KR102574549B1 - 항-fam19a5 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항체 및 이러한 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 항-FAM19A5 항체를 사용하여 섬유증 및 암을 치료하는 방법이 본 발명에서 제공된다.

Description

항-FAM19A5 항체 및 이의 용도
전자적 방식으로 제출된 서열목록에 대한 참조
본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일 형식의 전자적 방식으로 제출된 서열목록(파일명: 3763.005PC02_SeqListing_ST25.txt; 크기: 166,889 바이트; 생성일: 2018년 6월 26일)의 내용은 그 전체가 본 발명에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5(FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 항체, 이러한 항체를 포함하는 조성물, 및 대상에서 섬유증 및/또는 암(예를 들어, 뇌종양, 예를 들어 교모세포종)과 같은 장애나 질환을 예방하거나 치료하기 위한 이러한 항체의 사용 방법을 제공한다.
FAM19A5는 5개의 고도로 상동성인 소형 단백질로 이루어진 TAFA 단백질 서브패밀리의 일원이다(Tang T. Y. et al., Genomics 83(4):727-34 (2004). 이들 단백질은 고정된 위치에 보존된 시스테인 잔기를 함유하며, CC-케모카인 패밀리의 일원인 대식세포 염증성 단백질 1-알파(MIP-1-알파)와 관련이 있다. TAFA 단백질은 뇌와 척수의 특정 영역에서 우세하게 발현된다. 이들 단백질은 신경형성 과정에서 성인 신경줄기세포에 의해 생성되고 분비되는 것으로 여겨진다.
FAM19A5는 척추동물의 뇌에서 우세하게 발현되며, 완전한 중추신경계의 발생, 분화, 형성에서 중요하다고 여겨지고, 중추신경계 손상 및/또는 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다(미국특허 공개 No. 2015/0118230).
신경계의 조절에 더하여, FAM19A5는 또한 면역세포를 조절하는데 일정 역할을 할 수 있다. 섬유증은 건강과 관련된 흔한 증상으로서, 다양한 병리학적 과정에서 자주 발생하며, 섬유아세포를 자극하여 결합조직을 변형시키는 사이토카인을 방출하는 단핵 면역세포를 침윤시키는 것을 특징으로 한다. 따라서, FAM19A5에 특이적으로 결합하며 FAM19A5 활성을 조정할 수 있는 항체를 개발할 필요가 있다.
본 발명의 간략한 개요
서열 유사성 19를 가진 사람 패밀리, 멤버 A5("FAM19A5") 단백질에 특이적으로 결합하며, 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 기준 항체와 사람 FAM19A5 에피토프에 대한 결합에 대해 상호-경쟁하는, 분리된 항체("항-FAM19A5 항체"), 또는 그것의 항원-결합 부분이 본 발명에서 제공되며, (i) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 서열 유사성 19를 가진 사람 패밀리, 멤버 A5("FAM19A5") 단백질에 특이적으로 결합하며, 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 기준 항체와 동일한 FAM19A5 에피토프에 결합하는, 분리된 항체("항-FAM19A5 항체"), 또는 그것의 항원-결합 부분이 본 발명에서 제공되며, (i) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체는, SEQ ID NO: 6인, 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합한다. 특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 아미노산 잔기 (i) 46 내지 51(즉 DSSQPR), (ii) 46, 50, 및 52(즉 D---P-R), 또는 (iii) 46, 47, 48, 및 50(즉 DSS-P)에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서, SEQ ID NO: 6 인, FAM19A5 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는, SEQ ID NO: 9인, 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합한다.
특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 EP2, EP4, 및/또는 EP8로 확인된 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하며, EP2는 아미노산 DSSQP(SEQ ID NO: 66)를 포함하고, EP4는 아미노산 ARCACRK(SEQ ID NO: 68)를 포함하고, EP8은 아미노산 TCTQPGGR(SEQ ID NO: 72)을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하며,
(i) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, 또는 SEQ ID NO: 20을 포함하고;
(ii) 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 21을 포함하고;
(iii) 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 22를 포함하고;
(iv) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, 또는 SEQ ID NO: 32를 포함하고;
(v) 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, 또는 SEQ ID NO: 33을 포함하고; 및/또는
(vi) 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, 또는 SEQ ID NO: 34를 포함한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 (i) SEQ ID NO: 35를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 39를 포함하는 경쇄 가변 도메인; (ii) SEQ ID NO: 36을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 40을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 (iii) SEQ ID NO: 38을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 42를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 또는 SEQ ID NO: 38로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 또는 SEQ ID NO: 42로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 (i) SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, 또는 SEQ ID NO: 60을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, 또는 SEQ ID NO: 64를 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체는 키메라 항체, 사람 항체, 또는 사람화 항체이다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함한다: (a) 섬유증의 감소, 반전, 지연 및/또는 예방; (b) 과도한 세포외 바탕질(ECM) 형성의 감소; (c) 종양의 성장 또는 진행의 지연; (d) 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 가용성 사람 FAM19A5에 결합; (e) ELISA에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 막 결합 사람 FAM19A5에 결합; (f) 반응성 신경아교증 개시의 감소, 반전, 지연 및/또는 예방; (g) 반응성 성상교세포의 과도한 증식의 억제; (h) 뉴로칸 및 뉴런-글리아 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 발현의 감소; (i) 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK 발현의 증가; (j) 뉴런의 생존 촉진; (k) 뉴런에서 GAP43 발현의 증가; 및 (l) 축삭돌기 재성장의 촉진.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 또는 10과 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 구성되는 서열 유사성 19를 가진 사람 패밀리, 멤버 A5(FAM19A5) 에피토프를 제공하며, 상기 에피토프는 (i) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 또는 SEQ ID NO: 38을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 (ii) SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 또는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 기준 항체에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체 또는 FAM19A5 에피토프를 암호화하는 핵산이 본 발명에 개시된다.
또한, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 FAM19A5 에피토프를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 양태에서, 본 발명은 또한 뇌암을 치료하기 위한 항-FAM19A5 항체를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체와 대상의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는, 진단 필요가 있는 대상을 진단하는 방법을 제공한다.
구체예들
구체예 1. 서열 유사성 19를 가진 사람 패밀리, 멤버 A5(FAM19A5)에 특이적으로 결합하며 다음의 특성 중 하나 이상을 나타내는 분리된 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분:
(a) 섬유증의 감소, 반전, 지연 및/또는 예방;
(b) 과도한 세포외 바탕질(ECM) 형성의 감소; 및
(c) 종양의 성장 또는 진행의 지연.
구체예 2. 다음의 특성 중 하나 이상을 더 포함하는, 구체예 1의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분:
(d) 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 가용성 사람 FAM19A5에 결합;
(e) ELISA에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 막 결합 사람 FAM19A5에 결합;
(f) 반응성 신경아교증 개시의 감소, 반전, 지연 및/또는 예방;
(g) 반응성 성상교세포의 과도한 증식의 억제;
(h) 뉴로칸 및 뉴런-글리아 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 발현의 감소;
(i) 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK 발현의 증가;
(j) 뉴런의 생존 촉진;
(k) 뉴런에서 GAP43 발현의 증가; 및
(l) 축삭돌기 재성장의 촉진.
구체예 3.
(i) 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하며, 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 기준 항체;
(ii) 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하며, 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 기준 항체; 또는
(iii) 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하며, 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 기준 항체
와 사람 FAM19A5 에피토프에 대한 결합에 대해 상호-경쟁하는, 구체예 1 또는 2의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 4.
(i) 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하며, 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 기준 항체;
(ii) 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하며, 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 기준 항체; 또는
(iii) 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하며, 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 기준 항체
와 동일한 사람 FAM19A5 에피토프에 결합하는, 구체예 1 또는 2의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 5. SEQ ID NO: 6인, 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하는, 구체예 3 또는 4의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 6. 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이, SEQ ID NO: 6인, FAM19A5에만 결합하는, 구체예 2 내지 5 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 7. 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 추가의 FAM19A5 에피토프에 더 결합하는, 구체예 2 내지 5 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 8. 추가의 FAM19A5 에피토프는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 구체예 7의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 9. 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 구체예 1 내지 8 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 10. 중쇄 CDR1이 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, 또는 SEQ ID NO: 20을 포함하는, 구체예 9의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 11. 중쇄 CDR2가 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 21을 포함하는, 구체예 9 또는 10의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 12. 중쇄 CDR3이 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 22를 포함하는, 구체예 9 내지 11 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 13. 경쇄 CDR1이 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, 또는 SEQ ID NO: 32를 포함하는, 구체예 9 내지 12 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 14. 경쇄 CDR2가 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, 또는 SEQ ID NO: 33을 포함하는, 구체예 9 내지 13 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 15. 경쇄 CDR3이 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, 또는 SEQ ID NO: 34를 포함하는, 구체예 9 내지 14 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 16. (i) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 또는 SEQ ID NO: 38을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 (ii) SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 또는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 구체예 1 내지 15 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 17. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 또는 SEQ ID NO: 38로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 구체예 1 내지 16 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 18. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 또는 SEQ ID NO: 42로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%o, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 구체예 1 내지 17 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 19. 모노클로날 항체가 단일 도메인 항체인, 구체예 1 내지 18 중 어느 하나의 모노클로날 항체.
구체예 20. 모노클로날 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 구체예 1 내지 19 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 21. 모노클로날 항체가 사람 IgG1 항체인, 구체예 20의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 22. 모노클로날 항체가 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 이소타입 항체를 포함하는, 구체예 20의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 23. Fc 기능이 없는 불변 영역을 더 포함하는, 구체예 1 내지 22 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 24. 키메라 항체, 사람 항체, 또는 사람화 항체인, 구체예 1 내지 23 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 25. 모노클로날 항체가 (i) SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, 또는 SEQ ID NO: 60을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, 또는 SEQ ID NO: 64를 포함하는 경쇄를 포함하는, 구체예 1 내지 24 중 어느 하나의 모노클로날 항체.
구체예 26. 그것의 항원 결합 부분이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단쇄 Fv(scFv)인, 구체예 1 내지 25 중 어느 하나의 그것의 항원 결합 부분.
구체예 27. 제2 결합 모이어티를 가진 분자에 연결된 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 포함하는 이중특이적 분자.
구체예 28. SEQ ID NO: 5, 6, 9, 또는 10과 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 구성되는 서열 유사성 19를 가진 사람 패밀리, 멤버 A5(FAM19A5) 에피토프로서, 상기 에피토프는 (i) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 또는 SEQ ID NO: 38을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 (ii) SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 또는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 기준 항체에 특이적으로 결합될 수 있는 에피토프.
구체예 29. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 27의 이중특이적 분자, 또는 구체예 28의 에피토프를 암호화하는 핵산.
구체예 30. 구체예 29의 핵산을 포함하는 벡터.
구체예 31. 유전자 치료법에서 사용하기 위한, 구체예 30의 벡터.
구체예 32. 구체예 30의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
구체예 33. 제제에 연결된, 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분 또는 구체예 27의 이중특이적 분자를 포함하는 면역콘쥬게이트.
구체예 34. (i) 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 또는 구체예 33의 면역콘쥬게이트, 및 (ii) 담체를 포함하는 조성물.
구체예 35. (i) 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 또는 구체예 27의 이중특이적 분자, 및 (ii) 사용 설명서를 포함하는 키트.
구체예 36. 구체예 28의 에피토프로 비-사람 동물을 면역화하는 단계 및 항체, 또는 그것의 항원 결합 부분을 생성하는 단계를 포함하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분의 제조 방법.
구체예 37. 적합한 조건하에서 구체예 32의 세포를 배양하는 단계 및 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 분리하는 단계를 포함하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분의 생성 방법.
구체예 38. 섬유증의 개시가 지연되도록 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 27의 이중특이적 분자, 또는 구체예 33의 면역콘쥬게이트를 투여하는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상에서 섬유증을 감소, 반전, 및/또는 예방하는 방법.
구체예 39. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 27의 이중특이적 분자, 또는 구체예 33의 면역콘쥬게이트를 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 과잉의 ECM의 형성이 감소되는, 치료 필요가 있는 대상에서 과도한 세포외 바탕질(ECM)의 형성을 감소시키는 방법.
구체예 40. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 27의 이중특이적 분자, 또는 구체예 33의 면역콘쥬게이트를 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상에서 간암, 폐암, 신장암, 유방암, 및/또는 췌장암을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법.
구체예 41. 간암이 간세포 암종인, 구체예 40의 방법.
구체예 42. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 27의 이중특이적 분자, 또는 구체예 33의 면역콘쥬게이트를 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상에서 섬유증과 관련된 간암, 폐암, 신장암, 유방암, 및/또는 췌장암을 예방, 개선, 또는 치료하는 방법.
구체예 43. 섬유증은 간 섬유증, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 골수섬유증, 췌장 섬유증, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 동맥 섬유증, 관절섬유증, 유방 섬유증, 근육 섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프절 섬유증, 방광 섬유증, 및/또는 늑막 섬유증을 포함하는, 구체예 38 또는 42의 방법.
구체예 44. 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 정맥내, 경구, 비경구, 척추강내, 뇌실내, 폐, 피하, 또는 심실내 경로로 투여되는, 구체예 38 내지 43 중 어느 하나의 방법.
구체예 45. 대상은 사람인, 구체예 38 내지 44 중 어느 하나의 방법.
구체예 46. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 27의 이중특이적 분자, 또는 구체예 33의 면역콘쥬게이트를 대상으로부터 획득된 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상으로부터의 샘플에서 FAM19A5의 수준을 측정하는 방법.
구체예 47. FAM19A5의 수준이 기준 샘플과 비교하여 대상의 샘플에서 증가되는, 구체예 46의 방법.
구체예 48. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 27의 이중특이적 분자, 또는 구체예 33의 면역콘쥬게이트를 대상으로부터 획득된 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는, 진단 필요가 있는 대상에서 섬유증을 진단하는 방법.
구체예 49. 섬유증은 간 또는 폐의 섬유증인, 구체예 48의 방법.
구체예 50. FAM19A5의 수준이 섬유증이 없는 대상의 기준 샘플에서의 FAM19A5의 수준과 비교하여 대상의 샘플에서 증가되는, 구체예 48 또는 49의 방법.
구체예 51. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 27의 이중특이적 분자, 또는 구체예 33의 면역콘쥬게이트를 대상으로부터 획득된 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는, 진단 필요가 있는 대상에서 섬유증을 가진 종양을 진단하는 방법.
구체예 52. FAM19A5의 수준이 종양이 없는 대상의 기준 샘플에서의 FAM19A5의 수준과 비교하여 대상의 샘플에서 증가되는, 구체예 51의 방법.
구체예 53. 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 조직 생검, 기관 생검, 또는 이들의 조합인, 구체예 46 내지 52 중 어느 하나의 방법.
구체예 54. 샘플은 신선한 종양 샘플, 동결된 종양 샘플, 또는 포르말린-고정된 파라핀-포매 샘플인, 구체예 46 내지 52 중 어느 하나의 방법.
구체예 55. 접촉 단계는 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 구체예 46 내지 52 중 어느 하나의 방법.
구체예 56. 분석은 웨스턴 블롯 분석, 슬롯 블롯 분석, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성면역분석(RIA), 유세포-기반 면역형광(FACS), 질량분광법, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 또는 이들의 조합을 포함하는, 구체예 54의 방법.
도 1은 사람 FAM19A5 폴리펩타이드 상에서의 에피토프 F1-F6(BSA에 콘쥬게이트된)의 아미노산 서열과 이들의 위치를 도시한다. 이들 상이한 에피토프 단편의 크기는 괄호에 표시된다.
도 2는 항-FAM19A5 항체 1-65, 2- 13, 및 3-2의 결합에 대한 ELISA 결과를 도시한다. 3-2 항체의 경우 두 상이한 이소타입, 즉 사람 IgG1("h3-2") 및 마우스 IgG1("m3-2")가 도시된다. 각 항체에 대해, 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 및 6th 막대(왼쪽에서 시작해서)는 각각 에피토프 단편 F1, F2, F3, F4, F5, 및 F6에 대한 결합을 표시한다. 오른쪽에서 가장 멀리 있는 막대는 양성 대조군(즉, His 택을 가진 FAM19A5 단백질)이다. 정확한 O.D. 값이 각 막대의 위에 표시된다.
도 3A 내지 3C는 다음의 13개의 상이한 FAM19A5 에피토프 F2 단편 돌연변이 펩타이드에 대한 항-FAM19A5 항체 3-2 및 1-28의 결합에 대한 ELISA 결과를 도시한다: (i) F2-01-BSA(#1), (ii) F2-02-BSA(#2), (iii) F2-03-BSA(#3), (iv) F2-04-BSA(#4), (v) F2-05-BSA(#5), (vi) F2-06-BSA(#6), (vii) F2-07-BSA(#7), (viii) F2-08-BSA(#8), (ix) F2-09-BSA(#9), (x) F2-10-BSA(#10), (xi) F2-11-BSA(#11), (xii) F2-12-BSA(#12), 및 (xiii) F2-13-BSA(#13). 도 3A는 사람 IgG1 이소타입을 가진 3-2 항체에 대한 결과를 도시한다. 도 3B는 마우스 IgG1 이소타입을 가진 3-2 항체에 대한 결과를 도시한다. 도 3C는 1-28 항체에 대한 결과를 도시한다. 정확인 O.D. 값은 각 막대의 위에 표시된다.
도 4는 FAM19A 패밀리의 상이한 멤버들(즉, FAM19A1-5)의 아미노산 정렬을 도시한다. 멤버들 중 가장 큰 아미노산 다양성을 가진 영역을 상자로 표시하고 EP1 내지 EP8로 나타낸다. IgG 항체("IgG 유일")는 대조군으로 제시된다. y-축은 O.D. 값을 제공한다.
도 5는 FAM19A5 돌연변이 M1 내지 M8에 대한 항-FAM19A5 항체 1-65, 1-28, 2-13, 및 3-2의 결합에 대한 ELISA 결과를 도시한다. 각 항체에 대해, 8개의 막대는 돌연변이 M1 내지 M8에 해당한다(왼쪽에서 오른쪽으로).
도 6A는 상이한 항-FAM19A5 항체들 간 상호-경쟁을 평가하기 위해 사용된 2-부위 샌드위치 ELISA 분석의 도해를 도시한다. 도 6B는 6개의 상이한 항-FAM19A5 항체, 즉 1-65, P2-A03, P2-F11, 13B4, 2-13, 및 3-2에 대한 상호-경쟁 분석의 결과를 도시한다. 용어 "S/N"은 신호 대 노이즈 비를 말하며, 이것은 다음과 같이 측정된다: [10ng/mL 항원의 O.D.] / [0ng/mL 항원의 O.D.]. 회색 상자는 상호-경쟁을 나타낸다(즉, 2 이하의 S/N 비).
도 7A 및 7B는 FAM19A5에 대한 몇몇 항-FAM19A5 항체의 결합에 대한 ELISA 결과를 도시한다. 다음의 항체에 대한 결과가 표시된다: 1- 65, 13B4, 13F7, 1-28, 2-13, 3-2, P1-A03, P1-A08, P1-D03, P1-F02, P1-G09, P2-A01, P2- A03, P2-C12, P2-F07, 및 P2-F11(왼쪽에서 오른쪽으로). 도 7A는 항-FAM19A5 항체의 다양한 농도에 대한 결과를 막대그래프로 나타낸 것이다. 도 7B는 상이한 항-FAM19A5 항체의 Kd(nM)를 표시한다.
도 8은 담관 결찰(BDL)에 의해 유도된 간 섬유증을 가진 래트(n = 5)("질환 모델")의 혈청 중 FAM19A5 단백질의 수준을 건강한 래트("정상")(n = 3)와 비교한 것을 도시한다. FAM19A5 단백질의 수준은 정상 대조군 동물에서 관찰된 수준에 비하여 배수 변화로서 표시된다. "*"는 정상 대조군 동물과 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p < 0.005)를 나타낸다.
도 9는 3mg/kg 블레오마이신의 기관내 주사에 의해 유도된 특발성 폐 섬유증을 가진 래트(n = 5)("질환 모델")의 혈청 중 FAM19A5 단백질의 수준을 건강한 래트("정상")(n = 5)와 비교한 것을 도시한다. FAM19A5 단백질의 수준은 정상 대조군 동물에서 관찰된 수준에 비하여 배수 변화로서 표시된다. "*"는 정상 대조군 동물과 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p < 0.005)를 나타낸다.
도 10은 간 섬유증, 예를 들어 간경변이 확인된 사람 환자(환자 #1-10)와 건강한 개체(정상 #1-3)의 혈청에서의 FAM19A5 단백질 수준의 배수 변화를 도시한다. 각 막대그래프 위에 제시된 구체적인 값은 건강한 개체의 혈청에서 검출된 FAM19A5 단백질의 평균 농도에 대한 배수 변화를 나타낸다.
도 11은 대조군 항체("NHI") 또는 항-FAM19A5 항체("1-65," "3-2", 및 "1-28")로 치료된 심근경색-유도 동물에서의 좌심실 조직의 H&E(헤마톡실린 및 에오신) 염색을 비교한 것을 도시한다. 건강한 동물(즉, 비-심근경색 유도, "나이브")이 추가 대조군으로 사용되었다.
도 12A 및 12B는 심근경색-유도 동물의 좌심실 조직에서의 콜라겐 축적을 비교한 것을 도시한다. 심근경색-유도 동물은 대조군 항체("NHI") 또는 항-FAM19A5 항체("1-65," "3-2", 및 "1-28") 중 어느 하나를 투여 받았다. 건강한 동물(즉, 비-심근경색 유도, "나이브")이 추가 대조군으로 사용되었다. 도 12A는 메이슨 트리크롬 염색을 사용한 콜라겐 축적을 나타낸다. 도 12B는 전체 좌심실 영역에 대한 섬유성 영역의 비율로서 콜라겐 축적(즉, 섬유성 영역)을 나타낸다. 데이터는 평균±S.D.로 표시된다(n = 그룹 당 5 내지 8). 막대 위의 "***/**"는 "나이브" 그룹(건강한 동물)과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(각각 p < 0.001, p < 0.05). 막대 위의 "#"는 "NHI" 그룹(심근경색 유도 + 대조군 항체)와 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p < 0.05).
도 13은 3명의 상이한 간암 환자의 간 생검에서의 FAM19A5 단백질 발현의 면역조직화학 분석을 도시한다. 나타낸 대로, 각 환자는 다양한 정도의 섬유증을 가졌다: (i) 단계 #0(왼쪽 칼럼), (ii) 단계 #2(중간 칼럼), 및 (iii) 단계 #4(오른쪽 칼럼). 아래쪽 열은 위쪽 열에서 상자 표시된 영역을 더 크게 확대한 것이다. 화살표는 FAM19A5-양성 간 성상세포의 예들을 표시한다.
도 14A는 동물의 체중(g)을 시간의 함수로서 도시한다(접종 후 경과주). 동물 중 일부는 Hep3B 세포만 접종되었고, 정상 사람 면역글로불린(원, 그룹: "Hep3B + NHI", n = 3) 또는 항-FAM19A5 항체(닫힌 상자, 그룹: "Hep3B + FAM19A5 Ab", n = 3) 중 어느 하나로 치료되었다. 다른 동물들은 Hep3B 세포와 사람 간 성상세포(HHSteC)가 둘다 접종되었고, 정상 사람 면역글로불린(다이아몬드, 그룹: "Hep3B + HHSteC + NHI", n = 3) 또는 항-FAM19A5 항체(열린 상자, 그룹: "Hep3B + HHSteC + FAM19A5 Ab", n = 3) 중 어느 하나로 치료되었다. 데이터는 평균±S.D.로 표시된다.
도 14B는 상이한 그룹의 동물들에서 관찰된 평균 종양 부피를 시간의 함수로서 도시한다(접종 후 경과주). 나타낸 그룹은 상기 도 14A에서 설명된 것들과 동일하다. 종양 부피는 다음의 식으로 계산되었다: 0.5 x 길이 x 너비2 = 종양 부피(mm3). 데이터는 평균±S.D.로 표시된다.
도 14C 및 14D는 접종 후 42일째에 도 14A에서 설명된 동물로부터 분리된 종양의 사진촬영 이미지 및 중량(g)을 각각 도시한다. 도 14C에서, (i) 위 왼쪽은 "Hep3B + NHI" 그룹(n = 2)으로부터의 종양; (ii) 위 오른쪽은 "Hep3B + HHSteC + NHI" 그룹(n = 2)으로부터의 종양; (iii) 아래 왼쪽은 "Hep3B + FAM19A5 Ab" 그룹(n = 3)으로부터의 종양; (iv) 아래 오른쪽은 "Hep3B + HHSteC + FAM19A5 Ab" 그룹(n = 3)으로부터의 종양이다. 도 14D는 상이한 그룹으로부터 분리된 종양의 평균 중량(g)을 나타낸다.
도 15A 및 15B는 외상성 뇌 손상 후 반응성 신경아교증에 대한 항-FAM19A5 항체의 효과를 도시한다. 도 15A는 상이한 항-FAM19A5 항체로 치료된 동물의 뇌 조직에서 손상된 영역의 대표 면역조직화학 이미지를 제공한다: (i) 1-65(2/4)(1st 열); (ii) 1-28(2nd 열); (iii) 2-13(3rd 열); 및 (iv) 3-2(4th 열). 뇌 조직 절편은 GFAP(신경교 섬유질 산성 단백질, 녹색) 및 네스틴(적색)으로 염색되었는데, 이들은 뇌 손상 후 반응성 성상교세포에서 유도된다고 알려져 있다. 점선(흰색)은 TBI에 노출 후 병소 경계를 표시한다. 도 15B는 1-65, 1-28, 2-13, 및 3-2 항-FAM19A5 항체로 치료된 동물에서 TBI 병소의 중심으로부터 GFAP- 및/또는 네스틴-양성 성상교세포의 평균 거리를 제공한다.
도 16A는 항체 투여 일정 및 교모세포종 암세포를 마우스에 두개내 주사하는 것을 묘사한 도해를 제공한다.
도 16B는 조직 샘플의 투명성을 평가하는 CLARITY를 사용하여 교모세포종 동물 모델에서 항-FAM19A5 항체의 항암 효과를 평가한 것을 도시한다. 사람 IgG 대조군 항체(왼쪽) 또는 항-FAM19A5 항체(오른쪽) 중 어느 하나로 치료된 동물로부터 수거된 뇌에서 불투명한 종양 영역은 점선을 사용하여 표시된다.
도 17A 및 17B는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 교모세포종 동물 모델에서 항-FAM19A5 항체의 항암 효과를 평가한 것을 도시한다. 도 17A는 대조군 사람 IgG 항체(위쪽 열) 또는 항-FAM19A5 항체(아래쪽 열) 중 어느 하나로 치료된 동물로부터의 뇌 조직 절편의 4개의 대표 H&E 염색 이미지를 제공한다. 교모세포종은 이 이미지에서 어두운 영역에 해당한다. 도 17B는 대조군의 퍼센트로서 데이터를 제공함으로써 도 17A에 제시된 데이터를 정량한다. 검은색 막대는 (사람 IgG 항체로 치료된) 대조군 그룹에 해당한다. 회색 막대는 항-FAM19A5 항체 치료된 그룹에 해당한다. x-축의 숫자는 도 17A에 도시된 대표 이미지에 해당한다.
도 18A, 18B, 18C, 및 18D는 Hoechst 핵 염색을 사용하여 교모세포종 동물 모델에서 항-FAM19A5 항체의 항암 효과를 평가한 것을 도시한다. 도 18A는 대조군 사람 IgG 항체(위쪽 열) 또는 항-FAM19A5 항체(아래쪽 열)로 치료된 동물로부터 4개의 대표 뇌 조직 절편의 이미지를 도시한다. 각 이미지에서 연회색 영역은 종양에 해당한다. 도 18B는 도 18A의 4개의 대표 뇌 조직 절편에서 측정된 종양 내의 세포수(Hoeschst-양성 염색)("스팟 수") 및 종양 부피("부피")에 대한 수치 값을 나타낸 표를 제공한다. 도 18C(세포수) 및 18D(종양 부피)는 도 18B에 제시된 데이터를 그래프로 나타낸 것이다. 도 18C와 18D에서, 데이터는 대조군 동물에서 관찰된 상응하는 값의 %로서 표시된다. x-축의 숫자는 도 18A의 대표 뇌 조직 절편에 해당한다. 검은색 막대는 대조군 사람 IgG 항체로 치료된 동물에 해당한다. 회색 막대는 항-FAM19A5 항체로 치료된 동물에 해당한다.
도 19A및 19B는 교모세포종 마우스 모델에서 혈관 정상화에 대한 항-FAM19A5 항체의 효과를 도시한다. 도 19A는 대조군 사람 IgG 항체(왼쪽 이미지) 또는 항-FAM19A5 항체(오른쪽 이미지)로 치료된 동물로부터 분리된 뇌의 비슷한 영역 내에서의 CD31 발현(혈관 마커)의 면역조직화학 분석을 제공한다. 도 19A에서 흰색 점선은 교모세포종의 외부 경계를 표시한다. 도 19B는 도 19A의 대표 영역의 확대도를 제공한다.
도 20A 및 20B는 교모세포종 마우스 모델에서 종양에 대식세포의 침윤에 대한 항-FAM19A5 항체의 효과를 도시한다. 도 20A는 대조군 사람 IgG 항체(위쪽 이미지) 또는 항-FAM19A5 항체(아래쪽 이미지)로 치료된 마우스의 교모세포종에서의 Ibal 발현(대식세포 마커)의 면역조직화학 이미지를 제공한다. 도 20B는 도 20A에 도시된 이미지에서 관찰된 대식세포의 부피를 비교한 결과이다.
도 21은 대조군 사람 IgG 항체(위쪽 열) 또는 항-FAM19A5 항체(아래쪽 열) 중 어느 하나로 치료된 래트 신경교종 모델의 뇌의 MRI 스캔 이미지를 도시한다. 이들 이미지는 다음과 같은 종양의 다양한 특성들을 나타낸다: (i) T2 - 형태학적 분석; (ii) R2 - 유체 함량; (iii) CBV - 뇌 혈관 부피; (iv) EnhRate(증진 비율) 및 IAUC30(30초일 때의 초기 곡선 아래 면적) - 조직 투과성. 이 이미지에서 종양은 검은색 점 마크로 표시된다.
도 22는 마우스 뇌암 모델에서 생존에 대한 항-FAM19A5 항체의 효과를 도시한다. 검은색 원은 사람 IgG 대조군 항체로 치료된 동물을 나타낸다. 흰색 원은 항-FAM19A5 항체로 치료된 동물을 나타낸다.
서열 유사성 19를 가진 사람 패밀리, 멤버 A5에 특이적으로 결합하며, 본 발명에 개시된 특성들 중 하나 이상을 나타내는 분리된 모노클로날 항체 또는 그것의 항원-결합 부분이 본 발명에 개시되며, 상기 특성은 예를 들어 섬유증의 감소, 반전, 및/또는 예방; 과도한 세포외 바탕질(ECM) 형성의 감소; 종양의 성장 또는 진행의 지연; 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 가용성 사람 FAM19A5에 결합; ELISA에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 막 결합 사람 FAM19A5에 결합; 반응성 신경아교증 개시의 감소, 반전, 지연, 및/또는 예방; 반응성 성상교세포의 과도한 증식의 억제; 뉴로칸 및 뉴런-글리아 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 발현의 감소; 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK 발현의 증가; 뉴런의 생존 촉진; 뉴런에서 GAP43 발현의 증가; 및/또는 축삭돌기 재성장의 촉진이다.
본 발명에 개시된 내용의 이해를 용이하게 하기 위해 다수의 용어 및 문구가 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에서 제시된다.
I. 정의
본 발명 전체에서, 용어 "한" 또는 "어떤" 존재는 그 존재의 하나 이상을 말한다; 예를 들어 "한 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "한"(또는 "어떤"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 본 발명에서 상호 교환하여 사용될 수 있다.
또한, "및/또는"은 본 발명에서 사용된 경우 두 가지의 명시된 특징 또는 성분의 각각이 나머지 하나와 함께 또는 단독으로 구체적으로 개시된다는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)의 양태들을 각각 포함하는 것으로 의도된다.
어떤 양태가 "포함하는"과 함께 본 발명에서 설명되면 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"으로 설명된 다른 유사한 양태들도 또한 제공된다는 것이 이해된다.
달리 정의되지 않는다면, 본 발명에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology(Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press); the Dictionary of Cell and Molecular Biology(3rd ed., 1999, Academic Press); 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology(Revised, 2000, Oxford University Press)가 본 발명에서 사용된 대부분의 용어에 대한 일반적인 사전적 의미를 당업자에게 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 Systeme International de Unites(SI)에서 승인된 형태로 표시된다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 숫자들을 포괄적으로 포함한다. 달리 나타내지 않는다면, 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다. 본 발명에서 제공된 표제는 본 발명의 다양한 양태의 제한이 아니며, 이들은 전체적으로 명세서를 참조했을 수 있다. 따라서, 아래 정의된 용어들은 그 전체가 명세서를 참조하여 더 충분히 정의된다.
용어 "약"은 대략, 대충, 근처, 또는 의 영역 내에를 의미하기 위해 본 발명에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때 그것은 제시된 수치 값의 위와 아래로 경계를 확장시킴으로써 해당 범위를 변형한다. 일반적으로, 용어 "약"은, 예를 들어 위나 아래로(더 높거나 더 낮게) 10 퍼센트의 변동까지, 언급된 값의 위와 아래로 수치 값을 변형할 수 있다.
용어 "서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5" 또는 "FAM19A5"는 5개의 고도로 상동성인 단백질의 TAFA 패밀리(FAM19 패밀리라고도 함)에 속하는 단백질을 말하며, 뇌와 척수에서 우세하게 발현된다. FAM19A5는 또한 TAFA5 또는 케모카인-유사 단백질 TAFA-5라고도 알려져 있다.
사람에서, FAM19A5를 암호화하는 유전자는 염색체 22에 위치된다. 3개의 사람 FAM19A5(UniProt: Q7Z5A7) 이소폼이 있으며, 이들은 다음과 같이 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 것으로 생각된다: 이소폼 1(UniProt: Q7Z5A7-1), 이것은 132개 아미노산으로 구성된다; 이소폼 2(UniProt: Q7Z5A7-2), 이것은 125개 아미노산으로 구성된다; 및 이소폼 3(UniProt: Q7Z5A7-3), 이것은 53개 아미노산으로 구성된다. 사람 FAM19A5 단백질은 막 결합 형태와 가용성(분비된) 형태로 모두 존재한다고 여겨진다. 이소폼 1은 하나의 경막 영역을 가진 막 단백질인 것으로 생각된다. 이소폼 2는 분비된 단백질(가용성)로서 Tang T.Y. et al., Genomics 83(4): 727-34 (2004)에 보고되었고, 아미노산 위치 1-25에 신호 펩타이드를 함유한다. 이소폼 3은 EST 데이터에 기초하여 예상된다. 아래는 3개의 공지된 사람 FAM19A5 이소폼의 아미노산 서열이다.
(I) 이소폼 1(UniProt: Q7Z5A7-1, 경막 단백질): 이 이소폼이 표준 서열로서 선택되었다.
(II) 이소폼 2(UniProt: Q7Z5A7-2, 가용성 단백질):
(III) 이소폼 3(UniProt: Q7Z5A7-3):
용어 "FAM19A5"는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 FAM19A5의 임의의 변이체 또는 이소폼을 포함한다. 따라서, 본 발명에서 설명된 항체는 동일한 종의 상이한 이소폼(예를 들어, 사람 FAM19A5의 상이한 이소폼)과 교차-반응할 수 있거나, 또는 사람 이외의 종의 FAM19A5(예를 들어, 마우스 FAM19A5)와 교차-반응할 수 있다. 또는, 항체는 사람 FAM19A5에 특이적일 수 있으며, 다른 종과는 교차-반응성을 나타내지 못할 수 있다. FAM19A5, 또는 그것의 임의의 변이체 및 이소폼은 이들을 자연적으로 발현하는 세포 또는 조직으로부터 분리되거나 또는 재조합 방식으로 생성될 수 있다. 사람 FAM19A5를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 GenBank 기탁 번호 No. BC039396을 가지며 다음의 서열을 가진다:
[표 1A]
용어 "항체" 및 "항체들"은 본 분야의 용어이며 본 발명에서 상호 교환하여 사용될 수 있고, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 가진 분자를 말한다. 본 발명에서 사용된 용어는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉 "항원-결합 부분") 또는 이들의 단쇄를 포함한다. 한 구체예에서, "항체"는 이황화물 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 그것의 항원-결합 부분을 말한다. 다른 구체예에서, "항체"는 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH 도메인을 포함하는 단쇄 항체를 말한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 발명에서는 VH로 약기됨)과 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 특정한 자연-발생 항체에서, 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 특정한 자연-발생 항체에서, 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 발명에서는 VL로 약기됨)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다.
VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는, 더 보존성인 영역들이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는, 초가변성 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR와 4개의 FR로 이루어지며, 이들은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단을 향해 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 정통 보체 시스템의 제1 성분(C1q)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자들과 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "Kabat 넘버링" 및 유사한 용어들은 본 분야에서 인정되며 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 말한다. 특정 양태에서, 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라서 결정될 수 있다(예를 들어, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조). Kabat 넘버링 시스템을 사용하면, 항체 중쇄 분자 내에서 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35(이것은 선택적으로 35 이후에 하나 또는 2개의 추가의 아미노산을 포함할 수 있다; Kabat 넘버링 방식에서 35A 및 35B로 언급된다)(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65(CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102 (CDR3)에 존재한다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하면, 항체 경쇄 분자 내에서 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56(CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97(CDR3)에 존재한다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 방식에 따라서 결정되었다.
문구 "Kabat에 따른 아미노산 위치 넘버링", "Kabat 위치" 및 이들의 문법적 변이형들은 Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)에서 항체 컴필레이션의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 말한다. 이 넘버링 시스템을 사용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있는데, 이것은 가변 도메인의 FW 또는 CDR의 단축, 또는 이것에의 삽입에 해당한다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따르면 잔기 52a) 및 중쇄 FW 잔기 82 이후 삽입된 잔기(예를 들어 Kabat에 따르면 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 을 포함할 수 있다(표 1b 참조).
[표 1B]
잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 항체 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해, 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. Chothia는 구조 루프의 위치를 말한다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)). Chothia CDR-H1 루프의 단부는 Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링되었을 때 루프의 길이에 따라 H32 내지 H34 사이에서 변한다(이것은 Kabat 넘버링 방식이 H35A와 H35B에 삽입을 위치시키기 때문이다; 35A도 35B도 존재하지 않는다면 루프는 32에서 끝난다; 35A만 존재하면 루프는 33에서 끝난다; 35A와 35B가 둘 다 존재하면 루프는 34에서 끝난다). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충점을 표시하며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다.
EVIGT(ImMunoGeneTics)는 CDR을 포함하는 면역글로불린 가변 영역에 대한 넘버링 시스템을 제공한다. 예를 들어, Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003)를 참조하며, 이것은 본 발명에 참고로 포함된다. EVIGT 넘버링 시스템은 5,000개를 넘는 서열의 정렬, 구조 데이터 및 초가변 루프의 특성화에 기초했으며, 모든 종에 대해 가변 영역과 CDR 영역의 용이한 비교를 허용한다. IMGT 넘버링 스키마에 따르면, VH-CDR1은 위치 26 내지 35에 있고, VH-CDR2는 위치 51 내지 57에 있고, VH-CDR3은 위치 93 내지 102에 있고, VL-CDR1은 위치 27 내지 32에 있고, VL-CDR2는 위치 50 내지 52에 있고, VL-CDR3은 위치 89 내지 97에 있다.
본 발명에서 논의된 모든 중쇄 불변 영역 아미노산 위치에 대해, 넘버링은 서열화된 최초의 사람 IgG1인 골수종 단백질 EU의 아미노산 서열을 설명한 Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85에 최초로 설명된 EU 인덱스에 따른다. Edelman et al.의 EU 인덱스는 또한 Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda)에도 제시된다. 따라서, 문구 "Kabat에 제시된 EU 인덱스" 또는 "Kabat의 EU 인덱스" 및 "Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따른 위치" 및 이들의 문법적 변이형들은 Kabat 1991에 제시된 것과 같은 Edelman et al.의 사람 IgG1 EU 항체에 기초한 잔기 넘버링 시스템을 말한다.
가변 도메인(중쇄와 경쇄 모두) 및 경쇄 불변 영역 아미노산 서열에 사용된 넘버링 시스템은 Kabat 1991에 제시된 것이다.
항체는 면역글로불린 분자의 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 유형(예를 들어, IgD, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2), 또는 임의의 아형(예를 들어, 사람에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 마우스에서IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3)을 가질 수 있다. 면역글로불린, 예를 들어 IgG1은 몇몇 알로타입으로 존재하며, 이들은 최대 몇 개의 아미노산이 서로 상이하다. 본 발명에 개시된 항체는 통상 알려진 이소타입, 유형, 아형, 또는 알로타입 중 임의의 것으로부터 유래할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에 개시된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형 또는 이들의 임의의 하이브리드이다. 특정 구체예에서, 항체는 사람 IgG1 아형 또는 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 아형의 것이다.
"항체"는, 예로서, 자연-발생 및 비-자연-발생 항체; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 사람화 항체; 사람 및 비-사람 항체, 전체 합성 항체; 단쇄 항체; 단일특이적 항체; (이중특이적 항체를 포함하는) 다중특이적 항체; 2개의 중쇄와 2개의 경쇄 분자를 포함하는 테트라머 항체; 항체 경쇄 모노머; 항체 중쇄 모노머; 항체 경쇄 다이머; 항체 중쇄 다이머; 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍; 인트라바디; 헤테로콘쥬게이트 항체; 1가 항체; 낙타화 항체; 아피바디; (예를 들어, 항-항-Id 항체를 포함하는) 항-이디오타입(항-Id) 항체, 및 충분히 항원 결합할 수 있는 단일 모노머 가변 항체 도메인(예를 들어, VH 도메인 또는 VL 도메인)으로 구성된 결합 분자를 포함하는 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함한다(Harmen M. M. and Haard H. J. Appl Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22 (2007) 참조).
본 발명에서 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분"은 항원(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 이러한 "단편"은, 예를 들어 약 8 내지 약 1500개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 745개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 300개, 예를 들어 약 8 내지 약 200개 아미노산, 또는 약 10개 내지 약 50 또는 100개 아미노산 길이이다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 항체, 예를 들어 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어에 포함되는 결합 단편의 예들은 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, 및 이황화물-연결된 Fvs(sdFv); (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 이어질 수 있는 둘 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL과 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 이어질 수 있으며, 이로써 VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 사슬이 될 수 있다(단쇄 Fv(scFv)라고 함);(예를 들어 Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단쇄 항체도 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래의 기술을 사용하여 얻어지며, 단편들은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소 또는 화학 절단에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 본 분야에서 통상적으로 상호 교환하여 사용된다. 가변 영역은 전형적으로 항체의 일부분, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부분, 전형적으로 성숙한 중쇄에서 약 아미노 말단 110 내지 120개 아미노산과 성숙한 경쇄에서 약 90 내지 115개 아미노산을 말하며, 이들은 항체별로 서열이 광범하게 상이하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성 때문에 사용된다. 서열 변동성은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 영역에 집중되며, 가변 도메인에서 더 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 불린다.
경쇄 및 중쇄의 CDR은 항원과 항체의 상호작용 및 특이성을 주로 담당한다고 여겨진다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 사람 가변 영역이다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR과 사람 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 영장류(예를 들어, 비-사람 영장류) 가변 영역이다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR과 영장류(예를 들어, 비-사람 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "중쇄"는 항체와 관련하여 사용되었을 때, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 임의의 상이한 타입, 예를 들어 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)를 말할 수 있으며, 이들은 각각 IgG의 아형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여, 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 유형을 발생시킨다.
본 발명에서 사용된 용어 "경쇄"는 항체와 관련하여 사용되었을 때, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 임의의 상이한 타입, 예를 들어 카파(κ) 및 람다(λ)를 말할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 경쇄는 사람 경쇄이다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 상호 교환하여 사용되며 항체의 경쇄 가변 영역을 말한다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 상호 교환하여 사용되며 항체의 중쇄 가변 영역을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 상호 교환 가능하며 본 분야의 통상의 의미를 가진다. 불변 도메인은 항체 부분이며, 예를 들어 항체와 항원의 결합에는 직접 연루되지 않지만, Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카복시 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더 보존성인 아미노산 서열을 가진다.
"Fc 영역"(단편 결정화 가능한 영역) 또는 "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어 이펙터 세포) 상에 위치된 Fc 수용체 또는 정통 보체 시스템의 제1 성분(C1q)과의 결합을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자들과 면역글로불린의 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 말한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인(예를 들어, CH1 또는 CL)을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소타입에서, Fc 영역은 항체의 두 중쇄의 제2(CH2) 및 제3(CH3) 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편을 포함한다; IgM 및 IgE Fc 영역은 각 폴리펩타이드 사슬에 3개의 중쇄 불변 도메인(CH 도메인 2~4)을 포함한다. IgG의 경우, Fc 영역은 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3과 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양하지만, 사람 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 C226이나 P230에 있는 아미노산 잔기(또는 이들 두 아미노산 사이의 아미노산)에서 중쇄의 카복시-말단까지 늘어난 것으로서 한정되며, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스를 따른다. 사람 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 약 아미노산 231에서 약 아미노산 340까지 연장되고, CH3 도메인은 Fc 영역에서 Cm 도메인의 C-말단 측에 위치되는데, 그것은 IgG의 약 아미노산 341에서 약 아미노산 447까지 연장된다. 본 발명에서 사용된 Fc 영역은 임의의 알로타입 변이체를 포함하는 자생 서열 Fc, 또는 변이체 Fc(예를 들어, 비-자연-발생 Fc)일 수 있다. 또한, Fc는 분리된 상태의 영역을 말하거나 또는 "Fc 융합 단백질"(예를 들어, 항체 또는 면역유착(immunoadhesion))이라고도 하는, "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질"과 같은 Fc-포함 단백질 폴리펩타이드와 관계된 영역을 말한다.
"자생 서열 Fc 영역" 또는 "자생 서열 Fc"는 자연에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 자생 서열 사람 Fc 영역은 자생 서열 사람 IgG1 Fc 영역; 자생 서열 사람 IgG2 Fc 영역; 자생 서열 사람 IgG3 Fc 영역; 및 자생 서열 사람 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이들의 자연-발생 변이체를 포함한다. 자생 서열 Fc는 Fe들의 다양한 알로타입을 포함한다(예를 들어, Jefferis et al., (2009) mAbs 1:1; Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개) 참조).
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 Fcγ 패밀리의 수용체를 포함하고, 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 다른 방식으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. Fcγ 패밀리는 3개의 활성화 수용체(마우스에서 FcγRI, FcγRIII, 및 FcγRIV; 사람에서 FcγRIA, FcγRIIA, 및 FcγRIIIA)와 하나의 저해 수용체(FcγRIIB)로 구성된다. 사람 IgG1은 대부분의 사람 Fc 수용체와 결합하며 가장 강한 Fc 이펙터 기능을 도출한다. 그것이 결합하는 활성화 Fc 수용체의 종류에 대해서는 뮤린 IgG2a와 동등하다고 간주된다. 반면, 사람 IgG4는 최소한의 Fc 이펙터 기능을 도출한다(Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개) 참조).
불변 영역은 하나 이상의 이펙터 기능을 제거하기 위해, 예를 들어 재조합 기술에 의해 조작될 수 있다. "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용, 또는 그로부터 생기는 생화학적 이벤트를 말한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, FcγR-매개 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 및 항체 의존성 세포-매개 포식작용(ADCP), 및 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체; BCR)의 하향조절을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 한다. 따라서, 용어 "Fc 기능이 없는 불변 영역"은 Fc 영역에 의해 매개된 하나 이상의 이펙터 기능이 감소되거나 없는 불변 영역을 포함한다.
항체의 이펙터 기능은 상이한 접근법에 의해 감소 또는 회피될 수 있다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역을 결여한 항체 단편(예를 들어, 예컨대 Fab, F(ab')2, 단쇄 Fv(scFv), 또는 모노머 VH 또는 VL 도메인으로 구성된 sdAb)을 사용하여 감소되거나 회피될 수 있다. 또는, Fc 영역의 다른 가치 있는 속성(예를 들어 연장된 반감기 및 헤테로다이머화)은 보유하면서 항체의 이펙터 기능을 감소시키기 위해 소위 말하는 무글리코실화(aglycosylated) 항체가 Fc 영역에서 특정 잔기에 연결된 당을 제거함으로써 생성될 수 있다. 무글리코실화 항체는, 예를 들어 당이 부착된 잔기를 결실 또는 변경함으로써, 당을 효소적으로 제거함으로써, 글리코실화 저해제의 존재하에 배양된 세포에서 항체를 생성함으로써, 또는 단백질을 글리코실화할 수 없는 세포(예를 들어, 박테리아 숙주 세포)에서 항체를 발현함으로써 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허공개 No. 20120100140 참조). 다른 접근법은 이펙터 기능이 감소된 IgG 아형으로부터의 Fc 영역을 이용하는 것인데, 예를 들어 IgG2 및 IgG4 항체는 IgG1 및 IgG3보다 더 낮은 수준의 Fc 이펙터 기능을 갖는 것을 특징으로 한다. Fc 부분의 CH2 도메인에서 힌지 영역에 가장 가까이 있는 잔기가 항체의 이펙터 기능을 담당하며, 그것은 선천 면역 시스템의 이펙터 세포 상에서 C1q(보체) 및 IgG-Fc 수용체(FcγR)에 대해 상당히 중첩된 결합 부위를 함유한다(Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개 참조). 따라서, Fc 이펙터 기능이 감소되거나 없는 항체는, 예를 들어 IgG4 이소타입의 IgG 항체로부터 CH2 도메인과 IgG1 이소타입의 IgG 항체로부터 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역, 또는 IgG2로부터 힌지 영역과 IgG4로부터 CH2 영역을 포함하는 키메라 Fc 영역(예를 들어, Lau C. et al., J. Immunol. 191:4769-4777 (2013) 참조), 또는 변경된 Fc 이펙터 기능, 예를 들어 Fc 기능이 감소되거나 없는 돌연변이를 가진 Fc 영역을 생성함으로써 제조될 수 있다. 돌연변이를 가진 이러한 Fc 영역은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국특허 공개 No. 20120100140호와 거기 인용된 미국출원 및 PCT 출원 그리고 An et al., mAbs 1:6, 572-579 (2009)를 참조하며, 이들의 내용은 그 전체가 본 발명에 참고로 포함된다.
"힌지", "힌지 도메인", "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역"은 상호 교환하여 사용되며, CH1 도메인을 CH2 도메인과 연결하고 힌지의 상부, 중앙, 및 하부 부분을 포함하는 중쇄 불변 영역의 도메인을 말한다(Roux et al., J. Immunol. 1998 161:4083 참조). 힌지는 항체의 결합 영역과 이펙터 영역 사이에 가요성의 수준을 변화시키며, 또한 두 중쇄 불변 영역 사이에 분자간 이황화물 결합을 위한 부위를 제공한다. 본 발명에서 사용된 힌지는 모든 IgG 이소타입에 대해 Glu216에서 시작해서 Gly237에서 끝난다(Roux et al. 1998 J. Immunol. 161:4083 참조). 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지의 서열이 본 분야에 공지되어 있다(예를 들어 Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개) 참조).
용어 "CH1 도메인"은 중쇄 불변 도메인에서 가변 도메인과 힌지를 연결하는 중쇄 불변 영역을 말한다. 본 발명에서 사용된 CH1 도메인은 A118에서 시작해서 V215에서 끝난다. 용어 "CH1 도메인"은 야생형 CH1 도메인뿐만 아니라 그것의 자연적으로 존재하는 변이체(예를 들어 알로타입)를 포함한다. (야생형 및 알로타입을 포함하는) IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 CH1 도메인 서열은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Kabat E.A. et al., (1991)(상동) 및 Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개)를 참조한다. 예시적인 CH1 도메인은 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 반감기를 변형하는 돌연변이를 가진 CH1 도메인을 포함하며, 이들은 예를 들어 미국특허 공개 No. 20120100140 및 거기 인용된 미국특허 및 출원과 PCT 출원에 개시된다.
용어 "CH2 도메인"은 중쇄 불변 도메인에서 힌지와 CH3 도메인을 연결하는 중쇄 불변 영역을 말한다. 본 발명에서 사용된 CH2 도메인은 P238에서 시작해서 K340에서 끝난다. 용어 "CH2 도메인"은 야생형 CH2 도메인뿐만 아니라 그것의 자연적으로 존재하는 변이체(예를 들어 알로타입)를 포함한다. (야생형 및 알로타입을 포함하는) IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 CH2 도메인 서열은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Kabat E.A. et al., (1991)(상동) 및 Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개)를 참조한다. 예시적인 CH2 도메인은 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 반감기 및/또는 감소된 Fc 이펙터 기능을 변형하는 돌연변이를 가진 CH2 도메인을 포함하며, 이들은 예를 들어 미국특허 공개 No. 20120100140호 및 거기 인용된 미국특허 및 출원과 PCT 출원에 개시된다.
용어 "CH3 도메인"은 중쇄 불변 도메인에서 CH2 도메인에 대해 C-말단인 중쇄 불변 영역을 말한다. 본 발명에서 사용된 CH3도메인은 G341에서 시작해서 K447에서 끝난다. 용어 "CH3 도메인"은 야생형 CH3 도메인뿐만 아니라 그것의 자연적으로 존재하는 변이체(예를 들어 알로타입)를 포함한다. (야생형 및 알로타입을 포함하는) IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 CH3 도메인 서열은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Kabat E.A. et al., (1991)(상동) 및 Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개)를 참조한다. 예시적인 CH3 도메인은 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 반감기를 변형하는 돌연변이를 가진 CH3 도메인을 포함하며, 이들은 예를 들어 미국특허 공개 No. 20120100140호 및 거기 인용된 미국특허 및 출원과 PCT 출원에 개시된다.
본 발명에서 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 유형(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE 항체)을 말한다.
"알로타입"은 몇 개의 아미노산이 차이가 있는 특정한 이소타입 그룹 내에서 자연-발생한 변이체를 말한다(예를 들어, Jefferis et al., (2009) mAbs 1:1 참조). 본 발명에서 설명된 항체는 임의의 알로타입을 가질 수 있다. IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 알로타입은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Kabat E.A. et al., (1991)(상동); Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개); 및 Lefranc M.P., mAbs 1:4, 1-7(2009)를 참조한다.
문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 함께 본 발명에서 상호 교환하여 사용된다.
본 발명에서 사용된 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 말한다(예를 들어, FAM19A5에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 FAM19A5 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, FAM19A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 상이한 종으로부터의 다른 FAM19A5 단백질에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그것의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 간의 비-공유 상호작용의 전체 합계 강도를 말한다. 달리 나타내지 않는다면, 본 발명에서 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체와 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화성을 말한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(KD)에 의해 표시될 수 있다. 친화성은, 제한은 아니지만, 평형 해리 상수(KD), 및 평형 결합 상수(KA)를 포함하는, 본 분야에 공지된 다수의 방식으로 측정 및/또는 표시될 수 있다. KD는 koff/kon로부터 계산되고 몰 농도(M)로 표시되며, KA는 kon/koff로부터 계산된다. kon은, 예를 들어 항원에 대한 항체의 결합 속도 상수를 말하고, koff는, 예를 들어 항원에 대한 항체의 해리 속도 상수를 말한다. kon 및 koff는 면역분석(예를 들어 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)), BIACORE® 또는 역학적 배제 분석(KINEXA®)과 같은, 당업자에게 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적으로 인식한다", "특이적 결합", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합한다"는 항체와 관련하여 유사한 용어들로서 항원(예를 들어, 에피토프 또는 면역 복합체)에 결합하는 분자(예를 들어, 항체)를 말하며, 이러한 결합은 당업자에 의해 이해되는 바와 같다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는, 예를 들어 면역분석, BIACORE®, KINEXA® 3000 기기(Sapidyne Instruments, Boise, 인도), 또는 본 분야에 공지된 다른 분석들에 의해 결정되었을 때, 일반적으로 더 낮은 친화성으로 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 이 분자가 다른 항원에 결합할 때의 KA보다 적어도 2 logs, 2.5 logs, 3 logs, 4 logs 또는 그 이상 더 큰 KA으로 그 항원에 결합한다.
항체는 전형적으로 10-5 내지 10-11 M 이하의 해리 상수에 의해 반영되는, 높은 친화성으로 동족 항원에 특이적으로 결합한다. 약 10-4 M를 초과하는 KD는 일반적으로 비특이적 결합을 나타낸다고 간주된다. 본 발명에서 사용된, 항원과 "특이적으로 결합하는" 항체는 높은 친화성으로 항원 및 실질적으로 동일한 항원에 결합하는 항체를 말하며, 이것은 예를 들어 정해진 항원을 사용하여 면역분석(예를 들어 ELISA) 또는 BIACORE™ 2000 기기에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 의해 결정되었을 때, 10-7 M 이하, 바람직하게 10-8 M 이하, 더욱더 바람직하게 10-9 M 이하, 및 가장 바람직하게 10-8 M 내지 10-10 M 이하의 KD를 갖는 것을 의미하고, 이것은 관련 없는 항원에는 높은 친화성으로 결합하지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원"은 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질, 예컨대 단백질, 펩타이드 또는 합텐을 말한다. 항원은 FAM19A5 또는 그것의 단편일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "에피토프"는 본 분야의 용어로서 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된 영역을 말한다. 에피토프는, 예를 들어 폴리펩타이드의 연속(contiguous) 아미노산들(선형 또는 연속 에피토프)일 수 있거나, 또는 에피토프는, 예를 들어 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 둘 이상의 비-연속 영역(입체형태적, 비-선형, 불연속, 또는 비-연속 에피토프)들이 합쳐진 것일 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 항상 그렇지는 않지만 전형적으로 변성 용매에 노출시 보유되고, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체형태에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 20개 아미노산을 포함한다. 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합된 것을 결정하는 방법(즉, 에피토프 맵핑)이 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 이들은, 예를 들어 면역블롯팅 및 면역침전 분석을 포함하고, (예를 들어, FMAM19A5로부터의) 중첩 또는 연속 펩타이드가 주어진 항체(예를 들어, 항-FAM19A5 항체)와의 반응성에 대해 시험된다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 본 분야의 기술 및 본 발명에서 설명된 것들을 포함하며, 예를 들어 엑스선 결정학, 2-차원 핵자기공명 및 HDX-MS를 포함한다(예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) 참조).
특정 구체예에서, 항체가 결합한 에피토프는, 예를 들어 NMR 분광법, 엑스선 회절 결정학 연구, ELISA 분석, 질량분광법과 결합된 수소/중수소 교환(예를 들어, 액체 크로마토그래피 전자분무 질량분광법), 어레이-기반 올리고-펩타이드 스캐닝 분석, 및/또는 돌연변이유발 맵핑(예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 맵핑)에 의해 결정될 수 있다. 엑스선 결정학의 경우, 결정화는 본 분야에 공지된 방법 중 어느 것을 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어, Giege R. et al., (1994) Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50(Pt 4):339-350; McPherson A. (1990) Eur. J. Biochem. 189: 1-23; Chayen N.E. (1997) Structure 5:1269-1274; McPherson A. (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303 참조). 항체:항원 결정은 잘 공지된 엑스선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고, X-PLOR(Yale University, 1992, Molecular Simulations, Inc.에 의해 배포; 예를 들어 Meth. Enzymol.(1985) volumes. 114 & 115, eds Wyckoff H.W. et al.,; 미국특허 공개 No. 2004/0014194 참조), BUSTER (Bricogne G. (1993) Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 49(Pt1):37-60; Bricogne G. (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, ed Carter C.W.; Roversi P. et al., (2000) Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 56(Pt 10):1316-1323 참조)과 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정리될 수 있다. 돌연변이유발 맵핑 연구는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기술을 포함하는 돌연변이유발 기술의 설명은, 예를 들어 Champe M. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394 및 Cunningham B.C. & Wells J.A. (1989) Science 244:1081-1085를 참조한다.
용어 "에피토프 맵핑"은 항체-항원 인식에 대한 분자 결정소의 확인 과정을 말한다.
둘 이상의 항체와 관련하여 용어 "동일한 에피토프에 결합한다"는 주어진 방법에 의해 결정되었을 때 항체들이 아미노산 잔기의 동일한 세그먼트에 결합한다는 것을 의미한다. 항체들이 본 발명에서 설명된 항체와 "FAM19A5 상의 동일한 에피토프"에 결합하는지 여부를 결정하는 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 분해능을 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 엑스선 분석 및 수소/중수소 교환 질량분광법(HDX-MS)을 포함한다. 다른 방법은 항체와 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체의 결합을 모니터링하며, 여기서 항원 서열 내에서 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 손실이 주로 에피토프 성분의 표시로서 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법도 사용될 수 있다. 이들 방법은 조합 파지 전시 펩타이드 라이브러리로부터 특정한 짧은 펩타이드를 친화성 분리할 수 있는 관심 항체의 능력에 의존한다. 동일한 VH 및 VL 또는 동일한 CDR1, 2 및 3 서열을 가진 항체는 동일한 에피토프에 결합할 것으로 예상된다.
"표적과의 결합에 대해 다른 항체와 경쟁하는 항체"는 나머지 항체와 표적의 결합을 (부분적으로 또는 완전히) 저해하는 항체를 말한다. 두 항체가 표적과의 결합에 대해 서로 경쟁하는지 여부, 즉 하나의 항체가 나머지 항체와 표적의 결합의 저해하는지의 여부와 저해하는 정도는 공지된 경쟁 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 다른 항체와 표적의 결합에서 경쟁하며 이 결합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%까지 저해한다. 저해 또는 경쟁의 수준은 항체가 "차단 항체"(즉, 표적과 먼저 인큐베이션된 저온 항체)인지에 따라 상이할 수 있다. 경쟁 분석은, 예를 들어 E.d. Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 또는 E.d. Harlow and David Lane에 의한 "Using Antibodies"(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999)의 제11장에 설명된 대로 수행될 수 있다. 경쟁 항체는 (예를 들어, 입체 장해에 의해) 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접 에피토프에 결합한다.
다른 경쟁 결합 분석은 고체상 직접 또는 간접 방사성면역분석(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983) 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986) 참조); 고체상 직접 표지화 분석, 고체상 직접 표지화 샌드위치 분석(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) 참조); 1-125 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA( Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988) 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); 및 직접 표지화 RIA(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))를 포함한다.
"이중특이적" 또는 "이중기능성 항체"는 두 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 두 상이한 결합 부위를 가진 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)를 참조한다.
본 발명에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체 또는 모든 항체가 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체들의 조성물을 말한다. 따라서, 용어 "사람 모노클로날 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내고 사람 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 선택적 불변 영역을 가진 항체 또는 항체 조성물을 말한다. 한 구체예에서, 사람 모노클로날 항체는 트랜스제닉 비-사람 동물, 예를 들어 불멸화 세포에 융합된 사람 중쇄 트랜스젠과 경쇄 트랜스젠을 포함하는 게놈을 가진, 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 사람 항체"는 (a) 사람 면역 글로불린 유전자에 대해 트랜스젠이거나 트랜스염색체성(transchromosomal)인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 조합 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 사람 면역글로불린 유전자 서열을 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 사람 항체를 포함한다. 이러한 재조합 사람 항체는 점라인 유전자에 의해 암호화되지만, 예를 들어 항체 성숙화 동안 발생하는 후속 재배열 및 돌연변이를 포함하는 특정한 사람 점라인 면역글로불린 서열을 이용하는 가변 및 불변 영역을 포함한다. 본 분야에 공지된 대로(예를 들어, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125 참조), 가변 영역은 외래 항원에 대해 특이적인 항체를 형성하도록 재배열한 다양한 유전자에 의해 암호화된, 항원 결합 도메인을 함유한다. 재배열에 더하여, 가변 영역은 외래 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 다수의 단일 아미노산 변화(체세포 돌연변이 또는 초돌연변이라고 함)에 의해 더 변형될 수 있다. 불변 영역은 항원에 대한 추가의 반응에서 변할 것이다(즉, 이소타입 스위치). 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 분자는 원래 핵산 분자와 서열 동일성을 가질 수 없지만, 대신 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다(즉, 적어도 80% 동일성을 가진다).
"사람 항체"(HuMAb)는 프레임워크와 CDR 영역이 둘 다 사람 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진 항체를 말한다. 또한, 이 항체가 불변 영역을 함유한다면, 불변 영역 역시 사람 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명에서 설명된 항체는 사람 점라인 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특정 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본 발명에서 사용된 용어 "사람 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 점라인으로부터 유래된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열에 접목된 항체는 포함하지 않는다. 용어 "사람" 항체와 "완전한 사람" 항체는 동의어로서 사용된다.
"사람화 항체"는 비-사람 항체의 CDR 도메인 밖의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 사람 면역글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 치환된 항체를 말한다. 항체의 사람화 형태의 한 구체예에서, CDR 도메인 밖의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 사람 면역글로불린으로부터의 아미노산으로 치환되었고, 하나 이상의 CDR 영역 내의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부는 그대로 남는다. 아미노산의 첨가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 이들이 항체가 특정 항원에 결합하는 능력을 없애지 않는 한 허용된다. "사람화 항체"는 원래 항체의 것과 유사한 항원 특이성을 보유한다.
"키메라 항체"는 하나의 종으로부터 가변 영역이 유래되고 다른 종으로부터 불변 영역이 유래된 항체, 예컨대 마우스 항체로부터 가변 영역이 유래되고 사람 항체로부터 불변 영역이 유래된 항체를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 "교차-반응한다"는 상이한 종들로부터의 FAM19A5에 결합하는 본 발명에서 설명된 항체의 능력을 말한다. 예를 들어, 사람 FAM19A5에 결합하는 본 발명에 설명된 항체는 다른 종의 FAM19A5(예를 들어, 마우스 FAM19A5)에도 결합할 수 있다. 본 발명에서 사용된 교차-반응성은 결합 분석(예를 들어, SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성을 검출함으로써 또는 FAM19A5를 생리학적으로 발현하는 세포와의 결합, 또는 기능적 상호작용을 검출함으로써 측정될 수 있다. 교차-반응성을 결정하기 위한 방법은 본 발명에서 설명된 표준 결합 분석, 예를 들어, BIACORE® 2000 SPR 기기(Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)를 사용한 BIACORE® 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석, 또는 유세포계수 기술을 포함한다.
본 발명에서 어떤 물체에 적용된 용어 "자연-발생"은 그 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 말한다. 예를 들어, 자연의 출처로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연-발생적이다.
"폴리펩타이드"는 적어도 두 개의 연속 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 사슬을 말하며, 사슬의 길이에는 상한은 없다. 단백질에서 하나 이상의 아미노산 잔기는, 제한은 아니지만, 글리코실화, 포스포릴화 또는 이황화물 결합 형성과 같은 변형을 함유할 수 있다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, cDNA일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 한 가지 종류의 벡터는 "플라스미드"이고, 이것은 추가의 DNA 세그먼트가 리게이션될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 루프를 말한다. 다른 종류의 벡터는 바이러스 벡터이며, 이것은 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 리게이션될 수 있다. 특정한 벡터(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다. 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정한 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 발명에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라고 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성을 가진 발현 벡터는 주로 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 흔히 사용되는 형태이기 때문에 상호 교환하여 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스(예를 들어, 복제 결합 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스) 벡터와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 또한 포함되며, 이들은 동등한 기능을 수행한다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 숙주 세포"(간단히 "숙주 세포")는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포를 말하며, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다. 이러한 용어는 특정한 해당 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 언급한다는 것이 이해되어야 한다. 돌연변이나 환경적 영향으로 인해 이어진 세대들에서는 특정한 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일할 수 없지만 그래도 여전히 본 발명에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.
본 발명에서 사용된 용어 "결합된"은 둘 이상의 분자의 회합을 말한다. 결합은 공유 결합 또는 비-공유 결합일 수 있다. 결합은 또한 (재조합 방식으로 융합되는) 유전자 결합일 수 있다. 이러한 결합은 화학적 콘쥬게이션 및 재조합 단백질 생성과 같은 본 분야에에 인정된 여러 가지 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명에서 사용된 "투여하는"은 치료제 또는 치료제를 포함하는 조성물을 당업자에게 공지된 다양한 방법 및 송달 시스템 중 어느 것을 사용하여 대상에게 물리적으로 도입하는 것을 말한다. 본 발명에서 설명된 항체에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본 발명에서 사용된 문구 "비경구 투여"는 장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 말하고, 제한은 아니지만 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 림프내, 병소내, 낭내, 안구내, 심장내, 피내, 기관경유, 피하, 표피하, 관절내, 낭하, 지주막하, 심실내, 유리체내, 경막외 및 흉골하 주사 및 주입뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 또는, 본 발명에서 설명된 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 상피 또는 점막 투여 경로를 통해서, 예를 들어 비내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한, 투여는, 예를 들어 한 번, 여러 번, 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐서 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 질환과 관련된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 지표의 진행, 발생, 중증도 또는 재발의 반전, 완화, 개선, 저해, 또는 지연 또는 예방의 목적으로 대상에 대해 수행된, 또는 대상에게 활성제를 투여하는 중재나 과정의 어떤 종류를 말한다. 치료는 질환을 가진 대상이나 질환을 갖지 않은 대상(예를 들어, 예방을 위해)에서 모두 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "대상"은 임의의 사람 또는 비-사람 동물을 포함한다. 용어 "비-사람 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비-사람 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "신경아교증의 개시" 또는 "반응성 신경아교증의 개시"는 신경아교증의 시작 또는 개시를 포함한다. 신경아교증은, 예를 들어 외상, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역 반응, 및/또는 신경퇴행성 질환으로 인한 손상이나 상해에 반응하여 일어난 중추신경계(CNS, 예를 들어 뇌 및/또는 척수)의 신경아교세포의 비특이적 반응성 변화이며, 성상교세포, 소교세포 및 희돌기교세포를 포함하는, 신경교 세포의 몇몇 상이한 타입의 증식이나 비대를 포함한다. 신경아교증의 개시는 흉터 형성을 초래할 수 있고, 이것은 외상을 입거나 손상된 CNS의 부분에서 축삭돌기 재생을 저해한다. 신경아교증의 개시의 유해한 효과는 뉴런에 대한 비가역적 또는 영구적 손상 및/또는 주변 뉴런의 회복 불능을 포함한다. 따라서, 용어 "신경아교증의 개시의 지연" 및 "반응성 신경아교증의 개시의 지연"은 신경아교증의 시작이나 개시 및 그와 관련된 CNS에 대한 유해한 효과의 저해, 지연, 억제, 또는 예방을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "반응성 성상교세포의 과도한 증식"은, 예를 들어 CNS 손상, 외상, 상해, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역 반응, 및/또는 신경퇴행성 질환으로 인한 근처 뉴런의 파괴로 인한 성상교세포 수의 비정상적 증가를 포함한다. 반응성 성상교세포의 과도한 증식은 외상을 입거나 손상된 CNS의 부분에서 축삭돌기 재생을 저해하는 흉터 형성, 염증의 악화, 신경독성 수준의 반응성 산소 종의 생성 및 방출, 잠재적 흥분독성 글루타메이트의 방출, 발작 발생에 대한 잠재적 기여, 혈액-뇌 장벽 기능의 손상, 외상 및 뇌졸중 동안 세포독성 부종, 만성 통증에 기여할 수 있는 성상교세포의 만성 사이토카인 활성화에 대한 가능성, 및 CNS 손상 후 이차 변성을 포함하는 CNS에서의 유해한 효과를 초래할 수 있다(Sofroniew, Michael V. (2009) Trends in Neurosciences, 32(12): 638-47; McGraw, J. et al. (2001) Journal of Neuroscience Research 63(2): 109-15; 및 Sofroniew, M. V. (2005) The Neuroscientist 11(5): 400-7 참조). 따라서, 용어 "반응성 성상교세포의 과도한 증식의 억제"는 반응성 성상교세포의 과도한 또는 비정상적 증식 및 그와 관련된 CNS에 대한 유해한 효과의 저해, 지연, 억제, 저지, 또는 예방을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸"은 단백실 심부와 콘드로이틴 설페이트로 이루어진 프로테오글리칸을 포함한다. CSPG라고도 알려져 있는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸은 발생중인 CNS 및 성인 CNS를 통해서 넓게 발현되는 세포외 바탕질 분자이다. CSGP는 신경 발생 및 신경교 흉터 형성에서 중요한 역할을 하며, 이들은 CNS에서 손상 후 축삭돌기 재생을 저해한다. 공지된 CSPG들은 아그리칸(CSPG1), 베르시칸(CSPG2), 뉴로칸(CSPG3), CSPG4(또는 뉴런-글리알 항원 2(NG2)), CSPG5, SMC3(CSPG6, 염색체 3의 구조 유지), 브레비칸(CSPG7), 및 CD44 (CSPG8, 분화 44의 클러스터), 포스파칸뉴로칸(CSPG3)을 포함한다(Rhodes, K. E. and Fawcett, J. W. (2004) Journal of Anatom. 204(l):33-48 참조). 따라서, 용어 "콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 발현의 감소"는 하나 이상의 CSGP의 수준의 저감, 저해, 감소를 포함하거나, 또는 하나 이상의 CSGP의 활성의 감소 또는 하나 이상의 CSGP를 비활성으로 만드는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 용어는 뉴로칸, NG2 또는 둘 다의 수준을 저감, 저해, 감소시키는 것을 포함하거나, 또는 뉴로칸, NG2 또는 둘 다의 활성을 감소시키는 것 또는 뉴로칸, NG2 또는 둘 다를 비활성으로 만드는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "뉴런"은 전기화학적 신호를 통해서 정보를 가공하고 전달하는 전기적으로 흥분가능한 세포를 포함한다. 뉴런은 뇌 및 CNS의 척수의 중요 구성요소이며, 말초신경계(PNS)의 신경절을 가지고, 서로 연결됨으로써 신경 망구조를 형성할 수 있다. 전형적인 뉴런은 세포체(소마), 수지상체, 및 축삭돌기로 이루어진다. 뉴런의 소마(세포체)는 핵을 함유한다. 뉴런의 수지상체는 많은 분기들을 가진 세포 연장부이며, 여기서 뉴런에의 입력의 대부분이 발생한다. 축삭돌기는 소마로부터 연장된 촘촘한 케이블형 돌출부이며, 소바로부터 먼 곳으로 신경 신호를 운반하고, 특정한 종류의 정보를 다시 소마로 운반한다. 용어 "뉴런의 재성장의 촉진"은 바람직하게는 상해 또는 손상 후, 뉴런의 성장의 자극, 촉진, 증가, 또는 활성화를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "c-fos"는 원암유전자 c-fos를 포함하며, 이것은 신경전달물질의 자극에 의해 빠르게 유도된다. c-fos는 마우스 및 사람을 포함하는 많은 종들에 존재한다. c-fos 유전자 및 단백질은 공지되어 있고 특성화되어 있다(Curran, T, The c-fos proto-oncogene, pp 307-327(The Oncogene Handbook, Reddy EP et al., (eds.) Elsevier)(1988) 참조). c-fos의 발현은 본 분야에 공지된 방법, 예를 들어 노던 블롯, 정량적 PCR, 또는 면역조직화학에 의해 결정될 수 있다. 용어 "c-fos의 발현의 증가"는 c-fos mRNA, c-fos 단백질, 또는 c-fos 단백질 활성의 수준의 증가를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "pERK"는 포스포릴화 세포외 신호-조절 키나아제를 포함한다. 세포외 신호-조절 키나아제 또는 ERK는 ERK1 및 ERK2를 포함하며, 이것은 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK) 패밀리의 멤버이다. ERK는 그것의 상류 키나아제에 의해 포스포릴화를 통해서 활성화되어 pERK를 형성하고, 이것은 이후 하류 표적을 활성화시킨다. ERK는 학습의 근간이 되는 신경 및 시냅스 가소성에 연루된다(Ji R.R. et al., Nat Neurosci (1999) 2:1114-1119 참조). ERK 유전자, 단백질, 포스포릴화, 및 활성화는 공지되어 있고 특성화되어 있으며, ERK 및 pERK의 발현은 본 분야에 공지된 방법(예를 들어, 노던 블롯, 정량적 PCR, 또는 면역조직화학)에 의해 결정될 수 있다(Gao Y. J. and Ji R. R., Open Pain J. (2009) 2: 11-17 참조). 용어 "pERK의 발현의 증가"는 ERK mRNA, ERK 단백질, 또는 pERK 활성의 수준의 증가를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "GAP43"은 "성장 관련 단백질 43"이라고도 하며, 신경돌기 형성, 재생, 및 가소성을 촉진하는 신경조직-특이적 단백질이다(Benowitz L. I. and Routtenberg A. (1997) Trends in Neurosciences 20 (2): 84-91; Aarts L. H. et al., (1998) Advances in Experimental Medicine and Biology 446: 85-106 참조). 사람 GAP43은 GAP43 유전자에 의해 암호화된다. 사람 GAP43은 폴리펩타이드 서열(UniProt: KB - P17677)이고, 이 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA가 본 분야에 공지되어 있다(Kosik K. S. et al., (1988) Neuron 1(2): 127-32; Ng S. C. et al., (1988) Neuron 1(2): 133-9 참조). GAP43의 발현은 본 분야에 공지된 방법(예를 들어, 노던 블롯, 정량적 PCR, 또는 면역조직화학)에 의해 결정될 수 있다. 용어 "뉴런에서 GAP43의 증가"는 GAP43 mRNA, GAP43 단백질의 수준의 증진이나 증가, 또는 GAP43 단백질의 활성의 증가를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여, 대상에서 질환 또는 장애를 "치료하기에" 효과적인 또는 질환 또는 장애(예를 들어, 중추신경계 손상)의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키기에 효과적인, 약물의 양을 말한다. "치료적 유효량"은 질환 또는 장애(예를 들어, 외상성 뇌 손상과 같은 중추신경계 손상 또는 본 발명에 개시된 다른 질환)를 갖고 있거나 가질 위험이 있는 대상에 일부 개선이나 이익을 제공하는 약물 또는 치료제의 양을 포함한다. 따라서, "치료적 유효량"은 질환의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키거나 또는 일부 완화, 경감을 제공하고 및/또는 적어도 하나의 지표(예를 들어, 신경아교증의 개시)를 감소시키고, 및/또는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 임상 증상을 감소시키는 양이다.
II. 항- FAM19A5 항체
특별한 기능적 특징이나 특성을 특징으로 하는 항체, 예를 들어 모노클로날 항체가 본 발명에 개시된다. 예를 들어, 상기 항체는 가용성 FAM19A5 및 막 결합 FAM19A5를 포함하는 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합한다. 가용성 및/또는 막 결합 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 것에 더하여, 본 발명에서 설명된 항체는 다음의 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 섬유증의 감소, 반전, 지연 및/또는 예방;
(b) 과도한 세포외 바탕질(ECM) 형성의 감소;
(c) 종양의 성장 또는 진행의 지연;
(d) 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 가용성 사람 FAM19A5에 결합;
(e) ELISA에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 막 결합 사람 FAM19A5에 결합;
(f) 반응성 신경아교증 개시의 감소, 반전, 지연 및/또는 예방;
(g) 반응성 성상교세포의 과도한 증식의 억제;
(h) 뉴로칸 및 뉴런-글리아 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 발현의 감소;
(i) 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK 발현의 증가;
(j) 뉴런의 생존 촉진;
(k) 뉴런에서 GAP43 발현의 증가; 및
(l) 축삭돌기 재성장의 촉진.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, 예를 들어 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M(1 nM) 이하, 10-10 M(0.1 nM) 이하, 10-11 M 이하, 또는 10-12 M(1 pM) 이하, 예를 들어 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 또는 10-9 M 내지 10-7 M, 예를 들어 10-12 M, 5 X 10-12 M, 10-11 M, 5 X 10-11 M, 10-10 M, 5 X 10-10 M, 10-9 M, 5 X 10-9 M, 10-8 M, 5 X 10-8 M, 10-7 M, 또는 5 X 10-7 M의 KD의 높은 친화성으로 가용성 사람 FAM19A5 또는 막-결합 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합한다. 다양한 종의 사람 FAM19A5에 대한 항체의 결합 능력을 평가하는 표준 분석은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, 및 RIA를 포함한다. 적합한 분석들이 실시예에 상세히 설명된다. 항체의 결합 동력학(예를 들어, 결합 친화성)이 또한 ELISA, BIACORE® 분석 또는 KINEXA®과 같은 본 분야에 공지된 표준 분석에 의해 평가될 수 있다. FAM19A5의 기능적 특성(예를 들어, 리간드 결합)에 대한 항체의 효과를 평가하는 분석이 아래 및 실시예에 더 상세히 설명된다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, 예를 들어 ELISA에 의해 결정되었을 때, 10-7 M 이하, 10-8 M(10 nM) 이하, 10-9 M(1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 10-9 M 내지 10-7 M, 또는 10-8 M 내지 10-7 M의 KD로 가용성 사람 FAM19A5와 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 10 nM 이하, 예를 들어 0.1 내지 10 nM, 0.1 내지 5 nM, 0.1 내지 1 nM, 0.5 내지 10 nM, 0.5 내지 5 nM, 0.5 내지 1 nM, 1 내지 10 nM, 1 내지 5 nM, 또는 5 내지 10 nM의 KD로 가용성 FAM19A5와 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 ELISA에 의해 결정되었을 때, 약 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM, 또는 900 pM, 또는 약 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 또는 9 nM, 또는 약 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 또는 90 nM의 KD로 가용성 사람 FAM19A5와 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, 예를 들어 ELISA에 의해 결정되었을 때, 10-7 M 이하, 10-8 M(10 nM) 이하, 10-9 M(1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 10-9 M 내지 10-7 M, 또는 10-8 M 내지 10-7 M의 KD로 막-결합 사람 FAM19A5와 결합한다. 특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, ELISA에 의해 결정되었을 때, 10 nM 이하, 예를 들어 0.1 내지 10 nM, 0.1 내지 5 nM, 0.1 내지 1 nM, 0.5 내지 10 nM, 0.5 내지 5 nM, 0.5 내지 1 nM, 1 내지 10 nM, 1 내지 5 nM, 또는 5 내지 10 nM의 KD로 막 결합 사람 FAM19A5와 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 ELISA에 의해 결정되었을 때, 약 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM, 또는 900 pM, 또는 약 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 또는 9 nM, 또는 약 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 또는 90 nM의 KD로 막 결합 사람 FAM19A5와 결합한다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 반응성 신경아교증의 개시를 감소, 예방, 반전, 지연, 또는 저해할 수 있으며, 예를 들어 외상, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역 반응, 및/또는 신경퇴행성 질환으로 인한 상해나 손상에 반응하여 생신 중추신경계(CNS, 예를 들어 뇌 및/또는 척수)의 신경교 세포의 비특이적 반응성 변화를 지연, 저지, 또는 억제할 수 있다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 반응성 성상교세포의 과도한 또는 비정상적 증식 및 이와 관련된 CNS에 대한 유해한 효과를 지연, 저해, 저지, 억제, 제지, 또는 예방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은, 예를 들어 CNS 손상, 외상, 상해, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역 반응, 및/또는 신경퇴행성 질환으로 인한 뉴런의 파괴로 인한 성상교세포 수의 비정상적 증가를 저해하거나 예방할 수 있고, CNS에서 흉터 형성을 저해하거나 예방할 수 있고, 신경독성 수준의 반응성 산소 종의 방출 또는 잠재적 흥분독성 글루타메이트의 방출을 저해하거나 감소시킬 수 있고, 발작, 통증, 및/또는 CNS 손상 후 이차 변성을 감소시키거나 저해할 수 있다. 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 바람직하게 CNS 손상 또는 상해 후 뉴런의 재성장을 촉진, 자극, 증가 또는 활성화할 수 있다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 아그리칸(CSPG1), 베르시칸(CSPG2), 뉴로칸(CSPG3), CSPG4(또는 뉴런-글리알 항원 2(NG2)), CSPG5, SMC3(CSPG6, 염색체 3의 구조 유지), 브레비칸(CSPG7), CD44(CSPG8, 분화 44의 클러스터), 포스파칸뉴로칸(CSPG3) 또는 이들의 임의의 조합과 같은, 단백질 심부와 콘드로이틴 설페이트(CSGPs)로 이루어진 프로테오글리칸을 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현을 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 뉴로칸 및/또는 NG2의 수준을 저해, 저감, 또는 감소시키거나, 또는 뉴로칸 및/또는 NG2의 활성을 저해, 저감, 또는 감소시킨다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK의 발현을 증가시킬 수 있으며, 예를 들어 c-fos 및 pERK의 mRNA, 단백질 및/또는 단백질 활성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 또한 GAP43 mRNA, GAP43 단백질의 발현 수준을 증가 또는 증진시킬 수 있거나, 또는 GAP43 단백질 활성을 증가 또는 증진시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 본 발명에 개시된 CDR 또는 가변영역을 포함하는 항-FAM19A5 항체(예를 들어, 2-13, 3-2, 또는 1-28)와 사람 FAM19A5 에피토프에 대한 결합에 대해 상호-경쟁한다(또는 결합을 저해한다).
특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 기준 항체의 결합을 저해하며, (i) 기준 항체의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하고, 기준 항체의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 기준 항체는 (i) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 또는 SEQ ID NO: 38을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 (ii) SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 또는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 이러한 기준 항체와 사람 FAM19A5의 결합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%까지 저해한다. 경쟁 항체는 (예를 들어, 입체 장해에 의해) 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접 에피토프와 결합한다. 두 항체가 표적과의 결합에 대해 서로 경쟁하는지 여부는 RIA 및 EIA와 같은 본 분야에 공지된 경쟁 실험을 사용하여 결정될 수 있다.
특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체또는 그것의 항원 결합 부분은 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 본 발명에 개시된 기준 항체와 동일한 FAM19A5 에피토프에 결합하며, (i) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (iii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 기준 항체는 (i) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 또는 SEQ ID NO: 38을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 (ii) SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 또는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
두 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 분해능을 제공하는 항원:항체 복합체 결정의 엑스선 분석 및 수소/중수소 교환 질량분광법(HDX-MS), 항체와 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체의 결합을 모니터링하는 방법(여기서 항원 서열 내에서 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합은 손실이 주로 에피토프 성분의 표시로서 간주됨), 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법을 포함한다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, 예를 들어 항체와 사람 FAM19A5의 단편의 결합에 의해 결정되었을 때, 성숙한 사람 FAM19A5의 적어도 하나의 에피토프와 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 TLDRDSSQPRRTIARQTARC(SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 42 내지 61)의 아미노산 서열을 가진 적어도 하나의 에피토프에 결합하거나, 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 내에 위치된 단편, 예를 들어 SEQ ID NO: 6의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산을 가진 에피토프와 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 46 내지 51(즉, DSSQPR), 예를 들어 아미노산 잔기 46, 50, 및 52(즉, D---P-R), 예를 들어 아미노산 잔기 46, 47, 48, 및 50(즉, DSS-P)에 해당하는 하나 이상의 아미노산에서 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열 내에 위치된 단편, 예를 들어 SEQ ID NO: 9의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산을 가진 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 에피토프는 SEQ ID NO: 6과 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 에피토프는 SEQ ID NO: 9와 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10인 사람 FAM19A5 에피토프에만, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 아미노산 서열 내에 위치된 단편, 예를 들어 SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산을 가진 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 6 또는 그것의 단편과 자생 입체형태(즉, 비변성) 상태로 결합한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 9 또는 그것의 단편과 자생 입체형태(즉 비변성) 상태로 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 글리코실화 및 비글리코실화 사람 FAM19A5에 둘 다 결합한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 하나 이상의 추가의 FAM19A5 에피토프에 더 결합한다. 따라서, 특정한 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 6의 에피토프와 추가의 에피토프 또는 SEQ ID NO: 9의 에피토프와 추가의 에피토프에 결합한다. 다른 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 5의 에피토프, SEQ ID NO: 9의 에피토프, 및 추가의 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 6의 에피토프, SEQ ID NO: 10의 에피토프, 및 추가의 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 추가의 FAM19A5 에피토프는 QLAAGTCEIVTLDR(SEQ ID NO: 5, 에피토프 F1), TLDRDSSQPRRTIARQTARC(SEQ ID NO: 6, 에피토프 F2), TARCACRKGQIAGTTRARPA(SEQ ID NO: 7, 에피토프 F3), ARPACVDARIIKTKQWCDML(SEQ ID NO: 8, 에피토프 F4), CDMLPCLEGEGCDLLINRSG(SEQ ID NO: 9, 에피토프 F5), 또는 NRSGWTCTQPGGRIKTTTVS(SEQ ID NO: 10, 에피토프 F6), 또는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10, 또는 이들의 임의의 조합의 아미노산 서열 내에 위치된 단편으로부터 선택된다. SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 내에 위치된 단편은 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10 중 어느 것의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산을 가진 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 추가의 FAM19A5 에피토프는 SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 아미노산 서열 내에 위치된 단편, 예를 들어 SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산을 가진 단편, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 하나 이상의 추가의 에피토프에 자생 입체형태(즉, 비변성) 상태로 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 하나 이상의 추가의 FAM19A5 에피토프의 글리코실화 및 비글리코실화 형태에 모두 결합한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 EP2, EP4, 및/또는 EP8로서 확인된 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하며, EP2는 아미노산 DSSQP(SEQ ID NO: 66)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되고, EP4는 아미노산 ARCACRK(SEQ ID NO: 68)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되고, EP8은 아미노산 TCTQPGGR(SEQ ID NO: 72)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 에피토프는 EP2, EP4, 또는 EP8과 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 단지 EP2에만 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 EP4와 EP8에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 65[[EP1 - IVTLD]], SEQ ID NO: 67[[EP3 - RTIAR]], SEQ ID NO: 69[[EP5 - ARPA]], SEQ ID NO: 70[[EP6 - KTKQ WCDML]], 및 SEQ ID NO: 71[[EP7 - GCDLLINR]], 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 FAM19A5 에피토프에 결합한다.
특정 구체예에서, 예를 들어 면역분석(예를 들어, ELISA), 표면 플라즈몬 공명, 또는 역학적 배제 분석에 의해 측정되었을 때, FAM19A 패밀리의 다른 단백질보다 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 더 높은 친화성으로 FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)와 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 본 발명에서 제공된다. 특정 구체예에서, 예를 들어 면역분석에 의해 측정되었을 때, FAM19A 패밀리의 다른 단백질과 교차 반응성 없이 FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 본 발명에서 제공된다.
특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 자생 항체가 아니거나 또는 자연 발생 항체가 아니다. 예를 들어, 항-FAM19A5 항체는 더 많은, 더 적은, 또는 상이한 타입의 번역 후 변형을 가짐으로써, 자연 발생인 항체의 것과는 상이한 번역 후 변형을 가진다.
III. 예시적인 항- FAM19A5 항체
본 발명에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 특정한 항체는 실시예 1에서 분리된 항체 2-13, 3-2, 1-65, 및 1-28의 CDR 및/또는 가변 영역을 가진 항체, 예를 들어 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 이들의 가변 영역 또는 CDR 서열과 적어도 80% 동일성(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성)을 가진 항체이다. 2-13, 3-2, 1-65, 및 1- 28의 VH 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 35 내지 38에 제시된다. 2-13, 3-2, 1-65, 및 1- 28의 VL 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 39 내지 42에 제시된다.
따라서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분이 본 발명에서 제공되며, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35, 36 또는 38의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 35, 36, 또는 38로 구성되는 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다.
또한, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분이 제공되며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 39, 40, 또는 42의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 39, 40, 또는 42로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다.
특정 구체예에서, 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 35, 36, 또는 38로 구성되는 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역의 CDR 및 SEQ ID NO: 39, 40, 또는 42로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다.
또한, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분이 제공되며, (i) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 포함하고; (ii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하고; 또는 (iii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함한다.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분이 본 발명에서 제공되며, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35, 36, 또는 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분이 본 발명에서 제공되며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 39, 40, 또는 42에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원 결합 부분이 제공되며, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 35, 36, 또는 38로 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 39, 40, 또는 42로 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 분리된 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분을 제공하며, 이것은
(a) SEQ ID NOs: 35 및 39를 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(b) SEQ ID NOs: 36 및 40을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; 또는
(c) SEQ ID NOs: 38 및 42을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열
을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 (i) 2-13의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 2-13의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (ii) 3-2의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 3-2의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 (iii) 1-28의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 1-28의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
2-13에 대한 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 11, 12, 및 13에 제시된다. 2-13에 대한 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 23, 24, 및 25에 제시된다. 3-2에 대한 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 14, 15, 및 16에 제시된다. 3-2에 대한 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 26, 27, 및 28에 제시된다. 1-28에 대한 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 20, 21, 및 22에 제시된다. 1-28에 대한 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 32, 33, 및 34에 제시된다. 1-65에 대한 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 17, 18, 및 19에 제시된다. 1-65에 대한 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 29, 30, 및 31에 제시된다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
(d) SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
(d) SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(b) SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 사람 FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
(d) SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개를 포함한다.
본 발명에서 설명된 VH 도메인, 또는 그것의 하나 이상의 CDR은 중쇄, 예를 들어 전장 중쇄를 형성하기 위해 불변 도메인에 연결될 수 있다. 유사하게, 본 발명에서 설명된 VL 도메인, 또는 그것의 하나 이상의 CDR은 경쇄, 예를 들어 전장 경쇄를 형성하기 위해 불변 도메인에 연결될 수 있다. 전장 중쇄와 전장 경쇄는 조합되어 전장 항체를 형성할 수 있다.
따라서, 특정 구체예에서, 항체 경쇄 및 중쇄, 예를 들어 분리된 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체가 본 발명에서 제공된다. 경쇄와 관련하여, 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체의 경쇄는 카파 경쇄이다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체의 경쇄는 람다 경쇄이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체의 경쇄는 사람 카파 경쇄 또는 사람 람다 경쇄이다. 특정 구체예에서, FAM19A5 폴리펩타이드(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 발명에서 설명된 항체는 본 발명에 설명된 임의의 VL 또는 VL CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 경쇄의 불변 영역은 사람 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, FAM19A5 폴리펩타이드(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 발명에서 설명된 항체는 본 발명에 설명된 VL 또는 VL CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 경쇄의 불변 영역은 사람 람다 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 사람 불변 영역 서열의 비제한적 예들은 본 분야에서 설명되었고, 예를 들어 미국특허 No. 5,693,780 및 Kabat E.A. et al., (1991)(상동)을 참조한다.
중쇄와 관련하여, 일부 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체의 중쇄는 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 또는 뮤(μ) 중쇄일 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체의 중쇄는 사람 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 또는 뮤(μ) 중쇄를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 발명에서 설명된 항체는 본 발명에 설명된 VH 또는 VH CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 중쇄의 불변 영역은 사람 감마(γ) 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 발명에서 설명된 항체는 본 발명에 개시된 VH 또는 VH CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 중쇄의 불변 영역은 본 발명에서 설명되거나 본 분야에 공지된 사람 중쇄의 아미노산 서열을 포함한다. 사람 불변 영역 서열의 비제한적 예들은 본 분야에 설명되었고, 예를 들어 미국특허 No. 5,693,780 및 Kabat E.A. et al., (1991)(상동)을 참조한다.
일부 구체예에서, FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 발명에서 설명된 항체는 본 발명에 설명된 VH 또는 VH CDR 및 VL 또는 VL CDR을 포함하는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며, 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자, 또는 사람 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 발명에서 설명된 항체는 본 발명에 설명된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며, 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 임의의 아형(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 아형(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 및 알로타입(예를 들어, G1m, G2m, G3m 및 nG4m) 및 이들의 변이체를 포함하는, 자연-발생인, 사람 IgG의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개) 및 Jefferis R. and Lefranc M.P., mAbs 1:4, 1-7 (2009)를 참조한다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 또는 이들의 변이체의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 Fc 이펙터 기능, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(CDC) 및/또는 항체-의존성 세포 포식작용(ADCP)을 갖지 않는다. 이펙터 기능은 Fc 영역에 의해 매개되며, Fc 영역의 CH2 도메인에서 힌지 영역에 가장 가까이 있는 잔기가 항체의 이펙터 기능을 담당하고, 그것은 선천 면역 시스템의 이펙터 세포 상에서 C1q(보체) 및 IgG-Fc 수용체(FcγR)에 대해 상당히 중첩된 결합 부위를 함유한다. 또한, IgG2 및 IgG4 항체는 IgG1 및 IgG3 항체보다 더 낮은 수준의 Fc 이펙터 기능을 가진다. 항체의 이펙터 기능은 다음과 같은 본 분야에 공지된 상이한 접근법들에 의해 감소되거나 회피될 수 있다: (1) Fc 영역을 결여한 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, 단쇄 Fv(scFv), 또는 모노머 VH 또는 VL 도메인으로 구성된 sdAb)의 사용; (2) 예를 들어 당이 부착된 잔기의 결실 또는 변경, 효소적으로 당의 제거, 글리코실화 저해제의 존재하에 배양된 세포에서 항체의 생성, 또는 단백질을 글리코실화할 수 없는 세포(예를 들어, 박테리아 숙주 세포, 미국특허 공개 No. 20120100140 참조)에서 항체의 발현에 의해 생성될 수 있는, 무글리코실화 항체의 생성; (3) 이펙터 기능이 감소된 IgG 아형으로부터 Fc 영역(예를 들어, IgG2 또는 IgG4 항체로부터의 Fc 영역 또는 IgG2 또는 IgG4 항체로부터의 CH2 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역)의 이용(예를 들어 미국특허 공개 No 20120100140 및 Lau C. et al., J. Immunol. 191:4769-4777 (2013) 참조); 및 (4) Fe 기능이 감소되거나 없는 상태를 가져오는 돌연변이를 가진 Fc 영역의 생성(예를 들어, 미국특허 공개 No. 20120100140 및 거기 인용된 미국출원 및 PCT 출원과 An et al., mAbs 1:6, 572-579 (2009) 참조).
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv(scFv), 또는 모노머 VH 또는 VL 도메인으로 구성된 sdAb이다. 이러한 항체 단편은 본 분야에 잘 공지되어 있으며 상기 설명된다.
일부 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 Fc 이펙터 기능이 감소되거나 없는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 사람 IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 IgG2/IgG4 이소타입의 것이다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 IgG4 이소타입의 IgG 항체로부터 CH2 도메인과 IgG1 이소타입의 IgG 항체로부터 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역, 또는 IgG2로부터 힌지 영역과 IgG4로부터 CH2 영역을 포함하는 키메라 Fc 영역, 또는 Fc 기능이 감소되거나 없는 돌연변이를 가진 Fc 영역을 포함한다. Fc 이펙터 기능이 감소되거나 없는 Fc 영역은 본 분야에 공지된 것들을 포함한다. 예를 들어, Lau C. et al., J. Immunol. 191:4769-4777 (2013); An et al., mAbs 1:6, 572-579 (2009); 및 미국특허 공개 No. 20120100140 및 거기 인용된 미국특허와 특허공개 및 PCT 공개를 참조한다. 또한, Fc 이펙터 기능이 감소되거나 없는 Fc 영역은 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
IV. 핵산 분자
본 발명에서 설명된 다른 양태는 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분 중 어느 하나를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전체 세포에, 세포 용해물에, 또는 부분적으로 정제된 형태나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 제한 효소, 아가로오스 겔 전기영동 및 본 분야에 잘 공지된 다른 기술들을 포함하는 표준 기술에 의해, 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산(예를 들어, 다른 염색체 DNA, 예를 들어 자연에서 분리된 DNA에 연결된 염색체 DNA) 또는 단백질로부터 정제되었을 때, "분리되거나" 또는 "실질적으로 순수하다"(F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York 참조). 본 발명에 설명된 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명에 설명된 핵산은 표준 분자생물학 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 아래 더 상세히 설명된 대로 사람 면역글로불린 유전자를 지닌 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 이 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 획득될 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리(예를 들어, 파지 전시 기술을 사용한)로부터 얻어진 항체의 경우, 이 항체를 암호화하는 핵산이 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본 발명에서 설명된 특정 핵산 분자는 2-13, 3-2, 1-65, 및 1-28 모노클로날 항체의 VH 및 VL 서열을 암호화하는 것들이다. 2-13, 3-2, 1-65, 및 1-28의 VH 서열을 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO: 43, 44, 45 및 46에 제시된다. 2-13, 3-2, 1-65, 및 1-28의 VL 서열을 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO: 47, 48, 49 및 50에 제시된다.
본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체의 제조 방법은 신호 펩타이드와 함께 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 각각 SEQ ID NO: 43 및 47, SEQ ID NO: 44 및 48, SEQ ID NO: 46 및 50을 포함하는 셀라인에서 중쇄 및 경쇄를 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포가 본 발명에 포함된다.
VH 및 VL 세그먼트를 암호화하는 DNA 단편이 얻어진 후, 이들 DNA 단편은, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환하기 위해, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 더 조작될 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 가요성 링커와 같은 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 이와 관련하여 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame)을 유지하도록 2개의 DNA 단편이 이어지는 것을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(힌지, CH1, CH2 및/또는 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 사람 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 본 분야에 공지되어 있으며(예를 들어, Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편이 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역, 예를 들어 IgG2 및/또는 IgG 4 불변 영역일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자로 전환될 수 있다. 사람 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 본 분야에 공지되어 있으며(예를 들어, Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편이 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편이 가요성 링커를 암호화하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 암호화하는 다른 단편에 작동 가능하게 연결되며, 이로써 VL과 VH 영역이 가요성 링커에 의해 이어진 상태로 VH 및 VL 서열이 연속 단쇄 단백질로서 발현될 수 있다(예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554 참조).
일부 구체예에서, 본 발명은 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 다른 구체예에서, 벡터는 유전자 요법에 사용될 수 있다.
본 발명에서 적합한 벡터는 발현 벡터, 바이러스 벡터, 및 플라스미드 벡터를 포함한다. 한 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
본 발명에서 사용된 대로, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포에 도입되었을 때, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수 요소, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우, 복제 및 번역을 위한 필수 요소를 함유하는 임의의 핵산 구성물을 말한다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스, 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 본 발명에 개시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분에 대한 코딩 서열은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서 사용된 대로, 두 핵산 서열은 이들이 각 성분 핵산 서열이 그것의 기능성을 보유하도록 허용하는 방식으로 공유 연결되었을 때 작동 가능하게 연결된 것이다. 코딩 서열 및 유전자 발현 제어 서열은, 코팅 서열의 발현 또는 전사 및/또는 번역이 유전자 발현 제어 서열의 영향 또는 제어하에 있는 방식으로 이들이 공유 연결되었을 때 작동 가능하게 연결되었다고 말한다. 두 DNA 서열은, 5' 유전자 발현 서열에서 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 가져오고, 두 DNA 서열의 연결의 성격이 (1) 프레임-시프트 돌연변이의 도입을 가져오거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하거나, 또는 (3) 단백질로 번역되는 상응하는 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는다면, 작동 가능하게 연결되었다고 말한다. 따라서, 유전자 발현 서열은 이 유전자 발현 서열이 코딩 핵산 서열의 전사를 행할 수 있었다면 코딩 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 것이며, 이로써 얻어진 전사체는 원하는 항체 또는 그것의 항원-결합 부분으로 번역된다.
바이러스 벡터는, 제한은 아니지만, 레트로바이러스, 예컨대 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스, Harvey 뮤린 육종 바이러스, 뮤린 유방 종양 바이러스, 및 Rous 육종 바이러스; 렌티바이러스; 아데노바이러스; 아데노-관련 바이러스; SV40-타입 바이러스; 폴리오마바이러스; 엡스타인-바 바이러스; 유두종 바이러스; 헤르페스 바이러스; 우두 바이러스; 폴리오 바이러스; 및 RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스로부터의 핵산 서열을 포함한다. 본 분야에 잘 공지된 다른 벡터들도 쉽게 이용할 수 있다. 특정 바이러스 벡터는 비-필수 유전자가 관심의 유전자로 치환된 비-세포변성(non-cytopathic) 진핵생물 바이러스에 기초한다. 비-세포변성 바이러스는 레트로바이러스를 포함하며, 이것의 생애 주기는 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역 전사와 후속하여 숙주 세포 DNA에 프로바이러스 통합을 수반한다. 레트로바이러스는 사람 유전자 요법 시험을 위해 승인되었다. 복제-결함(즉, 원하는 단백질의 합성을 지시할 수 있지만 감염성 입자는 제조할 수 없슴)이 있는 레트로바이러스가 가장 유용하다. 이러한 유전자 변경된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내 유전자의 고 효능 형질도입에서 일반적인 유용성을 가진다. 복제-결함 레트로바이러스를 생성하는 표준 프로토콜(플라스미드에 외래 유전자 물질의 통합, 플라스미드로 패키징 셀라인의 트랜스펙션, 패키징 셀라인에 의한 재조합 레트로바이러스의 생성, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자의 수집, 및 바이러스 입자로 표적 세포의 감염 단계)은 Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual(W.H. Freeman Co., New York (1990)) 및 Murry, E.J., Methods in Molecular Biology(Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991))에 제공된다.
한 구체예에서, 바이러스는 이중-가닥 DNA 바이러스인 아데노-관련 바이러스이다. 아데노-관련 바이러스는 복제 결함이 되도록 조작될 수 있고, 광범위한 세포 타입 및 종을 감염시킬 수 있다. 또한, 아데노-관련 바이러스는 열 및 지질 용매 안정성, 조혈 세포를 포함하는 다양한 계통의 세포에서 높은 형질도입 빈도, 및 균교대증 저해의 결여와 같은 이점을 가지며, 이로써 많은 일련의 형질도입을 허용한다. 보고된 바에 따르면, 아데노-관련 바이러스는 부위-특정 방식으로 사람 세포 DNA에 통합될 수 있으며, 이로써 삽입 돌연변이유발의 확률 및 레트로바이러스 감염의 삽입된 유전자 발현 특징의 변동성을 최소화한다. 또한, 야생형 아데노-관련 바이러스 감염이 선택압의 부재하에 100 계대 이상 동안 조직 배양물에서 추적되었으며, 이는 아데노-관련 바이러스 게놈 통합이 상대적으로 안정한 이벤트임을 시사한다. 또한, 아데노-관련 바이러스는 염색체외 방식으로 기능할 수 있다.
다른 구체예에서, 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스의 벡터이다.
렌티바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 전형적으로 레트로바이러스에서 발견되는 3개의 유전자 gag, pol 및 env를 가지며, 이들의 측면에는 2개의 긴 말단 반복부(LTR) 서열이 있다. gag 유전자는 내부 구조(바탕질, 캡시드 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 암호화하고, pol 유전자는 RNA-지정 DNA 중합효소(역 전사효소), 프로테아제 및 인테그라아제를 암호화하고, env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 암호화한다. 5' 및 3' LTR은 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진하는 작용을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 다른 시스-작용 서열을 모두 함유한다. 렌티바이러스는 vif, vpr, tat, rev, vpu, nef 및 vpx(HIV-1, HIV-2 및/또는 SIV에서)를 포함하는 추가의 유전자를 가진다.
5' LTR에 인접해서 게놈의 역 전사에 필요한 서열(tRNA 프라이머 결합 부위)이 있으며, Psi 부위는 입자에 바이러스 RNA의 언캡시데이션에 효과적이다. 언캡시데이션(또는 감염성 비리온에 레트로바이러스 RNA의 패키징)에 필수적인 서열이 바이러스 게놈에서 빠질 경우, 이 시스 결함은 게놈 DNA의 언캡시데이션을 방지한다.
그러나, 얻어진 돌연변이는 모든 비리온 단백질의 합성을 여전히 지시할 수 있다. 본 발명은 패키징 기능을 지닌 둘 이상의 벡터, 즉 gag, pol 및 env, 뿐만 아니라 rev 및 tat로 적합한 숙주 세포를 트랜스펙션하는 것을 포함하는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스의 생성 방법을 제공한다. 아래 개시된 것과 같이, 기능적 tat 유전자를 결여한 벡터는 특정 용도에 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 제1 벡터는 바이러스 gag와 바이러스 pol을 암호화하는 핵산을 제공할 수 있고, 다른 벡터는 바이러스 env를 암호화하는 핵산을 제공할 수 있으며, 이로써 패키징 세포가 생성된다. 패키징 세포에, 이식 벡터로서 확인된, 이종성 유전자를 제공하는 벡터를 도입하는 것은 관심의 외래 유전자를 지닌 감염성 바이러스 입자를 방출하는 프로듀서 세포를 제공한다.
벡터 및 외래 유전자의 상기 나타낸 구성형태에 따라서, 제2 벡터는 바이러스 외피(env) 유전자를 암호화하는 핵산을 제공할 수 있다. env 유전자는 레트로바이러스를 포함하는, 거의 모든 적합한 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, env 단백질은 사람 및 다른 종의 세포의 형질도입을 허용하는 양쪽성 외피 단백질이다.
레트로바이러스-유래 env 유전자의 예들은, 제한은 아니지만, Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(MoMuLV 또는 MMLV), Harvey 뮤린 육종바이러스(HaMuSV 또는 HSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV 또는 MMTV), 기본(gibbon) 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV 또는 GALV), 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 및 Rous 육종 바이러스(RSV)를 포함한다. 다른 env 유전자들, 예컨대 수포성 구내염 바이러스(VSV) 단백질 G(VSV G), 간염 바이러스 및 인플루엔자의 것도 사용될 수 있다.
바이러스 env 핵산 서열을 제공하는 벡터는 본 명세서의 다른 곳에 설명된 조절 서열과 작동 가능하게 회합된다.
특정 구체예에서, 벡터는 비-분열 세포를 형질도입하는 벡터의 능력을 손상시키지 않고 HIV 병독성 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실된 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
일부 구체예에서, 벡터는 3' LTR의 U3 영역의 결실을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. U3 영역의 결실은 완전 결실 또는 부분 결실일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 설명된 FVIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 세포에서 (a) gag, pol, 또는 gag 및 pol 유전자를 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 이종성 env 유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열로 트랜스펙션될 수 있으며, 렌티바이러스 벡터는 기능적 tat 유전자를 결여한다. 다른 구체예에서, 세포는 rev 유전자를 포함하는 제4 뉴클레오타이드 서열로 더 트랜스펙션된다. 특정 구체예에서, 렌티바이러스 벡터는 vif, vpr, vpu, vpx 및 nef, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 기능적 유전자를 결여한다.
특정 구체예에서, 렌티바이러스 벡터는 gag 단백질, Rev-반응 요소, 중심 폴리퓨린 트랙(cPPT), 또는 이들의 임의의 조합을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
렌티바이러스 벡터의 예들은 WO9931251, W09712622, W09817815, W09817816, 및 WO9818934에 개시되며, 이들은 그 전체가 본 발명에 참고로 포함된다.
다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 본 분야에 폭넓게 설명되었으며 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989를 참조한다. 플라스미드 벡터는 숙주 게놈 내에서 복제할 수 없고 통합될 수 없기 때문에 생체내에서 세포에 유전자를 송달하는데 특히 유익한 것으로 판명되었다. 그러나, 숙주 세포와 양립하는 프로모터를 가진 이들 플라스미드는 플라스미드 내에서 작동 가능하게 암호화된 유전자로부터 펩타이드를 발현할 수 있다. 상업적 공급자로부터 이용할 수 있는 일부 통상 사용되는 플라스미드는 pBR322, pUC18, pUC19, 다양한 pcDNA 플라스미드, pRC/CMV, 다양한 pCMV 플라스미드, pSV40, 및 pBlueScript를 포함한다. 특정한 플라스미드의 추가의 예들은 pcDNA3.1, 카탈록 번호 V79020; pcDNA3.1/hygro, 카탈록 번호 V87020; pcDNA4/myc-His, 카탈록 번호 V86320; 및 pBudCE4.1, 카탈록 번호 V53220를 포함하며, 이들 모두는 Invitrogen(Carlsbad, CA.)의 제품이다. 다른 플라스미드들도 당업자에게 잘 공지되어 있다. 추가로, 플라스미드는 DNA의 특정 단편을 제거 및/또는 부가하기 위해 표준 분자생물학 기술을 사용하여 주문 설계될 수 있다.
V. 항체 생성
FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 단편은 항체의 합성을 위한 본 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현 기술에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에서 설명된 방법은, 달리 나타내지 않는다면, 분자생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 변형, 핵산 혼성화, 및 본 분야의 기술 범위 내의 관련 분야의 종래의 기술들을 이용한다. 이들 기술은 인용된 참고자료들에 기술되며 문헌에 충분히 설명된다. 예를 들어, Maniatis T. et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J. et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J. et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B. et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체는, 예를 들어 합성, DNA 서열의 유전자 조작을 통한 생성을 수반하는 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체(예를 들어, 재조합 항체)이다. 특정 구체예에서, 이러한 항체는 생체내 동물 또는 포유류(예를 들어, 사람)의 항체 점라인 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열(예를 들어, DNA 서열 또는 아미노산 서열)을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명에서 설명된 세포 또는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 특정 양태에서, 본 발명에서 설명된 세포 또는 숙주 세포(예를 들어, 본 발명에서 설명된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 숙주 세포)를 사용하여 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 발현(예를 들어, 재조합 방식으로 발현)하는 단계를 포함하는 FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 특정 구체예에서, 세포는 분리된 세포이다. 특정 구체예에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드가 세포에 도입되었다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 세포 또는 숙주 세포로부터 획득된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 더 포함한다.
폴리클로날 항체를 생성하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel F.M. et al., eds., John Wiley and Sons, New York 참조).
모노클로날 항체는 하이브리도마의 사용, 재조합, 및 파지 전시 기술, 또는 이들의 조합을 포함하는 본 분야에 공지된 폭넓은 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 본 분야에 공지된 것들을 포함하는 하이브리도마 기술을 사용하여 생성될 수 있으며, 이들은, 예를 들어 Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling G.J. et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681(Elsevier, N.Y., 1981)에 교시된다. 본 발명에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해서 생성된 항체에 제한되지 않는다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 단편, 예를 들어 이러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 외인성 발현하는 숙주 세포로부터 재조합 방식으로 생성될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에서 사용된 "모노클로날 항체"는 단일 세포(예를 들어, 재조합 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 숙주 세포)에 의해 생성된 항체이며, 상기 항체는, 예를 들어 ELISA 또는 본 분야에 공지된 다른 항원-결합 또는 경쟁 결합 분석에 의해서 또는 본 발명에서 제공된 실시예에서 결정된 대로, FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 모노클로날 항체는 키메라 항체 또는 사람화 항체일 수 있다. 특정 구체예에서, 모노클로날 항체는 1가 항체 또는 다가(예를 들어, 2가) 항체이다. 특정 구체예에서, 모노클로날 항체는 단일특이적 또는 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)이다. 본 발명에서 설명된 모노클로날 항체는, 예를 들어 Kohler G & Milstein C. (1975) Nature 256: 495에 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 예를 들어 본 발명에서 설명된 기술을 사용하여 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 클로날 셀라인 및 그에 의해 발현된 모노클로날 항체의 제조를 위한 다른 방법들도 본 분야에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel F.M. et al., 상동, 참조).
하이브리도마 기술을 사용하여 특정 항체를 생성하고 스크리닝하는 방법은 통상적이며 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 양, 염소, 토끼, 래트, 햄스터 또는 마카크 원숭이가 면역화되고, 이로써 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 도출하며, 상기 항체는 면역화에 사용된 단백질(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합할 것이다. 또는, 림프구가 시험관내 면역화될 수 있다. 다음에, 림프구는 폴리에틸렌글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합되며, 이로써 하이브리도마 세포가 형성된다(Goding J.W. (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986) 참조). 추가로, RFMMS(반복 면역화 다중 부위) 기술이 동물의 면역화에 사용될 수 있다(Kilpatrick K.E. et al., (1997) Hybridoma 16:381-9, 전체가 참고로 포함).
일부 구체예에서, 마우스(또는 다른 동물들, 예컨대 닭, 래트, 원숭이, 당나귀, 돼지, 양, 햄스터 또는 개)가 항원(예를 들어, FAM19A5, 예컨대 사람 FAM19A5)으로 면역화될 수 있고, 일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들어 항원에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되면, 마우스 비장이 수거되고 비장세포가 분리된다. 다음에, 비장세포가 잘-공지된 기술에 의해 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들어 American Type Culture Collection (ATCC)(Manassas, 버지니아)로부터 이용가능한 셀라인 SP20으로부터의 세포와 융합되어 하이브리도마가 형성된다. 하이브리도마는 제한된 희석에 의해 선택되고 클로닝된다. 특정 구체예에서, 면역화된 마우스의 림프절이 수거되고 NSO 골수종 세포와 융합된다.
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는, 바람직하게 미융합, 모 골수종 세포의 성장이나 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 파종되고 성장된다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(HGPRT 또는 FIPRT)를 결여한다면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘(HAT 배지)를 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
특정 구체예는 효과적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정적인 높은 수준의 생성을 지원하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포를 이용한다. 이런 골수종 셀라인은 특히 뮤린 골수종 셀라인, 예컨대 NSO 셀라인 또는 Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, 미국 캘리포니아)로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것들 및 American Type Culture Collection(Rockville, 미국 메릴랜드)로부터 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8.653 세포이다. 사람 골수종 및 마우스-사람 이종골수종 셀라인도 사람 모노클로날 항체의 생성을 위해 제시되었다(Kozbor D. (1984) J Immunol 133:3001-5; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) 참조).
하이브리도마 세포가 성장한 배양 배지는 FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 대해 지정된 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 본 분야에 공지된 방법, 예를 들어 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예컨대 방사성면역분석(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결정된다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활동성을 가진 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 제한 희석 과정에 의해 클론이 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding J.W. (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 상동, 참조). 이 과정을 위한 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI 1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지, 복수 유체, 또는 혈청으로부터 적절히 분리된다.
본 발명에서 설명된 항체는 특정한 FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)를 인식하며 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 생성될 수 있는 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 설명된 Fab 및 F(ab')2 단편은, 파파인(Fab 단편 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생성)과 같은 효소를 사용하여, 면역글로불린 분자의 단백질 가수분해 절단에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 항체 분자의 2개의 동일한 팔 중 하나에 해당하며, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이룬 완전한 경쇄를 함유한다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 이황화물 결합에 의해 연결된 항체 분자의 2개의 항원-결합 팔을 함유한다.
더 나아가, 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 또한 본 분야에 공지된 다양한 파지 전시 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 전시 방법에서, 기능적 항체 도메인이 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지닌 파지 입자의 표면에 전시된다. 특히, VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열이 동물의 cDNA 라이브러리(예를 들어, 침범된 조직의 뮤린 또는 닭 cDNA 라이브러리와 같은 사람 또는 비-사람 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합되고 파지미드 벡터에 클로닝된다. 이 벡터가 이콜리에 전기천공되고, 이콜리가 헬퍼 파지로 감염된다. 상기 방법에 사용된 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함하는 사상 파지이며, VH 및 VL 도메인은 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 중 어느 하나에 재조합 방식으로 융합된다. 특정 항원에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현하는 파지가, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면이나 비드에 결합되거나 포착된 항원을 사용하여 항원과 함께 선택되거나 확인될 수 있다. 본 발명에서 설명된 항체의 제조에 사용될 수 있는 파지 전시 방법의 예들은 Brinkman U. et al., (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames R.S. et al., (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough C.A. et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic L. et al., (1997) Gene 187:9-18; Burton D.R. & Barbas C.F. (1994) Advan. Immunol. 57: 191-280; PCT 출원 No. PCT/GB91/001134; 국제공개 Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, 및 WO 97/13844; 및 미국특허 Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 및 5,969,108에 설명된 것들을 포함한다.
상기 참고자료들에 설명된 대로, 파지 선택 후, 파지로부터 항체 코딩 영역이 분리되고, 이것을 사용하여 사람 항체, 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체가 생성되며, 예를 들어 아래 설명된 대로 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현된다. 또한, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편을 재조합 방식으로 제조하는 기술이 PCT 공개 No. WO 92/22324; Mullinax R.L. et al., (1992) Bio-Techniques 12(6): 864-9; Sawai H. et al., (1995) Am. J. Reprod. Immunol. 34: 26-34; 및 Better M. et al., (1988) Science 240: 1041-1043에 설명된 것들과 같은 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 이용될 수 있다.
한 양태에서, 전체 항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오타이드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하기 위한 측면 서열을 포함하는 PCR 프라이머가 주형, 예를 들어 scFv 클론으로부터 VH 또는 VL 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인이 VH 불변 영역을 발현하는 벡터에 클로닝될 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인은 VL 불변 영역, 예를 들어 사람 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터에 클로닝될 수 있다. 또한, VH 및 VL 도메인이 필요한 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터에 클로닝될 수도 있다. 다음에, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 중쇄 보존 벡터와 경쇄 보존 벡터가 셀라인에 함께 형질도입되고, 이로써 전장 항체, 예를 들어 IgG를 발현하는 안정한 또는 일시적 셀라인이 생성된다.
키메라 항체는 항체의 상이한 부분들이 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래된 분자이다. 예를 들어, 키메라 항체는 사람 항체의 불변 영역에 융합된 비-사람 동물(예를 들어, 마우스, 래트 또는 닭) 모노클로날 항체의 가변 영역을 함유할 수 있다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Morrison S.L. (1985) Science 229: 1202-7; Oi V.T. & Morrison S.L. (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies S.D. et al., (1989) J. Immunol. Methods 125: 191-202; 및 미국특허 Nos. 5,807,715, 4,816,567, 4,816,397, 및 6,331,415 참조한다.
사람화 항체는 정해진 항원에 결합할 수 있으며, 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 실질적으로 가진 프레임워크 영역 및 비-사람 면역글로불린(예를 들어, 뮤린 또는 닭 면역글로불린)의 아미노산 서열을 실질적으로 가진 CDR을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 사람 면역글로불린의 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함한다. 이 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 사람화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA, 및 IgE를 포함하는 면역글로불린의 임의의 부류, 및 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 사람화 항체는 본 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있으며, 이들은 제한은 아니지만 CDR-그래프팅(유럽특허 No. EP 239400; 국제공개 No. WO 91/09967; 및 미국특허 Nos. 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089), 베니어링 또는 리서페이싱(유럽특허 Nos. EP 592106 및 EP 519596; Padlan E.A. (1991) Mol. Immunol. 28(4/5): 489-498; Studnicka G.M. et al., (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; 및 Roguska M.A. et al., (1994) PNAS 91: 969-973), 사슬 셔플링(미국특허 No. 5,565,332), 및 예를 들어 미국특허 No. 6,407,213, 미국특허 No. 5,766,886, 국제공개 No. WO 93/17105; Tan P. et al., (2002) J. Immunol. 169:1119-25; Caldas C. et al., (2000) Protein Eng. 13(5):353-60; Morea V. et al., (2000) Methods 20(3):267-79; Baca M. et al., (1997) J. Biol. Chem. 272(16):10678-84; Roguska M.A. et al., (1996) Protein Eng. 9(10):895-904; Couto J.R. et al., (1995) Cancer Res. 55(23 Supp):5973s-5977s; Couto J.R. et al., (1995) Cancer Res. 55(8):1717-22; Sandhu J.S. (1994) Gene 150(2):409-10 및 Pedersen J.T. et al., (1994) J. Mol. Biol. 235(3):959-73에 개시된 기술들을 포함한다. 또한, 미국출원 공개 No. US 2005/0042664 A1(2005년 2월 24일)을 참조하며, 이것은 그 전체가 본 발명에 참고로 포함된다.
다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)를 제조하는 방법이 설명되었다. 예를 들어, 미국특허 Nos. 7,951,917; 7,183,076; 8,227,577; 5,837,242; 5,989,830; 5,869,620; 6,132,992 및 8,586,713을 참조한다.
단일 도메인 항체, 예를 들어 경쇄를 결여한 항체는 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(Riechmann L. & Muyldermans S. (1999) J. Immunol. 231:25-38; Nuttall S.D. et al., (2000) Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3):253-263; Muyldermans S., (2001) J. Biotechnol. 74(4):277-302; 미국특허 No. 6,005,079; 및 국제공개 Nos. WO 94/04678, WO 94/25591 및 WO 01/44301 참조).
또한, FAM19A5 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 잘 공지된 기술을 사용하여 항원을 "의태하는" 항-이디오타입 항체를 생성하는데 이용될 수 있다(예를 들어, Greenspan N.S. & Bona C.A. (1989) FASEB J 7(5): 437-444; 및 Nissinoff A. (1991) J. Immunol. 147(8): 2429-2438 참조).
특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체와 동일한 FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)의 에피토프에 결합하는, 본 발명에서 설명된 항체는 사람 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 특정 구체예에서, FAM19A5에 대한 결합으로부터, 본 발명에서 설명된 항체(예를 들어, 2-13 및 3-2)를 경쟁적으로 차단하는(예를 들어, 용량-의존적 방식으로), 본 발명에서 설명된 항체는 사람 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다.
사람 항체는 본 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 기능적 내인성 면역글로불린은 발현할 수 없지만 사람 면역글로불린 유전자는 발현하는 트랜스제닉 마우스가 사용될 수 있다. 특히, 사람 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 유전자 복합체가 마우스 배아 줄기세포에 무작위로 또는 상동성 재조합에 의해 도입될 수 있다. 또는, 사람 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 사람 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 마우스 배아 줄기세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의해 사람 면역글로불린 유전자좌의 도입과 동시에 또는 별도로 비기능적으로 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형 결실은 내인성 항체 생성을 방지한다. 변형된 배아 줄기세포는 확장되고 배반포에 미소주사되며, 이로써 키메라 마우스가 생성된다. 다음에, 키메라 마우스는 사람 항체를 발현하는 동형 자손을 생성하도록 육성된다. 이 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원으로, 예를 들어 항원(예를 들어, FAM19A5) 전부 또는 일부로 정상 방식으로 면역화된다. 종래의 하이브리도마 기술을 사용하여 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체가 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 획득될 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 은닉된 사람 면역글로불린 트랜스젠은 B 세포 분화 동안 재배열을 이루고, 계속해서 유형 전환 및 체세포 돌연변이를 거친다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성하는 것이 가능하다. 사람 항체를 제조하는 상기 기술의 개략적인 내용은 Lonberg N. & Huszar D. (1995) Int. Rev. Immunol 13 :65-93을 참조한다. 사람 항체 및 사람 모노클로날 항체를 제조하는 기술 및 이러한 항체를 제조하기 위한 프로토콜의 상세한 고찰을 위해서는, 예를 들어 국제공개 Nos. WO 98/24893, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국특허 Nos. 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318 및 5,939,598을 참조한다. 사람 항체를 생성할 수 있는 마우스의 예는 XENOMOUSE™(Abgenix, Inc.; 미국특허 Nos. 6,075,181 및 6,150,184), HUAB-MOUSE™(Mederex, Inc./Gen Pharm; 미국특허 Nos. 5,545,806 및 5,569,825), TRANS CHROMO MOUSE™(Kirin) 및 KM MOUSE™(Medarex/Kirin)을 포함한다.
FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 사람 항체는 사람 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 상기 설명된 파지 전시 방법을 포함하는 본 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 미국특허 Nos. 4,444,887, 4,716,111 및 5,885,793; 국제공개 Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조한다.
일부 구체예에서, 사람 항체는 마우스-사람 하이브리도마를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스(EBV)로 형질전환된 사람 말초혈 림프구가 마우스 골수종 세포와 융합되어 사람 모노클로날 항체를 분비하는 마우스-사람 하이브리도마가 생성될 수 있고, 이들 마우스-사람 하이브리도마는 표적 항원(예를 들어, FAM19A5, 예컨대 사람 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 사람 모노클로날 항체를 분비하는 것들을 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이러한 방법은 본 분야에 공지되고 설명되었으며, 예를 들어 Shinmoto H. et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y. et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31를 참조한다.
VI. 항체 조작 방법
상기 논의된 대로, 본 발명에서 개시된 VH 및 VL 서열을 가진 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그것에 부착된 불변 영역(들)을 변형함으로써 새로운 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 설명된 다른 양태에서, 본 발명에 설명된 항-FAM19A5 항체, 예를 들어 2-13 및 3-2의 구조적 특징은 사람 FAM19A5에 대한 결합과 같은 본 발명에 설명된 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유한 구조적으로 관련된 항-FAM19A5 항체를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, 이 조작 방법의 출발 물질은 본 발명에서 제공된 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그것의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본 발명에서 제공된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상, 또는 그것의 하나 이상의 CDR 영역을 실제로 제조(즉, 단백질로서 발현)하는 것이 필요하지는 않다. 오히려, 상기 서열(들)에 함유된 정보가 원래 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성하기 위한 출발 물질로서 사용되며, 그 다음 "제2 세대" 서열(들)이 단백질로서 제조되고 발현된다.
따라서, 다음의 단계를 포함하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 제조하기 위한 방법이 본 발명에서 제공된다:
(a) (i) 표 2에 제시된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열 또는 표 4에 제시된 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 (ii) 표 3에 제시된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열 또는 표 5에 제시된 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 제공하는 단계;
(b) 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경함으로써 적어도 하나의 변경된 항체 또는 항원-결합 부분 서열을 생성하는 단계; 및
(c) 변경된 항체 또는 항원-결합 부분 서열을 단백질로서 발현하는 단계.
표준 분자 생물학 기술이 변경된 항체 또는 항원-결합 부분 서열을 제조하고 발현하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 변경된 항체 또는 항원-결합 부분 서열(들)에 의해 암호화된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체의 기능적 특성을 하나, 일부, 또는 전부 보유한 것이며, 이들 특성은 다음을 포함한다:
(1) 예를 들어 Biacore에 의해 측정되었을 때, 예를 들어 10nM 이하(예를 들어, 0.01nM 내지 10nM)의 KD로 가용성 사람 FAM19A5에 결합;
(2) 예를 들어 Biacore에 의해 측정되었을 때, 예를 들어 1nM 이하(예를 들어, 0.01nM 내지 1nM)의 KD로 막 결합 사람 FAM19A5에 결합;
(3) 예를 들어 ELISA에 의해 측정되었을 때, 예를 들어 1nM 이하(예를 들어, 0.01nM 내지 1nM)의 EC50으로 막 결합 사람 FAM19A5에 결합;
(4) 반응성 신경아교증의 개시의 감소, 반전, 지연, 및/또는 예방;
(5) 반응성 성상교세포의 과도한 증식의 억제;
(6) 뉴로칸 및 뉴런-글리알 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현의 감소;
(7) 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK의 발현의 증가;
(8) 뉴런의 생존의 촉진;
(9) 뉴런에서 GAP43의 발현의 증가;
(10) 축삭돌기의 재성장의 촉진; 및
(11) 2-13, 3-2, 또는 1-28과 사람 FAM19A5에 대한 결합에 대해 한 방향 또는 양 방향으로 경쟁.
변경된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 (1)에서 (11)에 제시된 기능적 특성을 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 전부를 나타낼 수 있다. 변경된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분의 기능적 특성은 본 분야에서 이용가능한 및/또는 실시예에 제시된 것들과 같은 본 발명에서 설명된 표준 분석(예를 들어, ELISA, FACS)을 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명에서 설명된 항체 조작 방법의 특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 돌연변이가 도입될 수 있고, 얻어진 변형된 항-FAM19A5 항체는 본 발명에 설명된 대로 결합 활성 및/또는 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 본 분야에 설명되었다. 예를 들어, Short에 의한 PCT 공개 WO 02/092780은 포화 돌연변이유발, 합성 리게이션 조립, 또는 이들의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 설명한다. 또는, Lazar et al.에 의한 PCT 공개 WO 03/074679는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 설명한다.
VII. 세포 및 벡터
특정 양태에서, FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 본 발명에서 설명된 항체(또는 그것의 항원 결합 단편)를 발현하는(예를 들어, 재조합 방식으로) 세포(예를 들어, 숙주 세포) 및 관련된 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터가 본 발명에서 제공된다. 숙주 세포, 예를 들어 포유류 세포에서 재조합 발현을 위한 항-FAM19A5 항체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 본 발명에서 제공된다. 또한, 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체(예를 들어, 사람 또는 사람화 항체)를 재조합 방식으로 발현하는 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본 발명에서 제공된다. 특정 양태에서, 숙주 세포로부터 이러한 항체를 발현하는 단계를 포함하는, 본 발명에서 설명된 항체의 제조 방법이 본 발명에서 제공된다.
FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 본 발명에서 설명된 항체(예를 들어, 전장 항체, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 본 발명에서 설명된 단쇄 항체)의 재조합 발현은 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 구성을 수반한다. 본 발명에서 설명된 항체 분자, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 그것의 단편(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 획득된 후, 항체의 제조를 위한 벡터가 본 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의한 단백질의 제조 방법이 본 발명에서 설명된다. 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄) 코딩 서열과 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터가 구성될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 또한, 프로모터에 작동 가능하게 결합된, 본 발명에서 설명된 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 또는 그것의 단편, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는, 예를 들어 항체 분자의 불변 영역(예를 들어, 국제공개 Nos. WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국특허 No. 5,122,464 참조)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 항체의 가변 도메인이 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄와 경쇄의 발현을 위해 이러한 벡터에 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 종래의 기술에 의해 세포(예를 들어, 숙주 세포)로 전달될 수 있고, 얻어진 세포는 종래의 기술에 의해 배양되어 본 발명에서 설명된 항체(예를 들어, 2-13, 3-2, 또는 1-28의 VH 및/또는 VL, 또는 VH 및/또는 VL CDR 중 하나 이상을 포함하는 항체) 또는 그것의 단편이 생성될 수 있다. 따라서, 숙주 세포에서 이러한 서열의 발현을 위한 프로모터에 작동 가능하게 결합된, 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 단편, 또는 그것의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그것의 단편, 또는 본 발명에서 설명된 단쇄 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 숙주 세포가 본 발명에서 제공된다. 특정 구체예에서, 이중-사슬 항체의 발현을 위해, 증쇄와 경쇄를 개별적으로 둘 다 암호화하는 벡터가 아래 상세히 설명된 대로 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 동시 발현될 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 본 발명에서 설명된 항체의 중쇄와 경쇄, 또는 그것의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 함유한다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 두 상이한 벡터를 함유하며, 제1 벡터는 본 발명에서 설명된 항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역, 또는 그것의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제2 벡터는 본 발명에서 설명된 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 그것의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 숙주 세포는 본 발명에서 설명된 항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역, 또는 그것의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터를 포함하고, 제2 숙주 세포는 본 발명에서 설명된 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 세포에 의해 발현된 중쇄/경쇄 가변 영역이 제2 세포의 경쇄/경쇄 가변 영역과 회합되어 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 형성한다. 특정 구체예에서, 이러한 제1 숙주 세포와 이러한 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포의 집단이 본 발명에서 제공된다.
특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체의 경쇄/경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터, 및 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체의 중쇄/중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터의 집단이 본 발명에서 제공된다.
다양한 숙주-발현 시스템이 본 발명에서 설명된 항체 분자를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심의 코딩 서열이 생성되고, 계속해서 정제될 수 있는 비히클을 말할 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질도입되었을 때 본 발명에서 설명된 항체 분자를 원위치 발현할 수 있는 세포를 말한다. 이들은, 제한은 아니지만, 미생물, 예컨대 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리아파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예를 들어, 이콜리 및 비섭틸리스); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로미세스 피키아); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스(예를 들어, 바쿨로바이러스) 발현 벡터로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 타바코 모자이크 바이러스, TMV) 발현 벡터로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템(예를 들어, 녹조류, 예컨대 클라미도모나스 레인하르디티); 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구성물을 은닉하고 있는 포유류 세포 시스템(예를 들어, COS(예를 들어, COS1 또는 COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NSO, PER.C6, VERO, CRL7030, HsS78Bst, HeLa, 및 NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, Rl.l, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 및 BMT10 세포)을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 발현하기 위한 세포는 CHO 세포, 예를 들어 CHO GS SYSTEM(Lonza)으로부터의 CHO 세포이다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체를 발현하기 위한 세포는 사람 세포, 예를 들어 사람 셀라인이다. 특정 구체예에서, 포유류 발현 벡터는 POPTIVEC™ 또는 pcDNA3.3이다. 특정 구체예에서, 에스체리키아 콜리와 같은 박테리아 세포, 또는 진핵생물 세포(예를 들어, 포유류 세포)가, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해, 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유류 세포는 사람 시토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이 된다(Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5; 및 Cockett MI et al., (1990) Biotechnology 8(7): 662-7 참조). 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체는 CHO 세포 또는 NSO 세포에 의해 생성된다. 특정 구체예에서, FAM19A5(예를 들어, 사람 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 본 발명에서 설명된 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성성 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서는 많은 발현 벡터가 발현될 항체 분자에 의도된 용도에 따라 유익하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자의 제약 조성물의 생성을 위해 다량의 항체가 생성되어야 할 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물을 높은 수준으로 발현하도록 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는, 제한은 아니지만, 이콜리 발현 벡터 pUR278(Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2:1791-1794)(항체 코딩 서열은 lac Z 코딩 영역과 인프레임 방식으로 벡터에 개별적으로 리게이션될 수 있고, 이로써 융합 단백질이 생성된다); pIN 벡터(Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509); 등을 포함한다. 예를 들어, pGEX 벡터가 글루타티온 5-트랜스페라아제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 바탕질 글루타티온 아가로오스 비드로의 흡착 및 결합 후 유리 글루타티온의 존재하에 용출시킴으로써 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되며, 이로써 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있다.
곤충 시스템에서는, 예를 들어 오토그라파 칼리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자의 발현을 위한 벡터로서 사용될 수 있다. 이 바이러스는 스포돕테라 푸루기페르다 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어, 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 놓일 수 있다.
포유류 숙주 세포에서는, 많은 바이러스-기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심의 항체 코딩 서열이 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터와 3-원 리더 서열에 리게이션될 수 있다. 다음에, 이 키메라 유전자가 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에의 삽입은 감염된 숙주에서 항체 분자를 발현할 수 있는 생육성 재조합 바이러스를 가져올 것이다(예를 들어, Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81(12): 3655-9 참조). 또한, 삽입된 항체 코딩 서열의 효과적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 필요할 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈과 인접 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 동일 위상에 있어야 하며, 이로써 전체 삽입체의 번역이 보장된다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 터미네이터 등을 포함시킴으로써 증진될 수 있다(예를 들어, Bitter G et al., (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 원하는 특정한 방식으로 유전자 생성물을 변형하고 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포들은 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특징적이며 특이적인 메커니즘을 가진다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위한 적절한 셀라인 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 일차 전사체의 적절한 가공, 글리코실화, 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포성 기구를 가진 진핵생물 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유류 숙주 세포는, 제한은 아니지만, CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, NSO(어떤 면역글로불린 사슬도 내인성 생성하지 않는 뮤린 골수종 셀라인), CRL7030, COS(예를 들어, COS 1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, Rl.1, B-W, L-M, BSC 1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체는 CHO 세포와 같은 포유류 세포에서 생성된다.
특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 푸코오스 함량이 감소되거나 푸코오스 함량을 갖지 않는다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 이들 항체는 푸코실화 능력이 결핍되거나 결여된 세포에서 발현될 수 있다. 특정 예에서, 1,6-푸코실트랜스페라아제의 대립형질들이 모두 녹아웃된 셀라인을 사용하여 푸코오스 함량이 감소된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분이 제조될 수 있다. POTELLIGENT® 시스템(Lonza)이 푸코오스 함량이 감소된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 제조하는데 사용될 수 있는 이러한 시스템의 한 예이다.
재조합 단백질의 고-수율 생성을 위해, 적합한 발현 세포가 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 안정하게 발현하는 셀라인이 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 제공된 세포는 경쇄/경쇄 가변 도메인과 중쇄/중쇄 가변 도메인을 발현하며, 이들은 회합하여 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 형성한다.
특정 양태에서, 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것 이외에, 숙주 세포가 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어되는 DNA, 및 선택성 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA/폴리뉴클레오타이드의 도입 후, 조작된 세포는 부화된 배지에서 1-2일 동안 성장될 수 있고, 선택성 배지로 옮겨진다. 재조합 플라스미드에서 선택성 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고 세포는 그것의 염색체에 플라스미드를 안정하게 통합할 수 있게 되며 성장하여 중심부를 형성하며, 이것은 차례로 셀라인에 클로닝되어 확장될 수 있다. 이 방법은 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 발현하는 셀라인을 조작하는데 유익하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 셀라인은 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 유용할 수 있다.
많은 시스템이 사용될 수 있으며, 이 시스템들은 제한은 아니지만 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler M et al., (1977) Cell 11(1): 223-32), 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스페라아제(Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라아제(Lowy I et al., (1980) Cell 22(3): 817-23) 유전자를 포함하며, 이들은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 이용될 수 있다. 또한, 항대사산물 내성이 다음의 유전자에 대한 선택의 근거로서 사용될 수 있다(Wigler M et al., (1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K et al., (1981) PNAS 78: 1527-31); gpt, 이것은 미코페놀산에 내성을 부여한다(Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6); neo, 이것은 아미노글리코시드 G-418에 내성을 부여한다(Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260:926-932; 및 Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Feigner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); 및 hygro, 이것은 하이그로마이신에 내성을 부여한다(Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-56). 재조합 DNA 기술 분야에 통상 공지된 방법이 원하는 재조합 클론을 선택하기 위해 일반적으로 적용되며, 이러한 방법은, 예를 들어 Ausubel FM et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 Chapters 12 and 13, Dracopoli NC et al., (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbere-Garapin F et al., (1981) J Mol Biol 150: 1-14에 설명되며, 이들은 그 전체가 참고로 본 발명에 포함된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(Bebbington CR & Hentschel CCG, DNA 클로닝에서 포유류 세포에서 클로닝된 유전자의 발현을 위한 유전자 증폭에 기초한 벡터의 사용, Vol. 3(Academic Press, New York, 1987) 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 관련되므로, 항체의 생성 또한 증가할 것이다(Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).
숙주 세포는 본 발명에서 설명된 둘 이상의 발현 벡터로 동시 형질도입될 수 있으며, 제1 벡터는 중쇄 유래 폴리펩타이드를 암호화하고, 제2 벡터는 경쇄 유래 폴리펩타이드를 암호화한다. 2개의 벡터는 동일한 선택성 마커를 함유할 수 있고, 이것은 중쇄와 경쇄 폴리펩타이드의 동일한 발현을 가능하게 한다. 숙주 세포는 둘 이상의 발현 벡터의 상이한 양으로 동시 형질도입될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 제1 발현 벡터와 제2 발현 벡터의 다음 중 하나의 비율로 형질도입될 수 있다: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 또는 1:50.
또는, 중쇄와 경쇄 폴리펩타이드를 둘 다 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 독성 무함유 중쇄의 과잉을 피하기 위해 중쇄 앞에 놓여야 한다(Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; 및 Kohler G (1980) PNAS 77: 2197-2199). 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열을 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 모노시스트로닉 또는 멀티시스트로닉일 수 있다. 모노시스트로닉 핵산 구성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 유전자/뉴클레오타이드 서열, 또는 2-5, 5-10 또는 10-20개 범위의 유전자/뉴클레오타이드 서열을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 바이시스트로닉 핵산 구성물은 다음의 순서로 프로모터, 제1 유전자(예를 들어, 본 발명에서 설명된 항체의 중쇄), 및 제2 유전자(예를 들어, 본 발명에서 설명된 항체의 경쇄)를 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터에서, 두 유전자의 전사는 프로모터에 의해 유래될 수 있고, 제1 유전자로부터의 mRNA의 번역은 cap-의존성 스캐닝 메커니즘에 의해 유래될 수 있으며, 제2 유전자로부터의 mRNA의 번역은 cap-독립적 메커니즘에 의해, 예를 들어 IRES에 의해 유래될 수 있다.
본 발명에서 설명된 항체 분자가 재조합 발현에 의해 생성되면, 그것은 면역글로불린 분자의 정제에 대해 본 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화성, 및 크기분류 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해성, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본 발명에서 설명된 항체는 정제를 용이하게 하기 위해 본 발명에서 설명되거나 아니면 본 분야에 공지된 이종성 폴리펩타이드 서열과 융합될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분이 분리되거나 정제된다. 일반적으로, 분리된 항체는 분리된 항체 이외의 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체를 실질적으로 갖지 않는 것이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체의 제조물은 세포성 물질 및/또는 화학적 전구체를 실질적으로 갖지 않는다. "세포성 물질을 실질적으로 갖지 않는"다는 말은 항체가 분리되거나 재조합 방식으로 생성된 세포의 세포성 성분으로부터 항체가 분리된 항체의 제조물을 포함한다는 것을 의미한다. 따라서, 세포성 물질을 실질적으로 갖지 않는 항체는 이종성 단백질(또한 본 발명에서 "오염 단백질"이라고도 한다) 및/또는 항체의 변이체, 예를 들어 항체의 상이한 번역 후 변형된 형태 또는 항체(또는 항체 결합 부분)의 다른 상이한 버전을 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%(건조 중량 기준)를 가진 항체의 제조물을 포함한다. 항체가 재조합 방식으로 생성되는 경우, 일반적으로 배양 배지를 실질적으로 갖지 않으며, 즉 배양 배지는 단백질 제조물의 부피의 약 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만이다. 항체가 화학적 합성에 의해 생성되는 경우, 일반적으로 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 갖지 않으며, 즉 단백질의 합성에 연루된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 항체의 이러한 제조물은 관심 항체 이외의 다른 화학적 전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%(건조 중량 기준) 미만을 가진다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체는 분리되거나 정제된다.
VIII. 분석
본 발명에서 설명된 항체는, 예를 들어 표준 ELISA에 의해 FAM19A5에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 간단히 말해서, 마이크로타이터 플레이트가 정제된 FAM19A5로 PBS 중의 1-2μg/mL의 양으로 코팅된 된 후, PBS 중의 5% 소 혈청 알부민으로 차단된다. 항체의 희석물(예를 들어, FAM19A5-면역화된 마우스의 혈장의 희석물)이 각 웰에 첨가되고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션된다. 플레이트가 PBS/Tween으로 세척된 후, 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)와 콘쥬게이트된 2차 시약(예를 들어, 사람 항체에 대한, 염소-항-사람 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약)과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션된다. 세척 후, 플레이트는 ABTS 기질(Moss Inc, 제품: ABTS-1000)으로 전개되고 OD 415-495에서 분광광도계에 의해 분석된다. 다음에, 면역화된 마우스로부터의 혈청이 사람 FAM19A5를 발현하는 셀라인에는 결합하지만 FAM19A5를 발현하지 않는 대조군 셀라인에는 결합하지 않는 것에 대해 유세포분석에 의해 더 스크리닝된다. 간단히 말해서, 1:20 희석물에서 FAM19A5 발현 CHO 세포를 항-FAM19A5 항체와 함께 인큐베이션함으로써 항-FAM19A5 항체의 결합이 평가된다. 세포가 세척되고, PE-표지된 항-사람 IgG Ab로 결합이 검출된다. 유세포분석은 FACS 유세포분석기(Becton Dickinson, San Jose, 캘리포니아)를 사용하여 수행된다. 바람직하게, 최고 역가가 발생한 마우스가 융합에 사용될 것이다.
상기 설명된 ELISA 분석은 항체를 스크리닝하는데 사용될 수 있으며, 따라서 FAM19A5 면역원과의 양성 반응성을 나타내는 항체를 생성하는 하이브리도마의 스크리닝에도 사용될 수 있다. 다음에, FAM19A5에, 바람직하게는 높은 친화성으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마가 서브클로닝되고 더 특성화될 수 있다. 다음에, 모 세포의 반응성을 보유한 1개의 클론이 세포 은행을 만들고 항체를 정제하기 위해 각 하이브리도마로부터 선택될 수 있다(ELISA에 의해).
항-FAM19A5 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마가 모노클로날 항체 정제를 위해 2-리터 스파이너-플라스크에서 성장될 수 있다. 상청액이 여과되고 농축된 후, 단백질 A-세파로스 친화성 크로마토그래피(Pharmacia, Piscataway, 뉴저지)가 수행될 수 있다. 순도를 보장하기 위해 용출된 IgG는 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 점검될 수 있다. 버퍼 용액이 PBS로 교환될 수 있고, 1.43의 흡광 계수를 사용하여 OD280에 의해 농도가 결정될 수 있다. 모노클로날 항체는 알리쿼트로 나뉘어 -80℃에서 보관될 수 있다.
선택된 항-FAM19A5 모노클로날 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각 항체는 상업적으로 이용가능한 시약(Pierce, Rockford, 일리노이)을 사용하여 바이오틴화될 수 있다. 바이오틴화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지된 프로브로 검출될 수 있다. 표지되지 않은 모노클로날 항체와 바이오틴화된 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구가 상기 설명된 대로 FAM19A5 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA가 특정 이소타입의 항체에 특이적인 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 사람 모노클로날 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 마이크로타이터 플레이트의 웰이 4℃에서 하룻밤 항-사람 면역글로불린 1μg/mL로 코팅될 수 있다. 1% BSA로 차단 후, 플레이트는 1μg/mL 미만의 테스트 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조군과 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 반응된다. 다음에, 웰은 사람 IgG1 또는 사람 IgM-특이적 알칼리성 포스파타아제-콘쥬게이트 프로브 중 어느 것과 반응될 수 있다. 플레이트는 상기 설명된 대로 전개되고 분석된다.
FAM19A5를 발현하는 살아 있는 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 시험하기 위해, 실시예에 설명된 대로 유세포분석이 사용될 수 있다. 간단히 말해서, (표준 성장 조건에서 성장된) 막 결합 FAM19A5를 발현하는 셀라인이 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중에서 다양한 농도의 모노클로날 항체와 함께 4℃에서 1시간 동안 혼합된다. 세척 후, 세포는 1차 항체 염색과 동일한 조건하에서 플루오레세인-표지된 항-IgG 항체와 반응된다. 단일 세포에 대해 게이트 특성을 가진 직진 및 측면 스캐터를 사용하는 FACScan 기기에 의해 샘플이 분석될 수 있고, 표지된 항체의 결합이 결정된다. 유세포분석에 더하여 또는 유세포분석을 대신하여 형광 현미경을 사용한 다른 분석도 사용될 수 있다. 세포는 상기 설명된 대로 정확히 염색되고 형광 현미경에 의해 검사될 수 있다. 이 방법은 개별 세포의 시각화를 허용하지만 항원의 밀도에 따라 감도가 저하될 수 있다.
항-FAM19A5 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 FAM19A5 항원과의 반응성에 대해 더 시험될 수 있다. 간단히 말해서, FAM19A5를 발현하는 세포로부터의 세포 추출물이 제조되고 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 수행될 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원이 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨지고 20% 마우스 혈청으로 차단되고 시험될 모노클로날 항체로 프로브될 것이다. 항-IgG 알칼리성 포스파타아제를 사용하여 IgG 결합이 검출될 수 있고, BCIP/NBT 기질 정제(Sigma Chem. Co., St. Louis, 미주리)로 전개될 수 있다.
다양한 항-FAM19A5 항체의 결합 친화성, 교차-반응성, 및 결합 동력학을 분석하기 위한 방법은 본 분야에 공지된 표준 분석들, 예를 들어 BIACORE™ 2000 SPR 기기(Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)를 사용한 BIACORE™ 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 포함한다.
한 구체예에서, 항체는 사람 FAM19A5의 가용성 형태에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 항체는 사람 FAM19A5의 막 결합 형태에 특이적으로 결합한다. 항체는 FAM19A5의 특정 에피토프(예를 들어, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 6 내의 단편)에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 사람 FAM19A5에, 바람직하게는 높은 친화성으로 특이적으로 결합하고, FAM19 단백질 서브패밀리의 다른 멤버와는 교차-반응하지 않는다.
IX. 이중특이적 분자
본 발명에서 설명된 항체는 이중특이적 분자를 형성하는데 사용될 수 있다. 항-FAM19A5 항체, 또는 그것의 항원 결합 부분은 다른 기능적 분자, 예를 들어 다른 펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 다른 항체 또는 수용체 리간드)로 유도체화되거나 이들에 결합될 수 있으며, 이로써 적어도 두 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자가 생성된다. IL-6, CNTF, LIF, EGF 및 TGFa와 같은 사이토카인이 전사 3의 단백질 신호 변환제 및 활성제(STAT3)를 활성화함으로써 신경아교증 및/또는 반응성 성상교세포증 개시의 촉발제로 연루되었고(Balasingam et al., J. Neurosci. 14(2):846-56 (1994); Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.20; 92(13):5865-9 (1995) 참조), 이들은 CNS 손상 후 많은 양태의 반응성 성상교세포증을 조절한다(Herrmann J. E. et al., J. Neurosci. 28(28):7231-7243 (2008) 참조). 예를 들어, STAT3의 부재 또는 감소는 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP)의 상향조절의 감쇠, 성상교세포 비대의 부전, 및 증가된 염증 전파, 증가된 병소 부피 및 CNS 손상 후 부분적으로 약화된 운동 회복을 초래한다(Herrmann J. E. et al., J. Neurosci. 28(28): 7231-7243 (2008) 참조). 따라서, 예를 들어 항-FAM19A5 항체는 조합 치료를 위해 신경아교증의 개시 및/또는 반응성 성상교세포의 과도한 증식을 저해하는데 연루되는 임의의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 scFv, 예를 들어 IL-6 CNTF, LIF, EGF 또는 TGFα에 대한 항체와 결합될 수 있다.
또한, 항-FAM19A5 항체는 대상에서 중추신경계 손상(예를 들어, 외상성 뇌 손상, 뇌척수 손상, 뇌졸중, 또는 뇌종양), 뇌척수계 손상, 퇴행성 뇌 장애(예를 들어, 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, ALS), 퇴행성 뇌척수 또는 신경 장애, 또는 신경병증성 통증(아래 제XIII장의 질환 또는 장애 참조)을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하는 항체 또는 scFv와 결합될 수 있다. 예를 들어, 항-FAM19A5 항체는 다발성 경화증을 치료하는 항체 또는 scFv, 예를 들어 나탈리주맙(Tysabri), 또는 알레투주맙(Lemtrada)과 결합될 수 있다.
본 발명에서 설명된 항체는 실제로 둘 이상의 다른 기능적 분자와 유도체화되거나 결합될 수 있으며, 이로써 3개 이상의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자가 생성된다. 이러한 다중특이적 분자도 역시 본 발명에서 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포함된다. 본 발명에서 설명된 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명에서 설명된 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 다른 항체, 그것의 항원 결합 부분, 단백질 또는 결합 의태체와 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 다른 방식에 의해) 기능적으로 결합될 수 있으며, 이로써 이중특이적 분자가 얻어진다. 한 구체예에서, 이중특이적 분자는 FAM19A5와 VEGF에 결합한다. 다른 구체예에서, 이중특이적 분자는 FAM19A5와 EGF에 결합한다.
따라서, FAM19A5에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자가 본 발명에서 제공된다. 이중특이적 분자가 다중특이적인 본 발명에서 설명된 한 구체예에서, 상기 분자는 제3 결합 특이성을 더 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에서 설명된 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 적어도 하나의 항체, 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단쇄 Fv(scFv)를 포함하는 그것의 항원 결합 부분을 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 다이머, 또는 Fv 또는 단쇄 구성물과 같은 그것의 최소 단편일 수 있으며, 이것은 그 내용이 분명히 본원에 참고로 포함되는 Ladner et al.의 미국특허 No. 4,946,778에 설명된다.
사람 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 발명에서 설명된 이중특이적 분자에 이용될 수 있는 다른 항체들은 뮤린, 키메라 및 사람화 모노클로날 항체이다.
본 발명에서 설명된 이중특이적 분자는 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 구성성 결합 특이성들을 콘쥬게이트함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이성이 개별적으로 생성된 후, 서로 콘쥬게이트될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩타이드인 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제가 공유 콘쥬게이션을 위해 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카보디이미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 술포석신이미딜 4-(N-말데이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)를 포함한다(예를 들어, Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648 참조). 다른 방법은 Paulus (1985)Be bring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., (1985) Science 229:81-83, 및 Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375에 설명된 것들을 포함한다. 바람직한 콘쥬게이트 제제는 SATA 및 설포-SMCC이며, 둘 다 Pierce Chemical Co.(Rockford, 일리노이)에서 구입할 수 있다.
결합 특이성이 항체인 경우, 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설프히드릴 결합을 통해서 콘쥬게이트될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 힌지 영역은 콘쥬게이션 전에 홀수 개의 설프히드릴 잔기, 바람직하게 1개의 설프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
또는, 결합 특이성은 둘 다 동일한 벡터에서 암호화되고 동일한 숙주 세포에서 발현되어 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv)2, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 이중특이적 항체는 각 중쇄의 C-말단에 scFv를 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 설명된 이중특이적 분자는 하나의 단쇄 항체와 결합 결정소를 포함하는 단쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정소를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국특허 No. 5,260,203; 미국특허 No. 5,455,030; 미국특허 No. 4,881,175; 미국특허 No. 5,132,405; 미국특허 No. 5,091,513; 미국특허 No. 5,476,786; 미국특허 No. 5,013,653; 미국특허 No. 5,258,498; 및 미국특허 No. 5,482,858에 설명된다.
특이적 표적에 대한 이중특이적 분자의 결합은 본 분야에 인정된 방법, 예컨대 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성면역분석(RIA), FACS 분석, 바이오어쌔이(예를 들어, 성장 저해), 또는 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 확인될 수 있다. 이들 각 분석은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체)를 이용하여 특히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
X. 진단
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체에 부착되는 모이어티는 결합 모이어티, 표지화 모이어티, 및 생리학적 활성 모이어티로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 설명된 항체는 샘플 검사 및 생체내 영상화를 포함하는 진단 목적을 위해 사용될 수 있으며, 이 목적을 위해서 항체(또는 그것의 결합 부분)은 적절한 검출가능한 제제에 콘쥬게이트되어 면역콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 진단 목적을 위한 적절한 제제는 전신 영상화를 위한 방사성동위원소, 및 샘플 검사를 위한 방사성동위원소, 효소, 형광 표지 및 다른 적합한 항체 택을 포함하는 검출가능한 표지이다.
검출가능한 표지는 시험관내 진단 분야에서 현재 사용되는 다양한 종류 중 어느 것일 수 있으며, 이들은 콜로이드상 금과 같은 금속 졸을 포함하는 미립자 표지, 예를 들어 N2S2, N3S 또는 N4 타입의 펩타이드 킬레이트화제와 함께 제시되는 I125 또는 Tc99와 같은 동위원소, 형광 마커, 발광 마커, 인광 마커 등을 포함하는 발색단, 뿐만 아니라 주어진 기질을 검출가능한 마커로 전환하는 효소 표지, 및 중합효소 연쇄 반응에 의한 것과 같은 증폭 후 드러나는 폴리뉴클레오타이드 택을 포함한다. 적합한 효소 표지는 양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제 등을 포함한다. 예를 들어, 표지는 효소 알칼리성 포스파타아제일 수 있으며, 이것은 아다만틸 메톡시 포스포릴옥시 페닐 디옥세탄(AMPPD), 디소듐 3-(4-(메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로{3.3.1.1 3,7}데칸}-4-일)페닐 포스페이트(CSPD), 뿐만 아니라 CDP 및 CDP-STAR®와 같은 1,2-디옥세탄 기질 또는 당업자에게 잘 공지된 다른 발광 기질, 예를 들어 테르븀(III) 및 유로퓸(III)과 같은 적합한 란탄족의 킬레이트의 전환 후 화학발광의 존재나 형성을 측정함으로써 검출된다. 검출 수단은 선택된 표지에 의해 결정된다. 표지 또는 그것의 반응 생성물의 출현은 육안으로 확인될 수 있으며, 표지가 미립자이고 적합한 수준으로 축적된 경우에는, 분광광도계, 발광측정계, 형광측정계 등과 같은 기기를 사용하여 확인될 수 있고, 모든 경우 표준 관례에 따른다.
본 발명에서 설명된 항체는 또한 치료제와 콘쥬게이트될 수 있으며, 이로써 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)와 같은 면역콘쥬게이트가 형성된다. 적합한 치료제는 신경아교증 및/또는 반응성 성상교세포증의 개시를 조정하는 제제 및/또는 퇴행성 뇌 장애, 중추신경계 손상, 또는 신경병증성 통증을 치료하는 제제를 포함한다. 퇴행성 뇌 장애를 치료하기 위한 치료제는 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)를 치료하기 위한 약물을 포함한다. 이것은 이러한 퇴행성 뇌 장애의 치료에 통상 사용되는 약물, 예를 들어 아래 제XII에 개시된 약물을 포함한다.
면역콘쥬게이트는 본 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게, 콘쥬게이션 방법은 결합을 가져오며, 이것은 실질적으로(또는 거의) 비-면역원성, 예를 들어 펩타이드-(즉, 아미드-), 설파이드-, (입체 장해), 디설파이드-, 히드라존-, 및 에테르 결합이다. 이들 결합은 거의 비-면역원성이며, 혈청 내에서 적합한 안정성을 나타낸다(예를 들어, Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886 참조).
모이어티 및 항체의 생화학적 성질에 따라, 상이한 콘쥬게이션 전략이 이용될 수 있다. 모이어티가 50-500개 아미노산의 자연 발생 또는 재조합 모이어티인 경우, 단백질 콘쥬게이트의 합성 화학을 설명한 텍스트북에 있는 표준 과정을 따르며, 이것은 당업자에 의해 쉽게 숙지될 수 있다(예를 들어, Hackenberger, C. P. R., 및 Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074 참조). 한 구체예에서, 말레인이미노 모이어티와 항체 또는 모이어티 내의 시스테인 잔기의 반응이 사용된다. 이것은, 예를 들어 항체의 Fab 또는 Fab'-단편이 사용되는 경우 커플링 화학에 특히 적합하다. 또는, 한 구체예에서, 항체 또는 모이어티의 C-말단 단부와의 커플링이 수행된다. 단백질, 예를 들어 Fab-단편의 C-말단 변형은, 예를 들어 Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371에 설명된 대로 수행될 수 있다.
일반적으로, 부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 천연 아미노산을 기존의 나머지 관능기의 반응성에 직교하는 반응성을 가진 아미노산으로 변형하는 것에 기초한다. 예를 들어, 희귀 서열부 내의 특이적 시스테인은 알데하이드로 효소 전환될 수 있다(Frese, M. A., 및 Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427 참조). 또한, 주어진 서열부에서 천연 아미노산과 특정 효소의 특이적 효소 반응성을 이용함으로써 원하는 아미노산 변형을 획득하는 것이 가능하다(예를 들어, Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al., Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; 및 Protease-catalyzed formation of C-N bonds is used by Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403 참조).
부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 또한 적절한 변형 시약과 말단 아미노산의 선택적 반응에 의해 달성될 수 있다. N-말단 시스테인과 벤조니트릴의 반응성을 사용하여 부위-특이적 공유 커플링이 달성될 수 있다(Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662 참조). 또한, 자생 화학 리게이션은 C-말단 시스테인 잔기에 기초할 수 있다(Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96 참조).
EP 1 074 563은 음으로 하전된 아미노산 스트레치 내의 시스테인과 양으로 하전된 아미노산 스트레치에 위치된 시스테인의 빠른 반응에 기초한 콘쥬게이션 방법을 설명한다.
또한, 모이어티는 합성 펩타이드 또는 펩타이드 의태체일 수 있다. 폴리펩타이드가 화학적으로 합성된 경우, 직교 화학 반응성을 가진 아미노산이 이러한 합성 동안 통합될 수 있다(예를 들어, de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295 참조). 상당히 다양한 직교 관능기에 성패가 달려 있고 합성 펩타이드에 도입될 수 있기 때문에, 이러한 펩타이드와 링커의 콘쥬게이션이 표준 화학이 된다.
단일-표지된 폴리펩타이드를 획득하기 위해, 1:1 화학량론의 콘쥬게이트가 다른 콘쥬게이션 부산물로부터 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 이 과정은 염료 표지된 결합쌍 구성원과 하전된 링커를 사용하여 용이해질 수 있다. 이 종류의 표지되고 고도로 음으로 하전된 결합쌍 구성원을 사용함으로써 단일 콘쥬게이트된 폴리펩타이드가 비-표지된 폴리펩타이드 및 둘 이상의 링커를 지닌 폴리펩타이드로부터 쉽게 분리되는데, 그 이유는 전하와 분자량의 차이가 분리에 사용될 수 있기 때문이다. 형광 염료가 표지된 1가 바인더와 같은 미-결합 성분으로부터 복합체를 정제하는데 유용할 수 있다.
XI . 제약학적 조성물
생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제(Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, 펜실베니아) 중의 원하는 정도의 순도를 가진 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물이 본 발명에서 제공된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 이용된 투약량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 버퍼, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 염화 옥타데실디메틸벤질암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물들; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 예방 또는 치료제를, 제약학적으로 허용되는 담체 중에 포함한다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분의 유효량, 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 예방 또는 치료제를, 제약학적으로 허용되는 담체 중에 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 제약학적 조성물에 포함된 유일한 활성 성분이다. 본 발명에서 설명된 제약학적 조성물은 FAM19A5 활성을 증진, 유도 또는 활성화시키고, 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌 장애, 또는 신경병증 통증과 같은 상태를 치료하는데 유용할 수 있다.
비경구 제조물에서 사용된 제약학적으로 허용되는 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장제, 버퍼, 항산화제, 국소 마취제, 현탁 및 분산제, 유화제, 봉쇄 또는 킬레이트화제 및 다른 제약학적으로 허용되는 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예들은 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장 덱스트로오스 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로오스 및 락테이트 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 식물 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참깨유 및 땅콩유를 포함한다. 정균 또는 정진균 농도의 항균제가 다수-용량 용기에 패키지된 비경구 제조물에 첨가될 수 있으며, 이들은 페놀 또는 크레졸, 수은함유물질, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화벤잘코늄 및 염화벤제토늄을 포함한다. 등장제는 염화나트륨 및 덱스트로오스를 포함한다. 버퍼는 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 중황산나트륨을 포함한다. 국소 마취제는 프로카인 염산염을 포함한다. 현탁 및 분산제는 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리소르베이트 80(TWEEN® 80)을 포함한다. 금속 이온의 봉쇄 또는 킬레이트화제는 EDTA를 포함한다. 제약학적 담체는 또한 수 혼화성 비히클을 위해 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜을 포함하고, pH 조정을 위해 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.
제약학적 조성물은 대상에 대한 임의의 투여 경로에 맞게 제제화될 수 있다. 투여 경로의 구체적인 예들은 비내, 경구, 비경구, 척추강내, 뇌실내, 폐, 피하, 또는 심실내 경로를 포함한다. 피하, 근육내 또는 정맥내 주사를 특징으로 하는 비경구 투여가 또한 본 발명에서 고려된다. 주사가능물질이 종래의 형태로, 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체 중에서 용액 또는 현탁액으로 되기에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 주사가능물질, 용액 및 에멀젼은 또한 하나 이상의 부형제를 함유한다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 이에 더하여, 원한다면, 투여될 제약학적 조성물은 또한 소량의 비-독성 보조 물질, 예컨대 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해성 증진제, 및 다른 이러한 제제들, 예컨대 나트륨 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 사이클로덱스트린을 함유할 수 있다.
항체의 비경구 투여를 위한 제조물은 바로 주사 가능한 멸균 용액, 피하주사용 정제를 포함하는 사용 직전에 용매와 바로 조합될 수 있는 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 동결건조된 분말, 바로 주사 가능한 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 바로 조합될 수 있는 멸균 건조 불용성 제품 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
정맥내 투여되는 경우, 적합한 담체는 생리학적 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS), 및 증점 및 용해제를 함유하는 용액, 예컨대 글루코오스, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물을 포함한다.
항체를 포함하는 국부용 혼합물은 국소 및 전신 투여에 대해 설명된 대로 제조된다. 얻어진 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있으며, 크림, 겔, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크, 페이스트, 폼, 에어로졸, 관주제, 스프레이, 좌약, 붕대, 피부 패치 또는 국부적 투여에 적합한 임의의 다른 제제로서 제제화될 수 있다.
본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은, 예컨대 흡입에 의한, 국부적 투여를 위한 에어로졸로서 제제화될 수 있다(예를 들어, 미국특허 Nos. 4,044,126, 4,414,209 및 4,364,923 참조, 이들은 염증성 질환, 특히 천식의 치료에 유용한 스테로이드의 송달을 위한 에어로졸을 설명한다). 기도에 투여하기 위한 이들 제제는 분무기용의 에어로졸 또는 용액의 형태이거나, 또는 흡입제용의 마이크로파인 분말일 수 있으며, 단독으로 사용되거나 또는 락토오스와 같은 비활성 담체와 조합된다. 이러한 경우, 제제의 입자는, 한 구체예에서 50 마이크론 미만, 한 구체예에서 10 마이크론 미만의 직경을 가질 것이다.
본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 국소 또는 국부적 적용, 예컨대 피부 및 점막에 국부적 적용, 예컨대 눈에 국소 적용을 위해, 젤, 크림 및 로션으로 제제화될 수 있고, 눈에 적용 또는 수조내 또는 척추내 적용을 위해 제제화될 수 있다. 국부적 투여는 경피 송달을 위해 고려되며, 또한 눈이나 점막 투여, 또는 흡입 요법을 위해 고려된다. 다른 제약학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 또는 단독으로 항체의 코 용액이 또한 투여될 수 있다. 이온영동 및 전기영동 장치를 포함하는 경피 패치가 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 항체를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 패치는 미국특허 Nos. 6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010715, 5,985,317, 5,983,134, 5,948,433, 및 5,860,957에 설명된다.
특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 포함하는 제약학적 조성물은 동결건조된 분말이며, 이것은 용액, 에멀젼 및 다른 혼합물로서 투여를 위해 복원될 수 있다. 동결건조된 분말은 또한 고체 또는 겔로서 복원 및 제제화될 수 있다. 동결건조된 분말은 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 유도체를 적합한 용매에 용해함으로써 제조된다. 일부 구체예에서, 동결건조된 분말은 멸균 상태이다. 용매는 분말 또는 분말로부터 제조된 복원된 용액의 안정성 또는 다른 약물학적 성분을 개선하는 부형제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는, 제한은 아니지만, 덱스트로오스, 소르비톨, 프럭토오스, 콘 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코오스, 수크로오스 또는 다른 적합한 제제를 포함한다. 또한, 용매는, 한 구체예에서, 약 중성 pH의, 버퍼, 예컨대 시트레이트, 나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 당업자에게 알려진 다른 버퍼를 함유할 수 있다. 용액의 후속 멸균 여과 후 당업자에게 공지된 표준 조건하에서의 동결건조는 원하는 제제를 제공한다. 한 구체예에서, 얻어진 용액은 동결건조용 바이알에 배분될 것이다. 각 바이알은 화합물의 단일 투약량 또는 다수 투약량을 함유할 것이다. 동결건조된 분말은 적절한 조건하에, 예컨대 약 4℃ 내지 실온에서 보관될 수 있다.
주사용수에 의한 이 동결건조된 분말의 복원은 비경구 투여에 사용하기 위한 제제를 제공한다. 복원을 위해 동결건조된 분말이 멸균수 또는 다른 적합한 담체에 첨가된다. 정확한 양은 선택된 화합물에 따른다. 이러한 양은 경험적으로 결정될 수 있다.
본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트 및 본 발명에서 제공된 다른 조성물은 또한 치료될 대상의 특정 조직, 수용체, 또는 다른 신체 영역에 표적화되도록 제제화될 수 있다. 많은 이러한 표적화 방법이 당업자에게 잘 공지되어 있다. 모든 이러한 표적화 방법을 본 조성물에 사용하는 것이 본 발명에서 고려된다. 표적화 방법의 비제한적 예들은, 예를 들어 미국특허 Nos. 6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542 및 5,709,874를 참조한다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 설명된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌 장애, 또는 신경병증 통증을 치료하는 것을 목표로 한다.
생체내 투여에 사용되는 조성물은 멸균될 수 있다. 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 멸균된다.
XII. 키트
본 발명에서 설명된 하나 이상의 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 그것의 면역콘쥬게이트를 포함하는 키트가 본 발명에서 제공된다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 제공된 하나 이상의 항체 또는 그것의 항원-결합 부분과 같은, 본 발명에 설명된 제약학적 조성물의 성분들 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기, 선택적인 사용 설명서를 포함하는 제약학적 팩 또는 키트가 본 발명에서 제공된다. 일부 구체예에서, 키트는 본 발명에서 설명된 제약학적 조성물 및 본 발명에 설명된 것들과 같은 임의의 예방 또는 치료제를 함유한다.
XIII. 치료적 용도 및 방법
한 양태에서, 본 발명에서 설명된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 치료 필요가 있는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 CNS의 손상이나 상해를 완화하기 위한 방법이 본 발명에서 제시된다.
한 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 신경아교증의 시작 또는 개시 및 이와 관련된 CNS에 대한 유해한 효과를 저해, 지연, 억제, 저지, 감소, 반전, 또는 예방하기 위한 방법이 본 발명에서 제시된다. 한 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 반응성 성상교세포의 과도한 또는 비정상적 증식 및 이와 관련된 CNS에 대한 유해한 효과를 저해, 지연, 억제, 제지, 감소, 반전, 또는 예방하기 위한 방법이 본 발명에서 제시된다. 한 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현(뉴로칸, NG2 또는 둘 다의 수준을 포함하는)을 저하, 저해 또는 감소시키기 위한, 또는 뉴로칸, NG2 또는 둘 다의 활성을 감소시키거나 또는 비활성으로 만들기 위한 방법이 본 발명에서 제시된다. 한 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 바람직하게는 손상이나 상해 후 뉴런의 성장을 자극, 촉진, 증가, 또는 활성화시키기 위한 방법이 본 발명에서 제시된다. 한 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상에서 바람직하게는 뉴런의 핵에서 c-fos mRNA, c-fos 단백질, 또는 c-fos 단백질 활성의 수준을 증가시키고, ERK mRNA, ERK 단백질 또는 pERK 활성의 수준을 증가시키기 위한 방법이 본 발명에서 제시된다. 한 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상에서 바람직하게는 뉴런에서 GAP43 mRNA, GAP43 단백질의 수준을 증진 또는 증가시키거나, 또는 GAP43 단백질의 활성을 증가시키기 위한 방법이 본 발명에서 제시된다. 한 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상에서 뉴런의 생존을 증진 또는 촉진하고 및/또는 축삭돌기의 재성장을 촉진하기 위한 방법이 본 발명에서 제시된다. 한 구체예에서, 대상은 사람, 바람직하게는 예를 들어 CNS 손상, 외상, 상해, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역 반응, 및/또는 신경퇴행성 질환으로 인한, 뉴런의 상해 또는 손상을 가진 사람이다.
일부 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상에서 중추신경계 손상, 뇌척수계 손상, 퇴행성 뇌 장애, 퇴행성 뇌척수 또는 신경 장애, 또는 신경병증 통증을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 본 발명에서 제시된다.
한 구체예에서, 중추신경계 손상은 외상성 뇌 손상, 뇌척수 손상, 뇌졸중, 뇌종양(예를 들어, 신경교종 또는 교모세포종), 또는 이들의 조합이다. 한 구체예에서, 퇴행성 뇌 장애는 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 또는 이들의 조합이다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상에서 외상성 뇌 손상, 뇌척수 손상, 뇌졸중, 뇌종양(예를 들어, 신경교종 또는 교모세포종), 또는 이들의 조합을 치료하기 위한 방법이 본 발명에 개시된다. 한 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상에서 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, ALS를 치료하기 위한 방법이 본 발명에 개시된다. 일부 구체예에서, 대상은 사람이다.
일부 구체예에서, 본 발명에 개시된 방법은 뇌종양을 치료하는데 사용될 수 있으며, 상기 방법은 항-FAM19A5 항체(예를 들어, 본 발명에 개시된 것들)를 치료 필요가 있는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 뇌종양은 신경교종 또는 교모세포종이다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체의 투여는 기준(예를 들어, 항-FAM19A5 항체를 받지 않았던 대상에서의 상응하는 값)과 비교하여 종양(예를 들어, 교모세포종)의 성장을 감소시킨다. 특정 구체예에서, 종양 성장(예를 들어, 종양 부피 또는 중량)은 기준(예를 들어, 항-FAM19A5 항체를 받지 않았던 대상에서의 상응하는 값)과 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%까지 감소된다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체의 투여는 종양(예를 들어, 교모세포종)에서 혈관 정상화를 촉진한다. 특정 구체예에서, 혈관 정상화는 (i) 혈관수의 증가, (ii) 혈관 연결성의 개선, (iii) 혈관 투과성의 감소, (iv) 혈류 속도 증가, 또는 (v) 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명에 개시된 방법은 종양으로 확장되는 혈관의 수를 (두께 증가 및 연결성 개선과 함께) 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 또는 그 이상까지 증가시킨다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체의 투여는 종양(예를 들어, 교모세포종)에 면역세포의 침윤을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 종양에 면역세포의 침윤은 기준(예를 들어, 항-FAM19A5 항체에 노출되지 않은 종양에 존재하는 면역세포의 수)과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 또는 그 이상까지 증가된다. 특정 구체예에서, 면역세포는 대식세포, 수지상 세포, 소교세포, 및 T-림프구를 포함한다. 추가의 구체예에서, 여기 개시된 방법은 종양에 존재하는 면역세포의 세포 부피를 증가시킨다. 특정 구체예에서, 면역세포의 세포 부피는 기준(예를 들어, 항-FAM19A5 항체에 노출되지 않은 종양에 존재하는 면역세포의 부피)과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 또는 그 이상까지 증가된다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체(예를 들어, 본 발명에 개시된 것들)의 투여는 종양(예를 들어, 뇌종양)을 가진 대상의 생존을 증가시킨다. 특정 구체예에서, 생존은 기준(예를 들어, 항-FAM19A5 항체를 받지 않은 대상에서의 상응하는 값)과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 또는 그 이상까지 증가된다. 일부 구체예에서, 생존은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 또는 그 이상까지 증가된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 뇌종양(예를 들어, 교모세포종)은 전이성, 절제불능, 선행 암 치료법에 내성일 수 있다. 특정 구체예에서, 선행 암 치료법은 화학요법을 포함한다. 일부 구체예에서, 화학요법은 백금-기반 치료법을 포함한다. 일부 구체예에서, 백금-기반 치료법은 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴, 테트라니트레이트, 페난트리플라틴, 피코플라틴, 사트라플라틴 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 백금-기반 항신생물제를 포함한다. 특정 구체예에서, 백금-기반 치료법은 시스플라틴을 포함한다. 추가의 구체예에서, 백금-기반 치료법은 카보플라틴을 포함한다. 일부 구체예에서, 선행 암 치료법은 면역요법(예를 들어, 항-PD-1 항체)을 포함한다.
일부 구체예에서, (뇌종양, 예를 들어 교모세포종을 치료하기 위한) 본 발명의 방법에서 유용한 항-FAM19A5 항체는 암의 치료에 사용되는 다른 화합물, 약물 및/또는 제제와 조합하여 제공될 수 있다. 이러한 화합물, 약물 및/또는 제제는, 예를 들어 화학요법 약물, 소 분자 약물, 또는 주어진 암에 대한 면역 반응을 자극하는 항체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 설명된 방법은 표준 암 치료(예를 들어, 수술, 방사선 및 화학요법)와 조합하여 사용된다. 다른 구체예에서, 본 발명에서 설명된 방법은 유지 요법, 예를 들어 종양의 발생이나 재발을 예방하기 위한 요법으로서 사용된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 유용한 항-FAM19A5 항체는 둘 이상의 면역종양학 제제와 조합될 수 있으며, 예를 들어 면역 경로에서 다중 요소를 표적으로 하는 조합적 접근법과 조합될 수 있고, 예컨대 다음 중 하나 이상과 조합될 수 있다: 종양 항원 제시를 증진시키는 요법(예를 들어, 수지상 세포 백신, GM-CSF 분비 세포성 백신, CpG 올리고뉴클레오타이드, 이미퀴모드); CTLA-4 및/또는 PD1/PD-L1/PD-L2 경로를 저해하고 및/또는 Treg 또는 다른 면역 억제 세포(예를 들어, 골수종-유래 억제제 세포)를 고갈시키거나 차단함으로써, 부정적 면역 조절을 저해하는 요법; CD-137, OX-40, 및/또는 CD40 또는 GITR 경로를 자극하고 및/또는 T 세포 이펙터 기능을 자극하는 작동제에 의해, 긍정적 면역 조절을 자극하는 요법; 항-종양 T 세포의 빈도를 전신적으로 증가시키는 요법; CD25의 길항제(예를 들어, 다클리주맙)를 사용하거나 또는 생체외 항-CD25 비드 고갈에 의해, Treg, 예컨대 종양의 Treg를 고갈시키거나 저해하는 요법; 종양에서 억제제 골수종 세포의 기능에 영향을 미치는 요법; 종양 세포의 면역원성을 증진시키는 요법(예를 들어, 안트라사이클린); 유전자 변형 세포, 예를 들어 키메라 항원 수용체에 의해 변형된 세포를 포함하는 입양 T 세포 또는 NK 세포 전달(CAR-T 요법); 인돌아민 디옥시게나아제(IDO), 디옥시게나아제, 아르기나아제, 또는 산화질소 신테타아제와 같은 대사 효소를 저해하는 요법; T 세포 아네르기 또는 소진을 반전/예방하는 요법; 종양 부위에서 선천 면역 활성화 및/또는 염증을 촉발하는 요법; 면역 자극성 사이토카인의 투여; 또는 면역 억제성 사이토카인의 차단. 일부 예에서, 본 발명에서 유용한 항-FAM19A5 항체와 조합될 수 있는 추가의 항암제는, 제한은 아니지만, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-Ll 항체, 항-OX40(CD134, TNFRSF4, ACT35 및/또는 TXGP1L이라고도 한다) 항체, 항-CD137 항체, 항-LAG-3 항체, 항-GITR 항체, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체는 치료 필요가 있는 대상에서 섬유증을 치료, 감소, 반전, 예방, 개선, 제어, 또는 저해할 수 있으며, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 섬유증은 양성이다(즉, 증상을 일으키지 않음). 다른 구체예에서, 섬유증은 병리학적 상태와 관련되며, 재발성일 수도 있고 아닐 수도 있다. 일부 구체예에서, 섬유증은 간 섬유증, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 골수섬유증, 췌장 섬유증, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 동맥 섬유증, 관절섬유증, 유방 섬유증, 근육 섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프절 섬유증, 방광 섬유증, 및 늑막 섬유증으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 섬유증은 간 섬유증 또는 폐 섬유증이다. 다른 구체예에서, 섬유증은 간암, 폐암, 신장암, 유방암, 뇌암 및/또는 췌장암과 같은 암으로부터 유래된 종양과 관련된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 섬유증, 섬유증과 관련된 증상, 섬유증의 기저 원인, 또는 이들의 조합을 약화, 반전, 완화, 개선, 저해, 또는 지연 또는 예방한다.
다른 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체는 치료 필요가 있는 대상에서 장애 또는 질환과 관련된 섬유증을 치료, 감소, 반전, 예방, 개선, 제어, 또는 저해할 수 있으며, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 용어 "질환 또는 장애와 관련된 섬유증"은 질환 또는 장애를 수반하는 섬유증, 또는 질환 또는 장애에 의해 기인하거나 그로부터 생긴 결과인 섬유증을 말한다. 이 용어는 상기 개시된 질환이나 장애로부터 생기거나 그로 인해 야기된 섬유증, 또는 그 질환이나 장애를 수반하는 섬유증을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체는 치료 필요가 있는 대상에서 간암, 폐암, 신장암, 유방암, 뇌암(예를 들어, 신경교종 또는 교모세포종), 및/또는 췌장암을 치료, 감소, 반전, 예방, 지연, 개선, 제어, 또는 저해할 수 있으며, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 간암, 폐암, 신장암, 유방암, 뇌암, 및/또는 췌장암은 섬유증과 관련되거나 섬유증에 의해 야기된다. 일부 구체예에서, 뇌암은 신경교종 또는 교모세포종이다.
일부 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트의 치료적 유효량이 투여된다. 대상(예를 들어, 사람)을 치료할 때, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트의 치료적 유효량은 나이, 성별, 질환의 중증도와 같은 요인들에 의존한다. 전형적으로, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트는 하루 0.01μg 내지 1000mg의 용량으로 투여된다.
일부 구체예에서, 본 발명에 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물은 정맥내, 경구, 비경구, 척추강경유, 척추강내, 뇌실내, 폐, 피하, 또는 심실내 경로로 투여된다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 또는 그것의 조성물은 섬유증을 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 제제(예를 들어, 특발성 폐 섬유증을 위한 피르페니돈(ESBRJET®) 또는 닌테다닙(OFEV®))와 조합하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가의 치료 약물의 용량 및 투여는 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 각 약물의 제품 라벨에 설명된 대로 따른다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 또는 그것의 조성물은 중추신경계 손상(예를 들어, 외상성 뇌 손상, 뇌척수 손상, 뇌졸중, 또는 뇌종양(예를 들어, 신경교종 또는 교모세포종)), 뇌척수계 손상, 퇴행성 뇌 장애(예를 들어, 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, ALS), 퇴행성 뇌척수 또는 신경 장애, 또는 신경병증 통증을 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 헌팅턴병의 치료를 위한 비제한적인 예시적 제제는 테트라베나진(XENAZINE®), 항정신병제, 예컨대 할로페리돌(HALDOL®), 클로르프로마진, 리스페리돈(RISPERDAL®) 및 퀴에티아핀(SEROQUEL®)을 포함한다.
파킨슨병의 치료를 위한 비제한적인 예시적 제제는 레보도파(카르비도파와 함께 또는 단독), 도파민 작동제, 예컨대 프라미펙솔(MIRAPEX®), 로피니롤(REQUIP®), 및 로티고틴(NEUPRO®), 및 아포모르핀(APOKYN®), 셀레길린(ELDEPRYL® 및 ZELAPAR®), 라사길린(AZILECT®), 엔타카폰(COMTAN®), 벤즈트로핀(COGENTIN®), 트리헥시페니딜, 및 아만타딘을 포함한다.
알츠하이머병의 치료를 위한 비제한적인 예시적 제제는 도네페질(ARICEPT®), 갈란타민(RAZADYNE®), 및 리바스티그민(EXELON®)을 포함한다.
다발성 경화증의 치료를 위한 비제한적인 예시적 제제는 글라티라머 아세테이트(COPAXONE®), 디메틸 푸마레이트(TECFIDERA®), 핑골리모드(GILENYA®), 테리플루노미드(AUBAGIO®), 나탈리주맙(TYSABRI®), 알렘투주맙(LEMTRADA®), 및 미톡산트론을 포함한다.
ALS의 치료를 위한 비제한적인 예시적 제제는 릴루졸(RILUTEK®)을 포함한다.
하나 이상의 추가의 치료 약물의 용량 및 투여는 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 각 약물의 제품 라벨에 설명된 대로 따른다.
다음의 실시예들은 제한이 아닌 예시를 위해 제공된다.
실시예
이후의 실시예에서 다음의 실험 방법 및 상세한 내용이 참조된다.
실시예 1: 사람 FAM19A5 단백질의 발현 및 정제
재조합 사람 FAM19A5 단백질을 제조하여 정제하고, 정제된 단백질을 결합 친화성 분석에 기초한 항체 스크리닝 분석에 사용했다. 먼저, FAM19A5 유전자를 함유하는 LPS-hT 플라스미드를 박테리아에 형질전환시켜 단백질 과발현을 유도했다. 제조 후, FAM19A5 단백질을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(Qiagen, Valencia, 미국 캘리포니아)를 사용하여 정제했다. 이미다졸을 점차 더 높은 농도로 사용하여 Ni-칼럼으로부터 Hig-태그된 FAM19A5 단백질을 제거했다. 용액 중 단백질 발현은 코마씨 브릴리언트 블루 R-250 염료를 사용하여 측정된다. FAM19A5 이미다졸 함유 용액만을 가지고 PBS를 사용하여 FAM19A5 단백질을 농축했다. 농축이 완료되었을 때 FAM19A5 단백질의 순도 및 농도를 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 측정했다. 이어서, 농축된 단백질을 사용하여 FAM19A5-특이적 항체를 스크리닝했다.
실시예 2: FAM19A5 항체 라이브러리의 생성
유-중-수 에멀젼 애쥬번트(RIBI + MPL + TDM + CWS 애쥬번트, Sigma, St. Louis, 미국 미주리)를 함유하는 TDW 및 CWS의 세포벽 성분을 에멀젼화한 다음, 이것을 3마리의 닭에 피하 주사했다. 닭은 대략 2-3주 간격으로 총 3회 면역화했다. 면역화된 닭으로부터 얻어진 항체의 역가를, FAM19A5 단백질을 과발현했던 HEK293T 세포의 세포용해물을 사용하여 면역블롯팅을 통해서 측정했다.
TRI 시약(Invitrogen, Carlsbad, 미국 캘리포니아)을 사용하여 면역화된 닭으로부터 단쇄 가변 단편(scFv) 라이브러리를 제조했고, 상기 설명된 면역화된 닭의 비장, 골수, 및 활액낭으로부터 RNA를 추출했다.
올리고-dT 프라이머와 SUPERSCRIPT™ III 제1-가닥 합성 시스템(Invitrogen)을 사용하여 제1 가닥 cDNA를 합성했다. 닭의 면역 시스템으로부터 얻어진 cDNA에 대해, 확장형 고 충실도 PCR 시스템(Roche Molecular Systems, 미국 인디애나폴리스)을 사용하여 단쇄 가변 영역 라이브러리를 생성했다. 각 반응에서, 1μL cDNA, 각 프라이머 60 pmol, 10x 반응 버퍼 용액 10μL, 2.5mM dNTP(Promega, Madison, 미국 위스콘신) 8μL, 및 Taq DNA 중합효소 0.5μL를 물과 혼합했다. 최종 부피는 100μL였다. PCR 반응을 다음의 조건을 사용하여 수행했다: (i) 94℃에서 15초, (ii) 56℃에서 30초, 및 (iii) 72℃에서 90초의 30 사이클, 이후 72℃에서 10분간 최종 확장. 약 350bp의 길이를 가진 단편을 포함하는 PCR 생성물을 1.5% 아가로오스 겔 위에 로딩하고 전기영동 후, QIAGEN Gel II 추출 키트(QIAGEN, Valencia, 미국 캘리포니아)를 사용하여 상기 뉴클레오타이드 단편을 정제했다. 정제된 PCR 생성물을 OD 260nm에서 판독하여 정량했다(1 유닛 OD = 50μg/ml).
두 번째 PCR로부터 2개의 VH 및 VL 1차 생성물을 중첩 확장 PCR에 의해 무작위로 연결했다. 각 PCR 반응물을 정제된 VL 및 VH 생성물 100ng, 각 프라이머 60 pmol, 10x 반응 버퍼 10μL, 2.5mM dNTP 8μL, Taq DNA 중합효소 0.5μL, 및 최종 부피 100μL가 되는 양의 물과 혼합했다. PCR을 다음의 조건에서 수행했다: (i) 94℃에서 15초, (ii) 56℃에서 30초, 및 (iii) 72℃에서 2분의 25 사이클, 이후 72℃에서 10분간 최종 확장. 약 700bp의 길이를 가진 단쇄 가변 영역 단편을 포함하는 PCR 생성물을 1.5% 아가로오스 겔 위에 로딩하고 전기영동 후, QIAGEN Gel II 추출 키트(QIAGEN)를 사용하여 상기 뉴클레오타이드 단편을 정제했다. 정제된 PCR 생성물을 OD 260nm에서 판독하여 정량했다(1 유닛 OD = 50μg/ml).
PCR 생성물의 scFv 단편과 벡터 pComb3X-SS(The Scripps Research Institute 미국 캘리포니아)를 Sfi I 제한 효소로 효소절단했다. 정제된 중첩 PCR 생성물 10μg를 Sif I 360유닛(16유닛 당 1μg DNA, Roche Molecular Systems, Pleasanton, 미국 캘리포니아), 10x 반응 버퍼 20μL 및 최종 부피 200μL가 되는 양의 물과 혼합했다. pComb3X-SS 벡터 20μg을 Sfi I 120유닛(6유닛 당 1μg DNA), 10x 반응 버퍼 용액 20μL 및 최종 부피가 200μL가 되는 양의 물과 혼합했다. 혼합물을 8시간 동안 50℃에서 효소절단했다. 이후, scFv 단편(약 700bp)과 벡터(약 3400bp)를 포함하는 효소절단된 생성물을 1% 아가로오스 위에 로딩하고 겔 추출 키트 II QIAGEN(QIAGEN, Valencia, 미국 캘리포니아)을 사용하여 정제했다. Sfi I-제한된 pComb3X 벡터 1400ng과 효소절단된 scFv 단편 700ng을 5x 리가아제 버퍼, T4 DNA 리가아제 10μL(Invitrogen, Carlsbad, 미국 캘리포니아) 및 최종 부피가 200μL가 되는 양의 물과 혼합했다. 혼합물을 16시간 동안 16℃에서 인큐베이션하여 리게이션을 수행했다.
에탄올 침전 후, DNA 펠릿을 물 15μL에 용해했다. 라이브러리를 생성하기 위해, 리게이션 샘플을 바이브레이터 유전자(Gene pulser: Bio-Rad Laboratories, Hercules, 미국 캘리포니아)를 사용하여 전기천공을 통해 이콜리 균주 ER2738(New England Biolabs Inc, Hitchin, Hertfordshine, SG4 OTY, 영국 잉글랜드)에 형질전환시켰다. 세포를 5mL 수퍼 브로스(SB) 배지와 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 250rpm으로 교반하면서 인큐베이션했다. 다음에, 100mg/mL 카나마이신 3μL를 SB 배지 10mL에 첨가했다. 라이브러리 크기를 결정하기 위해, 0.1μL, 1μL 및 10μL의 배양물 샘플을 50μg/mL 카나마이신을 함유하는 루리아 브로스(LB) 한천 평판 위에 문질러 발랐다. 1시간 교반 후, 100mg/mL 카나마이신 4.5μL를 LB 배양물에 첨가하고 추가로 1시간 더 교반했다. 다음에, 물에 넣은 VCM13 헬퍼 파지 2mL(> 1011 cfu/ml)를 100mg/mL 카나마이신 92.5μL를 함유하는 예열된 LB(183mL)와 함께 LB 배지에 첨가했다. 이 혼합물을 2시간 동안 더 37℃에서 250rpm으로 교반했다. 다음에, 카나마이신 280μL(50mg/mL)를 배양물에 첨가하고 37℃에서 하룻밤 교반했다. 다음 날, 박테리아 펠릿을 고속 원심분리기(Beckman, JA-10 로터)를 사용하여 4℃에서 3,000g으로 원심분리했다. 이후, 박테리아 펠릿을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하는 한편, 상청액을 멸균 원심분리 병에 옮겨 담았다. 다음에, 폴리에틸렌 글리콜-8000(PEG-8000, Sigma) 8g과 염화나트륨(NaCl) 6g을 상청액에 첨가한 다음 얼음에 30분간 넣어 두었다. 이후, 상청액을 4℃에서 15,000g으로 15분간 원심분리했다. 다음에, 상청액을 따라 버리고, 파지 펠릿을 완충 식염수(TBS)에 현탁했다.
실시예 3: 고정된 항원 상에서의 라이브러리 패닝(바이오-패닝)
자기 비드(Dynabeads M-270 에폭시, Invitrogen)를 사용하여 바이오-패닝을 수행했다. 실온에서 20시간 동안 비드와 단백질을 함께 회전 교반시켜서 실온에서 대략 1 x 107 비드를 재조합 FAM19A5 단백질 5μg으로 코팅했다. 코팅이 완료된 후, 비드를 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 4번 세척하고 실온에서 3% BSA를 함유하는 PBS 중에서 1시간 동안 차단시켰다. 다음에, 코팅된 비드를 상기 설명된 파지-전시된 scFv와 함께 실온에서 2시간 동안 배양했다. 항원 코팅된 비드에 결합되지 않은 파지를 제거하기 위해 비드를 0.05% Tween 20/PBS로 세척했다. 다음에, 결합된 파지를 0.1M 글리신/염화수소(0.1M 글리신-HCl, pH 2.2) 50μL로 용출시키고 염화수소와 함께 2M Tris(트리스-HCl, pH 9.1) 3μL로 중화시켰다. 이 파지-함유 상청액을 사용하여 이콜리 ER2738 세포를 감염시켰고, VCSM13 헬퍼 파지를 사용하여 하룻밤 증폭시켜 구제했다. 또한, 50μg/mL 카나마이신을 함유하는 LB 한천 평판 위에 파지-감염된 배양물을 블롯팅하여 파지-감염된 배양물로부터 파지 역가에 의해 투입량(인풋) 및 생성량(아웃풋)을 결정했다. 다음 날, PEG-8000과 NaCl을 사용하여 파지를 침전시켰고, 이어서 바이오-패닝에 사용했다. 상기 과정을 반복함으로써 최대 총 5번의 바이오-패닝을 수행했다. 각 증폭마다 파지를 스크리닝하고 FAM19A5 단백질에 대한 높은 친화성을 선택했다.
실시예 4: 파지 ELISA에 의한 클론의 선택
바이오-패닝으로부터 선택된 클론을 분석하기 위해, 파지-전시된 scFv로부터 개별 클론들을 무작위로 선택하고 ELISA를 사용하여 선택된 클론이 FAM19A5 재조합 단백질에 결합하는지 확인했다. FAM19A5 재조합 단백질을 0.1M NaHCO3 버퍼로 희석하고, 웰 당 100ng의 단백질을 사용하여 16시간 동안 4℃에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 코팅했다. 다음 날, 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 3% BSA/PBS로 차단시켰다. 다음에, 파지 상청액을 6% BSA/PBS와 혼합하고 37℃에서 2시간 동안 배양했다. 다음에, 상청액을 함유한 플레이트를 0.05% Tween 20/PBS로 세척했다. HRP-콘쥬게이트된 M13 항체(a-M13-HRP, Pierce Chemical Co, Rockford, 미국 일리노이)를 1/5000으로 희석했다. 희석된 항체 50μL를 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 및 세척 후, 색 전개를 위해 플레이트에 0.05M 시트레이트 버퍼 용액, 1μg/mL의 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS, Amresco, Solon, 미국 오하이오) 및 0.1% H2O2를 첨가했다. 405nm에서 각 웰의 흡광도를 측정했다.
다음에, FAM19A5 재조합 단백질에 결합하며 높은 흡광도를 나타낸 24개 클론을 분석했고, 이들로부터 독특한 서열을 가진 13개의 scFv 클론을 획득했다. 추가 선택 후, 클론 2-13, 1-28, 및 3-2를 획득했다.
실시예 5: 항-FAM19A5-IgG2/4 항체의 생성
항-FAM19A5 scFv를 포유류 발현 벡터에 서브클로닝했다. FAM19A5 scFv 유전자 서열에서, 사람 Cκ 유전자를 경쇄 가변 도메인에 연결했고, CH1, CH2, 및 CH3 유전자의 사람 면역글로불린 이소타입 IgG2/4를 중쇄 가변 영역에 연결했다. 제한 부위(Genscript, 미국)를 부가하여 각 경쇄 및 각 중쇄를 가진 항체를 합성했다. 클로닝을 용이하게 하기 위해 합성된 유전자를 변형된 제한 부위를 가진 포유류 세포 발현 벡터에 삽입했다. 먼저, 경쇄 유전자를 Hind III 및 Xba I(New England Biolabs, 영국) 제한 효소를 사용하여 벡터에 삽입했고, 이어서 NheI 및 BamHI(New England Biolabs, 영국) 제한 효소를 사용하여 벡터에 중쇄 유전자를 부가했다.
항-FAM19A5-IgG2/4 항체를 발현하고 정제하기 위해 포유류 세포 형질도입 및 과발현 주사 시스템을 사용했다. 세포 배양 부피의 1/10에 상응하는 150mM 염화나트륨(NaCl, Merck) 중에 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, Warrington, 미국 펜실베니아) 4μg과 포유류 발현 벡터 2μg/mL를 혼합했다. 혼합물을 실온에서 15분간 그대로 두었다. 혼합물을 HEK293F 세포(2 x 106 세포/mL, Invitrogen)에 첨가한 다음, 6일 동안 135rpm의 교반 조건에서 7% CO2 및 37℃에서 100 U/mL 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 FREESTYLE™ 293 발현 배양 배지 중에서 인큐베이션했다. 세포 배양 상청액으로부터 발현된 항-FAM19A5 IgG2/4 항체를 정제하기 위해 단백질 A 비드(RepliGen, Waltham, 미국 매사츄세츠) 친화성 겔 크로마토그래피를 사용했다. 단백질 A 크로마토그래피는 4-12% Bis-Tris 구배 겔 전기영동 상에서 진행되었다. 단백질의 크기 및 수율을 코마씨 브릴리언트 블루 염색에 의해 확인했다.
실시예 6: FAM19A5 에피토프 단편 F1-F6을 사용한 에피토프 맵핑 분석
사람 FAM19A5 단백질의 중첩 펩타이드 단편(F1-F6, 도 1 참조)을 합성하고 BSA에 콘쥬게이트했다. BSA-콘쥬게이트된 펩타이드 단편 F1-F6에 대한 상이한 항-FAM19A5 항체들의 결합을 ELISA 분석에 의해 결정했다. 간단히 말해서, FAM19A5 단편 F1-F6(50mM 카보네이트 버퍼(Biosesang)로 1μg/mL로 희석하거나 고 농도 분석을 위해서는 20μg/mL로 희석)을 사용하여 4℃에서 하룻밤 96-웰 이뮤노 플레이트(Thermo Scientific)의 웰을 코팅한(100μL/웰) 다음, 계속해서 1x PBS로 2번 세척했다. 다음에, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 차단 버퍼(100μL/웰)로 차단시켰다. 1시간 인큐베이션 동안, 관련된 항-FAM19A5 항체를 희석 버퍼로 1μg/mL(또는 고 농도 분석의 경우 20μg/mL)로 희석했다. 플레이트를 세척한 후(1x PBS를 사용하여 2번), 희석된 항-FAM19A5 항체를 적절한 웰에 첨가했고, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 이어서, 플레이트를 세척 버퍼를 사용하여 총 5회 세척했다. 다음에, ODP 기질(멸균 탈이온수 9mL와 10x 안정한 퍼옥사이드 안정 버퍼(Thermo) 1mL에 ODP 정제(O-페닐렌디아민 중염산염, Thermo) 1개를 용해하여 제조)을 각 웰에 첨가했고, 10분간 색 변화 반응이 일어나도록 두었다. 웰에 2N H2S04(Daejung) 100μL를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 96-웰 마이크로플레이트 리더(Molecular Device)를 사용하여 492nm에서 각 웰의 흡광도 값을 검출했다.
도 2에 도시된 대로, 항-FAM19A5 항체 3-2는 에피토프 단편 F2에 강하게 결합했으며, 나머지 단편들에 대한 결합은 최소였다. 이것은 항-FAM19A5 항체 1-28에 대해서도 마찬가지였다(데이터 미도시). 반면, 1-65 항체는 에피토프 단편 F5에만 강하게 결합했다. 흥미롭게도, 항-FAM19A5 항체 2-13은 F1-F6 에피토프 단편 중 어느 것과도 결합하지 않은 것으로 드러났다.
다음에, 3-2 및 1-28이 결합한 에피토프 단편 F2 내의 특이적 아미노산 잔기를 확인하기 위해, F2 단편의 상이한 아미노산 잔기들을 표 9(아래)에 나타낸 대로 알라닌 또는 발린으로 치환했다. 돌연변이된 잔기는 굵은 글씨로 밑줄 표시했다. 나타낸 항-FAM19A5 항체들의 결합 친화성을 상기 설명된 대로 ELISA를 사용하여 측정했다.
도 3A 및 3B에 도시된 대로, 3-2 항체는 돌연변이 F2 펩타이드 단편 #1, 2, 4-6 및 9-13에 강하게 결합했고, 단편 #3, 7 및 8에 대한 결합은 감소했다. 후자의 3개 돌연변이 F2 펩타이드 단편은 각각 아미노산 잔기 D5, P9 및 R11(상기 표 9에서 SEQ ID NO: 6에 따라서 넘버링)에 알라닌 치환을 포함하며, 이는 3-2 항체가 주로 이들 아미노산 잔기에서 FAM19A5에 결합한다는 것을 시사한다.
1-28 항체는 돌연변이 F2 펩타이드 단편 #1, 2, 6 및 8-13에는 강하게 결합한 반면, 펩타이드 단편 #3, 4, 5 및 7에 대해서 1-28 항체는 훨씬 감소된 결합을 나타냈다(도 3C 참조). 이 데이터는 항-FAM19A5 항체 1-28이 에피토프 F2 단편 내에서 주로 아미노산 잔기 D5, S6, S7 및 P9(상기 표 9에서 SEQ ID NO: 6에 따라서 넘버링)에서 FAM19A5에 결합한다는 것을 시사한다.
실시예 7: FAM19A5 돌연변이 M1-M8을 사용한 에피토프 맵핑 분석
본 발명에서 개시된 항-FAM19A5 항체의 결합 에피토프를 더 특성화하기 위해, 상이한 FAM19 패밀리 멤버들(즉, FAM19A1-5)의 아미노산 서열을 도 4에 도시된 대로 정렬했다. 이 정렬에 기초하여, FAM19A5 단백질의 아미노산 서열이 FAM19A 패밀리의 나머지 멤버들(즉, FAM19A1-4)과 가장 유의하게 차이가 있었던 8개 영역이 확인되었다(M1-M8). 이들 영역의 아미노산 서열을 FAM19A1-4 단백질의 상응하는 영역의 컨센서스 서열로 치환했다(표 10 참조, 돌연변이된 아미노산 잔기는 굵은 글씨로 밑줄 표시했다).
돌연변이 FAM19A5-발현 파지를 다음과 같이 제조했다. 파지 배양을 위한 배지를 제조하기 위해, 2M 글루코오스(D-(+)-글루코오스, Sigma) 55.6mL, 1M MgC12(염화마그네슘, Junsei) 5mL, 34mg/mL 클로람페니콜(Sigma) 1mL를 2x YT 배지에 첨가했다. 모노-파지 ELISA를 통해서 획득된 콜로니를 선택했고, 제조된 배지(2x YT-GMC) 5mL에 넣어 쉐이킹 인큐베이터(VS-8480, Vision)에서 37℃에서 16시간 동안 배양했다. 각 배양물 100μL를 개별적으로 10mL 2x YT-GMC로 옮기고, O.D. 600nm 검출값이 0.5가 될 때까지 인큐베이터에서 37℃에서 배양했다. O.D. 600nm에서 검출값이 0.5에 도달하면, 각 배양물 5mL를 피감염 샘플로서 획득했다. 샘플 제조 후, M1 헬퍼 파지 50μL를 개별 샘플에 첨가한 다음, 쉐이킹 없이 30분, 쉐이킹하면서 추가로 30분 더 37℃에서 인큐베이션했다. 개별 배양물을 마이크로원심분리기(Micro12, Hanil)를 사용하여 3,850rpm으로 15분간 원심분리했다. 원심분리된 배양물의 상청액을 제거하여 따로 보관하고, 1M IPTG(AG Scientific) 1mL, 1M MgCl2 5mL, 70μg/μL 카나마이신(Biopure) 1mL 및 클로람페니콜 1mL를 함유하는 2x YT 배지 5mL를 대신 넣었다. 얻어진 펠릿을 새로 첨가된 배지에 완전히 분산시킨 후 교반하면서 16시간 동안 30℃에서 인큐베이션했다.
도 5에 도시된 대로, 항-FAM19A5 항체 1-28 및 3-2는 FAM19A5 돌연변이 M2에 결합하지 못했다. 표 10(위)에 나타낸 대로, M2 돌연변이는 아미노산 잔기 21-25(즉, 에피토프 EP2)에 치환을 가졌고, 이것은 FAM19A5의 에피토프 단편 내의 영역에 상응한다. 이 데이터는 실시예 1-6의 데이터와 일치하며, FAM19A5에 대한 1-28 및 3-2 항체의 결합에 있어서 에피토프 단편 F2의 중요성을 확인시켜 준다.
2-13 항체는 1-28, 3-2 및 1-65 항체와 완전히 상이한 에피토프에서 FAM19A5에 결합하는 것으로 드러났다. 도 5에 도시된 대로, 항-FAM19A5 항체는 FAM19A5 돌연변이 M1-M3 및 M5-M7에 대해 중간 내지 높은 결합을 가졌지만, 돌연변이 M4 및 M8과는 결합하지 못했으며, 이는 FAM19A5에 대한 2-13 항체 결합에 있어서 에피토프 EP4 및 EP8의 중요성을 시사한다. 2-13 항체가 실시예 7에서 FAM19A5 에피토프 단편 중 어느 것과도 결합하지 못했던 것을 고려하면(도 2 참조), 이 데이터 역시 2-13 항체가 선형 에피토프와 반대되는 입체구조적 에피토프를 가진 다는 것을 시사한다.
실시예 8: 교차-경쟁 분석
아래 설명된 대로 2-부위 샌드위치 ELISA를 사용하여 유사한 결합 에피토프를 가진 상이한 항-FAM19A5 항체들이 서로 교차-경쟁하는지 평가했다(도 6A 참조).
먼저, 항-FAM19A5 항체를 10μg/mL의 농도로 1x PBS로 희석했다. 희석된 항-FAM19A5 항체(1x PBS에 10μg/mL)("포착 항체")를 사용하여 대략 1시간 동안 37℃에서 96-웰 플레이트를 코팅했다(100μL/웰). 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 버퍼(0.01% Tween-20/PBS; 0.01% PBST라고도 함)로 총 5회 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 차단 용액(5% BSA/PBS; 5% PBSA라고도 함, 250μL/웰)으로 차단시킨 다음 다시 세척했다. 다음에, 100μg/mL FAM19A5 항원(5% BSA, 0.01% Tween-20을 함유하는 PBS로 희석; 5% PBSAT라고도 함; "희석 버퍼")을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 96-웰 플레이트를 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 0.01% PBST를 사용하여 총 5회 세척했다. 마지막 세척 후, 바이오틴화 항-FAM19A5 항체("검출 항체")(5% PBSAT로 1μg/mL로 희석)를 관련된 웰(100μL 부피)에 첨가했고, 플레이트를 37℃에서 추가로 1시간 더 인큐베이션했다. 이후, 플레이트를 0.01% PBST로 다시 세척했다(총 5회 세척). 다음에, 희석된(5% PBSAT로 1/2000) 스트렙트아비딘-HRP(1mg/mL, Sigma, 미국) 100μL를 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분간 인큐베이션했다. 다음에, 플레이트를 세척하고 TMB 기질(Thermo Fisher Scientific) 100μL로 처리했다. 실온에서 추가로 30분 더 인큐베이션한 후, TMB 기질을 첨가하여 색 변화 반응을 유도했다. 황산(2N H2S04) 50μL를 사용하여 반응을 중단시켰고, 96-웰 마이크로플레이트 리더(Molecular Device)를 사용하여 620nm의 기준 파장하에 450nm에서의 흡광도를 통해서 색 변화 범위를 검출했다.
도 6B에 도시된 대로, 항-FAM19A5 항체 1-65, P2-A03, P2-F11 및 13B4는 모두 서로 교차-경쟁했다. 1-65 항체와 마찬가지로, P2-A03, P2-F11 및 13B4 항체는 모두 에피토프 M6, M7 및/또는 M8에서(즉, F5 및/또는 F6 에피토프 단편 내에서) FAM19A5에 결합한다(데이터 미도시). 반면, 항체 2-13과 3-2는 나머지 항-FAM19A5 항체들과 교차-경쟁하지 않았으며, 이는 이들 항체가 주로 F2 에피토프 단편에서 결합한다는 것을 나타냈던 전술한 에피토프 맵핑 분석을 확인시켜 준다.
실시예 9: 결합 친화성 분석
FAM19A5에 대한 상이한 항-FAM19A5 항체들의 결합 친화성을 결정하기 위해, 앞서 설명된 대로 ELISA 분석을 사용했다(예를 들어, 실시예 6 참조). 도 7A 및 7B에 도시된 대로, 1-28, 3-2 및 1-65 항체는 유사한 결합 친화성으로 FAM19A5에 결합했다(각각 Kd = 0.17 nM, 0.12 nM 및 0.10 nM). 2-13 항체는 약 2.77 nM의 Kd 값으로 결합했다(도 7B 참조).
실시예 10: 간 섬유증에서 혈청 분석
본 발명에서 개시된 항-FAM19A5 항체의 생체내 기능 평가를 위해, 간 섬유증의 래트 모델(즉, 담관 결찰(BLD)-유도 간 섬유증 Sprague-Dawley(SD) 래트 모델)을 사용하여 간 섬유증에서 FAM19A5 단백질의 수준을 측정했다(Kountouras et al., Br J Exp Path 65:305-311 (1984) 참조). 간단히 말해서, 동물을 케타민과 자일라진으로 마취했다. 1.5cm 중간선 절개를 행하고 총담관의 자리를 잡고 3-0 실크 결찰사로 이중 결찰을 수행했다. 다음에, 간 섬유증 유도 후 21일째에 동물로부터 전혈을 수집하고 전혈로부터 혈청을 분리했다.
혈청 중 FAM19A5 단백질의 수준을 FAM19A5 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 측정했다. 96-웰 ELISA 플레이트를 100μL 부피로 1-65 사람 IgG1 항-FAM19A5 항체 1μg/mL로 하룻밤 코팅했다. 다음에, 플레이트를 PBS로 세척하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 1% BSA로 차단시켰다. 다음에, 플레이트를 PBS로 다시 세척하고, 표준물질 및 샘플 대략 100μL를 적당한 웰에 분배했다. 다음에, 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 이후, 플레이트를 0.05% PBS-Tween 20(즉, 세척 버퍼)로 세척했고, 염소 a-토끼 IgG 항체(Santa Cruz, Cat# SC-2030, PBS 중의 1% BSA로 1:5000 희석)에 콘쥬게이트된 검출 항체(양고추냉이 퍼옥시다아제)(HRP) 대략 100μL를 웰에 첨가했다. 플레이트를 추가로 1시간 더 실온에서 인큐베이션했다. 세척 버퍼로 추가 세척 후, O-페닐렌디아민 중염산염(OPD) 기질 대략 100μL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 전개시켰다. 약 10분 후, 1N H2SO4(황산) 대략 100μL를 웰에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 96-웰 마이크로플레이트 리더(Molecular Device, Versa Max)를 사용하여 492nm의 파장에서 흡광도를 측정했다.
도 8에 도시된 대로, FAM19A5 단백질의 수준은 정상(즉, 비-BDL-유도) 래트와 비교하여 BDL-유도 간 섬유증 SD 래트("질환 모델")의 혈청에서 3배 이상 더 높았다.
실시예 11: 폐 섬유증에서 혈청 분석
FAM19A5 단백질의 수준이 폐 섬유증에서도 증가했는지 평가하기 위해, 기관내 주사를 통해서 블레오마이신 3mg/kg을 투여하여 7주령 수컷 SD 래트에서 특발성 폐 섬유증을 유도했다. 블레오마이신 투여 후 24일째에 동물로부터 전혈을 수집하고 전혈로부터 혈청을 분리했다. 혈청 중 FAM19A5 단백질의 수준을 상기 실시예 10에 나타낸 대로 FAM19A5 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 측정했다. 도 9에 도시된 대로, FAM19A5 단백질의 수준은 정상(즉, 특발성 폐 섬유증이 없는) 래트와 비교하여 폐 섬유증 유도된 SD 래트("질환 모델")의 혈청에서 1.5배 이상 더 높았다.
실시예 12: 사람 간 섬유증 환자의 혈청 분석
간세포 손상시 혈청 중 AST 및/또는 ALT 수준이 증가할 수 있고, 이러한 증가는 주로 간 손상을 시사한다고 여겨진다(Gowda et al., Pan Afr Medjy.M (2009); Giannini et al., Arch Intern Med 163:218-224 (2003) 참조). 그러나, 손상이 심할 때는(예를 들어, 간경변) AST 및 ALT 수준이 정상을 나타낼 수도 있다. 따라서, FAM19A5 발현이 간 손상의 더 나은 지표일 수 있는지 평가하기 위해, FAM19A5 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 간경변이 확인된 사람 환자의 혈청에서 FAM19A5 단백질의 수준을 측정했다.
2-13 항-FAM19A5 사람 IgG1 항체를 50mM 카보네이트 버퍼(Bio-World, Cat. C2070-9.6, Lot. C70-9.616Z11C) 중에서 1μg/μL의 농도로 복원했다. 다음에, 항-FAM19A5 항체를 PBS로 1:1000의 비율로 희석한 후, 이것을 사용하여 96-웰 ELISA 플레이트를 하룻밤 코팅했다. 다음 날, 플레이트를 PBS로 세척하고, 이어서 약 1시간 동안 실온에서 PBS 중의 1% BSA로 차단시켰다. 이후, 플레이트를 PBS로 다시 세척하고, 표준물질 및 샘플 대략 100μL를 적당한 웰에 분배했다. 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 이후, 플레이트를 0.05% PBS-Tween 20(즉, 세척 버퍼)로 세척했다. 다음에, (1μg/μL의 농도로 복원된) 3-2 항-FAM19A5 마우스 IgG2a 항체를 PBS 중의 1% BSA로 1:2000의 비율로 희석했다. 이 희석된 항체 대략 1μL를 각 웰에 첨가했고, 플레이트를 실온에서 추가로 2시간 더 인큐베이션했다. 세척 버퍼로 추가 세척 후, 당나귀 a-마우스 IgG 항체(Jackson Lab, Cat. 715-035-151, Lot. 122401)(PBS 중의 1% BSA로 1:5000 희석)에 콘쥬게이트된 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 대략 100μL를 웰에 첨가했다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 버퍼로 세척하고, 1-STEP™ Ultra TMB-ELISA 기질 용액(Pierce, Cat. 34028, Lot. QJ20436540) 대략 1μL를 각 웰에 첨가했다. 10분 인큐베이션 후, 1N H2SO4(황산) 대략 100μL를 웰에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 96-웰 마이크로플레이트 리더(Molecular Device, Versa Max)를 사용하여 450nm의 파장에서 흡광도를 측정했다.
도 10에 도시된 대로, 간경변을 가진 환자는 FAM19A5 단백질 수준이 정상적인 건강한 개체의 혈청에서 관찰된 것보다 대략 2-6배 더 높았다. 이러한 데이터는 상기 설명된 동물 연구와 일치하며, FAM19A5 단백질의 혈청 농도가 간경변에 대한 이상적인 진단 마커일 수 있음을 시사한다.
실시예 13: 심근경색에 대한 효과의 분석
심근경색 동안 일어나는 허혈성 세포 사멸은 회복 반응을 초래하며, 이때 손상된 조직이 섬유증성 흉터로 대체된다. 주변 조직의 재형성(예를 들어, 좌심실 벽 얇아짐 및 심실 팽창)이 뒤따르고, 결국 심장 기능이 손상된다(Talman et al., Cell Tissue Res 365(3):563-581 (2016); Firth et al., Cardiovasc Drugs Ther 4:1363-1374 (1990) 참조). 심근경색에 대한 항-FAM19A5 항체의 효과를 평가하기 위해 마우스 허혈 재관류 모델을 사용했다. 간단히 말해서, Balb/cAnNCrljOri 마우스(6주령, 수컷)(Orient Bio Inc., 대한민국 서울)를 구입했고, 대략 1주일 동안 특수한 병원균-무함유(SPF) 조건에 가두었다. 이후, 마우스를 Zoletil 50(VIRBAC, 프랑스)과 자일라진(Rompun®, Bayer AG, 독일)으로 깊이 마취했다. 마취 후, 개방개흉술을 마우스에 수행하여 관상동맥을 노출하고, 7-0 봉합사와 PE20 튜브를 사용해서 동맥을 결찰하여 심근경색을 유도했다. 공기 삽관 후 벤틸레이터에 기관내 관을 연결하여 마우스의 호흡을 강제로 유지했다. 허혈 상태를 40분간 유지했고, PE20 튜브를 제거하여 혈액을 재관류시켰다. 심근경색 유도 후 3일째에 항-FAM19A5 항체(1-65, 3-2, 또는 1-28 항체)를 정맥내 주사를 통해서 마우스에 투여했으며, 매주 간격으로 총 3회 주사했다. 나이브(즉, 건강한) 마우스와 NHI 마우스를 대조군으로 사용했다.
심근경색 유도 후 21일째에 마우스를 죽이고 심장을 수거했다. 심장 조직을 10% 포르말린 용액에 고정했다. 다음에, 고정된 조직을 정상부 근처에서 2mm 두께로 횡 방향으로 슬라이스해서 파라핀 블록에 넣고, 5μm 절편으로 더 슬라이스해서 유리 조직 슬라이드 위에 장착하고 분석했다. 심장 조직 샘플에 대해 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행하여 심근경색-관련 조직 재형성에 대한 각 항-FAM19A5 항체(즉, 1-65, 3-2, 및 1-28 항체)의 효과를 평가했다.
예상된 대로, NHI 대조군 그룹으로부터의 심장 조직은 좌심실의 유의한 팽창과 좌심실 벽의 얇아짐을 나타냈다(도 11("NHI") 참조). 반면, 항-FAM19A5 항체를 받은 마우스로부터의 심장 조직은 나이브("건강한") 동물로부터의 심장 조직과 비슷했다(즉, 감소된 좌심실 팽창 및 좌심실 벽 조직의 보존).
이 효과를 확인하기 위해, 콜라겐을 염색시키는 메이슨 트리크롬 염색을 심장 조직 절편에 대해 수행했다. 앞서 주지된 대로, 콜라겐은 세포외 바탕질(ECM)의 주요 성분이므로, 조직 샘플에서 증가된 콜라겐 축적부의 메이슨 트리크롬 염색은 섬유증의 정확한 지표일 수 있다. 광학 현미경(Olympus BX53, 일본)을 사용하여 염색된 슬라이드를 촬영했고, 전체 좌심실 영역에 대한 섬유성 영역의 비율을 이미지 분석장치를 사용하여 계산했다.
도 12A에 도시된 대로, 항-FAM19A5 항체(1-65, 3- 2, 및 1-28)를 받은 마우스는 NHI 대조군 그룹과 비교하여 콜라겐의 축적이 상당히 더 적었다. 항-FAM19A5 항체 치료군 그룹에서는 전체 좌심실 영역의 대략 10-15%가 섬유성 조직으로 이루어졌다(도 12B 참조). 반면, NHI 대조군 그룹의 마우스에서는 섬유성 영역이 전체 좌심실 영역의 대략 20%를 구성했다. 상이한 FAM19A5 항체들 중에서도 1-65 항체가 가장 큰 효과를 가진 것으로 드러났다.
종합하면, 상기 결과는 심근경색 직후 FAM19A5 항체의 투여가 조직 재형성 및 섬유증 형성을 크게 개선할 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 14: 사람 간암 환자 분석
간 섬유증과 간경변은 간암의 주 위험 인자이다. 사람 간암 환자에서 암성 조직 주변에 간경변과 유사한 섬유증이 흔히 발생한다. 따라서, 간암에서 FAM19A5 발현을 평가하기 위해, 면역조직화학을 사용하여 사람 간 생검에서 FAM19A5 단백질 발현을 측정했다. 간단히 말해서, 다양한 정도의 섬유증(즉, 단계 #0 내지 단계 #4)을 가진 간암 환자로부터 간 샘플을 획득했다. 조직 샘플을 항-FAM19A5 항체로 면역염색한 다음, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 대조염색했다.
도 13에 도시된 대로, 단계 #0 환자와 비교하여 단계 #2 및 단계 #4 암 환자의 간 조직에는 FAM19A5 단백질 발현에 유의한 증가가 있었다. 증가된 FAM19A5 발현은 흉터 형성 영역 주변과 간 성상세포에 주로 집중되었다. FAM19A5 발현의 증가는 질환 진행과도 상관이 있었는데, 단계 #2 간 조직과 비교하여 단계 #4 간 조직은 훨씬 더 높은 수준의 FAM19A5를 발현했다. 종합하면, 이 데이터는 FAM19A5가 사람 간암에서도 중요한 역할을 한다는 것을 증명한다.
실시예 15: 간암 이종이식편 모델에서 항-FAM19A5 항체 투여의 효능 분석
사람 간암에 대한 항-FAM19A5 항체의 항종양 효능을 평가하기 위해 간암의 이종이식편 마우스 모델을 사용했다. 간단히 말해서, 누드 마우스를 구입했고, 특수한 병원균-무함유(SPF) 조건에 가두었다. 대략 1주일의 적응 기간 후, Hep3B 세포 및/또는 사람 간 성상세포(HHSteC)를 동물에 피하 주사했다. 이를 위해, 세포를 먼저 트립신으로 처리해서 단일 세포 현탁액을 제조했다. 다음에, 세포를 세척하고, 대략 5 x 106의 Hep3B 및/또는 0.4 x 106의 HHSteC 세포를 DMEM 배지 100uL에 재현탁했다. 다음에, 인슐린 주사기를 사용하여 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 세포를 피하 주사했다. 주사 후 약 3주째에 종양 형성에 대해 동물을 관찰했다.
종양 형성시(주사 후 약 3주), 정상 사람 면역글로불린(NHI, 대조군) 또는 3-2 사람 IgG1 항-FAM19A5 항체(2.5mg/kg) 중 어느 하나를 동물에 정맥내 주사했다. 동물은 총 3주 동안 주 1회 항체를 받았다. 체중과 종양 크기를 매주 평가했다. 접종 후 42일째에 동물을 죽이고 종양을 분석했다.
도 14A에 도시된 대로, 모든 상이한 그룹에서 동물은 실험 기간 내내 유사한 체중을 가졌다. 도 14B-14D에 도시된 대로, 항-FAM19A5 항체의 투여는 단지 Hep3B 세포만 접종된 동물에 대해 최소한의 항-종양 효과를 가졌다(즉, "Hep3B + NHI" 및 "Hep3B + FAM19A5 Ab"). 그러나, Hep3B 세포와 HHSteC가 둘 다 접종된 동물에서는 항-FAM19A5 항체의 투여가 종양 크기/중량의 유의한 감소를 가져왔다(즉, "Hep3B + HHSteC + NHI" v. "Hep3B + HHSteC + FAM19A5 Ab"). 이러한 데이터는 종양 미소환경에서 간세포성 간 성상세포와 항-FAM19A5 항체의 상호작용이 간암을 치료할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 16: 외상성 뇌 손상 후 항-FAM19A5 항체 투여의 효과
외상성 뇌 손상에 대한 본 발명에서 개시된 항-FAM19A5 항체의 효과를 평가하기 위해 외상성 뇌 손상(TBI) 모델을 사용했다. 간단히 말해서, C57BL/6 성체 수컷 마우스(8-9주령)를 이소플루란으로 깊이 마취했다. 1분간 두개관 위에 (액체 질소를 사용하여 미리 차게 한) 철 막대를 놓아서 극저온 TBI를 수행했다. 다음에, 마우스의 피부를 봉합하고, 정상 마우스와 동일한 방식으로 가두었다(Moon et al., Neuro Report 22: 304-308 (2011) 참조). TBI 유도 후 대략 1일째에 포스페이트-완충 식염수(PBS)에 희석된 상이한 항-FAM19A5 항체들(1-65(2/4); 1-28; 2-13; 및 3-2) 100μg을 동물에 정맥내 투여했다.
TBI 유도 후 5일(TBI5D)째에 동물을 죽였고, PBS 중의 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 관류시키고 뇌 조직을 수거했다. 수거된 뇌 조직을 추가로 24시간 동안 4% PFA 용액에 더 고정시켰다. 다음에, 뇌 조직을 30% 수크로오스에서 한랭보호하고, 크라이오스탯에서 연속 절편화하고(40μm), 사용할 때까지 -20℃에서 50% 글리세롤/50% PBS 중에 보관했다.
신경아교증과 관련된 반응성 성상교세포(네스틴 및 GFAP 발현에 대해 양성)를 염색시키기 위해, 뇌 조직 절편을 30분간 PBS 중의 3% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.1% Triton X-100으로 차단시켰다. 다음에, 1차 항체를 4℃에서 하룻밤 절편과 함께 인큐베이션했다. 이 연구에 사용된 1차 항체는 마우스 항-네스틴(Millipore, Billerica, 미국 메사츄세츠) 및 토끼 항-GFAP(Dako, Carpinteria, 미국 캘리포니아)였다. PBS로 몇 번 세척한 후, 적절한 2차 항체를 30분간 적용했다. Hoechst 33342(Invitrogen, Carlsbad, 미국 캘리포니아)로 핵을 표지했다. 이어서, 절편을 세척했고, 형광 또는 공초점 현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 아래에 장착하고 관찰했다.
효과를 정량하기 위해, 먼저 각 이미지에서 GFAP-음성 영역의 ROI(관심 영역)을 특정한 다음, 상응하는 ROI의 면적(μm2, A)을 LAS AF lite 소프트웨어(Leica Microsystem CMS GmbH, Mannheim, 독일)를 사용하여 계산했다. 또한, 반영과 접하고 있는 손상 심부 경계선의 측면 길이(μm, B)를 동일한 소프트웨어로 측정했다. A/B의 값은 병소 심부로부터의 평균 길이를 나타낸다(A/B, μm).
도 15A 및 15B에 도시된 대로, 1-28, 2-13, 및 3-2 항-FAM19A5 항체는 외상성 뇌 손상 후 반영 영역에서 반응성 신경아교증의 개시를 유사하게 감소, 반전, 및/또는 예방했다. 전체적인 효과는 1-65 항-FAM19A5 항체와 유사했으며, 이 항체는 외상성 뇌 손상 후 반응성 성상교세포의 생성을 유의하게 약화시킨다고 이미 제시되었던 항체이다(미국특허 No. 9,579,398 참조). 1-65 항체와 상이한 에피토프에서 FAM19A5 단백질이 결합함에도 불구하고, 1-28, 2- 13, 및 3-2 항체는 외상성 뇌 손상 후 투여되었을 때 효과적이었다.
실시예 17: 마우스 교모세포종 셀라인 GL-261 암세포에서 FAM19A5 항체의 항암 효과의 평가
교모세포종 모델을 유도하기 위해, 4주령 C57BL/6 마우스의 머리를 뇌 고정장치에 고정하고, GL-261 세포(1 x 105 세포/5μL)를 두개내 주사하여(두개내 주사 부위: 정수리점까지 전방 0.2mm, 정중선까지 측면 2.2mm, 두개골에서부터 미상-피각의 중앙 쪽으로 깊이 3.5mm) 교모세포종을 유도했다(도 16A). 사람 IgG(음성 대조군)와 항-FAM19A5 항체를 각각 각 동물에 GL-261 접종 후 7일째에 정맥내 주사했다. 각 마우스는 사람 IgG 대조군 항체 또는 항-FAM19A5 항체 중 어느 하나를 2.5 mg/kg의 용량으로 주 1회 3번 투여 받았다(도 16A).
GL-261 접종 후 23일째부터 사망이 발생하기 시작했으며, 모든 생존한 마우스를 죽이고 뇌를 제거해서 4% 파라포름알데하이드를 함유하는 포스페이트 완충 식염수로 고정시켰다. 뇌 조직에서 종양의 크기를 측정하기 위해 다음의 3가지 분석 방법을 사용했다: 1. 조직 정화(CLARITY)(도 16B), 2. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(도 17A 및 17B), 및 3. Hoechst 핵 염색(도 18A-18D).
(1) 조직 투명성을 확보하기 위해, 분석 조직을 먼저 하이드로겔 모노머 용액(A4P0)에 담그고 1일 동안 4℃에 보관해서 조직 전체에 하이드로겔이 침투하도록 했다. 이후, 온도를 37℃로 상승시켜 중합을 유도해서 망상형 구조를 형성했다. 다음에, 전기영동 조직 투명화(ETC)를 사용하여 조직에서 지질을 제거했다. 제조된 조직을 라이트박스에 넣었다. 상대적으로 불투명한 조직의 표면을 종양 표면으로 간주했고, 스케일 바를 사용하여 대략적인 종양 질량을 측정했다.
(2) 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E 염색)은 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드를 함유하는 포스페이트 완충 식염수로 고정한 다음, 30% 수크로오스를 함유하는 포스페이트-완충 식염수에 24시간 동안 더 현탁시켰다. 다음에, 조직을 뇌 조직용 성형틀에 넣고, 30% 당 용액을 함유하는 OCT 화합물을 드라이아이스 위에서 동결시키고, 크라이오스탯 마이크로톰(Leica)을 사용하여 뇌 조직을 30μm로 얇게 절단했다.
H&E 염색 완료 후, 슬라이드 스캐너(Carl Zeiss/AxioScanZ)를 통해서 제조된 견본의 이미지를 획득했고, ZEN 현미경 및 이미징 소프트웨어(Zeiss)를 사용하여 종양의 경계 표면을 임의로 특정해서 종양의 표면적 값을 획득했다.
(3) Hoechst 염색을 위해 얇게 절단된 조직을 Hoechst-함유 포스페이트 완충 식염수(1:2000)로 30분간 처리했다. 공초점 현미경(Leica)을 사용하여 제조된 견본의 형광 이미지를 획득했고, IMARIS 3D 소프트웨어(Bitplane)를 사용하여 종양 경계를 결정해서 종양의 부피와 종양 내 세포수를 획득했다.
도 16B, 17A, 17B, 및 18A-18D에 도시된 대로, 각 마우스의 종양 크기의 측정은 3가지 실험 방법에서 모두 사람 IgG-치료된 그룹과 비교하여 항-FAM19A5 항체-치료된 그룹에서 교모세포종의 크기가 유의하게 감소했음을 드러냈다.
실시예 18: 교모세포종 마우스 모델에서 FAM19A5 항체 치료 후 혈관 정상화의 촉진
교모세포종-유도 마우스 모델(실시예 17 참조)을 죽여서 획득한 뇌를 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드를 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 고정한 다음, 30% 수크로오스를 함유하는 PBS에서 24시간 동안 더 침윤시켰다. 다음에, 뇌를 뇌 조직용 성형틀에 넣고, 30% 당 용액을 함유하는 OCT 화합물과 함께 드라이아이스 위에서 동결시켰다. 다음에, 동결된 뇌를 크라이오스탯 마이크로톰을 사용하여 30μm로 얇게 절단했다. 면역조직화학을 수행하여 교모세포종-유도 마우스의 뇌에서 CD31 단백질(혈관 내피세포에 대한 마커)의 발현 패턴을 결정했다. 공초점 현미경(Leica)을 사용하여 제조된 견본의 형광 이미지를 획득했다.
비슷한 표면적을 시험했을 때(도 19A, 흰색 점으로 경계표시), 대조군 그룹에서는 혈관의 수와 그것의 연결성이 매우 불량했지만(도 19A, 왼쪽 칼럼), 항-FAM19A5 항체-치료된 그룹에서는 혈관의 수와 그것의 연결성이 상대적으로 높았다(도 19A, 오른쪽 칼럼). 이와 관련하여 도 19A의 대표 영역을 더 크게 확대한 도 19B를 참조한다.
상기 결과는 항-FAM19A5 항체 치료가 혈관 정상화를 촉진할 수 있고, 교모세포종의 치료를 용이하게 할 수 있다는 것을 시사했다.
실시예 19: 교모세포종의 마우스 모델에서 FAM19A5 항체 치료 후 면역세포의 분포 차이
교모세포종-유도 마우스 모델(실시예 17 참조)로부터 분리된 뇌를 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드를 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 고정한 다음, 30% 수크로오스를 함유하는 PBS에서 24시간 동안 더 투과시켰다. 다음에, 뇌를 뇌 조직용 성형틀에 넣고, 30% 당 용액을 함유하는 OCT 화합물과 함께 드라이아이스 위에서 동결시켰다. 다음에, 동결된 뇌를 크라이오스탯 마이크로톰을 사용하여 30μm로 얇게 절단했다. GFAP(성상교세포 마커) 및 Iba-1(대식세포 마커)에 대해 면역조직화학을 수행하여 교모세포종에서 성상교세포와 대식세포의 분포를 관찰했다.
대조군 그룹에서는 교모세포종에서 성상교세포가 관찰되지 않았지만,FAM19A5 항체-치료된 그룹에서는 이 종양에서 상대적으로 많은 수의 성상교세포가 유지되었다. 종양의 성상교세포는 주변 뉴런이나 뉴런의 세포외 환경에 대해 긍정적인 효과를 가질 것으로 기대된다. 더욱이, 교모세포종에서 대식세포 침윤 수준의 분석은 음성 대조군인 사람 IgG-치료된 그룹과 비교하여 항-FAM19A5 항체-치료된 그룹에서 대식세포 침윤이 극적으로 증가했음을 제시했다(도 20A 및 20B).
이들 결과는 항-FAM19A5 항체 치료가 또한 교모세포종으로 대식세포의 침윤을 촉진할 수 있고, 교모세포종의 치료를 용이하게 할 수 있다는 것을 시사했다.
실시예 20: C6 종양 세포를 사용한 래트 신경교종 모델에서 FAM19A5 항체의 항암 효능의 평가
동일유전자 래트 신경교종 모델을 유도하기 위해, 1.8 x 105/1μL의 C6 종양 세포를 뇌 고정장치 프레임을 사용하여 두개내 주사에 의해 수컷 Wistar 래트에 접종했다. 종양 접종 후 7일째부터 각 래트에 사람 IgG(음성 대조군) 항체 또는 항-FAM19A5 항체를 2.5mg/kg의 용량으로 3일마다 2회 정맥내 투여했다. 각 래트의 접종된 종양의 크기, 위치 및 정성적 결과를 분석하기 위해 종양 세포 접종 후 7일째에 2-3일 간격으로 MRI 스캔 이미지를 촬영했다.
T2-가중 이미지 스캔은 접종된 종양의 위치, 크기 등에 대해 시각적이며 정성적인 평가를 제공하는 기본적인 형태 분석이다. 종양 조직 내부의 유체 함량을 나타내는데 사용되는 R2 맵핑 분석은 종양 내부 부종 부피의 시각적 확인을 가능하게 한다. 전체 혈류를 검출하는데 사용되는 영상 분석 방법을 사용하여 고 분자량 T2 조영제 MION(크기: 20±5nm, 용량: 5mg/kg)의 주사 전후 R2* 값의 변화를 도출했으며, delR2* 맵핑을 통해 CBV(뇌 혈액 부피)를 계산했다. R2의 변량에 의해 CBV(뇌 혈액 부피) 값을 도출했고, 이것을 사용하여 뇌 조직에서 일반 혈액 부피를 시각적으로 분석했다. 증진 비율(EnhRate) 및 곡선 아래 면적(AUC)이 조직 투과성 검출에 대한 대표 변수였다.
이미지 스캔 결과(도 21)에 도시된 대로, T2-가중 이미지는 사람 IgG 항체(음성 대조군)와 비교하여 항-FAM19A5 항체 투여가 종양의 성장을 효과적으로 억제했음을 제시했다. 항-FAM19A5 항체 투여된 동물의 R2 맵핑 결과는 사람 IgG(음성 대조군) 치료된 동물과 비교했을 때 종양에서 괴사 영역이 감소하고, 그 결과 종양의 심부에서 물 함량이 감소했음을 나타냈다. CBV 분석 결과는 사람 IgG(음성 대조군) 치료된 동물과 비교하여 항-FAM19A5 항체 투여된 동물에서 종양 조직 내부에 상대적으로 큰 혈액 부피를 보였으며, 이것은 종양 조직 내부에서 혈류 속도의 증진을 증명했다. 마지막으로, 종양 조직 투과성의 평가는 사람 IgG(음성 대조군) 치료된 동물과 비교하여 항-FAM19A5 항체 투여된 동물에서 투과성의 감소를 나타냈다. "IAUC30"은 30초일 때의 초기 곡선 아래 면적을 나타낸다.
사람 IgG로 치료된 음성 대조군 그룹과 비교하여 항-FAM19A5 항체로 치료된 래트 신경교종 C6 종양 세포 모델로부터의 이런 발견들은 괴사 영역의 감소와 그에 따른 부종의 호전을 제시한다. 효과적인 종양 성장 억제는 종양 세포 투과성의 감소 및 혈류 속도의 개선에 의해 일어났다.
실시예 21: GL261 종양 세포를 사용한 마우스 뇌암 모델에서 항-FAM19A5 항체의 항암 효능의 평가
항-FAM19A5 항체의 항암 효과를 더 평가하기 위해, GL261 Red-FLuc 세포를 사용하여 마우스에서 뇌암을 유도했다. 간단히 말해서, GL261 Red-FLuc 세포(3 x 105)를 C57BL/6 마우스의 뇌에 주사했다(제0일). 다음에, 주사 후 3일째에 마우스에 사람 IgG(Sigma, cat.# 14506) 또는 항-FAM19A5 항체(3-2 클론, Lot # 171123) 중 하나를 정맥내 투여했다. 항체는 5mg/kg의 용량으로 총 4주 동안 주 1회 투여했다. 마지막 항체 투여(제24일) 후, 모든 동물이 죽을 때까지 생존에 대해 마우스를 모니터링했다.
도 22에 도시된 대로, 사람 IgG 그룹에서는 마지막 마우스가 GL261 세포 주사 후 28일째에 죽었다. 반면, 항-FAM19A5 항체로 치료된 동물에서는 마지막 마우스가 1주 더 늦게 죽었다(즉, GL261 세포 주사 후 35일째). 이 결과는 항-FAM19A5 항체가 뇌암을 가진 동물에서 생존을 증진시킬 수 있다는 것을 증명함으로써 항-FAM19A5 항체의 항암 효능을 더 확인시켜 주었다.
발명의 내용 및 요약서 부분을 제외한 상세한 설명 부분이 청구항을 해석하는데 사용될 수 있다는 것이 인정되어야 한다. 발명의 내용 및 요약서 부분은 본 발명자(들)에 의해 고찰된 본 발명의 예시적인 구체예를 전부는 아니지만 하나 이상을 제시할 수 있으며, 따라서 본 발명 및 첨부된 청구항을 어떤 식으로도 제한하지 않는다.
본 발명은 명시된 기능 및 이들의 관계의 구현을 예시하는 기능적 구성요소의 도움을 받아 상기 설명되었다. 이들 기능적 구성요소의 구분은 설명의 편의를 위해 임의로 규정되었다. 명시된 기능 및 이들의 관계가 적절히 수행되는 한 다른 방식으로 구분될 수도 있다.
특정한 구체예들에 대한 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 성격을 충분히 드러낼 것이며, 제3자는 당업계의 지식을 적용함으로써 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않고 부당한 실험 없이 이러한 특정한 구체예들을 다양한 용도에 맞게 쉽게 변형 및/또는 개조할 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 개조 및 변형은 본 발명에서 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 구체예들의 등가물의 의미와 범위 내에 있어야 한다. 본 발명에서 사용된 문구 또는 용어는 제한이 아닌 설명의 목적을 위한 것임이 이해되어야 하며, 본 명세서의 용어 또는 문구는 상기 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 한다.
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<110> NEURACLE SCIENCE CO., LTD. SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> ANTI-FAM19A5 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 3763.005PC02/C-K/DKC <150> 62/525,635 <151> 2017-06-27 <150> 62,582,887 <151> 2017-11-07 <160> 200 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Met Ala Pro Ser Pro Arg Thr Gly Ser Arg Gln Asp Ala Thr Ala Leu 1 5 10 15 Pro Ser Met Ser Ser Thr Phe Trp Ala Phe Met Ile Leu Ala Ser Leu 20 25 30 Leu Ile Ala Tyr Cys Ser Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val 35 40 45 Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln 50 55 60 Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg 65 70 75 80 Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp 85 90 95 Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile 100 105 110 Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr 115 120 125 Thr Thr Val Ser 130 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Gln Leu Leu Lys Ala Leu Trp Ala Leu Ala Gly Ala Ala 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Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 192 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13F7 LC <400> 192 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Arg Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 193 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 15A9 LC <400> 193 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ser Ala Ser Ile Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 194 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-A03 LC <400> 194 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser 85 90 95 Thr Gly Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 195 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-A08 LC <400> 195 Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Gln Val Asn Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Ser Leu Thr Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ser Arg Ser Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Gly Ser Gly Ser Asn 85 90 95 Tyr Gln Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Arg Ser 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 196 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-F02 LC <400> 196 Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 197 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-A01 LC <400> 197 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Thr Tyr Ser Ser 85 90 95 Thr Gly Thr His Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 198 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-A03 LC <400> 198 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Ala Tyr Asp Pro Ala 85 90 95 Ala Tyr Val Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu 100 105 110 Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 199 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-F07 LC <400> 199 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 200 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-F11 LC <400> 200 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile 100 105 110 Leu Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220

Claims (17)

  1. 서열 유사성 19를 가진 사람 패밀리, 멤버 A5("FAM19A5") 단백질에 특이적으로 결합하며, 하기의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 분리된 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분("항-FAM19A5 항체")으로서,
    (i) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (iii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는, 항-FAM19A5 항체.
  2. SEQ ID NO: 6(TLDRDSSQPRRTIARQTARC) 또는 7(TARCACRKGQIAGTTRARPA)의 서열 유사성 19를 가진 사람 패밀리, 멤버 A5 (FAM19A5) 에피토프로서, 상기 에피토프는 (i) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 또는 SEQ ID NO: 38을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 (ii) SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 또는 SEQ ID NO: 42를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 기준 항체에 특이적으로 결합될 수 있는, FAM19A5 에피토프.
  3. 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO: 6인, FAM19A5 에피토프.
  4. 제 3 항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 (i) 46 내지 51(즉, DSSQPR), (ii) 46, 50 및 52(즉, D---P-R), 또는 (iii) 46, 47, 48 및 50(즉, DSS-P)에 해당하는 FAM19A5 에피토프.
  5. 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO: 7인, FAM19A5 에피토프.
  6. 제 2 항에 있어서, EP2, EP4, 또는 EP8로 확인된 FAM19A5 에피토프로서, EP2는 아미노산 DSSQP(SEQ ID NO: 66)를 포함하고, EP4는 아미노산 ARCACRK(SEQ ID NO: 68)를 포함하고, EP8은 아미노산 TCTQPGGR(SEQ ID NO: 72)을 포함하는 것을 특징으로 하는 FAM19A5 에피토프.
  7. 제 3 항의 FAM19A5 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체로서, 상기 항-FAM19A5 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는, 항-FAM19A5 항체.
  8. 제 1 항에 있어서, (i) SEQ ID NO: 35를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 39를 포함하는 경쇄 가변 도메인; (ii) SEQ ID NO: 36을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 40을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 (iii) SEQ ID NO: 38을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 42를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체.
  9. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 또는 SEQ ID NO: 38로 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 또는 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, 또는 SEQ ID NO: 42로 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체.
  10. 제 1 항에 있어서, 키메라 항체, 사람 항체, 또는 사람화 항체인 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 (i) SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, 또는 SEQ ID NO: 60을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, 또는 SEQ ID NO: 64를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체.
  12. 제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체:
    (a) 섬유증의 감소, 반전, 지연 또는 예방;
    (b) 과도한 세포외 바탕질(ECM) 형성의 감소;
    (c) 종양의 성장 또는 진행의 지연;
    (d) 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 가용성 사람 FAM19A5에 결합;
    (e) ELISA에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 막 결합 사람 FAM19A5에 결합;
    (f) 반응성 신경아교증 개시의 감소, 반전, 지연 또는 예방;
    (g) 반응성 성상교세포의 과도한 증식의 억제;
    (h) 뉴로칸 및 뉴런-글리아 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 발현의 감소;
    (i) 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK 발현의 증가;
    (j) 뉴런의 생존 촉진;
    (k) 뉴런에서 GAP43 발현의 증가; 및
    (l) 축삭돌기 재성장의 촉진.
  13. 삭제
  14. 제 1 항 또는 제 7 항의 항-FAM19A5 항체 또는 제 2 항의 에피토프를 암호화하는 핵산.
  15. 제 1 항 또는 제 7 항의 항-FAM19A5 항체 및 담체를 포함하는 뇌암의 치료용 제약학적 조성물.
  16. 뇌암을 치료하기 위한 제 1 항 또는 제 7 항의 항-FAM19A5 항체.
  17. 제 1 항 또는 제 7 항의 항-FAM19A5 항체와 대상의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는, 치료 필요가 있는 대상으로부터의 샘플에서 FAM19A5의 수준을 측정하는 방법.
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KR20220031738A (ko) 2017-06-27 2022-03-11 주식회사 뉴라클사이언스 암 치료를 위한 항-fam19a5 항체의 용도
US11746149B2 (en) 2017-06-27 2023-09-05 Neuracle Science Co., Ltd. Use of anti-family with sequence similarity 19, member A5 antibodies for the treatment of glaucoma
EP3645039A4 (en) * 2017-06-27 2021-05-05 Neuracle Science Co., Ltd USE OF ANTI-FAM19A5 ANTIBODIES TO TREAT FIBROSIS
CN111315774B (zh) 2017-06-27 2023-12-22 纽洛可科学有限公司 抗fam19a5抗体及其用途
KR20240060864A (ko) * 2018-04-24 2024-05-08 주식회사 뉴라클사이언스 신경병성 통증의 치료를 위한 서열 유사성 19, 멤버 a5 항체를 갖는 항-패밀리의 용도
WO2020136603A1 (en) * 2018-12-27 2020-07-02 Neuracle Science Co., Ltd. Use of anti-fam19a5 antibodies for treating atherosclerosis
US20220144932A1 (en) * 2019-01-02 2022-05-12 Neuracle Science Co., Ltd. Anti-family with sequence similarity 19, member a5 antibodies and method of use thereof
JP2023516992A (ja) * 2020-03-02 2023-04-21 ニューラクル サイエンス カンパニー リミテッド 中枢神経系疾患を治療するための抗－ｆａｍ１９ａ１拮抗剤の用途
WO2022210783A1 (ja) 2021-03-30 2022-10-06 学校法人日本医科大学 甲状腺濾胞癌特異的マーカー

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120261568A1 (en) 2011-04-04 2012-10-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Precursor selection using an artificial intelligence algorithm increases proteomic sample coverage and reproducibility
US20150118230A1 (en) 2012-02-15 2015-04-30 Korea University Research And Business Foundation Pharmaceutical Use of FAM19A5 Involved in Regulating Gliogenesis

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US5585112A (en) 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
IT1246382B (it) 1990-04-17 1994-11-18 Eurand Int Metodo per la cessione mirata e controllata di farmaci nell'intestino e particolarmente nel colon
US5543390A (en) 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US6010715A (en) 1992-04-01 2000-01-04 Bertek, Inc. Transdermal patch incorporating a polymer film incorporated with an active agent
US6024975A (en) 1992-04-08 2000-02-15 Americare International Diagnostics, Inc. Method of transdermally administering high molecular weight drugs with a polymer skin enhancer
US6274552B1 (en) 1993-03-18 2001-08-14 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for delivery of biologically-active factors
US5985307A (en) 1993-04-14 1999-11-16 Emory University Device and method for non-occlusive localized drug delivery
US5523092A (en) 1993-04-14 1996-06-04 Emory University Device for local drug delivery and methods for using the same
US6004534A (en) 1993-07-23 1999-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Targeted polymerized liposomes for improved drug delivery
US5759542A (en) 1994-08-05 1998-06-02 New England Deaconess Hospital Corporation Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
US5660854A (en) 1994-11-28 1997-08-26 Haynes; Duncan H Drug releasing surgical implant or dressing material
US5983134A (en) 1995-04-23 1999-11-09 Electromagnetic Bracing Systems Inc. Electrophoretic cuff apparatus drug delivery system
US6316652B1 (en) 1995-06-06 2001-11-13 Kosta Steliou Drug mitochondrial targeting agents
US6167301A (en) 1995-08-29 2000-12-26 Flower; Ronald J. Iontophoretic drug delivery device having high-efficiency DC-to-DC energy conversion circuit
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US6039975A (en) 1995-10-17 2000-03-21 Hoffman-La Roche Inc. Colon targeted delivery system
TW345603B (en) 1996-05-29 1998-11-21 Gmundner Fertigteile Gmbh A noise control device for tracks
US5985317A (en) 1996-09-06 1999-11-16 Theratech, Inc. Pressure sensitive adhesive matrix patches for transdermal delivery of salts of pharmaceutical agents
AU722289B2 (en) 1996-10-01 2000-07-27 Aptalis Pharmatech, Inc. Taste-masked microcapsule compositions and methods of manufacture
GB9621680D0 (en) 1996-10-17 1996-12-11 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
WO1998017815A1 (en) 1996-10-17 1998-04-30 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral vectors
GB9622500D0 (en) 1996-10-29 1997-01-08 Oxford Biomedica Ltd Therapeutic gene
US6131570A (en) 1998-06-30 2000-10-17 Aradigm Corporation Temperature controlling device for aerosol drug delivery
US5860957A (en) 1997-02-07 1999-01-19 Sarcos, Inc. Multipathway electronically-controlled drug delivery system
US6120751A (en) 1997-03-21 2000-09-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Charged lipids and uses for the same
US6060082A (en) 1997-04-18 2000-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery
US5948433A (en) 1997-08-21 1999-09-07 Bertek, Inc. Transdermal patch
DE69839179T2 (de) 1997-10-28 2009-02-19 Bando Chemical Industries, Ltd., Kobe Dermatologisches pflaster und verfahren zur herstellung seiner basisschicht
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6048736A (en) 1998-04-29 2000-04-11 Kosak; Kenneth M. Cyclodextrin polymers for carrying and releasing drugs
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
US6256533B1 (en) 1999-06-09 2001-07-03 The Procter & Gamble Company Apparatus and method for using an intracutaneous microneedle array
US6261595B1 (en) 2000-02-29 2001-07-17 Zars, Inc. Transdermal drug patch with attached pocket for controlled heating device
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
GB0306771D0 (en) * 2003-03-24 2003-04-30 Ares Trading Sa Secreted protein family
CA2651376A1 (en) 2005-05-11 2006-11-16 Aarhus Universitet Method for diagnosis and treatment of a mental disease
JP2012515556A (ja) 2009-01-23 2012-07-12 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 低下したエフェクタ機能を有する安定化Ｆｃポリペプチドおよび使用方法
SG188397A1 (en) 2010-09-15 2013-04-30 Almac Diagnostics Ltd Molecular diagnostic test for cancer
CN102775490B (zh) * 2011-05-12 2017-04-12 北京大学 具有趋化活性的分泌蛋白及其应用
US8691231B2 (en) 2011-06-03 2014-04-08 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment of tumors expressing predominantly high affinity EGFR ligands or tumors expressing predominantly low affinity EGFR ligands with monoclonal and oligoclonal anti-EGFR antibodies
EP3027770A1 (en) 2013-08-02 2016-06-08 Université catholique de Louvain Signature of cycling hypoxia and use thereof for the prognosis of cancer
JP6473418B2 (ja) 2013-10-10 2019-02-20 幸成 加藤 抗ポドプラニン抗体
WO2015136469A1 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 Prothena Biosciences Limited Anti-mcam antibodies and associated methods of use
US10806787B2 (en) 2015-02-16 2020-10-20 Pharma Foods International Co., Ltd. Anticancer agents or antimetastatic agents using FSTL1 and combination drug thereof
KR101802411B1 (ko) 2015-02-17 2017-11-29 울산대학교 산학협력단 Ｆａｍ１９ａ５ 단백질을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 비만 치료제의 스크리닝 방법
KR102431830B1 (ko) * 2016-11-07 2022-08-16 주식회사 뉴라클사이언스 서열 유사성을 가진 항-패밀리 19, 멤버 a5 항체 및 그것의 사용 방법
US11746149B2 (en) * 2017-06-27 2023-09-05 Neuracle Science Co., Ltd. Use of anti-family with sequence similarity 19, member A5 antibodies for the treatment of glaucoma
EP3645039A4 (en) * 2017-06-27 2021-05-05 Neuracle Science Co., Ltd USE OF ANTI-FAM19A5 ANTIBODIES TO TREAT FIBROSIS
CN111315774B (zh) 2017-06-27 2023-12-22 纽洛可科学有限公司 抗fam19a5抗体及其用途
KR20220031738A (ko) * 2017-06-27 2022-03-11 주식회사 뉴라클사이언스 암 치료를 위한 항-fam19a5 항체의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120261568A1 (en) 2011-04-04 2012-10-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Precursor selection using an artificial intelligence algorithm increases proteomic sample coverage and reproducibility
US20150118230A1 (en) 2012-02-15 2015-04-30 Korea University Research And Business Foundation Pharmaceutical Use of FAM19A5 Involved in Regulating Gliogenesis

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