
具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列はヒトＭＥＲＴＫの２つのフィブロネクチンドメインを含み、これら２つのフィブロネクチンドメインはそれぞれ、配列番号１のアミノ酸２８６～３８１およびアミノ酸３８６～４８４である。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列は、ヒトＭＥＲＴＫの２つのフィブロネクチンドメインと、介在するアミノ酸とを含む（すなわち、連続したアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸２８６～４８４を含む）。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも９０％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも９９％の配列同一性を有する。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、ヒトＭＥＲＴＫの連続したアミノ酸配列のバリアントを含む。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも７０％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも９０％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも９９％の配列同一性を有する。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも９０％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する。具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも９９％の配列同一性を有する。
パーセント同一性を２つの配列（例えば、アミノ酸配列）の間で決定することを、この技術分野で知られている任意のアルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために利用されるアルゴリズムの具体的な、限定されない一例が、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムであって、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：５８７３－５８７７におけるように改変されるアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、本明細書中に記載される核酸分子に対して相同的であるヌクレオチド配列を得るために、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２について設定されるＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターを用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、本明細書中に記載されるタンパク質分子に対して相同的であるアミノ酸配列を得るために、例えば、スコア＝５０、ワード長＝３に設定されるＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターを用いて行うことができる。比較目的のためのギャップ挿入アライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、（１９９７）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９ ３４０２に記載されるように利用することができる。代替として、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴを、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うために使用することができる（同書）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラム、およびＰＳＩ Ｂｌａｓｔプログラムを利用するときには、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴのデフォルトパラメーター）を使用することができる（例えば、ワールドワイドウェブ上の国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ） ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の具体的な、限定されない一例が、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１ １７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムが、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用するときには、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長さペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用することができる。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて１０個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）の保存的置換を有する。具体的な実施形態において、連続したアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４を含む。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて９個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個）の保存的置換を有する。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて８個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個）の保存的置換を有する。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて７個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個）の保存的置換を有する。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて６個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個または６個）の保存的置換を有する。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて５個（例えば、１個、２個、３個、４個または５個）の保存的置換を有する。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて４個（例えば、１個、２個、３個または４個）の保存的置換を有する。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて３個（例えば、１個、２個または３個）の保存的置換を有する。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて２個（例えば、１個または２個）の保存的置換を有する。
具体的な実施形態において、バリアントは、配列番号１に対する連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３における多くて１個の保存的置換を有する。
用語「保存的置換」（すなわち、「保存的アミノ酸置換」）は、この技術分野で知られている任意の意味を有することができる。保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似する物理化学的性質（例えば、類似する電荷およびサイズ）を有する別のアミノ酸により置換することである。類似する電荷を有するアミノ酸のグループがこの技術分野では広く知られており、そのようなグループには、例えば、下記の６つの保存的置換グループが含まれる：グループ１（アラニン、グリシン、セリンおよびトレオニン）、グループ２（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、グループ３（アスパラギンおよびグルタミン）、グループ４（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、グループ５（イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン）、およびグループ６（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）。
アミノ酸はまた、類似する機能、化学的構造または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、イオウ含有）によって、下記のグループなどの保存的置換グループにグループ分けされ得る。脂肪族アミノ酸には、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。イオウ含有アミノ酸には、例えば、メチオニンおよびシステインが含まれる。酸性アミノ酸およびそれらのアミドには、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。小さい脂肪族の非極性残基またはわずかに極性の残基を有するアミノ酸には、例えば、アラニン、セリン、トレオニン、プロリンおよびグリシンが含まれる。極性の陰性荷電残基を有するアミノ酸およびそれらのアミドには、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンが含まれる。極性の陽性荷電残基を有するアミノ酸には、例えば、ヒスチジン、アルギニンおよびリシンが含まれる。大きい脂肪族の非極性残基を有するアミノ酸には、例えば、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびシステインが含まれる。大きい芳香族残基を有するアミノ酸には、例えば、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが含まれる。
一般には、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の安定性または機能に影響しないと予想される。
本明細書中に提供されるポリペプチドは、この技術分野で知られているポリペプチドに対する１またはそれを超える改変によって、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端または内部において改変されてよい。
具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドは１またはそれを超えるＮ末端改変を含有する。具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドは１またはそれを超えるＣ末端改変を含有する。具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドは１またはそれを超える内部改変を含有する。
例えば、ある特定の実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドは、ジスルフィド結合形成、グリコシル化（例えば、Ｎ結合型グリコシル化）、ファルネシル化、脂質修飾（例えば、Ｓ－パルミトイル化）、アセチル化、ビオチン化、リン酸化、異なるポリペプチドの配列に対するＮ末端またはＣ末端での融合、あるいは異なる分子に対するコンジュゲーションによって改変される。
ある特定の実施形態において、Ｎ末端の改変には、アシル化が含まれ、これには、Ｎ－ホルミル基、Ｎ－アセチル基、Ｎ－プロピル基、および長鎖脂肪酸基が含まれる。
具体的な実施形態において、Ｃ末端はカルボン酸である。具体的な実施形態において、Ｃ末端の改変はアミド化によってである。したがって、具体的な実施形態において、Ｃ末端はアミドである。
具体的な実施形態において、本明細書中に記載されるポリペプチドにおける１またはそれを超えるＬ－アミノ酸が（１またはそれを超える）Ｄ－アミノ酸（複数可）により置換される。Ｄ－アミノ酸は、置換されようとするアミノ酸残基と同じアミノ酸であることが可能であり、または異なるアミノ酸であることが可能である。
具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドの１またはそれを超えるアミノ酸が、非標準アミノ酸である修飾アミノ酸により置換される。
別の具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドは、限定されないが、環化を達成するためのペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカー（例えば、アラニン架橋）を含めて、この技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して環化される。例えば、本明細書中に提供されるポリペプチドは、生来のヒトＭＥＲＴＫペプチドの三次元構造を模倣するために環化され得る。
具体的な実施形態において、ポリペプチドは、第２のアミノ酸配列に連結されるヒトＭＥＲＴＫ配列の連続したアミノ酸配列（例えば、配列番号１の５０個、１００個、２００個、３００個または４００個の連続したアミノ酸）を含む融合タンパク質である。
具体的な実施形態において、第２のアミノ酸配列はアジュバントのアミノ酸配列である。具体的な実施形態において、アジュバントはキーホールリンペットヘモシアニンである。
具体的な実施形態において、第２のアミノ酸配列はタグまたは標識を含む。タグまたは標識の例には、Ｈｉｓタグ、Ｆｃタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、およびＭｙｃタグが含まれる。
別の局面において、本明細書中には、所与の分子に結合している本明細書中に記載されるポリペプチドを含むコンジュゲートが提供される。分子はポリペプチドとは異なる。分子はポリペプチドに共有結合により、または非共有結合により結合していることが可能である。具体的な実施形態において、分子はポリペプチドに共有結合により結合している。分子は、Ｎ末端、またはＣ末端、またはポリペプチドにおける内部位置においてポリペプチドに結合していることが可能である。具体的な実施形態において、例えば、コンジュゲートが免疫において使用されるときには、分子はアジュバントである（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）。具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるコンジュゲートは凍結乾燥形態であってよい。凍結乾燥されたコンジュゲートは、免疫のために使用する前に、免疫目的のために好適であるキャリア、例えば、無菌の溶液において再構成して、免疫原性組成物を形成することができる。別の具体的な実施形態において、例えば、コンジュゲートが、抗体または抗原結合フラグメントをスクリーニングする際に使用されるときには、分子は標識であり、標識はペプチド標識または非ペプチド標識であることが可能である。標識は、蛍光性部分、ビオチン、酵素部分などであることが可能であり、しかし、これらに限定されない。
本明細書中に提供されるポリペプチドおよびコンジュゲートは、この技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して作製され得る。具体的な実施形態において、本明細書中に記載されるポリペプチドは化学合成法によって合成される。具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドは、細菌発現系、酵母発現系、植物発現系、哺乳動物発現系、または他の発現系をインビトロで使用して組換え発現される。
具体的な実施形態において、本明細書中に記載されるポリペプチドは、固相合成または他の化学合成を使用して合成される。ポリペプチドは、固相合成手法により、例えば、Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｇｒｏｓｓ Ｅ．、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１－２８４；Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ、Ｓ．Ａ．Ｋａｔｅｓ、Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００；Ｍｙｅｒｓ Ａ．Ｇ．ら（１９９７）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：６５６；Ｍｙｅｒｓ Ａ．Ｇ．ら（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：３３２２Ｄ；Ａ．Ｗｅｌｌｉｎｇｓ、Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ、（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：４４；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．ら、（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１；Ｈ．Ｒｉｎｋ、（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３７８７；Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ、Ｂ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２０：４５１；Ｊ．Ｃｏｓｔｅら、（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３２：１９６７；Ｌ．Ａ．Ｃａｒｐｉｎｏ、Ａ．Ｅｌｆａｈａｍ、Ｃ．Ａ．Ｍｉｎｏｒ、Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ、（１９９４）Ｊ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、２０１；Ｍ．Ｆｅｌｉｘら、（１９９８）Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．５２：１５５；米国特許第５，７７０，７３２号（１９９８年６月２３日発行）；米国特許第５，５１４，８１４号（１９９６年５月７日発行）；および米国特許第５，４８９，６９２号（１９９６年２月６日発行）に記載される固相合成手法により調製することができる。本発明のポリペプチドを調製するために有用である様々な出発物質、およびそのための中間体が市販されており、またはそれらを、知られている合成方法および試薬を使用して市販物から調製することができる。
合成されたポリペプチドは、任意の好適な分析方法によって、例えば、分析ＨＰＬＣ、ＦＡＢ－ＭＳ、ＥＳ－ＭＳおよび／またはアミノ酸分析によって特徴づけることができる。具体的な実施形態において、ポリペプチドは、例えば、すべてのＵＶ活性ピークから決定される場合、９７％を超える純度を有する。
所望されるならば、非天然の非アルファアミノ酸およびペプチド模倣物が合成期間中にポリペプチドに組み込まれてよい。
具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドは凍結乾燥形態であってよい。凍結乾燥されたポリペプチドは、免疫のために使用する前に、免疫目的のために好適であるキャリア、例えば、無菌の溶液において再構成して、免疫原性組成物を形成させることができる。
５．２ 抗体を産生する方法
別の局面において、本明細書中には、抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合抗体フラグメントを産生する方法が提供される。本明細書中に記載される方法に従って産生される抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗原結合フラグメントは、がんの処置における使用について示されている。
本明細書中で使用される場合、用語「抗原結合フラグメント」または用語「抗原結合抗体フラグメント」は、抗体分子に抗原（例えば、フレームワーク領域によって囲まれる相補性決定領域（ＣＤＲ））についてのその特異性を与えるアミノ酸残基を含む抗体分子の一部を示す。例として、抗原結合フラグメントには、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ナノボディ、抗原結合ペプチド、および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによってつながれる抗体可変重鎖領域および抗体可変軽鎖領域を含むタンパク質である。
抗原結合フラグメントを、当業者に知られている任意の技法によって生じさせることができる。例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを、酵素を使用して、例えば、（Ｆａｂフラグメントを産生するために）パパインを、または（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために）ペプシンを使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生することができる。Ｆａｂフラグメントは、抗体分子の２つの同一アームの一方に対応し、重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインと対形成する完全な軽鎖を含有する。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結される抗体分子の２つの抗原結合アームを含有する。ｓｃＦｖを、この技術分野で知られている組換え方法によって生じさせることができる。ナノボディを、この技術分野で知られている様々な方法によって作製することができる。例えば、Ｙａｎｇ Ｅ．Ｙ．＆Ｓｈａｈ Ｋ．、Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．、２０２０、１０：１１８２（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０２０．０１１８２）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０２１、２８８：２０８４－２１０２；およびＨａｒｍｓｅｎ Ｍ．Ｍ．＆Ｄｅ Ｈａａｒｄ Ｈ．Ｊ．、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００７、７７：１３－２２を参照のこと。抗原結合ペプチドを、この技術分野で知られている様々な方法によって作製することができる。例えば、Ｓａｗ Ｐ．Ｅ．＆Ｓｏｎｇ ＥＷ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ、２０１９、１０：７８７－８０７を参照のこと。
別の局面において、本明細書中には、本明細書中に提供されるポリペプチドまたはコンジュゲートと、免疫目的のために好適であるキャリアとを含む免疫原性組成物が提供される。具体的な実施形態において、免疫原性組成物はさらにアジュバントを含む。そのような免疫原性組成物は、抗ＭＥＲＴＫ抗体を産生するために免疫において使用されてよい。使用されることがあるアジュバントの具体例には、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムなど）、エマルジョン型アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント、ＭＦ５９）、ＴＬＲアゴニスト（例えば、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃ、レミキモド（ｒｅｍｉｑｕｉｍｏｄ）およびイミキモド）が含まれるが、これらに限定されない。アジュバントの他の例が、例えば、ＭｃＫｅｅおよびＭａｒｒａｃｋ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７ Ａｕｇｕｓｔ；４７：４４－５１に記載される。免疫原性組成物は、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫するために使用されてよい。具体的な実施形態において、本明細書中に提供される抗ＭＥＲＴＫ抗体を産生する方法は、１回を超える非ヒト哺乳動物の免疫を含む。例えば、本明細書中に提供されるポリペプチドが、数日（例えば、約７日、約１０日、約１４日または約２１日）の経過にわたって繰り返し非ヒト哺乳動物に投与される場合がある。具体的な実施形態において、非ヒト哺乳動物は、２回、３回、４回または５回免疫される。
免疫原性組成物の、免疫目的のために好適であるキャリアは、この技術分野で知られている任意の好適なキャリアであり得る。具体的な実施形態において、免疫原性組成物は溶液である。具体的な実施形態において、キャリアは無菌のキャリアであり、例えば、免疫原性組成物は、ポリペプチドまたはコンジュゲートが溶解される無菌の溶液である。具体的な実施形態において、免疫原性組成物は、好適な緩衝液であるキャリアに溶解されるポリペプチドまたはコンジュゲートを含む。免疫原性組成物のために使用してよい緩衝液の例には、限定されないが、好ましくは生理学的レベルの食塩水（１５０ｍＭのＮａＣｌ）を含有する酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、コハク酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液および（Ｔｒｉｓ）緩衝液が含まれる。具体的な実施形態において、免疫原性組成物は、２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌの溶液（ｐＨ６．２）中にポリペプチドまたはコンジュゲートを含む。具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるポリペプチドまたはコンジュゲートは凍結乾燥形態であり、そして免疫のために使用する前に、免疫目的のために好適であるキャリア、例えば、無菌の溶液において再構成して、免疫原性組成物を形成させる。
本明細書中に記載される方法に従って産生される抗ＭＥＲＴＫ抗体は、例えば、モノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術、組換え技術およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含めてこの技術分野で知られている広範囲の様々な技法を使用して調製することができる。クローン細胞株の調製、およびそれによって発現されるモノクローナル抗体の調製のための様々な方法がこの技術分野では広く知られている（例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２年、第５版、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら（前掲））における第１１章を参照のこと）。例えば、モノクローナル抗体を、この技術分野で知られているハイブリドーマ技法、ならびに、例えば、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ＆Ｌａｎｅ Ｄ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ＧＪら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３ ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）；およびＫｏｈｌｅｒ Ｇ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５において教示されるハイブリドーマ技法を含めて様々なハイブリドーマ技法を使用して産生することができる。
具体的な実施形態において、本発明は、抗ＭＥＲＴＫ抗体を産生する方法であって、（ａ）非ヒト哺乳動物を本明細書に提供されるポリペプチド、コンジュゲート、あるいは免疫原性組成物により免疫すること、（ｂ）非ヒト哺乳動物からの抗体産生細胞を不死化して、不死化された抗体産生細胞を産生すること、（ｃ）ＭＥＲＴＫおよび／または前記ポリペプチドもしくはコンジュゲートと免疫特異的に結合する抗体を分泌する不死化された抗体産生細胞を選択すること、および（ｄ）不死化された抗体産生細胞を、抗体が産生されるように細胞培養物において培養することを含む、方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、免疫することは、動物に注射することによってである。具体的な実施形態において、哺乳動物はげっ歯類（例えば、ラット、ウサギまたはマウス）である。具体的な実施形態において、哺乳動物はラクダ科動物（例えば、ラクダまたはラマ）である。具体的な実施形態において、不死化された抗体産生細胞はハイブリドーマである。具体的な実施形態において、抗体産生細胞を不死化する工程は、抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して、抗体産生ハイブリドーマを産生することを含む。したがって、具体的な実施形態において、本明細書中に記載される抗ＭＥＲＴＫ抗体を産生する方法は、ハイブリドーマ技術を使用して抗体を産生することを含む。
特異的抗体を、ハイブリドーマ技術を使用して産生し、特異的抗体についてスクリーニングするための様々な方法が日常的であり、この技術分野では広く知られている。具体的な実施形態の１つが下記のように記載される。マウス（または他の非ヒト哺乳動物、例えば、ラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ハムスターまたはイヌなど）を抗原（本明細書中に記載されるポリペプチドまたはコンジュゲート）により免疫することができ、免疫応答が検出されると、例えば、抗原について特異的な抗体が血清中に検出されると、脾臓が採取され、（抗体産生細胞を含有する）脾細胞が単離される。脾細胞はその後、広く知られている技法によって、いずれかの好適なミエローマ細胞に対して、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能な細胞株ＳＰ２／０に由来する細胞に対して、ハイブリドーマを形成するように融合される。ハイブリドーマが選択され、限定希釈によってクローン化される。このようにして調製されるハイブリドーマ細胞が、非融合の元のミエローマ細胞の成長または生存を阻害する１またはそれを超える物質を好ましくは含有する好適な培養培地において播種され、成長させられる。ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地が、ＭＥＲＴＫに対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後で、クローン体が、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ ＪＷ（編）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、前掲）によってサブクローン化され、成長させられ、培地から分離され得る。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、この技術分野で知られている方法、例えば、免疫沈降によって、あるいはインビトロ結合アッセイ、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）などによって決定される。
具体的な実施形態において、産生される抗体は免疫グロブリンである。本明細書中に記載される方法に従って産生される抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含めて、いずれかのクラスの免疫グロブリンに由来し得、また、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含めて、いずれかのアイソタイプに由来し得る。具体的な実施形態において、特定のアイソタイプについてのスクリーニングが、産生された抗体を、特定のアイソタイプの定常ドメインを認識する抗体または抗血清に対する結合についてアッセイすることによって行われ得る。具体的な実施形態において、産生された、または特定された抗ＭＥＲＴＫ抗体は、例えば、特定のアイソタイプの所望の定常領域に組換えにより結合することができる。
具体的な実施形態において、抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする抗体配列を特定する方法であって、（ａ）非ヒト哺乳動物を本明細書に提供されるポリペプチド、コンジュゲート、あるいは免疫原性組成物により免疫すること、（ｂ）抗体産生細胞を非ヒト哺乳動物から単離すること、（ｃ）抗体産生細胞の抗体配列をクローニングし、抗体配列のライブラリーを作製すること、（ｄ）抗体配列をライブラリーにおいて発現させること、および（ｅ）ライブラリーにおいて発現されるときに、ＭＥＲＴＫおよび／または前記ポリペプチドもしくはコンジュゲートに免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する抗体配列を選択することを含む、方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、哺乳動物はげっ歯類（例えば、ラット、ウサギまたはマウス）である。具体的な実施形態において、哺乳動物はラクダ科動物（例えば、ラクダまたはラマ）である。クローン化され、ライブラリーにおいて発現される抗体配列は、ＶＨ配列および／またはＶＬ配列であり得る。具体的な実施形態において、ライブラリーはｓｃＦｖライブラリーである。
抗体産生細胞の配列は、例えば、ＤＮＡ配列決定を含めて、この技術分野で知られている任意の好適な方法によって決定されてよい。具体的な実施形態において、抗体配列のライブラリーはファージディスプレイライブラリーである。具体的な実施形態において、ライブラリーはｓｃＦｖライブラリーである。具体的な実施形態において、ｓｃＦｖライブラリーは酵母ｓｃＦｖライブラリーである。
ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に呈示される。特に、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列が、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、患部組織のヒトｃＤＮＡライブラリーまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡがＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと一緒に再結合され、ファージミドベクターにクローン化される。ベクターをＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）細胞に電気穿孔し、この大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは典型的には、ｆｄおよびＭ１３が含まれる繊維状ファージであり、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは通常の場合、ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのどちらかに組換え融合される。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原を用いて、例えば、標識された抗原、あるいは固体表面またはビーズに結合しているか、または捕捉されている抗原を使用して選択することができ、または同定することができる。抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ方法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕら、（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０；Ａｍｅｓ ＲＳら、（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡら、（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：９５２－９５８；Ｐｅｒｓｉｃ Ｌら、（１９９７）Ｇｅｎｅ １８７：９－１８；Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ＆Ｂａｒｂａｓ ＣＦ、（１９９４）Ａｄｖａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５７：１９１－２８０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／００１１３４；国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９、同ＷＯ９１／１０７３７、同ＷＯ９２／０１０４７、同ＷＯ９２／１８６１９、同ＷＯ９３／１１２３６、同ＷＯ９５／１５９８２、同ＷＯ９５／２０４０１および同ＷＯ９７／１３８４４；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号において開示される方法が含まれる。
上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージから得られる抗体コード領域を、完全な抗体または任意の所望の抗原結合フラグメントを生じさせるために単離し、使用し、また、例えば、下記において記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含めて任意の所望の宿主において発現させることが可能である。抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え産生するための様々な技法もまた、この技術分野で知られている方法を使用して、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ＲＬら、（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４－９；Ｓａｗａｉ Ｈら、（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：２６－３４；およびＢｅｔｔｅｒ Ｍら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３において開示される方法などを使用して用いることができる。
具体的な実施形態において、本明細書中に記載される方法に従って産生される抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである。ヒト抗体を、この技術分野で知られている任意の方法を使用して産生することができる。
例えば、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することができないが、しかし、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用することができる。特に、ヒトの重鎖免疫グロブリン遺伝子および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の複合体をマウス胚性幹細胞にランダムに、または相同的組換えによって導入することができる。代替として、ヒトの可変領域、定常領域および多様性領域を、ヒトの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞に導入することができる。マウスの重鎖免疫グロブリン遺伝子および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、または相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と同時に非機能性にすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失により、内因性抗体の産生が妨げられる。改変された胚性幹細胞が拡大され、キメラマウスを産生するために胚盤胞に顕微注入される。キメラマウスはその後、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を産生するために交配される。トランスジェニックマウスは、選択された抗原により、例えば、本明細書中に記載されるポリペプチドにより通常の様式で免疫される。抗原に対するモノクローナル抗体を、単一Ｂ細胞技術またはハイブリドーマ技術を使用して、免疫されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって収容されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞分化の期間中に再編成し、続いてクラススイッチング組換えおよび体細胞高頻度変異を受ける。したがって、そのような技法を使用して、治療有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ＆Ｈｕｓｚａｒ Ｄ（１９９５）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５－９３を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、国際公開番号ＷＯ９８／２４８９３、同ＷＯ９６／３４０９６および同ＷＯ９６／３３７３５、ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号および同第５，９３９，５９８号を参照のこと。ヒト抗体を産生する能力があるマウスの例には、Ｔｒｉａｎｎｉ（登録商標）マウス（例えば、米国特許第１０，８８１，０８４号および同第１０，７９３，８２９号に記載されるマウス）、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．；米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，１８４号）、ＨｕＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．／Ｇｅｎ Ｐｈａｒｍ；米国特許第５，５４５，８０６号および第５，５６９，８２５号）、Ｔｒａｎｓ Ｃｈｒｏｍｏ Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｋｉｒｉｎ）、およびＫＭ Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｋｉｒｉｎ）が含まれる。
具体的な実施形態において、本明細書中に記載される方法に従って産生される抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメントはさらに、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体を産生するために改変される。キメラ抗体は、抗体の様々な異なる部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来する分子であり、一方で、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域を含む。
具体的な実施形態において、本明細書中に記載される方法に従って産生される抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメントはさらに、例えば、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を産生するために改変される。
具体的な実施形態において、本明細書中に提供される抗ＭＥＲＴＫ抗体を産生する方法はさらに、（１またはそれを超える）抗体（複数可）を細胞培養物から単離することを含む。抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメントが産生され、細胞培養物から単離されると、抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン分子の精製のためにこの技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性（特にプロテインＡ後の特定の抗原に対する親和性によって）、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）によって、遠心分離によって、示差的溶解度によって、またはタンパク質の精製のための他の標準的な技法によって精製することができる。さらに、本明細書中に記載される抗体は、精製を容易にするために本明細書中に記載されているか、またはそうでない場合にはこの技術分野で知られている異種ポリペプチド配列に融合され得る。具体的な実施形態において、抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメントは単離され、または精製される。具体的な実施形態において、抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメントは、単離された抗体とは異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない。例えば、特定の実施形態において、本明細書中に記載される抗体の調製物は細胞材料および／または化学的前駆体を実質的に含まない。具体的な実施形態において、「細胞材料を実質的に含まない」抗体調製物には、抗体の調製物であって、当該抗体が単離される細胞の細胞成分から当該抗体が分離される調製物が含まれる。したがって、細胞材料を実質的に含まない抗体には、（乾燥重量基準で）約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満または０．１％未満の異種タンパク質（これはまた本明細書中では「混入タンパク質」として示される）および／または抗体のバリアント（例えば、抗体フラグメント）を有する抗体の調製物が含まれる。
５．３ 抗体をスクリーニングする方法
別の態様では、候補の抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合フラグメントをスクリーニングする方法であって、方法は、（ａ）本明細書に提供される抗体またはフラグメントを、ポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する能力についてアッセイすること、および（ｂ）ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する１またはそれを超える抗体または抗原結合フラグメントを特定することを含む、方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、候補の抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書中上記で記載されるように産生され、または特定される。具体的な実施形態において、候補の抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、ナノボディまたはペプチド抗体のライブラリーである。具体的な実施形態において、候補の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、ヒト抗体配列のファージディスプレイライブラリーまたはリボソームディスプレイライブラリーまたは酵母ディスプレイライブラリーである。前記ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する能力について抗体または抗原結合フラグメントをアッセイすることを、この技術分野で知られている任意の好適な方法によって行うことができる。具体的な実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントを、ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する能力についてアッセイすることは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して行われる。
具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるスクリーニングする方法において使用されるポリペプチドは、第２のアミノ酸配列がタグまたは標識を含む本明細書中に記載されるような融合タンパク質である。別の具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるコンジュゲートは、本明細書中に提供されるスクリーニングする方法において使用され、タグまたは標識である分子に結合している本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含む。
具体的な実施形態において、本明細書に提供されるスクリーニングする方法は、ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する能力についてアッセイし、かつ、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定する工程をさらに含む。
具体的な実施形態において、本明細書に提供されるスクリーニングする方法は、ポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの分解を誘導する能力についてアッセイし、かつ、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの分解を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定する工程をさらに含む。
別の態様では、抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合フラグメントを、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合フラグメントを特定するためにスクリーニングする方法であって、（ａ）抗体またはフラグメントを、本明細書に提供されるポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する能力についてアッセイすること、および（ｂ）ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定し、それによって、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定することを含む、方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、スクリーニングする方法は、工程（ｂ）において特定される１またはそれを超える抗体またはフラグメントを、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する能力についてアッセイし、かつ、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定することをさらに含む。
具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるスクリーニングする方法はさらに、前記ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することを含む。
具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるスクリーニングする方法はさらに、ヒト細胞におけるＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することを含む。
具体的な実施形態において、本明細書中に提供されるスクリーニングする方法はさらに、ヒト細胞におけるＭＥＲＴＫの分解を誘導する抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することを含む。
抗体がヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導するかどうかを決定する様々な方法がこの技術分野では知られており、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０２０／１７６４９７の段落４３０および段落４４２に記載されている。例えば、スクリーニングされている抗体は、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ（ｐＨ感受性色素）により標識され得、抗体の内部移行が、中性ｐＨで最小であり、リソソームなどの酸性環境において最大であるｐＨｒｏｄｏ蛍光を検出するフローサイトメトリーによって決定され得る。ＭＥＲＴＫの分解が、ＭＥＲＴＫタンパク質発現における変化を、例えば、ウエスタンブロッティングを使用して測定することによって決定され得る。
６．実施例
下記の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。
６．１ 実施例１：抗体ｚ１０エピトープの決定
抗体ｚ１０が結合するエピトープを、Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して決定した。抗体ｚ１０は、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０２０／１７６４９７（これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるヒト化抗ヒトＭＥＲＴＫモノクローナル抗体である。抗体ｚ１０は、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行を誘導すること、およびヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの分解を誘導することが示されている（ＷＯ２０２０／１７６４９７、段落４４１～段落４４３および段落４８３を参照のこと）。抗体ｚ１０はまた、細胞培養物におけるがん細胞のコロニー形成および細胞生存を阻害すること（ＷＯ２０２０／１７６４９７、段落４４５および段落４５２を参照のこと）、およびインビボにおけるマウス乳がんモデルでの腫瘍減少をもたらすことが示されている（ＷＯ２０２０／１７６４９７、段落４５３を参照のこと）。
本実施例において記載されるように、抗体ｚ１０が結合するエピトープを、Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して決定した。
６．１．１ Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ質量分析
ｈｉｇｈ－ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ分析を、それぞれのサンプル、抗体ｚ１０（２０ｍＭのヒスチジン＋１５０ｍＭのＮａＣｌ；７．３７ｍｇ／ｍＬ；５０μｌ；ｐＨ６．２）、およびＦｃドメインに融合される組換えヒトＭＥＲＴＫ（ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ）（無菌ＰＢＳにおいて１００μｇ／ｍｌで再構成されたもの；２回の凍結乾燥）に対して、それらの完全性および凝集レベルを検証するために行った。ｒｈＭＥＲ－Ｆｃを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号８９１－ＭＲ）から得た。これは、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸Ｐｒｏ１００～Ｌｙｓ３３０に融合されるＩｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｍｅｔ－Ａｓｐのアミノ酸リンカーを介して融合されるヒトＭＥＲＴＫ（配列番号１）のアミノ酸番号Ａｒｇ２６～Ａｌａ４９９からなる。
６．１．１．１ 材料および方法
（ｉ）計測手段
完全性／凝集試験のために、測定を、ＣｏｖａｌＸのＨＭ４相互作用モジュールを備えるＡｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して行った。ＣｏｖａｌＸの相互作用モジュールは、ナノモル濃度の感度で２ＭＤａまでの検出を最適化するように設計される特別な検出システムを含有する。
（ｉｉ）サンプル調製：
（ａ）対照実験
ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃタンパク質サンプルを蒸留水により溶解して、表１に示されるように１ｍｇ／ｍｌの濃度にした。
Figure 2024519333000003
２０μｌのそれぞれのタンパク質サンプル、抗体ｚ１０と、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃとをピペッティングして、１０μｌの最終体積を有する８個の希釈物を調製した。サンプルのこれら８個の希釈物は、表２に示される予想された濃度を得るために調製された：
Figure 2024519333000004
得られたそれぞれの希釈物の１μｌを、アセトニトリル／水（１：１、ｖ／ｖ）、０．１％のＴＦＡ中の再結晶シナピン酸マトリックス（１０ｍｇ／ｍｌ）（Ｋ２００ ＭＡＬＤＩ Ｋｉｔ）から構成されるマトリックスの１μｌと混合した。混合後、それぞれのサンプルの１μｌをＭＡＬＤＩプレート（ＳＣＯＵＴ ３８４）にスポットした。室温での結晶化の後、プレートをＭＡＬＤＩ質量分析計に導入し、Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩモードで直ちに分析した。分析を３回繰り返した。
（ｂ）架橋実験
架橋実験は、Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ質量分析による非共有結合性相互作用の直接分析を可能にする。非共有結合性相互作用を含有するタンパク質サンプルを、特別に開発された架橋用混合物（Ｂｉｃｈ，Ｃら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，８２（１），ｐｐ１７２－１７９）と混合することによって、非共有結合性複合体を高感度により特異的に検出することが可能である。生じる共有結合性結合は、相互作用している化学種がサンプル調製プロセスおよびＭＡＬＤＩイオン化を耐え抜くことを可能にする。特別なＨｉｇｈ－Ｍａｓｓ検出システムは、相互作用をＨｉｇｈ－Ｍａｓｓ範囲で特徴づけることを可能にする。
対照実験のために調製されるそれぞれの混合物（９μｌが残された）を、ＣｏｖａｌＸのＫ２００ ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析キットを使用する架橋に付した。９μｌのこれらの混合物（１から１／１２８まで）を１μｌのＫ２００安定剤試薬（２ｍｇ／ｍｌ）と混合し、室温でインキュベートした。インキュベーション時間（１８０分）の後、サンプルを対照実験についてのようにＭＡＬＤＩ分析のために調製した。サンプルを結晶化後直ちに、Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ分析によって分析した。
（ｉｉｉ）Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析
ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ分析を、標準的な窒素レーザーを有するＣｏｖａｌＸのＨＭ４相互作用モジュールを使用し、かつ０～１５００ｋＤａの様々な異なる質量範囲に集中して行った。
分析のために、下記のパラメーターを適用した：
・質量分析計：
・リニア／ポジティブモード
イオン源１：２０ｋＶ
イオン源２：１７ｋＶ
レンズ：１２ｋＶ
パルスイオン抽出：４００ｎｓ
・ＨＭ４
ゲイン電圧：３．１４ｋＶ
加速電圧：２０ｋＶ
６．１．１．２ 結果
（ｉ）抗体ｚ１０
（ａ）対照実験
これらの実験について、ＭＨ＋＝１４８．４３０ｋＤａを有する１つの主ピークが、１から１／１２８までのどの希釈物についても検出された。（図１、対照、ｐ４）（表３）。
Figure 2024519333000005
 （ｂ）架橋実験
これらの実験について、ＭＨ＋＝１５０．２３５ｋＤａを有する１つの主ピークが、１から１／６４までのどの希釈物についても検出された。（図１、架橋、ｐ４）（表４）。
Figure 2024519333000006
複合体トラッカー（ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｒａｃｋｅｒ）ソフトウェアを使用した場合、非共有結合性複合体が、より大きい質量範囲で検出されなかった（図１、重ね合わせ、ｐ４）。
（ｉｉ）ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ
（ｃ）対照実験
これらの実験について、ＭＨ＋＝１９０．９２４ｋＤａを有する１つの主ピークが、１から１／６４までのどの希釈物についても検出された（図２、対照、ｐ５）（表５）。
Figure 2024519333000007
 （ｄ）架橋実験
これらの実験について、ＭＨ＋＝１９８．９６８ｋＤａを有する１つの主ピークが、１から１／１６までのどの希釈物についても検出された（図２、架橋、ｐ５）（表６）。
Figure 2024519333000008
複合体トラッカーソフトウェアを使用した場合、非共有結合性複合体が、より大きい質量範囲で検出されなかった（図２、重ね合わせ、ｐ５）。
６．１．１．３ 結論 凝集試験
Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ質量分析および化学的架橋を使用した場合、ｚ１０または多量体ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの非共有結合性凝集体が検出されなかった。
６．１．２ ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ複合体の特徴づけ
６．１．２．１ 材料および方法
（ｉ）計測手段
ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ複合体の特徴づけのために、測定を、ＣｏｖａｌＸのＨＭ４相互作用モジュールを備えるＡｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して行った。ＣｏｖａｌＸの相互作用モジュールは、ナノモル濃度の感度で２ＭＤａまでの検出を最適化するように設計される特別な検出システムを含有する。
（ｉｉ）サンプル調製
（ａ）対照実験
ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの混合物を表７に示される濃度で調製した：
Figure 2024519333000009
得られた混合物の１μｌを、アセトニトリル／水（１：１、ｖ／ｖ）、０．１％のＴＦＡにおける再結晶シナピン酸マトリックス（１０ｍｇ／ｍｌ）（Ｋ２００ ＭＡＬＤＩ Ｋｉｔ）から構成されるマトリックスの１μｌと混合した。混合後、それぞれのサンプルの１μｌをＭＡＬＤＩプレート（ＳＣＯＵＴ ３８４）にスポットした。室温での結晶化の後、プレートをＭＡＬＤＩ質量分析計に導入し、直ちに分析した。分析を３回繰り返した。
（ｂ）架橋実験
対照実験のために調製される混合物（９μｌが残された）を、ＣｏｖａｌＸのＫ２００ ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析キットを使用する架橋に付した。９μｌの混合物を１μｌのＫ２００安定剤試薬（２ｍｇ／ｍｌ）と混合し、室温でインキュベートした。インキュベーション時間（３６０分）の後、サンプルを対照実験についてのようにＭＡＬＤＩ分析のために調製した。サンプルを結晶化後直ちに、Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ分析によって分析した。
（ｉｉｉ）Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析
ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ分析を、標準的な窒素レーザーを有するＣｏｖａｌＸのＨＭ４相互作用モジュールを使用し、かつ０～１５００ｋＤａの様々な異なる質量範囲に集中して行った。
分析のために、下記のパラメーターを適用した：
質量分析計：
リニア／ポジティブモード
イオン源１：２０ｋＶ
イオン源２：１７ｋＶ
レンズ：１２ｋＶ
パルスイオン抽出：４００ｎｓ
ＨＭ４：
ゲイン電圧：３．１４ｋＶ
加速電圧：２０ｋＶ
装置を較正するために、インスリン、ＢＳＡおよびＩｇＧのクラスターによる外部較正を適用した。それぞれのサンプルについて、３つのスポットを分析した（スポットあたり３００回のレーザー照射）。示されたスペクトルは３００回のレーザー照射の和に対応する。ＭＳデータを、ＣｏｖａｌＸのＣｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｃｋｅｒ分析ソフトウェアバージョン２．０を使用して分析した。
６．１．２．２ 結果
（ｉ）ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ
（ａ）対照実験
この実験について、ＭＨ＋＝１４８．１３７ｋＤａおよびＭＨ＋＝１９０．４６１ｋＤａを有する、ｚ１０およびｒｈＭＥＲ＿Ｆｃがそれぞれ検出された（図３、対照、ｐ８）（表８）。
Figure 2024519333000010
 （ｂ）架橋実験
架橋実験をＫ２００試薬との３６０分のインキュベーション時間の後で完了した。架橋後、ＭＨ＋＝３４６．６９１ｋＤａを有する、１つのさらなるピークが検出された（図３、架橋、ｐ８）（表９）。
Figure 2024519333000011
Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｃｋｅｒソフトウェアを使用して、対照スペクトルおよび架橋スペクトルを重ね合わせた。ＭＨ＋＝３３５．０９８ｋＤａを有する１つの非共有結合性タンパク質複合体が検出された（図３、重ね合わせ、ｐ８）（表１０）。
Figure 2024519333000012
 ６．１．３ ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの特徴づけおよびペプチド質量フィンガープリント。
ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃを特徴づけるために、サンプルを、トリプシン、キモトリプシン、Ａｓｐ－Ｎ、エラスターゼおよびサーモリシンによるタンパク質分解、続いてｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
６．１．３．１ 材料および方法
（ｉ）計測手段
ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの特徴づけのために、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計と連動したｎＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００－ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
（ｉｉ）サンプル調製：
（ａ）還元アルキル化
１０μＬのｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ（２．６３μＭ）を１μＬのＤＳＳ ｄ０／ｄ１２（２ｍｇ／ｍＬ；ＤＭＦ）と混合し、その後、室温で１８０分間、インキュベートした。インキュベーション後、反応を、１μＬの重炭酸アンモニウム（２０ｍＭの最終濃度）を加えることによって停止させ、その後、室温で１時間、インキュベートした。その後、溶液を、スピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）を使用して乾燥し、その後、８Ｍ尿素水（Ｈ２Ｏ ８ Ｍ ｕｒｅａ）に懸濁した（１０μＬ）。混合後、１μｌのＤＴＴ（５００ｍＭ）を溶液に加えた。その後、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、１μｌのヨードアセトアミド（１Ｍ）を加え、その後、暗室において室温で１時間、インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌのタンパク質分解緩衝液を加えた。トリプシン緩衝液は５０ｍＭのＡｍｂｉｃ（ｐＨ８．５）、５％のアセトニトリルを含有し、キモトリプシン緩衝液は１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１０ｍＭのＣａＣＬ２（ｐＨ７．８）を含有し、ＡＳＰ－Ｎ緩衝液は５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を含有し、エラスターゼ緩衝液は５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含有し、サーモリシン緩衝液は５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、０．５ｍＭのＣａＣＬ２（ｐＨ９．０）を含有する。
（ｂ）トリプシンによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃを１μｌのトリプシン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／１００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベートした。
（ｃ）キモトリプシンによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃを０．５μｌのキモトリプシン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／２００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を２５°Ｃで一晩インキュベートした。
（ｄ）ＡＳＰ－Ｎによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃを０．５μｌのＡＳＰ－Ｎ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／２００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベートした。
（ｅ）エラスターゼによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃを１μｌのエラスターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／１００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベートした。
（ｆ）サーモリシンによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃを２μｌのサーモリシン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／５０の比率で混合した。タンパク質分解混合物を７０℃で一晩インキュベートした。
消化後、ギ酸（１％の最終濃度）を溶液に加えた。
（ｉｉｉ）液体クロマトグラフィー
タンパク質分解後、タンパク質分解によって生じたペプチド溶液の１０μｌをナノ液体クロマトグラフィーシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００－ＲＳＬＣ）に負荷した。
－Ａ ９８／０２／０．１ Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ＨＣＯＯＨ ｖ／ｖ／ｖ
－Ｂ ２０／８０／０．１ Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ＨＣＯＯＨ ｖ／ｖ／ｖ
－グラジエント ２－４０ ％ Ｂ、３８分
－注入体積 １０μｌ
－プレカラム ３００－μｍ ＩＤ ｘ ５－ｍｍ Ｃ１８ ＰｅｐＭａｐ（商標）
－プレカラム流速 １０μｌ／分
－カラム ７５－μｍ ＩＤ ｘ ２５－ｃｍ Ｃ１８ ＰｅｐＭａｐＲＳＬＣ
－カラム流速 ３００ｎｌ／分
（ｉｖ）質量分析：ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ分析
ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ分析が下記のパラメーターにより行われている：
ニードル電圧 １．８Ｖ
キャピラリー電圧 ５Ｖ
μｓｃａｎ ＭＳ １
μｓｃａｎ ＭＳ２ １
ＭＳ範囲ｍ／ｚ ３５０－１７００
ＭＳ／ＭＳストラテジー ＭＳ＋６ ＣＩＤ
必要最小シグナル ＭＳ／ＭＳ ５００
イオン分離ウインドウ ３ｍ／ｚユニット
正規化衝突エネルギー ３５％
デフォルト電荷状態 ３
活性化Ｑ ０．２５
活性化時間 ３０
動的排除 ＯＮ
動的排除パラメーター ＲＣ１、ＲＤ３０ｓ、ＥＤ３０ｓ
電荷状態スクリーニング 該当なし
電荷状態棄却 該当なし
－電荷状態棄却パラメーター ＋１および未割当は棄却される
（ｖ）データ分析
入力データ
・酵素：トリプシン
・最大見逃し切断部位：２
・最小ペプチド長さ：６
・最大ペプチド長さ：１４４
スコアリングオプション
・最大Ｄｅｌｔａ Ｏｎ：０．０５
許容差
・前駆体質量許容差：１０ｐｐｍ
・フラグメント質量許容差：０．６Ｄａ
・平均前駆体質量を使用する：Ｆａｌｓｅ
・平均フラグメント質量を使用する：Ｆａｌｓｅ
スペクトルマッチング
・ニュートラルロスａイオンを使用する：Ｆａｌｓｅ
・ニュートラルロスｂイオンを使用する：Ｔｒｕｅ
・ニュートラルロスｙイオンを使用する：Ｔｒｕｅ
・隣接イオンを使用する：Ｔｒｕｅ
修飾
・最大等価修飾／ペプチド：３
・動的修飾：酸化／＋１５．９９５Ｄａ［Ｍ］
・静的修飾：カルバミドメチル／＋５７．０２１Ｄａ［Ｃ］
一般的設定
・前駆体選択：ＭＳ１前駆体を使用する
・最小前駆体質量：３５０Ｄａ
・最大前駆体質量：５０００Ｄａ
・総強度閾値：０
・最小ピークカウント：１
スキャンイベントフィルター
・質量分析計：任意
・ＭＳオーダー：ＭＳ２
・活性化タイプ：任意
・最小衝突エネルギー：０
・最大衝突エネルギー：１０００
・スキャンタイプ：完全
ピークフィルター
・Ｓ／Ｎ閾値（ＦＴのみ）：１．５
認識されない特性の代用
・認識されない電荷置換：自動
・認識されない質量分析計の置き換え：ＩＴＭＳ
・認識されないＭＳオーダーの置き換え：ＭＳ２
・認識されない活性化の置き換え：ＨＣＤ
・認識されない極性の置き換え：＋
データベース
・名称：２０１８＿１２＿ＢａｎｑｕｅＰｒｏｔＣｏｖ＿Ｋｅｒａｔｉｎ＿ＲＧＥＮＩＸ．ｆａｓｔａ
・説明：ＢａｎｑｕｅｐｒｏｔＣｏｖ＋ケラチンバンク．＋配列クライアント．
・形式：Ｆａｓｔａ；インデックス付き
Figure 2024519333000013
 ６．１．３．２ 結果
（ａ）トリプシンによるタンパク質分解
ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの配列において特定され、これにより配列の５４．２２％に及ぶペプチドが表１２に示される：
Figure 2024519333000014
Figure 2024519333000015
 ＊ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃに含有されるＭＥＲＴＫ配列は配列番号１のアミノ酸番号２６～９９９からなる。表１２におけるペプチド位置のナンバリングは、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃにおける最初のＭＥＲＴＫアミノ酸から始まり、したがって、与えられた位置プラス２５が、配列番号１におけるアミノ酸位置に対応する。したがって、例えば、表１２における位置ペプチド７３～８４は配列番号１のアミノ酸番号９８～１０９である。
（ｂ）キモトリプシンによるタンパク質分解
ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの配列において特定され、これにより配列の５．０６％に及ぶペプチドが表１３に示される：
Figure 2024519333000016
 ＊ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃに含有されるＭＥＲＴＫ配列は配列番号１のアミノ酸番号２６～９９９からなる。表１３におけるペプチド位置のナンバリングは、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃにおける最初のＭＥＲＴＫアミノ酸から始まり、したがって、与えられた位置プラス２５が、配列番号１におけるアミノ酸位置に対応する。
（ｃ）ＡＳＰ－Ｎによるタンパク質分解
ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの配列において特定され、これにより配列の１２．２４％に及ぶペプチドが表１４に示される：
Figure 2024519333000017
 ＊ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃに含有されるＭＥＲＴＫ配列は配列番号１のアミノ酸番号２６～９９９からなる。表１４におけるペプチド位置のナンバリングは、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃにおける最初のＭＥＲＴＫアミノ酸から始まり、したがって、与えられた位置プラス２５が、配列番号１におけるアミノ酸位置に対応する。
（ｄ）エラスターゼによるタンパク質分解
ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの配列において特定され、これにより配列の８８．８２％に及ぶペプチドが表１５に示される：
Figure 2024519333000018
Figure 2024519333000019
Figure 2024519333000020
 ＊ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃに含有されるＭＥＲＴＫ配列は配列番号１のアミノ酸番号２６～９９９からなる。表１５におけるペプチド位置のナンバリングは、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃにおける最初のＭＥＲＴＫアミノ酸から始まり、したがって、与えられた位置プラス２５が、配列番号１におけるアミノ酸位置に対応する。
（ｅ）サーモリシンによるタンパク質分解
ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの配列において特定され、これにより配列の８７．１３％に及ぶペプチドが表１６に示される：
Figure 2024519333000021
Figure 2024519333000022
Figure 2024519333000023
 ＊ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃに含有されるＭＥＲＴＫ配列は配列番号１のアミノ酸番号２６～９９９からなる。表１６におけるペプチド位置のナンバリングは、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃにおける最初のＭＥＲＴＫアミノ酸から始まり、したがって、与えられた位置プラス２５が、配列番号１におけるアミノ酸位置に対応する。
得られる結果に基づいて、トリプシンペプチド、キモトリプシンペプチド、ＡＳＰ－Ｎペプチド、エラスターゼペプチドおよびサーモリシンペプチドのオーバーラップマッピングを設計した（図４）。トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼおよびサーモリシンによるタンパク質分解のペプチドを組み合わせることにより、配列の９８．７３％が網羅される。
ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃのトリプシン消化についてＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐによって検出されるイオンのｎＬＣクロマトグラムおよび総和が図５に示される。
６．１．４ 分子界面の特徴づけ
ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ複合体のエピトープを高分解能で決定するために、タンパク質複合体を重水素化架橋剤とインキュベーションし、多酵素切断に供した。架橋されたペプチドを富化した後、サンプルを高分解能質量分析（ｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ）によって分析し、生じるデータを、ＸＱｕｅｓｔおよびＳｔａｖｒｏｘソフトウェアを使用して分析した。
６．１．４．１ 材料および方法
（ｉ）計測手段
この分析のために、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析と組み合わせてｎＬＣクロマトグラフィーを、節６．１．１．１（ｃ）および節６．１．１．１（ｄ）に記載されるように使用している。
（ｉｉ）サンプル調製：
ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの混合物を表１７に示される濃度で調製した：
Figure 2024519333000024
 （ａ）還元アルキル化
調製されたｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ混合物の２０μＬを２μＬのＤＳＳ ｄ０／ｄ１２（２ｍｇ／ｍＬ；ＤＭＦ）と混合し、その後、室温で１８０分間、インキュベートした。インキュベーション後、反応を、１μＬの重炭酸アンモニウム（２０ｍＭの最終濃度）を加えることによって停止させ、その後、室温で１時間、インキュベートした。その後、溶液を、スピードバックを使用して乾燥し、その後、８Ｍ尿素水に懸濁した（２０μＬ）。混合後、２μｌのＤＴＴ（５００ｍＭ）を溶液に加えた。その後、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、２μｌのヨードアセトアミド（１Ｍ）を加え、その後、暗室において室温で１時間、インキュベートした。インキュベーション後、８０μｌのタンパク質分解緩衝液を加えた。トリプシン緩衝液は５０ｍＭのＡｍｂｉｃ（ｐＨ８．５）、５％のアセトニトリルを含有し、キモトリプシン緩衝液は１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．８）を含有し、ＡＳＰ－Ｎ緩衝液は５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を含有し、エラスターゼ緩衝液は５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含有し、サーモリシン緩衝液は５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ９．０）を含有する。
（ｂ）トリプシンによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ混合物を２．５μｌのトリプシン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／１００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベートした。
（ｃ）キモトリプシンによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ混合物を１．２５μｌのキモトリプシン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／２００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を２５℃で一晩インキュベートした。
（ｄ）ＡＳＰ－Ｎによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ混合物を１．２５μｌのＡＳＰ－Ｎ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／２００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベートした。
（ｅ）エラスターゼによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ混合物を２．５μｌのエラスターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／１００の比率で混合した。タンパク質分解混合物を３７℃で一晩インキュベートした。
（ｆ）サーモリシンによるタンパク質分解
１００μｌの還元／アルキル化ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃ混合物を５．０μｌのサーモリシン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）と１／５０の比率で混合した。タンパク質分解混合物を７０℃で一晩インキュベートした。
消化後、ギ酸（１％の最終濃度）を溶液に加えた。
（ｉｉｉ）データ分析
架橋されたペプチドを、Ｘｑｕｅｓｔバージョン２．０およびＳｔａｖｒｏｘ ３．６．ソフトウェアを使用して分析した。
６．１．４．２ 結果
重水素化ｄ０ｄ１２とのタンパク質複合体ｚ１０／ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの、トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼおよびサーモリシンによるタンパク質分解の後、ｎＬＣ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ／ＭＳ分析により、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃと抗体ｚ１０との間に１９個の架橋されたペプチドが検出された。
配列および架橋位置が下の表１８に示される。
Figure 2024519333000025
Figure 2024519333000026
Figure 2024519333000027
 ＊ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃに含有されるＭＥＲＴＫ配列は配列番号１のアミノ酸番号２６～９９９からなる。表１８におけるペプチド位置のナンバリングは、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃにおける最初のＭＥＲＴＫアミノ酸から始まり、したがって、与えられた位置プラス２５が、配列番号１におけるアミノ酸位置に対応する。
６．１．４．３ 結論 エピトープマッピング
化学的架橋、Ｈｉｇｈ－Ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ質量分析、およびｎＬＣ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析を使用して、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃと抗体ｚ１０との間での分子界面が特徴づけられた。
本発明者らの分析は、相互作用には、ｒｈＭＥＲ＿Ｆｃの上での下記のアミノ酸が含まれることを示している：アミノ酸３５４、３５９、３６６；３７９、３８５、３８６、３９５、３９８、これらは、配列番号１のアミノ酸番号３７９、３８４、３９１、４０４、４１０、４１１、４２０および４２３にそれぞれに対応する。これらの結果が図６および図７に例示される。
上記は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されることはない。実際、本明細書中に記載される改変に加えて、本明細書中に提供される抗体および方法ならびにそれらの等価物の様々な改変が、上の記載および付随する図から当業者には明らかになる。そのような改変は、添付された請求項の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、それぞれの個々の刊行物あるいは特許または特許出願があたかも、すべての目的のためにその全体において参照によって組み込まれることが具体的に、かつ個々に示されていたのと同じ程度に、それらの全体において、また、すべての目的のために参照によって本明細書中に組み込まれる。

Claims (40)

  1. ヒトＭＥＲＴＫの連続したアミノ酸配列（配列番号１）または前記連続したアミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドであって、前記連続したアミノ酸配列が、前記ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）のアミノ酸番号３７９～４２３、および前記ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて４００個の連続したアミノ酸を含み、前記バリアントが、（ａ）配列番号１に対する前記連続したアミノ酸配列における１またはそれを超えるアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を有し、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみ、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する多くて２個の保存的置換を有する、ポリペプチド。
  2. 前記連続したアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記連続したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 前記連続したアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
  5. 前記バリアントを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 前記バリアントが配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３のそれぞれにわたって少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. 前記バリアントが配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する保存的置換のみを有し、かつ配列番号１のアミノ酸番号３７９～３９１およびアミノ酸番号４０４～４２３に対する多くて２個の保存的置換を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
  8. 前記バリアントが配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４にわたって少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
  9. 前記バリアントが配列番号１のアミノ酸番号２８６～４８４に対する保存的置換のみを有する、請求項５に記載のポリペプチド。
  10. 前記連続したアミノ酸配列が前記ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて３００個の連続したアミノ酸を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 前記連続したアミノ酸配列が前記ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて２００個の連続したアミノ酸を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 前記連続したアミノ酸配列が前記ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて１００個の連続したアミノ酸を含む、請求項１、３、および５～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 前記連続したアミノ酸配列が前記ヒトＭＥＲＴＫ配列（配列番号１）の多くて５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１、３、および５～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 前記連続したアミノ酸配列からなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 第２のアミノ酸配列に連結される前記連続したアミノ酸配列を含む融合タンパク質である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 前記第２のアミノ酸配列がアジュバントのアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. 前記アジュバントがキーホールリンペットヘモシアニンである、請求項１６に記載のポリペプチド。
  18. 前記第２のアミノ酸配列がタグまたは標識を含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
  19. 凍結乾燥形態である、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. 分子に結合している請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むコンジュゲート。
  21. 前記分子がアジュバントである、請求項２０に記載のコンジュゲート。
  22. 前記分子が前記ポリペプチドに共有結合により結合している、請求項２０または２１に記載のコンジュゲート。
  23. 凍結乾燥形態である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  24. 請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２０～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、免疫目的のために好適であるキャリアとを含む、免疫原性組成物。
  25. さらにアジュバントを含む、請求項２４に記載の免疫原性組成物。
  26. 抗ＭＥＲＴＫ抗体を産生する方法であって、（ａ）非ヒト哺乳動物を請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート、あるいは請求項２４または２５に記載の免疫原性組成物により免疫すること、（ｂ）前記非ヒト哺乳動物からの抗体産生細胞を不死化して、不死化された抗体産生細胞を産生すること、（ｃ）ＭＥＲＴＫと免疫特異的に結合する抗体を分泌する不死化された抗体産生細胞を選択すること、および（ｄ）前記不死化された抗体産生細胞を、抗体が産生されるように細胞培養物において培養することを含む、方法。
  27. 抗体産生細胞を不死化する前記工程が、前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して、抗体産生ハイブリドーマを産生することを含む方法によって行われる、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記抗体を前記細胞培養物から単離することをさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. 抗ＭＥＲＴＫ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする抗体配列を特定する方法であって、（ａ）非ヒト哺乳動物を請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート、あるいは請求項２４または２５に記載の免疫原性組成物により免疫すること、（ｂ）抗体産生細胞を前記非ヒト哺乳動物から単離すること、（ｃ）前記抗体産生細胞の抗体配列をクローニングし、抗体配列のライブラリーを作製すること、（ｄ）抗体配列を前記ライブラリーにおいて発現させること、および（ｅ）前記ライブラリーにおいて発現されるときに、ＭＥＲＴＫに免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する前記抗体配列を選択することを含む、方法。
  30. 候補の抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合抗体フラグメントをスクリーニングする方法であって、（ａ）前記抗体またはフラグメントを、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２０～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲートに結合する能力についてアッセイすること、および（ｂ）前記ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定することを含む、方法。
  31. 抗体またはフラグメントを、前記ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する能力について前記アッセイすることが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して行われる、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する前記抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する能力についてアッセイし、かつ、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定する工程をさらに含む、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記ポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する前記抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの分解を誘導する能力についてアッセイし、かつ、ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの分解を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定する工程をさらに含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合フラグメントを、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの前記内部移行および／または分解を誘導する抗ＭＥＲＴＫ抗体または抗ＭＥＲＴＫ抗原結合フラグメントを特定するためにスクリーニングする方法であって、（ａ）前記抗体またはフラグメントを、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２０～２２のいずれか一項に記載のコンジュゲートに結合する能力についてアッセイすること、および（ｂ）前記ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定し、それによって、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの前記内部移行および／または分解を誘導する１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定することを含む、方法。
  35. 工程（ｂ）において特定される前記１またはそれを超える抗体またはフラグメントを、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する能力についてアッセイし、かつ、ヒト細胞上のヒトＭＥＲＴＫの内部移行および／または分解を誘導する前記１またはそれを超える抗体またはフラグメントを特定することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記単離された抗体を精製することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  37. 前記ポリペプチドまたはコンジュゲートに免疫特異的に結合する前記抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することをさらに含む、請求項３０または３１に記載の方法。
  38. ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの内部移行を誘導する前記抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することをさらに含む、請求項３２、３４または３５に記載の方法。
  39. ヒト細胞上のＭＥＲＴＫの分解を誘導する前記抗体またはフラグメントの１またはそれより多くを精製することをさらに含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記哺乳動物がマウスである、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
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