ES2594893T3 - Anticuerpos anti HER2 y sus usos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti HER2 o un fragmento de un anticuerpo que se une a anti HER2, que comprende una VH y una VL que tiene una o más sustituciones de aminoácidos o combinaciones de sustituciones de aminoácidos en comparación con un anticuerpo que tiene una VH que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 1 a 117 de la SEQ ID NO: 1 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 1 a 103 de la SEQ ID NO: 2, en el que dicha una o más sustituciones de aminoácidos o combinaciones de sustituciones de aminoácidos se seleccionan de: (i) en comparación con una VH de SEQ ID NO: 1, la sustitución R83K, en la tercera región marco conservada de la cadena de VH (FR-H3); (ii) en comparación con una VL de SEC ID NO: 2, las sustituciones D28L y A34D en la primera CDR de la cadena de VL (CDR-L1), (iii) en comparación con una VL de SEC ID NO: 2, la sustitución A34D en la primera CDR de la cadena de VL (CDR-L1); (iv) en comparación con una VL de SEC ID NO: 2, la sustitución A34V en la primera CDR de la cadena de VL (CDR-L1); (v) en comparación con una VL de SEC ID NO: 2, las sustituciones Q27S y A34D en la primera CDR de la cadena de VL (CDR-L1); (vi) en comparación con una VL de SEC ID NO: 2, las sustituciones Q27L y A34V en la primera CDR de la cadena de VL (CDR-L1); (vii) en comparación con una VL de SEC ID NO: 2, las sustituciones Q27F y A34D en la primera CDR de la cadena de VL (CDR-L1); (viii) en comparación con una VL de SEC ID NO: 2, las sustituciones D28N y A34D en la primera CDR de la cadena de VL (CDR-L1).

Description

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Debe observarse que los artículos indefinidos “un”, “uno” y “una” y los artículos definidos “el”/“la”, se utilizan en la presente solicitud, como es habitual en las solicitudes de patente, para dar a entender uno(a) o más, salvo que el contexto dictamine claramente otra cosa. Adicionalmente, el término “o” se utiliza en la presente solicitud, como es habitual en las publicaciones de patente, para dar a entender la “o” disyuntiva o la “y” conjuntiva.

5 Las características y ventajas de la divulgación llegarán a ser más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de sus realizaciones.

6. Breve descripción de las tablas y de las figuras

La Tabla 1 muestra la numeración de los aminoácidos en las CDR de cadena pesada de trastuzumab.

La Tabla 2 muestra la numeración de los aminoácidos en las CDR de cadena ligera de trastuzumab.

15 La Tabla 3 muestra mutaciones en las CDR de cadena pesada de trastuzumab que no afectan sustancialmente de un modo negativo en la unión de HER2, es decir, producen una afinidad comparable o mejorada con respecto a trastuzumab, y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 4 muestra mutaciones en las CDR de cadena ligera de trastuzumab que no afectan sustancialmente de un modo negativo en la unión de HER2, es decir, producen una afinidad comparable o mejorada con respecto a trastuzumab, y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 5 muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena pesada de trastuzumab que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

25 La Tabla 6 muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena ligera de trastuzumab que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 7 muestra mutaciones adicionales en las CDR de cadena pesada de trastuzumab que no afectan sustancialmente de un modo negativo en la unión de HER2, es decir, producen una afinidad comparable o mejorada con respecto a trastuzumab, y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 8 muestra mutaciones adicionales en las CDR de cadena ligera de trastuzumab que no afectan sustancialmente de un modo negativo en la unión de HER2, es decir, producen una afinidad comparable o

35 mejorada con respecto a trastuzumab, y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 9 muestra mutaciones adicionales en las regiones marco conservadas de cadena pesada de trastuzumab que no afectan sustancialmente de un modo negativo en la unión de HER2, es decir, producen una afinidad comparable o mejorada con respecto a trastuzumab, y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 10 muestra mutaciones adicionales en las regiones marco conservadas de cadena pesada de trastuzumab que no afectan sustancialmente de un modo negativo en la unión de HER2, es decir, producen una afinidad comparable o mejorada con respecto a trastuzumab, y pueden incorporarse en los anticuerpos de la

45 divulgación.

La Tabla 11 muestra mutaciones adicionales en las regiones marco conservadas de cadena ligera de trastuzumab que no afectan sustancialmente de un modo negativo en la unión de HER2, es decir, producen una afinidad comparable o mejorada con respecto a trastuzumab, y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 12 muestra mutaciones conocidas en las regiones marco conservadas de cadena pesada de trastuzumab que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

55 La Tabla 13 muestra combinaciones de mutaciones que no afectan sustancialmente de un modo negativo en la unión de HER2, es decir, producen una afinidad comparable o mejorada con respecto a trastuzumab, y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 14 muestra combinaciones de mutaciones que no afectan sustancialmente de un modo negativo en la unión de HER2, es decir, producen una afinidad comparable o mejorada con respecto a trastuzumab, y pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 15 (15.1 a 15.3) muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena pesada de trastuzumab que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

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La Tabla 16 (16.1 a 16.2) muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena ligera de trastuzumab que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 17 (17-1.1 a 17-12) muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena pesada de trastuzumab encontradas en bibliotecas de unión a fagos que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 18 (18-1 a 18-13.2) muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena ligera de trastuzumab encontradas en bibliotecas de unión a fagos que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 19 (19-1 a 19-5) muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena ligera de trastuzumab encontradas en fagotecas de unión a anticuerpo biespecíficas que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 20 (20-1.1 a 20-2.2) muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena pesada de trastuzumab que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 21 (21.1 a 21.2) muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena ligera de trastuzumab que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 22 (22-1 a 22-6) muestra mutaciones conocidas en las regiones marco conservadas de la cadena pesada de trastuzumab que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 23 (23-1.1 a 23-4.2) muestra mutaciones conocidas en las regiones marco conservadas y CDR de la cadena ligera de trastuzumab que pueden incorporarse en los anticuerpos de la divulgación.

La Tabla 24 (24-1 y 24-2) muestra mutaciones desveladas en Li et al., 2009, Journal of Biological Chemistry 285(6): 3865-3871.

Figuras 1A-1C. La Figura 1A muestra las secuencias de aminoácidos y la numeración de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de trastuzumab, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, con las regiones CDR sombreadas. La Figura 1B muestra las secuencias CDR y los correspondientes identificadores de secuencia de trastuzumab. La Figura 1C muestra las secuencias marco conservadas y los correspondientes identificadores de secuencia de trastuzumab.

Las Figuras 2A-2G muestran las afinidades de unión de variantes de trastuzumab para HER2 con respecto a trastuzumab (afinidad de unión -100), medidas en ensayos de unión FACS con el ECD-C de HER2 marcado. Los experimentos se repitieron 2-3 veces y el valor medio con respecto al del trastuzumab parental se muestra como tablas (Figuras 2A y 2B) y como gráficos de barras de las variantes de cadena pesada y ligera (Figuras 2C2G).

La Figura 3 muestra la competición FACS sobre KS-BR3, una línea celular independiente de hormonas derivada de un adenocarcinoma mamario que expresa altos niveles de HER2 (Koyama et al., Neoplasia 9: 1021-1029 (2007)). Trastuzumab producido en 293c18 compite con Herceptin aunque irrelevante IgG1 no mostró competición (Figura 3A). En las Figuras 3B, 3C y 3D, respectivamente, se muestra una comparación de la unión entre mutaciones beneficiosas, mutaciones desinmunizantes y mutaciones combinatorias seleccionadas. Las representaciones con gráfico de barras de mutaciones beneficiosas, mutaciones desinmunizantes y mutaciones combinatorias se muestran en las Figuras 3E, 3F y 3G, respectivamente.

Las Figuras 4A-4B muestras respectivamente las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de todos los péptidos VL y VH de trastuzumab ensayados como posibles epítopos CD4+.

Las Figuras 5A-5D muestran respuestas de péptidos VL y VH de trastuzumab. La Figura 5A y la Figura 5Brespectivamente muestran el porcentaje de respuestas de donantes en cada uno de los péptidos VL y VH con un índice de estimulación de 2,95 o mayor. N=100 donantes. La Figura 5C y Figura 5D respectivamente muestran el índice de estimulación promedio de los 100 donantes, para cada péptido VL y VH más o menos el error típico.

Las Figuras 6A-6C muestran una serie de péptidos variantes basados en las regiones epitópicas de linfocitos T CD4+ identificadas, el péptido en la posición 29 que incluye la región marco conservada 3 de VH y 3 aminoácidos de CDR3 y el péptido en la posición 8 que incluye la CDR1 VL y partes de la región marco conservada 1 y 2. La Figura 6A muestra cambios de aminoácidos específicos en la región marco conservada 3 de VH y la CDR3 (aminoácidos sombreados). Las Figuras 6b y 6C muestran cambios de aminoácidos específicos en la CDR2 VL y partes de regiones marco conservadas 1 y 2 (aminoácidos sombreados). Se confirmó que los cambios de aminoácidos específicos no tenían impacto sobre la afinidad de la unión antigénica. Todos los péptidos se ensayaron con respecto a su capacidad para inducir respuestas proliferativas en linfocitos T CD4+ humanos mediante los métodos detallados en el Ejemplo 1.

La Figura 7 muestra respuestas de proliferación de linfocitos T CD4+ in vitro de 83 muestras de donantes contra péptidos variantes de trastuzumab. Figura 7A. Variantes peptídicas epitópicas de VH. Figura 7B. Variantes epitópicas de VL. (Rombos blancos: péptidos parentales. Rombos negros: péptidos variantes de acuerdo con las Figuras 6A-6C. Círculos blancos: variantes desinmunizadas seleccionadas).

5 La Figura 8 muestra péptidos de variantes epitópicas de VH y VL de trastuzumab ejemplares, donde “IE” es el índice de estimulación promedio para los 83 donantes ensayados y el “porcentaje de respondedores” es el porcentaje de donantes con un IE > 2,95.

La Figura 9 muestra la unión de variantes de trastuzumab con HER2, medida con un ensayo AlphaLISA de competición. En la Figura 9A se muestran resultados relativos de competición de unión (mutaciones sencillas beneficiosas), 9B (mutaciones desinmunizantes) y 9C (mutaciones combinatorias). En las Figuras 9D (variantes monocatenarias) y 9E (combinación de variantes de cadena pesada y ligera), se muestran actividades de unión relativas de las variantes que mostraron una unión equivalente con trastuzumab. Los datos se normalizaron con

15 un valor de CI50 obtenido de trastuzumab de tipo silvestre de tres conjuntos de experimentos independientes. Cada punto de datos de la curva de dilución se duplicó en la placa de ensayo.

La Figura 10 muestra la cinética de unión de variantes de trastuzumab, medida por BIAcore. La constante de la velocidad de asociación (kon) y de disociación (koff) de la unión de trastuzumab contra el dominio extracelular (ECD) de HER2 se determinaron utilizando resonancia de plasmón superficial en un BIAcore. La constante de disociación (KD) se calculó a partir de la ecuación kon/koff.

7. Descripción detallada

25 7.1. Anticuerpos anti HER2

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti HER2. A menos que se indique otra cosa, el término “anticuerpo” (Ac) se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a, o es inmunológicamente reactiva con, un antígeno particular, e incluye formas de anticuerpos policlonales, monoclonales, modificadas por ingeniería genética y modificadas de otra manera, incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos), y fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, incluyendo, por ejemplo, fragmentos Fab’, F(ab’)2, Fab, Fv, rIgG y scFv. Además, a menos que se indique otra cosa, se entiende que la expresión “anticuerpo monoclonal” (Acm) incluye moléculas tanto intactas, así como fragmentos de anticuerpo (tal

35 como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab’)2) que pueden unirse específicamente a una proteína. Los fragmentos Fab y F(ab’)2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación del animal, y pueden tener menos unión tisular inespecífica que la de un anticuerpo intacto (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316).

El término “scFv” se refiere a un anticuerpo Fv monocatenario (single chain) en el que los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo tradicional se han unido para formar una cadena.

Las referencias a “VH” se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena pesada de un Fv, scFv o Fab. Las referencias a “VL” se refieren a la región variable de una

45 cadena ligera de inmunoglobulina incluyendo la cadena ligera de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Los anticuerpos (Ac) y las inmunoglobulinas (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión con una diana específica, las inmunoglobulinas incluyen tanto moléculas de anticuerpos como otras similares a anticuerpos que carecen de especificidad por la diana. Los anticuerpos nativos y las inmunoglobulinas nativas son normalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestos por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H, heavy) idénticas. Cada cadena pesada tiene en el extremo amino un dominio variable (VH) seguido de diversos dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en el extremo amino (VL) y un dominio constante en el extremo carboxilo.

55 Los anticuerpos anti HER2 de la divulgación se unen a HER2 humano e inhiben su actividad en una célula.

Los anticuerpos anti HER2 de la divulgación contienen regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que están relacionadas en secuencia con las CDR del anticuerpo trastuzumab (también conocido como Herceptin).

Las CDR también se conocen como regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco conservadas (FR, framework). Como se sabe en la técnica, la posición de los aminoácidos/límite que delimita una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y de las diversas definiciones conocidas en la técnica. Algunas posiciones dentro de un dominio variable pueden verse como posiciones 65 hipervariables híbridas ya que estas posiciones pueden estar consideradas dentro de una región hipervariable bajo un conjunto de criterios mientras que se consideran fuera de una región hipervariable bajo un conjunto diferente de

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sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. En la técnica se conocen métodos de humanización de anticuerpos. Véanse, por ejemplo, Riechmann et al, 1988, Nature 332: 323-7; las patentes de

5 Estados Unidos n.º 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al; documento EP239400; Publicación PCT WO 91/09967; la patente de Estados Unidos n.º 5.225.539; el documento EP592106; documento EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka et al, 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973; y la patentes de Estados Unidos n.º 5.565.332.

Los anticuerpos anti HER2 de la divulgación pueden ser anticuerpos humanos. Los anticuerpos anti HER2 completamente “humanos” pueden ser deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Como se utiliza en el presente documento, los “anticuerpos humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulina humana y que no expresan inmunoglobulinas 15 endógenas. Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante diversos métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de presentación en fagos utilizando bibliotecas de anticuerpos procedentes de secuencias de inmunoglobulina humana. Véanse las patentes de Estados Unidos n.º 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741. Los anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando ratones transgénicos que no pueden expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; las patentes de Estados Unidos n.º 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Además, pueden contratarse compañías, tales como Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL), Amgen (Thousand Oaks, CA) y Regeneron (Tarrytown, NY), para obtener anticuerpos

25 humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando tecnología similar a la descrita anteriormente. Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse utilizando una técnica denominada “selección guiada”. En esta estrategia, se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers et al, 1988, Biotechnology 12: 899-903).

Los anticuerpos anti HER2 de la divulgación pueden primatizarse. La expresión “anticuerpo primatizado” se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables de mono y regiones constantes de ser humano. En la técnica se conocen métodos para producir anticuerpos primatizados. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.º 5.658.570; 5.681.722 y 5.693.780.

35 Los anticuerpos anti HER2 de la divulgación pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, con frecuencia, humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En la presente divulgación, una de las especificidades de unión puede dirigirse hacia HER2, pudiendo la otra ser para cualquier otro antígeno, por ejemplo, para una proteína de superficie celular, un receptor, una subunidad receptora, un antígeno específico de tejido, una proteína procedente de un virus, una proteína de envoltura codificada por un virus, una proteína procedentes de una bacteria o una proteína de la superficie de una bacteria, etc.

Los anticuerpos anti HER2 de la divulgación incluyen anticuerpos derivatizados. Por ejemplo, pero sin limitación, los

45 anticuerpos derivatizados se modifican típicamente por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión con un ligando celular o con otra proteína (véase la Sección 7.9 para un análisis de conjugados de anticuerpos), etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede realizarse mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales, utilizando, por ejemplo, tecnología de la compañía Ambrx (véase, por ejemplo, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10): 1011-2).

En otra realización adicional de la divulgación, los anticuerpos HER 2 o sus fragmentos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpo cuya secuencia se ha modificado para alterar al menos una función efectora biológica

55 mediada por la región constante con respecto a la secuencia de tipo silvestre correspondiente.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti HER2 de la divulgación puede modificarse para reducir al menos una función efectora biológica mediada por la región constante con respecto a un anticuerpo no modificado, por ejemplo, unión reducida con el receptor de Fc (FcR). La unión de FcR puede reducirse mutando el segmento de la región constante de inmunoglobulina del anticuerpo en regiones particulares necesarias para las interacciones con FcR (véase, por ejemplo, Canfield y Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173: 1483-1491; y Lund et al., 1991, J. Immunol. 147: 2657-2662). La reducción en la capacidad del anticuerpo para unirse a FcR también puede reducir otras funciones efectoras que se basan en interacciones con FcR, tales como opsonización, fagocitosis y citotoxicidad celular dependiente de antígeno (“CCDA”).

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otras realizaciones adicionales, los anticuerpos o sus fragmentos pueden modificarse para reemplazar uno o más aminoácidos que son susceptibles a ciclación, tal como asparagina o ácido glutámico, con un aminoácido que no sufre ciclación fácilmente.

5 7.2. Ácidos nucleicos y sistemas de expresión

La presente divulgación incluye moléculas de ácido nucleico y células hospedadoras que codifican los anticuerpos anti HER2 de la divulgación.

Un anticuerpo anti HER2 de la divulgación puede prepararse por expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo de manera recombinante, una célula hospedadora se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes portadores de fragmentos de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina del anticuerpo de tal manera que las cadenas ligera y pesada se expresan en la célula hospedadora y, opcionalmente, se secretan en el medio en el

15 que se cultivan las células hospedadoras, medio a partir del cual pueden recuperarse los anticuerpos. Para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos se utilizan metodologías convencionales de ADN recombinante, que incorporan estos genes en vectores de expresión recombinante e introducen los vectores en células hospedadoras, tales como las descritas en Molecular Cloning; Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) y en la patente de Estados Unidos n.º 4.816.397.

En una realización, los anticuerpos anti HER2 son similares a trastuzumab, salvo por cambios en una o más de las CDR (mencionados en el presente documento por tener secuencias “relacionadas con trastuzumab”). En otra realización, los anticuerpos anti HER2 son similares a trastuzumab salvo por cambios en una o más regiones marco 25 conservadas. En otra realización adicional, los anticuerpos anti HER2 son similares a trastuzumab salvo por cambios en una o más CDR y en una o más regiones marco conservadas. Para generar ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos anti HER2, primero se obtienen fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada. Estos ADN pueden obtenerse por amplificación y modificación de ADN de la línea germinal

o ADNc que codifica secuencias variables de cadena ligera y pesada, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la técnica se conocen secuencias de ADN de línea germinal para genes de región variable de cadena pesada y ligera humana (véase por ejemplo, la base de datos de la secuencia de la línea germinal humana “VBASE”, véase también Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH n.º 91 -3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T: 116-198; y Cox et al, 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827-836. Un fragmento de ADN que

35 codifica la región variable de cadena pesada o ligera de trastuzumab puede sintetizarse y utilizarse como un molde para la mutagénesis para generar una variante como se describe en el presente documento utilizando técnicas de mutagénesis habituales; como alternativa, un fragmento de ADN que codifica la variante puede sintetizarse directamente.

Una vez obtenidos los fragmentos de ADN que codifican trastuzumab o segmentos de VH y VL relacionados con trastuzumab, estos fragmentos de ADN pueden manipularse después mediante técnicas convencionales de ADN recombinante, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de la cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica la región VL o VH está unido operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal

45 como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. La expresión “unido operativamente”, como se utiliza en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN están unidos de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en fase.

El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa, uniendo operativamente al ADN que codifica la región VH con otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4). En la técnica se conocen las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana (véase, por ejemplo, Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH n.º 91-3242) y los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones pueden obtenerse por

55 amplificación con PCR convencional. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero en determinadas realizaciones es una región constante de IgG1. Para un gen de la cadena pesada de un fragmento Fab, el ADN que codifica la región VH puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifique solo la región constante de CH1 de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como en un gen de cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica la región VL con otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL – En la técnica se conocen las secuencias de los genes de la región constante de cadena ligera humana (véase, por ejemplo, Kabat E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición (U.S. Department of Health and Human Services, publicación 65 NIH n.º 91-3242)) y los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación con PCR convencional. La región constante de cadena la ligera puede ser una región constante kappa o lambda,

pero en determinadas realizaciones, es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican las regiones VH y VL están unidos operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4∼Ser)3, de tal manera que las secuencias VH y VL pueden expresarse como una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas mediante el

5 enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554).

Para expresar los anticuerpos anti HER2 de la divulgación, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, obtenidos como se describe anteriormente, se insertan en vectores de expresión, de tal manera que los genes están unidos operativamente a secuencias de control transcripcionales y traduccionales. En este contexto, la expresión “unido operativamente” quiere decir que un gen de anticuerpo está ligado en un vector de tal manera que las secuencias de control transcripcionales y traduccionales dentro del vector realizan su función esperada de regulación de la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la expresión de la célula

15 hospedadora utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo puede insertarse en vectores distintos o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión.

Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales (por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento génico del anticuerpo y vector, o ligamiento de extremos romos si no están presentes sitios de restricción). Antes de la inserción de las secuencias de cadena ligera

o pesada relacionadas con trastuzumab o de trastuzumab, el vector de expresión ya puede llevar secuencias de la región constante del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia para convertir las secuencias VH y VL relacionadas con trastuzumab o de trastuzumab en genes de anticuerpos de longitud completa, es insertarlas en vectores de expresión que ya codifican las regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada respectivamente, de tal

25 manera que el segmento de VH está unido operativamente a uno o más segmentos de CH dentro del vector y el segmento de VL está unido operativamente al segmento de CL dentro del vector. De manera adicional o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo a partir de una célula hospedadora. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de tal manera que el péptido señal está ligado en fase con el extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es de inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la divulgación llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena del anticuerpo en una célula 35 hospedadora. La expresión “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de cadena del anticuerpo. Dichas secuencia reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Como secuencias reguladoras adecuadas para la expresión en células hospedadoras de mamífero se incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores procedentes del citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador del CMV), Virus de Simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador del SV40), adenovirus 45 (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Para una descripción adicional de elementos reguladores víricos, y secuencias de los mismos, véanse, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.º

5.168.062 de Stinski, la Patente de Estados Unidos n.º 4.510.245 de Bell et al., y la Patente de Estados Unidos n.º

4.968.615 de Schaffner et al.

Además de los genes de cadena de anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la divulgación pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de las células hospedadoras en la que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.º 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel

55 et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador de selección confiere resistencia a fármacos, tales como G418, puromicina, blasticidina, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Como genes marcadores de selección adecuados se incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células hospedadoras sin DHFR con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418). Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el vector o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales. Las diversas formas del término “transfección” pretenden incluir una amplia variedad de técnicas normalmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, lipofección, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y técnicas similares.

65 Es posible expresar los anticuerpos de la divulgación en células hospedadoras procariotas o eucariotas. En determinadas realizaciones, la expresión de anticuerpos se realiza en células eucariotas, por ejemplo, células

hospedadoras de mamífero, para la secreción óptima de un anticuerpo inmunológicamente activo y correctamente plegado. Como ejemplos de células hospedadoras de mamífero para la expresión de anticuerpos recombinantes de la divulgación se incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO sin DHFR, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, utilizadas con un marcador de 5 selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NS0, células COS, células 293 y células SP2/0. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se desarrollan las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos convencionales de purificación de proteínas. También pueden utilizarse células hospedadoras para producir partes de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entiende que las variaciones en el procedimiento anterior se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedadora con ADN que codifica bien la cadena pesada o la cadena ligera (pero

15 no las dos) de un anticuerpo anti HER2 de la presente divulgación.

También puede utilizarse tecnología de ADN recombinante para retirar algunos o todos los ADN que codifican cualquiera o las dos cadenas ligera y pesada que no son necesarios para la unión con HER2. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas también quedan incluidas por los anticuerpos de la divulgación.

Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo de la divulgación y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de HER2 entrecruzando un anticuerpo de la divulgación con un segundo anticuerpo mediante métodos de entrecruzamiento químicos

25 convencionales. Los anticuerpos bifuncionales también pueden prepararse expresando un ácido nucleico modificado por ingeniería genética para codificar un anticuerpo bifuncional.

En determinadas realizaciones, pueden producirse anticuerpos específicos dobles, es decir, anticuerpos que se unen a HER2, y a un antígeno no relacionado, utilizando el mismo sitio de unión, mutando restos de aminoácidos en las CDR de cadena ligera y/o de cadena pesada. En diversas realizaciones, pueden producirse anticuerpos específicos dobles que se unen a dos antígenos, tales como HER2 y VEGF, mutando restos de aminoácidos en la periferia del sitio de unión con el antígeno. (Bostrom et al., 2009, Science 323: 1610-1614). Los anticuerpos funcionales dobles pueden prepararse expresando un ácido nucleico modificado por ingeniería genética para codificar un anticuerpo específico doble.

35 Para la expresión recombinante de un anticuerpo anti HER2 de la divulgación, la célula hospedadora puede transfectarse conjuntamente con dos vectores de expresión de la divulgación, codificando el primer vector un polipéptido derivado de cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de cadena ligera. Típicamente, cada uno de los dos vectores contiene un marcador de selección distinto. Como alternativa, puede utilizarse un solo vector que codifique los polipéptidos tanto de cadena ligera como de cadena pesada.

Una vez que se genera un ácido nucleico que codifica una o más partes de trastuzumab o de un anticuerpo anti HER2 con secuencias CDR relacionadas con las secuencias CDR de trastuzumab, pueden introducirse alteraciones

o mutaciones adicionales en la secuencia codificante, por ejemplo, para generar ácidos nucleicos que codifiquen

45 anticuerpos con secuencias CDR diferentes, anticuerpos con afinidad reducida por el receptor de Fc, o anticuerpos de diferentes subclases.

Los anticuerpos anti HER2 de la divulgación también pueden producirse por síntesis química (por ejemplo, por los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). También pueden generarse anticuerpos variantes utilizando una plataforma acelular (véase, por ejemplo, Chu et al., Biochemia n.º 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals)).

Una vez que un anticuerpo anti HER2 de la divulgación se ha producido por expresión recombinante, este puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de

55 inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad, particularmente, por afinidad por HER2 después de la selección de Proteína A o Proteína G, y cromatografía de columna por clasificación por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Adicionalmente, para facilitar la purificación, los anticuerpos anti HER2 de la presente divulgación, o sus fragmentos, pueden fusionarse con secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en el presente documento o, de lo contrario, conocidas en la técnica.

Una vez aislado, un anticuerpo anti HER2 puede, si se desea, purificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Véase, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work y Burdon, eds., Elsevier, 1980)), o mediante cromatografía de filtración en gel en una

65 columna SuperdexTM75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia).

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7.4. Propiedades cinéticas de los anticuerpos anti HER2

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti HER2 de la divulgación tienen una alta afinidad de unión por HER2. En realizaciones específicas, los anticuerpos anti HER2 de la presente divulgación tienen constantes de

5 velocidad de asociación (valores kon o ka), constantes de velocidad de disociación (valores koff o kd), constantes de afinidad (valores kA), constantes de disociación (valores kD) y/o valores CI50, específicos. En varias realizaciones, las constantes de unión para la interacción de los anticuerpos anti HER2 con el dominio extracelular del receptor HER2 (p185HER2-ECD) pueden determinarse utilizando resonancia de plasmón superficial de acuerdo con el método desvelado en Karlsson et al. (1991) J. Immunol. Methods 145: 229-240. En determinados aspectos, dichos valores se seleccionan de las siguientes realizaciones.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti HER2 de la divulgación se une a HER2 con una KA (kon/koff) de al menos 108 M-1, al menos 4 X 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 4 X 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 4 X 1011 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 4 X1012 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 4 X 1013 M-1, al menos 1013 M-1, al menos

15 4 X 1014 M-1, al menos 1014 M-1, al menos 4 X 1015 M-1, al menos 1015 M-1, o con una KA de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, de 4 X 108 M-1 a 4 X 1013 M-1 o de 4 X 1012 M-1 a 4 X 1015 M-1).

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti HER2 de la divulgación se une a HER2 con una KD (koff/kon) de 5 X 10-8 M o menor, de 10-8 M o menor, de 5X 10-9 M o menor, de 10-9 M o menor, de 5 X 10-10 M o menor, 10-10 M o menor, 5 X 10-11 M o menor, 10-11 M o menor, 4 X 10-12 M o menor, 10-12 M o menor, 5 X 10-13 M o menor, 10-13 M o menor, 5 X 1014 M o menor, 10-14 M o menor, 5 X 10-15 M o menor, 10-15 M o menor, o con una KD de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, 5 X 10-11 M a 5 X 10-13 M X 10-12 M a 10-15 M).

En realizaciones específicas, el valor KD (koff/kon) se determina mediante ensayos bien conocidos en la técnica, por

25 ejemplo, ELISA, calorimetría de titulación isotérmica (CTI), ensayo de polarización fluorescente o mediante cualquier otro biodetector tal como BIAcore.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti HER2 de la divulgación se une a HER2 e inhibe el crecimiento celular a una CI50 menor que 3 nM, menor que 2 nM, menor que 1 nM, menor que 0,5 nM , menor que 0,2 nM , menor que 0,1 nM , menor que 0,05 nM , menor que 0,02 nM, menor que 0,01 nM, menor que 0,005 nM, menor que 0,002 nM, menor que 0,001 nM, menor que 5 X 10-4 nM, menor que 2 X 10-4 nM, menor que 1 X 10-4 nM, menor que 5 X 10-5 nM, menor que 2 X 10-5nM, menor que 1 X 10-4 nM, menor que 5 X 10-6 nM, menor que 2 X 10-6 nM, menor que 1 X 10-6 nM, menor que 5 X 10-7 nM, menor que 2 X 10-7 nM, menor que 1 X 10-7 nM, o con una CI50 de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, de 0,02 nM a 2 X 10-5 nM, o de 5 X 10-5nM a 1 X

35 10-7 nM). La CI50 puede medirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti HER2 de la divulgación se une a HER2 a una concentración eficaz mínima (CE50) menor que 10 nM, menor que 9 nM, menor que 8 nM, menor que 7 nM, menor que 6 nM, menor que 5 nM, menor de 4 nM, menor de 3 nM, menor de 2 nM, menor de 1 nM, menor de 0,5 nM, menor de 0,2 nM, menor de 0,1 nM, menor de 0,05 nM, menor de 0,02 nM, menor de 0,01 nM, menor de 0,005 nM, menor de 0,002 nM, menor de 0,001 nM, menor de 5 X 10-4 nM, menor de 2 X 10-4 nM, menor de 1 X 10-4 nM, menor de 5 X 10-5 nM, menor de 2 X 10-5 nM, menor de 1 X 10-5 nM, menor de 5 X 10-6 nM, menor de 2 X 10-6 nM, menor de 1 X 10-6 nM, menor de 5 X 10-7 nM, menor de 2 X 10-7 nM, menor de 1 X 10-7 nM, o con una CE50 de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (por ejemplo, de 5 nM a 5 X 10-2 nM, o de 1 X 10-4 nM a 1 X 10-7 nM).

45 La CE50 puede medirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ensayo de unión de competición FACS.

En determinadas realizaciones, las propiedades cinéticas de un anticuerpo de la divulgación son comparables a, o mejoradas con respecto a, trastuzumab en un ensayo comparable. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un anticuerpo anti HER2 de la divulgación se une a HER2 con una velocidad kon que varía de aproximadamente 0,5x a 1000x de la kon de trastuzumab, por ejemplo una kon de 0,75 de la kon de trastuzumab, una kon de 1 x de la kon de trastuzumab, una kon de 1,1x de la kon de trastuzumab, una kon de 1,2x de la kon de trastuzumab, una kon de 1,3x de la kon de trastuzumab, una kon de 1,4x de la kon de trastuzumab, una kon de 1,5x de la kon de trastuzumab, una kon de 1,6x de la kon de trastuzumab, una kon de 1,6x de la kon de trastuzumab, una kon de 1,7x de la kon de trastuzumab,

55 una kon de 1,8x de la kon de trastuzumab, una kon de 1,9x de la kon de trastuzumab, una kon de 2x de la kon de trastuzumab, una kon de 2,25x de la kon de trastuzumab, una kon de 2,5x de la kon de trastuzumab, una kon de 2,75x de la kon de trastuzumab, una kon de 3x de la kon de trastuzumab, una kon de 4x de la kon de trastuzumab, una kon de 5x de la kon de trastuzumab, una kon de 6x de la kon de trastuzumab, una kon de 7x de la kon de trastuzumab, una kon de 8x de la kon de trastuzumab, una kon de 9x de la kon de trastuzumab, una kon de 10x de la kon de trastuzumab, una kon de 15x de la kon de trastuzumab, una kon de 20x de la kon de trastuzumab, una kon de 50x de la kon de trastuzumab, una kon de 75x de la kon de trastuzumab, una kon de 100x de la kon de trastuzumab, una kon de 150x de la kon de trastuzumab, una kon de 200x de la kon de trastuzumab, o una kon que varía entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo, una kon de 2x-75x de la kon de trastuzumab, una kon de 5x-100x de la kon de trastuzumab, una kon de 0,05x-1000x de la kon de trastuzumab, una kon de 0,75x-250x de la kon de trastuzumab, etc.

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querer limitarse a ninguna teoría, la mejora en los niveles de expresión puede dar como resultado una mejora en el plegamiento, una reducción de la glucosilación (por ejemplo, debido a la eliminación de un sitio de glucosilación) y/o una proteólisis reducida (por ejemplo, debido a la eliminación de un motivo de reconocimiento de proteasas) en comparación con trastuzumab.

5 En determinadas realizaciones, la expresión de un anticuerpo anti HER2 de la divulgación puede ser al menos 10 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 30 % mayor, al menos 40 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 75 % mayor al menos 100 % mayor, al menos 125 % mayor, al menos 150 mayor o al menos 200 % mayor que la expresión de trastuzumab en cualquier célula hospedadora procariota o eucariota determinada (por ejemplo, célula

10 de levadura, de insecto o de mamífero) como se describe en la Sección 7.2 anterior. En determinadas realizaciones, la expresión de un anticuerpo anti HER2 de la divulgación puede aumentarse con respecto a la de trastuzumab en cualquier célula hospedadora procariota o eucariota determinada (por ejemplo, célula de levadura, de insecto o de mamífero) en un intervalo entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, 20 %-75 % mayor, 50 %-100 % mayor, 30 %-125 % mayor, o similar. En diversas realizaciones específicas, la célula hospedadora es una célula de

15 E. coli, Sf9, S. cerevisiae, o CHO.

En otras realizaciones, la homogeneidad de un anticuerpo anti HER2 de la divulgación después de la expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota (por ejemplo, levadura, insecto o mamífero) (como se describe en la sección 7.2 anterior) y, opcionalmente, el aislamiento y/o purificación (por ejemplo, mediante pases sobre una 20 columna de afinidad) puede ser al menos 10 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 30 % mayor, al menos 40 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 60 % mayor, al menos 70 % mayor, al menos 80 % mayor, al menos 90 % mayor, al menos 100 % mayor, al menos 125 % mayor, al menos 150 % mayor o al menos 200 % mayor que la homogeneidad de trastuzumab cuando se expresa en la misma célula hospedadora sometida al mismo tratamiento (por ejemplo aislamiento y/o purificación). En determinadas realizaciones, la homogeneidad de un anticuerpo anti 25 HER2 de la divulgación puede aumentarse con respecto a la de trastuzumab en un intervalo que varía entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, 20 %-80 % mayor, 50 %-100 % mayor, 30 %-125 % mayor o similar. En varias realizaciones específicas, la célula hospedadora es E. coli, Sf9, S. cerevisiae, o CHO y la homogeneidad se ensaya en una composición después de que el anticuerpo anti HER2 se purifique, de tal manera que diversas especies de anticuerpo anti HER2 en la composición representan al menos 70 %, al menos 80 %, al

30 menos 90 % o al menos 95 % de las proteínas en la composición.

La presente divulgación proporciona adicionalmente métodos de exploración de anticuerpos anti HER2 para la expresión mejorada con respecto a trastuzumab. En realizaciones específicas, los métodos comprenden las etapas de (a) determinar una cantidad de un anticuerpo anti HER2 o de un fragmento que se une a un anticuerpo anti HER2

35 que se expresa en la célula hospedadora; y (b) comparar la cantidad de anticuerpo anti HER2 o de fragmento que se une a anti HER2 que se produce en la célula hospedadora, con una cantidad de trastuzumab que se produce en la célula hospedadora.

En la técnica se conocen métodos para ensayar la expresión de anticuerpos mejorada. En determinadas

40 realizaciones, una mejora en la expresión de un anticuerpo se ensaya de acuerdo con los métodos indicados en la Sección 7.1 anterior.

7.6. Respuesta inmunoadaptativa aumentada de anticuerpos anti HER2

45 Como se describe en la Sección 4, se ha mostrado que la terapia con el anticuerpo anti HER2 induce regresión tumoral de tumores que expresan HER2. El mecanismo de regresión tumoral con terapia anti HER2 incluye la inducción de la respuesta inmunoadaptativa, es decir, un aumento en la respuesta inmunitaria innata contra células tumorales que expresan HER2. Véase Park et al., 2010, Cancer Cell 18: 160-170,

50 En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti HER2 que producen una mayor respuesta inmunoadaptativa de trastuzumab. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti HER2 que tienen sustituciones de aminoácidos sencillas o múltiples en sus CDR y/o regiones marco conservadas en comparación con las CDR y/o regiones marco conservadas de trastuzumab, donde al menos una sustitución produce una respuesta inmunoadaptativa aumentada inducida por el anticuerpo en comparación con trastuzumab.

55 En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti HER2 de la divulgación inducen una respuesta inmunoadaptativa que es al menos 10 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 30 % mayor, al menos 40 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 75 % mayor, al menos 100 % mayor, al menos 125 % mayor, al menos 150 % mayor o al menos al menos 200 % mayor que la respuesta inmunoadaptativa inducida por trastuzumab. En

60 determinadas realizaciones, la respuesta inmunoadaptativa inducida por un anticuerpo anti HER2 de la divulgación es mayor que la respuesta inmunoadaptiva inducida por trastuzumab en una cantidad que varía entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo 20 %-75 % mayor, 50 %-100 % mayor, 30 %-125 % mayor, o similar.

7.7. Estabilidad aumentada de los anticuerpos anti HER2

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti HER2 que tienen estabilidad proteica aumentada en comparación con trastuzumab. La presente divulgación proporciona anticuerpos anti HER2

5 que tienen sustituciones de aminoácidos sencilla o múltiples en sus CDR y/o regiones marco conservadas, en comparación con las CDR y/o regiones marco conservadas de trastuzumab, donde al menos una sustitución produce una estabilidad aumentada del anticuerpo en comparación con trastuzumab. En determinadas realizaciones, la estabilidad aumentada es después del almacenamiento del anticuerpo. En otras realizaciones, la estabilidad aumentada es debido a una resistencia a la degradación por proteasas y similar.

En determinadas realizaciones, la estabilidad de un anticuerpo anti HER2 de la divulgación puede ser al menos 10 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 30 % mayor, al menos 40 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 75 % mayor, al menos 100 % mayor, al menos 125 % mayor, al menos 150 % mayor o al menos 200 % mayor que la estabilidad de trastuzumab. En determinadas realizaciones, la estabilidad de un anticuerpo anti HER2 de la

15 divulgación está aumentada en relación con la estabilidad de trastuzumab en un intervalo entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, 20 %-75 % mayor, 50 %-100 % mayor, 30 %-125 % mayor, o similar. En determinados aspectos, la estabilidad de un anticuerpo anti HER2 de la divulgación en una muestra es mayor que la estabilidad de trastuzumab en una muestra donde las muestras son sustancialmente idénticas (por ejemplo, ambas están en composiciones farmacéuticas que contienen los mismos ingredientes) y/o se procesan o manipulan sustancialmente de la misma manera (por ejemplo, se almacenan en las mismas condiciones de temperatura y humedad durante el mismo periodo de tiempo).

En determinados aspectos, la estabilidad aumentada de un anticuerpo anti HER2 de la divulgación es un aumento de la semivida. Una semivida aumentada puede producirse por una disminución en la oxidación de aminoácidos (por 25 ejemplo debido a que un resto de aminoácido susceptible a oxidación, tal como metionina, cisteína o triptófano, se ha sustituido en una CDR o FR con respecto a trastuzumab). Una semivida aumentada también puede producirse por una disminución en la ciclación de aminoácidos (por ejemplo debido a que un resto de aminoácido susceptible a ciclación, tal como asparagina o ácido glutámico) se ha sustituido en una CDR o FR con respecto a trastuzumab. Una semivida aumentada también puede producirse por la eliminación de un motivo de aminoácido reconocido por proteasas que puede estar en purificaciones de anticuerpo a niveles residuales. El aumento de la semivida o la disminución de la oxidación, ciclación o niveles de proteólisis con respecto a trastuzumab pueden ser de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 75 %, al menos 100 %, al menos 125 %, al menos 150 % o al menos 200 %. En determinadas realizaciones, el aumento de la semivida o la disminución de la oxidación, ciclación o niveles de proteólisis con respecto a trastuzumab está en un intervalo entre

35 cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, 20 %-75 % mayor, 50 %-100 % mayor, 30 %-125 % mayor, o similar.

La presente divulgación proporciona adicionalmente métodos para explorar anticuerpos anti HER2 para la estabilidad aumentada con respecto a trastuzumab. En realizaciones específicas, los métodos comprenden las etapas de: (a) determinar la cantidad de anticuerpo anti HER2 de longitud completa o fragmento que se une a anti HER2 en una primera muestra; y (b) comparar la cantidad de anticuerpo anti HER2 de longitud completa o fragmento que se une a anti HER2 en la primera muestra con una cantidad de trastuzumab de longitud completa en una segunda muestra.

45 En la técnica se conocen métodos para ensayar la estabilidad de los anticuerpos. En determinadas realizaciones, se ensaya un aumento en la estabilidad del anticuerpo de acuerdo con los métodos mencionados en la Sección 7.1 anterior.

7.8. Inmunogenicidad reducida de los anticuerpos anti HER2

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti HER2 que tienen inmunogenicidad reducida en comparación con trastuzumab. La presente divulgación proporciona anticuerpos anti HER2 que tienen sustituciones de aminoácidos sencillas o múltiples en sus CDR y/o regiones marco conservadas en comparación con las CDR y/o regiones marco conservadas de trastuzumab, donde al menos una sustitución reduce la

55 inmunogenicidad del anticuerpo en comparación con trastuzumab. En determinadas realizaciones, la inmunogenicidad reducida proviene de una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación o mitigación de uno o más de los epítopos de linfocitos T.

En determinados aspectos, los anticuerpos HER 2 de la divulgación que tienen inmunogenicidad reducida tienen actividad biológica comparable o mejorada en comparación con trastuzumab, por ejemplo, afinidad hacia HER2 o neutralización de la actividad de HER2. Dichas propiedades pueden ensayarse, por ejemplo, con los métodos descritos en la Sección 7.3 anterior.

En determinadas realizaciones, la inmunogenicidad de un anticuerpo anti HER2 de la divulgación está reducida con

65 respecto a trastuzumab. Dichos anticuerpos generalmente tienen secuencias variantes con respecto a la región variable de cadena pesada y/o ligera en regiones correspondientes a las SEQ ID NO: 16, 27, 31, 49 y/o 69. Los

anticuerpos tendrán generalmente una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en una o más de las secuencias correspondientes a las SEQ ID NO: 16, 27, 31, 49 y/o 69 aunque en el presente documento se contemplan hasta cuatro o cinco sustituciones en una o más de las regiones.

5 Como se utiliza en la presente divulgación, una variante con “inmunogenicidad reducida” se refiere a un anticuerpo anti HER2 con una secuencia variante en una región correspondiente a las SEQ ID NO: 16, 27, 31, 49 o 69, y donde un péptido tiene la secuencia variante en comparación con las SEQ ID NO: 16, 27, 31, 49 o 69 suscita una respuesta proliferativa reducida en células mononucleares de sangre periférica en comparación con un péptido de SEQ ID NO: 16, 27, 31, 49 o 69, respectivamente. Más adelante, en la Sección 9, se expone un ensayo de proliferación ejemplar que puede utilizarse para evaluar la respuesta proliferativa. La respuesta proliferativa reducida puede reflejarse en términos del porcentaje de respondedores, del índice de estimulación, o ambas cosas.

En otras realizaciones, en comparación con un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16, 27, 31, 49 o 69, la secuencia variante da como resultado al menos un 25 % de menos respondedores, al menos un 30 % de menos 15 respondedores, al menos un 25 % de menos respondedores, al menos un 35 % de menos respondedores, al menos un 40 % de menores respondedores, al menos 45 % de menos respondedores, al menos un 50 % de menos respondedores, al menos un 60 % de menos respondedores, al menos un 65 % de menos respondedores, al menos un 70 % de menos respondedores, al menos un 75 % de menos respondedores, al menos un 80 % de menos respondedores, al menos un 85 % de menos respondedores, al menos 90 % de menos respondedores, al menos un 95 % de menos respondedores, al menos el 100 % de menos respondedores o una reducción en respondedores en un intervalo que varía en cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, 25 %-75 % de menos respondedores, 50 %-90 % de menos respondedores, 60 %-100 % de menos respondedores, 70 %-90 % de menos respondedores,

o similar.

25 En otras realizaciones, la secuencia variante produce un índice de estimulación que es de al menos 5 % menor, al menos 10 % menor, al menos 15 % menor, al menos 20 % menor, al menos 25 % menor, al menos 30 % menor, al menos 35 % menor, o al menos 40 % menor que el índice de estimulación suscitado por un péptido de SEQ ID NO: 16, 27, 31, 49 o 69, respectivamente, o produce una estimulación reducida en un intervalo entre cualquiera de los valores anteriores en comparación con un péptido de SEQ ID NO: 16, 27, 31, 49 o 69, por ejemplo, 5 %-20 % menor, 10 %-30 % menor, 30 %-40 % menor, o similar.

Realizaciones ejemplares de anticuerpos anti HER2 con inmunogenicidad reducida en comparación con trastuzumab comprenden una o más de las sustituciones o combinaciones de sustituciones en la CDR y/o región marco conservada expuestas en las Tablas 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14. Opcionalmente, los anticuerpos anti HER2

35 con inmunogenicidad reducida en comparación con trastuzumab comprenden una o más sustituciones adicionales, tales como las mutaciones en la CDR expuestas en cualquiera de las Tablas 3, 5 y 7, en solitario o en combinación.

7.9. Conjugados de anticuerpo

Los anticuerpos anti HER2 de la divulgación incluyen conjugados de anticuerpos que están modificados, por ejemplo, mediante fijación covalente de cualquier tipo de molécula con el anticuerpo, tal como fijación covalente que no interfiera con la unión a HER2.

En determinados aspectos, un anticuerpo anti HER2 de la divulgación puede conjugarse con un residuo efector o

45 con un marcador. La expresión “residuo efector” como se utiliza en el presente documento, incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, u otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN), radionúclidos, particularmente radioyodo, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante RMN o espectroscopía con resonancia de espín electrónico (RES).

En un ejemplo, los anticuerpos anti HER2 pueden conjugarse con un residuo efector, tal como un agente citotóxico, un radionúclido o residuo farmacológico para modificar una respuesta biológica determinada. El residuo efector puede ser una proteína o un polipéptido, tal como, por ejemplo y sin limitación, una toxina (tal como abrina, ricina A,

55 exotoxina de Pseudomonas o toxina diftérica), una molécula de señalización (tal como -interferón, -interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor o activador de plasminógeno tisular), un agente trombótico o un agente antiangiogénico (por ejemplo, angiostatina o endostatina) o un modificador de la respuesta biológica, tal como una citocina o un factor de crecimiento (por ejemplo, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonas de granulocitos (G-CSF) o factor de crecimiento nervioso (NGF)).

En otro ejemplo los residuos efectores pueden ser citotoxinas o agentes citotóxicos. Los ejemplos de citotoxinas y de agentes citotóxicos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona,

65 mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.

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1997); and Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam y A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); y Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 531-545. El PEG puede fijarse a una cisteína en la región bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab’ modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido de manera covalente a un solo grupo tiol en una región bisagra modificada. Un resto de lisina

5 puede fijarse de manera covalente al grupo maleimida y cada uno de los grupos amina en el resto de lisina puede fijarse al polímero metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG ligado al fragmento Fab’ puede ser, por lo tanto, de aproximadamente 40.000 Da.

La palabra “marcador”, cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto o a una composición detectable que puede conjugarse directa o indirectamente con un anticuerpo anti HER2 de la divulgación. El propio marcador puede ser detectable (por ejemplo, marcadores radioisótopo o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, este puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable. Los residuos fluorescentes útiles incluyen, pero sin limitación, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonil cloruro, ficoeritrina y similares. Los marcadores enzimáticos útiles

15 incluyen, sin limitación, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa y similares.

Los conjugados del anticuerpo anti HER2 adicionales pueden ser útiles para, entre otras cosas, fines diagnósticos, como se describe más adelante en la Sección 7.10.

7.10. Usos diagnósticos de los anticuerpos anti HER2

Los anticuerpos anti HER2 de la divulgación, incluyendo los anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, mediante biotinilación, peroxidasa de rábano picante o mediante cualquier otro residuo detectable (incluyendo los descritos en la Sección 7.9) pueden utilizarse ventajosamente para fines diagnósticos.

25 En particular, los anticuerpos anti HER2 pueden utilizarse, por ejemplo, pero sin limitación, para purificar o detectar HE2, incluyendo métodos de diagnóstico tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para medir cualitativa y cuantitativamente niveles de HER2 en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). En una realización específica, los anticuerpos anti HER2 pueden utilizarse para detectar y cuantificar niveles de HER2 en suero, es decir, niveles del dominio extracelular de HER2 que se ha soltado de la superficie de las células.

La presente divulgación incluye adicionalmente anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un agente

35 de diagnóstico. Los anticuerpos pueden utilizarse desde el punto de vista diagnóstico, por ejemplo, para detectar la expresión de una diana de interés en células, tejidos específicos, o en suero, o para monitorizar el desarrollo o la progresión de una respuesta inmunológica como parte de un procedimiento de ensayo clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado. La detección puede facilitarse por acoplamiento del anticuerpo con una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse bien directamente al anticuerpo (o a su fragmento) o bien indirectamente, a través de un producto intermedio (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) utilizando técnicas conocidas en la materia. Los ejemplos de marcadores

45 enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de Estados Unidos n.º 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa, tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, -galactosidasa, acetilcolinesterasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Como ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados se incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; como ejemplos de materiales fluorescentes adecuados se incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; como ejemplos de materiales bioluminiscentes se incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y como ejemplos de materiales radioactivos adecuados se incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

55 La divulgación proporciona la detección de la expresión de HER2 que comprende poner en contacto una muestra biológica (células, tejido o fluidos corporales de un individuo) utilizando uno o más anticuerpos anti HER2 de la divulgación (opcionalmente conjugados con un residuo detectable) y detectar si la muestra es o no positiva para la expresión de HER2, o si la muestra tiene expresión alterada (por ejemplo, reducida o aumentada) en comparación con una muestra control.

La sobreexpresión de HER2 puede determinarse mediante ensayo de laboratorio clínico habitual, normalmente inmunohistoquímica (IHQ) y plata, hibridación cromogénica o fluorescente in situ (SISH/CISH/FISH). El ensayo de hibridación fluorescente in situ (FISH) está considerado como la técnica patrón oro para identificar pacientes que

65 podrían beneficiarse del tratamiento con Herceptin pero su uso es limitado por su coste. Otras técnicas incluyen cariotipificación virtual de tumores incluidos en parafina fijados en formalina.

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