JP7325339B2 - 新規な抗ｃ－Ｍｅｔ抗体およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ヒト肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびそれを含む癌の予防または治療用の組成物に関する。

ＲＴＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ）は、細胞成長、分化、新血管形成、組織修復などに重要な制御因子として作用する。このような一般的な生理過程の他にも、特定のＲＴＫの非正常的な発現は、種々の癌の発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）および進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）と関連している。よって、このようなＲＴＫは、癌の治療のための有望な薬物標的と見なされてきた。

ＨＧＦＲ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｃ－Ｍｅｔ）は、ＲＴＫの一種として、ＨＧＦ／ＳＦ（ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒと知られたｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に対する細胞表面受容体である（Ｌａｉｒｄ ＡＤ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ １２：５１－６４（２００３））。ＨＧＦによる非正常的なｃ－Ｍｅｔの活性化は、腫瘍発生の代表的なメカニズムのうちの一つであって、腫瘍の増殖、アポトーシスの阻害、新血管形成、侵襲および転移などと関連していることが知られている（Ｂｏｔｔａｒｏ ＤＰ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：８０２－８０４（１９９１）、Ｄａｙ ＲＭ ｅｔ ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：３３９９－３４０６（１９９９））。また、ｃ－Ｍｅｔの変異および増幅によるｃ－Ｍｅｔの非正常的な活性化は、肺癌、大腸癌、頭頸部癌、胃癌、乳癌などのような様々な癌と関連しており、腫瘍の攻撃性の増加および不良な予後と関連していることが報告されている（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｊ
ｅｔ ａｌ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ２６：１３８７－１３９９（２０１２）、Ｌｉｕ Ｘ
ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １６：３７－４５（２０１０）、Ｓｍｏｌｅｎ ＧＡ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：２３１６－２３２１（２００６）、Ｆｏｖｅａｕ Ｂ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ２０：２４９５－２５０７（２００９））。

したがって、ｃ－Ｍｅｔはこのような様々な癌を治療するための標的抗原として注目されており、ｃ－Ｍｅｔの発現および活性を阻害するための様々なアプローチが試みられている。現在まで知られたｃ－Ｍｅｔ特異的な低分子チロシンキナーゼ阻害剤（ｓｍａｌｌ
ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としてはＴｉｖａｎｔｉｎｉｂ（ＡｒＱｕｌｅ）、ＩＮＣ２８０（Ｎｏｖａｔｉｓ）、ＡＭＧ３３７（Ａｍｇｅｎ）などが挙げられ、ｃ－ＭｅｔのリガンドであるＨＧＦ特異的モノクローナル抗体としてはＲｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ（Ａｍｇｅｎ）、Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ（ＡＶＥＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＨｕＬ２Ｇ７（Ｇａｌａｘｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などが開発されている。また、ｃ－Ｍｅｔを標的とするアンタゴニストモノクローナル抗体としては、臨床３相のＧｅｎｅｎｔｅｃｈが開発中のＯｎａｒｔｕｚｕｍａｂ（ＷＯ ２００６／０１５３７１）、臨床２相のＬｉｌｌｙ社のＥｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ（ＷＯ ２０１０／０５９６５４）、臨床１相の開発中のＳＡＩＴ－３０１（ＵＳ ２０１４１５４２５１）、ＡＢＴ－７００（Ｗａｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．１６：１０５－１１８（２０１６））などが挙げられる。Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂの場合、ｃ－Ｍｅｔに作用剤として作用する二価モノクローナル抗体（５Ｄ５）に由来した一価アンタゴニスト抗体である（Ｍａｒｋ Ｍｅｒｃｈａｎｔ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１０（３２）：Ｅ２９８７－Ｅ２９９（２０１３））。このようにｃ－Ｍｅｔに対する様々な薬物が開発されてきたが、上述した
ようにｃ－Ｍｅｔは様々な癌の発生および進行と関連しているため、ｃ－Ｍｅｔを標的として癌を治療できる新しい治療剤の開発が持続的に要求される実情である。

このような技術的な背景下、本発明者らは、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する新規抗体の開発に鋭意努力した結果、ｃ－Ｍｅｔに高い親和性で結合する新規な抗ｃ－Ｍｅｔ抗体を開発し、このような抗ｃ－Ｍｅｔ抗体、そのキメラ、ヒト化および親和性最適化抗体が腫瘍細胞の増殖を顕著に阻害させるだけでなく、抗癌効果に優れることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の一つの目的は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）に特異的に結合する抗体、その抗原結合断片を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された宿主細胞、前記宿主細胞を用いた抗体またはその抗原結合断片の産生方法を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含むｃ－Ｍｅｔ検出用組成物、それを含む検出用キットおよびそれを用いたｃ－Ｍｅｔ抗原を検出する方法を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む癌の予防または治療用の組成物を提供することにある。

本発明の肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、新規な配列を有し、少ない量でも優れた癌細胞増殖阻害活性および顕著に優れた抗癌活性を示しており、癌などの疾患を効果的に予防または治療することができる。

本発明のハイブリドーマｃ－Ｍｅｔ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞増殖阻害活性の試験結果を示したものである。 ｓｃＦｖのディスプレイのための別途のトランスクリプトームを発現するベクターの模式図である。 本発明のｈｕ８Ｃ４親和性最適化抗体による腫瘍細胞増殖阻害活性に対する分析結果を示したものである。 本発明の二重抗体による腫瘍細胞増殖阻害活性に対する分析結果を示したものである。 本発明の二重抗体による腫瘍細胞増殖阻害活性に対する分析結果を示したものである。 本発明の二重抗体および併用療法の腫瘍細胞増殖阻害活性をＵ－８７ ＭＧ（ｇｌｉｏｂｌａｔｏｍａ）、ＮＣＩ－Ｈ２９２（ＮＳＣＬＣ）、ＮＣＩ－Ｈ１６４８（ＮＳＣＬＣ）およびＮＣＩ－Ｈ５９６（ＮＳＣＬＣ）細胞株において比較した結果である。 本発明の二重抗体および併用療法の腫瘍細胞増殖阻害活性をＬＳ１７４Ｔ（ｃｏｌｏｎ）、ＢＴ２０（ＴＮＢＣ）およびＫＰ４（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ）細胞株において比較した結果である。 本発明の二重抗体および併用療法の腫瘍細胞増殖阻害活性をＨＣＣ８２７（ＮＳＣＬＣ）およびＮＣＩ－Ｈ５９６（ＮＳＣＬＣ）細胞株において比較した結果である。 本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体および二重抗体の結合力を種々のｃ－ＭｅｔおよびＥＧＦＲ抗原に対してＥＬＩＳＡ方法で測定した結果を示したものである。 本発明の二重抗体による受容体レベル減少効果をＮＣＩ－Ｈ８２０（ＮＳＣＬＣ）細胞株において測定した結果である。 本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体および二重抗体によるｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲリン酸化の阻害をＮＣＩ－Ｈ８２０（ＮＳＣＬＣ）細胞株において測定した結果である。 Ｕ－８７ ＭＧ（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞異種移植片モデルにおいて本発明の二重抗体の抗癌効果を測定した結果である。 ＮＣＩ－Ｈ８２０（ＮＳＣＬＣ）細胞異種移植片モデルにおいて本発明の二重抗体の抗癌効果を測定した結果である。 ＮＣＩ－Ｈ２１７０（ＮＳＣＬＣ）細胞株において本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体および抗ＨＥＲ２抗体を併用療法で処理して腫瘍細胞増殖阻害活性を分析した結果である。 ＮＣＩ－Ｈ２１７０（ＮＳＣＬＣ）細胞異種移植片モデルにおいて本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体および抗ＨＥＲ２抗体の併用療法の抗癌効果を測定した結果である。 ＮＣＩ－Ｈ５９６（ＮＳＣＬＣ）細胞異種移植片モデルにおいて本発明の二重抗体の抗癌効果を測定した結果である。 ＥＢＣ－１（ＮＳＣＬＣ）細胞異種移植片モデルにおいて本発明の二重抗体の抗癌効果を測定した結果である。 ＨＣＣ８２７細胞株に二重抗体（ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ）などを処理した後に測定した細胞表面のｃ－Ｍｅｔ量を示した結果である。 ＨＣＣ８２７細胞株に二重抗体（ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ）などを処理した後に測定した細胞表面のＥＧＦＲ量を示した結果である。 水素-重水素交換質量分析法（ＨＤＸ－ＭＳ）を用いて二重抗体のエピトープを分析した結果を３次構造で示した結果である。

これについて具体的に説明すれば次の通りである。なお、本発明に開示された各々の説明および実施形態は各々の他の説明および実施形態にも適用できる。すなわち、本発明に開示された様々な要素の全ての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、下記に記述された具体的な記載によって本発明の範疇が制限されるものではない。

前記目的を達成するための本発明の一つの様態は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。

本発明のｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片は、ｃ－Ｍｅｔに高い親和性で結合してその発現または活性を阻害することによって優れた腫瘍細胞増殖阻害活性を示すため、抗体単独または通常の薬剤学的に許容される担体、その他の抗癌剤、抗癌補助剤などと共に癌の予防または治療のための抗癌組成物として有用に用いられることができる。

本発明で用いられる用語「抗体」とは、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体の役割をするタンパク質分子を意味し、その例として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、全長抗体（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）および抗体断片を全て含むことができる。また、前記用語は、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）または二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）を含むことができる。

本発明で用いられる用語「モノクローナル抗体」は実質的に同一な抗体集団から得た単一分子組成の抗体分子を言い、このようなモノクローナル抗体は特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す。本発明で用いられる用語「全長抗体」は２個の全長の軽鎖および２個の全長の重鎖を有する構造であり、各々の軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖の不変領域は、γ、μ、α、δおよびεタイプを有し、サブクラスとしてγ１、γ２、γ３、γ４、α１およびα２を有する。軽鎖の不変領域は、κおよびλタイプを有する。ＩｇＧは、サブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。

本発明で用いられる用語「断片」、「抗体断片」および「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合機能を有する本発明の抗体の任意の断片を言うものであって、互換的に用いられる。例示的な抗原結合断片としてはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖなどを含むが、これらに制限されるものではない。

前記Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の１番目の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。抗体分子の抗原結合断片または抗体断片とは抗原結合機能を有している断片を意味し、Ｆａｂ’は重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ
ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂとは差がある。Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。Ｆｖは重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成する組み換え技術はＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ ８８／１０６４９、ＷＯ ８８／１０６６３０、ＷＯ ８８／０７０８５、ＷＯ ８８／０７０８６およびＷＯ ８８／０９３４４などに開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されるか、またはＣ－末端において直に連結されているため、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。これらに制限されるものではないが、このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）_２断片を得ることができる）、または遺伝子組み換え技術により作製することができる。

具体的には、本発明において、前記ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体は、

（ａ）配列番号１で示された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２で示された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３で示された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号７で示された重鎖ＣＤＲ１；配列番号８で示された重鎖ＣＤＲ２；配列番号９で示された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体；

（ｂ）配列番号４で示された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５で示された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号６で示された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０で示された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で示された重鎖ＣＤＲ２；配列番号１２で示された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体、または、

（ｃ）これらの親和性最適化抗体であってもよい。

本発明で用いられる用語「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む全長重鎖およびその断片を全て含むことができる。また、
本発明で用いられる用語「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を全て含むことができる。

本発明において、前記抗体は、マウスから産生されたマウス抗体およびそれより抗体の親和性、免疫性などを改善させるために親抗体のアミノ酸配列に一部を置換、付加および／または欠失させた変異体を全て含むことができる。前記変異体は、これらに制限されるものではないが、その例として、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性最適化抗体などを含むことができる。本発明において、前記変異体は、親抗体と同一なＣＤＲを含むかあるいは同一なエピトープを標的にする条件で親抗体ＣＤＲアミノ酸配列の一部が変異（置換、付加または欠失）した抗体を包括的に言う。このような変異体は、同一なエピトープに対する結合能が保持される範囲内で抗体の親和性および免疫性などを改善させるために当業者により適切に調節できる。

言い換えれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ｃ－Ｍｅｔを特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載された抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和性および／またはその他の生物学的特性をより改善させるために抗体のアミノ酸配列に追加の変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入および／または置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状および種類に対する分析により、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは全て陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンは類似した大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは類似した形状を有することが分かる。よって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは生物学的に機能均等物と言える。

本発明で用いられる用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域およびヒト抗体の不変領域を組み換えた抗体であって、マウス抗体に比べて免疫反応が大きく改善された抗体である。

本発明で用いられる用語「ヒト化抗体」とは、ヒトではない種に由来した抗体のタンパク質配列をヒトから自然的に産生された抗体変異体と類似するように変形させた抗体を意味する。その例として、前記ヒト化抗体は、マウス由来のＣＤＲをヒト抗体由来のＦＲと組み換えてヒト化可変領域を製造し、それを望ましいヒト抗体の不変領域と組み換えてヒト化抗体を製造することができる。ただ、単にＣＤＲグラフティングのみをする場合、ヒト化抗体の親和性が落ちるため、ＣＤＲの３次元構造に影響を与えると思われる幾つかの重要なＦＲアミノ酸残基をマウス抗体のもので親和させることによって、本来のマウス抗体の親和性と同じレベルに上げることができる。

本発明で用いられる用語「親和性最適化抗体」は、特定の抗体のＣＤＲ配列の一部が置換、付加、欠失した変異体であって、前記特定の抗体と同一な抗原エピトープに結合しながらも抗原に対する結合親和性が向上した抗体を言う。具体的には、本発明の親和性最適化抗体は、本発明の（ａ）配列番号１で示された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２で示された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３で示された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号７で示された重鎖ＣＤＲ１；配列番号８で示された重鎖ＣＤＲ２；配列番号９で示された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体；または（ｂ）配列番号４で示された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５で示された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号６で示された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０で示された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で示された重鎖
ＣＤＲ２；配列番号１２で示された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体と同一なエピトープに結合する変異体抗体を言う。通常の技術者であれば、特定された軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列に基づいて公知の技術を用いて前記親和性最適化抗体を製造することができる。例えば、本発明の親和性最適化抗体は、ファージディスプレイを通じて製造することができる。本発明で用いられる用語「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば、線維状ファージ粒子の表面上に外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化されたタンパク質変異体の大きなライブラリーを対象にして、標的抗原と高い親和性で結合する配列を迅速で且つ効率的に分類できるという事実にある。ペプチドおよびタンパク質ライブラリーのファージ上へのディスプレイは、特異的結合特性を有したポリペプチドを調査するために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに用いられてきた。

本発明の一実現例として、前記抗体は、（ａ）配列番号１３で示された軽鎖可変領域および配列番号１５で示された重鎖可変領域；または（ｂ）配列番号１４で示された軽鎖可変領域および配列番号１６で示された重鎖可変領域を含む抗体であってもよい。一例として、前記抗体は、（ａ）配列番号１７で示されたヌクレオチドによりコードされる軽鎖可変領域および配列番号１９で示されたヌクレオチドによりコードされる重鎖可変領域；または（ｂ）配列番号１８で示されたヌクレオチドによりコードされる軽鎖可変領域および配列番号２０で示されたヌクレオチドによりコードされる重鎖可変領域を含む抗体であってもよいが、これらに制限されるものではない。

本発明の具体的な一実施例によれば、ヒトのｃ－Ｍｅｔ Ｓｅｍａ ｄｏｍａｉｎ／Ｆｃ融合タンパク質を抗原にしてマウスからハイブリドーマ細胞群を確保し、これらよりｃ－Ｍｅｔ／Ｈｉｓ融合タンパク質を抗原として用いたＥＬＩＳＡ分析方法によりスクリーニングを行うことによって、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗ｃ－Ｍｅｔ抗体を選別した。前記選別された抗体およびそのキメラ抗体は、既に公知されて市販中のＬＹ２８７５３５８およびＯＡ－５Ｄ５と比較しても対等であるか、またはさらに優れた腫瘍細胞増殖阻害活性を有するため（表３および図１）、癌の予防または治療に非常に有用に用いられることができる。

本発明の他の実現例として、前記抗体は、

（ａ）配列番号２１で示された軽鎖可変領域および配列番号２３で示された重鎖可変領域；（ｂ）配列番号２２で示された軽鎖可変領域および配列番号２４で示された重鎖可変領域；（ｃ）配列番号２９で示された軽鎖可変領域および配列番号３１で示された重鎖可変領域；または（ｄ）配列番号３０で示された軽鎖可変領域および配列番号３２で示された重鎖可変領域；を含むものであってもよい。一例として、前記抗体は、（ａ）配列番号２５で示されたヌクレオチドによりコードされる軽鎖可変領域および配列番号２７で示されたヌクレオチドによりコードされる重鎖可変領域；（ｂ）配列番号２６で示されたヌクレオチドによりコードされる軽鎖可変領域および配列番号２８で示されたヌクレオチドによりコードされる重鎖可変領域；（ｃ）配列番号３３で示されたヌクレオチドによりコードされる軽鎖可変領域および配列番号３５で示されたヌクレオチドによりコードされる重鎖可変領域；または（ｄ）配列番号３４で示されたヌクレオチドによりコードされる軽鎖可変領域および配列番号３６で示されたヌクレオチドによりコードされる重鎖可変領域；を含む抗体であってもよいが、これらに制限されるものではない。また、前記抗体は、配列番号３７～配列番号４４のうちいずれか一つで示されたヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域を含むものであってもよい。

本発明の具体的な一実施例においては、ファージディスプレイ選別により確保された抗
体のＣＤＲを含むヒト化抗体を製造し、これらの抗体が本発明のキメラ抗体と比較して類似したレベルの抗癌活性を示すのを確認した（実施例２および実施例３）。また、本発明の他の具体的な一実施例においては、ヒンジ領域配列に応じた抗体の腫瘍細胞増殖阻害活性を評価し、ヒンジ配列の差に応じて活性に多少の差はあったが、大部分の腫瘍細胞の増殖を効果的に阻害するのを確認した（表７）。

本発明のまた他の実現例として、これらに制限されるものではないが、前記ヒト化抗体に対する親和性最適化抗体は、配列番号１で示された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２で示された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３で示された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号７で示された重鎖ＣＤＲ１；配列番号８で示された重鎖ＣＤＲ２；配列番号９で示された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体において少なくとも一つのアミノ酸配列が置換された抗体であって、（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１の１番目位置のＧがＡ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、ＶまたはＷ；２番目位置のＡがＣ、Ｇ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、ＴまたはＶ；３番目位置のＳがＧ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴ；４番目位置のＥがＡ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶ；５番目位置のＮがＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶ；６番目位置のＩがＡ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶ；７番目位置のＹがＦ、Ｈ、ＲまたはＶ；または８番目位置のＧがＤ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶで置換；（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２の１番目位置のＧがＤ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、ＶまたはＹ；３番目位置のＴがＱ；または４番目位置のＮがＧで置換；（ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３の１番目位置のＱがＥ、Ｇ、Ｉ、ＭまたはＮ；２番目位置のＮがＡ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、ＳまたはＴ；３番目位置のＶがＩ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＴ；４番目位置のＬがＦ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、ＷまたはＹ；５番目位置のＳがＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、ＶまたはＹ；６番目位置のＳがＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、ＶまたはＹ；７番目位置のＰがＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＶ；８番目位置のＹがＥ、Ｆ、Ｌ、ＭまたはＱ；または９番目位置のＴがＤ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、ＷまたはＹで置換；（ｉｖ）重鎖ＣＤＲ１の１番目位置のＤがＧまたはＱ；２番目位置のＹがＱ；または４番目位置のＩがＡまたはＱで置換；（ｖ）重鎖ＣＤＲ２の３番目位置のＦがＤ、Ｅ、ＷまたはＹ；５番目位置のＧがＤ、ＨまたはＹ；６番目位置のＳがＦ、Ｐ、ＷまたはＹ；７番目位置のＧがＡ、Ｆ、Ｌ、ＮまたはＴ；８番目位置のＮがＦ、Ｐ、Ｓ、ＴまたはＹ；９番目位置のＴがＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、ＳまたはＶ；１０番目位置のＨがＡ、Ｄ、Ｆ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ；１１番目位置のＦがＧ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、ＶまたはＹ；１２番目位置のＳがＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、ＴまたはＶ；１３番目位置のＡがＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹ；１４番目位置のＲがＡ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、ＷまたはＹ；１５番目位置のＦがＤ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、ＶまたはＷ；１６番目位置のＫがＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹ；または１７番目位置のＧがＥ、Ｆ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷで置換；または（ｖｉ）重鎖ＣＤＲ３の１番目位置のＧがＥ、Ｆ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、ＶまたはＷ；２番目位置のＤがＥ；３番目位置のＹがＬ、Ｑ、ＴまたはＶ；４番目位置のＧがＷ；５番目位置のＦがＬまたはＹ；６番目位置のＬがＱ、ＳまたはＹ；または７番目位置のＹがＣ、Ｌ、Ｍ、ＮまたはＱで置換されたものであってもよい。ここで、軽鎖ＣＤＲ１は０～５個、軽鎖ＣＤＲ２は０～１個、軽鎖ＣＤＲ３は０～７個、重鎖ＣＤＲ１は０～１個、重鎖ＣＤＲ２は０～１１個、および重鎖ＣＤＲ３は０～６個の置換を含むことができる。

本発明のまた他の実現例として、前記親和性最適化抗体は、具体的には、配列番号１、および配列番号２２９～２６８のうちいずれか一つで示された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２、配列番号１８２～１９０、配列番号２２７および配列番号２２８のうちいずれか一つで示された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３、配列番号１４２～１８１、配列番号１９１～２２６、および配列番号２６９～３０１のうちいずれか一つで示された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号７、および配列番号１０８～１１２のうちいずれか一つで示さ
れた重鎖ＣＤＲ１；配列番号８、配列番号５４～６３、配列番号７２～１０７、および配列番号１１８～１４１のうちいずれか一つで示された重鎖ＣＤＲ２；配列番号９、配列番号６４～７１、および配列番号１１３～１１７のうちいずれか一つで示された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むものであってもよく、より具体的には、配列番号２１、および３０６～３１１のうちいずれか一つで示された軽鎖可変領域、および配列番号２３、および３０２～３０５のうちいずれか一つで示された重鎖可変領域を含んでもよく、さらに具体的には、（ａ）配列番号２１で示された軽鎖可変領域および配列番号３０２で示された重鎖可変領域；（ｂ）配列番号２１で示された軽鎖可変領域および配列番号３０５で示された重鎖可変領域；（ｃ）配列番号３１０で示された軽鎖可変領域および配列番号２３で示された重鎖可変領域；（ｄ）配列番号３０８で示された軽鎖可変領域および配列番号３０５で示された重鎖可変領域；（ｅ）配列番号３０６で示された軽鎖可変領域および配列番号３０３で示された重鎖可変領域；（ｆ）配列番号３０７で示された軽鎖可変領域および配列番号３０４で示された重鎖可変領域；（ｇ）配列番号３０８で示された軽鎖可変領域および配列番号３０４で示された重鎖可変領域；（ｈ）配列番号３０９で示された軽鎖可変領域および配列番号３０４で示された重鎖可変領域；（ｉ）配列番号３１１で示された軽鎖可変領域および配列番号３０４で示された重鎖可変領域；または（ｊ）配列番号３０６で示された軽鎖可変領域および配列番号３０２で示された重鎖可変領域；を含むものであってもよいが、これらに制限されるものではない。

本発明の具体的一実施例においては、前記ヒト化抗体より親和性が向上した抗体を選別するために競争的な選別方法を用い、それによって多数の親和性最適化抗体を確保した（表８～表１０および表１２）。前記親和性最適化抗体は、ヒト化抗体に比べて４．３～２８．５倍優れた腫瘍細胞増殖阻害効果を有する（表１１、表１３および図３）。

本発明において、前記抗体は、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する以外に、さらに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であってもよい。

ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、ＥｒｂＢチロシンキナーゼのうちの一つであって、非小細胞肺癌腫を含む多くの上皮細胞腫瘍において非正常的に活性化しており、細胞増殖、侵襲、転移、血管形成を引き起こして細胞生存を増加させることが知られている。代表的な肺癌治療剤としてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるｇｅｆｉｔｉｎｉｂ（Ｉｒｅｓｓａ）、ｅｌｏｔｉｎｉｂ（Ｔａｒｃｅｖａ）およびｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ（Ｔａｇｒｉｓｓｏ）；大腸癌治療剤としてＥＧＦＲ標的抗体であるｃｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）とｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）が用いられている（Ｙｅｗａｌｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３ ３４（３４）：８６９０－７０７（２０１３）、Ｄｅｒｉｃ Ｌ．Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ７、４９３－５０７（２０１０））。

このようなＥＧＦＲ標的治療剤は治療１年前後に抵抗性が発生するが、主な抵抗性メカニズムとしてｃ－Ｍｅｔの増幅、変異およびＨＧＦによる活性化が知られている（Ｓｉｍｏｎａ Ｃｏｒｓｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３：９７８－９９２（２０１３）、Ｃｕｒｔｉｓ Ｒ Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
１９、１３８９－１４００（２０１３））。また、ＥＧＦＲとｃ－Ｍｅｔは様々な腫瘍細胞において同時発現されており、ＥＧＦＲを阻害した時にｃ－Ｍｅｔが活性化され、それにより、ＥＧＦＲ ＴＫＩの抵抗性を速く進行させることが報告されている（Ｅｎｇｅｌｍａｎ、Ｊ．Ａ．、ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１６：１０３９－４３（２００７））。

このようなメカニズムに基づいて現在ｃ－Ｍｅｔ標的薬物の単独治療およびＥＧＦＲ標的薬物との併用治療が臨床試験の進行中であるが、未だ臨床で治療剤としての効能が検証されておらず、主な抵抗性原因として知られたｃ－Ｍｅｔ関連の癌腫に対する治療剤開発の必要性がある。そこで、本発明者らは、上述した抗体に基づいてｃ－Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体を作製した。前記二重特異性抗体は、既存のＥＧＦＲ治療剤に抵抗性のある腫瘍細胞の増殖を効果的に阻害するだけでなく、腫瘍細胞の優れた増殖阻害活性を示すため、様々なメカニズムを通じてｃ－Ｍｅｔにより媒介される癌などの疾患を治療するのに治療上有用に用いることができる。

前記二重特異性抗体は、ｃ－Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖または重鎖の一末端にＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を連結したものであってもよく、例えば、重鎖Ｃ－末端に連結したものであってもよいが、これに制限されるものではない。

前記ＥＧＦＲに特異的に結合する結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖであってもよい。

本発明の一実現例として、前記ＦｖはｓｃＦｖ断片であってもよく、前記ｓｃＦｖ断片の連結はｃ－Ｍｅｔ抗体の軽鎖または重鎖の一末端にｓｃＦｖ断片を連結できるコネクターを用いて連結することができる。本発明の一実現例においては、配列番号３１２で示されたコネクターで連結してＥＧＦＲに特異的に結合する抗体をさらに作製した。

前記ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ断片は、ＥＧＦＲに特異的に結合できる当業界で公知のＥＧＦＲ ｓｃＦｖであってもよく、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ、ＰｏｒｔｒａｚｚａまたはＴｈｅｒａＣＩＭなどであってもよいが、これらに制限されるものではない。

本発明の一実現例として、前記ＥＧＦＲ ｓｃＦｖはＥｒｂｉｔｕｘまたはＶｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ断片であってもよく、具体的には、前記ＥＧＦＲ ｓｃＦｖは配列番号３１３または配列番号３１４で示されたアミノ酸配列を含むものであってもよく、前記Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖは配列番号３１５で示されたアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これらに制限されるものではない。

本発明の具体的な一実施例によれば、前記二重特異性抗体の腫瘍細胞増殖阻害活性を確認した結果、ｈｕ８Ｃ４最適化抗体に比べて腫瘍活性阻害効能に優れるのを確認した（表１６、表１７、図４、図５、図１６および図１７）。特に、本発明の抗体は、ｃ－ＭｅｔおよびＥＧＦＲが正常に発現される細胞株であるＮＣＩ－Ｈ２９２およびＮＣＩ－Ｈ１６４８細胞株に対しても優れた細胞増殖阻害効果を有するのを確認した（表１７、表１９および図６）。このような結果から、本発明の抗体が有する抗癌効果はｃ－Ｍｅｔの発現異常または変異有無などに特に制限されないことが分かる。

さらに、本発明の二重抗体は、二つの抗体の併用療法より腫瘍細胞増殖阻害能に優れるのを確認した（表１８～表２１および図６～図８）。また、本発明の二重抗体が抗原およびシグナル伝達物質の活性に及ぶ影響を確認した結果、抗体単独に比べてシグナル伝達阻害効能に優れるのを確認した（図１１）。

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３および／または配列番号３３４からなる群より選択されるアミノ酸配列で示されたエピトープ領域に結合するものであってもよい。特定の抗体（基準抗体）に基づいて作製された親和性最適化抗体は、基準抗体と可変領域の軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列と高い相同性を有しており、基準抗体と同一のエピトープ領域に結合することを特徴とするので、結
合位置、特異性、そして抗体によって引き起こされる薬理メカニズム、薬理効果のような生物学的特性を全て共有することができ、結合親和性の面で基準抗体より優れた効果を示すことができる。

前記エピトープ領域は、例えば、基準ｃ－Ｍｅｔ抗原（配列番号３３５）においてＮ－末端から３２１番目～３２９番目位置のＹＶＳＫＰＧＡＱＬ（配列番号３３１）、３３３番目～３４１番目位置のＩＧＡＳＬＮＤＤＩ（配列番号３３２）、３６６番目～３７２番目位置のＰＩＫＹＶＮＤ（配列番号３３３）および４６４番目～４７４番目位置のＱＶＶＶＳＲＳＧＰＳＴ（配列番号３３４）を各々意味し、本発明の抗体またはその抗原結合断片が結合するｃ－Ｍｅｔ抗原配列が一部変異（置換、付加または欠失）を含むか、または結合する抗原がｃ－Ｍｅｔの断片、前駆体またはサブタイプの形態で存在することによりその結合位置または配列が多少変わっても、通常の技術者であれば、基準ｃ－Ｍｅｔ抗原のエピトープ配列情報に基づいて本発明の抗原またはその抗原結合断片が結合する位置および配列を明確に特定することができる。

本発明の具体的な一実施例においては、本発明の二重抗体ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖがヒトｃ－Ｍｅｔセマドメインβ鎖のＹ３２１～Ｌ３２９（配列番号３３１）、Ｉ３３３～Ｉ３４１（配列番号３３２）、Ｐ３６６～Ｄ３７２（配列番号３３３）、Ｑ４６４～Ｓ４７４（配列番号３３４）の４個のエピトープ領域に結合するのを確認した（表２８）。

本発明の「ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片」とは、ヒトｃ－ＭｅｔとＫ_Ｄ １×１０^－７Ｍ以下で結合するものを意味する。前記抗体または抗原結合断片は、例えば、ヒトｃ－ＭｅｔとＫ_Ｄ ５×１０^－８Ｍ以下、Ｋ_Ｄ １×１０^－８Ｍ以下、Ｋ_Ｄ ５×１０^－９Ｍ以下、またはＫ_Ｄ １×１０^－９Ｍ以下で結合するものであってもよいが、これらに制限されるものではない。

本発明の具体的な一実施例においては、ｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤに対するｈｕ８Ｃ４、ｈｕ８Ｃ４ ＡＨ７１およびｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖの結合親和性を確認し、各々３．１７３×１０^－１０、９．９９３×１０^－１１および２．７８×１０^－１０のＫ_Ｄ値を確認することによって、本発明の抗体またはその抗原結合断片のｃ－Ｍｅｔ抗原に対する高い結合親和性を直接確認した（表２２）。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、同じ類人猿であるカニクイザルのｃ－Ｍｅｔ抗原には交差反応性を有するが（表２２）、その他の動物由来抗原（例えば、齧歯類）には結合しないのを確認した（図９）。また、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ｃ－Ｍｅｔ以外の細胞表面受容体に結合しないのを確認した（表２４）。よって、前記結果から、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトと猿のｃ－Ｍｅｔ抗原に結合特異性を示すことが分かる。

本発明で用いられる用語「結合定数（Ｋ_ｏｎ）」とは特定の抗体－抗原相互作用の結合比率を意味し、用語「解離定数（Ｋ_ｏｆｆ）」とは特定の抗体－抗原相互作用の解離比率を意味する。また、本発明で用いられる用語「抗原に対する親和性（Ｋ_Ｄ）」は、Ｋ_ｏｆｆ：Ｋ_ｏｎの比率（すなわち、Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎ）をモル濃度（Ｍ）で示したものである。抗体に対するＫ_Ｄ値は、当業界で広く確立された方法を用いて測定できる。例えば、抗体のＫ_Ｄ値を測定するための方法として、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた表面プラズモン共鳴分析が挙げられるが、これに制限されるものではない。

本発明のまた他の様態は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む発現ベクター、前記発現ベクターが導入された宿主細胞、前記宿主細胞を用いた抗体またはその抗原結合断片の産生方法である。

前記抗体およびその抗原結合断片は前記で説明した通りである。

本明細書で用いられる用語「核酸分子」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、前記核酸分子において、基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、（１９９０）９０：５４３－５８４）。本発明の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸分子の配列は変形されてもよく、前記変形はヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。

本発明の核酸分子は、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むと解釈される。本発明において、実質的な同一性とは、前記本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を可能な限り対応するようにアライン（ａｌｉｇｎ）し、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも８０％の相同性、具体的には少なくとも９０％の相同性、より具体的には少なくとも９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。

本明細書で用いられる用語「ベクター」は、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ－関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含み、具体的にはプラスミドベクターであってもよいが、これらに制限されるものではない。

本発明のベクターにおいて、軽鎖可変領域をコードする核酸分子および重鎖可変領域をコードする核酸分子は、プロモーターと作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）されたものであってもよい。

本発明で用いられる用語「作動可能に連結された」とは核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、それにより、前記調節配列は前記他の核酸配列の転写および／または翻訳を調節する。

本発明の組み換えベクターシステムは、当業界で公知の様々な方法により構築できる。例えば、それに関する具体的な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、該文献は本明細書に参照として挿入される。

本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築できる。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築できる。

例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行できる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど）、翻訳の開始のためのリボソーム結合位置および転写／翻訳終結配列を含むのが一般的である。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が用いられる場合には、Ｅ
．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、Ｃ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９８４）１５８：１０１８－１０２４）、そしてファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｉ．ａｎｄ Ｈａｇｅｎ、Ｄ．、Ａｎｎ，Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、（１９８０）１４：３９９－４４５）が調節部位として利用できる。宿主細胞としてバチルス菌が用いられる場合には、バチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）６４：３９３２－３９３８；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９６）２５０：７３４－７４１）またはバチルス菌で発現可能な如何なるプロモーターでも調節部位として利用できる。

一方、本発明の組み換えベクターは、当業界で度々用いられるプラスミド（例えば、ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４・λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して作製することができる。例えば、本発明の組み換えベクターは、ｐＣＬ発現ベクター、具体的にはｐＣＬＳ０５（大韓民国登録特許第１０－１４２０２７４号）発現ベクターを操作して作製することができるが、これに制限されるものではない。

一方、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられることができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。具体的には、本発明の組み換えベクターは、ＣＭＶプロモーターを含む。

本発明の組み換えベクターは、それより発現される抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）および６×Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。また、本発明のベクターにより発現されるタンパク質が抗体であるため、精製のための追加の配列なしにも、発現された抗体はタンパク質Ａカラムなどを通じて容易に精製することができる。

一方、本発明の組み換えベクターは、選択標識として当業者で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含むことができる。

本発明の抗体を発現するベクターは、軽鎖と重鎖とが一つのベクターにおいて同時に発現されるベクターシステムであるか、または軽鎖と重鎖とを各々別途のベクターにおいて発現させるシステムのいずれも可能である。後者の場合、二つのベクターは、同時形質転換（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）および標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して宿主細胞に導入できる。同時形質転換は、軽鎖およ
び重鎖をコードする各々のベクターＤＮＡを同時に宿主細胞に導入した後、軽鎖および重鎖を全て発現する細胞を選別する方法である。標的形質転換は、軽鎖（または重鎖）を含むベクターで形質転換された細胞を選別し、選別された細胞を重鎖（または軽鎖）を含むベクターでさらに形質転換して、軽鎖および重鎖を全て発現する細胞を最終的に選別する方法である。

本発明のベクターを安定しながらも連続してクローニングおよび発現できる宿主細胞であれば当業界で公知の如何なる宿主細胞も用いることができ、例えば、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のようなバチルス属菌株、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ
ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を含むことができるが、これらに制限されるものではない。

前記ベクターの好適な真核宿主細胞としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）のような真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のような酵母、その他の下等真核細胞、昆虫－由来細胞のような高等真核生物の細胞、そして植物または哺乳動物由来の細胞を用いることができる。

具体的には、宿主細胞は、ＣＯＳ７細胞（ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、幼いハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞または２９３細胞であってもよく、より具体的には、チャイニーズハムスター卵巣細胞であってもよいが、これらに制限されるものではない。

本発明において、宿主細胞への「形質転換」および／または「形質感染」は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入する如何なる方法も含まれ、当分野で公知されたように、宿主細胞に応じて適宜な標準技術を選択して行うことができる。前記のような方法には、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌、アグロバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、デキストランサルフェート、リポフェクタミンおよび乾燥／抑制媒介形質転換方法などが含まれるが、これらに制限されるものではない。

本発明において、前記宿主細胞を用いた抗体またはその抗原結合断片を産生する方法は、具体的には、（ａ）本発明の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップ；および（ｂ）前記宿主細胞において抗－ｃ－Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片を発現させるステップを含むことができる。

前記抗体の製造において形質転換された宿主細胞の培養は、当業界で周知の適宜な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して使用できる。このような培養方法は、様々な文献（例え
ば、Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｌｅｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ－Ｈａｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ、１３８－１７６）に開示されている。細胞培養は、細胞の成長方式に応じて懸濁培養と付着培養、培養方法に応じて回分式、流加式および連続培養式の方法に区分される。培養に用いられる培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満たさなければならない。

動物細胞培養において、前記培地は、様々な炭素源、窒素源および微量の元素成分を含む。本発明で用いられる炭素源の例としては、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、マルトース、デンプンおよびセルロースのような炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油およびココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸のような脂肪酸、グリセロールおよびエタノールのようなアルコール、そして酢酸のような有機酸を含むことができ、これらの炭素源は、単独または組み合わせて用いることができる。

本発明で用いられる窒素源としては、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）および大豆粉のような有機窒素源、および尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含むことができ、これらの窒素源は、単独または組み合わせて用いることができる。前記培地は、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムおよび対応するナトリウム－含有塩を含むことができる。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。その他に、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などを含むことができる。

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加して、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を保持するために、培養物内に酸素または酸素－含有ガス（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、通常、２０℃～４５℃、好ましくは、２５℃～４０℃である。

前記産生方法は、（ｃ）前記宿主細胞で発現された抗－ｃ－Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片を回収するステップをさらに含むことができる。前記形質転換された宿主細胞を培養して得た抗体は、精製しない状態で用いてもよく、またはさらに様々な通常の方法、例えば、透析、塩沈殿およびクロマトグラフィーなどを用いて高純度に精製して用いてもよい。その中でもクロマトグラフィーを用いる方法が最も多く用いられており、カラムの種類と順は、抗体の特性、培養方法などに応じて、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどから選択することができる。

本発明のまた他の様態は、前記抗体またはその抗原結合断片を含むｃ－Ｍｅｔ検出用組成物、それを含む検出用キットおよびそれらを用いたｃ－Ｍｅｔ抗原を検出する方法である。

前記ｃ－Ｍｅｔ検出用組成物およびそれを含むキットは、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を検体試料に接触させて抗原－抗体複合体を形成することによって効果的にｃ－Ｍｅｔを検出することができる。

本明細書で用いられる用語「抗原－抗体複合体」とは、試料中のｃ－Ｍｅｔを発現する腫瘍または癌細胞を確認するための、ｃ－Ｍｅｔとそれを認知する抗体の結合物を意味する。

ｃ－Ｍｅｔ検出用組成物およびそれを含むキットを用いたｃ－Ｍｅｔ抗原の定量方法は、抗原－抗体複合体の形成を確認して行われることができ、前記抗原－抗体複合体の形成の確認は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫細胞化学法（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、免疫拡散アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体結合アッセイ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）またはタンパク質チップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ）などによって行われてもよく、これらに制限されるものではない。前記酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、固体支持体に付着した抗原を認知する標識された抗体を用いる直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認知する抗体の複合体において捕捉抗体を認知する標識された二次抗体を用いる間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認知する標識されたまた他の抗体を用いる直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認知するまた他の抗体と反応させた後、該抗体を認知する標識された二次抗体を用いる間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなどの様々なＥＬＩＳＡ方法を含む。

抗原－抗体複合体の形成を定性または定量的に測定可能にするラベルには酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス分子および放射性同位元素などがあるが、必ずしもこれらに制限されるものではない。前記酵素にはβ－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、β－ラクタマーゼなどがあるが、これらに制限されるものではない。

本発明のまた他の様態は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防または治療用の組成物である。

本発明のまた他の様態は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を癌が発病する危険があるか、または癌を有した個体に投与するステップを含む、癌の予防または治療方法である。

本発明のまた他の様態は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物の癌治療用途、および抗癌剤製造用途である。

前記抗体およびその抗原結合断片は前述した通りである。

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ｃ－Ｍｅｔ単独またはｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲに高い親和性で結合して癌細胞の成長を阻害することができるため、抗体単独でまたは通常の薬剤学的に許容される担体と共に癌のような過増殖性疾患の治療、予防および診断に用いることができる。

本発明で用いられる用語「予防」とは本発明の組成物の投与により癌などの疾患の発生または再発を防ぐか、または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは癌などの疾患発展の阻害、癌の軽減または癌の除去を意味する。

本発明の組成物に適用される疾患である癌は、具体的には、肺癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ、ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、膠芽腫、膵臓癌、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、唾液腺癌または甲状腺癌であってもよく、より具体的には、肺癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ、ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、膠芽腫、膵臓癌、頭頸部癌、乳癌であり、さらに具体的には、肺癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ、ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、膠芽腫、膵臓癌、頭頸部癌であってもよいが、これらに制限されるものではない。本発明において、癌は特にｃ－Ｍｅｔの過発現、増幅、突然変異または活性化による癌であってもよいが、これらに制限されるものではない。すなわち、本発明の抗体またはその結合断片を含む組成物は、ｃ－Ｍｅｔの異常発現または突然変異に関係なく全ての癌腫に対して増殖阻害効果を有するため、本発明の医薬用途がｃ－Ｍｅｔの発現様態または突然変異有無によって制限されるものではない。

前記組成物は、薬学的組成物、医薬部外品組成物、健康食品用組成物の形態であってもよい。

本発明の癌の予防または治療用の組成物は、薬剤学的に許容される担体をさらに含むことができる。前記薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに制限されるものではない。本発明の癌の予防または治療用の組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．、１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の組成物は、経口または非経口で投与することができ、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などにより投与することができる。経口投与時には、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化され、本発明の組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与することができる。

本発明の癌の予防または治療用の組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって様々であり、通常、熟練した医師であれば、所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。本発明の一実現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上であってもよい。本明細書で用いられる用語「薬剤学的有効量」とは、癌などの疾患の治療、予防および診断するのに十分な量を意味する。

本発明の癌の予防または治療用の組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有した者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質のうち溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、またはエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤
、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。

本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤とは順次または同時に投与してもよい。

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、抗体－治療剤（機能性分子）および二重特異性抗体－治療剤（機能性分子）結合体の形態で生体内に投入して癌の治療に用いることができ、それに関する説明は前記で説明した通りである。薬剤を特異的標的部位に標的化するのに適宜で好ましい色々な条件は、例えば、文献Ｔｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ、（１９８２）１９－３０に報告されている。

本発明の具体的な一実施例によれば、異種移植マウスモデルにおける本発明の癌の予防または治療用の組成物の抗－腫瘍活性を確認した結果、対照群に比べて腫瘍活性阻害効能に顕著に優れるのを確認した（図１２および図１３）。

本発明の組成物に含まれる抗体またはその抗原結合断片が標的とするｃ－Ｍｅｔは癌細胞の表面に発現される分子であるため、本発明の抗体に機能性分子をさらに結合するか、または併用投与してｃ－Ｍｅｔと関連した癌の予防、治療および診断に用いることができる。前記機能性分子は、化学物質、放射性核種、免疫治療剤、サイトカイン、ケモカイン、毒素、生物作用剤および酵素阻害物質などを含むことができる。

本発明の抗体またはその断片とカップリングさせて抗体薬物－結合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；ＡＤＣ）を形成できる機能性分子としては化学物質、サイトカイン、ケモカインが挙げられるが、これらに制限されるものではない。前記化学物質は、例えば、抗癌剤であり、具体的には、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロナイシン、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナファイド、アンプリジェン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、アフィジコリングリシナート、アサレイ、アスパラギナーゼ、５－アザシチジン、アザチオプリン、バチルス・カルメット－ゲラン（ＢＣＧ）、ベーカーズアンチフォール、β－２－デオキシチオグアノシン、ビスアントレンＨＣｌ、ブレオマイシンサルフェート、ブスルファン、ブチオニンスルホキシイミン、ＢＷＡ７７３Ｕ８２、ＢＷ５０２Ｕ８３／ＨＣｌ、ＢＷ７Ｕ８５メシレート、セラセミド、カルベティマー、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキノキサリンスルホンアミド、クロロゾトシン、クロモマイシンＡ３、シスプラチン、クラドリビン、コルチコステロイド、コリネバクテリウムパルヴム、ＣＰＴ－１１、クリスナトール、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン、シテムベナ、ダビスマレアート、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ジアザウリジン、デクスラゾキサン、ジアンヒドロガラクチトール、ジアジクオン、ジブロモズルシトール、ジデミンＢ、ジエチルジチオカルバメート、ジグリコアルデヒド、ジヒドロ－５－アザシチジン、ドキソルビシン、エチノマイシン、エダトレキサート、エデルフォシン、エフロニチン、エリオット溶液、エルサミトルシン、エピルビシン、エソルビシン、エストラムスチンフォスフェート、エストロゲン、エタニダゾール、エチオフォス、エトポシド、ファドラゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボン酢酸、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５’－フルオロウラシル、Ｆｌｕｏｓｏｌ^ＴＭ、フルタミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン、ヘプスルファム、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ホモハリントニン、硫酸ヒドラジン、４－ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロジウレア、イダルビシンＨＣｌ、イホスファミド、４－イポメアノール、イプロプラチン、イソトレチノイン、ロイコボリンカルシウム、酢酸リュ
ープロリド、レバミゾール、リポソームダウノルビシン、リポソーム捕捉ドキソルビシン、ロムスチン、ロニダミン、メイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、メノガリル、メルバロン、６－メルカプトプリン、メスナ、バチルス・カルメット－ゲランのメタノール抽出物、メトトレキサート、Ｎ－メチルホルムアミド、ミフェプリストン、ミトグアゾン、マイトマイシン－Ｃ、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、モノサイト／マクロファージコロニー刺激因子、ナビロン、ナフォキシジン、ネオカルチノスタチン、酢酸オクトレオチド、オルマプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラ、ペントスタチン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピラルビシン、ピリトレキシム、ピロキサントロン塩酸塩、ＰＩＸＹ－３２１、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲスチン、ピラゾフリン、ラゾキサン、サルグラモスチム、セムスチン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、スラミンナトリウム、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テニポシド、テレフタルアミジン、テロクシロン、チオグアニン、チオテパ、チミジンインジェクション、チアゾフリン、トポテカン、トレミフェン、トレチノイン、塩酸トリフルオペラジン、トリフルリジン、トリメトレキサート、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）、ウラシルマスタード、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンゾリジン、Ｙｏｓｈｉ ８６４、ゾルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、メルファラン、タキソテール、タキソールおよびこれらの混合物であってもよいが、これらに制限されるものではない。

以下では、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは当業界で通常の知識を有した者に明らかなことである。

実施例１． ｃ－Ｍｅｔ特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作製およびその腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

（１）ｃ－Ｍｅｔタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の作製および選別

動物免疫化を通じてハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、ヒトのｃ－Ｍｅｔ Ｓｅｍａ ｄｏｍａｉｎ／Ｆｃ融合タンパク質（自体作製）を抗原にしてマウスの腹腔内注射を施した。ハイブリドーマ細胞群の中からｃ－Ｍｅｔタンパク質にのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのｃ－Ｍｅｔ／Ｈｉｓ融合タンパク質を抗原として用いたＥＬＩＳＡ分析方法によりスクリーニングを行った。

（２）ｃ－Ｍｅｔ抗体

選別されたハイブリドーマ細胞株から得られたマウス抗体の軽鎖および重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を表１および表２に各々示す。

（３）ハイブリドーマｃ－Ｍｅｔ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞増殖阻害活性

ハイブリドーマ細胞株を用いて得られたｃ－Ｍｅｔ特異的マウス抗体、そして前記抗体とヒト重鎖および軽鎖不変領域を融合して作製したキメラ抗体の腫瘍細胞増殖阻害活性をヒト膠芽腫細胞株であるＵ－８７ ＭＧとヒト胃癌細胞株であるＭＫＮ４５で試験した。

具体的には、Ｕ－８７ ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ１４）を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ／５００ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／５００ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５１４０－１２２）を含有する培養培地ＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ、＃３０－２００３）に希釈して９６－ウェルプレートの各ウェル当たり２．５×１０^３個細胞の濃度で１００μＬずつ添加した後、プレートを１８～２４時間３７℃、９５％相対湿度および５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２条件下で培養した。各ウェルから細胞培養培地を除去した後、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＥＭＥＭ培地を１００μＬずつ各ウェルに添加し、最終濃度（１００ｎＭ）の２Ｘに製造した抗体を１／１０連続希釈して各抗体別に６個の濃度（すなわち、２００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ、２００ｐＭ、２０ｐＭおよび２ｐＭ）でウェルに１００μＬずつ添加した。その次に、前記プレートを３７℃、９５％相対湿度および５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２条件下で５日間培養し、最後の日に１０％ ＴＣＡ（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；Ｓｉｇｍａ、＃Ｔ０６９９）溶液で細胞を固定した。固定化された細胞は、各ウェルに８０μＬの０．４％ ＳＲＢ（ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）溶液を添加して２５分間染色した後、１％酢酸溶液で５回洗浄した。その次に、乾燥させたプレートの各ウェルに１５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液を入れてＳＲＢ ｄｙｅを溶解させた後、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ機器を用いて５４０ｎｍ波長で吸光度を測定した。

また、ＭＫＮ４５（＃ＪＣＲＢ０２５４）細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１０４９１）に希釈して９６－ウェルプレートの各ウェルに２．５×１０^３個ずつ分株して入れた後、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で一晩培養した。その後、前記プレートの各ウェルの培地を１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地１００μＬに交替した後、試験抗体を最終濃度１００ｎＭから１ｐＭになるように１／１０ずつ順次希釈（すなわち、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭ）して各ウェルに１００μＬずつ添加した。その次に、前記プレートを３７℃、５％ ＣＯ_２条件で５日間培養した後、培地を除去し、ＴＣＡ溶液を２００μＬずつ各ウェルに入れて細胞を固定した。前記Ｕ８７ ＭＧ細胞に対する試験と同様に通常のＳＲＢ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ方法によってプレートの細胞を染色し、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて５４０ｎｍ波長で各ウェルの吸光度を測定した。前記Ｕ８７ ＭＧおよびＭＫＮ４５細胞株に対する結果を表３および図１に示す。

表３および図１から確認できるように、本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である８Ｃ４、５Ｇ３抗体、そしてこれらのキメラ抗体はいずれも、公知のｃ－Ｍｅｔ抗体であるＬＹ２８７５３５８およびＯＡ－５Ｄ５（対照群）と比較して対等であるか、またはより優れた腫瘍細胞増殖阻害活性を有する。よって、本発明の８Ｃ４、５Ｇ３抗体、およびこれらのキメラ抗体、ヒト化抗体、抗原に対する親和性を最適化させた抗体などの変異体は、ｃ－Ｍｅ
ｔと関連した癌の予防または治療に非常に有用に用いられることができる。

本発明の８Ｃ４、５Ｇ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域に対する具体的なコンセンサス配列を下記の表４に示す。

実施例２． ８Ｃ４抗体のヒト化抗体の製造およびそのｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

本発明で製造された抗体の効果をさらに確認するために、一例示として、前記マウス抗体８Ｃ４をヒト化させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでその腫瘍細胞増殖阻害活性を確認した。

８Ｃ４抗体重鎖のヒト化デザインのために、先ず、Ｉｇ Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて、マウス抗体８Ｃ４の重鎖可変領域遺伝子と相同性の高いヒトの生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子を分析した。その結果、ＩＧＨＶ３－２３が８Ｃ４抗体とアミノ酸レベルで４８％の相同性を有するのを確認し、ＩＧＨＶ３－１１が８Ｃ４抗体とアミノ酸レベルで４６％の相同性を有するのを確認した。

マウス抗体８Ｃ４のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義し、マウス抗体８Ｃ４のＣＤＲ部分がＩＧＨＶ３－２３の骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に導入されるようにデザインしてｈｕ８Ｃ４－１を作製した。この時、４８番（Ｖ→Ｉ）、４９番（Ｓ→Ｇ）、７１番（Ｒ→Ａ）、７３番（Ｎ→Ｋ）、７８番（Ｌ→Ａ）、９４番（Ｋ→Ｇ）アミノ酸は、本来のマウス８Ｃ４抗体のアミノ酸配列にｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｉｏｎして、最終的にｈｕ８Ｃ４－１の重鎖を構築した。ｈｕ８Ｃ４－２の場合、マウス抗体８Ｃ４のＣＤＲ部分がＩＧＨＶ３－１１の骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に導入されるようにデザインし、４８番（Ｖ→Ｉ）、４９番（Ｓ→Ｇ）、７１番（Ｒ→Ａ）、７３番（Ｎ→Ｋ）、７８番（Ｌ→Ａ）、９４番（Ｒ→Ｇ）アミノ酸は、本来のマ
ウス８Ｃ４抗体のアミノ酸配列にｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｉｏｎして、最終的にｈｕ８Ｃ４－２の重鎖を構築した。

８Ｃ４抗体軽鎖の場合にも、ヒト化デザインのために、Ｉｇ Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて、マウス抗体８Ｃ４の軽鎖可変領域遺伝子と相同性の高いヒトの生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子を分析した。その結果、ＩＧＫＶ１－２７が８Ｃ４抗体とアミノ酸レベルで６５．３％の相同性を有し、ＩＧＫＶ１－３３が８Ｃ４抗体とアミノ酸レベルで６４．２％の相同性を有するのを確認した。

マウス抗体８Ｃ４のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義し、マウス抗体８Ｃ４のＣＤＲ部分がＩＧＫＶ１－３３の骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に導入されるようにデザインしてｈｕ８Ｃ４－１を作製し、ＩＧＫＶ１－２７の骨格に導入されるようにデザインしてｈｕ８Ｃ４－２を作製した。この時、ｈｕ８Ｃ４－１、ｈｕ８Ｃ４－２のいずれも６９番（Ｔ→Ｒ）アミノ酸を本来のマウス８Ｃ４抗体のアミノ酸配列にｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｉｏｎした。

前記８Ｃ４ヒト化抗体をｐＣＬＳ０５ベクター（大韓民国登録特許第１０－１４２０２７４号）を用いて２９３Ｔ細胞に発現させた。このように得られたＩｇＧ１形態のヒト化抗体に対して、前記実施例１と同様の方法により、ヒト膠芽腫細胞株であるＵ－８７ ＭＧにおいて腫瘍細胞増殖阻害活性を確認した。

その結果、ｈｕ８Ｃ４－１とｈｕ８Ｃ４－２のＩＣ_５０値は各々３０ｎＭおよび２４．６ｎＭであって、キメラ８Ｃ４抗体（ＩＣ_５０＝３２．４ｎＭ）と比較して類似したレベルの抗癌活性を示すのを確認した。

前記ｈｕ８Ｃ４－１、ｈｕ８Ｃ４－２ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域に対する具体的なコンセンサス配列を表５に示す。

実施例３． ５Ｇ３抗体のヒト化抗体の製造およびそのｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

次に、本願発明のマウス抗体５Ｇ３をヒト化させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでその腫瘍細胞増殖阻害活性を確認した。

具体的には、ｈｕ５Ｇ３－１の重鎖デザインのために、先ず、Ｉｇ Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて、マウス抗体５Ｇ３の重鎖可変領域遺伝子と最も相同性の高いヒトの生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子を分析した。その結果、ＩＧＨＶ１－４６が５Ｇ３抗体とアミノ酸レベルで６７．３％の相同性を有するのを確認した。マウス抗体５Ｇ３のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義し、マウス抗体５Ｇ３のＣＤＲ部分がＩＧＨＶ１－４６の骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に導入されるようにデザインした。この時、４８番（Ｍ→Ｉ）、６９番（Ｍ→Ｌ）、７１番（Ｒ→Ａ）、７３番（Ｔ→Ｋ）、７８番（Ｖ→Ａ）アミノ酸は、本来のマウス５Ｇ３抗体のアミノ酸配列にｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｉｏｎした。それにより、ｈｕ５Ｇ３－１の重鎖を構築した。

ｈｕ５Ｇ３－１の軽鎖は５Ｇ３抗体と６３．５％の相同性を有するＩＧＫＶ３－２０遺伝子にＣＤＲ－ｇｒａｆｔｉｎｇを行い、４３番（Ａ→Ｓ）、６０番（Ｄ→Ａ）、７１番（Ｆ→Ｎ）アミノ酸はｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｉｏｎを行ってｈｕ５Ｇ３－１の軽鎖を構築した。

また、ｈｕ５Ｇ３－２の重鎖をデザインするために、既存の最も安定していると知られたＶＨ３ ｓｕｂｔｙｐｅを用いてＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義されたマウス抗体５Ｇ３のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３を導入した。この時、６７番（Ｆ→Ａ）、６９番（Ｉ→Ｌ）、７３番（Ｔ→Ｋ）、９０番（Ｙ→Ｆ）、９４番（Ｔ→Ｒ）アミノ酸は、本来のマウス５Ｇ３抗体のアミノ酸配列にｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｉｏｎした。それにより、ｈｕ５Ｇ３－２の重鎖を構築した。

ｈｕ５Ｇ３－２の軽鎖はＶＨ３ ｓｕｂｔｙｐｅと安定的に構造を形成すると知られたＩＧＶＫＩＩＩ遺伝子にＣＤＲ－ｇｒａｆｔｉｎｇを行い、ｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｉｏｎは行わなかった。

前記５Ｇ３ヒト化抗体をｐＣＬＳ０５ベクター（大韓民国登録特許第１０－１４２０２７４号）を用いて２９３Ｔ細胞に発現させた。このように得られたＩｇＧ２形態のヒト化抗体に対して、実施例１と同様の方法により、ヒト胃癌細胞株であるＭＫＮ４５において腫瘍細胞増殖阻害活性を確認した。

その結果、ｈｕ５Ｇ３－１とｈｕ５Ｇ３－２のＩＣ_５０値は各々０．５２ｎＭ、０．５ｎＭであって、キメラ５Ｇ３抗体（ＩＣ_５０＝０．４１ｎＭ）と比較して類似したレベルの抗癌活性を示すのを確認した。

前記ｈｕ５Ｇ３－１、ｈｕ５Ｇ３－２ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域に対するコンセンサス配列を表６に示す。

実施例４． ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）変異体の作製およびその腫瘍細胞増殖阻害活性試験

次に、ヒトＩｇＧ１重鎖不変領域のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）配列に応じた腫瘍細胞増殖阻害活性試験を行った。

先ず、ヒトＩｇＧ１重鎖不変領域のヒンジは「ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３７）」のアミノ酸配列を有し、それを置換して配列番号３８～配列番号４４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域変異体を得た。

それを前記実施例２で作製されたｈｕ８Ｃ４－１、ｈｕ８Ｃ４－２ヒト化抗体の重鎖可変領域を含むベクターに各々クローニングした。ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒンジ配列に応じた腫瘍細胞増殖阻害活性を前記実施例１と同様の方法によりＵ－８７ ＭＧにおいて確認した。

また、非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９９３（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－５９０９）に対して次のように８Ｃ４ヒト化抗体の効果を分析した。ＮＣＩ－Ｈ１９９３細胞株を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１０４９１）に希釈して９６－ウェルプレートの各ウェルに３．０×１０^３個ずつ分株して入れた後、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で一晩培養した。その後、前記プレートの各ウェルの培地を２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地１００μＬに交替した後、試験抗体を最終濃度１００ｎＭから０．００１ｎＭになるように１／１０ずつ順次希釈（すなわち
、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭ）して各ウェルに１００μＬずつ添加した。その次に、前記プレートを３７℃、５％ ＣＯ_２条件で５日間培養した後、培地を除去し、ＴＣＡ溶液（Ｓｉｇｍａ、＃Ｔ０６９９）を２００μＬずつ各ウェルに入れて細胞を固定した。通常のＳＲＢ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ方法によってプレートの細胞を染色し、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて５４０ｎＭ波長で各ウェルの吸光度を測定した。

Ｕ－８７ ＭＧおよびＮＣＩ－Ｈ１９９３（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－５９０９）におけるｈｕ８Ｃ４－１の結果を表７に示す。

表７から確認できるように、ヒンジ配列の差に応じてｈｕ８Ｃ４抗体の腫瘍細胞増殖阻害活性に多少の差はあるが、大部分の腫瘍細胞の増殖を効果的に阻害するのを確認した。そこで、以下では代表的にｈｕ８Ｃ４－１に配列番号３８のヒンジ領域を有するＩｇＧ１ヒト化抗体をｈｕ８Ｃ４に命名し、それに対する親和性最適化抗体を作製し、その効果を
確認しようとした。

実施例５． ｈｕ８Ｃ４の親和性最適化抗体の作製およびそのｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

ｈｕ８Ｃ４の親和性最適化抗体を作製するために、先ず、ｓｃＦｖとｐＩＩＩが結合された形態でディスプレイされるファージミドベクターを用いてファージ－ディスプレイされたｓｃＦｖライブラリーを作製し、前記ベクターの概略的な構造を図２に示す。前記ファージミドベクターはＩＰＴＧ－誘導性ｌａｃプロモーターの制御下の抗体のｓｃＦｖ断片を含み、リンカー配列はＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ（配列番号５３）を用いた。

次に、ｈｕ８Ｃ４の重鎖と軽鎖ＣＤＲ部位に多様性を導入するためにＮＮＫコドンを有する突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いた。それにより、Ｈｉｓ、ＨＡおよびｐＩＩＩが融合されたｈｕ８Ｃ４ ｓｃＦｖライブラリーを作製し、作製された抗体ライブラリーからヒトｃ－Ｍｅｔに特異的な抗体を選別した。

具体的には、親和性が向上した抗体を選別するために競争的な選別方法を用いた。ＤｙｎａｂｅａｄｓＲ Ｍ－２８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１２０５Ｄ）にヒトｃ－Ｍｅｔ抗原を製造会社の指針に従って結合させた。抗原が結合されたビードをスーパーブロックＴＢＳ（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて２時間遮断した。また、３７℃で組み換えファージを一晩成長させた後に遠心分離して上清のファージをスーパーブロックＴＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を用いて２時間遮断した。その後、ビードを０．０５％ツイン２０が含まれたＰＢＳで洗浄した。遮断されたファージ溶液を洗浄されたビードに添加し、ファージ結合のためにロテータ（ｒｏｔａｔｏｒ）において２時間インキュベーションした後、ビードを０．０５％ツイン２０が含まれたＰＢＳで洗浄した。その次に、ヒトｃ－Ｍｅｔ抗原を０．０５％ツイン２０が含まれたＰＢＳ １ｍｌに添加して、ロテータにおいて２４時間インキュベーションした（Ｒｏｕｅｔ Ｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．７：３６４－３７３）。その次に、ビードに結合されたファージを１００ｍＭトリエタノールアミンで５分間溶離し、溶離液を０．５Ｍ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ７．２）で中和した。溶離されたファージ中和液を大腸菌ＴＧ１に感染させた。

前記実験を通じて選択された個別クローンをカルベニシリンおよびアンピシリンが添加された２ｘＹＴ ｂｒｏｔｈ２００μＬで９６－ウェルフォーマットにおいて成長させ、培養上清をＥＬＩＳＡに直接用いて、標的タンパク質でコーティングされたプレートに結合するファージ－ディスプレイされたｓｃＦｖを選別した。検出された抗体の軽鎖および重鎖ＣＤＲ領域アミノ酸配列を表８および表９に示し、代表的な軽鎖および重鎖親和性最適化抗体可変領域のアミノ酸配列を表１０に示す。

また、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記親和性最適化抗体のうち一部を用いてＵ－８７ ＭＧ細胞株に対する増殖阻害活性試験を行い、その結果を表１１に示す。

表１１から確認できるように、Ｕ－８７ ＭＧ細胞においてｈｕ８Ｃ４親和性最適化抗体の腫瘍細胞増殖阻害活性のＩＣ_５０は５．０～１８ｎＭであって、親抗体ｈｕ８Ｃ４に比べて効能が４．３～９．８倍増加するのを確認した。前記結果は、表８～表１０に提示されたアミノ酸配列を有する抗体のうち一部に対して行われたものであるが、母体となるｈｕ８Ｃ４抗体の親和性を最適化したものであり、これらはいずれも選別過程で抗原親和性に基づいて選別されたものであるため、残りの親和性最適化抗体、そして提示された重鎖および軽鎖可変領域ＣＤＲを組み合わせた抗体に対しても十分にそれと同等な効果があると予想される。

追加の実験のために前記軽鎖と重鎖の可変領域を組み合わせて１０種の親和性最適化抗体を作製した。具体的な軽鎖および重鎖配列の組み合わせを表１２に示す。

その次に、前記実施例１と同様の方法により、腫瘍細胞増殖阻害活性の評価を行い、その結果を表１３および図３に示す。

表１３から確認できるように、ｈｕ８Ｃ４だけでなく、その親和性最適化抗体の軽鎖および重鎖可変領域を組み合わせた１０種の主な抗体もまた腫瘍細胞増殖阻害活性を示すのが確認された。特に、前記１０種の抗体はＩＣ_５０が１．７～５．３ｎＭであって、親抗体であるｈｕ８Ｃ４に比べて９．２～２８．５倍優れた腫瘍細胞増殖阻害効果を有するのが確認された。

実施例６． 二重特異性抗体の作製およびｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞増殖阻害活性

ｃ－ＭｅｔおよびＥＧＦＲに特異的に結合する二重抗体を作製するために、ＥＧＦＲに特異的に結合すると知られたＥｒｂｉｔｕｘとＶｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ断片を本願発明のｃ－Ｍｅｔ抗体の重鎖Ｃ－末端にＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１２）コネクターで各々連結して二重抗体を作製した。

前記ｓｃＦｖの安定性を増加させるために、重鎖４４番目の残基と軽鎖１００番目の残基をシスティンで置換した（Ｒｅｉｔｅｒ Ｙ．ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３（１８）：５４５１－５４５９（１９９４））。ＥｒｂｉｔｕｘとＶｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ配列、二重抗体の重鎖のアミノ酸配列および二重抗体の可変領域の組み合わせを下記の表１４および表１５に示す。

その次に、ＥｒｂｉｔｕｘとＶｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ断片を連結した二重抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗癌効能を、実施例１と同様の方法により、Ｕ－８７ ＭＧ腫瘍細胞株において評価した。

また、ＮＣＩ－Ｈ１９９３、ＮＣＩ－Ｈ２９２、ＮＣＩ－Ｈ８２０肺癌細胞株を用いて腫瘍細胞増殖阻害活性を評価した。具体的には、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子が過発現されている細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９９３（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－５９０９）、ＥＧＦＲとｃ－Ｍｅｔが正常に発現される細胞株であるＮＣＩ－Ｈ２９２（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１８４８）とＥＧＦＲアミノ酸７９０番にトレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）に変異が生じたＮＣＩ－Ｈ８２０（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ－１８１）腫瘍細胞増殖阻害活性を次のような方法で行った。各細胞株を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１０４９１）に希釈して９６－ウェルプレートの各ウェルに２．０×１０^３個ずつ分株して入れた後、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で一晩培養した。その後、前記プレートの各ウェルを無血清培地１００μＬに交替した後、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で１８時間培養した。その次に、培地を２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳあるいはＨＧＦ ５０ｎｇ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地１００μＬに交替した後、試験抗体を最終濃度１００ｎＭから０．００１ｎＭになるように１／１０ずつ順次希釈（すなわち、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭ）して各ウェルに１００μＬずつ添加した。その次に、前記プレートを３７℃、５％ ＣＯ_２条件で５日間培養した後、培地を除去し、ＴＣＡ溶液を２００μＬずつ各ウェルに入れて細胞を固定した。通常のＳＲＢ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ方法によってプレートの細胞を染色し、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて５４０ｎＭ波長で各ウェルの吸光度を測定した。

前記各細胞株での増殖阻害活性の結果を表１６、表１７、図４および図５に示す。

その結果、Ｕ－８７ ＭＧ腫瘍細胞株で前記方法により作製された二重抗体間の効能には差がなく、ｈｕ８Ｃ４最適化抗体のＩＣ_５０に比べて約１５倍以上活性阻害効能に優れるのを確認した。また、ＮＣＩ－Ｈ１９９３、ＮＣＩ－Ｈ２９２、ＮＣＩ－Ｈ８２０肺癌
細胞株を用いた腫瘍細胞増殖阻害活性の評価結果、作製された二重抗体間の効能差はないのを確認した。

このような結果は、本発明の抗体がｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲの異常発現または突然変異に関係なく全ての癌腫に対して増殖阻害効果があり、よって、これらの癌腫に効果的に使用できることを示唆する。

実施例７． 併用療法に対する二重抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞増殖阻害活性の比較評価

ｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲを各々標的とする各抗体の併用療法と本発明の二重抗体の腫瘍細胞増殖阻害活性を比較するために８種類の癌腫を用いた。

具体的には、肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ２９２（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ－１８４８）、ＨＧＦ－自己分泌膠芽腫細胞株Ｕ－８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ－１４）、肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１６４８（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－５８８２）とＮＣＩ－Ｈ５９６（ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ－１７８）、ＨＣＣ８２７（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ２８６８）、大腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ、＃ＣＬ－１８８）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ、ｔｒｉｐｌｅ
ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）細胞株ＢＴ２０（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ－１９）および膵臓癌細胞株ＫＰ４（ＪＣＲＢ、＃ＲＣＢ１００５）において腫瘍細胞増殖阻害活性の評価を行った。前記ＮＣＩ－Ｈ１６４８細胞株はＥＧＦＲとｃ－Ｍｅｔが正常に発現されており、ＮＣＩ－Ｈ５９６細胞株はＭＥＴ遺伝子のエクソン１４番に一部の配列が欠損しており、ＨＣＣ８２７細胞株はＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９番に一部の配列が欠損しているという特徴を有する。また、ＬＳ１７４Ｔ細胞株はＫＲＡＳ変異を有し、ＫＰ４はＨＧＦを自己分泌するという特徴を有する。

Ｕ－８７ ＭＧ細胞株は実施例１の方法により、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞株は実施例６の方法により評価を行った。また、ＮＣＩ－Ｈ１６４８、ＮＣＩ－Ｈ５９６およびＨＣＣ８２７細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１０４９１）に希釈して９６－ウェルプレートの各ウェルに２．０×１０^３個ずつ分株、ＬＳ１７４Ｔ細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＃１１９９５－０６５）に希釈して２．０×１０^３個ずつ分株、ＢＴ２０細胞株は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、＃３０－２００３）に希釈して３．０×１０^３個ずつ分株、ＫＰ４細胞株は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１０４９１）に希釈して１．５×１０^３個ずつ分株して入れた後、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で一晩培養した。その後、プレートの各ウェルを無血清培地１００μＬに交替した後、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で１８時間培養した。その次に、培地を２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳあるいはＨＧＦ ５０ｎｇ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地１００μＬに交替した後、試験抗体を最終濃度１００ｎＭから１ｐＭになるように１／１０ずつ順次希釈（すなわち、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭ）して各ウェルに１００μＬずつ添加した。その次に、プレートを３７℃、５％ ＣＯ_２条件で５日間インキュベーションした後、培地を除去し、ＴＣＡ溶液を２００μＬずつ各ウェルに入れて細胞を固定した。通常のＳＲＢ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ方法によってプレートの細胞を染色し、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて５４０ｎＭ波長で各ウェルの吸光度を測定した。

本実施例の結果を表１８～２１、図６～図８に示す。

その結果、前記８種類の腫瘍細胞株の全てにおいて、ｈｕ８Ｃ４、Ｖｅｃｔｉｂｉｘあるいは二つの抗体の併用療法より本願発明の二重抗体の腫瘍細胞増殖阻害能に優れるのを確認した。また、対照二重抗体として用いられたＥＭ１－ＭＡｂ（Ｊａｎｓｓｅｎ）と比較した時、Ｕ－８７ＭＧ、ＮＣＩ－Ｈ２９２、ＢＴ２０、ＫＰ４細胞株において顕著に優れた腫瘍細胞増殖阻害能を確認した。

また、Ｕ－８７ＭＧ細胞株においてｃ－Ｍｅｔ標的抗体であるＬＡ４８０（Ｌｉｌｌｙ）、ＯＡ－５Ｄ５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＡｂＦ４６（Ｓａｍｓｕｎｇ）と比較した時
、ｈｕ８Ｃ４とｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖのいずれも対照抗体に比べて優れた腫瘍細胞増殖阻害能を確認した。

また、ＨＣＣ８２７細胞株においてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＴａｒｃｅｖａはＨＧＦ処理条件で抵抗性を示したが、この条件でＴａｒｃｅｖａとｈｕ８Ｃ４、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖまたはｃＭｅｔ阻害剤を併用処理した時に腫瘍細胞増殖阻害能が優れるのを確認した。

また、ＮＣＩ－Ｈ５９６細胞株において様々なＥＧＦＲ阻害剤およびｃ－Ｍｅｔ阻害剤と比較した結果、ＥＧＦＲまたはｃ－Ｍｅｔ単一標的薬物に比べてｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖの腫瘍細胞増殖阻害能が優れるのを確認した。

実施例８． ＥＣＤに対する結合力の測定（ＢＩＡｃｏｒｅ）

次に、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する本発明のｃ－Ｍｅｔ抗体の結合力を測定するために、ヒトとカニクイザルのｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤとＥＧＦＲ ＥＣＤに対するｃ－Ｍｅｔ抗体および二重抗体の結合をＢＩＡｃｏｒｅを用いて測定した。

具体的には、ヒトｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＥＴ－Ｈ５２２７）、カニクイザルｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、９０３０４－Ｃ０８Ｈ）、ヒトＥＧＦＲ ＥＣＤ ｓｔｒｅｐ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＥＧＲ－Ｈ５２８５）およびカニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、９０２８５－Ｃ０８Ｂ）を用いた。

先ず、抗－ｃ－Ｍｅｔ抗体と二重抗体を捕捉するためにＦｃに特異的な抗Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、２０４７－０１）を１００００ＲＵのレベルでＣＭ５センサチップに固定させた。抗体を１～２μｇ／ｍｌ濃度でＨＢＳ－ＥＰバッファ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）に希釈して抗Ｈｕｍａｎ Ｉｇ Ｆｃが固定されたＣＭ５チップに３０μＬ／ｍｉｎの流速で１０～１２０秒間注入した後、１５０～２００ＲＵの範囲で捕捉した。各々の抗原を１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５および０．１５６２５ｎＭに希釈して用い、低い濃度から順次注入した。その次に、３０μＬ／ｍｉｎの流速で５分間注入して結合させ、１０～１５分間ランニングバッファを注入して解離させた。１５μＬの１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を用いてチップを再生した。各々のサイクルに対する結合および解離速度はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１で「１：１（ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ））結合」モデルを用いて評価し、ｂｉａｃｏｒｅデータを表２２および表２３に要約して示す。

前記データは、本発明のｈｕ８Ｃ４、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ二重抗体がヒトおよびカニクイザルｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤに優れた親和性で結合するのを立証する
ものである。

実施例９． 様々な動物種のｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤ、ＥＧＦＲ ＥＣＤに対するｃ－Ｍｅｔ抗体の結合力の測定（ＥＬＩＳＡ）

マウス、カニクイザルおよびヒトｃ－Ｍｅｔ ＥＣＤとＥＧＦＲ ＥＣＤ対するｃ－Ｍｅｔ抗体および二重抗体の結合をＥＬＩＳＡを用いて測定した。

具体的には、マウスｃ－Ｍｅｔ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、５０６２２－Ｍ０８Ｈ）、カニクイザルｃ－Ｍｅｔ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、９０３０４－Ｃ０８Ｈ）、ヒトｃ－Ｍｅｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３５８－ＭＴ）、マウスＥＧＦＲ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、５１０９１－Ｍ０８Ｈ）、カニクイザルＥＧＦＲ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、９０２８５－Ｃ０８Ｂ）およびヒトＥＧＦＲ（Ａｂｃａｍ、１５５６３９）抗原をいずれも２μｇ／ｍｌの濃度で９６－ウェルプレートに分株して４℃で一晩反応させた。常温で１時間ブロッキングを行った後、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ二重抗体を１００ｎＭから１／５ずつ順次希釈して７個の濃度区間（すなわち、１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、８００ｐＭ、１６０ｐＭ、３２ｐＭおよび６．４ｐＭ）での結合能を測定しようとした。

ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ二重抗体を常温で１時間結合させた後、抗－ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０３５－０９７）を１：２５００で希釈して常温で１時間反応させた。発色はＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ４４４４）溶液を用いて行われ、値は４５０ｎｍの吸光度で測定し、ＥＬＩＳＡ結果を図９に示す。

その結果、ｈｕ８Ｃ４単独抗体とｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ二重抗体は、マウスｃ－ＭｅｔとマウスＥＧＦＲには結合せず、猿とヒトｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲには結合するのを確認した。また、陰性対照群として用いたヒトＩｇＧ抗体はいずれも結合していないのを確認した。前記結果は、本発明のｃ－Ｍｅｔ抗体がヒトと猿のｃ－ＭｅｔおよびＥＧＦＲにのみ特異的であることを示唆する。

実施例１０． 細胞表面の様々な受容体に対するｃ－Ｍｅｔ抗体の交差反応性

本発明に係るｃ－Ｍｅｔに特異的に結合するｈｕ８Ｃ４抗体の特異性および他のｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ抗原に対する交差反応性を間接ＥＬＩＳＡ方法により分析し、主なｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅの中からＦＧＦ Ｒ３、ＶＥＧＦＲ Ｒ２、ＩＧＦ ＩＲ、ＰＤＧＦ ＲおよびＲＯＮの５つの抗原を選択して分析を行った。

本実施例においては、抗原としてヒトｃ－Ｍｅｔ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、３５８－ＭＴ＿ＣＦ）、ヒトＦＧＦ Ｒ３（ＩＩＩｃ）Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、７６６－ＦＲ）、ヒトＩＧＦ－Ｉ Ｒ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、３９１－ＧＲ－０５０）、ヒトＰＤＧＦ Ｒβ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、３８５－ＰＲ＿ＣＦ）、ヒトＶＥＧＦ Ｒ２ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、３５７－ＫＤ＿ＣＦ）およびヒトＭＳＰ Ｒ／Ｒｏｎ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、１９４７－ＭＳ－０５０）を用いた。

０．０５Ｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ－ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ３０４１）バッファに１μｇ／ｍｌの濃度で各抗原を希釈して９６－ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ、＃２５９２）の各ウェルに添加した後、４℃で一晩コーティングした。前記プレートをＴＢＳ－Ｔで１回洗浄し、非特異的な結合を阻害するために４％－ｓｋｉｍ ｍｉｌｋが含まれたＴＢＳ－Ｔを各ウェルに２００μＬずつ添加して３７℃で１時間反応した。その後、ＴＢＳ－Ｔバッファで１回洗浄した後、一次抗体を２％－ｓｋｉｍ ｍｉｌｋが含まれたＴＢＳ－Ｔバッファに最高濃度３０ｎＭから０．００２ｎＭまで順次希釈して各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃で２時間反応させた。ＴＢＳ－Ｔバッファで３回洗浄した後、二次抗体として抗－ヒトｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ、Ａ７１６４）を１：５０００希釈して各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。その後、ＴＢＳ－Ｔバッファで３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｔ４４４４）を各ウェルに１００μＬずつ添加して発色反応を行った後、２Ｎ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加して反応を中断させた。吸光度の測定はｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて４５０ｎｍ波長の値を測定し、リファレンス波長は５７０ｎｍを用いた。各抗原に対する抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の結合程度は吸光度信号値に比例的であり、その結果を表２４に示す。

表２４から確認できるように、本発明のｈｕ８Ｃ４抗体はｃ－Ｍｅｔに対して優先的に結合し、他の抗原であるＦＧＦ Ｒ３、ＶＥＧＦＲ Ｒ２、ＩＧＦ ＩＲ、ＰＤＧＦ ＲおよびＲＯＮに対してはほぼ結合しないのを確認することができた。

実施例１１． ｃ－Ｍｅｔ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）活性および二重抗体のｃ－Ｍｅｔレベル阻害活性

本発明のｃ－Ｍｅｔ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞内の内在化活性およびｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲに同時に結合できる二重抗体による受容体レベル減少効果を確認した。

先ず、抗体内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）は正常な受容体の生理活性により起こるが、通常、細胞外部に発現されている受容体は、特異的なリガンドと結合すれば、ホモ－またはヘテロ－二量体化反応（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって活性化され、受容体を介したエンドサイトーシスを起こすようになる。細胞の受容体に特異的な抗体は、このような現象を誘導する能力を有しており、エンドサイトーシスを誘発して細胞内部に内在化され、その結果、受容体の分解を誘導してその発現程度を下げ、特定の受容体
によるシグナル伝達を阻害させる可能性がある。ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）分析機器を用いて細胞外部に結合されている抗体の量を探知することができるため、細胞内部に内在化された抗体の量が知ることができる。測定しようとする抗体の軽鎖に対する二次抗体として抗－ヒトｋａｐｐａ ＬＣにＦＩＴＣが結合されている抗体を用いて結合させれば、内在化されず細胞外部の標的受容体に結合した状態で残っている抗体の量を定量的に測定することができるため、それより内在化された抗体の量を確認することができる。抗原に対して非特異的なヒトＩｇＧ抗体を用いて試験に用いる抗体の非特異的結合によるバックグラウンドシグナルを測定して、実際の特異的結合による蛍光シグナルを測定することができる。

本実施例においてはｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ－Ｍｅｔ抗体の腫瘍細胞内の内在化活性を確認するために、胃癌細胞株であるＭＫＮ４５細胞株（＃ＪＣＲＢ０２５４）を用いた。ＭＫＮ４５はＭＥＴ遺伝子の増幅によりｃ－Ｍｅｔ受容体を高レベルで発現し、その結果、ＨＧＦ－非依存的な様相でｃ－Ｍｅｔ受容体のリン酸化が誘導される。抗ｃ－Ｍｅｔ抗体であるｈｕ８Ｃ４によってｃ－Ｍｅｔ受容体が細胞内部に内在化されて発現レベルを減少できるか否かを調査するために次のように試験を行った。

先ず、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（２ｍｌ）が含まれた６－ウェルプレートにＭＫＮ４５胃癌細胞株を各ウェル当たり５．０×１０^５個ずつ分株し、前記プレートを２４時間３７℃、相対湿度９５％および５％ ＣＯ_２条件で培養した。分析しようとする抗ｃ－Ｍｅｔ抗体および抗ＩｇＧ抗体（対照群）を最終濃度１００ｎＭになるように希釈して処理し、一晩反応させた。非内在化対照群として用いるプレートは、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体およびヒトＩｇＧ抗体（対照群）で処理し、４℃で１時間反応させた。その後、無酵素細胞（ｅｎｚｙｍｅ－ｆｒｅｅ ｃｅｌｌ）解離バッファ（Ｇｉｂｃｏ、＃１３１５１）１ｍｌで各ウェルの細胞を採取し、冷たいＰＢＳで２回洗浄した。二次抗体として抗－ヒトｋａｐｐａ ＬＣ－ＦＩＴＣ（ＬＳＢｉｏ ＃ＬＳ－Ｃ６０５３９）を１：２０００希釈して添加した後、４℃で１時間反応させた。その次に、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ、＃５５４６５５）１００μＬで固定させ、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターを用いて蛍光染色程度ＦＩＴＣ Ｇｅｏ－ｍｅａｎ（ＭＦＩ）値を測定した。細胞外部に結合されている抗体の量は下記の計算式によって得て、その結果を表２５に示す。

表面結合 Ａｂ（％）＝［（ＭＦＩ_{［３７℃ ｅｘｐ．］}－ＭＦＩ_{［ＩｇＧ 対照群］}）／（ＭＦＩ_{［４℃ 対照群］}－ＭＦＩ_{［ＩｇＧ 対照群］}）］×１００

表２５から確認できるように、対照群として用いた抗ｃ－Ｍｅｔ抗体であるＯＡ－５Ｄ５は細胞内部にほぼ内在化されない反面、本発明のｈｕ８Ｃ４抗体はＭＫＮ４５胃癌細胞
株において細胞内部に約４０％以上が内在化されることが分かった。つまり、これは、ｈｕ８Ｃ４抗体がｃ－Ｍｅｔ受容体の発現レベルを顕著に減少させることを示す。

次に、ｃ－Ｍｅｔ受容体とＥＧＦＲ受容体に同時に結合できる二重抗体による受容体レベル減少効果を確認するために、ＮＣＩ－Ｈ８２０肺癌細胞株に対する受容体レベル測定試験を行った。前記ＮＣＩ－Ｈ８２０細胞株は、ｃ－Ｍｅｔ受容体が約８３，０００ＳＡＢＣ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）、ＥＧＦＲ受容体が約７４，０００ＳＡＢＣレベルで発現されており、抗ｃ－Ｍｅｔ×ＥＧＦＲ二重抗体による受容体レベル減少効果を測定するのに適宜な細胞株である。

先ず、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（２ｍｌ）が含まれた６－ウェルプレートにＮＣＩ－Ｈ８２０細胞株を各ウェル当たり１．０×１０^５個ずつ分株し、前記プレートを２４時間３７℃、相対湿度９５％および５％ ＣＯ_２条件で一晩培養した。その後、血清が含まれていない培地に交替し、プレートを２４時間３７℃、相対湿度９５％および５％ ＣＯ_２条件で一晩培養した。その次に、分析しようとする抗ｃ－Ｍｅｔ抗体、抗ｃ－Ｍｅｔ×ＥＧＦＲ二重抗体、抗ＥＧＦＲ抗体および対照群としてヒトＩｇＧ抗体を２％－ＦＢＳが含まれた培地に最終濃度１０ｎＭになるように希釈して処理し、５日間培養させた。その次に、各ウェルの細胞を無酵素細胞解離バッファ１ｍｌで採取し、冷たいＰＢＳで２回洗浄した。その次に、二次抗体としてＧｏａｔ Ｆ（ａｂ’）_２抗－マウスＩｇＧ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ．＃Ｆ０１０３Ｂ）を各ウェルに１０μＬずつ添加した後、４℃で１時間反応させた。その次に、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ、＃５５４６５５）１００μＬで固定させ、その後、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターを用いて蛍光染色程度ＦＩＴＣ Ｇｅｏ－ｍｅａｎ（ＭＦＩ）値を測定した。

その結果、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体であるｈｕ８Ｃ４処理時、ＥＧＦＲ受容体はほぼ減少しなかったが、ｃ－Ｍｅｔ受容体は２％レベルに顕著に減少した（図１０）。また、抗ＥＧＦＲ抗体であるＶｅｃｔｉｂｉｘは、ＥＧＦＲ受容体を約８３％レベルに減少させたが、ｃ－Ｍｅｔ受容体はほぼ減少しなかった。これに対し、ｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲ受容体に同時に結合する本発明のｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ二重抗体を処理した場合、ＥＧＦＲ受容体は約２１％レベルに、ｃ－Ｍｅｔ受容体は約４％レベルに減少したのを確認した。
したがって、本発明のｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ二重抗体は、ｃ－ＭｅｔおよびＥＧＦＲ受容体の発現レベルを同時に顕著に減少させるのを確認した。

実施例１２． 二重抗体のｃ－ＭｅｔおよびＥＧＦＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏシグナル阻害活性の確認

次に、本発明の二重抗体が抗原およびシグナル伝達物質の活性に及ぼす影響を確認するために、ＮＣＩ－Ｈ８２０細胞株を用いて実験を行った。

先ず、ＮＣＩ－Ｈ８２０細胞株をウェル当たり５×１０^５個細胞の濃度で６－ウェルプレートに分株し、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で一晩培養させた後、無血清培地に交替してさらに一晩培養した。抗体は１００ｎＭ濃度で無血清培地に希釈したものを処理して２４時間反応させ、細胞採取１５分前にＨＧＦ（Ｇｉｂｃｏ、ＰＨＧ０２５４）とＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３６－ＥＧ－２００）を各々５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した。その次に、溶解バッファに前記細胞を溶解して細胞採取を行い、Ｌｏｗｒｙ ａｓｓａｙ法を用いてタンパク質濃度を定量した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにウェル当たり２０μｇのタンパク質をロードしてランニングした後、ニトロセルロース膜にブロットした。前記膜をブロッキングした後、全ての一次抗体を１：１，０００の比率で希釈して反応させ、二次抗体はＨＲＰ－結合抗－ウサギ抗体を１：５，０００で希釈して反
応させた。その次に、膜に吸着された抗体をＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）と反応させた後、ＬＣ－３０００機器を用いて測定した。

その結果、図１１から確認できるように、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ二重抗体の処理時、ＥＧＦＲリン酸化、Ｅｒｋリン酸化およびＡｋｔリン酸化がｈｕ８Ｃ４またはＶｅｃｔｉｂｉｘ抗体を単独で処理した時より顕著に減少するのを確認することができた。

したがって、本発明のｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ二重抗体は、ＮＣＩ－Ｈ８２０細胞株においてＥＧＦＲ、Ｅｒｋ、Ａｋｔなどの受容体および下位シグナル伝達物質の活性を減少させることができる。つまり、これは、本発明の抗体がシグナル伝達阻害を通じて効能を示すのを見せる結果である。

実施例１３． Ｕ－８７ ＭＧ異種移植マウスモデルでの腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

ＨＧＦ依存的Ｕ－８７ ＭＧ細胞異種移植片モデルにおいて本発明の二重抗体による腫瘍細胞増殖阻害活性を確認するために、代表的にｈｕ８Ｃ４ ＩｇＧ２×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖを用いて実験を行った。

先ず、ヒト膠芽腫Ｕ－８７ ＭＧ細胞株をＬ－グルタミン（３００ｍｇ／Ｌ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３および１０％熱失活した（ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＦＢＳなどが含まれたＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ(登録商標） ３０－２００３^ＴＭ）培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養させた。その次に、６～８週齢の雄無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）の横腹にＵ－８７ ＭＧ細胞をマウス当たり１×１０^７個の濃度で２００μＬずつ皮下接種した。接種２５日後、形成された腫瘍体積が６０～１３０ｍｍ^３に達したのを確認した後にグループ分離を行い、試験物質を週１回４週間に総５回（０、７、１４、２１および２８日）腹腔投与した。試験物質は５ｍｇ／ｋｇで投与し、腫瘍体積とマウス体重は週２回測定した。データに対する賦形剤対照群と試験物質投与群間の比較は一般にＳｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔを用いて検定し、統計方法はＯｒｉｇｉｎ Ｐｒｏ ８．５プログラムを利用した。「最大阻害％」は、溶媒対照群処理に対して腫瘍成長の阻害％を示す。

その結果、ｈｕ８Ｃ４ ＩｇＧ２×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖの３．５ｍｇ／ｋｇおよび６．８ｍｇ／ｋｇ投与群は溶媒対照群に比べて腫瘍体積を最大阻害９６％、１．５ｍｇ／ｋｇ投与群は最大８０％で阻害して、投与７日から試験終了日まで有意なレベルに腫瘍体積を減少させた（ｐ＜０．０１）（図１２）。また、陽性対照群であるＢｓＡＢ－０１と比較した時、本発明の二重抗体は、有意なレベルに腫瘍成長を減少させた（ｐ＜０．０１）。

したがって、前記結果から、本発明の二重抗体は、腫瘍成長を顕著に減少させて抗－腫瘍効能に優れるのを確認した。

実施例１４． ＮＣＩ－Ｈ８２０異種移植マウスモデルでの腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

ＮＣＩ－Ｈ８２０細胞株は、ＥＧＦＲアミノ酸７９０番のトレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）に変異し、ＭＥＴ遺伝子が増幅された細胞株であって、３世代ＥＧＦＲ ＴＫＩであるＡＺＤ９２９１（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ、ｔａｇｒｉｓｓｏ）の抵抗性細胞株として知られている（Ｄａｒｒｅｎ Ａ．Ｅ．Ｃｒｏｓｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．４（９）：１０４６－１０６１（２０１４））。このようなＥＧＦＲ Ｔ
ＫＩに抵抗性を有するＮＣＩ－Ｈ８２０細胞株において二重抗体の腫瘍細胞増殖阻害活性を調査するために、本発明の二重抗体のうち代表的にｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖを用いてＮＣＩ－Ｈ８２０異種移植マウスモデルでの評価を行った。

具体的には、本実施例に用いられたマウスは、マウスＨＧＦ遺伝子を除去し、ヒトＨＧＦ遺伝子を発現できるように形質変換させたマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＳＴＯＣＫ Ｈｇｆｔｍ１．１（ＨＧＦ）Ａｖｅｏ Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）として６週齢の雄を用いた。ＮＣＩ－Ｈ８２０（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ－１８１）細胞株を１０％ ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地と共に細胞培養用フラスコに入れ、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養させた。その次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、１５０９０）を１０倍希釈した後、それを添加して細胞を分離した。その次に、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）して上清を捨てた後、新しい培地に細胞浮遊液を得た。その次に、顕微鏡を用いて生存度を確認した後、５．０×１０^７個細胞／ｍｌの濃度で無血清培地に希釈して細胞株を準備した。前記準備した細胞株を０．１ｍｌ／ｈｅａｄの投与液量でマウスに皮下投与した。投与後、細胞株を移植した部位の腫瘍の大きさが約１００～１５０ｍｍ^３に達した時、順位化した腫瘍の大きさに応じて各群の腫瘍の大きさが可能な限り均一に分布するように分配した。その次に、細胞投与開始後７日目から群分離日（試験物質の投与開始日）および試験物質の投与終了後２８日目まで週２回腫瘍発生を確認し、キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒｓ）を用いて腫瘍の長軸および短軸を測定して腫瘍の大きさ（ａｂ^２／２（ａ：長軸の長さ、ｂ：短軸の長さ））を算出した。統計学的分析はＰｒｉｓｍ ５．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行い、ｐ値が０．０５未満の場合に統計学的に有意なものであると判定した。

その結果、試験物質の投与開始後４日目から２８日目までｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖを投与した全ての群において腫瘍増殖阻害活性が溶媒対照群に比べて有意に高く（ｐ＜０．００１）、腫瘍阻害率は最大１００％であるのを確認した（図１３）。その反面、陽性対照群として用いたＡＺＤ９２９１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）は溶媒対照群と有意な差はなかった。

実施例１５． ５Ｇ３ ｃ－Ｍｅｔ抗体およびＨＥＲ２抗体の併用投与によるｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である５Ｇ３と抗ＨＥＲ２抗体の併用に応じた腫瘍細胞増殖阻害活性を評価するために、ＮＣＩ－Ｈ２１７０細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖阻害活性試験を行った。ＮＣＩ－Ｈ２１７０細胞株（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－５９２８）はＮＳＣＬＣ（ｎｏｎｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）腫瘍細胞株であり、受容体レベルの測定結果、ＥＧＦＲは約２，７００ＳＡＢＣ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）、ｃ－Ｍｅｔは約１１，０００ＳＡＢＣレベルで発現していた。

具体的には、ＮＣＩ－Ｈ２１７０細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培養培地に希釈して各ウェル当たり３．０×１０^３個細胞の濃度で１００μＬずつ添加した後、プレートを１８～２４時間３７℃、９５％相対湿度および５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２条件下で培養した。その次に、各ウェルの細胞培養培地を除去した後、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ－１６４０培地を１００μＬずつ各ウェルに添加した。その次に、最終濃度（１００ｎＭ）の２Ｘに製造した抗体を１／１０連続希釈して各抗体別に６個の濃度（すなわち、２００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ、２００ｐＭ、２０ｐＭおよび２ｐＭ）でウェルに１００μＬずつ添加した。前記プレートを３７℃、９５％相対湿度および５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２条件下で５日間培養し、最後の日に各ウェルに２０μＬのＷＳ
Ｔ－８溶液（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ）を添加して１～２時間発色した後、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ機器を用いて４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。

細胞増殖阻害活性に対する結果を表２６および図１４に示す。

表２６から確認できるように、ＮＣＩ－Ｈ２１７０腫瘍細胞株において５Ｇ３および抗ＨＥＲ２抗体であるＡ０９１抗体（大韓民国登録特許第１０－１５１５５３５号）の併用処理は、各抗体の単独処理より腫瘍細胞増殖阻害能に優れるのが確認された。

実施例１６． ＮＣＩ－Ｈ２１７０ヒト肺癌細胞株の異種移植マウスモデルでの５Ｇ３
ｃ－Ｍｅｔ抗体およびＨＥＲ２抗体の併用投与によるｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

ＨＥＲ２抗体およびｃ－Ｍｅｔ抗体の併用効能を調査するために、肺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ２１７０異種移植マウスモデルにおいて抗癌活性実験を行った。

具体的には、本実施例においては、前記実施例１３と同様のマウスを用いて、実施例１４と同様の方法によりマウスの腫瘍の大きさを測定した。ＮＣＩ－Ｈ２１７０肺腫瘍細胞異種移植片モデルでのＡ０９１と５Ｇ３の併用による抗－腫瘍効能の評価結果を図１５に示す。

その結果、Ａ０９１単独またはＡ０９１と５Ｇ３を併用投与した場合、投与１４日以後から腫瘍体積が溶媒対照群に比べて有意なレベルに減少した（ｐ＜０．０５）。また、Ａ０９１と５Ｇ３を併用投与した群は、単独投与群であるＡ０９１または対照二重抗体であるＢｓＡＢ０２（ＵＳ２０１０／０２５４９８８ Ａ１）投与群に比べて有意な腫瘍体積の減少を示した（ｐ＜０．０１）。

実施例１７． ＮＣＩ－Ｈ５９６異種移植マウスモデルでの腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

ＮＣＩ－Ｈ５９６細胞株はｃ－Ｍｅｔのエクソン１４に変異のある肺癌細胞株であり、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖの抗癌効果を確認するために、ＮＣＩ－Ｈ５９
６異種移植マウスモデルでの評価を行った。

本実施例においては、前記実施例１４と同様のマウスおよび同様の方法を用いてマウスの腫瘍の大きさを測定した。

ＮＣＩ－Ｈ５９６肺腫瘍細胞異種移植片モデルにおいてｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ
ｓｃＦｖを週２回あるいは週１回で４週投与した抗癌効能の評価結果を図１６に示す。

腫瘍の大きさの測定結果、試験物質の投与開始後１１日目から実験終了時までｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ １０ｍｇ／ｋｇ、週２回投与群の腫瘍の大きさのレベルが対照群に比べて統計学的に有意な差を示し、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ ５ｍｇ／ｋｇ、週２回投与群およびｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ １０ｍｇ／ｋｇ、週１回投与群もまた試験物質の投与開始後１８日目から対照群に比べて有意に低かった。また、試験物質投与群の腫瘍の大きさのレベルは試験物質の投与量に応じて用量相関性のある腫瘍の大きさのレベルの変化傾向を示し、試験物質の投与終了日（Ｄａｙ ２８）以後、試験群の腫瘍の大きさも対照群に比べて低かった。

実施例１８． ＥＢＣ－１異種移植マウスモデルでの腫瘍細胞増殖阻害活性の確認

ＥＢＣ－１はｃ－Ｍｅｔ遺伝子が増幅された肺癌細胞株であり、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖの抗癌効果を確認するために、ＥＢＣ－１異種移植マウスモデルでの評価を行った。

本実施例に用いられたマウスは、Ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕｄｅマウス（Ｈａｒｌａｎ）として６週齢の雌を用いた。ＥＢＣ－１（ＪＣＲＢ、＃ＪＣＲＢ０８２０）細胞株を１０％
ＦＢＳが含まれたＥＭＥＭ培地と共に細胞培養用フラスコに入れ、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養させた。５．０×１０^７個細胞／ｍｌの濃度で無血清培地に希釈して細胞株を準備し、０．１ｍｌ／ｈｅａｄの投与液量でマウスに皮下投与した。細胞株を移植した部位の腫瘍の大きさが約１００～１５０ｍｍ^３に達した時、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖを週２回あるいは週１回で４週間投与し、実施例１４と同様の方法を用いてマウスの腫瘍の大きさを測定した。

ＥＢＣ－１肺腫瘍細胞異種移植片モデルにおいてｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖによる抗癌効能の評価結果を図１７に示す。

腫瘍の大きさの測定結果、試験物質の投与開始後７日目から試験物質の投与開始後５６日目までｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ １０ｍｇ／ｋｇ、週２回投与群の腫瘍の大きさのレベルが対照群に比べて統計学的に有意な差を示した。ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ ５ｍｇ／ｋｇ、週２回投与群と１０ｍｇ／ｋｇ、週１回投与群は、試験物質の投与開始後１８日目から対照群に比べて有意に低かった。また、試験物質投与群の腫瘍の大きさのレベルは試験物質の投与量に応じて用量相関性のある腫瘍の大きさのレベルの変化傾向を示し、試験物質の投与終了日（Ｄａｙ ２８）以後観察期間の間、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ １０ｍｇ／ｋｇ、週２回投与群の腫瘍の大きさのレベルは試験物質の投与開始後５６日目まで対照群に比べて有意に低かった。特に、試験物質の投与開始後１８日目にｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ １０ｍｇ／ｋｇ、週２回投与群のうち一つの個体は完全反応（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が観察された。

実施例１９． 二重抗体の癌細胞表面のｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲの減少効果

本発明の二重抗体（ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞表面のｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲの減少効果を確認し、本発明のｃ－Ｍｅｔ抗体（ｈｕ８Ｃ４）、ｖｅｃｔｉｂｉｘ、ｃ－Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ併用およびその他の抗体による効果と比較した。

一般に細胞膜に位置する受容体は、抗体と結合時、細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されて細胞膜に位置する量が減少する。このような細胞膜での受容体の減少は、リガンド結合による受容体の活性化阻害および受容体によるその下位シグナルの低下を誘発する。

本実施例においては、細胞膜ｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲの減少を観察するために肺腺癌細胞株であるＨＣＣ８２７を用いた。ＨＣＣ８２７はＥＧＦＲ Ｅ７４６－Ａ７５０欠損変異を有しており、ｃ－Ｍｅｔを過発現する。ＨＣＣ８２７に本発明の二重抗体（ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ）およびその他の抗体を処理し、ｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲに特異的な抗体を用いて免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を施した後、フローサイトメーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）で分析して、細胞表面のｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲの量を測定した。具体的な実施方法は次の通りである。

先ず、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（２ｍｌ）が含まれた６－ウェルプレートにＨＣＣ８２７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－２８６８^ＴＭ）を各ウェル当たり３．０×１０^５個ずつ分株し、前記プレートを２４時間３７℃、相対湿度９５％および５％ ＣＯ_２条件で培養した。本発明の二重抗体（ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ）、本発明のｃ－Ｍｅｔ抗体（ｈｕ８Ｃ４）、ｖｅｃｔｉｂｉｘ、本発明のｃ－Ｍｅｔ抗体（ｈｕ８Ｃ４）とｖｅｃｔｉｂｉｘの混合物、Ｃ－ＥＭ１およびＬＡ４８０を最終濃度１００ｎＭになるように希釈して処理し、１８時間反応させた。ｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲの非－減少対照群として用いるプレートはヒトＩｇＧ抗体を処理し、１８時間反応させた。その後、無酵素細胞（ｅｎｚｙｍｅ－ｆｒｅｅ ｃｅｌｌ）解離バッファ（Ｇｉｂｃｏ、＃１３１５１）５００μＬで各ウェルの細胞を採取し、遠心分離機で細胞と無酵素細胞解離バッファを分離した後、無酵素細胞解離バッファを除去した。免疫蛍光染色のためにヤギ由来ｃ－Ｍｅｔ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ２７６）、ヤギ由来ＥＧＦＲ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ２３１）または非特異的染色量の測定のための非特異的ヤギ由来抗体の各２μｇを２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有する冷たいＰＢＳ ２００μＬと混合して各ウェルに処理した後、４℃で１時間反応させた。その後、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有する冷たいＰＢＳで２回洗浄した。二次抗体としてＡＬＥＸＡ４８８が結合され、ヤギ抗体と結合するロバ由来抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ－１１０５５）１μＬを２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有する冷たいＰＢＳ ２００μＬに希釈して用いた。二次抗体と４℃で１時間反応させた後、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有する冷たいＰＢＳで細胞を２回洗浄し、その後、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ、＃５５４６５５）２００μＬを用いて固定させた。ＰＢＳで１回洗浄した後、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターを用いて蛍光染色程度ＡＬＥＸＡ４８８ Ｇｅｏ－ｍｅａｎ（ＭＦＩ）値を測定した。細胞膜に位置するｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲの量は下記の計算式によりｇｅｏ ＭＦＩ（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で示した。３回試験を繰り返し行った値の平均と標準偏差を表２７と図１８および１９に示す。

ｃ－Ｍｅｔ または ＥＧＦＲ 表面量＝ｇｅｏ ＭＦＩ_{［実験群］}－ｇｅｏ ＭＦＩ_{［非特異的ヤギ由来抗体］}

表２７から確認できるように、ｃ－Ｍｅｔと結合する抗体はいずれも細胞表面のｃ－Ｍｅｔを４０～７０％減少させ、ＥＧＦＲと結合する抗体は１０～１５％の微弱な減少効果を示した。ｃ－Ｍｅｔ減少効果をより詳しく見てみると、ｈｕ８Ｃ４、ｈｕ８Ｃ４＋Ｖｅｃｔｉｂｉｘ併用、Ｃ－ＥＭ１およびＣ－ＬＡ４８０は約４０％内外の細胞表面のｃ－Ｍｅｔを減少させたのに対し、ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖは７０％の細胞表面のｃ－Ｍｅｔを減少させて他の抗体および抗体組み合わせより優れた細胞表面のｃ－Ｍｅｔの減少効果を示した。

上記の結果は、本発明の二重抗体（ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ）が細胞表面のｃ－Ｍｅｔ量を顕著に減少させることを示す。

実施例２０． エピトープマッピング

本発明の二重抗体（ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ）のヒトｃ－Ｍｅｔ抗原に対するエピトープを究明するために、オソン先端医療産業振興財団の分子モデル設計支援チーム（韓国）に分析を依頼した。水素-重水素交換質量分析法（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ－ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＨＤＸ－ＭＳ）を用いて分析を行った。

ｃ－Ｍｅｔセマドメインはα／βの二つの鎖で構成されており、二つの鎖に対する各々のカバレージ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を確認し、試料内のジスルフィド結合が多数存在する理由でクェンチホールディング（ｑｕｅｎｃｈ ｈｏｌｄｉｎｇ）時間、ＴＣＥＰ濃度、ペプシン濃度などを調節してペプチドカバレージを最適化した。最終的にクェンチバッファ（Ｑｕｅｎｃｈ ｂｕｆｆｅｒ）条件は、１００ｍＭ Ｋ．Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１２５ｍＭ ＴＣＥＰ、０．５Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ－ＨＣｌ、ｐＨ２．６６にして実験を行った。

抗原と抗体は各々３．３ｍｇ／ｍｌと６５ｍｇ／ｍｌの濃度で準備し、３７ｐｍｏｌ ｃＭＥＴ抗原と３６ｐｍｏｌ抗体を実験前に３時間以上予め結合させた。重水素標識バッファ（ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を０分、０．３３分、１０分、６０分、２４０分間反応させた。各々の標識時間に合わせてクェンチバッファで標
識を中断し、ｖｏｒｔｅｘｉｎｇした後、液体窒素に直ちに凍らせて分析前まで－８０℃に保管した。質量分析計（ＭＳ）でペプシンカラムにロードして分析した。

分析結果、本発明の二重抗体（ｈｕ８Ｃ４×Ｖｅｃｔｉｂｉｘ ｓｃＦｖ）は、ヒトｃ－Ｍｅｔセマドメインβ鎖のＹ３２１～Ｌ３２９（配列番号３３１）、Ｉ３３３～Ｉ３４１（配列番号３３２）、Ｐ３６６～Ｄ３７２（配列番号３３３）、およびＱ４６４～Ｓ４７４（配列番号３３４）の４個の部位に立体的形態のエピトープに結合するのを確認した（表２８）。ＰｙＭＯＬプログラムを用いてヒトｃ－Ｍｅｔ抗原（ＰＤＢ Ｎｏ．４Ｋ３Ｊ）の３次構造上に標識して図２０に示す。

前記のような結果から、本発明のｃ－Ｍｅｔに特異的に結合するマウス抗体、ヒト化抗体、親和性最適化抗体またはその抗原結合断片がｃ－Ｍｅｔに選択的に作用して、少ない量でも優れた癌細胞増殖阻害活性および顕著に優れた抗癌活性を示しており、癌を効果的に予防または治療できることが分かる。

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とその等価物によって定義されると言える。

Claims (24)

1. 肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
   前記抗体は、
   （ａ）配列番号１で示された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２で示された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３で示された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、および配列番号７で示された重鎖ＣＤＲ１；配列番号８で示された重鎖ＣＤＲ２；配列番号９で示された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体；または
   （ｂ）これらの親和性最適化抗体であり、前記親和性最適化抗体は、
   （ｉ）配列番号２１で示された軽鎖可変領域および配列番号３０２で示された重鎖可変領域；
   （ｉｉ）配列番号２１で示された軽鎖可変領域および配列番号３０５で示された重鎖可変領域；
   （ｉｉｉ）配列番号３１０で示された軽鎖可変領域および配列番号２３で示された重鎖可変領域；
   （ｉｖ）配列番号３０８で示された軽鎖可変領域および配列番号３０５で示された重鎖可変領域；
   （ｖ）配列番号３０６で示された軽鎖可変領域および配列番号３０３で示された重鎖可変領域；
   （ｖｉ）配列番号３０７で示された軽鎖可変領域および配列番号３０４で示された重鎖可変領域；
   （ｖｉｉ）配列番号３０８で示された軽鎖可変領域および配列番号３０４で示された重鎖可変領域；
   （ｖｉｉｉ）配列番号３０９で示された軽鎖可変領域および配列番号３０４で示された重鎖可変領域；
   （ｉｘ）配列番号３１１で示された軽鎖可変領域および配列番号３０４で示された重鎖可変領域；若しくは
   （ｘ）配列番号３０６で示された軽鎖可変領域および配列番号３０２で示された重鎖可変領域を含む、
   抗体またはその抗原結合断片。
2. 前記抗体は、配列番号１３で示された軽鎖可変領域および配列番号１５で示された重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
3. 前記抗体は、
   （ａ）配列番号２１で示された軽鎖可変領域および配列番号２３で示された重鎖可変領域；または
   （ｂ）配列番号２２で示された軽鎖可変領域および配列番号２４で示された重鎖可変領域；を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
4. 前記抗体は、配列番号３７～配列番号４４のうちいずれか一つで示されたヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
5. 前記抗体は、さらに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
6. 前記抗体は、ｃ－Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖または重鎖の一末端に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体またはその抗原結合断片を連結した、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
7. 前記ＥＧＦＲに結合する抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖである、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
8. 前記Ｆｖは、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（商標）およびＴｈｅｒａＣＩＭ（商標）からなる群より選択されるいずれか一つ以上のｓｃＦｖ断片である、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
9. 前記ＥｒｂｉｔｕｘのｓｃＦｖ断片は、配列番号３１３または配列番号３１４で示されたアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
10. 前記ＶｅｃｔｉｂｉｘのｓｃＦｖ断片は、配列番号３１５で示されたアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
11. 前記抗体またはその抗原結合断片の連結は、配列番号３１２で示されたコネクターで連結される、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
12. 抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子。
14. 請求項１３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
15. 請求項１４に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
16. 請求項１５に記載の宿主細胞を用いた抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。
17. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、ｃ－Ｍｅ
    ｔ検出用組成物。
18. 請求項１７に記載のｃ－Ｍｅｔ検出用組成物を含む、ｃ－Ｍｅｔ検出用キット。
19. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を用いたｃ－Ｍｅｔ抗原を検出する方法。
20. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の予防または治療用の組成物。
21. 前記抗体またはその抗原結合断片は、ｃ－Ｍｅｔに結合して受容体活性を阻害する、請求項２０に記載の癌の予防または治療用の組成物。
22. 前記抗体またはその抗原結合断片は、さらにＥＧＦＲに結合して受容体活性を阻害する、請求項２１に記載の癌の予防または治療用の組成物。
23. 前記癌は、ｃ－Ｍｅｔの過発現、増幅、突然変異または活性化による、請求項２０に記載の癌の予防または治療用の組成物。
24. 前記癌は、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ、ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、膠芽腫、膵臓癌、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、脳癌、子宮癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄腫、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫および副腎皮質癌からなる群より選択される、請求項２０に記載の癌の予防または治療用の組成物。

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