TWI707869B - 新穎抗c-MET抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種特異性結合至人類肝細胞生長因子受體(c-Met)之新穎抗體或其抗原結合片段及用於預防或治療癌症之組合物，其中該抗體甚至以其極少量展示極佳的癌細胞增殖抑制活性及顯著極佳的抗癌活性，由此有效地預防或治療癌症。

Description

新穎抗c-MET抗體及其用途
本發明係關於一種特異性結合至人類肝細胞生長因子受體(c-Met)之抗體或其抗原結合片段及包含其之用於預防或治療癌症之組合物。
受體酪胺酸激酶(RTK)在細胞生長、分化、新血管生成、組織恢復等中充當重要調節劑。除了此類一般生理學過程以外，特定RTK之異常表現與許多種類之癌症的出現及進展相關。因此，此類RTK已視為用於癌症治療之有前景的藥物目標。
肝細胞生長因子受體(HGFR；c-Met) (一種RTK)為關於已知為分散因子之肝細胞生長因子(HGF/SF)的細胞表面上之受體(Laird AD等人, Expert. Opin. Investig. Drugs 12: 51-64 (2003))。藉由HGF進行之異常c-Met活化(代表性致癌機理中之一者)已知與腫瘤增殖、細胞凋亡抑制、新血管生成、侵入、轉移及類似者相關(Bottaro DP等人, Science 251: 802-804 (1991), Day RM等人, Oncogene 18: 3399-3406 (1999))。且此外，據報導藉由c-Met突變及擴增進行之異常c-Met活化與諸如肺癌、結腸癌、頭頸癌、胃癌、乳癌等各種癌症相關，且亦與腫瘤侵襲性增加及其不利預後有關(Lefebvre J等人, FASEB J 26: 1387-1399 (2012)，Liu X等人, Trends Mol Med 16: 37-45 (2010)，Smolen GA等人, Proc Natl Acad Sci USA 103: 2316-2321 (2006)，Foveau B等人, Mol Biol Cell 20: 2495-2507 (2009))。
因此，c-Met作為用於治療此類各種癌症之靶標抗原已引起許多注意，且已獲得抑制c-Met之表現及活性之各種方法。作為迄今為止已知之c-Met特異性小分子酪胺酸激酶抑制劑，存在提瓦替尼(Tivantinib) (ArQule)、INC280 (Novartis)、AMG337 (Amgen)等。並且，已研發出里樂木單抗(Rilotumumab) (Amgen)、費拉妥珠單抗(Ficlatuzumab) (AVEP Pharmaceuticals)、HuL2G7(Galaxy Biotech)等作為HGF特異性單株抗體，其為c-Met之配位體。此外，作為靶向c-Met之拮抗劑單株抗體，存在研發之臨床III期中Genentech之奧那組單抗(Onartuzumab) (WO 2006/015371)、臨床II期中Lilly之艾米貝珠單抗(Emibetuzumab) (WO 2010/059654)、研發之臨床I期中之SAIT-301 (US 2014154251)、ABT-700 (Wang J等人, BMC Cancer. 16: 105-118(2016))等。奧那組單抗為衍生自二價單株抗體(5D5)之單價拮抗性抗體，其作為藥劑作用於c-Met (Mark Merchant,等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 110(32): E2987-E299 (2013))。因此，已研發關於c-Met之各種藥物，但c-Met與如上文所述之各種癌症的出現及進展相關，因此不斷地驅動研發能夠藉由靶向c-Met治療癌症之新型治療劑的持續性需求。
針對此類技術背景，由於已嘗試研發特異性結合至c-Met之新穎抗體，本發明人已研發以高親和力結合至c-Met之新穎抗c-Met抗體，且亦已鑑定出此類抗c-Met抗體、其嵌合體以及人類化及親和力經優化抗體顯著抑制腫瘤細胞增殖且具有極佳的抗癌效果，因此已完成本發明。
技術問題 本發明之一個目標為提供一種特異性結合至肝細胞生長因子受體(c-Met)之抗體或其抗原結合片段。
本發明之另一目標為提供編碼該抗體或其抗原結合片段之核酸分子、包含該核酸分子之表現載體、將該表現載體引入其中的宿主細胞、使用該宿主細胞產生抗體或其抗原結合片段之方法。
本發明之又一目標為提供一種包含該抗體或其抗原結合片段之用於偵測c-Met之組合物、包含該組合物之用於偵測之套組及使用該套組偵測c-Met抗原之方法。
本發明之再一目標為提供一種用於預防或治療癌症之包含該抗體或其抗原結合片段之組合物。
技術解決方案 在下文中，將如下更詳細地描述本發明。同時，揭示於本發明中之各描述及實施例亦可分別應用於其他描述及實施例。換言之，揭示於本發明中之各種元件的所有組合在本發明之範疇內。此外，本發明之範疇可不受下文詳細描述限制。
為實現上述目標，本發明之一個態樣提供特異性結合至肝細胞生長因子受體(c-Met)之抗體或其抗原結合片段。
特異性結合至c-Met之本發明抗體或其抗原結合片段以高親和力結合至c-Met以抑制其表現或活性，因此展示極佳腫瘤細胞增殖抑制活性，以使得抗體可單獨或與習知醫藥學上可接受之載劑、其他抗癌藥物、抗癌佐劑等有價值地用作預防或治療癌症之抗癌組合物。
在本發明中，術語「抗體」意謂充當用於特異性識別抗原之受體的蛋白質分子，包含在免疫學上與特定抗原具有反應性之免疫球蛋白分子，其中其實例可包含單株抗體、多株抗體、全長抗體及抗體片段全部。此外，術語可包含二價分子或雙特異性分子(例如雙特異性抗體)、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體。
在本發明中，術語「單株抗體」係指獲自實質上相同抗體群體之單分子組合物之抗體分子，其中此類單株抗體展示針對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。在本發明中，術語「全長抗體」具有含有兩個全長輕鏈及兩個全長重鏈之結構，其中輕鏈中之各者藉由二硫鍵連接至重鏈。重鏈之恆定區具有伽瑪(γ)、米歐(μ)、阿爾法(α)、德耳塔(δ)及伊普西隆(ε)類型，且亦具有伽瑪1 (γ1)、伽瑪2 (γ2)、伽瑪3 (γ3)、伽瑪4 (γ4)、阿爾法1 (α1)及阿爾法2 (α2)作為亞類。輕鏈之恆定區具有卡帕(κ)及拉姆達(λ)類型。IgG包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4作為亞型。
在本發明中，術語「片段」、「抗體片段」及「抗原結合片段」係指具有抗體之抗原結合功能的本發明抗體之任何片段，其中此類術語可彼此互換使用。例示性抗原結合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv及類似者，但不限於此。
該Fab具有含有輕鏈及重鏈之可變區、輕鏈之恆定區及重鏈之第一恆定區(CH1結構域)之結構，且亦具有一個抗原結合位點。抗體分子之抗原結合片段或抗體片段意謂具有抗原結合功能之片段，且Fab'與Fab不同之處在於前者具有於重鏈CH1結構域之C端中具有一或多種半胱胺酸殘基之鉸鏈區。F(ab')2 抗體以使得Fab'之鉸鏈區之半胱胺酸殘基形成二硫鍵的方式產生。Fv為僅具有重鏈可變區及輕鏈可變區之最小抗體片段，其中用於產生Fv片段之重組技術揭示於PCT國際專利公開申請案WO 88/10649、WO 88/106630、WO 88/07085、WO 88/07086、WO 88/09344及類似申請案中。雙鏈Fv以使得重鏈可變區及輕鏈可變區藉由非共價鍵彼此連接的方式形成，而單鏈Fv以使得重鏈可變區及單鏈可變區通常藉由共價鍵經由肽連接子彼此連接或直接在C端中連接的方式形成，因此形成類似於如雙鏈Fv中所示之二聚體之結構。此類抗體片段可藉由使用蛋白質水解酶獲得(例如，Fab可藉由由木瓜酶進行全抗體之限制性消化獲得且F(ab')2 片段可藉由由胃蛋白酶進行全抗體之消化獲得)或可藉由基因重組技術產生，但不限於此。
特定言之在本發明中，其限制條件可為特異性結合至c-Met之抗體為： (a)包含以下之抗體：輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 1表示之輕鏈CDR1、由SEQ ID NO: 2表示之輕鏈CDR2、由SEQ ID NO: 3表示之輕鏈CDR3；及重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 7表示之重鏈CDR1、由SEQ ID NO: 8表示之重鏈CDR2及由SEQ ID NO: 9表示之重鏈CDR3； (b)包含以下之抗體：輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 4表示之輕鏈CDR1、由SEQ ID NO: 5表示之輕鏈CDR2、由SEQ ID NO: 6表示之輕鏈CDR3；及重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 10表示之重鏈CDR1、由SEQ ID NO: 11表示之重鏈CDR2及由SEQ ID NO: 12表示之重鏈CDR3；或 (c)其親和力經優化抗體。
在本發明中，術語「重鏈」可包含全長重鏈及其片段兩者，其包含具有胺基酸序列(具有足以獲得對抗原之特異性之可變區序列)的可變區結構域VH以及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。此外，在本發明中，術語「輕鏈」可包含全長輕鏈及其片段兩者，其包含具有胺基酸序列(具有足以獲得對抗原之特異性之可變區序列)的可變區結構域VL以及恆定區結構域CL。
在本發明中，抗體可包含自小鼠產生之小鼠抗體及其突變體兩者，其中親本抗體之胺基酸序列的一部分經取代、添加及/或缺失以提高抗體之親和力、免疫性等。作為一實例，突變體可包含嵌合抗體、人類化抗體、親和力經優化抗體等，但不限於此。在本發明中，突變體概括地指抗體，其中親本抗體之CDR胺基酸序列的一部分在具有與親本抗體之CDR相同的CDR或靶向與親本抗體之抗原決定基相同的抗原決定基之條件下突變(經取代、添加或缺失)。此類突變體可由熟習此項技術者以適當方式調整以在保持對相同抗原決定基之結合力的範疇內提高抗體之親和力、免疫性及類似者。
換言之，在特異性識別c-Met的範疇內，本發明抗體或其抗原結合片段可包含本文中所描述之抗c-Met抗體之序列以及其生物學等效物。舉例而言，可在抗體之胺基酸序列中作出額外變化，以便進一步提高抗體之結合親和力及/或其他生物學特徵。舉例而言，此類變化包含缺失、插入及/或取代抗體之胺基酸序列殘基。基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性，例如疏水性、親水性、電荷、大小等進行此類胺基酸突變。藉由分析胺基酸側鏈取代基之大小、形狀及類型，可看出精胺酸、離胺酸及組胺酸皆為正電荷殘基；丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸具有相似大小；且苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸具有相似形狀。因此，基於此類考量，可看出精胺酸、離胺酸及組胺酸；丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸；以及苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸為生物學上地功能等效物。
在本發明中，術語「嵌合抗體」為以使得小鼠抗體之可變區與人類抗體(其與小鼠抗體相比引起大大改良之免疫反應)之恆定區重組的方式形成之抗體。
在本發明中，術語「人類化抗體」意謂以使得衍生自除人類外之其他物種之抗體的蛋白質序列經修飾以類似於自人類天然產生之抗體突變體之蛋白質序列的方式形成之抗體。舉例而言，人類化抗體可藉由經由使衍生自小鼠之CDR與衍生自人類抗體之FR重組製備人類化可變區且接著藉由使該CDR與較佳人類抗體之恆定區重組來製備。然而，簡單CDR嫁接僅產生人類化抗體之低親和力，因此認為可能影響CDR之三維結構的若干關鍵FR胺基酸殘基可提高與小鼠抗體之彼等胺基酸殘基之親和力，因此到達與原始小鼠抗體之親和力相同的水準。
在本發明中，術語「親和力經優化抗體」，其為以使得特定抗體之CDR序列的一部分經取代、添加或缺失的方式形成之突變體，意謂在結合至與該特定抗體之抗原決定基相同的抗原決定基時對抗原具有更佳結合親和力之抗體。特定言之，本發明之親和力經優化抗體係指結合至與以下之抗原決定基相同的抗原決定基之突變型抗體：(a)包含以下之抗體：輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 1表示之輕鏈CDR1、由SEQ ID NO: 2表示之輕鏈CDR2、由SEQ ID NO: 3表示之輕鏈CDR3；及重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 7表示之重鏈CDR1、由SEQ ID NO: 8表示之重鏈CDR2、由SEQ ID NO: 9表示之重鏈CDR3；或(b)包含以下之抗體：輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 4表示之輕鏈CDR1、由SEQ ID NO: 5表示之輕鏈CDR2、由SEQ ID NO: 6表示之輕鏈CDR3；及重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 10表示之重鏈CDR1、由SEQ ID NO: 11表示之重鏈CDR2、由SEQ ID NO: 12表示之重鏈CDR3。一般熟習此項技術者可藉由使用基於特定輕鏈及重鏈CDR序列的已知技術製備親和力經優化抗體。舉例而言，本發明之親和力經優化抗體可經由噬菌體呈現製備。在本發明中，術語「噬菌體呈現」係指一種在噬菌體上，例如在纖維噬菌體粒子表面上將突變型多肽呈現為具有鞘蛋白的至少一部分之融合蛋白之技術。噬菌體呈現之用途在於其以隨機化蛋白質突變體之較大庫為目標，因此即時且有效率地對以高親和力結合至靶標抗原之序列進行分類的事實。在噬菌體上呈現肽及蛋白質之庫已用於篩選數百萬多肽，以便發現具有特異性結合特徵之多肽。
在本發明的一個例示性實施例中，其限制條件可為抗體為包含以下之抗體：(a)由SEQ ID NO: 13表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 15表示之重鏈可變區；或(b)由SEQ ID NO: 14表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 16表示之重鏈可變區。作為一實例，其限制條件可為該抗體為包含以下之抗體：(a)藉由由SEQ ID NO: 17表示之核苷酸編碼的輕鏈可變區及藉由由SEQ ID NO: 19表示之核苷酸編碼的重鏈可變區；或(b)藉由由SEQ ID NO: 18表示之核苷酸編碼的輕鏈可變區及藉由由SEQ ID NO: 20表示之核苷酸編碼的重鏈可變區，但不限於此。
根據本發明之一個特定實施例，融合瘤細胞群獲自小鼠，其中人類c-Met Sema結構域/Fc融合蛋白為一種抗原，特異性結合至c-Met之抗c-Met抗體藉由用ELISA分析法使用c-Met/His融合蛋白作為抗原篩選而選自該抗原。所選抗體及其嵌合抗體具有腫瘤細胞增殖抑制活性，其與市售已知LY2875358及OA-5D5 (表3及圖1)同等優異或比其更優異，因此極其有價值地用於預防或治療癌症。
在本發明之另一例示性實施例中，其限制條件可為抗體包含： (a)由SEQ ID NO: 21表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 23表示之重鏈可變區；(b)由SEQ ID NO: 22表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 24表示之重鏈可變區；(c)由SEQ ID NO: 29表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 31表示之重鏈可變區；或(d)由SEQ ID NO: 30表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 32表示之重鏈可變區。作為一實例，其限制條件可為抗體為包含以下之抗體：(a)藉由由SEQ ID NO: 25表示之核苷酸編碼的輕鏈可變區及藉由由SEQ ID NO: 27表示之核苷酸編碼的重鏈可變區；(b)藉由由SEQ ID NO: 26表示之核苷酸編碼的輕鏈可變區及藉由由SEQ ID NO: 28表示之核苷酸編碼的重鏈可變區；(c)藉由由SEQ ID NO: 33表示之核苷酸編碼的輕鏈可變區及藉由由SEQ ID NO: 35表示之核苷酸編碼的重鏈可變區；或(d)藉由由SEQ ID NO: 34表示之核苷酸編碼的輕鏈可變區及藉由由SEQ ID NO: 36表示之核苷酸編碼的重鏈可變區，但不限於此。此外，其限制條件可為抗體包含由SEQ ID NO: 37至SEQ ID NO: 44中之一者表示之鉸鏈區。
在本發明之一個特定實施例中，製備包含經由噬菌體呈現選擇所獲得的抗體之CDR之人類化抗體，且鑑定出此類抗體顯示類似於本發明嵌合體抗體之抗癌活性的抗癌活性(實例2及3)。此外，在本發明之另一特定實施例中，根據鉸鏈區序列評估抗體之腫瘤細胞增殖抑制活性，且鑑定出大部分腫瘤細胞之增殖經有效抑制，即使視鉸鏈序列之差異而定活性有略微差異(表7)。
在本發明之另一例示性實施例中，其限制條件可為人類化抗體之親和力經優化抗體為一種抗體，在該抗體中一或多個胺基酸序列由包含以下之抗體取代：包含由SEQ ID NO: 1表示之輕鏈CDR1、由SEQ ID NO: 2表示之輕鏈CDR2、由SEQ ID NO: 3表示之輕鏈CDR3的輕鏈可變區及包含由SEQ ID NO: 7表示之重鏈CDR1、由SEQ ID NO: 8表示之重鏈CDR2、由SEQ ID NO: 9表示之重鏈CDR3的重鏈可變區，但不限於此，且其中，(i)輕鏈CDR1之第1位置中的G經A、E、K、L、N、R、S、V或W取代；其第2位置中之A經C、G、I、P、S、T或V取代；其第3位置中之S經G、M、N、P、Q、R、S或T取代；其第4位置中之E經A、D、F、G、H、K、M、Q、R、S、T或V取代；其第5位置中之N經A、D、E、G、K、L、P、Q、R、S、T或V取代；其第6位置中之I經A、F、L、M、Q、R、S、T或V取代；其第7位置中之Y經F、H、R或V取代；或其第8位置中之G經D、F、H、M、N、R、S、T或V取代；(ii)輕鏈CDR2之第1位置中的G經D、F、H、K、P、Q、S、V或Y取代；其第3位置中之T經Q取代；或其第4位置中之N經G取代；(iii)輕鏈CDR3之第1位置中的Q經E、G、I、M或N取代；其第2位置中之N經A、D、E、H、L、Q、S或T取代；其第3位置中之V經I、L、M、N、Q、S或T取代；其第4位置中之L經F、H、I、M、R、S、V、W或Y取代；其第5位置中之S經C、D、E、F、G、H、K、L、N、Q、R、T、V或Y取代；其第6位置中之S經D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、T、V或Y取代；其第7位置中之P經A、D、E、G、N、Q、S或V取代；其第8位置中之Y經E、F、L、M或Q取代；或其第9位置中之T經D、F、G、I、L、N、S、V、W或Y取代；(iv)重鏈CDR1之第1位置中的D經G或Q取代；其第2位置中之Y經Q取代；或其第4位置中之I經A或Q取代；(v)重鏈CDR2之第3位置中的F經D、E、W或Y取代；其第5位置中之G經D、H或Y取代；其第6位置中之S經F、P、W或Y取代；其第7位置中之G經A、F、L、N或T取代；其第8位置中之N經F、P、S、T或Y取代；其第9位置中之T經A、D、E、F、G、H、L、P、S或V取代；其第10位置中之H經A、D、F、M、R、S、T、V、W或Y取代；其第11位置中之F經G、H、I、L、M、N、P、Q、V或Y取代；其第12位置中之S經A、D、G、H、I、L、P、T或V取代；其第13位置中之A經D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V或Y取代；其第14位置中之R經A、E、G、H、L、N、P、Q、S、W或Y取代；其第15位置中之F經D、E、G、L、M、P、R、S、V或W取代；其第16位置中之K經A、E、F、G、H、L、R、S、T、V或Y取代；或其第17位置中之G經E、F、H、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W取代；或(vi)重鏈CDR3之第1位置中的G經E、F、H、N、Q、V或W取代；其第2位置中之D經E取代；其第3位置中之Y經L、Q、T或V取代；其第4位置中之G經W取代；其第5位置中之F經L或Y取代；其第6位置中之L經Q、S或Y取代；或其第7位置中之Y經C、L、M、N或Q取代。在本文中，其限制條件可為輕鏈CDR1包含0至5個取代，輕鏈CDR2包含0至1個取代，輕鏈CDR3包含0至7個取代，重鏈CDR1包含0至1個取代，重鏈CDR2包含0至11個取代，且重鏈CDR3包含0至6個取代。
特定言之，在本發明之再又一例示性實施例中，其限制條件可為親和力經優化抗體包含：輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 229至SEQ ID NO: 268中之任一者表示的輕鏈CDR1；由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 182至SEQ ID NO:190、SEQ ID NO: 227及SEQ ID NO: 228中之任一者表示的輕鏈CDR2；由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 142至SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 191至SEQ ID NO: 226及SEQ ID NO: 269至SEQ ID NO: 301中之任一者表示的輕鏈CDR3；及重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 108至SEQ ID NO: 112中之任一者表示的重鏈CDR1；由SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 54至SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 72至SEQ ID NO: 107及SEQ ID NO: 118至SEQ ID NO: 141中之任一者表示的重鏈CDR2；由SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 64至SEQ ID NO: 71及SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 117中之任一者表示的重鏈CDR3，更特定言之，包含由SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 306至SEQ ID NO: 311中之任一者表示的輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 23及SEQ ID NO: 302至SEQ ID NO: 305中之任一者表示的重鏈可變區，且更加特定言之包含：(a)由SEQ ID NO: 21表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 302表示之重鏈可變區；(b)由SEQ ID NO: 21表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 305表示之重鏈可變區；(c)由SEQ ID NO: 310表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 23表示之重鏈可變區；(d)由SEQ ID NO: 308表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 305表示之重鏈可變區；(e)由SEQ ID NO: 306表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 303表示之重鏈可變區；(f)由SEQ ID NO: 307表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 304表示之重鏈可變區；(g)由SEQ ID NO: 308表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 304表示之重鏈可變區；(h)由SEQ ID NO: 309表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 304表示之重鏈可變區；(i)由SEQ ID NO: 311表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 304表示之重鏈可變區；或(j)由SEQ ID NO: 306表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO: 302表示之重鏈可變區，但不限於此。
在本發明之一個特定實施例中，競爭選擇法用於選擇具有比人類化抗體更高的親和力之抗體，因此獲得多種親和力經優化抗體(表8至10及12)。親和力經優化抗體具有比人類化抗體優異4.3至28.5倍之腫瘤細胞增殖抑制作用(表11、13及圖3)。
在本發明中，其限制條件可為抗體為除了特異性結合至c-Met以外亦另外特異性結合至表皮生長因子受體(EGFR)的抗體或其抗原結合片段。
已知EGFR (ErbB酪胺酸激酶中之一者)在包含非小細胞肺癌之許多表皮細胞腫瘤中異常活化，造成細胞增殖、侵入、轉移及血管生成，且提高細胞存活率。將為EGFR酪胺酸激酶抑制劑之吉非替尼(Gefitinib) (易瑞莎(Iressa))、埃羅替尼(elotinib) (得舒緩(Tarceva))及奧希替尼(osimertinib) (泰格莎(Tagrisso))用作代表性肺癌治療劑；且將為EGFR靶抗體之西妥昔單抗(cetuximab) (爾必得舒(Erbitux))及帕尼單抗(panitumumab) (維必施(Vectibix))用作結腸癌治療劑(Yewale C等人, Biomaterials. 2013 34(34):8690-707 (2013)，Deric L. Wheeler等人, Nature Reviews Clinical Oncology 7, 493-507 (2010))。
此類EGFR靶標治療劑在治療之前及之後一年產生抗性，其中c-Met擴增、突變及HGF誘發之活化已知為抗性之關鍵機理(Simona Corso Cancer Discovery 3:978-992 (2013), Curtis R Chong等人, Nature Medicine 19, 1389-1400 (2013))。此外，據報導EGFR及c-Met同時表現在各種腫瘤細胞中，其中，在抑制EGFR後，c-Met被活化，由此即時產生EGFR TKI之抗性(Engelman, J.A.,等人, Science, 316:1039-43 (2007))。
基於此類機理，僅用c-Met靶標藥物進行之單一治療及與EGFR靶標藥物一起進行之組合治療現已處於臨床試驗，但其作為治療劑之功效尚未驗證且需要研發用於c-Met相關的癌性腫瘤之治療劑，其已知為抗性之關鍵原因。因此，本發明人已基於上述抗體製備c-Met/EGFR雙特異性抗體。雙特異性抗體不僅有效地抑制腫瘤細胞之增殖，其對現有EGFR治療劑具有抗性，且亦針對腫瘤細胞顯示極佳的增殖抑制活性，因此有價值地用於治療諸如經由各種機理c-Met介導之癌症的疾病。
限制條件可為雙特異性抗體以使得特異性結合至EGFR之抗體或其抗原結合片段連接至c-Met特異性抗體之一個輕鏈端或重鏈端(例如，連接至重鏈C端，但不限於此)的方式形成。
限制條件可為特異性結合至EGFR之結合片段為Fab、Fab'、F(ab')2 或Fv。
在本發明之一個例示性實施例中，限制條件可為Fv為scFv片段，其中scFv片段藉由能夠將scFv片段連接至c-Met抗體之一個輕鏈端或重鏈端的連接子連接。在本發明之一個例示性實施例中，特異性結合至EGFR之抗體進一步藉由用由SEQ ID NO: 312表示之連接子連接來製備。
限制條件可為EGFR scFv片段為能夠特異性結合至EGFR之此項技術中已知之EGFR scFv，其中，例如，有爾必得舒、維必施、搏癌莎(Portrazza)、TheraCIM或類似者，但不限於此。
在本發明之一個例示性實施例中，限制條件可為EGFR scFv為爾必得舒或維必施scFv片段，特定言之，EGFR scFv包含由SEQ ID NO: 313或SEQ ID NO: 314表示之胺基酸序列，其中維必施scFv包含由SEQ ID NO: 315表示之胺基酸序列，但不限於此。
根據本發明之一個特定實施例，作為鑑定雙特異性抗體之腫瘤細胞增殖抑制活性的結果，鑑定出抗體具有比hu8C4經優化抗體更佳的腫瘤活性抑制功效(表16及17及圖4、5、16及17)。特定言之，鑑定出本發明抗體甚至對NCI-H292及NCI-H1648細胞株亦具有極佳的細胞增殖抑制作用，其中c-Met及EGFR表現正常(表17及19及圖6)。基於此類結果，可看出本發明抗體之抗癌效果不受c-Met表現異常或存在或不存在c-Met突變等的特定限制。
此外，鑑定出本發明之雙特異性抗體具有比兩種抗體之組合治療更佳的腫瘤細胞增殖抑制能力(表18至21及圖6至8)。此外，作為鑑定本發明之雙特異性抗體對抗原及信號轉導材料之活性的效果之結果，鑑定出本發明之雙特異性抗體具有比單獨抗體更佳的信號轉導抑制功效(圖11)。
限制條件可為本發明抗體或其抗原結合片段結合至由選自由SEQ ID NO: 331、SEQ ID NO: 332、SEQ ID NO: 333及/或SEQ ID NO: 334表示之群之胺基酸序列表示的抗原決定基區。基於特定抗體(參考抗體)製備之親和力經優化抗體表徵為相對於參考抗體與可變區之輕鏈及重鏈CDR序列具有高同源性，因此結合至與參考抗體相同的抗原決定基區，以使得此類親和力經優化抗體可享有全部生物學特徵(諸如醫藥機理及由結合位點、特異性及抗體引起之醫藥療效)且呈現比參考抗體更佳的對結合親和力之效果。
抗原決定基區各別地意謂例如來自參考c-Met抗原(SEQ ID NO: 335)之N端的第321至第329位置中之YVSKPGAQL (SEQ ID NO: 331)、第333至第341位置中之IGASLNDDI (SEQ ID NO: 332)、第366至第372位置中之PIKYVND (SEQ ID NO: 333)及第464至第474位置中之QVVVSRSGPST (SEQ ID NO: 334)，其中具有結合至其之本發明之抗體或其抗原結合片段的c-Met抗原序列包含部分突變(取代、添加或缺失)，或結合抗原以c-Met片段、前驅體或亞型之形式存在，因此其結合位點或序列可相應地略微變化。儘管如此，一般熟習此項技術者仍可清晰指明本發明抗原或其抗原結合片段基於參考c-Met抗原之抗原決定基序列資訊結合之位置及序列。
在本發明之一個特定實施例中，鑑定出本發明之雙特異性抗體hu8C4 ×維必施scFv結合至人類c-Met sema結構域β鏈之4個抗原決定基區Y321-L329 (SEQ ID NO: 331)、I333-I341 (SEQ ID NO: 332)、P366-D372 (SEQ ID NO: 333)及Q464-S474 (SEQ ID NO: 334) (表28)。
本發明之「特異性結合至c-Met之抗體或其抗原結合片段」意謂以1 × 10- 7 M或更小之KD 結合至人類c-Met的抗體或抗原結合片段。限制條件可為抗體或其抗原結合片段以例如KD 為5 × 10- 8 M或更小，KD 為1 × 10- 8 M或更小，KD 為5 × 10- 9 M或更小，或KD 為1 × 10- 9 M或更小結合至人類c-Met，但不限於此。
在本發明之一個特定實施例中，藉由鑑定hu8C4、hu8C4 AH71及hu8C4×維必施scFv對c-Met ECD之結合親和力，從而鑑定出KD 值分別為3.173 × 10- 10 、9.993 × 10- 11 及2.78 × 10- 10 ，直接鑑定出本發明抗體或其抗原結合片段對c-Met抗原具有較高結合親和力(表22)。鑑定出本發明抗體或其抗原結合片段對食蟹獼猴(一種猿)之c-Met抗原具有交叉反應(表22)，但不與來源於其他動物(例如嚙齒動物)之抗原結合(圖9)。此外，鑑定出本發明抗體或其抗原結合片段不與除c-Met外之細胞表面上之其他受體結合(表24)。因此，自以上結果可看出本發明抗體或其抗原結合片段顯示對人類及猴之c-Met抗原的結合特異性。
如本文所用，術語「結合常數(Kon )」意謂特定抗體-抗原相互作用之結合比率，且術語「解離常數(Koff )」意謂特定抗體-抗原相互作用之解離比率。此外，在本發明中，術語「對抗原之親和力(KD )」為將Koff :Kon 之比(亦即，Koff /Kon )表示為莫耳濃度(M)的一種親和力。限制條件可為抗體之KD 值藉由使用此項技術中廣泛確立之方法來量測。舉例而言，作為一種用於量測抗體之KD 值之方法，其可藉由使用BiocoreTM 系統之表面電漿子共振分析提供，但不限於此。
本發明之另一態樣提供一種用於產生編碼抗體或其抗原結合片段之核酸分子、包含該核酸分子之表現載體、將該表現載體引入其中之宿主細胞、使用該宿主細胞之抗體或其抗原結合片段的方法。
該抗體及其抗原結合片段諸如上述抗體及其抗原結合片段。
如本文所用，術語「核酸分子」具有全面包含DNA及RNA分子之含義，其中核苷酸(核酸分子中之基本組分單位)不僅包含天然核苷酸，且亦包含類似物，其中糖或鹼基部分經修飾(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980)；Uhlman及Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584)。本發明之用於編碼重鏈及輕鏈可變區之核酸分子序列可經修飾，其中修飾包含核苷酸之添加、缺失或非保守或保守取代。
應瞭解，本發明之核酸分子亦包含呈現與前述核苷酸序列之實質一致性的核苷酸序列。在本發明中，在以最相對應之方式將本發明之前述核苷酸序列與任何其他序列比對及藉由習知地用於此項技術中之演算法分析經比對序列的情況下，實質一致性意謂呈現最低80%同源性，特定言之最低90%同源性，更特定言之最低95%同源性之核苷酸序列。
如本文所用，術語「載體」，其為用於在宿主細胞中表現靶基因之構件，包含質體載體、黏質體載體及病毒載體，諸如噬菌體載體、腺病毒載體、反轉錄病毒載體及腺相關病毒，特定言之質體載體，但不限於此。
在本發明之載體中，限制條件可為編碼輕鏈可變區之核酸分子及編碼重鏈可變區之核酸分子以可操作方式與啟動子連接。
在本發明中，術語「以可操作方式連接」意謂在核酸表現調節序列(例如啟動子、信號序列或轉錄調節因子結合位點中之陣列)與其他核酸序列之間功能性結合，因此調節序列控制其他核酸序列之轉錄及/或解碼。
本發明之重組載體系統可經由此項技術中已知之各種方法建構。舉例而言，此類詳細方法揭示於Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)中，該文獻以引用之方式併入本文中。
本發明之載體通常可建構為用於選殖之載體或用於表現之載體。此外，本發明之載體可以使得原核細胞或真核細胞為宿主的方式建構。
舉例而言，若本發明之載體為表現載體且原核細胞為宿主，則通常包含能夠進行轉錄之強力啟動子(例如，tac啟動子、lac啟動子、lacUV5啟動子、lpp啟動子、pLλ啟動子、pRλ啟動子、rac5啟動子、amp啟動子、recA啟動子、SP6啟動子、trp啟動子、T7啟動子及類似者)、用於開始解碼之核糖體結合位點及轉錄/解碼終止序列。若大腸桿菌(例如HB101、BL21、DH5α等)用作宿主細胞，則大腸桿菌色胺酸生物合成路徑之啟動子及操縱子部分(Yanofsky, C., J. Bacteriol., (1984) 158:1018-1024)及噬菌體λ之左向啟動子(pLλ啟動子，Herskowitz, I.及Hagen, D., Ann. Rev. Genet., (1980) 14:399-445)可用作調節部分。若芽孢桿菌(Bacillus sp . )用作宿主細胞，則蘇力菌(Bacillus thuringiensis )之毒素蛋白基因之啟動子(Appl. Environ. Microbiol. (1998) 64:3932-3938；Mol. Gen. Genet. (1996) 250:734-741)或可在芽孢桿菌中表現之任何啟動子可用作調節部分。
同時，本發明之重組載體可藉由操縱通常用於此項技術中之質體(例如，pCL、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pUC19及類似者)、噬菌體(例如，λgt4·λB、λ-Charon、λΔz1、M13及類似者)或病毒(例如SV40等)來製備。
同時，若本發明之載體為表現載體且真核細胞為宿主，則可使用衍生自哺乳動物細胞之基因組之啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子、β-肌動蛋白啟動子、人類血紅素啟動子及人類肌酸啟動子)或衍生自哺乳動物病毒之啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子、痘瘡病毒7.5K啟動子、SV40啟動子、細胞巨大病毒(CMV)啟動子、HSV之tk啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、HIV之LTR啟動子、莫洛尼病毒啟動子、艾司坦-巴爾病毒(EBV)啟動子及勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子)，其中該等啟動子通常具有聚腺苷酸化序列作為轉錄終止序列。特定言之，本發明之重組載體包含CMV啟動子。
本發明之重組載體可與其他序列融合以便促進自其中表現之抗體的優化。作為融合序列之實例，存在麩胱甘肽S-轉移酶(Pharmacia，USA)、麥芽糖結合蛋白(NEB，USA)、FLAG (IBI，USA)、6x His (六聚組胺酸；Quiagen，USA)及類似者。此外，由本發明載體表現之蛋白質為抗體，因此表現抗體可易於經由蛋白A管柱等純化，而無需用於優化之額外序列。
同時，本發明之重組載體包含習知地用於此項技術中作為經選定標記之抗生素抗性基因，其中其可包含例如對安比西林(ampicillin)、慶大黴素(gentamicin)、卡本尼西林(carbenicillin)、氯黴素、鏈黴素、康微素(kanamycin)、遺傳黴素、新黴素及四環素之抗性基因。
作為表現本發明抗體之載體，可存在兩種載體系統，其中輕鏈及重鏈同時在一種載體中表現；以及一種系統，其中輕鏈及重鏈分別在分開的載體中表現。在後一種情況下，可將兩種載體例如經由共轉化或靶向轉化引入宿主細胞中。共轉化為一種用於將編碼輕鏈及重鏈之各載體DNA同時引入宿主細胞中之後選擇表現輕鏈及重鏈兩者之細胞的方法。靶向轉化為一種用於選擇用包含輕(或重)鏈之載體轉化的細胞且再次用包含重(或輕)鏈之載體轉化所選定細胞以最終選擇表現輕鏈及重鏈兩者之細胞的方法。
只要宿主細胞能夠穩定且連續地選殖並表現本發明之載體，即可使用此項技術中已知之任何宿主細胞，其中此類宿主細胞可包含芽孢桿菌菌株，諸如大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis )及蘇力菌；及原核宿主細胞，諸如鏈黴菌(Streptomyces )、假單胞菌(Pseudomonas ) (例如惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida ))、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis )或葡萄球菌(Staphylococcus ) (例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus ))，但不限於此。
作為載體之適合真核宿主細胞，可存在黴菌，諸如曲黴菌屬(Aspergillus species )；酵母，諸如畢赤酵母(Pichia pastoris )、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、裂殖酵母(Schizosaccharomyces )；及紅麵包黴菌(Neurospora crassa )；其他低級真核細胞、高級真核細胞，諸如來源於昆蟲之細胞及來源於植物或哺乳動物之細胞。
特定言之，宿主細胞可為COS7細胞(猴腎細胞)、NS0細胞、SP2/0、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、W138、幼倉鼠腎(BHK)細胞、MDCK、骨髓瘤細胞株、HuT 78細胞或293細胞，更特定言之CHO細胞，但不限於此。
在本發明中，「轉化」及/或「轉染」至宿主細胞中可藉由根據如此項技術中已知之宿主細胞選擇適合標準技術執行，包含將核酸引入生物體、細胞、組織或器官中的任何方法。方法包含電穿孔；胞質融合；磷酸鈣(CaPO4 )沈澱；氯化鈣(CaCl2 )沈澱；使用碳化矽纖維攪動；農桿菌介導之轉化；PEG、硫酸葡聚糖、脂染胺、脫水/抑制介導之轉化及類似者，但不限於此。
在本發明中，使用宿主細胞產生抗體或其抗原結合片段之方法可尤其包含以下步驟：(a)培養用本發明之重組載體轉化之宿主細胞；及(b)在宿主細胞中表現抗c-Met抗體或其抗原結合片段。
在製備上述抗體時，培養經轉化宿主細胞可在適當介質中及此項技術中已知之培養條件下進行。可根據熟習此項技術者所選定菌株容易地調整此類培養方法。此類培養方法揭示於各種文獻(例如，James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)中。細胞培養根據細胞生長類型分為懸浮培養及貼壁培養，且根據培養方法分為批式培養、饋料批式培養及連續培養。用於培養之介質必須適當滿足特定菌株之要求。
在培養動物細胞時，介質包含各種碳源、氮源及微量元素成分。可用碳源之實例可包含碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉及纖維素；脂肪，諸如大豆油、葵花油、蓖麻油及椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸；醇，諸如丙三醇及乙醇；及有機酸，諸如乙酸，其中此類碳源可單獨或以組合形式使用。
可用於本發明中之氮源可包含例如有機氮源，諸如蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米漿(CSL)及大豆-小麥；及無機氮源，諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨，其中此類氮源可單獨或以組合形式使用。作為磷源，介質可包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀及與其相對應之含鈉鹽。此外，介質可包含金屬鹽，諸如硫酸鎂或硫酸鐵。此外，介質可包含胺基酸、維生素、適當前驅體及類似者。
在培養期間，以適當方式將諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸及硫酸之化合物添加至培養產物中以調節培養產物之pH。此外，在培養期間，可藉由使用諸如脂肪酸聚乙二醇酯之消泡劑抑制氣泡形成。此外，將氧或含氧氣體(例如空氣)注入培養產物以便維持培養產物之有氧狀態。培養產物之溫度通常為20℃至45℃，較佳25℃至40℃。
產生方法可進一步包含以下步驟：(c)收集在宿主細胞中表現之抗c-Met抗體或其抗原結合片段。藉由培養經轉化宿主細胞獲得之抗體可在非純化狀態下使用，或進一步在藉由使用各種習知方法，例如透析、鹽沈澱、層析及類似者具有高純度之純化狀態下使用。除了彼等方法，最常使用一種使用層析之方法，其中根據抗體特徵、培養方法等，管柱之類型及排序可選自離子交換層析法、粒徑排阻層析法、親和力層析法等。
本發明之另一態樣提供包含抗體或其抗原結合片段之用於偵測c-Met之組合物、包含該組合物之用於偵測之套組及使用該套組偵測c-Met抗體之方法。
用於偵測c-Met之組合物及包含該組合物之套組以使得特異性結合至c-Met之抗體或其抗原結合片段與標本樣本接觸的方式形成抗原-抗體複合物，從而有效地偵測c-Met。
如本文所用，術語「抗原-抗體複合物」意謂c-Met與用於識別c-Met之抗體之間的共軛物，以便鑑定在樣本中表現c-Met之腫瘤或癌細胞。
一種使用偵測c-Met之組合物及使用包含該組合物之套組定量c-Met抗原的方法可藉由鑑定抗原-抗體複合物之形成來執行，其中鑑定抗原-抗體複合物之形成可藉由以下執行：酶免疫分析(ELISA)、西方墨點法、免疫螢光法、免疫組織化學染色、流式細胞測量術、免疫細胞化學、放射免疫分析(RIA)、免疫沈澱分析、免疫擴散分析、補體結合分析、蛋白晶片法等，但不限於此。ELISA包含各種ELISA方法，諸如使用用於識別與固體載體連接之抗原之經標記抗體的直接ELISA；使用用於識別抗體(用於識別與固體載體連接之抗原)複合物中之捕捉抗體之經標記二級抗體的間接ELISA；使用用於識別抗體及與固體載體連接之抗原之複合物中的抗原之另一經標記抗體之直接夾心ELISA；使用用於與另一抗體(用於識別抗體及與固體載體連接之抗原之複合物中的抗原，且隨後識別此類抗體等)反應之經標記二級抗體的間接夾心ELISA。
作為用於定性或定量地形成可測量抗原-抗體複合物之標記物，存在酶、螢光材料、配位體、發光材料、微粒、氧化還原分子、放射性同位素及類似者，但未必限於此。作為酶，存在β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿素酶、過氧化酶、鹼性磷酸酶、乙醯膽鹼酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶及GDP酶、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶及螢光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬胺酸轉胺酶、磷酸烯醇丙酮酸去羧酶、β-內醯胺酶等，但不限於此。
本發明之另一態樣提供一種包含本發明抗體或其抗原結合片段之用於預防或治療癌症之組合物。
本發明之另一態樣提供一種用於預防或治療癌症之方法，包含向存在罹患癌症之危險或患有癌症的個體投與包含本發明抗體或其抗原結合片段之組合物之步驟。
本發明之再又一態樣提供關於包含本發明抗體或其抗原結合片段之組合物癌症治療之用途及製備抗癌藥物之用途。
該抗體及其抗原結合片段諸如上述抗體及其抗原結合片段。
本發明抗體或其抗原結合片段能夠以高親和力單獨結合至c-Met或結合至c-Met及EGFR之組合以抑制癌細胞生長，以使得抗體單獨或與習知醫藥學上可接受之載劑組合可用於治療、預防及診斷過度增殖疾病，諸如癌症。
在本發明中，術語「預防」意謂藉由投與本發明組合物預防或延緩諸如癌症等疾病發生或復發之所有動作，且術語「治療」意謂抑制罹患諸如癌症之疾病、減輕癌症或消除癌症。
限制條件可為癌症(一種適用本發明組合物之疾病)特定言之為肺癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、三陰性乳癌(TNBC)、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內膜瘤、唾液腺腫瘤或甲狀腺癌，更特定言之為肺癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、三陰性乳癌(TNBC)、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、頭頸癌、乳癌，且更加特定言之為肺癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、三陰性乳癌(TNBC)、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、頭頸癌，但不限於此。在本發明中，限制條件可為癌症為一種特定言之由c-Met過度表現、擴增、突變或活化引起之癌症，但不限於此。換言之，包含本發明抗體或其結合片段之組合物對所有癌性腫瘤之增殖均具有抑制作用，無論c-Met是否表現異常或突變，以使得本發明之醫藥用途不受c-Met突變之表現態樣或其存在或不存在限制。
組合物可為一種醫藥組合物、準藥物組合物及保健食品組合物之形式。
用於預防或治療癌症之本發明組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥學上可接受之載劑為習知地用於製備調配物之醫藥學上可接受之載劑，包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠橡膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油及類似者，但不限於此。除了該等成分以外，用於預防或治療癌症之本發明組合物可進一步包含潤滑劑、保濕劑、甜味劑、調味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。適合之醫藥學上可接受之載劑及製劑詳細地描述於Remington's Pharmaceutical Sciences (第19版, 1995)中。
本發明組合物可經口或非經腸投與，其中非經腸投與可藉由靜脈內輸注、皮下輸注、肌肉內注射、腹膜內注射、內皮投與、局部投與、鼻內投與、肺內投與、經直腸投與及類似者執行。在經口投與期間，蛋白質或肽被分解，因此經口組合物可以使得其活性藥物經包覆或受保護而分解於胃中的方式調配。本發明組合物可藉由活性物質可經由其移動至靶細胞中之預定裝置投與。
用於預防或治療癌症之本發明組合物之適合劑量取決於如調配方法；投與類型；患者的年齡、重量、性別、病理病況、進食；投與時間；投與路徑；排泄速度及反應敏感性之此類因素而改變，其中一般熟練的醫生可容易地確定及規定所要治療或預防之有效劑量。根據本發明之例示性實施例，本發明之醫藥組合物之日劑量可共計為0.001-100 mg/kg或更高。在本說明書中，術語「醫藥上有效劑量」意謂足以治療、預防及診斷諸如癌症之疾病之量。
用於預防或治療癌症之本發明組合物可藉由根據熟習此項技術者可容易地執行之關於本發明的方法使用醫藥學上可接受之載劑及/或手段調配成製劑，以使得此類組合物可以單劑量形式製備或藉由嵌入多劑量容器中來製備。此時，劑型可呈含油溶液或水性介質、懸浮液或乳液之形式，或呈萃取物、粉末、栓劑、粉末狀藥物、顆粒、錠劑或膠囊之形式，且可進一步包含分散劑或穩定劑。
本發明組合物可以單獨治療劑形式投與或與其他治療劑組合投與，且可與習知治療劑依序或同時投與。
本發明抗體或其抗原結合片段可用於以使得將其以抗體治療劑(功能性分子)及雙特異性抗體治療劑(功能性分子)共軛物之形式體內注射的方式治療癌症，諸如上述抗體或其抗原結合片段。用於將藥物靶向至特異性目標位點之適當及合乎需要的各種條件報導於文獻中，例如Trouet等人, Plenum Press, New York and London, (1982) 19-30。
根據本發明之一個特定實施例，作為鑑定用於預防或治療異種移植小鼠模型中之癌症之本發明組合物之抗腫瘤活性的結果，鑑定出其腫瘤活性抑制功效與對照組相比顯著極佳(圖12及13)。
由包括於本發明組合物中之抗體或其抗原結合片段標靶之c-Met為在癌細胞表面上表現的分子，因此其可用於以使得功能性分子進一步與本發明抗體結合且與其組合投與的方式預防、治療及診斷c-Met相關之癌症。功能性分子可包含化學物質、放射性核素、免疫治療劑、細胞介素、趨化介素、毒素、生物藥劑、酶抑制劑及類似者。
能夠與本發明抗體或其片段偶合之功能性分子使得抗體藥物-共軛物(ADC)可為化學物質、細胞介素或趨化介素，但不限於此。舉例而言，化學物質可為抗癌藥物，特定言之，阿西維辛(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿考達唑(acodazole)、降真香鹼(acronycine)、阿多來新(adozelesin)、丙氨菌素(alanosine)、阿地介白素(aldesleukin)、別嘌醇鈉(allopurinol sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、胺格魯米特(aminoglutethimide)、胺萘非特(amonafide)、安普利近(ampligen)、安吖啶(amsacrine)、雄激素、胺癸叮(anguidine)、甘胺酸阿非迪黴素(aphidicolin glycinate)、亮胺酸溶肉瘤素(asaley)、天冬醯胺酶(asparaginase)、5-氮胞苷、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡介苗(bacillus calmette-guerin；BCG)、貝克氏抗葉酸劑(Baker's antifol)、β-2-二氧硫鳥苷、比生群HCl (bisantrene HCl)、硫酸博萊黴素(bleomycin sulfate)、白消安(busulfan)、丁硫胺酸磺基肟(buthionine sulfoximine)、BWA773U82、BW502U83/HCl、BW 7U85甲磺酸鹽、賽瑞醯胺(ceracemide)、卡貝替姆(carbetimer)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、氯喹噁啉-磺醯胺(chloroquinoxalin-sulfonamide)、氯脲黴素(chlorozotocin)、色黴素A3 (chromomycin A3)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、皮質類固醇、微小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)、CPT-11、克立那托(crisnatol)、環胞苷、環磷醯胺、阿糖胞苷、色他巴(cytembena)、順丁烯二酸達比斯(dabis maleate)、達卡巴嗪(decarbazine)、放線菌素、道諾黴素HCl (daunorubicin HCl)、脫氧鳥苷(deazauridine)、右雷佐生(dexrazoxane)、雙去水半乳糖醇、地吖醌(diaziquone)、二溴衛矛醇(dibromodulcitol)、膜海鞘素B、胺基甲酸二乙基二硫酯、二乙醇醛、二氫-5-氮胞苷、多柔比星(doxorubicin)、棘黴素、依達曲沙(edatrexate)、依地福新(edelfosine)、依氟鳥胺酸(eflornithine)、艾略特氏溶液(Elliot's solution)、依沙蘆星(elsamitrucin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、磷酸雌莫司汀(estramustine phosphate)、雌激素、依他噠唑(etanidazole)、伊索弗斯(ethiophos)、依託泊苷(etoposide)、法倔唑(fadrazole)、法紮拉濱(fazarabine)、非瑞替尼(fenretinide)、非格司亭(filgrastim)、非那雄安(finasteride)、黃酮乙酸、氟尿苷(floxuridine)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)、5'-氟脲嘧啶(5'-fluorouracil)、全氟碳™、氟他胺(flutamide)、硝酸鎵、吉西他濱(gemcitabine)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、海普法姆(hepsulfam)、伸己基雙乙醯胺、高粗榧鹼、硫酸肼、4-羥基雄烯二酮、羥基尿素、伊達比星HCl (idarubicin HCl)、異環磷醯胺、4-甘薯黑斑酶醇(4-ipomeanole)、異丙鉑(iproplatin)、異維甲酸、亞葉酸鈣、乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)、左旋咪唑(levamisol)、脂質道諾黴素、脂質體捕獲多柔比星、洛莫司汀(lomustine)、氯尼達明(lonidamine)、美登素(maytansine)、鹽酸氮芥、美法侖(melphalan)、美諾立爾(menogaril)、美巴酮(merbarone)、6-巰基嘌呤、美司鈉(mesna)、卡介苗之甲醇萃取物、甲胺喋呤(methotrexate)、N-甲基甲醯胺、米非司酮(mifepristone)、米托胍腙(mitoguazone)、絲裂黴素-C、米托坦(mitotane)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)、單核球/巨噬細胞群落刺激因子、納比隆(nabilone)、萘氧啶(nafoxidine)、新抑癌蛋白、醋酸奧曲肽(octreotide acetate)、奧馬鉑(ormaplatin)、奧賽力鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、N-膦乙醯基-L-天冬胺酸(pala)、噴司他丁(pentostatin)、哌嗪二酮(piperazinedione)、哌泊溴烷(pipobroman)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、鹽酸吡羅蒽醌(piroxantrone hydrochloride)、PIXY-321、普卡黴素(plicamycin)、卟吩姆鈉(porfimer sodium)、潑尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、孕激素、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)、雷佐生(razoxane)、沙格司亭(sargramostim)、司莫司汀(semustine)、螺旋鍺(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、磺氯苯脲(sulofenur)、蘇拉明鈉(suramin sodium)、他莫昔芬(tamoxifen)、克癌易(taxorere)、喃氟啶(tegafur)、替尼泊苷(teniposide)、對苯二甲醯胺(terephthalamidine)、替羅昔隆(teroxirone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、胸苷注射、噻唑呋林(tiazofurin)、拓朴替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、維甲酸(tretinoin)、鹽酸三氟吡啦嗪(trifluoperazine hydrochloride)、曲氟尿苷(trifluridine)、曲美沙特(trimetrexate)、腫瘤壞死因子(TNF)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、硫酸長春鹼(vinblastin sulfate)、硫酸長春新鹼(vincristine sulfate)、長春地辛(vindesine)、長春瑞賓(vinorelbine)、長春利定(vinzolidine)、Yoshi 864、佐柔比星(zorubicin)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、依託泊苷、美法侖、克癌易、紫杉醇及其混合物，但不限於此。
有利影響
特異性結合至肝細胞生長因子受體(c-Met)之本發明抗體或其抗原結合片段具有新穎序列，且甚至以其極少量展示極佳的癌細胞增殖抑制活性及顯著極佳的抗癌活性，由此有效地預防或治療諸如癌症之疾病。
在下文中，將經由實例更詳細地描述本發明。以下實例僅出於更詳細地說明本發明之目的而提供。因此，根據本發明之目的，熟習此項技術者顯而易知實例並不解釋為限制本發明之範疇。
實例 1 . 製備用於產生 c - Met 特異性抗體之融合瘤細胞及鑑定其腫瘤細胞增殖抑制活性 ( 1 ) 製備及選擇用於產生 c - Met 蛋白之單株抗體的融合瘤細胞株 將作為抗原之人類c-Met Sema結構域/Fc融合蛋白(自身產生的)經腹膜內注射至小鼠中，以便獲得經由動物免疫接種產生融合瘤細胞株所需的經免疫接種小鼠。經由ELISA分析方法使用人類c-Met/His融合蛋白作為抗原進行篩選，以便從融合瘤細胞群中選擇出只對c-Met蛋白具有特異性回應之融合瘤細胞。
(2) c-Met 抗體 獲自選定融合瘤細胞株之小鼠抗體的輕鏈及重鏈CDR胺基酸序列分別展示於表1及2中。 [表1] 融合瘤輕鏈CDR
Figure 107118588-A0304-0001
 [表2] 融合瘤重鏈CDR
Figure 107118588-A0304-0002
(3) 融合瘤 c - Met 抗體之活體外腫瘤細胞增殖抑制活性 關於獲自融合瘤細胞株之c-Met特異性小鼠抗體以及藉由將抗體與人類重鏈及輕鏈恆定區融合所製備之嵌合抗體，以人類神經膠母細胞瘤細胞株U-87 MG及人類胃癌細胞株MKN45中測試腫瘤細胞增殖抑制活性。
特定言之，將U-87 MG細胞(ATCC, #HTB14)稀釋於含有10% (v/v) FBS、100 U/500 ml青黴素及100 μg/500 ml鏈黴素(Invitrogen, #15140-122)之培養基EMEM (ATCC, #30-2003)中，其後將所得細胞以2.5 × 103 個細胞之濃度添加100 μℓ至96孔盤之各孔中，以使得培養盤在37℃、95% RH及5% (v/v) CO2 條件下培養18-24小時。自各孔移除細胞培養基，其後將含有2% (v/v) FBS之EMEM介質以100 μℓ添加至各孔中，且在2×最終濃度(100 nM)下製備之抗體以1/10之比率連續稀釋，以使得針對各抗體將所得細胞以六種濃度(亦即，200 nM、20 nM、2 nM、200 pM、20 pM及2 pM)添加100 μℓ至各孔中。隨後，培養盤在37℃、95% RH及5% (v/v) CO2 條件下培養5天，其後在最後一天將所得細胞用10% TCA (三氯乙酸；Sigma, #T0699)溶液固定。將所得經固定細胞染色25分鐘，以此方式使得添加80 μℓ 0.4% SRB (磺醯若丹明B)溶液至各孔中，其後用1%乙酸溶液洗滌所得細胞5次。隨後，將150 μℓ 10 mM Tris溶液嵌入乾燥培養盤之各孔中以溶解SRB染料，其後在540 nm之波長下藉由使用微量培養盤讀數器量測其光學密度。
此外，將MKN45 (#JCRB0254)細胞株稀釋於含有10% (v/v) FBS之RPMI-1640介質 (Gibco, #A10491)中，其後將所得細胞株以2.5 × 103 分配至96孔盤之各孔中，以使得所得培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養隔夜。隨後，培養盤各孔之介質用100 μℓ含有1% (v/v) FBS之RPMI-1640介質替換，其後以1/10之比率(亦即，100 nM、10 nM、1 nM、100 pM、10 pM及1 pM)依序稀釋測試抗體以在100 nM之最終濃度下達至1 pM，以使得將所得抗體以100 μℓ添加至各孔中。接著，培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養5天，其後自其中移除介質，以使得將200 μℓ TCA溶液嵌入各孔中以固定細胞。如對U87 MG細胞之測試中所示，培養盤之細胞根據習知SRB比色檢定方法染色，其後在540 nm之波長下藉由使用微量培養盤讀數器量測各孔之光學密度。U87 MG及MKN45細胞株之結果展示於表3及圖1中。 [表3] 對融合瘤c-Met抗體之腫瘤細胞增殖抑制活性之活體外測試的結果
Figure 107118588-A0304-0003
如以上表3及圖1中所見，本發明之抗c-Met 8C4、5G3抗體及其嵌合體抗體均具有腫瘤細胞增殖抑制活性，其與已知c-Met抗體LY2875358及OA-5D5 (對照組)同等優異或比其等更優異。因此，8C4、5G3抗體及其突變體(諸如本發明之嵌合體抗體、人類化抗體及對抗原親和力經優化之抗體)可極有價值地用於預防或治療c-Met相關之癌症。
本發明之8C4、5G3抗體之輕鏈及重鏈可變區的特異性共同序列展示於下表4中。 [表4] 8C4、5G3抗體之輕鏈及重鏈可變區的共有SEQ ID NO
Figure 107118588-A0304-0004
實例 2 . 製備 8C4 抗體之人類化抗體及鑑定其活體外腫瘤細胞增殖抑制活性 作為一個實例，將小鼠抗體8C4人類化並鑑定其活體外腫瘤細胞增殖抑制活性，以便進一步鑑定本發明中所製備之抗體的效果。
對於8C4抗體重鏈之人類化設計，與小鼠抗體8C4之重鏈可變區中之基因具有高同源性的人類生殖系基因先經Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析。結果，鑑定出IGHV3-23與8C4抗體在胺基酸水準上具有48%同源性，且亦鑑定出IGHV3-11與8C4抗體在胺基酸水準上具有46%同源性。
小鼠抗體8C4之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3由Kabat編號定義，且hu8C4-1以使得小鼠抗體8C4之CDR部分表示為引入IGHV3-23之構架中的方式製備。此時，第48號(V→I)、第49號(S→G)、第71號(R→A)、第73號(N→K)、第78號(L→A)及第94號(K→G)胺基酸回復突變為小鼠抗體8C4之原始胺基酸序列，以最終建構hu8C4-1之重鏈。在hu8C4-2的情況下，小鼠抗體8C4之CDR部分表示為引入IGHV3-11之框架中，且第48號(V→I)、第49號(S→G)、第71號(R→A)、第73號(N→K)、第78號(L→A)及第94號(R→G)胺基酸回復突變為小鼠抗體8C4之原始胺基酸序列，以最終建構hu8C4-2之重鏈。
甚至在8C4抗體之輕鏈的情況下，對於人類化設計，與小鼠抗體8C4之輕鏈可變區中之基因具有高同源性的人類生殖系基因經由Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析。結果，鑑定出IGKV1-27與8C4抗體在胺基酸水準上具有65.3%同源性，且IGKV1-33與8C4抗體在胺基酸水準上具有64.2%同源性。
小鼠抗體8C4之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3由Kabat編號定義，且小鼠抗體8C4之CRD部分表示為引入IGKV1-33之構架及IGKV1-27之構架中，由此分別製備hu8C4-1及hu8C4-2。此時，hu8C4-1及hu8C4-2兩者之第69號(T→R)胺基酸回復突變為小鼠抗體8C4之原始胺基酸序列。
8C4人類化抗體藉由使用pCLS05載體(韓國專利註冊號10-1420274)在293T細胞中表現。關於此類獲得之呈IgG1形式的人類化抗體，藉由與以上實例1中所示相同的方法鑑定其在U-87 MG (人類神經膠母細胞瘤細胞株)中是否具有腫瘤細胞增殖抑制活性。
結果，鑑定出hu8C4-1及hu8C4-2之IC50 值分別共計為30 nM及24.6 nM，因此指示與嵌合體8C4抗體之抗癌活性水準相似的抗癌活性水準(IC50 = 32.4 nM)。
hu8C4-1及hu8C4-2人類化抗體之輕鏈及重鏈可變區的特異性共有序列展示於表5中。 [表5] hu8C4-1及hu8C4-2人類化抗體之輕鏈及重鏈可變區的共有SEQ ID NO
Figure 107118588-A0304-0005
Figure 107118588-A0304-0005-1
實例 3 . 製備 5G3 抗體之人類化抗體且鑑定其活體外腫瘤細胞增殖抑制活性 隨後，將本發明之小鼠抗體5G3人類化以鑑定其活體外腫瘤細胞增殖抑制活性。
特定言之，對於hu5G3-1之重鏈設計，與小鼠抗體5G3之重鏈可變區中之基因具有最高同源性的人類生殖系基因首先經由Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析。結果，鑑定出IGHV1-46與5G3抗體在胺基酸水準上具有67.3%同源性。小鼠抗體5G3之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3由Kabat編號定義，且小鼠抗體5G3之CRD部分表示為引入IGHV1-46之構架中。此時，第48號(M→I)、第69號(M→L)、第71號(R→A)、第73號(T→K)及第78號(V→A)胺基酸回復突變為小鼠抗體5G3之原始胺基酸序列。藉此，建構hu5G3-1之重鏈。
對於hu5G3-1之輕鏈，CDR嫁接在與5G3抗體具有63.5%同源性之IGKV3-20基因中進行，且第43號(A→S)、第60號(D→A)及第71號(F→N)胺基酸回復突變以建構hu5G3-1之輕鏈。
此外，為了設計hu5G3-2之重鏈，由Kabat編號定義之小鼠抗體5G3之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3藉由使用VH3亞型引入，其習知地已知為最穩定亞型。此時，第67號(F→A)、第69號(I→L)、第73號(T→K)、第90號(Y→F)及第94號(T→R)胺基酸回復突變為小鼠抗體5G3之原始胺基酸序列。藉此，建構hu5G3-2之重鏈。
對於hu5G3-2之輕鏈，CDR嫁接在IGVKⅢ基因中進行，已知其穩定地形成具有VH3亞型之結構，並且不進行回復突變。
5G3人類化抗體藉由使用pCLS05載體(韓國專利註冊號10-1420274)在293T細胞中表現。關於此類獲得之呈IgG2形式之人類化抗體，藉由與以上實例1中所示相同的方法鑑定其在MKN45 (人類胃癌細胞株)中是否具有腫瘤細胞增殖抑制活性。
結果，鑑定出hu5G3-1及hu5G3-2之IC50 值分別共計為0.52 nM及0.5 nM，因此指示與嵌合體5G3抗體之抗癌活性水準相似的抗癌活性水準(IC50 = 0.41 nM)。
hu5G3-1及hu5G3-2人類化抗體之輕鏈及重鏈可變區的共同序列展示於表6中。 [表6] hu5G3-1及hu5G3-2人類化抗體之輕鏈及重鏈可變區的共有SEQ ID NO
Figure 107118588-A0304-0006
Figure 107118588-A0304-0006-1
實例 4 . 製備鉸鏈突變體且測試其腫瘤細胞增殖抑制活性 隨後，根據人類IgG1重鏈恆定區之鉸鏈序列對腫瘤細胞增殖抑制活性進行測試。
首先，人類IgG1重鏈恆定區之鉸鏈具有胺基酸序列「EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 37)」，其經取代以獲得具有胺基酸序列SEQ ID NO: 38至SEQ ID NO: 44的鉸鏈區突變體。
所得突變體分別選殖至包含以上實例2中製備之hu8C4-1、hu8C4-2人類化抗體之重鏈可變區的載體中。藉由與以上實例1中所示相同的方法在U-87 MG中鑑定根據鉸鏈序列之活體外腫瘤細胞增殖抑制活性。
此外，關於非小細胞肺癌細胞株NCI-H1993 (ATCC, #CRL-5909)如下分析8C4人類化抗體之效果。將NCI-H1993細胞株稀釋於含有10% (v/v) FBS之RPMI-1640介質 (Gibco, #A10491)中，其後將所得細胞株以3.0 × 103 分配至96孔盤之各孔中，以使得所得培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養隔夜。此後，培養盤各孔之介質用100 μℓ含有2% (v/v) FBS之RPMI-1640介質替換，其後以1/10之比率(亦即，100 nM、10 nM、1 nM、100 pM、10 pM及1 pM)依序稀釋測試抗體以在100 nM之最終濃度下達至0.001 nM，以使得將所得抗體添加100 μℓ至各孔中。接著，培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養5天，其後自其中移除介質，以使得將200μℓ TCA溶液(Sigma, #T0699)嵌入各孔中以固定細胞。此外，培養盤之細胞根據習知SRB比色檢定方法染色，其後在540 nm之波長下藉由使用微量培養盤讀數器量測各孔之光學密度。
U-87 MG及NCI-H1993 (ATCC, #CRL-5909)中之hu8C4-1之結果展示於表7中。 [表7] 鉸鏈區突變體序列及對腫瘤細胞增殖抑制活性之活體外測試的結果
Figure 107118588-A0304-0007
如表7中所見，根據鉸鏈序列之差異，hu8C4抗體之腫瘤細胞增殖抑制活性存在一定差異，但鑑定出此類抗體有效地抑制大部分腫瘤細胞之增殖。因此，在下文中，在hu8C4-1中代表性地具有鉸鏈區SEQ ID NO: 38之IgG1人類化抗體稱為hu8C4，且製備對其親和力經優化之抗體以鑑定其效果。
實例 5 . 製備 hu8C4 之親和力經優化抗體且鑑定其活體外腫瘤細胞增殖抑制活性 為了製備hu8C4之親和力經優化抗體，首先藉由使用以scFv及pIII之組合形式呈現之噬菌體載體來製備呈現噬菌體之scFv庫，其中載體之示意性結構繪示於圖2中。噬菌體載體包含在IPTG感應lac啟動子的控制下之抗體之scFv片段，其中所用連接子序列為GGGGS GGGGS GGGGS (SEQ. No.53)。
隨後，誘發突變之具有NNK密碼子之寡核苷酸用於將變種引入hu8C4之重鏈及輕鏈CDR結構域中。因此，製備具有His、HA及pIII之融合物之hu8C4 scFv庫，其後人類c-Met特異性抗體選自所製備抗體庫。
特定言之，競爭選擇法用於選擇具有提高之親和力之抗體。人類c-Met抗原根據製造商準則結合於Dynabeads® M-280 (Thermo Fisher Scientific, 11205D)中。具有結合至其之抗原的珠粒由超阻斷Tris緩衝鹽水(TBS, Pierce)阻斷2小時。此外，重組噬菌體在37℃下生長隔夜，且隨後使重組噬菌體離心，且其上澄液之噬菌體用超阻斷TBS、0.05% Tween 20阻斷2小時。隨後，用含有0.05% Twin 20之PBS洗滌珠粒。將經阻斷噬菌體溶液添加至經洗滌珠粒中，其後所得珠粒在旋轉器中培育2小時以用於噬菌體結合，以使得所得珠粒用含有0.05% Twin 20之PBS洗滌。隨後，將人類c-Met抗原添加至含有0.05% Twin 20之1 ml PBS中，其後所得抗原在旋轉器中培育24小時(Rouet R等人 (2012)Nat Protoc . 7:364-373)。此後，結合至珠粒之噬菌體用100 mM三乙醇胺溶離5分鐘，其後用0.5 M Tris/Cl (pH 7.2)中和溶離劑。經溶離噬菌體中和液體經大腸桿菌TG1感染。
經由實驗選擇之個別純系在96孔格式之添加有卡本尼西林及安比西林之2xYT培養液200 μℓ中生長，其後其培養上清液直接用於ELISA以選擇結合至塗覆有靶蛋白之培養盤的呈現噬菌體之scFv。偵測到的抗體之輕鏈及重鏈CDR區之胺基酸序列展示於表8及9中，且親和力經優化抗體之輕鏈及重鏈可變區之代表性胺基酸序列展示於表10中。 [表8] 重鏈CDR序列清單
Figure 107118588-A0304-0008
Figure 107118588-A0304-0009
Figure 107118588-A0304-0010
 [表9]
Figure 107118588-A0304-0011
Figure 107118588-A0304-0012
Figure 107118588-A0304-0013
Figure 107118588-A0304-0014
 [表10] 親和力經優化抗體之輕鏈及重鏈可變區之序列清單
Figure 107118588-A0304-0015
此外，藉由使用親和力經優化抗體之一部分對U-87 MG細胞株執行對增殖抑制活性之活體外測試，其中其結果展示於表11中。 [表11] 由hu8C4輕鏈及重鏈親和力經優化抗體產生之活體外腫瘤細胞增殖抑制活性
Figure 107118588-A0304-0016
如表11中所見，鑑定出U-87 MG細胞中之hu8C4親和力經優化抗體之腫瘤細胞增殖抑制活性的IC50 共計為5.0-18 nM，其中其療效增加為親本抗體hu8C4的4.3-9.8倍。以上結果表示對具有展示於表8至10中之胺基酸序列的一部分抗體執行之測試，其中親本hu8C4抗體之親和力經優化且所有抗體均基於抗原親和力經由選擇程序進行選擇。因此，預期甚至關於親和力經優化抗體以及具有所示重鏈及輕鏈可變區CDR之組合的抗體之其餘部分亦可能存在充分相等的效果。
對於額外實驗，藉由將輕鏈及重鏈可變區組合來製備10種親和力經優化抗體。輕鏈及重鏈序列之特異性組合展示於表12中。 [表12] 親和力經優化抗體之組合可變區序列清單
Figure 107118588-A0304-0017
隨後，藉由與以上實例1中所示相同的方法評估腫瘤細胞增殖抑制活性，其中其結果展示於表13及圖3中。 [表13] 由親和力經優化抗體產生之活體外腫瘤細胞增殖抑制活性
Figure 107118588-A0304-0018
如以上表13中所見，鑑定出hu8C4以及具有其親和力經優化抗體之輕鏈及重鏈可變區之組合的10種關鍵抗體亦展示腫瘤細胞增殖抑制活性。特定言之，10種抗體之IC50 共計為1.7-5.3 nM，且鑑定出其具有腫瘤細胞增殖抑制作用，其比親本抗體hu8C4優異9.2-28.5倍。
實例 6 . 雙特異性抗體之製備及活體外腫瘤細胞增殖抑制活性 為了製備特異性結合至c-Met及EGFR之雙特異性抗體，已知特異性結合至EGFR之爾必得舒及維必施scFv片段藉由GGGGSGGGGS (SEQ. No. 312)連接子分別與本發明之c-Met抗體之重鏈C端連接。
為了增加scFv的穩定性，重鏈之第44個殘基及輕鏈之第100個殘基經胱胺酸取代(Reiter Y.等人, Biochemistry 33(18):5451-5459 (1994))。爾必得舒及維必施scFv序列、雙特異性抗體之重鏈之胺基酸序列及雙特異性抗體之可變區之組合展示於以下表14及15中。 [表14] 用於製備雙特異性抗體之EGFR抗體以及雙特異性抗體之胺基酸序列清單
Figure 107118588-A0304-0019
Figure 107118588-A0304-0019-1
Figure 107118588-A0304-0019-2
Figure 107118588-A0304-0019-3
Figure 107118588-A0304-0019-4
Figure 107118588-A0304-0019-5
Figure 107118588-A0304-0019-6
Figure 107118588-A0304-0019-7
 [表15] 雙特異性抗體之組合可變區序列清單
Figure 107118588-A0304-0024
隨後，藉由與實例1中所示相同的方法在U-87 MG腫瘤細胞株中評估連接爾必得舒及維必施scFv片段之雙特異性抗體的活體外抗癌療效。
此外，藉由使用NCI-H1993、NCI-H292及NCI-H820肺癌細胞株評估腫瘤細胞增殖抑制活性。特定言之，關於具有c-Met基因在其中過度表現之NCI-H1993 (ATCC, #CRL-5909)細胞株、具有EGFR及c-Met在其中正常表現之NCI-H292 (ATCC, #CRL-1848)細胞株及具有蘇胺酸(T)在EGFR胺基酸第790號中突變為甲硫胺酸(M)之NCI-H820 (ATCC, #HTB-181)，藉由以下方法進行腫瘤細胞增殖抑制活性。將各細胞株稀釋於含有10% (v/v) FBS之RPMI-1640介質 (Gibco, #A10491)中，其後將所得細胞株以2.0 × 103 分配至96孔盤之各孔中，以使得所得培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養隔夜。隨後，培養盤之各孔用100 μℓ無血清介質替換，其後所得培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養18小時。此後，介質用100 μℓ含有2% (v/v) FBS或HGF 50 ng/ml之RPMI-1640介質替換，其後測試抗體以1/10之比率(亦即，100 nM、10 nM、1 nM、100 pM、10 pM及1 pM)依序稀釋以在100 nM之最終濃度下達至0.001 nM，以使得將所得抗體添加100 μℓ至各孔中。隨後，培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養5天，其後自其中移除介質，以使得200 μℓ TCA溶液嵌入各孔中以固定細胞。此外，培養盤之細胞根據習知SRB比色檢定方法染色，其後在540 nm之波長下藉由使用微量培養盤讀數器量測各孔之光學密度。
以上各細胞株之增殖抑制活性之結果展示於表16及17以及圖4及圖5中。 [表16] 由雙特異性抗體產生之活體外腫瘤細胞增殖抑制活性
Figure 107118588-A0304-0025
 [表17] 由雙特異性抗體產生之活體外肺癌細胞株增殖抑制活性
Figure 107118588-A0304-0026
結果，在藉由該方法由U-87 MG腫瘤細胞株製備之雙特異性抗體之間無療效差異，且鑑定出其活性抑制功效比hu8C4經優化抗體之IC50 優異約15倍。此外，作為使用NCI-H1993、NCI-H292及NCI-H820肺癌細胞株評估腫瘤細胞增殖抑制活性之結果，鑑定出在所製備之雙特異性抗體之間無療效差異。
此類結果表明無論c-Met及EGFR是否過度表現或突變，本發明抗體對所有癌症類型均具有增殖抑制作用，因此可有效地用於此等癌症類型中。
實例 7 . 比較評估雙特異性抗體與組合療法相比之活體外腫瘤細胞增殖抑制活性 使用八種類型之癌症比較分別靶向c-Met及EGFR之各抗體的組合療法與本發明之雙特異性抗體之間的腫瘤細胞增殖抑制活性。
特定言之，在以下細胞株中評估腫瘤細胞增殖抑制活性：肺癌細胞株NCI-H292 (ATCC, #CRL-1848)、HGF自體分泌神經膠母細胞瘤細胞株U-87 MG (ATCC, #HTB-14)、肺癌細胞株NCI-H1648 (ATCC #CRL-5882)及NCI-H596 (ATCC #HTB-178)、HCC827 (ATCC, #CRL2868)、結腸癌細胞株LS174T (ATCC, #CL-188)、三陰性乳癌(TNBC)細胞株BT20 (ATCC, #HTB-19)及胰臟癌細胞株KP4 (JCRB, #RCB1005)。NCI-H1648細胞株表徵為正常表現EGFR及c-Met，NCI-H596細胞株表徵為MET基因第14號外顯子之某一序列缺失，且HCC827細胞株表徵為EGFR基因第19號外顯子之某一序列缺失。此外，LS174T細胞株具有KRAS突變，且KP4表徵為自體分泌HGF。
U-87 MG細胞株係藉由實例1之方法評估，而NCI-H292細胞株係藉由實例6之方法評估。此外，將NCI-H1648、NCI-H596及HCC827細胞株稀釋於含有10% (v/v) FBS之RPMI-1640介質(Gibco, #A10491)中，稀釋後所得細胞株以2.0 × 103 分配於96孔盤之各孔中。將LS174T細胞株稀釋於含有10% (v/v) FBS之DMEM介質(Gibco, #11995-065)中，稀釋後所得細胞株以2.0 × 103 分配。將BT20細胞株稀釋於含有10% (v/v) FBS之EMEM介質(ATCC, #30-2003)中，稀釋後所得細胞株以3.0 × 103 分配。並且，將KP4細胞株稀釋於含有10% (v/v) FBS之RPMI-1640介質(Gibco, #A10491)中，稀釋後所得細胞株以1.5 ×103 分配，以使得所得培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養隔夜。隨後，培養盤之各孔用100 μℓ無血清介質替換，其後所得培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養18小時。此後，介質用100 μℓ含有2% (v/v) FBS或HGF 50 ng/ml之RPMI-1640介質替換，其後以1/10之比率(亦即，100 nM、10 nM、1 nM、100 pM、10 pM及1 pM)依序稀釋測試抗體以在100 nM之最終濃度下達至1 pM，以使得將所得抗體添加100 μℓ至各孔中。隨後，培養盤在37℃、5% CO2 條件下培育5天，其後自其中移除介質，以使得200 μℓ TCA溶液嵌入各孔中以固定細胞。此外，培養盤之細胞根據習知SRB比色檢定方法染色，其後在540 nm之波長下藉由使用微量培養盤讀數器量測各孔之光學密度。
此實例之結果展示於表18至21及圖6至8中。 [表18] 在U-87 MG及NCI-H292細胞株中比較評估組合療法與雙特異性抗體之間的活體外腫瘤細胞增殖抑制活性
Figure 107118588-A0304-0027
 [表19] 在NCI-H1648及NCI-H596細胞株中比較評估組合療法與雙特異性抗體之間的活體外腫瘤細胞增殖抑制活性
Figure 107118588-A0304-0028
 [表20] 在LS174T、BT20及KP4細胞株中比較評估組合療法與雙特異性抗體之間的活體外腫瘤細胞增殖抑制活性
Figure 107118588-A0304-0029
 [表21] 在HCC827及NCI-H596細胞株中比較評估組合療法與雙特異性抗體之間的活體外腫瘤細胞增殖抑制活性
Figure 107118588-A0304-0030
結果，鑑定出本發明之雙特異性抗體之腫瘤細胞增殖抑制能力比hu8C4、維必施或所有8種腫瘤細胞株中之兩種抗體之組合療法的腫瘤細胞增殖抑制能力更佳。此外，鑑定出與用作對照雙特異性抗體之EM1-MAb (Janssen)相比，在U-87MG、NCI-H292、BT20及KP4細胞株中具有顯著極佳的腫瘤細胞增殖抑制能力。
此外，當與LA480 (Lilly)、OA-5D5 (Genentech)及AbF46 (Samsung)(其為U-87MG細胞株中之c-Met靶抗體)相比時，鑑定出hu8C4及hu8C4 ×維必施scFv兩者與對照抗體相比皆具有極佳腫瘤細胞增殖抑制能力。
此外，儘管得舒緩(HCC827細胞株中之EGFR酪胺酸激酶抑制劑)在HGF處理條件下顯示出抗性，但鑑定出在與得舒緩、hu8C4、hu8C4 ×維必施scFv或c-Met抑制劑在此類條件下組合處理時顯示出極佳的腫瘤細胞增殖抑制能力。
此外，作為在NCI-H596細胞株中比較各種EGFR抑制劑及c-Met抑制劑之結果，鑑定出hu8C4 ×維必施scFv之腫瘤細胞增殖抑制能力與EGFR或c-Met單靶標藥物相比極佳。
實例 8 . 量測與 ECD ( BIAcore ) 之 結合力 隨後，為了量測本發明之c-Met抗體與細胞外域(ECD)的結合力，c-Met抗體及雙特異性抗體與c-Met ECD及EGFR ECD之結合藉由使用BIAcore在人類與食蟹獼猴之間量測。
特定言之，使用人類c-Met ECD (ACROBiosystems, MET-H5227)、食蟹獼猴c-Met ECD (SiNo. Biological, 90304-C08H)、人類EGFR ECD鏈黴素(ACROBiosystems, EGR-H5285)及食蟹獼猴EGFR ECD (SiNo. Biological, 90285-C08B)。
首先，為了捕獲抗c-Met抗體及雙特異性抗體，以10000 RU之水準將Fc特異性抗人類IgG抗體(SouthernBiotech, 2047-01)固定至CM5感測器晶片。將抗體以1-2 µg/ml之濃度稀釋於HBS-EP緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA及0.005% (v/v)界面活性劑P20)中，其後將所得抗體以30 μℓ/min之流動速率注入具有固定至其之抗人類Ig Fc的CM5晶片中持續10-120秒，且隨後在150-200 RU之範圍內捕獲。在以10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125及0.15625 nM稀釋之後使用各抗原，其後將所得抗原自較低濃度依序注入。隨後，將所得抗原以30 μℓ/min之流動速率注入持續5分鐘以進行結合，其後將操作緩衝液注入其中持續10-15分鐘以進行解離。將15 μℓ之10 mM甘胺酸-HCl (pH 1.5)用於複生晶片。藉由使用「1:1朗繆爾結合」模型在BIAevaluation軟體版本4.1中評估各循環之結合及解離速度，且biacore資料概述於表22及23中。 [表22] 量測與c-Met ECD之親和力
Figure 107118588-A0304-0031
 [表23] 量測與EGFR ECD之親和力
Figure 107118588-A0304-0032
該等資料用於證明hu8C4、本發明之hu8C4 ×維必施scFv雙特異性抗體以極佳親和力與人類及食蟹獼猴之c-Met ECD結合。
實例 9 . 在各種動物物種之間量測與 c - Met ECD 、 EGFR ECD 之 c - Met 抗體結合力 ( ELISA ) 藉由使用ELISA在小鼠、食蟹獼猴與人類之間量測c-Met抗體及雙特異性抗體與c-Met ECD及EGFR ECD之結合。
特定言之，小鼠c-Met (SiNo. Biological Inc, 50622-M08H)、食蟹獼猴c-Met (SiNo. Biological Inc, 90304-C08H)、人類c-Met (R&D Systems, 358-MT)、小鼠EGFR (SiNo. Biological Inc, 51091-M08H)、食蟹獼猴EGFR (SiNo. Biological, 90285-C08B)及人類EGFR (Abcam, 155639)抗原均以2 μg/ml之濃度分成96孔盤，其後所得培養盤在4℃下反應隔夜。在於室溫下阻斷1小時之後，將hu8C4 ×維必施scFv雙特異性抗體以1/5之比率自100 nM依序稀釋以在7個濃度區段(亦即，100 nM、20 nM、4 nM、800 pM、160 pM、32 pM及6.4 pM)中量測其結合力。
在於室溫下結合hu8C4 ×維必施scFv雙特異性抗體持續1小時之後，將抗人類IgG、F(ab')2 片段特異性HRP共軛之抗體(Jackson Immunoresearch, 109-035-097)以1:2500之比率稀釋，其後所得抗體在室溫下反應1小時。藉由使用TMB (Sigma, T4444)溶液進行顯色，其中在450 nm之光學密度下量測其值且其ELISA結果顯示於圖9中。
結果，鑑定出hu8C4單特異性抗體及hu8C4 ×維必施scFv雙特異性抗體不與小鼠c-Met及小鼠EGFR結合，但與猴及人類的c-Met及EGFR結合。此外，鑑定出用作陰性對照組之人類IgG抗體完全不結合。以上結果表明本發明之c-Met抗體僅對人類及猴的c-Met及EGFR具特異性。
實例 10 . c - Met 抗體與各種受體在細胞表面上之交叉反應性 特異性結合至根據本發明之c-Met之hu8C4抗體的特異性以及其與其他受體酪胺酸激酶抗原之交叉反應性藉由間接ELISA方法分析，且5個抗原FGF R3、VEGFR R2、IGF IR、PDGF R及RON自關鍵受體酪胺酸激酶中選出以進行分析。
在此實例中，將人類c-Met Fc嵌合體(R&D systems, 358-MT_CF)、人類FGF R3 (IIIc) Fc嵌合體(R&D systems, 766-FR)、人類IGF-I R (R&D systems, 391-GR-050)、人類PDGF Rβ Fc嵌合體(R&D systems, 385-PR_CF)、人類VEGF R2 Fc嵌合體(R&D systems, 357-KD_CF)及人類MSP R/Ron (R&D systems, 1947-MS-050)用作抗原。
將各抗原以1 μg/ml之濃度稀釋於0.05 M碳酸鹽-碳酸氫鹽(Sigma, C3041)緩衝液中，其後將所得抗原添加至96孔盤(Corning, #2592)之各孔中，以使得所得培養盤在4℃下塗覆隔夜。用TBS-T洗滌培養盤一次，其後將含有4%脫脂牛奶之TBS-T添加200 μℓ至所得培養盤之各孔中以便抑制非特異性結合，以使得所得培養盤在37℃下反應1小時。隨後，用TBS-T緩衝液洗滌培養盤一次，其後將一級抗體自30 nM之最高濃度至0.002 nM依序稀釋於含有2%脫脂牛奶之TBS-T緩衝液中，以使得將所得抗體添加100 μℓ至各孔中，從而在37℃下反應2小時。在用TBS-T緩衝液洗滌三次之後，將抗人類κ輕鏈-過氧化酶(Sigma, A7164)以1:5000之比率稀釋為二級抗體，其後將所得抗體添加100 μℓ至各孔中，從而在37℃下反應1小時。隨後，在用TBS-T緩衝液洗滌三次之後，將TMB溶液(Sigma, T4444)添加100 μℓ至各孔中以進行顯色反應，其後將2 N硫酸銨溶液添加50 μℓ至各孔中以停止反應。基於在450 nm波長下之值藉由使用微量培養盤讀數器量測光學密度，且使用570 nm之參考波長。抗c-Met抗體與各抗原之結合程度與光學密度信號值成比例，其中其結果展示於表24中。 [表24] 抗c-Met抗體hu8C4與各種抗原之結合特異性
Figure 107118588-A0304-0033
如表24中所見，本發明之hu8C4抗體較佳地與c-Met結合，且鑑定出其確實幾乎不與其他抗原FGF R3、VEGFR R2、IGF IR、PDGF R及RON結合。
實例 11 . c - Met 抗體之活體外內化活性及雙特異性抗體之 c - Met 含量 抑制活性 鑑定出本發明之c-Met抗體在腫瘤細胞中具有活體外內化活性以及對藉由能夠同時結合至c-Met及EGFR之雙特異性抗體降低受體含量之效果。
首先，藉由正常受體之生理學活性進行抗體內化，其中，在結合至特異性配位體時，在細胞外部表現正常之受體經由均二聚或異二聚變得活化且引起受體介導之內飲作用。對細胞之受體具有特異性的抗體具有誘發此類現象之能力且藉由引起內飲作用而內化至細胞中，因此誘發受體之分解，降低其表現程度，且可能藉由特定受體抑制信號轉導。在細胞外部結合之抗體之量可藉由使用螢光活化細胞分選(FACS)裝置偵測，由此發現在細胞內部內化之抗體量。在藉由使用具有FITC之結合至抗人類κ合LC之抗體作為二級抗體來結合抗體以用於待量測抗體之輕鏈的情況下，有可能定量量測並未內化但仍與細胞外部的靶標受體結合之抗體量，由此相應地鑑定內化抗體之量。有可能藉由在藉由使用對抗原不具特異性之人類IgG抗體之測試中所使用之抗體之非特異性結合量測背景信號，由此藉由實際特異性結合量測螢光信號。
在此實例中，MKN45細胞株(#JCRB0254) (一種胃癌細胞株)用於鑑定腫瘤細胞內部之c-Met抗體之活體外內化活性。MKN45藉由擴增MET基因以高水準表現c-Met受體，以使得c-Met受體之磷酸化以HGF非依賴性方式誘發。如下進行測試以查看c-Met受體是否藉由抗c-Met抗體hu8C4內化至細胞中，由此降低表現量。
首先，MKN45胃癌細胞株以5.0 × 105 分配至含有RPMI-1640介質(2 ml)之6孔盤之各孔中，該介質含有10% (v/v) FBS，其後將培養盤在37℃、RH 95%及5% CO2 條件下培養24小時。將待分析之抗c-Met抗體以及抗IgG抗體(對照組)稀釋以達至100 nM之最終濃度，其後所得抗體反應隔夜。待用作非內化對照組之培養盤係經抗c-Met抗體及人類IgG抗體處理(對照組)，其後所得培養盤在4℃下反應1小時。隨後，用1 ml無酶細胞解離緩衝液(Gibco, #13151)收集各孔之細胞，其後用冷PBS洗滌所收集細胞兩次。作為二級抗體，抗人類κ級LC-FITC (LSBio #LS-C60539)以1:2000之比率稀釋，其後將所得抗體添加至其中，由此在4℃下反應1小時。隨後，用PBS洗滌細胞兩次，其後將所得細胞用100 μℓ BD Cytofix (BD, #554655)固定並用PBS洗滌一次，以使得藉由使用BD FACS Canto II薄壁組織細胞分析儀來量測FITC幾何平均(MFI)值(螢光染色程度)。在細胞外部結合之抗體之量藉由以下公式獲得，其中其結果展示於表25中。表面結合 之 Ab (%) = [( MFI [ 37 ℃ exp.] -MFI [ IgG 對照 ] )/( MFI [ 4 ℃ 對照 ] - MFI [ IgG 對照 ] )] × 100 [表25] 量測hu8C4及OA-5D5對照抗體至MKN45胃癌細胞株中之內化
Figure 107118588-A0304-0034
如以上表25中所見，可展示OA-5D5 (一種用作對照組之抗c-Met抗體)幾乎不內化至細胞中，而本發明之hu8C4抗體內化約40%或更高至MKN45胃癌細胞株中之細胞中。亦即，展示hu8C4抗體顯著降低c-Met受體之表現量。
隨後，進行用於量測NCI-H820肺癌細胞株上之受體含量的測試以便鑑定藉由能夠同時與c-Met受體及EGFR受體結合之雙特異性抗體降低受體含量之效果。NCI-H820細胞株為適用於量測藉由抗c-Met × EGFR雙特異性抗體降低受體含量之效果的細胞株，此係由於c-Met受體以約83,000 SABC (特異性抗體結合力)之水準表現且EGFR受體以約74,000 SABC之水準表現。
首先，NCI-H820細胞株以1.0 × 105 分配至具有RPMI-1640介質(2 ml)之6孔盤之各孔中，該介質含有10% (v/v) FBS，其後將所得培養盤在37℃、RH 95%及5% CO2 條件下培養24小時。隨後，其用無血清介質替換，其後所得培養盤在37℃、RH 95%及5% CO2 條件下培養24小時。隨後，將待分析之抗c-Met抗體、抗c-Met × EGFR雙特異性抗體、作為對照組之抗EGFR抗體及人類IgG抗體在含有2% FBS的介質中稀釋及處理以達至10 nM之最終濃度，其後將所得抗體培養5天。此後，用1 ml無酶細胞解離緩衝液收集各孔之細胞，其後用冷PBS洗滌所收集細胞兩次。隨後，將山羊F(ab`)2 抗小鼠IgG CSF (R&D Systems Cat.#F0103B)添加10 μℓ至各孔中作為二級抗體，由此在4℃下反應1小時。隨後，用PBS洗滌細胞兩次，其後將所得細胞用100 μℓ BD Cytofix (BD, #554655)固定並用PBS洗滌一次，以使得藉由使用BD FACS Canto II薄壁組織細胞分析儀來量測FITC幾何平均(MFI)值(螢光染色程度)。
結果，當處理抗c-Met抗體hu8C4時，EGFR受體幾乎不降低，但c-Met受體顯著降低至2%之水準(圖10)。此外，抗EGFR抗體維必施將EGFR受體降低至約83%之水準，但c-Met受體幾乎不降低。相比之下，在處理同時結合至c-Met及EGFR受體之本發明之hu8C4 ×維必施雙特異性抗體的情況下，鑑定出EGFR受體降低至約21%之水準且c-Met受體相應地降低至約4%之水準。
因此，鑑定出本發明之hu8C4 ×維必施雙特異性抗體同時顯著地降低c-Met及EGFR受體之表現量。
實例 12 . 鑑定雙特異性抗體之 c - Met 及 EGFR 活體外信號抑制活性 隨後，使用NCI-H820細胞株進行實驗以鑑定本發明之雙特異性抗體對抗原及信號轉導材料之活性的效果。
首先，將NCI-H820細胞株以每孔5 × 105 個細胞之濃度分配至6孔盤中，其後所得培養盤在37℃、5% CO2 條件下培養隔夜，以使得其用無血清介質替換且再次培養隔夜。將抗體在無血清介質中稀釋及處理成100 nM之濃度，其後所得抗體反應24小時，以使得在收集細胞之前15分鐘將HGF (Gibco, PHG0254)及EGF (R&D Systems, 236-EG-200)分別處理成50 ng/ml及10 ng/ml之濃度。隨後，將細胞溶解於溶解緩衝液中以進行細胞收集，其後藉由使用勞立檢定法(Lowry assay method)將蛋白濃度定量。將20 μg蛋白裝載至各孔上且在SDS-PAGE中操作，其後在硝化纖維素膜中執行墨點法。在阻斷膜之後，將所有一級抗體以1:1,000之比率稀釋及反應，其後HRP結合抗兔抗體以1:5,000之比率稀釋且作為二級細胞進行反應。隨後，吸收至膜上之抗體與增強之化學螢光(ECL)反應，其後所得抗體藉由使用LC-3000裝置來量測。
結果，如圖11中所見，當處理hu8C4 ×維必施scFv雙特異性抗體時，EGFR磷酸化、Erk磷酸化及Akt磷酸化比單獨處理hu8C4或維必施抗體顯著降低。
因此，本發明之hu8C4 ×維必施scFv雙特異性抗體可降低諸如EGFR、Erk、Akt等受體之活性且減少NCI-H820細胞株中之下游信號轉導物質。結果，展示本發明抗體顯示出經由信號轉導抑制之療效。
實例 13 . 鑑定 U - 87 MG 異種移植小鼠模型中之腫瘤細胞增殖抑制活性 藉由使用hu8C4 IgG2 ×維必施scFv代表性地進行實驗以便藉由本發明之雙特異性抗體鑑定HGF依賴性U-87 MG細胞異種移植模型中之腫瘤細胞增殖抑制活性。
首先，人類神經膠母細胞瘤U-87 MG細胞株藉由使用含有L-麩醯胺酸(300 mg/ℓ)、25 mM HEPES、25 mM NaHCO3 、10%熱滅活FBS及類似者之EMEM (ATCC® 30-2003™)介質在37℃、5% CO2 條件下培養。隨後，將U-87 MG細胞以每小鼠1 ×107 個細胞之濃度皮下接種200 μℓ至6至8週齡雄性無胸腺裸鼠(Harlan)之側腹中。在鑑定出在接種後25天內形成之腫瘤體積達至60-130 mm3 之後，進行分組，其後將測試材料腹膜內投與一週一次持續4週(總共5次：0、7、14、21及28天)。測試材料以5 mg/kg投與，且腫瘤體積及小鼠重量一週量測兩次。對於資料，賦形劑對照組與測試材料投與組之間的比較通常藉由使用史都登式(Student) t測試來驗證，且所用統計方法為Origin Pro 8.5程式。「最大抑制%」指示與溶劑處理對照組相比之腫瘤生長的抑制%。
結果，用3.5 mg/kg及6.8 mg/kg之hu8C4 IgG2 ×維必施scFv投與之組與溶劑對照組相比腫瘤體積之最大抑制為96%，且用1.5 mg/kg之該scFv投與的組最大抑制為80%，因此自投與後第7天直至測試最後一天腫瘤體積降低至顯著水準(p ＜ 0.01) (圖12)。此外，當與作為陽性對照組之BsAB-01相比時，本發明之雙特異性抗體將腫瘤生長降低至顯著水準(p ＜ 0.01)。
因此，自以上結果鑑定出本發明之雙特異性抗體顯著減小腫瘤生長，因此具有極佳的抗腫瘤療效。
實例 14 . 鑑定 NCI - H820 異種移植小鼠模型中之腫瘤細胞增殖抑制活性 NCI-H820細胞株(一種具有突變為甲硫胺酸(M)之EGFR胺基酸第790號之蘇胺酸(T)及經擴增MET基因的細胞株)已知為AZD9291 (奧希替尼，泰格莎) (其為第三代EGFR TKI)之抗性細胞株(Darren A. E. Cross,等人, Cancer Discov. 4(9): 1046-1061 (2014))。藉由代表性地使用出自本發明之雙特異性抗體之hu8C4 ×維必施scFv在NCI-H820異種移植小鼠模型中進行評估，以便查看在對此類EGFR TKI具有抗性之NCI-H820細胞株中雙特異性抗體之腫瘤細胞增殖抑制活性。
特定言之，用於此實例中之小鼠為6週齡雄性小鼠(Jackson Laboratory， STOCK Hgftm1.1 (HGF) Aveo Prkdcscid/J)，其中小鼠HGF基因自其中移除並轉換為表現人類HGF基因。將NCI-H820 (ATCC, #HTB-181)細胞株嵌入燒瓶中以供用於與含有10% FBS之RPMI1640介質一起進行細胞培養，其後將所得燒瓶在37℃、5% CO2 條件下培養。隨後，用PBS洗滌所得細胞且將2.5%胰蛋白酶-EDTA (Gibco, 15090)稀釋10倍，其後將其添加至細胞中以分離細胞。此後，進行離心(1,000 rpm，5 min)以在新介質中除去上澄液並得到細胞懸浮液。隨後，由顯微鏡鑑定出細胞存活率，其後將所得細胞在無血清介質中稀釋成5.0 × 107 個細胞/毫升之濃度，從而製備細胞株。將所製備細胞株以0.1毫升/頭之量皮下投與至小鼠中。投與之後，當具有移植至其中之細胞株之區域中的腫瘤尺寸達至約100-150 mm3 時，分散細胞株以使得各組之腫瘤尺寸可根據順位腫瘤尺寸均勻地散佈。隨後，自開始細胞投與後第7天直至分組之日後第28天(開始投與測試材料之日)及停止投與測試材料之後一週兩次鑑定瘤形成，其後藉由測徑規量測腫瘤之長軸及短軸，從而計算腫瘤尺寸(ab2 /2 (a：長軸長度，b：短軸長度))。藉由Prism 5.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)進行統計分析。若p值小於0.05，則將其判定為統計學上顯著的。
結果，在自開始投與測試材料後第4天直至第28天用hu8C4 ×維必施scFv投與之所有組中，顯示腫瘤增殖抑制活性明顯高於溶劑對照組(p ＜ 0.001)，且亦鑑定出腫瘤抑制比率共計為最大100% (圖13)。在另一方面，用作陽性對照組之AZD9291 (Selleckchem)未顯示與溶劑對照組之顯著差異。
實例 15 . 藉由 5G3 c - Met 抗體與 HER2 抗體之組合投與鑑定活體外腫瘤細胞增殖抑制活性 藉由NCI-H2170細胞株進行對細胞增殖抑制活性之活體外測試，以便根據本發明之抗c-Met抗體5G3與抗HER2抗體之組合評估腫瘤細胞增殖抑制活性。NCI-H2170細胞株(ATCC #CRL-5928)為非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤細胞株，其中，作為量測其受體含量之結果，EGFR以約2,700特異性抗體結合力(SABC)之水準表現，而c-Met以約11,000 SABC之水準表現。
特定言之，將NCI-H2170細胞稀釋於含有10% (v/v) FBS之RPMI-1640培養基中，其後將所得細胞以每孔3.0 × 103 個細胞之濃度添加100 μℓ至培養盤中，以使得所得培養盤在37℃、95% RH及5% (v/v) CO2 條件下培養18-24小時。隨後，各孔之細胞培養基自其中移除，其後將含有2% (v/v) FBS之RPMI-1640介質添加100 μℓ至各孔中。此後，在2×最終濃度(100 nM)下製備之抗體以1/10之比率連續稀釋，以使得針對各抗體將所得抗體以六種濃度(亦即，200 nM、20 nM、2 nM、200 pM、20 pM及2 pM)添加100 μℓ至各孔中。培養盤在37℃、95% RH及5% (v/v) CO2 條件下培養5天，其後在最後一天將20 μℓ WST-8溶液(CCK-8, Dojindo)添加至各孔中以進行顯色持續1-2小時，以使得光學密度在450 nm之波長下藉由微量培養盤讀數器量測。
細胞增殖抑制活性之結果展示於表26及圖14中。 [表26] 由抗c-Met抗體及抗HER2抗體之組合療法產生的活體外腫瘤細胞增殖抑制活性
Figure 107118588-A0304-0035
如表26中所見，鑑定出5G3抗體與作為抗HER2抗體之A091抗體之組合治療(韓國專利註冊號10-1515535)具有比NCI-H2170腫瘤細胞株中之各抗體的單一治療更佳的腫瘤細胞增殖抑制能力。
實例 16 . 藉由在呈人類肺癌細胞株形式之 NCI - H2170 異種移植小鼠模型中之 5G3 c - Met 抗體及 HER2 抗體之組合投與鑑定活體內腫瘤細胞增殖抑制活性 對呈肺癌細胞株形式之NCI-H2170異種移植小鼠模型進行抗癌活性實驗，以便查看HER2抗體及c-Met抗體之組合療效。
特定言之，在此實例中，小鼠之腫瘤尺寸用與實例14中所示相同的方法藉由使用與以上實例13中所示相同的小鼠來量測。藉由呈肺腫瘤細胞形式之NCI-H2170異種移植小鼠模型中的A091及5G3之組合評估抗腫瘤療效之結果展示於圖15中。
結果，在執行僅A091單投與或A091與5G3之組合投與的情況下，腫瘤體積與溶劑對照組相比自投與後第14天降低至顯著水準(p ＜ 0.05)。此外，用A091與5G3之組合投與之組與僅用A091投與的組或用BsAB02 (US2010/0254988A1)作為對照雙特異性抗體投與之組相比顯示腫瘤體積之顯著降低(p ＜ 0.01)。
實例 17 . 鑑定 NCI - H596 異種移植小鼠模型中之腫瘤細胞增殖抑制活性 由於NCI-H596細胞株為在c-Met之外顯子14中具有突變之肺癌細胞株，因此對NCI-H596異種移植小鼠模型進行評估，以便鑑定hu8C4 ×維必施scFv之抗癌效果。
在此實例中，小鼠之腫瘤尺寸藉由使用與以上實例14中所示相同的小鼠及相同的方法來量測。
評估在呈肺腫瘤細胞形式之NCI-H596異種移植模型中投與hu8C4 ×維必施scFv一週一次或兩次總共4週之後的抗癌療效之結果展示於圖16中。
作為量測腫瘤尺寸之結果，用hu8C4 ×維必施scFv 10 mg/kg投與一週兩次之組的腫瘤尺寸水準自開始投與測試材料後第11天直至實驗結束與對照組相比顯示統計學上顯著之差異，且用hu8C4 ×維必施scFv 5 mg/kg投與一週兩次之組及用hu8C4 ×維必施scFv 10 mg/kg投與一週一次之組中的腫瘤尺寸水準自開始投與測試材料後第18天與對照組相比亦明顯較低。此外，用測試材料投與之組的腫瘤尺寸水準傾向於根據測試材料劑量以劑量相關方式變化，且測試組之腫瘤尺寸與對照組相比甚至在投與測試材料之最後一天(第28天)後亦較低。
實例 18 . 鑑定 EBC - 1 異種移植小鼠模型中之腫瘤細胞增殖抑制活性 由於EBC-1為具有c-Met基因擴增之肺癌細胞株，因此對EBC-1異種移植小鼠模型進行評估，以便鑑定hu8C4 ×維必施scFv之抗癌效果。
用於此實例中之小鼠為六週齡雌性無胸腺裸鼠(Harlan)。將EBC-1 (JCRB, #JCRB0820)細胞株嵌入燒瓶中以供用於與含有10% FBS之EMEM介質一起進行細胞培養，其後所得細胞株在37℃、5% CO2 條件下培養。以使得將所得細胞株在無血清介質中稀釋成5.0 × 107 個細胞/毫升之濃度的方式製備細胞株，其後將細胞株以0.1毫升/頭之量皮下投與至小鼠中。當具有移植至其中之細胞株之區域中的腫瘤尺寸達至約100-150 mm3 時，投與hu8C4 ×維必施scFv一週一次或兩次總共4週，其後小鼠之腫瘤尺寸藉由與實例14中所示相同的方法來量測。
評估呈肺癌細胞形式之EBC-1異種移植模型中hu8C4 ×維必施scFv之抗癌療效之結果展示於圖17中。
作為量測腫瘤尺寸之結果，用hu8C4 ×維必施scFv 10 mg/kg投與一週兩次之組的腫瘤尺寸水準自開始投與測試材料後第7天直至開始投與測試材料後第56天與對照組相比顯示統計學上顯著之差異。用hu8C4 ×維必施scFv 5 mg/kg投與一週兩次之組及用其投與一週一次之組自開始投與測試材料後第18天與對照組相比顯示顯著較低水準。此外，用測試材料投與之組的腫瘤尺寸水準傾向於根據測試材料劑量以劑量相關方式變化，且在投與測試材料最後一天(第28天)在觀察期期間用hu8C4 ×維必施scFv 10 mg/kg投與一週兩次之組的腫瘤尺寸水準與對照組相比直至開始投與測試材料後第56天為止顯著較低。特定言之，發現用hu8C4 ×維必施scFv 10 mg/kg投與一週兩次之組中的一個個體在開始投與測試材料後第18天具有完全反應。
實例 19 . 藉由雙特異性抗體減少癌細胞表面上之 c - Met 及 EGFR 之效果 鑑定藉由本發明之雙特異性抗體(hu8C4 ×維必施scFv)減少活體外腫瘤細胞表面上之c-Met及EGFR的效果，且將其與本發明之c-Met抗體(hu8C4)、維必施、c-Met/EGFR組合及其他抗體之效果進行比較。
通常位於細胞膜上之受體在與抗體結合時內化至細胞中，因此其位於細胞膜上之量減少。此類細胞膜上之受體的減少造成受體活化之抑制及其下游信號藉由配位體結合減弱。
在此實例中，使用肺腺癌細胞株HCC827觀測細胞膜上c-Met及EGFR之減少。HCC827具有EGFR E746-A750缺失突變且過度表現c-Met。HCC827用本發明之雙特異性抗體(hu8C4 ×維必施scFv)及其他抗體處理，其後藉由對c-Met及EGFR具有特異性之抗體進行免疫螢光染色，以使得用螢光活化細胞分選儀分析所得細胞株，從而量測細胞表面上之c-Met及EGFR之量。詳細方法如下。
首先，將HCC827細胞(ATCC® CRL-2868™)以3.0 × 105 分配至含有RPMI-1640介質(2 ml)之6孔盤之各孔中，該介質含有10% (v/v) FBS，其後培養盤在37℃、RH 95%及5% CO2 條件下培養24小時。將本發明之雙特異性抗體(hu8C4 × 維必施scFv)、本發明之c-Met抗體(hu8C4)、維必施、本發明之c-Met抗體(hu8C4)與維必施之混合物、C-EM1及LA480稀釋達至100 nM之最終濃度，其後將所得抗體處理且反應18小時。作為待用作具有c-Met及EGFR之非降低對照組的培養盤，將人類IgG抗體處理且反應18小時。隨後，藉由500μℓ 無酶細胞解離緩衝液(Gibco, #13151)收集各孔之細胞，其後細胞藉由離心分離器與無酶細胞解離緩衝液分離，以使得自其中移除無酶細胞解離緩衝液。對於免疫螢光染色，山羊衍生之c-Met抗體(R&D systems, AF276)、山羊衍生之EGFR抗體(R&D systems, AF231)或用於量測染色量之山羊衍生之非特異性抗體分別以2 μg與200 μℓ含有2% (v/v) FBS的冷PBS混合，其後將所得抗體處理至各孔中，以使得所得培養盤在4℃下反應1小時。隨後，將所得培養盤用含有2% (v/v) FBS之冷PBS洗滌兩次。ALEXA488結合為二級抗體，其後將與山羊抗體結合之1 μℓ驢衍生之抗體(Thermo Fisher, A-11055)用200 μℓ含有2% (v/v) FBS之冷PBS稀釋，以使用所得抗體。在與二級抗體在4℃下反應1小時之後，將所得細胞用含有2% (v/v) FBS之冷PBS洗滌兩次，其後藉由使用200 μℓ BD Cytofix (BD, #554655)固定所得細胞。在用PBS洗滌一次之後，ALEXA488幾何平均(MFI)值(螢光染色程度)藉由使用BD FACS Canto II螢光活化細胞分選儀來量測。位於細胞膜上之c-Met及EGFR之量藉由以下公式表示為幾何平均螢光強度(MFI)。關於反覆進行測試三次之後所獲得之值，其平均值及標準差展示於表27及圖18及19中。c - Met 或 EGFR 表面量 = 幾何 MFI[ 實驗組 ] - 幾何 MFI[ 山羊衍生之非特異性抗體 ] [表27] 在用雙特異性抗體(hu8C4 ×維必施scFv)等處理HCC827細胞株之後所量測的細胞表面上之c-Met及EGFR之量
Figure 107118588-A0304-0036
如以上表27中所見，與c-Met結合之所有抗體均使細胞表面上之c-Met減少40~70%，而與EGFR結合之抗體顯示減少10-15%之不顯著效果。進一步考慮到減少c-Met之效果，hu8C4、hu8C4 +維必施之組合、C-EM1及C-LA480使細胞表面上之c-Met減少約40%左右，而hu8C4 ×維必施scFv使細胞表面上之c-Met減少70%，由此顯示比其他抗體及抗體組合更佳的減少細胞表面上之c-Met之效果。
以上結果展示本發明之雙特異性抗體(hu8C4 ×維必施scFv)顯著減少細胞表面上之c-Met之量。
實例 20 . 抗原決定基定位 為了找出本發明之雙特異性抗體(hu8C4 ×維必施scFv)在人類c-Met抗原上之抗原決定基，將其分析委託給五松醫療創新基金會(Osong Medical Innovation Foundation) (KBIO，Korea)之分子模型設計支持小組。該分析藉由氫-氘交換質譜法(HDX-MS)進行。
c-Met sema結構域由兩條α/β鏈組成，由此鑑定兩條鏈各自的覆蓋度。由於樣本中存在多個二硫鍵，肽覆蓋度藉由調整淬滅保持時間、TCEP濃度、胃蛋白酶濃度等來優化。最終，在100 mM K.磷酸鹽、125 mM TCEP、0.5 M胍-HCl及pH 2.66之淬滅緩衝液條件下進行實驗。
分別以3.3 mg/ml及65 mg/ml之濃度製備抗原及抗體，且將37 pmol cMET抗原及36 pmol抗體在實驗前3小時結合。氘標記緩衝液反應0、0.33、10、60及240分鐘。用淬滅緩衝液根據各標記時間停止標記並進行渦旋，其後緊接著將其冷凍於液氮中，從而在分析之前儲存在-80℃下。將所得抗原及抗體載入胃蛋白酶管柱上且用質譜儀(MS)分析。
作為分析結果，鑑定出本發明之雙特異性抗體(hu8C4 ×維必施scFv)結合至人類c-Met sema結構域β鏈之4個區Y321-L329 (SEQ. No. 331)、I333-I341 (SEQ. No. 332)、P366-D372 (SEQ. No. 333)及Q464-S474 (SEQ. No. 334)中的3維形式之抗原決定基(表28)。藉由使用PyMOL程式對人類c-Met抗原(PDB編號4K3J)之三級結構進行標記，其中其結果展示於圖20中。 [表28] 抗原決定基區之胺基酸序列
Figure 107118588-A0304-0037
自以上結果可看出，特異性結合至c-Met之小鼠抗體、人類化抗體、本發明之親和力經優化抗體或其抗原結合片段選擇性地對c-Met起作用，其中該等抗體甚至以其極少量展示極佳的癌細胞增殖抑制活性以及顯著極佳第抗癌活性，由此有效地預防或治療癌症。
當本發明之特定部分已在上文詳細地描述時，熟習此項技術者顯而易知闡述此類詳細描述僅為說明例示性實施例，但並不解釋為限制本發明之範疇。因此，應理解，本發明之大致範疇由所附申請專利範圍及其等效物界定。
圖1展示對本發明之融合瘤c-Met抗體之腫瘤細胞增殖抑制活性的活體外測試之結果。 圖2展示用於表現scFv呈現之獨立轉錄組之載體的示意圖。 圖3展示藉由本發明之hu8C4親和力經優化抗體分析腫瘤細胞增殖抑制活性之結果。 圖4展示藉由本發明之雙特異性抗體分析腫瘤細胞增殖抑制活性之結果。 圖5展示藉由本發明之雙特異性抗體分析腫瘤細胞增殖抑制活性之結果。 圖6展示比較本發明之雙特異性抗體與以U-87 MG (神經膠母細胞瘤)、NCI-H292 (NSCLC)、NCI-H1648 (NSCLC)及NCI-H596 (NSCLC)細胞株進行之組合療法之間的腫瘤細胞增殖抑制活性之結果。 圖7展示比較本發明之雙特異性抗體與以LS174T (結腸)、BT20 (TNBC)及KP4 (胰臟)細胞株進行之組合療法之間的腫瘤細胞增殖抑制活性之結果。 圖8展示比較本發明之雙特異性抗體與以HCC827 (NSCLC)及NCI-H596 (NSCLC)細胞株進行之組合療法之間的腫瘤細胞增殖抑制活性之結果。 圖9展示藉由ELISA方法量測本發明之抗c-Met抗體及雙特異性抗體對於各種c-Met及EGFR抗原之結合力的結果。 圖10展示在NCI-H820 (NSCLC)細胞株中量測由本發明之雙特異性抗體降低受體含量之效果的結果。 圖11展示在NCI-H820 (NSCLC)細胞株中量測由本發明之抗c-Met抗體及雙特異性抗體抑制c-Met及EGFR磷酸化之結果。 圖12展示在U-87 MG (神經膠母細胞瘤)細胞異種移植模型中量測本發明之雙特異性抗體之抗癌效果的結果。 圖13展示在NCI-H820 (NSCLC)細胞異種移植模型中量測本發明之雙特異性抗體之抗癌效果的結果。 圖14展示分析在NCI-H2170 (NSCLC)細胞株中藉由本發明之抗c-Met抗體及抗HER2抗體以組合療法治療的腫瘤細胞增殖抑制活性之結果。 圖15展示在NCI-H2170 (NSCLC)細胞異種移植模型中量測用本發明之抗c-Met抗體及抗HER2抗體進行之組合療法之抗癌效果的結果。 圖16展示在NCI-H596 (NSCLC)細胞異種移植模型中量測本發明之雙特異性抗體之抗癌效果的結果。 圖17展示在EBC-1 (NSCLC)細胞異種移植模型中量測本發明之雙特異性抗體之抗癌效果的結果。 圖18展示在用雙特異性抗體(hu8C4 ×維必施scFv)等處理HCC827細胞株之後所量測之指示細胞表面上之c-Met量的結果。 圖19展示在用雙特異性抗體(hu8C4 ×維必施scFv)等處理HCC827細胞株之後所量測之指示細胞表面上之EGFR量的結果。 圖20展示在三級結構中藉由氫-氘交換質譜法(HDX-MS)所分析之指示雙特異性抗體之抗原決定基的結果。
<110> 韓商鐘根堂股份有限公司
<120> 新穎抗c-MET抗體及其用途
<150> KR 10-2017-0067106
<151> 2017-05-30
<160> 335
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4輕鏈CDR 1
<400> 1
Figure 107118588-A0305-02-0089-1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4輕鏈CDR 2
<400> 2
Figure 107118588-A0305-02-0089-2
<210> 3
<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4輕鏈CDR 3
<400> 3
Figure 107118588-A0305-02-0089-3
<210> 4
<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤5G3輕鏈CDR 1
<400> 4
Figure 107118588-A0305-02-0089-4
<210> 5
<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤5G3輕鏈CDR 2
<400> 5
Figure 107118588-A0305-02-0090-5
<210> 6
<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤5G3輕鏈CDR 3
<400> 6
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<210> 7
<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4重鏈CDR 1
<400> 7
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<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4重鏈CDR 2
<400> 8
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<210> 9
<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4重鏈CDR 3
<400> 9
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<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤5G3重鏈CDR 1
<400> 10
Figure 107118588-A0305-02-0091-10
<210> 11
<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤5G3重鏈CDR 2
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<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤5G3重鏈CDR 3
<400> 12
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4輕鏈可變區
<400> 13
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Figure 107118588-A0305-02-0092-13
<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤5G3輕鏈可變區
<400> 14
Figure 107118588-A0305-02-0092-14
<210> 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4重鏈可變區
<400> 15
Figure 107118588-A0305-02-0092-15
Figure 107118588-A0305-02-0093-16
<210> 16
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<213> 人工序列
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<223> 融合瘤5G3重鏈可變區
<400> 16
Figure 107118588-A0305-02-0093-17
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4輕鏈可變區
<400> 17
Figure 107118588-A0305-02-0093-18
Figure 107118588-A0305-02-0094-19
<210> 18
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<213> 人工序列
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<223> 融合瘤5G3輕鏈可變區
<400> 18
Figure 107118588-A0305-02-0094-20
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合瘤8C4重鏈可變區
<400> 19
Figure 107118588-A0305-02-0094-21
<210> 20
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 融合瘤5G3重鏈可變區
<400> 20
Figure 107118588-A0305-02-0094-24
Figure 107118588-A0305-02-0095-23
<210> 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4-1輕鏈可變區
<400> 21
Figure 107118588-A0305-02-0095-25
<210> 22
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<213> 人工序列
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<223> hu8C4-2輕鏈可變區
<400> 22
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<210> 23
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<213> 人工序列
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<223> hu8C4-1重鏈可變區
<400> 23
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<210> 24
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4-2重鏈可變區
<400> 24
Figure 107118588-A0305-02-0096-29
Figure 107118588-A0305-02-0097-30
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<213> 人工序列
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<223> hu8C4-1輕鏈可變區
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<213> 人工序列
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<223> hu8C4-2輕鏈可變區
<400> 26
Figure 107118588-A0305-02-0097-32
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<223> hu8C4-1重鏈可變區
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<223> hu8C4-2重鏈可變區
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<213> 人工序列
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<223> hu5G3-1輕鏈可變區
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<210> 30
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<223> hu5G3-2輕鏈可變區
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<213> 人工序列
<220>
<223> hu5G3-1重鏈可變區
<400> 31
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<210> 32
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<213> 人工序列
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<223> hu5G3-2重鏈可變區
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<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> hu5G3-1輕鏈可變區
<400> 33
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<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu5G3-2輕鏈可變區
<400> 34
Figure 107118588-A0305-02-0100-41
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<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu5G3-1重鏈可變區
<400> 35
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<210> 36
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu5G3-2重鏈可變區
<400> 36
Figure 107118588-A0305-02-0101-44
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<213> 人工序列
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<223> IgG1 CH恆定區之鉸鏈
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<210> 38
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<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
<400> 38
Figure 107118588-A0305-02-0102-46
<210> 39
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<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
<400> 39
Figure 107118588-A0305-02-0102-47
<210> 40
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
<400> 40
Figure 107118588-A0305-02-0102-48
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<213> 人工序列
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<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
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<210> 42
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<213> 人工序列
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<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
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<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
<400> 43
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<213> 人工序列
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<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
<400> 44
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<213> 人工序列
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<223> IgG1 CH恆定區之鉸鏈
<400> 45
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<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
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<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
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<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
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<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
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<220>
<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
<400> 50
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<220>
<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
<400> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH鉸鏈之變體
<400> 52
Figure 107118588-A0305-02-0104-60
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 53
Figure 107118588-A0305-02-0105-410
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 54
Figure 107118588-A0305-02-0105-62
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 55
Figure 107118588-A0305-02-0105-63
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 56
Figure 107118588-A0305-02-0105-64
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 57
Figure 107118588-A0305-02-0106-65
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 58
Figure 107118588-A0305-02-0106-66
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 59
Figure 107118588-A0305-02-0106-67
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 60
Figure 107118588-A0305-02-0106-68
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 61
Figure 107118588-A0305-02-0107-69
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 62
Figure 107118588-A0305-02-0107-70
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 63
Figure 107118588-A0305-02-0107-71
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 64
Figure 107118588-A0305-02-0107-72
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 65
Figure 107118588-A0305-02-0107-73
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 66
Figure 107118588-A0305-02-0108-74
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 67
Figure 107118588-A0305-02-0108-75
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 68
Figure 107118588-A0305-02-0108-76
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 69
Figure 107118588-A0305-02-0108-80
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 70
Figure 107118588-A0305-02-0108-79
Figure 107118588-A0305-02-0109-81
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 71
Figure 107118588-A0305-02-0109-82
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 72
Figure 107118588-A0305-02-0109-83
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 73
Figure 107118588-A0305-02-0109-84
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 74
Figure 107118588-A0305-02-0109-85
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 75
Figure 107118588-A0305-02-0110-86
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 76
Figure 107118588-A0305-02-0110-87
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 77
Figure 107118588-A0305-02-0110-88
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 78
Figure 107118588-A0305-02-0110-89
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 79
Figure 107118588-A0305-02-0111-90
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 80
Figure 107118588-A0305-02-0111-91
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 81
Figure 107118588-A0305-02-0111-92
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 82
Figure 107118588-A0305-02-0111-93
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 83
Figure 107118588-A0305-02-0112-94
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 84
Figure 107118588-A0305-02-0112-95
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 85
Figure 107118588-A0305-02-0112-96
<210> 86
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 86
Figure 107118588-A0305-02-0112-97
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 87
Figure 107118588-A0305-02-0113-98
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 88
Figure 107118588-A0305-02-0113-99
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 89
Figure 107118588-A0305-02-0113-100
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 90
Figure 107118588-A0305-02-0113-101
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 91
Figure 107118588-A0305-02-0114-102
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 92
Figure 107118588-A0305-02-0114-103
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 93
Figure 107118588-A0305-02-0114-104
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 94
Figure 107118588-A0305-02-0114-105
<210> 95
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 95
Figure 107118588-A0305-02-0115-106
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 96
Figure 107118588-A0305-02-0115-411
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 97
Figure 107118588-A0305-02-0115-108
<210> 98
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 98
Figure 107118588-A0305-02-0115-109
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 99
Figure 107118588-A0305-02-0116-110
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 100
Figure 107118588-A0305-02-0116-111
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 101
Figure 107118588-A0305-02-0116-112
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 102
Figure 107118588-A0305-02-0116-113
<210> 103
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 103
Figure 107118588-A0305-02-0117-114
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 104
Figure 107118588-A0305-02-0117-115
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 105
Figure 107118588-A0305-02-0117-116
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 106
Figure 107118588-A0305-02-0117-117
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 107
Figure 107118588-A0305-02-0118-118
<210> 108
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR1
<400> 108
Figure 107118588-A0305-02-0118-119
<210> 109
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR1
<400> 109
Figure 107118588-A0305-02-0118-120
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR1
<400> 110
Figure 107118588-A0305-02-0118-121
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR1
<400> 111
Figure 107118588-A0305-02-0119-123
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR1
<400> 112
Figure 107118588-A0305-02-0119-124
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 113
Figure 107118588-A0305-02-0119-125
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 114
Figure 107118588-A0305-02-0119-126
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 115
Figure 107118588-A0305-02-0119-127
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 116
Figure 107118588-A0305-02-0120-128
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR3
<400> 117
Figure 107118588-A0305-02-0120-129
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 118
Figure 107118588-A0305-02-0120-130
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 119
Figure 107118588-A0305-02-0120-131
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 120
Figure 107118588-A0305-02-0120-132
Figure 107118588-A0305-02-0121-133
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 121
Figure 107118588-A0305-02-0121-134
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 122
Figure 107118588-A0305-02-0121-135
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 123
Figure 107118588-A0305-02-0121-136
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 124
Figure 107118588-A0305-02-0121-137
Figure 107118588-A0305-02-0122-138
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 125
Figure 107118588-A0305-02-0122-139
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 126
Figure 107118588-A0305-02-0122-140
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 127
Figure 107118588-A0305-02-0122-141
<210> 128
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 128
Figure 107118588-A0305-02-0122-142
Figure 107118588-A0305-02-0123-143
<210> 129
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 129
Figure 107118588-A0305-02-0123-144
<210> 130
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 130
Figure 107118588-A0305-02-0123-145
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 131
Figure 107118588-A0305-02-0123-146
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 132
Figure 107118588-A0305-02-0123-147
Figure 107118588-A0305-02-0124-148
<210> 133
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 133
Figure 107118588-A0305-02-0124-149
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 134
Figure 107118588-A0305-02-0124-150
<210> 135
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 135
Figure 107118588-A0305-02-0124-151
<210> 136
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 136
Figure 107118588-A0305-02-0124-152
Figure 107118588-A0305-02-0125-153
<210> 137
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 137
Figure 107118588-A0305-02-0125-154
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 138
Figure 107118588-A0305-02-0125-155
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 139
Figure 107118588-A0305-02-0125-156
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 140
Figure 107118588-A0305-02-0125-157
Figure 107118588-A0305-02-0126-158
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CH CDR2
<400> 141
Figure 107118588-A0305-02-0126-159
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 142
Figure 107118588-A0305-02-0126-160
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 143
Figure 107118588-A0305-02-0126-161
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 144
Figure 107118588-A0305-02-0126-162
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 145
Figure 107118588-A0305-02-0127-163
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 146
Figure 107118588-A0305-02-0127-164
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 147
Figure 107118588-A0305-02-0127-165
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 148
Figure 107118588-A0305-02-0127-166
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 149
Figure 107118588-A0305-02-0127-167
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 150
Figure 107118588-A0305-02-0128-168
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 151
Figure 107118588-A0305-02-0128-169
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 152
Figure 107118588-A0305-02-0128-170
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 153
Figure 107118588-A0305-02-0128-171
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 154
Figure 107118588-A0305-02-0128-172
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 155
Figure 107118588-A0305-02-0129-173
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 156
Figure 107118588-A0305-02-0129-174
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 157
Figure 107118588-A0305-02-0129-175
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 158
Figure 107118588-A0305-02-0129-176
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 159
Figure 107118588-A0305-02-0129-177
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 160
Figure 107118588-A0305-02-0130-178
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 161
Figure 107118588-A0305-02-0130-179
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 162
Figure 107118588-A0305-02-0130-180
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 163
Figure 107118588-A0305-02-0130-181
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 164
Figure 107118588-A0305-02-0130-182
Figure 107118588-A0305-02-0131-183
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 165
Figure 107118588-A0305-02-0131-184
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 166
Figure 107118588-A0305-02-0131-185
<210> 167
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 167
Figure 107118588-A0305-02-0131-186
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 168
Figure 107118588-A0305-02-0131-187
<210> 169
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 169
Figure 107118588-A0305-02-0132-188
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 170
Figure 107118588-A0305-02-0132-189
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 171
Figure 107118588-A0305-02-0132-190
<210> 172
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 172
Figure 107118588-A0305-02-0132-191
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 173
Figure 107118588-A0305-02-0132-192
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 174
Figure 107118588-A0305-02-0133-194
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 175
Figure 107118588-A0305-02-0133-195
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 176
Figure 107118588-A0305-02-0133-196
<210> 177
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 177
Figure 107118588-A0305-02-0133-197
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 178
Figure 107118588-A0305-02-0133-198
<210> 179
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 179
Figure 107118588-A0305-02-0134-199
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 180
Figure 107118588-A0305-02-0134-200
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 181
Figure 107118588-A0305-02-0134-201
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 182
Figure 107118588-A0305-02-0134-202
<210> 183
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 183
Figure 107118588-A0305-02-0134-203
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 184
Figure 107118588-A0305-02-0135-204
<210> 185
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 185
Figure 107118588-A0305-02-0135-205
<210> 186
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 186
Figure 107118588-A0305-02-0135-206
<210> 187
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 187
Figure 107118588-A0305-02-0135-207
<210> 188
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 188
Figure 107118588-A0305-02-0135-208
<210> 189
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 189
Figure 107118588-A0305-02-0136-209
<210> 190
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 190
Figure 107118588-A0305-02-0136-210
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 191
Figure 107118588-A0305-02-0136-211
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 192
Figure 107118588-A0305-02-0136-212
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 193
Figure 107118588-A0305-02-0136-213
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 194
Figure 107118588-A0305-02-0137-214
<210> 195
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 195
Figure 107118588-A0305-02-0137-215
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 196
Figure 107118588-A0305-02-0137-216
<210> 197
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 197
Figure 107118588-A0305-02-0137-217
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 198
Figure 107118588-A0305-02-0137-218
Figure 107118588-A0305-02-0138-219
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 199
Figure 107118588-A0305-02-0138-220
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 200
Figure 107118588-A0305-02-0138-221
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 201
Figure 107118588-A0305-02-0138-222
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 202
Figure 107118588-A0305-02-0138-223
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 203
Figure 107118588-A0305-02-0139-412
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 204
Figure 107118588-A0305-02-0139-225
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<22 >
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 205
Figure 107118588-A0305-02-0139-226
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 206
Figure 107118588-A0305-02-0139-227
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 207
Figure 107118588-A0305-02-0139-228
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 208
Figure 107118588-A0305-02-0140-229
<210> 209
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 209
Figure 107118588-A0305-02-0140-231
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 210
Figure 107118588-A0305-02-0140-232
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 211
Figure 107118588-A0305-02-0140-234
<210> 212
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 212
Figure 107118588-A0305-02-0140-233
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 213
Figure 107118588-A0305-02-0141-235
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 214
Figure 107118588-A0305-02-0141-236
<210> 215
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 215
Figure 107118588-A0305-02-0141-237
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 216
Figure 107118588-A0305-02-0141-238
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 217
Figure 107118588-A0305-02-0141-239
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 218
Figure 107118588-A0305-02-0142-240
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 219
Figure 107118588-A0305-02-0142-241
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 220
Figure 107118588-A0305-02-0142-242
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 221
Figure 107118588-A0305-02-0142-243
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 222
Figure 107118588-A0305-02-0142-244
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 223
Figure 107118588-A0305-02-0143-245
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 224
Figure 107118588-A0305-02-0143-247
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 225
Figure 107118588-A0305-02-0143-248
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 226
Figure 107118588-A0305-02-0143-249
<210> 227
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 227
Figure 107118588-A0305-02-0143-250
<210> 228
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR2
<400> 228
Figure 107118588-A0305-02-0144-251
<210> 229
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 229
Figure 107118588-A0305-02-0144-252
<210> 230
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 230
Figure 107118588-A0305-02-0144-253
<210> 231
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 231
Figure 107118588-A0305-02-0144-254
<210> 232
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 232
Figure 107118588-A0305-02-0144-255
Figure 107118588-A0305-02-0145-256
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 233
Figure 107118588-A0305-02-0145-257
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 234
Figure 107118588-A0305-02-0145-258
<210> 235
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 235
Figure 107118588-A0305-02-0145-259
<210> 236
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 236
Figure 107118588-A0305-02-0145-260
<210> 237
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 237
Figure 107118588-A0305-02-0146-261
<210> 238
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 238
Figure 107118588-A0305-02-0146-262
<210> 239
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 239
Figure 107118588-A0305-02-0146-263
<210> 240
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 240
Figure 107118588-A0305-02-0146-264
<210> 241
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 241
Figure 107118588-A0305-02-0146-265
<210> 242
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 242
Figure 107118588-A0305-02-0147-266
<210> 243
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 243
Figure 107118588-A0305-02-0147-267
<210> 244
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 244
Figure 107118588-A0305-02-0147-268
<210> 245
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 245
Figure 107118588-A0305-02-0147-269
<210> 246
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 246
Figure 107118588-A0305-02-0147-270
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 247
Figure 107118588-A0305-02-0148-271
<210> 248
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 248
Figure 107118588-A0305-02-0148-272
<210> 249
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 249
Figure 107118588-A0305-02-0148-273
<210> 250
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 250
Figure 107118588-A0305-02-0148-274
<210> 251
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 251
Figure 107118588-A0305-02-0148-275
<210> 252
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 252
Figure 107118588-A0305-02-0149-276
<210> 253
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 253
Figure 107118588-A0305-02-0149-277
<210> 254
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 254
Figure 107118588-A0305-02-0149-278
<210> 255
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 255
Figure 107118588-A0305-02-0149-279
<210> 256
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 256
Figure 107118588-A0305-02-0149-280
<210> 257
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 257
Figure 107118588-A0305-02-0150-281
<210> 258
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 258
Figure 107118588-A0305-02-0150-282
<210> 259
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 259
Figure 107118588-A0305-02-0150-283
<210> 260
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 260
Figure 107118588-A0305-02-0150-284
<210> 261
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 261
Figure 107118588-A0305-02-0150-285
<210> 262
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 262
Figure 107118588-A0305-02-0151-286
<210> 263
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 263
Figure 107118588-A0305-02-0151-287
<210> 264
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 264
Figure 107118588-A0305-02-0151-288
<210> 265
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 265
Figure 107118588-A0305-02-0151-289
<210> 266
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 266
Figure 107118588-A0305-02-0151-290
Figure 107118588-A0305-02-0152-291
<210> 267
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 267
Figure 107118588-A0305-02-0152-292
<210> 268
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR1
<400> 268
Figure 107118588-A0305-02-0152-293
<210> 269
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 269
Figure 107118588-A0305-02-0152-294
<210> 270
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 270
Figure 107118588-A0305-02-0152-295
<210> 271
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 271
Figure 107118588-A0305-02-0153-296
<210> 272
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 272
Figure 107118588-A0305-02-0153-297
<210> 273
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 273
Figure 107118588-A0305-02-0153-298
<210> 274
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 274
Figure 107118588-A0305-02-0153-299
<210> 275
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 275
Figure 107118588-A0305-02-0153-300
<210> 276
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 276
Figure 107118588-A0305-02-0154-301
<210> 277
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 277
Figure 107118588-A0305-02-0154-302
<210> 278
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 278
Figure 107118588-A0305-02-0154-304
<210> 279
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 279
Figure 107118588-A0305-02-0154-305
<210> 280
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 280
Figure 107118588-A0305-02-0154-306
<210> 281
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 281
Figure 107118588-A0305-02-0155-307
<210> 282
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 282
Figure 107118588-A0305-02-0155-309
<210> 283
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 283
Figure 107118588-A0305-02-0155-310
<210> 284
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 284
Figure 107118588-A0305-02-0155-311
<210> 285
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 285
Figure 107118588-A0305-02-0155-312
<210> 286
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 286
Figure 107118588-A0305-02-0156-313
<210> 287
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 287
Figure 107118588-A0305-02-0156-314
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 288
Figure 107118588-A0305-02-0156-315
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 289
Figure 107118588-A0305-02-0156-316
<210> 290
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 290
Figure 107118588-A0305-02-0156-317
<210> 291
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 291
Figure 107118588-A0305-02-0157-318
<210> 292
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 292
Figure 107118588-A0305-02-0157-319
<210> 293
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 293
Figure 107118588-A0305-02-0157-320
<210> 294
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 294
Figure 107118588-A0305-02-0157-321
<210> 295
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 295
Figure 107118588-A0305-02-0157-322
<210> 296
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 296
Figure 107118588-A0305-02-0158-323
<210> 297
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 297
Figure 107118588-A0305-02-0158-324
<210> 298
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 298
Figure 107118588-A0305-02-0158-325
<210> 299
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 299
Figure 107118588-A0305-02-0158-328
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 300
Figure 107118588-A0305-02-0158-327
Figure 107118588-A0305-02-0159-329
<210> 301
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 CL CDR3
<400> 301
Figure 107118588-A0305-02-0159-330
<210> 302
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AH71
<400> 302
Figure 107118588-A0305-02-0159-332
<210> 303
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AH72
<400> 303
Figure 107118588-A0305-02-0159-333
Figure 107118588-A0305-02-0160-334
<210> 304
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AH73
<400> 304
Figure 107118588-A0305-02-0160-335
<210> 305
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AH85
<400> 305
Figure 107118588-A0305-02-0160-336
Figure 107118588-A0305-02-0161-337
<210> 306
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AL130
<400> 306
Figure 107118588-A0305-02-0161-338
<210> 307
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AL135
<400> 307
Figure 107118588-A0305-02-0161-339
Figure 107118588-A0305-02-0162-340
<210> 308
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AL165
<400> 308
Figure 107118588-A0305-02-0162-341
<210> 309
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AL166
<400> 309
Figure 107118588-A0305-02-0162-342
Figure 107118588-A0305-02-0163-343
<210> 310
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AL194
<400> 310
Figure 107118588-A0305-02-0163-344
<210> 311
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AL195
<400> 311
Figure 107118588-A0305-02-0163-345
Figure 107118588-A0305-02-0164-346
<210> 312
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 312
Figure 107118588-A0305-02-0164-347
<210> 313
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 爾必得舒(Erbitux)scFv HL
<400> 313
Figure 107118588-A0305-02-0164-348
Figure 107118588-A0305-02-0165-349
<210> 314
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 爾必得舒scFv LH
<400> 314
Figure 107118588-A0305-02-0165-350
Figure 107118588-A0305-02-0166-351
<210> 315
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 維必施(Vectibix)scFv
<400> 315
Figure 107118588-A0305-02-0166-352
<210> 316
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4×爾必得舒scFv HL
<400> 316
Figure 107118588-A0305-02-0167-353
Figure 107118588-A0305-02-0168-354
Figure 107118588-A0305-02-0169-355
<210> 317
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH71×爾必得舒scFv HL
<400> 317
Figure 107118588-A0305-02-0169-356
Figure 107118588-A0305-02-0170-357
Figure 107118588-A0305-02-0171-358
<210> 318
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH72×爾必得舒scFv HL
<400> 318
Figure 107118588-A0305-02-0171-359
Figure 107118588-A0305-02-0172-360
Figure 107118588-A0305-02-0173-361
<210> 319
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH73×爾必得舒scFv HL
<400> 319
Figure 107118588-A0305-02-0173-362
Figure 107118588-A0305-02-0174-363
Figure 107118588-A0305-02-0175-364
<210> 320
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH85×爾必得舒scFv HL
<400> 320
Figure 107118588-A0305-02-0175-365
Figure 107118588-A0305-02-0176-366
Figure 107118588-A0305-02-0177-367
<210> 321
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4×爾必得舒scFv LH
<400> 321
Figure 107118588-A0305-02-0177-368
Figure 107118588-A0305-02-0178-369
Figure 107118588-A0305-02-0179-370
<210> 322
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH71×爾必得舒scFv LH
<400> 322
Figure 107118588-A0305-02-0179-371
Figure 107118588-A0305-02-0180-372
Figure 107118588-A0305-02-0181-373
<210> 323
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH72×爾必得舒scFv LH
<400> 323
Figure 107118588-A0305-02-0181-374
Figure 107118588-A0305-02-0182-375
Figure 107118588-A0305-02-0183-376
<210> 324
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH73×爾必得舒scFv LH
<400> 324
Figure 107118588-A0305-02-0183-377
Figure 107118588-A0305-02-0184-378
Figure 107118588-A0305-02-0185-379
<210> 325
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH85×爾必得舒scFv LH
<400> 325
Figure 107118588-A0305-02-0186-380
Figure 107118588-A0305-02-0187-381
<210> 326
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4×維必施scFv
<400> 326
Figure 107118588-A0305-02-0188-382
Figure 107118588-A0305-02-0189-383
Figure 107118588-A0305-02-0190-384
<210> 327
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH71×維必施scFv
<400> 327
Figure 107118588-A0305-02-0190-385
Figure 107118588-A0305-02-0191-386
Figure 107118588-A0305-02-0192-387
<210> 328
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH72×維必施scFv
<400> 328
Figure 107118588-A0305-02-0192-388
Figure 107118588-A0305-02-0193-389
Figure 107118588-A0305-02-0194-390
<210> 329
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH73×維必施scFv
<400> 329
Figure 107118588-A0305-02-0194-391
Figure 107118588-A0305-02-0195-392
Figure 107118588-A0305-02-0196-393
<210> 330
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu8C4 AH85×維必施scFv
<400> 330
Figure 107118588-A0305-02-0196-394
Figure 107118588-A0305-02-0197-395
Figure 107118588-A0305-02-0198-396
<210> 331
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原決定基區Y321~L329
<400> 331
Figure 107118588-A0305-02-0198-397
<210> 332
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原決定基區I333~I341
<400> 332
Figure 107118588-A0305-02-0198-413
<210> 333
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原決定基區P366~D372
<400> 333
Figure 107118588-A0305-02-0199-399
<210> 334
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原決定基區Q464~S474
<400> 334
Figure 107118588-A0305-02-0199-400
<210> 335
<211> 1390
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> c-Met參考序列
<400> 335
Figure 107118588-A0305-02-0199-401
Figure 107118588-A0305-02-0200-402
Figure 107118588-A0305-02-0201-403
Figure 107118588-A0305-02-0202-404
Figure 107118588-A0305-02-0203-405

Claims (21)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，其特異性地結合至肝細胞生長因子受體(c-Met)，其中該抗體為：(a)包含以下之抗體：輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO：1表示之輕鏈CDR1、由SEQ ID NO：2表示之輕鏈CDR2及由SEQ ID NO：3表示之輕鏈CDR3；及重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO：7表示之重鏈CDR1、由SEQ ID NO：8表示之重鏈CDR2及由SEQ ID NO：9表示之重鏈CDR3；(b)包含以下之抗體：輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO：4表示之輕鏈CDR1、由SEQ ID NO：5表示之輕鏈CDR2及由SEQ ID NO：6表示之輕鏈CDR3；及重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO：10表示之重鏈CDR1、由SEQ ID NO：11表示之重鏈CDR2及由SEQ ID NO：12表示之重鏈CDR3；或(c)其親和力經優化抗體，其中該親和力經優化抗體包含：c-1)由SEQ ID NO：21表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：302表示之重鏈可變區；c-2)由SEQ ID NO：21表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：305表示之重鏈可變區；c-3)由SEQ ID NO：310表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：23表示之重鏈可變區；c-4)由SEQ ID NO：308表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：305表示之重鏈可變區； c-5)由SEQ ID NO：306表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：303表示之重鏈可變區；c-6)由SEQ ID NO：307表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：304表示之重鏈可變區；c-7)由SEQ ID NO：308表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：304表示之重鏈可變區；c-8)由SEQ ID NO：309表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：304表示之重鏈可變區；c-9)由SEQ ID NO：311表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：304表示之重鏈可變區；或c-10)由SEQ ID NO：306表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：302表示之重鏈可變區。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：(a)由SEQ ID NO：13表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：15表示之重鏈可變區；或(b)由SEQ ID NO：14表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：16表示之重鏈可變區。
  3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：(a)由SEQ ID NO：21表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：23表示之重鏈可變區；(b)由SEQ ID NO：22表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：24表示之重鏈可變區； (c)由SEQ ID NO：29表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：31表示之重鏈可變區；或(d)由SEQ ID NO：30表示之輕鏈可變區及由SEQ ID NO：32表示之重鏈可變區。
  4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含由SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：44中之任一者表示之鉸鏈區。
  5. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段進一步特異性結合至表皮生長因子受體(EGFR)，其中該抗體或其抗原結合片段進一步包含一或多個選自由爾必得舒(Erbitux)scFv及維必施(Vectibix)scFv組成之群之scFv片段，其中該爾必得舒scFv包含由SEQ ID NO：313或SEQ ID NO：314表示之胺基酸序列，且其中該維必施scFv包含由SEQ ID NO：315表示之胺基酸序列。
  6. 如請求項5之抗體或其抗原結合片段，其中該結合至EGFR之scFv片段係與c-Met特異性抗體之一個輕鏈或重鏈端連接。
  7. 如請求項6之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段藉由由SEQ ID NO：312表示之連接子連接。
  8. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
  9. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  10. 一種表現載體，其包含如請求項9之核酸分子。
  11. 一種宿主細胞，其具有經引入其中之如請求項10之表現載體。
  12. 一種產生抗體或其抗原結合片段之方法，其中該方法包含以下步驟：(a)培養如請求項11之宿主細胞；及(b)於該宿主細胞表現抗c-Met抗體或其抗原結合片段。
  13. 一種用於偵測c-Met之組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  14. 一種用於偵測c-Met之套組，其包含如請求項13之用於偵測c-Met之組合物。
  15. 一種使用如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段偵測c-Met抗原之方法。
  16. 一種用於預防或治療癌症之組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該癌症係藉由c-Met過度表現、擴增、突 變或活化所導致。
  17. 如請求項16之組合物，其中該抗體或其抗原結合片段與c-Met結合以抑制受體活性。
  18. 如請求項17之組合物，其中該抗體或其抗原結合片段進一步與EGFR結合以抑制該受體活性。
  19. 如請求項16之組合物，其中該癌症選自由以下組成之群：肺癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、三陰性乳癌(TNBC)、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、腦癌、子宮癌、子宮內膜瘤、甲狀腺癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤及腎上腺皮質癌。
  20. 一種如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項16至19中任一項之組合物之用途，其用於製造用以預防或治療癌症的藥劑，其中該癌症係藉由c-Met過度表現、擴增、突變或活化所導致。
  21. 如請求項20之用途，其中該癌症選自由以下組成之群：肺癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、三陰性乳癌(TNBC)、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、腦癌、子宮癌、子宮內膜瘤、甲狀腺癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤及腎上腺皮質癌。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11827709B2 (en) * 2019-12-05 2023-11-28 Seagen Inc. Anti-AVB6 antibodies and antibody-drug conjugates
CN111647084B (zh) * 2020-06-13 2020-12-01 广东赛尔生物科技有限公司 抗c-MET抗体及其在治疗癌症中的应用
CN112625131B (zh) * 2020-08-10 2021-08-17 北京鼎成肽源生物技术有限公司 抗人c-Met人鼠嵌合单克隆抗体及其应用
CA3237211A1 (en) * 2021-11-10 2023-05-19 Astrazeneca Ab Antibody molecules and conjugates
WO2023186078A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 普米斯生物技术(珠海)有限公司 针对c-Met的抗体及其用途
WO2023186092A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 普米斯生物技术(珠海)有限公司 针对c-Met的单克隆抗体以及双特异性抗体

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140141000A1 (en) * 2012-11-21 2014-05-22 Janssen Biotech, Inc. Bispecific EGFR/C-Met Antibodies

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0349578B2 (en) 1987-03-02 1998-10-28 Enzon Labs Inc. Organism carrying a Single Chain Antibody Domain at its surface.
AU605291B2 (en) 1987-03-20 1991-01-10 Micromet Ag Process for the purification of recombinant polypeptides
AU601273B2 (en) 1987-03-20 1990-09-06 Creative Biomolecules, Inc. Leader sequences for the production of recombinant proteins
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
CN104804095A (zh) * 2004-08-05 2015-07-29 健泰科生物技术公司 人源化抗c-met 拮抗剂
PA8849001A1 (es) 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
BRPI1014449A2 (pt) 2009-04-07 2017-06-27 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos anti-erbb-2/ anti-c-met.
SI2496601T1 (sl) 2009-11-05 2017-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Tehnike in sestavek za sekrecijo heterolognih polipeptidov
EP2545077B1 (en) * 2010-03-10 2018-10-31 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met
AU2011325097B2 (en) * 2010-11-03 2015-05-21 Argenx Bvba Anti c-Met antibodies
KR101420274B1 (ko) 2011-06-13 2014-07-21 주식회사 종근당 Ｃｓｐ－ｂ ５＇ｓａｒ 인자를 포함하는 동물세포 발현 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법
US20140154251A1 (en) 2011-10-05 2014-06-05 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti c-met antibody and uses thereof
EP2870178B1 (en) * 2012-05-09 2017-07-12 Eli Lilly and Company Anti-c-met antibodies
KR102042174B1 (ko) * 2013-03-29 2019-11-08 삼성전자주식회사 인간화 및 친화도 성숙된 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도
KR101536668B1 (ko) 2013-06-18 2015-07-15 사회복지법인 삼성생명공익재단 인간 및 마우스 c-Met에 교차결합하는 항체 및 그의 용도
KR102089591B1 (ko) * 2013-07-29 2020-03-18 삼성전자주식회사 항 EGFR scFv 단편 및 이를 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
NZ711451A (en) * 2014-03-07 2016-05-27 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
KR102309881B1 (ko) 2014-11-21 2021-10-06 삼성전자주식회사 c-Met 및 EGFR의 이중 저해제 및 IGF-1R 저해제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
KR101515535B1 (ko) 2015-01-28 2015-05-06 주식회사 종근당 항―ＥｒｂＢ２ 항체 변이체
CA3003759A1 (en) * 2015-11-03 2017-05-11 Merck Patent Gmbh Bi-specific antibodies for enhanced tumor selectivity and inhibition and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140141000A1 (en) * 2012-11-21 2014-05-22 Janssen Biotech, Inc. Bispecific EGFR/C-Met Antibodies

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