CN111315774A - 抗fam19a5抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了特异性结合人FAM19A5的抗体和包括此类抗体的组合物。本文还提供了使用抗FAM19A5抗体治疗纤维化或癌症的方法。

Description

抗FAM19A5抗体及其用途
参照电子提交序列表
与本申请一起提交的ASCII文本文件(名称：3763.005PC02_SeqListing_ST25.txt；大小：166,889字节；和创建日期：2018年6月26日)中的电子提交的序列表的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开提供了特异性结合序列相似家族19成员A5(FAM19A5)的抗体、包括此类抗体的组合物和使用此类抗体预防或治疗受试者中的病症或疾病如纤维化和/或癌症(例如脑肿瘤，例如成胶质细胞瘤)的方法。
背景技术
FAM19A5是蛋白质的TAFA亚家族的成员，其由五个高度同源的小蛋白质构成。TangT.Y.等人，《基因组学(Genomics)》83(4):727-34(2004)。这些蛋白质在固定位置含有保守的半胱氨酸残基，并且与为CC-趋化因子家族成员的巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP-1-α)远缘相关。TAFA蛋白质主要在大脑和脊髓的特定区域表达。据信这些蛋白质是由成年神经干细胞在神经发生过程中产生和分泌的。
FAM19A5主要在脊椎动物的大脑中表达，并且据信FAM19A5在完整中枢神经系统的发育、分化、形成中是重要的，并且可用于预防或治疗中枢神经系统损害和/或疾病。美国专利公开号2015/0118230。
除了调节神经系统，FAM19A5也可在调节免疫细胞中起作用。纤维化是常见的健康问题，经常发生在各种病理过程中，并且特征在于浸润单核免疫细胞，该单核免疫细胞释放刺激成纤维细胞改变结缔组织的细胞因子。因此，需要开发特异性结合FAM19A5且能够调节FAM19A5活性的抗体。
发明内容
本文提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白(“抗FAM19A5抗体”)，并且其与包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体交叉竞争结合人FAM19A5表位，其中：(i)重链CDR1包括SEQ IDNO：11的氨基酸序列，重链CDR2包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列，重链CDR3包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列，轻链CDR1包括SEQ ID NO：23的氨基酸序列，轻链CDR2包括SEQ ID NO：24的氨基酸序列，和轻链CDR3包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列；(ii)重链CDR1包括SEQ IDNO：14的氨基酸序列，重链CDR2包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列，重链CDR3包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列，轻链CDR1包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列，轻链CDR2包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和轻链CDR3包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或(iii)重链CDR1包括SEQ IDNO：20的氨基酸序列，重链CDR2包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，重链CDR3包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列，轻链CDR1包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列，轻链CDR2包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和轻链CDR3包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
本文还提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白(“抗FAM19A5抗体”)，并且其与参考抗体结合相同的FAM19A5表位，所述参考抗体包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：(i)重链CDR1包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列，重链CDR2包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列，重链CDR3包括SEQID NO：13的氨基酸序列，轻链CDR1包括SEQ ID NO：23的氨基酸序列，轻链CDR2包括SEQ IDNO：24的氨基酸序列，和轻链CDR3包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列；(ii)重链CDR1包括SEQID NO：14的氨基酸序列，重链CDR2包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列，重链CDR3包括SEQ IDNO：16的氨基酸序列，轻链CDR1包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列，轻链CDR2包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和轻链CDR3包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或(iii)重链CDR1包括SEQID NO：20的氨基酸序列，重链CDR2包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，重链CDR3包括SEQ IDNO：22的氨基酸序列，轻链CDR1包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列，轻链CDR2包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和轻链CDR3包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体结合至少一个FAM19A5表位，其为SEQID NO：6。在某些实施例中，抗FAM19A5抗体在对应于氨基酸残基(i)46至51(即DSSQPR)、(ii)46、50和52(即D---P-R)或(iii)46、47、48和50(即DSS-P)的一个或多个氨基酸处结合为SEQ ID NO：6的FAM19A5表位。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体结合至少一个为SEQ IDNO：9的FAM19A5表位。在某些实施例中，抗FAM19A5抗体结合至少一个FAM19A5表位，其鉴定为EP2、EP4和/或EP8，其中EP2包括氨基酸DSSQP(SEQ ID NO：66)，其中EP4包括氨基酸ARCACRK(SEQ ID NO：68)，并且其中EP8包括氨基酸TCTQPGGR(SEQ ID NO：72)。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中(i)重链CDR1包括SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20；(ii)重链CDR2包括SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：21；(iii)重链CDR3包括SEQID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：22；(iv)轻链CDR1包括SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：32；(v)轻链CDR2包括SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：33；和/或(vi)轻链CDR3包括SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：34。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包括(i)包括SEQ ID NO：35的重链可变结构域和包括SEQ ID NO：39的轻链可变结构域；(ii)包括SEQ ID NO：36的重链可变结构域和包括SEQ ID NO：40的轻链可变结构域；或(iii)包括SEQ ID NO：38的重链可变结构域和包括SEQID NO：42的轻链可变结构域。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包括与SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，和/或其中轻链可变区包括与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQID NO：42所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包括(i)包括SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQID NO：60的重链；和(ii)包括SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：64的轻链。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包括一种或多种以下性质：(a)减少、逆转、延迟和/或预防纤维化；(b)减少过量细胞外基质(ECM)的形成；(c)延迟肿瘤生长或进展；(d)如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量，以10nM或更小的KD结合可溶性人FAM19A5；(e)如通过ELISA所测量，以10nM或更小的KD结合膜结合性人FAM19A5；(f)减少、逆转、延迟和/或预防反应性神经胶质增生的发作；(g)抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖；(h)降低硫酸软骨素蛋白聚糖包含神经聚糖和神经元-神经胶质抗原2(NG2)的表达；(i)增加神经元细胞核中c-fos和pERK的表达；(j)促进神经元存活；(k)增加神经元中GAP43的表达；和(l)促进轴突的再生长。
本公开还提供了人序列相似家族19成员A5(FAM19A5)表位，其基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO：5、6、9或10至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述表位能够特异性结合参考抗体，所述参考抗体包括(i)包括SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的重链可变结构域，和(ii)包括SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42的轻链可变结构域。
本文还公开了编码本文所述的抗FAM19A5抗体或FAM19A5表位的核酸。还提供了包括本公开的抗FAM19A5抗体或FAM19A5表位的组合物。
在一些方面，本申请还提供了用于治疗脑癌的抗FAM19A5抗体。
在其它方面，本公开提供了诊断有需要的受试者的方法，其包括使受试者的生物样品与本文公开的抗FAM19A5抗体接触。
实施例
实施例1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人序列相似家族19成员A5(FAM19A5)并表现出一种或多种以下性质：
(a)减少、逆转、延迟和/或预防纤维化；
(b)减少过量细胞外基质(ECM)的形成；以及
(c)延迟肿瘤生长或进展。
实施例2.实施例1的单克隆抗体或其抗原结合部分，其还包括一种或多种以下性质：
(d)如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量，以10nM或更小的KD结合可溶性人FAM19A5；
(e)如通过ELISA所测量，以10nM或更小的KD结合膜结合性人FAM19A5；
(f)减少、逆转、延迟和/或预防反应性神经胶质增生的发作；
(g)抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖；
(h)降低硫酸软骨素蛋白聚糖包含神经聚糖和神经元-神经胶质抗原2(NG2)的表达；
(i)增加神经元细胞核中c-fos和pERK的表达；
(j)促进神经元存活；
(k)增加神经元中GAP43的表达；以及
(l)促进轴突的再生长。
实施例3.实施例1或2的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与以下参考抗体交叉竞争结合人FAM19A5表位：(i)包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体，其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ IDNO：23的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：24的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列；(ii)包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体，其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ IDNO：15的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或(iii)包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体，其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
实施例4.实施例1或2的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与以下参考抗体结合相同的FAM19A5表位：(i)包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体，其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：23的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：24的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQID NO：25的氨基酸序列；(ii)包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体，其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQID NO：26的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或(iii)包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体，其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
实施例5.实施例3或4的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合至少一个为SEQ IDNO：6的FAM19A5表位。
实施例6.实施例2至5中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述单克隆抗体或其抗原结合部分仅结合为SEQ ID NO：6的FAM19A5。
实施例7.实施例2至5中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述单克隆抗体或其抗原结合部分还结合另外的FAM19A5表位。
实施例8.实施例7的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述另外的FAM19A5表位选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及其任何组合组成的群组。
实施例9.实施例1至8中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。
实施例10.实施例9的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链CDR1包括SEQID NO：11、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20。
实施例11.实施例9或10的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链CDR2包括SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：21。
实施例12.实施例9至11中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链CDR3包括SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：22。
实施例13.实施例9至12中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：32。
实施例14.实施例9至13中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：33。
实施例15.实施例9至14任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：34。
实施例16.实施例1至15中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括(i)包括SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的重链可变结构域，和(ii)包括SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42的轻链可变结构域。
实施例17.实施例1至16中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括与如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ IDNO：38所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
实施例18.实施例1至17中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ IDNO：42所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
实施例19.实施例1至18中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是单结构域抗体。
实施例20.实施例1至19中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述单克隆抗体选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、其变体或其组合组成的群组。
实施例21.实施例20的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述单克隆抗体是人IgG1抗体。
实施例22.实施例20的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述单克隆抗体包括人IgG2或人IgG4同种型抗体。
实施例23.实施例1至22中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其还包括不具有Fc功能的恒定区。
实施例24.实施例1至23中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
实施例25.实施例1至24中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括(i)包括SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60的重链；和(ii)包括SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：62或SEQ ID NO：64的轻链。
实施例26.实施例1至25中任一项的其抗原结合部分，其中所述其抗原结合部分是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。
实施例27.一种双特异性分子，其包括与具有第二结合部分的分子连接的实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分。
实施例28.一种人序列相似家族19成员A5(FAM19A5)表位，其基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO：5、6、9或10至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述表位能够特异性结合参考抗体，所述参考抗体包括(i)包括SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的重链可变结构域，和(ii)包括SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42的轻链可变结构域。
实施例29.一种核酸，其编码实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例28的表位。
实施例30.一种载体，其包括实施例29的核酸。
实施例31.实施例30的载体，其用于基因疗法。
实施例32.一种细胞，其被实施例30的表达载体转化。
实施例33.一种免疫缀合物，其包括与药剂连接的实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分或实施例27的双特异性分子。
实施例34.一种组合物，其包括(i)实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例33的免疫缀合物，和(ii)载体。
实施例35.一种试剂盒，其包括(i)实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例33的免疫缀合物，和(ii)使用说明书。
实施例36.一种制备抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分的方法，其包括用实施例28的表位免疫非人动物并产生抗体或其抗原结合部分。
实施例37.一种产生抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在合适的条件下培养实施例32的细胞并分离抗体或其抗原结合部分。
实施例38.一种在有需要的受试者中减少、逆转和/或预防纤维化的方法，其包括施用实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例33的免疫缀合物，使得纤维化的发作被延迟。
实施例39.一种减少有需要的受试者的过量细胞外基质(ECM)的形成的方法，其包括向所述受试者施用实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例33的免疫缀合物，其中过量ECM的形成减少。
实施例40.一种预防、改善或治疗有需要的受试者的肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌和/或胰腺癌的方法，其包括向所述受试者施用实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例33的免疫缀合物。
实施例41.实施例40的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌。
实施例42.一种预防、改善或治疗有需要的受试者的与纤维化相关的肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌和/或胰腺癌的方法，其包括向所述受试者施用实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例33的免疫缀合物。
实施例43.实施例38或42的方法，其中所述纤维化包括肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化、胰纤维化、皮肤纤维化、心脏纤维化、动脉纤维化、关节纤维化、乳腺纤维化、肌肉纤维化、腹膜后纤维化、甲状腺纤维化、淋巴结纤维化、膀胱纤维化和/或胸膜纤维化。
实施例44.实施例38至43中任一项的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合部分静脉内、口服、肠胃外、鞘内、脑室内、肺、皮下或心室内施用。
实施例45.实施例38至44中任一项的方法，其中所述受试者是人。
实施例46.一种测量来自有需要的受试者的样品中FAM19A5水平的方法，其包括使实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例33的免疫缀合物与从所述受试者获得的样品接触。
实施例47.实施例46的方法，其中与参考样品相比，所述受试者的样品中FAM19A5的水平增加。
实施例48.一种诊断有需要的受试者的纤维化的方法，其包括使实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例33的免疫缀合物与从所述受试者获得的样品接触。
实施例49.实施例48的方法，其中所述纤维化在肺或肝中。
实施例50.实施例48或49的方法，其中与没有纤维化的受试者的参考样品中FAM19A5的水平相比，所述受试者的样品中FAM19A5的水平增加。
实施例51.一种诊断有需要的受试者的具有纤维化的肿瘤的方法，其包括使实施例1至26中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、实施例27的双特异性分子或实施例33的免疫缀合物与从所述受试者获得的样品接触。
实施例52.实施例51的方法，其中与没有所述肿瘤的受试者的参考样品中FAM19A5的水平相比，所述受试者的样品中FAM19A5的水平提高。
实施例53.实施例46至52中任一项的方法，其中所述样品是血液、血清、血浆、脑脊液、组织活检、器官活检或它们的组合。
实施例54.实施例46至52中任一项的方法，其中所述样品是新鲜肿瘤样品、冷冻肿瘤样品或福尔马林固定石蜡包埋的样品。
实施例55.实施例46至52中任一项的方法，其中所述接触包括进行测定。
实施例56.实施例54的方法，其中所述测定包括Western Blot测定、狭线印迹测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、基于流式细胞术的免疫荧光(FACS)、质谱法、表面等离子体共振(SPR)或其组合。
附图说明
图1显示表位F1至F6(与BSA偶联)的氨基酸序列和它们在人FAM19A5多肽上的位置。不同表位片段的大小在括号内指出。
图2显示抗FAM19A5抗体1-65、2-13和3-2结合的ELISA结果。对于3-2抗体，显示了两种不同的同种型：人IgG1(“h3-2”)和小鼠IgG1(“m3-2”)。对于每种抗体，第1条、第2条、第3条、第4条、第5条和第6条(从左侧开始)分别代表与表位片段F1、F2、F3、F4、F5和F6的结合。最右边的条代表阳性对照(即His标记的FAM19A5蛋白)。在每个条的顶部指示了精确的O.D.值。
图3A至3C显示抗FAM19A5抗体3-2和1-28与十三种不同FAM19A5表位F2片段突变肽结合的ELISA结果：(i)F2-01-BSA(#1)、(ii)F2-02-BSA(#2)、(iii)F2-03-BSA(#3)、(iv)F2-04-BSA(#4)、(v)F2-05-BSA(#5)、(vi)F2-06-BSA(#6)、(vii)F2-07-BSA(#7)、(viii)F2-08-BSA(#8)、(ix)F2-09-BSA(#9)、(x)F2-10-BSA(#10)、(xi)F2-11-BSA(#11)、(xii)F2-12-BSA(#12)和(xiii)F2-13-BSA(#13)。图3A显示具有人IgG1同种型的3-2抗体的结果。图3B显示具有小鼠IgG1同种型的3-2抗体的结果。图3C显示1-28抗体的结果。在每个条的顶部指示了精确的O.D.值。
图4显示FAM19A家族不同成员(即FAM19A1-5)的氨基酸序列比对。成员中具有最大氨基酸多样性的区域被框在框中并显示为EP1至EP8。IgG抗体(“仅IgG”)作为对照显示。y轴提供O.D.值。
图5显示抗FAM19A5抗体1-65、1-28、2-13和3-2与FAM19A5突变体M1至M8结合的ELISA结果。对于每种抗体，八个条对应于突变体M1至M8(从左至右)。
图6A显示用于评估不同抗FAM19A5抗体之间交叉竞争的双位点夹心ELISA测定的示意图。图6B显示六种不同抗FAM19A5抗体：1-65、P2-A03、P2-F11、13B4、2-13和3-2的交叉竞争分析结果。术语“S/N”是指信噪比，其测量如下：[10ng/mL抗原的O.D.]/[0ng/mL抗原的O.D.]。灰色方框显示了交叉竞争(即S/N比低于2)。
图7A和7B显示了几种抗FAM19A5抗体与FAM19A5结合的ELISA结果。显示了以下抗体的结果：1-65、13B4、13F7、1-28、2-13、3-2、P1-A03、P1-A08、P1-D03、P1-F02、P1-G09、P2-A01、P2-A03、P2-C12、P2-F07和P2-F11(从左至右)。图7A显示了不同浓度的抗FAM19A5抗体的条形图结果。图7B显示了不同抗FAM19A5抗体的Kd(nM)。
图8显示具有胆管结扎(BDL)诱导的肝纤维化(“疾病模型”)的大鼠(n＝5)与健康大鼠(“正常”)(n＝3)的血清中FAM19A5蛋白水平的比较。FAM19A5蛋白的水平显示为相对于在正常对照动物中观察到的水平的倍数变化。“*”表示与正常对照动物相比的统计学显著差异(p<0.005)。
图9显示具有气管内注射3mg/kg博来霉素诱导的特发性肺纤维化(“疾病模型”)的大鼠(n＝5)与健康大鼠(“正常”)(n＝5)的血清中FAM19A5蛋白水平的比较。FAM19A5蛋白的水平显示为相对于在正常对照动物中观察到的水平的倍数变化。“*”表示与正常对照动物相比的统计学显著差异(p<0.005)。
图10显示具有确认肝纤维化如肝硬化的人类患者(患者#1-10)和健康个体(正常#1-3)二者的血清中FAM19A5蛋白水平的倍数变化。每个条形图上显示的具体值表示相对于在健康个体血清中检测到的FAM19A5蛋白平均浓度的倍数变化。
图11显示用对照抗体(“NHI”)或抗FAM19A5抗体(“1-65”、“3-2”和“1-28”)处理的心肌梗塞诱导动物中左心室组织的H&E(苏木精和曙红)染色的比较。健康动物(即，没有心肌梗塞诱导，“正常对照”)用作另外的对照。
图12A和12B显示心肌梗塞诱导动物的左心室组织中胶原蛋白积累的比较。心肌梗塞诱导的动物接受对照抗体(“NHI”)或抗FAM19A5抗体(“1-65”、“3-2”和“1-28”)。再次使用健康动物(即，没有心肌梗塞诱导，“正常对照”)作为另外的对照。图12A显示使用Masson三色染色的胶原蛋白积累。图12B显示作为纤维面积与整个左心室面积的比的胶原蛋白积累(即纤维面积)。数据表示为平均值±S.D(n＝5至8/组)。条上的“***/**”表示与“正常对照”组(健康动物)相比的统计学显著差异(分别为p<0.001，p<0.05)。条上的“#”表示与“NHI”组(心肌梗塞诱导+对照抗体)相比的统计学显著差异(p<0.05)。
图13显示来自三个不同肝癌患者的肝活检中FAM19A5蛋白表达的免疫组织化学分析。如所示的，每个患者具有不同程度的纤维化：(i)级#0(左列)，(ii)级#2(中列)，和(iii)级#4(右列)。底行显示从顶行开始的框形区域的更高放大率。箭头指示FAM19A5阳性肝星状细胞的实例。
图14A显示作为时间(接种后的周数)函数的动物体重(克)。一些动物单独用Hep3B细胞接种，并用正常人免疫球蛋白(圆圈，组：“Hep3B+NHI”，n＝3)或抗FAM19A5抗体(封闭框，组：“Hep3B+FAM19A5 Ab”，n＝3)处理。其它动物用Hep3B细胞和人肝星状细胞(HHSteC)接种，并用正常人免疫球蛋白(菱形，组：“Hep3B+HHSteC+NHI”，n＝3)或抗FAM19A5抗体(开放框，组：“Hep3B+HHSteC+FAM19A5 Ab”，n＝3)处理。数据表示为平均值±S.D。
图14B显示作为时间(接种后的周数)函数的在不同组的动物中观察到的平均肿瘤体积。所示的组与上面图14A中描述的那些相同。用以下等式计算肿瘤体积：0.5×长度×宽度2＝肿瘤体积(mm3)。数据表示为平均值±S.D。
图14C和14D分别显示接种后42天，从图14A所述动物分离的肿瘤的照片和重量(克)。在图14C中，(i)左上显示来自“Hep3B+NHI”组(n＝2)的肿瘤；(ii)右上显示来自“Hep3B+HHSteC+NHI”组的肿瘤(n＝2)；(iii)左下显示来自“Hep3B+FAM19A5 Ab”组的肿瘤(n＝3)；和(iv)右下显示来自“Hep3B+HHSteC+FAM19A5 Ab”组(n＝3)的肿瘤。图14D显示从不同组分离的肿瘤的平均重量(g)。
图15A和15B显示抗FAM19A5抗体对创伤性脑损伤后反应性神经胶质增生的作用。图15A提供来自用不同的抗FAM19A5抗体：(i)1-65(2/4)(第1行)；(ii)1-28(第2行)；(iii)2-13(第3行)；和(iv)3-2(第4行)处理的动物脑组织损伤区域的代表性免疫组织化学图像。对脑组织切片的GFAP(胶质原纤维酸性蛋白，绿色)和巢蛋白(红色)染色，已知GFAP和巢蛋白在脑损伤后在反应性星形胶质细胞中被诱导。虚线(白色)表示在暴露于TBI后的病灶边界。图15B提供用1-65、1-28、2-13和3-2抗FAM19A5抗体处理的动物中GFAP和/或巢蛋白阳性星形胶质细胞与TBI病灶中心的平均距离。
图16A提供抗体施用方案和显示将成胶质细胞瘤癌细胞颅内注射到小鼠中的示意图。
图16B显示抗FAM19A5抗体在使用CLARITY的成胶质细胞瘤动物模型中的抗癌作用，其评估了组织样品的透明度。在用人IgG对照抗体(左)或抗FAM19A5抗体(右)处理的动物收获的大脑中，使用虚线表示看起来不透明的肿瘤区域。
图17A和17B显示抗FAM19A5抗体在使用苏木精和曙红(H&E)染色的成胶质细胞瘤动物模型中的抗癌作用。图17A提供来自用对照人IgG抗体(顶行)或抗FAM19A5抗体(底行)处理的动物的脑组织切片的四个代表性H&E染色图。成胶质细胞瘤对应于图像中的变暗区域。图17B通过提供作为对照百分比的数据来量化图17A中所示的数据。黑色条对应于对照组(用人IgG抗体处理)。灰色条对应于抗FAM19A5处理组。沿x轴的数字对应于图17A中所示的代表性图像。
图18A、18B、18C和18D显示抗FAM19A5抗体在使用Hoechst核染色的成胶质细胞瘤动物模型中的抗癌作用。图18A显示来自用对照人IgG抗体(顶行)或抗FAM19A5抗体(底行)处理的动物的四个代表性脑组织切片的图像。以浅灰色显示的区域对应于每个图像中的肿瘤。图18B提供显示在图18A的四个代表性脑组织切片中测量的肿瘤内细胞数目(Hoeschst阳性染色)(“点数量”)和肿瘤体积(“Vol”)的数值的表。图18C(细胞数目)和18D(肿瘤体积)是图18B中所示数据的图解描述。在图18C和18D中，数据都显示为对照动物中观察到的相应值的％。沿x轴的数字对应于来自图18A的代表性脑组织切片。黑色的条对应于用对照人IgG抗体处理的动物。灰色条对应于用抗FAM19A5抗体处理的动物。
图19A和19B显示抗FAM19A5抗体对成胶质细胞瘤小鼠模型中血管正常化的作用。图19A提供从用对照人IgG抗体(左图)或抗FAM19A5抗体(右图)处理的动物分离的大脑的可比较区域内CD31表达(血管标志物)的免疫组织化学分析。图19A中的白色虚线表示成胶质细胞瘤的外边界。图19B提供来自图19A的代表性区域的放大图。
图20A和20B显示抗FAM19A5抗体对成胶质细胞瘤小鼠模型中巨噬细胞浸润入肿瘤的作用。图20A提供用对照IgG抗体(顶部图像)或抗FAM19A5抗体(底部图像)处理的小鼠成胶质细胞瘤中Iba1表达(巨噬细胞标志物)的免疫组织化学图像。图20B比较了在图20A所示的图像中观察到的巨噬细胞的体积。
图21显示用对照人IgG抗体(顶行)或抗FAM19A5抗体(底行)处理的大鼠神经胶质瘤模型的大脑的MRI扫描图像。图像显示肿瘤的各种性质：(i)T2-形态分析；(ii)R2-流体含量；(iii)CBV-脑血容量；(iv)EnhRate(增强率)和IAUC30(30秒时曲线下初始面积)-组织渗透性。肿瘤在图像中由黑色点标记表示。
图22显示抗FAM19A5抗体对小鼠脑癌模型中存活的作用。黑色圆圈代表用人IgG对照抗体处理的动物。白色圆圈代表用抗FAM19A5抗体处理的动物。
具体实施方式
本文公开了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人序列相似家族19成员A5(FAM19A5)并表现出本文公开的一种或多种性质，例如减少、逆转和/或预防纤维化；减少过量细胞外基质(ECM)的形成；延迟肿瘤生长或进展；如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量，以10nM或更小的KD结合可溶性人FAM19A5；如通过ELISA所测量，以10nM或更小的KD结合膜结合性人FAM19A5；减少、逆转、延迟和/或预防反应性神经胶质增生的发作；抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖；降低硫酸软骨素蛋白聚糖包含神经聚糖和神经元-神经胶质抗原2(NG2)的表达；增加神经元细胞核中c-fos和pERK的表达；促进神经元存活；增加神经元中GAP43的表达；和/或促进轴突的再生长。
为了便于理解本文公开的公开内容，定义了多个术语和短语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
I.定义
在本公开中，术语“一”或“一个”实体是指一个或多个该实体；例如，“抗体”应理解为代表一个或多个抗体。因此，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可以互换使用。
此外，“和/或”在本文使用时应被视为两个指定特征或组件中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，在短语如“A和/或B”中使用的术语“和/或”在本文旨在包含“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，在短语如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应当理解，无论本文用语言“包括”描述何种方面，也提供了在术语“由……组成”和/或“基本上由……组成”中描述的类似方面。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如《简明生物医学和分子生物学词典(ConciseDictionary of Biomedicine and Molecular Biology)》第二版，Juo,Pei-Show,2002,CRCPress；《细胞与分子生物学词典(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)》第三版，1999,Academic Press；和《牛津生物化学与分子生物学词典(Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology)》修订版，2000,Oxford University Press为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左到右书写。本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，其可以通过参考说明书整体来获得。因此，下面紧接着定义的术语通过参考说明书整体而更充分地定义。
术语“约”在本文中用于指大约、粗略地、在其周围或在其区域中。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过将边界扩展到所给出的数值之上和之下来修饰该范围。通常，术语“约”可以通过上或下(高于或低于)例如10％的变量将数值修饰为所给出的数值之上和之下。
术语“序列相似家族19成员A5”或“FAM19A5”指属于五种高度同源的蛋白的TAFA家族(也称为FAM19家族)的蛋白，并且主要在大脑和脊髓中表达。FAM19A5也称为TAFA5或趋化因子样蛋白TAFA-5。
在人类中，编码FAM19A5的基因位于染色体22上。存在三种人FAM19A5(UniProt：Q7Z5A7)同种型，其被认为是通过可变剪接产生的：同种型1(UniProt：Q7Z5A7-1)，由132个氨基酸组成；同种型2(UniProt：Q7Z5A7-2)，由125个氨基酸组成；和同种型3(UniProt：Q7Z5A7-3)，由53个氨基酸组成。人FAM19A5蛋白被认为以膜结合和可溶性(分泌)形式存在。同种型1被认为是具有一个跨膜区的膜蛋白。同种型2，其在Tang T.Y.等人，《基因组学(Genomics)》83(4):727-34(2004)中报道作为分泌蛋白(可溶性)，含有在第1位至第25位氨基酸的信号肽。根据EST数据预测同种型3。下面是三种已知的人FAM19A5同种型的氨基酸序列。
(I)同种型1(UniProt：Q7Z5A7-1，跨膜蛋白)：选择该同种型作为规范序列。
MAPSPRTGSR QDATALPSMS STFWAFMILA SLLIAYCSQL AAGTCEIVTL DRDSSQPRRTIARQTARCAC RKGQIAGTTR ARPACVDARI IKTKQWCDML PCLEGEGCDL LINRSGWTCT QPGGRIKTTTVS(SEQ ID NO：1)
(II)同种型2(UniProt：Q7Z5A7-2，可溶性蛋白)：
MQLLKALWAL AGAALCCFLV LVIHAQFLKE GQLAAGTCEI VTLDRDSSQP RRTIARQTARCACRKGQIAG TTRARPACVD ARI IKTKQWC DMLPCLEGEG CDLLINRSGW TCTQPGGRIK TTTVS(SEQID NO：2)
(III)同种型3(UniProt：Q7Z5A7-3)：
MYHHREWPAR IIKTKQWCDM LPCLEGEGCD LLINRSGWTC TQPGGRIKTT TVS(SEQ ID NO：3)
术语“FAM19A5”包含由细胞天然表达的FAM19A5的任何变体或同种型。因此，本文所述的抗体可与相同物种中的不同同种型(例如，人FAM19A5的不同同种型)交叉反应，或与来自非人物种的FAM19A5(例如，小鼠FAM19A5)交叉反应。或者，抗体可对人FAM19A5具有特异性，且不能表现出与其它物种的任何交叉反应性。FAM19A5或其任何变体和同种型可以从天然表达它们的细胞或组织中分离，或者重组产生。编码人FAM19A5的多核苷酸具有GenBank登录号BC039396和以下序列：
表1A.人FAM19A5的多核苷酸序列
Figure BDA0002371731700000161
Figure BDA0002371731700000171
术语“抗体(antibody或antibodies)”是本领域的术语，并且在本文中可互换使用，并且是指具有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本文所用的术语包含完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在一个实施例中，“抗体”指包括通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。在另一实施例中，“抗体”指包括单个可变结构域例如VHH结构域的单链抗体。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。在某些天然存在的抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。在某些天然存在的抗体中，每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。
VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
术语“Kabat编号”和类似术语是本领域公认的，指对抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在某些方面，抗体的CDR可根据Kabat编号系统(参见，例如，Kabat EA和Wu TT(1971)《纽约科学院年鉴(Ann NY Acad Sci)》190:382-391和Kabat EA等人，(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)》第五版，美国卫生与公共服务部，NIH公开号91-3242)确定。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR典型存在于第31位至第35位氨基酸(其任选地可以包含一个或两个另外的氨基酸)、(在35位之后(在Kabat编号方案中称为35A和35B)(CDR1))第50位至第65位氨基酸(CDR2)和第95位至第102位氨基酸(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR典型存在于第24位至第34位氨基酸(CDR1)、第50位至第56位氨基酸(CDR2)和第89位至第97位氨基酸(CDR3)。在一个具体的实施例中，本文所述抗体的CDR已根据Kabat编号方案确定。
短语“如Kabat中的氨基酸位置编号”、“Kabat位置”及其语法变体是指Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》第五版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的抗体编译的用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或更多的氨基酸，对应于可变结构域的FW或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包含H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和重链FW残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82B和82c等)。参见表1B。
表1B
Figure BDA0002371731700000181
Figure BDA0002371731700000191
对于给定抗体，可以通过在抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列比对来确定残基的Kabat编号。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987))。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅35A存在，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。
IMGT(ImMunoGeneTics)也提供了免疫球蛋白可变区(包含CDR)的编号系统。参见，例如，通过引用并入本文的Lefranc，M.P.等人，《发展与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27:55-77(2003)。IMGT编号系统基于超过5,000个序列的比对、结构数据和高变环的表征，并且允许容易地比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号方案，VH-CDR1在第26位至第35位，VH-CDR2在第51位至第57位，VH-CDR3在第93位至第102位，VL-CDR1在第27位至第32位，VL-CDR2在第50位至第52位，并且VL-CDR3在第89位至第97位。
对于本公开中讨论的所有重链恒定区氨基酸位置，编号是根据Edelman等人(1969)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》63(1):78-85中首先描述的EU索引，该EU索引描述了骨髓瘤蛋白EU的氨基酸序列，其是测序的首个人IgG1。Edelman等人的EU索引也在Kabat等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》第五版，United States Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda中列出。因此，短语“Kabat中列出的EU索引”或“Kabat的EU索引”和“根据Kabat中列出的EU索引的第……位”及其语法变体是指基于如Kabat 1991中列出的Edelman等人的人IgG1 EU抗体的残基编号系统。
用于可变结构域(重链和轻链二者)和轻链恒定区氨基酸序列的编号系统如Kabat1991中所列。
抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如IgD、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；和小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白如IgG1以几种同种异型存在，它们在至多几个氨基酸上彼此不同。本文公开的抗体可以来自任何通常已知的同种型、类别、亚类或同种异型。在某些实施例中，本文所述的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的抗体或其任何杂合体。在某些实施例中，抗体是人IgG1亚类或人IgG2或人IgG4亚类的抗体。
“抗体”包含，例如，天然存在的和非天然存在的抗体二者；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人和非人抗体；完全合成的抗体；单链抗体；单特异性抗体；多特异性抗体(包含双特异性抗体)；包括两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体；抗体轻链单体；抗体重链单体；抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体；抗体轻链-抗体重链对；胞内抗体；异源缀合抗体；单价抗体；骆驼化抗体；affybody；抗独特型(抗-Id)抗体(包含，例如，抗-抗-Id抗体)，和单结构域抗体(sdAbs)，其包含由完全能够进行抗原结合的单一单体可变抗体结构域(例如，VH结构域或VL结构域)组成的结合分子。Harmen M.M.和Haard H.J.《应用微生物学与生物技术(Appl Microbiol Biotechnol.)》77(1):13–22(2007))。
如本文所用，抗体的术语“抗原结合部分”指保留特异性结合抗原(例如人FAM19A5)的能力的抗体的一个或多个片段。此类“片段”的长度为例如约8个至约1500个氨基酸，合适的长度为约8个至约745个氨基酸，合适的长度为约8个至约300个氨基酸，例如约8个至约200个氨基酸，或约10个至约50个或100个氨基酸。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来进行。包括在抗体例如本文所述的抗FAM19A5抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包含(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成，和二硫键连接的Fvs(sdFv)；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)《自然(Nature)》341:544-546)，由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或更多个分离的可任选地通过合成接头连接的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使得它们能够被制备成单个蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见，例如，Bird等人(1988)《科学(Science)》242:423-426；和Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在包括在抗体的术语“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶或化学裂解来产生。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用，并且是本领域常见的。可变区典型地指抗体的一部分，通常指轻链或重链的一部分，典型地在成熟重链氨基末端的约110至120个氨基酸，在成熟轻链中的约90至115个氨基酸，其在抗体之间在序列方面广泛不同，并用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的可变性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中更高度保守的区域称为框架区(FR)。
不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施例中，可变区是人可变区。在某些实施例中，可变区包括啮齿类或鼠CDR和人框架区(FR)。在特定的实施例中，可变区是灵长类(例如，非人灵长类)可变区。在某些实施例中，可变区包括啮齿类或鼠CDR和灵长类(例如非人灵长类)框架区(FR)。
如本文所用，术语“重链”在用于指代抗体时，可指基于恒定结构域的氨基酸序列的任何不同类型，例如α、δ、ε、γ和μ，其分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包含IgG亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文所用，术语“轻链”在用于指代抗体时，可以指基于恒定结构域的氨基酸序列的任何不同类型，例如κ或λ。轻链氨基酸序列是本领域熟知的。在具体的实施例中，轻链是人轻链。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用，并且是指抗体的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用，并且是指抗体的重链可变区。
如本文所用，术语“恒定区”或“恒定结构域”可互换，并且具有其在本领域中的通常含义。恒定区是抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但可表现出各种效应子功能，例如与Fc受体的相互作用。免疫球蛋白分子的恒定区通常具有相对于免疫球蛋白可变结构域更保守的氨基酸序列。
“Fc区”(可结晶片段区)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含与位于免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体的结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。因此，Fc区包括抗体的恒定区，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1或CL)。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包括两个相同的蛋白片段，其源自抗体两条重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定结构域；IgM和IgE Fc区在每条多肽链中包括三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，Fc区包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从C226或P230位的氨基酸残基(或这两个氨基酸之间的氨基酸)延伸至重链的羧基末端，其中编号根据如Kabat中的EU索引。人IgGFc区的CH2结构域从约氨基酸231延伸至约氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区中Cm结构域的C-末端侧，即它从IgG的约氨基酸341延伸至约氨基酸447。如本文所用，Fc区可以是天然序列Fc，包含任何同种异型变体，或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。Fc也可以指分离的或在含Fc的蛋白多肽的上下文中的该区域，例如“包括Fc区的结合蛋白”，其也称为“Fc融合蛋白”(例如抗体或免疫粘附素)。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包括与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包含天然序列人IgG1 Fc区；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。天然序列Fc包含各种Fes同种异型(参见，例如Jeffris等人(2009)《单克隆抗体(mAbs)》1:1；Vidarsson G.等人《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:520(在线公开于2014年10月20日))。
“Fc受体”或“FcR”是结合免疫球蛋白Fc区的受体。结合IgG抗体的FcR包括FcγR家族的受体，包含这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种激活受体(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制受体(FcγRIIB)组成。人IgG1结合至大部分人Fc受体并引起最强的Fc效应子功能。就其结合的活化Fc受体的类型而言，认为其等同于鼠IgG2a。相反，人IgG4引起最小的Fc效应子功能。Vidarsson G等人《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:520(在线公开于2014年10月20日)。
恒定区可以例如通过重组技术来操作，以消除一种或多种效应子功能。“效应子功能”是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用，或由此产生的生物化学事件。示例性的“效应子功能”包含C1q结合、补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR-介导的效应子功能如ADCC和抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)以及细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合。因此，术语“无Fc功能的恒定区”包含由Fc区介导的具有降低的或不具有一种或多种效应子功能的恒定区。
抗体的效应子功能可以通过不同的方法降低或避免。通过使用缺乏Fc区的抗体片段(如例如Fab、F(ab')2、单链Fv(scFv)或由单体VH或VL结构域组成的sdAb)可以降低或避免抗体的效应子功能。可替代地，所谓的非糖基化抗体可通过除去与Fc区中特定残基连接的糖来产生，以降低抗体的效应子功能，同时保留Fc区的其它有价值的属性(例如延长的半衰期和异二聚化)。非糖基化抗体可以通过例如缺失或改变糖所连接的残基、酶促除去糖、在糖基化抑制剂存在下培养的细胞中产生抗体或通过在不能糖基化蛋白的细胞(例如细菌宿主细胞)中表达抗体来产生。参见例如美国公开号20120100140。另一种方法是使用来自IgG亚类的具有降低的效应子功能的Fc区，例如，IgG2和IgG4抗体的特征在于具有比IgG1和IgG3更低水平的Fc效应子功能。Fc部分CH2结构域中最接近铰链区的残基负责抗体的效应子功能，因为它含有针对先天免疫系统效应细胞上的C1q(补体)和IgG-Fc受体(FcγR)的大部分重叠结合位点。Vidarsson G等人《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:520(在线公开于2014年10月20日)。因此，具有降低的Fc效应子功能或不具有Fc效应子功能的抗体可通过产生例如包括来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2结构域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域的嵌合Fc区，或包括来自IgG2的铰链区和来自IgG4的CH2区的嵌合Fc区(参见例如LauC等人《免疫学杂志(J.Immunol.)》191:4769-4777(2013))，或具有导致Fc效应子功能改变(降低的FC功能或无FC功能)的突变的Fc区来制备。此类具有突变的Fc区是本领域已知的。参见，例如，美国公开号20120100140和其中引用的美国和PCT申请以及An等人《单克隆抗体(mAbs)》1:6,572-579(2009)；所述专利的全部公开内容通过引用并入本文。
“铰链”、“铰链结构域”、“铰链区”或“抗体铰链区”可互换使用并且是指连接CH1结构域和CH2结构域的重链恒定区的结构域，并包含铰链的上部、中部和下部(Roux等人，(1998)《免疫学杂志(J.Immunol.)》161:4083)。铰链在抗体的结合区和效应区之间提供不同水平的灵活性，并且还为两个重链恒定区之间的分子间二硫键提供位点。如本文所用，对于所有IgG同种型，铰链起始于Glu216并终止于Gly237(Roux等人，(1998)《免疫学杂志(J.Immunol.)》161:4083)。野生型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4铰链的序列是本领域已知的。参见，例如，Kabat EA等人，(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)》第五版，美国卫生与公共服务部，NIH公开号91-3242；Vidarsson G.等人《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:520(在线公开于2014年10月20日)。
术语“CH1结构域”是指重链恒定区，其在重链恒定结构域中连接可变结构域与铰链。如本文所用，CH1结构域起始于A118并终止于V215。术语“CH1结构域”包含野生型CH1结构域，及其天然存在的变体(例如同种异型)。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(包含野生型和同种异型)的CH1结构域序列是本领域已知的。参见，例如，Kabat EA等人，(1991)同上和VidarssonG等人《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:520(在线公开于2014年10月20日)。示例性CH1结构域包含具有改变抗体生物活性例如半衰期的突变的CH1结构域，例如描述于美国公开号20120100140和其中引用的美国专利和出版物以及PCT出版物中。
术语“CH2结构域”指重链恒定结构域中连接铰链与CH3结构域的重链恒定区。如本文所用，CH2结构域起始于P238并终止于K340。术语“CH2结构域”包含野生型CH2结构域，及其天然存在的变体(例如同种异型)。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(包含野生型和同种异型)的CH2结构域序列是本领域已知的。参见，例如，Kabat EA等人，(1991)同上和Vidarsson G等人《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:520(在线公开于2014年10月20日)。示例性CH2结构域包含具有改变抗体生物活性例如半衰期和/或Fc效应子功能降低的突变的CH2结构域，例如描述于美国公开号20120100140和其中引用的美国专利和出版物以及PCT出版物中。
术语“CH3结构域”指重链恒定区，其是重链恒定结构域中CH2结构域的C-末端。如本文所用，CH3结构域起始于G341并终止于K447。术语“CH3结构域”包含野生型CH3结构域，及其天然存在的变体(例如同种异型)。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(包含野生型和同种异型)的CH3结构域序列是本领域已知的。参见，例如，Kabat EA等人，(1991)同上和Vidarsson G等人《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:520(在线公开于2014年10月20日)。示例性CH3结构域包含具有改变抗体生物活性例如半衰期的突变的CH3结构域，例如描述于美国公开号20120100140和其中引用的美国专利和出版物以及PCT出版物中。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。
“同种异型”指特定同种型组中天然存在的变体，这些变体在几个氨基酸上有所不同(参见例如Jeffris等人，(2009)《单克隆抗体(mAbs)》1:1)。本文所述的抗体可以是任何同种异型的。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种异型是本领域已知的。参见，例如，Kabat EA等人，(1991)同上；Vidarsson G等人《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:520(在线公开于2014年10月20日)；和Lefranc MP，《单克隆抗体(mAbs)》1:4,1-7(2009)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
如本文所用，“分离的抗体”旨在是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合FAM19A5的分离的抗体基本上不含特异性结合除FAM19A5以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合FAM19A5表位的分离的抗体可与来自不同物种的其它FAM19A5蛋白具有交叉反应性。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以以本领域已知的多种方式测量和/或表达，包含但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD由koff/kon的商计算并且表示为摩尔浓度(M)，而KA由kon/koff的商计算。kon是指例如抗体与抗原的结合速率常数，并且koff是指例如抗体与抗原的解离。kon和koff可以通过本领域普通技术人员已知的技术来确定，例如免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))、
Figure BDA0002371731700000251
或动力学排除测定
Figure BDA0002371731700000252
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”、“特异的结合”、“选择的结合”和“选择性结合”是抗体上下文中的类似术语，并且是指结合抗原(例如表位或免疫复合物)的分子(例如抗体)，此类结合是本领域技术人员所理解的。例如，特异性结合抗原的分子可以通过较低的亲和力结合其它肽或多肽，如通过例如免疫测定、
Figure BDA0002371731700000253
3000仪器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或本领域已知的其它测定所确定的。在一个具体实施例中，特异性结合抗原的分子结合抗原的KA至少是2log、2.5log、3log、4log或大于该分子结合另一抗原时的KA。
抗体典型地以高亲和力特异性结合其同源抗原，这通过10-5至10-11M或更低的解离常数(KD)反映。任何KD大于约10-4M一般被认为是表明非特异性结合。如本文所用，“特异性结合”抗原的抗体是指以高亲和力结合抗原和基本上相同的抗原的抗体，意指当通过例如免疫测定(例如ELISA)或表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORETM2000仪器中使用预定抗原测定时，具有10-7M或更低，优选10-8M或更低，甚至更优选10-9M或更低，并且最优选10-8M至10-10M或更低的KD，但不以高亲和力结合无关抗原。
如本文所用，术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质，例如蛋白、肽或半抗原。抗原可以是FAM19A5或其片段。
如本文所用，“表位”是本领域的术语，并且是指抗体可特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可以例如来自一个或多个多肽的两个或更多个非连续区域(构象、非线性、不连续或非连续表位)。由连续氨基酸形成的表位典型但不总是在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位典型地在用变性溶剂处理时丢失。表位典型包含独特空间构象中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20个氨基酸。用于确定哪些表位被给定抗体结合的方法(即表位作图)是本领域熟知的，并且包含例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试来自(例如来自FAM19A5)的重叠或连续肽与给定抗体(例如抗FAM19A5抗体)的反应性。测定表位空间构象的方法包含本领域技术和本文所述的那些，例如，x-射线晶体学、2-维核磁共振和HDX-MS(参见，例如，《分子生物学方法中的表位作图方案(Epitope Mapping Protocols in MethodsinMolecular Biology)》，Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996))。
在某些实施例中，抗体结合的表位可以通过例如NMR光谱、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、与质谱(例如液相色谱电喷雾质谱)偶联的氢/氘交换、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如定点诱变作图)来测定。对于X射线晶体学，结晶可以使用本领域已知的任何方法完成(例如Giege R等人，(1994)《晶体学报D卷：生物晶体学(ActaCrystallogr D Biol Crystallogr)》50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)《欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem)》189:1-23；Chayen NE(1997)《结构(Structure)》5:1269-1274；McPherson A(1976)《生物化学杂志(J Biol Chem)》251:6300-6303)。抗体：抗原晶体可以使用熟知的X射线衍射技术研究，并且可以使用计算机软件如X-PLOR精制(YaleUniversity,1992,由Molecular Simulations,Inc.发布；参见例如《酶学方法(MethEnzymol)》(1985)，第114卷和第115卷，Wyckoff HW等人编辑；U.S.2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)《晶体学报D卷：生物晶体学(Acta Crystallogr D BiolCrystallogr)》49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)《酶学方法(Meth Enzymol)》276A:361-423,ed Carter CW；Roversi P等人，(2000)《晶体学报D卷：生物晶体学(Acta CrystallogrD Biol Crystallogr)》56(Pt 10):1316-1323)。诱变作图研究可以使用本领域技术人员已知的任何方法完成。参见，例如，Champe M等人，(1995)《生物化学杂志(J Biol Chem)》270:1388-1394和Cunningham BC和Wells JA(1989)《科学(Science)》244:1081-1085描述了诱变技术，包含丙氨酸扫描诱变技术。
术语“表位作图”是指鉴定用于抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。
关于两种或更多种抗体的术语“结合相同表位”是指抗体结合相同的氨基酸残基区段，如通过给定方法所测定的。用于确定抗体是否与本文所述抗体“FAM19A5上相同表位”结合的技术包含例如表位作图方法，例如，抗原：抗体复合物的晶体的x-射线分析，其提供了表位的原子分辨率和氢/氘交换质谱(HDX-MS)。其它方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变体的结合，其中由于抗原序列内的氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。此外，也可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于相关抗体从组合噬菌体展示肽文库亲和分离特异性短肽的能力。具有相同VH和VL或相同CDR1、2和3序列的抗体预期结合相同表位。
“与另一抗体竞争结合靶标”的抗体是指(部分或完全)抑制另一抗体与靶标结合的抗体。可以使用已知的竞争实验来确定两种抗体是否彼此竞争结合靶标，即一种抗体是否抑制另一种抗体与靶标的结合以及抑制程度。在某些实施例中，抗体与另一种抗体竞争与靶标的结合并抑制另一种抗体与靶标的结合至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的水平可以不同，这取决于哪种抗体是“封闭抗体”(即，首先与靶标一起孵育的冷抗体)。竞争测定可如例如Ed Harlow和David Lane，《冷泉港方案(Cold Spring Harb Protoc)》；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或Ed Harlow和David Lane“《使用抗体(Using Antibodies)》”(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999)的第11章中所述进行。竞争性抗体结合相同表位、重叠表位或相邻表位(例如，如通过位阻所证明的)。
其它竞争性结合测定包含：固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli等人，《酶学方法(Methods inEnzymology)》9:242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》137:3614(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane，《抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)》，Cold SpringHarbor Press(1988))；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人，《分子免疫学(Mol.Immunol.)》25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，《病毒学(Virology)》176:546(1990))；和直接标记的RIA(Moldenhauer等人，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》32:77(1990))。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法产生，包含融合杂交瘤或连接Fab'片段。参见，例如Songsivilai和Lachmann，《临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》79:315-321(1990)；Kostelny等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》148,1547-1553(1992)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体或其中所有抗体对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体组合物。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性并且具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和任选恒定区的抗体或抗体组合物。在一个实施例中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含B细胞，所述B细胞得自转基因非人动物，例如转基因小鼠，其基因组包括与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因。
如本文所用，术语“重组人抗体”包含通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化以表达抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组、组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体包括利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区，但包含例如在抗体成熟期间发生的后续重排和突变。如本领域已知的(参见，例如，Lonberg(2005)《自然生物技术(NatureBiotech.)》23(9):1117-1125)，可变区含有抗原结合结构域，其由重排以形成对外源抗原具有特异性的抗体的各种基因编码。除了重排之外，可变区还可以通过多个单个氨基酸改变(称为体细胞突变或超突变)来进一步修饰，以增加抗体对外源抗原的亲和力。恒定区将在对抗原的进一步应答中改变(即同种型转换)。因此，响应于抗原而编码轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排和体细胞突变的核酸分子不能与原始核酸分子具有序列同一性，而是将基本上相同或相似(即，具有至少80％的同一性)。
“人抗体”(HuMAb)指具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文所述的抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包含其中源自另一哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。术语“人”抗体和“全人”抗体同义使用。
“人源化抗体”指非人抗体CDR结构域之外的一些、大部分或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应氨基酸代替的抗体。在抗体的人源化形式的一个实施例中，CDR结构域之外的一些、大部分或所有氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸置换，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或所有氨基酸未改变。氨基酸的小添加、缺失、插入、取代或修饰是允许的，只要它们不消除抗体结合特定抗原的能力。“人源化”抗体保留了与原始抗体相似的抗原特异性。
“嵌合抗体”是指可变区源自一个物种而恒定区源自另一个物种的抗体，例如其中可变区源自小鼠抗体而恒定区源自人抗体的抗体。
如本文所用，术语“交叉反应性”是指本文所述抗体结合来自不同物种的FAM19A5的能力。例如，本文所述结合人FAM19A5的抗体也可结合另一物种FAM19A5(例如小鼠FAM19A5)。如本文所用，交叉反应性可通过在结合测定(例如SPR、ELISA)中检测与纯化抗原的特异反应性或与生理学表达FAM19A5的细胞结合或以其他方式与其功能相互作用来测量。测定交叉反应性的方法包含本文所述的标准结合测定，例如，通过使用
Figure BDA0002371731700000291
2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的
Figure BDA0002371731700000292
表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术技术。
术语“天然存在的”在应用于本文的物体时是指物体可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包含病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，所述生物体可以从天然来源分离并且在实验室中没有被人有意修饰。
“多肽”是指包括至少两个连续连接的氨基酸残基的链，链的长度没有上限。蛋白中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，例如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成。“蛋白”可以包括一种或多种多肽。
如本文所用，术语“核酸分子”旨在包含DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。
如本文所用，术语“载体”旨在是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包含其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其提供等同的功能。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在是指包括并非天然存在于细胞中的核酸的细胞，并且可以是已经引入重组表达载体的细胞。应当理解，此类术语不仅指特定的受试细胞，还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在随后的世代中可能发生某些修饰，所以此类后代实际上不能与亲本细胞相同，但是仍然包含在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“连接”是指两个或更多个分子的缔合。该连接可以是共价或非共价的。连接也可以是遗传的(即重组融合的)。此类连接可以使用多种本领域公认的技术来实现，例如化学缀合和重组蛋白生产。
如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将治疗剂或包括治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述的抗体的优选施用途径包含静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”是指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射，并且包含但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、心室内、玻璃体内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。或者，本文所述的抗体可通过非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行。
如本文所用，术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指在受试者上进行的或向受试者施用活性剂的任何类型的干预或过程，目的是逆转、减轻、改善、抑制或减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、状态或生物化学指标的进展、发展、严重或复发。治疗可以是对患有疾病的受试者或未患有疾病的受试者(例如，用于预防)的治疗。
如本文所用，术语“受试者”包含任何人或非人动物。术语“非人动物”包含所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
如本文所用，术语“神经胶质增生发作”或“反应性神经胶质增生发作”包含神经胶质增生的开始或起始。神经胶质增生是中枢神经系统(CNS，例如大脑和/或脊髓)中神经胶质细胞响应于损伤或损害的非特异性反应性变化，所述损伤或损害来自例如创伤、脑脊髓损害、脑肿瘤、感染、缺血、中风、自身免疫反应和/或神经变性疾病，并且包含几种不同类型的神经胶质细胞，包含星形胶质细胞、小神经胶质细胞和少突胶质细胞的增殖或肥大。神经胶质增生的发作可导致瘢痕形成，这抑制了CNS的已受到创伤或损伤的部分中的轴突再生。神经胶质增生发作的有害作用包含对神经元的不可逆或永久性损伤和/或防止周围神经元恢复。因此，术语“延迟神经胶质增生发作”和“延迟反应性神经胶质增生发作”包含抑制、减缓、压制或预防神经胶质增生的开始或起始及其相关的对CNS的有害作用。
如本文所用，术语“反应性星形胶质细胞的过度增殖”包含由于附近神经元的破坏而导致的星形胶质细胞数量的异常增加，所述神经元的破坏例如来自CNS损害、创伤、损伤、脑脊髓损害、脑肿瘤、感染、缺血、中风、自身免疫反应和/或神经变性疾病。反应性星形胶质细胞的过度增殖可导致CNS中的有害作用，包含瘢痕形成(其抑制CNS的已受到创伤或损伤的部分中的轴突再生)、炎症的恶化、活性氧簇神经毒性水平的产生和释放、潜在的兴奋毒性谷氨酸的释放、对癫痫发生的潜在贡献、血脑屏障功能的损害、创伤和中风期间的细胞毒性水肿、星形胶质细胞的慢性细胞因子活化对慢性疼痛的潜在贡献以及CNS损伤后的继发性变性。Michael V.Sofroniew(2009)《神经科学趋势(Trends in Neurosciences)》，32(12):638–47；J.McGraw等人(2001)《神经科学研究杂志(Journal of NeuroscienceResearch)》63(2):109–15；和M.V.Sofroniew(2005)《神经科学家(The Neuroscientist)》11(5):400–7。因此，术语“抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖”包含抑制、减缓、压制、限制或预防反应性星形胶质细胞的过度或异常增殖及其相关的对CNS的有害作用。
如本文所用，术语“硫酸软骨素蛋白聚糖”包含由蛋白核心和硫酸软骨素构成的蛋白聚糖。硫酸软骨素蛋白聚糖，也称为CSPG，是广泛表达于整个发育中的和成年CNS中的细胞外基质分子。CSGPs在神经发育和神经胶质疤痕形成中起关键作用，并且它们抑制CNS中损伤后的轴突再生。已知的CSPG包含聚集蛋白聚糖(CSPG1)、多功能蛋白聚糖(CSPG2)、神经聚糖(CSPG3)、CSPG4(或神经元-神经胶质抗原2(NG2))、CSPG5、SMC3(CSPG6，染色体结构维持蛋白3)、短蛋白聚糖(CSPG7)和CD44(CSPG8，分化簇44)、磷酸酶蛋白聚糖-神经聚糖(CSPG3)。K.E.Rhodes和J.W.Fawcett(2004)《解剖学杂志(Journal of Anatom.)》204(1):33–48。因此，术语“降低硫酸软骨素蛋白聚糖的表达”包含降低、抑制、减少一种或多种CSGP的水平，或降低一种或多种CSGP的活性或使其失活。在某些实施例中，该术语包含降低、抑制、减少神经聚糖、NG2或两者的水平，或降低神经聚糖、NG2或两者的活性或使其失活。
如本文所用，术语“神经元”包含通过电信号和化学信号处理和传输信息的可电激励的细胞。神经元是CNS的大脑和脊髓的主要成分，以及外周神经系统(PNS)的神经节的主要成分，并且可以彼此连接以形成神经网络。典型的神经元由细胞体(胞体)、树突和轴突构成。神经元的胞体(细胞体)含有细胞核。神经元的树突是具有许多分支的细胞延伸，其中发生神经元的大部分输入。轴突是从胞体延伸的更细的、索状的突起，并且将神经信号从胞体带走，并将某些类型的信息带回胞体。术语“促进神经元的再生长”包含刺激、促进、增加或激活神经元的生长，优选在损伤或损害之后。
如本文所用，术语“c-fos”包含原癌基因c-fos，它被神经递质的刺激迅速诱导。c-fos存在于许多物种中，包含小鼠和人。c-fos基因和蛋白质是已知的并被表征。参见TCurran c-fos原癌基因，pp 307–327(Reddy EP等人《原癌基因手册(The OncogeneHandbook)》，(eds.)Elsevier)(1988)。c-fos的表达可以通过本领域已知的方法来确定，例如Northern Blot、定量PCR或免疫组织化学。术语“增加c-fos的表达”包含增加c-fosmRNA、c-fos蛋白或c-fos蛋白活性水平。
如本文所用，术语“pERK”包含磷酸化的细胞外信号调节激酶。细胞外信号调节激酶或ERK，包含ERK1和ERK2，是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员。ERK通过被其上游激酶磷酸化而激活以形成pERK，然后pERK激活下游靶标。ERK参与神经和突触可塑性基础性学习，以及记忆和疼痛超敏反应。Ji R.R.等人，《自然神经科学(Nat Neurosci)》(1999)2:1114–1119。ERK基因、蛋白质、磷酸化和活化是已知的并已被表征，且ERK和pERK的表达可通过本领域已知的方法(例如Northern Blot、定量PCR或免疫组织化学)来确定。参见GaoY.J.和Ji R.R.，《公开疼痛杂志(Open Pain J.)》(2009)2:11-17。术语“增加pERK的表达”包含增加ERKmRNA、ERK蛋白或pERK活性的水平。
如本文所用，术语“GAP43”，也称为“生长相关蛋白43”，是促进神经突形成、再生和可塑性的神经组织特异性蛋白。Benowitz L.I.和Routtenberg A.(1997)《神经科学趋势(Trends in Neurosciences)》20(2):84–91；Aarts L.H.等人，(1998)《实验医学与生物学进展(Advances in Experimental Medicine and Biology)》446:85–106。人GAP43由GAP43基因编码。人GAP43多肽序列(UniProt：KB-P17677)和编码该多肽的cDNA序列是本领域已知的。Kosik K.S.等人，(1988)《神经元(Neuron)》1(2):127–32；Ng S.C.等人，(1988)《神经元(Neuron)》1(2):133-9。GAP43的表达可以通过本领域已知的方法(例如Northern Blot、定量PCR或免疫组织化学)来确定。术语“增加神经元中的GAP43”包含增强或增加GAP43 mRNA、GAP43蛋白的水平，或增加GAP43蛋白的活性。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指药物单独或与另一种治疗剂组合有效“治疗”受试者中的疾病或病症或降低疾病或病症(例如中枢神经系统损害)的风险、可能性或发生的量。“治疗有效量”包含对患有疾病或病症(例如中枢神经系统损害，例如创伤性脑损伤或本文公开的其他疾病)的受试者或处于患有该疾病或病症风险中的受试者提供一些改善或益处的药物或治疗剂的量。因此，“治疗有效”量是降低疾病的风险、可能性或发生的量，或提供病症或一些减轻、缓和和/或降低至少一种指标(例如，神经胶质增生的发作)和/或减少疾病或病症的至少一种临床症状的量。
II.抗FAM19A5抗体
本文公开了以特定功能特征或性质为特征的抗体，例如单克隆抗体。例如，抗体特异性结合人FAM19A5，包含可溶性FAM19A5和膜结合性FAM19A5。除了特异性结合可溶性和/或膜结合性人FAM19A5之外，本文所述的抗体显示以下功能性质中的一种或多种：
(a)减少、逆转和/或预防纤维化；
(b)减少过量细胞外基质(ECM)的形成；
(c)延迟肿瘤生长或进展；
(d)如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量，以10nM或更小的KD结合可溶性人FAM19A5；
(e)如通过ELISA所测量，以10nM或更小的KD结合膜结合性人FAM19A5；
(f)减少、逆转、延迟和/或预防反应性神经胶质增生的发作；
(g)抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖；
(h)降低硫酸软骨素蛋白聚糖包含神经聚糖和神经元-神经胶质抗原2(NG2)的表达；
(i)增加神经元细胞核中c-fos和pERK的表达；
(j)促进神经元存活；
(k)增加神经元中GAP43的表达；以及
(l)促进轴突的再生长。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以高亲和力特异性结合可溶性人FAM19A5或膜结合人，例如KD为10-7M或更低、10-8M或更低、10-9M(1nM)或更低、10-10M(0.1nM)或更低、10-11M或更低或10-12M(1pM)或更低，例如10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10- 10M至10-7M或10-9M至10-7M，例如，10-12M、5 X 10-12M、10-11M、5X 10-11M、10-10M、5 X 10-10M、10-9M、5 X 10-9M、10-8M、5 X 10-8M、10-7M或5 X 10-7M。评价各种物种的抗体对人FAM19A5的结合能力的标准测定是本领域已知的，包含例如ELISA、Western Blot和RIA。合适的测定在实例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可通过本领域已知的标准测定来评估，例如通过ELISA、
Figure BDA0002371731700000341
分析或
Figure BDA0002371731700000342
下文和实例中进一步详细描述了评价抗体对FAM19A5功能性质(例如配体结合)的作用的测定。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以10-7M或更低、10-8M(10nM)或更低、10-9M(1nM)或更低、10-10M或更低、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M的KD结合可溶性人FAM19A5，如例如通过ELISA测定的。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以10nM或更低，例如0.1至10nM、0.1至5nM、0.1至1nM、0.5至10nM、0.5至5nM、0.5至1nM、1至10nM、1至5nM或5至10nM的KD结合可溶性FAM19A5。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以约1pM、2pM、3pM、4pM、5pM、6pM、7pM、8pM、9pM、10pM、20pM、30pM、40pM、50pM、60pM、70pM、80pM、90pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、700pM、800pM或900pM，或约1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM或9nM，或约10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM或90nM的KD特异性结合可溶性人FAM19A5，如通过ELISA测定的。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以10-7M或更低、10-8M(10nM)或更低、10-9M(1nM)或更低、10-10M或更低、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M的KD结合膜结合性人FAM19A5，如例如通过ELISA测定的。在某些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以10nM或更低的KD，例如0.1至10nM、0.1至5nM、0.1至1nM、0.5至10nM、0.5至5nM、0.5至1nM、1至10nM、1至5nM或5至10nM的KD特异性地结合膜结合性人FAM19A5，如通过ELISA测定的。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以约1pM、2pM、3pM、4pM、5pM、6pM、7pM、8pM、9pM、10pM、20pM、30pM、40pM、50pM、60pM、70pM、80pM、90pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、700pM、800pM或900pM或约1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM或9nM或约10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM或90nM的KD结合膜结合性人FAM19A5，如通过ELISA测定的。
本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可减少、预防、逆转、延迟或抑制反应性神经胶质增生的发作，例如延迟、减缓或抑制中枢神经系统(CNS，例如大脑和/或脊髓)中神经胶质细胞响应于损伤或损害的非特异性反应性变化，所述损伤或损害来自例如创伤、脑脊髓损害、脑肿瘤、感染、缺血、中风、自身免疫反应和/或神经变性疾病。
本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可延迟、抑制、减缓、压制、限制或预防反应性星形胶质细胞的过度或异常增殖及其相关的对CNS的有害作用。例如，本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可抑制或预防因神经元破坏而导致的星形胶质细胞数量异常增加(所述神经元破坏来自例如CNS损害、创伤、损伤、脑脊髓损害、脑肿瘤、感染、缺血、中风、自身免疫反应和/或神经变性疾病)，抑制或预防CNS中的瘢痕形成，抑制或减少活性氧簇神经毒性水平的释放或潜在兴奋毒性谷氨酸的释放，减少或抑制CNS损伤后的癫痫、疼痛和/或继发性变性。本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可促进、刺激、增加或激活神经元和/或轴突的再生长，优选在CNS损伤或损害之后。
本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可抑制硫酸软骨素蛋白聚糖的表达，所述硫酸软骨素蛋白聚糖包含由蛋白质核心和硫酸软骨素构成的蛋白聚糖(CSGP)，例如聚集蛋白聚糖(CSPG1)、多功能蛋白聚糖(CSPG2)、神经聚糖(CSPG3)、CSPG4(或神经元-神经胶质抗原2(NG2))、CSPG5、SMC3(CSPG6，染色体结构维持蛋白3)、短蛋白聚糖(CSPG7)、CD44(CSPG8，分化簇44)、磷酸酶蛋白聚糖-神经聚糖(CSPG3)或其任何组合。在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分抑制、降低或减少神经聚糖和/或NG2的水平，或神经聚糖和/或NG2的活性。
本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可增加神经元细胞核中c-fos和pERK的表达，例如增加c-fos和pERK的mRNA、蛋白质和/或蛋白质活性。本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分还可增加或增强GAP43 mRNA、GAP43蛋白的表达水平，或增加或增强GAP43蛋白活性。
在某些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分与包括本文公开的CDR或可变区的抗FAM19A5抗体(例如2-13、3-2或1-28)交叉竞争结合人FAM19A5表位(或抑制其结合)。
在某些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分抑制包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体的结合，(i)其中所述参考抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的氨基酸序列，并且所述参考抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3分别包括SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的氨基酸序列；(ii)其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列，和所述重链CDR3包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或(iii)其中所述重链CDR1包括SEQID NO：20的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列。在一些实施例中，所述参考抗体包括：(i)包括SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的重链可变结构域，和(ii)包括SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42的轻链可变结构域。
在某些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分将此类参考抗体与人FAM19A5的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。竞争性抗体结合相同表位、重叠表位或相邻表位(例如，如通过位阻所证明的)。两种抗体是否彼此竞争结合靶标可以使用本领域已知的竞争实验例如RIA和EIA来确定。
在某些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分与本文公开的包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体结合相同的FAM19A5表位，(i)其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列，和所述重链CDR3包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：23的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：24的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ IDNO：25的氨基酸序列；(ii)其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列，和所述重链CDR3包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或(iii)其中所述重链CDR1包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列。在一些实施例中，所述参考抗体包括：(i)包括SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ IDNO：38的重链可变结构域，和(ii)包括SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42的轻链可变结构域。
用于确定两种抗体是否结合相同表位的技术包含，例如，表位作图方法(例如，抗原：抗体复合物的晶体的X-射线分析，其提供表位的原子分辨率和氢/氘交换质谱(HDX-MS))、监测抗体与抗原片段或抗原的突变变体的结合的方法(其中由于抗原序列内的氨基酸残基的修饰而导致的结合的丧失通常被认为是表位组分的指示)及用于表位作图的计算组合方法。
本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可结合成熟人FAM19A5的至少一个表位，如例如通过抗体与人FAM19A5的片段结合所确定的。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合至少一个具有TLDRDSSQPRRTIARQTARC氨基酸序列(SEQ ID NO：6或SEQID NO：2的氨基酸残基42至61)的表位，或结合位于SEQ ID NO：6的氨基酸序列内的片段，例如具有SEQ ID NO：6的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的表位。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合至少一个或多个对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基46至51(即DSSQPR)的氨基酸，例如氨基酸残基46、50和52(即D---P-R)，例如氨基酸残基46、47、48和50(即DSS-P)。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合位于SEQ ID NO：9的氨基酸序列内的片段，例如具有SEQ ID NO：9的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19或20个氨基酸的表位。
在一些实施例中，所述至少一个表位具有与SEQ ID NO：6至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述至少一个表位具有与SEQ ID NO：9至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分仅结合为SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10的人FAM19A5表位，或位于SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10的氨基酸序列内的片段，例如具有SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的表位。
在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以其天然构象(即未变性)结合SEQ ID NO：6或其片段。在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分以其天然构象(即未变性)结合SEQ ID NO：9或其片段。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合糖基化和未糖基化的人FAM19A5二者。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分还结合一个或多个另外的FAM19A5表位。因此，某些抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合SEQ ID NO：6的表位和另外的表位或SEQ ID NO：9的表位和另外的表位。其它抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可结合SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9的表位和另外的表位。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合SEQ ID NO：6的表位、SEQ ID NO：10的表位和另外的表位。
在一些实施例中，所述一个或多个另外的FAM19A5表位选自QLAAGTCEIVTLDR(SEQID NO：5，表位F1)、TLDRDSSQPRRTIARQTARC(SEQ ID NO：6，表位F2)、TARCACRKGQIAGTTRARPA(SEQ ID NO：7，表位F3)、ARPACVDARIIKTKQWCDML(SEQ ID NO：8，表位F4)、CDMLPCLEGEGCDLLINRSG(SEQ ID NO：9，表位F5)或NRSGWTCTQPGGRIKTTTVS(SEQ ID NO：10，表位F6)或位于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQID NO：10或其任何组合的氨基酸序列内的片段。位于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列内的片段，包含具有SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中任一个的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的片段。在一些实施例中，所述一个或多个另外的FAM19A5表位选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10，或位于SEQ IDNO：5、6、7、8、9或10的氨基酸序列内的片段，例如，具有SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10或其任何组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的片段。在一些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合处于其天然构象(即未变性)的一个或多个另外表位中的任一个。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合糖基化和非糖基化的一个或多个另外的FAM19A5表位二者。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合鉴定为EP2、EP4和/或EP8的至少一个FAM19A5表位，其中EP2包括氨基酸DSSFP(SEQ ID NO：66)、基本上由其组成或由其组成，其中EP4包括氨基酸ARCACRK(SEQ ID NO：68)、基本上由其组成或由其组成，且其中EP8包括氨基酸TCTQPGGR(SEQ ID NO：72)、基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，所述至少一个表位具有与EP2、EP4或EP8至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分仅结合EP2。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合EP4和EP8。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分结合一个或多个FAM19A5表位，所述表位选自由SEQ ID NO：65[[EP1-IVTLD]]、SEQ ID NO：67[[EP3-RTIAR]]、SEQ ID NO：69[[EP5-ARPA]]、SEQ ID NO：70[[EP6-KTKQWCDML]]和SEQ ID NO：71[[EP7-GCDLLINR]]及其任何组合组成的群组。
在某些实施例中，本文提供了以高于FAM19A家族中另一蛋白的亲和力20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的亲和力结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的抗体或其抗原结合部分，所述亲和力通过例如免疫测定(例如ELISA)、表面等离子体共振或动力学排除测定来测量。在一个具体实施例中，本文提供了结合FAM19A5(例如人FAM19A5)且与FAM19A家族中另一蛋白无交叉反应性的抗体或其抗原结合部分，如通过例如免疫测定所测量。
在某些实施例中，抗FAM19A5抗体不是天然抗体或不是天然存在的抗体。例如，抗FAM19A5抗体例如通过具有更多、更少或不同类型的翻译后修饰而具有与天然存在的抗体不同的翻译后修饰。
III.示例性抗FAM19A5抗体
可用于本文公开的方法的特定抗体是具有实施例1中分离的抗体2-13、3-2、1-65和1-28的CDR和/或可变区序列的抗体，例如单克隆抗体，以及与其可变区或CDR序列具有至少80％同一性(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性)的抗体。2-13、3-2、1-65和1-28的VH氨基酸序列如SEQ ID NO：35-38所列。2-13、3-2、1-65和1-28的VL氨基酸序列如SEQ ID NO：39至42所列。
表2.可变重链CDR氨基酸序列(根据Kabat系统)
Figure BDA0002371731700000401
表3.可变轻链CDR氨基酸序列(根据Kabat系统)
Figure BDA0002371731700000411
表4.可变重链氨基酸序列
Figure BDA0002371731700000412
表5.可变轻链氨基酸序列
Figure BDA0002371731700000413
Figure BDA0002371731700000421
因此，本文提供了分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括SEQ ID NO：35、36或38的氨基酸序列。在其它实施例中，分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括选自由SEQ ID NO：35、36或38组成的群组的重链可变区的CDR。
还提供了分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，其中轻链可变区包括SEQ ID NO：39、40或42的氨基酸序列。在其它实施例中，分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括选自由SEQ ID NO：39、40或42组成的群组的轻链可变区的CDR。
在某些实施例中，分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括选自由SEQ IDNO：35、36或38组成的群组的重链可变区的CDR，以及选自由SEQ ID NO：39、40或42组成的群组的轻链可变区的CDR。
还提供了分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，(i)其中所述重链可变区包括SEQ ID NO：35的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列；(ii)其中重链可变区包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列，并且其中轻链可变区包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列；或(iii)其中重链可变区包括SEQID NO：38的氨基酸序列，并且其中轻链可变区包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列。
本文提供了分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括与如SEQ ID NO：35、36或38所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
本文还提供了分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：39、40或42所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
还提供了分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括与SEQ ID NO：35、36或38所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：39、40或42所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开提供分离的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)分别包括SEQ ID NO：35和39的重链和轻链可变区序列；
(b)分别包括SEQ ID NO：36和40的重链和轻链可变区序列；或
(c)分别包括SEQ ID NO：38和42的重链和轻链可变区序列。
在某些实施例中，本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括(i)2-13的重链CDR1、CDR2和CDR3或其组合，和/或2-13的轻链CDR1、CDR2和CDR3或其任何组合；(ii)3-2的重链CDR1、CDR2和CDR3或其组合，和/或3-2的轻链CDR1、CDR2和CDR3或其任何组合；或(iii)1-28的重链CDR1、CDR2和CDR3，或其组合，和/或1-28的轻链CDR1、CDR2和CDR3，或其任何组合。
2-13的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：11、12和13。2-13的VL CDR1、CDR2s和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：23、24和25。3-2的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：14、15和16。3-2的VL CDR1、CDR2s和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：26、27和28。1-28的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：20、21和22。1-28的VL CDR1、CDR2s和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ IDNO：32、33和34。1-65的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：17、18和19。1-65的VL CDR1、CDR2s和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：29、30和31。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VH CDR1；和/或
(b)包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VH CDR2；和/或
(c)包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VH CDR3。
在具体实施例中，抗体或其抗原结合部分包括一个、两个或所有三个上述VH CDR。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VL CDR1；和/或
(b)包括SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VL CDR2；和/或
(c)包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL CDR3。
在具体的实施例中，抗体或其抗原结合部分包括一个、两个或所有三个上述VLCDR。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VL CDR2；和/或
(f)包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VH CDR1；和/或
(b)包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH CDR2；和/或
(c)包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VH CDR3。
在具体实施例中，抗体或其抗原结合部分包括一个、两个或所有三个上述VH CDR。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VL CDR1；和/或
(b)包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL CDR2；和/或
(c)包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VL CDR3。
在具体的实施例中，抗体或其抗原结合部分包括一个、两个或所有三个上述VLCDR。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL CDR2；和/或
(f)包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VL CDR3。
在具体实施例中，抗体或其抗原结合部分包括一个、两个或所有三个上述VH CDR。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VL CDR1；和/或
(b)包括SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VL CDR2；和/或
(c)包括SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VL CDR3。
在具体的实施例中，抗体或其抗原结合部分包括一个、两个或所有三个上述VLCDR。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的本公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VH CDR1；和/或
(b)包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH CDR2；和/或
(c)包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH CDR3。
在具体实施例中，抗体或其抗原结合部分包括一个、两个或所有三个上述VH CDR。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VL CDR1；和/或
(b)包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL CDR2；和/或
(c)包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VL CDR3。
在具体的实施例中，抗体或其抗原结合部分包括一个、两个或所有三个上述VLCDR。
在一些实施例中，特异性结合人FAM19A5的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL CDR2；和/或
(f)包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VL CDR3。
在具体实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括上述CDR中的一个、两个、三个、四个、五个或六个。
本文所述的VH结构域或其一个或多个CDR可与恒定结构域连接以形成重链，例如全长重链。类似地，本文所述的VL结构域或其一个或多个CDR可以与恒定结构域连接以形成轻链，例如全长轻链。全长重链和全长轻链组合形成全长抗体。
因此，在具体实施例中，本文提供了包括抗体轻链和重链，例如单独的轻链和重链的抗体。关于轻链，在一个具体实施例中，本文所述抗体的轻链是κ轻链。在另一个具体实施例中，本文所述抗体的轻链是λ轻链。在又一个具体实施例中，本文所述抗体的轻链是人κ轻链或人λ轻链。在一个特定实施例中，特异性结合FAM19A5多肽(例如人FAM19A5)的本文所述抗体包括轻链，所述轻链包括本文所述的任何VL或VL CDR氨基酸序列，且其中所述轻链的恒定区包括人κ轻链恒定区的氨基酸序列。在一个特定实施例中，特异性结合FAM19A5多肽(例如人FAM19A5)的本文所述抗体包括轻链，所述轻链包括本文所述VL或VL CDR氨基酸序列，且其中所述轻链的恒定区包括人λ轻链恒定区的氨基酸序列。人恒定区序列的非限制性实例已在本领域中描述，例如参见美国专利号5,693,780和Kabat EA等人，(1991)同上。
关于重链，在一些实施例中，本文所述抗体的重链可以是α、δ、ε、γ或μ重链。在另一个具体实施例中，所述抗体的重链可包括人α、δ、ε、γ或μ重链。在一个实施例中，特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的本文所述抗体包括重链，所述重链包括本文所述的VH或VHCDR氨基酸序列，并且其中所述重链的恒定区包括人γ重链恒定区的氨基酸序列。在另一个实施例中，特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的本文所述抗体包括重链，所述重链包括本文公开的VH或VH CDR氨基酸序列，并且其中重链的恒定区包括本文所述或本领域已知的人重链的氨基酸。人恒定区序列的非限制性实例已在本领域中描述，例如参见美国专利号5,693,780和Kabat EA等人，(1991)同上。
在一些实施例中，特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的本文所述抗体包括VL结构域和VH结构域，所述VL结构域和VH结构域包括本文所述的VH或VH CDR以及VL和VL CDR，并且其中恒定区包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子或人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在另一个具体实施例中，特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的本文所述抗体包括VL结构域和VH结构域，所述VL结构域和VH结构域包括本文所述的任何氨基酸序列，并且其中恒定区包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的恒定区的氨基酸序列。在一些实施例中，恒定区包括天然存在的人IgG恒定区的氨基酸序列，包含亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)和同种异型(例如G1m、G2m、G3m和nG4m)及其变体。参见，例如，Vidarsson G.等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:520(在线公开于2014年10月20日)以及Jefferis R.和Lefranc MP，《单克隆抗体(mAbs)》1:4,1-7(2009)。在一些实施例中，恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的恒定区的氨基酸序列。
在某些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分不具有Fc效应子功能，例如补体依赖的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。效应子功能由Fc区介导，并且在Fc区的CH2结构域中最接近铰链区的残基负责抗体的效应子功能，因为它含有针对先天免疫系统的效应细胞上的C1q(补体)和IgG-Fc受体(FcγR)的大部分重叠的结合位点。此外，IgG2和IgG4抗体的Fc效应子功能水平比IgG1和IgG3抗体低。抗体的效应子功能可以通过本领域已知的不同方法来降低或避免，包含(1)使用缺乏Fc区的抗体片段(例如，诸如Fab、F(ab')2、单链Fv(scFv)或由单体VH或VL结构域组成的sdAb)；(2)产生非糖基化抗体，其可以通过例如缺失或改变糖所连接的残基、酶促除去糖、在糖基化抑制剂存在下培养的细胞中产生抗体或通过在不能糖基化蛋白的细胞(例如细菌宿主细胞，参见例如美国公开号20120100140)中表达抗体来产生；(3)使用来自IgG亚类的具有降低的效应子功能的Fc区(例如，来自IgG2或IgG4抗体的Fc区或包括来自IgG2或IgG4抗体的CH2结构域的嵌合Fc区，参见例如美国公开号20120100140和Lau C等人《免疫学杂志(J.Immunol.)》191:4769-4777(2013)；和(4)产生具有导致Fc功能降低或无Fc功能的突变的Fc区。参见例如美国公开号20120100140和其中引用的美国和PCT申请以及An等人《单克隆抗体(mAbs)》1:6,572-579(2009)。
因此，在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分为Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)或由单体VH或VL结构域组成的sdAb。此类抗体片段是本领域熟知的，并且如上所述。
在一些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分包括Fc效应子功能降低或无Fc效应子功能的Fc区。在一些实施例中，恒定区包括人IgG2或IgG4Fc区的氨基酸序列，在一些实施例中，抗FAM19A5抗体是IgG2/IgG4同种型。在一些实施例中，抗FAM19A5抗体包括嵌合Fc区，其包括来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2结构域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，或包括来自IgG2的铰链区和来自IgG4的CH2区的嵌合Fc区，或具有导致Fc功能降低或无Fc功能的突变的Fc区。Fc效应子功能降低或无Fc效应子功能的Fc区包含本领域已知的那些。参见例如Lau C等人《免疫学杂志(J.Immunol.)》191:4769-4777(2013)；An等人，《单克隆抗体(mAbs)》1:6,572-579(2009)；和美国公开号20120100140以及其中引用的美国专利和出版物和PCT出版物。本领域普通技术人员也可以容易地制备Fc效应子功能降低或无Fc效应子功能的Fc区。
IV.核酸分子
本文所述的另一个方面涉及编码本文所述的任何一种抗体或其抗原结合部分的一种或多种核酸分子。核酸可以完整细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术，包含碱/SDS处理、CsCl带、柱层析、限制酶、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它技术，与其它细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸(例如其它染色体DNA，例如与天然分离的DNA连接的染色体DNA)或蛋白纯化分离时，核酸是“分离的”或“使得基本上纯的”。参见，F.Ausubel等人编辑，(1987)《分子生物学最新方案(Current Protocols inMolecular Biology)》，Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。在某些实施例中，核酸是cDNA分子。
本文所述的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤(例如，由如下进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从文库回收编码抗体的核酸。
本文所述的某些核酸分子是编码2-13、3-2、1-65和1-28单克隆抗体的VH和VL序列的那些。编码2-13、3-2、1-65和1-28的VH序列的示例性DNA序列分别列于SEQ ID NO：43、44、45和46。编码2-13、3-2、1-65和1-28的VL序列的示例性DNA序列分别列于SEQ ID NO：47、48、49和50。
表6：可变重链多核苷酸序列
Figure BDA0002371731700000491
Figure BDA0002371731700000501
表7：可变轻链多核苷酸序列
Figure BDA0002371731700000502
用于制备本文公开的抗FAM19A5抗体的方法可包括在包括编码具有信号肽的重链和轻链的核苷酸序列的细胞系中表达重链和轻链，所述核苷酸序列分别例如SEQ ID NO：43和47，SEQ ID NO：44和48，SEQ ID NO：46和50。包括这些核苷酸序列的宿主细胞包括在本发明内。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，这些DNA片段就可以通过标准重组DNA技术进一步操作，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白的另一种DNA片段如抗体恒定区或柔性接头可操作地连接。如本上下文所用，术语“可操作地连接”旨在指两个DNA片段连接，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat E.A.等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》第五版(U.S.Department ofHealth and Human Services)，NIH公开号91-3242)，并且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如IgG2和/或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子可操作地连接。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat E.A.等人，(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》第五版(U.S.Department ofHealth and Human Services)，NIH公开号91-3242)，并且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与另一个编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4–Ser)3)的片段可操作地连接，以使VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird等人(1988)《科学(Science)》242:423-426；Huston等人，(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883；McCafferty等人，(1990)《自然(Nature)》348:552-554)。
在一些实施例中，本公开提供了包括分离的核酸分子的载体，所述分离的核酸分子包括编码抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。在其它实施例中，载体可用于基因治疗。
本公开的合适载体包含表达载体、病毒载体和质粒载体。在一个实施例中，载体是病毒载体。
如本文所用，表达载体是指任何核酸构建体，其含有插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件，或在RNA病毒载体的情况下，当引入适当的宿主细胞时，含有复制和翻译所必需的元件。表达载体可以包含质粒、噬菌粒、病毒及其衍生物。
本公开的表达载体可以包含编码本文所述的抗体或其抗原结合部分的多核苷酸。在一个实施例中，抗体或其抗原结合部分的编码序列与表达控制序列可操作地连接。如本文所用，当两个核酸序列以允许每个组成核酸序列保留其功能性的方式共价连接时，它们被称为是可操作地连接的。当编码序列和基因表达控制序列以使得编码序列的表达或转录和/或翻译处于基因表达控制序列的影响或控制之下的方式共价连接时，则称它们是可操作地连接的。如果在5'基因表达序列中诱导启动子导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接的性质不(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应RNA转录物翻译成蛋白的能力，则称两个DNA序列是可操作地连接的。因此，如果基因表达序列能够影响编码核酸序列的转录，使得所得转录物被翻译成所需抗体或其抗原结合部分，则基因表达序列将可操作地连接至编码核酸序列。
病毒载体包含但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，如莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；慢病毒；腺病毒；腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；EB病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒如逆转录病毒。可以容易地使用本领域熟知的其它载体。某些病毒载体基于非致细胞病变的真核病毒，其中非必需基因已被目标基因取代。非致细胞病变病毒包含逆转录病毒，其生命周期包括基因组病毒RNA逆转录为DNA，随后前病毒整合到宿主细胞DNA中。逆转录病毒已被批准用于人类基因疗法试验。最有用的是那些复制缺陷型(即能够指导期望蛋白的合成，但不能够制造感染性颗粒)的逆转录病毒。此类遗传改变的逆转录病毒表达载体具有在体内高效转导基因的一般用途。在Kriegler M.，《基因转移和表达，实验室手册(GeneTransfer and Expression,A Laboratory Manual)》，W.H.Freeman Co.,New York(1990)和Murry E.J.，《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》，Vol.7,HumanaPress,Inc.,Cliffton,N.J.(1991)中提供了用于生产复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包含将外源遗传物质掺入质粒中、用质粒转染包装细胞系、通过包装细胞系生产重组逆转录病毒、从组织培养基中收集病毒颗粒以及用病毒颗粒感染靶细胞的步骤)。
在一个实施例中，病毒是腺相关病毒，是一种双链DNA病毒。腺相关病毒可被工程化为复制缺陷型，并且能够感染广泛的细胞类型和种类。它还具有优点如热和脂质溶剂稳定性；在包含造血细胞在内的不同谱系细胞中的高转导频率；并且缺乏重复感染抑制，因此允许多个系列的转导。据报道，腺相关病毒可以以位点特异性的方式整合到人细胞DNA中，从而使插入突变的可能性和逆转录病毒感染的插入基因表达特征的可变性降到最低。此外，在不存在选择压力的情况下，野生型腺相关病毒感染已经在组织培养中追踪超过100代，这意味着腺相关病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺相关病毒也可以染色体外方式起作用。
在其它实施例中，载体源自慢病毒。在某些实施例中，所述载体是能够感染非分裂细胞的重组慢病毒的载体。
慢病毒基因组和前病毒DNA典型具有逆转录病毒中发现的三个基因：gag、pol和env，其侧翼为两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核壳)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR用于促进病毒粒子RNA的转录和多腺苷酸化。LTR含有病毒复制所必需的所有其它顺式作用序列。慢病毒具有其它基因，包含vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-l、HIV-2和/或SIV中)。
与5'LTR相邻的是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效衣壳化成颗粒(psi位点)所必需的序列。如果衣壳化(或逆转录病毒RNA包装到感染性病毒粒子中)所必需的序列从病毒基因组中缺失，则顺式缺陷会预防基因组RNA的衣壳化。
然而，所得突变体仍然能够指导所有病毒粒子蛋白的合成。本公开提供了一种产生能够感染非分裂细胞的重组慢病毒的方法，包括用两种或更多种携带包装功能的载体转染合适的宿主细胞，即gag、pol和env以及rev和tat。如下文将公开的，缺乏功能性Tat基因的载体对于某些应用是期望的。因此，例如，第一载体可提供编码病毒gag和病毒pol的核酸，而另一载体可提供编码病毒env的核酸，以产生包装细胞。将提供异源基因的载体(本文鉴定为转移载体)引入该包装细胞产生生产细胞，其释放携带目标外源基因的感染性病毒颗粒。
根据载体和外源基因的上述构型，第二载体可提供编码病毒包膜(env)基因的核酸。env基因可以源自几乎任何合适的病毒，包含逆转录病毒。在一些实施例中，env蛋白是双嗜性包膜蛋白，其允许人和其他物种的细胞的转导。
源自逆转录病毒的env基因的实例包含但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。也可使用其它env基因，如水泡性口炎病毒(VSV)蛋白G(VSV G)、肝炎病毒和流感病毒的env基因。
提供病毒env核酸序列的载体与本文别处所述的调节序列可操作地连接。
在某些实施例中，所述载体包含慢病毒载体，其中HIV毒力基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，而不损害所述载体转导非分裂细胞的能力。
在一些实施例中，载体包含包括3'LTR的U3区缺失的慢病毒载体。U3区的缺失可以是完全缺失或部分缺失。
在一些实施例中，包括本文所述FVIII核苷酸序列的本公开的慢病毒载体可以在细胞中用(a)包括gag、pol或gag和pol基因的第一核苷酸序列和(b)包括异源env基因的第二核苷酸序列转染；其中所述慢病毒载体缺乏功能性tat基因。在其它实施例中，细胞进一步用包括rev基因的第四核苷酸序列转染。在某些实施例中，慢病毒载体缺乏选自vif、vpr、vpu、vpx和nef或其组合的功能性基因。
在某些实施例中，慢病毒载体包括编码gag蛋白、Rev-响应元件、中央聚嘌呤区域(cPPT)或其任何组合的一种或多种核苷酸序列。
慢病毒载体的实例公开于WO9931251、W09712622、W09817815、W09817816和WO9818934中，其全部内容通过引用并入本文。
其它载体包含质粒载体。质粒载体在本领域中已被广泛描述，并且是本领域技术人员所熟知的。参见，例如，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。在过去的几年中，已经发现质粒载体对于体内递送基因至细胞是特别有利的，因为它们不能在宿主基因组内复制并整合到宿主基因组中。然而，这些质粒具有与宿主细胞相容的启动子，可以表达来自在质粒内可操作编码的基因的肽。一些通常使用的质粒可从商业供应商处获得，包含pBR322、pUC18、pUC19、各种pcDNA质粒、pRC/CMV、各种pCMV质粒、pSV40和pBlueScript。具体质粒的其它实例包含pcDNA3.1，目录号V79020；pcDNA3.1/hygro，目录号V87020；pcDNA4/myc-His，目录号V86320；和pBudCE4.1，目录号V53220，全部来自Invitrogen(Carlsbad,CA)。其它质粒是本领域普通技术人员熟知的。另外，质粒可以使用标准分子生物学技术定制设计以除去和/或添加DNA的具体片段。
V.抗体生产
免疫特异性结合至FAM19A5(例如人FAM19A5)的抗体或其片段可通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法产生，例如通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有说明，否则本文所述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和本领域技术的相关领域中的常规技术。这些技术描述于例如本文引用的参考文献中，并在文献中充分解释。参见，例如，Maniatis T等人，(1982)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Sambrook J等人，(1989)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》第二版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；Sambrook J等人，(2001)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM等人，《分子生物学最新方案(Current Protocols in MolecularBiology)》(John Wiley&Sons)(1987和每年的更新版)；《免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)》(John Wiley&Sons)(1987和每年的更新版)；Gait(ed.)(1984)《寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)》(IRL Press)；Eckstein(ed.)(1991)《寡核苷酸和类似物：实用方法(Oligonucleotidesand Analogues:A Practical Approach)》(IRL Press)；Birren B等人，(eds.)(1999)《基因组分析：实验室手册(Genome Analysis:A Laboratory Manual)》(Cold Spring HarborLaboratory Press)。
在一个具体实施例中，本文所述的抗体是通过涉及产生的任何方法，例如通过合成、DNA序列的遗传工程而制备、表达、产生或分离的抗体(例如重组抗体)。在某些实施例中，此类抗体包括在体内在动物或哺乳动物(例如人)的全套抗体种系内不天然存在的序列(例如DNA序列或氨基酸序列)。
在某一方面，本文提供了制备免疫特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养本文所述的细胞或宿主细胞。在某一方面，本文提供了制备免疫特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如包括编码本文所述的抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如重组表达)所述抗体或其抗原结合片段。在一个特定实施例中，所述细胞是分离的细胞。在一个特定实施例中，外源多核苷酸已被引入细胞。在一个特定实施例中，所述方法还包括纯化从细胞或宿主细胞获得的抗体或其抗原结合片段的步骤。
产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，Ausubel FM等人(2002)第5版《分子生物学短方案(Short Protocols in Molecular Biology)》的第11章，eds.,JohnWiley and Sons,New York)。
单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术制备，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，包含本领域已知的和例如在Harlow E和Lane D，《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，(ColdSpring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling GJ等人，《单克隆抗体和T细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)》563681(Elsevier,N.Y.,1981)中教导的那些。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。例如，单克隆抗体可从外源表达本文所述抗体或其片段(例如，此类抗体的轻链和/或重链)的宿主细胞重组产生。
在具体实施例中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单细胞(例如，产生重组抗体的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体，其中抗体免疫特异性结合FAM19A5(例如，人FAM19A5)，如通过ELISA或本领域已知或本文提供的实施例中的其它抗原结合或竞争性结合测定所确定的。在特定实施例中，单克隆抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施例中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如二价)抗体。在特定实施例中，单克隆抗体是单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。本文所述的单克隆抗体可以例如通过如Kohler G和Milstein C(1975)《自然(Nature)》256:495所述的杂交瘤方法制备，或者例如，可以使用本文所述的技术从噬菌体文库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其它方法是本领域熟知的(参见，例如，Ausubel FM等人(2002)第5版《分子生物学短方案(ShortProtocols in Molecular Biology)》第11章，同上)。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域常规的和熟知的。例如，在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它合适的宿主动物，如绵羊、山羊、兔、大鼠、仓鼠或猕猴，以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质(例如人FAM19A5)的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。然后使用合适的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding JW(Ed)，《单克隆抗体：原理与实践(MonoclonalAntibodies:Principles and Practice)》，pp.59-103(Academic Press,1986))。另外，RIMMS(多位点重复免疫)技术可用于免疫动物(Kilpatrick KE等人，(1997)《杂交瘤(Hybridoma)》16:381-9，其全文通过引用并入本文)。
在一些实施例中，小鼠(或其它动物，例如鸡、大鼠、猴、驴、猪、绵羊、仓鼠或狗)可用抗原(例如FAM19A5，如人FAM19A5)免疫，且一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到抗原特异性抗体，就收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过熟知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞，例如与可从美国模式培养物保藏所(ATCC)(Manassas,VA)获得的细胞系SP20的细胞融合，以形成杂交瘤。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。在某些实施例中，收获免疫小鼠的淋巴结并与NSO骨髓瘤细胞融合。
将由此制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质预防HGPRT缺陷细胞的生长。
具体的实施例使用骨髓瘤细胞，其有效融合，支持所选抗体产生细胞稳定地高水平产生抗体，并且对培养基如HAT培养基敏感。这些骨髓瘤细胞系包括鼠骨髓瘤细胞系，例如NSO细胞系或衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，该细胞系可从索尔克研究所细胞分配中心(San Diego,CA,USA)获得，并且SP-2或X63-Ag8.653细胞可从美国模式培养物保藏所(Rockville,MD,USA)获得。人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系也已被描述用于生产人单克隆抗体(Kozbor D(1984)《免疫学杂志(J Immunol)》133:3001-5；Brodeur等人，《单克隆抗体生产技术与应用(Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications)》，pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对FAM19A5(例如人FAM19A5)的单克隆抗体的产生。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过本领域已知的方法测定，例如免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。
在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序亚克隆，并通过标准方法(Goding JW(Ed)，《单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)》，同上)生长克隆。用于此目的合适培养基包含，例如，D-MEM或RPMI 1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为动物中的腹水瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中适当分离。
本文所述的抗体包含识别特异性FAM19A5(例如人FAM19A5)，并且可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生的抗体片段。例如，本文所述的Fab和F(ab')2片段可通过使用酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)蛋白水解切割免疫球蛋白分子来产生。Fab片段对应于抗体分子的两个相同臂之一，并含有与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab')2片段含有通过铰链区中的二硫键连接的抗体分子的两个抗原结合臂。
此外，本文所述的抗体或其抗原结合片段也可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生。在噬菌体展示方法中，抗体功能域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。特别地，从动物cDNA文库(例如，受影响组织的人或非人如鼠或鸡cDNA文库)中扩增编码VH和VL结构域的DNA序列。通过PCR将编码VH和VL结构域的DNA与scFv接头重组在一起并克隆到噬菌粒载体中。将载体在大肠杆菌中电穿孔，并用辅助噬菌体感染大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体典型地是丝状噬菌体，包含fd和M13，并且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。表达结合特定抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原选择或鉴定，例如，使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或珠的抗原。可用于制备本文所述抗体的噬菌体展示方法的实例包含Brinkman U等人，(1995)《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》182:41-50；Ames RS等人，(1995)《免疫学方法杂志(J ImmunolMethods)》184:177-186；Kettleborough CA 等人，(1994)《欧洲免疫学杂志(Eur JImmunol)》24:952-958；Persic L等人，(1997)《基因(Gene)》187:9-18；Burton DR和BarbasCF(1994)《高等免疫学(Advan Immunol)》57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/001134；国际公开号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO 97/13844；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108中公开的那些。
如上文参考文献所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生完整抗体，包含人抗体或任何其它所需的抗原结合片段，并在任何所需宿主中表达，包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下所述。重组产生抗体片段如Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术也可使用本领域已知的方法，如PCT公开号WO92/22324；Mullinax RL等人，(1992)《生物技术(BioTechniques)》12(6):864-9；Sawai H等人，(1995)《美国生殖免疫学杂志(Am J Reprod Immunol)》34:26-34；和Better M等人，(1988)《科学(Science)》240:1041-1043中公开的那些。
在一方面，为了产生完整抗体，可以使用包含VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧翼序列的PCR引物从模板例如scFv克隆扩增VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，PCR扩增的VH结构域可以克隆到表达VH恒定区的载体中，并且PCR扩增的VL结构域可以克隆到表达VL恒定区，例如人κ或λ恒定区的载体中。VH和VL结构域也可克隆到表达必需恒定区的一个载体中。然后使用本领域技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体例如IgG的稳定或瞬时细胞系。
嵌合抗体是其中抗体的不同部分来源于不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗体可以含有融合至人抗体恒定区的非人动物(例如小鼠、大鼠或鸡)单克隆抗体的可变区。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison SL(1985)《科学(Science)》229:1202-7；Oi VT和Morrison SL(1986)《生物技术(BioTechniques)》4:214-221；Gillies SD等人，(1989)《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》125:191-202；和美国专利号5,807,715、4,816,567、4,816,397和6,331,415。
人源化抗体能够结合预定抗原，并且其包括基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区和基本上具有非人免疫球蛋白(例如鼠或鸡免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDR。在特定实施例中，人源化抗体还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。抗体还可以包含重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包含IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术来生产，包含但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)，镶面或表面重建(欧洲专利号EP 592106和EP 519596；Padlan EA(1991)《分子免疫学(Mol Immunol)》28(4/5):489-498；Studnicka GM等人，(1994)《蛋白质工程学(ProtEngineering)》7(6):805-814；和Roguska MA等人，(1994)《美国科学院院报(PNAS)》91:969-973)，链改组(美国专利号5,565,332)和公开在例如美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号WO 93/17105；Tan P等人，(2002)《免疫学杂志(J Immunol)》169:1119-25；Caldas C等人，(2000)《蛋白质工程学(Protein Eng.)》13(5):353-60；MoreaV等人，(2000)《方法(Methods)》20(3):267-79；Baca M等人，(1997)《生物化学杂志(J BiolChem)》272(16):10678-84；Roguska MA等人，(1996)《蛋白质工程学(Protein Eng)》9(10):895 904；Couto JR等人，(1995)《癌症研究(Cancer Res.)》55(23Supp):5973s-5977s；Couto JR等人，(1995)《癌症研究(Cancer Res.)》55(8):1717-22；Sandhu JS(1994)《基因(Gene)》150(2):409-10和Pedersen JT等人，(1994)《分子生物学杂志(J Mol Biol)》235(3):959-73中的技术。还参见整体通过引用并入本文的美国申请公开号US 2005/0042664Al(Feb.24,2005)。
已经描述了用于制备多特异性(例如双特异性抗体)的方法。参见，例如，美国专利号7,951,917；7,183,076；8,227,577；5,837,242；5,989,830；5,869,620；6,132,992和8,586,713。
单结构域抗体，例如缺乏轻链的抗体，可以通过本领域熟知的方法产生。参见Riechmann L和Muyldermans S(1999)《免疫学杂志(J Immunol)》231:25-38；Nuttall SD等人，(2000)《当前制药生物技术(Curr Pharm Biotechnol)》1(3):253-263；Muyldermans S，(2001)《生物技术杂志(J Biotechnol)》74(4):277-302；美国专利号6,005,079；和国际公开号WO94/04678、WO94/25591和WO01/44301。
此外，使用本领域技术人员熟知的技术，免疫特异性结合FAM19A5抗原的抗体可进而用于产生“模拟”抗原的抗独特型抗体。(参见，例如Greenspan NS和Bona CA(1989)《美国实验生物学会联合会会志(FASEB J)》7(5):437-444；和Nissinoff A(1991)《免疫学杂志(JImmunol)》147(8):2429-2438)。
在特定实施例中，与本文所述的抗FAM19A5抗体结合FAM19A5(例如，人FAM19A5)的相同表位的本文所述的抗体是人抗体或其抗原结合片段。在特定实施例中，竞争性阻断(例如以剂量依赖性方式)本文所述抗体(例如2-13和3-2)与FAM19A5(例如人FAM19A5)结合的本文所述抗体是人抗体或其抗原结合片段。
人抗体可以使用本领域已知的任何方法产生。例如，可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。特别地，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以单独地或与通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座同时地被赋予非功能性。特别地，JH区的纯合缺失预防了内源抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。用选择的抗原，例如全部或部分抗原(例如FAM19A5)以正常方式免疫转基因小鼠。使用常规杂交瘤技术，可以从免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用此类技术，可以生产治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于这种生产人抗体的技术的概述，参见Lonberg N和Huszar D(1995)《免疫学国际综述(Int Rev Immunol)》13:65-93。关于生产人抗体和人单克隆抗体的这种技术以及生产这种抗体的方案的详细讨论，参见例如国际公开号WO98/24893、WO96/34096和WO96/33735；和美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598。能够产生人抗体的小鼠的实例包含XENOMOUSETM(Abgenix,Inc.；美国专利号6,075,181和6,150,184)、HUAB-MOUSETM(Mederex,Inc./Gen Pharm；美国专利号5,545,806和5,569,825)、TRANS CHROMO MOUSETM(Kirin)和KM MOUSETM(Medarex/Kirin)。
特异性结合FAM19A5(例如，人FAM19A5)的人抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包含使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的上述噬菌体展示方法。还参见美国专利号4,444,887、4,716,111和5,885,793；以及国际公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。
在一些实施例中，人抗体可以使用小鼠-人杂交瘤产生。例如，用Epstein-Barr病毒(EBV)转化的人外周血淋巴细胞可与小鼠骨髓瘤细胞融合以产生分泌人单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，并且可筛选这些小鼠-人杂交瘤以确定分泌免疫特异性结合靶抗原(例如FAM19A5如人FAM19A5)的人单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤。此类方法是已知的，并且在本领域中有所描述，参见例如Shinmoto H等人，(2004)《细胞技术学(Cytotechnology)》46:19-23；Naganawa Y等人，(2005)《人抗体(Human Antibodies)》14:27-31。
VI.工程化抗体的方法
如上所述，具有本文公开的VH和VL序列的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可通过修饰VH和/或VL序列或与其连接的恒定区而用于产生新的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分。因此，在本文所述的另一方面，本文所述的抗FAM19A5抗体如2-13和3-2的结构特征用于产生结构相关的抗FAM19A5抗体，其保留本文所述抗体的至少一种功能性质，例如结合人FAM19A5。例如，用于工程化方法的起始材料是本文提供的VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不必实际制备(即表达为蛋白质)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，含在序列中的信息被用作起始材料以产生源自原始序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并将其表达为蛋白质。
因此，本文提供了制备抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分的方法，其包括：
(a)提供：(i)重链可变区序列，其包括表2中所列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列或表4中所列的重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3；和(ii)轻链可变区序列，其包括表3中所列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列或表5中所列的轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3；
(b)改变重链可变区序列和/或轻链可变区序列内的至少一个氨基酸残基，以产生至少一个改变的抗体或抗原结合部分序列；以及
(c)将改变的抗体或抗原结合部分序列表达为蛋白质。
标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体或抗原结合部分序列。
在一些实施例中，由改变的抗体或抗原结合部分序列编码的抗体或其抗原结合部分是保留本文所述抗FAM19A5抗体的一种、一些或所有功能性质的抗体或其抗原结合部分，所述功能性质包含，
(1)例如以10nM或更小(例如0.01nM至10nM)的KD结合可溶性人FAM19A5，例如如通过Biacore测量的；
(2)例如以1nM或更小(例如0.01nM至1nM)的KD结合膜结合性人FAM19A5，例如如通过ELISA测量的；
(3)例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合膜结合性人FAM19A5，例如如通过ELISA所测量的；
(4)减少、逆转、延迟和/或预防反应性神经胶质增生的发作；
(5)抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖；
(6)降低硫酸软骨素蛋白聚糖包含神经聚糖和神经元-神经胶质抗原2(NG2)的表达；
(7)增加神经元细胞核中c-fos和pERK的表达；
(8)促进神经元存活；
(9)增加神经元中GAP43的表达；
(10)促进轴突的再生长；以及
(11)与2-13、3-2或1-28在任一方向或两个方向竞争结合人FAM19A5。
改变的抗体或其抗原结合部分可以表现出一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种或所有上述(1)-(11)中列出的功能性质。改变的抗体或其抗原结合部分的功能性质可以使用本领域可获得的和/或本文描述的标准测定来评估，例如实例中所列的那些(例如ELISA、FACS)。
在本文所述的工程化抗体的方法的某些实施例中，可以沿着编码抗FAM19A5抗体的序列的全部或部分随机或选择性地引入突变，并且可以筛选所得的修饰的抗FAM19A5抗体的结合活性和/或本文所述的其它功能性质。突变方法已在本领域中描述。例如，PCT公开WO 02/092780简短地描述了使用饱和诱变、合成的连接组装或其组合产生和筛选抗体突变的方法。或者，Lazar等人的PCT公开WO 03/074679描述了使用计算筛选方法优化抗体的生理化学性质的方法。
VII.细胞和载体
在某些方面，本文提供了表达(例如重组)本文所述抗体(或其抗原结合片段)的细胞(例如宿主细胞)，所述抗体特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)和相关多核苷酸和表达载体。本文提供了包括多核苷酸的载体(例如，表达载体)，所述多核苷酸包括编码抗FAM19A5抗体或片段的核苷酸序列，以用于在宿主细胞中，例如在哺乳动物细胞中重组表达。本文还提供了包括用于重组表达本文所述的抗FAM19A5抗体(例如人或人源化抗体)的此类载体的宿主细胞。在一个特定方面，本文提供了用于产生本文所述的抗体的方法，包括从宿主细胞表达此类抗体。
特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的本文所述抗体(例如全长抗体、抗体的重链和/或轻链或本文所述单链抗体)的重组表达包括构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得了编码本文所述的抗体分子、抗体的重链和/或轻链或其片段(例如重链和/或轻链可变结构域)的多核苷酸，就可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术产生用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体或抗体片段(例如轻链或重链)的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有抗体或抗体片段(例如轻链或重链)编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包含，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了可复制的载体，其包括编码本文所述抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变结构域或其片段或重链或轻链CDR的核苷酸序列，该核苷酸序列可操作地连接至启动子。此类载体可以例如包含编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如国际公开号WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且抗体的可变结构域可以克隆到此类载体中以表达完整的重链、完整的轻链或完整的重链和轻链两者。
表达载体可以通过常规技术转移到细胞(例如宿主细胞)中，然后可以通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的抗体(例如2-13、3-2或1-28的抗体，其包括VH和/或VL，或VH和/或VL CDR的一个或多个)或其片段。因此，本文提供了含有多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码本文所述的抗体或其片段，或其重链或轻链，或其片段，或本文所述的单链抗体，所述多核苷酸可操作地连接至启动子以在宿主细胞中表达此类序列。在某些实施例中，为了表达双链抗体，可以在宿主细胞中共表达分别编码重链和轻链的载体，以表达完整的免疫球蛋白分子，如下所详述的。在某些实施例中，宿主细胞含有包括编码本文所述抗体的重链和轻链两者的多核苷酸或其片段的载体。在具体的实施例中，宿主细胞含有两种不同的载体，第一种载体包括编码本文所述抗体的重链或重链可变区的多核苷酸或其片段，且第二种载体包括编码本文所述抗体的轻链或轻链可变区的多核苷酸或其片段。在其他实施例中，第一宿主细胞包括第一载体，所述第一载体包括编码本文所述抗体的重链或重链可变区的多核苷酸或其片段，并且第二宿主细胞包括第二载体，所述第二载体包括编码本文所述抗体的轻链或轻链可变区的多核苷酸。在具体实施例中，由第一细胞表达的重链/重链可变区与第二细胞的轻链/轻链可变区缔合以形成本文所述的抗FAM19A5抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，本文提供了包括此类第一宿主细胞和此类第二宿主细胞的宿主细胞群。
在一个特定实施例中，本文提供了一载体群，其包括第一载体和第二载体，所述第一载体包括编码本文所述抗FAM19A5抗体轻链/轻链可变区的多核苷酸，且所述第二载体包括编码本文所述抗FAM19A5抗体重链/重链可变区的多核苷酸。
多种宿主表达载体系统可用于表达本文所述的抗体分子。此类宿主表达系统代表了可以用来产生并随后纯化目标编码序列的载体，而且代表了当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所述的抗体分子的细胞。这些包含但不限于微生物，例如用含有编码抗体的序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有编码抗体的序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母)；用含有编码抗体的序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用含有编码抗体的序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如绿藻，如莱茵衣藻)；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS(如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NSO、PER.C6、VERO、CRL7030、HsS78Bst、HeLa和NIH3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、Rl.l、B-W、L-M、BSCl、BSC40、YB/20和BMT10细胞)，所述重组表达构建体含有来自哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。在一个具体实施例中，用于表达本文所述抗体或其抗原结合片段的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS SYSTEMTM(Lonza)的CHO细胞。在一个特定实施例中，用于表达本文所述抗体的细胞是人细胞，例如人细胞系。在一个具体实施例中，哺乳动物表达载体是POPTIVECTM或pcDNA3.3。在一个特定实施例中，细菌细胞如大肠杆菌或真核细胞(例如哺乳动物细胞)，尤其是用于表达完整重组抗体分子的细胞，被用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，与载体如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的结合是抗体的有效表达系统(Foecking MK和Hofstetter H(1986)《基因(Gene)》45:101-5；和Cockett MI等人，(1990)《生物技术(Biotechnology)》8(7):662-7)。在某些实施例中，本文所述的抗体由CHO细胞或NSO细胞产生。在一个具体实施例中，编码免疫特异性结合FAM19A5(例如人FAM19A5)的本文所述抗体的核苷酸序列的表达受组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节。
在细菌系统中，根据表达的抗体分子的预期用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量此类抗体时，为了产生抗体分子的药物组合物，指导表达易于纯化的高水平融合蛋白产物的载体可能是理想的。此类载体包含但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U和Mueller-Hill B(1983)《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)》2:1791-1794)，其中编码抗体的序列可以与lac Z编码区框内单独连接到载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S和Inouye M(1985)《核酸研究(Nuc Acids Res)》13:3101-3109；Van HeekeG和Schuster SM(1989)《生物化学杂志(J Biol Chem)》24:5503-5509)；等。例如，pGEX载体也可用于表达外源多肽与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，此类融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附和结合到基质谷胱甘肽琼脂糖珠上，然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体设计成包含凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可以用作表达外源基因的载体。该病毒在草地夜蛾细胞中生长。编码抗体的序列可以单独克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中，并处于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，目标编码抗体的序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后，通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(例如，El或E3区)将产生有活力的并能够在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如，参见Logan J和Shenk T(1984)《美国科学院院报(PNAS)》81(12):3655-9)。特异性起始信号也可能是插入的编码抗体的序列的有效翻译所需的。这些信号包含ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相以确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的(天然的和合成的二者)。表达效率可通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等而增强(参见，例如，Bitter G等人，(1987)《酶学方法(Methods Enzymol.)》153:516-544)。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以所需的具体方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保对所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于基因产物的初级转录物的适当加工、糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包含但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、NSO(不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7030、COS(例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、Rl.l、B-W、L-M、BSC 1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施例中，本文所述的抗FAM19A5抗体在哺乳动物细胞如CHO细胞中产生。
在一个具体实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合部分具有减少的岩藻糖含量或没有岩藻糖含量。可以使用本领域技术人员已知的技术来产生此类抗体。例如，抗体可以在缺乏或没有岩藻糖基化能力的细胞中表达。在一个具体的实例中，具有l,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因的敲除的细胞系可以用于产生具有减少的岩藻糖含量的抗体或其抗原结合部分。
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系统(Lonza)是此类系统的一个实例，其可用于产生具有减少的岩藻糖含量的抗体或其抗原结合部分。
为了长期、高产率生产重组蛋白，可以产生稳定表达细胞。例如，可工程化稳定表达本文所述的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分的细胞系。在具体实施例中，本文提供的细胞稳定表达轻链/轻链可变结构域和重链/重链可变结构域，其缔合以形成本文所述的抗体或其抗原结合部分。
在某些方面，不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是用由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标志物转化宿主细胞。在引入外源DNA/多核苷酸之后，可以允许工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将其切换到选择性培养基。重组质粒中的选择标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中，并生长以形成灶，其又可被克隆并扩展到细胞系中。该方法可有利地用于工程化表达本文所述的抗FAM19A5抗体或其抗体结合部分的细胞系。此类工程化的细胞系可特别用于筛选和评估直接或间接与抗体分子相互作用的组合物。
可以使用许多选择系统，包含但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人，(1977)《细胞(Cell)》11(1):223-32)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska EH和Szybalski W(1962)《美国科学院院报(PNAS)》48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy I等人，(1980)《细胞(Cell)》22(3):817-23)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。同样，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler M等人，(1980)《美国科学院院报(PNAS)》77(6):3567-70；O'Hare K等人，(1981)《美国科学院院报(PNAS)》78:1527-31)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan RC和Berg P(1981)《美国科学院院报(PNAS)》78(4):2072-6)；nNeo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu GY和Wu CH(1991)《生物疗法(Biotherapy)》3:87-95；Tolstoshev P(1993)《药理学与毒理学年评(Ann Rev Pharmacol Toxicol)》32:573-596；Mulligan RC(1993)《科学(Science)》260:926-932；和Morgan RA和Anderson WF(1993)《生物化学年评(Ann RevBiochem)》62:191-217；Nabel GJ和Feigner PL(1993)《生物技术的发展趋势(TrendsBiotechnol)》11(5):211-5)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre RF等人，(1984)《基因(Gene)》30(1-3):147-56)。重组DNA技术领域中通常已知的方法可常规地用于选择所需的重组克隆，并且此类方法描述于例如整体通过引用并入本文的Ausubel FM等人，(eds.)《分子生物学最新方案(Current Protocols in Molecular Biology)》，JohnWiley&Sons,NY(1993)；Kriegler M，《基因转移和表达(Gene Transfer andExpression)》，《实验室手册(A Laboratory Manual)》，Stockton Press,NY(1990)；和Dracopoli NC等人，(eds.)《人类遗传学的最新方案(Current Protocols in HumanGenetics)》第12和13章，John Wiley&Sons,NY(1994)；Colbere-Garapin F等人，(1981)《分子生物学杂志(J Mol Biol)》150:1-14。
抗体分子的表达水平可以通过载体扩增来增加(综述参见Bebbington CR和Hentschel CCG，《基于基因扩增的载体在DNA克隆中在哺乳动物细胞中表达克隆基因的用途(The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning)》第3卷(Academic Press,NewYork,1987))。当表达抗体的载体系统中的标志物可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志物基因的拷贝数。由于扩增区与抗体基因相关，抗体的产生也将增加(Crouse GF等人，(1983)《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》3:257-66)。
宿主细胞可以用两种或更多种本文所述的表达载体共转染，第一种载体编码重链衍生的多肽，且第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可以含有相同的可选择标志物，其使得重链和轻链多肽能够同等表达。宿主细胞可以用不同量的两种或更多种表达载体共转染。例如，宿主细胞可以用第一种表达载体和第二种表达载体的下列比例中的任何一种转染：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。
或者，可以使用编码并能够表达重链和轻链多肽二者的单一载体。在这种情况下，轻链应该置于重链之前以避免过量的无毒重链(Proudfoot NJ(1986)《自然(Nature)》322:562-565；和Kohler G(1980)《美国科学院院报(PNAS)》77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子或多顺反子。多顺反子核酸构建体可编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个基因/核苷酸序列，或在2-5、5-10或10-20个基因/核苷酸序列的范围内。例如，双顺反子核酸构建体可以按以下顺序包括启动子、第一基因(例如，本文所述的抗体的重链)和第二基因(例如，本文所述的抗体的轻链)。在此类表达载体中，两个基因的转录都可以由启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以通过帽依赖性扫描机制进行，而来自第二基因的mRNA的翻译可以通过帽非依赖性机制进行，例如通过IRES进行。
一旦通过重组表达产生了本文所述的抗体分子，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如通过色谱法(如，离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是通过蛋白A后对特定抗原的亲和力，和大小分级柱色谱法(sizing columnchromatography))、离心、差异溶解或通过用于纯化蛋白的任何其它标准技术来纯化。此外，本文所述的抗体可与本文所述的异源多肽序列融合或以本领域已知的其它方式融合以促进纯化。
在具体实施例中，分离或纯化本文所述的抗体或其抗原结合部分。通常，分离的抗体是基本上不含具有与分离的抗体不同的抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，在特定实施例中，本文所述的抗体制剂基本上不含细胞物质和/或化学前体。词语“基本上不含细胞物质”包含抗体制剂，其中抗体与细胞的细胞组分分离，从所述细胞分离或重组产生抗体。因此，基本上不含细胞物质的抗体包含具有少于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白(本文也称为“污染蛋白”)和/或抗体变体(例如，抗体的不同翻译后修饰形式或抗体的其它不同版本(或抗体结合部分))的抗体制剂。当重组产生抗体时，其通常也基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成产生抗体时，其通常基本上不含化学前体或其它化学物质，即，其与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，抗体的此类制剂具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的除目的抗体以外的化学前体或化合物。在一个具体实施例中，分离或纯化本文所述的抗体。
VIII.测定
可通过例如标准ELISA测试本文所述抗体与FAM19A5的结合。简言之，用于PBS中的1-2μg/ml纯化的FAM19A5包被微量滴定板，然后用于PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。将抗体稀释液(例如，来自FAM19A5免疫的小鼠的血浆稀释液)加入每个孔中并在37℃下孵育1-2小时。用PBS/Tween洗涤板，然后在37℃下与缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的第二试剂(例如，对于人抗体，山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起孵育1小时。洗涤后，用ABTS底物(Moss Inc，产品：ABTS-1000)显影板并通过分光光度计在OD 415-495下分析。然后通过流式细胞术进一步筛选来自免疫小鼠的血清与表达人FAM19A5的细胞系的结合，但不与不表达FAM19A5的对照细胞系的结合。简言之，通过将表达FAM19A5的CHO细胞与1:20稀释的抗FAM19A5抗体孵育来评估抗FAM19A5抗体的结合。洗涤细胞，用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞术(Becton Dickinson,San Jose,CA)进行流式细胞术分析。优选地，将产生最高滴度的小鼠用于融合。
如上所述的ELISA测定可用于筛选抗体，并因此筛选产生显示与FAM19A5免疫原的阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后可亚克隆并进一步表征产生优选以高亲和力结合FAM19A5的抗体的杂交瘤。然后可以从每个杂交瘤中选择一个保留了亲代细胞反应性(通过ELISA)的克隆用于制备细胞库和用于抗体纯化。
为了纯化抗FAM19A5抗体，可在两升旋转瓶中生长选择的杂交瘤用于单克隆抗体纯化。过滤并浓缩上清液，然后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,NJ)进行亲和色谱法。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法检测以确保纯度。缓冲液可以换成PBS，且浓度可以通过OD 280使用1.43消光系数来确定。单克隆抗体可被等分并在-80℃下储存。
为了确定所选择的抗FAM19A5单克隆抗体是否结合独特表位，可以使用市售试剂(Pierce,Rockford,IL)将每种抗体生物素化。生物素化的MAb结合可以用链霉亲和素标记的探针检测。使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究可以使用如上所述的FAM19A5包被的ELISA板进行。
为了确定纯化抗体的同种型，可使用对特定同种型抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，微量滴定板的孔可以用1μg/ml抗人免疫球蛋白在4℃包被过夜。在用1％BSA封闭后，使板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度反应一至两个小时。然后，孔可以与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合探针反应。如上所述显影和分析板。
为了测试单克隆抗体与表达FAM19A5的活细胞的结合，可以使用流式细胞术，如实例中所述。简言之，将表达膜结合性FAM19A5的细胞系(在标准生长条件下生长)与各种浓度的单克隆抗体在含有0.1％BSA的PBS中在4℃下混合1小时。洗涤后，在与第一抗体染色相同的条件下，使细胞与荧光素标记的抗IgG抗体反应。样品可以通过FACScan仪器使用光和侧向散射性质门控单细胞来分析，并测定标记抗体的结合。除了流式细胞术测定之外，或代替流式细胞术测定，还可以使用利用荧光显微法的替代测定。细胞可以如上所述精确染色并通过荧光显微法检查。该方法允许单个细胞的可视化，但根据抗原的密度可能具有降低的灵敏度。
可通过Western Blotting进一步测试抗FAM19A5抗体与FAM19A5抗原的反应性。简言之，可制备来自表达FAM19A5的细胞的细胞提取物，并使其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，用20％小鼠血清封闭，并用待测单克隆抗体探测。IgG结合可以使用抗IgG碱性磷酸酶检测，并用BCIP/NBT底物片剂(SigmaChem.Co.,St.Louis,MO)显影。
分析各种抗FAM19A5抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包含本领域已知的标准测定，例如，使用BIACORETM2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的BIACORETM表面等离子体共振(SPR)分析。
在一个实施例中，抗体特异性结合人FAM19A5的可溶形式。在一个实施例中，抗体特异性结合人FAM19A5的膜结合形式。抗体可特异性结合FAM19A5的特定表位(例如SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：6内的片段)。在某些实施例中，抗体特异性结合人FAM19A5，优选以高亲和力结合，并且不与蛋白的FAM19亚家族的其它成员交叉反应。
IX.双特异性分子
本文所述的抗体可用于形成双特异性分子。抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分可衍生或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如另一抗体或受体配体)，以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。细胞因子如IL-6、CNTF、LIF、EGF和TGFα被认为是神经胶质增生和/或反应性星形神经胶质增生发作的触发因子(Balasingam等人，《神经科学杂志(J.Neurosci.)》14(2):846-56(1994)；Winter等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》20；92(13):5865-9(1995))，其激活蛋白信号转导和转录激活因子3(STAT3)，然后调节CNS损伤后反应性星形神经胶质增生的许多方面。HerrmannJ.E.等人，《神经科学杂志(J.Neurosci.)》28(28):7231–7243(2008)。例如，STAT3不存在或减少导致胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)上调减弱、星形胶质细胞肥大衰竭和炎症扩散增加、CNS损伤后病灶体积增加和运动恢复部分减弱。Herrmann J.E.等人，《神经科学杂志(J.Neurosci.)》28(28):7231–7243(2008)。因此，例如，抗FAM19A5抗体可与抗体或scFv连接，所述抗体或scFv与任何参与抑制神经胶质增生发作和/或反应性星形神经胶质增生过度增殖的蛋白质特异性结合以用于联合治疗，例如对IL-6CNTF、LIF、EGF或TGFα的抗体。
此外，抗FAM19A5抗体可与抗体或scFv连接，所述抗体或scFv治疗受试者的疾病或病症，包含中枢神经系统损害(例如创伤性脑损伤、脑脊髓损害、中风或脑肿瘤)、脑脊髓系统损害、退行性脑病症(例如亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化、ALS)、退行性脑脊髓或神经病症或神经病性疼痛(参见下文XIII部分的疾病或病症)。例如，抗FAM19A5抗体可与治疗多发性硬化的抗体或scFv连接，例如那他珠单抗(Tysabri)或阿仑单抗(Lemtrada)。
本文所述的抗体实际上可以衍生或连接到多于一种的其它功能分子上，以产生结合多于两种的不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也意图被如本文所用的术语“双特异性分子”涵盖。为了产生本文所述的双特异性分子，本文所述的抗体可以与一种或多种其他结合分子(例如另一种抗体、其抗体结合部分、肽或结合模拟物)功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)，从而产生双特异性分子。在一个实施例中，双特异性分子结合FAM19A5和VEGF。在另一个实施例中，双特异性分子结合FAM19A5和EGF。
因此，本文提供了包括至少一种对FAM19A5的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在本文所述的其中双特异性分子是多特异性的实施例中，所述分子还可以包含第三结合特异性。
在一个实施例中，本文所述的双特异性分子包括至少一种抗体或其抗体结合部分作为结合特异性，包含例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利号4,946,778中所述，其内容通过引用明确并入。
尽管优选人单克隆抗体，但可用于本文所述双特异性分子中的其它抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
本文所述的双特异性分子可以使用本领域已知的方法通过缀合组分结合特异性来制备。例如，双特异性分子的每个结合特异性可以分别产生，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包含蛋白质A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等人，(1984)《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》160:1686；Liu MA等人，(1985)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》82:8648)。其它方法包含Paulus(1985)《贝林研究所(Behring Ins.Mitt.)》No.78,118-132；Brennan等人，(1985)《科学(Science)》229:81-83)和Glennie等人，(1987)《免疫学杂志(J.Immunol.)》139:2367-2375)中描述的那些。优选的共轭剂是SATA和磺基-SMCC，二者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链C-末端铰链区的巯基结合而缀合。在一个特别优选的实施例中，在缀合前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基，优选一个巯基残基。
或者，两种结合特异性可以在相同载体中编码，并在相同宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、mAb x(scFv)2、Fab x F(ab')2或配体x Fab融合蛋白时，该方法特别有用。双特异性抗体可以包括在每条重链的C末端含有scFv的抗体。本文所述的双特异性分子可以是包括一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包括两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包括至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可使用本领域公认的方法来确认，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或Western Blot测定。这些测定法中的每一种通常通过使用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特别相关的蛋白质-抗体复合物的存在。
X.诊断
在一个实施例中，与抗FAM19A5抗体连接的部分选自由结合部分、标记部分和生物活性部分组成的群组。
本文所述的抗体可用于诊断目的，包含样品测试和体内成像，并且为此目的，抗体(或其结合部分)可与合适的可检测试剂缀合，以形成免疫缀合物。为了诊断目的，合适的试剂是可检测标记，其包含用于全身成像的放射性同位素和用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记和其它合适的抗体标签。
可检测标记可以是目前在体外诊断学领域中使用的各种类型中的任何一种，包含颗粒标记，包含金属溶胶如胶体金，同位素如I125或Tc99，例如与N2S2、N3S或N4型肽螯合剂一起存在的同位素，发色团，包含荧光标志物、发光标志物、磷光标志物等，以及将给定底物转化为可检测标志物的酶标记，和在扩增后如通过聚合酶链式反应显示的多核苷酸标签。合适的酶标记包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。例如，标记可以是碱性磷酸酶，通过测量1,2-二氧杂环丁烷底物如金刚烷基甲氧基磷酰氧基苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{l,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.1 3,7}癸}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)以及CDP和CDP-
Figure BDA0002371731700000741
或本领域技术人员熟知的其它发光底物(例如合适镧系元素如铽(III)和铕(III)的螯合物)转化后化学发光的存在或形成来检测。检测手段由所选标记确定。在标记为颗粒状并以适当水平积累的情况下，可以使用肉眼来发现标记或其反应产物的出现，或者使用仪器如分光光度计、发光计、荧光计等来发现标记或其反应产物的出现，均按照标准惯例。
本文所述的抗体还可以与治疗剂缀合以形成免疫缀合物，例如抗体-药物缀合物(ADC)。合适的治疗剂包含调节神经胶质增生和/或反应性星形神经胶质增生的发作和/或治疗退行性脑病症、中枢神经系统损害或神经病性疼痛的药剂。用于治疗退行性脑病症的治疗剂包含用于治疗亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化和肌萎缩性侧索硬化(ALS)的药物。这包含通常用于治疗此类退行性脑病症的药物，例如，下文XII部分中公开的药物。
免疫缀合物可以通过本领域已知的方法制备。优选地，缀合方法产生基本上(或几乎)非免疫原性的连接，例如肽-(即酰胺-)、硫化物-、(空间位阻的)、二硫化物-、腙-和醚连接。这些连接几乎是非免疫原性的，并且在血清中表现出合理的稳定性(参见，例如，SenterP.D.，《化学生物学现状(Curr.Opin.Chem.Biol.)》13(2009)235-244；WO 2009/059278；WO95/17886)。
根据所述部分和抗体的生物化学性质，可以采用不同的缀合策略。在所述部分是天然存在的或50至500个氨基酸的重组体的情况下，在教科书中存在描述蛋白质缀合物合成化学的标准程序，其可由技术人员容易地遵循(参见，例如，Hackenberger C.P.R.和Schwarzer D.，《英文应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》47(2008)10030-10074)。在一个实施例中，使用马来酰亚胺基部分与抗体或部分内的半胱氨酸残基的反应。这在例如使用抗体的Fab或Fab'-片段的情况下是特别合适的偶联化学。或者，在一个实施例中，进行与抗体或部分的C-末端的偶联。蛋白质(例如Fab片段)的C-末端修饰可例如如(Sunbul M.和Yin J.，《有机和生物分子化学(Org.Biomol.Chem.)》7(2009)3361-3371)所述进行。
通常，位点特异性反应和共价偶联是基于将天然氨基酸转化成具有与存在的其它官能团的反应性正交的反应性的氨基酸。例如，稀有序列环境内的特定半胱氨酸可酶促转化为醛(参见Frese M.A.和Dierks T.，《化学生物化学(ChemBioChem.)》10(2009)425-427)。还可以通过利用某些酶与天然氨基酸在给定序列环境内的特定酶反应性来获得所需的氨基酸修饰(参见，例如Taki M.等人，《蛋白质工程设计与选择(Prot.Eng.Des.Sel.)》17(2004)119-126；Gautier A.等人，《化学与生物学(Chem.Biol.)》15(2008)128-136；和蛋白酶催化的C-N键形成，Bordusa F.，《生物有机化学亮点(Highlights in BioorganicChemistry)》(2004)389-403)。
位点特异性反应和共价偶联也可以通过末端氨基酸与适当的修饰试剂的选择性反应来实现。N-末端半胱氨酸与苄腈的反应性(参见Ren H等人，《英文应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》48(2009)9658-9662)可以用于实现位点特异性共价偶联。天然化学连接也可依赖于C-末端半胱氨酸残基(Taylor E.Vogel；Imperiali B，《核酸和分子生物学(Nucleic Acids and Molecular Biology)》(2009)第22章(蛋白质工程化)第65页-第96页)。
EP 1 074 563描述了一种缀合方法，其基于一段带负电荷的氨基酸中的半胱氨酸与位于一段带正电荷的氨基酸中的半胱氨酸的更快反应。
该部分也可以是合成肽或肽模拟物。在化学合成多肽的情况下，在此合成期间可掺入具有正交化学反应性的氨基酸(参见，例如de Graaf A.J.等人，《生物缀合物化学(Bioconjug.Chem.)》20(2009)1281-1295)。由于大量正交官能团正处于关键时刻并且可以被引入合成肽中，因此将此类肽与接头缀合是标准化学。
为了获得单标记的多肽，可以通过色谱法将具有1:1化学计量的缀合物与其它缀合副产物分离。通过使用染料标记的结合对成员和带电接头可以促进该过程。通过使用这种标记的和高度带负电荷的结合对成员，单缀合的多肽容易与非标记的多肽和携带多于一个接头的多肽分离，因为电荷和分子量的差异可以用于分离。荧光染料可用于从未结合的组分，如标记的单价结合剂中纯化复合物。
XI.药物组合物
本文提供了包括在生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(《雷氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA)中的具有期望纯度的本文所述的抗体或其抗原结合部分的组合物。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包含缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一个具体实施例中，药物组合物包括在药学上可接受的载体中的本文所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，以及任选地一种或多种另外的预防剂或治疗剂。在一个具体实施例中，药物组合物包括在药学上可接受的载体中的有效量的本文所述的抗体或其抗原结合部分，以及任选地一种或多种另外的预防剂或治疗剂。在一些实施例中，抗体是药物组合物中包含的唯一活性成分。本文所述的药物组合物可用于增强、诱导或激活FAM19A5活性和治疗病症，例如中枢神经系统损害、退行性脑病症或神经病性疼痛。
用于肠胃外制剂的药学上可接受的载体包含水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、多价螯合剂或螯合剂和其它药学上可接受的物质。水性媒介物的实例包含氯化钠注射剂、林格注射剂、等渗右旋糖注射剂、无菌水注射剂、右旋糖和乳酸林格注射剂。非水肠胃外媒介物包含植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂可以加入到包装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，所述抗微生物剂包含苯酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包含氯化钠和右旋糖。缓冲剂包含磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包含硫酸氢钠。局部麻醉剂包含盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包含羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包含聚山梨醇酯80(
Figure BDA0002371731700000771
80)。金属离子的多价螯合剂或螯合剂包含EDTA。药物载体还包含用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
药物组合物可以被配制用于向受试者施用的任何途径。施用途径的具体实例包含鼻内、口服、肠胃外、鞘内、脑室内、肺、皮下或心室内。本文还考虑了特征为皮下、肌内或静脉内注射的肠胃外施用。注射剂可以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液、适于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式或作为乳液。注射剂、溶液和乳液还含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，如果期望，待施用的药物组合物也可以含有少量无毒的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它这样的试剂，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
用于抗体的肠胃外施用的制剂包含准备注射的无菌溶液、准备在临用前与溶剂组合的无菌干燥可溶产品，例如冻干粉末，包含皮下注射片剂、准备注射的无菌悬浮液、准备在临用前与媒介物组合的无菌干燥不溶产品和无菌乳液。溶液可以是水性或非水性的。
如果静脉内施用，合适的载体包含生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。
如所述制备包括抗体的局部混合物用于局部和全身施用。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等，并且可以配制成乳膏、凝胶、软膏、乳液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂、喷雾、栓剂、绷带、皮肤贴剂或任何其它适于局部施用的制剂。
本文所述的抗体或其抗原结合部分可以配制成用于局部施用的气雾剂，例如通过吸入(参见，例如，美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述了用于递送可用于治疗炎性疾病，特别是哮喘的类固醇的气雾剂)。这些用于向呼吸道施用的制剂可以是用于喷雾器的气雾剂或溶液的形式，或者是用于吹入的微细粉末，单独地或与惰性载体如乳糖组合。在这种情况下，在一个实施例中，制剂的颗粒的直径小于50微米，在一个实施例中小于10微米。
本文所述的抗体或其抗原结合部分可以配制成用于局地或局部施用，例如用于局部应用至皮肤和粘膜，例如在眼中，以凝胶、乳膏和洗剂的形式，并且用于应用至眼或用于脑池内或脊柱内应用。局部施用考虑用于经皮递送，也用于向眼睛或粘膜施用，或用于吸入疗法。也可以施用单独的抗体鼻溶液或与其它药学上可接受的赋形剂组合的抗体鼻溶液。
经皮贴剂，包含离子电渗和电泳装置，是本领域技术人员熟知的，并且可以用于施用抗体。例如，这种贴剂公开于美国专利号6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中。
在某些实施例中，包括本文所述的抗体或其抗原结合部分的药物组合物是冻干粉末，其可以重构用于作为溶液、乳液和其它混合物施用。它也可以被重构和配制成固体或凝胶。通过将本文所述的抗体或其抗原结合部分或其药学上可接受的衍生物溶解在合适的溶剂中来制备冻干粉末。在一些实施例中，冻干粉末是无菌的。溶剂可以含有改善稳定性的赋形剂或粉末或由粉末制备的重构溶液的其它药理学组分。可以使用的赋形剂包含但不限于右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的试剂。溶剂也可含有缓冲剂，例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施例中，其pH为约中性。随后将溶液无菌过滤，接着在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，以提供期望的制剂。在一个实施例中，将所得溶液分配到小瓶中以进行冻干。每个小瓶将含有单剂量或多剂量的化合物。冻干粉末可以在适当的条件下储存，例如在约4℃至室温下。
用注射用水重构该冻干粉末提供了用于肠胃外施用的制剂。为了重构，将冻干粉末加入到无菌水或其它合适的载体中。精确的量取决于所选择的化合物。此类量可以凭经验确定。
本文所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物和本文提供的其他组合物还可以被配制为靶向待治疗的受试者的身体的特定组织、受体或其他区域。许多此类靶向方法是本领域技术人员熟知的。本文的所有此类靶向方法都预期用于本发明组合物。靶向方法的非限制性实例参见，例如美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。在一个具体实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合部分靶向治疗中枢神经系统损害、退行性脑病症或神经病性疼痛。
用于体内施用的组合物可以是无菌的。这可以通过例如无菌滤膜过滤而容易地实现。
XII.试剂盒
本文提供了试剂盒，其包括本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或其免疫缀合物。在一个具体实施例中，本文提供了药物包或试剂盒，其包括一个或多个容器，所述容器填充有本文所述的药物组合物的一种或多种成分，例如本文提供的一种或多种抗体或其抗原结合部分，使用说明书可以任选。在一些实施例中，试剂盒含有本文所述的药物组合物和任何预防剂或治疗剂，例如本文所述的那些。
XIII.治疗用途和方法
一方面，本文提供了用于减轻受试者CNS损伤或损害的方法，包括向有需要的受试者施用本文所述的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。
在一个实施例中，本文提供了用于抑制、减缓、压制、限制、减少、逆转或预防受试者中神经胶质增生及其相关CNS有害作用的开始或起始的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一个实施例中，本文提供了用于抑制、减缓、压制、限制、减少、逆转或预防受试者中反应性星形胶质细胞的过度或异常增殖及其相关CNS有害作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一个实施例中，本文提供了用于降低、抑制或减少受试者中硫酸软骨素蛋白聚糖的表达(包含神经聚糖、NG2或两者的水平)，或减少神经聚糖、NG2或两者的活性或使其失活的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一个实施例中，本文提供了用于刺激、促进、增加或激活受试者中神经元生长(优选在损伤或损害后)的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一个实施例中，本文提供了用于在有需要的受试者中，优选在神经元细胞核中，增加c-fos mRNA、c-fos蛋白或c-fos蛋白的活性水平，以及增加ERK mRNA、ERK蛋白或pERK活性水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一个实施例中，本文提供了用于在有需要的受试者中，优选在神经元中，增强或增加GAP43 mRNA、GAP43蛋白水平或增加GAP43蛋白的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一个实施例中，本文提供了增强或促进有需要的受试者中的神经元存活和/或促进轴突的再生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一个实施例中，所述受试者是人，优选具有神经元损伤或损害的人，所述神经元损伤或损害来自例如CNS损害、创伤、损伤、脑脊髓损害、脑肿瘤、感染、缺血、中风、自身免疫反应和/或神经变性疾病。
在一些实施例中，本文提供了用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述疾病或病症包含中枢神经系统损害、脑脊髓系统损害、退行性脑病症、退行性脑脊髓或神经病症或神经病性疼痛，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一个实施例中，中枢神经系统损害是创伤性脑损伤、脑脊髓损害、中风、脑肿瘤(例如神经胶质瘤或成胶质细胞瘤)或其组合。在一个实施例中，退行性脑病症为亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或其组合。因此，在一个实施例中，本文公开了一种用于治疗有需要的受试者的创伤性脑损伤、脑脊髓损害、中风、脑肿瘤(例如神经胶质瘤或成胶质细胞瘤)或其组合的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一个实施例中，本文公开了用于治疗有需要的受试者的亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化、ALS的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。在一些实施例中，所述受试者是人。
在一些实施例中，本文公开的方法可用于治疗脑肿瘤，其中所述方法包括向有需要的受试者施用抗FAM19A5抗体(例如本文公开的那些)。在某些实施例中，脑肿瘤是神经胶质瘤或成胶质细胞瘤。
在一些实施例中，与参照(例如未接受抗FAM19A5抗体的受试者中的相应值)相比，施用抗FAM19A5抗体减少肿瘤(例如成胶质细胞瘤)的生长。在某些实施例中，与参照(例如未接受抗FAM19A5抗体的受试者中的相应值)相比，肿瘤生长(例如肿瘤体积或重量)减少至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
在一些实施例中，施用抗FAM19A5抗体促进肿瘤(例如成胶质细胞瘤)中的血管正常化。在某些实施例中，血管正常化包括(i)增加的血管数量，(ii)改善的血管连通性，(iii)降低的血管渗透性，(iv)增加的血液流速，或(v)其任何组合。在某些实施例中，本文公开的方法使延伸到肿瘤中的血管(具有增加的厚度和改善的连通性)的数量增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。
在一些实施例中，施用抗FAM19A5抗体增加免疫细胞浸润到肿瘤(例如成胶质细胞瘤)中。在一些实施例中，与参照(例如，未暴露于抗FAM19A5抗体的肿瘤中存在的免疫细胞的数目)相比，免疫细胞向肿瘤中的浸润增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。在某些实施例中，免疫细胞包括巨噬细胞、树突细胞、小神经胶质细胞和T淋巴细胞。在进一步的实施例中，本文公开的方法增加肿瘤中存在的免疫细胞的细胞体积。在某些实施例中，与参考(例如，未暴露于抗FAM19A5抗体的肿瘤中存在的免疫细胞的体积)相比，免疫细胞的细胞体积增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。
在一些实施例中，施用抗FAM19A5抗体(例如本文公开的那些)增加患有肿瘤(例如脑肿瘤)的受试者的存活。在某些实施例中，与参照(例如未接受抗FAM19A5抗体的受试者中的相应值)相比，存活增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。在一些实施例中，存活增加至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年、3年、4年或5年或更多。
在一些实施例中，可以用本发明方法治疗的脑肿瘤(例如，成胶质细胞瘤)可以是转移性的、不可切除的、对于先前癌症疗法是难治的。在某些实施例中，先前的癌症疗法包括化学疗法。在一些实施例中，化学疗法包括基于铂的疗法。在一些实施例中，所述基于铂的疗法包括选自由顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、四硝酸三铂、菲铂、吡铂、沙铂及其任意组合组成的群组的基于铂的抗肿瘤剂。在某些实施例中，基于铂的疗法包括顺铂。在进一步的实施例中，基于铂的疗法包括卡铂。在一些实施例中，先前的癌症疗法包括免疫疗法(例如，抗PD-1抗体)。
在一些实施例中，可用于本发明方法(例如以治疗脑肿瘤，例如成胶质细胞瘤)的抗FAM19A5抗体可与用于治疗癌症的其它化合物、药物和/或药剂组合给予。此类化合物、药物和/或药剂可以包含例如化疗药物、小分子药物或刺激对给定癌症的免疫应答的抗体。在一些实施例中，本文所述的方法与标准护理治疗(例如，手术、放射和化学疗法)组合使用。在其它实施例中，本文所述的方法用作维持疗法，例如，旨在预防肿瘤发生或复发的疗法。
在一些实施例中，可用于本公开的抗FAM19A5抗体可与多于一种免疫肿瘤学药剂组合，并且可例如与靶向免疫途径的多个元件的组合方法组合，所述多个元件例如以下的一种或多种：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如，树突细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；抑制负性免疫调节的疗法，例如通过抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2途径和/或耗尽或阻断Treg或其它免疫抑制细胞(例如骨髓衍生的抑制细胞)；刺激正免疫调节的疗法，例如，用刺激CD-137、OX-40和/或CD40或GITR途径和/或刺激T细胞效应子功能的激动剂；全身性增加抗肿瘤T细胞频率的疗法；损耗或抑制Treg，例如肿瘤中Treg的疗法，例如使用CD25拮抗剂(例如达克珠单抗)或通过离体抗CD25珠损耗；影响肿瘤中抑制性骨髓细胞功能的疗法；增强肿瘤细胞免疫原性的疗法(例如蒽环类)；过继性T细胞或NK细胞转移，包含遗传修饰的细胞，例如，通过嵌合抗原受体修饰的细胞(CAR-T疗法)；抑制代谢酶如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶、一氧化氮合酶的疗法；逆转/预防T细胞无反应性或衰竭的疗法；在肿瘤部位触发先天免疫激活和/或炎症的疗法；施用免疫刺激细胞因子；或阻断免疫抑制细胞因子。在一些情况下，可与用于本公开的抗FAM19A5抗体组合的另外的抗癌剂可包含但不限于抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗OX40(也称为CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)抗体、抗CD137抗体、抗LAG-3抗体、抗GITR抗体或其任何组合中的一种或多种。
在某些实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体可治疗、减少、逆转、预防、改善、控制或抑制有需要的受试者的纤维化，包括向所述受试者施用抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分。在一个实施例中，纤维化是良性的(即，不引起症状)。在另一个实施例中，纤维化与病理状态相关，其可以是可逆的或不可逆的。在一些实施例中，纤维化选自由肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化、胰腺纤维化、皮肤纤维化、心脏纤维化、动脉纤维化、关节纤维化、乳腺纤维化、肌肉纤维化、腹膜后纤维化、甲状腺纤维化、淋巴结纤维化、膀胱纤维化和胸膜纤维化组成的群组。在一个实施例中，纤维化是肝纤维化或肺纤维化。在另一个实施例中，纤维化与源自癌症的肿瘤相关，所述癌症例如肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、脑癌和/或胰腺癌。在一个实施例中，所述方法减轻、逆转、缓解、改善、抑制或减缓或预防纤维化、与纤维化相关的症状、纤维化的主要诱因或其组合。
在其它实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体可治疗、减少、逆转、预防、改善、控制或抑制有需要的受试者的与疾病或病症相关的纤维化，包括向所述受试者施用抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分。术语“与疾病或病症相关的纤维化”是指伴随疾病或病症的纤维化，或由疾病或病症引起或导致的纤维化。该术语包含由上文公开的疾病或病症导致或引起的纤维化，或伴随该疾病或病症的纤维化。
在又其它实施例中，本文公开的抗FAM19A5抗体可治疗、减少、逆转、预防、延迟、改善、控制或抑制有需要的受试者的肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、脑癌(例如神经胶质瘤或成胶质细胞瘤)和/或胰腺癌，包括向所述受试者施用抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、脑癌和/或胰腺癌与纤维化相关或由纤维化引起。在一些实施例中，所述脑癌是神经胶质瘤或成胶质细胞瘤。
在一些实施例中，施用治疗有效量的本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物。当治疗受试者(例如人)时，本文公开的治疗有效量的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物取决于因素如年龄、性别、疾病严重性。典型地，以每天0.01μg至1000mg的剂量施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物。
在一些实施例中，静脉内、口服、肠胃外、经鞘、鞘内、脑室内、肺、皮下或心室内施用本文公开的抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物或其组合物。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分或其组合物可与一种或多种用于治疗纤维化的另外的药剂(例如，用于特发性肺纤维化的吡非尼酮
Figure BDA0002371731700000831
或尼达尼布
Figure BDA0002371731700000832
)组合施用。一种或多种另外的治疗药物的剂量和施用是本领域已知的，例如，如由相应药物的产品标签所指导的。
在一些实施例中，抗FAM19A5抗体或其抗原结合部分或其组合物可与一种或多种另外的药剂组合施用，用于治疗中枢神经系统损害(例如创伤性脑损伤、脑脊髓损害、中风或脑肿瘤(例如神经胶质瘤或成胶质细胞瘤))、脑脊髓系统损害、退行性脑病症(例如亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化、ALS)、退行性脑脊髓或神经病症或神经病性疼痛。例如，用于治疗亨廷顿氏病的非限制性示例性药剂包含四苯喹嗪
Figure BDA0002371731700000841
抗精神病药，例如氟哌啶醇
Figure BDA0002371731700000842
氯丙嗪、利培酮
Figure BDA00023717317000008418
和喹硫平
Figure BDA0002371731700000843
用于治疗帕金森氏病的非限制性示例性药剂包含左旋多巴(有或没有卡比多巴)、多巴胺激动剂如普拉克索
Figure BDA00023717317000008419
罗匹尼罗
Figure BDA0002371731700000844
和罗替戈汀
Figure BDA00023717317000008420
和阿扑吗啡
Figure BDA00023717317000008421
司来吉兰(
Figure BDA0002371731700000845
和
Figure BDA0002371731700000846
)、雷沙吉兰
Figure BDA00023717317000008422
恩他卡朋
Figure BDA00023717317000008423
苯扎托品
Figure BDA0002371731700000847
三己芬迪和金刚烷胺。
用于治疗阿尔茨海默氏病的非限制性示例性药剂包含多奈哌齐
Figure BDA0002371731700000848
加兰他敏
Figure BDA00023717317000008417
和卡巴拉汀
Figure BDA00023717317000008414
用于治疗多发性硬化的非限制性示例性药剂包含醋酸格拉替雷
Figure BDA0002371731700000849
富马酸二甲酯
Figure BDA00023717317000008415
芬戈莫德
Figure BDA00023717317000008413
特立氟胺
Figure BDA00023717317000008410
那他珠单抗
Figure BDA00023717317000008416
阿仑单抗
Figure BDA00023717317000008412
和米托蒽醌。
用于治疗ALS的非限制性示例性药剂包含利鲁唑
Figure BDA00023717317000008411
一种或多种另外的治疗药物的剂量和施用是本领域已知的，例如，如由相应药物的产品标签所指导的。
下面实例的提供采用说明性方式而非限制性方式。
实例
下面的实验方法和细节在下面的实例中被引用。
实例1人FAM19A5蛋白的表达和纯化
产生并纯化重组人FAM19A5蛋白，并将纯化的蛋白用于基于结合亲和力分析的抗体筛选测定。首先，将含有FAM19A5基因的LPS-hT质粒转化到细菌中，并诱导蛋白过表达。一旦产生，就使用Ni-NTA亲和色谱(Qiagen,Valencia,CA,USA)纯化FAM19A5蛋白。使用逐渐增加浓度的咪唑，我们从Ni柱上除去His-标记的FAM19A5蛋白。使用考马斯亮蓝R-250染料测量溶液中的蛋白表达。仅取含FAM19A5咪唑的溶液，我们使用PBS浓缩FAM19A5蛋白。当浓缩完成时，使用Western Blot测定测量FAM19A5蛋白的纯度和浓度。随后将浓缩的蛋白用于筛选FAM19A5特异性抗体。
实例2抗体文库FAM19A5的产生
将含有油包水乳液佐剂(RIBI+MPL+TDM+CWS佐剂(Sigma,St.Louis,Mo,USA))的TDW和CWS的细胞壁组分乳化，然后皮下注射到三只鸡中。使鸡免疫共三次，免疫之间相隔约2至3周。使用过表达FAM19A5蛋白的HEK293T细胞的裂解物，通过免疫印迹测量从免疫鸡获得的抗体的滴度。
从免疫鸡制备单链可变片段(scFv)文库。使用TRI试剂(Invitrogen,Carlsbad,CAUSA)，我们从上述免疫的鸡的脾、骨髓和滑膜囊提取了RNA。使用寡-dT引物和SUPERSCRIPTTMIII第一链合成系统(Invitrogen)合成第一链cDNA。对于从鸡的免疫系统获得的cDNA，使用Expand高保真PCR系统(Roche Molecular Systems,IN,USA)产生单链可变区文库。在每个反应中，将1μL cDNA、60pmol各引物、10μL的10×反应缓冲液、8μL的2.5mM dNTP(Promega,Madison,WI,USA)和0.5μL的Taq DNA聚合酶与水混合。最终体积为100μL。使用以下条件进行PCR反应：30个循环的(i)94℃下15秒(ii)56℃下30秒和(iii)72℃下90秒，随后72℃下最终延伸10分钟。将包括长度约为350bp的片段的PCR产物上样到1.5％琼脂糖凝胶上，电泳后用QIAGEN Gel II提取试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA,USA)纯化核苷酸片段。通过在OD260nm处读数来定量纯化的PCR产物。(1单位OD＝50μg/ml)。
通过重叠延伸PCR将来自第二次PCR的两个VH和VL第一产物随机连接。将每个PCR反应与100ng纯化的VL和VH产物、60pmol各引物、10μL的10×反应缓冲液、8μL的2.5mMdNTP、0.5μL的Taq DNA聚合酶和水混合，最终体积为100μL。PCR在下列条件下进行：25个循环的(i)94℃下15秒，(ii)56℃下30秒，和(iii)72℃下2分钟，接着72℃下最终延伸10分钟。将包括长度约700bp的单链可变区片段的PCR产物上样到1.5％琼脂糖凝胶上，电泳后，用QIAGEN II凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化核苷酸片段。通过在OD260 nm处读数来定量纯化的PCR产物。(1单位OD＝50/ml)。
将PCR产物的scFv片段和载体pComb3X-SS(The Scripps Research Institute,CA,USA)用Sfi I限制酶消化。将10μg纯化的重叠PCT产物与360单位Sif I(μg DNA/16单位，Roche Molecular Systems,Pleasanton,CA,USA)、20μL的10X反应缓冲液和水混合至最终体积为200μL。将20μg pComb3X-SS载体与120单位Sfi L(μg DNA/6单位)、20μL的10×反应缓冲液和水混合至最终体积为200μL。将混合物在50℃消化8小时。然后，将包括scFv片段(约700bp)和载体(约3400bp)的消化产物上样到1％琼脂糖凝胶上，并使用凝胶提取试剂盒II QIAGEN(QIAGEN,Valencia,CA,USA)纯化。将1400ng Sfi I限制的pComb3X载体和700ng消化的scFv片段与5×连接酶缓冲液、10μL的T4 DNA连接酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和水混合至最终体积为200μL。将混合物在16℃下孵育16小时以进行连接。
用乙醇沉淀后，将DNA沉淀溶解在15μL水中。为了产生文库，使用振荡器基因(Genepulser:Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)通过电穿孔将连接样品转化到大肠杆菌菌株ER2738(New England Biolabs Inc,Hitchin,Hertfordshine,SG4 OTY,England,UK)中。将细胞混合在5ml超级肉汤(SB)培养基中，并在37℃下以250rpm搅拌一小时进行孵育。然后，将3μL的100mg/mL卡那霉素加入10mL SB培养基。为了确定文库大小，将0.1μL、1μL和10μL培养样品涂布在含有50μg/mL卡那霉素的Luria肉汤(LB)琼脂平板上。搅拌1小时后，将4.5μL的100mg/mL卡那霉素加入LB培养物中，并进一步搅拌另外1小时。然后，将2mLVCM13辅助噬菌体的水溶液(>1011cfu/mL)与含有92.5μL的100mg/mL卡那霉素的预热LB(183mL)一起加入LB培养基中。将该混合物在37℃下以250rpm搅拌另外2小时。然后，将280μL(50mg/mL)卡那霉素加入培养物中，并在37℃搅拌过夜。第二天，使用高速离心机(Beckman，JA-10转子)在3,000g、4℃下离心细菌沉淀。然后，使用细菌沉淀提取噬菌粒DNA，同时将上清液转移至无菌离心瓶。接着将8克聚乙二醇-8000(PEG-8000，Sigma)和6克氯化钠(NaCl，Merck)加入到上清液中，然后在冰中保持30分钟。然后，将上清液在15,000g、4℃下离心15分钟。然后弃去上清液，将含有1％BSA的噬菌体沉淀Tris(复制)悬浮于缓冲盐水(TBS)中。
实例3固定化抗原上的文库淘选(生物淘选)
使用磁珠(Dynabeads M-270环氧树脂，Invitrogen)进行生物淘选。在室温下，通过在室温下一起搅拌同时旋转珠子和蛋白20小时，用5μg重组FAM19A5蛋白包被大约1×107个珠子。一旦完成包被，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤珠子4次，并在室温下在含有3％BSA的PBS中封闭一小时。然后，将包被的珠子与上述噬菌体展示的scFv在室温下培养两小时。为了除去任何未与抗原包被的珠子结合的噬菌体，用0.05％Tween20/PBS洗涤珠子。然后用50μL的0.1M甘氨酸/氯化氢(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.2)洗脱结合的噬菌体，并用3μL的2M Tris与氯化氢(Tris-HCl，pH 9.1)中和。将该含有噬菌体的上清液用于感染大肠杆菌ER2738细胞，并将VCSM13辅助噬菌体用于扩增和拯救过夜。通过在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上印迹噬菌体感染的培养物，还测定来自噬菌体感染的培养物的噬菌体滴度的输入(输入)和产生(输出)。第二天，使用PEG-8000和NaCl沉淀噬菌体，随后将其用于生物淘选。通过重复上述过程进行生物淘选，直至总共五次不同的淘选。每次扩增时，筛选并选择对FAM19A5蛋白具有高亲和力的噬菌体。
实例4通过噬菌体ELISA选择克隆
为了分析从生物淘选中选择的克隆，我们从噬菌体展示的scFv中随机选择单个克隆，并使用ELISA证实克隆与FAM19A5重组蛋白结合。将FAM19A5重组蛋白稀释在0.1MNaHCO3缓冲液中，并使用100ng/孔的蛋白在4℃包被96孔微量滴定板16小时。第二天，用3％BSA/PBS在37℃封闭板1小时。然后，将噬菌体上清液与6％BSA/PBS混合，并在37℃培养2小时。然后用0.05％Tween20/PBS洗涤含有上清液的板。将HRP缀合的M13抗体(a-M13-HRP,Pierce Chemical Co,Rockford,IL,USA)稀释至1/5000。将50μl稀释的抗体加入到板中，并在37℃孵育1小时。孵育和洗涤后，向板中加入0.05M柠檬酸盐缓冲液、1μg/ml的2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS,Amresco,Solon,OH,USA)和0.1％H2O2用于显色。在405nm下测量每个孔的吸光度。
然后分析24个与FAM19A5重组蛋白结合并显示高吸光度的克隆，并从那13个scFv中获得具有独特序列的克隆。进一步选择后，获得克隆2-13、1-28和3-2。
实例5抗FAM19A5-IgG2/4抗体的产生
将抗FAM19A5 scFv亚克隆到哺乳动物表达载体中。在FAM19A5 scFv基因序列中，将人Cκ基因与轻链可变结构域连接，并将人免疫球蛋白同种型IgG2/4的CH1、CH2和CH3基因与重链可变区连接。通过添加限制性位点(Genscript,USA)合成具有每条轻链和每条重链的抗体。将合成的基因插入到具有修饰的限制性位点的哺乳动物细胞表达载体中以促进克隆。首先，使用Hind III和Xba I(New England Biolabs,UK)限制酶将轻链基因插入载体中，然后通过使用NheI和BamHI(New England Biolabs,UK)限制酶将重链基因加入载体中。
为了表达和纯化抗FAM19A5-IgG2/4抗体，我们使用了哺乳动物细胞转染和过表达注射系统。我们将2μg/ml哺乳动物表达载体与4μg聚乙烯亚胺(PEI,Polysciences,Warrington,PA,USA)在150mM氯化钠(NaCl，Merck)中混合，相当于细胞培养体积的1/10。将混合物在室温下静置15分钟。将混合物加入HEK293F细胞(2×106细胞/ml，Invitrogen)，然后在含有100U/ml青霉素和链霉素(Invitrogen)的FREESTYLETM2933表达培养基中，在7％CO2和37℃下，在135rpm的搅拌条件下，孵育六天。为了从细胞培养上清液中纯化表达的抗FAM19A5 IgG2/4抗体，我们使用蛋白A珠(RepliGen,Waltham,MA,USA)亲和凝胶色谱。在4-12％Bis-Tris梯度凝胶电泳上运行蛋白A色谱。通过考马斯亮蓝染色证实蛋白的大小和产量。
实例6使用FAM19A5表位片段F1-F6的表位作图分析
合成人FAM19A5蛋白的重叠肽片段(F1-F6，参见图1)，并将其缀合至BSA。通过ELISA测定确定不同抗FAM19A5抗体与BSA-缀合的肽片段F1-F6的结合。简言之，将FAM19A5片段F1-F6(稀释至50mM碳酸盐缓冲液(Biosesang)中的1μg/mL或稀释至用于高浓度分析的20μg/mL)用于在4℃包被96孔免疫板(Thermo Scientific)(100μL/孔)的孔过夜，然后随后在1X PBS中洗涤两次。然后在室温下用封闭缓冲液(100μL/孔)封闭板1小时。在1小时孵育期间，将相关抗FAM19A5抗体在稀释缓冲液中稀释至1μg/mL(或对于高浓度分析稀释至20μg/mL)。一旦洗涤板(使用1x PBS洗涤2x)，就将稀释的抗FAM19A5抗体加入适当的孔中，并将平板在室温下孵育1小时。随后使用洗涤缓冲液将板洗涤总计五次。接着，将ODP底物(通过将一个ODP片剂(O-苯二胺二盐酸盐，Thermo)溶解于9mL无菌去离子水和1mL10X稳定的过氧化物稳定缓冲液(Thermo)中而制备)加入到每个孔中，并且允许变色反应发生10分钟。通过向孔中加入100μL的2N H2SO4(Daejung)终止该反应。使用96孔酶标仪(Molecular Device)在492nm处检测每个孔的吸收值。
如图2所示，抗FAM19A5抗体3-2与表位片段F2强烈结合，与其它片段结合最小。这对于抗FAM19A5抗体1-28也是如此(数据未显示)。相反，1-65抗体仅与表位片段F5强烈结合。有趣的是，抗FAM19A5抗体2-13似乎不结合F1-F6表位片段中的任何一个。
接着，为了鉴定3-2和1-28抗体结合的表位片段F2内的特定氨基酸残基，如表9(下文)所示用丙氨酸或缬氨酸替换F2片段的不同氨基酸残基。突变残基加粗和下划线。使用如上所述的ELISA测定测量所示抗FAM19A5抗体的结合亲和力。
表9.
Figure BDA0002371731700000881
Figure BDA0002371731700000891
如图3A和3B所示，3-2抗体与突变体F2肽片段#1、2、4-6和9-13强烈结合，与片段#3、7和8的结合减少。后三种突变体F2肽片段分别在氨基酸残基D5、P9和R11(根据上表9中的SEQ ID NO：6编号)处包括丙氨酸取代，表明3-2抗体主要在这些氨基酸残基处与FAM19A5结合。
对于1-28抗体，它与突变体F2肽片段#1、2、6和8-13强烈结合，而对于肽片段#3、4、5和7，1-28抗体显示结合大大减少。参见图3C。该数据表明抗FAM19A5抗体1-28主要在表位F2片段内的氨基酸残基D5、S6、S7和P9(根据上表9中的SEQ ID NO：6编号)处结合FAM19A5。
实例7使用FAM19A5突变体M1-M8的表位作图分析
为了进一步表征本公开中公开的抗FAM19A5抗体的结合表位，如图4所示比对不同FAM19家族成员(即FAM19A1-5)的氨基酸序列。基于该比对，鉴定了FAM19A5蛋白的氨基酸序列与FAM19A家族的其它成员(即FAM19A1-4)差异最显著的八个区域(M1-M8)。这些区域的氨基酸序列被FAM19A1-4蛋白相应区域的共有序列替代。参见表10(突变的氨基酸残基加粗和下划线)。
表达突变体FAM19A5的噬菌体如下制备。为了制备用于噬菌体培养的培养基，将55.6mL的2M葡萄糖(D-(+)-葡萄糖，Sigma)、5mL的1M MgCl2(氯化镁，Junsei)，1mL的34mg/mL氯霉素(Sigma)加入2xYT培养基中。选择通过单噬菌体ELISA获得的菌落，并将其置于5mL制备的培养基(2xYT-GMC)中，在37℃下在振荡培养箱(VS-8480，Vision)中培养16小时。将100μL的各培养物分别转移到10mL的2xYT-GMC中，单独在37℃的培养箱中培养至O.D.600nm下的检测值达到0.5。一旦在O.D.600nm下的检测值达到0.5，就获得5mL的每种培养物作为待感染的样品。在样品制备后，将50μL的M1辅助噬菌体加入到单个样品中，然后在37℃不摇动下孵育30分钟，在摇动下孵育另外30分钟。使用微型离心机(Micro12，Hanil)以3,850rpm将单个培养物离心15分钟。离心培养物的上清液被除去以保持分离，并用5mL的2xYT培养基替换，所述培养基含有1mL的1M IPTG(AG Scientific)、5mL的1M MgCl2、1mL的70μg/μL卡那霉素(Biopure)和1mL氯霉素。将得到的沉淀物充分分散在新加入的培养基中，然后在搅拌下于30℃孵育16小时。
表10.
Figure BDA0002371731700000901
Figure BDA0002371731700000911
如图5所示，抗FAM19A5抗体1-28和3-2不能与FAM19A5突变体M2结合。如表10(上文)所示，M2突变体在氨基酸残基21-25(即表位EP2)处具有替代，其对应于FAM19A5的表位片段F2内的区域。这与实例7的较早数据一致，并证实表位片段F2对于1-28和3-2抗体与FAM19A5结合的重要性。
对于2-13抗体，似乎在与1-28、3-2和1-65抗体完全不同的表位结合FAM19A5。如图5所示，抗FAM19A5抗体2-13与FAM19A5突变体M1-M3和M5-M7具有中等至高的结合，但不能与突变体M4和M8结合，表明表位EP4和EP8对2-13抗体与FAM19A5结合的重要性。考虑到2-13抗体似乎不结合实例7的任何FAM19A5表位片段(参见图2)，该数据似乎也表明2-13抗体具有构象表位而不是线性表位。
实例8交叉竞争分析
接着，如下所述使用双位点夹心ELISA来评估具有相似结合表位的不同抗FAM19A5抗体是否彼此交叉竞争。参见图6A。
首先，将所示抗FAM19A5抗体在1x PBS中稀释至10μg/mL的浓度。在37℃下，用稀释的抗FAM19A5抗体(10μg/mL，在1x PBS中)(“捕获抗体”)包被96孔板(100μL/孔)约1小时。孵育后，用洗涤缓冲液(0.01％Tween-20/PBS；也称为0.01％PBST)洗涤板，总共五次洗涤。用封闭溶液(5％BSA/PBS；也称为5％PBSA)(250μL/孔)在37℃封闭一小时，然后再次洗涤。接着，将100μg/mL的FAM19A5抗原(稀释于含有5％BSA、0.01％Tween-20的PBS中；也称为5％PBSAT；稀释缓冲液)加入到每个孔中，并将96孔板在37℃下孵育2小时。在孵育后，将板用0.01％PBST洗涤，总共五次洗涤。在最后一次洗涤后，将所示生物素化抗FAM19A5抗体(“检测抗体”)(在5％PBSAT中稀释至1μg/mL)加入到相关孔(100μL体积)中，并将板在37℃下孵育另外1小时。然后用0.01％PBST再次洗涤板(总共五次洗涤)。接着，将100μL稀释的(1/2000，在5％PBSAT中)链霉亲和素-HRP(1mg/mL(Sigma,USA))加入到孔中，并将板在室温下孵育30分钟。然后洗涤板并用100μL TMB底物处理(然后洗涤3,3板并用100μL溶液(ThermoFisher Scientific)处理)。在室温下孵育另外30分钟后，通过添加TMB底物诱导变色反应。使用50μL硫酸(2N H2SO4)终止此反应，并使用96孔酶标仪(Molecular Device)通过在450nm处的吸收波长和620nm处的参考波长检测变色的程度。
如图6B所示，抗FAM19A5抗体1-65、P2-A03、P2-F11和13B4都彼此交叉竞争。与1-65抗体类似，P2-A03、P2-F11和13B4抗体均在表位M6、M7和/或M8(即在F5和/或F6表位片段内)结合FAM19A5(数据未显示)。相反，抗体2-13和3-2不与其它抗FAM19A5抗体交叉竞争，证实了较早的表位作图分析，其显示这些抗体主要结合F2表位片段。
实例9结合亲和力分析
为了测定不同抗FAM19A5抗体对FAM19A5的结合亲和力，如之前所述(例如实例6)使用ELISA测定。如图7A和7B所示，1-28、3-2和1-65抗体以相似的结合亲和力(Kd分别＝0.17nM、0.12nM和0.10nM)结合FAM19A5。2-13抗体以约2.77nM的Kd值结合。参见图7B。
实例10肝纤维化的血清分析
为了开始评估本文公开的抗FAM19A5抗体的体内功能，使用肝纤维化大鼠模型(即胆管结扎(BLD)-诱导的肝纤维化Sprague-Dawley(SD)大鼠模型)测量肝纤维化中FAM19A5蛋白水平。参见Kountouras等人，《英国实验病理学杂志(Br J Exp Path)》65:305-311(1984)。简言之，用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉动物。制造1.5cm中线切口，定位胆总管，用3-0丝线结扎物双重结扎。然后，在肝纤维化诱导后21天，从动物收集全血，并从全血中分离血清。
使用FAM19A5夹心ELISA测定测量血清中FAM19A5蛋白质的水平。用100μL体积的1μg/mL的1-65人IgG1抗FAM19A5抗体包被96孔ELISA板过夜。然后用PBS洗涤板，随后用1％BSA/PBS在室温下封闭1小时。接着，再次用PBS和大约100μL标准物洗涤板，并将样品分配到合适的孔中。然后将板在室温下孵育2小时。然后，用0.05％PBS-Tween 20(即洗涤缓冲液)洗涤板，并将约100μL检测抗体(辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗兔IgG抗体(SantaCruz，Cat#SC-2030)，在1％BSA/PBS中以1:5000稀释)加入到孔中。将板在室温下孵育另外1小时。用洗涤缓冲液另外洗涤后，将约100μL邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物加入每个孔中，并使板在室温下显影。约10分钟后，将约100μL的1N H2SO4(硫酸)加入到孔中以终止反应。立即使用96孔MicroPlate读数器(Molecular Device，Versa Max)在492nM波长下测量吸光度。
如图8所示，BDL诱导的肝纤维化SD大鼠(“疾病模型”)的血清中FAM19A5蛋白质水平是正常(即，非BDL诱导的)大鼠的血清中FAM19A5蛋白质水平的3倍以上。
实例11肺纤维化的血清分析
为了评估FAM19A5蛋白质水平在肺纤维化中是否也增加，通过气管内注射施用3mg/kg博来霉素在7周龄雄性SD大鼠中诱导特发性肺纤维化。在施用博来霉素后24天，从动物中收集全血，并将血清与全血分离。如上文实例10所示，使用FAM19A5夹心ELISA测定测量血清中FAM19A5蛋白质的水平。如图9所示，肺纤维化诱导的SD大鼠(“疾病模型”)的血清中FAM19A5蛋白质水平是正常(即无特发性肺纤维化)大鼠的血清中FAM19A5蛋白质水平的1.5倍以上。
实例12人肝纤维化患者的血清分析
AST和/或ALT水平可以在肝细胞损害后在血清中增加，并且这种增加通常被依赖以提示肝损害。参见Gowda等人，《泛非医学杂志(Pan Afr Med J)》3:17(2009)；Giannini等人，《内科医学档案(Arch Intern Med)》163:218-224(2003)。然而，当损害严重时(例如肝硬化)，AST和ALT水平可以表现为正常。因此，为了评估FAM19A5表达是否可为肝损害的更好指标，使用FAM19A5夹心ELISA测定测量已确认肝硬化的人类患者的血清中FAM19A5蛋白质的水平。
将2-13抗FAM19A5人IgG1抗体以1μg/μL的浓度重构于50mM碳酸盐缓冲液(Bio-World,Cat.C2070-9.6,Lot.C70-9.616Z11C)中。然后将抗FAM19A5抗体以1:1000的比例在PBS中稀释，随后用于包被96孔ELISA板过夜。第二天，用PBS洗涤板，随后在室温下用1％BSA/PBS封闭约1小时。然后，再次用PBS洗涤板，并将约100μL的标准品和样品分配到适当的孔中。将板在室温下孵育2小时。然后，用0.05％PBS-Tween20(即洗涤缓冲液)洗涤板。接着，将3-2抗FAM19A5小鼠IgG2a抗体(以1μg/μL的浓度重构)以1:2000的比例稀释在1％BSA/PBS中。将约100μL该稀释的抗体加入到每个孔中，并使板在室温下孵育另外2小时。在用洗涤缓冲液另外洗涤后，将约100μL辣根过氧化物酶(HRP)缀合的驴抗小鼠IgG抗体(Jackson Lab,Cat.715-035-151,Lot.122401)(在1％BSA/PBS中以1:5000稀释)加入到孔中。随后将板在室温下孵育1小时。孵育后，用洗涤缓冲液洗涤板，并将约100μL的1-STEPTMUltra TMB-ELISA底物溶液(Pierce,Cat.34028,Lot.QJ20436540)加入到每个孔中。在孵育10分钟后，将约100μL的1N H2SO4(硫酸)加入到孔中以终止反应。立即使用96孔MicroPlate读数器(Molecular Device，Versa Max)在450nM波长下测量吸光度。
如图10所示，肝硬化患者的FAM19A5蛋白质水平是正常健康个体的血清中观察到的水平的约2-6倍。此类数据与上述动物研究一致，表明FAM19A5蛋白质的血清浓度可能是肝硬化的理想诊断标志物。
实例13对心肌梗塞的作用的分析
心肌梗塞期间发生的缺血性细胞死亡导致修复反应，其中受损组织被纤维化瘢痕取代。这之后是周围组织的重塑(例如，左心室壁变薄和室扩张)，并最终导致受损的心脏功能。参见Talman等人，《细胞组织研究(Cell Tissue Res)》365(3):563-581(2016)；Firth等人，《心血管药物疗法(Cardiovasc Drugs Ther)》4:1363-1374(1990)。为了评估抗FAM19A5抗体对心肌梗塞的作用，使用小鼠缺血再灌注模型。简言之，购买Balb/cAnNCrljOri小鼠(6周龄，雄性)(Orient Bio Inc.,Seoul,South Korea)，并在特定的无病原体(SPF)条件下饲养约1周。然后，用Zoletil 50(VIRBAC,France)和Zylazine(
Figure BDA0002371731700000941
Bayer AG,Germany)深度麻醉小鼠。一旦麻醉，就对小鼠进行开胸术以暴露冠状动脉，并通过用7-0缝合线和PE20管结扎动脉诱导心肌梗塞。通过在空气插管后将气管内导管连接到呼吸机，在小鼠中保持强制呼吸。维持缺血条件40分钟，此时通过除去PE20管重新灌注血液。从心肌梗塞诱导后第3天开始，以每周一次的间隔通过静脉内注射将抗FAM19A5抗体(1-65、3-2或1-28抗体)施用于小鼠，总共三次注射。正常对照(即健康)和NHI小鼠用作对照。
在心肌梗塞诱导后第21天，处死小鼠并收获其心脏。将心脏组织固定在10％福尔马林溶液中。然后，将固定的组织以2mm的厚度在顶端周围横向切片，并放置在石蜡块中，将石蜡块进一步切成5μm切片，并放置在玻璃组织载玻片上用于分析。对心脏组织样品进行苏木精和曙红(H&E)染色以评估每种抗FAM19A5抗体(即1-65、3-2和1-28抗体)对心肌梗塞相关组织重塑的作用。
如所预期的，来自NHI对照组的心脏组织显示显著的左心室扩张和左心室壁变薄。参见图11(“NHI”)。相反，来自接受抗FAM19A5抗体的小鼠的心脏组织类似于来自正常对照(“健康”)动物的心脏组织(即，减少左心室扩张和保存左心室壁组织)。
为了帮助定量这种作用，在心脏组织切片上进行染色胶原蛋白的Masson三色法。如前所述，胶原蛋白是细胞外基质(ECM)的主要成分，因此，组织样品中增加的胶原蛋白积累的Masson三色染色可以是纤维化的准确指标。染色的载玻片使用光学显微镜(OlympusBX53,Japan)拍照，且纤维面积与总左心室面积的比率也使用图像分析仪计算。
如图12A所示，接受抗FAM19A5抗体(1-65、3-2和1-28)的小鼠与NHI对照组相比胶原蛋白积累显著减少。在抗FAM19A5抗体处理组中，约10-15％的总左心室面积由纤维组织构成。参见图12B。相反，在来自NHI对照组的小鼠中，纤维面积占总左心室面积的约20％。在不同的FAM19A5抗体中，1-65抗体似乎具有最大的作用。
总之，上述结果证明，在心肌梗塞后不久施用FAM19A5抗体可极大地改善组织重塑和纤维化形成。
实例14人肝癌患者分析
肝纤维化和肝硬化是肝癌的主要风险因素。在人肝癌患者中，经常存在与癌组织周围的肝硬化相似的纤维化。因此，为了评估肝癌中FAM19A5表达，使用免疫组织化学在人肝活检中测量FAM19A5蛋白表达。简言之，从具有不同程度纤维化(即，#0期至#4期)的肝癌患者获得肝样品。用抗FAM19A5抗体免疫染色组织样品，然后用苏木精和曙红(H&E)复染。
如图13所示，与#0期患者相比，#2期和#4期癌症患者的肝组织中FAM19A5蛋白表达显著增加。FAM19A5表达的增加主要集中在瘢痕形成区域周围和肝星状细胞中。FAM19A5表达的增加也与疾病进展相关，其中与#2期肝组织相比#4期肝组织表达高得多的FAM19A5水平。总之，该数据证明FAM19A5在人肝癌中也起重要作用。
实施例15抗FAM19A5抗体施用在肝癌异种移植模型中的功效分析
为了评估抗FAM19A5抗体对人肝癌的抗肿瘤功效，使用肝癌的异种移植小鼠模型。简言之，购买裸鼠并在无特定病原体(SPF)条件下饲养。在大约一周的适应期后，给动物皮下注射Hep3B细胞和/或人肝星状细胞(HHSteC)。为此，首先用胰蛋白酶处理细胞以制备单细胞悬浮液。接着，洗涤细胞，并将约5×106的Hep3B和/或0.4×106的HHSteC细胞重悬于100μL的DMEM培养基中。然后使用胰岛素注射器将细胞皮下注射到裸鼠的右胁部。注射后约3周，观察动物的肿瘤形成。
在肿瘤形成后(注射后约3周)，给动物静脉内注射正常人免疫球蛋白(NHI，对照)或3-2人IgG1抗FAM19A5抗体(2.5mg/kg)。动物每周接受一次抗体，总共3周。每周评估体重和肿瘤大小二者。在接种后42天，处死动物，并进一步分析肿瘤。
如图14A所示，所有不同组的动物在整个实验期间具有相似的体重。如图14B至图14D所示，施用抗FAM19A5抗体对仅接种Hep3B细胞的动物具有最小的抗肿瘤作用(即“Hep3B+NHI”和“Hep3B+FAM19A5 Ab”)。但是在用Hep3B细胞和HHSteC两者接种的动物中，施用抗FAM19A5抗体导致肿瘤大小/重量的显著降低(即“Hep3B+HHSteC+NHI”v.“Hep3B+HHSteC+FAM19A5 Ab”)。此类数据显示抗FAM19A5抗体与肿瘤微环境中肝细胞肝星状细胞的相互作用可以治疗肝癌。
实例16在创伤性脑损伤后施用抗FAM19A5抗体的作用
为了评估本文公开的抗FAM19A5抗体对创伤性脑损伤的作用，使用创伤性脑损伤(TBI)模型。简言之，用异氟烷深度麻醉C57BL/6成年雄性小鼠(8-9周龄)。通过将铁棒(用液氮预冷冻)置于颅盖上1分钟进行低温TBI。然后缝合小鼠皮肤，并以与正常小鼠相同的方式饲养。Moon等人，《神经学报告(Neuro Report)》22:304-308(2011)。TBI诱导后约1天，给动物静脉内施用100μg在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的不同抗FAM19A5抗体(1-65(2/4)；1-28；2-13；和3-2)。
在TBI诱导后第5天(TBI5D)，处死动物，用4％多聚甲醛(PFA)/PBS灌注，并收获它们的脑组织。将收获的脑组织进一步在4％PFA溶液中固定另外24小时。然后，将脑组织在30％蔗糖中进行冷冻保护，在低温恒温器(40μm)上连续切片，并在-20℃下储存在50％甘油/50％PBS中直至使用。
为了染色与神经胶质增生相关的反应性星形胶质细胞(对巢蛋白和GFAP表达呈阳性)，用含3％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％Triton X-100/PBS封闭脑组织切片30分钟。然后将第一抗体与切片在4℃下孵育过夜。本研究中使用的第一抗体是小鼠抗巢蛋白(Millipore,Billerica,MA,USA)和兔抗GFAP(Dako,Carpinteria,CA,USA))。用PBS洗涤几次后，施用适当的第二抗体30分钟。细胞核用Hoechst 33342(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)标记。随后，将切片洗涤、安装，并在荧光或共聚焦显微镜(Leica,Wetzlar,Germany)下观察。
为了定量该作用，首先规定每个图像的GFAP-阴性区域的ROI(相关区域)，然后使用LAS AF lite软件(Leica Microsystem CMS GmbH,Mannheim,Germany)计算相应ROI的面积(μm2,A)。还用相同的软件测量接触半影的损伤核的边界线的侧向长度(μm,B)。A/B的结果表示距病灶核心的平均距离(A/B，μm)。
如图15A和15B所示，1-28、2-13和3-2抗FAM19A5抗体类似地减少、逆转和/或预防创伤性脑损伤后半影区域中反应性神经胶质增生的发作。总体作用与1-65抗FAM19A5抗体相似，其先前已显示在创伤性脑损伤后显著减弱反应性星形胶质细胞的产生。参见美国专利9,579,398。尽管在与1-65抗体不同的表位处结合FAM19A5蛋白，但当在创伤性脑损伤后施用时1-28、2-13和3-2抗体同样有效。
实例17FAM19A5抗体在小鼠成胶质细胞瘤细胞系GL-261癌细胞中的抗癌作用的评价
为了诱导成胶质细胞瘤模型，将4周龄C57BL/6小鼠的头部固定在立体定位装置中，并颅内注射GL-261细胞(1×105个细胞/5μl)(颅内注射位点：前囟前0.2mm，中线侧2.2mm，从头骨表面到尾状壳核中部3.5mm深)，以诱导成胶质细胞瘤(图16A)。在GL-261接种后七天，分别静脉内注射人IgG(阴性对照)和抗FAM19A5抗体至各自的动物。每只小鼠接受2.5mg/kg剂量的人IgG对照抗体或抗FAM19A5抗体，每周一次，共三次(图16A)。
GL-261接种后第23天开始，死亡开始发生，并且因此所有存活的小鼠都被处死，取出脑并用含4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水固定。为了测量脑组织中肿瘤的大小，使用三种分析方法：1.组织澄清(CLARITY)(图16B)，2.苏木精和曙红(H&E)染色(图17A和17B)和3.Hoechst核染色(图18A至图18D)。
(1)为了组织透明，首先将分析组织浸入水凝胶单体溶液(A4P0)中，并在4℃下储存一天，以确保水凝胶穿透整个组织。然后，将温度升高到37℃以诱导聚合形成网状结构。然后使用电泳组织清除(ETC)来去除组织中的脂质。然后将制备的组织置于灯箱上。将相对不透明的组织的表面视为肿瘤的表面，并使用比例尺测量近似的肿瘤质量。
(2)苏木精和曙红染色(H&E染色)用含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水后固定24小时，然后悬浮于含有30％蔗糖的磷酸盐缓冲盐水中另外24小时。然后将组织置于脑组织模具中，将含有30％糖溶液的OCT化合物在干冰上冷冻，并使用冷冻切片机(Leica)将脑组织薄切成30μm。
H&E染色结束后，用载玻片扫描仪(Carl Zeiss/AxioScanZ)获得制备的标品的图像，用ZEN显微镜和成像软件(Zeiss)任意指定肿瘤的边界表面，以获得肿瘤的表面积值。
(3)用含有Hoechst的磷酸盐缓冲盐水(1:2000)处理用于Hoechst染色的薄切组织30分钟。使用共聚焦显微镜(Leica)获得制备的样品的荧光图像，并使用IMARIS3D软件(Bitplane)确定肿瘤边界，以获得肿瘤的体积和肿瘤内的细胞数目。
如图16B、17A、17B和18A至18D所示，在所有三种实验方法中，测量每只小鼠的肿瘤大小揭示，与人IgG处理组相比，抗FAM19A5抗体处理组中成胶质细胞瘤的大小显著降低。
实例18在成胶质细胞瘤小鼠模型中FAM19A5抗体处理后血管正常化的促进
将通过处死成胶质细胞瘤诱导的小鼠模型获得的大脑(参见实例17)用含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)后固定24小时，然后在含有30％蔗糖的PBS中浸润另外24小时。然后将大脑置于脑组织的模具中，并将其用含有30％糖溶液的OCT化合物在干冰上冷冻。然后使用冷冻切片机将冷冻的大脑薄切成30μm。进行免疫组织化学以确定成胶质细胞瘤诱导的小鼠大脑中CD31蛋白(血管内皮细胞的标志物)的表达模式。使用共聚焦显微镜(Leica)获得制备样品的荧光图像。
当检查可比较的表面积时(图19A，以白点分界)，在对照组中，血管的数目和其连通性非常差(图19A，左列)，而在抗FAM19A5抗体处理组中，血管的数目和其连通性相对高(图19A，右列)。参见图19B，其是图19A的代表性区域的更高放大率。
上述结果表明抗FAM19A5抗体处理可促进血管正常化，这可有助于成胶质细胞瘤的治疗。
实例19在成胶质细胞瘤小鼠模型中FAM19A5抗体治疗后免疫细胞的分布差异
将从成胶质细胞瘤诱导的小鼠模型分离的大脑(参见实例17)用含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)后固定24小时，然后在含有30％蔗糖的PBS中渗透另外24小时。然后将大脑置于脑组织的模具中，并将其用含有30％糖溶液的OCT化合物在干冰上冷冻。然后使用冷冻切片机将冷冻的大脑薄切成30μm。通过对GFAP(星形胶质细胞标志物)和Iba-1(巨噬细胞标志物)进行免疫组织化学观察成胶质细胞瘤中星形胶质细胞和巨噬细胞的分布。
在对照组中，在成胶质细胞瘤中未观察到星形胶质细胞，而在FAM19A5抗体处理组中，相对大量的星形胶质细胞保留在肿瘤中。预期肿瘤中的星形胶质细胞对外周神经元或对神经元的细胞外环境具有积极作用。此外，成胶质细胞瘤中巨噬细胞浸润水平的分析显示，与阴性对照人IgG处理组相比，抗FAM19A5抗体处理组中巨噬细胞浸润显著增加(图20A和20B)。
这些结果表明抗FAM19A5抗体处理也可促进巨噬细胞浸润至成胶质细胞瘤，其然后可有助于成胶质细胞瘤的治疗。
实例20使用C6肿瘤细胞评价FAM19A5抗体在大鼠神经胶质瘤模型中的抗癌功效
为了诱导同基因大鼠神经胶质瘤模型，从肿瘤接种后第7天开始，使用立体定位框架，通过颅内注射将1.8×105/1μL的C6肿瘤细胞接种到雄性Wistar大鼠，以2.5mg/kg的剂量向每只大鼠静脉内施用人IgG(阴性对照)抗体或抗FAM19A5抗体，每三天一次，共两次。在肿瘤细胞接种后第7天之后，以2-3天的间隔拍摄每只大鼠的MRI扫描图像以分析接种的肿瘤大小、位置和定性结果。
T2加权图像扫描是基本形态分析，其提供了接种肿瘤的位置、大小等的视觉和定性评价。用作肿瘤组织内流体含量指示的R2作图分析允许视觉确认肿瘤内的水肿体积。用于检测总血流量的成像分析方法用于推导在注射高分子量T2造影剂MION(大小：20±5nm，剂量：5mg/kg)前后R2*值的变化，其通过DelR2*作图计算CBV(脑血容量)。CBV(脑血容量)值由R2的变化得到，并用于视觉分析脑组织中的总血量。增强率(EnhRate)和曲线下面积(AUC)是组织渗透性检测的代表性参数。
如图像扫描结果(图21)所示，T2加权图像显示，与人IgG抗体(阴性对照)相比，施用抗FAM19A5抗体有效抑制肿瘤生长。施用抗FAM19A5抗体的动物的R2作图结果显示，与人IgG(阴性对照)处理的动物相比，肿瘤中坏死面积减小，导致肿瘤核心中的水含量降低。CBV分析结果显示，与人IgG(阴性对照)处理的动物相比，施用抗FAM19A5抗体的动物的肿瘤组织内的血液体积相对大，这证明肿瘤组织内的血流速率增加。最后，肿瘤组织渗透性的评价显示，与人IgG(阴性对照)处理的动物相比，施用抗FAM19A5抗体的动物的渗透性降低。“IAUC30”表示30秒时曲线下初始面积。
与用人IgG处理的阴性对照组相比，用抗FAM19A5抗体处理的大鼠神经胶质瘤C6肿瘤细胞模型的这些发现显示坏死面积的减少，导致水肿的改善。通过降低肿瘤细胞渗透性和改善血流速度，发生有效的肿瘤生长抑制。
实例21使用GL261肿瘤细胞评价抗FAM19A5抗体在小鼠脑癌模型中的抗癌功效
为了进一步评估抗FAM19A5抗体的抗癌作用，使用GL261 Red-FLuc细胞诱导小鼠脑癌。简言之，将GL261 Red-FLuc细胞(3×105)注射入C57BL/6小鼠的大脑中(第0天)。然后，注射后3天，给小鼠静脉内施用人IgG(Sigma,cat.#I4506)或抗FAM19A5抗体(3-2克隆，Lot#171123)。抗体以5mg/kg的剂量每周一次施用，总计四周。最后一次抗体施用(第24天)后，监测小鼠的存活直至所有动物死亡。
如图22所示，在人IgG组中，最后一只小鼠在GL261细胞注射后第28天死亡。相反，在用抗FAM19A5抗体处理的动物中，最后一只小鼠一周后死亡(即GL261细胞注射后第35天)。通过证明抗FAM19A5抗体可增强脑癌动物的存活，该结果进一步证实了抗FAM19A5抗体的抗癌功效。
应当理解，具体实施方式而非发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述发明人所设想的本公开的一个或多个但不是所有示例性实施例，因此，不旨在以任何方式限制本公开和所附权利要求。
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具体实施例的上述描述将如此充分地揭示本公开的一般性质，以致其他人可以通过应用本领域技术内的知识，在不偏离本公开的一般概念的情况下，在不进行过度实验的情况下，容易地修改和/或改变此类具体实例的各种应用。因此，基于本文所呈现的教示和指导，此类改变和修改旨在处于所公开实施例的等效物的含义和范围内。应当理解，这里的措辞或术语是为了描述而不是限制的目的，使得本说明书的术语或措辞由技术人员根据教示和指导来解释。
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该PCT申请要求2017年6月27日提交的第62/525,635号美国临时申请和2017年11月7日提交的第62/582,887号美国临时申请的优先权，这两个申请均通过引用整体并入本文。
序列表
<110> 纽洛可科学有限公司
首尔大学校产学协力团
<120> 抗-FAM19A5抗体及其用途
<130> 3763.005PC02/C-K/DKC
<150> 62/525,635
<151> 2017-06-27
<150> 62,582,887
<151> 2017-11-07
<160> 200
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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Pro Ser Met Ser Ser Thr Phe Trp Ala Phe Met Ile Leu Ala Ser Leu
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Leu Ile Ala Tyr Cys Ser Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val
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Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
65 70 75 80
Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp
85 90 95
Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile
100 105 110
Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr
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Thr Thr Val Ser
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> DNA
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a 1501
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 表位F2
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<212> PRT
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<223> 表位F5
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<223> 表位F6
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1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体VH-CDR2
<400> 21
Ile Arg Ser Asp Gly Ser Asn Pro
1 5
<210> 22
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体VH-CDR3
<400> 22
Ala Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Cys Ala Leu Asp Ala Tyr Arg Ser Gly
1 5 10 15
Gly Tyr Ser Cys Gly Val Tyr Pro Gly Ser Ile Asp Ala
20 25
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-13抗体VL-CDR1
<400> 23
Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Gly
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-13抗体VL-CDR2
<400> 24
Trp Asp Asp Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-13抗体VL-CDR3
<400> 25
Gly Thr Glu Asp Ile Ser Gly Thr Ala Gly Val
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-2抗体VL-CDR1
<400> 26
Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-2抗体VL-CDR2
<400> 27
Glu Ser Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-2抗体VL-CDR3
<400> 28
Gly Ser Trp Asp Ser Ser Asn Gly Gly Ile
1 5 10
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-65抗体VL-CDR1
<400> 29
Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly
1 5 10
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-65抗体VL-CDR2
<400> 30
Trp Asn Asp Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-65抗体VL-CDR3
<400> 31
Gly Asn Asp Asp Tyr Ser Ser Asp Ser Gly Tyr Val Gly Val
1 5 10
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体VL-CDR1
<400> 32
Gly Tyr Gly Tyr Gly
1 5
<210> 33
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体VL-CDR2
<400> 33
Gln Asn Asp
1
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体VL-CDR3
<400> 34
Gly Ser Glu Asp Ser Ser Thr Leu Ala Gly Ile
1 5 10
<210> 35
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-13抗体VH
<400> 35
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Gly Met Phe Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ala Glu Ile Thr Asn Asp Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Glu Cys Pro Gly Gly Phe Ser Cys Trp Gly Asp
100 105 110
Thr Gly Gln Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 36
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-2抗体VH
<400> 36
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ala Gln Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Pro Ala Val
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Pro Gly Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ser Tyr Asp Cys Pro Tyr Gly His Cys Ser Ser Gly Val
100 105 110
Asp Ser Ala Gly Glu Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 37
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-65抗体VH
<400> 37
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gln Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Asn Lys Ser Gly Ser Asp Thr Ser Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Ala Ser Tyr Ile Thr Ala Ala Thr Ile Asp Ala Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体VH
<400> 38
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Ser Asp Gly Ser Asn Pro Ser Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Lys Asp Asn Gly Arg Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Cys Ala Leu Asp Ala Tyr Arg Ser Gly
100 105 110
Gly Tyr Ser Cys Gly Val Tyr Pro Gly Ser Ile Asp Ala Trp Gly His
115 120 125
Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
130 135
<210> 39
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-13抗体VL
<400> 39
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Leu Val Thr Val Ile Tyr Trp Asp Asp Glu
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ala Leu Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Thr Glu Asp Ile Ser Gly Thr Ala Gly Val Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-2抗体VL
<400> 40
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr
20 25 30
Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Glu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ser Ser Asn Gly
85 90 95
Gly Ile Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 41
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-65抗体VL
<400> 41
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Trp
20 25 30
Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Ser Ser Ala Pro Leu Thr Val Ile Tyr Trp
35 40 45
Asn Asp Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Gly Ser Thr His Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Asn Asp Asp Tyr Ser Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Tyr Val Gly Val Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 42
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体VL
<400> 42
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Glu Gly Thr Val
1 5 10 15
Glu Ile Thr Cys Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Gln Asn Asp Lys
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Gly Ser Glu Asp Ser Ser Thr Leu Ala Gly Ile Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 43
<211> 388
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-13抗体VH
<400> 43
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc agccatggca tgttctgggt gcgacagacg 120
cccggcaagg ggttggaata tgtcgctgaa attaccaatg atggtagtgg cacaaactac 180
gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct acttctgcgc cagatctact 300
tatgaatgtc ctggtggttt tagttgttgg ggtgatactg gtcaaataga cgcatggggc 360
cacgggaccg aagtcatcgt ctcctcca 388
<210> 44
<211> 394
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-2抗体VH
<400> 44
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc agcttcaaca tgttctgggt gcgacaggcg 120
cccggcaagg ggctggaata cgtcgctcaa attagcagca gtggtagtag cacaaactac 180
gcacccgcgg tgaggggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaaccccgg ggctgaagac accggcacct actactgcgc caaaagtagt 300
tatgactgtc cttacggtca ttgtagtagt ggtgttgata gtgctggtga gatcgacgca 360
tggggccacg ggaccgaagt catcgtctcc tcca 394
<210> 45
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-65抗体VH
<400> 45
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc agctatcaga tgggctgggt gcgacaggcg 120
cccggcaagg ggctggaatg ggtcggtgtt attaacaaga gtggtagtga cacatcatac 180
gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct acttctgcgc caaaggttct 300
gctagttata taactgctgc taccatcgac gcatggggcc acgggaccga agtcatcgtc 360
tcctcc 366
<210> 46
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体VH
<400> 46
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccgggtt cgacttcagc gattatggca tgggttgggt gcgacaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggttgctgct attagaagtg atggtagtaa cccatcatac 180
gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgaaggaca acgggcgaag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accgccacct actactgcgc caaggatggt 300
aatggttact gtgctctcga tgcttatcgt agtggtggtt atagttgtgg tgtttatcct 360
ggtagcatcg acgcatgggg ccacgggacc gaagtcatcg tctcctcc 408
<210> 47
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-13抗体VL
<400> 47
ggccctgact cagccgtcct cggtgtcagc aaacccagga gaaaccgtca agataacctg 60
ctccgggggt agctatagct atggctggtt ccagcagaag tctcctggca gtgcccttgt 120
cactgtgatc tactgggatg atgagagacc ctcggacatc ccttcacgat tctccggtgc 180
cctatccggc tccacaaaca cattaaccat cactggggtc caagccgacg acgaggctgt 240
ctatttctgt gggactgaag acatcagcgg cactgctggt gtatttgggg ccgggacaac 300
cctgaccgtc ctggg 315
<210> 48
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-2抗体VL
<400> 48
ggccctgact cagccgtcct cggtgtcagc aaacccagga gaaaccgtca agatcacctg 60
ctccgggggt ggcagctatg ctggaagtta ctattatggc tggtaccagc agaaggcacc 120
tggcagtgcc cctgtcactc tgatctatga aagcaacaag agaccctcgg acatcccttc 180
acgattctcc ggttccacat ctggctccac agccacacta accatcactg gggtccaagc 240
cgatgacgag gctatctatt actgtgggag ctgggacagt agcaatggtg gtatatttgg 300
ggccgggaca accctgaccg tcctagg 327
<210> 49
<211> 331
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-65抗体VL
<400> 49
ggccctgact cagccgtcct cggtgtcagc aaaccctggg gaaactgtca agatcacctg 60
ctccgggggt ggtagcagtg gctatggtta tggctggtat cagcagaagt cacctagcag 120
tgcccctctc actgtgatct actggaacga caagagaccc tcggacatcc cttcacgatt 180
ctccggttcc aaatccggct ccacacacac attaaccatc actggggtcc aagccgagga 240
cgaggctgta tatttctgtg ggaatgatga ctacagcagt gatagtggat atgtcggtgt 300
atttggggcc gggacaaccc tgaccgtcct a 331
<210> 50
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体VL
<400> 50
gccctgactc agccgtcctc ggtgtcagca aacctggaag gaaccgtcga gatcacctgc 60
tccgggagtg gctatggtta tggctggtat cagcagaagt ctcctggcag tgcccctgtc 120
actgtgatct atcagaacga caagagaccc tcggacatcc cttcacgatt ctccggttcc 180
aaatccggct ccacgggcac attaaccatc actggggtcc aagtcgagga cgaggctgtc 240
tattactgtg ggagtgaaga cagcagcact cttgctggta tatttggggc cgggacaacc 300
ctgaccgtcc ta 312
<210> 51
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3突变体
<400> 51
Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val
1 5 10 15
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Ile Glu Glu Arg Ser Gln
20 25 30
Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp
50 55 60
Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile
65 70 75 80
Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr
85 90 95
Thr Thr Val Ser
100
<210> 52
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4突变体
<400> 52
Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val
1 5 10 15
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
20 25 30
Thr Val Lys Cys Ser Cys Phe Pro Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp
50 55 60
Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile
65 70 75 80
Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr
85 90 95
Thr Thr Val Ser
100
<210> 53
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M5突变体
<400> 53
Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val
1 5 10 15
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
20 25 30
Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Asn Lys Pro Ser Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp
50 55 60
Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile
65 70 75 80
Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr
85 90 95
Thr Thr Val Ser
100
<210> 54
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M6突变体
<400> 54
Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val
1 5 10 15
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
20 25 30
Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Leu Gln Arg Trp Trp
50 55 60
Cys Gln Met Glu Leu Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile
65 70 75 80
Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr
85 90 95
Thr Thr Val Ser
100
<210> 55
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M7突变体
<400> 55
Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val
1 5 10 15
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
20 25 30
Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp
50 55 60
Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Glu Cys Lys Thr Leu Pro
65 70 75 80
Asp Asn Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr
85 90 95
Thr Thr Val Ser
100
<210> 56
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M8突变体
<400> 56
Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val
1 5 10 15
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
20 25 30
Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp
50 55 60
Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile
65 70 75 80
Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Ser Cys Ser Ser Gly Asn Lys Ile Lys
85 90 95
Thr Thr Thr Val Ser
100
<210> 57
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-13抗体HC
<400> 57
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Gly Met Phe Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ala Glu Ile Thr Asn Asp Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Glu Cys Pro Gly Gly Phe Ser Cys Trp Gly Asp
100 105 110
Thr Gly Gln Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
130 135 140
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145 150 155 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165 170 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
195 200 205
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210 215 220
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225 230 235 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245 250 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275 280 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290 295 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305 310 315 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325 330 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
355 360 365
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 58
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-2抗体HC
<400> 58
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ala Gln Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Pro Ala Val
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Pro Gly Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ser Tyr Asp Cys Pro Tyr Gly His Cys Ser Ser Gly Val
100 105 110
Asp Ser Ala Gly Glu Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile
115 120 125
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
130 135 140
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
165 170 175
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
180 185 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
195 200 205
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
210 215 220
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
355 360 365
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 59
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-65抗体HC
<400> 59
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gln Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Asn Lys Ser Gly Ser Asp Thr Ser Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Ala Ser Tyr Ile Thr Ala Ala Thr Ile Asp Ala Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 60
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体HC
<400> 60
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Ser Asp Gly Ser Asn Pro Ser Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Lys Asp Asn Gly Arg Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Cys Ala Leu Asp Ala Tyr Arg Ser Gly
100 105 110
Gly Tyr Ser Cys Gly Val Tyr Pro Gly Ser Ile Asp Ala Trp Gly His
115 120 125
Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 61
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-13抗体LC
<400> 61
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Leu Val Thr Val Ile Tyr Trp Asp Asp Glu
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ala Leu Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Thr Glu Asp Ile Ser Gly Thr Ala Gly Val Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys
210
<210> 62
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-2抗体LC
<400> 62
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr
20 25 30
Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ser Asn Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Asp Asp Glu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ser Ser Asn Gly
85 90 95
Gly Ile Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Arg Ser Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 63
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-65抗体LC
<400> 63
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Trp
20 25 30
Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Ser Ser Ala Pro Leu Thr Val Ile Tyr Trp
35 40 45
Asn Asp Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Ser Gly Ser Thr His Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Asn Asp Asp Tyr Ser Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Tyr Val Gly Val Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Arg Ser
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 64
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-28抗体LC
<400> 64
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Glu Gly Thr Val
1 5 10 15
Glu Ile Thr Cys Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Gln Asn Asp Lys
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Gly Ser Glu Asp Ser Ser Thr Leu Ala Gly Ile Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys
210
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EP1表位
<400> 65
Ile Val Thr Leu Asp
1 5
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EP2表位
<400> 66
Asp Ser Ser Gln Pro
1 5
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EP3表位
<400> 67
Arg Thr Ile Ala Arg
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EP4表位
<400> 68
Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys
1 5
<210> 69
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EP5表位
<400> 69
Ala Arg Pro Ala
1
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EP6表位
<400> 70
Lys Thr Lys Gln Trp Cys Asp Met Leu
1 5
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EP7表位
<400> 71
Gly Cys Asp Leu Leu Ile Asn Arg
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EP8表位
<400> 72
Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg
1 5
<210> 73
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-01-BSA (#1)
<400> 73
Thr Ala Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-02-BSA (#2)
<400> 74
Thr Leu Ala Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 75
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-03-BSA (#3)
<400> 75
Thr Leu Asp Arg Ala Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 76
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-04-BSA (#4)
<400> 76
Thr Leu Asp Arg Asp Ala Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 77
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-05-BSA (#5)
<400> 77
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ala Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-06-BSA (#6)
<400> 78
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Ala Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 79
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-07-BSA (#7)
<400> 79
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Ala Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-08-BSA (#8)
<400> 80
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Ala Thr Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 81
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-09-BSA (#9)
<400> 81
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Ala Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 82
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-10-BSA (#10)
<400> 82
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ala Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 83
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-11-BSA (#11)
<400> 83
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Arg Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 84
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-12-BSA (#12)
<400> 84
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Ala Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Cys
20
<210> 85
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-12-BSA (#13)
<400> 85
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Cys
20
<210> 86
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型FAM19A5同种型2（无信号肽）
<400> 86
Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val
1 5 10 15
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
20 25 30
Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp
50 55 60
Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile
65 70 75 80
Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr
85 90 95
Thr Thr Val Ser
100
<210> 87
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1突变体
<400> 87
Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Val Ile
1 5 10 15
Ala Ala His Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
20 25 30
Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp
50 55 60
Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile
65 70 75 80
Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr
85 90 95
Thr Thr Val Ser
100
<210> 88
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M2突变体
<400> 88
Gln Phe Leu Lys Glu Gly Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val
1 5 10 15
Thr Leu Asp Arg Cys Cys Asn Lys Asn Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln
20 25 30
Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp
50 55 60
Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile
65 70 75 80
Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr
85 90 95
Thr Thr Val Ser
100
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12抗体VH CDR1
<400> 89
Thr Tyr Ala Val Thr
1 5
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12抗体VH CDR2
<400> 90
Tyr Ile Asn Trp Arg Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12抗体VH CDR3
<400> 91
Asp Ala Ser Ser Gly Ala Ala Phe Gly Ser Tyr Gly Met Asp Pro
1 5 10 15
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12抗体VL CDR1
<400> 92
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ser
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12抗体VL CDR2
<400> 93
Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12抗体VL CDR3
<400> 94
Gln Gln Gly Tyr Ser Ser Thr Asn Val Trp Asn Ala
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 95
Ser Ser Asn Trp Trp Ser
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13B4抗体VH CDR2
<400> 96
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<213> 人工序列
<220>
<223> 13B4抗体VH CDR3
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 98
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Val Tyr Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 13B4抗体VL CDR2
<400> 99
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 13B4抗体VL CDR3
<400> 100
Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val
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<220>
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Gly Tyr Ser Trp Thr
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<211> 16
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<213> 人工序列
<220>
<223> 13F7抗体VH CDR2
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Glu Ile Ser His Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 103
Ala Leu Arg Gly Thr Tyr Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 104
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 106
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 108
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15A9抗体VL CDR1
<400> 110
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ser Leu Asn
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15A9抗体VL CDR2
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Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15A9抗体VL CDR3
<400> 112
Gln Glu Ser Ala Ser Ile Pro Arg Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A03抗体VH CDR2
<400> 114
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A03抗体VH CDR3
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Gly Ser Asn Trp Ser Ser Gly Met Asn Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A03抗体VL CDR1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A03抗体VL CDR3
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Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Gly Leu Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A08抗体VH CDR3
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Gly Asp Ser Phe Gly Tyr Gly Leu
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A08抗体VL CDR1
<400> 122
Thr Ala Asp Thr Leu Ser Arg Ser Tyr Ala Ser
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A08抗体VL CDR2
<400> 123
Arg Asp Thr Ser Arg Pro Ser
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A08抗体VL CDR3
<400> 124
Ala Thr Ser Asp Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Gln Tyr Val
1 5 10
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-F02抗体VH CDR1
<400> 125
Asn Tyr Tyr Met Gly
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-F02抗体VH CDR2
<400> 126
Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-F02抗体VH CDR3
<400> 127
Ile Asp Ile Gly Val Gly Asp Tyr Gly Trp Ala Tyr Asp Arg Leu Asp
1 5 10 15
Leu
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-F02抗体VL CDR1
<400> 128
Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Ile Ser
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-F02抗体VL CDR2
<400> 129
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-F02抗体VL CDR3
<400> 130
Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser Ile Thr
1 5 10
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A01抗体VH CDR1
<400> 131
Gly Tyr Tyr Met Ser
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A01抗体VH CDR2
<400> 132
Ile Ile Tyr Pro Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 133
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A01抗体VH CDR3
<400> 133
Val Ala Gly Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Glu Thr Phe Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A01抗体VL CDR1
<400> 134
Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Ile Ser
1 5 10
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A01抗体VL CDR2
<400> 135
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 136
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A01抗体VL CDR3
<400> 136
Leu Gly Gly Val Thr Tyr Ser Ser Thr Gly Thr His Leu Thr
1 5 10
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A03抗体VH CDR1
<400> 137
Asn Tyr Asp Met Ser
1 5
<210> 138
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A03抗体VH CDR2
<400> 138
Phe Met Asp Thr Asp Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A03抗体VH CDR3
<400> 139
Arg Gly Ser Ser Tyr Tyr Gly Gly Ile Asp Ile
1 5 10
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A03抗体VL CDR1
<400> 140
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A03抗体VL CDR2
<400> 141
Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 142
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A03抗体VL CDR3
<400> 142
Gln Ser Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Ala Tyr Val Gly Asn Ala
1 5 10
<210> 143
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07抗体VH CDR1
<400> 143
Ser Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 144
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07抗体VH CDR2
<400> 144
Ile Ile Tyr Pro Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 145
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07抗体VH CDR3
<400> 145
Thr Val Ser Gly Tyr Phe Asp Ile
1 5
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07抗体VL CDR1
<400> 146
Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07抗体VL CDR2
<400> 147
Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07抗体VL CDR3
<400> 148
Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F11抗体VH CDR1
<400> 149
Ser Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 150
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F11抗体VH CDR2
<400> 150
Tyr Ile Ala Asn Asn Tyr Asn Pro His Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 151
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F11抗体VH CDR3
<400> 151
Asp Asn Tyr Gly Met Asp Pro
1 5
<210> 152
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F11抗体VL CDR1
<400> 152
Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Lys Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 153
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F11抗体VL CDR2
<400> 153
Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 154
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F11抗体VL CDR3
<400> 154
Gln Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser Ala Asp Cys Asn Ala
1 5 10
<210> 155
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12抗体VH
<400> 155
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ala
20 25 30
Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Asn Trp Arg Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp
85 90 95
Ala Ser Ser Gly Ala Ala Phe Gly Ser Tyr Gly Met Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 156
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13B4抗体VH
<400> 156
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Asn Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Ser Val Asp Lys Thr Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gln Leu Val Gly Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 157
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13F7抗体VH
<400> 157
Gln Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Asn Ala Glu Ser Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Ser Trp Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Ser His Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Arg Gly Thr Tyr Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15A9抗体VH
<400> 158
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Leu Lys Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Asn Pro Phe Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 159
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A03抗体VH
<400> 159
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asp Tyr
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Pro Ser Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Glu Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Ser Asn Trp Ser Ser Gly Met Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 160
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A08抗体VH
<400> 160
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Tyr
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Val Tyr Pro Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Thr Ala Ser Thr Thr Val Asp Leu Met Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp
85 90 95
Ser Phe Gly Tyr Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 161
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-F02抗体VH
<400> 161
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Asp
85 90 95
Ile Gly Val Gly Asp Tyr Gly Trp Ala Tyr Asp Arg Leu Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 162
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A01抗体VH
<400> 162
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Pro Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Phe Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile
65 70 75 80
Thr Thr Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val
85 90 95
Ala Gly Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Glu Thr Phe Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A03抗体VH
<400> 163
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr Asp
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Phe Met Asp Thr Asp Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly
85 90 95
Ser Ser Tyr Tyr Gly Gly Ile Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Pro Val
100 105 110
Thr Val Ser Leu
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07抗体VH
<400> 164
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Pro Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Val
85 90 95
Ser Gly Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Leu
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Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ala Asn Asn Tyr Asn Pro His Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
85 90 95
Asp Asn Tyr Gly Met Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
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Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
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Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Ser Thr Asn
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Val Trp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<213> 人工序列
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<400> 167
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Val Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Lys Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Leu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13F7抗体VL
<400> 168
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Arg Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15A9抗体VL
<400> 169
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ser Ala Ser Ile Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A03抗体VL
<400> 170
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser
85 90 95
Thr Gly Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A08抗体VL
<400> 171
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Gln Val Asn Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Leu Thr Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ser Arg Ser Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Gly Ser Gly Ser Asn
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Tyr Gln Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr
100 105 110
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-F02抗体VL
<400> 172
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
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85 90 95
Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 173
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A01抗体VL
<400> 173
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Thr Tyr Ser Ser
85 90 95
Thr Gly Thr His Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 174
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A03抗体VL
<400> 174
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Ala Tyr Asp Pro Ala
85 90 95
Ala Tyr Val Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu
100 105 110
<210> 175
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07抗体VL
<400> 175
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 176
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F11抗体VL
<400> 176
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn
20 25 30
Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys
85 90 95
Ser Ser Ala Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile
100 105 110
Leu
<210> 177
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12抗体VH
<400> 177
cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcaccgtct ctggattctc cctcagtacc tatgcagtga cctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggaatggat cggatacatt aattggcgtg gtgggacatc ctacgcgaac 180
tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgtcga ccacggtgga tctgaaaatg 240
accagtccga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagagatgc tagtagtggt 300
gctgcttttg ggtcttacgg catggacccc tggggcccag ggaccctcgt caccgtctct 360
tca 363
<210> 178
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12抗体VL
<400> 178
gagctcgata tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gagcattagt agctacttat cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgaa gcatccaaac tggcctctgg ggtcccatcg 180
cggttcagcg gcagtggata tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaacag ggttatagta gtactaatgt ttggaatgct 300
ttcggcggag gcaccaatgt ggaaatcaaa 330
<210> 179
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-C12 HC
<400> 179
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ala
20 25 30
Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Asn Trp Arg Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp
85 90 95
Ala Ser Ser Gly Ala Ala Phe Gly Ser Tyr Gly Met Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 180
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13B4 HC
<400> 180
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Asn Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Ser Val Asp Lys Thr Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gln Leu Val Gly Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 181
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13F7 HC
<400> 181
Gln Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Asn Ala Glu Ser Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Ser Trp Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Ser His Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Arg Gly Thr Tyr Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
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Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 182
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15A9 HC
<400> 182
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
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100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
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Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asp Tyr
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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Pro Ser Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Glu Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Ser Asn Trp Ser Ser Gly Met Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
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420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Tyr
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
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Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
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Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
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Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
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Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
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Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
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340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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<213> 人工序列
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Ala Gly Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Glu Thr Phe Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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195 200 205
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
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50 55 60
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Ser Ser Tyr Tyr Gly Gly Ile Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Pro Val
100 105 110
Thr Val Ser Leu Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07 HC
<400> 188
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr
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Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
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Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
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Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
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Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<220>
<223> P2-F11 HC
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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
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340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
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385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
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435 440
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
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195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 191
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13B4 LC
<400> 191
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
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Asn Ser Gly Lys Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Leu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Ser Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 192
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13F7 LC
<400> 192
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Arg Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 193
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15A9 LC
<400> 193
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ser Ala Ser Ile Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 194
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A03 LC
<400> 194
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser
85 90 95
Thr Gly Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 195
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-A08 LC
<400> 195
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Gln Val Asn Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Leu Thr Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ser Arg Ser Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Gly Ser Gly Ser Asn
85 90 95
Tyr Gln Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Arg Ser
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 196
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1-F02 LC
<400> 196
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 197
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A01 LC
<400> 197
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Thr Tyr Ser Ser
85 90 95
Thr Gly Thr His Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 198
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-A03 LC
<400> 198
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Ala Tyr Asp Pro Ala
85 90 95
Ala Tyr Val Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu
100 105 110
Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 199
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F07 LC
<400> 199
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 200
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2-F11 LC
<400> 200
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn
20 25 30
Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys
85 90 95
Ser Ser Ala Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile
100 105 110
Leu Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220

Claims (17)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白(“抗FAM19A5抗体”)，并且其与包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的参考抗体交叉竞争结合人FAM19A5表位，其中：
(i)所述重链CDR1包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ IDNO：23的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：24的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列；
(ii)所述重链CDR1包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ IDNO：26的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或
(iii)所述重链CDR1包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQID NO：32的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
2.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白(“抗FAM19A5抗体”)，并且其与参考抗体结合相同的FAM19A5表位，所述参考抗体包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(i)所述重链CDR1包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ IDNO：23的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：24的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列；
(ii)所述重链CDR1包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQ IDNO：26的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或
(iii)所述重链CDR1包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列，所述重链CDR2包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述重链CDR3包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列，所述轻链CDR1包括SEQID NO：32的氨基酸序列，所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的抗FAM19A5抗体，其结合至少一个为SEQ ID NO：6的FAM19A5表位。
4.权利要求3所述的抗FAM19A5抗体，其在对应于氨基酸残基(i)46至51(即DSSQPR)、(ii)46、50和52(即D---P-R)或(iii)46、47、48和50(即DSS-P)的一个或多个氨基酸处结合为SEQ ID NO：6的FAM19A5表位。
5.权利要求1或2所述的抗FAM19A5抗体，其结合至少一个为SEQ ID NO：9的FAM19A5表位。
6.权利要求1或2所述的抗FAM19A5抗体，其结合至少一个FAM19A5表位，其鉴定为EP2、EP4和/或EP8，其中EP2包括氨基酸DSSQP(SEQ ID NO：66)，其中EP4包括氨基酸ARCACRK(SEQID NO：68)，并且其中EP8包括氨基酸TCTQPGGR(SEQ ID NO：72)。
7.权利要求1至6中任一项所述的抗FAM19A5抗体，其包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中
(i)所述重链CDR1包括SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20；
(ii)所述重链CDR2包括SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：21；
(iii)所述重链CDR3包括SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：22；
(iv)所述轻链CDR1包括SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：32；
(v)所述轻链CDR2包括SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：33；和/或
(vi)所述轻链CDR3包括SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：34。
8.权利要求1至7中任一项所述的抗FAM19A5抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO：35的重链可变结构域和包括SEQ ID NO：39的轻链可变结构域；(ii)包括SEQ ID NO：36的重链可变结构域和包括SEQ ID NO：40的轻链可变结构域；或(iii)包括SEQ ID NO：38的重链可变结构域和包括SEQ ID NO：42的轻链可变结构域。
9.权利要求1至7中任一项所述的抗FAM19A5抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括与SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，和/或其中所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42所列的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
10.权利要求1至9中任一项所述的抗FAM19A5抗体，其是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
11.权利要求1至10中任一项所述的抗FAM19A5抗体，其中所述抗FAM19A5抗体包括(i)包括SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60的重链；和(ii)包括SEQ ID NO：61、SEQID NO：62或SEQ ID NO：64的轻链。
12.权利要求1至11中任一项所述的抗FAM19A5抗体，其包括一种或多种以下性质：
(a)减少、逆转、延迟和/或预防纤维化；
(b)减少过量细胞外基质(ECM)的形成；
(c)延迟肿瘤生长或进展；
(d)如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量，以10nM或更小的KD结合可溶性人FAM19A5；
(e)如通过ELISA所测量，以10nM或更小的KD结合膜结合性人FAM19A5；
(f)减少、逆转、延迟和/或预防反应性神经胶质增生的发作；
(g)抑制反应性星形胶质细胞的过度增殖；
(h)降低硫酸软骨素蛋白聚糖包含神经聚糖和神经元-神经胶质抗原2(NG2)的表达；
(i)增加神经元细胞核中c-fos和pERK的表达；
(j)促进神经元存活；
(k)增加神经元中GAP43的表达；和
(l)促进轴突的再生长。
13.一种人序列相似家族19成员A5(FAM19A5)表位，其基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO：5、6、9或10至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述表位能够特异性结合参考抗体，所述参考抗体包括(i)包括SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的重链可变结构域，和(ii)包括SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42的轻链可变结构域。
14.一种核酸，其编码权利要求1至12中任一项所述的抗FAM19A5抗体或权利要求13所述的表位。
15.一种组合物，其包括权利要求1至12中任一项所述的抗FAM19A5抗体和载体。
16.权利要求1至12中任一项所述的抗FAM19A5抗体，其用于治疗脑癌。
17.一种诊断有需要的受试者的方法，其包括使所述受试者的生物样品与权利要求1至12中任一项所述的抗FAM19A5抗体接触。
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