KR101505157B1

KR101505157B1 - 항―ＥｒｂＢ２ 항체 변이체

Info

Publication number: KR101505157B1
Application number: KR1020120048805A
Authority: KR
Inventors: 문승기; 박소라; 안기영
Original assignee: 주식회사 종근당
Priority date: 2012-05-08
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2015-03-24
Also published as: EP2847227A4; ES2647962T3; EP2847227B1; EP2847227A1; JP2015517486A; JP6059339B2; WO2013168918A1; KR20130125412A; US9403912B2; US20150104443A1; CN104271603A; CN104271603B

Abstract

본 발명은 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체 변이체는 종래의 시판 항체치료제인 4D5에 비하여 ErbB2에 대한 친화도가 개선되었으며, 우수한 암세포 증식 저해활성을 나타낸다.

Description

항―ＥｒｂＢ２ 항체 변이체{Anti-ErbB2 Antibody Variants}

본 발명은 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 항체 변이체 또는 그의 하원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

HER2(ErbB2)는 EGFR(ErbB1), HER3(ErbB3) 및 HER4(ErbB4) 등과 같은 수용체 타이로신 카이네이즈(receptor tyrosin kinase)의 한 종류로서 세포막에 존재하며, 세포의 성장, 분화 및 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Jaclyn et al. Clin Breast Cancer. (2008) 8:38-49). HER2는 다른 HER 패밀리 단백질들과 달리 리간드에 의존적으로 활성화되지 않고 항상 활성화된 상태로 작용하며, 보통 정상세포에서는 세포막에 약 20,000개 정도 발현되지만, 암세포에서는 그 100배인 약 20,000,000개 정도가 과발현되는 것으로 알려져 있다(Shepard et al. J Clin Immunol. (1991) 11:117-127). 이러한 HER2의 과발현은 HER2-HER2 호모다이머 (homodimer) 뿐만 아니라, 다른 HER 패밀리인 HER1 또는 HER3와의 헤테로다이머 (heterodimer)를 과도하게 유도하고, 그 결과 세포의 증식 및 성장을 유발함으로써 암세포로 변형되는 것을 촉진한다(Mayumi et al. (2006) Clin Cancer Res. 12:7242-7251).

지금까지 유방암(25-30%), 난소암(15-30%), 위암(23%), 폐암(11-32%), 신장암(30-40%), 직장암(17-90%), 췌장암(26-45%), 방광암(44%), 전립선암(12%) 및 두경부암(29-39%) 등 다양한 암세포에서 HER2의 과발현이 보고되었다(Cancer Immunol Immunother (2004) 53:166-175; Clin Cancer Res (2006) 12:4377s-4383s; Br J Cancer (2004) 91:1195-1199; Cancer (2002) 94:2584-2589; Cancer (2003) 98: 66-73; Int J Oncol (2005) 27: 681-685; Int J Pancreatol (1995) 17:15-21; Int J Cancer (2000) 87:349-359; Ann Oncol (2001) 12:S15-S19; J Pathol (2004) 204:317-325). 또한, HER2의 과발현은 자궁내막암, 침샘암, 결장암 및 갑상선암에서 관찰되었다(King et al., Science (1985) 229:974; Yokota et al., Lancet: (1986) 1:765-767; Fukushige et al., Mol Cell Biol. (1986) 6:955-958; Guerin et al., Oncogene Res. (1988) 3:21-31; Cohen et al., Oncogene (1989) 4:81-88; Yonemura et al., Cancer Res. (1991) 51:1034; Borst et al., Gynecol. Oncol, (1990) 38:364; Weiner et al., Cancer Res. (1990) 50:421-425; Kern et al., Cancer Res.(1990) 50:5184; Park et al., Cancer Res. (1989) 49:6605; Zhau et al., Mol. Carcinog. (1990) 3:254-257; Aasland et al. Br. J. Cancer (1988) 57:358-363; Williams et al. Pathobiology (1991) 59:46-52; McCann et al., Cancer (1990) 65:88-92).

HER2를 표적으로 하는 항암 치료제는 Genentech에서 개발하여 1998년부터 판매된 허셉틴(Herceptin^ⓡ, Trastuzumab, 4D5)이 유일하며, 그 적응증은 HER2가 과발현된 전이성 유방암 또는 조기 유방암에 다른 항암제와 함께 병용 투여하는 것이다(J. Clin . Oncol . (1999) 17:2639-2264). 허셉틴은 HER2의 세포 밖 도메인 IV에 작용하여 HER2-HER2 사이의 호모다이머 생성을 억제시킴으로써 암세포 생존과 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다(Ann Oncol (2007) 18:977-984).

그러나, HER2 표적 항암치료제로서 허셉틴의 성공에도 불구하고 단독 투여 시 12-34%, 병용 투여 시 38-50% 정도의 반응 효과를 나타내며, 또한 단독 투여 시 2-7%, 병용 투여 시 11-28%까지 비정상적인 심장질환이 보고되었으며, 여성 10명중 1명 정도는 이미 갖고 있는 심질환의 위험 증가 우려 때문에 허셉틴 약물치료를 받을 수 없다(N Engl J Med (2007) 357:39-51). 따라서, 허셉틴 보다 부작용이 적은 후속 항체의 개발이 요구되고 있으며, Genetech에서 개발한 Omnitarg가 현재 임상 3상에 있다(Clin Cancer Res (2006) 12:4436s-4440s). 그러나, Omnitarg는 허셉틴에 비해 부작용 면에서의 장점은 있으나 효능이 떨어진다는 단점을 가지고 있다. 이러한 이유로, 신규한 HER2 항체 또는 이의 개선된 형태, 예를 들어 친화성 또는 효능 등이 증가된 4D5 항체 변이체가 절실히 요구된다.

한편, 항체는 루프 모양을 형성하는 6개의 상보성 결정 부위 (Complementarity-determining region, CDR)와 CDR에서 뻗어져 나오는 프레임워크 부위(Framework region, FR)가 항체 특유의 구조를 형성함으로써 항원에 결합할 수 있다(Fell et al. (1989) Immunol Ser. 43:181-202). FR은 CDR에 비해 서열이 보존되어 있으나, CDR 루프는 각각의 항체마다 매우 다양한 서열로 이루어져 있다 (Wu et al. (1970) J Expt Med. 132:211-250). 이러한 항체 서열의 다양성은 B 세포에서 VH, D_H, J_H(중쇄서열) 혹은 V_κ, J_κ 혹은 V_λ, J_λ(경쇄서열)의 유전자 재배열에 의해 이루어진다. 유전자 재배열 이외에도 핵산의 추가 혹은 점 돌연변이의 과정을 거쳐 체세포 고도변이가 일어남으로써 항원 특이성을 가지며 친화도가 높은 항체가 체내에서 생산될 수 있다.

일반적으로, 항원에 대한 고친화도 항체를 얻는 것은 노출되는 항원의 표면이 제한되므로 용이하지 않다. 특히, 이러한 현상은 naive 파지 디스플레이 라이브러리로부터 인 비트로 선별(in vitro selection)을 수행할 때 보다 더 잘 일어난다. 따라서, naive 파지 디스플레이 라이브러리로부터 일반적으로 얻어지는 항체의 친화도는 10-100 nM 수준에 불과하다(Iwai et al. (2010) Protein Eng Des Sel. 23:185-193).

항체의 친화도를 향상시키기 위한 전략은 임의 전략(random approach)과 표적화 전략(targeted approach)으로 나누어 볼 수 있다(Sheedy et al. (2007) Biotechnol Adv. 5(4):333-52). 표적화 돌연변이 유발(Targeted mutagenesis)은 특정 CDR이나 FR, 즉 특정 아미노산에 돌연변이를 주는 전략으로 표적화 PCR(targeted PCR), CDR 워킹(CDR walking), 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis) 및 CDR 타겟 핫스팟(CDR target hotspot) 등의 방법을 이용할 수 있다. 임의 돌연변이 유발(Random mutagenesis)은 가변 도메인에 변이를 주는 전략으로 에러-유발 PCR(error-prone PCR), DNA 셔플링 및 체인 셔플링 등의 방법을 이용할 수 있다(Kim et al. (2006) Adv Drug Deliv Rev. 58:657-667). 이러한 방법으로 만든 다양한 변이체들을 라이브러리로 제작하고, 파아지 표면에 다양한 변이체 라이브러리를 디스플레이하여 선별하는 과정을 거치게 된다. 이 외에도 이스트 디스플레이 및 리보솜 디스플레이를 이용하기도 한다(Rader et al. (1997) Curr Opin Biotechnol. 8:503-508; Zahnd et al. (2004) J Biol Chem. 279(18):18870-18877).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 ErbB2에 대한 인간화 항체인 4D5 보다 항원 친화도 및/또는 암세포 증식 저해활성이 개선된 항체 변이체를 개발하기 위하여 노력하였다. 이에, 본 발명자들은 CDR을 타겟으로 하는 표적화 돌연변이 유발 및 에러-유발 PCR을 이용한 임의 돌연변이 유발 전략으로 항체 라이브러리를 제작하고, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 항-ErbB2 항체 변이체를 선별하였으며, 선별된 항체 변이체가 모항체에 비하여 높은 항원 친화도를 나타낼 뿐만 아니라, 암세포의 증식을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 경쇄 가변 도메인; 및 (b) 다음의 아미노산 치환으로 구성된 군으로부터 선택된 2 이상의 아미노산 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:

서열목록 제1서열의 아미노산 서열에서 카바트 번호부여 시스템(Kabat numbering system)에 따른 위치 41의 Pro이 Arg으로 치환, 위치 96의 Gly이 Asn으로 치환, 위치 97의 Gly이 Ala으로 치환, 위치 98의 Asp이 Trp으로 치환, 위치 98의 Asp이 Lys으로 치환, 위치 100b의 Ala이 Ser으로 치환, 위치 100c의 Met이 Phe로 치환, 위치 101의 Asp이 Ala으로 치환, 위치 101의 Asp이 Val으로 치환, 위치 102의 Tyr이 His으로 치환 및 위치 102의 Tyr이 Leu으로 치환.

본 발명자들은 ErbB2에 대한 인간화 항체인 4D5 보다 항원 친화도 및/또는 암세포 증식 저해활성이 개선된 항체 변이체를 개발하기 위하여 노력하였다. 이에, 본 발명자들은 CDR을 타겟으로 하는 표적화 돌연변이 유발 및 에러-유발 PCR을 이용한 임의 돌연변이 유발 전략으로 항체 라이브러리를 제작하고, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 항-ErbB2 항체 변이체를 선별하였으며, 선별된 항체 변이체가 모항체에 비하여 높은 항원 친화도를 나타낼 뿐만 아니라, 암세포의 증식을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하였다.

이하, 하기에서 상세히 설명한다.

Ⅰ. 항-ErbB2 항체 변이체 및 그의 항원 결합 단편

본 발명의 항체 변이체는 ErbB2에 대하여 특이적 결합능을 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "항체 변이체(antibody variant)"는 ErbB2에 대한 인간화 항체 4D5의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인에서 각각 적어도 2 이상의 아미노산이 치환된 가변 도메인을 포함하는 아미노산 치환 변이체를 의미한다. 즉, 본 발명은 모항체 4D5의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 중 특정 위치의 아미노산을 치환함으로써 항원 친화력 및 암세포 증식 저해활성이 개선된 항체 변이체를 제공하는 것이다.

하기의 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 항체 변이체는 모항체인 4D5에 비해 ErbB2에 대한 친화력이 최대 8배 향상되었으며(표 5), 또한 4D5에 비해 약 3.5배 우수한 활성으로 위암세포의 증식을 억제한다(도 8).

상기 4D5 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하며, 4D5 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 항체 변이체는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 항원 결합 단편(항체 단편)을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

항체 분자의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fv 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 V_H 및 3 개의 불변영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 V_L 및 불변영역 도메인 C_L을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 중쇄 가변 도메인은 다음의 아미노산 치환을 포함한다:

(ⅰ) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열에서 카바트 번호부여 시스템에 따른 위치 98의 Asp이 Trp으로 치환, 위치 100c의 Met이 Phe로 치환, 위치 101의 Asp이 Ala으로 치환 및 위치 102의 Tyr이 Leu으로 치환(서열목록 제3서열);

(ⅱ) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열에서 카바트 번호부여 시스템에 따른 위치 96의 Gly이 Asn으로 치환, 위치 97의 Gly이 Ala으로 치환, 위치 98의 Asp이 Lys으로 치환, 위치 100b의 Ala이 Ser으로 치환, 위치 100c의 Met이 Phe로 치환, 위치 101의 Asp이 Val으로 치환 및 위치 102의 Tyr이 His으로 치환(서열목록 제4서열); 또는

(ⅲ) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열에서 카바트 번호부여 시스템에 따른 위치 41의 Pro이 Arg으로 치환, 위치 98의 Asp이 Trp으로 치환, 위치 100c의 Met이 Phe로 치환, 위치 101의 Asp이 Ala으로 치환 및 위치 102의 Tyr이 Leu으로 치환(서열목록 제6서열).

본 명세서에서 상기 중쇄 가변 도메인의 아미노산 치환을 설명하면서 언급한, 카바트 번호부여 시스템에 따른 위치 41은 서열목록 제1서열의 41번째 아미노산인 Pro을 의미하며, 위치 96은 서열목록 제1서열의 100번째 아미노산인 Gly을 의미하며, 위치 97은 서열목록 제1서열의 101번째 아미노산인 Gly을 의미하며, 위치 98은 서열목록 제1서열의 102번째 아미노산인 Asp를 의미하며, 위치 100b는 서열목록 제1서열의 106번째 아미노산인 Ala을 의미하며, 위치 100c는 서열목록 제1서열의 107번째 아미노산인 Met을 의미하며, 위치 101은 서열목록 제1서열의 108번째 아미노산인 Asp를 의미하며, 위치 102는 서열목록 제1서열의 109번째 아미노산인 Tyr을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 다음의 아미노산 치환을 포함한다:

서열목록 제2서열의 아미노산 서열에서 카바트 번호부여 시스템에 따른 위치 50의 Ser이 Thr으로 치환, 위치 51의 Ala이 Thr으로 치환, 위치 52의 Ser이 Thr으로 치환, 위치 53의 Phe이 Trp으로 치환, 위치 54의 Leu이 Pro으로 치환, 위치 72의 Thr이 Ser으로 치환, 위치 91의 His이 Tyr로 치환, 위치 93의 Thr이 Gln으로 치환, 위치 93의 Thr이 Asn으로 치환, 위치 96의 Pro이 Ala으로 치환, 위치 96의 Pro이 Val으로 치환 및 위치 97의 Thr이 Ser으로 치환으로 구성된 군으로부터 선택된 2 이상의 아미노산 치환.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 경쇄 가변 도메인은 다음의 아미노산 치환을 포함한다:

(ⅰ) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에서 카바트 번호부여 시스템에 따른 위치 93의 Thr이 Gln으로 치환, 위치 96의 Pro이 Ala으로 치환 및 위치 97의 Thr이 Ser으로 치환(서열목록 제5서열); 또는

(ⅱ) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에서 카바트 번호부여 시스템에 따른 위치 50의 Ser이 Thr으로 치환, 위치 51의 Ala이 Thr으로 치환, 위치 52의 Ser이 Thr으로 치환, 위치 53의 Phe이 Trp으로 치환, 위치 54의 Leu이 Pro으로 치환, 위치 72의 Thr이 Ser으로 치환, 위치 91의 His이 Tyr로 치환, 위치 93의 Thr이 Asn으로 치환 및 위치 96의 Pro이 Val으로 치환(서열목록 제7서열).

본 명세서에서 상기 경쇄 가변 도메인의 아미노산 치환을 설명하면서 언급한, 카바트 번호부여 시스템에 따른 위치 50은 서열목록 제2서열의 50번째 아미노산인 Ser을 의미하며, 위치 51은 서열목록 제2서열의 51번째 아미노산인 Ala을 의미하며, 위치 52는 서열목록 제2서열의 52번째 아미노산인 Ser을 의미하며, 위치 53은 서열목록 제2서열의 53번째 아미노산인 Phe을 의미하며, 위치 54는 서열목록 제2서열의 54번째 아미노산인 Leu을 의미하며, 위치 72는 서열목록 제2서열의 72번째 아미노산인 Thr을 의미하며, 위치 91은 서열목록 제2서열의 91번째 아미노산인 His을 의미하며, 위치 93은 서열목록 제2서열의 93번째 아미노산인 Thr을 의미하며, 위치 96은 서열목록 제2서열의 96번째 아미노산인 Pro을 의미하며, 위치 97은 서열목록 제2서열의 97번째 아미노산인 Thr을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열목록 제3서열, 서열목록 제4서열 및 서열목록 제6서열로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인; 및 (b) 서열목록 제2서열, 서열목록 제5서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함한다:

(ⅰ) 서열목록 제2서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열목록 제3서열의 중쇄 가변 도메인;

(ⅱ) 서열목록 제2서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열목록 제4서열의 중쇄 가변 도메인;

(ⅲ) 서열목록 제5서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열목록 제3서열의 중쇄 가변 도메인; 또는

(ⅳ) 서열목록 제7서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열목록 제6서열의 중쇄 가변 도메인.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 인간화 항체(humanized antibody)이다.

본 발명의 항체 변이체 또는 항체 단편은, HER2를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-ErbB2 항체 변이체 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물들도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

한편, 본 발명의 항체 변이체 또는 항체 단편은 기능성 분자와 결합된 면역접합체일 수 있다. HER2는 암세포의 표면에 발현되는 분자이므로 본 발명의 항체에 기능성 분자를 추가적으로 결합하여 HER2를 과발현하는 암의 예방, 치료 및 진단에 이용할 수 있다. 상기 기능성 분자는 화학물질, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질 등을 포함한다.

본 발명의 항체 변이체 또는 그의 단편과 커플링 시키기기에 바람직한 기능성 분자는 화학물질, 사이토킨 또는 케모킨이며, 보다 바람직하게는 화학물질이다. 상기 화학물질은 항암제이고, 예를 들면 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5'-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴,파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁소텔, 탁솔 및 이들의 혼합물이나 이에 한정되지 않는다.

Ⅱ. 핵산 분자 및 재조합 벡터

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584). 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제3서열, 서열목록 제4서열 또는 서열목록 제6서열의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자이며, 상기 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제2서열, 서열목록 제5서열 또는 서열목록 제7서열의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 전체 중쇄 영역을 코딩하는 핵산 분자 또는 전체 경쇄 영역을 코딩하는 핵산 분자 내에 포함된 형태일 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자; 및 (b) 본 발명의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함되며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "작동적으로 결합된"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터는 (a) 서열목록 제3서열, 서열목록 제4서열 및 서열목록 제6서열로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자; 및 (b) 서열목록 제2서열, 서열목록 제5서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터는 다음의 핵산분자를 포함한다:

(ⅰ) 서열목록 제3서열의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자 및 서열목록 제2서열의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자;

(ⅱ) 서열목록 제4서열의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자 및 서열목록 제2서열의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자;

(ⅲ) 서열목록 제3서열의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자 및 서열목록 제5서열의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자; 또는

(ⅳ) 서열목록 제6서열의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자 및 서열목록 제7서열의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., (1984) 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., (1980) 14:399-445)가 조절부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터(Appl. Environ. Microbiol. (1998) 64:3932-3938; Mol. Gen. Genet. (1996) 250:734-741) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터는 pCL 발현 벡터, 바람직하게는 pCLS05(대한민국 출원번호 제10-2011-0056685호) 발현 벡터를 조작하여 제작할 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 벡터는 CMV 프로모터를 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 항체 변이체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다. 하기의 실시예에서는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템을 이용하여 항체를 제조하였다.

Ⅲ. 형질전환체

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주세포는 아스페르길러스 속(Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포, 그리고 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 숙주세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 또는 293 세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 차이니즈 햄스터 난소 세포이다.

E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 바람직하지 않지만, Fab 및 Fv 등의 생산에는 사용될 수 있다.

본 명세서에서, 숙주세포로의 "형질전환" 및/또는 "형질감염"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

Ⅳ. 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주세포에서 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계를 포함하는 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.

상기 항체 제조에서 형질전환 된 숙주세포의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다. 세포 배양은, 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다.

동물세포 배양은 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글라이세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 그리고 아세트산과 같은 유기산을 포함한다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40 ℃이다.

형질전환된 숙주세포를 배양하여 수득한 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 항체의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에서 선택할 수 있다.

Ⅴ.암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 방법으로 제조한 항체는 ErbB2(HER2)에 높은 친화도로 결합하여 HER2를 과발현하는 암의 성장을 억제할 수 있으므로 항체 단독 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 암의 예방 및 치료에 사용가능하다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암의 발전의 억제, 암의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.

본 발명이 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 적용되는 질환인 암은 HER2를 과발현하는 암이고, 보다 바람직하게는 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 신장암, 직장암, 췌장암, 방광암, 전립선암, 두경부암, 자궁내막암, 침샘암 또는 갑상선암이고, 보다 더 바람직하게는 유방암 또는 위암이며, 가장 바람직하게는 위암이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "HER2를 과발현하는 암"은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교하여 유의적으로 더 높은 수준으로 HER2를 암 세포 표면에 갖고 있는 암이다. 이러한 과다발현은 유전자 증폭에 의해서나, 전사 또는 번역 증가에 의해서 일어날 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

항체 변이체는 항체 변이체-치료제(기능성 분자) 결합체 형태로 생체내로 투입하여 암의 치료에 이용할 수 있으며, 이에 대한 설명은 상기에서 설명한 바와 같다. 약제를 특이적 표적 부위로 표적화하는데 적당하고 바람직한 여러 가지 조건은 예를 들어 문헌 Trouet et al., Plenum Press, New York and London, (1982) 19-30에 보고되어 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 항체 변이체는 ErbB2에 높은 친화도로 결합한다. 특히, 본 발명의 항체 변이체는 ErbB2에 대한 친화도가 종래 시판 항체치료제인 4D5에 비하여 최대 8배 개선되었다.

(b) 본 발명의 항체 변이체는 우수한 암세포 증식 저해활성을 나타낸다. 특히, 본 발명의 항체 변이체의 위암 세포주 증식 저해활성은 4D5 보다 약 3.5배 우수하다.

(c) 따라서, 본 발명의 항체 변이체는 적은 양으로도 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 scFv의 디스플레이를 위한 별도의 전사체를 발현하는 벡터의 일부를 나타낸다. 오픈 리딩 프레임은 OmpA 분비 신호서열, 경쇄 가변 도메인, 링커 서열(L), 중쇄 가변 도메인, c-myc 태그 서열 및 바이러스 외피 단백질을 코딩한다.
도 2는 ErbB2에 결합하는 scFv-pIII 분자를 생산하는 E. coli 클론을 선별하기 위한 모노클로날 ELISA 결과를 보인 그래프이다.
도 3은 인간화 항체 4D5의 중쇄 가변 도메인(서열목록 제1서열), AH06과 A058의 중쇄 가변 도메인(서열목록 제3서열), AH16의 중쇄 가변 도메인(서열목록 제4서열) 및 A091의 중쇄 가변 도메인(서열목록 제6서열)의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸다.
도 4는 인간화 항체 4D5, AH06, AH16의 경쇄 가변 도메인(서열목록 제2서열), A058의 경쇄 가변 도메인(서열목록 제5서열) 및 A091의 경쇄 가변 도메인(서열목록 제7서열)의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸다.
도 5는 동물세포에서 생산 및 정제된 본 발명에 따른 항-ErbB2 항체 변이체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 6 내지 8은 항-ErbB2 항체 변이체의 세포증식 저해활성에 대한 분석 결과를 나타낸다. 도 6: D98W; 도 7: A058, A091; 도 8: AH06, AH16. 정제된 IgG를 6일 동안 NCI-N87 세포에서 평가하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 다양한 CDR 잔기를 갖는 파지-디스플레이된 scFv 라이브러리 제작

scFv와 pIII가 결합된 형태로 디스플레이를 생성하는 파지미드 벡터를 사용하여 파지-디스플레이된 scFv 라이브러리를 제작하였다. 상기 벡터의 대략적인 구조를 도 1에 도시하였다. 상기 벡터는 IPTG-유도성 Plac 프로모터의 제어하의 항체의 가변 도메인을 포함하며, 링커 서열은 GGGGSGGGSGGSS(서열목록 제8서열)이다. 모항체가 되는 항-ErbB2 항체(4D5)의 제조방법 및 가변 도메인 서열은 미국특허 제5,821,337호 및 제6,054,297호에 공지되어 있다.

scFv 디스플레이 벡터의 유일한 "정지 주형" 버전을 사용하여 라이브러리를 생성하였다. 본 실시예에서는 TGA 정지 코돈이 경쇄의 카바트 잔기 48에 삽입된 주형 pCMTG 파지미드 벡터를 사용하였다(IG Therapy Co., 한국). 중쇄 CDR3에는 정지 코돈이 도입되지 않았다. 다양화시킬 위치에 NNK 코돈을 갖는 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드를 사용하여 CDR 다양성을 도입함과 동시에 정지 코돈을 제거하였다. 이에 따라 동종이합체화 c-myc 및 pIII에 융합된 scFv 라이브러리 구성원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 생성되었다.

중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 지역을 우선적으로 변화시켰다. 중쇄 CDR3 지역을 변화시키기 위하여 HF(서열번호 19)와 LN01_R 프라이머(서열번호 9), HF(서열번호 19)와 LN02_R 프라이머(서열번호 10)를 사용하여 PCR을 수행하였다. C1000 Thermal cycler 기기(Bio-Rad, 미국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 Ex taq (Takara, 일본)으로 다음과 같이 증폭과정을 진행하였다: 95℃에서 20초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 프라이머 결합 및 72℃에서 45초 동안 연장시키는 증폭 과정을 27회 사이클 실시. 그리고, 경쇄 CDR3 지역을 변화시키기 위하여 LN03_F(서열번호 11)와 LR 프라이머(서열번호 17), LN04_F(서열번호 12)와 LR 프라이머 쌍을 이용하여 다음과 같이 PCR을 실시하였다: 95℃에서 20초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 프라이머 결합 및 72℃에서 45초 동안 연장시키는 증폭 과정을 27회 사이클 실시.

중쇄 CDR3와 경쇄 CDR3 변이체들 중에서 선별된 항체들을 주형으로 경쇄 CDR2를 타겟으로 NNK 코돈을 사용하여 무작위적으로 돌연변이를 유도하는 라이브러리를 제작하기 위하여 두 번의 PCR 과정을 수행하였다. PCR은 95℃에서 20초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 프라이머 결합 및 72℃에서 45초 동안 연장시키는 증폭 과정을 27회 사이클 실시하였다. 정방향 프라이머로 LF(서열번호 18)를 사용하였고, 역방향 프라이머로 LN05_R(서열번호 13)과 LN06_R(서열번호 14)을 1:1의 비율로 혼합한 프라이머를 사용하여 A 조각을 얻고, LN0506_F(서열번호 15)와 HR 프라이머(서열번호 20)를 사용하여 B 조각을 얻었다. A 조각과 B 조각을 주형으로 LF(서열번호 18)와 HR 프라이머(서열번호 20) 쌍으로 PCR을 수행하였다. 이 외에도 중쇄 CDR3과 2개의 경쇄(CDRL2, CDRL3) 변이체들 중에서 선별된 항체들을 주형으로 LF(서열번호 18)와 LN07_R 프라이머(서열번호 16)를 사용하여 추가적으로 라이브러리를 제작하였다.

상기 라이브러리로부터 선별된 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR3, 경쇄 CDR2 변이 항체를 주형으로 CDR과 프레임워크 부분 모두를 타겟으로 무작위적으로 돌연변이를 유도하기 위하여 에러 유발 PCR(error-prone PCR)을 수행하여 항체 라이브러리를 제작하기 위하여, 다음과 같이 PCR 과정을 두 번에 걸쳐 수행하였다: 첫 번째 PCR은 GeneMorpII Random mutagenesis kit(Stratagene, 미국)를 사용하여 95℃에서 20초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 프라이머 결합 및 72℃에서 45초 동안 연장시키는 증폭 과정을 32회 사이클 수행하였고, 두 번째 PCR은 Ex taq(Takara, 일본)을 사용하여 95℃에서 20초 동안 변성, 58℃에서 30초 동안 프라이머 결합 및 72℃에서 45초 동안 연장시키는 증폭 과정을 20회 사이클 수행하였으며; 먼저, LF(서열번호 18)와 LR(서열번호 17)를 사용하여 경쇄를 포함하는 조각과 HF(서열번호 19)와 HR 프라이머(서열번호 20) 쌍을 이용하여 중쇄를 포함하는 조각을 PCR을 통해 각각 증폭하였다. 경쇄와 중쇄 두 조각을 LF(서열번호 18)와 HR 프라이머(서열번호 20) 쌍으로 PCR 하여 scFv 형태의 단편으로 얻어 라이브러리를 제작하였다. PCR에 사용된 프라이머의 서열은 표 1에 나타내었다.

프라이머명	서열	서열번호
LN01_R	ACTAGTGCTACTCACGGTCACCAGAGTTCCCTGTCCCCAGTAATCCATGGCGTAMNNGCCMNNMNNMNNMNNTCTAGAGCAGTAGTAC	제9서열
LN02_R	ACTAGTGCTACTCACGGTCACCAGAGTTCCCTGTCCCCAMNNMNNMNNMNNGTAGAAGCCATCACC	제10서열
LN03_F	GACTTCGCTACGTACTACTGCNNKNNKNNKNNKACCACTCCTCCGAC	제11서열
LN04_F	GACTTCGCTACGTACTACTGCCAACAGCACTACNNKACTNNKNNKNNKTTCGGACAAGGCAC	제12서열
LN05_R	TGAATCTAGATGGCACACCMNNMNNMNNGAAMNNMNNMNNGTAGATCAGCAGCTTC	제13서열
LN06_R	TGAATCTAGATGGCACACCMNNMNNMNNCCAMNNMNNMNNGTAGATCAGCAGCTTC	제14서열
LN0506_F	GGTGTGCCATCTAGATTCAGTG	제15서열
LN07_R	ACTAGTGCTACTCACGGTCACCAGAGTTCCCTGTCCCCAGTAATCCATMNNGTAMNNGCCMNNMNNMNNMNNTCTAGAGCAGTAGTAC	제16서열
LR	GCGCGCTACTCACGGTC	제17서열
LF	GGCCCAGGCGGCCGATATCCAGATGAC	제18서열
HF	GAGCTCATGGATATCCAGATGACCCAGAG	제19서열
HR	GCGCGCTACTCACGGTC	제20서열

모 항체는 인간화 항체 4D5의 가변 도메인의 아미노산 서열(서열목록 제1서열의 중쇄 가변 도메인; 서열목록 제2서열의 경쇄 가변 도메인)을 포함한다(표 2).

	아미노산 서열	서열목록
중쇄 가변 도메인	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS	제1서열
경쇄 가변 도메인	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK	제2서열

라이브러리 LN01 및 LN02는 1개의 중쇄 CDR(CDRH3)에서 무작위화된 잔기로 제작되었고, 라이브러리 LN03 및 LN04는 1개의 경쇄 CDR(CDRL3)에서 무작위화된 잔기로 제작되었다. 또한, 라이브러리 LN05, LN06 및 LN07은 2개의 경쇄 CDR(CDRL2, CDRL3) 및 중쇄 CDR3에서 무작위화된 잔기로 제작되었다. 무작위화된 특정 잔기를 표 3에 나타내었다. CDR 위치는 카바트 명명법에 따라 넘버링 하였다. 추가적으로, 에러 유발 PCR을 통하여 제작한 CDR은 물론 프레임워크 부분을 포함하는 변이체 라이브러리를 LN08로 명명하였다.

상기 라이브러리는 대장균 XLl-블루(200158, Stratagene, 미국)에 전기천공 시키고(Sidhu et al. (2000) Methods Enzymol. 328:333-363), 형질전환 된 세포를 Ex12 헬퍼 파지(IG therapy, 한국)의 존재 하에서 밤새 성장시켜 파지미드 DNA를 피막화하고, 그의 표면상에 scFv 단편을 디스플레이하는 파지 입자를 생산하였다. 각 라이브러리는 5 x 10⁸개초과의 구성원을 함유하였다.

실시예 2. 라이브러리로부터 ErbB2 특이적 항체의 선택

실시예 1의 항체 라이브러리로부터 ErbB2 특이적 항체를 선별하였다. NUNC 96-웰 멕시소프(Maxisorp) 면역플레이트를 4℃에서 포획 표적(2 ㎍/㎖)으로 밤새 코팅하고, 수퍼블록 TBS(Superblock Tris buffered saline, Pierce)로 2시간 동안 차단하였다. 37℃에서 밤새 성장시킨 후 PEG/NaCl로 침전시켜 파지를 농축하고, 수퍼블록 TBS, 0.05% Tween 20(시그마)에 재현탁 시켰다. 이후, 파지 용액(약 10^l2 파지/㎖)을 코팅된 면역플레이트에 첨가하였다. 파지 결합을 위해 2시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈 20으로 10회 세척하였다. 결합된 파지를 0.1 M 글라이신(pH 2.2)으로 10분 동안 용리하고, 용리액을 1 M Tris/Cl(pH 9.0)로 중화하였다. 용리된 파지를 대장균 XLl-블루에서 증폭시켰다.

모항체의 K_D값이 피코몰 수준으로 항원과의 친화도가 매우 높은 수준이므로 친화도가 향상된 항체를 선별하는데 어려움이 있다. 따라서, 본 발명자들은 모항체보다 친화도가 높은 항체를 선별하기 위하여 크게 3가지 방법을 사용하였다. 첫 번째 방법으로, 세척시간을 최대 44시간까지 처리하여 off-rate가 향상된 항체를 선별하고자 하였다(Chen et al. (1999) J Mol Biol . 293:865-81). 두 번째 방법으로, 0.1 M 글라이신(pH 2.2)을 사용하여 전-용리(pre-elution) 과정을 수행한 뒤, 최종적으로 용리하는 방법을 사용하였으며(Bruin et al. (1999) Nat Biotechnol. 17(4):397-9), 세 번째 방법으로, 용리 전에 티오시안산 암모늄 (ammonium thiocyanate)을 처리하여 약하게 결합되어 있는 항체들을 제거하는 방법을 사용하였다(Macdonald et al. (1988) J Immunol Methods 106:191??4; Wang et al. (2000) J Immunol Methods. 241(1-2):171-84; Hur et al. (2010) Immunol Lett. 134(1):55-61).

상기 실험을 통하여 선택된 개별 클론을 카베니실린 및 암피실린이 보충된 2YT 브로쓰 500 ㎕에서 96-웰 포맷에서 성장시키고, 배양 상층액을 파지 ELISA에 직접 사용하여 표적 단백질로 코팅된 플레이트에는 결합하나 BSA로 코팅된 플레이트에는 결합하지 않은 파지-디스플레이된 scFv를 검출하였다(도 2). BSA-코팅된 플레이트에 비해 표적 단백질-코팅된 플레이트 상에서 OD값 0.5 이상이며, 1.0 M 티오시안산 암모늄을 처리하여도 결합력을 유지하는 클론을 ErbB2에 대한 특이적 결합체(변이체)로 정의하였다. 4-5회의 반복실험 후, 개별 클론을 스크리닝하여 라이브러리로부터 표적 단백질 ErbB2에 대한 결합체를 선별하였다.

상기 특이적 결합체의 DNA 서열을 분석하였다. 분석 결과, 한 특이적 결합체(AH06)는 카바트에 따른 번호부여 시스템에 따라 모항체 4D5의 중쇄 가변 도메인의 98, 100c, 101 및 102 자리에서 아미노산이 치환되었음을 확인하였다. 상기 AH06 이외의 결합체의 서열을 확인한 결과, 카바트 잔기 98, 100c, 101 및 102 외에 추가적으로 중쇄 가변 도메인에서 카바트 잔기 41, 96, 97 또는 100b, 경쇄 가변 도메인에서 카바트 잔기 50, 51, 52, 53, 54, 72, 91, 93, 96 또는 97 자리의 아미노산이 치환되었음을 확인하였다.

최적의 특이적 결합체를 찾기 위하여 치환된 각각의 잔기를 조합하여 최종적으로 선별된 특이적 결합체를 AH06, AH16, A058 및 A091로 명명하였다. 인간화 항체 AH06의 중쇄는 인간화 4D5 항체 중쇄의 변이체이며, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다. 인간화 항체 AH16은 서열목록 제2서열 및 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 포함한다. 인간화 항체 A058은 서열목록 제3서열 및 서열목록 제5서열의 아미노산 서열을 포함한다. 인간화 항체 A091은 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 항제의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 표 4에 나타내었다. 또한, 모항체 4D5와 상기 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 비교하여 도 3 및 4에 나타내었다.

중쇄 및 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열

	아미노산 서열	서열목록
중쇄 가변 도메인	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGWGFYAFALWGQGTLVTVSS	제3서열
중쇄 가변 도메인	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWNAKGFYSFVHWGQGTLVTVSS	제4서열
경쇄 가변 도메인	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYQTPASFGQGTKVEIK	제5서열
중쇄 가변 도메인	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQARGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGWGFYAFALWGQGTLVTVSS	제6서열
경쇄 가변 도메인	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYTTTWPYSGVPSRFSGSRSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQQYYNTPVTFGQGTKVEIK	제7서열

실시예 3. 항- ErbB2 항체의 경쇄 및 중쇄 전체 유전자 발현 벡터의 제조

실시예 2에서 제조된 scFv 형태의 인간화 항체의 가변 도메인 유전자를 인간화 항체의 전체 유전자로 제조하기 위하여 pCLS05 발현벡터(대한민국 출원번호 제 2011-0056685호)를 사용하였다. 먼저, 상기 항체의 중쇄 가변 도메인 유전자를 발현벡터 pCLS05에 삽입하기 위하여, 중쇄 가변 도메인 유전자를 제한효소 EcoRI/XhoI(NEB, 미국)과 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 1.5 % 아가로스 젤 전기영동과 에티디움 브로마이드 염색을 통하여 약 1.4 kb의 유전자 조각을 확인하였다. 마찬가지로, 발현벡터 pCLS05도 제한효소 EcoRI/XhoI으로 절단하여 약 7.5 kb의 절단된 발현벡터를 확인하였다. 이후, 각각의 유전자 조각을 퀴아젤 추출키트(Qiagen, 미국)를 이용하여 회수한 다음, T4 DNA 연결효소(DNA ligase, Takara Holdings, 일본)를 이용하여 16℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 대장균 DH5α를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 서열분석을 통하여 중쇄 전체 유전자가 벡터 내로 삽입되었음을 확인하였다.

인간화 항체의 중쇄 전체 유전자가 들어있는 상기 pCLS05 발현벡터에 경쇄 전체 유전자를 삽입하기 위하여, 경쇄 전체 유전자를 제한효소 HindIII/BamHI (NEB, 미국)과 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 1.5 % 아가로스 젤 전기영동과 에티디움 브로마이드 염색을 통하여 약 0.7 kp의 유전자 조각을 확인하였다. 마찬가지로, 발현벡터 pCLS05도 제한효소 EcoRI/XhoI으로 절단하여 약 8.8 Kb의 절단된 발현벡터를 확인하였다. 이후, 각각의 유전자 조각을 퀴아젤 추출키트(Qiagen. 미국)를 이용하여 회수한 다음, T4 DNA 연결효소(Takara Holdings, 일본)를 이용하여 16℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 대장균 DH5α를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 서열분석을 통하여 전체 경쇄 유전자가 벡터 내로 삽입되었음을 확인하였다.

실시예 4. 인간화 항체의 발현을 위한 CHO 세포의 형질전환

인간화 항체의 동물세포에서의 활성을 측정하기 위하여, 상기 실시예 3에서 각각 제조된 발현벡터를 이용하여 FreeStyle^TM CHO-s 세포(#R800-07, Invitrogen, 미국)를 형질전환시켰다. 먼저, CHO 세포를 배양하기 위하여 FreeStyle^TM CHO Expression 배지(Invitrogen, 미국)에 8 mM L-글루타민(25030-081, Gibco, 미국)을 첨가한 배양배지를 이용하였다. 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 배양기 (humidified CO₂ incubator)에서 2 내지 3일 동안 상기 세포를 배양한 후, 상온(25℃)에서 1,200 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 다음으로, 회수된 CHO-s 세포를 0.4 % 트리판 블루(Fluka, 미국) 용액으로 염색하고 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 세포의 수를 측정하였다.

세포농도를 5 x 10⁵ cells/㎖, 생존도(viability) > 95%가 되게 CHO-s 세포를 새로운 배지로 계대배양 하였다. 132 ㎍의 발현벡터와 130 ㎕ FreeStyle^TM MAX Reagent(#16447-100, Invitrogen, 미국)를 10분간 반응시킨 후 준비된 세포와 섞어 5일간 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂, 110 rpm Orbital shaker)에서 배양하였다.

실시예 5. 인간화 항체의 정제

상기 실시예 4에서 얻은 형질전환체를 하기와 같이 배양한 후 항체를 정제하여 인간화 항체를 수득하였다. 구체적으로, 500 ㎖ 삼각플라스크에 담긴 100 ㎖의 FreeStyle^TM CHO Expression 배지에서 5 x 10⁷개의 세포를 5% CO₂, 37℃ 습윤 배양기에서 5일 동안 배양하였다. 상기 세포 배양액을 회수하고 원심분리한 후, 이를 여과하여 항체가 포함된 배양액만을 얻었다. 또한, 배양액에서 항체만을 정제하기 위하여 30 mg human IgG/㎖의 결합능을 가지는 레진(resin)인 Mabselect(17-5199-01, GE Healthcare, 영국) 1 ㎖을 disposable chromatography column(732-1010, BIO-RAD, 미국)에 충전하여 사용하였다. 항체를 단백질-A와 결합시키기 위하여 항체가 발현된 상기 세포 배양액을 Mabselect 컬럼에 통과시킨 다음, 0.1M 스트르산나트륨(Sodium Citrate) 완충액을 통과시켜 단백질-A와 결합된 인간화 항체를 용출시켰다. 이후, Tris-Cl(pH 9.0) 완충액을 상기 항체 회수액의 1/10 부피로 첨가하여 항체 용출액의 pH를 중화시켰다.

정제된 항체를 PBS(pH 7.4)로 버퍼 교환(buffer change)을 진행하였다. MWCO 30000인 VIVASPIN(Sartorius, Cat. No. VS2021)을 PBS로 웨팅(wetting) 시켜준 후에 정제된 항체 시료를 넣고 3,000 rpm, 4℃, 30분 동안 원심분리 하였다. 0.5 ㎖로 농축된 시료에 5 ㎖가 되도록 PBS를 10배 부피로 첨가하여 원심분리를 3회 반복함으로써 1,000배 이상 버퍼 교환되도록 하였다.

정제된 항체의 단백질들을 NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gels 4∼12% gradient(Invitrogen, Cat. No. NP0321)를 사용하여 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 정제된 항체의 중쇄 단백질 밴드(5만 달톤 분자량 위치) 및 경쇄 단백질 밴드(2만 5천 달톤 분자량 위치) 모두를 확인할 수 있었다(도 5).

실시예 6. 항- ErbB2 항체의 ErbB2 에 대한 친화력 측정

본원발명에 따른 항-ErbB2 항체 변이체들의 ErbB2에 대한 친화도를 측정하였다. 먼저, 문헌(Chen et al. (1999) J Mol Biol . 293(4):865-81)에 따라 바이아코어(BIAcore) 데이터를 얻었다. BIAcore™-2000 표면 플라스몬 공명 시스템 (BIAcore, Inc.)을 사용하여 측정된 결합 및 해리속도 상수로부터 ErbB2에 대한 상기 항체 변이체들의 결합 친화도를 계산하였다. M5 센서 칩 표면에 아미노 커플링 방법을 사용하여 항원을 고정시켰다(Analyt. Biochem. (1991) 198:268-277). N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 사용하여 바이오센서 칩을 활성화시켜 ErbB2를 공유 커플링 시켰다. ErbB2를 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8로 완충액 교환하고, 약 30 ㎍/㎖로 희석하였다. ErbB2 분취액을 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여 커플링된 단백질의 약 250-300 반응 유닛(RU)을 달성하였다. 1 M 에탄올아민 용액을 차단제로서 주입하였다. 약동학 측정을 위해 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125 nM로 희석하여 사용하고 낮은 농도부터 순차적으로 주입하였다. 10 ㎕/분의 유속으로 5분간 주입하여 결합시키고, 30분간 러닝 버퍼를 주입하여 해리시켰다. 표면 플라스몬 공명 측정으로부터의 평형 해리 상수, K_D 값을 k_off/k_on으로서 계산하였다. 바이아코어 데이터를 표 5에 요약하여 나타내었다.

	결합상수 (k_on, 1/Ms)	해리상수 (k_off, 1/s)	항원에 대한 친화도 (K_D, M)
4D5	2.09 x 10⁵	8.82 x 10^-5	4.22 x 10^-10
D98W	3.97 x 10⁵	8.89 x 10^-5	2.24 x 10^-10
AH06	8.80 x 10⁵	4.42 x 10^-5	5.02 x 10^-11
AH16	4.04 x 10⁵	1.20 x 10^-4	2.97 x 10^-10
A058	5.22 x 10⁵	2.78 x 10^-4	5.33 x 10^-10
A091	6.44 x 10⁵	6.88 x 10^-4	1.07 x 10^-9

표 5에 나타난 바와 같이, 문헌(Resi et al. (2002) 21:851-862)에 보고되어 있는 D98W 변이체의 친화도는, K_D값이 224 pM로 모항체 4D5의 K_D값 422 pM에 비하여 약 2배 향상되었으나, 본원발명의 항-ErbB2 항체 변이체 AH06은 K_D값이 50.2 pM로 모항체 4D5에 비하여 8배 향상된 친화도를 나타내었다. 또한, 본원발명의 AH16은 K_D값이 297 pM로 모항체 4D5에 비하여 약 2배 향상된 친화도를 나타내었다(표 5). 이러한 결과는, 본원발명의 4D5 변이체는 모항체인 4D5에 비하여 항원에 대한 친화도가 현저히 개선되었음을 나타낸다.

실시예 7. 항-ErbB2 항체의 생체 외 세포증식 저해활성 시험

각 항-ErbB2 항체 변이체의 ErbB2 매개 질병 저해 효과를 확인하기 위하여, 위암 세포주 NCI-N87 세포(ATCC 기탁번호 CRL-5822)를 사용하여 항체의 세포증식 저해능력을 시험하였다. 세포증식 저해활성 평가를 위하여, NCI-N87 세포를 0.05% 트립신-EDTA를 사용해 탈착시킨 후, 0.75x10⁴ cells/㎖ 농도가 되도록 배지에 현탁시켜 96-웰 세포 배양용 플레이트에 0.1 ㎖씩 접종하였다. 접종 후 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 세포가 부착되도록 배양하였으며, 세포에 인간화 항체를 처리하였다. 항체를 10, 1, 0.1, 0.01 및 0.001 ㎍/㎖ 농도로 처리하였고, 항체 처리 시에는 RPMI1640/2% FBS 배지를 사용하였다. 약 6일 동안 반응시킨 후, WST-8(Dojindo)을 처리하여 3-4 시간 발색반응을 시킨 후 450 nm 파장 값을 측정하였다.

NCI-N87 세포에 대한 항-ErbB2 항체 변이체 및 4D5 항체의 세포증식 저해활성을 도 6-8에 나타내었다. 도 7 및 8에 나타난 바와 같이, 본원발명의 항-ErbB2 항체 변이체는 모항체 4D5 대비 약 3.5배까지 세포증식 저해활성이 증가하였다. 반면, 상기 실시예 6에서 모항체 4D5 대비 친화도가 2배 가량 향상된 것으로 측정되었던 D98W의 세포증식 저해활성은, 4D5 대비 동등 수준의 활성을 나타내는데 그쳤다(도 6). 구체적으로, 본원발명의 A091의 IC₅₀은 10.3 nM(4D5의 IC₅₀은 25.4 nM)으로 4D5 대비 약 2배 효능이 향상되었으며, A058에 대한 IC₅₀은 4.3 nM(4D5에 대한 IC₅₀는 10.4 nM)으로 4D5 대비 약 2.5배 효능이 향상되었다(도 7). 또한, AH06에 대한 IC₅₀은 3.4 nM(4D5에 대한 IC₅₀는 11.6 nM)으로 4D5 대비 약 3.5배 효능이 향상되었다(도 8).

이러한 결과는, 본원발명의 4D5 변이체들이 모항체 4D5 및 문헌에 개시된 D98W에 비하여 친화도 뿐만 아니라, 세포증식 저해활성 역시 현저히 향상되었음을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chongkundang <120> anti-ErbB2 antibody variants <130> PN120220 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH amino acid sequence of 4D5 <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL amino acid sequence of 4D5 <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH amino acid sequence of 4D5 variant <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Trp Gly Phe Tyr Ala Phe Ala Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH amino acid sequence of 4D5 variant <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Asn Ala Lys Gly Phe Tyr Ser Phe Val His Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL amino acid sequence of 4D5 variant <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gln Thr Pro Ala 85 90 95 Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH amino acid sequence of 4D5 variant <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Trp Gly Phe Tyr Ala Phe Ala Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL amino acid sequence of 4D5 variant <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Thr Thr Trp Pro Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LN01_R primer <400> 9 actagtgcta ctcacggtca ccagagttcc ctgtccccag taatccatgg cgtamnngcc 60 mnnmnnmnnm nntctagagc agtagtac 88 <210> 10 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LN02_R primer <400> 10 actagtgcta ctcacggtca ccagagttcc ctgtccccam nnmnnmnnmn ngtagaagcc 60 atcacc 66 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LN03_F primer <400> 11 gacttcgcta cgtactactg cnnknnknnk nnkaccactc ctccgac 47 <210> 12 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LN04_F primer <400> 12 gacttcgcta cgtactactg ccaacagcac tacnnkactn nknnknnktt cggacaaggc 60 ac 62 <210> 13 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LN05_R primer <400> 13 tgaatctaga tggcacaccm nnmnnmnnga amnnmnnmnn gtagatcagc agcttc 56 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LN06_R primer <400> 14 tgaatctaga tggcacaccm nnmnnmnncc amnnmnnmnn gtagatcagc agcttc 56 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LN0506_F primer <400> 15 ggtgtgccat ctagattcag tg 22 <210> 16 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LN07_R primer <400> 16 actagtgcta ctcacggtca ccagagttcc ctgtccccag taatccatmn ngtamnngcc 60 mnnmnnmnnm nntctagagc agtagtac 88 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LR primer <400> 17 gcgcgctact cacggtc 17 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer <400> 18 ggcccaggcg gccgatatcc agatgac 27 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HF primer <400> 19 gagctcatgg atatccagat gacccagag 29 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR primer <400> 20 gcgcgctact cacggtc 17

Claims

(a) 서열목록 제2서열의 경쇄 가변 도메인; 및 (b) 서열목록 제3서열의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체(humanized antibody)인 것을 특징으로 하는 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항 또는 제 9 항의 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자.
제 1 항 또는 제 9 항의 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자.
(a) 제 1 항 또는 제 9 항의 항-ErbB2 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 신장암, 직장암, 췌장암, 방광암, 전립선암, 두경부암, 자궁내막암, 침샘암 및 갑상선암으로 구성된 군으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.